carlos jorge rocha oliveira Óxido nítrico estimula a...

CARLOS JORGE ROCHA OLIVEIRA

Óxido Nítrico Estimula a Via de Ras-MAP Quinase

Promovendo a Progressão do Ciclo Celular e

Proliferação em Células Endoteliais

de Aorta de Coelho

Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo, Escola Paulista de Medicina para obtenção do Título de Doutor em Ciências

São Paulo 2004

CARLOS JORGE ROCHA OLIVEIRA

Óxido Nítrico Estimula a Via de Ras-MAP Quinase

Promovendo a Progressão do Ciclo Celular e

Proliferação em Células Endoteliais

de Aorta de Coelho

Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo, Escola Paulista de Medicina para obtenção do Título de Doutor Ciências Orientador: Prof. Dr. Hugo Pequeno Monteiro.

São Paulo 2001

ROCHA OLIVEIRA, Carlos Jorge.

Óxido Nítrico Estimula a Via de Ras-MAP Quinase Promovendo a Progressão do Ciclo Celular e Proliferação em Células Endoteliais de Aorta de Coelho. São Paulo, 2004. 121 p.

Tese (Doutorado) – Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina.

1. Óxido Nítrico. 2. Transdução de Sinal. 3. MAP Quinase 4..Ciclo Celular 5. Ciclinas, quinase dependentes Ciclinas. 6. Proliferação.

Minha dedicatória à...

Professor Dr. Hugo Pequeno Monteiro, pelo

incentivo e espírito de companheirismo e

profissionalismo.

Aos meus pais Ascenção (Nena) e Jayme (in

memorium), pelo amor e sabedoria que sempre

refletiram sobre minha conduta pessoal...

Às minhas irmãs, Cleomar, Maria Luiza, Lucimar

e Fabiana por aprendermos juntos que obstáculos

existem para serem vencidos...

Aos meus filhos, Carlos (Nê), Juliano (Jú),

Gabriela (Gabi) e Carolina (Carol) que me dão

forças e a determinação de sempre recomeçar por

eles...

À Iara, Amiga, Companheira, Confidente, o meu

motivo maior para viver e sempre vencer...

Meus agradecimentos

O crescimento pessoal e profissional do ser humano é construído

através das pessoas que o cercam. O presente trabalho é fruto

do auxílio de várias pessoas que contribuíram direta e

indiretamente oferecendo seu apoio e contribuição,

agradeço a todas...

ABREVIAÇÕES

BSA Albumina Bovina

Ca2+ Cálcio

cAMP Adenosil monofosfato cíclico

CDK Quinase dependente de ciclina

cGMP Guanosina monofosfato ciclico

cNOS NO sintetase constitutiva

DAG Diacilglicerol

EGF Fator de crescimento epidérmico

EGFR Receptor do fator de crescimento epidérmico

ERN Espécies reativas de nitrogênio

ERO Espécies reativas de oxigênio

FAK "Focal adhesion kinase"

GDP Difosfato de guanosina

GSH Tripeptídeo redutor glutationa

GTP Trifosfato de guanosina

H2O2 Peróxido de nitrito

INO NO sintetase induzível

IP3 Trifosfato inositol

L-NAME Éster de N-metil-L-arginina

L-NMMA Acetato de N-monometil-L-arginina

MAPK Quinase proteíca ativada por mitógeno

MEK Quinase protéica ativadora de MAPK

NO Óxido nítrico

O2 Oxigênio

O2- Superóxido

OH- Radical hidroxila

OONO- Peroxinitrito

PDGF Fator de crescimento derivado de plaquetas

PI Fosfato inositol

PI-3K Fosfatidilinositol 3 quinase

PI-3P Fosfatidilinositol 3 fosfato

PKA Proteína quinase dependentes de cAMP

PKC Proteína quinase C

PKG Proteína quinase dependente de cGMP

PLC Fosfolipase C

PLCγ Fosfolipase Cγ

PTK Proteína tirosina quinase

PTP Proteína tirosina fosfatase

RSNO S-nitrosotiol

SBF Soro bovino fetal

SH2 "src-homology type 2 domain"

SH3 "src-homology type 3 domain"

SNAP S-nitroso-N-acetil-penicilamina

SNP Nitroprussiato de sódio

Tyr Tirosina

VEGF Fator de crescimento do endotélio vascular

SUMÁRIO

1 - Introdução ..............................................................................................15

1.1 Proteínas tirosina quinases e tirosina fosfatases nas vias de sinalização

celular ...........................................................................................................16

1.2 Modulação das atividades de tirosina quinase e tirosina fosfatases por

sistemas redox..............................................................................................20

1.3 Células endoteliais ................................................................................22

1.4 Produção de NO e O2- por células musculares lisas e por células

endoteliais ....................................................................................................23

1.5 Processos de sinalização dependente de óxido nítrico (NO) ................24

1.6 Efeitos do NO na proliferação de células endoteliais ............................28

1.7 Ciclo celular ............................................................................................29

1.8 Controle do ciclo celular em mamíferos..................................................33

1.9 Transição G1-S e as quinases cdk 4,6 / ciclina D...................................33

1.10 NO e o ciclo celular ...............................................................................36

2 – Objetivos ..............................................................................................37

3 – Materiais e Métodos ............................................................................39

3.1 Materiais ...............................................................................................40

3.2 Métodos ................................................................................................43

3.3 Transfecção de DNA plasmidial em células endoteliais de aorta de coelho

......................................................................................................................................... 44

3.3.1 Transfecção e isolamento dos clones ................................................45

3.3.2 Caracterização dos clones de células endoteliais de aorta de coelho

transfectadas com o mutante negativo dominante de p21Ras ....................46

3.4 Western blot...........................................................................................47

3.5 Análise do ciclo celular ..........................................................................49

3.6 Ensaio de proliferação celular.................................................................49

3.7 Fracionamento citoplasmático e nuclear.................................................50

3.8 Análise estatística ...................................................................................51

3.9 Imunofluorescência Indireta (Imuno-Citoquímica)...................................51

4 – Resultados ............................................................................................53

4.1 Efeitos da inibição de p21Ras na fosforilação e ativação das MAP

quinases ERK 1 / ERK 2 em células endoteliais de aorta de coelho mediada

por óxido nítrico e soro bovino fetal ..............................................................54

4.2 Translocação das MAP quinases ERK 1 e ERK 2 para o núcleo e

conseqüente fosforilação do fator de transcrição Elk-1 estimulada por óxido

nítrico, dá início a ativação do ciclo celular...................................................58

4.3 Fator de transcrição Elk-1 fosforilado aumenta e expressão da ciclina D1

e das quinases dependentes de cliclinas cdk4 e cdk 6.................................68

4.4 Associação catalítica da ciclina D1 com as proteínas quinases

dependentes de ciclinas Cdk4 e Cdk6 hiperfosforila a proteína retinoblastoma

(pRb) quando células endoteliais de aorta de coelho foram estimuladas com

doadores de NO e SBF.................................................................................73

4.5 Efeito do óxido nítrico e do soro bovino fetal na progressão do ciclo

celular da fase G1 para a fase S em células endoteliais de aorta de coelho

......................................................................................................................76

4.6 Efeito do óxido nítrico e do soro bovino fetal na passagem do ciclo celular

da fase G1 para a fase S, através do aumento da expressão da ciclina E...83

4.7 Efeito do óxido nítrico e do soro bovino fetal na passagem do ciclo celular

da fase S para a fase G2/M, através do aumento da expressão da ciclina ..85

4.8 Efeito do óxido nítrico e do soro bovino fetal na proliferação de células

endoteliais de aorta de coelho ......................................................................91

4.9 Inibição das MAP quinases ERK 1 e ERK 2 e seus efeitos na proliferação de

células endoteliais de aorta de coelho induzida por óxido nítrico e SBF.................... 92

5 – Discussão .............................................................................................96

6 – Referências Bibliográficas ................................................................105

7 – Apêndice..............................................................................................118

RESUMO

As vias regulatórias do ciclo celular, como a cascata de proteínas

quinases dependentes de ciclina (CDKs), são moduladas por sinais

extracelulares, principalmente fatores de crescimento e hormônios.

Observações feitas no início da década de 90 (Ziche et al., 1994) que têm

sido corroboradas por vários grupos de pesquisa, apontam para a

participação do Óxido Nítrico (NO) na angiogênese, processo que envolve a

proliferação e a migração de células endoteliais (Folkman & Shing, 1992).

Deve-se entretanto ressaltar que o papel do NO na seqüência dos eventos

envolvendo a cascata de sinalização Ras-MAP quinases e suas conexões

com ciclinas e quinases dependentes de ciclinas, culminando com a

proliferação das células endoteliais não foi descrito. Nossa contribuição vem

no sentido de preencher esta lacuna. Levando em conta essas observações

e os resultados obtidos neste estudo, concluímos que o NO através da

cascata de sinalização por ele induzida (Rocha Oliveira, et al, 2003),

contribui para o entendimento do mecanismo que marca a participação deste

radical na proliferação de células endoteliais de aorta de coelho. Nossos

estudos demonstram a participação do NO na progressão do ciclo celular em

células endoteliais de aorta de coelho. Seus efeitos são exercidos

especificamente sobre a via p21Ras – MAP quinase. A seqüência de

eventos: fosforilação de Elk-1, síntese de ciclina D1, cdk4, cdk6, fosforilação

da pRb, transição do ciclo celular da fase G1 para a fase S, controlada pela

ciclina E, passagem da fase S para G2/M através do aumento da expressão

da ciclina A que culmina com a proliferação das células endoteliais de aorta

de coelho.

ABSTRACT

The cell cycle regulation pathways, like cyclin-dependent protein

kinase cascade (CDKs), are modulated by extracellular signals, including

growth factors and hormones. Investigations made since the 90´s (Ziche et

al., 1994) indicate that Nitric Oxide (NO) plays an important role in

angiogenesis, which is a process that involves the proliferation and migration

of endothelial cells (Folkman & Shing, 1992). However, the role of NO in

these events involving Ras-MAP Kinases signaling cascade and its

connections with cyclin and cyclin-dependent kinases, culminating with

endothelial cells proliferation has not been described. This study intends to fill

this gap. Based on the observations of Rocha Oliveira et al., 2003 and the

findings of this study we concluded that NO is a important component in the

proliferation mechanism and in the cell cycle progression of rabbit aortic

endothelial cells. NO acts on the p21Ras – MAP kinase pathway in the

following sequence: Elk-1 phosphorilation, cyclin D1, cdk4, cdk6 synthesis,

pRb phosphorilation, cycle cell transition from G1 to S phase, controlled by

cyclin E, passage from S phase to G2/M through an increase of cyclin A

expression concluding in the proliferation of the rabbit aortic endothelial cells.

Keywords – Nitric Oxide – Signal Transducer – MAP kinases – Cell Cycle –

Cyclins, cdk4 and cdk6 – Proliferation.

1 - INTRODUÇÃO

Introdução

16

1.1 Proteínas tirosina quinases e tirosina fosfatases nas vias de sinalização celular.

Um dos mais importantes processos através do qual o ambiente

transmite informação para o interior das células é a ativação de receptores

PTK. A reação de fosforilação em resíduos de tirosina de proteínas celulares

é o mecanismo de que fazem uso os fatores de crescimento polipeptídicos

(fator de crescimento epidérmico (EGF), insulina, fator de crescimento

insulina símile tipo 1 (IGF-1), PDGF, CSF, FGF, etc.), para regularem a

proliferação, diferenciação e o metabolismo das células (Schlessinger 2000;

Blume-Jensen & Hunter, 2001).

Estudos realizados para elucidação das vias de sinalização mediadas

por EGF permitiram o estabelecimento de um modelo de via de transdução

de sinal mediada por fatores de crescimento polipeptídicos (Ullrich &

Schlessinger, 1990). Quando EGF se liga ao seu receptor ele estimula a

autofosforilação em resíduos de tirosina do domínio citoplasmático do

receptor. O sinal é transferido para a oncoproteína p21Ras, uma proteína

que se liga a GTP e desempenha um papel central nos processos de

transdução de sinal (Burgering & Bos, 1995). p21Ras alterna-se entre uma

forma associada a GDP e outra a GTP e este ciclo é regulado por fatores de

troca GDP-GTP e por proteínas que estimulam a atividade GTPase

intrínseca de p21Ras (Li et al., 1993). Duas proteínas adaptadoras Grb2 e

SoS conectam p21Ras ao receptor ativado. Grb2 através de seus domínios

SH3 (“src - homology type 3 domain" - domínios que apresentam afinidade

Introdução

17

por regiões ricas em Pro) recruta SoS, um fator que promove a troca GDP-

GTP, formando um complexo ternário p21Ras associado a GTP (Skolnik et

al., 1993). Exclusivamente nesta forma, p21Ras liga-se as moléculas

efetoras como a Raf quinase que sofre translocação do citoplasma para a

membrana plasmática (Avrunch et al., 1993). Nesta nova localização, Raf

quinase é completamente ativada por autofosforilação ou pela atividade de

serina/ treonina ou tirosina quinases (Avrunch et al., 1993). Neste ponto da

cascata, Raf quinase promove uma alteração nos meios de sinalização

passando de processos mediados pela ação de tirosina quinases para

processos mediados por serina/treonina quinases. Raf fosforila uma outra

quinase a “Mitogen Activated Protein Kinase Kinase” (MAPKK ou MEK)

(Dent at al., 1992). MEK por sua vez irá fosforilar uma família de serina /

treonina quinases conhecidas por MAP quinases (Gille et al., 1992). As MAP

quinases irão fosforilar fatores de transcrição e outras proteínas quinases e

até mesmo receptores PTK (Ex: EGF, PDGF) (Schlessinger, 2000),

conectando finalmente receptores de fatores de crescimento a fatores de

transcrição nucleares (Gille et al, 1992; Davis, 1993) . Importante salientar

que dentre as MAP quinases destacam-se dois subgrupos principais: as

quinases reguladas por sinais extracelulares (ERKs) e as quinases

reguladas por condições de stress (JNKs) (Davis, 1994). Ativação de

proteínas constituintes de cada um dos subgrupos parece obedecer a um

equilíbrio dinâmico entre ERKs ativadas por fatores de crescimento e JNKs

ativadas por stress, o que poderia determinar se uma célula irá sobreviver,

proliferar ou sofrer apoptose (Xie et al., 1995).

Introdução

18

Além de receptores PTK, um grupo de PTK intracelulares

representados pela família Src (Src, Fyn, Yes, Yrk, Hck, Lyn, Lck, Fgr e Blk)

(Erpel & Courtneidge, 1995), também pode conectar as vias de transdução

de sinal tão diversas quanto aquelas que governam proliferação ou adesão

celulares. Receptores que possuem ou não atividade de tirosina quinase

interagem com os membros da família Src, que por sua vez funcionarão

como condutores do sinal inicial (Erpel & Courtneidge, 1995; Taniguchi,

1995).

Fosforilação em tirosina também pode mediar processos de adesão

celular dependentes de integrinas. Diversas PTK que podem ser ativadas

por integrinas estão intimamente associadas a processos de sinalização

integrina-dependentes (Yamada & Miyamoto, 1995). Uma delas a proteína

quinase de adesão focal (FAK) que é expressa em regiões especializadas

de aderência ao substrato, localizadas na membrana plasmática (Yamada &

Miyamoto, 1995), desempenha papel central em processos de sinalização

associada à adesão celular (Schaller et al., 1994). FAK é fosforilada em dois

resíduos de tirosina (Tyr 397 e Tyr 925) se tornando um sítio de

recrutamento para moléculas possuidoras de domínios SH2 tais como Grb2

e Src (Schaller et al., 1994). Essas associações integram FAK à via de

sinalização dependente de p21Ras - MAP quinase. Importante salientar que

fatores de crescimento também são capazes de interagir com integrinas, de

maneira sinérgica ou aditiva, resultando possivelmente em modulação de

fosforilação de FAK e outros constituintes da via de sinalização dependente

de integrinas (Arora et al., 1995).

Introdução

19

A fosforilação reversível em resíduos de tirosina é um mecanismo

fundamental de regulação celular (Lemman & Burnett, 1992). As PTPs,

responsáveis pela defosforilação de resíduos de tirosina fosforilados se

constituem em uma família de enzimas divididas em dois grupos principais

citoplasmáticas e do tipo receptor. Algumas PTPs citoplasmáticas foram

classificadas como fosfatases de dupla especificidade porque defosforilam

resíduos de tirosina e/ou serina/treonina fosforilados. As enzimas do tipo

receptor possuem um domínio extracelular e um ou dois domínios catalíticos

intracelulares. Recentemente demonstrou-se que as PTPs tipo receptor

participam em interações célula-célula não possuindo até o momento ligante

específicos identificado (Brady-Kalnay & Tonks, 1995). As PTPs

citoplasmáticas possuem um único sítio catalítico, e várias regiões de

regulação (Sun & Tonks, 1994). Essas enzimas podem se ligar a sítios

específicos pertencentes a domínios intracelulares de proteínas envolvidas

em sinalização (Erpel & Courtneidge, 1995). Todas as PTPs sem exceção

apresentam uma seqüência altamente conservada de 11 aminoácidos

(Ile/Val) - His-Cys-X-Ala-Gly-X-X-Arg-(Ser/Thr) e Gly em seu sítio catalítico.

A oxidação ou mutação sítio-dirigida de um resíduo essencial de cisteína

presente nesta seqüência torna qualquer PTP catalíticamente inativa

(Fischer et al., 1991). A Inibição das atividades de PTP pode resultar em

incrementos nos níveis intracelulares de proteínas fosforiladas em tirosina

indicando com isso a existência de uma relação dinâmica entre as vias de

fosforilação e defosforilação em tirosina.

Introdução

20

1.2 Modulação das atividades de tirosina quinase e tirosinas fosfatases por sistemas redox.

Embora processos de sinalização ocorram essencialmente pela

associação de fatores de crescimento, hormônios e citocinas a seus

receptores específicos, várias evidências experimentais sugerem que o

estado redox intracelular desempenha um papel fundamental nos

mecanismos de ação destes ligantes. O estado redox é controlado pelo

tripeptideo redutor glutationa (GSH), e reflete um balanço entre os níveis

celulares de sulfidrilas e disulfetos podendo ser alterado pela ação de

espécies reativas do oxigênio (ERO) e outros oxidantes (Meister &

Anderson, 1983). Assim, as atividades das enzimas sinalizadoras podem ser

modificadas por alterações no estado redox intracelular, que modulam estas

atividades de forma negativa ou positiva (Monteiro & Stern, 1996).

Apesar da especificidade da ligação entre fatores de crescimento e

seus respectivos receptores, sistemas oxidantes também podem modular as

atividades de PTK. Assim é que, espécies reativas do oxigênio (ERO)

produzidas através do processo de oxido-redução de naftoquinonas, são

capazes de estimular a fosforilação em resíduos de tirosina de proteínas

constituintes da membrana plasmática de células hepáticas de rato (Chan, et

al., 1986). O peróxido de hidrogênio potencia a fosforilação em resíduos de

tirosina dependente de insulina de uma série de proteínas em células de

hepatoma de rato (Heffetz, & Zick, 1989). Conforme discutido anteriormente

nesta Introdução, os níveis intracelulares de fosforilação em resíduos de

Introdução

21

tirosina de proteínas são determinados a partir da ação conjunta das PTK e

das proteínas tirosina fosfatases (PTPs) (Dixon & Walton, 1993). Sabe-se

que a reação de defosforilação catalisada por essas enzimas depende

essencialmente de um resíduo de cisteina presente no seu sitio catalítico

(Tonks et al., 1988), fazendo dessas enzimas excelentes candidatas à

modulação por sistemas oxidantes. Conseqüentemente, tem se

demonstrado que a atividade das PTPs pode ser inibida por uma variedade

de sistemas oxidantes (Swarup et al., 1982; Monteiro et al., 1991; Monteiro

et al., 1993), o que poderia resultar em elevação dos níveis intracelulares de

fosforilação em tirosina. Destes sistemas o mais bem estudado tem sido o

vanadato. Este metal, através de um processo de oxido-redução intracelular

com produção de ERO e formação de intermediários mais reativos,

peroxovanadil, pervanadato (Liochev & Fridovich, 1990), e um potente

inibidor de atividades de PTP, promove elevação dos níveis intracelulares de

fosfotirosina e transformação celular (Klarlund, 1985). Monteiro et al., (1991),

demonstram que a diamida, um oxidante de grupos - SH inibi atividades de

PTP em células HER14 sem alterar as atividades de PTK nestas células.

Estes efeitos inibitórios eram revertidos por incubação das células com β -

mercaptoetanol e EGF (Monteiro et al., 1991). Os mesmos autores

mostraram também que o acido ascórbico em concentrações fisiológicas e

na presença de traços de ferro, inibe atividades de PTP nas mesmas

células. Pre-incubação das células com EGF revertia a inibição das

atividades de PTP causada pelo acido ascórbico (Monteiro et al., 1993).

Introdução

22

1.3 Células endoteliais.

As células endoteliais constituem a chamada camada íntima da

parede arterial. Durante muito tempo pensou-se no endotélio vascular

simplesmente como uma superfície por onde passava o fluxo sangüíneo.

Hoje, no entanto, sabe-se que as células endoteliais não somente se

constituem em uma barreira de permeabilidade seletiva entre os espaços

vascular e intersticial como também tem um papel muito importante na

regulação da homeostase vascular (Lemman & Burnett, 1992). Além disso,

de maneira similar às células musculares lisas, as células endoteliais são

participantes muito importantes de processos inflamatórios. Estas células,

sob estímulo físico, químico ou hormonal, produzem uma variedade de

fatores tais como: oxido nítrico (NO), o ânion superoxido (O2-), prostaciclina,

endotelina, fator ativador de plaquetas, fator de hiperpolarização derivado do

endotélio, interleucinas, fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF)

e fator básico de crescimento de fibroblastos (bFGF) (Flavahan, 1992).

Por causa de suas funções variadas e sua localização, o endotélio

tem um papel bastante importante na iniciação e/ou progressão das doenças

cardiovasculares, incluindo-se ai a arteriosclerose. Por outro lado, as

funções do endotélio podem estar comprometidas em estados patológicos

como resultado dos efeitos do estresse oxidativo. Similar ao que foi

observado em células musculares lisas, o estresse oxidativo pode influenciar

a reatividade vascular através de alterações em processos de transdução de

sinal dependente de cálcio nas células endoteliais (Schilling & Elliot, 1992).

Introdução

23

1.4 Produção de NO e O2- por células musculares lisas e por células

endoteliais.

A ativação de células endoteliais e células musculares lisas pode

levá-las a secretar uma série de fatores reguladores da homeostase do

sistema vascular. Dentre estes fatores destacamos os radicais livres NO e

O2-. O O2

- é produto de redução uni-életrônica do oxigênio molecular

produzido principalmente pelas cadeias de transporte eletrônico mitocôndrial

e do retículo endoplasmático (Halliwell & Gutteridge, 1989). Inicialmente

observou-se que o ionoforo de cálcio A23187 induzia contrações

dependentes do endotélio em artérias basilares de cães (Katusic, 1988).

Posteriormente, mostrou-se que estas contrações eram devidas ao O2-

produzido pelas células endoteliais estimuladas com o ionoforo de cálcio

(Katusic & Vanhoutte, 1989). Por sua vez, o NO é uma espécie

extremamente reativa, que pode mediar uma grande variedade de respostas

biológicas, tendo sido identificado como o fator de relaxamento dependente

do endotélio, é capaz de promover inibição de proliferação e contração das

células musculares lisas, inibição da agregação plaquetária e inibição da

adesão de monócitos e plaquetas a superfície endotelial, entre outros

fenômenos (Nathan, 1992; Moncada & Higgs, 1993).

O NO é gerado a partir do nitrogênio guanidino terminal do

aminoacido L-arginina, através da reação catalisada pela enzima NO

sintetase (NOS) que é encontrada em muitos tecidos e, existe basicamente

como três isoformas, uma NO sintetase induzível (i-NOS) e duas NO

Introdução

24

sintetases constitutivas (c-NOS). As c-NOS são dependentes de cálcio e

calmodulina e são encontradas em células endoteliais e, em tecido cerebral

(Kiechle et al., 1993). Substâncias que elevam a concentração de cálcio

intracelular como trombina, ADP, acetilcolina e o ionoforo de cálcio A23187

(Nathan, 1992; Moncada & Higgs, 1993), são capazes de ativar as c-NOS. A

c-NOS de células endoteliais possui sítios de ligação para calmodulina e

sofre modificações pos-tradução (miristilação, isoprenilação, fosforilação)

que podem regular sua atividade e determinar sua localização na célula

(Michel & Li, 1993). Por outro lado, a isoforma induzível que se encontra em

macrófagos e em células do tecido muscular liso é independente de cálcio e

podendo ser induzida por lipopolisacarideo de parede bacteriana (LPS),

interleucina 1β (IL-1β) ou interferon γ (Schlessinger & Ullrich, 1990). Marczin

et al, (1993), mostraram que a síntese de NO em células musculares lisas de

aorta de rato estimulada com LPS ou IL-1β é suprimida na presença de

inibidores de atividades de tirosina quinase. Estas observações sugerem o

envolvimento destas atividades, na indução de expressão da i-NOS nestas

células, tanto por LPS como por IL-1β.

1.5 Processos de sinalização mediados por NO.

O NO é um radical livre gasoso relativamente estável, capaz de se

difundir através de membranas celulares e atingir alvos biológicos

específicos (enzimas) a distâncias relativamente longas. Estas

características fazem com que esta pequena molécula seja capaz de

Introdução

25

participar de um grande número de processos fisiológicos (Schini-Creth &

Vanhoutte, 1995).

Devido à suas características químicas, NO é capaz de estimular

processos de sinalização através de reações com grupos sulfidrila, ERO ou

metais redox. Em condições fisiológicas, NO reage com O2, com o ânion

superóxido, metais de transição e sulfidrilas, gerando óxidos de nitrogênio,

peroxinitrito, adutos metal-NO e S-nitrosotióis (Stamler, 1994).

Estudos têm demonstrado a existência de uma série de alvos

celulares do NO, e espécies redox deles derivadas. Dentro deste grupo de

proteínas e enzimas com propriedades sinalizadoras capazes de serem

ativadas e desativadas por NO, destaca-se a forma solúvel da enzima

guanilato ciclase (Wong & Garbers, 1992). A nitrosilação dependente de NO

do ferro heme da guanilato ciclase, pode elevar os níveis de guanilil mono

fosfato cíclico (cGMP) intracelular, ativando proteínas quinases G

dependentes de cGMP (PKG) (Ignarro et al., 1990). Conseqüentemente,

tem sido sugerido que a fosforilação de proteínas, é um mecanismo através

do qual, a ativação da guanilato ciclase solúvel pelo NO poderia mediar a

sinalização celular dependente de PKG. Além da modulação das PKG,

outras quinases também podem ter sua atividade modulada pelo radical.

Lander et al. (1993), inicialmente mostraram que o transporte de glicose em

linfócitos era estimulado por doadores de NO, nitroprussiato de sódio (SNP)

ou S-nitroso-acitil-penicilamina (SNAP). Esta ativação de linfócitos é

mediada por vias de sinalização dependentes de PTK e PTP. PTP do tipo

receptor são ativadas em linfócitos humanos tratados com os doadores de

Introdução

26

NO. Ativação da PTK intracelular Lck, membro da família Src, também foi

observada nestas células quando as mesmas foram submetidas ao

tratamento com SNP ou SNAP. Nenhum dos efeitos acima descritos podia

ser mimetizado por 8 BrcGMP, um análogo estável e permeável de cGMP.

Trabalhos desenvolvidos na metade dos anos 90 pelo nosso grupo de

investigação mostraram que o nível intracelular de proteínas fosforiladas em

tirosina era incrementado em fibroblastos de camundongo HER14, quando

estes eram incubados com SNP ou SNAP. Um grupo de proteínas com

pesos moleculares aparentes de 126, 56 e 43 kDa eram fosforiladas em

tirosina após estimulo com os doadores de NO. A pré-incubação de células

com oxihemoglobina ou azul de metileno inibia o incremento de fosforilação.

A inibição pelo azul de metileno sugere a participação de cGMP no

processo. Esta hipótese foi confirmada quando da utilização do 8 BrcGMP,

um análogo estável da cGMP, que estimulou a fosforilação do mesmo grupo

de proteínas, fosforiladas sob ação dos doadores de NO (Peranovich et al.,

1995; .Chiu, et al, 1996; Monteiro et al., 1997)

Em trabalho recentemente publicado pelo grupo, as 3 proteínas foram

identificadas como sendo as PTKs citoplasmática FAK e SrC quinase, 126 e

56 kDa respectivamente, e a proteína 43 kDa foi identificada como sendo

uma das ERKs MAP quinases (Monteiro et al., 2000).

Além de uma ação sobre a fosforilação na época pouco caracterizada,

demonstramos que o NO é capaz de estimular atividade de PTK dependente

de EGF (Monteiro et al., 1994; Peranovich, et al., 1995). Estímulo de

fosforilação em tirosina do mesmo grupo de proteínas fosforiladas por ação

Introdução

27

direta do doador de NO, ocorre quando as células são incubadas

simultaneamente com SNP e EGF.

Contrastando com a ativação de PTPs pela ação dos doadores de NO

em linfócitos, em células HER14 observamos inibição destas atividades.

Analisados em conjunto, estes resultados mostram a diversidade dos

processos de sinalização dependentes de fosforilação em tirosina

modulados por NO. Tais processos aparentemente operam de acordo com o

tipo celular.

Lander et al. (1995), mostraram que p21Ras (Ras) pode ser ativado

por ação direta do NO, resultando em níveis mais elevados de Ras - GTP.

Esta ativação é reversível e ocorre através de S-nitrosilação de um resíduo

de cisteina essencial, Cys 118, localizado no domínio da proteína onde

ocorre a associação de nucleotídeos GTP-GDP. Ras atua como

intermediário central do fluxo de informações gerado a partir de PTKs que se

fosforilam, ativando uma cascata de reações catalisadas por outras

proteínas quinases.

Em trabalho que concluímos durante o desenvolvimento desta Tese

de Doutorado (ver Apêndice 2), mostramos inequivocamente que em células

endoteliais de aorta de coelho, NO/cGMP ativavam a rota de sinalização

Ras-ERK1/2 MAP Kinases e que através desta rota observava-se estimulo

da atividade do receptor de EGF e da fosforilação de proteinas em residuos

de tirosina. Nossos resultados também sugeriram que o NO ofertado através

de doadores exógenos poderia estar estimulando a proliferação de células

endoteliais (Rocha Oliveira et al, 2003).

Introdução

28

1.6 Efeitos do NO na proliferação de células endoteliais.

No caso específico de células do sistema vascular, observou-se que

NO é capaz de promover síntese de DNA em células endoteliais (Ziche et

al., 1994), estimulando a proliferação destas células. Ao contrário do

observado para células endoteliais, doadores de NO inibiam a mitogênese e

a proliferação de células musculares lisas do tecido vascular (Garg & Hassid,

1989). Por outro lado, a geração endógena de NO em células musculares

lisas irá estimular a mitogênese em um processo que irá depender do estado

de confluência das células (Barbosa de Oliveira et. Al., 2001). Além do tipo

celular, as concentrações locais de NO também são um fator importante na

determinação dos efeitos que este radical livre irá exercer sobre o

metabolismo das células. Utilizando um outro modelo experimental, Jenkins

et al. (1995), mostraram que células tumorais humanas de adenocarcinoma

de colon transfectadas com a forma induzível do NO sintetase e produzindo

quantidades de NO variando entre 9 e 14,5 µM. proliferavam mais

lentamente que as mesmas células não transfectadas. Entretanto a

implantação subcutânea destas células tumorais transfectadas em

camundongos “nude” produziam tumores mais vascularizados que

proliferavam mais rapidamente do que os tumores originários das células

parentais. Uma vez mais se concluiu que o papel dual do NO na proliferação

dos tumores poderia estar relacionado às concentrações locais deste radical

livre. Como conclusão geral poderia ser dito que tipo celular e concentrações

Introdução

29

locais de NO são variáveis importantes na determinação dos efeitos que

este radical irá exercer sobre o metabolismo das células.

Estudos têm demonstrado que a angiogênese é um processo

complexo e se caracteriza pela ativação do crescimento de células

endoteliais, pela proliferação e migração fenotípica. Desta forma, fatores de

crescimento como bFGF e VEGF são também potentes estimuladores da

proliferação e migração (Ziche,1997). Citamos ainda que, a administração

sistêmica do NO e inibidor de síntese N-nitro-L-arginine metil ester (L-name)

em coelhos que são submetidos a implante córneo do tecido endotelial

vascular com fator de crescimento (VEGF), mais não fator básico de

crescimento (bFGF), são induzidos a angiogênese. Deste modo podemos

concluir que o NO é importante para ativação do (VEGF), mas não induziu o

(bFGF) para a angiogênese. Ziche et al, 1994 propõem que, a NO sintetase

(NOS) e a guanilato ciclase são controladores em potencial da angiogênese

tumoral em resposta a (VEGF).

1.7 Ciclo celular.

O ciclo celular é um conjunto de processos altamente ordenados que

compreende o período entre duas divisões celulares (Lewin, 1997). Nos

organismos eucariotos, esses processos são regulados de tal maneira que

as células, em condições normais, nunca iniciam uma etapa do ciclo sem

que a etapa anterior tenha sido completamente finalizada (Nasmyth, 1996).

Introdução

30

Os primeiros estudos do ciclo celular foram realizados sob

microscopia óptica em tecidos somáticos. Naquela época era bem conhecido

o fato que, durante a divisão celular ou mitose (M), os cromossomos eram

condensados e alinhados no equador do fuso mitótico e as cromátides

migravam para pólos opostos da célula. Entretanto, sabia-se muito pouco

sobre o intervalo entre duas mitoses sucessivas, também chamadas de

interfase, exceto que nessa fase as células cresciam em volume. Somente

mais tarde, após o reconhecimento de que a molécula de DNA representava

o material genético, é que foi demonstrada, nessa fase, a duplicação

cromossômica. Tal achado permitiu dividir didaticamente a interfase em três

intervalos: G1, que compreende ao gap entre mitose e duplicação do DNA;

S, que é o período da síntese do DNA; e G2, entre a fase S e a mitose

seguinte (Nasmyth, 1996). Um outro intervalo foi ainda definido (G0) porque

alguns tipos celulares permaneciam por um longo período em um estado

quiescente sem que ocorresse a duplicação de seu DNA (Pardee, 1989).

As atividades regulatórias responsáveis pela transição de um estágio

para outro do ciclo foram principalmente investigadas através de

experimentos de fusão de células, um processo obtido com a utilização de

agentes químicos ou virais que causam a ligação de membranas

plasmáticas, gerando uma célula híbrida com dois ou mais núcleos em um

citoplasma comum. Foi observado então que, após a fusão de uma célula na

fase S com outra em G1, ambos os núcleos duplicavam seu DNA, indicando

que o citoplasma da primeira deveria conter um ativador de duplicação do

DNA. Por outro lado, quando uma célula na fase S era fundida com uma em

Introdução

31

G2, o seu núcleo continuava a duplicação, mas o núcleo em G2 não se

duplicava e atrasava sua entrada na mitose até que o primeiro terminasse o

seu processo; então ambos os núcleos entravam sincronicamente em

mitose. Isso sugeriu que algum regulador, possivelmente o próprio ativador

da fase S, inibisse o início da mitose. Os experimentos de fusão de células

também demonstraram a presença de um promotor da fase M em células

que estão em divisão, uma vez que essas células quando fundidas com

outras em qualquer estágio da interfase induziam, nessas últimas, uma

pseudomitose caracterizada pela condensação prematura de cromossomos.

A presença desse indutor, do mesmo modo que o de fase S, parecia

transitória, já que heterocárions com núcleo em G1 e G2 não exibiam

duplicação de DNA ou mitose (Lewin, 1997).

Mais recentemente, os resultados de estudos realizados em

leveduras, anfíbios e células de mamíferos demonstram que os ativadores

de fase S e M constituem uma classe especial de enzimas. Essas enzimas

são quinases que representam uma subunidade catalítica ativa somente

após sua fosforilação e interação com uma subunidade regulatória instável

denominada ciclina, cujo nível, como seu próprio nome indica, oscila nas

várias fases do ciclo celular (Murray e Kirschner, 1991; Nasmyth, 1996).

A subunidade catalítica é uma fosfoproteína e seu estado de

fosforilação é um determinante de sua atividade. Assim para tornar-se ativa,

grupos fosfatos precisam estar ausentes em algumas posições e presentes

em outras. Como a quinase é autocatalítica, a fosforilação de uma pequena

quantidade de enzima é suficiente para a ativação das demais moléculas

Introdução

32

(Lewin, 1997). As unidades catalíticas mostram uma homologia de

seqüência superior a 40% enquanto essa homologia em ciclinas está

freqüentemente limitada a um domínio de aproximadamente 100

aminoácidos, responsável pela ligação e ativação das quinases (Morgan,

1995).

A passagem das células de um estágio para o outro do ciclo celular é

regulada, então, por fatores que atuam sobre a transcrição dos genes das

ciclinas e a degradação dessas proteínas e sobre a modificação por

fosforilação da subunidade catalítica da enzima (Nurse, 1990). Esse controle

atua na manutenção da ordem dos eventos e possuem pontos de checagem

ou checkpoints, responsáveis por assegurar que etapas críticas como

duplicação e segregação cromossômicas sejam finalizadas com grande

fidelidade. Além disso, tal controle responde através de bloqueio de

proliferação quando a integridade do genoma está comprometida (Hartwell &

Weinert, 1989).

Um dos checkpoints mais importantes é o START, que ocorre em G1

e é também conhecido, em células de mamíferos, como ponto de restrição.

Nesse ponto, a célula deve decidir se progride para outro ciclo de duplicação

de DNA em função dos estímulos externos e de sua massa molecular.

Outros checkpoints também agem na mitose, impedindo que a célula se

divida antes que todo o DNA tenha sido duplicado e reparado, e outros

atuam na Fase S prevenindo a duplicação de DNA lesado (Hunter & Pines,

1994).

Introdução

33

1.8 Controle do ciclo celular em mamíferos.

As células de mamíferos estão sujeitas a um grande número de

diferentes estímulos extracelulares, como fatores de crescimento,

antagonistas de mitose e indutores de diferenciação, aos quais respondem

com progressão ou bloqueio de seu ciclo até atingirem a fase G1 tardia. Do

mesmo modo que em leveduras, os principais reguladores destas respostas

incluem quinases. Entretanto, enquanto uma única subunidade catalítica

(cdc2 em S. pombe e CDC28 em S. cerevisiae) é responsável pela transição

do ciclo de leveduras, as células de mamíferos sintetizam, além da quinase

dependente de ciclina cdc2 tambem conhecida como cdk2, as quinases cdk4

e cdk6. As quinases cdk4 e cdk6 formam complexos com as ciclinas D e

atuam nas etapas iniciais do ciclo celular, em resposta a fatores de

crescimento e são essenciais para a duplicação do DNA (Hartwell & Kastan,

1994; Graña & Reddy, 1995).

1.9 Transição G1-S e as quinases cdk 4,6 / ciclina D.

A primeira quinase a ser ativada em mamíferos após as células serem

liberadas do estado quiescente é composta pelas várias ciclinas D e por

cdk4 e ou cdk6, dependendo do tipo celular. Suas atividades catalíticas são

primeiramente observadas no meio da fase G1, com um pico máximo

próximo à transição G1-S, e podem persistir através dos ciclos

subseqüentes se os estímulos mitogênicos continuarem presentes, uma vez

Introdução

34

que a expressão de ciclina D é ativada por fatores de crescimento.

Entretanto, se esses fatores forem removidos, o nível de ciclina D abaixa

imediatamente, independente do estágio do ciclo celular (Graña e Reddy,

1995; Sherr, 1996).

Existem três tipos de ciclinas D (D1, D2 e D3), que são em parte

específicas para cada tipo celular, com a maioria das células expressando

D3 juntamente com D1 ou D2. A ciclina D1 é codificada pelo gene CCND1

localizado na banda cromossômica 11q13, que tem sido identificado como o

protooncogene PRAD1. A expressão aumentada da ciclina D1 é observada

em diferentes tumores e está associada com translocações, inversões,

inserções virais e amplificações da região 11q13 (Sherr, 1993).

Um melhor entendimento do controle do ciclo celular em G1 tem sido

obtido do estudo de genes supressores de tumor, cujos produtos interagem

com complexos cdks/ciclinas. O produto do gene RB, por exemplo, que está

ausente ou inativo em retinoblastomas e em outros tipos de câncer, são um

substrato para os complexos cdk/ciclina D (Lewin, 1997).

Em células quiescentes ou durante o início de G1, a proteína pRb, na

sua forma hipofosforilada, liga-se ao fator de transcrição E2F, que ativam

positivamente a transcrição de genes responsáveis pela transcrição para a

fase S, incluindo aqueles das ciclinas A e E. Esse “seqüestro” de E2F pela

pRb garante que as células não iniciem a duplicação do DNA. Várias outras

proteínas semelhantes a pRb, incluindo a p107 e p130 em mamíferos e a

RBF em Drosophila, também regulam os fatores E2F e são capazes de inibir

a entrada na fase S (Levine, 1997; Wang, 1977). No ponto de restrição, ou

Introdução

35

próximo a ele, a pRb é fosforilada pelas quinases cdk4,6/ciclina D. Essa

fosforilação causa então, a liberação de E2F e, conseqüentemente, a

transcrição dos genes requeridos para a duplicação do DNA (Nevins, 1992).

Algumas oncoproteínas virais tais como o antígeno T do vírus SV40, a

proteína E1A do adenovírus e a E7 do vírus papiloma humano, facilitam a

progressão do ciclo celular, em parte pela sua ligação a pRb e liberação de

E2F (Jansen-Dür, 1996). É interessante que essas proteínas virais contêm

seqüências semelhantes à seqüência do terminal amino das ciclinas D,

sugerindo que estes resíduos devem ser responsáveis pelas ligações com a

pRb. Realmente, mutações em ponto no terminal amino das ciclinas

impedem que essa ligação ocorra (Dowdy et al., 1993).

Na regulação da transcrição G1-S, a próxima quinase a ser ativada

consiste na cdk2/ciclina E. Ao contrário das ciclinas D, a expressão da

ciclina E oscila periodicamente e atinge um nível máximo no estágio G1-S e

é degradada em S (Dulic et al., 1992; Koff et al., 1992). O complexo também

fosforila a pRb, o que resulta num controle retroativo positivo, uma vez que o

gene da ciclina E é regulado pelo E2F. A progressão do ciclo, que estava

sob a dependência de mitógenos atuando sobre a expressão da ciclina D,

passa a ser independente de estímulos externos e dirigidos pela ciclina E

(Sherr, 1996).

É possível que os fatores E2F também regulem o gene da ciclina A,

que forma complexos com a cdk2. Sua síntese é iniciada na fase final de

G1-S e é importante para a transição de G1-S, pois sua inibição em cultura

pode impedir a duplicação do DNA (Girard et al., 1991; Sherr, 1996).

Introdução

36

1.10 NO e o ciclo celular.

Em comunicação, Tanner et. al, 2000, propõe que o óxido nítrico inibi a

proliferação de células musculares lisas de aorta humana, mudando a

expressão e atividade das proteínas regulatórias do ciclo celular. Outros

achados sugerem que o doador de óxido nítrico (SNAP) inibi a transição da

fase G1/S por inibição da quinase dependente de ciclina Cdk2 que impede a

hiperfosforilação da proteína do retinoblastoma (pRb) e induz a ativação da

proteína p21 Sdi1/Cip/Waf1 (Ishida et. Al, 1997). Em contraste quando o doador

de óxido nítrico (SNAP) é retirado, a proliferação é recuperada (Ishida et. Al,

1997). Em estudos realizados por Pervin et. al, 2001, os autores sugerem

que o efeito do óxido nítrico inibi a síntese de ciclina D1 e pode ser relevante

em linhagens celulares que expressão essa proteína.

2 - OBJETIVOS

Objetivos

38

Este trabalho teve como objetivo fornecer as bases moleculares para

o entendimento do papel que o Óxido Nítrico (NO) desempenha em Células

endoteliais de aorta de coelho, atuando como modulador positivo de

progressão através do ciclo celular e da proliferação celular.

3 - MATERIAIS E MÉTODOS

Materiais e Métodos

40

3.1 Materiais

Anticorpos

Anti ERK 1,2 total (New England Biolabs)

Anti ERK 1,2 fosforilada (New England Biolabs)

Anti Elk 1 (Cell Signaling)

Anti Elk 1 fosforilada (Cell Signaling)

Anti cdc 2 (Cell Signaling)

Anti-cdk 4 (Cell Signaling)

Anti cdk 6 (Cell Signaling)

Ciclina D1, E, A (Oncogene)

Anti pRb total (Cell Signaling)

Anti pRb fosforilada (Cell Signaling)

Anti-Mouse IgG, h&L Chain Specific (Goat) Rhodamine Conjugate

(Calbiochem).

Anti IgG de camundongo e anti IgG de coelho conjugados com peroxidase

(Amersham Pharmacia)

Drogas e antibióticos

S-Nitroso-N-acetylpenicillamine (SNAP), (Calbiochem)

Ampicilina (Gibco)

Estreptomicina (Gibco)


41

Geneticina (Gibco)

Penicilina (Gibco)

IPTG (USB)

Inibidor de MEK 1 (PD98059), (Calbiochem)

lipofectina (Gibco/BRL).

Higromicina (Gibco/BRL).

Pancreatina (Gibco/BRL).

Inibidor da farnesil transferase FPT II (Calbiochem)

Meio de cultura e soro

Meio F12 (Gibco)

Meio LB - 0,1% triptona, 0,5% extrato de levedura, 0,5% NaCl, 0,1% NaOH

1N.

Meio LB em placa - 0,1% triptona, 0,5% extrato de levedura, 0,5% NaCl,

0,1% NaOH 1N, 1,5% ágar , pH 7.0

SBF (soro bovino fetal) (Gibco) – inativado a 55ºC durante 1 hora.

Meio 2YT - 1,6% triptona, 1% extrato de levedura, 0,5% NaCl

Soluções Solução de congelamento - 50% FBS, 20% DMSO, 30% F12.

Tampão RIPA pH8.0 - 20mM Tris-HCl, 137mM NaCl, 1%NP40, 10% glicerol,

10µg/ml aprotinina, 10µg/ml leupeptina, 1mM PMSF, 200µM ortovanadato de

sodio.


42

Tampão de lise pH7.5 - 20mM Hepes, 150mM NaCl, 10% glicerol, 1% Triton

X, 1mM EGTA, 1.5mM MgCl2, 1µg/ml aprotinina, 1µg/ml leupeptina, 1mM

PMSF, 1mM ortovanadato de sódio, 100mM pirofosfato de sódio e 500mM

fluoreto de sódio.

Tampão de lavagem - 50mM Tris pH7.5, 0,5% Triton X 100, 150mM NaCl,

5mM MgCl2, 1mM DTT, 1µg/ml aprotinina, 1µg/ml leupeptina.

Tampão de corrida - 500mM glicina, 50mM Tris-base pH 8.3, 1% SDS.

Tampão de transferência - 48mM Tris-base, 39mM glicina, 0,037% SDS,

20% metanol.

TBST - 10mM Tris-base pH7.6, 150mM NaCl, 0,1% Tween.

PBS - 7,78mM Na2HPO4, 2,20mM KH2PO4, 140Mm NaCl, 2,73mM KCl.

Tampão Hepes - 10mM Hepes/NaOH pH7.4, 140mM NaCl, 5mM CaCl2.

Tampão TE - 100mM Tris-HCl pH8.0, 1mM EDTA.

Tris - solução estoque 1.5M pH8.8.

Tris - solução estoque 1.0M pH6.8.

SDS - solução estoque 10%.

Persulfato de amônio - solução estoque 10%.

Solução stripping - Tris-HCl pH6.7, 2-mercaptoetanol .

Tampão de amostra 4x - 50mM Tris-HCl pH6.8, 5% 2-mercaptoetanol, 2%

SDS, 0,05% bromofenol, 10% glicerol.


43

Corante Ponceau S - 5% TCA, 0,5% Ponceau.

Reagente de Bradford (Bio Rad).

Gel de poliacrilamida 10% - 9,9ml H2O, 10ml solução de poliacrilamida 30%,

7,5ml Tris 1,5M pH8.8, 300µl SDS 10%, 300µL persulfato de amônia, 10µl

TEMED.

Gel stacking - 6,8ml H2O, 1,7ml solução de poliacrilamida 30%, 1,25ml Tris

1,0M pH6.8, 100µl SDS 10%, 100µL persulfato de amônia, 10µl TEMED.

Tampão de extração citoplasmática 1 – 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM NaCl, 3

mM MgCl2, 0,5% Nonidete p40, 0,5 mM PMSF, 50 mMNaF, 1 mM NaVO3, 10

µg/ml Leupeptina, 10µg/ml Aprotinina.

Buffer 2 para extração nuclear – 1 M de Sacarose.

Tampão de extração nuclear 3 – 200 mM Nacl, 100 mM Hepes pH 7.9, 1,5

mM MgCl2, 0,1 mM EDTA, 5% Glicerol, 0,5 mM PMSF, 50 mM NaF, 1 mM

NaVO3, 10µg/ml Leupeptina, 10µg/ml Aprotinina.

Kits

ECL (Amershan).

CycleTEST PLUS™ DNA Reagent Kit (Becton Dickinson).

3.2 Métodos

Culturas celulares


44

Células endoteliais de aorta de coelho foram gentilmente cedidas pela

Dra. Helena Bonciani Nader, professora titular da disciplina de Biologia

Molecular (Escola Paulista de Medicina). As células são cultivadas em meio

F12. O meio de cultura é suplementado com 10% de soro bovino fetal. As

células são mantidas a uma atmosfera de 95% de ar e 5% de CO2 a 37°C.

3.3 Transfecção de DNA plasmidial em células endoteliais de aorta de coelho

Linhagens bacterianas, plasmídeos: amplificação e caracterização dos

plasmídeos bacterianos. Foi utilizado o plasmídeo pUC 19 obtido

comercialmente, e que contém 2686 pares de base e origem de replicação

para E. coli, possuindo como marcador o gene que confere resistência a

ampicilina e um sítio múltiplo de clonagem pREP4 que possui a marca de

resistência para higromicina. Para obtenção das células expressando o

mutante negativo dominante de p21ras, foi utilizado o plasmídeo pMMrasDN

obtido através do Dr. Ed. Skolnik do Departamento de Farmacologia do

Centro Médico da Universidade de Nova York. O plasmídeo contém 4900

pares de base de origem de replicação para E. coli. A linhagem bacteriana

de E. coli DH5-· (supE44· alc U 169 · 80 lac Z·M 15) hsd R17 rec Al end gyra

96 thi-l (rel Al), obtida da American Type Culture Collection (ATCC/EUA), foi

utilizada para obtenção dos plasmídeos em larga escala. As bactérias foram

cultivadas em Meio LB (Tris 10 mM. pH 7,4, MgSO4 , 1 mM. Triptona 1,0%,

Extrato de levedura 0,5%, NaCl 0,5%) e Meio SOC (NaCl 10 mM. KCL 2,5

mM, MgCl2 10 mM, MgSO4 10 mM, Glicose 20 nM, Triptona 2,0%, Extrato


45

de levedura 0,5%). As bactérias foram transformadas com os plasmídeos

acima descritos, pelo método do cloreto de cálcio descrito por Mandel &

Higa, (1970) e Cohen et al. (1973). Após obtenção do DNA plasmidial, a

concentração do mesmo foi determinada por espectrofotometria, medindo-se

a absorbância a 260 nm, conforme descrito por Sambrook et al. (1989). Os

plasmídeos assim obtidos foram digeridos com as enzimas de restrição Pst I,

e Bam HI para confirmar sua estrutura. A análise das digestões foi feita

através de eletroforese em gel de agarose. A eletroforese foi realizada sob

uma corrente de 50 mA durante 90 minutos. O gel é corado com brometo de

etídeo (10 µg/ml) e visualizado em trans-iluminador de luz ultravioleta.

3.3.1 Transfecção e isolamento dos clones

Células endoteliais de aorta de coelho a uma confluência de 50% (500.000

células/garrafas de cultivo de área igual a 25 cm2) foram transfectadas

utilizando-se o método da lipofectina (Gibco/BRL). Foi separada uma mistura

de DNA a 100 µl de meio de cultura F12, sem soro e sem antibióticos para a

transfecção, conforme esquematizado abaixo:

1) Controle negativo pUC 19 (9 µg)

2) Controle positivo pUC 19 (9 µg) e pREP4 (1 µg)

3) pE1a (9 µg) e pREP4 (1 µg)

4) pHR5 (9 µg) e pREP4 (1 µg).

Uma solução é preparada pela mistura de 10 µl de lipofectina com 90 µl de

meio F12, sem soro e sem antibióticos e adicionada às misturas de DNA,

seguindo-se de incubação à temperatura ambiente durante 15 minutos para


46

obtenção do complexo DNA-lipofectina. O complexo foi diluído em meio F12

sem soro e sem antibióticos, e as células em monocamadas foram

incubadas neste meio de transfecção durante 4 horas, a 37°C em atmosfera

de 95% de ar e 5% de CO2. Decorrido este período, o meio utilizado para

transfecção é substituído por meio de cultivo, F12 suplementado com 10%

de soro bovino fetal, e as células permaneceram neste meio por 48 horas.

Após este período, as monocamadas celulares são tripsnizadas e

subcultivadas em meio F12 suplementado com soro bovino fetal e

higromicina na concentração de 100 µg/ml em placas de 24 poços

aglomerados durante 18 dias em atmosfera de 95% de ar e 5% de CO2. A

cada intervalo de 3 dias, o meio de cultivo suplementado com o antibiótico

de seleção será substituído por meio fresco. As colônias formadas (clones)

são coletadas por incubação com pancreatina após isolamento em anéis

estéreis. Estes clones foram expandidos e posteriormente caracterizados.

3.3.2 Caracterização dos clones de células endoteliais de aorta de coelhos

transfectadas com o mutante negativo dominante de p21Ras. Os clones

foram caracterizados por “Southern blotting” e “Northern blotting”, para

verificação da integração do DNA plasmidial e sua expressão.

Respectivamente DNA e RNA são extraídos de aproximadamente 5 x 106

células mantidas em garrafas de cultura de 75 cm2 de área. DNA das células

é extraído, digerido por enzimas de restrição e separado em gel de agarose

conforme procedimento descrito acima utilizando para isolar DNAs

plasmidianos. Procedemos então à transferência desse DNA do gel para


47

membrana de Nylon Hybond-N (Amersham Pharmacia Biotech) pelo método

de capilaridade e fixação por irradiação com luz UV. Para extração do RNA,

as células são lavadas com PBS e lisadas em solução A (fenol saturado com

água, tiociato de guanidina 4 M, citrato de sódio 25 mM, pH 7.0, acetato de

sódio 2M, pH 4.0, na proporção 1:1) de acordo com Xie et al., (1995). Ao

lisado celular adicionar-se-á igual volume da mistura de clorofórmio álcool

isoamilico e após vigorosa agitação, incubação por 30 minutos e

centrifugação a 12000 x g., o sedimento é lavado com etanol 70%. O RNA

precipitado é dissolvido em água e mantido a -20°C. sendo todas as

soluções e materiais, tratados previamente para a eliminação de RNAse. O

RNA é então fracionado em gel de agarose contendo formaldeido,

transferido para membrana de Nylon Hybond-N e fixado de forma similar ao

DNA, conforme descrito por Sambrook et al., (1989). Sondas radioativas são

preparadas utilizando-se α[32P] dCTP para marcar o plasmídeo pMMRasDN

pelo método “Random Priming” utilizando-se o kit “Random Primers DNA

Labeling System” (Gibco/BRL) conforme protocolo do fabricante. As

membranas são hibridizadas “overnigth” a 42°C seguindo-se o protocolo

convencional, sendo as lavagens finais em condições de alta estrigência. As

membranas então são expostas a filmes autoradiográficos pelo tempo

necessário para obtenção do sinal. Após caracterização, obtivemos os

clones, C1A, C2A e C3A que apresentou a maior expressão negativa

dominante, e foi, portanto, utilizado nos experimentos.

3.4 Western blot


48

Nestes experimentos, células foram lisadas em tampão A (Hepes 20

nM. pH 7.5, 150 nM, glicerol 10%, triton X-100 a 1%, MgCl2 1.5 mM, EDTA 1

mM; aprotinina 1 µg/ml; leupeptina 1 µg/ml e PMSF 1 mM) acrescido dos

inibidores de proteínas fosfatases, ortovanadato de sódio 2 mM, fluoreto de

sódio 50 mM e pirofosfato de sódio 10 mM. A concentração de proteínas nos

lisados foi determinada pelo método de Bradford (Bradford, M.M.,1976).

Quantidades iguais de proteínas dos lisados foram misturadas com 50 µl de

tampão de amostra 4 vezes concentrado (Tris-HCl 150 mM, pH 6.8, β-

mercaptoetanol 15%, SDS 6%, azul de bromofenol 0,3%), fervidas por 5 min

e separadas eletroforéticamente em gel de poliacrilamida e SDS 10%. As

reações de Western-blotting foram realizadas em gel de poliacrilamida 10%

para ERK, Elk 1, Ciclina D1, E,A, cdk 4, cdk 6 e proteína Rb. As proteínas

foram submetidas à eletroforese em tampão de corrida a 250V e 8mA

durante toda à noite. A transferência foi realizada em papel de nitrocelulose

aplicando-se uma de corrente de 200mA a 250V por 2 horas em cuba de

transferência (BioRad). A confirmação da transferência foi realizada rinsando

a membrana com Ponceau S; em seguida, a membrana foi lavada com

TBST e bloqueada em solução 5% leite para ERK 1 / 2, Elk 1, Ciclina D1,

cdc 2, cdk 4, cdk 6 e proteína Rb por 2 horas sob agitação em temperatura

ambiente. Após o período a membrana foi lavada 3 vezes por 15 minutos

com TBST sob agitação e adicionado o anticorpo primário diluído; ERK

(1:2000), Elk 1 (1:2000), Ciclina D1, E, A (1/1000), cdk 4 (1/500) cdk 6

(1/500), Proteína Rb (1/1000) cdc 2 (1/1000) em 5% BSA durante toda a

noite, sob agitação a 4ºC. Após a incubação a membrana foi novamente


49

lavada 3 vezes de 15 minutos a temperatura ambiente. O anticorpo

secundário anti-IgG de camundongo produzido em cabra; anti-IgG de coelho

produzido em suino ou anti-IgG de cabra produzido em coelho foi diluído em

TBST 0,1%; ERK (1:3000), Elk 1 (1:3000), Ciclina D1, E, A (1/2000), cdk 4

(1/1000) cdk 6 (1/1000), Proteína Rb (1/2000) cdc 2 (1/2000) e incubado

durante 1 hora a temperatura ambiente sob agitação. A membrana foi lavada

1 vez por 15 minutos e 2 vezes por 5 minutos com TBST. A revelação foi

realizada utilizando-se kit ECL de quimioluminescência.

3.5 Análise do Ciclo Celular

Para a análise do ciclo celular, 104 células/ml foram plaqueadas em

placas de 6 poços aglomerados. Após 24 horas as células foram contadas e

tratadas com 0,1mM de SNAP e 10% de SBF durante 120 minutos e 300

minutos em atmosfera 5% de CO2 à 37ºC. Para o controle, as células foram

mantidas em meio F12 suplementado com 0,5% de SBF. Após o período de

incubação as células foram lavadas duas vezes em PBS. Utilizamos o

protocolo do “CycleTEST PLUS™ DNA Reagent Kit” da empresa Becton

Dickinson para o tratamento das células e sua aquisição. A aquisição das

células foi feita por citometria de fluxo, através do software ModFit LT V 2.0 e

a análise dos histogramas pelo software Cell Quest (Becton Dickinson).

3.6 Ensaio de proliferação celular


50

Células endoteliais de aorta de coelho foram semeadas em placas de

6 poços aglomerados a uma densidade de 5 x 104 células por poço em meio

F12 suplementado com 0,5% de soro bovino fetal. As células foram

mantidas nestas condições durante 24 horas a uma atmosfera com 5% de

CO2 à 37ºC. Após este período, o doador de NO (SNAP) na concentração

de 0,1 mM e soro bovino fetal a 10%, foram adicionados ao meio de cultura

e deixados por 300 minutos. Em seguida o meio de cultura foi trocado por

meio F12 com suplementação de 0,5% de soro bovino fetal e as células

foram incubadas por mais 24 horas. Após este período as células foram

contadas em 48 horas para comparações de resultados dos estímulos.

Células endoteliais de aorta de coelho nas condições acima, mas sem

estímulos foram utilizadas como controles de proliferação basal. Quando do

uso do inibidor de MEK 1 (PD98059), as células endoteliais de aorta de

coelhos foram incubadas inicialmente por 30 minutos com este inibidor e

posteriormente estimuladas com doadores de NO e SBF. De maneira

análoga foi o procedimento para as células transfectadas com Ras negativo

dominante N17Ras (C3A) e para as transfectadas com plasmídeo vazio

pcDNA. Os ensaios de proliferação foram realizados em triplicatas e seus

resultados determinados como a média aritmética (±) o desvio padrão. Os

resultados finais foram expressos em numero de células contadas (N x 104),

obtida em culturas estimuladas, e o basal obtido em culturas não

estimuladas (média aritmética (±) o desvio padrão).

3.7 Fracionamento citoplasmático e nuclear


51

Lisar as células em tampão de extração citoplasmática 1 (descrito em

material e método) por 20 minutos a 4ºC. Carregar o lisado com 1 ml do

buffer 2 (descrito em material e método) em tubo eppendorf. Centrifugar 10

minutos a 4ºC/1.600g. Centrifugar sobrenadante por 10 minutos a

4ºC/13.000g. Sobrenadante contem a fração citoplasmática. Lavar o pellet

da primeira centrifugação em tampão de extração nuclear (descrito em

material e método). Resuspender o pellet em 100µl de tampão de extração

nuclear e incubar por 30 minutos a 4ºC em agitação constante (vortex).

Centrifugar o lisado por 10 minutos a 4ºC por 10 minutos/13.000g.

Sobrenadante contem fração nuclear.

3.8 Análise Estatística

Resultados representam a média do valor de três experimentos. Os

resultados são expressos como média aritmética ± S.D. Foram feitas

comparações estatísticas com o teste Student's t. Utilizamos também o t

Dunnet ANOVA. Foram consideradas estatisticamente significantes as

diferenças *P < 0,05.

3.9 Imunofluorescencia Indireta (Imuno-Citoquímica)

Células endoteliais de aorta de coelho e células transfectadas com

mutante negativo dominante para p21Ras N17Ras (C3A) foram tratadas

com doadores de NO (SNAP = 0,1mM) e Soro Bovino Fetal (10%) em tempo

de 15 e 30 minutos. Para controle foram utilizadas células mantidas em meio


52

F12 mais suplementação com SBF a 0,5%. Após estímulos as células foram

lavadas 3 vezes com PBS e em seguida fixadas com PFA 4% por dez

minutos a 4ºC. Após o período, foram lavadas 3 vezes com PBS e

permeabilizadas em PBS nonidet P40 0,1% por 30 minutos a 37ºC. Em

seguida mais três lavagens com PBS e bloqueadas com PBS Albumina 1%

por 30 minutos a 37ºC. Após o bloqueio, as células foram lavadas uma vez

com PBS. O anticorpo primário anti-fosfo ERK 1 / ERK 2 e o anticorpo

secundário utilizado foram diluídos em albumina 1% e incubados a 37ºC por

uma hora para o anticorpo primário e 24 horas para o anticorpo secundário.

Os anticorpos encontram-se descritos no item “anticorpos” acima. Após o

período as células foram lavadas com PBS quatro vezes por 7 minutos cada

sob agitação. A leitura foi feita em microscópio confocal com objetiva de

100 X e ocular de 10 X, com aumento final de 1.000 X.

4 - RESULTADOS

Resultados

54

4.1 Efeitos da inibição de p21Ras na fosforilação e ativação das

MAP quinases ERK 1 / ERK 2 em células endoteliais de aorta de coelho

mediada por óxido nítrico e soro bovino fetal.

Confirmando observações feitas anteriormente (Rocha Oliveira et. Al.,

2003), na figura 1 mostramos que doadores de NO e SBF promovem a

fosforilação e conseqüente ativação das MAP quinases ERK 1 / ERK 2, e

que este processo dependia da ativação de p21Ras. Observamos que a

adição do inibidor da farnesil transferase FPT II inibiu a fosforilação das MAP

quinases ERK 1 / ERK 2 após estímulos.

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2

4

6

8

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sito

met

ry

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itrar

y un

its)

Figura 1. Células endoteliais de aorta de coelho foram carenciadas por 24 horas e pré-incubadas com FPT II na concentração de 25 µM por mais 24 horas. Depois deste período foram feitas as incubações na presença do doador SNAP (0,1 mM) e SBF (10%), por 30 minutos. Após este período as células foram lisadas. A quantidade de proteína utilizada do lisado foi de 75µg. Utilizamos SDS/PAGE (10% gel) e transferência para membranas de nitrocelulose. “Immunoblotting” foi fixado com anti ERK1 / ERK 2 anticorpos e anti-phospho ERK 1 / ERK 2. A revelação foi feita através de ECL. O autoradiograma é o representativo de três experimentos independentes. O nível de fosforilação em cada faixa de proteína observado no autoradiograma foi determinado por densitometria laser. A significância foi fixada em *p < 0.05 em relação ao controle não tratado.

* *

Resultados

55

O mesmo efeito foi observado quando utilizamos as células

endoteliais de aorta de coelho transfectadas com N17Ras (C3A) que são

negativas dominantes para p21Ras, Figura 2A.

0

5

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Den

sito

met

ry

(arb

itrar

y un

its)

Figura 2A. Células C3A foram incubadas com doador SNAP (0,1 mM) e SBF (10%) por 30

minutos. Após este período as células foram lisadas. A quantidade de proteína utilizada do

lisado foi de 75µg. Utilizamos SDS/PAGE (10% gel) e transferência para membranas de

nitrocelulose. “Immunoblotting” foi fixado com anti ERK 1 / ERK 2 anticorpos e anti-phospho

ERK 1 / ERK 2. A revelação foi feita através de ECL. O autoradiograma é o representativo

de três experimentos independentes. O nível de fosforilação em cada faixa de proteína

observado no autoradiograma foi determinado por densitometria laser. A significância foi

fixada em *p < 0.05 em relação ao controle não tratado.

*

Resultados

56

O controle para verificação de efeitos inequívocos da transfecção foi

feito utilizando-se células transfectadas com vetor vazio pcDNA. Foram

obtidos resultados semelhantes àqueles obtidos para células parentais,

Figura 2B.

0

5

10

15

Den

sito

met

ry

(arb

itrar

y un

its)

Figura 2B. Células com vetor vazio (pcDNA) foram incubadas com doador SNAP (0,1 mM)

e SBF (10%) por 30 minutos. Após este período as células foram lisadas. A quantidade de

proteína utilizada do lisado foi de 75µg. Utilizamos SDS/PAGE (10% gel) e transferência

para membranas de nitrocelulose. “Immunoblotting” foi fixado com anti ERK 1 / ERK 2

anticorpos e anti-phospho ERK 1 / ERK 2. A revelação foi feita através de ECL. O

autoradiograma é o representativo de três experimentos independentes. O nível de

fosforilação em cada faixa de proteína observado no autoradiograma foi determinado por

densitometria laser. A significância foi fixada em *p < 0.05 em relação ao controle não

tratado.

**

Resultados

57

Ainda confirmando observações anteriores, o inibidor de MEK

PD98059 não permite a fosforilação e a ativação de ERK 1 / ERK 2,

caracterizando a participação da via Ras / MEK / ERK 1 / 2 nos eventos de

sinalização iniciados por NO, Figura 3.

0

2

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6

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sito

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ry

(arb

itrar

y un

its)

Figura 3. Células endoteliais de aorta de coelho foram carenciadas por 24 horas e pré-

incubadas com inibidor de MEK PD98059 na concentração de 20 µM por 30 minutos.

Depois deste período foi feita a incubação na presença do doador SNAP (0,1 mM) e SBF

(10%) por 30 minutos. Após este período as células foram lisadas. A quantidade de proteína

utilizada do lisado foi de 75µg. Utilizamos SDS/PAGE (10% gel) e transferência para

membranas de nitrocelulose. “Immunoblotting” foi fixado com anti ERK 1 / ERK 2 anticorpos

e anti-phospho ERK 1 e ERK 2. A revelação foi feita através de ECL. O autoradiograma é o

representativo de três experimentos independentes. O nível de fosforilação em cada faixa

de proteína observado no autoradiograma foi determinado por densitometria laser. A

significância foi fixada em *p < 0.05 em relação ao controle não tratado.

**

Resultados

58

A cascata de sinalização das MAP kinases ERK 1 / 2 é essencial para

regulação da expressão gênica em resposta a sua grande variedade de

sinais extracelulares e intracelulares. Entretanto, os eventos que ocorrem

após a ativação destas proteínas quinases ainda não são totalmente

conhecidas.

As MAP Kinases ERK 1 / 2 podem ser funcionalmente redundantes ou

não. Chuang & Ng, 1994, mostram que p44 ERK 1 ativa especificamente o

fator de transcrição ELK 1, enquanto p42 ERK 2 ativa o gene de resposta

imediata C-Myc.

Nós fracionamos as células após estímulo com doador de NO ou com

soro e estudamos a distribuição celular das formas ativas das MAP quinases

ERK 1 / ERK 2.

4.2 Translocação das MAP quinases ERK 1 e ERK 2 para o núcleo e

conseqüente fosforilação do fator de transcrição Elk-1 estimulada por

óxido nítrico, dá início a ativação do ciclo celular.

A utilização do extrato nuclear serviu para demonstrar a translocação

das MAP quinases ERK 1 e ERK 2 para o núcleo da célula. Células

endoteliais de aorta de coelho foram carenciadas por 24 horas e estimuladas

com doador de óxido nítrico SNAP (0,1 mM) e SBF (10%) por 30 minutos.

Após o período as células foram lisadas e submetidas à análise por

“immunobloting” utilizando anticorpos específicos para reconhecimento da

Resultados

59

forma ativada de ERK 1 / ERK 2 conforme descrito em material e métodos.

No extrato nuclear a MAP quinase ERK 1 predominava e se encontrava

fosforilada após estímulo com doador de No e SBF, Figura 4A.

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5

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Den

sito

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ry

(arb

itrar

y un

its)

Figura 4A. Células endoteliais de aorta de coelho foram carenciadas por 24 horas. Após

este período foram incubadas na presença de SNAP e SBF em doses previamente

descritas. Após 30 min. de incubação as células foram lisadas. A quantidade de proteínas

utilizada do lisado nuclear foi de 150µg. A corrida foi feita através de SDS/PAGE (10% gel) e

transferida para membranas de nitrocelulose. “Immunoblotting” foi fixado com anti ERK 1 /

ERK 2 anticorpos e anti-phospho ERK 1 / ERK 2. A revelação foi feita por ECL. O

autoradiograma é representativo de três experimentos independentes. O nível de

fosforilação em cada faixa de proteína observado no autoradiograma foi determinado por

densitometria laser. A significância foi fixada em *p < 0.05 em relação ao controle não

tratado.

Nas células que expressam a forma negativa dominante de Ras

(C3A), apenas o estímulo com soro promoveu a fosforilação da MAP

* *

Resultados

60

quinase p44 ERK 1. Células transfectadas com vetor vazio se comportaram

como as células parentais. Figura 4B.

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10

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its)

Figura 4B. Células C3A e pcDNA foram carenciadas por 24 horas. Após este período foram incubadas na presença de SNAP (0,1 mM) e SBF (10%) em doses previamente descritas. Após 30 min. de incubação as células foram lisadas. A quantidade de proteínas utilizada do lisado nuclear foi de 150µg. A corrida foi feita através de SDS/PAGE (10% gel) e transferida para membranas de nitrocelulose. “Immunoblotting” foi fixado com anti ERK 1 / ERK 2 anticorpos e anti-phospho ERK 1 / ERK 2. A revelação foi feita por ECL. O autoradiograma é representativo de três experimentos independentes. O nível de fosforilação em cada faixa de proteína observado no autoradiograma foi determinado por densitometria laser. A significância foi fixada em *p < 0.05 em relação ao controle não tratado.

*

**

Resultados

61

1 2 3

Quando utilizamos o inibidor de MEK 1 (PD98059), não verificamos a

fosforilação das MAP quinases ERK 1 e ERK 2, no extrato nuclear de células

endoteliais de aorta de coelho submetidas aos dois estímulos (dados não

demonstrados).

Utilizamos imunofluorescência indireta com o objetivo de

confirmarmos a migração para o núcleo das formas fosforiladas das ERKs,

após estímulo com soro e com doador de NO.

Estimulo com 10% de soro bovino fetal induziram a migração das

formas fosforiladas MAP quinases ERKs para o núcleo celular, no curso do

tempo inicial. Os dados foram obtidos através da imunofluorescência indireta

com leitura em microscopia confocal, Figura 4C.

Figura 4C. Soro bovino fetal (SBF) ativa a translocação das MAP quinases ERK 1 e ERK 2

para o núcleo em células Endoteliais de aorta de coelho. Células foram carenciadas por 24

horas e estimuladas com SBF 10% por 15 minutos e 30 minutos. 1- corresponde a célula

controle sem estímulo; 2 – corresponde ao tempo 15 minutos com estimulo de SBF; 3 –

corresponde ao tempo 30 minutos com estimulo de SBF. A imunofluorescencia indireta foi

elaborada com a utilização de anticorpos anti-phospho ERK 1 / ERK 2. A leitura foi feita em

microscópio confocal com objetiva de 100 X e ocular de 10 X, aumento final de 1.000 X.

Resultados

62

1 2 3

1 2 3

Semelhante resultado foi observado com a utilização de SNAP 0,1

mM, Figura 4D

Figura 4D. Óxido Nítrico ativa a migração das MAP quinases ERK 1 e ERK 2 para o núcleo de células endoteliais de aorta de coelho. Células foram carenciadas por 24 horas e estimuladas com doador de NO (SNAP=0,1mM) por 15 minutos e 30 minutos. 1- corresponde a célula controle sem estímulo; 2 – corresponde ao tempo 15 minutos com estímulo de SNAP; 3 – corresponde ao tempo 30 minutos com estímulo de SNAP. A imunofluorescencia indireta foi elaborada com a utilização de anticorpos anti-phospho ERK 1 / ERK 2. A leitura foi feita em microscópio confocal com objetiva de 100 X e ocular de 10 X, aumento final de 1.000 X.

Inibidor de MEK 1 PD 98059 inibe a translocação das ERKs para o

núcleo da célula em RAEC diante de estimulo com SNAP 0,1 mM. Figura

4E.

Figura 4E. Inibidor de MEK 1 PD 98059 inibe a migração das Map quinases ERK 1 e ERK 2 para o núcleo de células endoteliais de aorta de coelho. Células foram carenciadas por 24 horas e pré-incubadas com inibidor de MEK PD98059 na concentração de 20 µM por 30 minutos. Depois deste período foi feita a incubação na presença do doador SNAP (0,1 mM) por 15 e 30 minutos. 1- corresponde a célula controle sem estímulo; 2 – corresponde ao tempo 15 minutos com SNAP; 3 – corresponde ao tempo 30 minutos com SNAP . A imunofluorescencia indireta foi elaborada com a autilização de anticorpos anti-phospho ERK 1 / ERK 2. A leitura foi feita em microscópio confocal com objetiva de 100 X e ocular de 10 X, aumento final de 1.000 X.

Resultados

63

2 1 3

Resultados semelhantes foram obtidos com a utilização do inibidor de

MEK 1 PD 98059 e com estimulo de soto fetal bovino a 10% (dados não

apresentados).

Como esperado em células C3A, a ausência da forma funcional de

Ras não permitiu a translocação nuclear das ERK 1 / 2 após estímulo com

NO. Ao contrário, quando estimuladas com soro, as células responderam cm

a ocorrência do fenômeno, Figura 4F e 4G.

Figura 4F. Células C3A estimuladas com SNAP 0,1 mM.

Figura 4F. Óxido Nítrico não estimula a migração das MAP quinases ERK 1 e ERK 2 para o

núcleo de células endoteliais de aorta de coelho transfectadas com mutante negativo

N17Ras, C3A. Células foram carenciadas por 24 horas e estimuladas com doador de NO

(SNAP=0,1mM) por 30 minutos. 1- corresponde a célula controle sem estímulo; 2 –

corresponde ao tempo 15 minutos com estímulo de SNAP; 3 – corresponde ao tempo 30

minutos com estímulo de SNAP. A imunofluorescencia indireta foi elaborada com a

utilização de anticorpos anti-phospho ERK 1 / ERK 2. A leitura foi feita em microscópio

confocal com objetiva de 100 X e ocular de 10 X, aumento final de 1.000 X.

Resultados

64

2 1 3

Figura 4G. Células C3A estimuladas com soro bovino fetal 10%.

Figura 4G. Soro bovino fetal estimula a migração das MAP quinases ERK 1 e ERK 2 para o

núcleo de células endoteliais de aorta de coelho transfectadas com mutante negativo

N17Ras, C3A. Células foram carenciadas por 24 horas e estimuladas com SBF 10% por 15

e 30 minutos. 1- corresponde a célula controle sem estímulo; 2 – corresponde ao tempo 15

minutos com estímulo de SBF; 3 – corresponde ao tempo 30 minutos com estímulo de SBF.

A imunofluorescencia indireta foi elaborada com a utilização de anticorpos anti-phospho

ERK 1 / ERK 2. A leitura foi feita em microscópio confocal com objetiva de 100 X e ocular de

10 X, aumento final de 1.000 X.

Nós também observamos a migração das MAP quinases ERK 1 e

ERK 2 para o núcleo em células transfectadas com plasmídeo vazio

(pcDNA), (dados não apresentados).

Após a caracterização da translocação para o núcleo das MAP

quinases ERK 1 e ERK 2 verificamos a fosforilação do fator de transcrição

Elk-1 após 60 minutos de incubação com doador de NO (SNAP 0,1mM) e

SBF (10%). A determinação do tempo foi estabelecida através de uma curva

de tempo em células estimuladas com SNAP 0,1 mM, figura 4H. Resultado

semelhante foi observado com estimulo de SBF 10% (dados não

apresentados).

Resultados

65

Figura 4 H.

050

100150200250300350

0 min 15 min 30 min 45 min 60 min

Den

sito

met

ry(a

rbitr

ary

units

)

Figura 4H. Células Endoteliais de Aorta de Coelhos foram carenciadas por 24 horas. Após

este período foram incubadas na presença de SNAP (0,1 mM) e SBF (10%). Os lisados de

extrato nuclear foram obtidos nos tempos 15 min/ 30 min/ 45 mim e 60 min. A quantidade de

proteínas utilizada do lisado nuclear foi de 150µg. A corrida foi feita através de SDS/PAGE

(10% gel) e transferida para membranas de nitrocelulose. “Immunoblotting” foi fixado com

anti Elk-1 anticorpos e anti-phospho Elk-1. A revelação foi feita por ECL. O autoradiograma

é resultado de três experimentos independentes. O nível de fosforilação em cada faixa de

proteína observado no autoradiograma foi determinado por densitometria laser. A


Com a fosforilação de Ekl -1 em células endoteliais de aorta de coelho

através de estimulo com SNAP e SBF por 60 minutos, fomos observar os

eventos em células transfectadas C3A e pcDNA, nas mesmas condições

descritas para células endoteliais de aorta de coelho, como demonstrado na

figura 4 I.

* **

Resultados

66

0

5

10

15

Den

sito

met

ry

(arb

itrar

y un

its)

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Den

sito

met

ry

(arb

itrar

y un

its)

Figura 4I. Células C3A e pcDNA foram carenciadas por 24 horas. Após este período

foram incubadas na presença de SNAP e SBF em doses previamente descritas. Os lisados

de extrato nuclear foi obtido no tempo 60 min. A quantidade de proteínas utilizada do lisado

nuclear foi de 150µg. A corrida foi feita através de SDS/PAGE (10% gel) e transferida para

membranas de nitrocelulose. “Immunoblotting” foi fixado com anti Elk-1 anticorpos e anti-

phospho Elk-1. A revelação foi feita por ECL. O autoradiograma é resultado de três

experimentos independentes. O nível de fosforilação em cada faixa de proteína observado

no autoradiograma foi determinado por densitometria laser. A significância foi fixada em *p <

0.05 em relação ao controle não tratado.

A confirmação da participação da via de p21Ras – MAP quinases

ERK 1 e ERK 2 no processo de fosforilação de Elk – 1, foi feita utilizando-se

o inibidor de MEK PD 98059 e as células C3A, deficientes em Ras.

*

* *

Resultados

67

Nós observamos que, quando utilizamos o inibidor de MEK 1,

PD98059 em células endoteliais de aorta de coelho, a fosforilação de Elk-1

não ocorreu, figura 4J. O mesmo efeito foi observado quando da utilização

de células C3A estimuladas com SBF, (dados não apresentados).

Figura 4J.

0

2

4

6

8

Den

sito

met

ry

(arb

itrar

y un

its)

Figura 4J. Células endoteliais de aorta de coelho foram carenciadas por 24 horas e pré-

incubadas com inibidor de MEK PD98059 na concentração de 20 µM por 30 minutos.

Depois deste período foi feita a incubação na presença do doador SNAP (0,1 mM) e SBF

(10%) por 30 minutos. Após este período as células foram lisadas. A quantidade de



anti Elk-1 anticorpos e anti-phospho Elk-1. A revelação foi feita por ECL. O autoradiograma

é resultado de três experimentos independentes. O nível de fosforilação em cada faixa de



**

Resultados

68

4.3 Fator de transcrição Elk-1 fosforilado aumenta e expressão da

ciclina D1 e das quinases dependentes de cliclinas cdk4 e cdk 6.

Como demonstrado acima, a fosforilação das MAP quinases ERK 1 /

2 e a sua conseqüente translocação para o núcleo, fosforila o fator de

transcrição Elk-1. Para a progressão do ciclo celular a fosforilação de ELK-1

promove o recrutamento da ciclina D1, cdk4 e cdk 6. Este complexo ternário

é necessário para a progressão do ciclo celular. Em células de mamíferos, a

ciclina D1, é uma importante ferramenta no controle da transição da fase G1

para fase S (Sherr, 1994 e Hunter, 1994). A ciclina D1 ativa as proteínas

dependentes de quinase Cdk4 e Cdk6 (Weinberg, 1995).

Em nosso estudo, observamos que o estimulo com doador SNAP (0,1

mM) e SBF (10%) elevam a expressão da ciclina D1 e das quinases

dependente de ciclinas cdk 4 e cdk 6 em células endoteliais de aorta de

coelho, e em células transfectadas com vetor vazio pcDNA, figura 5A e 5B.

Figura 5A.

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Resultados

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Figura 5A. Células Endoteliais de Aorta de Coelhos foram carenciadas por 24 horas. Após


extrato nuclear foram obtidos após 60 minutos. A quantidade de proteínas utilizada do lisado


membranas de nitrocelulose. “Immunoblotting” foi fixado com anticorpo anti ciclina D1,

anticorpo anti cdk4 e cdk 6. Para normalizador foi utilizado anticorpo anti cdc 2. A revelação

foi feita por ECL. O autoradiograma é resultado de três experimentos independentes. O

nível de fosforilação em cada faixa de proteína observado no autoradiograma foi

determinado por densitometria laser. A significância foi fixada em *p < 0.05 em relação ao

controle não tratado.

* *

* *

Resultados

70

Figura 5B

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Figura 5B. Células transfectadas com plasmídeo vazio pcDNA foram carenciadas por 24 horas. Após este período foram incubadas na presença de SNAP (0,1 mM) e SBF(10%). Os lisados de extrato nuclear foram obtidos após 60 minutos. A quantidade de proteínas utilizada do lisado nuclear foi de 150µg. A corrida foi feita através de SDS/PAGE (10% gel) e transferida para membranas de nitrocelulose. “Immunoblotting” foi fixado com anticorpo anti ciclina D1, anticorpo anti cdk4 e cdk 6. Para normalizador foi utilizado anticorpo anti cdc 2. A revelação foi feita por ECL. O autoradiograma é resultado de três experimentos independentes. O nível de fosforilação em cada faixa de proteína observado no autoradiograma foi determinado por densitometria laser. A significância foi fixada em *p < 0.05 em relação ao controle não tratado.

* *

* *

* *

Resultados

71

Utilizamos a expressão da proteína quinase p34cdc2 ou cdc2 como

normalizadora na avaliação das alterações de expressão da ciclina D1 e das

quinases dependentes de ciclinas cdk4 e cdk6, uma vez que a expressão

desta proteína quinase é importante para a transição dos estágios G1-S e

G2-M e permanece inalterada ao longo do ciclo celular, (Sherr, 1994).

Quando utilizarmos as células Ras negativa dominante, C3A, não

verificamos o aumento da expressão da ciclina D1, bem como das quinases

dependentes de ciclinas cdk4 e cdk6, quando estas células eram

estimuladas com doador de NO (SNAP 0,1mM) por 60 minutos. Ao contrário,

quando as células C3A eram estimuladas com soro bovino fetal (10%), como

demonstrado na figura 5C.

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Resultados

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Figura 5C. Células Ras dominante negativa, C3A, foram carenciadas por 24 horas. Após este período foram incubadas na presença de SNAP (0,1 mM) e SBF(10%) em doses previamente descritas. Os lisados de extrato nuclear foram obtidos após 60 minutos. A quantidade de proteínas utilizada do lisado nuclear foi de 150µg. A corrida foi feita através de SDS/PAGE (10% gel) e transferida para membranas de nitrocelulose. “Immunoblotting” foi fixado com anticorpo anti ciclina D1, anticorpo anti cdk4 e cdk 6. Para normalizador foi utilizado anticorpo anti cdc 2. A revelação foi feita por ECL. O autoradiograma é resultado de três experimentos independentes. O nível de fosforilação em cada faixa de proteína observado no autoradiograma foi determinado por densitometria laser. A significância foi fixada em *p < 0.05 em relação ao controle não tratado.

Como esperado o bloqueio da via Ras – MAP quinase em ERK 1 / 2

através do uso de seu inibidor farmacológico PD 98059, inibiu a expressão

da ciclina D1, estimulada pelo doador de NO ou por soro, figura 5D.

*

Resultados

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Figura 5D. Células Endoteliais de Aorta de Coelhos foram carenciadas por 24 horas e pré incubadas com inibidor de MEK PD98059 na concentração de 20µM por 30 minutos. Após este período foram incubadas na presença de SNAP (0,1 mM) e SBF (10%). Os lisados de extrato nuclear foram obtidos após 60 minutos. A quantidade de proteínas utilizada do lisado nuclear foi de 150µg. A corrida foi feita através de SDS/PAGE (10% gel) e transferida para membranas de nitrocelulose. “Immunoblotting” foi fixado com anticorpo anti ciclina D1, anticorpo anti cdk4 e cdk 6. Para normalizador foi utilizado anticorpo anti cdc 2. A revelação foi feita por ECL. O autoradiograma é resultado de três experimentos independentes. O nível de fosforilação em cada faixa de proteína observado no autoradiograma foi determinado por densitometria laser. A significância foi fixada em *p < 0.05 em relação ao controle não tratado.

4.4 Associação catalítica da ciclina D1 com as proteínas quinases

dependentes de ciclinas Cdk4 e Cdk6 hiperfosforila a proteína

retinoblastoma (pRb) quando células endoteliais de aorta de coelho

foram estimuladas com doadores de NO e SBF.

A associação catalítica da ciclina D1 com cdk 4 e cdk 6 é essencial

para a fosforilação da proteína Rb. Esta associação catalítica hiperfosforila

a proteína do retinoblastoma (pRb) no final da fase G1 (Weinberg, 1995).

Nós verificamos que o aumento da expressão de ciclina D1 e das

**

Resultados

74

ciclinas dependentes de quinase cdk 4 e cdk 6, fosforilam a proteína Rb,

quando células endoteliais de aorta de coelho foram estimuladas com

doador de NO (SNAP 0,1 mM) ou com SBF (10%) por 60 minutos, figura 6A.

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Figura 6A. Células Endoteliais de Aorta de Coelhos foram carenciadas por 24 horas. Após


extrato nuclear foram obtidos nos tempos 15 min/ 30 min/ 45 mim e 60 min. A quantidade de



anticorpo anti pRb e anti-phospho pRb. A revelação foi feita por ECL. O autoradiograma é

resultado de três experimentos independentes. O nível de fosforilação em cada faixa de



Com a fosforilação da proteína Rb em células endoteliais de aorta de

coelho através de estimulo com SNAP e SBF por 60 minutos, fomos

observar os eventos em células transfectadas C3A e pcDNA, nas mesmas

condições descritas para células endoteliais de aorta de coelho, como

demonstrado na figura 6B.

* *

Resultados

75

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Figura 6B. Células C3A e pcDNA foram carenciadas por 24 horas. Após este período

foram incubadas na presença de SNAP e SBF em doses previamente descritas. Os lisados

de extrato nuclear foi obtido no tempo 60 min. A quantidade de proteínas utilizada do lisado


membranas de nitrocelulose. “Immunoblotting” foi fixado com anticorpo anti pRb e anti-

phospho pRb. A revelação foi feita por ECL. O autoradiograma é resultado de três

experimentos independentes. O nível de fosforilação em cada faixa de proteína observado

no autoradiograma foi determinado por densitometria laser. A significância foi fixada em *p <

0.05 em relação ao controle não tratado.

O inibidor de MEK PD98059 bloqueou a fosforilação da proteína Rb

mediada tanto por NO quanto por soro (dados não apresentados).

*

* *

Resultados

76

4.5. Efeito do óxido nítrico e do soro bovino fetal na progressão do ciclo celular da fase G1 para a fase S em células endoteliais de aorta de coelho.

Aquisição de células por citometria de fluxo foi elaborada para

associar a fosforilação da proteína Rb com a transição do ciclo celular da

fase G1 para a fase S. Nós examinamos a participação do doador de NO

(SNAP) e SBF no processo com células endoteliais de aorta de coelho.

Utilizamos também o inibidor de MEK 1, PD98059 com incubação prévia de

30 minutos e em seguida os estímulos para verificarmos a participação das

MAP quinases ERK 1 e ERK 2 na cascata de sinalização celular. 104

células/ml foram plaqueadas em placas de 6 poços aglomerados. Após 24

horas as células foram tratadas com 0,1mM de SNAP e 10% de SBF durante

120 minutos em atmosfera 5% de CO2 à 37ºC. Para o controle, as células

foram mantidas com meio F12 suplementado com 0,5% de SBF. Utilizamos

o protocolo do “CycleTEST PLUS™ DNA Reagent Kit” da empresa Becton

Dickinson para o tratamento das células para aquisição. A aquisição das

células foi feita por citometria de fluxo, através do software ModFit LT V 2.0 e

a análise dos histogramas pelo software Cell Quest (Becton Dickinson),

Figura 7A. O tempo foi determinado através do acompanhamento das

alterações tempo-dependente, (dados não apresentados).

Resultados

77

1

2

Resultados

78

3

4

Resultados

79

5

Figura 7A. Para controle células endoteliais de aorta de coelho foram mantidas em meio

F12 com suplementação de 0,5% de SBF (Histograma 1). Células endoteliais de aorta de

coelho foram tratadas com doador de NO (SNAP 0,1 mM) , SBF (10%) por 120 minutos

(Histograma 2 e 3). Utilizamos também o inibidor de MEK 1 PD98059 (20 µM) por 30

minutos e em seguida estimulo com doador de NO (SNAP 0,1mM) e SBF (10%) por 120

minutos (Histograma 4 e 5). A aquisição das células foi feita por citometria de fluxo, através

do software ModFit LT V 2.0 e a análise dos histogramas pelo software Cell Quest (Becton

Dickinson). A significância foi fixada em *p < 0.05. Os dados tabulados são representativos

de três experimentos independentes.

Com o objetivo de oferecermos suporte experimental adicional para

elucidarmos o papel de p21Ras no processo da ativação do ciclo celular

mediado pelo NO, utilizamos células negativas dominantes para p21Ras,

C3A. Procedemos de maneira análoga às células parentais, figura 7B.

Resultados

80

Resultados

81

Figura 7B. Células C3A foram tratadas com doador de NO (SNAP 0,1 mM) , SBF (10%)

por 120 minutos. As células controles foram mantidas em meio F12 com suplementação de

SBF 0,5% de SBF. A aquisição das células foi feita por citometria de fluxo, através do

software ModFit LT V 2.0 e a análise dos histogramas pelo software Cell Quest (Becton

Dickinson). A significância foi fixada em *p < 0.05. Os dados tabulados são representativos

de três experimentos independentes.

A utilização do inibidor de MEK 1, PD 98059 bloqueou a progressão

do ciclo celular da fase G1 para a fase S, quando células C3A foram

estimuladas com soro bovino fetal 10%, (dados não apresentados).

Com as células transfectadas com o vetor vazio procedemos de

maneira análoga às células parentais, figura 7C.

Resultados

82

Resultados

83

Figura 7C. Células pcDNA foram tratadas com doador de NO (SNAP 0,1 mM) , SBF (10%)

por 120 minutos. A aquisição das células foi feita por citometria de fluxo, através do software

ModFit LT V 2.0 e a análise dos histogramas pelo software Cell Quest (Becton Dickinson).

A significância foi fixada em *p < 0.05. Os dados tabulados são representativos de três

experimentos independentes.

A utilização do inibidor de MEK 1, PD 98059 bloqueou a progressão

do ciclo celular da fase G1 para a fase S, quando células pcDNA foram

estimuladas com doador de NO (SNAP 0,1 mM) e soro bovino fetal (10%),

(dados não apresentados).

4.6 Efeito do óxido nítrico e do soro bovino fetal na passagem do ciclo

celular da fase G1 para a fase S, através do aumento da expressão da

ciclina E.

Resultados

84

A caracterização dos dados demonstrados nos histogramas, através

da passagem do ciclo celular da fase G1 para a fase S, pode ser confirmada

com a análise do aumento da expressão da ciclina E, uma vez que a

expressão do gene codificador da ciclina E é regulado pelo E2F (Sherr,

1996) como demonstrado na figura 8. Ativação da Ciclina E pode ser

observada após 180 minutos de estímulo com doador de NO SNAP=0,1mM

e SBF a 10%. O tempo de 180 minutos foi determinado através de uma

cinética de tempo, (dados não apresentados). Figura 8.

Figura 8. Células Endoteliais de Aorta de Coelhos foram carenciadas por 24 horas. Após este período foram incubadas na presença de SNAP (0,1 mM) e SBF(10%). Também foram utilizadas células C3A e PcDNA nas mesmas condições. Os lisados de extrato nuclear foram obtidos após 180 minutos. A quantidade de proteínas utilizada do lisado nuclear foi de 150µg. A corrida foi feita através de SDS/PAGE (10% gel) e transferida para membranas de nitrocelulose. “Immunoblotting” foi fixado com anticorpo anti ciclina E. Para normalizador foi utilizado anticorpo anti cdc 2. A revelação foi feita por ECL. O autoradiograma é representativo de três experimentos independentes. O nível de fosforilação em cada faixa e proteína observado no autoradiograma foi determinado por densitometria laser. A significância foi fixada em *p < 0.05 em relação ao controle não tratado.

0

20

40

60

80

100

Des

nsito

met

ry a

rbitr

ary

units

* * * * *

Resultados

85

4.7 Efeito do óxido nítrico e do soro bovino fetal na passagem do ciclo

celular da fase S para a fase G2/M, através do aumento da expressão da

ciclina A

Para caracterizar a progressão do ciclo celular através da passagem

da fase S para a Fase G2/M, determinamos o aumento da expressão da

ciclina A. Ativação da Ciclina A após 300 minutos de estímulo com doador

de NO SNAP=0,1mM e BFS a 10%. O tempo de 300 minutos foi

determinado através de uma cinética de tempo, (dados não demonstrados).

Figura 9A.

0

20

40

60

80

100

Des

nsito

met

ry a

rbitr

ary

units

Figura 9A. Células Endoteliais de Aorta de Coelhos foram carenciadas por 24 horas. Após este período foram incubadas na presença de SNAP (0,1 mM) e SBF(10%). Também foram utilizadas células C3A e PcDNA nas mesmas condições. Os lisados de extrato nuclear foram obtidos após 300 minutos. A quantidade de proteínas utilizada do lisado nuclear foi de 150µg. A corrida foi feita através de SDS/PAGE (10% gel) e transferida para membranas de nitrocelulose. “Immunoblotting” foi fixado com anticorpo anti ciclina A. Para normalizador foi utilizado anticorpo anti cdc 2. A revelação foi feita por ECL. O autoradiograma é representativo de três experimentos independentes. O nível de fosforilação em cada faixa de proteína observado no autoradiograma foi determinado por densitometria laser. A significância foi fixada em *p < 0.05 em relação ao controle não tratado.

* * * * *

Resultados

86

Aquisição de células por citometria de fluxo foi elaborada para

associar o aumento da expressão da ciclina A com a transição do ciclo

celular da fase S para a fase G2/M. Foram utilizadas células endoteliais de

aorta de coelho, células C3A e células pcDNA. 104 células/ml foram

plaqueadas em placas de 6 poços aglomerados. Após 24 horas as células

foram tratadas com 0,1mM de SNAP e 10% de SBF durante 300 minutos em

atmosfera 5% de CO2 à 37ºC. Utilizamos o protocolo do “CycleTEST

PLUS™ DNA Reagent Kit” da empresa Becton Dickinson para o tratamento

das células e aquisição. A aquisição das células foi feita por citometria de

fluxo, através do software ModFit LT V 2.0 e a análise dos histogramas pelo

software Cell Quest (Becton Dickinson), Figura 9B. O tempo foi determinado

através de uma cinética de tempo, dados não apresentados.

Resultados

87

Resultados

88

Resultados

89

Resultados

90

Figura 9B. Células RAEC (EC), C3A e PcDNA foram tratadas com doador de NO (SNAP

0,1 mM) , SBF (10%) por 300 minutos. A aquisição das células foi feita por citometria de

fluxo, através do software ModFit LT V 2.0 e a análise dos histogramas pelo software Cell

Quest (Becton Dickinson). A significância foi fixada em *p < 0.05. Os dados tabulados são

representativos de três experimentos independentes.

Resultados

91

Como esperado, quando utilizamos o inibidor de MEK PD98059 e em

seguida estímulos com SNAP e SBF em células endoteliais de aorta de

coelho, C3A, e pcDNA não observamos a transição do ciclo celular da fase S

para a fase G2/M, dados não demonstrados.

4.8 Efeito do óxido nítrico e do soro bovino fetal na proliferação de células

endoteliais de aorta de coelho.

Uma vez demonstrada a progressão da fase G2/M do ciclo celular,

mediada por NO, passamos ao estudo da proliferação sob estímulo de

doador de NO. O estímulo dado pelo SBF (10%) foi utilizado como controle

positivo. Células endoteliais de aorta de coelho foram estimuladas com

doadores de NO e soro bovino fetal nas concentrações: SNAP (0,1 mM) e

SBF (10%). Células endoteliais de aorta de coelho em meio de cultura F12

com suplementação de 0,5% de soro bovino fetal foram contadas e

semeadas inicialmente a 5X104 células / poço. Novas contagens foram feitas

após o intervalo de 24 horas. Estímulo com doadores de NO e com soro

bovino fetal foi feito no tempo 24 horas por 300 minutos. A contagem final

para comparação entre as diferentes situações foi feita no tempo de 48

horas. Os resultados obtidos demonstram que células endoteliais de aorta

de coelho estimuladas com NO e SBF tiveram incrementos na proliferação

celular em comparação com células que não receberam estimulo, Figura 10.

Resultados

92

*

*

Curva de Crescimento Celular Raec

5

15,28

8,08

28,52 29,9

05

10152025303540

Inicial 24 h 48 h 48 h 48 hTempo

Núm

ero

de C

élul

as EC

EC/SNAP

EC/SBF

Figura 10. Células endoteliais de aorta de coelho foram mantidas em meio F12 mais 0,5%

de SBF. Contagem após 24 horas. Estímulos com doadores de NO e SBF no tempo 24

horas por 300 minutos. Verificação do efeito dos estímulos na proliferação no tempo 48

horas. Células contadas inicialmente, 5X104 por poço. Resultados são dados de três

experimentos independentes e todas as contagens foram feitas em triplicatas. *P < 0,05.

Controle vs. SNAP e SBF.

4.9 Inibição das MAP quinases ERK 1 e ERK 2 e seus efeitos na proliferação

de células endoteliais de aorta de coelho induzida por óxido nítrico e SBF.

Células endoteliais de aorta de coelho em meio de cultura F12 mais

suplementação de 0,5% de SBF foram semeadas inicialmente a 5X104

células / poço. Novas contagens foram feitas no tempo 24 horas. A inibição

das MAP quinases ERK 1 e ERK 2 foi feita com o inibidor PD98059 na

concentração de 20 µM no tempo de 24 horas por 30 minutos. Estímulos

com SNAP (0,1 mM) e SBF (10%) foram dados por 300 minutos neste

tempo. Contagem final no tempo 48 horas foi feita para comparação dos

efeitos proliferativos. Os resultados observados mostram que o uso do

*

*

*

*

Resultados

93

*

inibidor PD98059 afeta diretamente a proliferação de Raec em condições

basais e de estímulo por NO e SBF. Figura 11.

Curva de Crescimento Celular Raec Tratadas com PD

5

8,15

15,5

8,17

28,41

8,19

30,05

8,18

05

10152025303540

Inicial 24 h 48 h 48 h 48 h 48 h 48 h 48 h

Tempo

Núm

ero

de C

élul

as CTL

CTL

CTL

CTL/PD

SNAP

SNAP/PD

SBF

SBF/PD

Figura 11. Células endoteliais de aorta de coelho foram contadas no período de 24 horas.

Em seguida a Inibição das MAP quinases por PD 98059 no tempo 24 horas e após,

estímulo com doadores de NO e SBF por 30 minutos. Verificação do efeito dos estímulos na

proliferação no tempo 48 horas Numero de células iniciais de 5X104 por poço. Resultados

são dados de três experimentos independentes e todas as contagens foram feitas em

triplicatas. *P < 0,05. Controle vs. SNAP e SBF.

Ficou demonstrado o papel de p21Ras na modificação mediada por

NO quando utilizamos as células C3A. Procedemos de maneira análoga as

células parentais. Estímulos com SNAP (0,1 mM) e SBF (10%) foi feito no

tempo 24 horas por 300 minutos e a contagem final no tempo 48 horas para

comparação dos efeitos em relação às células controles mantidas sem

estímulos.

O uso do inibidor de MEK 1 PD98059 foi utilizado para verificar seu

efeito na proliferação de células C3A quando estimuladas com soro bovino

fetal. Células contadas inicialmente, 5X104 por poço. Demonstramos assim

*

* *

*

Resultados

94

que a proliferação de células C3A estimulada por SBF era independente de

Ras, porém dependente de ERK 1 e ERK 2. Figura 12.

C3A - Curva de Crescimento Celular

5

7,11 10,8

7,12

24,5

7,12

0

5

10

15

20

25

30

Inicial 24 h 48 h 48 h 48 h 48 h

Tempo

Núm

ero

de C

élul

as

C3A/CTL

C3A/CTL

C3ACTL

SNAP

SBF

SBF/PD

Figura 12. Células C3A em meio F12 mais 0,5% de SBF. Contagem após 24 horas.

Estímulos nas doses indicadas no tempo 24 horas. Para a inibição das MAP quinases

utilizamos o inibidor de MEK 1 PD 98059 30 minutos antes dos estímulos. Verificação do

efeito dos estímulos na proliferação no tempo 48 horas. Células contadas inicialmente,

5X104 por poço. Resultados são dados de três experimentos independentes e todas as

contagens foram feitas em triplicatas. *P < 0,05. Controle vs. SNAP e SBF.

Também foi elaborada uma curva de crescimento para

células pcDNA. Os procedimentos foram estabelecidos de maneira análoga

aos das células parentais. Figura 13.

**

*

Resultados

95

*

Curva de Crescimento Celular ECpcDNA

58,13

15,26

28,3 28,97

05

101520253035

Inicial 24 h 48 h 48 h 48 h

Tempo

Núm

ero

de C

élul

asECpcDNA

ECpcDNA

ECpcDNA

EC/SNAP

EC/SBF

Figura 13. Células pcDNA em meio F12 mais 0,5% de SBF. Contagem no tempo 24

horas. Estímulos nas doses indicadas no tempo 24 horas. Verificação do efeito dos

estímulos na proliferação no tempo 48 horas. Células contadas inicialmente, 5X104 por

poço. Resultados são dados de três experimentos independentes e todas as contagens

foram feitas em triplicatas. *P < 0,05. Controle vs. SNAP e SBF.

Resultados da curva de crescimento com células pcDNA tratadas com

inibidor de MEK, PD 98059 e em seguidas estimuladas com doador de NO,

SNAP e SBF, mostrou inibição na proliferação, dados não apresentados.

*

**

*

6 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Referências Bibliográficas

2

Alessi, D.R.; Cuenda, A.; Cohen, P.; Dudley, D.T.; Saltiel, A.R. J. Biol.

Chem., 270: 27489-27494, 1995.

Arora, P. D.; Ma, J.; Min, W.; Cruz, T.; Mcculloch, C.A. Interleukin-1 Induced

Calcium Flux In Human Fibroblasts Is Mediated Through Focal Adhesions. J.

Biol. Chem., 270: 6042-6049, 1995.

Avrunch, J.; Zhang, X.F; Kyriakis. J.M. Raf Meets Ras: Completing The

Framework Of A Signal Transduction Pathway. Trends Biochem. Sci., 19:

279-283, 1993.

Baass, P.C.; Di Guglielmo, G.M.; Authier, F.; Posner, B.I.; Bergeron, J.J.M.

Compartmentalized Signal Transduction By Receptor Tyrosine Kinases.

Trends Cell. Biol., 5: 465-470, 1995.

Barbosa De Oliveira, L.C.; Rocha Oliveira, C.J.; Stern A.; Monteiro, H.P.

Effects of lypopolysaccharide On low - and high-density cultured rabbit

vascular smooth muscle Cells: differential modulation of nitric oxid relaese,

ERK 1 / ERK 2 Map Kinases activity, protein tyrosine phosphatase activity,

And DNA synthesis. Brazillian J. Med. Biol. Res., 35:181-190, 2002.

Blune-Jansen, Hunter, T.P. Oncogenic kinase signalling. Nature, 411: 355-

365, 2001.

Bradford, M.M. A Rapid And Sensitive Method For The Quantitation Of

Microgram Quantites Of Protein Utiling The Principle Of Protein-Dye Binding.

Anal. Biochem., 72: 248-245, 1976.


3

Brady-Kalnay, S. M.; Tonks, N. K. Protein Tyrosine Phosphatases As

Adhesion Receptors. Curr. Opin. Cell. Biol., 7: 650-657, 1995.

Buonassisi, V; Venter, J. C. Hormone and neurotransmitter receptors in na

established vascular endothelial cells line. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.

73:1612-1616, 1976

Burdon, R.H.; Rice-Evans, C. Free Radic. Res. Commun., 6: 345-358, 1989.

Burgering, B. M.T.; Bos, J.L. Regulation Of Ras-Mediated Signalling: More

Than One Way To Skin A Cat. Trends Biochem Sci., 20: 18-22, 1995.

Cdena, D.L.; Gill, G. N. Receptor Tyrosine Kinases. Faseb J., 6: 2332-2337,

1992.

CHIU, D. T., MONTEIRO, H. P., STERN, A. The Intracellular Reducing

Environment Modulates Cytoregulation And Cytotoxicity By Reactive Oxygen

Species. Biochemical Society Transactions. Londres - Inglaterra: , v.24,

p.884 - 887, 1996.

Chuang, C.F.; Ng, S.Y. Functional divergence of the MAP Kinase Pathway

ERK 1 and ERK 2 activate specific Transcription Factors. FEBS Lett.

46:229-239, 1994.

Clementi, E.; Sciorati, C.; Riccio, M.; Miloso, M.; Meldolesi, J.; Nisticò, G. J.

Biol. Chem., 270: 22277-22282, 1995.


4

Cohen, S.N.; Chang, A.C.Y.; Hsu, L. Non-Chromosomal Antibiotic

Resistance In Bacteria: Genetic Transformation Of E. Coli By R-Factor Dna.

Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69: 2110-2113, 1973

Cobb MH, Hepler JE, Cheng M, Robbins D. The mitogen-activated protein

kinases, ERK1 and ERK2. Semin Cancer Biol. 1994 Aug;5(4):261-8.

Cooke JP. NO and angiogenesis. Atheroscler Suppl. Dec;4(4):53-60. 2003

Chan, T. M.; Chen, E.; Tatoyan, A.; Shargill, N.S.; Pleta, M.; Hchstein, P.

Stimulation Of Tyrosine Specific Phosphorylation In The Rat Livet Plasma

Membrane By Oxygen Radicals. Biochem. Biophys. Res. Commun., 139:

439-445, 1986.

Davis, R.J. Mapks New Jnk Expands The Group. Trends Biochem. Sci., 19:

470-473, 1994.

Davis, R.J. The Mitogen-Activated Protein Kinase Signal Transduction

Pathway. J. Biol. Chem., 268: 14553-14556, 1993.

De Vries-Smits, A.M.M. Et Al. Nature, 357: 602-604,1992.

Dent, P.; Harer, W.; Haystead, T.A.J.; Vincent, L. A.; Roberts, T.M.; Sturgill,

T.W. Activation Of Mitogen-Activated Protein Kinase-Kinase By V-Rafin

Nih3t3 Cells And In Vitro. Science, 257: 1404-1406, 1992.

Deora, A.A.; Hajjar, D.P.; Lander, H.M. Recruitment and activation of Raf-1

kinase by nitric oxide-activated Ras. Biochemistry, 39: 9901-9908, 2000.


5

Deora, A.A.; Win, T.; Vanhaesebroeck, B.; Lander, H.M. J. Biol. Chem., 273:

29923-29928, 1998.

Dixon, J. E.; Walton, K.M. Protein Tyrosine Phosphatases. Ann. Re.

Biochem., 62: 101-120, 1993.

Dowdy, S.F., Hinds, P.W., Lovie, K., Reed, S.I., Arnold, A. and Weinberg,

R.A. Physical interaction of the retinoblastoma protein with human D cyclins.

Cell, 73:499-511, 1993.

Dulic, V. Less, E. and Reed, S.I. Association of human cyclin E with a

periodic G1-S phase protein kinase. Science, 257:1958-1961, 1992

Erpel, T.; Courtneidge, S.A. Src Family Of Protein Tyrosine Kinases And

Cellular Signal Transduction Pathways. Curr. Opin. Cell. Biol., 7: 176-182,

1995.

Fantl, V., Smith, R., Brookes, S., Dickson, C. & Peters, G. Chromosome

11q13 abnormalities in human breast cancer. Review. Cancer Surv. 18: 77–

94, 1993.

Fischer, E. H.; Charbonneau, H.; Tonks, N. K. Protein Tyrosine

Phosphatases: A Diverse Family Of Intracellular And Transmembrane

Enzymes. Science, 253: 401-406, 1991.

Flavahan, N.A. Atherosclerosis Or Lipoprotein-Induced Endothelial

Dysfunction: Potnetial Mechanisms Underlying Reduction In Edrf / No

Activity. Circulation, 85: 1927-1938, 1992.


6

Fleming, I.; Julou-Schaeffer, G.; Gray, G.A.; Parrat, J.R.; Stoclet, J.C.

Evidence Thet An L-Arginine/Nitric Oxide Dependent Elevation Of Tissue

Cyclic Gmp Content Is Involved In Depression Of Vascular Reactivity By

Endotoxin. British J. Pharmacol., 103: 1047-1052, 1991.

Folkman, J.; Shing, Y. Angiogenesis. J. Biol. Chem., 267: 10931-10934,

1992.

Garg, U.C.; Hassid, H. Nitric Oxide-Generating Vasodilatodors And 8-

Bromo-Cyclic Guanosine Monophosohate Inhibit Mitogenesis And

Proliferation Of Cultured Rat Vascular Smooth Muscle Cells. J. Clin. Invest.,

83: 1774-1777, 1989.

Garrington, T.P.; Johnson, G.L. Curr. Opin. Cell Biol., 11: 211-218, 1999.

Garthwaite, J.; Southam, E.; Boulton, C.L.; Nielsen, E.B.; Schmidt, K.; Mayer,

B. Mol. Pharmacol., 123: 299-309, 1995.

Gille, H.; Sharrocks, A.D.; Shaw, P.E. Phosphorviation Of Transcription

Factor P62 Tcf By Map Kinase Stimulates Ternary Complex Formation At C-

Fos Promoter. Nature, 358: 414-417, 1992.

Girard, F., Strausfeld, U., Fernandez, A. and Lamb, N.J.C. Cyclin A is

required for the onset of DNA re. Cell, 67:1169-1179, 1991.

Graña, X. and Reddy, P. Cell cycle control in mammalian cells: role of

cyclins, cyclin dependent kinases (CDKs), growth suppressor genes and

cyclin-dependent kinase inhibitors (CDKIs). Oncogene, 11:211-219, 1995


7

Gutkind, J.S. J. Biol. Chem., 273: 1839-1842, 1998.

Hagemann, C. : Happ, U.R. Isotype-Specific Functions Of Raf Kinases. Exp.

Cell Res., 253: 34-46, 1999.

Halliwell & Gutteridge. The rate of ROS to the cell. Free Radicalis In Biology

And Medicine. 2. Ed., Clarendon Press – Oxford, 1989.

Hartwell, L.H. and Kastan, M.B. Cell cycle control and cancer. Science, 266:

1821-1828, 1994.

Hartwell, L.H. and Weinert, T.A. Checkpoints: controls that ensure the order

of cell cycle events. Science, 246: 629-634, 1989.

Heck, D. E.; Laskin, D.L.; Gardner, C. R.; Laskin, J.D. Epidermal Growth

Factor Suppresses Nitric Oxide And Hydrogen Peroxide Production By

Keratinocytes. J. Biol. Chem., 267: 21277-21280, 1992.

Heffetz, D.; Zick, Y. H2o2 Potentiates Phosphorylation Of Novel Putative

Substrates For The Insulin Receptor Kinase In Intact Fao Cells. J. Biol.

Chem., 264: 10126-10132, 1989.

Honneger, A.M.; Dull. J.S.; Van Obberghen, E.; Bellot, F.; Szapary, D.;

Schmidt . A.; Ullrich. A.; Schlessinger, J. Point Mutation At The Apt Binding

Site Of Egf Receptor Abolishes Protein Tyrosine Kinase Activity And Alters

Cellular Routing. Cell., 51:199-209, 1987.


8

Horstrup, K.; Jablonka, B.; Honig-Liedl, P.; Just, M.; Kochsiek, K.; Walter, U.

Phosphorylation Of Focal Adhesion Vasodilatador-Stimulated

Phosphoprotein At Ser 157 Inact Human Platelets Correlates With Fibrinogen

Receptor Inhibiition. Eur. J. Biochem., 225: 21-27, 1994.

Hunter, T. and Pines, J. Cyclins and cancer II: Cyclin D and CDK inhibitors

come of age. Cell, 79:573-582, 1994.

Ignarro, L.J. Biosynthesis And Metabolism Of Endothelium-Derived Nitric

Oxide. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 30: 535-560, 1990.

Ignarro, L.J.; Lippton, H.; Edwards, J.C.; Baricos, W.H.; Hyman, A.L.;

Kadowitz, P.J.; Gruetter, C.A. Mechanisms Of Vascular Smooth Muscle

Relaxation By Organic Nitrates, Nitrites, Nitroprusside And Nitric Oxide:

Evidence For The Involvement Of S- Nirrosothiols As Active Intermediates.

J. Pharmacol. Exp. Ther., 218: 739-749, 1981.

Ishida, A.; Sasaguri, T.; Kosaka, C.; Nojima, H.; Ogata, J.; Induction of the

Cyclin-dependent Kinase Inhibitor p21Sdi1/Cip/Waf1 by Nitric Oxide-generating

Vasodilator in Vascular Smooth Muscle Cells. J. Biol. Chem., 272:10050-

100057, 1997.

Jansen-Dür, P. How viral oncogenes make the cell cycle. TIG, 12:270-275,

1996.

Jenkins, D.C.; Charles, I.G.; Thomsen, L.L.; Moss, D.W.; Holmes, L.S.;

Baylis, S.A.; Rhodes, P.; Westmore, K.; Emson, P.C.; Moncada, S. Roles Of


9

Nirtric Oxide In Tumor Growth. Proc. Natl. Acad. Sci USA, 92: 4392-4396,

1995.

Kanner, S. B.; Kavanagh, T.J.; Grossman, A.; Hu, S.L.; Bolen, J.B.;

Rabinovitch, P.S.; Ledbetter, J.A. Sulfhydryl Oxidation Down-Regulates T-

Cell Signaling And Inhibits Tyrosine Phosphorylation Of Phospholipase Cγ1.

Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89: 300-304, 1992.

Kato, J. Induction of S Fase By Regulatory Factors. Frontiers in

Bioscience. 4:787-795; 1999.

Katsuki, S.; Arnold, W.; Mittal, C.K.; Murad, F. J. Cyclic Nucl. Res., 3: 23-35,

1977.

Katusic, Z. S.; Vanhoutte, P.M. Superoxide Anion Is An Endotheliun-Derived

Contracting Factor. Am. J. Physiol., 257: H33-H37, 1989.

Katusic, Z. S; Shepherd, J. T.; Vanhoutte, P.M. Endotheliu-Dependent

Contractions To Calcium Ionophore A23187, Arachidonic Acid, And

Acetyicholine In Canine Basilar Artery. Stroke, 19: 476-479, 1988.

Kiechle, F. L.; Malinski, T. Nitric Oxide: Biochemistry, Pathophysiology And

Detection. Am. J. Clin. Pathol., 100: 567-575, 1993.

Klarlund, J.K. Transformation Of Cells By An Inhiitor Of Phosphatases Acting

On Phosphotyrosine In Proteins. Cell., 41: 707-717, 1985.


10

Klob, J.B. Mechanisms Involved In The Pro-And Anti-Apoptotic Role On No

In Human Leukemia. Leukemia, 14: 1685-1694, 2000.

Kolch, Walter. The Regulation Of The Ras/Raf/Mek/Erk Pathway By Protein

Interactions. Biochem. J., 351: 289-305, 2000.

Kolf, A., Giordano, A., Desai, D., Yamashita, K., Harper, J.W., Elledge, S.,

Nisahimoto, T., Morgan, D.O., Franza, B.R. and Roberts, J.M. Formation and

activation of a cyclin E-cdk2 complex during G1 phase of the human cell

cycle. Science, 257:1689-1694, 1992.

Kypta, R. M.; Goldberg, Y.; Ulug, E.T.; Courtneidge, S.A. Association

Between Pdgf Receptor And The Members Of The Src Family Of Tyrosine

Kinases. Cell, 62: 481-492, 1990.

Lander, H. M.; Ogiste, J.S.; Pearce, S.F.A.; Levi, R.; Novogrodsky, A. Nitric

Oxide-Stimulated Guanine Nucleotide Exchange On P21Ras. J. Bio. Chem.,

270: 7017-7020, 1995.

Lander, H.M. An essential role for free radicals and derived species in signal

transduction. Faseb J., 11: 118-124, 1997.

Lander, H.M.; Jacovina, A.T.; Davis, R.J.; Tauras, J.M. Differential activation

of mitogen-activated protein kinases by nitric oxide-related species. J. Biol.

Chem., 271: 19705-19709, 1996.

Lander, H.M.; Schaipal, P.; Levine, D.M.; Novogrodsky, A. Activation Of

Human Peripheral Blood Mononuclear Cells By Nitric Oxide Generating

Compounds. J. Immunol., 150: 1509-1516, 1993.


11

Lemman, A.; Burnett Jr., J.C Intact And Altered Endothelium En Regulation

Of Vasomotion. Circulation, 86: (Suppl. ΙΙΙ) ΙΙΙ-12 - ΙΙΙ-19, 1992.

Lenormand, P., Brondello, J. M., Brunet, A. and Pouyssegur, J. (1998).

Growth factor-induced p42/p44 MAPK nuclear translocation and retention

requires both MAPK activation and neosynthesis of nuclear anchoring

proteins. J. Cell Biol. 142, 625-633.

Lepoivre, M.; Fieschi, F.; Goves, J.; Thelander, L.; Fontecave, M. Inactivation

Of Ribonucliotide Reductase By Nitric Oxide. Biochem. Biophys. Res.

Commum., 179: 442-448, 1991.

Levine, A.J. p53, the cellular gatekeeper for growth and division. Cell,

88:323-331, 1997

Lewin, B. Genes VI. Oxford University Press, Inc, New York, 1260 p., 1977

Li, N.; Batzer. A.; Daly, R.; Yajnik, V.; Skolnik, E.; Chardin, P.; Bar-Sage, D.;

Margolis, B.; Schlessinger, J. Guanine-Nucleotide Releasing Factor Hsos1

Binds To Grb2 And Links Receptor Tyrosine Kinases To Ras Signalling.

Nature, 363: 85-88, 1993.

Liochev, S.L.; Fridovich, I. Vanadate-Stimulated Oxidation Of Nad (P) H In

The Presence Of Biological Membranes And Other Sources Of O2-. Arch.

Biochem. Biophys., 279: 1-7, 1990.


12

Lundberg A.S, Weinberg R.A. Functional inactivation of the retinoblastoma

protein requires sequential modification by at least two distinct cyclin-cdk

complexes. Mol. Cell Biol.;18 (2):753-61. 1998. (Feb).

Lloyd Ac, Obermuller F, Staddon S, Barth Cf, Mcmahon M, Land H.

Cooperating Oncogenes Converge To Regulate Cyclin/Cdk Complexes.

Genes Dev. 11:663-77. 1997.

Maciejewski, J.P.; Selleri, C.; Sato, T.; Cho, H.J.; Keefer, L.K.; Nathan, C.F.;

Young, N.S. Nitric Oxide Suppression Of Human Hematopoiesis In Vitro. J.

Clin. Invest., 96: 1085-1092, 1995.

Mandel, M.; Higa, A. Calcium-Dependent Bacteriophage Dna Infection. J.

Mol. Biol., 53: 154, 1970.

Marczin, N.; Papapetropoulos, A.; Catravas, J.D. Tyrosine Kinase Inhibitors

Suppress Endotoxin Ane Il-1b-Induced No Synthesis In Aortic Smooth

Musche Cells. Am. J. Plysiol., 265: H1014-H1018, 1993.

Marshall, H.E.; Merchant, K.; Stamler, J.S. Faseb J., 14: 1889-1900, 2000.

Mccormick, F., How . Receptors Turn Ras On. Nature, 363: 15-16, 1993.

Mcdonald, L. J.; Murad, F. In Nitric Oxide Biochemistry, Molecular Biology

And Therapeutic Implications (Ignarro, L., Murad, F., Eds.). Academic Press

Inc., San Diego: 263-275, 1995.

Meister A.; Anderson, M.E. Glutathione. Annu. Rev. Biochem., 52: 711-760,

1983.


13

Michel, T.; Li, G. K. Nitric Oxide: Biochemistry, Pathophysiology And

Subcellular Translocation Of Endothelial Nitric Oxide Synthase. Proc. Nat.

Acad. Sci. Usa, 90: 6252-6256, 1993.

Moncada, S.; Higgs, A. The L-Arginine-Nirric Oxide Pathway. N. Engl. J.

Med., 329: 2002-2012, 1993.

Monteiro, H. P.; Ivaschenko, Y.; Fischer, R.; Stern, A. Inhibition Of Protein

Tyrosine Phosphatase Activity By Diamide Is Reversed By Egf In Fibroblasts.

Febs Lett., 295: 146-148, 1991.

MONTEIRO, H. P., OLIVEIRA, L. C. B., PERANOVICH, T. M. S., PENHA, R.

G., STERN, A. Nitric Oxide-Stuimulated Tyrosine Phosphorylation-

Dependent Signaling Pathways In Cultured Cells In: Oxidative Stress,

Cancer, AIDS and Neurodegenerative Diseases.1 ed.Nova Iorque - EUA :

Marcell Dekker, 1997, v.1

Monteiro, H. P.; Stern, A. Redox Modulation Of Tyrosine Phosphorylation-

Dependent Signal Transduction Pathways. Free Rad. Biol. Med., 21: 323-

333, 1996.

Monteiro, H.P.; Gruia-Gray, J.; Peranovich, T.M.S.; Barbosa De Oliveira,

L.C.; Stern, A. Nitric oxide stimulates tyrosine phosphorylation of focal

adhesion kinase, Src kinase, and mitogen-activated protein kinases in murine

fibroblasts. Free Rad. Biol.& Med., 28: 174-182, 2000.


14

Monteiro, H.P.; Ivaschenko, Y.; Fischer, R.; Stern, A. Ascorbic Acid Inhibits

Protein Tyrosine Phosphatases In Her14 Cells Expressing Hman Epidermal

Growth Factor Receptors. Intl. J. Biochem., 25: 1859-1864, 1993.

Monteiro, H.P.; Peranovich, T.M.S.; Fries, D.M.; Stern, A.; Silva, A.M. Nitric

Oxide Potentiates Egf-Stimulated Tytosine Kinase Activity In 3T3 Cells

Expressing Human Egf Receptors. Em: K. Asada E T. Yoshikawa, Eds.

Fronteiers Of Reactive Oxygen Especies In Biology And Medicine.

Amsterdam: Elsevier Science: 215-218, 1994.

Moodie, S.A, ; Wolfman, A. The 3rs Of Life: Ras, Raf And Growth Regulation.

Trends Genet., 10: 44-48, 1994.

Morbidelli, L.; Chang, C.H; Douglas, J.G.; Granger, H.S.; Ledda, F.; Ziche, M.

Nitric oxide mediates mitogenic effect of VEGF on coronary venular

endothelium. Am. J. Physiol., 270: H411-H415, 1996.

Morgam, D.O. Principles of CDK regulation. Nature, 374: 131-134, 1995.

Murad, F. Jama, 276: 1189-1192, 1997.

Murray, A.W. and Kirschener, M.W. What controls the cell cycle. Scientific

American, 264: 56-63, 1991.

Murrell, G.A.C.; Francis, M.J.O.; Bromley, L. Biochem. J., 265: 659-665,

1990.


15

Nasmyth, K. Viewpoint: putting the cell cycle in order. Science, 274: 1643-

1645, 1996.

Nathan, C. Nitric Oxide As A Secretory Product Of Mammalian Cells. Faseb

J., 6: 3051-3064, 1992.

Nevins, J.R. E2F: a link between the Rb tumor suppressor protein and viral

oncoproteins. Science, 258:424-429, 1992

Nishibe, S.; Wahl, M.I.; Hernandez-Sotomayor, S.M.T.; Tonks, N.K.; Rhee,

S.G.; Carpenter, G. Increase Of The Catalytic Activity Of Phospholipase Cγ 1

By Tyrosine Phosphorylation. Science, 250: 1253-1256, 1990.

Nurse, P. Universal control mechanism-regulating onset of M-phase. Nature,

344: 503-508, 1990.

Pardee, A.B. G1 events and regulation of cell profileration. Science, 246:

603-608, 1989.

Peranovich, T.M.S.; Silva, A.M. Da; Fries, D.M.; Stern, A.; Monteiro, H.P.

Nitric Oxide Stimulates Tyrosine Phosphorylation In Murine Fibroblasts In

The Absence And Presence Of Epidermal Growth Factor. Biochem J., 305:

613-619, 1995.


16

Pervin, S.; Singh, R.; Chaudhuri, D. Nitric oxide-induced cytostasis and cell

cycle arrest of a human breast cancer cell line (MDA-MB-231): Potential role

of cyclin D1. PNAS. 98:3583-3588, 2001

Pham, N.; Cheglakov, I.; Koch, C.A.; De Hoog, C.L.; Moran, M.F.; Rotin, D.

Curr. Biol., 10: 555-558, 2000.

Rees, D.D.; Palmer, R.M.J.; Moncada, S. Role Of Indothelium-Derived Nitric

Oxide In The Regulation Of Blood Presure. Proc. Nat. Acad. Sce. USA, 86:

3375-3378, 1989.

Reuter, C.W.M.; Morgan, M.A.; Bergmann, L. Blood, 96: 1655-1669, 2000.

Rocha Oliveira, C.J.; Schindler, F.; Ventura, A, M.; Moraes, M.S.; Arai, R. J.;

Debbas, V.; Stern, A.; Monteiro, H. P. Nitric Oxide and cGMP Activate the

Ras-MAP Kinase Pathway-Stimulating Protein Tyrosine Phosphorylation in

Rabbit Aortic Endothelial Cells. Free Radic. Biol. Med. 35:381-396:2003

Rooij, J.; Bos, J. L. Oncogene, 14: 623-625, 1997.

Salvemini, D.; Botting, R. Modulation Of Platelet Function By Free Radicals

And Free Radical Scavengers. Trends Pharm. Sci, 14: 36-42. 1993.

Sambrook, J.; Fritch., E.F.; Maniatis, T. Molecular Clinic. A Laboratory

Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Ny, 1989.

Scott-Burden, T.; Schini, V. B.; Elizondo, E.; Junquero, D. C.; Vanhoutte,

P.M. Platelet Derived Growth Factor Suppresses And Fibroblast Growth

Factor Enhances Cytokine-Induced Production Of Nitric Oxide By Cultred


17

Smooth Muscle Cells. Effects On Cell Proliferation. Circ. Res., 71: 1088-

1100, 1992.

Schaller, M. D.; Hildebrand, J. D.; Shannon, J. D.; Fox, J. W.; Vines, R. R.;

Parsons, J. T. Autophosphorylation Of The Focal Adhesion Kinase Pp125fak

Directs Sh2-Dependent Binding Of Pp60src. Mol. Cell. Biol., 14: 1680-1688,

1994.

Schilling, W.P.; Elliot, S.J. Calcium Signaling Mechanisms Of Vascular

Endothelial Cells And Their Role In Oxidant-Induced Endothelial Cell

Dysfunction. Am. J. Physiol., 262: Hl617-Hl630, 1992.

Schini-Kerth, V. B.; Vanhoutte, P.M. Nitric Oxide Synthases In Vascular

Cells. Exp. Physiol., 80: 885-905, 1995.

Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell, 103: 211-

225, 2000.

Schlessinger, J.; Ullrich, A. Signal Transduction By Receptors With Tyrosine

Kinase Activity. Cell, 61: 203-212, 1990.

Seger, R.; Krebs, E.G. The Mapk Signalling Cascade. Faseb J., 9: 726-735,

1995.


18

Serrano M, Lin Aw, Mccurrach Me, Beach D, Lowe Sw. Oncogenic Ras

Provokes Premature Cell Senescence Associated With Accumulation Of P53

And P16ink4a. Cell. 88: 593-602. 1997

Sherr Cj. G1 Phase Progression: Cycling On Cue. Cell. 18; 79(4): 551-555.

1994.

Sherr, C.J. Cancer cell cycles. Science, 274:1672-1677, 1996.

Sherr, C.J. Mammalian G1 Cyclins. Cell, 73:1059-1065, 1993.

Skolnik, E.Y.; Batzer, N.; Li, C.H. Lee; Lowenstein, E.; Mohammadi, M.;

Margolis, B.; Schlessinger, J. The Function Of Grb2 In Linking The Insulin

Receptor To Ras Signaling Pathways. Science, 260: 1953-1955, 1993.

Stamler, J.S. Redox Signaling: Nitrosylation And Related Target Interactions

Of Nitric Oxide. Cell, 78: 931-936, 1994.

Stamler, J.S.; Singel, D. J; Loscaizo, J. Biochemistry Of Nitric Oxide And Its

Redox-Activated Forms. Science, 258: 1898-1902, 1992.

Stern. A. Oxidative Stress And Growth Factor-Mediated Signal Transduction

Em:C. Pasquier. R.Y. Olivier. C. Auclair E L. Packer, Eds Oxidative Stress,

Cell Activation And Viral Infection. Basel: Birkhauser Verlag: 35-42, 1994.


19

Sun, H.; Tonks, N. K. The Coordinated Action Of Protein Tyrosine

Phosphatases And Kinases In Cell Signalling. Trends Biochem. Sci., 19:

480-485, 1994.

Swarup, G.; Cohen, S.; Garbers, D.L. Inhibition Of Menbrane

Phosphotyrosyl-Protein Phosphatase Activity By Vanadate. Biochem.

Biophys. Res. Commun., 107: 1104-1109, 1982.

Taniguchi. T. Cytokine Signalling Through Nonreceptor Tyrosine Kinases.

Science, 268: 251-255, 1995.

Tanner, F,C.; Meier, P.; Gruetert, H.; Champion, C.; Nabel, E.G.; Luscher,

T.F. Nitric Oxide Modulates Expression of Cell Cycle Regulatory Proteins.

Circulation, 101: 1982-1989, 2000.

Tonks, N.K.; Diltz, C.D.; Fischer, E.H. Purification Of The Major Protein-

Tyrosine Phosphatases Of Hman Placenta. J. Biol. Chem., 263: 67722-

6730, 1988.

Trowbridge, L.S. Cd45: A Prototype For Transmembrane Protein Tyrosine

Phosphatases. J. Biol. Chem., 266: 23517-23520, 1991.

Ullrich, A.; Schlessinger, J. Signal Transduction By Receptors With Tyrosine

Kinase Activity. Cell, 61: 203-212, 1990.

Vojtek, A.B.; Der, C.J. J. Biol. Chem., 273: 19925-19928, 1998.

Wang, J.Y.J. Retinoblastoma protein in growth suppression and death

protection. Current Opinion in Genetics & Development, 7:39-45, 1997.


20

Weinberg, R.A. The Retinoblastoma Protein And Cell Cycle Control.

[Review]. Cell. 81: 323-30; 1995.

Werner-Felmayer, G.; Werner, E. R.; Fuchs, E.; Hausen, A.; Reibnegger, G.;

Wachter, H. Tetrahydrobiopterin-Dependent Formation Of Nitrite And Nitrate

In Murine Fibroblasts. J. Exp. Med., 172: 1599-1607, 1990.

Wong, S.K.F.; Garbers, D.L. Receptor Guanylyl Ciclase. J. Clin. Invest., 90:

299-305, 1992.

Xie, Z.; Dickens, M.; Raingeaud, J.; Davis, R.J.; Greenberg, M.E. Opposing

effects of ERK and JNK-p38 MAP kinases on apoptosis. Science, 270:

1326-1331, 1995.

Yamada, K.M.; Miyamoto, S. Intergrin Transmembrane Signalling And

Cytoskeletal Control. Curr. Opin. Cell Biol., 7: 681-689, 1995.

Ziche, M.; Morbidelli, L.; Masini, E.; Amerine, S.; Granger, H.J.; Maggi, C.A.;

Geppetti, P.; Ledda, F. Nitric Oxide Mediates Angiogenesis En Vivo And

Endothelial Cell Growth And Migration In Vitro Promodet By Substance P. J.

Clin. Invest., 94: 2036-2044, 1994.

Ziche, M.; Parenti, A.; Ledda, F.; Dell’era, P.; Granger, H.J.; Maggi, C.A.;

Presta, M. Nitric oxide promotes proliferation and plasminogen activator

production by coronary venular endothelium through endogenous bFGF.

Circ. Res., 80: 845-852, 1997.

7 – APÊNDICE

Apêndice

121

1 - Barbosa De Oliveira, L.C.; Rocha Oliveira, C.J.; Stern A.; Monteiro, H.P.

Effects of lypopolysaccharide On low - and high-density cultured rabbit

vascular smooth muscle Cells: differential modulation of nitric oxid relaese,

ERK 1 / ERK 2 Map Kinases activity, protein tyrosine phosphatase activity,

And DNA synthesis. Brazillian J. Med. Biol. Res., 35:181-190, 2002.

2 - Rocha Oliveira, C.J.; Schindler, F.; Ventura, A, M.; Moraes, M.S.; Arai, R.

J.; Debbas, V.; Stern, A.; Monteiro, H. P. Nitric Oxide and cGMP Activate the

Ras-MAP Kinase Pathway-Stimulating Protein Tyrosine Phosphorylation in

Rabbit Aortic Endothelial Cells. Free Radic. Biol. Med. 35:381-396:2003.

3 – Hugo P. Monteiro; Marli F. Cursio; Carlos J. Rocha Oliveira. Vias de Transdução de Sinais em Células Endoteliais: Implicações na Angiogênese. Editor: Protásio Lemos da Luz - Co-Editores: Francisco

Rafael Martins Laurindo e Antonio Carlos Palandri - Editora Atheneu, São

Paulo, Brasil – Endotélio e Doenças Cardiovasculares (2003); 83-95.

carlos jorge rocha oliveira Óxido nítrico estimula a...

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