casca de arroz como adsorvente para extraÇÃo de ... · a minha amada tia e madrinha zaira, por...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE - FURG

ESCOLA DE QUÍMICA E ALIMENTOS - EQA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA TECNOLÓGICA E

AMBIENTAL - PPGQTA

CASCA DE ARROZ COMO ADSORVENTE PARA

EXTRAÇÃO DE MICOTOXINAS EM CEBOLA

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

Ana Paula Moura Guimarães Carvalho

Rio Grande - RS, Brasil

2011



por


Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Química

Tecnológica e Ambiental, Linha de Pesquisa Desenvolvimento e Validação de

Metodologia Analítica, da Universidade Federal do Rio Grande (FURG, RS),

como requisito parcial para obtenção do grau de MESTRE EM QUÍMICA

Orientador: Profa. Drª. Eliana Badiale Furlong

Rio Grande, RS, Brasil

2011

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE - FURG

ESCOLA DE QUÍMICA E ALIMENTOS - EQA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA TECNOLÓGICA E

AMBIENTAL - PPGQTA

A Comissão Examinadora, abaixo assinada, aprova a

Dissertação de Mestrado



elaborada por


como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Química

Comissão Examinadora

Profa. Drª. Eliana Badiale Furlong (Orientador - Presidente)

Prof. Dr. Ednei Gilberto Primel

Profª. Drª. Giniani Carla Dors

Rio Grande, 31 de agosto de 2011

À meu pai, meu grande amigo de todas

as horas, alguém que amo muito, que sempre

me incentivou. Que mesmo em suas horas

ruins não me abandonou, se preocupou em me

dar forças para continuar, pai amoroso,

batalhador pessoa que sigo como exemplo e

tenho muito orgulho. Te amo

AGRADECIMENTOS

A Deus pela força e proteção.

À Prof Drª. Eliana Badiale Furlong, pela orientação e oportunidade concedida.

Obrigada!

À Prof Drª. Giniani Carla Dors, pela disponibilidade em participar na defesa da

dissertação e agradeço por contribuir com suas sugestões para o trabalho.

Ao Prof. Dr. Ednei Gilberto Primel, pela participação e sugestões no exame de

qualificação, sugestões na defesa da dissertação e por todos os conhecimentos transmitidos

durante suas aulas.

Ao Prof. Dr. Márcio Raimundo Milani pela participação e sugestões no exame de

qualificação e pelos ensinamentos enquanto professor.

Aos professores do programa de Pós Graduação em Química Tecnológica e

Ambiental por todos os ensinamentos no decorrer do curso.

À minha família, especialmente aos meus pais Paulo e Isolda, pessoas incríveis,

exemplos de fé, honestidade, amor ao próximo e perseverança, por nunca medirem esforços

para me ajudar. Pelo amor, pela minha educação, por acreditarem em mim, pela dedicação e

cuidados com a Bruna, por me ajudarem, por serem os grandes amores da minha vida.

Ao meu marido amado Fabio Adriano, por ser uma pessoa maravilhosa, tão especial

na minha vida, fazendo tudo parecer mais fácil, estando sempre disposto a me ajudar, por todo

amor e carinho, por toda a compreensão, por me dar forças para vencer cada etapa. Te amo

muito.

A minha filhinha Bruna, muito muito amada, por ser simplesmente linda,

incrivelmente compreensível com a saudade do dia-a-dia, minha melhor amiga, minha fonte

de inspiração, a razão da minha vida.

A minha querida irmã Chaiane, por tantos momentos compartilhados, por tantas

risadas, por me fazer tão bem, por ser simplesmente amiga de todas as horas.

A minha amada avó Nair, por tanto amor e dedicação, por ser meu exemplo de fé,

perseverança e honestidade.

A minha amada tia e madrinha Zaira, por todo amor, incentivo, por não medir

esforços para me ajudar e por confiar no meu potencial.

A minha amiga amada Helen, por sempre estar ao meu lado, por me fazer tão bem,

por todas as risadas e foram muitas, por toda ajuda, companheirismo, por me fazer acreditar

que tudo iria dar certo. Sem você certamente a realização deste trabalho não seria possível.

A minha amiga Michele, por fazer tudo parecer mais fácil, por todo apoio durante esta

jornada, estando sempre pronta para me ajudar, pela amizade, companhia tão agradável,

sempre alegre de bem com a vida.

A minha amiga Tânia, pela ajuda, amizade, pelos momentos tão bons de

descontração.

As minhas amigas do laboratório: Maria de Jesus, Renata, Fernanda, Larine,

Luciana, Anelise, Gabriela, Priscila, Letícia, Adriana e ao meu amigo Cristiano. Por

terem me acolhido tão bem e pelos bons momento.

Aos amigos que fiz durante o curso, pela verdadeira amizade que construímos. Em

especial, agradeço ao meu amigão Maicon e a minha grande amiga Eliete, sem vocês essa

trajetória seria bem mais difícil.

As graduandas Nathali e Francine, por toda a ajuda, esforço e dedicação.

A todos que contribuíram direta ou indiretamente para a conclusão deste trabalho.

RESUMO

Dissertação de Mestrado

Programa de Pós-Graduação em Química Tecnológica e Ambiental - PPGQTA

Universidade Federal do Rio Grande - FURG

CASCA DE ARROZ COMO ADSORVENTE PARA EXTRAÇÃO DE MICOTOXINAS

EM CEBOLA

AUTORA: Ana Paula Moura Guimarães Carvalho

ORIENTADOR: Profa. Drª. Eliana Badiale Furlong

Rio Grande, 31 de agosto de 2011

A produção mundial de arroz chega a 80 milhões de toneladas ao ano, considerando que as

cascas representam 20% deste valor, anualmente são geradas cerca de 1.162.000 toneladas

desse rejeito. Há alguns anos, esse material era descartado no ambiente, atualmente as leis de

proteção ambiental, demandaram na preocupação com resíduos de casca de arroz (FOLETO,

2005). Segundo Mayer (2006) a casca leva aproximadamente 5 anos para se decompor e exala

um volume elevado de metano, um dos gases responsáveis pelo efeito estufa. Visando

proteger a integridade do meio ambiente, estão sendo buscadas alternativas para reduzir os

impactos ambientais do descarte e recuperar os investimentos na cultura do grão. Devido seu

alto teor de silício a casca de arroz, é matéria-prima de grande interesse para aplicação em

vários ramos: indústria eletrônica, cerâmica e na agricultura e também pode ser utilizada

como fonte energética e ser aplicadas como adsorvente, em análises químicas (FOLETO,

2005; ROSA, 2009). Neste trabalho o objetivo foi padronizar método para a determinação das

aflatoxinas B1, B2, G1, G2 e ocratoxiana A em cebola, empregando a técnica de extração,

Dispersão da Matriz em Fase Sólida (MSPD), tendo a casca de arroz como adsorvente, de

forma a possibilitar a determinação dos contaminantes empregando cromatografia de camada

delgada de alta eficiência (HPTLC) e/ou cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a

detector de fluorescência (HPLC-FD). A cebola (Allium cepa L.) foi a matriz escolhida

devido sua importância econômica, ela é a terceira hortaliça mais importante economicamente

no Brasil, depois do tomate e da batata. O país está entre os dez maiores produtores do

mundo, sendo que na safra de 2010 a produção foi de 1.548.146 toneladas. Dentre os estados

que se destacam pela sua produção estão: Santa Catarina, São Paulo e Rio Grande do Sul. No

entanto, a cebola assim como os demais alimentos é suscetível à contaminação fúngica e se

entre a microbiota estiverem espécies toxigênicas pode ocorrer à produção de micotoxinas. O

método foi validado avaliando-se curva analítica, linearidade, limites de detecção e

quantificação, precisão (repetitividade e precisão intermediária) e exatidão (recuperação) para

cada tipo de determinação cromatográfica. Para HPTLC, os limites de detecção variaram

entre 0,33-5µg Kg-1

e os de quantificação entre 1-15µg Kg-1

Para o método HPLC-FD os

limites de detecção variaram entre 0,003– 0,26 µg Kg-1

e os de quantificação 0,03 – 2,6 µg

Kg-1

. As recuperações para o método HPTLC variaram entre 76- 95% e para HPLC-FD

variaram entre 72-88%. O método desenvolvido foi aplicado para verificar a ocorrência de

micotoxinas em 14 amostras de cebola. A contaminação com aflatoxinas foi verificada em

43% das amostras analisadas. O nível máximo encontrado foi de 90 µg Kg-1

para aflatoxina

B2 em uma amostra de cebola crioula, com o defeito de mancha negra.

Palavras chaves: micotoxina, MSPD, casca de arroz HPTLC, HPLC-FD

ABSTRACT

Master’s Thesis

Programa de Pós-Graduação em Química Tecnológica e Ambiental - PPGQTA

Universidade Federal do Rio Grande - FURG

RICE HUSK FOR EXTRACTION AS ADSORBENTS OF MYCOTOXINS IN ONION

AUTHOR: Ana Paula Moura Guimarães Carvalho

ADVISOR: Prof. Drª Eliana Badiale Furlong.

August 31th, 2011, Rio Grande, RS, Brazil

The world production reached 80 million tons per year, considering that shells represent 20 %

of this amount annually are generated approximately 1,162,000 tons of tailings. A few years

ago, this material was discarded in the environment, at present the environmental protection

laws, demanded in concern with rice husk (FOLETO, 2005). According to Mayer (2006) the

shell takes about 5 years to decompose and gives off a high volume of methane, a greenhouse

gas emissions. In order to protect the integrity of the environment, alternatives are being

sought to reduce the environmental impacts of disposal and to recover the investment in the

culture of grain. Because of its high content of silicon and rice husk, the raw material is of

great interest for application in various industries: electronics industry, and agriculture and

ceramics can also be used as an energy source and be applied as an adsorbent in chemical

analysis (FOLETO , 2005; ROSA, 2009). In this work the objective was to standardize the

method for determination of aflatoxins B1, B2, G1, G2 and ochratoxin A the onion, using the

extraction technique, Dispersion Matrix Solid Phase (MSPD), and rice husk as adsorbent of

order to enable the determination of contaminants using thin layer chromatography for high

efficiency (HPTLC) and / or high performance liquid chromatography coupled with

fluorescence detector (HPLC-FD). The onion (Allium cepa L.) was chosen because the matrix

its economic importance, it is the third most economically important vegetable crop in Brazil,

after the tomato and potato. The country is among the ten largest producers in the world, and

in the 2010 crop production was 1,548,146 tons. Among the states that stand out for their

production are: Santa Catarina, Sao Paulo and Rio Grande do Sul However, onions and other

foods are susceptible to fungal contamination and between the microbiota are toxigenic

species can occur in the production of mycotoxins. The method was validated by evaluating

calibration curve, linearity, limits of detection and quantification, precision (repeatability and

intermediate precision) and accuracy (recovery) for each type of chromatographic

determination. For HPTLC, detection limits ranged from 0.33-5μg kg-1

and quantification of

1-15ug kg-1

for the HPLC-FD method detection limits ranged from 0.003 to 0.26 μg kg-1

and

the quantification of 0.03 to 2.6 μg kg-1

. The HPTLC method for the recovery ranged from 76

to 95% and HPLC-FD ranged from 72-88%. The method was applied to verify the occurrence

of mycotoxins in 14 samples of onion. The aflatoxin contamination was found in 43% of the

samples. The maximum level found was 90 μg kg-1 for aflatoxin B2 in a sample of Creole

onion, with the black spot defect.

Keywords: mycotoxin, MSPD, rice Husk HPTLC, HPLC-FD

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Defeitos na cebola......................................................................................... 22

Figura 2 - Estrutura química da Ocratoxina A............................................................... 29

Figura 3 - Estruturas químicas das aflatoxinas.............................................................. 31

Figura 4 - Esquema representativo de extração em técnica MSPD............................... 37

Figura 5- Cromatoplaca com padrões de micotoxinas.................................................. 66

Figura 6 - Cromatogramas separação das AFAs............................................................ 67

Figura 7 - Superfície de resposta para a recuperação de AFG1...................................................... 77

Figura 8 - Comparação dos cromatogramas (A) separação das AFAs (B) fase móvel

(C) branco......................................................................................................

82

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Classificação da cebola quanto às dimensões do bulbo................................ 20

Tabela 2 - Aspectos econômicos e toxicológicos de algumas micotoxinas................... 26

Tabela 3 - Limites máximos de micotoxinas estabelecidos para diversos alimentos.... 33

Tabela 4 - Legislação internacional de aflatoxinas em tipos de alimentos para

consumo humano e animal.........................................................................

34

Tabela 5 - Composição mineral da casca e da cinza de casca de arroz in natura......... 42

Tabela 6 - Absortividade molar em determinados comprimentos de onda para as

micotoxinas...................................................................................................

52

Tabela 7 - Fases móveis testadas para eluição das micotoxinas.................................... 57

Tabela 8 - Fases móveis testadas para eluição das micotoxinas.................................... 59

Tabela 9 - Variáveis para o planejamento fatorial......................................................... 60

Tabela 10 - Composição química dos diferentes tipos de cebola Nacional..................... 62

Tabela 11 - Composição química dos diferentes tipos de cebola Importada.................. 63

Tabela 12 - Conteúdo de compostos fenólicos em cebola nacional................................ 64

Tabela 13 - Composição química da casca de arroz........................................................ 65

Tabela 14 - Indicativos para a analise em HPTLC.......................................................... 66

Tabela 15 - Linearidade das micotoxinas empregando o sistema HPTLC...................... 67

Tabela 16 - Condições estabelecidas para determinação de aflatoxinas.......................... 68

Tabela 17 - Limites de detecção e quantificação instrumental e do

método..........................................................................................................

69

Tabela 18 - Resultados obtidos para a calibração das micotoxinas empregando o

sistema HPLC-FD.........................................................................................

69

Tabela 19 - Efeito Matriz empregando MSPD........................................................... 70

Tabela 20 - Recuperação média das micotoxinas empregando diferentes adsorventes e

eluentes ........................................................................................................

71

Tabela 21 - Efeito do tempo de interação na recuperação por MSPD............................. 72

Tabela 22 - Recuperação das aflatoxinas.............................................................................................................. 73

Tabela 23 - Efeitos e coeficientes para as variáveis obtidas pelo tratamento estatístico

para as recuperações da aflatoxina B1 ao nível de confiança de 95%

(p<0,05).........................................................................................................

74

Tabela 24 - Dados de ANOVA para planejamento experimental segundo as variáveis

significativas ao nível de confiança de 95% (p<0,05) para a AFB1....................

74


para as recuperações da aflatoxina B2 ao nível de confiança de 95%

(p<0,05).........................................................................................................

75


significativas ao nível de confiança de 95% para a AFB2..........................................

76


para as recuperações da aflatoxina G1 ao nível de confiança de 95%

(p<0,05).........................................................................................................

76


significativas ao nível de confiança de 95%para a AFG1...........................................

77


para as recuperações da AFG2.........................................................................................................

78


significativas ao nível de confiança de 95% para a AFG2..........................................

78

Tabela 31 - Recuperação média (%) e repetibilidade RSDr (%) para as micotoxinas

em amostras de cebola analisadas por HPTLC.............................................

80

Tabela 32 - Recuperação média (%) e precisão intermediária RSDpi (%) para as

micotoxinas em amostras de cebola analisadas por HPTLC........................

81

Tabela 33 - Resultados da precisão em termos de repetibilidade(%RSDr) e da

precisão intermediária (RSDpi) do instrumento analisados por HPLC-FL..

83

Tabela 34 - Recuperação média (%) e repetibilidade RSDr (%) para as micotoxinas

em amostras de cebola analisadas por HPLC-FD.........................................

84

Tabela 35 - Resultados da precisão intermediária (RSDpi) do método analisados em

amostras de cebola por HPLC-FD................................................................

84

Tabela 36 - Contaminação com as cinco micotoxinas estudadas em amostras de

cebolas com diferentes classes......................................................................

85

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária

AFB1-Aflatoxina B1

AFB2-Aflatoxina B2

AFB1-Aflatoxina G1

AFB1-Aflatoxina G2

AOAC - Association of Official Analytical Chemists

C18 - sílica modificada com hidrocarboneto linear C18, octadecilsilano

CCD – Cromatografia de Camada Delgada

CCDAE – Cromatografia de Camada Delgada de Alta Eficiência

d.i. - diâmetro interno

EM - Efeito Matriz, do inglês matrix effect

EMBRAPA - Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária

eV - elétron-Volt

ELISA – do inglês, Enzime-Linked Imnunosorbent Assay

FAO - Food Agriculture Organization

FLD – Detector de Fluorescência, do inglês, Fluorescence Detection

GC - Cromatografia Gasosa, do inglês Gas Chromatography

GCB-Carbono grafitizado do inglês Grafitized Carbon Black

HPLC - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência, do inglês High Performance Liquid

Chromatography

HPTLC – do inglês, high performance thin layer chromatography

IARC – do inglês, International Agency of Research on Cancer

IBGE - Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística

INMETRO - Instituto Nacional de Metrologia

IUPAC - International Union of Pure and Applied Chemistry

LC - Cromatografia Líquida, do inglês Liquid Chromatography

LC-ESI-MS/MS - Cromatografia Líquida com Fonte de Ionização por Electrospray acoplada

à Espectrometria de Massas tandem Espectrometria de Massas, do inglês Liquid

Chromatography coupled with Electrospray Ionization with Mass Spectrometry tandem Mass

Spectrometry

LD - Limite de Detecção

LQ - Limite de Quantificação

MAPA - Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento

MSPD - Dispersão da Matriz em Fase sólida, do inglês matrix solid-phase dispersion

12

OMS. Organização Mundial da Saúde.

OTA – Ocratoxina A

p.a. - grau pró-análise

pH - potencial hidrogeniônico

QuEChERS - Rápido, Fácil, Barato, Eficiênte, Robusto e Seguro, do inglês Quick, Easy,

Cheap, Effective, Rugged and Safe

r - Coeficiente de correlação linear

R - Recuperação

Rf – Fator de retardamento, do inglês, Retardation Factor

rpm - rotação por minuto

RSD - Desvio Padrão Relativo, do inglês Relative Standard Deviation

RSDpi - Desvio Padrão Relativo para Precisão Intermediária

RSDr - Desvio Padrão Relativo para Repetitividade

SPE - Extração em Fase Sólida, do inglês Solid Phase Extraction

tR - tempo de retenção

TLC – do inglês, thin layer chromatography

UV - ultravioleta

v/v - volume por volume

LISTA DE ANEXOS

ANEXO A – Série Eluotrópica

ANEXO B – Linearidade das curvas analíticas em HPTLC

ANEXO C – Linearidade das curvas analíticas em HPLC-FD

ANEXO D – Caracterização físico-química da cebola

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 16

2 OBJETIVOS ............................................................................................................... 18

2.1 Objetivo geral .............................................................................................................. 18

2.2 Objetivos específicos ................................................................................................... 18

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .................................................................................. 19

3.1 Cebola: aspectos gerais .............................................................................................. 19

3.1.1 Composição química das cebolas ................................................................................ 22

3.2 Contaminação fúngica ................................................................................................ 23

3.3 Micotoxinas ................................................................................................................. 24

3.3.1 Aspectos gerais ............................................................................................................. 24

3.3.2 Característica de micotoxinas freqüentemente encontradas em alimentos ................. 27

3.3.2.1 Ocratoxina A (OTA) ..................................................................................................... 27

3.3.2.2 Aflatoxinas ................................................................................................................... 29

3.3.3 Legislação ..................................................................................................................... 32

3.4 Determinação de Micotoxinas ................................................................................... 35

3.5 Extração por dispersão da matriz em fase sólida .................................................... 36

3.5.1 Casca de arroz .............................................................................................................. 41

3.6 Cromatografia ............................................................................................................. 42

3.7 Validação de métodos analíticos ................................................................................ 44

3.7.1 Efeito matriz ................................................................................................................ 47

4 MATERIAIS E MÉTODOS ...................................................................................... 50

4.1 Solventes e reagentes .................................................................................................. 50

4.2 Instrumentos ............................................................................................................... 50

4.3 Padrões de micotoxinas .............................................................................................. 51

4.3.1 Preparo dos padrões analíticos .................................................................................... 51

4.4 Amostras de cebola ..................................................................................................... 53

4.4.1 Amostragem .................................................................................................................. 53

4.4.2 Caracterização físico-química da cebola ..................................................................... 53

4.5 Casca de arroz ............................................................................................................. 54

4.5.1 Caracterização físico-química da casca de arroz ........................................................ 54

4.5.2 Tratamento da casca de arroz para uso como adsorvente ........................................... 55

4.6 Estabelecimento das condições cromatográficas ..................................................... 55

4.6.1 Condições para determinação por HPTLC .................................................................. 55

4.6.2 Condições para determinação por HPLC-FD ............................................................. 57

4.7 Adequação da técnica de extração por dispersão em fase sólida (MSPD) ............ 58

4.7.1 Testes preliminares ........................................................................................................ 58

4.7.2 Planejamento experimental para adequação do emprego da casca de arroz como

adsorvente ..................................................................................................................... 59

4.8 Avaliação da eficiência das condições de MSPD estabelecidas .............................. 60

4.9 Aplicação da metodologia para avaliar ocorrência de micotoxinas em cebolas ... 61

5 RESULTADOS E DISCUSSÕES ............................................................................. 62

5.1 Caracterização físico-química da cebola .................................................................. 62

5.2 Caracterização da casca de arroz ............................................................................. 64

5.3 Estabelecimento das condições cromatograficas ..................................................... 65

5.3.1 Condições para determinações por HPTLC ................................................................ 65

5.3.2 Condições para determinações por HPLC-FD ............................................................ 67

5.4 Efeito de matriz na extração por MSPD .................................................................. 70

5.5 Padronização da técnica de MSPD ........................................................................... 70

5.5.1 Testes preliminares ....................................................................................................... 70

5.5.2 Planejamento Fatorial para adequação da extração em MSPD ............................ 73

5.6 Método Desenvolvido ................................................................................................. 79

5.6.1 HPTLC .......................................................................................................................... 79

5.6.2 HPLC-FD ..................................................................................................................... 81

5.7 Aplicação dos métodos na determinação de micotoxinas em amostras de

cebolas .......................................................................................................................... 85

6 CONCLUSÕES ........................................................................................................... 87

REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 88

ANEXOS ................................................................................................................... 102

16

1 INTRODUÇÃO

A cebola (Allium cepa, L.) esta entre os vegetais de mais amplo cultivo e emprego na

alimentação mundial. O valor da produção esta estimado em cerca de US$ 6 bilhões anuais, o

que a coloca como uma das três hortaliças mais importantes ao lado do tomate e da batata.

(EMBRAPA, 2011)

Alguns dos seus componentes auxiliam na prevenção de algumas doenças, sendo

caracterizada como um alimento funcional, ao qual são atribuídas funções antiviral,

anticancerígena e anti-hipertensiva, dentre outras (MULLEN et al., 2004; MOGREN et al.,

2008; GÁNDARA et al., 2011). No entanto, assim como outros tecidos vegetais comestíveis,

a cebola, pode ser contaminada por micro-organismos sendo os fungos os mais prováveis,

cujas espécies toxigênicas podem produzir metabólitos secundários tóxicos denominados

micotoxinas. Estas substâncias químicas estão associadas a doenças que variam desde um

distúrbio gastrintestinal, imunológico, diminuição da velocidade de crescimento até câncer

(GOLDMAN et al., 1996; MULLEN et al., 2004; MOGREN et al., 2008; ZIELINSKA, et al.,

2008; SHIMIZU et al., 2011).

Os fungos podem contaminar os vegetais no campo ou após a colheita e causar

alterações sensoriais e nutricionais no tecido. Porém o aparecimento das micotoxinas em

diferentes matrizes está diretamente relacionado, à espécie contaminante e seu potencial

genético em resposta a fatores ambientais como umidade, temperatura, condições de manejo

da cultura, armazenamento e transporte, que representem estresse para o metabolismo

fúngico. A descontaminação por degradação destes compostos é fortemente dificultada pela

estabilidade de suas estruturas a condições químicas ou físicas diversas. Logo a maneira mais

eficiente para evitar a contaminação em alimentos é prevenir o crescimento de fungos e evitar

condições de estresse do micro organismo (SUBRAHMANYAM, 2009; DALIÉ, 2010;

DORS, 2011).

Tendo em vista que os problemas causados pela contaminação por micotoxinas

ocorrem em todo o mundo, representando um perigo para a saúde pública e um grave

problema econômico, a fiscalização através de dados provenientes de metodologias adequadas

é extremamente necessário para minimizar os riscos.

A metodologia analítica para a determinação de micotoxinas, como de qualquer outro

analito consiste em etapas de extração, limpeza, separação, detecção, quantificação e em

17

muitas circunstâncias por confirmação, dada a ocorrência aleatória delas. Dentre as técnicas

de extração que vem sendo adotadas, visando melhores recuperações de compostos traços, a

Dispersão da Matriz em Fase Sólida (MSPD, do inglês, matrix solid-phase dispersion), tem se

destacado por sua simplicidade, rapidez, flexibilidade, utilização de pequenas quantidades de

amostras e de solventes, rendimento e seletividade aceitáveis (DÍAZ et al., 2009; LAGANÁ

et. al., 2010). Os adsorventes mais utilizados nesta técnica são os lipofílicos, tais como C18 e

menos freqüentemente, C8, outros materiais como sílica, polímeros sintéticos, florisil, fibras

de grafite também podem ser utilizados (BARKER, 2000; YOU-ZHAO HE et al., 2006;

LAGANÁ et al., 2010). A casca de arroz bem como a cinza da casca, em função do seu alto

teor de sílica na forma amorfa, podem ser utilizadas como adsorvente em técnicas de extração

como a MSPD (FOLETO, 2005).

Para recuperar analitos de amostras com atividade de água elevada, como é o caso da

cebola, são necessários massas maiores que nas demais matrizes e volumes de solvente

compatíveis. Estes são posteriormente evaporados ou descartados durante as diversas etapas

de preparação de amostra, representando um risco no ambiente de trabalho e na necessidade

de investimentos no descarte dos resíduos analíticos para prevenir impactos maiores. Assim

procedimentos que evolvem MSPD chamam a atenção pelas características descritas e são,

portanto, muito promissores para resolver estes problemas específicos de matrizes como a

cebola.

Na determinação de micotoxinas, além das etapas de extração e purificação serem

decisivas, é necessário o emprego de técnicas cromatográficas para identificar e quantificar

cada uma delas presentes numa matriz, visto que a toxicidade dos diferentes grupos é distinta

e há sempre a possibilidade de co-ocorrência de contaminantes produzidos por fungos de

diferentes espécies. Comumente são empregadas a cromatografia de camada delgada,

cromatografia líquida ou a gás acopladas a detectores universais, como os de massa ou

específicos como os de fluorescência. No entanto, os extratos de amostras para determinação

destes compostos requerem o mesmo tipo de cuidados analíticos independentemente do

sistema de identificação e quantificação que venham a ser adotados.

18

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Padronizar o método de extração, empregando a técnica Dispersão da Matriz em Fase

Sólida (MSPD), para determinação de aflatoxinas B1, B2, G1, G2 e ocratoxina A em cebola,

tendo casca de arroz como adsorvente.

2.2 Objetivos específicos

- Avaliar o emprego de casca de arroz como adsorvente na técnica de MSPD para

extração simultânea de micotoxinas

- Estabelecer os indicativos de mérito do método de extração para determinação de

micotoxinas por HPTLC e HPLC-FD

- Aplicar o método validado na determinação de ocorrência de micotoxinas em

amostras de cebola

- Caracterizar físico-quimicamente as amostras de cebola, visando correlacionar com a

ocorrência de contaminantes.

19

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1 Cebola: aspectos gerais

A cebola (Allium cepa, L.) é um bulbo de caule pouco desenvolvido, cônico, maciço,

coberto por folhas modificadas. Esta planta subterrânea possui as raízes na parte inferior do

caule. As folhas representam a porção comestível, podendo ser do tipo túnicas ou escamadas

que desempenham a função de armazenamento de nutrientes para outras porções do vegetal

durante seu ciclo de vida (GEMTCHÚJNICOV, 1976; RAVEN, EVERT e EICHHORN,

1996; SHIMIZU et al., 2011).

Registros indicam que a cebola vem sendo cultivada a mais de 5000 anos, e que era

consumida por todos os povos antigos (caldeus, gregos e romanos). No Egito há documentos

que descrevem a importância da cebola como alimento, e também, uma vez que, foi

encontrada em sarcófagos, associada às superstições e mitologia egípcias

(GEMTCHÚJNICOV, 1976, SHIMIZU et al., 2011).

No Brasil a cebola é a terceira hortaliça, depois do tomate e da batata, mais importante

economicamente, visto que o país esta entre os dez maiores produtores do mundo. Na safra de

2009 a produção Brasileira foi de 1.412.938 toneladas e na safra de 2010 a produção foi de

1.548.146 toneladas, o que representa uma variação positiva de 9,6% (IBGE, 2009; FAO,

2009). Os estados de Santa Catarina, São Paulo e Rio Grande do Sul são os três maiores

produtores de cebola do país, sendo que o primeiro possui uma área plantada de 21.500

hectares e uma produção, na safra, 2009/2010, de 450 mil toneladas.

No Rio Grande do Sul, a cultura da cebola é vista como uma das mais importantes

para os pequenos agricultores, cuja produção em 7.854 hectares, na safra de 2009 foi de

171.736 toneladas e 180.136 toneladas em 2010, demonstrando uma variação positiva de

4,9% (EMBRAPA 2011; IBGE, 2009) No entanto, a localização geográfica de algumas

regiões produtoras do RS, dificulta a comercialização rápida do produto “in natura”. As

condições climáticas também propiciam a contaminação fúngica, levam a necessidade de

cultivo de variedades resistentes, condições de manejo da cultura e produção dirigida para

um segmento de mercado para propiciar sustentabilidade a economia da região, pelo

fornecimento de matéria prima de melhor qualidade (EMBRAPA 2011).

20

BONACCORSI et al (2008) mencionam que as variedades de cebola existentes no

mercado são muitas e seus cultivares podem ser classificados quanto ao foto período; formato

de bulbo (periforme, chato, redondo, bojudo e outros); coloração das escamas (amarelas,

roxas, brancas e verdes); sistema de plantio (mudas ou semeadura direta); finalidade (mesa,

conserva, molhos e outros) e dimensões de bulbo.

Na Tabela 1 estão as classes de cebola que são adotadas para a comercialização de

cebolas, conforme órgãos oficiais (EMATER, 2009 e MAPA, 2011)

Tabela 1 - Classificação da cebola quanto às dimensões do bulbo

Classes ou calibres Maior diâmetro transversal do bulbo (mm)

2 Maior que 35 até 50



5 Maior que 90

Fonte: MAPA 2011.

A Portaria n° 529, do Ministério da Agricultura do Abastecimento e da Reforma

Agrária aprovou em 1995 o Regulamento Técnico MERCOSUL de Identidade e Qualidade da

Cebola, que contém as normas para o comércio da cebola “in natura”: ”A cebola é um bulbo

pertencente à espécie Allium cepa, L, cujos defeitos graves apresentados neste são o talo

grosso, podridão, mancha negra e mofado. Os defeitos leves são o colo mal formado ou

deformado do bulbo, a falta de revestimento externo, falta de turgência e os danos mecânicos.

A cebola que não atender aos requisitos da norma são classificadas como “fora do padrão” e

comercializada somente com tal designação na embalagem, no que diz respeito ao comércio

em território nacional. São desclassificadas e proibidas para comercialização toda a cebola

que apresentar resíduos de substâncias nocivas a saúde (acima dos níveis admitidos no âmbito

do MERCOSUL) e que apresentar em mau estado de conservação, sabor e odor estranho”.

O surgimento de defeitos em cebolas é ocasionado por fatores, tais como: a

conservação pós-colheita de maneira inadequada, em que a temperatura e a umidade relativa

devem ser os principais elementos controlados durante o armazenamento e transporte. De

forma geral, as cultivares que possuem alto teor de matéria seca, alta pungência, boa

dormência e que tenham sido colhidas no ponto ideal, bem como submetidas à cura podem ser

21

armazenadas por até cinco meses sob temperatura ambiente e umidade relativa entre 60 e

80%. Condições de umidades relativas superiores a 80% favorecem a brotação e o

desenvolvimento de podridões, como a causada por Aspergillus niger. Em regiões produtoras

que necessitam armazenar os bulbos por períodos extensos é recomendado o uso da

refrigeração (EMBRAPA, 2011).

Para evitar o surgimento de defeitos são necessários cuidados de manuseio da cultura e

a colheita deve ser feita em momento adequado, pois o alto conteúdo de umidade na folhagem

e no “pescoço”, a maior largura do “pescoço” e a presença de substâncias reguladoras de

crescimento podem estimular a brotação após a colheita. A cebola colhida imatura ou “verde”

tem também a desvantagem de perder muito peso com a evaporação da água e terá má

conservação uma vez que não ocorre cicatrização adequada no local de corte das folhas,

prejudicando o produtor e o consumidor (EMBRAPA 2011).

A irrigação inadequada é outro fator desencadeador dos defeitos e recomenda-se sua

diminuição gradual a partir do início da maturação dos bulbos e interrompida duas a três

semanas antes da colheita, pois o alto conteúdo de umidade favorece o crescimento de micro-

organismos, que compromete a qualidade e a comercialização (EMBRAPA 2011; MAPA

2011).

Os defeitos das cebolas são denominados conforme suas características em:

- Brotado: quando possuir brotado visível acima do colo do bulbo;

-Mancha Negra: região enegrecida em função do ataque de fungos nos catáfilos

externos.

-Deformado: apresenta diferenças no cultivar, incluindo crescimentos secundários, ou

seja, bulbos unidos pelo talo, possuindo externamente catáfilos envolventes.

-Podridão: dano patológico que implique em qualquer grau de decomposição

desintegração ou fermentação dos tecidos.

-Talo grosso: quando a união dos catafilos do colo do bulbo apresentam uma abertura

maior que a normal, devido a um alongamento do talo pelo interior do mesmo” (MAPA

2011). A Figura 1 ilustra alguns destes defeitos.

22

Figura 1 - Defeitos na cebola Fonte: MAPA 2011.

3.1.1 Composição química

A ação farmacológica das plantas do gênero Allium, principalmente o alho e a cebola,

tem sido atribuída a sua composição química, tornando o consumo destes tecidos benéfico ao

organismo humano, por desempenhar funções tais como: diminuição de riscos de doenças

cardiovasculares, anti-carcinogênicidade, antiviral, antifúngica, anti-mutagênica, bactericida,

antialérgica, inibidor de agregação plaquetária e anti-hipertensiva, além de atividade

antiúlcera. Estes efeitos são atribuídos a presença de flavonóides, em especial a quercetina,

que vem sendo amplamente pesquisado. (GOLDMAN et al. 1996; MOGREN et al., 2008;

ZIELINSKA, et al., 2008; GÁNDARA et al., 2011)

As condições de cultivo (tipos de solo, sistema de produção, clima) são fatores que

influenciam a composição da cebola, bem como os fatores genéticos. Os bulbos de cebolas

frescos para consumo possuem baixo índice calórico e contem de 89 -95% de água, além de

mono e dissacarídeos (açúcares totais em média de 6%), proteínas (1,6%), gordura (0,3%) e

sais minerais (0,65%). Em sua composição também se destacam alguns compostos fenólicos,

as antocianinas (que conferem a coloração avermelhada ou roxa aos bulbos) ou as quercetinas

e seus derivados (que conferem coloração amarelada ou cor de pinhão aos bulbos). As

antocianinas, quercetinas e seus derivados são de grande interesse pelas suas propriedades

anticarcinogênicas e antioxidantes (EMBRAPA 2009; HUBER et al. 2009; ROHN, et al.,

2011).

Alguns ácidos, como málico, cítrico, succínico, fumárico, quínico, biotínicos,

nicotínicos, fólicos, pantotênicos e ascórbico são encontrados em cebolas e sua proporção é

23

variável com uma série de fatores. Diferentes minerais tais como cálcio, ferro, fósforo,

magnésio, potássio, sódio, e selênio, este ultimo de contribuição significativa para a dieta

(CHOPE et al., 2009; EMBRAPA, 2010; HUBER et al. 2009, JASTRZEBSKI et al., 2009;

PYRZYNSKA, 2009; SHIMIZU, K. et al., 2011). Também são constituintes da cebola as

vitaminas B1 (tiamina), B2 (riboflavina), e vitamina C (ácido ascórbico), nas proporções de

50 ug; 50 ug; 32 mg para cada 100 g, respectivamente (EMBRAPA, 2010).

A cebola não é considerada uma fonte de nutrientes em função dos baixos teores de proteína,

ácidos graxos e carboidratos, no entanto, seu valor condimentar, conservador e medicinal

garante a sua importância na elaboração de alimentos e papel na economia agrícola, atingindo

níveis de consumo estimado em 7,2 kg pessoa-1

ano-1

(EMBRAPA 2010).

3.2 Contaminação fúngica

A contaminação de matérias primas alimentícias por fungos depende do crescimento

destes e pode ocorrer no campo, durante e após a colheita, transporte, processamento e

armazenamento do produto (SABINO, 1996; RICHARD, 2007). Sendo que os efeitos

indesejáveis da intoxicação no homem e nos animais através da ingestão de alimentos

mofados já era conhecido antes mesmo da descoberta do uso benéfico dos fungos (PITT,

1998). A partir da identificação de que alguns tipos de fungos desempenham um papel

importante para o homem, no processamento de gêneros alimentícios como maturação de

queijos, produção de bebidas e fabricação de pães, foram desenvolvidos ao longo da evolução

tecnológica uma série de processos que aplicam a propriedade destes micro organismos

transformarem diversas matérias-primas em insumos indispensáveis (SABINO, 1996;

PARDO 2004).

O estresse, o desbalanço de nutrientes, as condições ambientais e umidade superior a

70% característico de alguns tecidos, como é o caso da cebola que possui percentuais de

umidade superior a 80%, são fatores capazes de propiciar que espécies fúngicas toxigênicas

produzam micotoxinas. Estes compostos são metabólitos secundários com função de proteger

as células fungicas contra adversidades e garantir a sobrevivência da espécie. Alguns gêneros

como Aspergillus, Penicillium e Fusarium possuem espécies com este potencial (ATROSHI

et al., 2002). Entre estes três grupos a frequência de sua ocorrência é função do habitat e

24

substrato preferencial para o seu desenvolvimento. As espécies Fusarium são fitopatógenas,

além de produzirem micotoxinas antes ou logo após a colheita. No entanto as espécies

Aspergillus e Penicillium são mais facilmente encontradas como contaminantes de

equipamentos e alimentos durante armazenamento e processamento. Os metabólitos

produzidos por estas espécies podem permanecer nas matrizes mesmo após a troca da

microbiota ao longo da cadeia produtiva, propiciando a ocorrência simultânea de micotoxinas

produzidas por diferentes espécies e com diferentes graus de toxidade (SWEENEY e

DOBSON, 1998; BENNETT, KLICH, 2003).

Espécies de fungos capazes de produzir micotoxinas, podem se desenvolver em uma

grande variedade de substratos destinados tanto a alimentação humana como animal (MIDIO,

MARTINS 2000). De todas as micotoxinas existentes somente algumas apresentam mais

destaque, pois estão claramente relacionadas com danos à saúde de humanos e de animais e

pela sua freqüência de ocorrência representam risco contínuo. São elas: ocratoxina A,

aflatoxinas, zearalenona, deoxinivalenol, patulina, rubratoxina, citrinina, toxina T-2 e

fumonisina. Todas as micotoxinas são de origem fúngica, mas nem todos os componentes

tóxicos produzidos por fungos são micotoxinas, um exemplo são os produtos fúngicos tóxicos

para bactérias denominados antibióticos e os que são tóxicos para as plantas, as fitotoxinas,

outro exemplo de composto fúngico que não é micotoxina é o etanol (BENNETT, KLICH,

2003).

3.3 Micotoxinas

3.3.1 Aspectos gerais

O termo micotoxina é derivado da palavra grega “mykes” que significa fungo

“toxicum” que significa veneno ou toxina. Estes metabolitos tóxicos produzidos por espécies

toxigênicas de fungos, podem ser ingeridos pelo homem e animais, provocando as

micotoxicoses. As micotoxinas compreendem um conjunto complexo de substâncias tóxicas

com propriedades químicas, biológicas e toxicológicas distintas, termicamente estáveis. As

principais podem ser classificadas em três grupos: as aflatoxinas, produzidas por fungos do

25

gênero Aspergillus como Aspergillus. flavus e Aspergillus parasiticus; as ocratoxinas,

produzidas pelo Aspergillus ochraceus e diversas espécies do gênero Penicillium; e as

fusariotoxinas, que possuem como principais representantes os tricotecenos, zearalenona e as

fumonisinas, produzidas por diversas espécies do gênero Fusarium (SUBRAHMANYAM et

al., 2009).

A Tabela 2 apresenta as micotoxinas mais estudadas pelos seus impactos

toxicológicos. Estão destacados os principais, fungos produtores, a estrutura química os

alimentos mais freqüentemente contaminados e os sintomas característicos observados em

animais de criação e humanos contaminados.

Tabela 2 - Aspectos toxicológicos de algumas micotoxinas

Fonte: SCUSSEL (2000); YOSHIZAWA (2001)

As formas de contato de animais e humanos com as micotoxinas podem se dar através

da ingestão de alimentos contaminados, da inalação de esporos toxigênicos e contato dérmico

direto. No entanto, a presença de fungos em alimentos não necessariamente caracteriza a

Aflatoxinas Ocratoxina A Zearalenona Tricotecenos

Fungo

produtor

A. flavus,

A.parasiticus A. ochraceus F.graminearum

Fusarium,

Stachbotrys,

Trichoderma

Estrutura

Química

Cumarinas

substituídas e

ligadas ao

deidrofurano

-fenilalanina

ligada a

isocumarina

Derivadas do

ácido resorcílico

Sesquiterpenóides

substituídos por éster e

álcool

Sintomas

em

animais

Hepatotoxicose,

carcinogênese

hepática, baixa

conversão

alimentar, redução

da lipase

pancreática.

Nefrotóxica,

hepatotóxica,

Efeitos

estrogênicos,

infertilidade.

Perda de apetite,

vômito, diarréia, perda

de peso.

Sintomas

em

humanos

Aflatoxicose,

hepatocarcigenese,

síndrome de Reye,

endofalopatia e

degeneração

gordurosa nas

vísceras.

Nefropatia dos

Balkans,

tumor renal.

Aborto, câncer

cervical.

Aleucia tóxica

alimentar (ATA),

doença de akakabi-bio,

estaquiobotriotoxicose.

Alimentos

de

ocorrência

Amendoim,

pistache, nozes,

castanha do

Brasil, trigo,

cevada, aveia,

painço, milho,

caroço de algodão

Trigo, cevada,

aveia, centeio,

milho, sorgo,

arroz, feijão,

noz, ervilhas,

grãos de café,

ração,

produtos

animais

Milho, trigo,

cevada, aveia,

centeio, sorgo,

arroz

Trigo, cevada, aveia,

centeio, milho, sorgo,

arroz, ração

condimentos.

27

contaminação micotoxicologica, uma vez que os fungos somente produzem micotoxinas em

condições de estresse ao seu metabolismo sendo os fatores mais facilmente identificáveis

como desencadeante umidade elevada na matriz e no ambiente, temperatura, período de

armazenagem, danos físicos e ocorrência de outros contaminantes biológicos. Da mesma

forma a ausência do fungo não significa a ausência de micotoxinas, pois os fungos e seus

esporos podem ser inativados por condições de processo, mas o substrato pelo o qual eles se

desenvolveram e produziram seus metabolitos permanecem contaminados (MIDIO,

MARTINS, 2000).

Uma vez que as micotoxinas, mesmo em quantidades traços, são capazes de causar

danos à saúde de humanos e de animais de criação, contaminando uma grande variedade de

alimentos que constituem a base das economias de muitos países e são difíceis de serem

removidas, vem se buscando formas de prevenção e controle. Antes da colheita os cuidados

recomendados são manejo de irrigação; uso de variedades de plantas resistentes; controle da

infestação por insetos; prevenção de danos mecânicos dos produtos; controle do período de

colheita, evitando que cultura permaneça no campo mais do que o necessário e controle do

campo mantendo-o limpo e seco (FAO, 2009)

O controle pós-colheita consiste na realização de limpeza e separação, eliminando os

produtos danificados ou afetados; inclusão na alimentação dos animais alguns tipos de

adsorventes (alumino silicatos, argilas, carvão ativo) capazes de ligarem-se fortemente as

micotoxinas presentes no trato digestivo dos animais, e assim reduzir sensivelmente a sua

biodisponibilidade e toxicidade associada (GARCIA, 2008).

3.3.2 Característica de algumas micotoxinas

3.3.2.1 Ocratoxina A (OTA)

Essa micotoxina foi descrita primeiramente por Van der Merwe, Steyne, Fourie, Scott

e Theron em 1965, que a isolaram do Aspergillus alutaceos (atualmente denominado por

Aspergillus ochraceus). Posteriormente ficou demonstrado que ela poderia ser produzida por

várias espécies de Aspergillus como o Aspergillus ostianus, Aspergillus melleus e o

28

Aspergillus Sulphureus, bem como do gênero Penicillium, como o Penicillium viridicatum,

Penicillium palitans, Penicillium cyclopium, Penicillium commune, Penicillium variabile e

Penicillium purpurescens (PITTET, 1998; PITT 2000).

Em vista da diversidade de espécies produtoras a presença desta toxina vem sendo

relatada em diversas matrizes alimentares como os cereais, café, especiarias, frutos secos,

carnes, vinhos, cervejas e em fluidos humanos e de animais (NUNES et al., 2001; ROMERO

et al., 2005). Os compostos desta família podem ser classificados em três categorias:

ocratoxina A, B e C conforme os substituintes na base cumarina fenilalanina,sendo que a

ocratoxina A (OTA) é a mais tóxica (FRINK-GREMMELS et al., 1995; CASTEGNARO et

al., 2006; KABAK, 2009).

A OTA é absorvida de forma passiva através da membrana lipídica do trato

gastrintestinal na sua forma não ionizada. Primeiramente ela é absorvida no estomago, mas

alguns autores sugerem que a sua absorção máxima ocorra no esôfago, e em menor grau no

jejuno (GALTIER, 1991; MARQUARDT e FROHLICH, 1992).

Os danos causados pela OTA são cumulativos e o período de aparecimento dos

primeiros sintomas é considerado longo (BARISIC et al 2002). Está associada a doenças

renais mortais em humanos designada por nefropatia endêmica dos Balcãs (NEB), descrita

pela primeira vez em 1956 quando os sintomas foram descritos em populações da Bulgária e

posteriormente da Iugoslávia e Romênia, embora os estudos ainda não comprovem a sua

etiologia. A patologia é crônica e se caracteriza por um aumento da incidência de tumores do

aparelho urinário, e outros danos renais, a anemia é um dos primeiros sinais da doença, que

precede aos sinais de injuria renal. Em pacientes que sofrem de NEB, aparecem sintomas de

dores de cabeça, dores lombares e perda de peso GODIN et al. 1997).

A Agência Internacional para Pesquisa sobre Câncer (IARC) classificou a OTA como

um possível agente cancerígeno (grupo 2B), bem como teratogênico, imunotóxicos,

genotóxicos e possivelmente neurotóxico (CASTEGNARO et al., 2006; KABAK, 2009). Sua

fórmula molecular (C20H18ClNO6), denominada:7-carboxil-5-cloro-8-hidroxil-3,4-dihidro-

3R-metilisocumarina-7-L--fenil-alanina. A OTA e sua estrutura é ilustrada na Figura 2.

29

Figura 2 - Estrutura química da Ocratoxina A

Sua massa molar é de 403,82 g/mol, apresenta fluorescência verde, sob luz UV,

absorve luz ultravioleta, em pH 4 em 215 nm e 333 nm, em pH 9 em decorrência da presença

de anéis aromáticos substituídos por grupos doadores de elétrons e da rigidez da estrutura.

Estas características a tornam moderadamente solúvel em solventes orgânicos como

clorofórmio, etanol, metanol e xileno (CERAIN, 2009).

A degradação da OTA pode ser alcançada através de agentes químicos como o

peróxido de hidrogênio com aquecimento e tratamento alcalino e solução de amônia

(GARDA E BADIALE-FURLONG, 2003). A fermentação realizada por fungos do gênero

Aspergillus e Rhizopus em produtos contaminados podem reduzir em torno de 70% os níveis

de contaminação (CANCIAMANI et al, 2007).

3.3.2.2 Aflatoxinas

O primeiro relato científico sobre o efeito das aflatoxinas foi descrito em 1960 na

Inglaterra, onde uma enfermidade conhecida como “doença X dos perus” ocasionou a morte s

de aves, cuja causa, foi atribuída a uma substância tóxica presente no farelo de amendoim,

proveniente do Brasil (CHEEKE e SHULL, 1985; SUBRAHMANYAM, 2009).

Nas últimas décadas aumentaram consideravelmente as pesquisas visando caracterizar

os possíveis efeitos das aflatoxinas sobre a saúde humana, com destaque para os experimentos

referentes à atividade biológica da aflatoxina B1 em células hepáticas. As aflatoxinas B1

(AFB1), B2 (AFB2), G1 (AFG1) e G2 (AFG2) pertencem a um grupo de micotoxinas

produzidos por fungos Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus e Aspergillus nomius. A

30

primeira espécie é produtora apenas de aflatoxinas B, enquanto as outras duas espécies

produzem aflatoxinas B e G (DALIÉ, 2010). As aflatoxinas são hepatóxicas, teratogênicas,

mutagênicas e carcinogênicas, o efeito da toxidade varia com a dose, tempo de exposição e

espécie animal. A Aflatoxina B1 (AFB1) é considerada a mais tóxica das micotoxinas é

classificada pela Agência Internacional de Pesquisa sobre o Câncer (IARC) como

carcinogênico Grupo 1 seguida da G1, B2 e G2 (YOSHIZAWA, 2001).

A série G das aflatoxinas difere quimicamente da série B, pois apresenta um anel 3-

lactona, onde na série B ocorre um anel ciclopentanona, também as aflatoxinas B1 e G1

possuem uma dupla ligação 8-9 na forma de um éter vinil no anel terminal furano não

encontrado em B2 e G2. As diferenças em suas estruturas conferem às aflatoxinas atividades

distintas, sendo as aflatoxinas B1 e G1 carcinogênicas e mais tóxicas que B2 e G2 (JAIMEZ et

al., 2000). O surto de doenças causado pela contaminação por aflatoxinas vem afetando uma

grande área geográfica. Mais de 123 mortes foram registradas no Quênia em 2004 e 2005.

Estudos epidemiológicos deste caso mostraram um relacionamento entre o foco e os métodos

locais de colheita, armazenamento e preparação de milho (DALIÉ, 2010).

Dentre as várias reações metabólicas de significância toxicológica em animais,

destaca-se a biotransformação da AFB1. A principal reação de ativação dessa toxina ocorre

através da epoxidação da dupla ligação de carbonos 8 e 9, pelas enzimas do citocromos P-450,

resultando em um intermediário, o AFB1 8,9- epóxido, que pode interagir com o DNA e

RNA e proteínas através de reações de sustituição nucleofilicas. Estes adutos promovem

alesão bioquímica primária produzida pelas aflatoxinas. manifestadas pelos efeitos

mutagênicos e carcinogênicos (CHEECK e SHULL, 1985; YOSHIZAWA, 2001). A excreção

da aflatoxina B1 também envolve reações de sustituição nucleofilica de seus epóxidos, um dos

caminhos envolve a abertura do anel de epóxido através da substituição nucleofilica com a

glutationa, uma molécula relativamente polar que possui um grupo sulfidrila fortemente

nucleofilico. O composto derivado dessa reação é consideravelmente mais polar do que o

epóxido original sendo então facilmente excretado através de caminhos aquosos

(SOLOMONS et al., 2005). A reação de hidroxilação, da AFB1 origina as aflatoxinas M1

(AFM 1) e Q1 (AFQ1), enquanto que a demetilação produz aflatoxina P1 (AFP1). Esses

metabólitos são conjugados e excretados principalmente através da urina e bile. A formação

desses derivados pode constituir parte do processo de detoxificação da AFB1, embora alguns

compostos, como a AFM1, também apresentem toxicidade em modelos experimentais

(BIEHL e BUCK, 1987).

31

Seus pesos moleculares são: AFB1: 312, 3; AFB2: 314,3 ; AFG1: 328, 3; AFG2: 330, 3

g mol-1

São solúveis em: metanol, clorofórmio, acetonitrila e outros solventes polares, mas

parcialmente solúveis em água (10-30 μg ml-1

). As aflatoxinas absorvem luz ultravioleta na

faixa entre 362 e 363 nm e a emissão de florescência para as aflatoxinas B1 e B2 ocorre em

425 nm e 450 nm para as aflatoxinas G1 e G2. Seus pontos de fusão são de 269, 289, 246,

240 °C respectivamente para as aflatoxinas B1, B2, G1 e G2 (MERCK, 1996; SWEENEY e

DOBSON, 1998). São denominadas: AFLA B1 (2 3,6aα, 9aα-tetrahidro-4-metoxiciclopental

[c] furo [3’, 2’: 4,5] furo [2,3h] [1]benzopirano1, 11-diona); AFLA B2 (2 3,6aα, 8, 9,9aα-

Hexahidro-4-metoxiciclopental [c] furo [3’, 2’: 4,5] furo [2,3-h] [1]benzopirano1, 11-diona);

AFLA G1 (3, 4,7aα, 10aα-Tetrahidro-5-metoxi-1H, 12H-furo [3’2’’2’: 4,5] furo [2,3h] pirano

[3,4-c] [1]benzopirano1, 12-diona) e AFLAG2 (3, 4,7aα, 910,10aα-Hexahidro-5-metoxi-1H,

12Hfuro[3’, 2’: 4,5] furo [2,3h] pirano [3,4-c] [1]benzopirano1, 12-diona) (DINIZ, 2002). A

Figura 3 ilustra as estruturas das Aflatoxinas.

Figura 3 - Estruturas químicas das aflatoxinas

32

3.3.3 Legislação

Desde 1974, vários países propuseram limites máximos para micotoxinas em

alimentos (DALIÉ, 2010). Embora os riscos à saúde humana sejam os principais fatores para

programas de monitoramento de ocorrência das micotoxinas, o impacto na economia mundial

também é considerado. Esse diz respeito às perdas causadas diretamente a animais de

produção ou alimentos (BENNETT, KLICH, 2003).

No Brasil os limites máximos de micotoxinas para diversos alimentos foram

estabelecidos segundo Resolução RDC 07/2011, publicada pela Agência Nacional de

Vigilância Sanitária (ANVISA) em 22 de fevereiro de 2011. A norma da Agência estabelece

esses limites para 14 categorias de alimentos (Tabela 3).

33

Tabela 3 - Limites máximos de micotoxinas estabelecidos para diversos alimentos

Micotoxinas Alimentos LMT (µg Kg-1

)

Aflatoxina M1 Leite fluido 0,5

Leite em pó 5

Queijo 2,5

Aflas B1, B2, G1, G2 Cereais e derivados exceto milho 5

Feijão 5

Castanha exceto castanha-do-Brasil 10

Frutas desidratadas e secas 10

Castanha-do-Brasil c/ casca consumo direto 20

Castanha-do-Brasil sem casca consumo direto 10

Castanha-do-Brasil sem casca para processamento

posterior

15

Alimento base cereal p/ alimentação infantil 1

Fórmulas infantis para lactantes e crianças de primeira

infância

1

Amêndoas de cacau 10

Produtos de cacau e chocolate 5

Especiarias 20

Amendoim com ou sem casca, cru ou tostado e derivados 20

Milho e farinha de milho 20

Ocratoxina A Cereais e derivados 10

Feijão 10

Café torrado (moído ou em grão) café solúvel 10

Vinho e seus derivados 2

Suco de uva e polpa de uva 2

Especiarias 30

Alimentos a base de cereal p/ alimentação infantil

(lactantes e crianças da 1° infância)

2

Produtos de cacau e chocolate 5

Amêndoas de cacau 10

Frutas secas e desidratadas 10

Fonte: ANVISA (2011)

34

Os limites máximos estabelecidos para as aflatoxinas, conforme mostra a Tabela 3,

assim como para as demais micotoxinas não seguem uma padronização universal o que

acarreta muitas vezes, em problemas na comercialização desses produtos no mercado externo

(DINIZ, 2002). Na Tabela 4 estão os valores de legislação para as micotoxinas em alguns

países.

Tabela 4 - Legislação internacional de Aflatoxinas em diversos tipos de alimentos para

consumo humano e animal

País Alimentos para consumo

humano (μg kg-1

)

(AFB1 +AFB2+AFG1+AFG2)

Alimentos para consumo animal

(μg kg-1

)

(AFB1 +AFB2+AFG1+AFG2)

Canadá 15 20

Cuba 5 5

Estados Unidos 20 300 (ração para bovino de corte)

20 (ração para bovino leiteiro)

200 (ração para suíno)

México 20 200 (cereais p/ bovino e ração p/ suínos)

0 (rações p/bovinos leiteiros e aves)

Suécia 5 AFB1: 50 (ingredientes p/ ração)

AFB1: 10 (ingredientes p/ ração bovino

leiteiro)

AFB1: 10 (ração completa)

AFB1: 1,5 (ração p/ bovinos leiteiros)

União Européia

AFB1: 2 AFB1: 50 (matéria prima p/ rações)

AFB1+AFB2+AFG1+AFG2: 4 AFB1: 50 (ração p/ bovinos e caprimos)

AFB1: 20 (ração p/ suínos e aves)

AFB1: 10 (ração p/ novilhos e cordeiros)

AFB1: 5 (complementos de rações)

Fonte: CAST (2003)

35

Quanto a OTA, o limite máximo estabelecido no Uruguai para os alimentos como

café, arroz, cevada e milho é de 50 μg kg-1

. Segundo a União Européia os limites de

Ocratoxina A para cereais crus é de 5 μg kg-1

, produtos derivados de cereais para consumo

direto 3 μg kg-1

e frutas secas 10 μg kg-1

. Porém, alguns países da União Européia como é o

caso da Grécia, possuem legislação extra que especifica os limites para os sucos e derivados

de maçã e para o café cru de 20 μg kg-1

; a Suécia estipulou como limite para ração de aves

200 μg kg-1

; a Itália prevê os limites para o café cru de 8 μg kg-1

, café torrado e moído de 4

μg kg-1

, cacau e produtos derivados de 0,5 μg kg-1

e para a cerveja de 0,2 μg kg-1

(MICOTOXINAS, 2011).

3.4 Determinação de Micotoxinas

Como a maioria das micotoxinas são tóxicas em pequenas concentrações, requerem

métodos sensíveis e confiáveis para a sua detecção. Em função das diferenças em suas

estruturas não é possível utilizar uma técnica padrão para detectar todas as micotoxinas.

Procedimentos adequados para algumas moléculas podem ser inadequados para outras de

características semelhantes ou para a mesma molécula em uma matriz diferente.

Os métodos analíticos para a determinação de micotoxinas em alimentos normalmente

são constituídos por etapas de extração, limpeza, separação, detecção, quantificação e

confirmação. As etapas diferem quanto os tipos de equipamentos utilizados, reagentes

disponíveis e dos requerimentos analíticos (sensibilidade, exatidão, precisão, tempo e custo).

A detecção das micotoxinas após a recuperação da matriz pode ser realizada por

procedimentos cromatográficos e de imunoensaios Estes últimos podem ser de Enzime-

Linked Imnunosorbent Assay (ELISA) e a cromatografia por imunoafinidade (IAC), que são

dificilmente adaptáveis para a avaliação de multimicotoxinas, além de elevado custo, e

utilização de proteínas frágeis como anticorpos, podendo facilmente perder sua afinidade pela

micotoxina de interesse, como resultado de mudanças sutis em condições, como temperatura e

pH (WELKE, 2010).

36

A cromatografia de camada delgada de alta eficiência (CCDAE ou HPTLC) e

cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE ou HPLC) possuem a vantagem de serem

adequadas a multimicotoxinas. No caso da utilização da HPTLC as vantagens são o baixo

custo, fácil compreensão e execução, separações em breve intervalo de tempo, versatilidade,

grande reprodutibilidade, porém apresenta uma menor precisão em comparação ao HPLC e

GC, uma vez que permite determinação semi-quantitativa dos analitos. O uso de HPLC

oferece como vantagens a versatilidade, ter como único requisito a solubilidade da amostra na

fase móvel, alta resolução, boa detectabilidade com desvios de detecção menores que 5%. As

desvantagens são alto custo do equipamento e manutenção interface entre os diferentes

componentes e experiência do operador (SYDENHAM e THIEL, 1996;

SUBRAHMANYAM, 2009).

3.5 Extração por dispersão da matriz em fase sólida (MSPD)

A extração é uma etapa fundamental para a determinação de micotoxinas, como para

qualquer outra determinação, uma vez que o objetivo desta etapa é a separação dos analitos de

intertesse dos demais componentes da amostra, através da solubilização com um solvente

adequado. A escolha do solvente extrator depende do tipo de matriz, analito, sistema de

limpeza e detecção a ser utilizado posteriormente (VAN EGMOND, 1996; JAIMEZ, 2000).

Na etapa de extração várias substâncias presentes na matriz podem ser co-extraidas,

sendo necessária uma etapa posterior de limpeza para remoção dos possíveis interferentes. Os

principais métodos para extração de micotoxinas são: partição líquido-líquido, extração em

fase sólida (SPE), MSPD, (dispersão da matriz em fase sólida) QuEChERS, (do inglês Quick,

Easy, Cheap, Effective, Ruged and Safe) e colunas de imunoafinidade (LAGANÁ et al.,

2010).

A técnica MSPD foi desenvolvida por Barker e colaboradores em 1989, originada da

técnica clássica SPE. O diferencial da MSPD está na dispersão da matriz em um suporte

sólido de forma a permitir a homogeneização da amostra e o rompimento celular (LAGANÁ

et. al., 2010). O primeiro trabalho de Barker, utilizando MSPD como técnica de extração, foi

realizado misturando tecidos bovinos com uma quantidade adequada da fase sólida (C18) em

um almofariz de vidro com um pilão de vidro, para produzir um material aparentemente

37

homogêneo. Após a etapa de homogeneização, o material obtido foi acondicionado em uma

coluna comum de SPE, e foi realizada a eluição com solvente adequado. A mistura da amostra

com um suporte abrasivo sólido propicia a ruptura mecânica da estrutura da matriz,

visualizada em microscopia eletrônica de varredura (YOU-ZHAO HE et al., 2006; LAGANÁ

et al., 2010).

Basicamente a extração por MSPD consiste em:

- macerar a amostra com adsorvente adequado, visando uma mistura homogênea;

- transferir o material homogêneo para uma coluna;

- realizar a eluição com um solvente ou uma mistura de solventes adequados;

- analisar o extrato obtido diretamente ou aplicar etapa de clean-up; (LAGANÁ et al.,

2010;).

Um esquema da aplicação da técnica de MSPD em processos de extraçâo está

apresentado na Figura 4

Figura 4 - Esquema representativo de extração em técnica MSPD Fonte: ABAD, 2006

Esta técnica de extração vem sendo utilizada para o isolamento de várias classes de

analitos que ocorrem em quantidades traços, tais como medicamentos, pesticidas,

micotoxinas, bifenilas policloradas, antibióticos e antibacterianos, surfactantes e compostos

naturais com atividade funcional, em diferentes matrizes (principalmente de origem animal,

mas também vegetais e amostras ambientais). A extração MSPD apresenta-se vantajosa para

38

amostras sólidas ou amostras semi-sólidas pela sua simplicidade, rapidez e flexibilidade,

utilização de pequenas quantidades de amostras e de solventes, condições de extração suaves

(temperatura ambiente, pressão atmosférica), além da não formação de emulsão e

acompanhada por rendimento e seletividades aceitáveis. A principal desvantagem da técnica é

a dificuldade para automatização do processo (LAGANÁ et al., 2010).

Neste sistema, “o clean-up” da amostra pode não ser necessário, dependendo da

natureza da matriz e dos instrumentos empregados para a determinação dos analitos. Quando

há uma forte interação dos analitos com a matriz sólida, a MSPD pode ser associada à

extração com líquido pressurizado (PLE), pois o uso de solventes a altas temperaturas e

pressões, podem levar ao aumento da recuperação do analito. Ainda a técnica de MSPD pode

ser melhorada por meio da extração dos analitos com solvente em banho de ultra-som antes de

eluição (BARKER, 2000; LAGANÁ et al., 2010).

Segundo Barker, 2000 a MSPD possui propriedades de retenção similares a mistura

de partição e adsorção e da mesma forma a seletividade é estritamente dependente, tanto da

natureza dos materiais adsorventes quanto dos solventes de eluição empregados. Os

adsorventes utilizados são os lipofílicos, tais como C18 e menos freqüentemente o C8, que

facilitam a dispersão de tecidos e rompem as membranas celulares, da mesma forma que os

surfactantes e detergentes utilizados em metodologias clássicas. Outros materiais como sílica,

polímeros sintéticos, Florisil, fibras de grafite também podem ser utilizados na MSPD.

Visando a diminuição do tamanho da amostra, alguns matérias abrasivos, como a areia,

podem ser utilizados com o auxílio da força aplicada durante o processo de homogeneização

com o grau e pistilo (BARKER, 2000; YOU-ZHAO HE et al., 2006; LAGANÁ et al., 2010).

O tamanho da partícula do suporte sólido exerce influência na eficiência da extração

por MSPD. Partículas muito pequenas entre 3 e 10 µm requerem um maior volume de

solvente para a eluição dos compostos. Assim, é recomendado empregar suportes sólidos com

diâmetros de partícula entre 40 e 100 µm (BARKER, 2007; DÍAZ et al., 2009). Outro

importante parâmetro é a relação entre a amostra e o material de dispersão, onde, cerca de 0,5

g de amostra estão dispersos com o suporte sólido, com índices variando de 1:1 a 1:4, tendo

algumas exceções (SORIANO et al., 2003; DÍAZ et al., 2009).

O tempo de interação entre amostra e analito também é um fator importante em MSPD

Para amostras líquidas, após a fortificação, a interação entre amostra e analito ocorre quase

que de maneira instantânea, isto ocorre em virtude das amostras serem homogêneas. No caso

de matrizes sólidas, é necessário um intervalo de contato entre o solvente e os analitos para

39

que ocorra a evaporação do solvente e a maior interação entre os compostos e a matriz

(PINHO et al., 2009). Além disso, é importante notar que o pistilo usado deve ser de vidro ou

de ágata, pois materiais porosos, como por exemplo porcelanas, podem levar a perda da

amostra (LAGANÁ et al., 2010).

Os solventes para eluição selecionados devem estar estreitamente ligados à natureza

do material sólido. Normalmente, misturas de solventes orgânicos são empregados, mas em

algums procedimentos, como PLE (extração com líquido pressurizado), a água quente fornece

resultados de recuperação satisfatórios. Como na SPE clássica, visando obter um extrato

limpo, pode-se realizar uma etapa de lavagem com um solvente adequado antes da eluição do

composto alvo (LAGANÁ et al., 2010)

Tendo em vista suas vantagens, e aplicação para o isolamento de uma grande

variedade de classes de analito, nos últimos dez anos vários autores têm empregado extração

pela técnica de MSPD para determinação de micotoxinas.

Em termos de aplicação da técnica para extrair micotoxinas alguns autores vem

empregando,adsorventes disponíveis comercialmente. SOLER et al. (2010) analisou as

aflatoxinas B1, B2, G1 e G2, e OTA em amostras de diferentes cereais. A técnica de extração

foi a MSPD, em que o adsorvente e o solvente utilizados foram C18 e acetonitrila,

respectivamente. As determinações foram realizadas por LC-QqQ-MS/MS. As recuperações

variaram entre 64% a 91%, com relação ao desvio padrão relativo, este foi menor que 19%.

Os limites de detecção variaram de 0,3 ng g-1

para as aflatoxinas e 0,8 ng g-1

para a OTA e os

limites de quantificação variaram de 1 ng g-1

para as aflatoxinas e 2 ng g-1

para a OTA, sendo

inferiores aos limites estabelecidos pela União Européia nas matrizes avaliadas.

JUAN et al. (2008) determinaram à ocorrência de ocratoxina A em cereais e produtos

a base de cereais orgânicos e não orgânicos incluindo arroz, trigo, cevada, centeio, aveia e

milho oriundos da Espanha e de Portugal, utilizaram a técnica de extração MSPD,

cromatografia líquida com detector de fluorescência (LC-FD) para detecção e quantificação e

metilação para a confirmação da ocratoxina A nas amostras. Das 83 amostras analisadas a

OTA foi detectada em 22% em concentrações que variaram de 0,20 a 27,10 ng g-1

. O

adsorvente utilizado na extração foi C8 e a recuperação das amostras fortificadas com 10 ng

g-1

de ocratoxina A variaram entre 78% a 89% com um desvio padrão de 3,66 %. Os limites

de detecção foram 0,05 ng g-1

e de quantificação 0,19 ng g-1

.

LAGANÀ et al. (2008) analisaram as aflatoxinas B1, B2, G1 G2 e M1 em amostras de

avelãs, comparando as técnicas de extração: MSPD, a homogeneização e extração ultra-

40

sônica, utilizando LC - ESI-MS-MS. O adsorvente utilizado em MSPD foi o C18. As técnicas

de extração foram consideradas eficazes, mas, devido à complexidade da matriz, os extratos

necessitaram de mais uma etapa de clean-up, usando o Carbograph-4 para a limpeza do

extrato. As recuperações obtidas através da homogeneização e ultra-som foram comparáveis,

enquanto MSPD a recuperação mostrou valores significativamente menores. A técnica de

extração ultra-sônica mostrou-se a melhor técnica.

LAGANÀ et al. (2007) determinaram aflatoxinas B1, B2, G1 e G2 em amostras de

azeite de oliva, utilizando (C18) para a tecnica de extração MSPD e LC-ESI-MS/MS para a

identificação e quantificação das micotoxinas. Os coeficientes de regressão linear foram

superiores a 0,9991 e as recuperações variaram entre 92-107%, com desvio padrão relativo

abaixo de 13%.

YOU-ZHAO HE et al. (2006) analisaram as micotoxinas, aflatoxinas B1, B2, G1 e G2,

em produtos agrícolas, com alto teor de pigmentos, como a pimenta em pó, feijão verde e

gergelim, utilizando MSPD, IAC (coluna de imunoafinidade) e cromatografia líquida com

detector de fluorescência (LC-FD), com derivação. Para a MSPD o adsorvente utilizado foi

alumina neutra e como material de limpeza o GCB, carbono grafitizado, do inglês (Grafitized

Carbon Black), a eluição foi realizada com acetonitrila. As recuperações variaram de 88% a

95% com o desvio padrão relativo (RSD) inferior a 6%. Os limites de detecção (LOD) foram

0,25 ng g-1

para as aflatoxinas B1 e G1 e 0,10 ng g-1

para as B2 e G2. Não foram encontradas

diferenças significativas, entre MSPD e IAC pelo teste t em nível de confiança de 95%.

SORIANO et al. (2004) determinaram as micotoxinas, aflatoxinas B1, B2, G1 e G2 em

58 amostras de cereais, frutas secas, ervas e especiarias, legumes, salgadinhos, nozes e

produtos a base de castanha coletadas em mercados e supermercados na Espanha. Utilizaram

MSPD (C18) para extração e cromatografia líquida com detecção por fluorescência seguida

por confirmação em cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massa usando uma

interface “electrospray”. Das 58 amostras analisadas 3 estavam contaminadas com as

concentrações 0,42 e 0,52 mg kg-1

para AFB1 e AFG1, respectivamente, em amostras de avelã,

nos produtos a base de castanha as concentrações encontradas foram 0,29 e 0,47 mg kg-1

para

a AFB1 e AFG1, respectivamente, e nas amostras de pinhão 0,30 mg kg-1

para AFG1. Estes

valores foram inferiores aos limites máximos de resíduos legislados para a União Européia.

SORIANO et al (2003) determinaram as aflatoxinas B1, B2, G1 e G2 em amostras de

amendoim, utilizando MSPD para extração e determinação por cromatografia liquida com

detector de fluorescência (LC-FD) e confirmação por LC-MS. Na etapa de extração foram

41

escolhidos C18 como adsorvente e acetonitrila como solvente. As recuperações variam de

78% a 86%, com desvio padrão relativo entre 4% e 7% e os limites de quantificação variaram

entre 0, 125 ng g-1

a 2,5 ng g-1

.

3.5.1 Casca de arroz

A produção mundial de arroz chega a 80 milhões de toneladas ao ano e o Rio Grande

do Sul é responsável por produzir anualmente o valor aproximado de cinco milhões de

toneladas. Considerando que as cascas representam 20% deste valor, anualmente são geradas

cerca de 1.162.000 toneladas desse rejeito. Há alguns anos, quase todo esse material era

descartado no ambiente, porém, atualmente as leis de proteção ambiental, demonstraram

preocupação com estes resíduos de casca de arroz (FOLETO, 2005). Segundo Mayer (2006) a

casca leva aproximadamente 5 anos para se decompor e exala um volume elevado de metano,

um dos gases responsáveis pelo efeito estufa.

Visando proteger a integridade do meio ambiente, estão sendo buscadas alternativas

para reduzir os impactos ambientais do descarte e recuperar os investimentos na cultura do

grão. Devido seu alto teor de silício a cinza da casca de arroz, é matéria-prima de grande

interesse para aplicação em vários ramos: indústria eletrônica, cerâmica e na agricultura, e

também pode ser utilizada como fonte energética, que além de reduzir as emissões de gás

metano na atmosfera, reduz o uso de energia gerada por fontes não renováveis. Porém, o

processo de queima da casca de arroz gera outro rejeito: a cinza. Mas tanto a cinza como a

própria casca de arroz, podem ser aplicadas como adsorventes em análises químicas

(FOLETO, 2005; ROSA, 2009). Porém não foram encontrados relatos do uso de casca de

arroz como adsorvente para MSPD, mesmo com as propriedades interessantes em termos de

composição química, e porosidade e custo.

A composição da casca, bem como da cinza de arroz foram determinadas por HOTZA

(2006), para as determinações a casca foi submetida a um processo de lavagem com água

deionizada para a remoção de poeira e outros componentes. A caracterização da composição

química da casca e da cinza do arroz foi determinada por técnicas de fluorescência de raios-X

em aparelho Phillips (modelo PW 24000), difração de raios-X em difratômetro Phillips

(modelo Xpert), microscopia eletrônica de varredura em microscópio Phillips (modelo XL

42

30), distribuição do tamanho de partículas segundo a técnica de difratometria a laser em

equipamento Cilas (modelo 1064L) e área de superfície específica pelo método B.E.T.

(Brunauer, Emmett e Teller), em equipamento Quantachrome Autosorb. Para realização da

medida colorimétrica foi utilizado espectrofotômetro HunterLab (modelo ColorQuest) de

geometria 45º/0º com fonte de iluminação D65 e ângulo de observação padrão 10º. Como

escala de leitura colorimétrica adotou-se o sistema de coordenadas cromáticas L* a*b* da CIE

(“Commission Internationale de I´Eclairage” – Comissão internacional de Iluminação). Os

valore encontram-se na Tabela 5

Tabela 5 - Composição mineral da casca de arroz e da cinza de casca de arroz in natura

Óxidos *Composição da CA(%) *Composição da CCA(%)

SiO2 13,55 72,10

Al2O3 0,04 0,30

Fe2O3 0,01 0,15

CaO 0,10 0,43

MgO 0,05 0,70

K2O 0,03 0,72

Na2O 0,02 0,50

MnO 0,02 0,15

TiO2 <0,010 0,05

P2O5 0,05 0,60 *(%) percentual em massa

CA: casca de arroz

CCA: cinza da casca de arroz

3.6 Cromatografia

De modo geral a cromatografia possui os mesmos princípios de uma extração, porém

uma das fases é mantida fixa enquanto a outra fase se desloca. Portanto trata-se de um

processo físico-químico de separação que encontra aplicação em todos os ramos da ciência.

Foi descrita teoricamente pelo botânico russo Mikhail Semenovich Tswett no inicio do século

20. As aplicações da cromatografia cresceram consideravelmente, devido não apenas ao

desenvolvimento de novos tipos de técnicas cromatográficas, mas também a necessidade dos

cientistas de melhores métodos para separar componentes muito semelhantes de misturas

complexas. (MÜHLEN, et al., 2004; HARRIS, 2008; SKOOG et al., 2008).

43

Em todas as separações cromatográficas a amostra é transportada por uma fase móvel,

esta pode ser um gás, um líquido ou ainda um fluido supercrítico. A fase estacionária

imiscível com a fase móvel encontra-se fixa a uma coluna ou superfície sólida. Os diferentes

componentes que compõem a mistura, a ser separada distribuem-se entre as duas fases

alternadamente (SOARES, 2006). A cromatografia pode ser classificada quanto ao meio

físico no qual as fases móvel e estacionária entram em contato em: coluna e em camada

delgada e quanto ao mecanismo de separação (SOARES, 20006; SKOOG et al., 2008).

A cromatografia em camada delgada (CCD) consiste na separação dos componentes

de uma mistura através da migração diferencial sobre uma camada delgada de adsorvente

retido sobre uma superfície plana que pode ser vidro ou alumínio. Esta técnica possui algumas

vantagens como sua simplicidade, baixo custo, separação rápida. Tradicionalmente é um

método de análise qualitativa, mas pode ser utilizada como um método quantitativo de

análise, utilizando-se a densitometria, que consiste em determinar a área e a intensidade da

mancha, a fluorescência e radioatividade, para substâncias que apresentarem estas

características (GILBERT, 2002; COLLINS, 2006). Comercialmente encontram se fases

estacionarias de espessura e partículas de diferentes dimensões. A diminuição das dimensões

das partículas resulta em maior sensibilidade da técnica, além de rapidez e menor efeito de

multicaminhos, sendo em função disso denominada cromatografia de camada delgada de alta

eficiência ou HPTLC (do inglês high performance thin layer chromatography).

A cromatografia de coluna em função da fase móvel pode ser classificada em cromatografia

líquida de alta eficiência em inglês high performace liquid chromatography (HPLC) que por

sua versatilidade de mecanismos de separação, fácil adaptação para análises quantitativas

acuradas, adequação para a separação de espécies não-voláteis ou termicamente frágeis e sua

ampla aplicabilidade a substâncias de interesse para as indústrias e ajustável a diferentes tipos

de detectores, vem se tornando a técnica analítica de separação mais amplamente utilizada em

diferentes ramos da ciência e da tecnologia (SKOOG et al., 2008; CHEN et al., 2009;

RODRIGUES et al., 2010).

A cromatografia líquida acoplada ao detector de fluorescência é sensível, visto que se

adapta a aplicação a compostos que se encontram em concentrações inferiores a 10-3

M. Sua

especificidade também é maior comparativamente a outras formas de geração de sinal

analítico, visto que se, utiliza dois comprimentos de onda característicos para o composto em

estudo (comprimento de onda excitação e comprimento de onda de emissão). Além disso a

fluorescência é uma características de cromóforos que absorvem na região do ultravioleta

44

mesmo que emitam na região visível do espectro eletro-magnético e que se distinguem pela

rigidez da estrutura onde se encontram (SOARES, 2006; MAIA et al., 2008 SKOOG et al.,

2008; HARRIS, 2008).

3.7 Validação de métodos analíticos

A fim de garantir a confiabilidade de um método analítico são recomendados uma

série de procedimentos conhecidos como validação de métodos analíticos. Segundo a

ANVISA (2003) a validação deve garantir, através de estudos experimentais, que o método

atenda às exigências das aplicações pretendidas, assegurando a confiabilidade dos resultados.

Conforme LANÇAS 2004, a validação é o ato ou efeito de validar, dar validade, tornar válido,

legítimo ou legal. Visa diminuir ou controlar os fatores que levam a imprecisão ou inexatidão

de um dado gerado. Os instrumentos e métodos analíticos devem ser validados antes do uso

de rotina, após manutenção e, intervalos de tempos regulares. Com relação aos indicativos de

desempenho e critérios de aceitação, o método é considerado validado quando forem

avaliados alguns indicativos de mérito, tais como: linearidade da curva analítica, limites de

detecção e de quantificação, exatidão, precisão e o efeito de matriz.

A obtenção da curva analítica é um dos estágios fundamentais na análise química, pois

trata-se da ferramenta mais freqüentemente utilizada para a quantificação dos analitos. Ela

pode ser descrita como um modelo matemático que estabelece uma relação entre a

concentração do analito e a resposta do sinal do detector do sinal (área/altura da banda

cromatográfica, absorvância, transmitância, variação de voltagem entre outros). A melhor

relação matemática para descrever esta relação é a de uma reta linear e crescente com a

concentração do analito (RIBANI et al., 2004; CASSIANO et al., 2009). A variável

independente (eixo horizontal) está relacionada com as várias concentrações preparadas do

padrão analítico, e a variável independente (eixo vertical) relaciona o sinal analítico obtido

para cada concentração do padrão.

45

Essa relação produz uma equação de regressão linear (Equação 1) que é considerada

válida para um certo intervalo de concentração do analito em questão, independente da

técnica instrumental utilizada. (RIBANI et al, 2004)

baxy Equação.1

onde:

y = resposta medida (altura ou área do pico);

x = concentração;

a = inclinação da curva analítica = sensibilidade;

b = interseção com o eixo y.

A linearidade refere-se à capacidade do método de gerar resultados linearmente

proporcionais à concentração do analito, enquadrados na faixa analítica específica, e a

equação que a define pode ter seus coeficientes definidos empregando a técnica dos mínimos

quadrados entre os valores das variáveis independentes e dependentes (RIBANI, 2004).

O coeficiente de correlação linear (r) é freqüentemente usado para indicar o quanto

pode ser considerada adequada à reta como modelo matemático, uma vez que demonstra uma

menor variação dos dados obtidos quanto, mais próximo de 1 for o valor de r. Valores de r

iguais ou superiores a 0,90 são recomendados (INMETRO, 2011; RIBANI, 2004).

A quantificação do analito em validação pode ser realizada através de diferentes

formas de padronização. A padronização externa, que compara a área da substância a ser

quantificada na amostra com as áreas obtidas com soluções de concentrações conhecidas

preparadas a partir de um padrão. A padronização interna consiste na preparação das soluções

padrão de concentrações conhecidas do composto de interesse, às quais se adiciona a mesma

quantidade conhecida de uma substância denominada padrão interno. O padrão interno deve

ser similar à substância a ser quantificada, ter tempo de retenção próximo a esta substância,

não ser constituinte da matriz bem como não reagir com os componentes da matriz, e no

cromatograma ficar separada de todas as demais substâncias presentes na amostra (RIBANI,

46

2004). Superposição de matriz, este método baseia-se na adição do padrão da substância em

diferentes concentrações em uma matriz semelhante à da amostra, isenta da substância, e

construção do gráfico de calibração relacionando as áreas obtidas com as concentrações dos

padrões. Este método pode ser utilizado para calibração, tanto com a padronização interna

como com a padronização externa e é utilizado a fim de compensar o efeito da matriz ou de

possíveis interferentes. É importante em determinações quando a matriz pode interferir na

pré-concentração, extração, separação ou detecção da substância de interesse (KRUVE et al.,

2008).

O limite de detecção (LD) representa a menor concentração da substância a ser

analisada que é capaz de ser detectada, mas não necessariamente quantificada utilizando,

procedimento experimental. O limite de quantificação (LQ) representa a menor concentração

da substância a ser analisada que é capaz de ser medida utilizando procedimento

experimental. Os valores do LD e do LQ podem ser estimados através de métodos de

detecção visual, relação sinal/ruído e estimativa empregando curva analítica (PASCHOAL et

al., 2008). A estimativa do LD é geralmente 3 vezes a razão sinal/ruído e o LQ é estimado

multiplicando-se 10 vezes a razão sinal ruído (RIBANI et al., 2004).

A exatidão ou recuperação é um termo aplicado a figura de mérito e representa a

proximidade entre os resultados obtidos pelo método em estudo, com relação a um valor dito

como verdadeiro (RIBANI et al., 2004). Normalmente ela é expressa em termos de

percentagem e os procedimentos usuais para determiná-la empregam materiais de referência

certificado e/ou realização de ensaios de recuperação (INMETRO, 2011).

A recuperação é o indicativo mais utilizado para a validação de métodos analíticos, que é

calculado através da comparação do resultado da extração de uma quantidade conhecida do

analito adicionado na matriz com o resultado obtido para o analito em amostras preparadas

em solvente. Geralmente a dispersão dos resultados aumenta com a diminuição da

concentração e a recuperação pode diferir consideravelmente a altas e baixas concentrações.

(RIBANI et al., 2004). A ANVISA recomenda que a recuperação pode ser calculada em três

níveis de concentração, próximos ao limite de quantificação.Os intervalos aceitáveis de

recuperação para análise de traços geralmente estão entre 70 e 120%, com precisão de até ±

20%. (RIBANI et al., 2004)

A precisão de um método analítico representa o grau de concordância dos resultados

entre ensaios independentes, repetidos de uma mesma amostra, amostras semelhantes ou

padrões sob condições estabelecidas. É expressa através da estimativa do desvio padrão

47

relativo, sendo aceitáveis valores até 20% para análises traços. A precisão pode ser

determinada em termos de repetibilidade e precisão intermediária (LANÇAS, 2004).

A repetibilidade representa o grau de concordância entre os resultados de medições

sucessivas de um mesmo método analítico, realizadas sob as mesmas condições, ou seja:

mesmo procedimento; mesmo analista; mesmo equipamento usado sob as mesmas condições;

mesmo local; mesmos reagentes e repetições em um curto intervalo de tempo. (ANVISA,

2003; RIBANI et al., 2004; CASSIANO et al. 2009).

A precisão intermediária indica a habilidade do método em fornecer os mesmos

resultados dentro do mesmo laboratório, mas em diferentes dias, por diferentes analistas e/ou

diferentes equipamentos (CASSIANO et al., 2009).

A robustez de um método analítico mede sua suscetibilidade frente a pequenas

variações que podem ocorrer durante as análises de rotina (CASSIANO et al., 2009).

Considera-se robusto o método que não é afetado por uma modificação pequena e deliberada

em seus parâmetros (INMETRO, 2011). Alguns exemplos de variações incluem: tempo de

extração, estabilidade das soluções analíticas, variação do pH da fase móvel e composição da

fase móvel em LC. A robustez do método também pode ser avaliada através da variação da

matriz (ANVISA, 2010).

A robustez do método MSPD modificado foi avaliada pela variação da matriz, uma

vez que este foi aplicado para variedades distintas de cebolas e diferentes tempos de extração.

3.7.1 Efeito de matriz

As análises de amostras complexas, como frutas, vegetais, mel, sucos, vinhos, óleo de

oliva, tecidos animais, leite humano, solos, entre outros, possuem um efeito de matriz mais

acentuado.

Segundo o INMETRO (2007) a matriz pode conter interferentes, capazes de comprometer o

desempenho da medição pelo detector selecionado, aumentando ou reduzindo o sinal

cromatográfico. Mesmo para detectores específicos como o de fluorescência, constituintes da

matriz podem interferir nas análises inibindo ou mesmo aumentando a emissão de luz em um

determinado comprimento de onda (BARBOSA, 2005, CASSIANO et al, 2009).

48

Os problemas gerados pelos componentes da matriz nas respostas do detector não

dependem somente das características desses componentes, mas também das próprias

condições cromatográficas, particularmente na coluna cromatográfica. Por exemplo, quando

uma nova coluna é colocada no sistema cromatográfico, inicialmente pouco ou nenhum efeito

de matriz é observado. Entretanto, o efeito de matriz (EM) nas análises aparece após algumas

semanas de uso, em razão das sucessivas injeções e da conseqüente contaminação do sistema

cromatográfico (NEVES et al., 2009).

A interferência da matriz pode ser determinada pela razão entre a área do padrão

preparado no extrato branco da matriz e a área do padrão preparado em solvente. Se o valor

para esta razão for igual a 100% não há interferência da matriz nas analises (PRESTES 2007).

Há outras formas de calcular o efeito causado por componentes da matriz na resposta

cromatográfica THOMPSON et al. (2002) sugerem avaliar o EM através da comparação dos

coeficientes angulares das curvas analíticas obtidas para o solvente e para matriz através do

teste t (Student). Para esse caso indica-se avaliar primeiramente se as variâncias residuais das

duas curvas são significativamente diferentes, através do teste F para em seguida aplicar o

teste t mais apropriado (TEXEIRA, 2009).

Visando minimizar o efeito de matriz, após a extração uma etapa adicional pode ser realizada

para separar satisfatoriamente os analitos de co-extrativos remanescentes, denominado

limpeza dos extratos. Comumente, são empregados procedimentos como cromatografia de

permeação em gel, cromatografia por adsorção, cartuchos de extração em fase sólida

empregando vários tipos de adsorventes (sílica, C-18, carvão ativado, alumina, florisil, C-8,

etc.), dispersão da matriz em fase sólida (MSPD) e, mais recentemente, a extração com

partição em baixa temperatura. As duas últimas técnicas consideram a extração e a limpeza

realizadas simultaneamente. Porém este processo de limpeza pode resultar em perda de

alguns compostos, bem como aumentar o tempo e o custo das análises. Esta etapa representa

a alternativa mais recomendada para reduzir o efeito de matriz, por causar menos danos ao

sistema cromatográfico. Schenck e Lehotay observaram que a utilização de carvão ativado na

etapa de limpeza resultou na total remoção de pigmentos de extratos de frutas e vegetais. Ao

combinar carvão ativado com cartuchos de extração em fase sólida (adsorventes trocadores

de íons e com grupos aminos), além da eliminação dos pigmentos, havia também redução

significativa do efeito de matriz (NEVES et al., 2009).

Mesmo que métodos como limpeza de extratos e adequadas condições

cromatográficas sejam empregadas, os EM ainda podem ser persistentes. Assim,

49

superposição da matriz é uma forma de calibração externa e uma ótima alternativa para

compensar o EM e fornecer resultados adequados de exatidão quando se trabalha com a

determinação de compostos traços em matrizes complexas (KRUVE et al 2008).

50

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Solventes e reagentes

- Acetato de etila Vetec (Brasil);

- Acetonitrila Vetec (Brasil);

- Ácido clorídrico Synth(Rio de Janeiro - Brasil).

- Ácido fórmico p.a. 98% (Merck, RJ, Brasil);

- Ácido sulfúrico Synth(Rio de Janeiro - Brasil)

- Água destilada;

- Água Ultrapura, purificada em sistema Direct-Q UV3® Millipore (resistividade 18,2

MΩ cm);

- Benzeno (Merck, RJ, Brasil).

- Celite LabSynth (Brasil);

- Clorofórmio Quimex (Brasil);

- Fenolftaleína Vetec(Rio de Janeiro - Brasil).

- Hexano LabSynth (Brasil);

- Hidróxido de sódio Synth(Rio de Janeiro - Brasil).

- Metanol Vetec (Brasil);

- Nitrogênio comprimido White Martins (Brasil);

- Tolueno Vetec (Brasil);

4.2 Instrumentos

- Agitador de tubos PHENIX AP 56 (Brasil).

- Balança analítica GIBERTINI E42S-B (Italy).

- Banho Maria BIOPAR COEL TLK 48 (Brasil).

- Banho Ultrassônico UNIQUE Ultra Cleaner 700 (Brasil).

51

- Centrífuga Prevac DCS-16-RV (Argentina).

- Concentrador TECNAL TE-019 (Brasil).

- Cromatógrafo líquido de alta eficiência (HPLC) composto por bomba LC-AT,

desgaseificador DGU, controlador CBM-20A, detector SPD-20A, injetor manual 7725i com

alça de 20 μL, detector FL-10AXL e software LC Solution- Shimadzu.

- Destilador QUIMIS 341-25 (Brasil).

- Evaporador Rotativo QUIMIS Q-344B2 (Brasil).

- Blender de laboratório WARING COMMERCIAL 34BL97 (7012) (USA).

- Lâmpada ultravioleta de alta intensidade, modelo UVGL 58, multibanda 254-366 nm

MINERAL LIGHT (Brasil).

- Mesa Agitadora Orbital TECNAL TE-141 (Brasil).

- Placas para cromatografia em camada delgada de alta eficiência (HPTLC). Nano

sílica; partículas médias 2 – 10 μm, Macherey-Nangel (Alemanha).

- pHmetro Hanna modelo 200

4.3 Padrões de micotoxinas

Os padrões utilizados de aflatoxinas: B1, B2, G1, G2 e ocratoxina A foram adquiridos

da Sigma Chemical Co, USA.

4.3.1 Preparo dos padrões analíticos

As soluções padrão das micotoxinas utilizadas foram preparadas conforme

metodologia descrita por Scott (1993). A partir de recipientes comerciais contendo em torno

de 5 mg das micotoxinas, cada uma delas foi dissolvida em 100 mL de uma mistura de

benzeno/acetonitrila p.a (98/2). As soluções estoque foram diluídas de modo a resultar em

soluções padrão cujas concentrações foram confirmadas espectrofotometricamente.

Primeiramente o espectrofotômetro foi calibrado através de uma curva padrão de soluções de

dicromato de potássio para calcular o fator de correção do instrumento (AOAC, 2000).

52

Tabela 6 - Absortividade molar () em determinados comprimentos de onda para as

micotoxinas

Micotoxina Comprimento de

onda absorção (nm)

Solvente

AFB1 360 21800 metanol

AFB2 362 24000 metanol

AFG1 362 17700 metanol

AFG2 362 19300 metanol

OTA 333 5550 Benzeno/ácido acético (99/1)

Estes dados foram utilizados para a estimativa da concentração das soluções de

trabalho conforme a equação 2

A quantificação das soluções padrão de cada uma das micotoxinas foi realizada após

varredura no espectro ultravioleta e verificação da pureza das soluções para cada composto,

empregando a equação 3 e dados da Tabela 6.

g micotoxina mL-1 = A. PM. 1000.FC.-1

Equação.2

onde:

A = valor da absorbância da solução padrão;

PM = peso molecular da micotoxina em estudo;

FC = fator de correção do instrumento;

= absortividade molar caracteristico da micotoxina em estudo, no comprimento de

onda característico.

53

4.4 Amostras de cebola

4.4.1 Amostragem

As amostras de cebolas da variedade, crioula com e sem defeitos, foram coletadas no

município de São José do Norte, no Rio Grande do Sul em março de 2009, cedidas pela

EMATER-RS após classificação segundo Regulamento Técnico de Qualidade da Cebola

(1995) do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA). As demais

variedades: cebolas roxa nacional calibre 2 e 3; roxa importada calibre 2 e 4; branca nacional

calibre 2 e 4; branca importada calibre 4; roxa cultivar orgânico calibre 2; branca cultivar

orgânico calibre 2 e amarela imporatada calibre 2 e 4 foram adquiridas de feiras e mercados

da região sul do Rio Grande do Sul empregando amostragem aleatória simples. Todas foram

classificadas de acordo com seus diâmetros conforme Regulamento do MAPA. E cada lote

das variedades coletadas foram descascados e homogeneizados em blender antes das

determinações.

4.4.2 Caracterização físico-química da cebola

O pH, a acidez, das amostras de cebola foram determinados segundo procedimentos da

AOAC (2000), a acidez determinada por titulometria de neutralização com NaOH 0,1 mol L-1

padronizada.

Os teores de umidade (n° 950.46B), cinzas (n° 920.153) lipídeos totais (n° 960.39) e

proteínas estimados pelo método de micro-kjeldahl (n° 928.08), observando os métodos da

(AOAC, 2000), estão descritos em detalhes no Anexo D.

Os fenóis solúveis e insolúveis foram extraídos em etanol e hexano, respectivamente,

e quantificados espectrofotometricamente. Para isto, foram pesados 5,000 g de amostra de

onde foram extraídos os fenóis com10 mL de etanol 80% por 10 min, seguido por

centrifugação a 6000 rpm a 10°C por 10 min. O procedimento foi repetido 2 vezes.

54

O sobrenadante (fração solúvel) foi separado do resíduo (fração insolúvel) e seu

volume completado a 25 mL com etanol 80% e quantificado pelo método de Folin Ciocalteau.

A fração solúvel foi submetida a partição com 10 mL de hexano por 10 min, seguida

por centrifugação a 6000rpm durante 15 min a 10°C. O resíduo foi hidrolisado com 60 mL de

NaOH 4 mol L-1

por 4 h., sob refluxo seguido por ajuste do pH a 1, utilizando HCl 6 mol L-1

e novamente centrifugado a seguir realizou-se a centrifugação a 6000 rpm por 30 min., a 10°C

O sobrenadante foi submetido a partição com acetato de etila, ao qual se adicionou sulfato de

sódio anidro para separar a fração aquosa, sendo a fração orgânica seca em rotaevaporador

(35°C). O resíduo foi suspenso em 10 mL com etanol 80% e quantificado pelo método de

Folin Ciocalteau (SOUZA et al 2009).

4.5 Casca de arroz

4.5.1 Caracterização físico-química da casca de arroz

A casca de arroz foi caracterizada, visando sua utilização como adsorvente na técnica

de extração das micotoxinas: AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 e OTA em cebolas, por dispersão da

matriz em fase sólida. A caracterização físico-química da casca de arroz foi realizada através

da determinação dos teores de umidade, cinzas, lipídios, proteínas e silício. Conforme

procedimentos da AOAC (2000).

Para a determinação do teor de sílica na casca de arroz foi utilizada as cinzas

insolúveis em ácido clorídrico. Para isto foi realizada a secagem em estufa com circulação de

ar da marca QUIMIS de 5 g de amostra, a 105°C, durante 1 h em cápsula de porcelana, após

foi realizada calcinação e a seguir incineração em mufla a 550°C. Às cinzas obtidas foram

adicionadas 20 mL de ácido clorídrico (1+9), agitando-se e aquecendo-se o sistema em

banho-maria por 10 min. O material obtido foi filtrado e, posteriormente, lavado com 50 mL

de água quente. O papel filtro contendo o material, foi transferido para a mesma cápsula de

porcelana em que foi feita a incineração e então este foi carbonizado, incinerado em mufla a

650°C (AOC, 2000).

55

4.5.2 Tratamento da casca de arroz para uso como adsorvente

O procedimento para o tratamento da casca de arroz consistiu em moer as cascas em

moinho de facas e separar em jogo de peneiras. Foi empregada a fração de 32 mesh. Cada

20,00 g desta fração da casca foi lavada com 80 mL de hexano em mesa agitadora orbital a

1600 rpm durante 30 minutos Após a mistura foi filtrada e a lavagem repetida três vezes. O

resíduo sólido foi novamente submetido a três lavagens consecutivas com 80 mL de metanol.

O material lavado era seco em estufa com circulação de ar, a 90 C° até peso constante.

4.6 Estabelecimento das condições cromatográficas

4.6.1 Condições para determinação por HPTLC

A escolha da fase móvel para eluição das micotoxinas em HPTLC baseou-se na

natureza química das cinco micotoxinas de interesse e na polaridade da fase móvel. Para isso,

consultou-se a “serie eluotrópica” (Anexo A) que possui relação direta com o poder de

eluição.

Sendo testadas as seguintes misturas:

-Tolueno: acetato de etila: Ácido Fórmico (3/1,5/ 0,5); Tolueno:acetato de etila:Ácido

Fórmico (1,5/ 3/ 0,5); Tolueno:acetato de etila:Ácido Fórmico (2,5/2/ 0,5); Tolueno:acetato

de etila:Ácido Fórmico (3/ 2/1).

Para aplicar as micotoxinas na placa, foram utilizadas micro seringas, adotando-se

uma margem de 1 cm de distância da borda inferior e 1 cm entre os pontos de aplicação de

padrões e amostras. As cubas cromatográficas foram previamente saturadas e conservadas

fechadas para diminuir a variabilidade do fator de retardamento (Rf). A identificação das

micotoxinas foi realizada através da fluorescência das manchas e de seu fator de

retardamento, Rf, estimado por meio da Equação 3 comparativamente para cada uma das

micotoxinas.

56

m

r

d

dRf Equação.3

onde: dr é a distancia, percorrida pelo analito em cm e dm é a distancia percorrida pelo

eluente em cm.

Foram preparadas soluções nas concentrações de 3 µg mL-1

para as Aflatoxinas e 14,5

µg mL-1

para ocratoxina A e aplicados quantidades crescentes. Estes padrões foram aplicados

em cromatoplacas de nanosílica ADAMANT com partículas médias 2–10 μm, Macherey-

Nangel (Alemanha). As plcas foram eluidas em cuba de vidro com a mistura dos solventes

tolueno: acetato de etila: ácido fórmico (3:2:1 v/v/v). Após a eluição e secagem os

cromatogramas foram visualizados sob a luz ultravioleta de ondas curtas e longas (254 e 366

nm) por três analistas experientes e os resultados empregados como médias.

A validação do procedimento foi realizada através da determinação da linearidade da

curva analítica, do limite de detecção (LD), do limite de quantificação (LQ), da exatidão

(recuperação) e da precisão (repetibilidade e precisão intermediária).

Como limite de detecção, foi considerado o nível no qual as toxinas adicionadas

podiam ser visualizadas de forma inequívoca por, no mínimo, 2 analistas treinados. O limite

de quantificação foi avaliado considerando LOD x 3 como descrito por Ribani et. al., (2004).

A exatidão estimada em termos da recuperação e a precisão em termos de repetibilidade e

precisão intermediária foram avaliadas através de fortificações em três níveis diferentes, estes

níveis fazem parte da curva são: 22,5 ng g-1

, 75 ng g-1

e 120 ng g-1

para OTA; 4,75 ng g-1

15 ng g-1

e 24 ng g-1

para AFB1 e G1 e 1,5 ng g-1

, 5 ng g-1

e 8 ng g-1

para AFB2 e G2. As

determinações foram realizadas em triplicada. A precisão intermediária foi estimada

empregando outro analista para realizar a extração de MSPD e desempenhar as análises

cromatográficas

57

4.6.2 Condições para determinação por HPLC-FD

Foi utilizado um cromatógrafo líquido de alta eficiência (HPLC) composto por bomba

LC-AT, desgaseificador DGU, controlador CBM-20A, detector SPD-20A, injetor manual

7725i com loop de 20 μL, detector FL-10AXL e software LC Solution- Shimadzu e coluna

Ascentis Supelco C18 (15 cm x 4.6 mm, 3 μm).

Os solventes testados para eluição foram: água acidificada com ácido acético (99/1),

metanol e acetonitrila em diferentes proporções, (Tabela 7) todos filtrados a vácuo através de

membranas de nylon (0,45 µm) e desgaseificados em banho de ultra-som durante 30 min à

temperatura ambiente. A vazão utilizada foi 0,9 m L min-1

a concentração das micotoxinas

utilizadas foi de 0,01 µg m L-1

.

Tabela 7 - Fases móveis testados para eluição das micotoxinas

FASE MÓVEL PROPORÇÃO

água acidificada ácido acético (99/1), metanol e acetonitrila 64:26:10

agua acidificada ácido acético (99/1), metanol e acetonitrila 54:36:10





A linearidade da resposta do instrumento e do método foi obtida através da construção

de curvas analíticas por meio de padronização externa no solvente e por superposição da

matriz com soluções analíticas preparadas em acetonitrila grau HPLC. Para a padronização

externa por superposição da matriz o extrato da técnica de extração MSPD foi seco em

atmosfera de nitrogênio e, em seguida, os frascos secos foram utilizados para preparo das

soluções analíticas através de diluições da solução padrão em acetonitrila grau HPLC. Cada

solução foi injetada em triplicata e as concentrações utilizadas foram em ng mL-1

: 8; 16; 24;

32; 40; 56; 80 para a aflatoxina B1, 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,4; 2,0 para a aflatoxina B2, 8; 16;

24; 32; 40; 56; 80 para a aflatoxina G1 e 0,5; 1; 2; 3; 4; 7; 10 para a aflatoxina G2.

58

A equação de regressão linear foi gerada utilizando o software LCSolution

(Shimadzu®) fornecendo o coeficiente de determinação (r2), coeficiente angular (a),

coeficiente linear (b) e o coeficiente de correlação linear (r), a partir do qual se avaliou a

linearidade do instrumento e do método.

A estimativa do LD do instrumento (LDi) foi realizada a partir da relação sinal/ruído

considerando o mínimo de 3 vezes a razão do sinal/ruído (S/N 3:1). Para estimar o LQ do

instrumento (LQi) foi utilizado 10 vezes a razão sinal/ruído (S/N 10:1).

Através do valor estimado do LDi e LQi do instrumento multiplicado pelos fatores de

diluição para o método de extração de MSPD modificado obtiveram-se o LDm e LQm do

método em g.kg-1

.

A exatidão do método foi avaliada pela determinação da recuperação das micotoxinas

após a fortificação de amostras de cebola em três níveis. A precisão foi estimada em termos

de repetibilidade e precisão intermediária. Os níveis para estas analises foram em ng g-1

: 5,3;

10,6; 18 para aflatoxina B1 e G1 0,06; 0,2; 0,46 para aflatoxina B2 e 0,33; 1,0; 2,3 para a

aflatoxina G2. A precisão intermediária foi estimada empregando outro analista para realizar a

extração de MSPD.

4.7 Adequação da técnica de extração por dispersão em fase sólida (MSPD)

A escolha do suporte sólido, do solvente para a eluição dos analitos, do tempo de

interação entre o analito e a matriz, das quantidades de amostra, solvente e adsorvente foram

testados com vistas a obter recuperações percentuais (R%) entre 70 e 120% e desvio padrão

relativo (RSD) menor que 20% na determinação das micotoxinas AFB1, AFB2, AFG1 e AFG2,

e OTA, em cebola in natura.

4.7.1 Testes preliminares

Foram empregadas apenas 2 micotoxinas para representarem as duas famílias de

interesse, a AFG2 por estar disponível no laboratório e por ser a menos tóxica da família das

AFAs e a OTA. Os testes foram realizados em cebola amarela importada calibre 2.

59

As recuperações referentes aos testes preliminares foram determinadas por HPTLC,

pois é um método mais econômico, gera menos resíduo e é aplicável em laboratórios com

infra-estrutura simples.

Os parâmetros testados para a MSPD foram: adsorvente, solvente e estudo do tempo

de interação. Os adsorventes testados foram C18, alumina neutra e a casca de arroz

quimicamente tratada e homogeneizada com granulometria de 32 mesh e celite na proporção

1/1. As quantidades de adsorvente e amostra foram 1, 2 e 3 g nas proporções entre amostra e

adsorvente: 1:1, 1:3 e 3:1, respectivamente. O solventes para eluição testados foram: metanol,

acetonitrila e clorofórmio e uma mistura de clorofórmio e metanol nas proporções de 27:3 e

25:5. Os volumes da mistura de solventes de eluição foram 25, 30 e 35 mL. E os tempos de

interação testados foram 1, 2 e 3 h. Para os testes referentes ao tempo de interação a amostra

(3 g) foi fortificada e dispersa por 5 min com 3 g de celite/casca de arroz tratada (1/1),

transferida para coluna de MSPD e eluída com 30 mL de clorofórmio/metanol (25/5, v/v).

4.7.2 Planejamento experimental para adequação do emprego da casca de arroz como

adsorvente

Foi realizado um planejamento fatorial 23 para estabelecer a condição que propiciasse

os maiores percentuais de recuperação simultânea das quatro micotoxinas, testando-se os

volumes da mistura clorofórmio:metanol (25, 30, 35 mL), a proporção massa de amostra e

adsorvente (1;2 e 3 g) e a massa de amostra (1, 2 e 3 g). As respostas dos experimentos foram

os teores recuperados das micotoxinas presentes nas amostras previamente fortificadas. Os

valores das variáveis testadas estão especificados na Tabela 8 e a matriz do planejamento

experimental foi realizado conforme a Tabela 9. A determinação das micotoxinas foi realizada

em HPLC-FD nas condições descritas no item 5.4.2 .

Tabela 8 - Variáveis e níveis utilizados no planejamento experimental (23)

Fatores -1 0 +1

Mistura clorofórmio/metanol (mL) 25 30 35

Mistura casca/celite (g) 1 2 3

Massa da amostra (g) 1 2 3

60

Tabela 9 - Variáveis para o planejamento fatorial 23

Experimentos Mistura (mL)

clorofórmio/metanol

Mistura (g)

Casca/celite

Massa amostra (g)

1 -1(25) -1(1) -1(1)

2 +1(35) -1(1) -1(1)

3 -1(25) +1(3) -1(1)

4 +1(35) +1(3) -1(1)

5 -1(25) -1(1) +1(3)

6 +1(35) -1(1) +1(3)

7 -1(25) +1(3) +1(3)

8 +1(35) +1(3) +1(3)

9 0(30) 0(2) 0(2)

10 0(30) 0(2) 0(2)

11 0(30) 0(2) 0(2) -1 e +1: Níveis estudados e 0: pontos centrais

Para análise estatística dos dados foi utilizado o programa “Statistica 6.0”,

considerando a recuperação como resposta das variáveis em estudo, em um intervalo de

confiança de 95%

4.8 Avaliação da eficiência das condições de MSPD estabelecidas

Para verificar a eficiência da extração das micotoxinas por MSPD tendo como

adsorvente a casca de arroz tratada e as condições estabelecidas foi realizado um

procedimento para avaliar o efeito matriz nas quantificações das micotoxinas em HPLC-FD.

Uma solução padrão contendo a mistura das micotoxinas foi adicionada ao extrato do MSPD

em acetonitrila. O cálculo do efeito matriz (%EM) segundo KRUVE et al (2008), é realizado

através da comparação da área do sinal gerado pela injeção da solução padrão diluída com o

extrato da matriz, e a área do sinal gerado pela injeção da solução padrão diluída com

solvente, conforme apresentado na Equação 5 abaixo.

100 laacetonitri padrão área

matriz padrão área% xEM

Equação. 4

61

4.9 Aplicação da metodologia para avaliar ocorrência de micotoxinas em cebolas

Após estabelecimento e validação das condições de extração e determinações

cromatográficas das micotoxinas a metodologia descrita foi aplicada para realizar um

levantamento de ocorrência em amostras de cebolas comerciais de diferentes variedades de

cebolas de diferentes procedências.

As amostras foram descascadas, cortadas e homogeneizadas em blender antes das

determinações. Para a extração por MSPD, 3 g da amostra foram homogeneizadas com

auxilio de grau e pistilo, por 5 min, com 3 g da mistura dos adsorventes casca de arroz

tratada/celite (1/1). O material homogeneizado foi transferido para uma coluna de vidro com

capacidade para 10 mL, contendo lã de vidro na parte inferior e superior. Após compactação

da coluna, foi realizada a eluição das micotoxinas a tempe ratura e presão ambiente,

utilizando 35 mL da mistura de solventes clorofórmio/metanol (25/5). O extrato foi evaporado

sob corente de N2 e o resíduo suspenso em 1 mL de benzeno para HPTLC e 1 mL de

acetonitrila para HPLC-FD.

No total quatorze amostras foram analisadas por HPTLC e HPLC-FD. As condições

escolhidas para HPTLC foram: cromatoplacas de nanosílica ADAMANT com partículas

médias 2–10 μm, Macherey-Nangel Alemanha e fase móvel tolueno: acetato de etila: ácido

fórmico (3: 2: 1 v/v/v). Para HPLC-FD as condições foram: coluna analítica Ascentis Supelco

C18 (15cm x 4,6mm, 3μm), fase móvel água acidificada 99/1:metanol:Acetonitrila

(60:28:12), vazão 0,9 mL min-1

e volume de injeção 20µL.

62

5 RESULTADOS E DISCUSSÕES

5.1 Caracterização físico-química da cebola

A classificação comercial dos bulbos de cebola é realizada através do diâmetro

transversal destes bulbos, distribuídos em quatro classes, cujos tamanhos variam entre 35 a 90

mm (MAPA, 2011). Porém, esta classificação não leva em consideração outros aspectos

capazes de refletir na qualidade do conteúdo do tecido. Em vista disto as amostras de cebola

foram classificadas de acordo com a norma e avaliadas quanto as suas propriedades físico-

químicas. Os resultados encontram-se nas Tabela 10, 11 e 12.

Tabela 10 - Composição química dos diferentes tipos de cebola Nacional

Bulbo Roxo Bulbo Branco Crioula

*Cal 2 Cal 3 **Org Cal 2 Cal 3 Org Cal 2

p H 5,56a 5,56

a 5,24

a 5,70

a 5,52

a 5,50

a 5,66

a

Acidez (%) 0,18 a

0,15 a

0,19a

0, 09 b 0, 09

b 0,20

a 0,18

a

Umidade (%) 89,60a

88,40 a

89,60a

91,00a

90,40a

90,40ª 87,10 a

Proteína (%) 2,00a

1,80 a

1,60 a

1,20a

1,00 b

2,30 a

1,50 a

Lipídios (%) 0,26a

0,24a

0,26a

0,22a

0,31a

0,22ª 0,20a

Cinzas (%) 0,38a

0,40 a

0,41a

0,37a

0,40a

0,38ª 0,38 a

*Cal- calibre. **Org- Orgânico. Letras iguais não diferem estatisticamente entre si ao nível de significância de

5%.

Não foram verificadas diferenças significativas entre as diferentes variedades e classes

de cebola para a composição química. Os resultados sugerem que as possíveis diferenças

químicas podem ser determinadas por compostos menores ,ou seja, não pelos que aparecem

em níveis percentuais. Apenas os níveis de acidez da variedade bulbo branco das classes 2 e 3

63

foram significativamente menores que nas demais. Souza et al, 2009 analisando cebolas de

bulbo branco classificadas por tamanho também não detectaram diferenças significativas

entre as amostras analisadas naquela coleta.

Tabela 11 - Composição química dos diferentes tipos de cebola Importada

Bulbo Amarelo Bulbo Roxo Bulbo Branco

*Cal 2

Cal 4 Cal 2 Cal 4 Cal 4

p H 5,39a

5,21a 5,12

a 5,18

a 5,32

a

Acidez (%) 0,23a 0,20

a 0,19

a 0,21

a 0,19

a

Umidade (%) 91,30a 89,80

a 90,50

a 91,70

a 92,10

a

Proteína (%) 1,90a

1,70a 2,30

a 2,00

a 1,70

a

Lipídios (%) 0,18a 0,21

a 0,34

b 0,29

a 0,20

a

Cinzas (%) 0,42a 0,44

a 0,38

a 0,40

a 0,41

a

*Cal- calibre. Letras iguais não diferem estatisticamente entre si ao nível de significância de 5%.

As amostras de cebola importada apresentam o mesmo comportamento que as

nacionais inclusive quando separadas por variedade e classe, sendo que as grandezas dos

valores encontrados para as amostras de cebola nacionais e importadas foram semelhantes aos

relatados por Souza et al (2009).

A Tabela 12 apresenta o conteudo de compostos fenólicos nas amostras de cebola

nacional. Os compostos fenólicos totais de um tecido podem ser determinados por seu poder

redutor e nos tecidos vegetais atuam como agentes de defesa contra pragas e contribuindo

para a pigmentação, adstringência, aroma e estabilidade oxidativa (NACZK e SHAHIDI,

2004; ANGELO e JORGE, 2007). Nas amostras de cebola foram avaliado os fenóis solúveis e

insolúveis uma vez que a atividade biológica dos compostos fenólicos depende da sua

absorção e metabolização, que por sua vez, esta relacionada com a estrutura química,

conjugação com outras substancias e solubilidade. A grande diversidade destes compostos

dificultam a correlação de seus efeitos benéficos a saúde, por isso são atribuídos a cada grupo

e não ao conteúdo total, motivando a quantificação da porção solúveis e insolúveis. Os fenóis

solúveis encontram-se compartimentalizados dentro dos vacúolos celulares e estão na forma

livre ou conjugada, são solúveis em soluções aquosas orgânicas, metanol, etanol e outras

64

misturas polares. Os insolúveis encontram-se ligados a estruturas da parede celular,

esterificados com arabinose ou resíduos de galactose (MARQUEZ-LANFER, 2008).

Tabela 12 - Conteúdo de compostos fenólicos em cebola nacional

Solúveis

(mgfenol gcebola-1

)

Insolúveis

(mgfenol gcebola-1

)

Bulbo roxo (*cal 2) 2,85b 0,62

bd

Bulbo roxo (cal 3) 2,66b 0,48

de

Bulbo branco (cal 2) 1,17a 0,13

c

Bulbo branco (cal 3) 1,75ab

0,13c

Bulbo roxo orgânico (cal 2) 2,24ab

1,04a

Bulbo branco orgânica (cal 2) 1,81ab

0,48de

Crioula (cal 2) 2,69b 0,32

ce

Com defeito (mofo) 1,80ab

0,81b

Com defeito (broto) 1,92ab

0,43de

Letras iguais não diferem estatisticamente entre si ao nível de significância de 5%.

*cal: calibre

A porção fenólica constituída por estruturas desta família que são solúveis e insolúveis

apresentaram em média 2,1 e 0,5 mgfenol gcebola-1

, respectivamente. A porção solúvel não

apresentou diferença nos níveis quantificados, entre as diferentes fontes testadas. Porem, para

a porção insolúvel, o maior conteúdo foi quantificado em cebola de bulbo roxo cultivado no

modo orgânico, o que sugere que durante o ciclo evolutivo deste tecido os fenóis vão sendo

distribuídos de forma diferente na porção solúvel e insolúvel, possivelmente atendendo a

necessidade metabólica, visto que especialmente no caso de aumento do tamanho a maior

variação decorre do acumulo de água (MIRA et al., 2009).

5.2 Caracterização da casca de arroz

Foi realizada a caracterização físico-química da casca de arroz, utilizada como

adsorvente na técnica de extração por MSPD. Foram determinados os teores de umidade,

cinzas, extrato etéreo, teor de compostos nitrogenados, bem como o teor de cinzas insolúveis

em ácido clorídrico, indicando o teor de sílica responsável pelo poder adsorvente. Os

resultados estão apresentados na Tabela 13

65

Tabela 13 - Composição química da casca de arroz

Casca de arroz Teores

umidade 12,10%

cinza 19,00%

extrato etéreo 1,00%

compostos nitrogenados 0,08%

cinzas *ins em HCl (sílica) 9,35%

*ins= Insolúveis

O teor de sílica encontrado na casca de arroz foi de 9,35 % estando de acordo com os

valores determinados por outros autores como HOTZA (2006), que após análise da

composição da casca de arroz encontrou o valor de 13,55% como teor de sílica na casca.

5.3 Estabelecimento das condições cromatograficas

5.3.1 Condições para determinações por HPTLC

Uma vez estabelecido o eluente que proporcionou uma melhor separação das

micotoxinas na cromatoplaca, conforme mostra a Figura 6, tolueno: acetato de etila: ácido

Fórmico (3: 2: 1 v/v/v), foram avaliados os fatores de retardamento, os limites de detecção e

quantificação, a curva analítica e linearidade, para as micotoxinas AFB1, AFB2, AFG1 , AFG2

e OTA (Tabelas 14 e 15). Cabe salentar que a detecção visual foi realizada por 3 analistas e os

resultados correspondem a media das três leituras.

66

Figura 5 - Cromatoplaca com padrões de micotoxinas

Tabela 14 - Indicativos para a analise em HPTLC

Indicativos analisados AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 OTA

*LD (µg Kg-1

) 1,00 0,33 1,00 0,33 5,00

**LQ (µg Kg-1

) 3,00 1,00 3,00 1,00 15,00

Rf 0,30 0,27 0,22 0,18 0,61

*LD: Limite de detecção; **LQ:Limite de quantificação

De acordo com estudos realizados em diferentes matrizes utilizando HPTLC os limites

de detecção e quantificação foram aceitáveis. Autores como Welke et al (2010) determinaram

OTA em vinho, utilizando HPTLC como técnica cromatográfica as recuperações foram de

90,4%, os limites de detecção e quantificação foram 0,016 µg L-1

e 0,1 µg L-1

respectivamente. Leite (2010) analisou solutos e micotoxinas nas águas do cultivo e

beneficiamento do arroz utilizando como método cromatográfico HPTLC os limites de

detecção foram 1,6 para a AFB1 5,6 para a AFB2 e 26 ng mL-1

para OTA.

67

Tabela 15 - Linearidade das micotoxinas empregando o sistema HPTLC

Micotoxinas Curva analítica Coeficientes de correlação (r)

Aflatoxinas B1 e G1 y = 3.0153x - 0. 4693 0.9999

Aflatoxina B2 e G2 y = 3.04441x - 0. 4588 0.9989

Ocratoxina A y =14.373x + 3.7306 0.9993

5.3.2 Condições para determinações por HPLC-FD

Os solventes empregados na fase móvel foram: água ultrapura acidificada com ácido

acético (99/1):metanol:acetonitrila, em diferentes proporções,(Tabela 5). A proporção que

proporcionou uma melhor separação das aflatoxinas foi 60:28:12 respectivamente, conforme

apresentado no cromatograma da Figura 7. As quatro aflatoxinas foram separadas em 20 min.

Figura 7 – Cromatograma da separação das AFAS onde os tempos de retenção em min

são: G2= 8.9, G1= 11.2, B2= 13.4 e B1= 17.1

A Tabela 16 apresenta as condições empregadas no sistema cromatográfico para

determinação das AFAs B1, B2, G1,e G2 no modo de eluição isocrático, coluna analítica

composta por C18 como fase estacionária e a fase móvel constituída por solventes mais

polares demonstram a aplicação de um método cromatográfico em fase reversa, na qual

analitos de polaridade intermediária são analisados (COLLINS et al., 2006; CALDAS, 2009).

68

Tabela 16 - Condições estabelecidas para determinação: AFB1, AFB2, AFG1, AFG2

Parâmetros HPLC-FD

Coluna analítica Ascentis Supelco C18 (15cm x 4,6mm, 3μm)

Fase móvel Água acidificada 99/1:metanol:ACN (60:28:12)

Vazão 0,9 mL min-1

Volume de injeção 20 μL

Detector Fluorescência

Os limites de detecção (LDi) e quantificação (LQi) do instrumento, apresentados em

µg mL-1

, e os limites de detecção (LDm) e quantificação (LQm) dos métodos, apresentados

em µg Kg-1

, para as micotoxinas estudadas, estão representados na tabela 17.

Tabela17 - Limites de detecção e quantificação instrumental (µg m L-1

) e dos métodos

(µg Kg-1

)

Micotoxinas LDi LQi LDm LQm

MSPD

AFB1 0,0008 0,008 0,26 2,6

AFB2 0,00001 0,0001 0,003 0,03

AFG1 0,0008 0,008 0,26 2,6

AFG2 0,00005 0,0005 0,016 0,16

Não há legislação que estabeleça os limites máximos permitidos para micotoxinas em

cebola, porém os limites de quantificação do método empregando MSPD estabelecidos neste

trabalho obtiveram valores menores que os limites máximos de micotoxinas estabelecidos

pela legislação brasileira (ANVISA) para a maioria dos alimentos, conforme mostra a Tabela

3. Autores como He et al. (2006) analisaram aflatoxinas em produtos agrícolas com alto teor

de pigmento como a pimenta em pó e o feijão verde. utilizando HPLC-FD, os limites de

detecção estabelecidos foram 0,25 g Kg-1

para as AFB1; AFG1 e 0,10 g Kg-1 para as AFG2

AFB2.

69

Shundo et al (2009) analisaram AFAs e OTA em amostras de pimentão oriundo do

Brasil utilizando HPLC-FL. Os limites de detecção foram 0,09; 0,09; 0,14 e 0,14 g Kg-1

, e os

de quantificação 0,23; 0,23; 0,45 e 0,45 g Kg-1

, para a AFB1; AFB2, AFG1 e AFG2

respectivamente. Para a OTA o limite de detecção estabelecido foi 0,24 g Kg-1

e de

quantificação 0,80 g Kg-1

As equações das curvas analíticas, bem como os coeficientes de correlação (r), obtidos

através de calibração externa e superposição da matriz para o sistema de Cromatografia

Líquida de Alta Eficiência estão descritos na Tabela 18.

Tabela 18 - Resultados obtidos para a calibração das micotoxinas empregando o sistema

HPLC-FD

Micotoxinas Curva analítica no

solvente

r Curva analítica na matriz r

AFB1 y = 2811369x - 9911,92 0,999 y = 2326768x + 4120,02 0,998

AF B2 y = 1,42. 108

- 4615,71 0,999 y = 2,27108 x + 1206,17 0,999

AF G2 y = 1,97. 107 x + 315,7 0,999 y = 1,76 10

7 x + 216,7 0,999

AFG1 y =1707064 x – 7009,2 0,999 y = 1913674 x + 6031 0,999

A análise das equações das curvas analíticas, dos métodos cromatográficos, nos

permite concluir que o modelo linear é adequado para as micotoxinas em estudo, pois

fornecem coeficientes de correlação (r) maiores que 0,99 demonstrando que os sistemas

cromatográficos fornecem resultados diretamente proporcionais à concentração das

micotoxinas em estudo, estando assim de acordo com os estabelecidos pela ANVISA, que

recomenda valores de r maiores que 0,99 e o INMETRO que recomenda valores acima de

0,90.

70

5.4 Efeito matriz

Para a avaliação do efeito de matriz considera-se que resultados acima ou abaixo de

100% indicam enriquecimento ou supressão respectivamente, na fluorescência do composto

analisado. A Tabela 19 expressa os valores da média do efeito de matriz para todas as

concentrações da curva para cada micotoxina. Observa-se que não houve EM significativo

para nenhuma das micotoxinas estudadas.

Tabela: 19 - Efeito Matriz empregando MSPD

Micotoxina Concentração

µg m L-1

Área Matriz Área Solvente EM (%)

Aflatoxina B1 0, 024 276851 308769 90,0

Aflatoxina B2 0, 0014 39777 43589 93,0

Aflatoxina G1 0, 024 224346 221140 101,0

Aflatoxina G2 0, 004 51477 64053 80,3

EM: Efeito matriz

Segundo os dados expressos na Tabela 19, não houve EM, significativo para nenhuma

das micotoxinas analisadas.

5.5 Padronização da técnica de MSPD

5.5.1 Testes preliminares

O sucesso desse processo de extração aplicado a tecido com alto teor de umidade para

extrair pesticidas de tomates foi testado por Pinho et al. (2009). Rodrigues et al (2010)

também adotaram a técnica de extração para determinação de resíduos de agrotóxicos em

cebolas obtendo os indicativos de mérito recomendáveis para a confiabilidade do método

71

Outros autores mencionam a utilização de MSPD para determinar micotoxinas, mas

empregaram cereais como matrizes mesmo estes possuindo teores de umidade inferiores a

15% (SOLER, et al. 2010; LAGANA, et al. 2010; YOU-ZHAO, et al, 2006; ZOLLNER, et al.

1999 e 2006). Matrizes como fluidos biológicos e vinhos também mostraram boas respostas

quando as micotoxinas foram extraídas empregando MSPD (WELKE, 2007; ZOLLNER et al,

2002)

Tendo em vista a importância do adsorvente e suas combinações com a massa de

amostra e o volume de solvente eluente, foram triados os potenciais de alguns adsorventes

convencionais como C18 e alumina (LANÇAS, 2004) tendo em vista comparar seus efeitos

com os da casca de arroz para tal função. O indicativo de eficiência da combinação destes

fatores foi avaliado pela recuperação das micotoxinas AFG2 e OTA que representaram as duas

famílias de analito de interesse. Sendo elas determinadas em HPTLC um método mais

econômico, que gera menos resíduo e é aplicável em laboratórios com infra-estrutura simples

para fins de avaliar a qualidade de alimentos em diferentes regiões produtoras. Desta forma se

o procedimento de extração fosse aplicável seriam combinados dois fatores que poderiam

baratear o monitoramento de ocorrência de micotoxinas. A Tabela 20 estão apresentados os

resultados dos testes preliminares, realizados em triplicata, para escolha do adsorvente e do

eluente.

Tabela 20 - Recuperação média das micotoxinas empregando diferentes adsorventes e

eluentes

Adsorvente (2g) Solvente (25mL) AFG2 (%) OTA(%)

*C A T/celite (1/1) Metanol 60 40

*C A T/celite (1/1) Clorofórmio 70 60

*C A T/celite (1/1) Acetonitrila 50 20

Alumina neutra Metanol 30 10

Alumina neutra Clorofórmio 40 _

Alumina neutra Acetonitrila _ _

C18 Metanol 50 30

C18 Clorofórmio 40 20

C18 Acetonitrila _ _

*CAT. Casca de arroz tratada

72

O adsorvente que apresentou as maiores recuperações para as duas micotoxinas foi a

casca de arroz tratada e celite (1:1) eluida com clorofórmio e com metanol. Em vista disto foi

realizado um teste de eluição com mistura de solventes: clorofórmio e metanol na proporção

27:3, esta proporção de mistura de solventes também foi testada por Soares e Amaya, (1989)

que emprega esta mistura para partição líquido-líquido das micotoxinas a partir de matrizes

complexas, com recuperações superiores a 80%. Os resultados da recuperação mostraram a

afinidade diferenciada das micotoxinas pelo adsorvente, pois a ocratoxina A ficava mais

aderida ao adsorvente em comparação com as AFAS e ao ser empregada a alumina neutra

como adsorvente esta não era recuperada em níveis detectáveis.

Os valores de recuperação média das 5 micotoxinas empregando 2 g de casca de arroz

tratada: celite (1:1) como adsorvente e 25 mL de clorofórmio/ metanol (27/3), como solvente

de eluição, foram 67% para a AFB1; 80% para a AFB2 e G1; 76% para a AFG2 e 76% para a

OTA. Com o objetivo de melhorar a recuperação das micotoxinas, em especial da AFB1, foi

testado também uma outra proporção da mistura de solvente extrator, clorofórmio/metanol,

25:5, bem como a influência de diferentes tempos de interação entre a amostra e os analitos

nas recuperações.

Tabela 21 - Efeito do tempo de interação na recuperação por MSPD

Micotoxinas Recuperação (%)

1h 2h 3h

AFB1 78 70 78

AFB2 76 87 87

AFG1 90 88 87

AFG2 88 88 88

OTA 80 78 78

Os resultados (Tabela 21) mostram que os tempos de interação estudados não

aumentavam os níveis de recuperação das micotoxinas, assim optou-se pelo menor tempo, 1

hora.

73

5.5.2 Planejamento Fatorial para adequação da extração em MSPD

Um planejamento fatorial foi realizado para adequar o método de MSPD empregando

casca de arroz tratada como adsorvente para extração simultânea das micotoxinas em

amostras de cebola que foram quantificadas por HPLC-FD. Os resultados deste planejamento

considerados como percentuais de recuperação para cada experimento estão demonstrados na

Tabela 22.

Tabela 22 – Recuperação das Aflatoxinas

Recuperação (%)

*Experimento AF B1 AF B2 AF G1 AF G2

1 38 23 64 41

2 57 42 76 64

3 58 66 88 72

4 63 70 91 82

5 46 27 53 33

6 42 71 77 68

7 66 76 89 74

8 77 83 89 84

9 81 86 87 88

10 83 87 85 88

11 79 91 88 93

*Experimentos explicados na Tabela 9

A Tabela 23 estão apresentados os efeitos e a significância para as variáveis estudadas

para a recuperação da aflatoxina B1.

74


para as recuperações da AFB1 ao nível de confiança de 95% (p<0,05)

Efeito Desvio padrão Significância (p)

Média/Interação 62,7272 0,6030 0,000092

(1) Clor/met (mL) 7,7500 1,4142 0,031723

(2) Casca/celite 20,2500 1,4142 0,004842

(3)Massa amostra 3,7500 1,4142 0,117647

1L com 2L 0,2500 1,4142 0,875965

1L com 3L 4,2500 1,4142 0,095181

2L com 3L 7,25000 1,414214 0,036007

A Tabela 23 mostra que entre as três variáveis estudadas, clorofórmio/metanol,

casca/celite e a interação da casca/celite com a massa de amostra foram estatisticamente

significativas ao nível de confiança de 95% para a recuperação da AFB1. A mistura

clorofórmio/metanol apresentou efeito positivo ao passar do menor para o maior valor, assim

como indicou aumento na média desta resposta. O mesmo fato ocorreu com as demais

variáveis.

A Tabela 24 apresenta os resultados da analise de variância para as variáveis que

apresentaram diferença significativa ao nível de confiança de 95%.


significativas ao nível de confiança de 95% (p<0,05) para a AFB1

Fonte de

variação

Soma

quadrática

Grau de

liberdade

Média

quadrática

Teste F Ftab(95%) Fcal/Ftab

Regressão 1045,375 3 348,46 1,57 4,35 0,37

Resíduo 1554,807 7 222,11

Falta de ajuste 1546,807

Erro Puro 8,000

Pelos resultados apresentados na Tabela 24, verificamos que não foi possível validar o

modelo em função das variáveis estudadas por meio de análise de variância, ou seja, o modelo

75

não foi preditivo e significativo para os efeitos combinados. Isto foi verificado pelo fato da

relação Fcal/Ftab ter sido menor que três.

A Tabela 25 apresenta os efeitos e a significância para as variáveis estudadas para a

recuperação da AFB2. As variáveis clorofórmio/metanol, casca/celite e a interação

clorofórmio/metanol com casca/celite foram estatisticamente significativas ao nível de

confiança de 95% para a recuperação da AFB2, apresentando efeito positivo, ou seja, ao

passar do menor para o maior valor, aumentava o valor da resposta. Novamente a quantidade

de adsorvente utilizada influenciou na resposta, recuperação, positivamente.


para as recuperações da AFB2 ao nível de confiança de 95% (p<0,05)


Média/Interação 65,6364 0,797724 0,000148

(1) Clor/met (mL) 18,5000 1,870829 0,010072

(2) Casca/celite 33,0000 1,870829 0,003199

(3) Massa amostra 14,0000 1,870829 0,017393

1L com 2L 13,0000 1,870829 0,020088

1L com 3L 7,0000 1,870829 0,064586

2L com 3L 2,5000 1,870829 0,313197


apresentaram diferença significativa ao nível de confiança de 95%. Verifica-se que não foi

possível validar o modelo em função das variáveis estudadas por meio de análise de variância,

ou seja, o modelo não foi preditivo e significativo para os efeitos combinados.

76


significativas ao nível de confiança de 95% para a AFB2

Fonte de

variação

Soma

quadrática

Grau de

liberdade

Média

quadrática


Regressão 3592,5 4 898,125 2,4 4,53 0,53

Resíduo 2248,045 6 374,675


Erro Puro 14,0000

Total 5840,545 10


recuperação da AFG1. Observa-se que clorofórmio/metanol, casca/celite e a interação

clorofórmio/metanol com casca/celite foram estatisticamente significativas ao nível de

confiança de 95% para a recuperação da AFG1, apresentando efeito positivo ao passar do

menor para o maior valor.


para as recuperações da aflatoxina G1 ao nível de confiança de 95%

(p<0,05)


Média/Interação 80,6363 0,460566 0,000033

(1) Clor/met (mL) 9,7500 1,080123 0,012051

(2) Casca/celite 21,7500 1,080123 0,002457

(3) Massa amostra 2,7500 1,080123 0,125809

1L com 2L 8,2500 1,080123 0,016713

1L com 3L 2,2500 1,080123 0,172691

2L com 3L 2,2500 1,080123 0,172691

.

77


apresentaram diferença significativa ao nível de confiança de 95%. Diante dos resultados da

analise de variância, verificamos que o Fcal/Ftab foi maior que três (3,13), permitindo que o

modelo seja considerado preditivo e significativo para a recuperação da AFG1. A Figura 10

mostra que maiores recuperações em torno de 90%, ocorrem quando, para a extração por

MSPD, utilizam-se maiores quantidades de solvente e adsorvente.


significativas ao nível de confiança de 95%para a AFG1

Fonte de

variação

Soma

quadrática

Grau de

liberdade

Média

quadrática


Regressão 1272,374 3 424,124 13,61 4,35 3,13

Resíduo 218,171 7 31,16


Erro Puro 4,667

Total 1490,545 10

3 factors, 1 Blocks, 11 Runs; MS Pure Error=2,333333

DV: afG1

90

85

80

75

70

65

Figura 7 - Superfície de resposta para a recuperação de aflatoxina G1

78


recuperação da aflatoxina G2. É possível observar que clorofórmio/metanol, casca/celite e a

interação clorofórmio/metanol com casca/celite foram estatisticamente significativas ao nível

de confiança de 95% para a recuperação da AFG2, apresentando efeito positivo.


para as recuperações da AFG2


Média/Interação 71,54545 0,870388 0,000148

(1) Clor/met (mL) 19,5000 2,041241 0,010781

(2) Casca/celite 26,5000 2,041241 0,005881

(3) Massa amostra 0,0000 2,041241 1,000000

1L com 2L 9,5000 2,041241 0,043198

1L com 3L 3,0000 2,041241 0,279423

2L com 3L 2,0000 2,041241 0,430505


apresentaram diferença significativa ao nível de confiança de 95%.


significativas ao nível de confiança de 95% para a AFG2

Fonte de

variação

Soma

quadrática

Grau de

liberdade

Média

quadrática


Regressão 2345,499 3 781,833 3,87 4,35 0,89

Resíduo 1415,228 7 202,176


Erro Puro 16,667

Total 3760,727 10

79

Verifica-se que não foi possível validar o modelo em função das variáveis estudadas

por meio de análise de variância.

Após analise estatística constatou-se que a recuperação foi maior quando foi utilizada

a maior relação de casca:celite (quantidade de adsorvente) com a maior quantidade da mistura

cloroformio/metanol para todas as AFAs. Atribui-se este resultado ao fato que maiores

quantidades de adsorventes foram necessárias para reter as impurezas da amostra bem como

atuar como abraviso descompartimentalizando o tecido e facilitando a entrada do solvente

extrator, o que justifica a maior necessidade de solvente.

5.6 Método Desenvolvido

5.6.1 HPTLC

O processo de extração utilizado neste trabalho foi o de dispersão da matriz em fase

sólida modificado, utilizando como adsorvente casca de arroz, após ter sido submetida a um

simples tratamento químico descrito no item 4.5.2, e celite(1/1), este adsorvente mostrou-se

capaz de extrair as micotoxinas sem que os componentes presentes na casca interferissem na

extração.

A Tabela 31 apresenta os valores da exatidão para o método em termos de recuperação

bem como os resultados da precisão avaliado em termos da repetibilidade. Ambos foram

analisados considerando os resultados dos ensaios de fortificação em diferentes níveis, em

triplicata para cada nível, pela técnica de extração MSPD, através da análise da intensidade da

fluorescência das manchas separadas em placas de HPTLC. Uma vez que a eficiência do

método de extração pode variar em função da quantidade de padrão adicionado

80

Tabela 31 - Recuperação média (%) e repetibilidade RSDr (%) para as micotoxinas em

amostras de cebola analisadas por HPTLC

Micotoxina Nível de fortificação

(ng)

R (%) RSDr (%)

AFB1 13,5

45,0

72,0

76

80

80

12

-

-

AFG1 13,5

45,0

72,0

91

88

85

16

12

9

AFB2 4,5

15,0

24,0

91

91

85

16

16

9

AFG2 4,5

15,0

24,0

95

91

91

9

16

16

OTA 67,5

225,0

360,0

83

80

80

3

-

- -Não ocorreu desvio padrão relativo, entre as análises

As percentagens de recuperação ficaram entre 76 e 95% para as micotoxinas

analisadas e no que diz respeito a precisão os valores ficaram entre 2,9 e 15,7 %. Estes

resultados estão de acordo com os valores recomendados no processo de validação, que

recomendam recuperações entre 70 e 120% com precisão de até ± 20% (RIBANI 2004 e

ANVISA 2003). Na Tabela 32 estão expressos os resultados para a precisão intermediária.

81

Tabela 32 - Recuperação Média (%) e precisão intermediária RSDpi (%) para as

micotoxinas em amostras de cebola analisadas por HPTLC


(ng)

R (%) RSDpi (%)

AFB1 13,5

45,0

72,0

80

76

76

-

12

12

AFG1 13,5

45,0

72,0

95

95

91

9

9

16

AFB2 4,5

15,0

24,0

91

91

85

16

16

9

AFG2 4,5

15,0

24,0

91

95

91

16

9

16

OTA 67,5

225,0

360,0

80

76

76

-

12

12 -Não ocorreu desvio padrão relativo, entre as análises

5.6.2 HPLC-FD

A casca de arroz demonstrou ser um adsorvente capaz de atuar na extração das

micotoxinas por MSPD, uma vez que os componentes presentes na casca não interferiram na

análise cromatográfica conforme mostra os cromatogramas (Figura 13). O branco

(cromatograma C), é a extração apenas da casca de arroz tratada sem a adição da amostra,

este não apresentou contaminação por aflatoxinas.

82

Figura 8 - Comparação dos cromatogramas (A) separação das AFAs (B) fase móvel

(C) branco

A precisão do instrumento avaliada em termos de repetibilidade (RSDr) foi realizada

através da injeção de 3 níveis de concentração selecionados, utilizadas na elaboração das

curvas analíticas. Para verificar a precisão intermediaria (RSDpi) do instrumento as injeções

foram realizadas em dias diferentes, os resultados da (RSDr) e da (RSDpi) estão descritos na

Tabela 33.

83

Tabela 33 - Resultados da precisão em termos de repetibilidade(RSDr) e da precisão

intermediária (RSDpi) do instrumento analisados por HPLC-FL

Micotoxina µg m L-1

(%RSDr) (%RSDpi)

AFB1 0, 016

0, 024

0, 08

8

6

2

6

7

3

AFB2 0, 0002

0, 0004

0, 002

10

1

11

9

2

10

AFG1 0, 016

0, 024

0, 08

9

4

5

7

2

4

AFG2 0, 001

0, 002

0, 01

14

11

7

10

13

6

Para avaliar a precisão do método em termos de repetibilidade, foram considerados os

resultados dos ensaios de fortificação em diferentes níveis de fortificação, em triplicata, para a

técnica de extração MSPD, (Tabela 34). Para a análise do RSDpi do método empregou-se

analistas distintos, conforme mostra a Tabela 35

A precisão, na análise de alimentos, depende da matriz, da concentração do analito e

da técnica de extração (GONÇALVES, 2007). Para a validação recomenda-se que a precisão

apresente valores de RSD ≤ 20% (RIBANI et al., 2004). Neste trabalho, os resultados obtidos

estão dentro dos limites sugeridos.

84

Tabela 34 - Recuperação Média (%) e repetibilidade RSDr (%) para as micotoxinas em

amostras de cebola analisadas por HPLC-FD


(ng)

R (%) RSDr (%)

AFB1 5,3

10,6

18,0

78

72

76

12

19

20

AFB2 0,06

0,2

0,46

85

88

84

14

16

5

AFG1 5,3

10,6

18,0

84

81

88

14

8

7

AFG2 0,33

1,00

2,33

87

86

88

13

20

8

Tabela 35 - Resultados da precisão intermediária (RSDpi) do método analisados em

amostras de cebola por HPLC-FD


(ng g-1

)

R (%) RSDr (%)

AFB1 5,3

10,6

18,0

75

71

77

15

19

11

AFB2 0,06

0,2

0,46

83

87

86

12

16

7

AFG1 5,3

10,6

18,0

86

83

85

18

14

15

AFG2 0,33

1,00

2,33

88

85

87

12

20

15

As percentagens de recuperação ficaram entre 72 e 88% para as micotoxinas

analisadas e no que diz respeito a precisão os valores ficaram entre 5,6 e 20,0 %. Estes

resultados estão de acordo com os valores recomendados no processo de validação, que

85

recomendam recuperações entre 70 e 120% com precisão de até ± 20% (RIBANI 2004 e

ANVISA 2003). O método empregando MSPD, HPTLC e HPLC-FD demonstrou ser robusto,

pois permitiu a determinação de micotoxinas nas diferentes variedades de cebolas estudadas,

utilizando diferentes tempos de extração, apresentando recuperações e precisão satisfatórias.

5.7 Aplicação dos métodos na determinação de micotoxinas em amostras de cebolas

Após realizada a adequação do método este foi aplicado para avaliar a ocorrência de

micotoxinas em amostras de cebola nacional e importada, dividas em diferentes variedades,

quanto ao calibre e coloração do bulbo, orgânica e não orgânica, ainda foram analisadas

amostras de cebola crioula com e sem defeitos. Os resultados obtidos através de analise em

HPLC estão expostos na Tabela 36

Tabela 36 - Contaminação com as micotoxinas estudadas em amostras de cebolas com

diferentes classes

Amostras de Cebola Contaminações (µg Kg-1

)

AFB1 AFB2 AFG1 AFG2

roxa, nacional, cal 2 - - - 15

roxa, nacional, cal 3 - - - 0,850

branca, nacional, cal 2 - - - -

branca, nacional, cal 4 - 0,35 - -

crioula, nacional, cal 2 - - - -

crioula, mancha negra, cal 2 - 90 81,68 17

crioula, brotada, cal 2 - - - 10

roxa, org, nacional, cal 2 - - - -

branca, org, nacional, cal 2 - - 84 1,46

amarela, importada, cal 4 - - - -

amarela, importada, cal 2 - - - -

roxa, importada, cal 2 - - - -

roxa, importada, cal 4 - - - -

branca, importada, cal 4 - - 30,5 -

cal: calibre; org: orgânica

86

Do total de amostras analisadas 43% estavam contaminadas com as AFB2, AFG2 e

AFG1, sendo que apenas 14,3% destas, apresentaram níveis de contaminação abaixo dos

limites máximos estabelecido pela União Européia e pela Legislação Brasileira.

Não foram detectadas amostras contaminadas com AFB1. A maior contaminação por

AFB2 e AFG2 ocorreram nas cebolas crioula, mancha negra, cal 2, e para a AFG1 a cebola,

branca, orgânica, nacional, calibre 2. Os resultados mostraram que as maiores contaminações

micotoxicologicas ocorreram em cebolas com defeitos e cebolas com cultivar orgânico. A

provável explicação para estes dados, no caso das cebolas com defeitos brotado e mancha

negra é que estes estão relacionados com um alto índice de umidade na hortaliça, o que

propicia a contaminação micotoxicologica. E para as cebolas de cultivar orgânico a maior

contaminação pode ser explicada pelo fato de que estes alimentos não foram submetidos a

tratamento antifúngico.

Com relação ao conteúdo fenólico, as cebolas com um maior teor de fenol

apresentaram nenhuma ou uma menor contaminação, possivelmente, pois os compostos

fenólicos são antifúngicos naturais. Quanto ao tamanho dos bulbos (calibre) para cebolas com

a mesma coloração, era esperado que bulbos maiores, por possuírem teores de umidades mais

elevados, tivessem uma maior contaminação, porém os resultados mostram que esta relação

não foi observada.

87

6 CONCLUSÕES

A utilização da casca de arroz quimicamente tratada, como adorvente, na técnica de

MSPD, permitiu a extração de todas as micotoxinas estudadas, com recuperações que

variaram para o método HPTLC entre 76-95% e para HPLC-FD entre 72-88%. O uso dos

métodos HPTLC e LC-FD, demonstraram especificidade, precisão e seletividade na

identificação e quantificação dos compostos. Para HPTLC, os limites de detecção variaram

entre 0,33 - 5 µg Kg-1

e os de quantificação entre 1-15 µg Kg-1

. Para o método HPLC-FD os

limites de detecção variaram entre 0,003–0,26 µg Kg-1

e os de quantificação 0,03–2,6µg Kg-1

.

A ocorrência das AFAs B2 G2 e G1, foi verificada em 43% das amostras analisadas.

Sendo que destas amostras apenas 14,3% apresentaram índices de contaminação abaixo do

limite máximo estabelecido pela União Européia e pela Legislação Brasileira. O nível

máximo encontrado foi de 90 µg Kg-1

para AFB2 em amostra de cebola crioula, mancha

negra, cal 2.

88

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102

ANEXOS

ANEXO A – Série Eluotrópica

103

ANEXO B – Linearidade das curvas analíticas em HPTLC

Figura 16: Linearidade das curvas analíticas em HPTLC

104

ANEXO C – Linearidade das curvas analíticas em HPLC-FD

Figura 17. Linearidade das curvas no solvente das aflatoxinas B1, B2, G1, G2, respectivamente

em HPLC-FD.

105

ANEXO D – Caracterização físico-químico da cebola

O pH e a acidez das amostras de cebola foram determinados consistindo em:

homogeneizar 10(+ 0000)g de amostra em água previamente fervida (90 mL) e agitar por 30

minutos. No sobrenadante foram determinados os pHs potenciometricamente, utilizando um

pHmetro marca Hanna modelo 200. A acidez foi determinada por titulometria de

neutralização com NaOH 0,1mol L-1

padronizada e expressa como porcentagem do ácido

orgânico predominante, ácido pirúvico.

Os teores de umidade foram determinados em estufa com circulação de ar a 60 °C. .

Para isto foram pesados em cápsulas de alumínio, previamente taradas 5, 000g de massa

homogeneizada da amostra. (n° 1)

Os percentuais de cinzas foram determinados pela calcinação de 3, 000g de massa da

amostra homogeneizada em mufla a 550 °C, até a obtenção de cinzas claras. (n° 2)

Os níveis protéicos foram determinados pelo método de micro-Kjeldahl, como

descrito a seguir. (n° 3)

Em um tubo de digestão foram colocados 0,2 g de amostra aos quais foram

adicionados 0,7 g de catalisador (3 g de sulfato de potássio e 0,03 g de selênio em pó).

Também foram adicionados 3 mL de peróxido de hidrogênio e 7 mL de ácido sulfúrico. Os

tubos foram colocados em um bloco digestor e efetuada a digestão a quente até a solução se

tornar clara. Após esta etapa, a solução foi esfriada a temperatura ambiente.

Foram destilados em um destilador de arraste a vapor todo o conteúdo digerido e

passado para o recipiente coletor do destilador. Foram adicionados 50 mL de NaOH 40%,

para conferir a neutralidade do meio aos quais foram adicionados 3 gotas de indicador de

fenolftaleína na mistura. O destilado foi recolhido em um erlenmeyer contendo 10 mL de

acido bórico 4% (adicionado de 4 gotas de indicador misto), coletado 125 mL e titulado com

HCL 0,1 mol L-1

padronizado até viragem do indicador. Foi empregando fator de conversão

de nitrogênio a proteína 6,25.

Preparo dos reagentes:

a) Padronização do HCl

- Colocar 2g de Na2CO3 para secar em estufa a 300°C por 1 hora;

- Pesar 0,15g e adicionar 25 mL de água (fazer quadruplicata deste procedimento);

106

- Adicionar 4 gotas de indicador misto;

OBS: o indicador misto é mistura das soluções alcoólicas de vermelho de metila 0,1% e

vermelho de bromocresol 0,1%, proporção 1:1.

- Titular com HCl 0,1N

Cálculo do fator de correção:

Fator = Pc x 1000 Pc = peso do carbonato

V x 5,2995 V = volume gasto de HCl

b) Ácido bórico 4%

- Pesar 40 g de ácido bórico e levar a uma balão de 1000 mL completando o volume com água

destilada.

c) Hidróxido de Sódio 40%

- Pesar 400 g de hidróxido de sódio e diluir em um béquer aos poucos com água destilada (em

banho de gelo), transferir para um balão volumétrico de 1L e completar o volume com água

destilada.

Procedimento de digestão e destilação:

Em um tubo de digestão colocar 0,2 g de amostra embrulhada em papel de seda ou

filtro, juntar 0,7 g de catalisador (3 g de sulfato de potássio e 0,03 g de selênio em pó).

Adicionar 3 mL de peróxido de hidrogênio e 7 mL de ácido sulfúrico (adicionar o ácido aos

poucos). Colocar os tubos em um bloco digestor e efetuar a digestão a quente até a solução se

tornar clara. Após esta etapa, esfriar a solução a temperatura ambiente.

Destilar em um destilador de arraste a vapor todo o conteúdo do digerido passando

para o recipiente coletor do destilador. Adicionar 50 mL de NaOH 40%, para conferir a

neutralidade do meio adicionar 3 gotas de indicador de fenolftaleína na mistura. Recolher o

destilado em um erlenmeyer contendo 10 mL de acido bórico 4% (adicionado de 4 gotas de

indicador misto), coletar 125 mL e titular com HCL 0,1N padronizado até viragem do

indicador.

Para a determinação de lipídios, 5, 000g de amostra foram embrulhadas em papel filtro

e adicionadas a um cartucho de “Soxhlet”. Utilizando 150 mL de éter de petróleo. O conjunto

de refluxo foi empregado durante 6 horas. Após os balões foram secos em estufa a 105° C e

pesados.(nº método, AOAC, 2000) (n° 4)

107

Os resultados das determinações de caracterização química das diferentes classes de

cebola, foram submetidos análise de variância (ANOVA) e teste de Tukey em nível de

significância de 95%.

casca de arroz como adsorvente para extraÇÃo de ... · a minha amada tia e madrinha zaira, por...

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