cebi e11 rup cel 2 2012

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CARRERA DE ESPECIALIZACION EN CARRERA DE ESPECIALIZACION EN

BIOTECNOLOGIA INDUSTRIALBIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL

FCEyNFCEyN--INTIINTI

Materia de Especialización CEBI_E11

RECUPERACIÓN Y PURIFICACIÓN DE MACROMOLÉCULAS

Docente a cargo: Mariano GRASSELLI

CEBI_E11_2 : Ruptura celular

Objetivos

• Maximizar la liberación del producto

• Evitar la desnaturalización y/o inactivación

• Evitar la degradación térmica

• Evitar las alteraciones secundarias

• Evitar la formación de partículas submicronicas

• Maximizar la velocidad de liberación

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Factores que afecta la disrupción

• Medio de cultivo en que creció

• Tipo de microorganismo

• Estado fisiológico

• Tamaño

• Forma

• Velocidad a la que ha crecido

Microorganismo

• Sensibilidad al calor

• Sensibilidad al shear

• Localización dentro de la célula

Producto

Métodos

• Métodos físicos

• Métodos químicos

• Métodos biológicos

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Métodos físicos

• Mecánicos• Agitación con abrasivos

• Homogeneización a alta presión

• Extrusión por presión

• Microfluidizadores

•••• No Mecánicos• Shock osmótico

• Congelamiento – descongelamiento

• Sonicado

• Secado

Molino de bolillas (bead mill)

Motor

Correa

transmisión

Cámara Eje impulsor

Paletas

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Paletas

Cámara

dR/dt = k * [células sin romper]

dR/dt = k . (Rm-R)

dondeR= ruptura

Rm= ruptura máxima

La forma integrada de la ecuación de velocidad que describe la

disrupción microbiana es :

∫ 1/(Rm-R) dR = ∫ k dt

ln (Rm / (Rm –R)) = k.t

ln (Rm - R) - ln Rm = - k.t

ln (Rm - R) = - k.t + ln Rm

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La constante de velocidad k representa la eficiencia de

ruptura celular,

y es función de :

• Velocidad de agitación

• Concentración de células•rango de 30-60 % de sólidos (peso húmedo)

• Concentración de bolillas de vidrio•70 y 90 % v/v del volumen de la cámara

• Diámetro de las bolillas• > 0,5 mm para levaduras,

• < 0,5 mm para bacterias.

• Temperatura

• Diseño del molino de bolillas

0

1

2

3

4

5

0 20 40 60 80 100

Tiempo (min)

ln (100 - R)

ln (Rm - R) = - k.t + ln Rm

Si Rm es 100% :

ln (100 - R) = - k.t + 2,3 . log 100

ln (100 - R) = - k.t + 4,6

Tiempo necesario

para liberar el 99%

de la proteína

t r = 4,6

k

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French Press

de laboratorio (batch)

APV-1000

Condiciones de trabajo

• Muestra enfriada

• 4 pasajes a 800 atm (22 L/h)

Homogeneizador de alta presión

www.apv.com

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Funcionamiento del Homogeneizador

HOMOGENISED

PRODUCT

BASIC

PRODUCT

Anillo de

impacto

Entrada del

Producto

Producto

Homogeneizado

UPPER UPPER UPPER UPPER

PARTPARTPARTPARTVálvula

800 atm

1 atm

1) Cuando las células entran en la válvula de

descarga, colisionan sobre el piston

2) Luego, la suspensión es acelerada a través de

un canal angosto que une el asiento de la

válvula y el pistón. En este punto el fluido

alcanza velocidades por encima de 300

m/seg cuando golpea el anillo de impacto.

3) Finalmente, la suspensión fluye a través del

espacio anular entre el anillo de impacto y el

pistón hacia la válvula de salida, y sufre una

abrupta caída de presión

Funcionamiento del Homogeneizador

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Salidas de 1 válvula

Salidas de 2 válvulas

Acero inox cromado (h/ 200 bar)

Carburo de tungsteno (h/ 600 bar) Cerámicas (> 600 bar)

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ln (Rm / (Rm–R)) = k.N.Pa

Rm= cantidad maxima de proteína soluble que puede ser liberada.

R = cantidad de proteína liberada.

k = constante de velocidad temperatura-dependiente.

N = numero de pasajes de la suspensión celular por el homogeneizador.

P = presión de operación del homogeneizador.

a = exponente de presion, que depende del microorganismo y del estado

metabólico en que se encuentre.

para levaduras aprox 3

para bacterias entre 1,5 y 3

ln (Rm -R) = - k.N.Pa + ln Rm

Si Rm (liberación máxima) es 100% :

ln (100 - R) = - k.N.Pa + 2,3 . log 100

ln (100 - R) = - k.N.Pa + 4,6

0

1

2

3

4

5

0 1 2 3 4 5

N

ln (100 - R)

Nro teórico de

ciclos para R =

99%

t r = 4,6

k.Pa

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Std DNA P1P0 P2 P3 P4

Ladder 500 pb

Gel Agarosa (DNA)

Degradación mecánica de DNA

Alto PM

Bajo PM

Nro de pasajes

El calor generado durante el proceso de homogeneización es

debido a la descompresión adiabática,

Puede elevar la temperatura del sistema en 1-2 ºC por cada

1000 psi (60 atm) de presión.

Otros problemas más frecuentes:

• Generación de aerosoles

• Desgaste de válvula

Técnica de ruptura celular mas frecuentemente usada para

la gran escala.

No es recomendada para microorganismos filamentosos

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Microfluidizadores

Funcionan por el choque de un chorro de líquido (jet) de alta

velocidad de una suspensión (caldo) sobre una placa.

• De choque

• un chorro de líquido de 80 µm de diámetro choca contra una placa metálica enfriada

• Microfluidizador• dos corrientes de líquido de 2x100 µm se encuentran en una cruz

• De choque en contracorriente: • dos chorros de líquido de 180 µm de diámetro se chocan entre si de frente (evita la erosión de los materiales)

• Dejan residuos de mayor tamaño (más fácil la posterior

separación sólido-líquido)

• Son eficientes a bajo contenido de biomasa (2% peso

húmedo de biomasa)

• Mejor enfriamiento

• Permiten trabajar a bajos flujos (2-20 l/h para trabajos

continuos integrados con la fermentación).

• Se pueden usar volúmenes pequeños (30 ml)

• Son compactos

Ventajas

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Model LAB 8H

Hydraulic pressure intensifier

Capacity 8 L/hr.

Maximum pressure 1600 bar

Nanojet Models LAB 15H & LAB 30H

Model LAB 15H


Capacity 15 L/hr.


Model LAB 30H


Capacity 30 L/hr.


Ultrasonido

•Es un equipo muy utilizado a escala laboratorio por

• Simplicidad

• Efectividad en pequeñas muestras.

•El equipo consta de una punta metálica conectada a un generador de

ultrasonidos (ondas acusticas de 15-20 kHz de frecuencia).

•El mecanismo de ruptura es la cavitación:

•generación de microburbujas que al colapsar generan una onda

expansiva que se propaga por el medio (variando la presión)

• Cinética de primer orden y la k es proporciónal a la potencia acústica del

amplificador.

•NO se utiliza a escala piloto o industrial porque la mayor parte de la

energía se transforma en calor.

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Como medir la ruptura?

Directamente

• Turbidez

• Recuento en microscopio

Indirectamente

• Concentración de proteínas

• Actividad enzimática

Métodos químicos

• Tratamiento con álcali

• Tratamiento con solventes

• Tratamiento con detergentes

• Tratamiento con ácidos

• Tratamiento con sustancias caotrópicas

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Métodos biológicos

• Lisis enzimática

• Inhibición de la síntesis de pared celular

• Fagos

• Virus

Diferencias en la pared celular de bacterias

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Composición química de la pared celular

de bacterias gram +

Bacterias Gram (-)

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Levaduras

Las paredes celulares de levaduras tienen 2 capas principales :

a) Capa externa de complejo proteína-manano

b) Capa interna de glucano

Bacterias Gram (+)

Bacterias Gram (-)

Levaduras

Hongos filamentosos

Peptidoglicano

Peptidoglicano

Pared externa

Mananos parcial/

entrecruzados por

fosfodiésteres

Glucanos y proteínas

Glicoproteínas

Quitina

α y β glucanos

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Tratamiento con álcali

• Requerimientos– Producto estable a pH altos (10,5 a 12,5)

• Ventajas• Económico y escalado fácil

• Elimina microorganismos viables

• Inactivación de proteasas

• Reduce la contaminación con piretógenos

• Desventajas• Posible desnaturalización

• Posible degradación

Tratamiento con solventes

• Mecanismo– Extracción del componente lipídico de las membranas

– Autólisis


• Elimina microorganismos viables

• Inhibe el crecimiento microbiano (contaminante)

• Estabiliza proteínas (Solventes miscibles con agua en baja cc.)

• Desventajas• Desnaturalización

• Liberación de proteasas

• Solventes inflamables

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β-D-galactosidasa

proteasas

Biomasa + Solvente (etanol)

Biomasa + Buffer

Incubación y separación

Solvente % de liberación después de

15 h con buffer

Etanol 90

Metanol 90

Isopropanol 85

Butanol 2

t-butanol 90

Acetona 20

Metil etil cetona 20

Tolueno 15

Metil isobutil cetona 15

Liberación de β-D-galactosidasa de Kluveromyces fragilis.Tabla de diferentes solventes. para liberar posteriormente la enzima en buffer.

La concentración final de solvente fue 80% y se dejó incubando durante 90

min con la biomasa.

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Autólisis y Extracción química


• Desventajas• Tiempos largos de reacción

• Bajos rendimientos

Condiciones a optimizar• Temperatura

• pH

• Tiempo de incubación

• Molaridad del buffer

• Estado metabólico de las células

a 50°C en 0,1 M de

buffer acetato pH 5

a 50°C en buffer fosfato 0,1 M pH 5,9

30°C (cuadrados) 50°C (círculos)

+ L-cisteína

Liberación de Inulasa de K. fragilis (de espacio periplásmico)

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Tratamiento con detergentes

• Mecanismo• Solubilización de las membranas

• Permeabilización celular

• Ventajas• Evita la excesiva fragmentación de la pared celular

• Evita la liberación de DNA

• Fácil escalado

• Efecto sinérgico con agentes caotrópicos

• Desventajas• No es económico

• Contaminante posterior en la purificación

• Produce inactivación

• Disminuye el rendimiento

• pH y temperatura son factores críticos

Reactivo Concentración

Proteína total

solubilizada (%)

SCN de guanidinio 6 M 84

SCN sodio 6 M 42

Cl guanidinio 6 M 13

Br de cetilpiridinio 2 % 61

Deoxicolato de sodio 2 % 41

Tritón X-100 2 % 54

SDS (dodecil sulfato de sodio) 2 % 82

Urea 6 M <4

Tiourea 2 M <4

Solubilización de proteínas de membrana de E. coli

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VENTAJAS

• Rápido y sencillo

• Condiciones de trabajo suaves

• Proteasas específicas

• Lisis selectivas

DESVENTAJAS

• No es económico

• No hay disponibilidad

• Microorganismo debe ser sensible

• Liberación de ADN

• Eliminación en pasos posteriores de purificación

• La lisis está marcadamente afectada por el buffer, pH y temperatura

Métodos enzimáticos

•Glicosidasas

• cortan cadenas de polisacáridos

•Acetilmuramil-L-alaninamidasas,

• clivan la unión entre proteínas y polisacáridos

•Endopeptidasas,

• clivan cadenas polipeptídicas.

Lisozima

Tipos de enzimas bacteriolíticas

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Los sistemas enzimáticos para la lisis de levaduras

• β (1-3) glucanasa• Proteasa específica

• β (1-6) glucanasa• Mananasa

• Kitinasa

Sistemas enzimáticos del

Cytophaga sp.

Oerskovia xanthineolytic

Lisis de B. subtilis (10 g/L peso seco)

Se agrega un sobrenadante crudo del complejo

enzimático Cytophaga sp. en una concentración de

3-30% v/v

Lisis de levaduras

hasta 110 g/L peso seco de biomasa en reactores de

disrupción.

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pH:

circulo ... pH 6

Triángulo ... pH 6,9

Cuadrado ... pH 8

Molaridad de buffers:

Claros ... 50 mM

Oscuros ... 100 mM

Fosfato

Fosfato + EDTA

Fosfato + Lisozima

Fosfato + EDTA

+ Lisozima

EDTA 1 mM

Lisozima 0,03 mg/ml

Lisis de un cultivo de P. putida

cebi e11 rup cel 2 2012

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