Di r ecci ó n:Di r ecci ó n: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Intendente Güiraldes 2160 - C1428EGA - Tel. (++54 +11) 4789-9293

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Tesis de Posgrado

Caracterización de antígenosCaracterización de antígenosrecombinantes de la glicoproteínarecombinantes de la glicoproteína

E2 del virus de la diarrea viralE2 del virus de la diarrea viralbovina y su utilización comobovina y su utilización como

vacunas y reactivos de diagnósticovacunas y reactivos de diagnóstico

Marzocca, Marina Patricia

2003

Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en CienciasBiológicas de la Universidad de Buenos Aires

Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.

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Cita tipo APA:Marzocca, Marina Patricia. (2003). Caracterización de antígenos recombinantes de laglicoproteína E2 del virus de la diarrea viral bovina y su utilización como vacunas y reactivos dediagnóstico. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_3615_Marzocca.pdf

Cita tipo Chicago:Marzocca, Marina Patricia. "Caracterización de antígenos recombinantes de la glicoproteína E2del virus de la diarrea viral bovina y su utilización como vacunas y reactivos de diagnóstico".Tesis de Doctor. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 2003.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_3615_Marzocca.pdf

UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRESFACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES

Tema de tesis

CARACTERIZACION DE ANTIGENOS RECOMBINANTES DE LAGLICOPROTEÍNA E2 DEL VIRUS DE LA DIARREA VIRAL BOVINA Y SU

UTILIZACIÓNCOMO VACUNAS Y REACTIVOS DE DIAGNÓSTICO

AutoraMarina Patricia Marzocca

Directorde TesisDr. José Leonardo La Torre

DirectorAsistenteDr. Pablo Rafael Grigera

Lugar de trabajoCentro de Wrologia Animal (CEVAN)

Tesis presentada para optar al titulo de Doctoren Ciencias BiológicasAño 2003

Dedicado a Andrés, a Sonia y a mis padres.

AGRADECIMIENTOS

Al Dr. José La Torre por haberme dado la posibilidad de desarrollar este trabajo enel Centro de Virología Animal alentando siempre la libertad creativa. y por su

excelente disposición para permitirme continuar con el mismo en las épocas decrisis económica.

Al Dr. Pablo Grigera por transmitirrne sus enseñanzas; y por su constancia einiciativapermanente, claves para el desarrollo de este trabajo.

AI Centro de Estudios para la Investigación Químico-farmacéutica (CEDIQUIFA),ala Universidad de Buenos Aires y al Consejo Regional para la Producción(COREPRO) por haberme otorgado las primeras becas de investigación. Enparticular a la Fundación del Estudios en Virología Animal (FEVAN) cuya becasostenida permitióque pueda desarrollar y terminar este proyecto.

A mis compañeros del CEVAN por su cordialidad y afecto, por el buen clima detrabajo compartido durante estos años.

A todos los que de alguna u otra manera colaboraron en el desarrollo de estatesis: Alejandra Capozzo. Romina Shawer, Verónica Poggio. Osvaldo Periolo yEduardo Scodeller. Y en particular por sus aportes a Susana Giambiagi y CristinaSeki.

A Verónica Morvillo. Blanca Robiolo y a Eduardo Scodeller por ayudarme con las

correcciones. A Vero también por alentarme con sus consejos.

A mi mamá, papá y hermanos por valorar mi esfuerzo y bn’ndarme ayuda en todomomento.

Finalmente a vos Andrés por tu amor, paciencia y ayuda, y a vos Sonia por tuchispa energizante, por cederme una buena parte de tu tiempo y por mucho más...

RESUMEN

El Virus de la Diarrea Viral Bovina (BVDV)pertenece al género Pestivirus de la

familia Flaviviridaey es causante de importantes pérdidas económicas en la industriaganadera regional y mundial. Las manifestaciones clinicas de la infección son variadasy las pérdidas en la producción ganadera se deben principalmente a la disminución enla producción de leche, retraso en el crecimiento, aumento de infecciones secundariasy aumento dela mortalidaden animales jóvenes.

El control epidemiológico de BVDV se realiza a través de programas devacunación masiva y eliminación de animales persistentemente infectados, principalesdiseminadores del virus en los rebaños.

Los bajos títulos virales obtenidos en cultivo de tejidos constituyen unadificultad importante en la elaboración industrial de vacunas inactivadas. La utilizaciónde cepas atenuadas como vacunas anti BVDVes, por otra parte, un riesgo mayor yaque la aparición de revertantes en un animal pre-infectado con BVDV podríadesencadenar la “enfermedad de las mucosas”, que es fatal y en vacas preñadaspodría dar origen a una camada de terneros persistentemente infectados. Eldiagnóstico de las infecciones con BVDV, realizada a través de la detección deanticuerpos en suero bovino por seroneutralización y/o inmunoensayo enzimática(ELISA)también presenta dificultades debidas, entre otras. a la necesidad de contarcon infraestructuras adecuadas para el cultivode células y a los desafios técnicos quepresenta la obtención de antígeno purificado.

En este trabajo se expresó en sistemas recombinantes y se caracterizóbioquímica e inmunológicamente al principal inmunógeno de BVDV, la glicoproteínaE2. La proteína fue expresada en células de mamífero y de insecto, en su formaentera (rE2) y delecionada en su extremo carboino terminal de anclaje a membrana(ArE2)y se ensayó su desempeño como vacuna y como antígeno para diagnóstico. Laproteína recombinante E2 (rE2) presento características electroforéticas einmunoquímicas idénticas a la E2 viral y resultó ser un potente inmunógeno enbovinos. La incorporación del gen de rE2 en el genoma de un Virus de la estomatitisvesicular (VSV) recombinante permitió. también , la creación de un virus atenuado deVSV (VSV-E2) capaz de inducir una excelente respuesta humoral anti BVDV enratones y óptima producción de E2 recombinante en células de BHKen cultivo.

En este trabajo también se demostró que la proteína ArE2 es expresada yliberada al sobrenadante del cultivo de células de Drosophila melanogaster lo quepermitió contar con una preparación rápida y relativamente pura de antígeno. Este fueutilizado en un test de ELISA de captura (a través de un anticuerpo monoclonal antirE2. también desarrollado en el curso de este trabajo de Tesis) que presenta altasensibilidad y especificidad para la detección de anticuerpos anti BVDVen suerosbovinos.

SUMMARY

The Bovine Viral Diarrhea Virus (BVDV)belongs to the genus Pestivirus of the

family Flaviviridae and is responsible for important economic Iosses in the cattleindustry throughout thre world. The clinical manifestations of the infection are variedand the looses in the cattle production are mainly due to the decreased production ofmilk, delay in the growth, increase of secondary infections and increase of the mortallyin young animals.

Control of BVDV is carried through programs of massive vaccination andelimination of persistently-infected animals that are the main source of contagiousvirus in the field.

Deficient virus production in cell culture constitutes an important difficulty in theindustrial elaboration of inactivated vaccines. The use of attenuated viruses as BVDV

immunogens on the other hand, is risky since revertants could produce mucosaldisease in preinfected animals . This is eventually fatal and , in the case of pregnantcows, could give origin to persistently infected calves.

The diagnosis of BVDV infections is accomplish by detection of specificantibodies in bovine serum in seroneutralization and/or enzyme linked immuno(ELISA) assays. These techniques also present difficultiesrelated, for instance, to thenecessity of having appropiate infrastructures for cell culture and obtaining purifiedantigen in workable amounts, as well.

ln this work the main immunogenic protein of BVDV,the giycoprotein E2, was

expressed in different recombinant systems and characterized,subsequently,biochemically and immunologically. The protein was expressed in mammalian and ininsect cells either as a whole protein (rE2) or as a deleted form Iacking its carboxiterminal membrane anchor (ArE2)and its potential as immunogen and as a diagnosticantigen was explored. The recombinant protein E2 (rE2) showed electrophoretic andimmunochemical characteristics identical to those of its viral counterpart and alsoinduced a potent anti BVDVserum response in bovines when administerd in an oilemulsion.

Incorporation of the rE2 gene in a recombinant Vesicular stomatitis virus (VSV)genome allowed us, in addition, to generate an attenuated virus of VSV (VSV-E2)able to induce an excellent humoral anti-BVDV response in mice and to producerecombinant E2 in infected BHKcell cultures.

The protein ArE2 is expressed and released to the extracellular medium oftransformed Drosophila melanogaster cells expressing the recombinant protein, inwhat turned to be a quick and simple way to get relativer pure and soluble antigen.This allowed the design of an ELISA test using soluble rE2 as antigen and a specificanti E2 capture MAb ( developed during this Thesis work using rE2 expressed bybaculovirus) that presents high sensibility and specificity for the detection of anti BVDVantibodies in bovine sera.

ABREVIATU RAS UTILIZADASa­aaAcMoAPIAspBac-E2BDVBMBSABVDVCCapcmCPCSFVC-terminalCVCysDITC5oDMSODNAdpvdrE2

drEZBac

DVBE282

EDTAELISAEM

Fig.9GliGluGuGrHepesIFAIPAIRES

IVKbkDI

LysM

M. y M.

antiAminoácidoAnticuerpo monoclonalAnimales persistentemente infectadosAspárticoBaculovirus recombinante que codifica para la E2 de BVDVVirus de Ia enfermedad de Border (Border disease virus)Buffer muestraSeroalbúmina bovina (Bovine seroalbumine)Virus de la diarrea viral bovina (Bovine virus diarrhea virus)Proteina de cápside7“‘Gppp: 7-metil Guanosina-S‘trifosfatoCentímetroCitopáticoVirus de la fiebre porcina clásica (Classical swine fever virus)Extremo carboino terminalCoeficiente de variaciónCisteínaDosis infectiva 50% en tejido celularDimetilsulfóxidoÁcido DesoxirribonucleicoDías post-vacunaciónDímero de la proteína E2 recombinante expresada en célulasCV1

Dímero de la proteina recombinante E2 expresada encélulas de Spodoptera frugiperdaDiarrea viral bovinaProteína E2 recombinante expresada en células de DrosophilamelanogasterEtilendiaminotetraacetato de sodioEnsayo inmunoenzimático (Enzyme linked immuno assay)Enfermedad de las mucosasFiguraGramoGlicinaGlutámicoProteína G de VSV no reducidaProteína G de VSV reducida(N-[2-hidroxietil]piperazin-N‘[2-ácido etanosulfónico])Ensayo de Inmunofluorescencia (Immunfluorescence assay)Ensayo de lnmunoperoxidasa (lmmunoperoxidase assay)Sitio interno de entrada de ribosomas (internal ribosome entrysite)Vacunas ¡nactivadas (inactivated vaccines)MilbasesMil DaltonsLitroLisinaMolarMateriales y métodos

MEMmin.MKmlMLVmMmoiNCPnmNP-40an2ntN-terminal3'NTR5'NTRORFPAGEpbPBSPCR

pf-E2

pss-AE2

RERdRprE2rEZBac

rE2VRFRIRIPA

RNARNAmRNAsasRnsrpmRSVRT

Medio esencial mínimoMinutoMarcador de Peso MolecularMililitro

Vacuna viva modificada (Modified live vaccine)MilimolarMultiplicidad de infección (multiplicity of infection)No citopáticoNanometroNonidet P40Proteína E2 recombinante no reducidaNucleótidoExtremo amino terminalExtremo genómico 3'no traducibleExtremo genómico 5'no traducibleMarco de lectura abierto (Open reading frame)Gel de poliacrilamida (Polyacrilamide gel electrophoresis)Pares de basesBuffersalino de fosfatosReacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chainreaction)Plásmido con la secuencia de la E2 de BVDVy sin secuenciaseñalFenilalaninaPost-infecciónPeso MolecularPoliadenosinaPorcentaje de positividadPlásmido con la secuencia señal de VSV-G seguida por lasecuencia de Ia E2 de BVDVPlásmido con la secuencia señal de VSV-G seguida por lasecuencia de la E2 de BVDV delecionada en el extremoCarboxilo terminalRetículo endoplasmáticoRNA polimerasa dependiente de RNAProteína E2 recombinante expresada en células CV1Proteina recombinante E2 expresada en células deSpodoptera frugiperdaProteína E2 expresada por el virus recombinante VSV-E2Forma replicativaIntermediarios replicativosEnsayo de inmunoprecipitaión (Radioimmunoprecipitationassay)Ácido ribonucleicoRNAmensajeroRibonucleasaRibonucleasaRevoluciones por minutoVirus respiratorio sincicialTranscripción reversa (Reverse transcriptase)

Transcripción reversa de Ia polimerasa seguida poramplificación mediante PCR.Proteína rE2 delecionada en el extremo Carboxilo terminalexpresada en células CV1Unidad Svedberg de sedimentaciónDodecil sulfato de sodioSuero equinoSennaSuero fetal bovinoSuero fetal bovino inactivadoCélulas de Spodoptera frugiperada linea Sf21Metionina marcada con 358Secuencia señalSecuencia señal de la proteína G de VSVCélulas de Drosophila melanogaster linea 82Temperatura ambienteTestículo fetal bovinoUnidadesUnidades formadoras de placaVoltiosValinaVacuna comercialVirus de la fiebre aftosaVirus de la estomatitis vesicularVirus recombinante de VSV que codifica para la E2 de BVDVMicro CurieMicrogramoMicrolitroGrados centígradosProteína AE2 recombinante expresada en células deDrosophila melanogaster rAE2

hhpbahh>pbé'AO

apaga

ÍNMCE

INTRODUCCIÓNVirus de la diarrea viral bovinaDescubrimientoClasificación del virus y caracteristicas taxonómicasImportancia epidemiológicaEstructura y propiedades fisicoqulmicas del viriónVariabilidad biotípicaGenoma de BVDVProteínas codificadas por BVDVProteínas viralesUnión del virus a membrana, replicación viral y maduraciónDiversidad genéticaReacciones antigénicas cruzadasEstructura antigénica de la glicoproteína E2Manifestaciones clínicas de BVDVInfección en bovinos inmunocompetentesEnfermedad subclínical Enfermedad clínica leve (DVB)

. Sindrome hemorrágicoDiarrea Viral Bovina Aguda Severa (DVBSA)

. Otras manifestaciones clínicasAd-l-lfld-l-l-l-l-¡J-I-¡AJJ-l-¡AJ bbbbbbbnhhhhhhh'flgaa.‘ “¿aaaa Infecciónen vacas preñadas inmunocompetentes (infecciones

fetales)Muerteembriónica, abortos y nacimientos prematuros

. Efectos congénitosTeneros sanos nacidos seropositivos a BVDV

. Inmunotolerancia a BVDVInfecciones de BVDVen bovinos inmunotolerantesInfección persistente

. Enfermedad de las mucosasVacunaciónVacunas a virus vivo modificadoVacunas inactivadasLa glicoproteína recombinante E2 de BVDVcomo inmunógenoVirus de la estomatitis vesicular recombinante como inmunógenoCaracteristicas del sistema VSVrecombinanteDiagnóstico de BVDVDetección de virus o de componentes virales

. Aislamiento de virus en células en cultivo

. Detección de antígenos viralesDetección de ácido nucleico viralSerología

comxlxlmul-‘d-á-n

ÍNDICE

1.5.2.a. Test de neutralización viral para detección de anticuerpos 421.5.2.b. Ensayos enzimáticos 421.5.3. Otros tests serológicos 441.6. Inmunología de BVDV 442. OBJETIVOS I 473. MATERIALES Y METODOS 483.1. Clonado del gen E2 483.2. Cultivos celulares 513.3. Infección de cultivos y preparación de stock viral 533.3.1. Cepas virales 533.3.2. Producción de Vaccinia vTF7 543.3.3. Producción de BVDV 543.3.4. Infecciones con VSV 543.4. Expresión transiente en células CV1,marcación metabólica 553.5. Detección con anticuerpos monoclonales 563.6 Inmunoprecipitación 563.7. Western blotting 573.8. Biotinilización 583.9. Inmunofluorescencia 593.10. Marcación metabólica de BVDV 603.11. Construcción del plásmido E2-VSVy recuperación del

recombinante VSV 603.12. Purificación del VSVrecombinante 613.13. Marcación metabólica, inmunoprecipitación e inmunoblotting de

VSV-E2 613.14. Inmunoprecipitación de viriones purificados 623.15. Titulación del antígeno viral 623.15.1. Titulación por dilución terminal 623.15.2. Titulación por plaqueo 633.16. Neutralización serológica de la infectividad viral 643.17. Test de inmunoperoxidasa 653.18. Extracción de RNAde BVDV 653.19. Transcripción reversa y reacción en cadena de la polirnerasa de

BVDV 663.20. Construcción de virus recombinante Bac-E2 663.20.1. Clonado en pVL1393 673.20.2. Cotransfección en células de insecto (Spodoptera frugiperda) 673.20.3. Clonado de Baculovirus recombinantes 683.20.4. Producción de E2 recombinante 693.21. Pruebas de inmunización 703.21.1 Inoculación de conejos con E2 recombinante 703.21.2. Inoculación de bovinos 703.21.3. Inoculación de ratones con VSVrecombinante 713.22. Producción de anticuerpos monoclonales anti-E2 713.22.1. Plan de inmunización 713.22.2. Fusión celular 713.22.3. Producción de líquido ascítico en ratón 723.23. Expresión de E2 truncada en el sistema Drosophila melanogaster 733.23.1. Construcción del plásmido pMTNS-HisAEz 73

ÍNDICE

3.23.2. Transfección de células 82 743.23.3. Marcación metabólica del células SZ-AEZ 753.24. Elisa para la detección de anticuerpos en bovinos 764. RESULTADOS 774.1. Clonado de un gen quimérico E2 que contiene la secuencia señal

de VSV-G 774 2 Expresión de la proteína E2 en células de mamífero 794.2.1. Análisis de reactividad especifica con anticuerpos monoclonales,

tamaño y glicosilación de la proteína recombinante expresada enCV1 79

4.2.2. Análisis de uniones del tipo puente disulfuro intra eintennoleculares en la E2 recombinante 81

4.2.3. Rol de la secuencia señal heteróloga en la conformación de E2 824.2.4. Distribución intracelular de E2 recombinante en las células

transfectadas con pss-E2 834.3. Expresión de la proteína E2 sin el dominio transmembrana en

células CV1 864.4. Expresión de E2 en células de insecto 874.4.1. Análisis del producto de expresión del gen ss-E2 en células de

Spodoptera frugiperda con suero anti BVDV 884.4.2. Análisis de uniones intra e intermoleculares de la proteína

recombinante 894.4.3. Distribución celular de E2 recombinante en células de Sf21 904.5. Propiedades inmunogénicas de la proteína recombinante 914.5.1. Pruebas de inmunogenicidad en ratones 954.5.2. Pruebas de inmunogenicidad de rEZBacen conejos 964.5.3. Pruebas de inmunogenicidad de rEZBacen bovinos 974.6. Expresión de E2 en un sistema VSVrecombinante 994.6.1. Características del sistema VSVrecombinante 994.6.2. Expresión de Ia rE2Ven Ia membrana celular y viral 1014.6.3. Pruebas de inmunogenicidad de VSV-E2en ratones 1034.7. Potencial de la proteínas E2 recombinantes como reactivos para 107

la detección de anticuerpos anti-BVDV4.7.1. Expresión de AE2en células de Drosophila melanogaster 1084.7.2. Análisis de la formación de dimeros de la AE2expresada en 110

Drosophilamelanogaster4.7.4. Obtención y caracterización del anticuerpo monoclonal anti-E2 1114.7.5. ELISApara la detección de anticuerpos anti-E2 de BVDV 1134.7.5.a. Optimización y standarización de reactivos y protocolo 1134.7.5.b. Expresión de los resultados 1144.7.5.c. Repetibilidad del método 1144.7.5.d. Punto de corte del ELISA 1164.7.6. Análisis de muestras incógnita con el ELISAanti-E2 1164.7.7. Determinación de la sensibilidad y especificidad diagnóstica 1194.7.8. Correlación con neutralización 1204.7.9 Detección de anticuerpos en animales vacunados 1215. DISCUSIÓN 1236. CONCLUSIONES 1337. BIBLIOGRAFÍA 135

1. INTRODUCCIÓN

1.1. Virus de la diarrea viral bovina

1.1.1. DescubrimientoLos primeros antecedentes descriptos de la enfermedad producida por el

Virus de la diarrea viral bovina (Bovine virus diarrea virus: BVDV)se remontan57 años atrás cuando Olafson y Childs (Childs, 1946; Olafson y ool.,1946)publicaron simultáneamente la descripción de una gastroenteritis agudacontagiosa, con alta morvilidad, baja mortalidad y caracterizada por brotes dediarrea con lesiones erosivas del tracto digestivo. Los animales desarrollabanademás temperatura elevada y tos. Dicha enfermedad se denominó “diarreaviral bovina" (DVB).

Siete años después, Ramsey y Chivers (Ramsey y col., 1953)describieron una enfermedad entérica altamente fatal, la “enfermedad de lasmucosas" (EM). Esta enfermedad estaba caracterizada por pirexia, anorexia,letargo, diarrea profusa sanguinolenta, descarga nasal muco purulenta ydeshidratación. La muerte se desencadenaba dentro de las dos semanasposteriores al comienzo de los signos clinicos, observándose en la necropsiauna ulceración extensiva en el tracto gastrointestinal.

Cuatro años después Underdahl (Underdahl y coI., 1957). aisló decélulas de riñón bovino un virus considerado el agente causal de estaenfermedad.

Análisis posteriores demostraron que la DVBy la EMestaban vinculadaspor este virus (Gillespie y col.. 1961) al que se denominó Virus de la diarreaviral bovina.

1.1.2. Clasificación del virus y características taxonómicasEl BVDVpertenece al género Pestivirus (del latín pestis que significa

peste) de la Familia Flavivin'dae (Tabla 1) la cual comprende además otrosdos géneros: Flavivirus (del latín flavus que significa amarillo) y Hepacivirus(del griego heparo hepatos que significa higado) (Pringle, 1999).

Los tres géneros tienen diferentes propiedades biológicas y nomuestran seroneutralización cruzada, pero su morfología viral, su estrategiade replicación y su organización genómica son similares (Lindenbach yRice, 2001).

INTRODUCCIÓN

TABLA 1. Miembros de la Familia Flavivin'dae (Lindenbach y Rice, 2001).

(BVDV-1 )

(BVDV-2)or

fever VÍI'US(CSFV)

¡OOOOOÓOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO...O...

INTRODUCCIÓN

La morfología de los viriones presenta una bicapa lipídica con 2 o másproteínas de envoltura alrededor de la cápside, ésta a su vez contiene elgenoma de RNA simple de cadena de polaridad positiva (+) asociado conmúltiples copias de la proteína de cápside (C).

El mecanismo de replicación de los miembros de esta familia no ha sidocompletamente dilucidado. Los miembros Flavivirus aportan la mayor cantidadde datos. A medida que se conozca más información de los otros géneros,Hepacivirus y Pestivirus, se podrá llegar a un conocimiento más profundo. Lospasos del ciclo de replicación asumidos como comunes a los 3 géneros seesquematizan en la Fig.1.

Fig.1: Ciclo de replicación de Flavivin'dae (adaptado de Lindebach y Rice, 2001)ESQUEMA GENERAL

F. Fusióna membranadependi e depH Q ADesnudamientoVx VN­

l.Adsorción k

Él EndocitosismediadaMspor receptor

// 6. Replicaciónde RNA"adaa membrana¿3”N% “¿-e?%

7. Morfogénesis de viriones z . ‘envesículas ‘Í 000intracelulares

‘ O

8. Transporte del viriones ymaduracióndelasglicoproteinas‘:

OOO

000 o0 0O

9.Fusión de vesículas en lamembrana plasmática:

K liberación de viriones

Se ha descripto que la unión del virión a la membrana celular y suposterior penetración involucra mecanismos de endocitosis mediada porreceptores celulares específicos para las proteínas de envoltura (1 y 2 enFig.1). La fusión de la envoltura de los viriones con la membrana celular liberala nucleocápside en el citoplasma, en donde tiene lugar la replicación ytranscripción del RNA (3 a 6 en Fig. 1).

INTR()D!/( ‘(‘lÓN

El RNAviral se replica mediante la síntesis de una cadena intermediaríade RNA de polaridad negativa (-) del tamaño del RNA genómico (6 en Fig. 1),en complejos que se asocian a membranas perinucleares,

Los viriones adquieren su envoltura por gemación a partir de membranasintracelulares hacia vesículas citoplasmáticas donde maduran (7 y 8 en Fig. 1).Estas vesículas siguen el camino secretorio de la célula hospedadora, sefusionan con la membrana plasmática, y se liberan como viriones maduros enel compartimiento extracelular (9 en Fig.1).

La organización genómica del RNA es similar para los tres géneros.Todas las proteínas virales se producen como parte de una única poliproteínade más de 3.000 aminoácidos (aa) que se cliva por acción de proteínas delhuésped y del virus. Las proteínas estructurales están codificadas en la regiónamino terminal (N-terminal) de la poliproteína y las proteinas no estructuralesen la región carboino terminal (C-terminal) (Fig. 2)

Fig. 2: Esquema de la organización genómica de Pestivirus

S'NTR MARCO DF.LECTURA ABIERTO 3'NTR

RNA 5, “lESTRUCTURAL N0 ESTRUCTURAL

5 'NTR: extremo genómico 5' no traducible;3' NTR: extremo genómico 3' no traducible.

Los tres géneros presentan secuencias en común ubicadas en regionessimilares de la poliproteína como por ejemplo motivos de serina-proteasa, RNAhelicasa y RNApolimerasa dependiente de RNA(RdRp).

El rango de huésped -in vivo- varía para los 3 géneros. Para losF/avivirus típicos incluye mamíferos e insectos, para los Pestivirus estárestringido a mamíferos del grupo Artiodactyla y para Hepacivirus (el virus de lahepatitis C) está restringido mamíferos del grupo Primates.

El género Pestivirus incluye cuatro especies: BVDV-1; BVDV-2; CSFV(Virus de Ia fiebre porcina clásica) y BDV (Virus de la enfermedad de Border).La nomenclatura de los distintos Pestivirus proviene en general de la especiedel animal huésped. Esto no significa que no puedan cruzar la barrera deespecie, de hecho ocurre y existe una extensiva reactividad cruzada entreellos, excepto para CSFV (Vilceky Belak, 1996).

INTRODUCCIÓN

El CSFV, en forma natural, únicamente infecta a cerdos. EI BVDV-1es elPestivirus que infecta predominantemente a los bovinos, aunque tambiéninfecta a ovejas y cerdos, BVDV-2 ha sido descripto mayoritariamente enbovinos pero también infecta a ovejas y cerdos. Por otra parte el BDV esprincipalmente un patógeno ovino que de modo ocasional infecta a cerdos(Sandvik y col., 1997).

1.1.3. Importancia epidemiológicaEl BVDV está ampliamente distribuido por todo el mundo y produce

importantes pérdidas económicas entre ellas la reducción en la producción deleche, disminución de la fertilidad, desórdenes respiratorios, abortos, defectoscongénitos, retardo en el crecimiento e inclusive Ia muerte en animales coninfecciones agudas como veremos más adelante.

Por otra parte, la infección fetal puede originar animalespersistentemente infectados (API)generalmente más pequeños y débiles, quedesarrollan una respuesta inmune deficiente a otras infecciones.Eventualmente los API pueden morir de una enfermedad denominadaenfermedad de las mucosas que se describirá más adelante.

Aunque la prevalencia de la infección varía entre los diferentesrelevamientos, la infección tiende a ser endémica en muchas poblaciones yalcanza un nivel de 1-2% de API y 60-85% de ganado con serología positiva(Houe, 1999). En la Argentina la prevalencia de API es de alrededor del 1% yde animales con serología positiva de 37-82% (Pacheco y Lager, 2000;Rweyemamu y col.,1990)

Los cálculos de las pérdidas económicas producidas como consecuenciade la infección con BVDVson complejos. En brotes de distintos rebaños varíande acuerdo al estado inicial de inmunidad, al estadío de la preñez en elmomento de la infección, y a la virulencia de la cepa infectante. Las pérdidasestimadas por rebaño varían desde unos pocos cientos hasta 100 mildólares.A nivel nacional Ia mayoría de las estimaciones de las pérdidas económicasoscilan entre 10 y 40 millones de dólares por millónde terneros recién nacidos(Houe, 2003).

Dada la presencia frecuente de BVDVen los sueros fetales bovinosutilizados como suplemento de medios de cultivo celular (Bolin y col., 1991;Zabal y col., 2000) este virus se comporta como un importante factor decontaminación de distintos productos biológicos como pueden ser vacunas deuso veterinario y/o humano (Falcone y Tollis, 2000; Giangaspero y col., 2001;Harasawa, 1995; Wensvoort y Terpstra, 1988). Así, por ej., en 13 de 41 líneascelulares de Ia American Type Culture Collection (ATCC) analizadasdirectamente de ampollas descongeladas sin pasajes intermedios, se hadetectado antígeno y/o RNAviral (Boliny col.,1994).

[NTRODI /( ‘('IÓN

1.1.4. Estructura y propiedades fisicoquímicas del viriónLa purificación y el estudio de los componentes estructurales del virión

de los Pestivirus. es dificultosa debido a que este virus tiene un bajo indice decrecimiento en cultivos celulares. Por otra parte no produce bloqueo de lasíntesis de proteínas en las células infectadas y además la densidad de lapartícula viral es similar a la de los constituyentes subcelulares de las célulashospedadoras. A todo lo anterior se suma la fragilidad de los viriones duranteprocedimientos de purificación, la Iabilidad de los sitios antigénicos y el tamañovariable de las partículas en preparaciones de virus purificado o parcialmentepurificado (Laude, 1987; Pritchard y col., 1955; Schipper y col.,1955; Thiel yco|.,1991).

Los viriones de BVDV tienen entre 40 y 60 nm de diámetro con uncoeficiente de sedimentación de 140 S y una densidad de flotación 1.12 a 1.13g/cm3en gradientes de sacarosa.

Aunque aún no se ha podido determinar la composición química depreparaciones de partículas purificadas, se ha demostrado que el virión deBVDVconsiste de un core central que contiene RNAcubierto por la proteína denucleocápside C, rodeada por una membrana lipidica con dos glicoproteínasancladas, E1 y E2. Una tercera glicoproteína (E0) está débilmente asociada ala envoltura y aún no fue determinado el mecanismo mediante el cual se une ala superficie del virión (Donis, 1995; Iqbal y co|., 2000).

La migración electroforética de las glicoproteínas en geles depoliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) es difusa debido a lacarga y a la heterogeneidad de la glicosilación. La estructura de las cadenas deoligosacáridos de unión N-glicosídica de las glicoproteínas no ha sidodeterminada y tampoco se conoce si hay azúcares adicionales de unión tipo O­glicosidica.

La naturaleza infecciosa del RNA desnudo indica que los viriones nonecesitan llevar una RNApolimerasa dependiente de RNA(Donis, 1995).

Mediante la observación por microscopía electrónica las particulasvirales han sido descriptas como pleomórficas, mayormente esféricas y adiferencia de lo descripto para CSFV, en BVDV no pueden distinguirseproyecciones en la membrana viral (Ohmann, 1990).

Los Pestivirus son inactivados por altas temperaturas, solventes de loslípidos y detergentes.

Resultan sensibles al éter etílico, al clorofonno y a la tripsina. Lasensibilidad al calor aumenta en presencia de 1M MgClz.

Los viriones resisten a un rango amplio de pH siendo más estables entreel pH 5,7 y 9,3 con una máxima estabilidad a pH 7,4 (Hafez y Liess, 1972;Rümenapf y col., 1991).

lNTR()¡)l/( v 'IÓN

1.1.5. Variabilidad biotipicaEl BVDV puede agruparse en biotipo citopático (cp) y en biotipo no

citopático (ncp) según el efecto del virus en un cultivo celular. Asi mientras queel BVDV ncp no causa daño celular aparente en un cultivo celular(vacuolización), el biotipo cp causa daños celulares característicos visibles ymuerte celular (Moennig y Plagemann, 1992).

Aunque ambos biotipos se encuentran en los bovinos, el ncp es elbiotipo más comúnmente aislado (Pellerin y col., 1994).

Las cepas cp expresan invariablemente una proteína denominada N83considerada un marcador molecular de este biotipo, no así las cepas ncp.

Ambos biotipos expresan el polipéptido precursor de NS3 denominadoN82-3 (Collett, 1988”, Donis y Dubovi, 1987“, 1987”). El biotipo citopático surgede cambios genéticos de su par homólogo no citopático tales como deleciones,duplicaciones genómicas y rearreglos, inserciones de secuencias celulares eincluso mutaciones puntuales que inducen al clivaje de la proteína N82-3 paradar origen a las proteínas NS2 y NS3 (Meyers y col., 19913. 1991”, 1992. 1998,Tautz y col., 1994, 1996).

En general, a pesar de las diferencias biotipicas entre las cepashomólogas de biotipo cp y ncp éstas son indistinguibles antigénicamente, yasea por neutralización o por reactividad de los viriones con anticuerposmonoclonales (AcMo).

1.1.6. Genoma de BVDV

La información genética del BVDVestándar se encuentra almacenadaen una única molécula de RNA de un tamaño de 12,3-12,5 Kb (Brock y col.,1992, Collett y col._ 19883; De Moerlooze y col., 1993; Deng y Brock, 1992).

Las distintas cepas citopáticas de BVDV contienen inserciones odeleciones en su genoma que modifican el tamaño del mismo. Por ejemplo lasecuencia de ubiquitinade 228 bases en la cepa Osloss -entre los nucleótidos(nt) 5152 y 5153 (Meyers y col.,1989, 19913), la secuencia de RNA celular de270 bases en el caso de la cepa NADLentre los nucleótidos 4992 y 4993(Collett y col.,19883) y la deleción de 41 nucleótidos en Ia 3' NTR de Osloss(Deng y Brock, 1993) son responsables de la variación en el tamaño delgenoma.

El genoma de BVDVtiene un único marco de lectura abierto (openreading frame: ORF) que comienza en el nucleótido 386 de la cadenapositiva (+) del RNA y tiene 3898 codones de largo. En diferentes sitios delRNA (+) o del RNA (-) se encuentran muchos ORFs cortos (menos de 30codones) que aparentemente no se traducen (Collett y col.,1988a; Deng yBrock, 1992; Deng y Brock,1993).

lNTR()Dl/( ‘(‘IÓN

El RNA genómico no posee una estructura tipo guanosina metiladainvertida en el extremo 5’ (Cap) ni tampoco una secuencia de poliadenosina(PoliA)en el extremo 3’. Los extremos no traducibles en 5’ y 3' de 383-385 nt y188-228 nt de largo respectivamente (Brock y co|., 1992; Deng y Brock, 1992;Renard y col., 1987; Collett y col.,19883) presentan roles funcionales tanto en latraducción como en la replicación viral (Deng y Brock, 1993; Yu y col, 1999;2000)

La iniciación de la traducción está mediada por un sitio interno deentrada de n'bosomas (IRES) del tipo lll (Poole y co|., 1995).

1.1.7. Proteinas codificadas por BVDVEl genoma estándar de BVDVncp tiene un ORF con capacidad para

codificar una poliproteína de 3898 aminoácidos (aa), teóricamente una proteínade 438 kD (Deng y col., 1992).

La poliproteína de BVDVtiene 14 sitios potenciales de glicosilación en laregión que codifica para los polipéptidos estructurales, 8 de los cuales estánpresentes tanto en los Pestivirus bovinos como en los porcinos.

La poliproteína resultante es procesada co- y post-traduccionalmente porproteasas codificadas por el virus y por la célula hospedadora (Rümenapf ycol., 1993; Wiskerchen y Collett, 1991‘; Wiskerchen y col., 1991") para originarpor lo menos 12 proteinas individuales. Estas proteínas están ubicadas en elsiguiente orden, desde el extremo NH2 (N-terminal) hacia el extremo COOH(C-terminal) de Ia poliproteína (Fig. 3):NH2Npro(pro=proteasa)- C(C=nucleocápside) - Em5("‘s=Rnasa) - E1 - E2 - p7 ­N82 - N83 - NS4A - NS4B - N85A - NSSB COOHdonde E hace referencia a

proteína de envoltura y NS a proteína no estructural (Collett y col, 1988”; 1991;Elbers y col.,1996).

Fig. 3: Organización genómica de BVDV(adaptado de Qu y col., 2001)

N°'° Erns p7 4A

5' ÉC @E1}E2' 2 3 É4B 5A‘ 53 3.‘=<">--? ? ll l r

El esquema muestra los productos maduros del clivaje de la poliproteína y laslocalizaciones de los sitios de clivaje. Las proteínas no estructurales N82, N83,NS4A. N848, N85A y N85B se designan como 2. 3, 4A, 4B. 5A y 5Brespectivamente. Las enzimas responsables del procesamiento de la poliproteínase indican de Ia siguiente manera: N"’°autoproteasa (rombo). peptidasa señal dellúmen del Reticulo endoplasmático (RE) (flecha blanca), serin-proteasa (flechanegra), actividad no identificada (?).

INTRODUCCIÓN

Antes de producirse los polipéptidos virales maduros se generanintermediarios procesables (Rümennapf y col, 1993). En el caso de lasproteínas estructurales existe un precursor denominado E012 que esprocesado luego en E0 (antigua denominación de Em), E1 y E2. Elprocesamiento se inicia por un corte entre la cápside (C) y el E012 translocadoseguido por un corte en el C terminal de E2. E012 luego es clivado para formarE01 y E2 (Fig. 4). Luego que E2 se libera del precursor, E01 se procesa en E0y E1 (Rümenapf y col, 1993). Dado que nunca se identificó una proteina de438 kD en células infectadas se propone que los eventos de procesamientoproteoliticodeben ser cotranslacionales.

Fig. 4: Esquema propuesto para el procesamiento de las proteínas E de Pestivirus(adaptado de Rümenapf y col., 1993)

RElúmen

El E2 l "m"" Kill,llllll‘l\lllllllllllllllllllIlIllIIlIllllIIlllllIllllll l\/ \,’

NH, (Npro: c i yY NS2-3

El procesamiento es iniciado por la translocación del péptido señal ubicado en elextremo 5’ de Ems(o E0). Las tijeras indican corte por señalasa; la flecha sólidaindica el corte por una proteasa desconocida que cliva el sitio E0/E1. E1 tienedos regiones de probable unión a membrana. la primera de las cuales actúacomo señal de fin de transferencia para E1 y la segunda que funcionaría comouna señal de translocación para E2. Estudios preliminares ¡ndimn que la regiónC terminal de Ia E2 incluye 30 aa hidrofóbicos que funcionan como una señal defin de transferencia para E2 y una señal de translocación para la proteínaubicada hacia 3'.

1.1.8. Proteinas virales

NproEs el primer producto de traducción del marco de lectura. Consiste

de 168 aa, y en SDS-PAGE migra como un polipéptido de 20 kD de PM.Npro es una autoproteasa que se cliva intramolecularrnente en suextremo C-terminal en la secuencia Cys-Ser luego de la cisteína y selibera de la poliproteína naciente.

[NTRODIK ‘(‘l(')N

No se le conoce otra función además de la generación del extremoN-terminal de la proteína C (Wiskerchen y col., 19913).C

Esta proteina tiene 102 aa y en SDS-PAGE migra como unpolipéptido de 14 kD.

Es la proteína de la cápside y está altamente conservada en losdiferentes Pestivirus. Su zona N-terminal está generada por la acciónautocatalítica de Npro como se describió anteriormente.

La proteína C está localizada presumiblemente en el citoplasma de lascélulas infectadas y no se sabe aún si migra a otros compartimentos. Sufunción es empaquetar el RNA genómico y proveer interacciones necesariaspara la formación del virión envuelto pero aún no se identificaron los dominiosinvolucrados en este proceso.

Con respecto a su inmunogenicidad se ha descripto que los sueros deanimales convalecientes que han sufrido una infección con BVDVno contienenanticuerpos contra esta proteína (Donis y Dubovi, 1987), sin embargo, laproteína expresada en un sistema viral recombinante produce respuesta tantohumoral como celular en un modelo murino (Elahi y col., 1999).Ems

Esta proteína de envoltura muy conservada tiene 227 aa en su formamadura con una masa predecible de 26 kD y una migración en SDS-PAGE de48 kD debido a la incorporación de azúcares. El análisis de los aa revela lapresencia de 7 a 9 sitios potenciales de N-glicosilación.

Presenta un polipéptidoseñal que seria el responsable del pasaje al RE y laacción de una señalasa en el lumen del RE da origen a una forma madura muyhidrofílicade Ems.La ausencia de regiones hidrofóbicas hace que sea secretadade las células infectadas (Rümenapf y col.,1993; Silva-Krotty col., 1994).

Esta glicoproteina en el caso de CSFV se encuentra en los vin'onescomo homodímeros que se unen por enlaces covalentes del tipo disulfuro luegode su traslocación al RE (Thiel y coI., 1991) pero aún no se conoce elmecanismo mediante el cual Emsse une a los viriones.

Se propone que esta glicoproteina participa en Ia interacción inicial delvirus a las células a través de su unión con glicosaminoglicanos de la superficiecelular (Iqbal M y col., 2000; 2002).

La secuencia proteica de Ernsde BVDVpresenta motivos conservadosde dominios ribonucleasas (RNAsas) de hongos y plantas y la proteinahomóloga de CSFV (gp 46/E0) purificada o expresada en células de insecto hamostrado tener actividad RNAsa (Hulst y col.,1994; Schneider y col., 1993).esta actividad tendría que ver en la replicación.

Se ha descripto también que la Ernsrecombinante de CSFV es capaz deinducir apoptosis en linfocitosde muchas especies (Bruschke y col., 1997).

lO

INTRODIK ‘(‘IÓN

Con relación a la inmunogenicidad, si bien induce niveles considerablesde anticuerpos en bovinos, estos anticuerpos tienen una actividad neutralizanteviral moderada (Boulanger y col._1991; Xue y col.,1990).

Se describió que la proteína recombinante Erns de CSFV produceinmunidad protectiva en cerdos (Kónig y col.. 1995; van Zijly col., 1991).

E1

Con 195 aa y dos sitios para la glicosilación se le calcula un PM de 21.6kD menor que el observado experimentalmente de 25 kD en SDS-PAGE.

Esta glicoproteina presenta dos dominios hidrofóbicos que le sirven deanclaje a la membrana y de inicio de translocación del polipéptido adyacenteE2 (Rümenapf y col., 1993).

Se ha encontrado en viriones covalentemente unida a E2 por unionesdisulfuro (Thiel y col., 1991, Weiland y co|., 1990).

No se detectan niveles significativos de anticuerpos contra E1 enanimales convalecientes (Donis y Dubovi, 1987).

E2

La proteína E2 es la más grande de las proteinas de envoltura con unamasa predecible de 41 a 45 kD pero la modificación postraduccional da comoresultado una migración molecular aparente que varía entre 51 y 58 kDdependiendo en parte de las diferencias de glicosilación (Donis y Dubovi,1987“).

Esta proteína posee 17 cisteínas (Cys) y 4 sitios potenciales deglicosilación (Weiland y col., 1990).

Los requerimientos básicos para el corte por señalasa se dan en elextremo N-terminal de Ia secuencia entre los nucleótidos 2461 y 2462 (aa 692­693) (Paton y col.,1992; Rümenapf y col., 1993) y en el extremo C-terminalentre los nucleótidos 3583-3584 (aa 1066) (Elbers y col.,1996). A partir deestos datos se deduce un esqueleto polipeptídicode 374 aa.

El extremo C-terminal de E2 es una región que contiene por Io menos 30aminoácidos hidrofóbicos pudiendo funcionar como una señal de fin detransferencia de E2 y de inicio de translocación de la proteína NSZ-3constituyendo probablemente uno o más sitios de anclaje a la membrana(Rümenapf y col., 1993; Yu y co|., 1996).

EI clivaje en el extremo C-terminal de E2 es posiblemente mediado poruna proteasa de la célula hospedadora pero ocurre ineficientemente y comoresultado se obtienen dos especies. E2 y E2-p7 en células infectadas porPestivirus (Elbers y col., 1996; Harada y col., 2000).

La E2-p7 no está presente en viriones de CSFV pero esto aún no hasido demostrado para BVDV(Elbers y col._1996).

lNTR()DU( ‘(‘IÓN

La E2 forma homodímeros y heterodimeros con E1 mediante puentesdisulfuro, y estos complejos están presentes en la superficie de los vin'onesmaduros (Thiel y coI., 1991; Weiland y col., 1990).

Las características más relevantes de la E2 son su variabilidad y suinmunodominancia, siendo la principal inductora de anticuerpos neutralizantesen el huésped luego de la infección o de la vacunación con vacunas vivas oinactivadas (Bolin, 1993; Paton y co|.,1992; Xue y col., 1990).p7

Tiene una masa molecular aparente de 6 a 7 kD y consisteprincipalmente de aa hidrofóbicos. Su perfil de hidrofobicidad y las estructurasdeducidas son bastante conservadas.

Se identificó al aa Val ubicado en la posición 1067 desde el ORF comoel N-terminal de p7 y al aa Glu ubicado en la posición 1137 (muy conservadoen los Pestivirus) como el N-terminal de N82-3 (la proteína codificada acontinuación de su extremo 3'). De acuerdo a esto p7 tiene 70 aa (Harada ycol., 2000).

Está descripto que para la replicación de RNA se necesita el clivajeentre p7 y NS2-3 y la generación de la proteína N82-3, y que además tantoE2 como p7 son esenciales para la generación de viriones infecciosos, sinembargo no se conoce la función exacta de p7. Seguramente p7 no es uncomponente estructural principal del virión (no fue detectado en viriones deCSFV) y se especula que representa un miembro de las viroporinas (Elbersy col.,1996; Harada y col., 2000). Las viroporinas constituyen un grupo depequeños polipéptidos que forman un poro hidrofílicoen la membrana poroligomerizacióny desestabilización subsecuente.N82-3

Esta proteina no estructural tiene aproximadamente 1300 aa y eslevemente básica. Migra en SDS-PAGE como un polipéptido de 1300 aa. Laproteína N82-3 es muy conservada en Flavivin'dae y en BVDVcp se expresaademás como dos polipéptidos separados: N82 y N83. La región N-tenninal(homóloga a N82), es muy hidrofóbica y el dominio C-tenninal (homólogo aN83) es hidrofílico.

En la proteína N82-3 se han descripto claramente 5 zonas consenso: 1)una zona altamente hidrofóbica, 2) un Zinc finger (dedos de Zinc), 3) una sen'n­proteasa tipo tripsina, 4) una helicasa y 5) una nucleótido trifosfatasa (NTPasa)(De Moerlooze y col., 1990; Deng y Brock, 1992; Gu y col., 2000).

El Zinc finger serviría para unir RNA y mantener el complejo replicativocercano a la membrana a través de su extremo amino hidrofóbico.

La región con actividad de proteasa es esencial para la generación delpropio extremo C-terminal de N83 y para el procesamiento, conjuntamente conel cofactor N84A, de sitios de clivaje de la poliproteina ubicados luego del

12

INTRODl/(Y‘IÓN

extremo C-terminal de N83 permitiendo la liberación de N84A, N848, N85A, yN85B (Tautz y col. ,1997; Wiskerchen y Collett, 1991”, Xu y col., 1997).

Ambas actividades, RNA helicasa y NTPasa son requeridas para lasíntesis de la cadena de RNA de polaridad negativa (-) durante la replicaciónviral (Gu y col.. 2000).N82

Es una proteína hidrofóbica y de tamaño variable debido a la existenciade elementos genéticos adicionales generados por rearreglos de la secuencia opor inserciones en el genoma de secuencias extrañas al mismo. Resulta delclivaje de N82-3 y es colinear con su extremo N-terminal conteniendo al motivoZinc finger (De Moerlooze y co|., 1990).

Es poco inmunogénica y no induce anticuerpos humorales en el ganadoinfectado (Donis, 1995). Hasta el momento se desconoce su función precisa.N83

Este polipéptido no estructural hidrofílicoes el marcador de BVDVcp.Su secuencia es colinear con el extremo C-terminal de N82-3 y su

extremo N-terminal es el aa Gli ubicado en la posición 1680 (Xu y col., 1997;Tautz y col., 1997). Ambos extremos de N83 se originan por un clivajeautoproteolitico en Cys aunque en algunas cepas el corte entre N82 y N83 esmediado por otra actividad proteolítica diferente a la serin-proteasa (Xu y col.,1997)

Contiene las zonas consenso proteasa, helicasa y NTPasa.Se especula que su actividad de proteasa podría estar relacionada con

la inducción apoptótica responsable de la citopatogenicidad.Por otra parte se plantea que en las cepas ncp la inhibiciónapoptótica

estaría vinculada a la interacción de N82-3 con factores celulares mientras queen las cepas cp la presencia de N83 anularía dicha interacción (Zhang y col.,1996)

Se supone que los requerimientos funcionales de este polipéptidodebenhaber limitadosu evolución ya que la N83 es la proteína más conservada en elgénero Pestivims.

La proteína N83 es muy estable en células infectadas y altamenteinmunogénica (Donis, 1995).NS4A

La proteina N84A también muy conservada entre los Pestivirus esacídica y posee 64 residuos de longitud.

Es un cofactor necesario para la acción serin-proteasa de N83 (Tautz ycoI., 2000, Xu y col.,1997).NS4B

La masa predecible de esta proteína sería de 38 a 39 kD, sin embargomigra como un polipéptido de 30 kD en SDS-PAGE. Se desconoce si esto es

13

¡NTRnnI /( ‘r'IÓN

debido a un procesamiento en el extremo C-terminal, a modificacionespostraduccionales, o simplemente a una migración aberrante.

Está descripta como una proteína muy conservada, básica y con un altoporcentaje de aa hidrofóbicos que indican su posible asociación a la membranacelular.

N848 es necesaria para la replicación de BVDV (Li y coI., 2001) yexisten datos preliminares que sugieren que la acumulación de dicha proteínaen células infectadas en estadios tardíos de la infección con BVDVcp estaríarelacionada con la citopatogenicidad (Qu y col.,2001).

En relación a Ia inmunogencidad está descripto que los bovinosinfectados con BVDVno desarrollan anticuerpos contra esta proteína (Donis,1995)NSSA

NSSA es una proteina hidrofilica cuya secuencia presenta unavariabilidad considerable en los Pestivirus.

Es una serin-fosfoproteina fuertemente asociada con una o más kinasascelulares (Reed y col., 1998) y se postula que tiene un rol en la replicación virala través de la unión de la proteina con el factor 1A de elongación de Iatraducción bovino (eEF1A) (Johnson y col., 2001).

Este polipéptidoes relativamente estable en células infectadas.No se detecta respuesta inmune humoral en animales convalecientes

(Bolin y Ridpath, 1989; Donis y Dubovi, 1987).N858

Esta proteina cuya vida media es la más corta de todos los polipéptidos.corresponde a la RNA-polimerasa RNA dependiente (Lai y col. 1999; Zhong yco|., 1998).

Los animales que se han recuperado de una infección con BVDVnopresentan anticuerpos contra esta proteina (Bolin y Ridpath, 1989; Donis yDubovi, 1987).

1.1.9. Unión del virus a membrana, replicación viral y maduraciónSe ha descripto una proteína de 50 kD como un receptor específico de

BVDV sin embargo es probable que la unión y penetración de BVDV estémediada por varios receptores característicos de cada cepa. La unión alreceptor celular no es el único paso esencial para que el virus infecte la célulablanco (Xue y Minocha, 1993; 1996).

Se postula que p56 (una glicoproteína que se une a actina) juega unpapel importante en la entrada viral en las células de origen bovino debido aque un anticuerpo monoclonal especifico bloquea completamente lainfectividad de BVDV. Hasta el momento no está claro si p56 interaccionadirectamente con las proteinas de envoltura del virus (Schelp y col, 2000).

INTRODUCCIÓN

Existen estudios que indican que E2 está involucrada en la unión y/openetración del virus a las células huésped (Xue y Minocha, 1993).

También se propone que la glicoproteína Ernsparticipa en la interaccióndel virus con las células a través de la unión con glicosaminoglicanos de lamembrana celular. El virus se uniría inicialmente a través de esta interacción

(Iqbal M y col., 2000) por medio de un cluster de residuos básicos localizadosen el extremo C-terminal de la Erns(Iqbal y co|., 2002) .

Luego de la entrada del virus a Ia célula y de la liberación del RNAgenómico al citoplasma (desnudamiento) comienza la traducción del genomaviral. Concomitantemente las proteínas virales nacientes se asocian con elRNAgenómico y con factores de la célula hospedadora para formar complejosde replicación. Estos complejos catalizan la transcripción de moléculas de RNAde polaridad negativa.

Se considera que la replicación de BVDVocurre vía Ia síntesis de unamolécula complementaria de RNA de polaridad negativa formando así unamolécula de RNA doble cadena con la cadena entrante de polaridad positiva.Este complejo de doble cadena se conoce como la forma replicativa (RF) queluego actuaría como un templado para la síntesis de la cadena positiva de RNAformando en conjunto los intermediarios replicativos (RI) (Gong y col., 1998,Warrilow y col., 2000) (Fig. 5).

Fig. 5: Modelo de la sintesis de RNA viral in vivo (extraído de Warrilow y col.2000)

4_\\ T‘ vRNAsf (+lik m,\\ _._ 63‘/ K 1/

Iniciación del complejo de replicación de cadena positiva (círculo negro) (1). La elongación por lareplicasa desplaza la cadena positiva del templado RI (2). Continuación de la elongación de lacadena naciente y reiniciación del complejo de replicación de cadena positiva (3). La elongación secompleta (4) y resulta en la disociación del vRNA (5) a partir del templado. y el RI es reciclado. RF(6) es el producto de la reacción ya sea cuando el vRNAse utilizacomo templado para la sintesis dela cadena negativa o cuando no hay nuevos complejos de replicación en el Rl durante la sintesis dela última cadena naciente (flecha punteada).

Se asume que el proceso de replicación intracelular viral ocurre en unbreve período de tiempo (Weiland y col., 1999).

lNTRODI/(Y‘IÓN

Como está descripto para el género Flavivirus, la liberación de losPestivirus es probable que ocurra por gemación de viriones nacientes desdelas membranas intracelulares en vesículas citoplasmáticas y por fusiónexocitocítica de las vesículas que contienen al virus con la membranaplasmática (Grummer y col., 2001). Trabajos recientes realizados por Jordan ycol. sugieren que BVDVse secreta a través de un camino dependiente delGolgi (Jordan y col., 2002).

El ensamblado de los virus envueltos generalmente, requiereinteracciones entre las glicoproteínas asociadas a la membrana y las proteínasde la cápside en el citosol. En general esta interacción está facilitada por eldominio citoplasmático de la glicoproteína anclada a la membrana por unasecuencia transmembrana. No se ha identificado aún el dominio citoplasmáticoen las proteínas de envoltura de los Pestivirus. La proteina p7, con unasecuencia cargada y orientada hacia al citosol, podria interaccionar con laproteína de cápside e iniciarel proceso de gemación sin que necesariamente elvirión se enriquezca en ella (Elbers y col.,1996).

No se detectan proteínas virales presentes en forma individual en lamembrana plasmática de las células infectadas. tanto las proteínas noestructurales N82-3, NS-3, y las estructurales como Ems, E1 y E2 estánúnicamente asociadas a las membranas intracelulares (Grummer y col., 2001).

1.1.10. Diversidad genéticaLa relación entre las secuencias nucleotídicas de los Pestivirus es un

criterio importante para su clasificación (Avalos-Ramirez, 2001). Así las cuatroespecies de Pestivirus pueden diferenciarse por comparación de lassecuencias genómicas completas o de secuencias parciales (Avalos-Ramirez,2001; Becher y col., 1999).

Además, las especies de Pestivirus pueden distinguirse entre si por sureactividad frente a reactivos de serologia específicos tal como la unióndiferencial a AcMos y/o la neutralización cruzada con antisueros policlonales(Becher y co|., 1995; Dekker y col., 1995; Paton y col., 1995). En los ensayosde neutralización, los antisueros generados contra una determinada cepa dePestivirus generalmente exhiben un títqu neutralizante mucho más alto contravirus de la misma especie que contra virus de una especie heteróloga.

Todas estas vías en conjunto permiten la diferenciación de las 4especies de Pestivirus: BVDV-1,BVDV-2,BDVy CSFV. Recientemente se hanincluídodos especies más dentro del género Pestivirus, una que corresponde aun aislamiento de jirafa y la otra a un aislamiento de reno (Avalos-Ramirez ycol. , 2001).

En el caso de BVDVdada su característica de gran diversidad de cepas(Paton y col._ 1995) para segregar a los aislamientos en el genotipo I (BVDV-1)

16

INTR()D!/("( ‘IÓN

y en el genotipo Il (BVDV-2)se utiliza la comparación de secuencias cortasderivadas de las zonas altamente conservadas 5' NTR. La homología desecuencias dentro de cada genotipo es mayor al 93%, mientras que lahomología entre el grupo l y ll está cerca de 74% (Pellerin y col., 1994; Ridpathy col., 1994). Altemativamente tanto Npro como E2 permiten además lasegregación de los genotipos en subgrupos (Becher y co|., 1999; Week y col.,2001)

Según Becher, por medio de estudios filogenéticos con base en la regiónNpro, pueden distinguirse 5 subgrupos para BVDV-1 (a, b, c, d y e) y dossubgrupos para cada uno de los Pestivirus restantes. Los mismos resultadospueden obtenerse al analizar Ia región E2. En la Fig. 6 se muestra la relacióngenética de 23 cepas de Pestivirus por comparación de las secuencia de laglicoproteina E2.

Fig. 6. Análisis filogenético de las secuencias de nucleótidos que oodifican para laproteína E2 de 23 cepas de Pestivirus (extraido de Becher y col.. 1999).

Dendograma que muestra la relación genética de las cepas de Pestivirus. Lasdistancias se calcularon por el método de dos parámetros de Kimura y se usaronpara construir el árbol de acuerdo al método de Felsenstein. Los largos de lasramas son proporcionales a las distancias genéticas. Se indican los aislamientos,subgrupos y especies.

INTR()D!/( ‘(‘IÓN

La mayoría de los Pestivirus bovinos aislados corresponden al tipo l(Edwards, 1997). Estos son utilizados en la producción de vacunas, estudios deinvestigación y tests de diagnóstico (por ej. Singer, Oregon, C24V, Osloss)aunque poseen una virulenciamoderada.

Las cepas de BVDV-2se han aislado de ganado mon'bundo con unaforma aguda de la enfermedad denominada síndrome hemorrágico, que semanifiesta con alta virulencia (Pellerin y col., 1994). También se han aislado deanimales persistentemente infectados nacidos de vacas vacunadas con BVDVy de suero fetal aunque en estos casos se describió menor virulencia(Wolfmeyer y co|., 1997).

En La Argentina se han aislado cepas de los dos genotipos (Jones ycol.,2001).

1.1.11. Reacciones antigénicas cruzadasLa neutralización cruzada entre BVDV, BDV y CSFV se vincula a la

existencia de dominios antigénicos compartidos entre los Pestivirus en lasglicoproteinas de envoltura particularmente la E2 que es el principal blanco deanticuerpos neutralizantes.

La neutralización cruzada con sueros policlonales contra un determinadovirus es generalmente de menor título contra un virus heterólogo respecto deuna neutralización homóloga. Si bien se ha descripto la unión heteróloga deAcMosentre diferentes especies de Pestivirus no se ha descripto neutralizaciónheteróloga con AcMos (Edwards y Paton, 1995); esto implica que las relacionesantigénicas a nivelde la glicoproteína E2 son moderadas.

Las diferencias cuantitativas en cuanto a Ia neutralización intra e inter

especies de Pestivirus resulta de utilidad para la evaluación de nuevos virus. Lavariación antigénica entre los aislamientos de BVDVha sido detectada usandoanticuerpos policlonales y monoclonales (Bolin y col., 1988; Corapi y col., 1990,Ridpath y col., 1994; Xue y col., 1990).

Los patrones de reactividad de neutralización de un suero policlonalespecifico contra una cepa de BVDVtambién permite su clasificación en losgenotipos l y IIal igual que el estudio de la secuencia genómica de 5’ NTR. Sinembargo a diferencia del secuenciamiento, el análisis por neutralización nopermite la clasificación de los genotipos en subgrupos (Pellerin y col., 1994).

1.2. Estructura antigénica de la glicoproteína E2

La proteína E2, Ia más variable de todas las proteínas de BVDV,es unaglicoproteína de membrana de clase I altamente inmunogénica y Ia principalinductora de la producción de anticuerpos neutralizantes (Donis y col., 1988,Magar y col., 1988; Weiland y col., 1990; Wensvoort y Terpstra, 1989) .

lNTR()l)l/( ‘(‘IÓN

A pesar de la importancia de la E2 no se conoce aún la localizaciónexacta de sus epitopes ni las relaciones entre los mismos.

Corapi y col. en 1988 han descripto, basándose en los patrones dereactividad con AcMos, la presencia de 10 sitios antigénicos en la proteína. Porotra parte, Bolin y col. en 1988 informaron la existencia de por Io menos tresdominios antigénicos detectables con AcMos mediante ensayos deneutralización. Mientras que otros autores (Moennig y col. 1989, Xue y col.,1990; Paton y col., 1992) han informado sobre la presencia de 3 a 4 dominiosantigénicos. Por último Toth y col. (1999) describieron la presencia de tresepitopes para la E2 de BVDV.

Los datos citados en el párrafo anterior indican que la glicoproteína tienevarios sitios antigénicos; sin embargo no todos estos sitios contribuyen a laneutralización.

En BVDV-1 varias cepas comparten un único y principal dominioantigénico neutralizante, la mayoria de los AcMos neutralizantes se unen a esteúnico dominio inmunodominante.

Los trabajos de Paton revelan que este dominio está compuesto porvarios epitopes dependientes de la conformación probablemente definidos porsecuencias discontinuas de aa. Dichos epitopes mapean hacia la región N­terminal de la proteina coincidiendo con Io descripto para CSFV (Yu y col.,1994, van Rijn y col., 1993). Más allá de este dominio antigénico, Paton informala existencia de un segundo epitope presente en solo 3 de los 92 aislamientosde BVDVanalizados.

Los estudios realizados por Toth permiten localizar además un epitopeneutralizante en un fragmento que contiene los últimos 90 aa del extremo C­tenninal mientras que otro discontinuo dependeria de la expresión de laproteína entera para formarse.

Por otra parte dos publicaciones coinciden al describir la presencia de almenos un epitope lineal (Deregt y col.,1998a' Yu y co|., 1996).

A diferencia de BVDV-1 en el que los epitopes neutralizantesconservados mapean en un inmunodominio dominante, en el caso de BVDV-2los AcMos neutralizantes se unen a epitopes altamente conservados en 3dominios antigénicos (Deregt y col, 1998")

La utilización del modelo estructural de la E2 de CSFV permite avanzarmás rápidamente en el estudio de la estructura de la E2 de BVDV.En el caso de la E2 de CSFV están bien descriptos 4 dominios antigénicos, lossitios probables de glicosilación y los puentes disulfuro relevantes (van Rijn ycol., 1994). En este modelo la zona de 35 aa C-terminal, muy conservada enPestivirus, está insertada en la envoltura de la membrana.

La estructura propuesta para la E2 de CSFV está esquematizada en laFig. 7.

INTRODUCCIÓN

Fig. 7 Estructura antigénica propuesta para la glicoproteína E2 de CSFV (adaptadode van Rijn y co|., 1994).

HidrofóbicoPolar no cargadoAminoácidocargadoCisteina

m

Ohio

Los aminoácidos están agrupados en hidrofóbicos (A,G,M,I,L,V,F,W,P),polares nocargados (N,Q,S,T,Y), cargados (D,E,K,R,H)y cisteína (C). Se indican además lasuniones disulfuro propuestas en la mitad N-terminal de E2, los dominiosantigénicos (A, B, C, D) y los grupos de glicosilación.

Extrapolando el modelo estructural de CSFV a BVDV,se especula quela E2 de BVDVposee una estructura espacial compleja caracterizada por lapresencia de múltiples puentes disulfuro intracadena.

De todos modos existen algunas diferencias entre ambos virus que esnecesario puntualizar, por ejemplo, si bien la homología entre las glicoproteínasE2 de BVDVy CSFV es de un 76 % de identidad aminoacídica y el patrón dehidrofobicidad es practicamente idéntico, Ia variación de la secuencia altera elnúmero y la distribución de los sitios potenciales de glicosilación y el número deCys.

Además en el caso de CSFV, los epitopes conformacionales muestranuna dependencia de 6 residuos de Cys en las posiciones 4, 48, 104, 130, 140 y168 (Van Rijn y col., 1994) mientras que no existen publicaciones en relación alas Cys involucradas en las uniones intercadena o intracadena de la E2 BVDV.A pesar de que los residuos de Cys están muy conservados en BVDVconrespecto a CSFV hay dos residuos adicionales en el primer caso en lasposiciones 59 y 106 que podrían estar involucrados en puentes disulfuro

20

INTRODUCCIÓN

alternativos afectando la estructura de E2 de un modo diferente al propuestopara CSFV (Fig. 8).

Estas diferencias marcan que no siempre las características observadasen la E2 de CSFV pueden extrapolarse a BVDVsiendo por lo tanto justificableslos estudios relacionados a la E2 de este virus en particular.

Fig. 8: Comparación de los patrones de hidrofobicidad (a), distribución de residuoscisteínas (b) y sitios potenciales de glicosilación (c) entre CSFV y BVDV(extraidode Weiland y col., 1990).

¡A l lllll lll lllll lll I l Jl I lllllllllllllc.l l llllllll lll “¡lllHCV con ? l gp 44/48 I ngJ l gp 55 l

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BVDV

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*Residuos de cisteínas extras en BVDVgp 48, gp 25, gp 53 corresponden a Ems,E1 y E2 respectivamente.

Otra diferencia entre CSFV y BVDVes la inmunodominancia de la regiónde los aa número 71 a 74 y la importancia del aa en la posición 72. La mayoriade los epitopes de BVDVse han mapeado en relación a este aa particular y aesta región pero no se han identificado mutantes de escape de neutralizaciónpara CSFV en esta región, Io que sugiere que dicha región no tiene la mismaimportancia en estos dos Pestivirus.

También se describió la existencia de AcMos neutralizantes anti-CSFV

que reaccionan contra BVDVsin neutralizarlo.Todo lo mencionado anteriormente revela diferencias estructurales

fundamentales entre la región N-terminalde la E2 de ambos virus.Dada la secuencia de aa de CSFV y BVDVse ha podido definir, hacia el

extremo C-terminal, un epitope lineal altamente conservado en los Pestivirus.

21

INTRODUCCIÓN

Según trabajos de Yu (Yu y col , 1996) este epitope lineal no está accesible enla superficie nativa del BVDVavalando de este modo los trabajos de van Rijn(van Rijn y coI.; 1994) que indican la presencia de una región C-terminal unidaa membrana y de una región N-terminal expuesta en la superficie del virión(Fig. 7).

Según Deng y Brock (1992) existen dos regiones hipervariableshidrofilicas denominadas V1 y V2 en Ia superficie externa de los viriones.Dichos dominios han sido propuestos como epitopes protectivos de la proteínay como blancos importantes para la neutralización. En la Fig. 9 se muestraesquemáticamente la distribución de los dominios citados.

Fig. 9: Localización e hidrofobicidad de dominios variables y conservadosidentificados en los Pestivirus (extraído de Deng y Brock, 1992).

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L l l _M____l I ‘ y1 I ¡fl -4­I

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Localización e hidrofobicidad de tres dominios variables y cuatro dominiosconservados identificados en los Pestivirus en la región de las proteinas viralesestructurales y la proteína no estructural N82 (p54). El box negro y el símbolo Vindica un dominio variable. El box sombreado y el símbolo C indica el dominioconservado. La hidrofobicidad se indica de manera proporcional en la partesuperior. Las líneas sólidas y punteadas corresponden a la hidrofobicidad de lascepas SD-1 y NADLrespectivamente. La estrella indica la inserción en NADL. Enla parte inferiorde Ia figura se indica el número de los aa. S indica secuencia señalP14, gp48, gp25, gp53 y p54 corresponden a C, Ems, E1, E2 y N82respectivamente.

22

INTRODI/(Y‘IÓN

En las células infectadas con BVDV la glicoproteína E2 permaneceasociada a las membranas del Golgi (Greiser-Wilke y col., 1991, Grummer ycol., 2001).

Weiland y col. (1999) demostraron que la proteína E2 que es posibledetectar por métodos de inmunohistoquímica, en la superficie de célulasinfectadas con BVDV, corresponde a la proteina presente en los virionesprotruyendo de la superficie celular y no a moléculas E2 insertadas en lamembrana celular.

La E2 no posee secuencia señal propia. La secuencia señal presentecorresponde a una región hidrofóbica terminal de la proteína E1 ubicadaupsteam respecto de la E2 (Rümenapf y col., 1993).

La E2 de BVDV forma homodímeros y heterodímeros con laglicoproteína E1 por medio de uniones disulfuro y en general los trabajosexistentes con respecto a la estructura dimérica de E2 han utilizado a CSFVcomo modelo (Thiel y col., 1991; Weiland y col., 1990) siendo unos pocos losestudios que hacen referencia específica al dímero de BVDV E2 (Branza­Nichita y col.,2001; Durantel y col., 2001) y posteriores al comienzo de estetrabajo.

1.3. Manifestaciones clínicas de BVDV

Las manifestaciones clinicas de BVDVpresentan un amplio espectro deenfermedades, abarcando desde infecciones subclínicas hasta una forma fataldenominada “enfermedad de las mucosas".

Van'os factores influyen en la forma clínica de la infección con BVDVcomo por ejemplo la inmunocompetencia o inmunotolerancia del animalinfectado, el estado de preñez, el tiempo gestacional del feto, el statusinmunológico (derivado de una infección previa o de una vacunación) y el niveldel stress que le provoca el medio.

Asi también. la diversidad genética encontrada en los diferentesaislamientos genera diferencias en las respuestas clínicas a Ia infección.

La vía de entrada mucosa oronasal es considerada la fase inicialde la

infección (Brownlie, 1990). A partir de este sitio ocurre una dispersión sistémicaque se evidencia por la presencia del virus libre en suero o asociado concélulas de Ia fracción leucocitaria (“capa de blancos") de la sangre.Posteriormente el virus replica en diferentes mucosas y es excretadoprincipalmenteen secreciones oronasales y sémen.

En la Fig. 10 se detallan distintas formas clínicas de la infección conBVDV.

23

INTRODUCCIÓN

Fig. 10: Manifestaciones clinicas de la infección con BVDV.

Inlbcción aguda

iVucn pícfludu Vaca no pmñadu

lïmbrii'm n l'clo Sindrome DVB severa con DVI! subclinicn¡"fumado hcmnrrúgico cm) mucnc: DVI! SA o clinica lcw:

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L L1.3.1. Infección en bovinos ' --- rLa infección en bovinos inmunocompetentes depende de la amplia

diversidad de cepas de BVDVy de la diferencia de virulencia observada entre

24

INTR()Í)l/( ‘(‘IÓN

ellas. Estas características dan como resultado los cuadros de infeccióndetallados a continuación:

1.3.1.a. Enfermedad subclínical Enfermedad clínica leve (DVB)En animales seronegativos e inmunocompetentes, entre el 70% y el 80%

de las infecciones con BVDV son subclínicas (Ames, 1990) y la fuente decontagio la constituyen los animales inmunotolerantes y animalespersistentemente infectados con el virus (APl).

Durante el proceso de infección subclínica aumenta la temperaturacorporal, disminuyen los leucocitos (leucopenia), disminuye la producción deleche y se generan anticuerpos específicos.

Cuando la infección se manifiesta clínicamente con sintomatología leve ypracticamente sin mortalidad se denomina diarrea viral bovina (DVB). Enrebaños susceptibles ocurren brotes de diarreas (en animales de 6 meseshasta 1 año de edad) que se caracterizan por la alta morbilidad. Luego de unperiodo de incubación de 5-7 días se produce fiebre y leucopenia transiente.

La viremia iniciada a los 4-5 días persiste durante 15 díasaproximadamente siendo la aparición de los anticuerpos alrededor de los 10-12días posteriores a Ia infección (Kirkland y col., 1991). Otros síntomas clínicostales como depresión, anorexia, descarga oculonasal, diarrea, ritmorespiratorioacelerado y erosiones y ulceraciones orales ocasionales pueden estarasociados. Por otro lado, dado que el BVDVinduce inmunosupresión, puedenexistir infecciones secundarias.

El virus se encuentra en suero, secreciones nasales y sémen en bajaconcentración en comparación con bovinos persistentemente infectados(Baker, 1995).

El diagnóstico de DVB consiste en el aislamiento viral o en lademostración de la seroconversión entre las 2 y 4 semanas luego de lainfección. El desarrollo de anticuerpos específicos persistirá de por vida (Duffelly Harkness, 1985; Perdrizet y co|., 1987).

La terapeutica de Ia infección se basa en la utilización deantimicrobianos, anti-inflamatorios no esteroideos, electrolitos o fluidos,antidiarreicos y protectores gastrointestinales (Baker, 1995).

1.3.1.b. Síndrome hemorrágicoEl síndrome hemorrágico es una diarrea viral bovina aguda en adultos y

en terneros (Rebhun y col., 1989).La enfermedad se manifiesta con una marcada trombocitopenia

generando cuadros de diarrea sanguinolenta, epistaxis, hemorragias en lasmembranas mucosas y sangrado en los sitios de inyección. A estos síntomas

25

lNTRODI/(‘(“IÓN

se pueden sumar otros como esclerosis ocular, pirexia y leucopenia (Rebhun ycol., 1989).

Este síndrome se asocia particularmente al genotipo Il de BVDV ncp(Pellerin y col., 1994; Ridpath y col., 1994) aunque en Europa se han asociadocasos esporádicos de síndrome hemorrágico al genotipo l (Hamers y col.,2000). El sindrome hemorrágico se diagnostica mediante el aislamiento delvirus o seroconversión y detección de trombocitopenia.

Además de Ia terapeutica ya mencionada, otra alternativa para eltratamiento de la enfermedad es la transfusión completa de sangre (Baker,1995)

1.3.1.c. Diarrea Viral Bovina Aguda Severa (DVBSA)Como su nombre lo indica esta enfermedad es una forma severa de la

infección aguda con BVDVy que puede terminar en muerte. Las caracteristicasde la clínica descripta para la DVB SA incluyen fiebre alta, neumonía, diarrea,Iinfopenia y trombocitopenia en todas las edades y úlceras orales en losanimales más viejos. La severidad de la infección por rebaño varia desdealgunos pocos animales muertos hasta un 10%-20%.

Los primeros reportes que comenzaron a encuadrar esta forma clinicade la enfermedad se publicaron a partir de 1993 (David y coI., 1994; Hibberd ycol., 1993) en tambos del Reino Unido. Otras publicaciones describen casossimilares en Ontario y Québec (Carman y col., 1994; Pellerin y col.,1994); comoasí también en Europa, Sud América y Japón (Shimazaki y co|., 2003).

La mayoría de los virus aislados de casos de BVD SA pertenecen algenotipo II.

1.3.1.d. Otras manifestaciones clínicasLa infección aguda con BVDV puede producir ¡nmunosupresión

aumentando por lo tanto la susceptibilidad a otros patógenos (Potgieter y col.,1988). Las infecciones con Pasteurella hemolitica, Bovine Respiratory SincytialVirus y Salmonella typhimorium (Brodersen y Kelling, 1998; Lehmkuhl y col.,1977; Penny y col.,1996; Potgieter y col.,1984) son algunos ejemplos delamplio rango de infecciones clinicas secundarias asociadas al animal infectadocon BVDV.

La ¡nmunosupresión observada con BVDVposiblemente esté asociada altropismo del virus por células sanguíneas, órganos linfáticos, timo y Placas dePeyer. Por ejemplo se ha observado replicación viral en linfocitos in vitro yalteración de la población de linfocitos B y T, polimorfos nucleares y

neutrófilos,y plaquetas (Bolin, 19853; Brodersen y col., 1998; Fn'nk y coI., 2002;

Ohmann, 1983; Reggiardo y Kaeberle, 1981; Truitt y Schechmeister, 1973;Walz y col 2001,).

26

INTR(mm ‘("lÓN

El BVDVtambién tiene tropismo por las células germinales (Brownlie ycol., 1997; Paton y col._1989; Voges y col.1998). Dado que este virus es capazde replicar en las vesículas seminales y en la próstata pueden detectarsepartículas virales en el sémen de animales infectados (Kirkland y col., 1991;Kommisrud y col., 1996; Paton y col., 1989).

Esta infección correlaciona, muchas veces, con la disminución de lamovilidadespermática y con la presencia de anormalidades morfológicas de losespermatozoides (Baker, 1995).

El virus también infecta tejidos ováricos y produce alteraciones a nivelhormonal inhibiendo por ejemplo la formación de un cuerpo lúteo competente.Este hecho en última instancia estaría relacionado con la disminución de la

fertilidad (Brownlie y col., 1997; Fray y coI., 2002). Se han descriptocorrelaciones entre presencia viral y patologías como las ovaritis en vacasinfértiles, las vulvovaginitis infecciosas pustulares y las lesiones pustulares dela vulva y vagina asociadas con prurito (Baker, 1995).

1.3.2. Infecciónen vacas preñadas inmunocompetentes (infeccionesfetales)

Desde el punto de vista epidemiológico el contagio del embn‘ón engestación con BVDVprovoca serias consecuencias.

La infección a través de la placenta es común y ocurre con alta eficiencia(Duffell y Harkness, 1985; Roeder y Harkness, 1986). En estudiosexperimentales se demostró que tanto las cepas cp como las ncp de BVDVcruzan la placenta con casi 100% de eficiencia pudiendo causar aborto(Dubovi, 1992).

El principio determinante del tipo de infección fetal es la edadgestacional en la que ocurre. A continuación se describen las posiblesconsecuencias.

1.3.2.a. Muerte embriónica, abortos y nacimientos prematurosLa infección transplacental del feto entre los días 50-100 de gestación

puede resultar en la muerte del mismo (Duffelly Harkness, 1985; Sorecher ycol., 1991). Generalmente las infecciones tardías en el periodo de gestación noresultan en abortos, aunque se han registrado algunos casos (Baker, 1995).

1.3.2.b. Defectos congénitosLa infección transplacental del feto entre los 100 y 150 días de gestación

puede producir numerosos defectos congénitos. En este período gestacionalocurren los estadios finales de Ia organogénesis del sistema nervioso y eldesarrollo del sistema inmune fetal pudiendo generar una respuestainflamatoria al BVDV(Duffell y Harkness, 1985).

27

lNTR()l)l/( ‘(‘IÓN

Los terneros pueden nacer con hipoplasia cerebelar por lo cualpadecerán luego temblores, inestabilidad motriz, microencefalopatía,hidranencefalia, hidrocefalia, porencefalia e ipomielinogénesis. Como asítambién cegueras y cataratas, braquiignatismo (mandíbula mas corta que lonormal), enanismo por retraso del crecimiento, rupturas congénitas de huesos,menor peso de los recién nacidos y menor peso de los órganos (Constable yco|., 1993; Duffelly Harkness, 1985).

Los posibles mecanismos del daño a nivel celular incluyen la inhibicióndel crecimiento celular, diferenciación celular, o directamente lisis celular.

1.3.2.c. Teneros sanos nacidos seropositivos a BVDVLos terneros infectados en los últimos estadios de la gestación pueden

nacer seropositivos a BVDVy normales (Duffell y Harkness, 1985). En estoscasos disminuyen notoriamente los defectos congénitos.

Dado que el calostro es una fuente potencial de anticuerpos contraBVDVla detección de anticuerpos séricos debe realizarse previamente a laingestión del mismo.

1.3.2.d. lnmunotolerancia a BVDVLa infección con BVDV no citopático antes del desarrollo de

inmunocompetencia (primer trimestre de gestación) puede dar origen alnacimiento de terneros que son inmunotolerantes y persistentementeinfectados con BVDV(McClurkin y col., 1984).

La inmunotolerancia solo ha sido asociada al biotipo no citopático(Brownlie y coI., 1989; Mc Clurkin y co|., 1984).

1.3.3. Infecciones de BVDVen bovinos inmunotolerantes

1.3.3.3. Infección persistenteLos APl son virémicos y excretan virus durante toda su vida (Con'a y

McClurkin; 1978) . La prevalencia de la infección persistente en una poblaciónbovina es baja pero los API se constituyen en una fuente importante detransmisión de la enfermedad, las hembras persistentemente infectadasgenerarán nacimientos de otros API; dispersando y manteniendo presente elvirus en la naturaleza (Baker, 1995).

Los API son inmunotolerantes al BVDV pero inmunocompetentes conrespecto a otros antígenos. La inmunotolerancia parece ser especifica a lascepas no citopática infectantes ¡n útero por lo cual pueden desarrollar una

28

INTan/r ‘r'IÓN

respuesta inmunológica a cepas heterólogas de BVDV (Bolin y col.,1985b,Houe y Heron, 1993; Mc Clurkin y col.,1984) o a otros antígenos.

De este modo los API pueden ser seropositivos para BVDVpues al serinfectados con una cepa citopática heteróloga desarrollarán anticuerpos contralas proteínas variables del virus (como la E2) pero no producirán en ningúncaso anticuerpos contra regiones conservadas (como la N83) debido a que lainfección in útero fue previa al desarrollo de su sistema inmune, reconociendopor lo tanto al virus (particularmente a las regiones conservadas) comoantígeno propio.

Los API que ingieren calostro pueden adquirir anticuerpos pasivamenteinterfiriendo entonces con la habilidad de aislar el virus (Palfi y coI., 1993).

Los API parecen estar predispuestos a infecciones con otrosmicroorganismos que producen usualmente neumonía y enteritis (Brownlie,1990). Este hecho podría estar asociado con una inmunosupresión inducidapor la infección persistente. Estos animales poseen una supervivenciadisminuida (Houe y Heron, 1993) y una mortalidad del 50% en el primer año devida (Duffelly Harkness, 1985). Pueden ser más pequeños que los ternerosnormales y con un grado de crecimiento más lento pero también pueden tenerapariencia normal. También se ha descripto una glomerulonefn'tis y encefalitissubclínica en API de apariencia sana (Cutlip y col., 1980).

Además otra característica muy importante de los API es que son losanimales con riesgo de desarrollar la enfermedad de las mucosas detallada acontinuación.

1.3.3.b. Enfermedad de las mucosasLa etiología de esta enfermedad es compleja y se corresponde con los

dos biotipos de BVDV. La enfermedad de las mucosas ocurre cuando elganado bovino que es inmunotolerante y persistentemente infectado con unacepa ncp de BVDV se sobreinfecta con una cepa cp que comparte granhomología con el virus persistente infectante. La EM también puede surgir porla generación de novo de una mutante cp a partir de la ncp persistenteinfectante (Bolin y col., 1985"; Kummerer y Meyers, 2000; Moennig y co|., 1990;Moennig y Plagemann, 1992).

La EM se manifiesta en distintas formas clínicas. Hay una forma agudaque aparece con un 100% de mortalidad y ocurre usualmente en animales de 6a 18 meses de edad. Existe además una forma crónica con curso más lentoaunque también asociada a porcentajes de mortalidad altos.

Las diferencias en la relación de las cepas cp y ncp serían lasreponsables de las variaciones en la respuesta clínica (Bolin, 1995) (Figura 11).Un extremo es la EM aguda fatal cuando el virus cp superinfectante compartehomología cercana con el virus ncp persistente infectante de manera que el

29

¡0.0.0.0.000000000000000COOOOOOO0...0...OOOOOOOOOI

INTRODUCCIÓN

API "reconoce" al virus cp como propio y no desarrolla anticuerpos (ramaizquierda en el cuadro). El otro extremo del espectro es una enfermedad noclínica, pero con seroconversión. En este último caso ei virus superinfectantees una cepa heteróioga (rama derecha en el cuadro).

Entre estos dos extremos, basados en ias relaciones antigénicas se hadescripto ia “EMcrónica” como así una forma de de posible recuperación.

Figura 11: infección en bovinos persistentemente infectados

Bovinos persistentementeinfectados con la cepa nocitopática “A” (ncA)

i i

Infección con virus Infección con viruscitopático homólogo A (cA) citopático heteróiogo B (cB)

2-3 semanas 2-3 semanas

Enfermedad deias mucosas Respuesta

inmune

Ab: anticuerpos

30

INTRODUCCIÓN

La EM aguda está caracterizada por pirexia (40,5 °C a 41 °C), debilidad,anorexia, aumento del ritmo respiratorio y cardíaco, emaciación ydeshidratación con acidosis a medida que avanza la enfermedad. Y puedeprovocar lesiones en la cavidad oral involucrando labios, márgenes gingivales,lengua, paladar, comisuras de la boca. También pueden aparecer lesioneserosivas en las narinas externas, cavidad nasal, vulva y mamas, descargaocular mucopurulenta con lagrimeo excesivo y edema de cornea.

El curso de la enfermedad va desde los 2 o 3 días hasta las 2 o 3semanas culminandoen muerte (generalmente por eutanasia).

A los dos o tres días posteriores a la manifestación de los signos clinicosaparece una diarrea profusa y acuosa. En los casos hiperagudos la muerteocurre antes de que aparezca la diarrea. Las heces tienen cantidades variablesde sangre fresca o coagulada y restos intestinales fibrinosos.

En los primeros estadios de la enfermedad hay leucopenia severa,también se puede desarrollar neutropenia, linfopenia y trombocitopenia (Baker,1990; Duffelly Harkness, 1985; Perdrizet y col. 1987).

No existen tratamientos garantizados para animales con enfermedad delas mucosas. Aunque exista la posibilidad de recuperación, estos animalespermanecerán infectados de por vida y deberán ser identificados lo antesposible y removidos del rebaño.

La bibliografía acerca de la utilización de drogas inmunomoduladorascomo terapeútica revelan que dichas drogas no tienen una acción potente a lolargo del tiempo y que el animal continúa siendo persistentemente infectado.

Van'os programas de control de BVDVen Europa están basados sobre ladetección y remoción de los animales persitentemente infectados del rebaño,principales responsables de la diseminación del virus en el mismo.

1.4. Vacunación

Los principales objetivos de un programa para el control de BVDVdebenser prevenir las infecciones fetales a fin de eliminar las pérdidas reproductivasasociadas a BVDV(y así también evitando el nacimiento de API) y prevenir lasinfecciones agudas a fin de reducir las pérdidas asociadas a las mismas(Harkness, 1987).

Esto puede lograrse impidiendo la exposición al virus mediante laremoción de los API del rebaño, y aumentando Ia inmunidad a BVDVmediantela vacunación.

Aún no se ha desarrollado una vacuna estándar para la protección de lainfección pero en la actualidad hay disponibles una serie de preparacionescomerciales en Europa y Norte América. Estas vacunas se comenzaron autilizar desde hace aproximadamente 40 años pero sin embargo no parecehaber existido una disminución significativa de la prevalencia de BVDVen los

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paises o regiones donde fueron usadas. Esto plantea la necesidad de focalizarel esfuerzo tanto en profundizar en el estudio de los mecanismosinmunológicos de protección de los bovinos como en el desarrollo de nuevasgeneraciones de vacunas más eficaces y seguras.

Existen disponibles en el mercado dos tipos de vacunas: a virus vivomodificado (MLV: Modified live vaccinesz) y a virus inactivado (IV: Inactivatedvaccines). Aunque se utilizan ambos tipos de vacunas hoy en dia continúahabiendo una controversia respecto a cual de ellas es la más eficiente (Bolin,1995)

Si bien ha sido demostrado que los anticuerpos pasivamente adquiridospueden proteger contra el desafio a BVDV(Bolin y Ridpath, 1995), la relaciónentre titqu neutralizante y protección aún no está clara (van Oirschot y col.1999). Esto no es sorprendente ya que no existe un método universalmenteaceptado para la determinación del titulo seroneutralizante, ni un desafioestandarizado así como tampoco existe una definición estándar de protección.Sin embargo y a pesar de esto el estudio de la eficacia de las vacunas luego dela vacunación radica en el test de seroconversión. También se analiza la

reducción de la diseminación del virus y de parámetros clínicos medibles comotemperatura rectal y Ieucopenia luego de un desafío viral en los animalesvacunados.

Frecuentemente se relaciona al BVDVcon la enfermedad respiratoriabovina y se ha descripto que es capaz de suprimir al sistema inmune ypavimentar la vía de entrada para otros patógenos. Es por esta razón que lavacuna generalmente se incorpora a un complejo multivacunal junto con otrosantígenos con el objeto de prevenir la enfermedad respiratoria. Generalmentela preparación vacunal está constituida por uno o más de los siguientesmicroorganismos: herpes virus bovino-1, virus parainfluenza-3, virusrespiratorio sinsicial y distintas especies de Pasteurella y Haemophilius, (vanOirschot y col., 1999) administrándose generalmente por vía intramuscular osubcutanea.

En general los títulos alcanzados en animales vacunados con antígenoscomerciales de ambos tipos son bajos alcanzando en los mejores casosvalores de titqu neutralizante del orden de 1:2.000 (Fulton y Burge, 2001).

1.4.1. Vacunas a virus vivo modificado

Estas vacunas contienen un virus atenuado que replica en el huéspedinoculado con el antígeno. La atenuación de la virulencia se alcanza pormúltiples pasajes de las cepas de BVDVen cultivos celulares de diferenteorigen. Mutantes temperatura-sensible obtenidas por tratamiento de BVDVconácido nitroso y subsecuentes diluciones a temperaturas permisivas y

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restrictivas (Lobmann y col., 1984) también han sido utilizadas para inducirrespuesta anti-BVDVen diferentes huéspedes.

En los Estados Unidos por ejemplo la mayoría de las vacunas de BVDVa virus vivo modificado contienen las cepas Oregon, 024V. NADL o Singer(Arnes y Baker, 1990).

El uso de cepas atenuadas en vacunación, y particularmente en el casode un virus de compleja biología como BVDV,es siempre riesgoso en términossanitarios. El principal problema de las MLVde BVDVes que son una fuentepotencial de infección in útero y de inmunosupresión (Liess y col., 1984).También es importante tener en cuenta que el antígeno se producegeneralmente en cultivos celulares de origen bovino y que por lo tanto puedencoexistir BVDV contaminantes provenientes de las células de cultivo o delsuero utilizado como complemento del medio de cultivo.

Una cepa citopatogénica contaminante en la vacuna podría precipitar laenfermedad de las mucosas por superinfección en animales persistentementeinfectados, mientras que. en vacas preñadas un componente de cepa nocitopatogénico vacunal podría cruzar la placenta e infectar al feto originando lapersistencia viral en el mismo.

Debido a la posibilidad que anticuerpos maternos interfieran con lareplicación no se aconseja inmunizar con este tipo de vacunas a animalesmenores de 3 meses de edad (Schultz, 1993).

La principal ventaja de las MLV es que todas las fases del sistemainmune son activadas y producen una respuesta inmune celular y humoralbalanceada. A diferencia de las vacunas inactivadas en la que los antígenosdeben ser destruidos y solo se generan anticuerpos contra las proteínasestructurales, las MLVestimulan una respuesta inmune específica contra cadauno de los antígenos virales Ems,E1, E2, NS2-3 y NS3. También las MLVsoncapaces de inducir una fuerte respuesta de anticuerpos neutralizantes,duración prolongada de la inmunidad, detectable hasta 18 meses post­vacunación (Cortese y col., 19983), y su administración es menos frecuente(van Oirschot y col., 1999).

1.4.2. Vacunas inactivadasLa principal ventaja de las vacunas inactivadas de BVDVes que no son

inmunosupresivas y no tienen posibilidad de infectar a los fetos, minimizandotambién las infecciones por BVDV o patógenos adventicios contaminantespresentes en la preparación.

La posibilidad de perder parte de la inmunogenicidad durante el procesode inactivación así como la obtención de una respuesta de anticuerposneutralizantes más débil y de protección menos duradera (de aproximadamente4 meses según Bolin y col., 1990) que la inducida por vacunas atenuadas

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representan desventajas en el sistema de BVDVinactivado. Es necesarioen el caso de las vacunas inactivadas aumentar la frecuencia de suadministración.

Por otra parte está descripto que una inmunización adecuadarequiere una alta concentración de masa antigénica en la vacuna (Beer ycol., 2000; Kaashoek y coI., 1995) lo cual en el caso de BVDVrepresentauna importante dificultad dada la baja producción de antígeno de BVDVencultivo celular.

La variabilidad antigénica de BVDV limita el uso de vacunasmonovalentes. Este punto, sin embargo es tema de discusión. Por ejemplo, laglicoproteína E2 expresada en un vector del virus Vaccinia induce anticuerposneutralizantes en corderos contra BVDV-1a pero no contra BVDV-1h (Toth ycol., 1999) y según Bolin y Ridpath (1996) y Bruschke y col. (1997a)recombinantes de E2 del genotipo la no protejen contra el desafio con BVDVgenotipo ll.

Por otra parte varios trabajos documentan que tanto vacunas a virus vivomodificado como a virus inactivado del genotipo l estimulan la producción deanticuerpos capaces de neutralizar varias cepas de BVDV heterólogasincluyendo cepas del genotipo II (Cortese y col. 1998; Dean y Leyh, 1999;Fulton y Burge, 2001; Hamers y col. 2002). Esto sugiere que a pesar de lasdiferencias de secuencia entre E2 de las diferentes cepas, las configuracionesde algunos epitopes neutralizantes son similares.

La aparente contradicción entre los resultados de pruebas de inmunidadcruzada se debería al grado, duración y tipo (clínica, fetal o epidemiológica) deprotección considerados según los diferentes autores así como el tipo devacuna (van Oirschot y col., 1999).

1.4.3. La glicoproteína recombinante E2 de BVDVcomo inmunógenoComo se vió en los puntos 1.4.1 y 1.4.2 el diseño de vacunas anti-BVDV

presenta un amplio margen de mejora.Siendo la glicoproteína E2 el principal inmunógeno de BVDV y mayor

blanco de anticuerpos neutralizantes, es un candidato apropiado para estudiarsu posible utilizacióncomo vacuna a subunidad.

Trabajos realizados por Yu (Yu y col., 1994) indican que la proteina E2expresada en bacterias no induce anticuerpos neutralizantes en conejos,sugiriendo entonces que la conformación de la E2 juega un rol de importanciaen la generación de respuesta inmune neutralizante y debe ser un factor deconsideración en el diseño de vacunas a subunidades.

Teniendo en cuenta que la mayoría de los epitopes neutralizantes de E2probablemente sean discontinuos, es probable que la E2 de origen procariótico

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INTRODIK ‘('IÓN

se pliegue incorrectamente, impidiendo de esta forma su buen funcionamientocomo inmunógeno.

De hecho Ia misma proteína expresada en el sistema Vacciniarecombinante en células de mamífero produce anticuerpos neutralizantescuando es inoculada como proteína purificada en conejos y bovinos (Tijssen ycol., 1996) aunque los títulos neutralizantes obtenidos son bajos.

Bolin y Ridpath (1996) han realizado estudios de inmunidad en bovinoscon la proteina E2 expresada en células de insecto mediante el sistemaBaculovirus recombinante. Esta proteina recombinante expresada junto a lasecuencia hidrofóbica que le precede (correspondiente a la región C- terminalde la proteina E1) y sin su región de anclaje a membrana (últimos 31 aa)produce anticuerpos neutralizantes en bovinos pero los títulos neutralizantesobtenidos son bajos, inferiores a 1:128 luego de la segunda dosis y aumentansólo luego de la tercer dosis (1:1OOO-4.000).

Uno de los principales objetivos propuestos para el presente trabajo deTesis es estudiar la inmunogenicidad de la proteína E2 completa recombinante(rE2) expresada en un sistema de Baculovirus, y además evaluar su potencialcomo una vacuna alternativa. Esta proteína recombinante por Io tanto incluiríaen su región carboxi|o terminal al epitope neutralizante descripto por Yu y col.(1996).

Con el objeto de expresar un polipéptido capaz de procesarsecorrectamente durante la post traducción se decidió expresar la proteina E2asociada a la secuencia señal heteróloga SS presente en Ia proteina G delVirus de la estomatitis vesicular (VSV).

Es sabido que en las células eucariotas el plegamiento de las proteinasen el Iúmen del RE es precedido por la translocación del polipéptido nacienteen la membrana del RE. Este proceso, clave para que las modificacionesposteriores puedan llevarse a cabo, es dependiente de la presencia de lasecuencia señal hidrofóbica en el extremo N-terminal del polipéptido (Schatz yDobberstein, 1996).

La proteína E2 también ha sido expresada en sistemas recombinantesde virus de mamíferos. Estos virus recombinantes han sido, a su vez, utilizadoscomo vacunas atenuadas experimentales (Baxi, 2000; Elahi y col.,1999; Kweony col., 1999).

Salvo para el caso de un Adenovirus recombinante donde se alcanzantítulos neutralizantes del orden de 1:1.000 en ratas algodoneras, los niveles derespuesta neutralizante obtenidas con los otros dos virus recombinantesFowlpox y Herpesvirus bovino son bajas.

Los tres sistemas utilizados corresponden a virus a DNA yconsecuentemente también presentan la desventaja de su posiblerecombinación con el DNAdel huésped.

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1.4.4. Virus de la estomatitis vesicular recombinante como inmunógenoEn los últimos años se han desarrollado recombinantes del Virus de la

estomatitis vesicular (rVSV) capaces de expresar una amplia gama deproteínas heterólogas y que han dado muy buenos resultados corno vacunasatenuadas. La replicación exclusiva del VSV en el citoplasma y la falta derecombinación genética le confiere una ventaja potencial con respecto a losinmunógenos que utilizan DNA plasmídico o vectores de virus a DNA en losque resulta posible una alteración del background genético del animal inducidopor la vacuna.

El tropismo de VSV hacia el tracto respiratorio superior, su habilidadpara disparar una fuerte respuesta inmune celular-humoral (Freer y col., 1994;Kundig y co|., 1993; Zinkernagel y col., 1978). su capacidad para crecer a altostítulos en cultivos celulares y su fácil purificación, convierten a los vectoresrVSV que expresan inmunógenos heterólogos en candidatos atractivos comovacunas vivas atenuadas a ser administradas por via intranasal (Roberts y col.,1998; 1999).

La infección con rVSVs induce la expresión alta y estable de genesheterólogos insertados entre las secuencias que codifican para la proteína G yla proteína L de VSV. Así por ej. se ha demostrado la incorporación de Ia gp120del Virus de la inmunodeficiencia humana en un recombinante de VSV y de lasglicoproteínas F y G del Virus respiratorio sincicial (RSV) o la G del Virus deinfluenza (Johnson y co|.,1997; Kahn y co|., 1999; Roberts y co|., 1998).

En algunos casos la incorporación de la proteína heteróloga en Iaenvoltura de rVSV requiere el reemplazo de su extremo citoplasmático por elde la proteína G de VSV como es el caso de la gp120 (Kahn y col.,1999;Roberts y co|.,1998).

El rVSVque expresa la glicoproteína HAdel Virus de la Influenza ha sidoensayado en ratones resultando completamente atenuado para la patogénesise incluso produce protección total al desafío con el virus salvaje letal luego dela vacunación intranasal (Roberts y col., 1998; 1999). También la inoculacióncon un rVSV que expresa la proteína H del Virus del sarampión induce altostítulos neutralizantes, superiores a los que induce el virus solo y puedeninmunizar a ratas algodoneras inclusive en presencia de anticuerpos maternostransferidos en forma pasiva (Schlereth y co|., 2000).

El VSV es un problema epidemiológico en los Estados Unidos deAmérica y es enzoótico en áreas de Centro América. Si bien en nuestro pais esuna enfermedad exótica, en otros países de Sudamérica ha sido muchas veces“enmascarado” por el Virus de la fiebre aftosa (VFA) dado que produce unasintomatología semejante. Es digno de mencionar que, a diferencia de otrosvirus de importancia veterinaria (por ej. el VFA) y debido a su relativa

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estabilidad genética, el VSV presentaría bajo riesgos como vacuna atenuada(Wagner, 1974).

Todos estos antecedentes convierten al rVSV en un vector interesantepara el estudio de la expresión de proteinas inmunogénicas de BVDV enparticular E2 y su posible utilización como vacuna. En este trabajo también sehan investigado las características estructurales de la glicoproteína E2expresada en el sistema rVSV recombinante como así también el potencialinmunogénico del virus recombinante como vacuna atenuada o inactivada.

1.4.4.a. Características del sistema VSVrecombinanteEl Virus de la estomatitis vesicular es el prototipo de la familia

Rhabdovin'dae e infecta un amplio rango de animales que incluyen bovinos,caballos y cerdos (Wagner y Rose. 1996).

La infección con VSV se asocia con una enfermedad que cursa conlesiones vesiculares alrededor de la boca, pezuñas y mamas recuperándoselos animales dentro de las dos semanas posteriores al inicio de la infección(Walton y co|., 1987; Wagner y Rose, 1996).

El VSV tiene un genoma a RNA de 11 Kb no segmentado y de polaridadnegativa. Dicho RNA codifica para 5 RNAm correspondientes a 4 proteinasestructurales internas: nucleocápside (N). fosfoproteína (P), proteina de matriz(M) y polimerasa (L) y 1 glicoproteína de transmembrana (G) expuesta en lasuperficie exterior del virión (Wagner y Rose, 1996).

A partir de DNAplasmídico es posible generar partículas recombinantesde VSV (rVSV)que se obtienen en la mayoría de las células de mamíferos contítulos extremadamente altos (Lawson y col., 1995). La mínima unidadinfecciosa de VSV es el RNAgenómico unido a la proteína de la nucleocápsidey a las subunidades L y P de Ia polimerasa codificadas por el virus. Enconsecuecia para reconstituir virus infeccioso a partir de RNA viral es primeronecesario ensamblar el complejo proteína N-RNAque sirve como templado detranscripción y replicación para la polimerasa de VSV.

La metodología seguida por Lawson para la obtención de rVSVconsisteen la transfección de células, previamente infectadas con un virusrecombinante Vaccinia T7 (que expresa la RNA polimerasa del bacten'ofagoT7), con plásmidos que codifican los componentes virales del complejo detranscripción (N, L y P) bajo el control del promotor de la RNA polimerasa T7(Fig. 12).

Adicionalmente se transfecta a las células con un plásmido que codificael antigenoma viral completo también bajo control del promotor T7. El uso delantigenoma en lugar del genoma viral es importante pues evita el problema dehibridización de RNA genómico con mRNAs transcriptos de los plásmidos quecodifican N, P y L.

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Los sobrenadantes de estas células infectadas con Vaccinia T7 ytransfectadas contienen a los virus recombinantes infectivos.

Fig. 12. Diagrama del sistema de recuperación de rVSV infeccioso a partir de DNAplasmidico (adaptado de Rose y Whitt, 2001).

Vaccinia t7 que codifica RNApolimerasa

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pN iTransfección de cuatro 4 i

plásmidos con 1

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1.5. Diagnóstico de BVDVLos signos clínicos de la enfermedad de BVDV,como ya hemos visto, se

presentan en un amplio rango que va de desde la asintomatología a laietalidad, y además muchos de ellos son similares sino idénticos a los de otrasenfermedades comunes en Ia población bovina.

Contar con herramientas de diagnóstico simples y rápidas que permitandiferenciar a BVDVde otras patogénesis es esencial en Ia estrategia de controlde la enfermedad. Esto permitirá, por ejemplo, una identificación en tiempo realde seropositivos y de API, previo a su entrada a rebaños no infectados .

1.5.1. Detección de virus o de componentes viralesLa detección del BVDVpuede llevarse a cabo mediante:

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INTRODUCCIÓN

a) aislamiento viral por replicación en cultivo celular en uno o más pasajesseguido de fijación y tinción con anticuerpos especificos, b) detección deantígeno directamente en muestras de órganos sin propagación del virus y c)determinación de RNAviral mediante técnicas moleculares.

1.5.1.a. Aislamiento de virus en células en cultivoSi bien existen métodos nuevos de detección de BVDVel aislamiento

viral es el método más frecuentemente utilizado para el diagnóstico (Brock,1995)

El BVDVpuede cultivarse en diferentes tipos de cultivos celulares. Perodado que el título viral en comparación con otros virus es bajo y muy variablesegún los diferentes aislamientos, es importante lograr la optimización delsistema de cultivo de tejidos si se desea analizar numerosas muestras decampo.

La infección viral se realiza preferentemente en cultivo primario decélulas de riñón, comete nasal o testículo bovino (Edwards, 1990). El suerofetal bovino que se use como suplemento, debe estar libre de BVDVy deanticuerpos anti-BVDV.

Para el caso de animales con infección aguda, el virus se aíslaprincipalmente a partir de leucocitos de la “capa de blancos" de muestras desangre extraída durante el período ventana luego de 3 días y hasta 8-10 díaspostinfección. Los leucocitos son cocultivados con células susceptibles durantedos o más pasajes.

En cuanto a las infecciones persistentes el método de aislamiento viral apartir de muestras de suero es el recomendado ya que el nivel de viremia enlos API es generalmente alto. El aislamiento viral también deberá realizarse apartir de muestras pareadas de suero tomadas a los 30 días del pn'mermuestreo con el objeto de analizar la presencia de virus. Se detectará virus enambas muestras en los API, no así en los bovinos con infeción aguda en losque ya no se detectará virus a los 30 días del primer resultado positivo.

El test tiene limitaciones en el caso del análisis de animales jóvenesdado que los anticuerpos calostrales neutralizan al virus libre en el suerodurante un periodo desconocido razón por Io cual algunos laboratorios noanalizan muestras de animales menores de 6 meses de edad.

Para ensayos postmorten de aislamiento viralse analizarán muestras deórganos linfoideos.

Como las células infectadas con BVDVncp son indistinguibles de las noinfectadas, los cultivos celulares utilizados para el aislamiento viralnormalmente se fijan y se incuban con anticuerpos especificos marcados confluorocromo o con enzimas. Este procedimiento debe realizarse además en las

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células no infectadas en forma periódica para distinguir posiblescontaminaciones de los cultivos con BVDVadventicio.

A fin de aislar una cepa BVDVcp, los cultivos se observan diariamentepara visualizar el efecto citopático. Si está presente en bajo titulo, se podránobservar los foci de infección por microscopía de contraste de fase y si lascélulas se fijan en ese estadío y se analizan con anticuerpos específicosmarcados, se detectará antígeno viralen la periferia de los foci.

Además el BVDV citopatogénico puede detectarse porseroneutralización con sueros específicos. La neutralización cruzada de losvirus aislados con sueros contra diferentes cepas y/o con paneles de AcMos,permite demostrar las diferencias antigénicas entre ellos (Sandvik , 1999).

1.5.1.b. Detección de antígenos viralesLa detección de antígenos virales se realiza por inmunohistoquimica,

directamente en las células de una muestra proveniente del animal, o porensayos inmunoenzimáticos (ELISA: Enzime linked immuno assay) utilizandodirectamente muestras de plasma. sangre, suero o bien antígeno extraído deleucocitos, tejidos o sangre.

La disponibilidad de AcMos anti-BVDV permitió desarrollar una granvariedad de ELISAs de captura (agELISA) para la detección rápida de BVDV(Bottcher y col., 1993; Entrican y col., 1995; Fenton y col., 1991; Gottschalk ycol., 1992; Mignon y col., 1991; Saliki y col., 2000; Sandvik y col., 1995;Shannon y col., 1991). En estos agELlSA se utilizan los AcMos para captura ydetección de antígeno en combinación con sueros policlonales anti-BVDV.Enestos tests se reconoce la proteina antigénicamente conservada NSZ-3 por locual es posible detectar todas las cepas de BVDV.

La sencillez y rapidez del método conjuntamente con Ia no dependenciadel cultivo de células y la rapidez del método convirtió a estos agELlSA enherramientas muy útiles para el análisis de muestras numerosas de sueros.

1.5.1.c. Detección de ácido nucleico viralMuchas publicaciones describen el uso de la transcripción reversa (RT)

conjuntamente con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para ladetección del RNA de BVDV(Da Silva y col., 1995; Hamel y col.,1995; Letelliery col., 1999; Pellerin y col., 1994; Radwan y col., 1995; Schmitt, y col..1994). Lamayor sensibilidad epidemiológica se ha obtenido utilizando primersespecíficos para secuencias conservadas ubicadas en Ia región 5’ NTRy en elgen NS-3 de BVDV.

La RT-PCR permite además monitorear BVDVncp contaminantes en loscultivos celulares y en el suero fetal bovino utilizado como suplemento.

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El secuenciamiento del DNA obtenido por RT-PCR ha facilitado laclasificación virológica de los Pestivirus de rumiantes (Becher y col, 1999;Couvreur, 2002; Ridpath y col., 1994; Vilcek y col., 2001). Esta clasificación,coincide en general con Ia clasificación proveniente de estudios de lareactividad con AcMos pero permite una discriminación más sutil de los virusexaminados.

1.5.2 SerologiaLa mayoría de los estudios que evaluan la respuesta inmunológica a

BVDV lo hacen mediante la determinación de anticuerpos contra virusparcialmente purificado. Dichos anticuerpos pueden detectarse en el suero deanimales inmunocompetentes desde los tres meses de edad hasta varios añospost-infección luego de una infección aguda (Howard, 1990).

En ciertos casos el diagnóstico definitivo de BVDVresulta dificultoso y esútil realizar un muestreo serológico para estudiar el estado de infección envacas jóvenes luego de la desaparición de anticuerpos del calostro y antes dela vacunación. La detección de anticuerpos indica la presencia reciente o actualde BVDVcirculando.

Los anticuerpos especificos para BVDV pueden clasificarse en dosgrupos: 1) anticuerpos contra glicoproteínas (principalmente la glicoproteínaE2) que bloquean Ia infectividad o neutralizan al virus y 2) anticuerpos contraproteínas no estructurales (N82-3, NS-3).

En el primer caso los títulos neutralizantes de un animal infectado conuna cepa variará de acuerdo a Ia cepa utilizada en el ensayo.

La proteína no estructural NSZ-3 altamente inmunogénica no esglicosilada y es antigénicamente conservada entre todos los Pestivirus. Losanticuerpos contra NS2-3 no neutralizan a BVDV, pero pueden detectarsemediante otros tests serológicos como por ejemplo el ELISA y resultanimportantes para la serología de BVDVen general, pues detectan sueros deanimales infectados con diferentes cepas.

La detección de anticuerpos debe realizarse en muestras de suerospareadas provenientes del animal con la infección aguda y convalecientecolectadas con una diferencia de 30 dias de manera tal que permita verificar elaumento del titulo de anticuerpos durante la convalecencia (Sandvik, 1999).

En cuanto a la serología para animales persistentemente infectados, eltítqu de anticuerpos neutralizantes puede aumentar luego de una infecciónaguda con otra cepa, pero los animales no desarrollarán anticuerpos contra laproteína conservada NS-3. De ahí que en un rodeo con serología neutralizanteanti-BVDV, bovinos seronegativos para Ia proteína NS-3, constituyenpotenciales API siendo necesario confirmar dicho estado mediante la detecciónde antígeno en los mismos.

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1.5.2.a. Test de neutralización viral para detección de anticuerposLa neutralización viral es el método más comunmente utilizado para la

determinación de anticuerpos anti-BVDV.En este test, una cepa citopática de referencia es co-incubada con

diluciones seriadas del suero a analizar durante 1 hora a 37 °C. A continuación

se agregan células susceptibles y se realiza una incubación durante 4-5 diasaproximadamente (Edwards, 1990). Una vez transcurrido ese tiempo sedetermina la inhibicióndel efecto citopátíco mediante observación microscópicay/o por tinción de la monocapa con el colorante Cristal violeta.

No existe una cepa en particular que esté universalmente aceptada paraeste test pero las más utilizadas dentro de las citopáticas son NADL,Singer yOregon. También pueden utilizarse cepas no citopáticas y en ese caso lascélulas infectadas se revelan por la técnica de inmunoperoxidasa (IPA) o porinmunofluorescencia (IFA) con sueros policlonales de referencia anti-BVDV(Brock, 1995).

La técnica de seroneutralización presenta varias desventajas tales comoel requerimiento de una infraestructura adecuada para el cultivo de células, elmonitoreo constante de las células y sueros utilizados como suplemento delmedio de cultivopara detectar posibles contaminaciones adventicias, la demoraen obtención de los resultados, la preparación de stocks virales que en generalson de bajo título y la toxicidad de ciertos sueros para cultivo.

1.5.2.b. Ensayos enzimáticosEl ensayo de ELlSA para determinar actividad serológica anti-BVDVse

ha convertido en las últimas décadas en una de las principales técnicasdiagnósticas utilizadas en el laboratorio. Esto es debido a que no requieren deluso de cultivos celulares, pueden adaptarse facilmente al análisis de un grannúmero de muestras y los resultados de los tests pueden leerse en pocashoras.

De rutina se utilizan principalmente dos tipos de sistemas: en el llamadoELISA indirecto el antígeno se inmoviliza en la placa y "atrapa" a losanticuerpos específicos del suero incógnita detectándose luego la reacción conanticuerpos conjugados con enzima y cromógeno.

En el segundo sistema, llamado ELISAde competencia los anticuerposespecíficos para el virus presentes en la muestra a testear compiten por elantígeno con anticuerpos especificos conjugados y como resultado se obtieneuna menor señal para las muestras que contienen anticuerpos anti-BVDV.

La sensibilidad del ELISAestá determinada por la elección del antígenoviral. Dentro de la variedad de antígenos utilizados se encuentran: extracto decélulas infectadas tratadas con detergente, partículas virales purificadas,

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proteínas recombinantes producidas en bacterias o en células de insecto. Estosantígenos son inmovilizados en la placa por pegado directo o por unión aAcMos de captura (Cho y col., 1991; Chu y col., 1985, Howard y col., 1985;Juntti y col., 1987; Kramps y coI., 1999; Kwang y col., 1995; Lecomte y col..1990; Vanderheijden y col., 1993).

Los ELISAs han sido desarrollados en general para la detección deanticuerpos en suero, pero también existen tests que detectan anticuerpos enleche (Beaudeau y col., 2001; Kramps y col., 1999; Niskanen y col, 1991). Estaalternativa resulta interesante dado que permite la detección de anticuerpos enun muestreo general de tanques de leche previo al análisis de las muestrasindividuales.

Últimamente el diagnóstico por ELISA se ha focalizado en Ia detecciónde anticuerpos contra proteínas no estructurales y se han utilizando con muybuenos resultados antígenos recombinantes producidos en bacterias y encélulas de insecto. Aunque existe una correlación aceptable entre la técnica deseroneutralización y un ELISAque utiliza antígenos no estructurales de BVDV(Sandvik, 1999) es de esperar que un ELISAque utilice proteínas estructuralescomo la E2 refleje aún mejor la capacidad neutralizante de los suerosanalizados.

Para la detección de anticuerpos contra proteínas estructurales losELISAs comerciales y los descriptos en la bibliografia utilizan como fuente deantígeno extractos virales o virus purificado. Dado que la producción viral encultivo celular resulta en títulos bajos y que la purificación de BVDV esdificultosa, la cantidad y calidad de antígeno disponible para este tipo dediagnóstico serológico generalmente resulta limitada. Existen además otrosproblemas asociados a estos ELISAs, como ser los niveles de backgroundaltos y variables causados por contaminaciones en el antígeno o por lareactividad cruzada de las inmunoglobulinas conjugadas.

Por las razones antes mencionadas se estimó que un componenteestructural de BVDV expresado en un sistema recombinante y que puedaobtenerse fácilmente y sin necesidad de purificación podría ser de gran utilidaden el diagnóstico a través de técnicas de ELISA.

Con tal fin se expresó la proteína estructural E2 sin su regióntransmembrana (AE2) en un sistema recombinante de células de insecto, elsistema de Drosophila melanogaster. La ventaja de este sistema de expresiónsobre el de Baculovirus es que permite la obtención de líneas celularesestables que expresan constitutivamente la proteína recombinante bajo unasimple inducción con 804Cu. Es un sistema más simple dado que únicamenterequiere el mantenimiento de la línea celular (y no de un virus conjuntamente) yademás las células son más resistentes que las de Spodoptera Io que facilita

43

INTR()DII( ‘(‘IÓN

su manejo en la disgregación mecánica para la amplificación de los cultivos yen lo que respecta al cultivoen sistemas con agitación.

Ya que la proteína E2 truncada expresada en este sistema es liberada alsobrenadante celular debido a la ausencia de la secuencia de anclaje amembranas, se especuló con que la utilizaciónde un medio de cultivosin sueropermitiría obtenerla en forma relativamente simple y con baja concentración deproteinas contaminantes.

En este trabajo de tesis se estudió la utilización de esta proteínarecombinante como antígeno en un sistema de ELISA para el análisis desueros bovinos. En el ELISA estudiado la AE2 es capturada en la placamediante un anticuerpo monoclonal anti-E2, cuya producción, clonaje ycaracterización constituye también parte de este trabajo de Tesis.

1.5.3. Otros tests serológicosMuchos tests han sido adaptados a la serologia de BVDV.incluyendo la

inmunodifusión en geles de agar, fijación de complemento,inmunofluorescencia indirecta y Western blotting.

La inmunodifusión en agar detecta primariamente anticuerpos contra laN82-3 pero como la sensibilidad analítica es baja, se comporta mejor como unensayo simple que para muestreo (Edwards, 1990).

De manera similar Ia sensibilidad analítica de la fijación de complementono es muy alta, pero dado que los anticuerpos detectados en este ensayoaparecen y declinan antes que los anticuerpos neutralizantes o que losprecipitantes, pueden utilizarse para la detección temprana en animales queseroconvierten (Gutekunst y Malmquist, 1964).

Para el test de inmunofluorescencia indirecto, las células infectadas conBVDVse fijan en portaobjetos para microscopía y se utilizan como antígeno deigual modo que en un ELISA. Esta metodología resulta impráctica cuando hayque analizar muchas muestras. De todos modos constituye un métodoalternativo para analizar sueros citotóxicos o que dan altos niveles debackground por ELISA.

El Western blotting como el ELISA provee información de laespecificidad molecular de los anticuerpos aunque también resulta pocopráctico para analizar muchas muestras.

1.6. Inmunología de BVDV

Luego de una infección aguda con BVDV se genera una respuestadependiente de células B y T .

Se ha descripto que luego de Ia infección con BVDVse puede recuperarvirus no más allá de 3 a 10 días post-infección y si bien no hay anticuerpos

44

INTR()Dl/( ‘('IÓN

detectables en ese momento, la respuesta de anticuerpos continúa en aumentoen ausencia aparente de virus durante 10 a 11 semanas. La explicación podríaser que el virus no infeccioso (antígeno viral) es presentado continuamente alas células inmunes durante esas 10-11 semanas y que el virus infeccioso es“secuestrado” en los tejidos linfoideos .

Luego de la infección o vacunación, los bovinos desarrollan anticuerposcontra las tres proteinas de envoltura Erns, E1, E2 y contra la proteína noestructural N82-3 (Bolin, 1993)

Los anticuerpos neutralizantes sistémicos parecen estar involucrados enla prevención de infecciones postnatales. Howard y col. (1989) encontraroncorrelación entre los altos títulos de anticuerpos adquiridos en forma pasiva y laausencia de virus en nasofaringe y la ausencia de viremia luego de lainoculación intranasal con BVDVsalvaje. También se observó asociación entreprotección a la dispersión sistémica de BVDV y el título neutralizante enanimales vacunados con vacunas a subunidad (Boliny Ridpath. 1996).

Es claro que los procesos inmunológicos que actúan contra infeccionescongénitas y postnatales son diferentes. Existen hallazgos contradictorios encuanto a la asociación entre titulos neutralizantes y protección a infeccionescongénitas, la mayoría de los estudios indican que no existe relación entreambos factores (van Oirschot, 1999) .

Por otra parte existen evidencias que sugieren que para resolver unainfección con BVDVes necesaria una inmunidad mediada por células ya quelos anticuerpos solos no eliminan una infección persistente y que la depleciónde linfocitos T CD4+ produce una duración más prolongada de la infecciónaguda (Howard y co|., 1989; 1992). Además las infecciones primarias conBVDVcp y BVDVncp inducen una fuerte respuesta de linfocitos T CD4+ quereconoce epitopes de proteínas estructurales (Erns, E2 y C) y no estructurales(N82-3, Npro) en modelos in vitro (Collen y Morrison, 2000).

La inmunización con virus vivo desarrolla anticuerpos contra diferentesproteínas virales siendo las proteínas inmunodominantes E2 y N82-3, larespuesta a NSZ-3 precede a la de la E2, principal blanco de los anticuerposneutralizantes. La respuesta de los anticuerpos a las proteínas de BVDVinactivado son inmunodominantes hacia E2 ya que las vacunas muertasconvencionales no poseen la proteína NSZ-3. Esta característica permitiríadiferenciar mediante serologia a los animales vacunados de los infectados.

Por otro lado se inducen además anticuerpos contra Ems y E1 noneutralizantes, por lo cual no serían componentes importantes en losmecanismos de defensa humoral.

Se acepta en general que los animales responden a infeccionesnaturales o inoculación con virus atenuado con una inmunidad larga mediadapor células aunque no se conoce la importancia relativa de esta respuesta.

45

lNTR()l)l/(‘(‘lÓN

Se considera que la producción de anticuerpos neutralizantes en unanimal seronegativo es un fuerte indicador de que ha existido una respuestainmune.

Para la inducción de la respuesta celular anti-BVDVes necesario el virusvivo, por lo tanto las respuestas mediadas por células serían importantes encontrolar las infecciones primarias con BVDV.

En consecuencia el uso de vacunas vivas o vacunas recombinantes

incluidas en un vector viral capaz de replicar e inducir la inmunidad mediadapor células sería útil para inmunizar contra el virus.

Si bien las vacunas que utilizan BVDV atenuado en virulencia soninmunógenos eficientes, presentan al mismo tiempo problemas de bioseguridadremarcable. Antígenos recombinantes de E2 asociados a vectores como elVSVpodrían ofrecer una buena alternativa en este aspecto.

2. OBJETIVOS

El objetivogeneral de este trabajo de Tesis es estudiar Ia estructura y analizarel comportamiento inmunológico de una glicoproteína E2 recombinante (rE2)del Virus de la diarrea viral bovina (BVDV),específicamente:

1- Analizar Ia estructura y distribución subcelular de la rE2 expresada encélulas eucariotas tanto en sus formas no deletada como en la deletada en suC-terrninal.

2. Analizar la capacidad inmunogénica anti-BVDVde rE2 expresada en célulaseucarióticas y utilizada como antígeno no replicativo en diversos huéspedes(por ejemplo ratones, conejos y bovinos).

3. Incorporar a rE2 dentro de un sistema replicativo (por ejemplo el del Virus dela estomatitis vesicular recombinante) y analizar su capacidad inmunogénicaanti-BVDVen un modelo murino (replicativo).

4. Estudiar el potencial de rE2 como antígeno de diagnóstico y diseñar un testde ELISApara la detección de anticuerpos anti-BVDVen sueros bovinos.

47

MATFRIAI Fc y MÉTODOS

3. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1. Clonado del gen E2

Los tratamientos con enzimas de restricción y el clonado en losplásmidos se realizaron de acuerdo a Sambrook y col. (1989).

El plásmido pss-E2 se construyó por Iigación del fragmento ss-E2(secuencia señal de la glicoproteina G de VSV-glicoproteina E2 de BVDV)en

los sitios BamH I/Xba l del plásmido pCDNA 3.1 (+) (Invitrogen).

EI fragmento ss-E2 se amplificó a partir del plásmido pGEMgp53(Vassilev y Donis, datos no publicados) que contiene el gen E2 de la cepaSinger de BVDV(nucleótidos 2462 a 3582 -numerado de acuerdo a la cepaBVDV NADL, Genbank M31182, Collett y col., 1988-) por medio de dos

reacciones de PCR sucesivas (Figs. 13 y 14).

Las reacciones de PCR se realizaron en un volumen final de 80 pl con

0,02 mmoles de dNTP, 5,6 mM de CIMg, 8 pl de buffer 10x para Taq

Polimerase y 2,5 U de Taq polimerase (todos reactivos GIBCO) y 100 pmolesde cada uno de los primers. Las reacciones se realizaron en 25 ciclos de 94°C,37°C y 72°C. En la primera reacción de PCR se utilizó para el extremo 5' elprimer A de secuencia complementaria a los aa número 9 a 16 de Ia secuenciaseñal de la glicoproteina G de VSV (ss-VSVG) unida en marco de lectura conlas primeras 24 bases del gen E2. Para el extremo 3' se utilizóel primer B desecuencia complementaria a los últimos nucleótidos del gen E2 (3563-3582)seguida por la secuencias de corte para la enzima Nhe l y Xba l.

A partir de una alícuota equivalente a 1:100 del producto inicial dereacción se realizó una segunda reacción de PCR con el primer B y con elprimer C complementario a los primeros 15 aa de la ss-VSVG y con el sitioBamH I en el extremo 5' seguido por un sitio Nhu I.

48

MATFRIÁI FÑ'YMÉTODOS

Fig. 13: Estrategia de clonado del gen E2 con la secuencia señal del gen Gde VSV.

Primer round de PCR:Primer B

5' ‘— Xbala 3PrimerA E2 (nt 2462 a 3582)

s-VSVG

Segundo round de PCR:Primer B4..­

/ I E2Primer Css-VSVG

BamHl

Gen híbrido obtenido

mm. ss-VSVG E2 Pm,

Los productos de PCR fueron purificaros por columnas (Promega) segúnlas instrucciones del fabricante e incubados con las enzimas de restricción

BamH i y Xba I antes de realizar la Iigación en el pcDNA1.3.

Para amplificar el fragmento del gen EZ sin la secuencia señal de VSV-G seutilizaron los primers B y D, este último con el sitio BamH I seguido por un

codón ATG y las primeras 24 bases del extremo 5' del gen E2 que codificandesde el aa 1 (Asp) a 8 (Phe) de la glicoproteína E2.

El fragmento obtenido fue clonado en forma subsecuente en el plásmidopcDNA3.1 en los sitios BamH Iy Xba I para generar el plásmido pr2.

A continuación se indican las secuencias de los primers en las que elasterisco marca con el comienzo del gen E2 y las secuencias en minúscula yletra pequeña corresponden los sitios de corte para las enzimas indicadas:Primer A:5'CTTGCCGTTTCGCCCATTTTGGGC'GACTTGCATTGCAAACCTGAATTC

[2462-2485]Primer B:

Xbal Nhel

5'ATGAGTTAtctagaGCTAGCTATTA'CCTGAGGCCTTCTGTTCTGA

{3582-3563}Primer C:

BamHI Nhul

5'AGngatccACGCGTfiQTTGTCTTATCTAATCTTTGCACTTGCCGTTTCGCCCATTTTG

49

MATERIALESYMÉTODOS

Primer D:BamHI

5’GCTngatccATG*GACTTGCATTGCAAACCTGAATI'C[2462-2485]

Los primers A y C en su conjunto permitieron incorporar a la secuenciaE2 la secuencia entera del péptido señal ss-VSVG siguiente:

5’ATGTTGTCTTATCTAATCTTTGCACTTGCCGTTTCGCCCATTTTGGGC

El mismo gen E2 fue clonado sin su extremo carboxilo terminal (región

hidrofóbica) en el pcDNA 3.1 para generar el plásmido pss-AE2 utilizando el primer

C y el reverso E complementario al extremo carboxilo del gen E2 [bases 3490 a3470] y con el sitio de corte para la enzima Xba I . La secuencia del primer E seindica a continuación:

Xbal

5‘ ATGAGTTActagaTATTACTGAGGCCGGGGTTTTCATTAGGGC

[3490-3470]

Fig. 14: Construcción del fragmento híbrido ss-E2 por PCR

123El fragmento ss-E2 (marcado con una flecha) se construyó por dos rondas suscesivasde PCR a partir del plásmido pGEMgp53. Los productos obtenidos en cada ronda fueronresueltos electroforéticamente en un gel de agarosa 1%. En primer lugar fue generadoun fragmento hibrido, con las últimas 24 bases de la secuencia señal de VSV-G

upstream de la secuencia E2 de BVDV,a partir de aproximadamente 2 pg del plásmidopGEMgp53 y con los primers A y B obteniéndose un fragmento de aproximadamente1200 pb (calle 2). El producto del primer round de PCR se usó como templado en unasegunda reacción y los primers C y B para agregarle la secuencia señal completa deVSV-G y obteniéndose un fragmento con movilidad ligeramente menor que el anterior ydel tamaño esperado de 1210 pb señalado como ss-E2 (calle 3). La calle 1 correspondea los marcadores de PM, las barras indican los tamaños de 2 Kb; 1,6 Kb y 1 Kb.

Se purificó el producto del 2° round de PCR, se cortó con las enzimasde restricción BamH I y Xba l y se ligó a pcDNA 3.1 (Fig. 15) entre los mismos

sitios bajo el promotor de la polimerasa del bacteriofago T7 para generar elplásmido pss-E2 según se indicó anteriormente.

50

MATFRÍAr FV YMÉTODOS

Fig. 15: Esquema del plásmido para el clonado del gen ss-E2

pcDNA3.1 (+/—) L,- 5.4 kb m9

3'x.

oo

3.2. Cultivos celulares

Los cultivos primarios de células de testículo fetal bovino (TFB)utilizados fueron provistas por el Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria(INTA) y las líneas celulares MDBK (NBL-1) de riñón bovino, BHK-21 de riñón

de hamster bebé, CV1 de riñón de mono verde africano y las líneas de mielomaSP2/0, fueron adquiridas en la American Type Culture Collection (ATCC).

La línea de insecto Spodoptera frugiperda Sf21 fue cedida gentilmentepor el Dr Baralle (Trieste , Italia) y la línea Drosophila melanogaster S2 provistaen el kit de transfección Drosophi/a Expresión System Versión B for the StableExpresión and Purification of Hetero/ogous Proteins in Schneider 2 Cells(Invitrogen).

En el caso de las líneas celulares MDBKy BHK-21 se usó el medio decultivo Glasgow Minimum Essential Medium (G-MEM, SIGMA) suplementado

con 2,9 g/I de caldo triptosa fosfato, 10 % de suero fetal bovino irradiado(SFBi), ácido carbónico al 7,5% hasta alcanzar pH 7,4, 200 103U/Ide Penicilina

y 50 U/I de Estreptomicina. El medio para la línea celular BHK-21 sesuplemento además con 10 mI/lde aminoácidos no esenciales de composición[L-Alanina HCI (0,890 g/I), L-Asparragina monohidrato (1,5 g/I), L-Aspártico

1,339/I), Acido glutámico (1,474 g/I), Glicina (0,750 g/I), L-prolina (1,15 g/I), L­

Serina 1,05 g/I] y mientras que el medio para las células CV1 se suplementócon 8 mM de Glutamina. Las células SP2/0 se cultivaron a 37°C en medio

51

MA TFRIA I ¡«‘S‘Y MÉTODOS

Iscove’s modified Dulbecco's Medium (Hybrimax, SIGMA) adicionado con 8 mM

glutamina, 600 103 U/I de Penicilina, 150 U/I Estreptomicina, 4,5 g/l de

bicarbonato de sodio, 25 mM de N-2 hydroxyyethylpiperazine-N­

2ethanesulfonicacid (Hepes) y 20% de SFB a 37°C.Cuando se realizaron infecciones virales los medios fueron

suplementados con 20 mMHepes.Para los cultivos primarios de TFB el medio usado fue Minimum

Essential Medium con sales de Earle’s. aa no esenciales y glutamina (GIBCO),suplementado con Hepes. ácido carbónico y antibiótico como se describióanteriormente.

Las células de TFB se mantuvieron entre los pasajes 1 y 6 ya quepasados estos la viabilidad disminuyó significativamente; las células MBDKyBHK-21 se mantuvieron entre los pasajes 6 y 60.

Los cultivos celulares fueron mantenidos en botellas de vidrio o de

poliestireno (NUNC o GREINER). Los cultivos se realizaron en sistemaestacionario y rotativo.

La metodología utilizada para el mantenimiento de las células BHK-21,MDBK, TFB y CV1 fue la siguiente: cuando la monocapa celular alcanzóconfluencia total, las células se desprendieron con tripsina 0,05% en soluciónsalina de fosfatos -PBS- (137,5 mM NaCI; 2,5 mM KCI, 8,5 mM NazH P04 pH

7,2), y 0,02 N de etilendiamino tetraacetato de sodio (EDTA)salvo en el casode Ia línea celular BHK-21 donde se usó una solución de tripsina al 0,25% enPBS sin el agregado de EDTA.

Una vez tripsinizadas, las células se resuspendieron en un pequeñovolumen de medio de crecimiento y se trasvasaron a razón de 1:2 a 1:5 delvolumen a un recipiente de igual superficie con medio de crecimiento nuevopara ser incubadas a 37°C.

En el caso de las células de mieloma la amplificación se realizó pordispersión mecánica y dilución 1:4 en medio de cultivo indicado previamente.

Stocks de células se mantuvieron en Nitrógeno líquido (—196°C).El

procedimiento general seguido para el congelamiento fue disgregar lamonocapa celular de manera enzimática con tripsina o mecánica segúncorrespondiese, centrifugar a 1100 rpm durante 10 minutos y resuspender lascélulas en el medio de congelamiento (50% de medio de crecimiento, 40% desuero fetal bovino irradiado, 10% dimetilsulfóxido —DMSO-).Luego se fraccionóa razón de 1 ml de la resuspensión celular en criotubos (Nalgene) y secolocaron en un recipiente que permitiera el congelamiento lento a —70°C.A las

52

MATFRMI Fc y MÉTODOS

48 hs posteriores al congelamiento se conservaron en un tanque de Nitrógenolíquido.

El proceso de descongelamiento celular se realizó en baño de 37°C demanera rápida. Las células descongeladas se resuspendieron en medio decrecimiento en el recipiente para cultivo y se incubaron durante 2 horas 37°C.Pasado ese tiempo se descartó el sobrenadante , las células pegadas a lasuperficie se lavaron con medio completo y posteriormente se incubaron enmedio completo fresco hasta alcanzar Ia confluencia a 37°C.

Con respecto a las células de insecto, Ia línea Sf21 se cultivó en mediode cultivo TC-100 Insect Médium (GIBCO) suplementado conantibiótico/antimicótico (GIBCO) y 10% SFBi. Se cultivaron a 28°C en sistema

estacionario o en agitación continua en frasco “spinner” (spinner flask). Loscultivos en sistema estacionario se amplificaron cuando las células llegaron aconfluencia y en el caso de cultivoen agitación cuando la concentración celularfue de 106células /ml.

Para amplificar los cultivos celulares se partió de una concentracióninicialde 105células/ml . Para los cultivos estacionarios se utilizaron a razón de

5 ml de cultivo/ 25 cm2 de superficie y para los cultivos en suspensión serealizaron a razón de 100 ml en un “spinner” de 500 ml de volumen.

Las células de Droshophila melanogaster línea Schneider 2 (82) secultivaron en medio Schneider (GIBCO) con antibiótico/antimicótico (GIBCO).Los cultivos se mantuvieron en fase estacionaria a 25°C. Las células se

sembraron semanalmente a razón de 2 106células/ml y se amplificaron cuandoalcanzaron a 2 107células/ml. La amplificación celular se realizó por dispersiónmecánica en diluciones de 1:10.

Los stocks celulares de células de insecto se mantuvieron congeladosen nitrógeno líquido, las células se congelaron en SFBi con 10% deDimetilsulfóxido. Para el proceso de congelamiento se procedió como fuepreviamente descripto.

3.3. Infección de cultivos y preparación de stock viral

3.3.1. Cepas viralesSe utilizaron los siguientes virus:Virus de la diarrea viral bovina (BVDV) cepas: Singer (origen INTA),

NADL y Oregon (provisto por Dr. Rubén Donis R., University of Nebraska,

USA).

MATFRMI FK‘y MÉTODOS

Virus Vaccinia recombinante Vg-6,2 (vTF7) con el gen de la polimerasa

del bacteriófago T7 (provisto por Dr. Bernard Moss).

VSV-Indiana San Juan (provisto por Dr. Wagner, USA).

3.3.2. Producción de Vaccinia vTF7

Se propagó en células CV1 en G-MEM suplementado con 10% SFBi(Grigera y col., 1992).

3.3.3. Producción de BVDV

Las infecciones se realizaron sobre monocapas celulares de TFB o deMDBKsaturadas al 80% en sistema estático o “roller”.

Las monocapas celulares se lavaron con medio de cultivo sinsuplemento de suero, se infectaron con multiplicidadde infección (moi) de 0,1-1UFP/célula y a razón de 1 mI/25 crn2 de monocapa celular en cultivoestacionario y de 10 mI/750 cm2 en sistema "roller". El inóculo se dejó

adsorbiendo a la monocapa durante 1 hora a 37°C. Posteriormente se agregómedio de infección (medio de crecimiento suplementado con 1% de SFBi envez de 10%) utilizando 5ml por cada 25cm2 de superficie en sistemaestacionario y 30ml por cada 750cm2 en “roller”. y se incubaron a 37°C enestufa gaseada con 5% de C02 (estufa de C02), mientras que las infeccionesen sistema “roller".se realizaron directamente en botellas cerradas en estufa a

37°C y en rotación. En los 2 casos se realizaron paralelamente cultivos controlsin infectar. Las monocapas celulares se observaron periódicamente almicroscopio óptico para ver el efecto citopático.

Una vez detectado un 80% de efecto citopático en Ia monocapa celular,células junto con el sobrenadante de la infección fueron sometidos a tres ciclosde congelamiento y descongelamiento a -70°C y posterior clarificación a 3.000rpm durante 15 minutos en centrífuga Sorvall Instruments DU PONT ModelRCSC.

El sobrenadante clarificado resultante fue fraccionado y conservado a -70°Ccomo stock viral.

3.3.4. Infecciones con VSV

Para obtener stocks virales de VSV se infectaron monocapas celularesde BHK-21 con 0,5 UFP/célula. La adsorción se realizó durante 1 hora a 37°C,

a continuación se descartó el sobrenadante y se adicionó medio fresco deinfección suplementado con 5% SFB en un volumen final de 10 ml por cada 25

54

MATERIALES YMÉTODOS

cm2 de superficie de monocapa en sistema estacionario. La incubación serealizó a 37°C en estufa de C02.

El sobrenadante se cosechó al observar 100% de efecto citopático(aproximadamente 24 hs), y se centrifugó a 3.000 rpm durante 15 minutos.

3.4. Expresión transiente en células CV1,marcación metabólica

El sistema que utiliza virus Vaccinia recombinante que expresa la

polimerasa del bacteriofago T7 provee las bases para Ia expresión de genes que

se encuentren bajo el promotor T7, en células de mamíferos (Fuerst y col, 1986).Este sistema es aplicado para la producción eficiente de proteínas, que paratener actividad biológica, precisan de las modificaciones post-traduccionales

específicas que tienen lugar en células de mamíferos. Otros sistemaseucan'óticos, si bien poseen los mecanismos para realizar las modificaciones

habituales de las células eucan'otas, suelen glicosilar las proteínas de maneradiferente a las células de mamíferos, Io que puede interferir en determinadas

ocasiones, con la actividad biológica.Para realizar la transfección se infectaron células CV1 en monocapa al

80% de confluencia en pocillos de 3,5 cm de diámetro (TC-plate 6 well, Greiner

bio-one CELLSTAR) -aproximadamente 3 x 105 células- con el virusrecombinante Vaccinia TF7 a una moi de 5 UFP/ célula diluido en medio de

infección sin suero , previo lavado con 1 ml de G-MEMy se incubaron durante 45

minutos a 37°C en estufa gaseada de C02.Paralelamente se incubaron por separado en tubos de poliestireno 0.5 mI

de G-MEM sin antibiótico con 10 pg del plásmido a transfectar y en otro tubo 0,5

ml de G-MEM sin antibiótico con 15 pl de lipofectina [Lipofectin reagent (GIBCO)]

durante 20 minutos a temperatura ambiente (TA).

Luego de la adsorción del virus, las células se Iavaron con G-MEM sin

antibiótico y se les agregó la mezcla de plásmido con la lipofectina y se incubó a

37°C durante 3,5 horas. Se descartó el sobrenadante, la monocapa se lavó conG-MEM y se incubó con 1 ml de G-MEM 15% SFBi durante 16 hs. En el caso de

realizarse marcación, luego del lavado de la monocapa con G-MEM se le

agregaron 0.8 ml de una mezcla de un medio deficiente en metionina

[Dulbecco's modified Eagle's Médium (D-MoEM) (SIGMA)] y G-MEM (en la

proporción 9:1) con 15% de SFBi. Se incubó durante 2 horas a 37°C y luego se

completó a 1.5 ml con el mismo medio suplementado con 50 pCÍ de 358­

metionina y antibiótico (200 U/ ml de Penicilina, 50 U/ mI Estreptomicina) y se

incubó a 37° C en estufa gaseada de C02 durante 16 hs.55

MATFRIAI Fc YMÉTODOS

Para estudiar la glicosilación del producto recombinante las célulastransfectadas fueron incubadas con G-MEM suplementado con 25 uCi/ml de3H-manosa durante 16 hs a 37°C. En los casos indicados se agregó 1 ug/ml detunicamicina (TM) (SiGMA)en el medio de incubación (Grigera y col., 1991).

Luego de la incubación se colectó el sobrenadante y se lavó lamonocapa con PBS frio, las células se cosecharon en igual buffercon ayuda descraper, se transfirieron a un eppendorf y se clarificaron en microcentrifuga(MicroCentaur, Sanyo) 10 minutos a 3.000 rpm. Las células se resuspendieronen buffer de lisis "HO" (50 mM Tris-HCI pH 7.8, 100 mM NaCI, 5 mM EDTA, 1%

Nonidet P-40 (NP-40), 0,5% deoxicolato de sodio, 2 umM Phenylmethyl

sulfonylfluon'de (PMSF-SIGMA) en frío a una proporción de 0,5-1 ml por pocillo

y se clarificó por centrifugación a 13.000 rpm durante 10 min. a 4°C en tubosEppendorf. Se descartó el pellet y se conservó el sobrenadante alicuotado a —70°C hasta su utilización.

3.5. Detección con anticuerpos monoclonales

Para detectar la expresión de la glicoproteína recombinante E2 seutilizaron los sobrenadantes de hibridomas de anticuerpos monoclonales(AcMo) 10 y 12 en forma conjunta (AcMo 10/12) o el AcMo 6011 en forma de

líquido ascitjco suministrados gentimente por el Dr. Rubén Donis de laUniversity of Nebraska, USA.

Los anticuerpos fueron seleccionados por su capacidad parainmunoprecipitar la glicoproteína E2 de Iisados de células infectadas con BVDVy por su capacidad para detectar el antígeno en monocapas MDBKinfectadascon BVDV por inmunofluorescencia indirecta (Donis y col.. 1988). Estosmonoclonales mostraron una reducción variable pero importante en sucapacidad para unirse al antígeno desnaturalizado por SDS. El uso de ladetección altamente sensible de la técnica de quimioluminiscencia (ECL,Amershan) permitió utilizar el pool 10/12 altamente específico con excelenterelación señal ruido en ensayos de Western blotting.

3.6. Inmunoprecipitación

La inmunoprecipitación de los componentes proteicos de lasinfecciones o de las transfecciones se llevó a cabo luego de la lisis celular enbuffer HO y de la clarificación de la muestra a 13.000 rpm en microcentrifuga

56

MATFRIA I Fw YMÉTODOS

durante 15 minutos. Los fluidos citoplasmáticos se diluyeron en fraccionesidénticas luego de lo cual se incubaron con el anticuerpo específico.

Las reacciones de inmunoprecipitación se realizaron en un volumenfinal de 0,5 ml a 1 ml, utilizándose aproximadamente una tercera parte delsobrenadante total de lisis de un pocillode 3,5 cm de diámetro. Posteriormentese agregó el antisuero específico en la dilución adecuada (por ejemplo AcMo10/12 en la dilución 1:3 y AcMo 6D11 en la dilución 1:50 o suero de conejo anti­

p80 1:100 (gentileza del Dr. Marc Collett, Viropharma Company, USA; suerobovino comercial VMRD 12500, suero bovino anti-Singer 1:100 (gentiliza de

Rubén Donis) se incubó durante 2 horas a 4°C. Luego se agregó Protein Asepharose (Protein A sepharose SIGMA)al 0,5% de concentración final y seincubó durante 1 hora a 4 °C en rotación (el stock de Protein A sepharose se

preparó al 10% en 20 mM buffer Tris, 100 mM NaCI, 1 mM EDTA, 1-5% BSA,

0,1% NP 40 con dos lavados previos en el mismo buffer sin BSA).A continuación se centrifugó la mezcla de reacción a 13.000 rpm en

microcentrífuga 3 minutos y el pellet de Protein A sepharose se lavó 3 vecescon igual volumen de buffer RIPA (idem buffer de lisis con agregado de SDS0,1 % final ). Se conservó el precipitado de Protein A sepharose.

El precipitado se resuspendió en buffer muestra "BM"(80 mM Tris 1MpH 6,8, 10% glicerol, 2% SDS) con o sin agregado de 1% de B-mercaptoetanol(MSH) según se indique, se hirvió durante 4 minutos, se centrifugó 1 min. a1.0000 rpm en microcentrífuga y el sobrenadante se analizó por electroforesisen geles de poliacrilamida 10% o 12%. La electroforesis se realizó en un

sistema de minigeles (Mini-Protean Il BIO-RAD) a 100 volts en bufferTris/glicina (25 mM Trizma base pH 8,3, 192 mM glicina) con 0,1% SDS. En lasmezclas de inmunoprecipitación no se usó SDS a fin de maximizar lareactividad de los epitopes conformacionales.

Luego de la corrida, el gel se incubó durante 30 minutos en una soluciónde isopropanolzacéticozagua (25:10:65) y luego se secó al vacío.

Se expuso con películas KODAK X-OMATAR-5 a -70°C hasta surevelado con revelador y fijador (KODAK).

3.7. Western blotting

Las infecciones de monocapas celulares con BVDV se realizaron arazón de 10 UFP/célula y a las 24 hs post-infección las monocapas fueron

lavadas 3 veces con PBS y resuspendidas en “BM”a razón de 100 ul por cada25 crn2 de superficie. En el caso de las transfecciones los pellets celulares

57

MATFPHI FC YMÉTODOS

congelados fueron resuspendidos a razón de 60 pl de "BM"por pocillo de 3,5cm de diámetro.

En ambos casos las muestras se hirvieron posteriormente a 100°C y secentrifugaron a 10.000 rpm durante 10 minutos en microcentrífuga. Elsobrenadante recuperado se corrió electroforéticamente y las proteinas del gelse electrotransfirieron a una membrana de nitrocelulosa (NitroBind, msi)durante 1 hora 30 minutos a 75 Volts en buffer Tris/Glycina 20% de metanolsegún Sambrook y col.,1989.

Para el control de transferencia se tiñó la membrana con Rojo PonceauS (3-hydroxy-4-[2-sulfo-4(suIfo-phenylazo)phenylazo)-2,7-naphtalene disulfonicacid) preparado según Sambrook y col. Posteriormente se Iavó la membranacon PBS a fin de desteñirla y se incubó con la solución de bloqueo (BSA 3%,Azida sódica 0,02% en PBS) durante 30' a 37°C o durante toda la noche a 4°C.

La membrana bloqueada se incubó con una dilución apropiada del AcMo10/12 BSA 3%. Tween 20 0,1% en PBS) durante 5 horas a TA. A continuaciónse realizaron 5 lavados de 5 minutos cada uno con Tween 20 0,1% en PBS yse incubó con suero anti-ratón conjugado con peroxidasa de rábano (anti­mouse peroxidase HRP, JACKSON) diluido 1:1.500 en buffer de dilucióndurante 1 hora a 37°C. Se realizaron 5 lavados de 5 minutos cada uno con

Tween 20 0,1% en PBS y luego se reveló por quimioluminiscencia con reactivocomercial (Amershan, ECL) según las instrucciones del fabricante y se expusocon película KodaK.

En los casos indicados la membrana, bloqueada con 2% lechedescremada (MOLICO) en PBS, se reveló con suero policlonal bovino anti­BVDV comercial (BVD VIRUS -bovine- ANTISERUM, VMRD, Inc.) en la

dilución 1:250 en PBS y luego de 5 lavados con PBS de 5 min. cada uno, seincubó con una dilución 1:1000 de anticuerpo anti-bovino conjugado conperoxidasa (Jackson). Como sustrato se usó 4-Cloro-1-naftol. (15 mg de 4­chloro-l-naphtol disueltos en 5 ml de metanol y diluídos 1:5 con PBS) con

agregado de 20 pl de H202 por cada 5 ml. La reacción de color se detuvo conlavados en agua destilada.

3.8. Biotinilización

A las 8.5 hs post transfección las monocapas celulares se Iavaron dosveces con PBS, 3 veces con 0,04 M buffer bicarbonato y se incubaron durante

58

MATFRMI F9 YMÉTODOS

10 minutos a 4°C con Biotinamidocaproate N-hydroxysuccinimide ester indimethylformamide (Amersham) 1:25 con rotación suave según la técnica deHsu y Chao, 1993.

El reactivo de marcado se eliminó con PBS, las células se

resuspendieron en buffer HO y posteriormente se inmunoprecipitaron como fuedescripto anteriormente (3.6).

El material innmunoprecipitado se resuspendió en BM con o sin B­mercaptoetanol y se analizó en un gel de poliacrilamida y se transfirió a papelde nitrocelulosa. Para el revelado se utilizó streptavidina conjugada conperoxidasa de rábano (HRP-streptavidin, JACKSON) 1:1500 en buffer PBS y elsistema de detección de quimioluminiscencia (ECL,Amersham).

3.9. Inmunofluorescencia

Las células se cultivaron en multipocillos de 8 wells (Nalge-Nunc, Lab­Teck chamber slide with cover) hasta un 60-70% de confluencia.Se utilizaron células CV1 transfectadas con pss-E2, pss-AE2 y p-fE2; célulasMDBKinfectadas con BVDVa moi de 0,1 UFP/célula y células BHK infectadas

con VSV a moi de 1 y células de Spodoptera frugiperda infectadas conBaculovirus a moi = 0,1 UFP/célula.

En todos los casos luego de la incubación las monocapas fueron Iavadas4 veces con 0,5 ml de PBS durante 5 minutos y se fijaron con formaldehído 3%en PBS durante 20 minutos a TA a las 16 hs post infección en el caso de lasinfecciones con VSV y a las 48 hs para BVDVy Baculovirus; las transfeccionesse fijaron a las 16 horas post- transfección.

Las monocapas fijadas se lavaron 3 veces con PBS y parapermeabilizarlas se trataron con Tritón X-100 0,5% en PBS durante 3' a TA.Las monocapas permeabilizadas o sin permeabilizar se bloquearon con BSA3% en PBS durante 1 hora a TA, luego se incubaron con una diluciónapropiada del suero específico en la solución de bloqueo (por ej. 1:3 para elAcMo 10/12 y 1:100 para el suero de conejo anti-E2 y anti-G y 1:200 parasueros bovinos) durante 16-20 hs a 4°C o 2 h a TA.

Se lavó el anticuerpo extensivamente con PBS y las monocapas seincubaron con anticuerpos anti-ratón o anti-bovino o anti-conejofluoresceinados (Fluorescein (FlTC)-conjugated AffiniPure anti-Mouse o anti­bovine o anti rabbit Jackson) diluidos 1:200 en buffer de bloqueo durante 1 horaa 37°C en la oscuridad. Las monocapas se lavaron nuevamente 4 veces conPBS, y se montaron con glicerol al 50% en PBS conjuntamente con 4'—6—

59

MATFRIAI Fc YMÉTODOS

Diamidino-2-phenylindole (DAPI) cuando se indique. Este reactivo formacomplejos fluorescentes con DNA doble cadena permitiendo identificar losnúcleos celulares. Posteriormente la observación de la inmunofluorescencia se

realizó en microscopio de fluorescencia Zeiss.

3.10. Marcación metabólica de BVDVMonocapas semiconfluentes de TFB o MDBKen placas de 6 pocillos

(3,5 cm de diámetro) se infectaron con BVDVa moi de 10 UFP/cél en medio deinfección sin suero.

El virus se dejó adsorbiendo durante 1 hora a 37°C se descartó el medioy se agregó medio de infección (1% de suero) y se incubó 16-24 horas.

Pasado ese tiempo, la monocapa se Iavó con medio de infeccióndeficiente en metionina (D-MoEM),se agregó 1 ml del mismo medio con 1% de

SFBi y se incubó durante 30 minutos a 37°C en estufa gaseada.Posteriormente se descartó el medio y se incubó otras 4 horas 30 minutos a

37°C, con 0,8 ml de D-MoEM 1% SFBi suplementado con 200 pCi/ml de 358­

metionina (NEN).

Finalizado el tiempo de la marcación se descartó el sobrenadante, lamonocapa se lavó con PBS y se resuspendió mecánicamente con “cellscraper"en 0,5-1 ml de buffer de lisis HO. Una vez resuspendida por completo la

monocapa se aplicó vortex durante 10-20 segundos y se clarificó 10 min. a10.000 rpm en microcentrífuga. Se descartó el pellet celular y el sobrenadantese congeló alicuotado a -70°C hasta su análisis por inmunoprecipitación.

3.11. Construcción del plásmido E2-VSVy recuperación delrecombinante VSV

El gen ss-E2 fue escindido con las enzimas Xho l y Nhe I del plásmidopss-E2 y se clonó en el vector de cadena completa pVSVXN2(.Schnell y col.,

1996) que contiene los cinco genes de VSV (N, P, M, G y L) en orden,flanqueados por el promotor de la polimerasa del bacteriofago T7, el leader deVSV ,ribozyma y secuencia terminadora de T7. El plásmido obtenido con el genE2 localizado entre los genes VSV-G y L se designó pVSV-E2.

La recuperación del virus recombinante ha sido previamente descripta(Lawson y col., 1995; Schnell y col., 1996) y fue realizada en colaboración conel Dr. John Rose de Yale University, Cell Biology Department, USA (para

mayores detalles ver Grigera, Marzocca y col., 2000). Básicamente las célulasBHK-21 se infectaron a moi de 10 con vTF7 y una hora luego de la infección se

60

MATFRMI FC YMÉTODOS

transfectaron con plásmidos que contenían por separado los genes N, P y Lbajo el promotor T7 junto con el plásmido pVSV-E2.

La solución de transfección se removió a las 3 horas y se reemplazó porDulbecco Minimum Essential Medium (D-MEM)con 5% SFB. Luego de 2 días

los sobrenadantes de transfección se flltraron por membrana de poro de 0,22

pm de diámetro para remover virus Vaccinia residual y se pasaron 2 veces porcélulas BHK-21no infectadas. Los sobrenadantes del segundo pasaje viral seutilizaron para infectar monocapas de células BHK-21 y luego de la detecciónde CPE (aproximadamente 8-12 hs p.i.) realizar un ensayo deinmunofiuorescencia indirecto con AcMo 10/12 o monoclonal anti-VSV-G,

según se describió anteriormente.La cepa viral obtenida se propagó de igual modo que el descripto para

VSV.

3.12. Purificación del VSVrecombinanteLa concentración y purificación del virus marcado con 35S-metionina se

realizó según fue descripto anteriormente (Luo y co|.,1988).Los sobrenadantes clarificados de una botella roller de células

infectadas y marcadas se concentraron por centrifugación durante 2 horas a25.000 rpm ultracentrífuga Beckman rotor SW 28.1.Los precipitados se resuspendieron en buffer ClNa 0,5 M en PBS y sesembraron en un gradiente continuo de sacarosa (15-45%) preparado en elmismo buffer. Se centrifugaron durante 3 hs a 25.000 rpm en UltracentrifugeBeckmam Model L5-50 y se cosecharon fracciones de 1 ml. Todas lasfracciones con bandas visibles fueron correspondientes a particulas viralesfueron unidas y diluidas con buffer CINa 0,5 M en PBS. Posteriormenteconcentradas por por ultracentrífugación durante 3 horas en rotor SW42. Elpellet obtenido se resuspendió en buffer RIPA (0,1 M NaCl, 0,05 M HCl-Tn's pH

7.8, 0,005 M EDTA, 1% NP40, 0,1% SDS y 0,001 M PMSF) y se clan'ficó para

su procesamiento.

3.13. Marcación metabólica, inmunoprecipitación e inmunoblotting deVSV-E2

Monocapas semiconfluentes de BHK-21en placas de 6 pocillos (3,5 cmde diámetro) se infectaron con VSV-E2 a moi de 10 en G-MEM sin suero. Elvirus se dejó adsorbiendo durante 1 hora a 37°C, luego se descartó el medio yse agregó G-MEM 5% SFBi y se incubó a 37°C. A las 5 horas postinfección el

medio se reemplazó con D-MoEM(sin metionina y sin suero) con una décimaparte de G-MEM y a 6 hs postinfección se agregaron 100 uCi/ml de 358­

6]

MATFRMI F9 YMÉTODOS

metionina durante otras dos horas. AIfinal de la marcación el sobrenadante se

descartó y la monocapa se Iavó con PBS, se resuspendió en 0,5-1 ml de bufferHO y se clarificó por centrifugación a 13.000 rpm durante 10' enmicrocentrífuga a 4°C como se describió anteriormente (3.10). A continuaciónlos lisados en una solución 1% final de SDS e incubados a TA durante 15 min,

fueron diluidos 10 veces en buffer RIPA. Finalmente se separó en alícuotas yse inmunoprecipitaron como se describió anteriormente (3.6).

Con el objetivo de analizar las cantidades relativas de rE2 y de Gpresentes en células infectadas con VSV-E2, se inmunoprecipitaron alícuotasidénticas, de lisados de células BHK-21 infectadas con VSV-E2 y marcadascon 35S-metionina durante 14 hs desde la 6 hs p.i. Las inmunoprecipitaciones

se realizaron con suero de conejo anti-E2 o anti-VSV-G (serotipo Indiana)1:50. EI análisis proteico se realizó en SDS-PAGE y el nivel de expresión derE2V relativo al de la proteína VSV-G se estimó por densitometría del área delas bandas en la fluorografía posterior a la inmunoprecipitación. Se estimó lacantidad relativa luego de realizar la corrección por los residuos de metionina(10 y 13 respectivamnete).

3.14. lnmunoprecipitación de viriones purificadosAproximadamente 40 ug de partículas de VSV-E2 purificadas y

marcadas con 35S-metioninadesde las 6 hasta las 20 hs p.i se resuspendieronen 100 ul de buffer RIPA con 1% de SDS, se mezclaron con vortex y seincubaron a TA ambiente durante 15 min. en 1 ml con buffer RIPA A

continuación se clarificó durante 15 min a 13.000 rpm en microcentrífuga y elsobrenadante se dividió en alícuotas apropiadas y fue incubadoindependientemente con suero policlonal de conejo anti-E2, anti-VSV-G o consuero preinmune como control y se precipitó con Protein A sepharose según sedescribió anteriormente (3.6).

3.15. Titulación del antígeno viral

Se realizó mediante el método de dilución terminal o de plaqueo.

3.15.1. Titulación por dilución terminalSe realizaron diluciones seriadas al 1:10 de los stocks virales de BVDV

en medio de infección sin suero y se incubaron 100 ul con volúmenes igualesde las células resuspendidas en medio de infección con 5% de SFB (1 a 3 105céls/ml) en placas de poliestireno de 96 pocillos (Tissue culture plate, 96 W, flat

62

MATFRIAI Fw y MÉTODOS

bottom, Greiner bio-one CELLSTAR). Las placas se incubaron en estufa deC02 a 37°C entre 5/7 días. Una vez descartado el sobrenadante de lasmonocapas las mismas fueron teñidas con solución de Cristal violeta (1% decristal violeta, 5% formol y 10% etanol en agua destilada) y se calculó el título(Dosis infectivas tejido celular 50% -DITC50-/ml)mediante el método de Reed

and Muench (Reed and Muench, 1938).La titulación de VSV.E2 se realizó sobre monocapas de células

preformadas al 100% de confluencia. Se realizaron diluciones seriadas 1:10 yse infectaron las monocapas con 100 pl de cada dilución. Al cabo de una horade incubación a 37°C se agregó igual volumen de medio de crecimiento y seincubó dos días a 37°C en estufa humidificada de C02. Las células se

revelaron luego de 2 dias como descripto anteriormente.

3.15.2. Titulación por plaqueoSe inocularon 300 pl de diluciones seriadas de stocks virales 1:10 en

medio de cultivo sin suero en monocapas de TFB o MDBK confluentes enplacas de 6 pocillos (TC-plate 6 well. Greiner bio-one CELLSTAR). Laadsorción del virus se realizó durante 1 hora a 37°C en cámara húmeda de

002 con agitación suave cada 15 minutos. Transcurrido ese tiempo, se Iavaronlas monocapas con el mismo medio de infección y se agregaron 3 mI de unamezcla preparada en el momento de partes iguales de agarosa 2% en aguadestilada (L.M.P. Agarose —lowMelting Point- GIBCO) precalentada a 45°C ymedio de mantenimiento 2X precalentado a 37°C:

Composición de medio de mantenimiento 2X:

MEM Glasgow (10X) 20 ml

Caldo triptosa fosfato (118 g/l) 20 ml

Penicilina (2 x 105 U/ml) Streptomicina (5 x 1m|

104./ml)

Bicarbonato de sodio 7,5% 6 ml

Hepes 1M 8 mlSFBi 2 ml

Una vez solidificada la agarosa. se incubaron las placas a 37°C encámara húmeda de C02 durante 5 dias. Las células se fijaron con formaldehídoal 10% en agua durante 20 minutos, se retiró la capa de agar con espátula y

63

MATFPMI FV YMÉTODOS

luego las monocapas fueron teñidas con solución de cristal violeta durante 20minutos. Finalmente se Iavaron con abundante agua y se contaron lasunidades formadoras de placas virales (UFP). Para el cálculo del título viral seutilizó la dilución con un número de placas cercano a 100.

El título de expresó como UFP/ml y se calculó mediante la siguientefórmula:

número de unidades formadores de placas (UFP)dilución x volumen (ml)

Las titulaciones para VSV se realizaron de la misma manera sobremonocapas de BHK-21,revelándose a los 2 días post-infección.

3.16. Neutralización serológica de la infectividad viral

La neutralización de la infectividad viral se realizó por reducción del

número DlTCsoo de UFP en las monocapas correspondientes.En el caso de reducción de UFP se incubaron aproximadamente 50 ul

de la dilución de BVDVconteniendo 100 UFP y 50 ul de diluciones seriadas delos sueros (previamente decomplementados a 56°C) en medio sin suerodurante 1 hora a 37°C en estufa de C02.

Posteriormente se infectaron monocapas celulares confluentes de TFB oMDBKcon las mezclas de virus y suero y se dejaron adsorbiendo durante 1hora a 37°C. Una vez retirado el inóculo se procedió de igual manera que en latitulación viral.

En cada ensayo se incluyeron controles de BVDV sin neutralizarrepresentando el 100% de las UFP. Este valor se utilizó para calcular losporcentajes de placas obtenidas para cada diluciónde suero.

El título de los sueros se calculó como la dilución o el log1ode la inversa

de la dilucióndel suero que fue capaz de reducir al 50%.el número de las UFP.Todos los ensayos se realizaron por duplicado.En el caso de la neutralización por reducción de DITCsose coincubaron

en placas de multipocillos de 96 pocillos, 100 DITC50de BVDV en 25 ul de

medio de infección sin suero y 25 ul de diluciones seriadas de los sueros atestear (previamente decomplementados) durante 1 hora a 37°C.

Posteriormente se agregaron 150 ul de suspensión de células en mediode infección con 1% de SFBi (3 x 105 céIs/ml) y se incubó a 37°C en estufahumidificada de C02 durante 5 días. Para cada suero se realizó un control sinvirus.

64

MATERIALES YMÉTODOS

3.17. Test de inmunoperoxidasa

Se infectaron monocapas confluentes de TFB o MDBKen placas depoliestireno de 96 pocillos a moi de 1 UFP/cél con 0,1 ml de la dilución del

stock viral de BVDVen medio sin suero y se incubó a 37°C durante 1 hora. Seagregaron 0,1 ml de medio de infección suplementado con 2% de SFB y seincubó a 37°C durante 48 horas.

Luego la monocapa celular se Iavó con PBS y se fijó con unamezcla de partes iguales de acetona y metanol durante 20 minutos a —20°C, se descartó la solución fijadora, se Iavó 5 veces con PBS, se dejósecar a TA rápidamente y se conservó a 4°C, no más de 7 días hasta suuso.

El revelado se realizó con el sistema biotina-avidina (ABC KITVECTASTAIN Elite ABC KIT, VECTOR Iaboratories) según lasespecificaciones del fabricante. Los anticuerpos monoclonales seenfrentaron a las monocapas celulares en la dilución 1:50 y los suerospoliclonales en la dilución 11200.

Como sustrato se utilizaron 100 pl por pocillo de ácido diamino

benzoico en PBS (1 mg/ml) con agregado de 1 ul de HzOz30% por ml. Seincubó en oscuridad durante 10 minutos y a continuación las monocapas selavaron con H20 destilada y se observaron los focos de infección en elmicroscopio.

3.18. Extracción de RNAde BVDV

La extracción de RNA se realizó según la técnica descn‘pta por elfabricante con “TRIZOL Reagent (Total RNA lsolation Reagent", Life

Technologies) basado en el método del isothiocianato de guanidina.El RNA se extrajo de sobrenadantes de cultivos de TFB o MDBK no

infectadas o infectadas con BVDVcon 0,1 UFP/cél. e incubadas durante 2-3días a 37°C.

Previamente las monocapas celulares se lavaron y resuspendieron enPBS y se centrifugaron a 1.100 rpm para luego ser procesadas con “TRIZOL”.

El RNAobtenido a partir de 100 pl de sobrenadantes se resuspendió enun volumen final de 7 pl de agua destilada estéril y se conservó a -70°C parasu posterior análisis por transcripción reversa y reacción en cadena de lapolimerasa (RT-PCR).

65

MATFRIAI F9 YMÉTODOS

3.19. Transcripción reversa y reacción en cadena de lapolimerasa de BVDV

La RT-PCR se realizaron en un único paso con el kit Access RT-PCRSystem (Promega) según instrucciones del fabricante.

Cada reacción se realizó en un volumen final de 30 ul con Nuclease­Free Water, 2 ul de la muestra de RNA, 6 ul AMV/Tfl 5x Reaction buffer, 0,7 ul

de la mezcla de 10 mM de cada dATP, dCTP, dGTP, dTrP; 1,5 mM de 804Mg,50 pmoles de cada uno de los primers M1 (5' GTAGTCGTCAGTGGTTCG) (ntPrimers BVDV 188-205) y M2 (5' GCCATGACAGCAGAGAT) (nt 368-384)

ambos correspondientes a la región 5' no codificante (Bolin y col., 1994) y 10 URNAsin (Promega). Luego se agregaron 5 U de cada una de las enzimas AMVReverse Transcriptase y Tfl DNAPolymerase.

La reacción se realizó en un ciclo de 45 min a 48°C y 2' a 95°C seguidopor 35 ciclos de 30 segundos. a 94°C, 1 min. a 60°C y 2 min. a 68°C.Finalmente se extendió 5 min. a 68°C.

La visualización del producto de amplificación se realizó mediantecorrida electroforética en geles de agarosa 2% (GIBCO)según Sambrook ycol. (1989).

3.20. Construcción de virus recombinante Bac-E2

La elección de un sistema eucariótico de expresión es clave parala obtención de glicoproteínas recombinantes activas. Diversascaracterísticas únicas del sistema de expresión de Baculovirus hacenque sea un método de elección para la producción de inmunógenos.

Este sistema garantiza altos niveles de expresión de la proteinadeseada con una tecnología simple donde el producto es facil depurificar, ya que en general, se localiza en el mismo compartimiento dela proteína auténtica (polihedrina) reemplazada por la que se deseaexpresar (Baculovirus Expression System: procedures and methodsmanual, 1993).

Para la obtención de un Baculovirus recombinante (Autographacalifórnica polihedrosis virus : ACPV) que exprese Ia proteína E2 de BVDVse

utilizó el sistema BaculoGold TMLinearized Baculovirus DNA (2,5 ug in 25 pl)

PharMingen.

66

MATERIALES YMÉTODOS

Este sistema provee ADN Iinealizado de ACPV el que se cotransfecta,utilizando Iipofectina junto con un vector de transferencia (pVL1393, lnvitrogen)que porta el gen que se desea expresar, a células de Spodoptera fmgiperda.

3.20.1. Clonado en pVL1393El fragmento ss-E2 se escindió del plásmido pss-E2 con las enzimas

Xba I y BamH I y se clonó en el plásmido PVL1393 (Invitrogen) (Figura16) en

iguales sitios de restricción.

Fig. 16: Esquema del plásmido para el cionado del gen ss-E2

3.20.2. Cotransfección en células de insecto (Spodoptera frugiperda)Se sembraron 106 células/2 ml de Spodoptera frugiperda Sf21 en

pocillos de 3,5 cm2de diámetro 2 hs antes de la cotransfección.Para la cotransfección se utilizó un kit comercial (BaculoGold

Transfection kit, Pharmigen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Una

solución de 20 ul de Iipofectina (2 partes de Iipofectina y 1 parte de agua

destilada) se coincubó con 20 ul de una solución del vector y de Baculogold

(1 ug del vector /250 ng de Baculogold en agua destilada) durante 15 minutos a

TA. Posteriormente se procedió al agregado de la mezcla a las células. Se67

MATFRIAI FK‘YMÉTODOS

realizó un control de células no transfectadas agregando a las célulasúnicamente la solución de Iipofectina.

Inicialmente las células se lavaron con medio TC-100 sin suero

luego se agregó 1 ml de medio sin suero a cada pocillo conjuntamentecon la mezcla de transfección. La placa fue sellada con cinta de papeladhesiva y se incubó durante 16 hs a 28°C. A continuación se agregó 1ml de medio con 10% de SFBi por pocillo y se dejó incubando la placadurante 48 hs.

Las células se congelaron y descongelaron dos veces. Se tomótodo el contenido del pocillo de la transfección, se pasó a un tubo estérily se centrifugó a 1.000 rpm. Por último el sobrenadante fue guardado a4°C y —70°Ccomo fuente de inóculo.

3.20.3. Clonado de Baculovirus recombinantes

Se sembraron 106células de Spodoptera frugiperda en pocillos de3,5 cm de diámetro 2 horas antes de la infección con Baculovirusrecombinante.

Se prepararon diluciones seriadas de 1:10 del stock viral y seinfectaron por duplicado las monocapas con 800 pl de cada dilución.

Para las infecciones se retiró el sobrenadante de la placa y seagregaron 800 ul de diluciones seriadas 1:10 del stock viral a cadamonocapa celular y se incubó durante 1 hora a 28°C con placa sellada.Una vez descartado el inóculo viral las células se cubrieron con 2 ml de

agarosa al 1% en TC-100 Insect Médium (GIBCO). Una vez solidificadala mezcla se agregó 1 ml de medio con suero. Las placas se sellaron yse incubaron a 28°C durante 3-4 días.

La detección de las placas de lisis viral se realizó con el colorantevital Rojo neutro. Se preparó una dilución de rojo neutro (0,5% PNol) enPBS estéril y se adicionó 1 ml de la misma a cada pocillo, se incubódurante 3 o 4 horas a 28°C en oscuridad. Posteriormente se extrajo elsobrenadante, las placas se invirtierony se incubaron 2 horas a TAy enoscuridad,

Mediante micropipeta se cosechó el agar de las placas de lisis(transparentes), se resuspendieron en 300 pl de medio TC-100 10%SFBi y se congeló y descongeló 2 veces. Este stock viral se utilizóparainfectar 106 células y la producción de proteína se evaluó por SDS­PAGE y posterior tinción con Coomasie blue y Western blotting.

68

MATFRIAI Fs‘ YMÉTODOS

3.20.4. Producción de E2 recombinante

El manejo de las células de Sf21 se realizó siguiendo la metodologíadescripta por King y Possee en The Baculovirus Expresión System. Alaboratory guide (1992).

Para la producción de inóculo se infectaron en sistema estático arazón de 106células de células de Sf21 a moi = 1 UFP/cél.

Brevemente y a modo de ejemplo 106 células en 5 ml de medioTC-100 con 10% de SFB se sembraron en botella de poliestireno de 25cr'n2y se dejaron 1 hora a 28°C hasta completa adhesión. Luego seretiró el medio y se adicionó el virus en un volumen final de 1 ml demedio completo. Luego de 1 hora de adsorción a 28°C, se descartó elsobrenadante y se agregaron 5 ml de medio completo. A continuaciónse procedió a una nueva incubación a 28°C hasta observar CPE en el100% de las células. En este punto, donde la mayoría de las célulasestaban desprendidas de la monocapa (4-5 días post-infección), secolectó el sobrenadante. Posteriormente se clarificó a 3.000 rpmdurante 10 minutos para ser utilizado como stock viral.

La producción de proteína se realizó en sistema estático y ensuspensión. En el primer caso se siguió el mismo procedimiento perocon alta multiplicidad de infección (5 UFP/cél.). Las células secosecharon a los 2-3 dias post infección con un 80% de células conefecto citopático adheridas aún al soporte.

Se recogió el sobrenadante celular junto con las células y secentrifugó a 3.000 rpm durante 10 minutos y el pellet se guardó comofuente de antígeno. En el caso del sistema en suspensión, el volumende células a utilizar para la infección se centrifugó a 1.000 rpm durante10 minutos. El pellet celular se resuspendió en el sobrenadante viral demanera de obtener una moi de 5 UFP/cél (por ejemplo seresuspendieron a razón de 45 106 células en un volumen total de 11 mlde stock viral rEzBac) y la mezcla se incubó durante 1 hora a 28°C.

Posteriormente la mezcla de incubación de células y virus setrasvasó a un frasco “spinnef’ (Techne Flask) y se llevó a volumen conel medio completo hasta llegar a 1:5 del máximo volumen del “spinner” yse dejó incubando a 28°C en agitación (a razón de 80 rpm). Comocontrol de infección y en forma paralela 2 x 106 cél provenientes de lamezcla de incubación con virus se resuspendieron en un volumen finalde 5 ml se sembraron de 25 cm2 y se incubaron a 28°C. El cultivo en

69

MATFPM I Fc y MÉTODOS

suspensión se cosechó cuando se evidenció CPE en el 80% de lascélulas del cultivo estático.

3.21. Pruebas de inmunización

3.21.1. lnoculación de conejos con E2 recombinanteDos conejos hembras de aproximadamente 1 año de edad se

inocularon por vía subcutánea en una serie de cuatro inyecciones a cadalado de la columna vertebral.

Cada dosis consistió en aproximadamente 50 ug de rE2-Baccontenidos en células Sf21 infectadas con rEZBac. Las células clarificadas

a 3.000 rpm durante 15 min. en centrífuga Sorvall RCSC, resuspendidasen PBS fueron emulsionadas en partes iguales con adyuvante deFreund‘s incompleto. Cada animal recibió tres dosis de 4 ml espaciadasen 20 días.

La obtención del suero se realizó mediante el sangrado de la arteriade la oreja de los conejos con aguja Butterfly-23 (VENISYSTEMS).

3.21.2. lnoculación de bovinos

Se realizaron dos inmunizaciones espaciadas por 21 días con 40ug (2 bovinos) o 10 ug (3 bovinos) de rEZBac (células de Spodopterafrugiperda infectadas con Bac-E2) en PBS. Cada vacuna consistió en unaemulsión de 4 ml formada con la preparación de antígeno en PBS (40%) ymezcla de adyuvantes Marcol Montanide® (60%) más 200 pg deladyuvante QuilA (a partir de una solución madre 10 mg/ml). Los bovinosprocedentes del laboratorio Azul no tenían anticuerpos previos contraBVDV.

El régimen de sangrado para los animales sometidos a dosinmunizaciones fue el siguiente: 1) sangrado antes de recibir Ia primerainmunización (sangría 1: día 0 post vacunación -d.p.v-); 2) posterior a la 1°inmunización (sangría 2: 43 dpv), posterior a la 2° inmunización (sangría3: 64 d.p.v.) y 4): 90 dpv (sangría 4).

Paralelamente durante todo el ensayo se sangraron una serie de 5animales no inoculados para detectar eventuales contaminaciones conBVDV. Las tareas de inoculación subcutánea y el sangrado por venayugular de los bovinos fue realizado por profesionales especializados delLaboratorio Azul, Argentina.

70

MATFRMI Fc y MÉTODOS

3.21.3. lnoculación de ratones con VSVrecombinante

Grupos de 5 ratones hembras BALB-c(INTA)de 6-8 semanas de edad

fueron inoculados por via intranasalcon 25 pl de sobrenadante proveniente deinfecciones virales de VSV-E2 diluído en medio de cultivo hasta obtener Ia

cantidad de UFP indicadas en cada caso (102, 103, 104, 105, 1o6 o 107).En

todos los casos se aplicó un refuerzo a los 21 dpv.Los ratones fueron anestesiados ligeramente con cloroformoy pesados

en una balanza Acculab 3000 antes y hasta los 14 días post-vacunación.

3.22. Producción de anticuerpos monoclonales anti-E2

3.22.1. Plan de inmunización

Se inmunizaron ratones hembras Balb-c, de aproximadamente 21días, por via intraperitoneal e intraplantal según el siguiente plan deinmunización:

1raDosis con adyuvante de Freund’s completo (GlBCO) al dia 1,2day 3er Dosis con adyuvante de Freund’s incompleto (GIBCO) al

día 21 y al día 36 respectivamente4tay última dosis 3 dias antes de la fusión celular.Las dosis de antígeno consistieron en aproximadamente 2.5 105

células Spodoptera frugíperda infectadas con Baculovirus E2(aproximadamente 10 ug de proteína E2 recombinante) diluídas en 0,5 mIde PBS.

Para la obtención de los bazos, los ratones fueron sacrificados pordislocación cervical.

3.22.2. Fusión celular

La fusión de los linfocitos obtenidos a partir de bazos de ratonesinmunizados con rE2-Bac y células de mieloma se realizó utilizandoPolietilenglicol (PEG) al 50 % y siguiendo la metodología descripta enHarlow E. y Lane D. (1988). Antibodies (1988).

Los bazos de los ratones en medio Iscove's sin suero fueron

disgregados mecánicamente y en frío utilizando mortero y tijeras. Elmachacado celular resultante filtrado por filtro metálico fue centrifugado a800 rpm durante 5 min. de modo de obtener las células B en precipitadocelular.

71

MATFRMI Fc y MÉTODOS

Posteriormente se lavaron 2 veces las células utilizando el mismo

medio lscove’s sin suero y se centrifugaron a 800 rpm. De igual modo, secentrifugaron las células de mieloma SP2/0 y se lavaron con mediolscove's sin suero.

Tanto las células del bazo como las de mieloma SP/O en una

relación 5:1 en medio sin suero se centrifugaron a 800 rpm durante 5minutos, se resuspendieron en 1 ml de PEG 4.000 (SIGMA) al 50% enPBS por goteo lento en baño a 37°C durante 1 minuto y luego sediluyeron en medio fresco sin suero y se centrifugaron nuevamente.

Finalmente las células fueron resuspendidas en medio con SFBi al20%, plaqueadas a razón de 2.5 105 células por pocillo (200 ul porpocillo) y cultivadas durante 48 hs en estufa gaseada de C02 a 37°C. Alas 48 hs y día por medio durante 15 días, se realizó el cambio de mediode incubación por 100 pl de medio Iscove's con el agente selectivo HAT(aminopterina 0.04 mM, hipoxantina 0,1 mM y timidina 0,016 mM)(SIGMA).

La visualización de los clones comenzó aproximadamente a partirdel día 10 post-infección. Una vez crecidos los clones, se procedió a labúsqueda de los clones positivos a través del análisis de ossobrenadantes puros de los hibridomas mediante el test delnmunoperoxidasa (3.17.) sobre monocapas de células infectadas conBVDV.

Los clones se mantuvieron en HAT durante aproximadamente 30días, siendo retirada primero la A y luego H y T. Una vez seleccionadoslos clones positivos se amplificaron mediante resuspensión y dilución 1:2en medio de cultivo, se clonaron por dilución límite para su análisis segúnla técnica descripta en Harlow y Lane, Antibodies, 1988.

Por último los hibridomas se congelaron y conservaron ennitrógeno líquido como se ha descripto anteriormente (3.2.).

3.22.3. Producción de líquido ascítico en ratónRatones BALB-c fueron primeramente inyectados

intraperitonealmente con 0,5 ml de Pristane (SIGMA) y 1 semana mástarde con 106células de hibridomas positivos en 0,5 ml de PBS.

A la semana siguiente se colectó el líquido ascítico por drenaje dela cavidad abdominal con jeringa (Agujas Monoject 250 1,1 mm X 40 mm)y se clarificó a 3.000 rpm durante 20 minutos, se separó en alícuotas y seconservó -20°C.

72

MATERIALES YMÉTODOS

3.23. Expresión de E2 truncada en el sistema Drosophilamelanogaster

La proteína E2 de BVDV se expresó en el sistema de expresiónconstitutivo de células de Drosophila melanogaster de manera de obtener laproteína recombinante en el sobrenadante de las células en cultivo.

3.23.1. Construcción del plásmido pMTN5-HisAE2EI gen E2 sin región carboxi|o terminal conjuntamente con la región que

codifica la secuencia señal de VSV-G (gen ss-AE2) fue escindido del plásmido

pss-AEZ y subclonado en el vector de expresión pMTN5-His (Invitrogen)

(Fig.17) para cotransfectar células de Drosophila melanogaster Schneider 2

(82). El pss-AE2 fue digerido con la enzima BamH l, tratado con Klenow, y

finalmente digerido con Xba I.El fragmento de 1100 pb purificado del gel de agarosa y precipitado por

PEG fue clonado en el vector pMTN5-His, entre los sitios de restricción EcoR Vy Xba I, bajo el control del promotor de metalotioneína (MT)de D. melanogasterinducible por SO4Cu (Sambrook y col., 1989). El pásmido resultante se

denominó pMT/AEZy fue utilizado para transformar bacterias competentesDH50.

73

M4TERIALES YMÉTODOS

3.23.2. Transfección de células 82Para la transfección de las células S2 se utilizó el kit comercial

Drosophila Expresión System Versión B for the Stable Expresión andPurification of Hetero/ogous Proteins in Schneider 2 Cel/s (lnvitrogen). Las

células 82 fueron cotransfectadas con el plásmido pMT/AEZy el vector deselección pCoHygro (Fig 18) conteniendo el gen de hygromicina Bfosfotransferasa bajo el control de un promotor copia constitutivo de D.melanogaster, que le otorga a las células 82 resistencia a hygromicinaB.

Fig. 18: Esquema del plásmido pCoHYGRO

Las células fueron cotransfectadas por el método de fosfato de Ca 2+según indicaciones del fabricante. La transfección se realizó en pocilios depoliestireno de 3,5 cm de diámetro c/u con 3 106 células en 3 ml de medio

Schneider suplementado con 10% de SFBi. Una vez que las células llegaron auna concentración de 4-6 106 células/ ml se realizó la transfección con la una

mezcla de soluciones A y B descriptas a continuación:

Solución A: 2M CaClz 36 pl

DNA (19 pg) 9 pl

pCoHYGRO (1pg) 2 ul

HzO estéril 253 pl

Solución B: 300m de HSB 2x (50 mM HEPES, 1,5 mM

NaH2PO4; 280 mM NaCI, pH 7,1)

74

MATERIALES YMÉTODOS

Una vez transcurridas 24 hs, el sobrenadante fue reemplazadopor medio Schneider con 10% SFBi y se incubó 25°C durante 2 días.

Posteriormente se reemplazó el medio de incubación por elmismo medio suplementado con 300 pg/ml de Hygromicina (a partir deun stock de 100 mg/ml) y se incubó hasta la obtención de célulasresistentes. Cada 4-5 días se realizaron cambios de medio hasta eliniciodel crecimiento de células resistentes (3-4 semanas).

Cuando las células alcanzaron una concentración de 6-20 x 106cels/ml fueron expandidas en medio Schneider suplementado con 10%de SFBi e higromicina.

Para la producción de la proteína las células AE2/82 (líneaestable de 82 con el gen ss-AEZ) se lavaron con medio sin suero(Drosophila-SFM-GlBCO- suplementado con glutamina).

Luego se resupendieron en el mismo medio y se sembraron a unaconcentración de 4-6 x106ceIs/ml durante 48 hs. Pasado ese tiempo seindujeron con 5 mMfinal de SO4Cu y se incubaron durante 5 días.Posteriormente se cosecharon sobrenadante y células separadamentecon el fin de analizar la distribución del antígeno recombinante AE2/82.

La detección de la expresión de la proteína recombinante serealizó por Western blotting y RIPA con suero bovino anti-BVDV yanticuerpos monoclonales de referencia según se describió en lospuntos 3.6 y 3.7.

3.23.3. Marcación metabólica del células SZ-AEZPara la marcación del producto de expresión de células de S2,

las mismas se sembraron en medio sin suero a razón de 107células/mly pocillo de 3,5 cm de diámetro. Se incubó durante 72 hs y se indujocon 804Cu durante toda la noche. Luego se Iavó con medio deficienteen metionina (Grace's insect medium, GlBCO) se centrifugaron lacélulas a 1.000 rpm durante 10 min., se resuspendieron en el mismomedio y se sembraron en la placa de cultivo incubando durante durante1 hora.

Posteriormente las células junto con el sobrenadante celular secosecharon, se centrifugaron a 1.000 rpm durante 10 min. y seresuspendieron en el mismo medio con el agregado 100 pCi 35S/mly arazón de 0,5 ml por well. Se incubó a 25°C.

Pasadas 4 hs se cosechó el sobrenadante y se analizó porlnmunoprecipitacióncon sueros específicos como se describe en 3.6.

75

MTERIALES YMÉTODOS

3.24. Elisa para la detección de anticuerpos en bovinosSe diseñó un sistema de ELISA según el esquema que se detalla a

continuación.

ms! Hp.6)O O

4) I 9, . I Sueroth

3) I .I EABWWOWMSZ

2‘ I I ¡anonima

Se sensibilizaron placas de ELISA (Nunc Immunoplates 1 MAXISORP,

Denmark) con el anticuerpo monoclonal 2.9.H (desarrollado en este trabajo de

tesis) en una dilución de 1:2000 en buffer carbonato/bicarbonato pH 9,6 durante 16hs a 4°C.

Una vez sensibilizadas las placas se Iavaron dos veces con PBS y se

agregó una dilución 1:40 del sobrenadante de cultivo inducido de células SZ-AEZ

(el AcMo y el antígeno fueron previamente titulados) y se incubó durante 1 hora a

37°C. Luego de 5 lavados con PBS se agregaron los sueros durante 30 min. a37°C. Los sueros analizados provinieron de la seroteca de CEVAN, los sueros de

animales vacunados con BVDV inactivado fueron provistos por el Dr Andrés

Vngorovitz (INTA).

Luego de otros 5 lavados con PBS y se agregó el conjugado anti-bovino

marcado con peroxidasa de rábano (Jackson Peoxidase-conjugated Affinipure

F(ab') 2 Fragment Anti-Bovine) (1:2.000 en Ia solución de dilución) y se incubó

durante 1 hora a 37°C. Tanto el antígeno como los sueros y el conjugado se

diluyeron en PBS Tween 0,5%, suero equino (SE) 1% y CINa (209/I).

Nuevamente se realizaron 5 lavados con PBS y posteriormente se agregó el

cromógeno 2-2'AZINO bis (3-Ethylbenz-Thiazoline 6-Sulfonic acid) Diamonium Salt

en ácido cítn'co anhidro 0,03 M pH 7,5; 0,05% de H202 durante 20 minutos a TA y

en oscuridad. La lectura se realizó a los 30 minutos posteriores a 450 nm utilizando

un equipo de ELISA Reader BIO-RAD Model.

76

4. RESULTADOS

4.1. Clonado de un gen quimérico E2 que contiene lasecuencia señal de VSV-G

La translocación del polipéptido E2 de BVDV a través de lamembrana del RE y el pasaje al Iúmen del RE requiere la presencia de unasecuencia señal (ss) en su extremo N-terminal. La proteína E2 no tiene sspropia sino que es provista por una secuencia hidrofóbica en el extremo C­terminal del polipéptido E1 ubicado hacia 5' de la E2.

Con el objetivo de expresar Ia proteína E2 de BVDVen un sistemaheterólogo, se incluyó en el extremo 5' de la secuencia codificante de laE2 madura (cepa Singer). la ss de Ia proteína G de VSV (VSV-G)según sedescribió en Materiales y Métodos (M. y M.). El fragmento híbrido se clonóen el plásmido pCDNA 3.1 (lnvitrogen) bajo el promotor de la polimerasadel bacteriofago T7 para generar el plásmido pss-E2 como se describió enM. y M..

Para la construcción de ss-E2 se amplificó el fragmento E2 a partir delplásmido pGEMgp53 en dos rounds de PCR (Fig. 9 de M. y M.). El producto deamplificación de 1210 pb contuvo los 48 pb de la ss de VSV-G más lasecuencia completa de la E2 (nt 2462 a 3582) y fue Clonado en el plásmido debase pCDNA3.1 obteniéndose el plásmido pss-E2 (Fig. 19.A y B).

77

L...O...0.000000...OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO0.00.0....

RESULTADOS

Fig. 19: Esquema de la construcción de pss-E2

A)

B)

ATG

I CMV T7 ’5 -—E 3flssVSV-Gm BVDV_E2

A) El gen quimérico ss-E2 se clonó en ei plásmido de base pCDNA 3.1para generar el plásmido pss-E2.

B) EI fragmento ss-E2 contiene ei gen quimérico ss-E2 (secuencia señalss de VSV-G en el extremo 5' de Ia secuencia codificante de ia proteínaBVDV-E2) bajo los promotores CMV y T7. En el extremo 3’ se indican losúltimos aminoácidos codificados, correspondientes al extremo C-tenninai dela proteína.

La construcción fue analizada por secuenciamiento y una vezconfirmado que el gen E2 estaba correctamente cionado, a continuaciónde la ss de VSV-G, se utilizó DNA de pss-E2 en ensayos detransfección de células de mamífero (CV1) para estudiar el producto deIa expresión dei gen quimérico (M. y M.).

78

RESULTADOS

4.2. Expresión de la proteína E2 en células de mamífero

4.2.1. Análisis de reactividad especifica con anticuerpos monoclonales,tamaño y glicosilación de la proteína recombinante expresada en CV1

Para analizar las caracteristicas del producto del gen ss-E2 clonado enpCDNA3.1 (pss-E2), se expresó Ia proteína recombinante en células CV1 bajoel sistema Vaccinia transiente según se indicó en M. y M. El sistema que utilizavirus Vaccinia recombinante, que expresa la polimerasa del bacteriofago T7,provee las bases para la expresión de genes que se encuentren bajo elpromotor T7 en células de mamíferos. Este sistema es aplicado para laproducción eficiente de proteinas, que para tener actividad biológica. precisande las modificaciones post-traduccionales específicas que tienen lugar encélulas de mamíferos

Para ello células CV1 previamente infectadas con el virus recombinanteVaccinia th-6,2 (vTF7) que expresa la polimerasa T7 fueron transfectadascon el pss-E2 de manera de expresar el gen ss-E2 clonado bajo el promotorde la polimerasa T7. La proteina recombinante fue identificada ycaracterizada mediante corrida electroforética en geles de poliacrilamidacon SDS (SDS-PAGE) y ensayos de Western blotting yradioinmunoprecipitación (RlPA) con anticuerpos específicos según seindicó en M. y M.

El análisis mediante Western blotting de Ia proteína recombinante conuna mezcla de anticuerpos monoclonales de referencia anti-E2 de BVDV(AcMo 10/12) reveló una proteína de 50-55 kD (Fig.20, calle 3) y de acuerdoal tamaño esperado de Ia proteina E2 del virus salvaje (Fig.20, calle 1). Laproteína recombinante se denominó rE2.

Dado que la proteína E2 de BVDV es glicosilada se analizó si laproteína recombinante también era capaz de glicosilarse. Se realizó unatransfección con el agregado de tunicamicina, un inhibidorde Ia glicosilaciónen asparraginas, agregado inmediatamente después de la transfección. ElWestern blotting reveló una proteína de menor PM a la observada enausencia de tunicamicina (Fig. 20, calle 4) sugiriendo que la proteínarecombinante estaba N-glicosilada.

Para confirmarlo, se analizó el producto de una transfección,realizada en presencia de 3H-manosa, por RIPA con AcMo 10/12 como seindicó en M. y M.. En este caso el AcMo 10/12 inmunoprecipitó una proteína

que coomigró con la proteína recombinante revelada por Western blotting79

RESULTADOS

(Fig. 20, calle 6). En un ensayo de marcación con 3H-manosa realizado enparalelo en presencia de tunicamicina no se detectó polipéptido marcado(Fig. 20, calle 7). Estos datos confirmaron que Ia proteína rE2 recombinanteestaba N-glicosilada .

Fig. 20: Expresión del plásmido pss-E2 en células CV1 infectadas conVaccinia vTF7.

kD A

A) Western-blotting: reactividad del AcMo 10/12 con BVDV.Pellets celulares de células MDBKlisadas en buffer HO (aproximadamente 3 105células) infectados con BVDV (calle 1), no infectados (calle 2) (M. y M.) fueronresuspendidos en BM con SDS y B-mercaptoetanol, resueltos SDS-PAGE 12% yelectrotransferidos a una membrana de nitroceiulosa (M.y M.).B) Western-blotting: reactividad del AcMo 10/12 con el producto de expresión depss-E2.Pellets celulares (de aproximadamente 3 105 células) de células transfectadas eincubadas en ausencia (calle 3) o en presencia de 1 pg de tunicamicina (calle 4)(M. y M.) fueron resueltos como en A y transferidos a una membrana denitrocelulosa. La calle 5 corresponde a un Iisado de cantidades equivalentes decélulas CV1 transfectadas con el plásmido control pss-VSV-G que codifica para laproteína G de VSV.En ambos casos A y B la membrana fue incubada con AcMo 10/12 (1:10) yposteriormente incubada con suero anti-ratón conjugado con peroxidasa (125000)yrevelada por quimioluminiscencia (M. y M.).C) I" " ' _ '. " ' Incorporación de 3H-manosa por el polipéptidorecombinante.Aproximadamente 9 105 células CV1 transfectadas con pss-E2 fueron marcadascon 25 pCi/ml de 3H-manosa desde las 3 hs hasta las 19 hs post transfección enausencia (calle 6) o en presencia de 1 pg de tunicamicina (calle 7) (M. y M.). Lascélulas fueron resuspendidas en buffer de lisis HO y clarificadas. El sobrenadantefue incubado con AcMo 10/12 (1:3) durante 16 hs a 4°C y posteriormente con Prot.A Sepharose durante 2 hs a 4°C (M. y M.). Las proteínas inmunoprecipitadasfueron analizadas en SDS-PAGE 12% y posteriormente reveladas porautorradiografía.Las barras indican los marcadores de PM con sus tamaños en kD a la izquierda.

80

¡emm TAnos

4.2.2. Análisis de uniones del tipo puente disulfuro intra eintermoleculares en la E2 recombinante

La formación de puentes disulfuro intra e intermoleculares y laglicosilación de las proteínas son eventos críticos en el plegamiento y eltransporte intracelular de numerosas proteínas virales, que ocurren luegode su traducción (Rose y Doms, 1988).

Está demostrado que en la glicoproteína VSV-G las uniones deltipo puente disulfuro intra e intercadena le otorgan a la proteína unaconformación más “compacta” en comparación con Ia forma “relajada”reducida obtenida en SDS-PAGE y únicamente la forma no reducidamantiene su capacidad para reaccionar en Western-blotting conanticuerpos neutralizantes contra el inmunógeno G nativo (Grigera y col.,1992)

Ya que la E2 nativa de BVDV forma dímeros que se unen porpuente disulfuro se estudió si esta característica también se encontrabaen la proteína recombinante. Para ello se transfectaron células CV1 conpss-E2 y se analizó la migración de la proteína recombinante en SDS­PAGE en condiciones reductoras y no reductoras comparando lareactividad de la proteína con los anticuerpos monoclonales anti-E2 luegode ambos tratamientos (Fig. 21).

En condiciones no reductoras el AcMo 10/12 reconoció una

proteína de PM entre 90 y 100 kD (Fig. 21, calle 2). Esta proteína secorrespondería con un dímero de rE2 de forma similar a lo que ocurrecon la E2 de BVDV.

El AcMo 10/12 reconoció además una proteína de menor PM queel monómero rE2 presumiblemente una forma más “compacta” noreducida (an2r) de rE2.

El AcMo 10/12 no reconoció a ninguna proteína producto de lastransfecciones en presencia de tunicamicina (calle 3), lo que podríaatribuirse a una reducción de la reactividad de los anticuerpos con lasformas no glicosiladas de rE2 o alternativamente a la formación deagregados proteicos que no penetraron al gel o bien fueron pobrementetransferidos a la nitrocelulosa. Esta segunda alternativa resultó másprobable ya el AcMo 10/12 pudo reconocer incluso a la forma másreducida de la rE2 ,con pérdida total de uniones intercadena (Fig. 21,calle 2), y fue posible detectar reactividad con proteínas de alto PM, a

8|

RESULTADOS

juzgar por la presencia de marca en la parte superior del gel en presenciade tunicamicina (Fig. 21, calle 3).

Los resultados demostraron que el polipéptido recombinante codificadopor pss-E2 formaba uniones intra e intercadena en forma similar, sino idénticaa la E2 de células infectadas con BVDV.

Fig. 21: Western blotting. Análisis de los productos de expresión de pss-E2en condiciones no reductoras.

MSH - — +TM ­

Aproximadamente 3 105 células CV1 transfectadas con pss-E2 e incubadas enpresencia (+) o en ausencia (-) de tunicamicina (TM) fueron resuspendidas enbuffer muestra con o sin B-mercaptoetanol (MSH+ y MSH-: condiciones reductoraso no reductoras respectivamente) y resueltas electroforéticamente en SDS-PAGE12%. Luego se electrotransfirieron a una membrana de nitrocelulosa y fuerontesteadas con AcMo 10/12 como fue descripto para la Fig. 20Células CV1 transfectadas con el plásmido pss-G (G=proteína G de VSV) comocontrol negativo (Calles: 1 y 6); células CV1 transfectadas con pss-E2 (2, 3, 4, 5).drE2: indica dímero de rE2, an2 indica monómero no reducido de E2.Las barras indican los marcadores de PM con sus tamaños en kD a la izquierda. Elpanel MSH+se usó como referencia y corresponde a la Fig.20.B.

4.2.3. Rolde la secuencia señal heteróloga en la conformación de E2Se analizó si ss resultaba crítica para la síntesis del polipéptido

recombinante. Para ello se realizaron transfecciones con el pf-E2 quecodifica para el gen de E2 pero que no posee la secuencia ss en el extremoN-terminal. Para la construcción de pf-E2 se ampliflcó el fragmento E2 apartir del plásmido pGEMgp53 mediante 1 reacción de PCR y el producto deamplificación de 1162 pb fue clonado en el plásmido de base pCDNA3.1obteniéndose el plásmido pf-E2 como se describió en M.y M.

82

RESULTADOS

La proteína recombinante obtenida en transfecciones de células CV1con el pf-E2 bajo el sistema Vaccinia transiente se analizó por SDS-PAGE yWestern-blotting (Fig. 22). En este caso el AcMo 10/12 reconoció únicamenteuna proteína que migró por abajo del marcador de 45 kD de PM (indicado poruna flecha en la calle 3) de tamaño menor al monómero no reducido de la rE2 yprobablemente correspondiente a un producto de la proteólisis de la proteínano traslocada (Towsend y col., 1989). No se detectaron polipéptidos marcadoscon 3H-manosa en un ensayo de transfección paralelo (resultados nomostrados).

Estos resultados indicaron que para la síntesis de la proteínarecombinante E2 era requerimiento indispensable la secuencia señal.

Fig. 22: Expresión del plásmido p-fE2 en células CV1infectadas con vTF7.

1 2 3

Aproximadamente 3 105 células CV1 transfectadas con un plásmido control pss-G(calle 1), con pss-E2 (calle2) o con pf-E2 -idem pss-E2 pero sin la secuencia ss­(calle 3) fueron resuspendidas en buffer muestra sin B-mercaptoetanol (M. y M.) ylas proteínas presentes en los Iisados celulares fueron resueltaselectroforéticamente en SDS-PAGE 12%. Luego fueron electrotransferidas a unamembrana de nitrocelulosa y fueron testeadas con AcMo 10/12 como fue descriptoen Ia Fig. 20.La flecha hueca indica el único polipéptido específico detectado en las célulastransfectadas con pf-E2. drE2: indica dímero de rE2; pc indica proteína celular,an2 indica monómero no reducido de E2.Las barras indican los marcadores de PM con sus tamaños en kD a la izquierda.

4.2.4. Distribución intracelular de E2 recombinante en las célulastransfectadas con pss-E2

El mantenimiento de su conformación nativa parece ser un prerrequisitopara el eficiente transporte intracelular de las glicoproteínas virales. Pequeños

83

RESULTADOS

cambios en la conformación pueden originar agregados de proteínas malplegadas que se acumulan en el espacio perinuclear de las células (Rose yDoms ,1988).

Se estudió entonces Ia localización celular de la proteína recombinanteE2 mediante inmunofluorescencia indirecta de monocapas de células CV1transfectadas con pss-E2 permeabilizadas o no permeabilizadas con Tritón X­100 (Fig.23).

Fig. 23: lnmunofluorescencia de células CV1permeabilizadas y nopermeabilizadas transfectadas con pss-E2

PERMEABLE NO PERMEABLE

AcMo10/12 DAPI AcMo10/12 DAP

Monocapas de células CV1 infectadas con Vaccinia vTF7 y transfectadas con elplásmido pss-E2 (M. y M.) fueron fijadas a las 16 hs p.i. con formaldehído ypermeabilizadas con Tritón X-100 (PERMEABLE) o no permeabilizadas (NOPERMEABLE) (M. y M.). Luego fueron incubadas con AcMo 10/12 (1:3) yreveladas con anticuerpos fluoresceinados anti-ratón (FlTC) (1:200). Luego lascélulas fueron montadas con glicerol 50% PBS y DAPI (M. y M.) y observadas bajomicroscopía de fluorescencia (40x). Los paneles en la figura muestran diferentescampos de monocapas de células transfectadas con su perfil nuclearrepresentativo (DAPI)como referencia (M. y M.).

Las células permeabilizadas presentaron una marca intensa perinuclearcompatible con la presencia de rE2 en los compartimientos del RE y Golgi.

También mostraron marca en la periferia del citoplasma lo cual indica que lapresencia de rE2 no estaba restringida únicamente a la región periplasmática.

La inmunofluorescencia de las células no permeabilizadas mostró que larE2 se localizó en la superficie celular a diferencia de Io que ocurre con la E2de BVDVque no se expresa en superficie de células infectadas (Grummer ycol, 2001).

84

RESULTADOS

Ni las células transfectadas con pss-E2 incubadas en presencia detunicamicina o con el pf-E2 transfectadas en paralelo mostraron tinción demembrana con el AcMo 10/12 (resultados no mostrados).

Para confirmar la presencia de la proteína rE2 en membrana se realizóun ensayo de biotinilización como se describió en M. y M. que utiliza la

propiedad de Ia Biotinamidocaproate N-hydroxysuccinamide de unirseúnicamente a proteínas de superficie de membrana. Se biotinilóla monocapade células CV1 transfectadas con pss-E2, se Iisaron las células en buffer RIPAy el Iisado celular fue inmunoprecipitado con el AcMo 10/12 y analizado SDS­PAGE y Western-blotting. El Western-blotting se reveló con streptavidinaconjugada con peroxidasa de rábano (HRP) y quimioluminiscencia comodescripto en M. M. (Fig. 24).

Fig. 24: Biotinilación de células transfectadas con pss-E2.

MSH_- ___'|'_

drE295—_>m m67 ___

<— rE2<- an245—

Células CV1 infectadas con Vaccinia vTF7 y transfectadas con el plásmido pss-E2(calle 1 y 3) o pf-E2 (calles 2 y 4) fueron marcadas con el reactivo de biotinilación alas 8,5 hs post infección durante 10 minutos 4° C (M. y M.). A continuación lascélulas fueron lavadas de manera extensiva con PBS, lisadas en buffer HO y eltotal de los sobrenadantes de los Iisados celulares fue inmunoprecipitado conAcMo 10/12 en la dilución 1:3 (M. y M.).Los inmunoprecipitados se resolvieron por SDS-PAGE 12% en condicionesreductoras o no reductoras (MSH +, MSH -) y fueron electrotransferidos a unamembrana de nitrocelulosa. Para el Western-blotting se utilizó streptavidinaconjugada con peroxidasa (1:1500).y se reveló por quimioluminiscencia (M. y M).an2: rE2 no reducidadrE2: dimero de rE2.Las barras indican los marcadores de PM con sus tamaños en kD a la izquierda.

85

RESULTADOS

El inmunoblot en condiciones no reductoras mostró que el polipéptidodimérico drE2 fue el reconocido casi exclusivamente por el AcMo 10/12.

EI análisis en condiciones reductoras mostró disminución en la señal de

drE2 biotinilado y la aparición de una banda heterogénea a nivel de la rE2. Elaumento de los tiempos de incubación a 100°C, en condiciones reductoras.disminuyó la presencia de drE2 (resultado no mostrado). La banda heterogéneade rE2 correspondería a una mezcla de monómeros de E2 reducidos (rE2) y noreducidos (an2).

Todos estos datos confirmaron que la E2 fue transportada desde su sitiode síntesis a la membrana celular y fortalecieron la hipótesis que la formadimérica de la glicoproteína E2, el polipéptido p90, era el principal expuesto enIa superficie de las células transfectadas con pss-E2.

4.3. Expresión de la proteína E2 sin el dominio transmembrana en célulasCV1

Los dominios transmembrana y los extremos citoplasmáticos de lasglicoproteínas de membrana, celulares o virales. son determinantes importantespara el plegamiento y para las interacciones intermoleculares que llevan a laformación de puentes disulfuro. En la glicoproteína E2 de BVDV existe unaregión de 30 aa en el extremo C-terminal que de acuerdo a sus característicasde hidrofobicidadse postula como zona de anclaje a membrana.

La importancia de la región C-terminal para la distribución celular y parala conformación de la E2 se determinó por comparación de la distribución de larE2 con una mutante de deleción sin la región C-terminal. La mutante fuegenerada por PCR a partir del pss-E2 por remoción de la secuencia que codificapara los últimos 31 aá de Ia secuencia de la E2 (nucleótidos 3491 a 3582)

generando el pss-AE2 (M.y M).

Se realizaron transfecciones de células CV1 con pss-AE2 y pss-E2 enpresencia de 35S-met.y se inmunoprecipitaron con AcMo 10/12 por separado lasproteínas del medio de cultivo y del extracto celular según se describió en M. yM.( Fig. 25).

Los análisis demostraron que el producto de la transfección obtenido con

pss-AE2 resultó de menor tamaño que la rE2 (MSH +_ calles 3 y 1respectivamente) y que la proteína delecionada se secretó al medio extracelulara diferencia del producto obtenido al transfectar con pss-E2 (MSH +, calles 4 y 2respectivamente). Por otra parte, la deleción de los últimos 31 aa de la regióncarbox¡|o terminal de la proteína, no afectó la capacidad de formar dimeros(MSH -,ca|le 4).

86

RESULTADOS

Fig. 25: Expresión del plásmido pss-AE2 (E2 con una deleción en el extremoC-terminal) en células CV1infectadas con vTF7.

MSH + MSH ­

í r ” «5233 a drAEZ

V 1 2 3 4 1 2 3 4un ex “un ex i un ex; un exi

Células CV1 infectadas con Vaccinia vTF7 y transfectadas con el pss-E2 (calles 1 y 2) o conpss-AE2 (calles 3 y 4), fueron marcadas con 35S-metdurante 6 horas post transfección hastasu cosecha a las 24 hs post transfección (M. y M.). Cantidades equivalentes desobrenadantes de Iisados celulares en buffer HO provenientes de aproximadamente 3 106células por un lado y de medio de cultivo por el otro fueron inmunoprecipitadas con AcMo10/12 en la dilución 1:3 y los productos inmunoprecipitados fueron resueltos por SDSPAGE12% en condiciones reductoras (MSH+)y no reductoras (MSH-).Calles 1 y 3 Iisados celulares (in), 2 y 4 sobrenadantes de cultivo (ex). La calle V correspondea un control positivo de células TFB infectadas con BVDV e inmunoprecipitadas de igualmanera.Las barras indican los marcadores de PM: 99, 68 y 45 kD de arriba hacia abajo.Las flechas indican los polipéptidos precipitados E2 y AE2 y sus correspondientes dímeros(drE2 y drAE2), in corresponde a intracelular, ex corresponde a extracelular, wt corresponde alas transfecciones con pss-E2 y A con pss- AE2.

4.4. Expresión de E2 en células de insectoUna vez demostrado que el fragmento recombinante ss-E2 generaba una

proteína con características semejantes a la nativa, se decidió estudiar laexpresión de la glicoproteína E2 en un sistema Baculovirus-células de insecto

Spodoptera frugiperda. Se eligió este sistema con el fin de obtener la proteína E2en cantidades suficientes para realizar pruebas de inmunidad. El sistemaBaculovirus/Spodoptera frugiperda produce proteínas recombinantes en altaconcentración dado que se reemplaza el gen de la polihedrina viral, quenormalmente se expresa en forma abundante (pero que no es esencial para lareplicación del virus en cultivo) por el gen de Ia proteína heteróloga de interés, el

cual queda ubicado bajo el promotor fuerte de polihedrina. De esta manera, al

generar un virus recombinante, éste, con cada ciclo infectivo, genera grandescantidades de Ia proteína de interés, la que además sufre las modificacionespost-traduccionales propias de las proteínas eucariotas.

87

RESULTADOS

4.4.1. Análisis del producto de expresión del gen ss-E2 en células deSpodoptera frugiperda con suero anti-BVDV

Para obtener un Baculovirus recombinante que codifique para la E2 de BVDVse realizaron cotransfecciones de células de S. frugiperda (Sf21) con el plásmidopM8 (derivado del vector de transferencia pVL1393) y ADN genómico de AcNPVsegún M. y M.. EI pM8 se obtuvo mediante el clonado en pVL1393 del fragmento ss­E2 derivado del pss-E2 por corte con las enzimas de restricción BamHI y Xbal comose describió en M. y M.. El sobrenadante de la transfección se plaqueó en célulasSf21 y la obtención de la proteína recombinante se analizó por SDS-PAGE yWestern-blotting según se describió en M. y M. siendo seleccionados 8 clones deBaculovirus recombinante que fueron posteriormente amplificados. (Fig. 26).

Fig. 26: Expresión de E2 en el sistema Baculovirus/células de insectoSpodoptera frugiperda

A105

59 j

43

1 2 3 4 MK 1 2 3 4 MK

Células Sf21 fueron infectadas con Baculovirus recombinante (Bac-E2). A las 72 hs post-infección elcultivo fue clarificado y las células resuspendidas en buffer muestra con B-mercaptoetanol y lasproteínas fueron resueltas en SDS-PAGE 10% (M. y M.). En cada calle fueron sembradasaproximadamente 2,5 105células.A) Gel de poliacrilamida teñido con Coomasie blue (My M.). Células sin infectar (calle 1), célulasinfectadas con Bac-E2 (calles 2 y 3). Las proteínas de un gel idéntico fueron electrotransferidas a unpapel de nitrocelulosa y detectadas con suero bovino comercial anti-BVDV (1:250) y posteriorincubación con anticuerpos anti-bovino conjugados con peroxidasa (1:1000) y tinción con 4_Chloronaphthol (M. y M.) (panel de la derecha). MKcorresponden a los marcadores de PM cuyos tamañosse indican en kD a la izquierda. La flecha indica el producto recombinante obtenidoB) Western blotting. Producciones de rEZBac en células de Sf21 infectadas con diferentes clones deBac-E2 (M.y M.) (calles 1 a 8) y control de células no infectadas (calle 9). MK corresponden a losmarcadores de PM como en A.C) Gel teñido con Coomasie blue y Western blottingde dos clones Bac-E2 seleccionados. Células sininfectar (1 y 2), células infectadas con Bac-E2 (3 y 4). MKcorresponde a marcadores de PM cuyostamaños se indican a la derecha en kD.

La flecha indica la proteína recombinante rE28ac..

88

1...0...OOO...OCOOOOOOOOOOOOOOOO00......0.0.0.0...

RESULTADOS

Como puede observarse en la tinción con Coomasie blue del gel depoliacrilamida en la Fig.26. A la infección con el Baculovirus recombinante obtenido

produjo la expresión de una proteína de aproximadamente 50-55 kDcorrespondiente al PM de la E2 de BVDVque migró como una banda heterogéneay difusa que fue detectada por los anticuerpos específicos anti-BVDV.La proteínarecombinante se denominó rEZBac. La proteína también fue reconocida en unensayo de Western blotting por el AcMo 10/12 (resultados no mostrados).

Los clones virales obtenidos fueron titulados obteniéndose títulos de 106

DlTCso/ml (M. y M.). La cuantificación de la producción de E2 resultó dificultosa

debido a heterogeneidad de tamaño que mostró la proteína recombinante (Fig.26.C, calles 3 y 4). La producción de rEZBac se estimó en aproximadamente 0,5-1

ug de proteina cada 105 de células por comparación de la banda de rEZBacobservable por tinción con Coomasie blue en relación a concentraciones conocidasde albúmina bovina (resultados no mostrados)

4.4.2. Análisis de uniones intra e intermoleculares de la proteínarecombinante

Para investigar si la proteína expresada en el sistema Baculovirus/Sf21 eracapaz de formar dimeros se realizaron experimentos de marcación con 358-meteinmunoprecipitación de la proteína recombinante rEZBac (M. Y M.) y los productosse analizaron en SDS-PAGE con o sin MSH (Fig. 27).

Fig. 27: Análisis de rEZBac en geles de poliacrilamida en condicionesreductoras y no reductoras

Células Sf21 fueron infectadas con BacE2 a moi = 5 y marcadas a los 2 días postinfección con 35S-met. durante 4 hs. Las células fueron Iisadas con buffer HO y elsobrenadante clarificado inmunoprecipitado con AcMo 10/12 (M. y M.). El productoinmunoprecipitado fue resuspendido en condiciones reductoras (MSH +) o no reductores(MSH -). Ambas muestras se resolvieron en SDS-PAGE 12% y fueron reveladas porautorradiografía. Cada calle corresponde al producto de aproximadamente 3 105células.Las barras indican los marcadores de PM con sus tamaños en kD a la izquierda.drEZBac: dímero de rEZBac, anZBac: monómero de rEZBac no reducido

89

10......OOOÓOOOOOOOOOOOOOOOOO...00......0.0.0.0...

RESULTADOS

En condiciones no reductoras se obtuvo una banda que migró comouna proteína dimérica de aproximadamente 90 kD (calle MSH -). En lamisma calle se observa un producto de menor PM correspondiente a laforma monomérica no reducida (anZBac). El agregado de MSH, produjo latransformación del producto dimérico en el monómero por ruptura de lospuentes disulfuro (calle 2).

La comparación de Ia migración en SDS-PAGE de la proteínaexpresada en células insecto y la expresada en células de mamífero CV1no mostró diferencias significativas (Fig. 28). El tamaño similar de ambasproteínas recombinantes sugirió que el grado de glicosilaciónfue semejanteo igual en ambos sistemas.

Fig. 28: Expresión de rE2 en células de mamífero e insecto

Células CV1 infectadas con Vaccinia vTF7 y transfectadas con pss-E2 (calle 1) océlulas Sf21 infectadas con BacE2 (calle 2), marcadas con 35S-met (M. y M.),fueron lisadas con buffer HO e inmunoprecipitadas con AcMo 10/12 como sedescribió anteriormente. Los productos se resolvieron mediante corridaelectroforética en SDS-PAGE 12% en condiciones reductoras. Las barras indicanlos marcadores de PMcon sus tamaños en kDa la derecha.

4.4.3. Distribución celular de E2 recombinante en células de Sf21

Se analizó la expresión subcelular de la proteína recombinante encélulas de insecto mediante una inmunofluorescencia indirecta de

células Sf21 infectadas con Bac-E2 y reveladas con AcMo 10/12 (Fig.29).

La proteína rEZBac se detectó en membrana celular (NO PERM.)aunque en pequeña proporción en relación a la proteína detectadaintracelularmente (PERM) al igual que la proteína recombinante

90

RESULTADOS

expresada en células CV1 y a diferencia de la proteína E2 en célulasinfectadas con BVDVque no se inserta en la superficie celular.

Este resultado conjuntamente con el observado para la expresiónen células CV1 indicaría que parte de las proteínas E2 recombinantesse insertaron en la superficie celular.

Fig. 29: lnmunofluorescencia de células infectadas con Baculovirusrecombinante.

NO PERM. PERM.

Bac-E2

Células Sf21 infectadas con Bac-E2 a moi=5 UFP/cel fueron fijadas a las 48 hspost-infección con formaldehído y permeabilizadas con Tritón X-100 (PERM)o nopermeabilizadas (NO PERM) (M. yM.). Las células fijadas y bloqueadas con BSA3% en PBS fueron incubadas con AcMo 10/12 y reveladas con anticuerpos anti­ratón fluoresceinados (1:200) (M. y M.). Luego de lavados extensivos con PBS lascélulas fueron observadas con microscopio de fluorescencia (40x). El panelsuperior de la figura muestra un campo de células infectadas con Bac-E2 y elinferiorde células no infectadas tratadas de la misma manera.

4.5. Propiedades inmunogénicas de la proteína recombinante

Luego de haber estudiado Ia expresión de las proteínas recombinantesen células de insecto, se prosiguió a caracterizar su comportamientoinmunogénico primero en ratones y luego en conejos y bovinos en formasubsiguiente

Para analizar la reactividad de los sueros de los animales inmunizados

con rEZBac, se utilizaron dos técnicas: a) inmunoprecipitación de Iisados decélulas infectadas con BVDVmarcadas radioactivamente y b) neutralización de

91

RESULTADOS

BVDV. Esta última se realizó en cultivo celular por inhibición deunidades formadoras de placa (UFP) o de dosis infectiva tejido celular50 (DITCso). La cepa Singer utilizada en los ensayos se analizópreviamente por inmunoprecipitación y por inmunofluorescencia consueros de referencia anti-BVDV y por PCR utilizando primerscorrespondientes a una región conservada 5' NTR (Fig. 30).

En la Fig.30.Ase muestra el análisis de las proteínas presentes enel sobrenadante clarificado de un lisado de células TFB infectadas con

BVDVmarcadas con 35S-met.e inmunoprecipitadas con suero bovino dereferencia anti-BVDV cepa Singer. Pueden observarse las bandasespecíficas de las proteínas más inmunogénicas NSZ-3, N83 y E2 (calle2), no detectándose proteínas virales en las células no infectadas (calle1). Como control se realizó el mismo ensayo con el AcMo anti-E2 6011(calles 3 y 4) y con suero de conejo anti-NS-3 (calles 5 y 6). En la callecorrespondiente a la inmunoprecipitación con el anticuerpo monoclonalse observan bandas extras productos de posibles complejos proteicosen el lisado celular y cooprecipiaciones.

El mismo suero bovino anti-Singer se utilizó en un ensayo deinmunofluorescencia revelando los focos de infección de BVDV en

monocapas de células MDBK infectadas (Fig. 31.B) y resultandonegativos los controles no infectados.

Mediante RT-PCR de la región 5'NTR de RNA obtenido desobrenadante de células infectadas con BVDV(M. y M.) se amplificó unfragmento de 195 pb de tamaño esperado (Fig. 30.C).

El virus se analizó también por neutralización con el suero debovino anti la cepa Singer por reducción de DlTCso (Fig. 31). Losresultados indicaron que el suero neutralizó el virus certificando de estaforma su identidad. lguales resultados se obtuvieron con anticuerposmonoclonales de referencia (AcMo 10). En paralelo se tituló el virus porel método de plaqueo (Fig. 32) obteniéndose títulos del orden de 105-106UFP/ml en producciones virales realizadas en TFB según M. y M..

92

RESULTADOS

Fig. 30: Caracterización de BVDV(Cepa Singer).

‘NI ¡“NI ¡“NI l'suero bovino AcMo suero de conejo

VD a-E2 a-N ­

NOlNFECTADAS MK1 2 3 4 5INFECTADAS

\I'\,. " ' Iuplcbipitauiúu. Células TFB infectadas con BVDV cepa Singer a

moi=10 UFP/cel. fueron marcadas con 35S-met. a las 16 hs post infección y durante4 hs (M. y M.). Los sobrenadantes clarificados de Iisados celulares marcados einfectados (calles 2, 4 y 6) o no infectados (calles 1, 3 y 5) se inmunoprecipitaron condistintos anticuerpos de referencia. Suero bovino anti-BVDV (calles 1 y 2); AcMoanti-E2 6D11 (3 y 4); suero de conejo anti-NS 2-3 (5 y 6). Las barras indican losmarcadores de PM cuyos tamaños se indican a Ia derecha en kD.B) lnmunofluorescencia de células TFB infectadas con BVDV.Monocapas de célulasinfectadas con la cepa Singer a moi de 0,1 UFP fueron fijadas con metanol/acetonaa las 48 hs pi. Luego fueron incubadas con suero bovino anti-BVDVcepa Singer(11200)y posteriormente fueron incubadas con anticuerpos anti-bovino fluorescentes(1:200) (M. y M.) y tras lavados extensivos con PBS las monocapas fueronobservadas con microscopio de fluorescencia (20x). Se muestra además unamonocapa de células no infectadas.C) RT-PCR de la región 5' no codificante del genoma de BVDV.El RNA fue extraidocon TRIZOLa partir de 100 ul de sobrenadantes de cultivos celulares y amplificadopor RT-PCR con los primers M1 y M4 (M. y M.). MDBK no infectadas (calles: 1 y 2),sobrenadante de infección con una cepa aislada de campo (3), control (-) H20 (4),sobrenadante de infección con la cepa Singer (5). A la izquierda (MK)corresponde almarcador de PM cuyos valores se expresan en pb a la izquierda. La flecha indica elfragmento amplificado de 196 pb.

93

RESULTADOS

Fig. 31: Neutralización de BVDV.

_____S+__ ___s-_

100 DlTCsode BVDV en 25 pl de medio sin suero fueron incubadas por triplicado convolúmenes iguales de diluciones seriadas al 1:2 de suero bovino de referencia anti-BVDVcepa Singer (8+) (calles 1, 2 y 3) desde Ia dilución 1:125 hasta 1:16..000 desde la filasuperior a la inferior respectivamente. Se realizaron incubaciones controles de la mismamanera con suero de campo negativo previamente testeado por RIPA(8-) (calles 5, 6 y 7).Para ambos sueros S + y S - se realizaron controles de suero sin incubación con virus(calles 4 y 8 respectivamente).El recuadro corresponde al control de Dosis infecciosas de BVDV con 102, 10, 1 y 0,1DITC50desde la fila superior a la inferior respectivamente y por cuadriplidado (pocillos 9 a12) para cada dilución.

Fig. 32: Plaqueo de BVDVen monocapa de MDBK.

A B C D E

Monocapas de celulares fueron infectadas con 0,5 ml de diferentes diluciones deun stock de BVDVcepa Singer por duplicado (M. y M.). Luego de una hora deadsorción se agregó una mezcla de una parte de agarosa 2% y una parte de mediode cultivo 2X y se incubó a 37°C en estufa humidificada durante 6 días. El reveladose realizó con solución de cristal violeta (M. y M.)Control de células sin infectar (A); diluciones 1:102, 1:103 y 1:104 del stock viral (B,C y D respectivamente). A, B, C y D corresponden a células MDBKy E a TFB.

94

RESULTADOS

4.5.1. Pruebas de inmunogenicidad en ratonesLa proteina E2 recombinante expresada en el sistema Baculovirus

recombinante, se analizó desde el punto de vista inmunogénico para evaluar supotencial utilización como vacuna. En primer término se evaluó la respuestainmune en ratones Balb-c. Un grupo de 5 ratones Balb-c fueron inyectados por vía

intraperitoneal con aproximadamente 10 pg de proteina rEZBac y otros cinco con 5

pg. La vacuna administrada consistió en una suspensión de células Sf21

infectadas con Bac-E2 en 250 pl PBS y homogeneizadas con partes iguales deadyuvante de Freund‘s según se indicó en M. y M. La respuesta inmune se midiópor inmunoprecipitación de BVDV (cepa Singer) marcado con 35S-met y porensayos de neutralización (cepa Singer, Fig. 33).

Los ratones inmunizados con la proteína recombinante produjeronanticuerpos neutralizantes con títqu promedio de 123100. Estos son títulossemejantes a los del anticuerpo de referencia “super neutralizante" AcMo 10(Rubén Donis).

Fig. 33: Análisis de los sueros de ratones inmunizados con rEZBac.

215—105_.69—

43_

1234587\_)5}; 10K 513103 Pte MaAcaEZ

PRE rE2 10 308A) Radioinmunoprecipitación (RIPA). Un Iisado total de células TFB infectadas con BVDVymarcadas con 35S-met (calle 1, 2, 3, 4, 5, 7) o no infectadas (calle 6) fueroninmunoprecipitadas (M. y M.) con una dilución 1:10 de sueros de ratones BaIb-c postvacunación con 5 pg de rEZBac (Calles 1, 3); 10 pg de rEZBac (2, 4). Se muestran losresultados individualesde 2 ratones sobre un total de 5 inmunizados para cada dosis. Lossueros fueron obtenidos a los 20 dias post-vacunación. Como controles se utilizaronsueroratones preinmunizados (5); anticuerpo monoclonal anti-E2 de referencia 6D11 (6, 7). Lasproteinas fueron analizadas en SDS-PAGE 12%. Las barras indican los marcadores dePM cuyos tamaños se indican a la izquierda en kD.B) Neutralización. 100 UFP de la cepa Singer de BVDVfueron incubadas con dilucionesseriadas de sueros de animales preinmunizados (PRE), inmunizados con 5 pg de rE2bac(rE2) o AcMos anti-E2 de referencia 10 y 3D8. Luego la mezcla de incubación se utilizópara infectar monocapas de células TFB. Los resultados se expresan como -log.del títquneutralizante. Los sueros de los ratones vacunados con rEZBac fueron obtenidos a los 30días luego de dos vacunaciones espaciadas por 20 días. Los resultados corresponden alpromedio de los títulos neutralizantes de 5 sueros.

95

RESULTADOS

Para determinar la reactividad de los sueros con otras cepas deBVDV se realizaron ensayos de inmunoperoxidasa (IPA) sobremonocapas de células infectadas con la cepa patrón Singer y con cepaspatrón NADLy OREGON y una cepa de campo (Fig. 34). El suero de losratones inmunizados con rEZBac reaccionó positivamente contra todaslas cepas con el mismo patrón de reactividad.

Fig. 34: lnmunoperoxidasa de monocapas infectadas con BVDV.

A B

Monocapas confluentes de células MDBKinfectadas con la cepa Singer a moi=0,1UFP/cél fueron fijadas a las 48 hs p.i con acetona/metanol. Las monocapas fueronincubadas con sueros de ratones inmunizados con rEZBac en la dilución 1:50 y seprosiguió según las indicaciones del manual ABC KIT Elite VECTASTAIN (M. y M.).Posteriormente se observaron con microscopio (10x).

A) Control de células no infectadas. B) Células infectadas.

Los resultados obtenidos demostraron que la proteína rEZBacresultó un excelente inmunógeno en ratones y se prosiguió entonces arealizar estudios de inmunizacón en conejos

4.5.2. Ensayos de inmunogenicidad de rEZBacen conejosSe inmunizaron dos conejos por vía subcutánea con 50 ug de

rEZBac con dos dosis espaciadas por 21 días como se describió en M.y M.. Los sueros preinmunes, post primera dosis y post segunda dosisse analizaron por separado por RIPA de 35S-BVDVde la misma formaque se indica en la Fig. 33.A (Fig. 35).

Como se observa en la Fig. 35 ambos sueros post primera dosisy post segunda dosis provenientes tanto del conejo A o Breaccionaron específicamente con la proteína E2.

96

+0....0...0.0.00000000COOOOOOOOOOOOOOOOO00.0.00...

RESULTADOS

Los.mismos sueros se analizaron por neutralización contra Ia cepaSinger, obteniéndose títulos neutralizantes significativos del orden de126300.

Estos resultados indicaron que la rEZBac también resultó un bueninmunógeno en conejos y consecuentemente se realizaron los estudios deinmunidad en bovinos.

Fig. 35: RIPA de Iisados de células infectadas con BVDVcon sueros deconejos inmunizados con rEZBac.

12345678910111213lNlINIINIINlllNIlNlEI sobrenadante de un Iisado de células TFB infectadas con BVDV(I) (calles 1, 3, 5,

7, 9, 10, 12) o no infectadas (NI) (2 ,4, 6, 8, 11, 13) y marcadas con 35S-met (M. y M.) fueinmunoprecipitado con‘una dilución 1:100 de sueros de conejos (A o B) de 20 días postprimera vacunación o 20 días post segunda vacunación. Cada dosis vacunal consistió de50 ug de rE2Bac (M. y M.).

Calles: 1, 2, suero preinmune conejo A; 3, 4, suero conejo A post primer dosis; 5, 6,suero conejo A post segunda dosis; 7, 8, MoAc6011 anti-E2 de referencia ; 9, MoAcanti­IBR; 10, 11 suero conejo B post primer dosis; 12, 13, suero conejo B post segunda dosis.Las proteínas fueron analizadas en SDS-PAGE 12%. A la derecha las barras indican losmarcadores de PM 200, 90, 69 y 45 kD desde arriba hacia abajo respectivamente. Laflecha indica Ia posición dela glicoproteína E2.

4.5.3. Pruebas de inmunogenicidad de rEZBacen bovinosDada la alta respuesta inmunogénica obtenida con rEZBacen ratones

y conejos, se estudió su capacidad inmunogénica en bovinos.Un total de 5 bovinos (elegidos previamente al ensayo por carecer de

anticuerpos neutralizantes contra BVDV) fueron inoculados por víaintramuscular con dos dosis de 40 o 10 pg de rEZBac espaciadas por 43días según se indicó en M. y M. (Tabla 2 y gráfico anexo).

Los bovinos desarrollaron una respuesta neutralizante significativa enrelación a la obtenida con una vacuna inactivada de BVDVdisponible en elmercado, inclusive cuando recibieron la dosis más baja de antígeno. A los 21días de la aplicación de la segunda dosis (64 dpv) se observó un aumentodel títqu de anticuerpos para ambas dosis, y 47 días después de la segundadosis (90 dpv) se observó una disminución en el títqu neutralizante

97

RESULTADOS

permaneciendo en todos los casos con títulos superiores los animales que recibieronmás antígeno.

Los resultados obtenidos con la inmunización de bovinos con rEZBac

indicaron que el antígeno recombinante resultó un excelente inmunógeno con buenapotencialidad para su uso comercial.

Tabla 2: Títulos de anticuerpos neutralizantes contra la cepa Singer debovinos vacunados con 2 dosis de rEZBac.

Vacuna Animal Título neutralizante

Odpv 43 dpv 64 dpv 90 dpv1° Dosis 2° DosisSangría 1 Sangría 2 Sangría 3 Sangria 4

NO VACUNADOS 093 - - — ­156 - — - ­

VACUNA 10pg 25 — 1:8 1:128 1:8“A” 10pg 01 - — 1:256 ­

10pg 16 - - 124096 1:64VACUNA 40pg 0532 - 1:8 1:2048 11512

“B” 40pg 14 — 1:8 1:3192 1:512

VACUNA "A"

4,0 l n Bovino25

z lm 3’0 DBovino 12É 2 o

E, l IBovino 16—| 1,0

DBovino0,0 (N99)

odpv 43dpv 64dpv 90dpv v.c.(') v.c.(")

VACUNA "B"4,0

f, 3,0 ElBovino 5_°aF 2,0 * ' ' ' "7' I Bovino14óO-,' 1,0 e e e fl e e

a Bovino(Neg)0,0 ””””"" ' """1 "'"”T ""' 'T'"‘" ' _ 'l" 'l0 dpv 43 dpv 64 dpv 90 dpv VC .(’) V‘C‘(")

En los gráficos se expresan los títulos correspondientes a la Tabla 2 como -log. del tituloseroneutralizante en función de los días post-vacunación. Las vacunas A y B fueronaplicadas 2 veces, al día 0 y al dia 43.

(*) Bovinos vacunados con dos dosis de una vacuna anti-BVDVcomercial producen titulosmáximos de 122048 (Fulton y Burge, 2001).(“) Bovinos vacunados con dos dosis de una vacuna anti-BVDVcomercial producen titulosde 1:8 (Centro de VirologíaAnimal, datos no mostrados).

98

RESULTADOS

4.6. Expresión de E2 en un sistema VSVrecombinante

Ya que el sistema VSV recombinante demostró ser efectivo para laexpresión de diferentes glicoproteínas virales, nos propusimos usar estesistema para la expresión de la glicoproteína E2 y posterior estudio de sucapacidad para inducir respuesta inmune específica contra BVDV.

4.6.1. Construcción y caracterización del recombinante VSV-E2A fin de expresar Ia glicoproteína E2 en este sistema el gen ss-E2 fue

escindido del plásmido pss-E2 y clonado en el plásmido pVSVXN1(Schnell yco|., 1996) en los sitios Xho I y Nhe I. EI gen fue insertado entre los genes G yL para generar el plásmido pVSV-E2 que se usó para cotransfectar célulasBHK-21 junto con los plásmidos conteniendo los genes N, P y L de VSV yrecuperar el virus recombinante VSV-E2 como se describió en M.y M..

Para caracterizar los productos proteicos expresados por VSV-E2,células BHK-21fueron infectadas con VSV-E2 a m.o.i de 5 y marcadas con 358­

met entre las 6 y las 8 hs p.i. como se describió en M. y M.

Los lisados celulares fueron inmunoprecipitaros con AcMo 10/12 anti­BVDVy las proteinas inmunoprecipitadas fueron corridas electroforéticamenteen SDS-PAGE seguido por fluorografía (Fig.36). El perfil polipeptídico reveló unúnico polipéptido (rE2V) que reaccionó con el AcMo 10/12 y que comigró con IaE2 auténtica de las células infectadas con BVDV (calles 2 y 3respectivamente). Un análisis paralelo en geles no reductores de idénticasmuestras precipitadas con el AcMo 10/12 confirmó que la proteinarecombinante rE2V expresada por VSV-E2 era un dímero unidocovalentemente (calle 5). Una banda menor muy tenue que migró más que elMarcador de PM de 45-kD correspondiente a un monómero no reducido,también puede verse en esta calle.

El gen foráneo ss-E2 es entonces transcripto y traducido en elcitoplasma de las células BHK-21infectadas con el recombinante VSV-E2.

Las calles 1 y 6 en la Fig. 36.8 muestran el perfil polipeptídico de losviriones marcados con 35S-met purificados del sobrenadante de cultivos deBHK-21 infectados con VSV-E2 y analizados en paralelo bajo condicionesreductoras y no reductoras respectivamente. Como se anticipó la glicoproteínaVSV-G no reducida (Gu, calle 6) mostró una mayor movilidad con respecto a sucontraparte reducida (Gr, calle 1). Esto es debido a que presenta unaestructura más compacta estabilizada por puentes disulfuro (Grigera y col.,1992). Sin embargo no se detectó una banda extra correspondiente al

99

RESULTADOS

polipéptido rE2V en la calle 1, un resultado inesperado ya que rE2 estabapresente en la superficie de las células (como confirma la inmunofluorescencia enFig. 37.A) y presumiblemente disponible para la incorporación en la partícula en elproceso de gemación.

Fig. 36: Expresión de la E2 recombinante en células BHK-21infectadas conVSV-E2.

N P M G LVSV-wi ­

P M G ssEZ Lvsvsz x ­

CTCGAGATGTTGTCTTATCTAATCTT AGMCAGAAGGCCTCAGGTMTAGCTAGC

Xhol Met Leu Ser Tyr Leulle Phe Glu Gin Lys Ala SerGly Nhel

B MSH + MSH ­

W i 95- "a. F 4LGr u ‘— rE2V> 67- > «Gu

rE2V-> m fl 4. 45'” Mal/5%“ N

. 30- .<M.9

1 2 3 4 5 6AoMo AcMo AcMo AcMoa-E2 a-E2 a-lBR a-E2

(A)Loca|ización genómica del gen ssE2 en el VSV-E2 recombinante. En Ia partesuperior de la figura se muestra un esquema del genoma del VSV (VSVwt). El gen ss-E2que codifica para 374 aminoácidos de E2 unidos a la secuencia señal de la proteína G deVSV fue clonado en los sitios Xho I- Nhe I hacia 3' del gen VSV-G. Se muestran losprimeros aa de la ss y los últimos de E2.

(B) Expresión del rE2 en células infectadas con VSV-E2. Las células BHK-21infectadas a m.o.i= 5 con VSV-E2 fueron marcadas con 35S-met entre las 7 y las 9 hs pisegún M. y M.. Luego los Iisados celulares en buffer HO fueron clarificados y llevados a0,1% de SDS, homogeneizados y reclarificados (M. y M.). El sobrenadante fue alicuotadoen fracciones provenientes de aproximadamente 3,2 105 cel. las cuales fueroninmunoprecipitadas con AcMo 10/12 anti-E2 dil 1:10 (calle2) o con AcMo anti-Virus de larinotraqueítis infecciosa (IBR) como control —en la dil. 1:10 (calle 4). Los productos de lainmunoprecipitación fueron analizados electroforéticamente en condiciones reductoras(MSH+)en forma paralela a la E2 nativa viral inmunoprecipitada a partir de Iisados de célulainfectadas con BVDV(calle 3). La calle 5 muestra el perfil de una alícuota idéntica de VSV­E2 analizado en condiciones no reductoras (MSH-). Las calles 1 y 6 en Ia fluorografíamuestran respectivamente los perfiles reductores y no reductores de los viriones purificadosde células BHK-21infectadas con VSV-E2 y marcados metabólicamente con 35S-metdesde6 h p.i. hasta la cosecha (aproximadamente 20 hs p.i.) según M. y M. Las calles 5 y 6 sesobreexpusieron para detectar los polipéptidos que migran entre VSV L y G en lafluorografia. Las barras corresponden a la posición relativa de los marcadores de PM consus valores en kD a la izquierda; Gu, proteína G no reducida; Gr, proteina G reducida.

100

RESULTADOS

Se especuló entonces con que las altas concentraciones de lasproteinas de VSV, particularmente N, pudiesen estar enmascarando lapresencia de rE2Vque, precisamente. debería migrar por encima de Ia proteínaN. Esto fue confirmado en el análisis de viriones de VSV-E2 en condiciones no

reductoras que muestra una banda difusa comigrante con la E2 homodimén'capresente en lisados infectados con VSV-E2 (por debajo de la proteina VSV L,Fig. 36.8, calle 6).

El nivel de expresión de rE2V relativo al de la proteina VSV-G se estimó

por densitometría del área de las bandas en la fluorografia posterior a lainmunoprecipitación con sueros anti-E2 y anti-G de los sobrenadantes delisados de células infectadas con VSV-E2 (M. y M) (un perfil representativo semuestra en las calles 4 y 5 de la Fig.37.B). El promedio de tres experimentosindependientes reveló un valor de 0,55 en la relación rE2V/G sugien'endo quelos niveles de expresión de rE2Vestán dentro de los rangos esperados para ungen heterólogo distal al extremo 3' de la secuencia del gen G (Schnell y col.,1996)

4.6.2. Expresión de la rE2Ven la membrana celular y viralDado que en el análisis directo de los viriones purificados marcados con

35S-met no se detectó la proteína E2, y con el objetivo de aumentar lasensibilidad y la especificidad del análisis se realizaron inmunoprecipitacionesde virones de VSV-E2 desnaturalizados con SDS con anticuerpos específicosanti-E2 y anti-G según se indicó en M. y M (Fig. 37. B).

Las partículas virales marcadas fueron solubilizadas en buffer RIPA,clarificadas e inmunoprecipitadas con suero policlonal de conejo anti-rEZBac oanti-VSV-G y analizadas en 12% SDS-PAGE seguido por análisis bajocondiciones no reductores (Fig 37.8). El suero hiperinmune anti-E2 reconocióuna banda correspondiente a rE2 dimérica (calle 2), la fluorografiasobreexpuesta también reveló la presencia de proteínas de VSV (por ejemploIa proteina M) en los inmunoprecipitados, debido posiblemente a un bindinginespecífico del suero de conejo y/o a una disrupción incompleta de la partículaviral durante el procedimiento (Kahn y col., 1999).

La comparación de los perfiles fluorográficos de las partículas viralesy lisados totales mostró que la incorporación de la glicoproteina rE2Ven losviriones es significativamente menos eficiente que la de VSV-G. Lacuantificación densitométrica de las bandas y la corrección por el número deresiduos de metionina, resultó en una relación de rE2/G en los viriones de

aproximadamente de 0,1. Esto representaría una disminución de 5 veces101

RESULTADOS

con respecto a la relación entre ambas proteínas observada en el lisadototal de células BHK-21 infectadas con VSV-E2 (calles 4 y 5).

Fig. 37: Presencia de rE2Ven la membrana plasmática de células infectadascon VSV-E2y en la partícula viral purificada.

A B

Microscopíade campo

daro

rE2>

G>

h .2 3 4 5Prein.a-E2\_/ a-E2

a-VSVG

(A) Fluorescencia indirecta: monocapas de células BHK-21 infectadas con VSV-E2a moi=5 fueron fijadas con formaldehído a las 8 hs post-infección (M. y M.) eincubadas con suero de conejo anti-rEZBac o anti-VSV-G (1:100) (a-E2 y a-VSVGrespectivamente). Posteriormente las monocapas fueron incubadas conanticuerpos anti-conejo conjugados con FlTC (1:100) (M. y M.) y tras extensivoslavados con PBS observadas con microscopio de fluorescencia (40x).(B) Aproximadamente 40 pg de viriones VSV-E2 purificados y marcados con 358­met. (M. y M.), fueron inmunoprecipitados con diferentes sueros (M. y M.). Controlnegativo con suero preinmune (calle 1), suero de conejo anti-rEZBac (calle 2),suero de conejo anti-VSV-G (calle 3). Las muestra de la calle 3 representa unaquinta parte de la muestra inmunoprecipitada con suero preinmune o anti-E2(calles 1 y 2 respectivamente). Las calles 4 y 5 muestran los perfiles de idénticasalícuotas de lisado de células totales precipitadas con suero policlonal anti-VSV-Go anti-E2 respectivamente analizados en paralelo. Las barras corresponden a laposición relativa de los marcadores de PM con sus valores en kD a la derecha.

Los resultados obtenidos permiten concluir que las infecciones conVSV-E2 expresaron una proteína E2 (rE2V) recombinante concaracterísticas similares o iguales a la E2 de BVDV en términos dereactividad con sueros especificos y el tamaño y la capacidad paraformar dímeros. Es diferente, sin embargo, en cuanto a que se expresaen la superficie celular ya que la E2 de BVDVse encuentra únicamenteasociada a las membranas intracelulares (Fig. 38).

102

RESULTADOS

Como puede observarse en la Fig. 38(B), E2, visualizada por IF encélulas MDBK infectadas con BVDV,tiene una distribución granular en elcitoplasma de las células infectadas. En cambio en células BHKinfectadascon VSV-E2 (A), la proteína recombinante se distribuye en forma difusa enel citoplasma celular.

Fig. 38: lnmunofluorescencia

A) BHK infectadas con VSV-E2 B) MDBKinfectadas con BVDV

NO PERMEABILIZADA PERMEABILIZADA NO PERMEABILIZADA PERMEABILIZADA

Campoclaro

FIuorescencia

Monocapas de células BHK-21 fueron infectadas con VSV-E2 a moi de 0.1 (A) ymonocapas de células MDBK fueron infectadas con BVDV a moi de 1 (B) eincubadas a 37°C, durante 24 hs o 48 hs respectivamente. Posteriormente lascélulas infectadas fueron fijadas con formaldehído y luego penneabilizadas conTritón X-100 o no permeabilizadas (M. y M.). Se realizó la inmunofluorescencia conAcMo 10/12 y suero anti-ratón FITC como descripto anteriormente yposteriormente se observó con microscopio (40x). El panel superior corresponde ala microscopía de campo claro y el inferiora la inmunofluorescencia.

4.6.3. Pruebas de inmunogenicidad de VSV-E2en ratonesLas cepas salvajes de VSV causan encefalitis letal en los ratones

inoculados por vía intranasal inclusive a dosis tan bajas como 102UFP/animal (Wagner 1974, Roberts y col., 1998). Por consiguiente el uso dela quimera VSV-E2 como vacuna estaría condicionado a la capacidad deinducir respuesta inmune seroneutralizante pero también a la incapacidadde producir patogenicidad en el huésped.

Se analizó la capacidad inmunogénica de VSV-E2 y su virulencia enratones BaIb-c inoculando grupos independientes de 5 ratones por vía

intranasal con 102, 103, 105 y 1o7 UFP en 50 tu de PBS y midiendo la

103

RESULTADOS

respuesta seroneutralizante a BVDV y la reactividad de los sueroscontra el BVDVmarcado con 35S-met. (Tabla 3 y Fig.39).

Todos los animales inoculados con una única dosis mayor o iguala 103 UFP desarrollaron una alta respuesta inmune neutralizante contraBVDV (con títulos del orden de 1:1500-3000) a los 20 dias postinoculación.

El títqu permaneció constante a los 40 dpi independientemente de lareinoculación de 105 UFP en el día del primer sangrado. La tabla tambiénmuestra la respuesta seroneutralizante obtenida en ratones con dos

inoculaciones de 20 ug rEZBac.

La respuesta seroneutralizante anti-BVDVfue duradera en el tiempoya que los sueros testeados alrededor de 180 dpv mantuvieron el títquneutralizante en el orden de 1:1000. Los animales no presentaron signos dela enfermedad neurológica con VSV aunque si una leve disminución depeso (5-10% del peso) en la primera semana luego de la inoculación perose recuperaron entre el día 8 y 9.

El título neutralizante obtenido resultó similar con dosis de 103hasta

107UFP lo que sugirió que era necesaria la replicación viral para generarrespuesta inmune. Esto fue avalado por estudios que sugieren que lainoculación intranasal con VSV inactivado por UV no induce anticuerposdetectables anti-VSV (Roberts y col., 1999). La falta de respuesta inmunecon dosis de 102UFP/animal sugiere que esta dosis corresponde a menosde una unidad infecciosa en el animal.

La respuesta seroneutralizante en los animales se correlacionó con lacapacidad de inmunoprecipitar virus. El fluorograma de la Fig. 39 muestra lareactividad de los sueros anti-VSV-E2tomados a 20 días postinfección con107, 105, 1o3 y 1o2 UFP (calles 1 a 4 respectivamente ).

Los sueros de animales inoculados con 103 o más reaccionaron

contra E2, mientras que los inoculados con 102 no reaccionaron porneutralización ni por RlPA.

ICO...O...O...0....OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOCOOOOOO

RESULTADOS

Tabla 3: Respuesta inmune de ratones inmunizados con VSV-E2

Vacuna Título neutralizante

4,03,5z A”,

m 3,0 .107UFP

g 2'5 D103UFPE 2,0 ¡10‘UFP

g; 1,5 107UFP__I 1,0 rEZBac

Pm

Po

Ddpv 20 dpv 40 dpv 180 dpv

Títqu neutralizante anti-BVDVen suero de ratones inoculados con VSV-E2:cuatro grupos independientes de ratones Balb-c se inocularon intranasalmentecon dosis de 50 ul de 102, 103, 105, 1o7 UFP de VSV-E2 en el día o. Lasmuestras de suero se tomaron a los 20 días post vacunación inicial(dpv) y semidió el título neutralizante (SNT) por reducción de número de UFP contra lacepa Singer de BVDVen monocapas de células MDBK(M. y M.). Los animalesrecibieron una segunda dosis de 105UFP a los 20 dpv y el suero fue testeado alos 40 y 180 dpv. El suero rEZBac corresponde a un pool de sueros de 5ratones BaIb-c inoculados con rEZBac con dos dosis de 20 ug. Los resultadosse expresan como la máxima diiución que inhibió el 50% de las UFP. Entreparéntesis se expresan ios títulos contra VSV (serotipo Indiana San Juan) encélulas BHK-21 a los 20 dpv.El gráfico representa -Iog. de los titulos neutralizantes obtenidos contra BVDVpara cada dosis de vacuna en función de los días de la toma de muestra.

105

l...OOO...OOOOOOOOOOOOOOOOOCOOOOOOOOOOOO0.0.0.0...

RESULTADOS

Fig. 39: RIPA de Iisados de células MDBK infectadas con BVDV, consueros de ratones inmunizados con VSV-E2.

Lisados de aproximadamente 3,2 105cel. MDBKinfectadas con BVDVy marcadoscon 35S-met. (M. y M.) fueron inmunoprecipitados por separado con 4 pools desueros (20 dpv) representativos de animales inoculados con una única dosis de 107(calle 1), 1o5 (calle2), 1o3 (calle 3) y 1o2 UFP de vsv-52 (calle 1 a 4respectivamente). Los productos de la inmunoprecipitación se analizaron en 12%SDS-PAGE en condiciones reductoras (M. y M.). Las barras corresponden a laposición relativa de los marcadores de PM con sus valores en kD a Ia izquierda

Se investigó además la inmunogenicidad del virus purificadainactivado con BEY e inoculado por vía intraperitoneal para Io cual grupos

de 5 ratones fueron inmunizados con dosis de aproximadamente 0,1 o 1 ugde proteína rE2V. Los sueros fueron analizados por inmunoprecipitacióncontra BVDV marcado metabólicamente con 35S-met y por neutralización(Fig. 40). Todos los sueros a excepción de los de los animales vacunadoscon las dosis más bajas reaccionaron especificamente con la E2 de BVDV.Los titulos neutralizantes obtenidos fueron del orden de 12200,inferiores en

1 unidad log. en relación a los obtenidos con la inoculación del virus vivo.Estos resultados muestran que, si bien existió respuesta inmune

humoral, el título de anticuerpos obtenido fue bajo en relación al inducidopor las particulas no inactivada. Esto es muy posiblemente debido a

106

RESULTADOS

subóptimas cantidades de E2 presente en la dosis de partículas viralesutilizada.

Fig. 40: Inmunoprecipitación de E2 con sueros de ratones inoculados con VSV-E2

215.__1os—69—43 ————

28--­

1 2 3 4 5 6

Sobrenadantes de lisados celulares de MDBKinfectados con BVDVy marcadasmetabólicamente 358-met. (M. y M.) fueron inmunoprecipitados con sueros deratones Balb-c inoculados con VSV-E2 inactivado. Las proteínasinmunoprecipitadas fueron resueltas en SDS-PAGE 12%. AcMo anti-E2 10/12(calle 1), suero preinmune (calle 2), sueros de animales inoculados conaproximadamente 0,1 pg (calles 3 y 4), sueros de animales inoculados conaproximadamente 1 pg de rE2 (calles 5 y 6). Las barras corresponden a la posiciónrelativa de los marcadores de PM con sus valores en kD a la izquierda

4.7. Potencial de la proteínas E2 recombinantes comoreactivos para la detección de anticuerpos anti-BVDV

Parte de este trabajo de tesis tuvo como objetivo explorar la utilización delas proteína recombinante rE2 como reactivo en el diagnóstico inmunológico deBVDV.

Los ensayos de ELISA para la detección de anticuerpos anti-BVDV ensueros bovinos utilizan en general como blanco antlgénico tanto extractos decélulas infectadas tratadas con detergente, virus purificados como proteínasrecombinantes producidas en bacterias. Estos antígenos generalmente se pegan ala placa de ELISApor medio de anticuerpos monoclonales. Sin embargo debido ala difícil purificación de BVDVy a que los títulos virales que se obtienen en lasinfecciones en cultivos celulares son generalmente bajos, la cantidad y la calidadde antígeno disponible para el diagnóstico serológico es limitada. La utilización deproteínas estructurales expresadas en bacterias presentaría también limitacionesdebido a Ia falta de glicosilación que modificaría epitopes importantes de lasmismas

Otros problemas asociados a los ELISAson niveles de background altos yvariables causados por la contaminación con BVDVadventicio del antígeno usadoen el test o por reactividad cruzada de las inmunoglobulinas conjugadas con el

107

RESULTADOS

antígeno debido a su difícil purificación. dando como resultado una baja relaciónentre señal específica e inespecífica. (Sandvik y col., 1999). Por todas estasrazones los ELISA para la detección de anticuerpos no han ganado granaceptación y si bien existen kits disponibles comercialmente, el test deseroneutralización sigue siendo el más comunmente usado para el diagnóstico deanticuerpos anti-BVDV.

Sin embargo el test de seroneutralización trae aparejado otrosinconvenientes tales como la dependencia de infraestructura adecuada para elcultivode células y los tiempos más extensos para la obtención de resultados.

En este trabajo de tesis y como parte de la caracterización de la proteína E2recombinante se decidió expresar Ia misma en forma soluble de manera depermitir su fácil recuperación evitando pasos de purificación. Como se mostróanteriormente la expresión de la proteína E2 sin su región carboxilo terminal diocomo resultado una proteína recombinante delecionada que conservócaracterísticas propias del antígeno nativo E2 como Ia reactividad con anticuerposmonoclonales dependientes de la conformación y la dimerizacón, al menos en elsistema de expresión Vaccinia transiente.

El sistema de expresión de proteínas recombinantes de Drosophilamelanogaster presenta como ventaja en relación a los otros dos sistemasutilizados en esta tesis (el sistema Vaccinia transiente y el sistema de Baculovirusrecombinante) que no depende de ninguna infección viral para la producción delantígeno. La misma consiste en una simple inducción con SO4Cu de las célulasrecombinantes con el gen de interés. Como las células pueden inducirse en unmedio libre de suero, proteínas que se liberen al sobrenadante estarianrelativamente libres de “proteínas contaminantes”.

Se decidió expresar la proteína E2 truncada (AE2) sin su región de anclajea membrana en el sistema Drosophila melanogaster para utilizarlaeventualmentecomo posible antígeno en un ELISApara la detección de anticuerpos bovinos anti­BVDV. En el diseño del ELISA la proteína se “pegaría” a la placa mediante unanticuerpo monoclonal anti-E2 también obtenido como parte del desarrollo de estetrabajo de tesis.

4.7.1. Expresión de AE2en células de Drosophila melanogasterSe clonó el fragmento ss-AE2 en el vector pMTN5-His entre los sitios

EcoR V y Xba l bajo el control del promotor de metalotioneína (MT) de D.

melanogaster, inducible por SO4Cu, como se indicó en M.y M.

Se transformaron bacterias DH5-a con el producto de la ligación y elDNAde las colonias obtenidas resistentes a ampicilina se cortó con las enzimas

de restricción EcoR V y Xba l para confirmar el clonado del fragmento ss-AE2

¡08

RESULTADOS

Para la obtención de lineas estables Drosophila melanogaster, Schneider 2(82) que expresaran la proteína recombinante ss-AE2 se realizaron transfecciones

de las células con el vector clonado pMTN5-His/ss-AE2 (pMT/AE2) purificadosegún se describió en M. y M. Luego de obtenidos los policlones resistentes aHigromicina se analizó el producto de expresión, proveniente de la inducción conSO4Cu, tanto en el Iisado celular como en el sobrenadante de cultivopor separado(Fig. 41). La antigenicidad de la proteína se testeó por Western-blotting con unsuero comercial anti-BVDVsegún M. y M.

Las células de Drosophila melanogaster produjeron una proteínarecombinante que fue reconocida por el suero policlonal específico anti-BVDVtanto en el sobrenadante celular como en la fracción intracelular (calles 5 y 6). La

proteína recombinante liberada al sobrenadante se denominó AE282. El

reconocimiento de la AEZSZ por el suero anti-BVDV indicó que esta proteína

conservaba características antigénicas de la proteína E2.La proteína intracelular migró más lentamente que la presente en el

sobrenadante, esto posiblemente debido a distintos grados de glicosilación o a lafalta de clivaje de la secuencia señal.

La proteína AE282 pudo ser detectada por Westem-blotting pero no pudoser detectada por Coomasie blue aún en concentrados 10X de la muestra porprecipitación con ácido tricloroacético (resultados no mostrados)

Fig. 41: Expresión del producto de pMTIAEZen células de Drosophilamelanogaster.

12345678Células de Drosophila melanogaster transfectadas con pMT/AEZ y resistentes aHigromicina (policlon SZIAE2) se indujeron con SO4Cu y se incubaron 5 días a 24°C (M. yM.). Tanto el Iisado celular como el sobrenadante de cultivo se analizó por SDS-PAGE­10% y los geles fueron revelados por Coomasie Blue según M.yM. (A)o electrotransferidosa una membrana de nitrooelulosa e incubados con anticuerpos bovinos anti-BVDV(VMRD)12500 en PBS y posterior incubación con suero anti-bovino conjugado con peroxidasa yrevelado con 4-chloro-naphtol (M. y M.) (B).Lisado celular del policlon SZ/AE2 (calles 1 y 5); sobrenadante celular del policlon 82/AE2(2 y 6); Iisado celular de D. melanogaster pMT/B-gal-control negativo- (3 y 7); sobrenadantede cultivo de células de D. melanogaster. pMT/B-gal-control negativo-.( 4 y 8).Las barras corresponden a la posición de los marcadores de PM con sus valores en kD a laizquierda.

109

RESULTADOS

4.7.2. Análisis de la formación de dímeros de la AE2 expresada enDrosophilamelanogaster

Para estudiar si la proteína AEZSZ se sintetizaba como dímero elsobrenadante del policlón se resolvió en condiciones no reductoras y seelectrotransfirió a una membrana de nitrocelulosa y se reveló con anticuerposespecíficos. La Fig. 42 muestra que la proteina expresada en el sistemaDrosophila melanogaster y liberada al sobrenadante se expresó como dímerocomo su contraparte viralcon secuencia transmembrana (calle 6).

Fig. 42: Análisis por Western-blotting de la proteína recombinante expresadaen Drosophila melanogaster en condiciones no reductoras.

MSH + MSH ­

_ 1-DAE282<—AE282 69

23

MK 1 2 3 4 MK 5 6

Sobrenadantes de la inducciónde células de D. melanogaster 82 con el gen ss­AE2 (linea SZ/AEZ) Se analizaron por Western-blotting en condicionesreductoras (MSH +) y no reductoras (MSH -).Se resolvieron 25 ul de sobrenadante de cultivo por calle en un gel 10% SDS­PAGE y luego las proteínas se electrotransfirieron a una membrana denitrocelulosa y se testearon con suero bovino comercial anti-BVDV.Sobrenadante de cultivo de SZ/AEZ(calles 1, 2, 3, 6); sobrenadante de cultivo deD. melanogaster que expresa la proteína B-galactosidasa (4, 5). MKcorrespondeal Marcador de PM y los números a la izquierda indican los tamaños de losmarcadores en kD.AEZSZ: monómero de AE2, DAE282: dímero de AE2.

Para la puesta a punto del ELISAse eligió el antígeno AEZSZproducido

en Drosophila melanogaster y no rEZBac producido en Spodoptera frugiperda.Esto es debido a que si bien la productividad de AEZSZ fue menor encomparación a la rEZBac (la primera no pudo detectarse en geles SDS-PAGEteñidos con Coomasie Blue y tampoco generó respuesta inmune en ratonesinoculados con 250 ul de sobrenadante de cultivos de SZIAEZ), laconcentración de proteínas inespecíficas en el sobrenadante del policlón

estable 82/AE2 fue consistentemente menor con respecto al pellet de células110

RESULTADOS

de Spodoptera frugíperda rEZBac resuspendidas en PBS. También evaluamosIa posibilidad que la lisis de las células para su utilización como antígeno en unELISA,podría generar micelas que distorsionaran los resultados.

4.7.4. Obtención y caracterización del anticuerpo monoclonal anti-E2La obtención de anticuerpos monoclonales se realizó según se describió en M.y M. , a partir de linfocitosde bazos de ratones Balb-C inmunizados con 3 dosisde 10 pg de rEZBac.

La búsqueda de los hibridomas especificos obtenidos de la fusión de loslinfocitos de ratones inmunizados con las células de mieloma se realizó

analizando los sobrenadantes por la técnica de inmunofluorescencia sobremonocapas de células infectadas con BVDV y permitió la detección de 3hibridomas positivos de los que sobrevivió únicamente uno ( 2.9.H). Se produjolíquido ascítico en ratones y se confirmó Ia especificidad del anticuerpo para laE2 de BVDV mediante inmunoprecipitación de BVDV marcado con 358- met.

(Fig. 43).

El anticuerpo 2.9.H fue testeado por neutralización contra la cepa Singerresultando positivo. También se estudió la reactividad del anticuerpo contraotras cepas de BVDV mediante el test de inmunoperoxidasa resultandotambién reactivo contra la cepa NADL, pero no así contra la cepa Oregon(resultados no mostrados).

Fig. 43: inmunoprecipitación de E2 de lisados de células TFB infectadascon BVDVutilizando AcMo 2.9.H.

1 2 3 4

Sobrenadante de lisados de células provenientes de aproximadamente 3,2 105cél.TFB infectadas con BVDVy marcadas con 35S-met según M. y M. (calles 2, 3, 4) ono infectadas (calle 1) fueron inmunoprecipitados AcMo 2.9.H dil. 1:50 (calles 1,2),AcMo anti-E2 de BVDV 6011 dil.1:50 como control positivo (3) y AcMo anti-Virusde la rinotraqueítis infecciosa (IBR) dil. 1:50 como control negativo - (4). Las barrascorresponden a la posición relativa de los marcadores de PM con sus valores enkD a la izquierda.

lll

RESULTADOS

El principal objetivo de la obtención de un anticuerpomonoclonal anti-E2 y de la proteína recombinante AEZSZ fue lapuesta a punto de un sistema de ELISA que utilice ambosreactivos para la detección de anticuerpos anti-BVDVen muestrasde sueros bovinos.

En el diseño de ELISA propuesto, el antígeno recombinanteAE282 es atrapado en la placa a través del anticuerpo monoclonaly enfrentado a diluciones de sueros incógnita con posteriorrevelado. En un paso previo de normalización se verificó laespecificidad del anticuerpo monoclonal 2.9.H porinmunoprecipitación de Ia proteína recombinante AEZSZ marcadametabólicamente con 35S-met. (Fig. 44).

El análisis confirmó que el AcMo 2.9.H reaccionaespecíficamente con la proteína recombinante AE282 y demostrósu potencialidad como reactivo en el esquema de ELISApropuesto.

Fig. 44: lnmunoprecipitación de AE282 de sobrenadantes de células deDrosophila melanogaster .

Sobrenadantes del policlón estable de células D. melanogaster que expresan laproteína recombinante AE2 (calles 1, 2, 4) o la proteína heteróloga gp3 de IBR

:omo control negativo (calle 3), provenientes de aproximadamente 3 105 célulasmarcadas con S-met fueron inmunoprecipitados según M. y M.. Suero bovino:omercial anti-BVDV (calle 1), AcMo 2.9.H (calles 2 y 3), AcMo inespecifico (calle4). Las barras corresponden a la posición relativa de los marcadores de PM consus valores en kD ala izquierda.

ll2

DOC....00.0...OO...OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO0.0.0.0...

RESULTADOS

4.7.5. ELISApara la detección de anticuerpos anti-E2 de BVDV

4.7.5.a. Optimización y standarización de reactivos y protocoloEI anticuerpo monoclonal (AcMo 2.9.H), el antígeno (AEZSZ) y el

conjugado fueron titulados a fin de definir las mejores condiciones de uso.Una vez establecidas las diluciones óptimas de los reactivos se

analizaron diferentes diluciones de sueros bovinos, utilizándose como

referencia positiva un suero comercial anti-BVDV (VMRD) y como referencia

negativa un suero de campo negativo seleccionado como tal porinmunofluorescencia y por neutralización contra la cepa Singer. Cada suero seanalizó con y sin antígeno recombinante, esto último con el objetivo deindependizar los resultados de las reacciones inespecíflcas particulares decada suero (Fig.45).

Fig. 45: ELISApara la detección de anticuerpos anti BVDV

Comercial M1+ M2+ M3+ M4- M5+

l- +H—.+\C +\f—+\1+\C +l12 345 6789101112Dil. de suero i .Á i. ._ . , ,1/200, w -»

0335*! «¿9319 Ü“‘ [*r “2;

La placa fue sensibilizada con AcMo 2.9.H (11200) según M. y M.. Luego se lavócon PBS Tween 0.5% y se incubó durante 1 hora a 37°C con antígeno AEZSZ(1:40) (+) o sin antígeno (-) en PBS, 0,02% Tween 1% SE. Se lavó nuevamentecon PBS Tween 0.5% y se incubó durante 1 hora a 37°C con diluciones seriadasen base 2 (indicadas a la izquierda) de los sueros bovinos en el siguiente orden:suero comercial (VMRD)(calles 1 y 2) y sueros bovinos de campo M1 (calles 3 y4), M2 (calles 5, 6), M3 (calles 7 y 8); M4 (suero negativo): (calles 9 y 10) y M5 (11y 12). Los sueros se diluyeron en PBS 0,02% Tween 1% SE. Se lavó nuevamentecon PBS Tween 0.5% y se incubó durante 1 hora a 37°C El revelado se realizó conABTS según M. y M.

113

RESULTADOS

En todos los casos fue posible distinguir sueros positivos denegativos encontrándose una marcada diferencia entre los valores de lasabsorbancias de ambos.

Este estudio dio resultados satisfactorios en cuanto a la capacidaddel test para diferenciar entre los valores positivos y negativos. Sinembargo las diluciones de los sueros incógnita, utilizadas en este ensayopreliminar, fueron muy altas y por Io tanto poco prácticas e inconvenientesdesde el punto de vista operativo para el diagnóstico serológico. Se buscóentonces establecer una dilución inferior y que resultara práctica para eltest.

Esencial para el buen funcionamiento del test bajo estas condicionesfue la disminución de la señal inespecífica o background. Esto se logróaumentando Ia fuerza iónica del diluyente y Ia concentración de detergentey disminuyendo los tiempos de incubación.

Las mejores condiciones se establecieron para una dilución 1:20 delos sueros incógnita en buffer PBS. 1% SE, 0,2 M NaCl y 0,5% Tween 20.

4.7.5.b. Expresión de los resultadosLa densidades ópticas (absorbancias) son medidas absolutas que

están sujetas a variaciones debidas a cambios de la temperatura ambiental,los parámetros del test y el instrumental fotométrico, entre otras.

Con el objetivo de normalizar los valores y eliminar Ia variabilidadasociada a los parámetros mencionados, los resultados fueron expresadoscomo porcentaje del valor de un control de suero positivo (C+) y de uncontrol de suero negativo (C-), incluidos en cada placa, según la siguientefórmula:

Porcentaje de positividad (PP)= (DNMn-DNC-)/(DNC+—DNC-)x 100

donde DN corresponde a la diferencia neta entre la absorbancia del sueroobtenida al enfrentado al antígeno y Ia absorbancia obtenida al enfrentarloa la solución sin antígeno (señal inespecífica del suero). Mn hace referenciaa la muestra de suero incógnita (Wrighty col., 1993).

4.7.5.c. Repetibilidad del métodoPara la prueba de repetibilidad (ensayos interplaca), se determinó el

coeficiente de variación (CV=DS/media) interensayo comparando valoresde PP de dos sueros positivos (control 3 y control 4) en 75 ensayos

independientes (Fig 46).

H4

RFSUITAnos

Para ambos sueros se obtuvieron valores de CV del 11%. Estos valores

bajos de CV indicaron que existió una alta repetibilidad del método (Jacobson,1998)

También se realizaron 65 determinaciones de PP de un suero negativo(control 294). Dado que este suero presentó muy bajos valores de PP y muy

pequeñas fluctuaciones, no se tuvo en cuenta el alto valor de %CV obtenido

como consecuencia de los bajos valores de PP.El % CV interplaca se encontró en un rango de 3—9%para ambos sueros

positivos.

Fig. 46: Repetibilidad del ELISAanti-E2

N V 7 CONTROL 3

PP

¿mandenme-wm

ooooooooooooooo

51015202530354045505560657075Nro. de ensayo

ewsïsïé#¿.+l . ,

4 812162024283236404448525660646872

l Nro.deensayo

CONTROL 294

l Nro. de ensayo

Se calculó el PP de los sueros positivos 3 y 4 y del suero negativo 294. Se realizaron 75determinaciones independientes para los sueros positivos y 65 para el suero negativo. Lasbarras horizontales corresponden a 1, 2 y 3 DS respectivamente.

115

RESULTADOS

4.7.5.d. Punto de corte del ELISAPara establecer el punto de corte del ELISA anti-E2 se estudiaron 99

sueros no neutralizantes para BVDVdisponibles en el laboratorio para otrasrutinas de diagnóstico. La serología de estos sueros habia sido ya determinadapor la técnica de seroneutralización contra la cepa Singer y fue la técnica dereferencia utilizada para fijar el valor de corte del ELISA.

En la Fig. 47 se grafican los valores de Porcentaje de positividad (PP)obtenidos con los sueros negativos analizados.

Fig. 47: Frecuencias de Porcentajes de positividad (ELlSA) de suerosbovinos.

No neutralizantes

60 ———————­50

240oE30a220

10o AAAAAA7.- vyv.vivooomooesooooofaq-FN" chancho“c‘escocuuu'aa’°r°ouoosogoo°N v-I-Nfl Ü ¡susI

PP

Un total de 99 sueros no neutralizantes para BVDVse analizaron por ELISAanti-E2(M. y M.). El gráfico indica el número de sueros que corresponden a los diferentesvalores de PP obtenidos.La placa de ELISA se sensibilizó con el AcMo 2.9.H en la dilución 1:200. luego seagregó el antígeno AE2 en la dilución 1:40. Los sueros. bovinos se analizaron en ladilución 1:20. Posteriormente se incubó con conjugados anti-bovino y se reveló conABTS (M. y M.) La solución dilución utilizada para el antígeno, los sueros y elconjugado anti-bovino fue PBS, 1% SE. 0.2 M NaCl y 0.5% Tween 20.

Dada la distribución normal de la curva se calculó el punto de corte comoel promedio de los valores obtenidos (11) + 3 DS (Jacobson, 1998),obteniéndose un valor de PP=14 para el punto de corte del ELISA.

4.7.6. Análisis de muestras incógnita con el ELISAanti-E2Se analizaron en total 183 muestras de sueros incógnita disponibles en

el laboratorio en las condiciones fijadas como óptimas. En la Fig. 48 se muestrael protocolo establecido y una placa revelada donde se analizaron 46 sueros.

116

RESULTADOS

En la Tabla 4 se indican los valores de absorbancia obtenidos y las diferenciasnetas correspondientes.

Fig. 48: ELISAanti-E2 de sueros incógnita+ n + u +(D o 0 0 (9< < < < <

8 910 1112

+ +­22221234567®®®®®®®®®®®®®®®®®®®®®®®®®®®®®®®®®®®®®®®®®®®®®®®®®@®®®®®®®®®@®®®®®@@@®@®®®®®®®®®®

control- +A”

control+ +3“0

IQ'HITIU

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12A 0,375 01322 0.235 2.418 11'51 07953 0.28 0.226 0.1K! O23 0.21 0.217B 0.131 24408 0245 2261 0.232 1.847 0.189 0.243 0199 2.427 (1336 2‘31C 0,351 2739 0'18 1.754 0.237 2.241 0.208 0.223 0.284 0.2% 0.164 0.201D 0316 2.404 0233 2323 0389 0.369 0.183 0.215 0.25 2.19 0.319 1.825E 0 1.991 0283 0284 0214 2.358 0.184 2 0163 0175 0198 0.213F 0298 2.4 046 2313 0177 2.546 0.262 OMS 0166 (J 0164 0.184G 0 3% 2.201 01192 1.714 0.199 2.318 0.207 2.231 0.285 2.414 015 0.3)1H 0746 2.523 0.369 11593 0.567 2.335 0.188 0.211 0.239 2.272 0.213 0.19

Un total de 46 sueros bovinos incógnita (M1 a M46) se analizaron por ELISAen ladilución 1:20 para la detección de anticuerpos anti-E2 de BVDV.Cada suero seprovó con antígeno (+) y sin (-) antígeno. En la placa se marcan además los

controles de suero negativo (control -) y de suero positivo para BVDV(control +) .

En la parte inferiorse muestran los valores de OD.

117

RESUI TADOS

Tabla 4:

2 313 1.8531 714 1.5221 593 1.2240 953 -0.1081 847 1.6152 241 2.0040 369 -0 022.358 2.1442.546 2.3692.318 2.1192.335 1.7680.226 -0.0030.243 0.0540.223 0.0150.215 0.0322.265 2.0810.286 0.0242.231 2.0240.211 0.0230.223 0.042.427 242280.235 -0.0492.19 1.94

0.175 0.0120.254 0.0892.414 2.1292.272 2.0330.217 -0.0042.31 1.9740.201 0.0371.825 1.5060.213 0.0150.184 0.020.201 -0.0490.19 -0.023 NEG

Se indican los resultados del ELISAde Ia Fig. 45. Para cada suero se indica la ODcon antígeno (c/Ag), sin antígeno (s/Ag), la diferencia neta obtenida (DN)y %corresponde al porcentaje de positividad.

DN = (OD CN - OD y“)DN: diferencia neta

% = (DNMn - DNC_) / (DNC, —DNC.)

INTERPRETACION

< 14% NEGATIVO

> 14% POSITIVO

Del total de los 183 sueros analizados 84 resultaron positivos porELISA. El gráfico de los valores de los PP en función del número desueros (Fig. 49) demostró un claro nivel de corte entre los sueros

118

RESUL TADOS

previamente definidos como positivos o negativos de acuerdo a laseroneutralización.

F9. 49: Distribución de frecuencias de PP (ELISA) de 183 suerosneutralizantes y no neutralizantes.

"I-O 5- .4» I. .'.r,3222883883888.coucllcc IG:3'? 2338383283PP

Un total de 84 sueros bovinos neutralizantes fueron analizados por ELISAanti-E2corno en la Fig. 47. El gráfico indica el número de sueros que corresponden a losdiferentes valores de PP obtenidos. Se incluyen los valores de PP obtenidos paralos 99 sueros negativos de la Fig. 47.

4.7.7. Determinación de la sensibilidad y especificidad diagnósticaEn base a los resultados obtenidos con las 183 muestras, fueron

calculadas la sensibilidad y especificidad relativa del método de ELISAanti-E2 .

Los 183 sueros fueron analizados por seroneutralización y por ELISAanti-E2 considerándose seroneutralizantes los sueros con título igual o supen’ora 1:8.

La sensibilidad del método se calculó como el porcentaje de suerosdetectados positivos por el ELISA con respecto al total de suerosneutralizantes.

La especificidad se calculó como el porcentaje de sueros detectadosnegativos por el ELISA con respecto al total de sueros negativos porneutralización (Jacobson, 1998).

Para ajustar el punto de corte se realizaron los cálculos de especificidady sensibilidad usando 3 valores distintos para el PP: 10, 14 y 20 (Figv49).

119

RESULTADOS

Fig. 49: Cálculo de sensibilidad y especificidad del ELISAanti-E2.

PP=10 PP=14 PP=20

Neutralizaciór

3P

841 ELISA

0 98

95% CI

Sens¡b¡|¡dad 100% Sensibilidad 100% 100% . .Especmddad 94% Especifioidad 98,9% 97%100% Espeafiadad 100%

Sensibilidad 98.8%

Se analizaron un total de 183 sueros bovinos por neutralización contra la cepaSinger y por ELISA anti-E2. Se construyó una tabla de doble entradaconsiderando seroneutralizantes (+) a los sueros con título neutralizante superioro igual a 1:8. Para los resultados de ELISAse consideraron diferentes puntos decorte para el porcentaje de positividad (PP) 20, 14 y 10. La Sensibilidad secalculó como el porcentaje de sueros positivos por ELISA del total de suerosneutralizantes. La especificidad se calculó como el % de sueros negativos deltotal de sueros no neutralizantes. Ci indica el intervalo de confianza (Davies,1994)

De acuerdo a los valores obtenidos de sensibilidad y especificidadpara los distintos puntos de corte, la máxima sensibilidad y especificidadse obtuvo para el valor 14 de PP. Este valor coincidió con el punto decorte calculado teniendo en cuenta únicamente los sueros negativos(Fig. 47).

En función de estos resultados se estableció una sensibilidad del

100% y una especificidad del test en 98,9%.

4.7.8. Correlación con neutralizaciónSe analizó Ia correlación entre los valores de ELISA y los títulos

neutralizantes contra la cepa Singer, calculando el título neutralizante delos 183 sueros positivos y negativos según M. y M. y graficando el % dereactividad por ELISA (PP) en función de —log. del título neutralizanteobtenido para cada suero (Fig. 50).

120

RFSUI TADOS

Fig. 50: Correlación entre título neutralizante y ELISAanti-E2.

14o A R2 = 0,8213

j O

120 o

É1’..lEl,n.n.

o 7,7," 7 . 7:7, a múwwb 7 . . , a , , , 7. 7 a 7,.

0 0 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50-29 9

-Iog tit neutralización

La comparación de los valores de ELISAcon los de neutralización dioun Coeficiente de determinación (R2)de 0,82. El valor obtenido indica queexiste una muy buena correlación lineal entre los dos métodos. Es de notartambién que se observó una gran dispersión de valores de PP para elmismo valor de neutralización.

4.7.9 Detección de anticuerpos en animales vacunados

El ELISA desarrollado en este trabajo podría eventualmente servirtambién como herramienta para analizar la respuesta inmune en animalesvacunados.

Para estudiar su eventual utilización en el análisis de potencia vacunal,se testearon muestras de suero de los bovinos inmunizados con 2 dosis de la

vacuna oleosa formulada con proteína rE2-Bac (Ver Tabla 2 Vacuna “A”y “B”65 dpv) y de sueros de animales vacunados con 2 dosis de una vacunaexperimental inactivada de BVDVcepa Singer (origen INTA)(Fig. 51).

121

¡0000...OOO...OOOOOOOOOOOOOOOOOO00......0......000

RFSUÏ TADOS

Fig. 51: ELISAde sueros de bovinos vacunados

120 ‘

100 j

Í

1

0 t

o 7.‘

o 4 h .._. 7.7, . - ,7 7 V ww. . me, Hl-D 1- 1- 0') O (O ON LD lO (O (D INN N N N N

PP CDoo OO

A

N

(O LO 1‘ 0')‘- ‘- a) 151|VACUNA rEZ-Blc A

VACUNArEszIc a BOVINOS

VACUNA BVDViÍÜÉmEl gráfico indica el Porcentaje de positividad (PP) obtenido en ELISA anti-E2 consueros de animales inmunizados con 10 ug de rE2-Bac (vacuna “A”),40 ug derE2-Bac (Vacuna “B”), BVDV inactivado y de bovinos no inmunizados (controlnegativo).Los sueros fueron analizados en la dilución 1:20 como indicado en la Fig. 47.

Como se observa en Ia Fig. 51 los resultados confirman que el ELISAdiseñado en este trabajo de Tesis es apto para la detección y eventualmentecuantificación de la respuesta inmune inducida por vacunas a subunidad y/oclásicas formuladas con virus de BVDVinactivado.

122

DISCUSIÓN

5. DISCUSIÓN:

En este trabajo de tesis se ha expresado el gen de la glicoproteína E2de BVDV en 2 sistemas recombinantes eucan'óticos independientes. Seestudiaron sus características estructurales e inmunológicas y sucomportamiento como vacunas y/o reactivos de diagnóstico.

Como es común a todas las N-glicoproteínas, el producto de traduccióndel gen E2 es transportado inmediatamente al lumen del Retículoendoplasmático (RE) y al sistema de Golgi para luego ser insertado en lamembrana plasmática de la célula infectada. En este proceso, el polipéptido E2inicial sufre modificaciones post-traduccionales (por ejemplo: N-glicosilación)esenciales para definir la conformación tridimensional de la proteína y supotencial inmunogénico. La etapa inicial de translocación en el RE de toda N­glicoproteína requiere la presencia de una secuencia amino terminalhidrofóbica, denominada secuencia señal (ss) que es esencial para sureconocimiento por el sistema de transporte y es removida proteolíticamentetan pronto como las moléculas de glicoproteína llegan a la cara interna de lamembrana (Górlich y Mattaj, 1996).

Se consideró de mayor importancia entonces asegurar que el polipéptidoexpresado por el gen recombinante de E2 siguiera todos los pasos deprocesamiento de su contraparte nativa de manera de obtener unaglicoproteína con inmunogenicidad idéntica a la presente en las partículasvirales de BVDV.

En la célula infectada con BVDV,el gen de la E2 es expresado comoparte de una poliproteina en la que secuencias hidrofóbicas no pertenecientesa la E2 y codificadas en el extremo 3' del gen localizado upstream le permitensu translocación en el RE.

La secuencia de DNAcodificante de la región estructural de Ia E2 con laque se inicióeste trabajo carece de una secuencia señal propia y fue entoncesnecesario incorporarle una alternativa. Es así como se construyó el genquimérico (ss-E2) Iigando la secuencia del gen de la E2 de BVDVal extremo 3’

del DNAcodificante de Ia secuencia señal de la glicoproteína G del Virus de laestomatitis vesicular (VSV).

Almomento de encarar esta estrategia era ya posible encontrar trabajosque demostraban la funcionalidad de secuencias señales heterólogas para laproteína E2 de BVDVy de HCV (Hulst y col, 1993; Tijssen y col., 1996).

Los datos presentados por Schlicht y Wasenauer (1991) planteaban, porotro lado, la posibilidad de que una secuencia señal no nativa pudiera

123

DISCUSIÓN

eventualmente producir cambios en la conformación original de la glicoproteínarecombinante (y por ende en sus propiedades inmunogénicas). En la pn'meraetapa de este trabajo entonces, se focalizó el esfuerzo en la caracterizacióntanto bioquímica como inmunológica del producto de expresión del genquimérico ss-E2.

Caracterización del producto recombinante rE2: el polipéptidorecombinante rE2 expresado por el gen ss-E2 fue reconocido por anticuerposmonoclonales anti-E2 dirigidos a epitopes no lineales y su capacidad deglicosilarse resultó ser sensible a tunicamicina, un inhibidorde la síntesis de deoligosacáridos unidos a asparragina (Tkacz y Lampen, 1975). La proteína E2recombinante además retuvo, como la nativa, la capacidad de formar dímerospor medio de uniones disulfuro.Tomados en conjunto estos datos sugieren quela secuencia señal de VSV-G es funcional y permite las modificacionespostraduccionales necesarias para obtener moléculas de E2 con unaconformación idéntica a la nativa.

Las glicoproteínas de membrana solo se secretan si son correctamenteplegadas y oligomerizadas en el Retículo endoplasmático. Las moléculas noplegadas correctamente o subunidades de oligómeros no ensamblados quedanretenidos en el RE, pudiendo ser degradados proteolíticamente (Ellgaard yco|., 1999). La presencia entonces de moléculas recombinantes en la superficiecelular, demostrada en experimentos de biotinilación y análisis constreptavidina conjugada a peroxidasa, es un dato adicional que confirma elcorrecto plegamiento de Ia glicoproteína rE2 antes de ser insertada en lamembrana plasmática.

Según Thiel y col., la glicoproteína E2 presente en los vin'ones de CSFVy BVDV se encuentra mayoritariamente en forma de homodímero o deheterodímero (Thiel y col., 1991). La presencia exclusiva de la forma diméricade la rE2 en la membrana celular de las células transfectadas por el plásmidopssE2, de acuerdo a los experimentos de biotinilización,es otro argumento enfavor del correcto procesamiento de la rE2 expresada por el gen ss-E2.

Por otro lado, la presencia de la proteína recombinante truncada rAE_2

sin la región transmembrana carboxi|o terminal) en el sobrenadante tanto de las

células CV1 transfectadas con pss-AEZ como así también en el sobrenadantede la línea estable de Drosophi/a melanogaster es una demostraciónconvincente de que la región de 31 aa C-terminal está efectivamenteinvolucrada en la unión de esta proteina a membrana (postulado originalmente

por Rümenapf y col, 1993). Confirma además que la conformación de la rAE2

124

DISCUSIÓN

(e indirectamente la de la rE2) es la apropiada para ser transportada desde elsitio de sintesis al exterior de la célula.

La deleción de la región transmembrana en Ia E2 no afectó la capacidadde la proteína de formar dímeros ni de ser reconocida por anticuerposmonoclonales anti-E2 conformación-dependientes (esto es, reactivos contraepitopes no lineales). Tampoco se observaron fragmentos de degradaciónproteicos en los ensayos de radioinmunoprecipitación lo cual sugiere que estaregión no estaría relacionada con el correcto plegamiento y conformacióncuatemaria final de la glicoproteína. Esto es digno de remarcar ya que en otrasproteinas se ha observado que la deleción o modificación de la regióntransmembrana o lindantes a la misma produce aberraciones en susestructuras cuatemarias y/o degradación intracelular (Gaudin y col., 1999;Michalak y coI._ 1997). Por ejemplo la glicoproteína S de espículas delTransmissible gastroenteritis virus sin su región transmembrana es secretadapero es incapaz de trimerizarse (Godet y col., 1991) y la hemoaglutinina deInfluenza sin anclaje a membrana deja el RE como un monómero y formatrímeros y otros agregados mayores que se agregan en el compartimentoposterior del Golgi (Singh y col., 1990).

Es de destacar que una fracción de la rAE2expresada en las células deDrosophila melanogaster permaneció asociada a las membranas internas.Aunque en este trabajo no se han realizado estudios de cinética, es probableque el consenso de clivaje entre la secuencia señal y la proteina estructural nohaya sido reconocido con un 100% de eficiencia por la proteasa de insecto ycomo consecuencia la subpoblación no procesada permanezca asociada a lamembrana. Alternativamente, existe la posibilidad que la sobre expresión de laglicoproteína sature al sistema de clivaje, dejando una fracción del producto detraducción primario sin procesar y “atrapado” en un compartimientomembranoso.

E2 recombinante como antígeno vacunal: en cuanto a Ia capacidadinmunogénica de la proteína recombinante, los resultados muestran que lostítulos neutralizantes obtenidos en bovinos luego de dos inmunizaciones con laproteína rE2Bac (1:128-1:8.192) fueron tan buenos y en un caso claramentesuperiores a los que se obtienen con una vacuna comercial (1:8). Los nivelesde respuesta humoral neutralizante fueron tambien de orden similar (y hastaincluso superiores) a los obtenidos con proteínas recombinantes equivalentes.Por ej. Bolin y Ridpath (1996) utilizando como vacuna la E2 expresada por un

125

DISCUSIÓN

gen en el que fueron deletados los últimos 109 nucleótidos del extremo 3',obtuvieron títulos neutralizantes en bovinos menores o iguales a 1:128 luego dela segunda dosis vacunal y títulos de hasta 1:4.096 luego de la tercer dosis.

El antígeno utilizado por Bolin y col. debió concentrarse para serutilizado como vacuna mientras que la preparación de rEZBac obtenida en estetrabajo no requirió pasos de concentración, representando esto una claraventaja para su uso eventual como vacuna comercial.

La preparación de rEZBac utilizada en este trabajo parece también másinmunogénica que la utilizada por Kweon (1997) quien obtiene titulos entre 2 y64 luego de dos inmunizaciones. Tanto Bolin como Kweon utilizan la secuenciaseñal nativa que precede a E2 en la poliproteína nativa en sus construccionesrecombinantes. No se ha producido evidencia experimental en este trabajo quenos permita especular con que la utilizaciónde la secuencia señal de la VSV-Gresulta en una mejora de la capacidad inmunogénica de la rEZBac.

Los resultados obtenidos con inoculaciones del polipéptido rEZBacsugieren que la secuencia señal heteróloga no modificó la capacidadinmunogénica de la E2. Esto coincide con el trabajo de Tijssen y col. (1996)que utiliza también una secuencia señal heteróloga y que obtiene altos titulosneutralizantes al inmunizar conejos y bovinos con la proteína E2 purificada yproducida en un sistema Vaccinia recombinante .

La disminución del titulo neutralizante a los 90 días post vacunación conla rEZBac correlaciona con resultados obtenidos por otros autores. Por ejemplosegún Schipper y col. (1983) el título de anticuerpos neutralizantes enrespuesta a una vacuna inactivada alcanza sus máximos valores (12900)entre40 y 55 días post primera vacunación (con un booster a los 30 dias) ycomienza a decaer a partir del día 60 con títulos de 1:400 al día 70.

Los máximos titulos seroneutralizantes obtenidos en bovinos luego deinmunizar con dos dosis de la rEZBac (1:4.000-8.000) resultaron superiores a lamayoría de los encontrados en la bibliografía con vacunas tradicionalesmonovalentes (Bolin y col., 1990; Fulton y Burge, 2001; Shimazaki y col, 2003)o del mismo orden que los obtenidos en unos pocos trabajos (Makoschey ycol.. Beer y col. 2000). Por ejemplo, bovinos vacunados con 2 dosis de vacunade BVDVinactivada espaciadas por 4 semanas alcanzan títulos inferiores a1:256 luego de 14 dias post última vacunación (Bolin y Ridpath, 1990).También, trabajos realizados por Fulton (2001) con distintas vacunascomerciales inactivadas en bovinos muestran que los animales responden conun amplio rango de títulos de anticuerpos (hasta 122.048)contra la cepa l en el

¡26

DISCUSIÓN

día 42 luego de 2 inmunizaciones al día 0 y 28 y con un rango menor contra lacepa ll. Estos títulos declinan en el dia 140 hasta valores entre 0 y 1:256.

Por otro lado una vacuna a virus inactivado con un titulo de 107"2DlTCso

previo a la inactivación y que es relativamente alto para BVDV y difícilmentesuperable en la industria, produce en bovinos un título máximo de anticuerposneutralizantes de 128.162 (Makoschey y col., 2001). En este mismo trabajoademás se inmunizan bovinos con una vacuna cuyo título previo a lainactivación es de 108'2DITCsoobteniéndose seroneutralizaciones de 1:32.000.

Es digno de mencionar que los autores no pueden descartar que estosaltos niveles de respuesta inmune sean producto de la utilización de unadyuvante diferente a los tradicionalmente usados Quil A o hidróxido dealuminio.

Hay diversos aspectos del mecanismo inmunológicode respuesta a lasvacunas anti-BVDVque aún no han sido aclarados, particularmente en lo quese refiere a la relación que vincula títulos neutralizantes con niveles deprotección (van Oirschot y col., 1999). No existe al momento un métodouniversalmente aceptado para determinar el título neutralizante y tampocoexisten modelos de desafío ni definiciones estándar de protección para BVDV.

El título seroneutralizante suele tomarse como índice de protección y ental sentido los anticuerpos inducidos por vacunación serían responsables de lainmunidad al BVDV;varias publicaciones muestran que la transferencia pasivade anticuerpos especificos contra BVDV puede conferir protección contraciertos signos clínicos tal como fiebre y Ieucopenia al desafio con BVDVvivo(Bolin y Ridpath, 1995; Howard y col., 1989). Según Bolin un título superior a

1:256 es suficiente para prevenir signos clínicos de la infección aunque no asíla viremia y diseminación viral. Según Beer (2000), quien obtiene altos titulosneutralizantes (1:32.000) luego de dos dosis con vacunas bivalentes (genotipo ly ll) inactivadas, los animales con títulos neutralizantes mayores de 1:512 nomuestran Ieucopenia luego del desafío y la presencia de virus en leucocitos oen los lavado nasales es poco frecuente.

Aunque la comparación de eficacia entre vacunas es difícilde realizardebido a diferencias entre los protocolos utilizados, los títulos neutralizantes

obtenidos en este trabajo con bovinos inmunizados con 40 pg de rEZBac,sugieren que esta proteína recombinarte tiene gran potencial comoantígeno/inmunógeno vacunal.

El control de BVDV también puede realizarse utilizando vacunasatenuadas. Según Fulton (2001), quien compara títulos seroneutralizantescontra BVDV luego de inmunizar con diferentes vacunas comerciales, no

127

DISCUSIÓN

existen diferencias significativasentre las respuestas de anticuerpos generadaspor vacunas inactivadas y atenuadas que utilizan las cepas de genotipo l.Inclusive ambas producen anticuerpos neutralizantes contra una ceparepresentativa del tipo ll.

Las vacunas atenuadas cuentan, sin embargo, con algunas ventajas enrelación a las inactivadas: la principal radica en una administración menosfrecuente ya que Ia protección contra la infección clínica perdura por lo menos1 año a diferencia de 4 meses para una vacuna inactivada (Cortese y col.,19983).Estas vacunas inducen una respuesta inmunológica de tipo celular y noúnicamente humoral, que de acuerdo a Harpin (1999) sería la combinaciónóptima para generar máxima protección.

Una mayor desventaja del uso de vacunas atenuadas basadas en virusde BVDV,es la posibilidad de generar animales persistentemente infectadospor reversión de Ia cepa atenuada e infecciónde los animales en gestación.

En este trabajo de Tesis también se investigó la expresión de la E2 enun sistema viral atenuado recombinante y la utilización de este como inductorde respuesta inmune anti-BVDVen ratones.

Se expresó la E2 de BVDVen el sistema recombinante del Virus de laestomatis vesicular (rVSV)incorporando el gen ss-E2 entre los genes G y L deVSV de manera de generar el virus recombinante VSV-E2. Existenantecedentes de rVSVs que expresan antígenos heterólogos y que handemostrado desarrollar inmunidad protectiva en animales de experimentación.Por ejemplo, la vacunación de ratones con rVSVque expresa la hemoaglutininade Influenza provee protección completa al desafío con Influenza (Roberts ycol., 1998) y también un rVSV que expresa la proteina H del Virus delsarampión induce altos títulos antivirales (Schlereth y col., 2000).

Se especuló entonces con que un sistema de este tipo que expresase laE2 de BVDVtendría las ventajas de la vacuna atenuada de BVDVy por otraparte podría evitar la generación de animales persistentemente infectados conBVDVcomo producto de la infección in útero con eventuales cepas revertantes

La replicación exclusiva de VSV en citoplasma y su caracteristica deRNA virus le minimizan la capacidad de recombinar con el genoma celular y Ioconvierte en candidato interesante, desde el punto de vista de la bioseguridad,para ser utilizado en vacunaciones de uso masivo. Otro aspecto ventajoso derVSV como potencial vector vacunal es la posibilidad de su administración porvía oral y los altos títulos virales que se obtienen (103-109 UFP/ml) en un gran

128

DISCUSIÓN

número de líneas celulares de uso industrial (especialmente células BHK-21)como así también su fácil purificación.

Un aspecto favorable también es que la presencia de una única proteínade envoltura en el virión de VSV genera menos background antigénico que lasvariantes de la E2 expresada en otros sistemas recombinantes como Vacciniao Herpes.

En este trabajo se demostró, en una primera etapa, que la glicoproteínaE2 de BVDV puede ser expresada eficientemente en el sistema VSVrecombinante y también incorporada a la envoltura viral. La cuantificación defluorografias representativas sugiere que las moléculas diméricas de rE2Vrepresentan aproximadamente un 10% de la cantidad de las moléculas Gincorporadas en la partícula, un nivel similar al encontrado en el análisis deVSVs recombinantes que expresan glicoproteínas virales y no viralesalternativas (Johnson y co|., 1997; Roberts y col., 1999). Nuestros resultadosindican sin embargo que, a diferencia de la glicoproteína 120 de HIV(Johnsony co|., 1997) pero en coincidencia con los de la hemoaglutinina del VirusInfluenza y la F del Virus respiratorio sincicial (Kahn y col.,1999; Roberts y col.,1999), la presencia de rE2V en viriones recombinantes no requin'ó delreemplazo de su propia secuencia C-terminal por la de la VSV-G

La relación rE2/G en el virión es probablemente el reflejo de ladistribución de estas dos glicoproteínas en la membrana plasmática en elmomento de la gemación. La menor marcación relativa de rE2V en la superficiecelular comparada con la de VSV-G guarda relación con esta interpretaciónaunque no podemos descartar errores en la cuantificación debidos a ladiferente avidez por los anticuerpos específicos anti-G y anti-E2. No se puededescartar sin embargo que la presencia de uniones disulfuro y/o la estructuraC-terminal representen una desventaja para retener a la rE2 en el sitio degemación (Johnson y col., 1998; Owens y Rose, 1993).

La vacunación intranasal de ratones con VSV-E2 produjo una fuerterespuesta serológica específica y sostenida que perduró por Io menos 180días. Los ratones no mostraron síntomas de enfermedad aún después derecibir dos inoculaciones de 107 UFP por vía nasal, una dosis letal en el casode las cepas salvajes de VSV. Como era de esperar los ratones tambiénmostraron altos titulos seroneutralizantes contra VSV.

Los resultados sugieren que este tipo de virus pueden tener valor comovacunas alternativas a las clásicas no solo contra BVDVsino contra VSV.

La potencialidad de un vector de VSV de inducir daño en animales de

granja todavia deberá ser analizada y es un impedimento práctico para un

129

DISCUSIÓN

ensayo a campo en regiones libres de VSV. Mutaciones adicionales atenuantesen los genes G y N (Lodish y Weiss, 1979; Wagner, 1974) o rearreglos génicos(Flanagan y col. 2000) podrían eventualmente agregarse al vector rVSV paraminimizarcualquier riesgo de enfermedad y hacerlas más seguras. Es tambiéndigno de mencionar que Roberts y col. (1999) han logrado, desarrollar un rVSVcompletamente atenuado por deleción y/o modificación del gen G. Los virionesresultantes, deficientes en proteína G, contienen cantidades crecientes de laglicoproteína foránea, probablemente como resultado de una síntesisaumentada y/o de espacio adicional en la envoltura.

Es importante destacar que los titulos de anticuerpos obtenidos enratones con rEZBac y VSV-E2 también han sido superiores a los obtenidos enotros trabajos como los de Elahi y col. (1999) con valores entre 1/10 y 1/32 conun Fowl pox recombinante o los de Harpin y col. (1997 y 1999) que obtienen

títulos entre 10 y 128 con vacunas a DNA. Por otra parte Baxi y col. (2000)también obtienen títulos inferiores (1:1.028-1:1.024) con un Adenovirusrecombinante Tipo 3 cuando inmunizan ratas algodoneras.

Ratones inmunizados con dos dosis consecutivas de aproximadamente0,5 pg de rE2V contenidas en 20-30 pg de VSV-E2 purificado e inactivado

también desarrollaron anticuerpos específicos anti-BVDV. Los títulosseroneutralizantes fueron en promedio una o dos unidades logaritmicasmenores a las obtenidas con el VSV-E2 y dentro de los valores obtenidos conrEZBac. Los resultados sugieren que cualquiera de las estrategiasanteriormente citadas que permitan aumentar la cantidad de moléculas de E2en la partícula viral podrían reforzar el potencial de VSV-E2 como vacunainactivada.

E2 recombinante como antígeno de diagnóstico: la detección deanticuerpos anti-BVDV es una herramienta de mayor significancia en eldiagnóstico de infecciones con BVDV. En particular, el ensayo deneutralización viral, es sensible y especifico para la detección de anticuerpos yha sido reconocido como test de referencia para Ia serología.Este test, sin embargo, presenta problemas en su aplicabilidad debido a lanecesidad de contar con infraestructura para cultivo de células y del constantemonitoreo tanto de células como de sueros utilizados en los medios de cultivo

para la detección de contaminaciones adventicias. La obtención de resultadosconcluyentes, por otro lado, puede tomar entre 4-5 días en la mayoría de loscasos lo que lo torna poco práctico en casos de emergencias sanitarias.

Los ensayos de ELISAresultan sin duda más prácticos. Se han utilizadodiferentes formas de antígeno para este tipo de ensayo: por ejemplo partículas

130

I)!S(.'U.S‘lÓN

virales enteras (Chu y col, 1985). extractos de cultivos celulares infectados conBVDV(Howard y col., 1985), antígenos virales inmobilizados con anticuerposmonoclonales (Cho y col., 1991. Moennig y col., 1991) o proteínasrecombinantes producidas en bacterias (Kwang y col., 1995; Lecomte y col.,1990)

Con excepción del caso en que la proteina blanco se expresa enbacterias, la disponibilidad de antígeno está directamente asociada con losniveles de producción viral en cultivo celular. Esto acarrea los inconvenientesya mencionados en lo que respecta a la baja producción viral, Ia presencia devirus adventicio proveniente de sueros contaminados y de bioseguridadasociados ala producción de BVDV La producción de antígenos recombinantesen bacterias no está tampoco exenta de dificultades ya que se requieren pasosde desnaturalización y renaturalización como así también diálisis de lasmuestras.

La elección del sistema de Drosophi/a melanogaster para la expresión

del polipéptido E2 truncado (ArE2) permitió obtener un antígeno para ELISAque no requiere de ningún paso extra de purificación o concentración ya queesta glicoproteína recombinante es secretada al sobrenadante de las célulastransfectadas. Esto también evita la contaminación con BVDVadventicio yaque la proteína recombinante puede ser expresada en un medio libre de suerobovino.

La combinación del antígeno recombinante con el anticuerpo monoclonalanti-E2 ha permitido diseñar un test de ELISAcon reducido background y aptopara discriminar entre sueros neutralizantes y no neutralizantes contra la cepaSinger. Se ha podido establecer una muy buena correlación lineal entre losvalores de los títulos obtenidos por ELISA y los títulos neutralizantes de lossueros analizados, Io que sugiere que el test tiene potencial para detectaranimales infectados naturalmente.

Como mencionamos, el antígeno utilizado en este método (rAE2) norequirió pasos de purificación ni de concentración y el diseño general delensayo ha permitido además el uso de diluciones de suero (1:20) que son muyadecuadas desde el punto de vista operativo.

De los resultados que se presentan aquí surge que este ELISApodríaeventualmente ser aplicable al estudio de infecciones naturales en trabajos deseroprevalencia ya que ha mostrado sensibilidad y especificidad de diagnósticodel 98,9% y 100% , respectivamente, cuando se utiliza un punto de corte iguala 14 de porcentaje de positividad.

131

DISCUSIÓN

Es aceptado que la variación en los títulos neutralizantes reflejandiferencias entre las glicoproteínas de las cepas infectantes, y por lo tanto seránecesaria la expresión de proteínas rAE2correspondientes a diferentes cepaspara su utilización en un ELISAque nos permita estudios comparativos en los

rebaños. Resultados no mostrados aquí indican que el antígeno rAE2 utilizadoen el ELISA fue reconocido por sueros monoespecíficos de conejosinmunizados con E2 recombinante tanto de las cepas NADL,SD1 y Singer loque sugiere que el test permitiría detectar como mínimo infecciones con esascepas en animales de campo.

El ensayo de ELISAdesarrollado en este trabajo eventualmente servirátambién para testear la respuesta inmune de sueros de animales vacunados yestudiar el potencial inmunogénico de vacunas comerciales.

(ÍONCL USIONES

6. CONCLUSIONES

Este trabajo de Tesis se ha centrado en investigar la expresión de laproteina E2 de BVDVen diferentes sistemas recombinantes, caracterizar suestructura bioquímica y estudiar su posible utilización como inmunógeno ycomo reactivo de diagnóstico.

De los resultados presentados y discutidos en los capítulos precedentespueden extraerse las siguientes conclusiones:

La proteína recombinante E2 quimérica entera (rE2) expresada en lossistemas Vaccinia transiente y Baculovirustiene características similaressinó idénticas a las de su contraparte viral salvaje en lo referente a lacapacidad para reaccionar con anticuerpos dependientes de laconformación, capacidad de glicosilación y capacidad de formardimeros. A diferencia de la proteína salvaje expresada en célulasinfectadas con BVDV,rE2 se localizó en la membrana plasmática de lascélulas infectadas.

La proteína rE2 expresada en el sistema Baculovirus utilizada comovacuna a subunidad resultó un potente inmunógeno en ratones, conejosy bovinos y fue capaz de inducir una respuesta anti-BVDVcompatiblecon protección en bovinos.

La proteína rE2 quimérica expresada en el sistema VSV recombinantees indistinguible de la salvaje por técnicas inmunológicas y bioquímicasy como su contraparte expresada en Vaccinia se pudo detectar tanto enla membrana de las células infectadas como en la membrana de la

partícula viral recombinante.

El virus recombinante VSV conteniendo la E2 se comportó como unvector atenuado que produjo una potente respuesta seroneutralizanteanti-BVDV en ratones. El mismo vector viral recombinante utilizado

como vacuna inactivada produjo respuesta seroneutralizante aunque demenor magnitud. Un incremento en el grado de incorporación de laproteína recombinante en la membrana viral debería mejorareventualmente la respuesta inmune inducida por particulas VSV-E2inactivadas.

¡33

CON(ÍLUSIONES

La proteina E2 quimérica deletada en su C-terminal, y expresada tantoen sistemas de Vaccinia y Drosophila melanogaster es liberada alsobrenadante celular. Esta forma soluble de Ia proteína E2 recombinanteobtenida en D. Melanogaser ha mostrado ser un excelente antígeno enun sistema de ELISA de alta sensibilidad, especificidad y repetibilidadpara detectar sueros de animales naturalmente infectados con BVDV.Este sistema presentó buen grado de correlación con los valores deseroneutralización.

Este ensayo podría aplicarse eventualmente también para la valoraciónde la respuesta a la vacunación con vacunas comerciales para BVDV.Maa

Dr. JOSE L. LA TORRE

QQN'ÍZ) C- “i.

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