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CENTRO DE ESTUDOS GERAIS INSTITUTO DE BIOLOGIA PROGRAMA DE NEUROIMUNOLOGIA PATRICIA CRISTINA FERNANDES ARÊAS AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL DE NAFTOQUINONAS DISSERTAÇÃO SUBMETIDA À UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE VISANDO A OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM NEUROIMUNOLOGIA Orientadora: Lídia Maria da Fonte de Amorim UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE 2007

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CENTRO DE ESTUDOS GERAIS INSTITUTO DE BIOLOGIA

PROGRAMA DE NEUROIMUNOLOGIA

PATRICIA CRISTINA FERNANDES ARÊAS

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL DE NAFTOQUINONAS

DISSERTAÇÃO SUBMETIDA À UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

VISANDO A OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM NEUROIMUNOLOGIA

Orientadora: Lídia Maria da Fonte de Amorim

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

2007

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ii

PATRICIA CRISTINA FERNANDES ARÊAS

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL DE NAFTOQUINONAS

Trabalho desenvolvido no Laboratório de Toxicologia Molecular do Departamento de

Biologia Celular e Molecular, Instituto de Biologia-UFF

Dissertação de mestrado submetida a

Universidade Federal Fluminense como

requisito parcial para obtenção do grau de

mestre em Neuroimunologia.

Orientadora: Lídia Maria da Fonte de Amorim

NITERÓI

2007

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FICHA CATALOGRÁFICA

Arêas, Patricia Cristina Fernandes Avaliação da atividade antitumoral de naftoquinonas / Patricia Cristina Fernandes Arêas - 2007 Orientadora: Lídia Maria da Fonte de Amorim Tese (Mestrado) - Universidade Federal Fluminense - UFF, Instituto de Biologia. 1. Naftoquinonas. 2. Câncer. 3. K562. 4. Apoptose. 5. Síntese protéica. 6. Triazóis.I. Amorim, Lídia Maria da Fonte de. II. Universidade Federal Fluminense - UFF. Instituto de Biologia.

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iv

PATRICIA CRISTINA FERNANDES ARÊAS

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL DE NAFTOQUINONAS

Dissertação de mestrado submetida a Universidade Federal Fluminense como requisito parcial para obtenção do grau de mestre em Neuroimunologia.

Aprovada em 14 de setembro de 2007.

BANCA EXAMINADORA

__________________________________________

Adriano Caldeira de Araújo (UERJ)

__________________________________________

Viveca Antônia Giongo (UGF)

__________________________________________

Izabel Christina de Palmer Paixão Frugulhetti (UFF)

REVISOR E SUPLENTE

_________________________________________

Elizabeth Giestal de Araújo (UFF)

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v

Dedico este trabalho aos

meus grandes amores,

Antonio, Luiza e Isabella.

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vi

AGRADECIMENTOS

A professora Lídia Amorim por sua orientação e seus ensinamentos, e por ter acreditado

em minha capacidade técnica e científica desde o início.

A meu marido Antonio por me compreender e me dar o estímulo, a força e o apoio

incondicionais necessários ao desenvolvimento de um trabalho com esta dimensão.

A minha filha Luiza por ter sido capaz de compreender minha ausência em muitos

momentos, sendo minha companheira e melhor amiga.

A minha filha Isabella, que apesar de ter chegado na fase final deste trabalho, reafirmou

minha determinação para concluí-lo.

Aos meus pais Luiz e Julia, meus sogros Antonio e Jane, e minha cunhada Sávia, por

estarem presentes em momentos cruciais do desenvolvimento de minha filha Luiza,

educando-a e lhe dando amor e carinho quando eu e o Antonio não pudemos estar

presentes, e agora por estarem repetindo esta dedicação com Isabella.

A professora Izabel Frugulhetti por sua co-orientação e por me mostrar que vontade de

ensinar e generosidade independem de colocação profissional.

A professora Tereza Quírico por disponibilizar gentilmente seu laboratório,

imprescindível para realizar várias etapas desta dissertação e, principalmente, por seus

conselhos e estímulo mesmo nos momentos mais difíceis.

A professora Patrícia Burth pelo apoio durante este período.

A professora Elizabeth Giestal de Araújo por acreditar em mim desde a seleção para o

mestrado até sua conclusão.

Aos professores Ana Ventura e Cláudio Alberto Serfaty, e seus alunos, pelo uso de seus

laboratórios para o desenvolvimento de algumas etapas deste trabalho.

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Aos professores Adriano Caldeira de Araújo e José Carlos P de Mattos e a aluna

Michelle Pinheiro Rodrigues do Laboratório de Radio e Fotobiologia da UERJ pelo

apoio na realização do teste do cometa.

Ao Prof. Vitor Francisco Ferreira e ao aluno Fernando de Carvalho da Silva pelo

fornecimento das substâncias testadas nesse trabalho e pelo auxilio nas questões

químicas.

A professora Keila Mara Cassiano do Departamento de Estatística da UFF pela análise

estatística dos resultados deste trabalho.

Aos amigos Maria Luiza e Diogo pela constante ajuda e amizade durante todo este

período.

Aos amigos do laboratório de Virologia Molecular pela compreensão durante o uso de

seu laboratório.

Ao Departamento de Imunologia, pelo uso do leitor de microplacas durante o

desenvolvimento deste trabalho.

A todos os professores do curso de pós-graduação por seus ensinamentos práticos e

teóricos.

A FAPERJ/SUS e PROAP/UFF pelo apoio financeiro.

A todos que de alguma forma me apoiaram e confiaram que eu seria capaz de chegar até

aqui.

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SUMÁRIO

Página

LISTAS DE TABELAS, FIGURAS E GRÁFICOS ................................................. x

RESUMO.................................................................................................................... xii

ABSTRACT................................................................................................................ xiv

1 INTRODUÇÃO .............................................................................................. 1

1.1 Incidência mundial de câncer............................................................................ 1

1.2 Câncer no Brasil................................................................................................ 2

1.3 Tratamento do câncer........................................................................................ 5

1.4 Câncer, aspectos gerais..................................................................................... 8

1.5 Mecanismo de ação dos quimioterápicos contra o câncer................................ 12

1.6 Origem dos quimioterápicos antineoplásicos naturais....................................... 13

1.7 Avaliação de novas drogas................................................................................ 14

1.8 Atividade antineoplásica de naftoquinonas....................................................... 16

1.9 Propriedades farmacológicas dos triazóis .......................................................... 18

2 OBJETIVOS ................................................................................................... 19

2.1 Objetivo geral.................................................................................................... 19

2.2 Objetivos específicos........................................................................................ 19

3 MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................... 20

3.1 Manutenção das linhagens celulares utilizadas no estudo............................... 20

3.2 Substâncias testadas........................................................................................ 21

3.3 Avaliação da viabilidade celular..................................................................... 21

3.3.1 Citotoxicidade celular..................................................................................... 21

3.3.2 Determinação do IC50..................................................................................... 23

3.4 Avaliação do mecanismo de ação das substâncias......................................... 23

3.4.1 Avaliação da síntese protéica.......................................................................... 24

3.4.2 Avaliação da apoptose por fragmentação do DNA........................................ 25

3.4.3 Avaliação de lesões oxidativas pelo teste do cometa..................................... 26

3.5 Análise estatística ........................................................................................... 27

4 RESULTADOS ............................................................................................ 28

4.1 Avaliação da viabilidade celular.................................................................... 28

4.1.1 Citotoxicidade celular ................................................................................... 28

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ix

4.1.2 Determinação do IC50.................................................................................... 32

4.2 Avaliação do mecanismo da ação das substâncias............................................ 36

4.2.1 Avaliação da síntese protéica............................................................................ 36

4.2.2 Avaliação da apoptose por fragmentação do DNA........................................... 36

4.2.3 Avaliação da genotoxicidade das naftoquinonas pelo teste do

cometa.......................................................................................................................... 40

5 DISCUSSÃO ................................................................................................... 43

6 CONCLUSÃO ................................................................................................ 53

7 BIBLIOGRAFIA............................................................................................ 55

8 ANEXOS......................................................................................................... 59

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x

LISTA DE TABELAS, GRÁFICOS E FIGURAS

TABELAS TABELA 1. Estimativas para o ano 2006 das taxas brutas de incidência por 100.000 habitantes e de número de casos novos por câncer, em homens e mulheres, segundo a região.................................................................................................

3

TABELA 2. Estimativas para o ano 2006 de número de casos novos de câncer, por região...............................................................................................

3

TABELA 3. Estimativa para 2006 do número de casos novos de câncer em homens..............................................................................................................

4

TABELA 4. Estimativa para 2006 do número de casos novos de câncer em mulheres............................................................................................................

4

TABELA 5. Gastos federais em assistência oncológica...................................................................................................................

6

TABELA 6. Viabilidade celular (%) nas linhagens K562 e HEP2 tratadas com naftoquinonas na concentração de 50 μM por 24 horas.............................

29

TABELA 7. Viabilidade celular (%) de triazóis na concentração de 50 μM por 24 horas nas linhagens K562 e HEP2..........................................................

31

TABELA 8. Valores de IC 50............................................................................

36

TABELA 9. Análise da síntese protéica em relação ao controle (DMSO)........

37

FIGURAS FIGURA 1. Tipos de metilação .........................................................................

10

FIGURA 2. Classificação das quinonas.............................................................

16

FIGURA 3. Rota de síntese das naftoquinonas utilizadas no estudo................................................................................................................

22

FIGURA 4. Apoptose por fragmentação do DNA com incubação das substâncias por 4 horas.........................................................................................................

37

FIGURA 5. Apoptose por fragmentação do DNA 24 horas.............................

38

FIGURA 6. Alteração da morfologia celular na presença de naftoquinonas na linhagem K562 após 24 horas de incubação...................................................................

39

FIGURA 7. Visualização da fragmentação do DNA pelo teste do

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xi

cometa........................................................................................................................... 41 GRÁFICOS GRÁFICO 1. Procedimentos quimioterápicos aprovados pelo SUS.........................................................................................................

7

GRÁFICO 2. Valores em Reais para os procedimentos quimioterápicos.............................................................................................

7

GRÁFICO 3. Viabilidade celular em presença das naftoquinonas com maior potencial citotóxico a 50μM na linhagem K562 em 24 horas...............................................................................

29

GRÁFICO 4. Viabilidade celular em presença das naftoquinonas com maior potencial citotóxico a 50μM na linhagem HEP2 em 24 horas..............................................................................

30

GRÁFICO 5. Viabilidade da linhagem K562 em diferentes concentrações de DMSO, no período de 24 horas..........................................................................

33

GRÁFICO 6. Viabilidade da linhagem HEP2 em diferentes concentrações de DMSO, no período de 24 horas..........................................................................

33

GRÁFICO 7. Viabilidade das linhagens K562 e HEP2 em diferentes concentrações do quimioterápico Etoposídeo.............................................................................

34

GRÁFICO 8. Regressão logarítmica e sua equação nas diferentes concentrações do quimioterápico Etoposídeo nas linhagens K562 (A) e HEP2 (B)..................

35

GRÁFICO 9. Teste do cometa (2 horas)............................................................

42

GRÁFICO 10. Viabilidade celular (%) com azul de tripan por 2 horas...........

42

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xii

RESUMO

No ano de 2005, foram registrados 58 milhões de óbitos no mundo dos quais

13% ocorreram devido a algum tipo de câncer. No Brasil, as estatísticas mostram o

aumento da incidência de casos de câncer e dos recursos em assistência oncológica

liberados pelo Sistema Único de Saúde (SUS), entre os anos de 2000 e 2005, onde

registrou-se um aumento de 103% nos gastos federais. Somente no ano de 2005 foram

aprovados cerca de 1.5 milhões de procedimentos quimioterápicos em todo Brasil pelo

SUS. Os quimioterápicos naturais foram introduzidos ao longo dos últimos vinte anos

no tratamento do câncer, reforçando o interesse de indústrias farmacêuticas em produtos

de origem natural. Existe grande interesse na identificação de novos agentes

antineoplásicos, que tenham ação seletiva e seus efeitos adversos minimizados. No

presente estudo foi feita uma análise “in vitro” de Triazóis, Ácido Pirazolil Acrílico,

Naftoquinonas e outros derivados do Lapachol e da Lausona, como possíveis agentes

citotóxicos às linhagens tumorais K562 e HEP2. A partir da triagem realizada no teste

de viabilidade celular com MTT, selecionamos a linhagem K562 como a linhagem mais

sensível ao tratamento e cinco naftoquinonas como os compostos mais citotóxicos.

Estas naftoquinonas exibiram citotoxidade mais elevada do que o Etoposídeo, o

controle positivo. As concentrações inibitórias 50% (IC50) utilizando células K562

foram 0.06 μM, 467.6 μM, 3126.2 μM, 977.1 μM e 488,0 μM para βLapachona, Nor

βLapachona, Metoxi, Epoxi αLapachona e IVS 320, respectivamente. A síntese

protéica foi inibida em todas as cinco drogas testadas e também foi observada indução

da fragmentação do DNA característica da apoptose após 24 horas de incubação a 50

μM. Após 2 horas 50 μM as células exibiram genototoxicidade no teste do cometa. De

modo geral, observou-se que as substâncias Nor βLapachona e IVS 320 foram mais

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promissoras em relação aos potenciais antitumorais o que sugere a necessidade de

maiores estudos.

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xiv

ABSTRACT

Cancer is an important cause of death in worldwide. In 2005 were recorded 58

millions of deaths and about 13% were in consequence of cancer. In Brazil, official data

show an increase of cancer cases as well as the costs with cancer care. Federal resources

show an increase of 103% since 2000 until 2005. In 2005 the Brazilian government

recorded 1,5 million units of chemotherapy proceedings. The chemotherapy with natural

compounds was introduced on cancer therapy about 20 years ago. Besides that, an

increase of pharmaceutical industry interests was observed. Finally, there is a great

interest of more selective and safe new cancer drugs. In doing so, we performed an “in

vitro” study with the antitumoral activity of Triazoles, Pirazolil acrylic acid and

Naphtoquinones compounds as well as others Lapachol and Lausone derivatives

compounds on K562 and HEP2 tumoral cell lineages. A MTT test was performed and

the K562 cells were selected as the most sensitive cellular lineage as well as the five

naphtoquinones as the most citotoxic compounds. These naphtoquinones exhibited

cytotoxicity higher than Etoposide, the positive control of the tests. The IC50.using

K562 cells were 0.06 μM, 467.6 μM, 3126.2 μM, 977.1 μM and 488,0 μM

to βLapachone, Nor βLapachone, Metoxi, Epoxi αLapachona and IVS 320,

respectively. Protein synthesis was inhibited for all five compounds and, all five

naphtoquinones induced DNA fragmentation profile characteristics of apoptosis after 24

hours of incubation at 50 μM. After two hours at 50 μM cells exhibited genotoxic

effects on comet assay. Overall, Nor βLapachone and IVS 320 were considered such

potential antitumoral compounds that could be better investigated.

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1 – INTRODUÇÃO

1.1 - Incidência mundial de câncer

No ano de 2005, foram registrados 58 milhões de óbitos no mundo dos quais

13% ocorreram devido a algum tipo de câncer. Os casos de mortalidade estão

relacionados principalmente aos cânceres de pulmão (1,3 milhões de mortes/ano),

estômago (1 milhão de mortes/ano), fígado (662.000 mortes/ano), cólon (655.000

mortes/ano) e mama (502.000 mortes/ano). Cerca de 70% destes casos ocorreram em

países em desenvolvimento (WHO, 2006) .

Acredita-se que em 2015 o câncer seja responsável por 9 milhões de mortes, em

2020 trinta milhões de pessoas sejam portadoras desta patologia e em 2030 tenhamos

11,4 milhões de mortes no mundo. As estatísticas globais mostram que os cânceres de

pulmão, estômago, fígado, coloretal, esôfago e próstata são os principais causadores de

mortes em homens, e entre as mulheres, são os cânceres de mama, pulmão, estômago,

coloretal e cervical. O principal responsável por óbitos é o câncer de pulmão, tanto em

países desenvolvidos como em desenvolvimento. Os cânceres de próstata, mama e

colon são mais observados em países desenvolvidos quando comparados a países em

desenvolvimento, onde a maior incidência é de cânceres de fígado, estômago e cervical

(WHO, 2006).

Quase 50% dos casos de câncer podem ser prevenidos através de alimentação

adequada, atividade física e abstinência de tabaco e álcool. A dieta desregulada é

responsável por 30% dos cânceres em países desenvolvidos e 20% dos cânceres em

países em desenvolvimento. Carcinógenos ambientais e agentes infecciosos são

responsáveis por 4% e 18% dos casos de câncer em países desenvolvidos,

respectivamente. O tabaco, é responsável por 30% dos tumores malignos em países

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desenvolvidos, e além de causar o câncer de pulmão, também é um fator de risco para o

câncer de laringe, esôfago e cavidade oral, entre outros. Consumidores passivos de

tabaco também são acometidos pelo câncer de pulmão. Cerca de 2% dos casos de

câncer ocorrem devido a infecções crônicas como hepatite B (HBV) e papiloma vírus

humano (HPV) (WHO, 2006).

A prevenção do câncer é o passo inicial para o controle desta patologia, tendo

como estratégia principal a redução da exposição a fatores de risco. Altas taxas de cura

são observadas em pacientes que obtiveram uma detecção precoce através de testes

laboratoriais e diagnósticos por imagem, e um tratamento adequado que inclui

principalmente quimioterapia e radioterapia (WHO, 2006).

1.2 – Câncer no Brasil

As informações contidas neste trabalho sobre estimativas de câncer no Brasil

foram fornecidas pelo Instituto Nacional do Câncer (INCA) para o ano de 2006. Ainda

não foram disponibilizadas informações confirmando estas estimativas nem tampouco

as estimativas para o ano de 2007.

As estimativas para 2006 apontaram cerca de 472.050 casos novos de câncer,

tendo a região sudeste o maior número de casos (TABELA 1). Em todas as regiões, o

câncer de pele não melanoma apresenta maior incidência (TABELA 2) (INCA, 2005).

No Brasil, a maior incidência no sexo masculino seria o câncer de pele não

melanoma, seguido do câncer de próstata e de pulmão (TABELA 3). No sexo feminino,

o tipo mais incidente seria o de pele não melanoma, seguido do câncer de mama e colo

uterino (TABELA 4) (INCA, 2005).

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TABELA 1. Estimativas para o ano 2006 das taxas brutas de incidência por 100.000habitantes e de número de casos novos por câncer, em homens e mulheres, segundo a região (INCA, 2005).

Estimativa dos Casos Novos Região Masculino Feminino Total

Norte 8.360 8.910 17.270Nordeste 34.290 40.480 74.770Centro-Oeste 14.240 13.910 28.150Sul 53.420 48.690 102.110Sudeste 124.260 125.490 249.750

TABELA 2. Estimativas para o ano 2006 de número de casos novos de câncer, por

região (INCA, 2005).

Localização

Primária Norte Nordeste

Centro-

Oeste Sul Sudeste

Mama Feminina 1.110 7.120 2.520 9.540 28.640

Traquéia, Brônquio

e Pulmão 990 3.350 1.590 7.230 14.010

Estômago 1.260 3.680 1.310 4.670 12.280

Próstata 1.680 8.730 3.050 9.200 24.620

Colo do Útero 1.610 4.410 1.430 3.840 7.970

Cólon e Reto 520 2.450 1.320 5.920 15.150

Esôfago 220 1.230 550 3.180 5.400

Leucemias 510 1.820 630 1.850 4.740

Cavidade Oral 380 2.170 670 2.520 7.730

Pele Melanoma 140 450 240 1.790 3.140

Outras Localizações 4.230 15.560 6.520 27.520 71.020

Subtotal 12.650 50.970 19.830 77.260 194.700

Pele não Melanoma 4.620 23.800 8.320 24.850 55.050

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TABELA 3. Estimativa para 2006 do número de casos novos de câncer em homens(INCA, 2005).

Estimativa dos Casos Novos Estado Capital

Localização Primária Neoplasia maligna

Casos Taxa Bruta Casos Taxa Bruta Traquéia, Brônquio e Pulmão 17.850 19,41 5.300 26,40 Estômago 14.970 16,30 3.950 19,68 Próstata 47.280 51,41 13.980 69,74 Cólon e Reto 11.390 12,36 4.390 21,78 Esôfago 7.970 8,64 1.720 8,47 Leucemias 5.330 5,82 1.570 7,78 Cavidade Oral 10.060 10,91 3.050 15,01 Pele Melanoma 2.710 2,92 830 3,80 Outras Localizações 61.530 66,92 18.370 91,45 Subtotal 179.090 194,77 53.160 264,63Pele não Melanoma 55.480 60,74 13.680 68,13 Todas as Neoplasias 234.570 255,14 66.840 332,62

TABELA 4. Estimativa para 2006 do número de casos novos de câncer em mulheres(INCA, 2005).

Estimativa dos Casos Novos Estado Capital

Localização Primária Neoplasia maligna

Casos Taxa Bruta Casos Taxa Bruta Mama Feminina 48.930 51,66 17.900 80,54 Traquéia, Brônquio e Pulmão 9.320 9,82 2.980 13,38 Estômago 8.230 8,65 2.610 11,55 Colo do Útero 19.260 20,31 6.030 27,11 Cólon e Reto 13.970 14,73 5.370 24,09 Esôfago 2.610 2,74 600 2,43 Leucemias 4.220 4,45 1.360 6,08 Cavidade Oral 3.410 3,58 1.130 4,92 Pele Melanoma 3.050 3,16 940 4,02 Outras Localizações 63.320 66,78 22.750 102,17 Subtotal 176.320 185,95 61.670 276,96Pele não Melanoma 61.160 64,53 15.340 68,92 Todas as Neoplasias 237.480 250,45 77.010 345,94

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A leucemia, neoplasia hematológica que afeta o sangue e a medula óssea e é

caracterizada por uma proliferação anormal das células sanguíneas, especialmente as

células brancas, os leucócitos, encontra-se como o sétimo e sexto câncer mais freqüente

em homens e mulheres, respectivamente (TABELAS 3 e 4). A maior estimativa para os

casos de leucemia por estados brasileiros foi de 9,11 casos para homens e 6,59 casos

para mulheres, no Rio Grande do Sul, para cada 100.000 habitantes. No Rio de Janeiro,

estimou-se 7,66 casos para homens e 5,53 casos para mulheres, para cada 100.000

habitantes (INCA, 2005). Entre as leucemias, a leucemia mielóide crônica representa

cerca de 14% de todas as leucemias e 20% das leucemias de adulto, tendo sua maior

incidência na quarta década de vida, mas podendo também afetar crianças e idosos

(Morrison, 1994; Quintas-Cardama & Cortes, 2006).

1.3 – Tratamento do câncer

Após a confirmação do diagnóstico e antes do início do tratamento deve-se fazer

uma avaliação do paciente para determinar a extensão do câncer, o prognóstico e a

melhor terapia. As estatísticas mostram o aumento da incidência de casos de câncer e

dos recursos em assistência oncológica liberados pelo Sistema Único de Saúde (SUS),

entre os anos de 2000 e 2005. Neste período registrou-se um aumento de 103% nos

gastos federais (TABELA 5). Em 2005, foram contabilizadas 1,6 milhões de consultas

oncológicas ambulatoriais, 423 mil internações por câncer, sendo tratados mensalmente

128 mil pacientes por quimioterapia e 98 mil pacientes por radioterapia (INCA, 2006a).

Somente no ano de 2005 foram aprovados cerca de 1.5 milhões de

procedimentos quimioterápicos em todo Brasil pelo SUS (GRÁFICO 1). Quando

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convertidos em Reais, estes procedimentos atingiram a quantia de aproximadamente R$

900.000.000,00 (GRÁFICO 2). Drogas com alvo molecular específico e radioterapia

também têm mostrado bons resultados, possibilitando a interação dessas drogas com

moléculas mais expressas em células cancerosas e diminuindo efeitos nocivos as células

normais (Ferreira & Rocha, 2004; Vink et al., 2007; Merck co, 2006; INCA, 2006a).

TABELA 5. Gastos federais em assistência oncológica (INCA, 2006a)

Ano Evolução dos gastos (R$)

2000 570.847.495

2001 661.916.854

2002 786.161.628

2003 903.872.011

2004 1.000.135.565

2005 1.159.724.708

A quimioterapia é o método que utiliza compostos químicos, chamados

quimioterápicos, que atuam com diferentes mecanismos de ação detendo a

multiplicação celular. Os avanços verificados nas últimas décadas, na área da

quimioterapia antineoplásica, têm facilitado consideravelmente a aplicação de outros

tipos de tratamento de câncer e permitido maior número de curas (INCA, 2006b).

Os agentes quimioterápicos utilizados no tratamento do câncer são originalmente

sintéticos, semi-sintéticos ou naturais, sendo divididos em cinco classes diferentes,

agentes alquilantes, antimetabólitos, produtos naturais, agentes diversos e hormônios e

antagonistas (Hardman & Limbird, 2005).

Os agentes antineoplásicos são atualmente utilizados de forma combinada

atuando em processos metabólicos diferentes e aumentando a probabilidade de

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erradicação das células cancerosas, além de apresentarem menor toxicidade, já que são

utilizados em uma dosagem menor quando comparados ao seu uso separadamente

(Hardman & Limbird, 2005).

GRÁFICO 1. Procedimentos quimioterápicos aprovados pelo SUS. (INCA, 2006a)

GRÁFICO 2. Valores em Reais para os procedimentos quimioterápicos. (INCA, 2006a)

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Os agentes quimioterápicos utilizados no tratamento do câncer muitas vezes não

são tolerados pelos pacientes. Atualmente, são testados tratamentos que utilizam

nanopartículas magnéticas como carreadores de agentes antitumorias, que são injetados

na circulação e atingem o tecido tumoral alvo com pequena contaminação de tecidos

normais. Grande quantidade da droga é retida no tecido alvo através de um campo

magnético, favorecendo o tratamento e diminuindo os efeitos colaterais (Alexiou et al.,

2006).

Devido à observação de regressão de tumores utilizando componentes do

sistema imunológico, estão sendo desenvolvidas novas estratégias em imunoterapia

anticâncer. A interlecina 2 (IL2), uma citocina humana que estimula linfócitos, não

demonstrou atividade antineoplásica in vitro, porém se mostrou capaz de estimular

linfócitos T com atividade antitumoral in vivo. O tratamento com IL2 levou à regressão

não só de alguns tipos de câncer como de tumores metastáticos (Rosenberg, 2001).

Embora exista um grande número de agentes quimioterápicos, a eficácia destes

agentes para o tratamento do câncer ainda está distante de ser alcançada. Vários fatores

como: a heterogeneidade da doença que compreende cerca de 100 tipos de cânceres e a

resistência intrínseca ou adquirida aos quimioterápicos depois de pouco tempo de

tratamento dificultam o uso de apenas um agente quimioterápico (Cozzi et al., 2004).

1.4 – Câncer, aspectos gerais.

O câncer é uma doença resultante de alterações genéticas, ou seja, que causam

modificações na estrutura do DNA (ácido desoxirribonucléico), ou epigenéticas, que são

capazes de alterar a constituição química do DNA não alterando diretamente a

seqüência de nucleotídeos. Geralmente, os genes atingidos estão relacionados aos

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processos de indução e controle do ciclo de divisão celular e/ou um desequilíbrio no

controle da morte celular programada. (Ferreira & Rocha, 2004; Alberts et al., 2004).

Entre os anos de 2001 e 2003 foram identificados na literatura pertinente cerca

de 80 genes associados a quimiosensibilidade in vitro de linhagens celulares tumorais

sendo caracterizados como potencias candidatos que podem auxiliar no estabelecimento

de testes de quimiosensibilidade. As funções celulares dos genes variaram de acordo

com o tipo celular e as condições experimentais. Dentre as proteínas codificadas foram

observadas proteínas transportadoras, detoxificadoras, reparadoras de DNA, reguladoras

do ciclo celular e reguladoras da apoptose, entre outras. Algumas proteínas são

relativamente específicas para uma droga (Cisplatina, Etoposídeo etc) ou tipo celular.

Os genes TP53 e BCL2 foram associados a apoptose. Do ponto de vista celular, várias

vias envolvendo diferentes genes podem agir antagonicamente ou complementando-se

na determinação da quimiosensibilidade da célula (Sekine et al., 2007).

Os pontos de checagem presentes em todas as fases do ciclo celular atuam como

protetores da integridade genômica. Através destes pontos, eventuais danos no DNA são

reconhecidos e vários mecanismos podem ser ativados para reparar o dano, e quando

este for irreversível ou as condições forem adversas ao seu crescimento a célula é

induzida a entrar em apoptose (Li et al., 2003).

As alterações estruturais e/ou funcionais de genes controladores do ciclo celular

podem ser decorrentes da amplificação e ativação de proto-oncogenes, ou mutações que

levem à perda ou inativação de genes supressores de tumor (Ferreira & Rocha, 2004;

Pasternak, 2002; Alberts et al., 2004).

O genoma humano possui dinucleotídeos citosina-fosfoguanina distribuídos

uniformemente, formando as ilhas CpG. Após a replicação, um grupamento metil (CH3)

é adicionado a extremidade 5’ do dinucleotídeo CpG. A expressão do gene é regulada

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por endonucleases, sendo este silenciado quando as ilhas CpG são metiladas. São

gerados padrões de metilação por DNA metiltransferases (DNMTs) que transferem um

grupo metil a partir da adenosilmetionina (SAM). A hipometilação está associada a

reativação de genes e instabilidade cromossômica, podendo levar a ativação de proto-

oncogenes. A hipermetilação está associada a repressão de genes e instabilidade

cromossômica, podendo levar a supressão de genes de reparo do DNA e supressores de

tumor, além de condensação da cromatina. Tanto a hipo como a hipermetilação estão

relacionadas a vários tipos de câncer (FIGURA 1) (Agrawal et al., 2007).

FIGURA 1. Tipos de metilação (Agrawal et al., 2007)

Tipos de Metilação

Hipometilação Hipermetilação

Instabilidade cromossômica

Repressão gênica

Reativação gênica

Global

Regional

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Indivíduos portadores de alguns tipos de câncer podem produzir marcadores

tumorais, que são produzidos pelo próprio tumor, pelo tecido adjacente ao tumor ou

pelo tecido acometido por metástase. Os marcadores tumorais compreendem DNA,

RNA, proteínas, antígenos e hormônios que podem ser detectados através de ensaios

como a reação da polimerase em cadeia (PCR), western e northern blot. Em estágios

precoces do tumor os marcadores tumorais podem estar em níveis baixos, porém os

testes capazes de detectá-los se propõem em apontar indivíduos sadios que apresentem

condições de desenvolver este tipo de doença, ou que já estejam com a doença em curso

numa forma sub-clínica. A utilização destes marcadores como agentes de diagnóstico é

muito importante pois pode se constituir num elemento de diagnóstico muito precoce,

bem como pode monitorar a eficiência do tratamento ao qual o indivíduo está submetido

(Voorzanger-Rousselot & Garnero, 2007).

Para o desenvolvimento da carcinogênese basta que uma célula alterada por uma

mutação entre em processo de expansão clonal. Estas células passam a se reproduzir

desordenadamente e formam agregados chamados de tumores benignos, ou invadem

tecidos adjacentes, chamados de tumores malignos ou câncer.

As metástases são formadas pela disseminação de uma célula cancerígena e sua

penetração em outros tecidos formando tumores secundários. A aquisição de um

fenótipo migratório pela célula tumoral representa um fator determinante para sua

capacidade invasiva e metastática. A conversão de uma célula normal em tumoral é

acompanhada pela ativação de várias vias oncogênicas. No processo de transformação

maligna há uma remodelagem do estroma, onde células como macrófagos e fibroblastos

liberam fatores solúveis que influenciam o crescimento e a angiogênese. Para que

ocorra o processo invasivo, a adesão entre as células adjacentes e a integridade da

membrana são perdidas devido a ação de metaloproteinases, permitindo que a célula

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transformada se solte da massa tumoral, chegue ao sistema linfático ou circulação

sanguínea e se instale em outros sítios (Mimeault & Batra, 2007; Alberts et al., 2004).

1.5 – Mecanismo de ação dos quimioterápicos contra o câncer

A mostarda nitrogenada, utilizada durante a 1ª. Guerra Mundial, representa um

dos tipos de agentes alquilantes que são capazes de interagir diretamente com a

estrutura do DNA, danificando-a. Atualmente, mostardas nitrogenadas (Ex.

Ciclofosfamida), triazanos e nitrosuréias, entre outros, são agentes alquilantes utilizados

no tratamento anticâncer. Os antimetabólitos são representados por agentes análogos de

purinas, pirimidinas e ácido fólico, capazes de alterar a síntese ou função dos ácidos

nucléicos, agindo em enzimas-chave como a DNA polimerase. A actinomicina D

(extraída da espécie Streptomyces) e o Etoposídeo (derivado semi-sintético da

podofilotoxina), são agentes da classe dos produtos naturais capazes de se ligar de

forma estável ao DNA, bloqueando a ação da RNA polimerase e da topoisomerase,

respectivamente. A Cisplatina (cis-diaminodicloroplatina), caracterizada como um

agente diverso, foi descoberta ocasionalmente em 1965 e demonstrou inibir a replicação

de Escherichia coli. Posteriormente, foi testada em sistemas tumorais e mostrou sua

capacidade antineoplásica através de ligações cruzadas intra e interfilamentares, que

promoveram a inibição da replicação e transcrição do DNA. Outro composto contendo

platina em sua estrutura química, a Carboplatina foi aprovado para o tratamento de

câncer no final da década de 80. A terapia anticâncer também utiliza hormônios como a

Dexametasona, caracterizada como um quimiosensibilizador capaz de potencializar a

atividade antitumoral de agentes como a Carboplatina. Quando administrada

isoladamente, a Dexametasona apresentou reduzida capacidade de inibir o crescimento

tumoral (Hardman & Limbird, 2005; Wang et al., 2004).

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1.6 – Origem dos quimioterápicos antineoplásicos naturais

Os quimioterápicos Etoposídeo, Vincristina, Vimblastina, Tenoposídeo e Taxol

foram introduzidos ao longo dos últimos vinte anos no tratamento do câncer, reforçando

o interesse de indústrias farmacêuticas em produtos de origem natural (Viegas &

Bolzani, 2006).

Na década de 60, a Camptotecina foi isolada da árvore chinesa Camptotheca

acuminata, e anos mais tarde mostrou sua atividade citotóxica através da inibição da

topoisomerase I. Porém, a Camptotecina apresentou reduzida solubilidade não sendo

utilizada pela indústria farmacêutica. Foram então desenvolvidos análogos da

Camptotecina (Ex. Topotecan) mais solúveis em água, aprovados em 1996 pela Food

and Drug Adminisration (FDA) para o tratamento do câncer de cólon e ovário (Viegas

& Bolzani, 2006).

O Taxol, descoberto em 1966, apresentou atividade citotóxica in vitro, porém

em função de sua estrutura complexa e dificuldade de fontes naturais (10 toneladas de

casca de Taxus brevifolia: 1 Kg Taxol), seu uso foi interrompido. Cerca de 15 anos

depois, outros taxanos foram descobertos e apresentavam concentração e rendimento

superiores ao do Taxol. Em 1988 foi proposta uma rota semi-sintética para o Taxol, que

foi suplantada em 1994 por outra rota também semi-sintética mais eficiente (Viegas &

Bolzani, 2006).

Atualmente, a procura por novos agentes antitumorais tem se tornado cada vez

mais necessária visando sua maior eficácia e menor efeito citotóxico em tecidos

normais. Na última década, quimioterápicos derivados de bactérias (Adriamicina),

plantas (Lapachol, Taxol), organismos e microorganismos marinhos, entre outros, têm

apresentado resultados bastante satisfatórios (Subramanian et al., 2006). O tratamento

de várias doenças utilizando como base produtos naturais é observado há muitos anos

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na medicina popular. Partindo desta tradição a utilização de medicamentos produzidos a

partir de plantas no tratamento do câncer tornou-se uma constante, confirmada pelo fato

de cerca de 62% de drogas comercializadas para o tratamento do câncer entre 1983 e

1994 serem de origem natural (Ravelo et al., 2004).

1.7 – Avaliação de novas drogas

O desenvolvimento e avaliação de novas drogas tornaram-se uma prática cada

vez mais necessária visando o tratamento e cura de várias doenças potencialmente

fatais.

Inicialmente, o estudo consiste na extração ou síntese de uma molécula da nova

droga. No caso de ser proveniente de síntese, a identificação desta nova droga é feita a

partir da modificação química de uma molécula já conhecida. A atividade e seletividade

da droga é feita através de uma triagem que utiliza vários ensaios biológicos in vitro e in

vivo, definindo seu perfil farmacológico e comparando-o ao de compostos de referência.

O composto obtido a partir dos ajustes da molécula inicial, pode então ser submetido a

testes pré-clínicos, como a determinação da toxicidade aguda e crônica. A avaliação de

novos medicamentos para seres humanos deve levar em consideração alguns fatores

que, eventualmente podem alterar o estudo em questão: 1, as exacerbações e remissões

em algumas doenças que são capazes de levar a oscilações de sua gravidade; 2, a

presença de outras doenças que poderiam influenciar a avaliação e 3, a tendência dos

pacientes a responder positivamente a um tratamento (resposta placebo) (Katzung,

2003).

Os pacientes são submetidos a quatro fases de estudo clínico. Na fase um,

geralmente em voluntários sadios, são comparadas as respostas em animais e seres

humanos, estabelecidos os limites prováveis de faixa posológica segura e determinados

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absorção, meia-vida e metabolismo. Na fase dois, é utilizado um grupo menor de

pacientes sendo agora portadores da doença-alvo e avaliando de forma mais

aprofundada as toxicidades da droga estudada. Na fase três, o estudo pode abranger

milhares de pacientes, possibilitando o melhor estabelecimento da segurança e eficácia

da droga. A partir desta fase, desde que autorizado pelo órgão responsável, pode-se

comercializar a nova droga, sendo implantado um serviço de monitoramento,

característico da fase quatro. No caso específico das drogas antineoplásicas com

atividade potencial que não exibem toxicidade excessiva, são realizados os estudos de

fase I em pacientes com câncer avançado e as etapas posteriores são geralmente

aceleradas (Katzung, 2003).

Como um dos órgãos internacionais de grande relevância para o teste de novas

moléculas com potencial atividade antitumoral tem-se o Programa de Desenvolvimento

Terapêutico (DTP) do National Cancer Institute (NCI), que opera testes in vitro e in

vivo com o objetivo de identificar e avaliar novas drogas e mecanismos de ação

(National Cancer Institute, 2007). Este serviço, implementado desde Abril de 1990

para testar compostos com atividades antitumorais, utiliza um painel de 59 células

tumorais in vitro formado de nove tipos de cânceres, entre eles, leucemia, melanoma,

cânceres de pulmão, cólon, cérebro, ovário, mama, próstata e fígado. O objetivo é

priorizar avaliações mais profundas em compostos sintéticos e naturais que mostrem

inibição do crescimento celular ou morte em linhagens de células tumorais (Shoemaker,

2006).

Nessa triagem o ensaio é composto por duas fases, começando com a avaliação

de todos os compostos contra as linhagens celulares do painel em uma dose única (10-5

M). Os compostos que exibem inibição de crescimento significante são avaliados contra

as células do painel em cinco níveis de concentração. Dentre as cinco linhagens de

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células leucêmicas presentes no painel de células do NCI, a K562 se encontra presente,

sendo a única representante de leucemia mielóide crônica (Shoemaker, 2006).

1.8 – Atividade antineoplásica de naftoquinonas

As quinonas são classificadas de acordo com o sistema aromático presente em

sua estrutura, tendo as naftoquinonas um anel naftalênico característico (Figura 2) (Silva

et al., 2003).

o-naftoquinona p-naftoquinona

benzeno naftaleno antraceno

FIGURA 2. Classificação das quinonas (Silva et al., 2003).

OO

OOH

O

Lapachol

O

O

OH

Lausona

O

O

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Vários estudos têm demonstrado a ação de naftoquinonas, como Lapachol

(Tabebuia sp) e a Lausona (Lawsonia sp) e seus derivados como agentes

antineoplásicos. A βLapachona, uma orto-naftoquinona, têm sido amplamente estudada

principalmente por apresentar efeitos seletivos em linhagens tumorais quando

comparados a linhagens normais. Vários mecanismos de ação das naftoquinonas se

apresentam de forma dose e tempo-dependente. A inibição do crescimento celular

observada, pode ocorrer em função da indução da apoptose, inibição da topoisomerase

II ou estresse oxidativo, entre outros (Choi et al., 2003; Silva et al., 2003; Kongkathip et

al., 2003; Li et al., 2003; Woo & Choi, 2005; Reinicke et al., 2005).

As naftoquinonas foram descritas como responsáveis por uma significante

redução do crescimento celular em linhagens tumorais quando conjugadas a outros

agentes, como o Tiosemicarbazone (NTQS) e seus complexos formados com metais. A

citotoxicidade do NTQS associada ao cobre, por exemplo, mostrou ser maior que a do

Etoposídeo, quimioterápico usado na clínica (Chen et al., 2004).

Vários estudos têm relatado a importância da atividade antitumoral das

naftoquinonas. A βLapachona destaca-se neste âmbito e sua atividade biológica justifica

a continuidade dos estudos com naftoquinonas e seus derivados, como a 2-fenil-

βLapachona e ésteres de naftoquinonas, agentes ativadores do estresse oxidativo e

inibidores de topoisomerase II, respectivamente (Kongkathip et al., 2004; Kongkathip et

al., 2003).

A Lausona (2 hidroxi-1,4-naftoquinona), também classificada como orto-

naftoquinona, mostrou-se capaz de inibir in vitro o crescimento celular, bloqueando

principalmente na fase S o ciclo de células derivadas de carcinoma de colon humano

(HCT 15) (Kamei et al., 1998).

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1.9 – Propriedades farmacológicas dos triazóis

Os triazóis são heterocíclicos aromáticos nitrogenados de cinco membros

contendo um ou mais átomos de hidrogênio, sendo denominados genericamente de azol.

Várias publicações têm descrito a atividade biológica dos triazóis. Dentre as atividades

farmacológicas dos heterocíclicos nitrogenados, podemos citar sua ação como fármaco

antiviral (Ribavarina), antifúngico (Fluconazol), antiinflamatório e analgésico

(Dipirona) e antitumoral (Carbamato de fluorouracila), entre outros (Melo et al., 2006).

Partindo da necessidade de se identificar novos agentes antineoplásicos, que

tenham ação seletiva e seus efeitos adversos minimizados, fizemos no presente estudo

uma análise “in vitro” de triazóis, ácido pirazolil acrílico, naftoquinonas e outros

derivados do Lapachol e da Lausona, como possíveis agentes citotóxicos às linhagens

tumorais.

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2 – OBJETIVOS

2.1 - Objetivo geral

Avaliar o potencial antitumoral de substâncias provenientes de síntese química

cedidas pelo professor Vitor Francisco Ferreira do Departamento de Química Orgânica

da Universidade Federal Fluminense e investigar as ações biológicas dos compostos

com maior atividade citotóxica..

2.2 - Objetivos específicos

- Avaliar o potencial antitumoral de naftoquinonas e derivados, triazóis e do

Ácido Pirazolil Acrílico

- Avaliar a viabilidade celular por MTT

- Calcular a dose que mata 50% das células (IC50)

- Avaliar a fragmentação do DNA característica da apoptose

- Avaliar a síntese protéica

- Avaliar a genotoxicidade das drogas através do teste do cometa.

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3 – MATERIAL E MÉTODOS

3.1 – Manutenção das linhagens celulares utilizadas no estudo

A linhagem celular K562, cedida pelo Instituto Nacional do Câncer (INCA), e a

linhagem celular HEP2, cedida pela Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ) foram

mantidas em garrafas de poliestireno (TPP) de 25 cm2 ou 75 cm2 com tampa de rosca,

obtendo um volume final de 10 mL ou 30 mL, respectivamente em meio DMEM alta

glicose com glutamina (CULTILAB), acrescido de 10 % de soro fetal bovino

(SORALI) previamente inativado a 56 ºC por 1 hora. Também foram acrescentados

para cada litro de meio 0,06 grama de penicilina G (CULTILAB), 0,1 grama de

estreptomcina (CULTILAB), 1 mL de anfotericina B (2,5 mg/mL – FUNGIZON/

BRISTOL-MYERS SQUIBB), 2,25 gramas de NaHCO3 (REAGEN) e HCl 1N

(REAGEN) para ajustar o pH até 7,6. As células eram repicadas duas vezes por

semana, em fluxo laminar (TROX MODELO FLV SÉRIE 491) previamente limpo com

álcool 70 % e iluminado por luz UV por 30 minutos. Em cada repique da linhagem

K562, foram mantidas 2x104 células/mL, após quantificação em hemocitômetro de

Neubauer (BOECO GERMANY 1/10 mm), em garrafas de poliestireno (TPP) de 25

cm2 ou 75 cm2 com tampa de rosca, obtendo um volume final de 10 mL ou 30 mL,

respectivamente. A linhagem HEP2 tinha seu meio desprezado, era lavada por duas

vezes com PBS/EDTA e mantida por 5 minutos com tripsina 0,25% a 37ºC. Após o

acréscimo de meio as células eram quantificadas em hemocitômetro de Neubauer, e

repicadas na concentração de 2x104 células/mL em garrafas de poliestireno de 25 cm2.

As culturas eram visualizadas em microscópio invertido (NIKON ECLIPSE TS100) e

mantidas em estufa (FANEM MODELO 002CB) a 37 ºC.

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21

3.2 – Substâncias Testadas

Os triazóis, o Ácido Pirazolil Acrílico e as naftoquinonas, derivadas do Lapachol

e da Lausona, foram cedidos pelo Prof. Vitor Francisco Ferreira, do Departamento de

Química Orgânica do Instituto de Química da Universidade Federal Fluminense (UFF).

A partir do Lapachol marca PVP, foi feito o processo de purificação por Soxhlet com

solvente hexano, segundo Ferreira, 1996. Em seguida, o extrato foi evaporado sob

pressão reduzida em evaporador rotatório, obtendo-se o Lapachol puro.

Além do Lapachol purificado, foram testadas substâncias sintetizadas a partir

dele, a αLapachona, Epóxi αLapachona, βLapachona, Triacetato e Nor βLapachona

(FIGURA 3A). Também foram testadas a Lausona pura da marca Aldrich e três

substâncias sintetizadas a partir dela: Metóxi, Epóxi Metóxi e IVS 320 (Figura 3B e

C)(Ferreira, 1996). Todas as substâncias foram mantidas em uma concentração estoque

de 50 mM, a 4 ºC, após diluição em dimetil sulfóxido (DMSO - SIGMA).

A nomenclatura oficial das naftoquinonas encontram-se no anexo 1, e as

estruturas dos triazóis encontram-se no anexo 2.

3.3 – Avaliação da viabilidade celular

3.3.1 - Citotoxicidade celular

A triagem das substâncias com potencial efeito citotóxico foi feita através do

teste colorimétrico utilizando MTT, descrito por Mosmann (1983). O ensaio avalia a

capacidade de células metabolicamente ativas de reduzirem o MTT, convertendo os sais

amarelos de tetrazolium (3-(4,5-Dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazol brometo) a

cristais de formazan, de cor púrpura. Após a solubilização dos cristais, a quantificação

foi realizada em leitor de microplacas (ANTHOS 2010) a 570 nm (Mosmann, 1983)

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22

O

O

O H

H O

OO

H

H

OOH

O

+

FIGURA 3. Rota de síntese das naftoquinonas utilizadas no estudo. A partir do (A)

lapachol e (B e C) da lausona.

OOH

O

Lapachol

OAcOAc

OAc

Triacetato

Zinco metálico

Anidrido acético

H2SO4

OO

O

β-Lapachona

CH2N2

Éter Etílico

OO

O

Epoxi-beta

OO

Oα-Lapachona

CH2N2

Éter Etílico

OO

OEpoxi-alfa

HClÁcido Acético

OO

O

Sulfônica

H2SO4Anidrido Acético

CH2N2

Éter EtílicoSO3H

OO

OSO3Me

OO

OSO3Me

+

EstersulfônicaEpóxi-sulfônicaOOH

O

Lapachol

OOH

ONor-lapachol

O

OOH2SO4

O

OOCH2N2

Éter Etílico

Nor-betalapachona Epóxi-norbeta

O

O

OHO

O

OAg1) NH4OH

2) HNO33) AgNO3

Tolueno, CH3I

O

O

OO

O

OCH2N2

Éter Etílico

Metóxi Epóxi-metóxiSal de Prata da Lausona

Lausona

1)H2O2/ dioxano, 70 oC

2)HCl/ SO2/ N2

3)NaOH/ CuSO4/ HCl

A

B

C

IVS 320 Lausona

IVS 322

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No ensaio de citotoxicidade foram utilizadas 2x104 células/poço, em placa de 96

poços, incubadas com as substâncias por 20 horas, a 37 ºC. Imediatamente após, 10 μl

da solução de MTT (5 mg/mL – SIGMA) diluídos em meio de cultura DMEM sem

soro, foram acrescentados às culturas tratadas, e estas incubadas por um período de 4

horas, a 37 ºC. Após o período total de incubação, 24 horas, foram adicionados 100 μl

de solução de duodecil sulfato de sódio (SDS - NUCLEAR) 10% e ácido clorídrico

(HCl - REAGEN) 0,01 N, e o experimento mantido overnight, a 37 ºC. A densidade

óptica de cada poço foi obtida a 570 nm, possibilitando determinação do potencial

citotóxico de cada substância testada em relação ao controle não tratado. Os ensaios

foram realizados em triplicatas, e cada experimento repetido três vezes com as

substâncias nas concentrações de 6,25 μM, 12,5 μM, 25 μM, 50 μM, 100 μM e 200

μM. Foram utilizados controles negativos com DMSO e sem DMSO, além do controle

positivo contendo o quimioterápico comercial Etoposídeo (DARROW).

3.3.2 – Determinação do IC50

Os resultados dos valores de absorvância foram convertidos em porcentagem de

viabilidade celular onde as células em presença de DMSO correspondiam a 100% de

viabilidade. A análise de regressão foi realizada nos resultados de viabilidade,

resultando em uma equação usada para calcular a concentração de substância necessária

para produzir 50 % de redução de viabilidade celular (IC50).

3.4 – Avaliação do mecanismo de ação das substâncias

Após a avaliação da citotoxicidade, as substâncias com maior atividade

citotóxica foram selecionadas e avaliadas quanto ao mecanismo de ação. Nesses testes

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foram avaliadas as substâncias: Epóxi α Lapachona, βLapachona, Nor βLapachona,

IVS 320, Metóxi, e Etoposídeo.

3.4.1 – Avaliação da síntese protéica

Com o objetivo de analisar possíveis alterações na biossíntese de proteínas, na

presença das substâncias selecionadas, a linhagem celular K562 foi incubada com

metionina radioativa 25uCi/mL (35S-Metionina 47Ci/mmol), a 37ºC, em uma atmosfera

de 5% de CO2. A partir da comparação entre os níveis de incorporação de metionina 35S

do controle não tratado e das culturas tratadas, era possível detectar se havia alguma

alteração na produção de proteínas celulares.

No experimento, 105 células em um volume final de 300μl foram incubadas com

as substâncias Epóxi α Lapachona, βLapachona, Nor βLapachona, IVS 320 e Metóxi na

concentração final de 50 μM, por 2 horas a 37 ºC. O Etoposídeo, também na

concentração de 50 μM, foi usado como controle positivo. Após a incubação, foi feita

uma centrifugação a 2000 rpm por 3minutos a 4 ºC. O sobrenadante foi retirado e as

células ressuspensas em 200μl de meio de cultura (MEM - CULTILAB) sem metionina,

contendo a substância em teste na concentração de 50 μM. Em seguida, foram

adicionados 20 μl de metionina 35S (40μCi/mL - AMERSHAN), totalizando 220 μl. As

células foram incubadas por 2 horas a 37 ºC. Após centrifugação, as células foram

lavadas e incubadas com 100 μl de tampão de lise (Tris-HCl pH.:8,5 2M; NaCl 5mM;

SDS 20%; EDTA 250Mm.), 100 μl de ácido tricloroacético (TCA) 10 %, agitação e

incubação por 20 minutos a 4 ºC. Posteriormente, foram adicionados 400 μl de água

mili-Q e 500 μl de TCA 20 %. Cada amostra foi filtrada utilizando-se filtro GFA

(WHATMAN) 0,22μm, onde os filtros eram lavados três vezes com TCA 5 % seguido

de uma lavagem com etanol absoluto. Cada filtro foi colocado em um tubo para secar a

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temperatura ambiente. Após a secagem, cada filtro foi colocado em um tubo de

cintilação com 3 mL de solução cintiladora e contado em cintilador (Carvalho et al.,

2005).

3.4.2 – Avaliação da apoptose por fragmentação do DNA

As substâncias selecionadas foram testadas na concentração de 50 μM, por 4 e

24 horas. Após o tratamento, as células tiveram o DNA extraído e analisado quanto à

fragmentação do DNA, em gel de agarose.

Para cada substância foram utilizados dois poços de placas de 6 poços (TPP),

com 2 mL de células na concentração de 2x106 células/mL.

Após incubação, as células foram centrifugadas a 3000 rpm por 10 minutos, o

sobrenadante descartado e o precipitado lavado 2 vezes com PBS (NaCl, KCl,

Na2HPO4.7H2O, KH2PO4) 1X. Após descarte do sobrenadante, foram adicionados 100

μl de solução de digestão (50 mM Tris pH=8,0; 10 mM EDTA; 0,5% SDS ) com 20 μl

de proteinase K (25 mg/mL - GIBCO), a amostra transferida para um eppendorf e

mantida por 48 horas em banho-maria a 56ºC. Adicionou-se 5 μl RNAse A (0,5 mg/mL

- GIBCO) e as amostras foram mantidas por mais 24 horas em banho-maria, a 37ºC.

Após 72 horas de incubação, as amostras foram centrifugadas a 12000 rpm por 5

minutos a 4ºC. As proteínas não digeridas, presentes no sobrenadante, foram extraídas

com 125 μl da mistura de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25:24:1), seguido de

centrifugação a 12000 rpm por 5 minutos a 4ºC. A fase aquosa, contendo o DNA, foi

retirada e estocada a 4ºC. Para visualização do DNA extraído, utilizou-se gel de agarose

a 2% (BIOAMÉRICA) dissolvida em TAE 1X (0,04 M Tris acetato; 0,002 M EDTA -

pH 8,5) e acrescido de 5μg/mL de brometo de etídio (SIGMA). Foram também testados

o Etoposídeo na concentração de 50μΜ e a Dexametasona nas concentrações de 1 e 10

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μΜ (4 e 24 horas de incubação), e 100 e 200 μΜ (24 horas de incubação). Este método

foi realizado como descrito por Chau (1998).

3.4.3 – Avaliação de lesões oxidativas pelo teste do cometa

O presente teste teve como objetivo detectar possíveis lesões na estrutura do

DNA de células tratadas com as substâncias, após o uso de detergentes e altas

concentrações de sais, que permitem ao DNA desprovido de histonas e aderido à matriz

nuclear residual, migrar ou não quando submetido à eletroforese. De acordo com o

perfil de migração, é possível avaliar o dano causado por cada substância, já que células

sem danos em seu genoma ficariam com seu DNA retido na região anteriormente

ocupada pelo núcleo da célula, e células com danos em seu genoma apresentariam

caudas como conseqüência da migração de fragmentos do DNA.

Foi realizado um controle negativo com DMSO, visto que o DNA pode sofrer

lesões devido ao próprio metabolismo celular. Utilizando a metodologia descrita por

Dantas (2002), 2 mL culturas com densidade de 2x105 células/mL, foram plaqueadas

em placas (TPP) de 24 poços com dois poços para cada substância. As substâncias

selecionadas foram analisadas em uma concentração final de 50 μM e incubadas por

duas horas a 37 ºC. Após a incubação, duas alíquotas de 1 mL foram retiradas de cada

poço e centrifugadas a 3000 rpm por 5 minutos a 4ºC. Cada uma das alíquotas teve suas

células ressuspensas em 100 μl de meio onde, uma teve suas células contadas e a outra

foi utilizada no preparo das lâminas para o teste do cometa como descrito a seguir:

- Para realização da contagem, 20 μl das células foram adicionadas a outro eppendorf

contendo 20 μl do corante vital azul de tripan (REAGEN) e 10 μl da mistura foram

contadas em câmara de Neubauer.

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- Para realização do teste do cometa 20 μl da amostra de células foram adicionadas a

outro eppendorf contendo 240 μl de agarose de baixo ponto de fusão (GIBCO BRL) a

37 ºC e homogeneizados. Um total de 120 μl da mistura foram aplicados em cada

lâmina (25,4 x 76,2 mm com borda fosca) previamente lavada em etanol absoluto, seca,

banhada em agarose 1,5 % (GIBCO) e mantida horizontalmente overnight a temperatura

ambiente. Cada lâmina foi coberta com uma lamínula (24 x 50 mm) e incubada por dez

minutos a 4ºC. Após incubação, as lamínulas foram retiradas e as lâminas colocadas

verticalmente em uma cuba com solução desnaturante (NaCl 2,5M; TRIS 10 mM;

EDTA 100 mM; NaOH; Lauril sarcosinato sódio 1 %), overnight, a 4 ºC em ausência de

luz. Ainda em ausência de luz, as lâminas foram dispostas horizontalmente em uma

cuba com tampão de eletroforese (NaOH 300 mM; EDTA 1 mM) e incubadas por 25

minutos. Em seguida feita uma corrida de 25 minutos (25 volts/300 miliamperes). As

lâminas foram retiradas, colocadas em um suporte horizontal e lavadas com tampão de

neutralização (TRIS 0,4 M) por 1 minuto, seguido de lavagem com etanol absoluto por

1 minuto e uma lavagem com água milli-Q. As lâminas foram deixadas à temperatura

ambiente para secagem. Após secagem, foi adicionada solução corante (brometo de

etídio 40 μg/mL) e foi feita a leitura em microscópio de fluorescência. Para análise da

viabilidade celular, retirou-se todo sobrenadante, o precipitado foi ressuspenso em 100

μl de meio e quantificado com azul de tripan.

3.5 – Análise estatística

Diferenças estatísticas entre as várias substâncias foram feitas por diferentes

testes. A regressão logarítmica e os gráficos foram feitos no programa Excel, as

comparações entre as substâncias no teste com MTT foram feitas pelo teste de Fisher, e

as análises no teste de genotoxicidade foram feitas pelo teste de Turker.

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28

4 – RESULTADOS

4.1 Avaliação da viabilidade celular

4.1.1 - Citotoxicidade celular

Foram testadas 27 substâncias pertencentes a diferentes classes químicas (10

naftoquinonas – estruturas no capítulo de material e métodos; 16 triazóis e o Ácido

Pirazoil Acrílico provenientes de síntese química, nas linhagens K562 e HEP2. O

Etoposídeo, quimioterápico comercial, foi utilizado como controle positivo dos testes de

viabilidade celular. Das substâncias avaliadas a classe das naftoquinonas promoveu

maior citotoxicidade celular (TABELA 6).

A partir da análise de citotoxicidade, foram selecionadas 5 naftoquinonas ou

derivados com maior potencial citotóxico na concentração de 50 μM, em um período de

incubação de 24 horas, βLapachona , Epoxi αLapachona, Nor βLapachona, IVS 320 e

Metoxi, na linhagem K562 (GRÁFICO 3). A linhagem celular HEP2, apresentou maior

resistência a algumas substâncias que foram citotóxicas à K562 (GRÁFICO 4). O

Etoposídeo e a β Lapachona foram avaliados em ambas as linhagens tendo seus

resultados de viabilidades adicionados aos das naftoquinonas mais citotóxicas

(GRÁFICOS 3 e 4). As outras substâncias testadas (Triazóis e Ácido Pirazolil Acrílico)

apresentaram pequena redução da viabilidade celular tanto na linhagem K562 como na

HEP2, por esse motivo, não foram utilizadas em nenhuma avaliação posterior deste

trabalho (TABELA 7).

Em 50 μM, a Nor βLapachona caracterizou-se como a substância mais

citotóxica, com 67,1 ± 9,5% de viabilidade celular, na linhagem K562.

No experimento com HEP2, a Metoxi foi a substância que exibiu maior

citotoxicidade, com 70,2% ± 8,5 de viabilidade celular.

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TABELA 6. Viabilidade celular (%) nas linhagens K562 e HEP2 tratadas com

naftoquinonas na concentração de 50 μM por 24 horas.

SUBSTÂNCIAS K562 HEP2

Etoposídeo 88,2 ± 16,5 91,1 ± 8,8

α-Lapachona 85,7 ± 8,8 103,7 ± 13,0

β−Lapachona 83,0 ±24,5 74,0 ± 12,7

Epoxi α-Lapachona 74,3 ± 4,2 78,0 ± 12,9

Nor β− Lapachona 67,1 ± 9,5 87,3 ± 31,5

Triacetato 89,0 ± 8,5 93,7 ± 22,5

IVS 320 70,7 ± 7,3 99,8 ± 5,8

Metoxi 72,1 ± 8,1 70,2 ± 8,5

Epoxi metoxi 85,9 ± 10,5 103,7 ± 12,9

Lapachol 95,5 ± 7,5 104,5 ± 8,3

Lausona 97,0 ± 5,9 98,3 ± 18,3

GRÁFICO 3. Viabilidade celular em presença das naftoquinonas com maior

potencial citotóxico (50 μM) na linhagem K562 em 24 horas.

Etop

Lap

Epox

i La

p

Nor

L

ap

IVS

320

Met

oxi

0

20

40

60

80

100

concentração μM

viab

ilida

de c

elul

ar (%

)

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30

Etop

Lap

Epox

i La

p

Met

oxi

0

20

40

60

80

100

concentração μM

viab

ilida

de c

elul

ar (%

)

GRÁFICO 4. Viabilidade celular em presença das naftoquinonas com maior

potencial citotóxico (50 μM) na linhagem HEP2 em 24 horas.

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TABELA 7. Viabilidade celular (%) de triazóis na concentração de 50 μM por 24

horas nas linhagens K562 e HEP2.

SUBSTÂNCIAS K562 HEP2

Triazolmono 85.4 ± 7,1 105.2 ± 5,3 N-H-Triazol 87.0 ± 15,1 103.0 ± 12,0 N-F-Triazol 92.1 ± 7,9 104.4 ± 8,8 N-Cl-Triazol 90.7 ± 13,9 100.0 ± 15,3 Hidra-Triazol 91.9 ± 7,0 110.9 ± 18,8 Triazol-MXI 78.0 ± 9,6 105.1 ± 18,4 Triazol DAF1 90.2 ± 10,6 101.7 ± 14,9 Triazol DAG 81.2 ± 7,2 99.2 ± 12,6

Triazol DAGAL 91.7 ± 6,6 105.3 ± 13,7 Triazol DAF2 95.5 ± 8,2 103.6 ± 16,2 Triazol DAAL 91.8 ± 9,7 98.8 ± 9,1

Hidra-N-Cl 98.9 ± 13,5 106.1 ± 10,4 N-Br-Triazol 95.3 ± 6,2 101.8 ± 13,2

N-Cl,Cl-Triazol 90.2 ± 9,6 99.0 ± 14,3 N-H-Tri-OH 96.0 ± 9,7 104.1 ± 6,8

TriazolriboOH 97,8 ± 9,2 105.7 ± 11,3 Ácido Pirazolil Acrílico 96,8 ± 6,9 103,6 ± 13,1

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32

4.1.2 – Determinação do IC50

Inicialmente, foi feita uma avaliação do DMSO em diferentes concentrações

para verificação do seu efeito citotóxico, já que este foi utilizado como veículo para as

substâncias testadas. Como resultado, o DMSO não mostrou redução significativa

(p>0,05) do crescimento celular (GRÁFICOS 5 e 6).

As substâncias com maior potencial citotóxico foram submetidas a uma análise

de regressão a fim de encontrar o modelo que melhor interpretasse a relação funcional

entre a concentração e a viabilidade celular. Foram propostos pela profa. Keila Mara

Cassiano (Departamento de Estatística/UFF) modelos lineares, exponenciais,

logaritmicos, hiperbólicos, potenciais e sigmoidais e escolheu-se o modelo que

apresentou maior significância estatística e maior poder de explicação. O IC50 foi obtido

a partir da equação do modelo escolhido, ou seja, considerou-se que o IC50 é a

estimativa da concentração da substância que, pelo modelo de regressão, promove a

morte celular em 50% das células.

Nas análises realizadas, optou-se pelo modelo logaritmo ( XbaY ln+= ), que

apresentou as melhores qualidades estatísticas e se mostrou o modelo que melhor se

ajustou aos dados. Como exemplo, está ilustrado abaixo a citotoxicidade do

quimioterápico Etoposídeo, nas linhagens HEP2 e K562, com as respectivas equações

de regressão logarítmica. Nota-se tanto graficamente, quanto pelo valor do coeficiente

de explicação, 2R , que o modelo se ajustou bem aos dados reais. Foi possível

determinar que o IC50 na K562 foi de 3595,9 μM e na HEP2 foi de 2378,9 μM

(GRÁFICO 8).

A análise do quimioterápico Etoposídeo, utilizado como controle positivo em

ambas as linhagens, demonstrou uma resposta similar (GRÁFICO 7).

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33

0,0012 0,025 0,05 0,1 0,2 0,40

20

40

60

80

100

% DMSO

viab

ilida

de c

elul

ar %

GRÁFICO 5. Viabilidade da linhagem K562 em diferentes concentrações de

DMSO, no período de 24 horas.

0,0012 0,025 0,05 0,1 0,2 0,40

20

40

60

80

100

120

% DMSO

viab

ilida

de c

elul

ar %

GRÁFICO 6. Viabilidade da linhagem HEP2 em diferentes concentrações de

DMSO, no período de 24 horas.

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34

50

60

70

80

90

100

110

120

130

0 50 100 150 200

concentração μM

viab

ilida

de c

elul

ar (%

)K562HEP 2

GRÁFICO 7. Viabilidade das linhagens K562 e HEP2 em diferentes

concentrações do quimioterápico Etoposídeo.

Após o cálculo para as substâncias em teste, o IC50 da βLapachona foi de 0,06

μM, tendo essa substância mostrado o melhor potencial antitumoral no período de 24

horas. Seguindo da βLapachona, a Nor βLapachona (IC50: 467,6 μM) e IVS 320, (IC50:

488,0 μM) se mostraram como as substâncias mais promissoras como inibidoras do

crescimento celular na linhagem K562 (TABELA 8). Na linhagem HEP2 ocorreu maior

citotoxicidade para a βLapachona (IC50: 2,3 μM), seguida pela Metoxi (IC50: 320,9 μM)

e IVS 320 (IC50: 1469,0 μM).

A partir da avaliação anterior, selecionamos a linhagem K562 para a

continuação do estudo por ter apresentado maior sensibilidade ao tratamento, ser

manipulada de forma mais simples e rápida, além de fazer parte do painel de 60 células

do National Cancer Institute usado para a triagem in vitro de substâncias com atividade

antitumoral (Shoemaker, 2006).

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35

y = -8,4089Ln(x) + 118,85R2 = 0,9213

50

60

70

80

90

100

110

120

0 50 100 150 200

concentração μM

viab

ilida

de c

elul

ar (%

)

A. Célula K562

y = -10,666Ln(x) + 132,93R2 = 0,9719

50

60

70

80

90

100

110

120

130

0 50 100 150 200

concentração μM

viab

ilida

de c

elul

ar (%

)

B. Célula HEP2

GRÁFICO 8. Regressão logarítmica e sua equação nas diferentes concentrações

do quimioterápico nas linhagens K562 (A) e HEP2 (B).

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TABELA 8. Valores de IC50

SUBSTÂNCIAS K562 HEP2

Etoposídeo 3595,9 μM 2378,9 μM

βLapachona 0,06 μM 2,3 μM

Nor βLapachona 467,6 μM 2111,2 μM

Metoxi 3126,2 μM 320,9 μM

Epóxi αLapachona 977,1 μM 4962,9 μM

IVS 320 488,0 μM 1469,0 μM

4.2 – Avaliação do mecanismo da ação das substâncias

4.2.1 – Avaliação da síntese protéica

A linhagem K562 após o tratamento com Etoposídeo e os derivados do

Lapachol e da Lausona selecionados, na concentração de 50 μM, foi incubada por 2

horas com metionina 35S, e sua incorporação foi determinada por cintilografia.

Observou-se uma acentuada redução na síntese de proteínas em todas as substâncias

testadas. A maior queda foi observada em relação à βLapachona (96,2%), seguida da

IVS 320 (92,5%), enquanto o Etoposídeo apresentou a menor redução, 60,6%

(TABELA 9).

4.2.2 – Avaliação da apoptose por fragmentação do DNA

Após a incubação em um período de exposição de 4 horas com as substâncias

βLapachona, Nor βLapachona, Metóxi, Epóxi αLapachona, IVS 320 e Etoposídeo a

análise em gel de agarose não detectou um padrão característico de degradação do

DNA. Observou-se que o DNA das células em estudo apresentou um perfil semelhante

ao do controle negativo, não tendo sido possível a observação de fragmentos de DNA

que caracterizariam a apoptose. (Figura 4).

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TABELA 9. Análise da síntese protéica em relação ao controle (DMSO).

SUBSTÂNCIAS Síntese protéica (%)

Etoposídeo 39,4 ± 7,2

βLapachona 3,8 ± 3,9

Nor βLapachona 9,3 ± 29,1

Metoxi 7,8 ± 13,6

Epóxi αLapachona 10,7 ± 11,7

IVS 320 7,5 ± 14,8

FIGURA 4. Apoptose por fragmentação do DNA com incubação das substâncias por 4

horas. Marcador de peso molecular de 100 pares de bases. 1. β Lapachona. 2. Nor

βLapachona. 4. Metóxi. 5. Epóxi αLapachona. 6. IVS 320. 8. Etoposídeo. 9.

Dexametasona 1 μM. 10. Dexametasona 10 μM. 11. Controle negativo (células

contendo 0,1% de DMSO).

* 3 e 7 excluídos do estudo.

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Após incubação das substâncias por um período de 24 horas, observamos que

seis substâncias (FIGURA 5, raias de 1 a 5 e 12) poderiam estar induzindo a apoptose

por apresentarem fragmentação do DNA com padrão em escada. Em ambos os

períodos, também foram testadas diferentes concentrações de dexametasona, indutor da

apoptose (Druilhe et al., 2003), porém em nenhuma foi observada a fragmentação do

DNA com padrão em escada e sim um intenso rastro indicativo de degradação. Os

controles negativos também apresentaram rastro (13 e 14).

A morfologia celular foi observada em microscópio invertido com aumento de

200x em presença de três das substâncias mais citotóxicas (Nor βLapachona, Metoxi,

IVS 320). Foi possível observar que em presença das substâncias por 24 horas, ocorreu

alteração da morfologia celular em comparação com os controles negativos, em

presença ou ausência de DMSO. (FIGURA 6)

FIGURA 5. Apoptose por fragmentação do DNA 24 horas. Marcador de peso

molecular de 100 pares de bases. 1. β Lapachona. 2. Nor βLapachona. 3. Metóxi. 4.

Epóxi αLapachona. 5. IVS 320. 7. Etoposídeo. 8. Dexametasona 1 μM. 9.

Dexametasona 10 μM. 10. Dexametasona 100 μM. 11. Dexametasona 200 μM. 12.

Actinomicina. 13. Controle negativo com DMSO. 14. Controle negativo sem DMSO.

* 6 excluído do estudo

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FIGURA 6. Alteração da morfologia celular na presença de naftoquinonas na linhagem

K562 após 24 horas de incubação. (A) Controle negativo sem DMSO. (B) Controle

negativo com DMSO. (C) βLapachona. (D) Nor βLapachona. (E) Metoxi. (F) IVS 320.

A B

C D

E F

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4.2.3 – Avaliação da genotoxicidade das naftoquinonas pelo teste do cometa

Neste experimento foi possível a visualização da fragmentação do DNA através

do aparecimento do rastro característico após separação por eletroforese, que

dependendo da intensidade foi classificada em classe 0, 1, 2 ou 3 (FIGURA 7). As

quatro classes de cometas encontradas puderam ser observadas em todas as substâncias

testadas: derivados do Lapachol e da Lausona. A análise estatística mostrou diferença

significativa de todas as substâncias em relação ao controle com DMSO (p<0,05)

(GRÁFICO 9). Não foi possível avaliar a genotoxicidade no período de 24 horas,

devido a perda do material que se soltou da lâmina.

A análise da viabilidade celular feita com azul de tripan, simultaneamente ao

teste do cometa, no período de 2 horas, mostrou um resultado semelhante para todas as

substâncias (GRÁFICO 10).

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FIGURA 7. Visualização da fragmentação do DNA pelo teste do cometa após 4 horas

de incubação. A. Cometa classe 0; B. Cometa classe 1; C. Cometa classe 2; D. Cometa

classe 3.

A B

C D

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DMSOlap

Nor Metoxi

Epoxi

IVS 320

0

50

100

150

UA

GRÁFICO 9. Teste do cometa (2 horas).

GRÁFICO 10. Viabilidade celular (%) com azul de tripan por 2 horas.

lap

NorMeto

xi

Epoxi

IVS 320

50

60

70

80

90

100

110

viab

ilida

de c

elul

ar %

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5 – DISCUSSÃO

As drogas utilizadas atualmente no tratamento quimioterápico apresentam os

mais variados mecanismos de ação e são administradas sozinhas ou combinadas a

outros tratamentos como radioterapia e cirurgia. Porém, estes tratamentos ainda

apresentam efeitos nocivos que podem variar entre os indivíduos e, em alguns tipos de

câncer, são insuficientes. Partindo da necessidade de minimizar estes efeitos e de

aumentar as possibilidades de cura, vários estudos têm apresentado novas substâncias

com possíveis atividades antitumorais.

Para avaliar o potencial antitumoral de um composto, inicialmente este deve ser

testado em laboratório utilizando testes in vitro e in vivo em animais, e caso tenha ação

comprovada, este é testado em seres humanos. No presente trabalho, avaliamos a

capacidade de substâncias promoverem a morte celular utilizando testes in vitro com

linhagens tumorais.

A mensuração da viabilidade e proliferação celulares formam a base de

numerosos testes in vitro que procuram entender a resposta de uma população celular à

fatores externos. Rubstein e colaboradores (1990) compararam a resposta de 197

compostos em 38 linhagens tumorais representando sete tipos de tumores em ensaios de

microplacas utilizando MTT e sulforodamina B. Eles concluíram que as duas

metodologias tiveram respostas similares, mas a avaliação com sulforodamina B foi

mais vantajosa em termos práticos para ensaios em larga escala e, por esse motivo, o

ensaio com sulforodamina B foi adotado pelo NCI no screening de drogas com

atividade antitumoral. Nos nossos ensaios optamos por usar o MTT por ser uma

metodologia já empregada no laboratório de Virologia Molecular do Departamento de

Biologia Celular e Molecular, onde este trabalho foi desenvolvido.

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O teste de MTT para ensaios de microplacas desenvolvido por Mosmann (1983)

utiliza o sal tetrazolium de MTT (3-(4, 5-dimethylthiazolyl-2)-2, 5-diphenyltetrazolium

bromide) que possui coloração amarela. No ensaio, o MTT é reduzido nas células

metabolicamente ativas gerando cristais de formazan, de coloração púrpura, que são

solubilizados e quantificados através de espectrofotometria. A intensidade da atividade

metabólica indica o grau de viabilidade das células, quanto maior a citotoxicidade

promovida pelas substâncias menor será a intensidade metabólica e consequentemente

menor será a absorvância da solução (Berridge et al., 2005).

O DMSO (Dimetil Sulfoxido – (CH3)2SO), composto amplamente utilizado

como solvente, foi utilizado para solubilizar todas as substâncias testadas. Ele tem a

capacidade de dissolver tanto compostos polares quanto apolares e pode ser misturado

em uma grande variedade de solventes orgânicos, como a água. Também é

frequentemente usado como solvente nas reações que envolvem sais, carboidratos,

polímeros e peptídeos. Por essa razão, ele desempenha um papel importante na

dissolução de amostras a serem avaliadas em testes biológicos. Entretanto, é apontado

que o DMSO pode ter efeito citotóxico dependendo da concentração utilizada (Muir,

2007).

Ao avaliar a citotoxicidade em ausência e em presença das diferentes

concentrações de DMSO utilizadas observamos que, em presença de DMSO, não

ocorreu redução significativa do crescimento celular, não sendo citotóxico nem mesmo

na maior concentração testada (0,4%). Mesmo sem esta interferência, as análises da

citotoxicidade das substâncias foram sempre realizadas em relação a um controle

possuindo a quantidade proporcional de DMSO sendo utilizado como controle negativo

dos testes já que outras avaliações experimentais também seriam realizadas.

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O quimioterápico Etoposídeo tem a capacidade de inibir a enzima topoisomerase

II. Esta enzima normalmente funciona na célula quando se faz necessária a quebra e a

reunião das fitas de DNA em mamíferos como, por exemplo, no processo de duplicação

do DNA. A interação do Etoposídeo impede que a topoisomerase II religue as fitas do

DNA levando a célula a uma parada em G2 e subsequentemente disparando a apoptose

(Hande, 1996). Nos ensaios realizados o Etoposídeo foi utilizado como controle

positivo dos experimentos.

Inicialmente foi feita uma triagem das substâncias na concentração de 50 μM,

tendo como objetivo a detecção dos compostos com maior citotoxicidade. Constatamos

que os triazóis e o Ácido Pirazolil Acrílico, na concentração de 50 μM, não

apresentaram eficácia como substâncias antitumorais tanto na linhagem K562 como na

HEP2, não tendo sido utilizados posteriormente. Como as naftoquinonas foram a classe

química que promoveu maior citotoxicidade, cinco substâncias desta classe foram

selecionadas para serem avaliadas mais detalhadamente.

O Etoposídeo mostrou-se menos citotóxico na triagem das substâncias com

MTT, nas linhagens K562 e HEP2, com viabilidades celulares de 88,2 ± 16,5 e 91,1 ±

8,8, respectivamente, quando comparado as naftoquinonas estudadas, apontando aí uma

ação mais intensa das naftoquinonas em promover a morte das células tumorais.

O Lapachol, um dos precursores das naftoquinonas utilizadas neste estudo não

promoveu efeito citotóxico no ensaio de triagem feito com MTT nas duas linhagens

tratadas. Provavelmente, porque a concentração utilizada (50 μM) não tenha sido

suficiente para se verificar a atividade antitumoral. Carvalho e colaboradores (2005) ao

avaliarem a atividade citotóxica do Lapachol observaram extrema citotoxicidade e

inibição da síntese protéica na concentração de 2,5 mM além da inibição da atividade

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metastática e alteração no perfil de proteínas na concentração de 1,7 mM em células de

adenocarcinoma de cérvix humano (HeLa).

A Lausona, um precursor das naftoquinonas do estudo, também foi analisada,

tendo uma resposta bastante semelhante a do Lapachol tanto na linhagem K562 como

na HEP2, apesar de já ter sido mostrada como uma substância citotóxica capaz de inibir

50% da viabilidade de células HCT-15 (carcinoma de cólon humano) na fase S em uma

concentração máxima de 60μM (Kamei et al., 1998).

A βLapachona por ser uma das naftoquinonas mais estudadas, teve seu potencial

antitumoral avaliado em todos os ensaios do presente estudo. A βLapachona apresenta

um amplo espectro de ação em células de linhagens tumorais não apresentando

significativa redução da viabilidade de células não transformadas. Há indícios de que

seus efeitos citotóxicos também possam ser observados quando é administrada na forma

de pró-droga sendo convertida em βLapachona no microambiente ácido tumoral e

posteriormente bioativada pela NAD(P)H: quinona oxidorredutase 1 (NQO1), enzima

produzida em grande quantidade em vários tipos de câncer humano. Dentre seus

mecanismos de ação estão a indução da apoptose, inibição da topoisomerase II, inibição

da telomerase e estresse oxidativo

(Reinicke et al., 2005; Lee et al., 2005; Woo & Choi, 2005; Li et al., 2003; Silva et al.,

2003; Krishnan & Bastow, 2000).

A partir dos resultados no ensaio com MTT tornou-se possível apontar a K562

como a linhagem com maior sensibilidade a todas as naftoquinonas estudadas na

concentração de 50 μM, exceto para a βLapachona e Metoxi, que foram mais

citotóxicas na HEP2.

Apesar da ampla utilização da βLapachona em diversos estudos como um

potencial antitumoral, nesta avaliação, ela apresentou menor capacidade de reduzir a

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viabilidade celular na concentração de 50μM quando comparada as naftoquinonas

Epóxi αLapachona, Nor βLapachona, IVS 320 e Metoxi.

No processo de triagem das naftoquinonas com MTT, na K562, a Nor

βLapachona mostrou ser a mais citotóxica, seguida pela IVS 320. Estas substâncias

apresentam estruturas químicas diferenciadas, sendo a Nor βLapachona uma o-

naftoquinona e a IVS 320 uma p-naftoquinona. Possivelmente, o maior potencial

citotóxico da Nor βLapachona deva estar relacionado à sua estrutura que é bastante

semelhante a da βLapachona, substância encontrada na literatura pertinente como

antitumoral (Lee et al., 2005; Reinicke et al., 2005; Li et al., 2003; Choi et al., 2003).

Após a triagem, as substâncias escolhidas, Epóxi αLapachona, Nor βLapachona,

IVS 320 e Metoxi, foram avaliadas em diferentes concentrações e, com esses resultados

após a análise de regressão, foram determinadas as concentrações de cada substância

com capacidade de matar 50% da população celular (IC50). A βLapachona e o

Etoposídeo foram utilizados como controles positivos, representando uma naftoquinona

em teste e um quimioterápico comercial, respectivamente.

Na análise de regressão utilizamos o modelo logarítmico como sendo o mais

ajustado aos dados encontrados, apresentando um bom coeficiente de explicação (R2) e

permitindo a determinação da concentração de cada substância que promoveria a morte

de 50% das células (IC50). Mesmo tendo sido menos sensível, mostramos também os

cálculos de IC50 para HEP2. Nesta linhagem, encontramos os menores valores de IC50

para βLapachona (2,3μM) e Metoxi (320,9μM). Na linhagem K562, a βLapachona

também apresentou o melhor potencial antitumoral com IC50 de 0,06 μM seguido pela

Nor βLapachona, com IC50 de 467,6 μM, e IVS 320 com IC50 de 488,0 μM. Os

resultados encontrados na análise de regressão para K562, com exceção da βLapachona,

são compatíveis com a triagem feita com MTT. Curiosamente, quanto menor a

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concentração de βLapachona, maior seu potencial citotóxico, característica que a difere

das demais substâncias em ambas as linhagens. É possível que a βLapachona esteja

interferindo na técnica de MTT. Trabalhos apontam que pode ocorrer interferência das

substâncias na metodologia com MTT (Ulukaya et al., 2004; Bruggisser et al., 2002).

A avaliação do possível mecanismo de ação empregado por essas substâncias

para exercerem seus efeitos também foi feita através da alteração na síntese de

proteínas, análise do perfil de fragmentação do DNA celular e genotoxicidade destas

substâncias. Nessas avaliações somente a linhagem K562 foi utilizada, essa escolha se

baseou no fato desta célula ser mais sensível as substâncias utilizadas, estar presente no

painel de células do NCI e de ser mais fácil de manipular.

A síntese de proteínas através da incorporação de metionina na presença de

naftoquinonas foi avaliada em apenas dois estudos. Carvalho e colaboradores (2005)

determinaram que o Lapachol promoveu a inibição da síntese protéica na concentração

de 2,5 mM em linhagem celular de mamíferos e Pereira e colaboradores (2006)

verificaram que a 3-hidroxi-β-N-lapachona, composto ausente em nossas análises,

também inibia a síntese protéica em S. aureus. Em nossos ensaios a síntese de proteínas

mostrou ser um processo metabólico bastante afetado pelo tratamento com as

naftoquinonas, onde a maioria das substâncias levou a uma redução maior que 90%.

Nesta avaliação o Etoposídeo continuou se destacando do restante das substâncias por

apresentar uma queda de 60,6% na síntese de proteínas. Nossos resultados portanto,

reforçam os encontrados na literatura.

Um dos marcadores bioquímicos clássicos de apoptose é o aparecimento de

padrão de fragmentação da cromatina, indicativo da clivagem de regiões entre os

nucleossomos. Essa clivagem internucleossomal, conseqüência da ativação de

endonuclease, produz um padrão de quebra em oligômeros múltiplos de 180 pb

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formando o padrão em escada quando os fragmentos de DNA são submetidos à

eletroforese (Wyllie, 1980)

Chau e colaboradores (1998) demonstraram que a βLapachona tinha a

capacidade de induzir apoptose, verificada por fragmentação do DNA, em células HL-

60 após 4 horas de exposição na concentração de 1μM. Já por citometria de fluxo outras

duas linhagens de células leucêmicas, a U937 e a Molt-4, tinham cerca de 50% das

células em apoptose após 24 horas de exposição na concentração de 4μM. O autor

relaciona essa indução da apoptose com a produção de H2O2 durante o tratamento com

βLapachona e aponta que as células K562 e MCF-7 seriam mais resistentes a apoptose

pois produziriam menos H2O2 graças a uma quantidade maior de glutationa

intracelular. Portanto, a indução de apoptose pela βLapachona parece estar envolvida

com o estresse oxidativo (Chau et al., 1998).

Ao avaliar a indução da apoptose, verificada pela fragmentação do DNA em

presença das naftoquinonas selecionadas, não foi possível caracterizar nenhum padrão

de fragmentação no tratamento feito durante 4 horas. Entretanto, foi possível observar

indícios da ação das substâncias na indução da apoptose, quando utilizadas na

concentração de 50 μM durante 24 horas, devido a observação em fragmentos na faixa

de 200 a 600 pares de bases. A visualização dos fragmentos ficou prejudicada pelo

intenso rastro, característico de degradação do DNA. Na técnica utilizada para isolar o

DNA as proteínas foram extraídas com fenol:clorofórmio e a fase aquosa obtida,

submetida à eletroforese. A degradação pode ter ocorrido como conseqüência do

armazenamento do DNA com resíduos de fenol:clorofórmio antes da corrida

eletroforética, suspeita reforçada pelo intenso rastro também observado no DNA das

células controle sem DMSO em 24 horas.

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Observamos que o Etoposídeo também não indicou ser um bom indutor de

apoptose em ambos os períodos de incubação. A actinomicina D, apresentada na

literatura como bloqueador da RNA polimerase mostrou também ser um possível

indutor de morte celular no período de 24h, na linhagem K562, devido a presença do

padrão de bandas em escada compatível com apoptose.

As células utilizadas no experimento para averiguação da morte celular por

apoptose foram fotografadas. Foi possível observar que a morfologia celular dos

controles com e sem DMSO mostrou-se muito similar com a presença de grumos

celulares característicos da linhagem K562. No meio de cultura observamos poucos

restos celulares. Destacamos as células incubadas com βLapachona e Nor βLapachona

por apresentarem maior alteração em termos de coloração de membrana celular e forma.

Pudemos observar também que as células tratadas com estas duas substâncias

apresentavam-se em menor quantidade, individualizadas e misturadas a debris celulares.

Essas alterações morfológicas reforçam os efeitos citotóxicos e de inibição de síntese

protéica anteriormente observados.

As naftoquinonas são apontadas na literatura como substâncias que induzem o

estresse oxidativo. Essas substâncias têm a capacidade de aceitar elétrons e gerar

espécies reativas de oxigênio incluindo ●O−2,

●OH e H2O2 cujos efeitos oxidativos

poderiam explicar a citotoxicidade (Boveris et al., 1978; Silva et al., 2003; de Witte et

al., 2004).

O método de Single-Cell Gell Assay (SCGE) também conhecido como teste do

cometa, pode detectar e quantificar quebras do DNA em células eucarióticas. O método

é baseado na observação que em presença de um campo elétrico os fragmentos de DNA,

carregados negativamente, migram através do gel de agarose. O DNA intacto presente

no núcleo mantém o formato circular enquanto o núcleo com o DNA fragmentado,

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apresenta migração para o anodo formando a figura de um cometa com maior

intensidade na cauda quando há uma maior quebra (Gontijo & Tice, 2003). Utilizamos

esse teste para avaliar se haviam lesões do DNA nas células tratadas com as

naftoquinonas, promovidas provavelmente pelas espécies reativas de oxigênio.

Constatamos a genotoxicidade das naftoquinonas através do teste do cometa em

um período de 2 horas de incubação. A β Lapachona, a Epóxi αLapachona, a Nor

βLapachona, a IVS 320 e a Metoxi promoveram a quebras do DNA e através da análise

estatística mostramos que todas foram significativamente diferentes em relação ao

controle com DMSO. Nas condições utilizadas, entretanto, não foi possível fazer

distinção entre o número de cometas entre as diferentes naftoquinonas testadas, o que

possibilitaria a avaliação das diferenças estruturais. Tanto nas substâncias estudadas

como no controle com DMSO pudemos observar as quatro classes de cometas. Este

resultado mostra-se em concordância com a análise da síntese de proteínas no mesmo

período de incubação e a avaliação da apoptose em 24 horas de tratamento. Não existem

relatos anteriores na literatura avaliando as naftoquinonas através do teste do cometa.

Na análise feita com azul de Tripan no período de 2 horas não foi possível

identificar uma redução significativa da viabilidade celular durante o tratamento com as

naftoquinonas selecionadas, tendo sido observado o oposto no período de 24 horas,

onde a viabilidade das células tratadas com a substância menos citotóxica foi de cerca

de 20%. Esse resultado provavelmente foi conseqüência do pouco tempo em contato

com as substâncias.

As naftoquinonas demonstraram ser uma classe interessante de compostos com

atividade citotóxica, propriedade que pode ser explorada no tratamento do câncer.

Modificações estruturais podem ser uma importante estratégia para a produção de novas

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moléculas com maior atividade contra as células tumorais e menor toxicidade para as

células normais.

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6 – CONCLUSÃO

Partindo da necessidade do desenvolvimento de uma quimioterapia anticâncer

mais eficaz, propomos aqui a investigação do potencial antitumoral, e especificamente,

de possíveis mecanismos de ação de substâncias provenientes de síntese química.

A partir da análise feita, constatamos que a classe das substâncias mais

promissoras à utilização no tratamento quimioterápico contra o câncer foi a das

naftoquinonas. Estas promoveram menor viabilidade celular de linhagens tumorais

utilizando teste de viabilidade por MTT (capaz de avaliar a atividade mitocondrial).

A célula K562 foi mais sensível a citotoxicidade promovida pelas naftoquinonas

quando comparada a HEP-2.

A análise através de regressão logarítmica se ajustou de forma satisfatória aos

dados, e permitiu obter a IC50, tendo as substâncias Nor βLapachona e IVS 320,

substâncias pouco avaliadas na literatura, maior citotoxicidade.

As cinco naftoquinonas escolhidas como mais citotóxicas promoveram intensa

redução da síntese protéica, através da avaliação da incorporação de aminoácido

radioativo (35S-metionina).

Houve a fragmentação do DNA com padrão em escada nas células tratadas com

as naftoquinonas na concentração de 50 μM após 24 horas de tratamento.

Foi possível observar lesões no DNA na presença das cinco naftoquinonas

escolhidas através do teste do cometa na concentração de 50 μM após 2 horas de

tratamento.

A classe das naftoquinonas mostrou-se promissora no que diz respeito a

continuidade de testes não só in vitro como também in vivo na tentativa de alcançar uma

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estrutura química que seja mais eficaz na terapia anticâncer e com menos efeitos

nocivos aos tecidos normais.

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8 - ANEXOS

ANEXO 1. NOMENCLATURA OFICIAL DAS NAFTOQUINONAS.

SUBSTÂNCIA NOME QUÍMICO

αLapachona 2,2-dimetil-3,4-dihidro-2H-benzo[g]cromeno-5,10-diona

βLapachona 2,2-dimetil-3,4-dihidro-2H-benzo[h]cromeno-5,6-diona

Epóxi

αLapachona

2,2-dimetil-3,4-diidropiro[benzo[g]cromeno-10,2’-oxirano]-5(2H)-

ona

Nor

βLapachona

2,2-dimetil-2,3-dihidronaftol[1,2-b]furano-4,5-diona

Triacetato 3-(3-metilbutil-2-enil)-1,4-dihidronaftaleno-1,2,4-triil triacetato

IVS-0320 6b,7-diidro-5H-ciclopenta[d]naftol[1,2-b]furano-5,6(9 aH)-diona

Metoxi 2-hidroxi-4-metoxinaftaleno-1-(4H)-ona

Epoxi-metoxi 4-metoxi-4H-espiro[naftaleno-1,2’-oxirano]-2-ol

Lapachol 2-hidroxi-3-(3-metilbutil-2-enil)naftaleno-1,4-diona

Lausona 2-hidroxinaftaleno-1,4-diona

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ANEXO 2. ESTRUTURAS QUÍMICAS DOS TRIAZÓIS E DO ÁCIDO PIRAZOLIL

ACRÍLICO.

N-Cl,Cl-TRIAZOL

NN

NHN

O

O

Cl

ClC12H12Cl2N4O2

Exact Mass: 314,0337Mol. Wt.: 315,1548

C. 45,73; H. 3,84; Cl. 22,50; N. 17,78; O. 10,15

N-Br-TRIAZOL

NN

N

O

O

HN

BrC12H13BrN4O2

Exact Mass: 324,0222Mol. Wt.: 325,1614

C. 44,33; H. 4,03; Br. 24,57; N. 17,23; O. 9,84

N-H-TRIAZOL

NN

NHN

O

O

C12H14N4O2Exact Mass: 246,1117

Mol. Wt.: 246,2653C. 58,53; H. 5,73; N. 22,75; O. 12,99

N-Cl-TRIAZOL

NN

NHN

O

O

ClC12H13ClN4O2

Exact Mass: 280,0727Mol. Wt.: 280,7101

C. 51,34; H. 4,67; Cl. 12,63; N. 19,96; O. 11,40 N-F-TRIAZOL

NN

NHN

O

O

FC12H13FN4O2

Exact Mass: 264,1023Mol. Wt.: 264,2558

C. 54,54; H. 4,96; F. 7,19; N. 21,20; O. 12,11

HIDRA-N-H

NN

NHN

NH

ONH2

C10H12N6OExact Mass: 232,1073

Mol. Wt.: 232,2421C. 51,72; H. 5,21; N. 36,19; O. 6,89

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HIDRA-N-Cl

NN

NHN

NH

NH2

O

ClC10H11ClN6O

Exact Mass: 266,0683Mol. Wt.: 266,6869

C. 45,04; H. 4,16; Cl. 13,29; N. 31,51; O. 6,00

N-H-TRI-OH N

NN

OH

HN

C10H12N4OExact Mass: 204,1011

Mol. Wt.: 204,2286C. 58,81; H. 5,92; N. 27,43; O. 7,83

TRIAZOLMONO

TRIAZOL-MXI

TRIAZOL DAF1

TRIAZOLDAG

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TRIAZOL DAGAL

TRIAZOL DAF2

TRIAZOL DAAL

HIDRA TRIAZOL

TRIAZOLRIBOOH

ÁCIDO PIRAZOLIL ACRÍLICO

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