UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL REI

PRÓ-REITORIA DE ENSINO

ENGENHARIA AGRONÔMICA

André Henrique Campelo Mourão

Caracterização molecular de

Bacillusthuringiensis e produção de

bioinseticida para controle de pragas do milho

(Zeamays)

Sete Lagoas – MG

2014

ANDRÉ HENRIQUE CAMPELO MOURÃO

Caracterização molecular de Bacillus thuringiensis e produção de

bioinseticida para controle de pragas do milho (Zeamays)

Trabalho de Conclusão de Curso

apresentado ao curso de Engenharia

Agronômica da Universidade Federal

de São João Del Rei como requisito

parcial para obtenção do título de

Engenheiro Agrônomo.

Área de concentração: Microbiologia/Controle Biológico

Orientador: Prof. Dr. Juliano de Carvalho Cury

Sete Lagoas – MG

2014

ANDRÉ HENRIQUE CAMPELO MOURÃO

Caracterização molecular de Bacillusthuringiensis e produção de

bioinseticida para controle de pragas do milho (Zeamays)

Trabalho de Conclusão de Curso

apresentado ao curso de

Engenharia Agronômica da

Universidade Federal de São

João Del Rei como requisito

parcial para obtenção do título

de Engenheiro Agrônomo.

Sete Lagoas, 11 de julho de 2014

Banca examinadora:

________________________________

Fernando H. Valicente – Pesquisador – EMBRAPA/CNPMS

________________________________

Leonardo Lucas Carnevalli Dias – Professor – UFSJ

_________________________________

Juliano de Carvalho Cury – Professor – UFSJ

Orientador

DEDICO

Aos meus pais pela dedicação e carinho

e ao meu irmão pelo companheirismo.

AGRADECIMENTOS

A Deus, fonte de luz e inspiração.

A Embrapa Milho e Sorgo por possibilitar a realização do trabalho,

cedendo laboratório e material às pesquisas.

A Universidade Federal de São João Del Rei por fornecer conhecimento

e pela oportunidade de ingressar no curso de Engenharia Agronômica.

Ao Doutor Fernando HercosValicente pela oportunidade, incentivo, por

proporcionar momentos descontraídos e principalmente pelos

ensinamentos e lições não só profissionais, mas de vida.

Ao professor Dr. Juliano de Carvalho Cury pela compreensão,

disponibilidade e confiança.

A Prof Leonardo Lucas Carnevalli Dias,pela participação como membro da

banca de defesa.

Aos colegas de laboratório Osmar (Nate), Celso, Camila, Thaís, Priscilla,

Daniele, Fernando, Donald, Rosane, Arthur pelo convívio e auxílio nas

tarefas desenvolvidas.

Aos meus pais Luiz e Jussara pelo auxílio incondicional e por me

proporcionarem mais este momento feliz em minha vida.

Ao meu irmão Mateus por me ajudar a esquecer as dificuldades que

passamos, e por dar forçaa meus pais e a mim nos momentos difíceis.

Ao meu irmão Vitor (in memorian) que sei que esta olhando por nós, uma

grande perda durante esta minha caminhada. Aprender a perder nunca

saberemos, mas o tempo transforma todos os sentimentos.

A minha namorada Julie pela paciência, compreensão e palavras de

incentivo.

E a todos que de alguma forma me ajudaram e continuam me ajudando.

A todos, muito obrigado.

“A adversidade desperta em nós capacidades que, em

circunstâncias favoráveis, teriam ficado adormecidas.”

Horácio

RESUMO

O Bacillusthuringiensis(Bt) é uma bactéria gram positiva, aeróbica ou

anaeróbica facultativa, em formato de bastonete e que forma inclusões

cristalinas que são tóxicas a insetos das ordens Lepidóptera, Coleóptera,

Díptera, além de nematoides e ácaros. Tais inclusões são proteínas produzidas

por genes chamados Cry. O Bt pode ser utilizado para a produção de plantas

transgênicas ou bioinseticidasatravés de processos fermentativos. Esse

trabalho foi desenvolvido com o objetivo de analisar molecularmente a

presença de alguns genes Cry na cepa 1644 e a otimização do processo de

produção de bioinseticida visando o controle das lagartas

Spodopterafrugiperda, Helicoverpazea e Diatreasaccharalis. Para analise

molecular foi utilizada a técnica da PCR, para detecção dos genesCry:

Cry1Ab/1Ac; Cry 1Aa/1Ad; Cry 1Ac, Cry 1B, Cry 1D; Cry 1C; Cry 1Fa/1Fb; Cry

1G; Cry 1A5; Cry 1Ab; Cry 1Fb; Cry 1Fa1/1Fb; Cry 1I; Cry 1H; Cry 2Aa, Cry

2Ab; Cry 2Ac; Cry 2Ad; Cry 9; Cry 9A; Cry 9B e Cry 9D. O meio de cultivo

utilizado para a fermentação continha 4,0% de glicose de milho e 3,0% de

farinha de soja mais sais (0,002 g.L-1 de FeSO4 , 0,02 g.L-1de ZnSO4 , 0,02 g.L-

1de MnSO4, 0,3 g.L-1de MgSO4).Foramdetectadosos genesCry 1Ab/1Ac; Cry

1Aa/1Ad; Cry 1B, Cry 1C; Cry 1A5; Cry 1Ab; Cry 1I; Cry 1H; Cry 2Ab; Cry 2Ad;

Cry 9. Foram coletadas e analisadas amostras em tempo pré determinado. O

pH do meio de cultura variou entre 4,21 e 6,45. A maior quantidade de

biomassa celular produzida se deu após 72h de fermentação (3,8 g.L-1) . A

concentração de esporos teve um pico máximo de 3,83E+08 após 56h de

fermentação. Todos os insetos ficaram expostos á dieta com toxinas por 120

horas e as maiores eficiências de mortalidade observadas foram de 81,75%

paraS. frugiperdaapós 72 horas de fermentação, 58,75% para H. zeaapós 72

horas de fermentação e 50% para D. saccharalis após 56 horas de

fermentação.

Palavras chave: Controle de pragas, Fermentação, Bacillusthuringiensis.

ABSTRACT

Bacillusthuringiensis (Bt) is a gram positive, aerobic or facultatively anaerobic,

rod shaped bacteria and produces crystalline inclusions that are toxic to insects

of the orders Lepidoptera, Coleoptera, Diptera, besides mites and nematodes.

Such inclusions are proteins produced by Cry genes. Bt can be used for the

production of transgenic plants or biopesticides through fermentation

processes. This work based on the molecular analysis of the presence of Cry

genes in theBt strain 1644 and the optimization of the production process of

biopesticide for the control of Spodopterafrugiperda, Helicoverpazea and

Diatreasaccharalis. Molecular analyses was done using the PCR technic for

detection of Cry genes: Cry1Ab/1Ac; Cry 1Aa/1Ad; Cry 1AC, Cry 1B, Cry1D;

Cry 1C; Cry 1Fa/1Fb; Cry 1G; Cry 1A5; Cry1Ab; Cry 1Fb; Cry 1Fa1/1Fb; Cry 1I;

Cry 1H; Cry2Aa, Cry 2Ab; Cry 2Ac; Cry 2Ad; Cry 9; Cry 9A; Cry 9B and Cry9D.

The medium used for the fermentation contained 4.0% glucose and 3.0% corn

soybean meal plus salts (0.002 gL-1 FeSO4, 0.02 gL-1 ZnSO4, 0.02 gL-1

MnSO4, 0.3 gL-1 MgSO4). There were detected the presence of Cry 1Ab/1Ac;

Cry 1Aa/1Ad; Cry 1B; Cry 1C, Cry 1A5, Cry1Ab, Cry 1I, Cry 1H, Cry 2Ab, Cry

2Ad and Cry9. Samples were collected and analyzed at pre-determined time.

The culture medium pH has ranged from 4.21 to 6.45. A greater amount of cell

biomass production occurred after 72 hours of fermentation (3.8 gL-1). The

spore concentration had its peak of 3.83 E +08 spors/ml after 56h of

fermentation. All insects were exposed to the toxin through artificial diet for 120

hours and the highest mortality observed was 81.75% for S. frugiperda after 72

hours of fermentation, 58.75% H. zea after 72 h and 50% for D. saccharalis

after 56 hours of fermentation.

Keywords: Pest control, Fermentation, Bacillus thuringiensis.

SUMÁRIO

Introdução 08

Revisão bibliográfica 10

Material e métodos 19

Resultados e discussão 26

Conclusão 34

Referencias 35

8

INTRODUÇÃO

O milho é uma gramínea pertencente à família Poaceae, tribo Maydeae,

gênero Zea e espécie Zea mays L. Esse cereal é o terceiro mais cultivado no

mundo, perdendo apenas para o trigo e o arroz. O Brasil é o terceiro maior produtor

do grão, atrás apenas dos Estados Unidos e China. A maior parte desses grãos,

cerca de 70%, é destinada à cadeia produtiva de suínos e aves, sendo o restante

destinado ao consumo humano e, mais recentemente, à produção de energia

(CONAB, 2011). Um dos maiores problemas da agricultura mundial é o ataque de

uma ampla gama de pragas, e no milho a redução de rendimento varia em níveis de

17,7% a 55,6% (CRUZ, 2008).

Dentre as principais pragas que atacam o milho podemos citar alguns

Lepidópteros como Spodopterafrugiperda (lagarta do cartucho), Helicoverpazea,

(lagarta da espiga) e Diatreasaccharalis (broca da cana). Sendo a lagarta do

cartucho ainda a principal praga que ataca o milho, não só na fase inicial da cultura,

mas também encontrada até mesmo atacando espigas(CRUZetal., 2013). Mas na

última safra houve no Brasil uma grande incidência do ataque de outra praga, a H.

armigera, que não era uma encontrada no Brasil, recentemente vem causando

grandes prejuizos não apenas no milho, mas em soja, algodão, tomate e varias

outras culturas.

Para o controle destas pragas, ainda é utilizado de forma indiscriminada e

excessivaos inseticidas químicos, porém o controle biológicovem sendo uma arma

bastante utilizada e eficaz. Nesse tipo de controle atuam inseticidas formulados com

a bactéria entomopatogênicaBacillus thuringiensis (Bt) (VALICENTE &ZANASI,

2005; FATORETTOetal., 2007). O uso de híbridos ou variedades transgênicas de

milho, que são conhecidas por milho Bt, nas quais foram inseridos genes da bactéria

B. thuringiensis, são alternativas para o manejo da lagarta do cartucho e outras

larvas de lepidópteras que incidem na cultura do milho (CHIARADIA, 2010).

B. thuringiensis é uma bactéria gram-positiva,aeróbica ouanaeróbica

facultativa (RASKOetal., 2005), em forma de bastonete, formadora de esporos e que

9

tem a capacidade de produzir, durante a esporulação, diversas inclusões cristalinas

altamente específicas, que são responsáveis pela atividade tóxica desta bactéria

(GLARE& O’CALLAGHAM, 2000; HABIB& ANDRANDE, 1998). Esporos de Bt

podem ser isolados de diversos ambientes como solo, rizosfera, filoplano, água

fresca, poeiras de grãos e de insetos, crustáceos, anelídeos e mamíferos insetívoros

(RAYMONDetal., 2010).

Bt produz inclusões cristalinas (proteínas cry), as quais são tóxicas a

diferentes ordens de insetos tais como: Lepidóptera, Coleóptera, Díptera e ainda

nematóides e ácaros (FEITELSONetal., 1992). Tais inclusões são formadas por

polipeptídeos denominados δ-endotoxinas, que são liberadas junto ao esporo no

momento da lise celular (DEAN, 1984; HANNAY&FITZ-JAMES, 1995).

Portanto, o Bt é uma importantealternativa ao controle de pragas através do

emprego de bioinseticidas. De acordo com Vlak (1993), o alerta aos riscos

ambientais gerados pelos inseticidas químicos traz uma preocupação em buscar

novas alternativas, incluindo o uso de agentes microbianos como os Baculovírus e

oBt.

Considerando a produção de bioinseticida à base de Bt, este trabalho foi

desenvolvido com o objetivo de analisar molecularmente a presença de alguns

genes Cry na cepa 1644, (cepa pertencente ao banco de microrganismo da

Embrapa Milho e Sorgo) e a otimização do processo de produção de bioinseticida

visando o controle das lagartas Spodopterafrugiperda,

HelicoverpazeaeDiatreasaccharalis.

10

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Segundo a Companhia Nacional de Abastecimento (CONAB), na safra

2013/2014 é esperada a quebra de mais um recorde na produção de grãos, com a

projeção de 188,7 milhões de toneladas. Sendo a maior parte devido ao plantio de

soja, seguido pelo milho, que tem expectativa de produção de 75,5 milhões de

toneladas mesmo o milho sofrendo uma redução de 7,4% (6,1 milhões de

toneladas), em relaçãoà safra 2012/2013.

Sendo assim, a cultura do milho é uma das mais importantes do setor

agrícola no Brasil. É uma das mais antigas do mundo, com origem nas Américas.

Possui diversas formas de utilização, variando desde a alimentação animal até a

indústria de alta tecnologia.

Um dos maiores problemas da agricultura mundial é o ataque de uma ampla

gama de pragas. No milho, esse ataque pode ocorrer na raiz, folha, espiga e

pendões. Quando a incidência se dá na parte aérea da planta a aplicação das

medidas de controle à praga é mais fácil, pois a visibilidade do ataque é maior que

quando se dá na parte subterrânea. Esse ataque na raiz, por exemplo, é muitas

vezes confundido com deficiência nutricional, efeito de adversidades climáticas ou

da má qualidade da semente plantada (ÁVILLA& PARRA, 2004; MORÓN, 2004). A

redução de rendimento na cultura do milho devido ao ataque de pragas varia em

níveis de 17,7% a 55,6% (CRUZ, 2008).

Os danos causados pelas pragas da fase vegetativa e reprodutiva do milho

variam de acordo com o estádio fenológico da planta, condições edafoclimáticas,

sistemas de cultivo e fatores bióticos localizados.

Cerca de 1/3 da perda dos produtos agrícolas é causada por pragas e

doenças (VLAK, 1993). A produção do milho pode ser afetada por diversas pragas

que atacam as sementes, raízes e plantas jovens após a semeadura (VIANA, CRUZ,

WAQUIL, 2000).

11

Dentre as principais pragas do milho incluem-se: a lagarta do cartucho

(Spodoptera frugiperda), que se alimenta desta cultura em quase todos os instares,

sendo encontrada no cartucho de plantas jovens até na espiga; as lagartas da

espiga (Helicoverpa zeae mais recentemente a Helicoverpa armigera), que atacam

principalmente a parte comercial, a espiga; a broca da cana de açúcar (Diatrea

saccharalis), que ataca a cultura do milho durante quase todo o ciclo da planta, mas

principalmente durante a fase de enchimento de grãos.

A S. frugiperda, dependendo do estágio de crescimento, pode causar uma

redução de 34% na produção do milho, e também a morte da planta (VALICENTEet

al., 1988). As lagartas recém-eclodidas raspam o limbo foliar das folhas mais novas

seguindo para as folhas centrais do cartucho. Depois deatingir o segundo ou terceiro

instar, começam a perfurar as folhas consumidas. Valicente e Cruz (1991)

descreveram possíveis formas de migração da lagarta do cartucho. Dentre elas,

pode-se citar a migração para outra planta através de uma teia e o transporte das

mesmas pelo vento até o cartucho. Tardiamente, podem ser encontradas se

alimentando da palha e dos grãos (VALICENTEet al.,1998).

Segundo Gomez, Moscardi&Sosa-Gomez (1999) há uma estimativa de que,

nos EUA, a perda média anual causada pela lagarta do cartucho do milho seja de

cerca de US$ 300 milhões. Nos anos de 1975 a 1977 esse prejuízo excedeu os US$

500 milhões. No Brasil, S. frugiperda ataca amendoim, algodão e diversas

gramíneas cultivadas, incluindo-se o trigo, a soja e o milho. A intensidade da perda

foliar varia de acordo com a fase de desenvolvimento da planta atacada, com o local

de plantio e segundo as práticas agronômicas utilizadas (HARPAZ, RACCAH, 1978).

A H. zeadeposita seus ovos geralmente individualmente e em qualquer local

da planta, mas tendo preferência pelo cabelo da espiga ou boneca. Após 3-4 dias

dá-se a eclosão das larvas, que começam a alimentar-se imediatamente. À medida

que elas se desenvolvem, penetram no interior da espiga e iniciam a destruição dos

grãos em formação. O período larval varia de 13 a 25 dias, no qual estão sempre se

alimentando e causando prejuízos.

Os prejuízos causados pela H. zea não se limitam apenas a alimentação

direta dos grãos da espiga. Podem cortar o “cabelo” da espiga, impedindo a

12

fertilização e, consequentemente, causando a má granação, provocando falhas na

espiga. Além disso,podem causar perfuração da palha, permitindo a penetração de

microrganismos, além de favorecer a infestação por outras pragas importantes, tais

como o caruncho (Sitophiluszeamais) e a traça (Sitotrogacerealella). No Brasil os

prejuízos causados pela H. zeasão da ordem de 8 a 10%.

As lagartas daD. saccharalis,na fase inicial de desenvolvimento das plantas

demilho, podem atacar o cartucho, cujos danos, se foremsuperficiais, resultam na

formação de uma série de furostransversais na lâmina foliar.Se o dano for mais

profundo, o ponto de crescimento da planta pode ser atingido, provocando o sintoma

característico de “coração-morto”. Em plantas de milho mais desenvolvidas, as

lagartas, geralmente de 3º ínstar, penetram no colmo, onde fazem galerias

ascendentes.

À medida que se desenvolvem, a capacidade de dano das larvas aumenta,

fazendo com que o colmo das plantas fique enfraquecido e sujeito ao quebramento.

Cada larva pode consumir de dois a três nós. Eventualmente pode haver danos às

espigas.

A capacidade de dano médio da praga pode resultar em perdas de 21 a 27%

no rendimento de grãos. Noentanto, prejuízos maiores podem ocorrer principalmente

se o ataque ocorrer nos entrenós próximos à espiga, o que acaba afetando a relação

fonte/dreno da planta.

Para se evitar maiores danos e perdas, se faz necessário o controle tanto

destas, como de outras pragas e doenças que atacam não só o milho como

qualquer outra cultura. E, quando se pensa em controle, o que inicialmente vem

“àcabeça” do produtor, pela praticidade, facilidade de compra e rapidez de ação, é a

aplicação de inseticidas químicos.

Segundo dados do BNDES (Banco Nacional de Desenvolvimento), em 2010 a

indústria brasileira de inseticidas totalizou vendas de US$ 7,3 bilhões.Entre 1990 e

2010 o mercado brasileiro cresceu 576%, enquanto o mercado mundial aumentou

83%. Como resultado, a participação das vendas da indústria de defensivos no

Brasil, em relação às vendas globais, aumentou de 10% para 15,3% no período.

13

Nos sistemas agrícolas os inseticidas químicos são frequentemente e

indiscriminadamente utilizados para reduzir os danos causados nas lavouras e,

consequentemente, o prejuízo econômico (MOSCARDI, SOUZA, 2002). Porém, este

método pode acarretar efeitos maléficos como o desequilíbrio biológico, a poluição

do meio ambiente pela geração de resíduos, risco de intoxicação para o homem na

aplicação e consumo acidental do inseticida, além do alto custo para o agricultor

(VALICENTEet al., 1988).

O uso indiscriminado de agrotóxicos acarreta também uma redução da

população de organismos benéficos. As pragas podem sofrer o processo de seleção

natural, sendo que as resistentes podem obter sucesso reprodutivo e conseguir, ao

longo de várias gerações, passar os genes de resistência a seus descendentes.

Com isso, o produtor, cada vez mais, necessita de uma dose maior de inseticida e

às vezes precisa recorrer a outros produtos mais tóxicos (VALICENTE, CRUZ,

1991).

Como alternativa ao controle de pragas, e atualmente devido ao surgimento

de novas pragas, tem-se o controle biológico e o uso de bioinseticidas. De acordo

com Vlak (1993), o alerta aos riscos ambientais gerados pelos inseticidas químicos

traz uma preocupação em buscar novas alternativas, incluindo o uso de agentes

microbianos como os Baculovírus e o Bacillusthuringiensis.

Não só a introdução de uma nova espécie de praga no sistema agrícola

brasileiro, mas os problemas causados pela utilização de apenas um método de

controle de pragas têm ocasionado uma seleção de pragas resistentes. Isso nos

mostra a importância de se ter rotineiramente o manejo integrado como princípio

fundamental, de tal modo que o produtor possa rapidamente adequar medidas que

também sejam eficientes, econômicas e ambientalmente adequadas para reduzir a

população da nova praga a níveis de danos não econômicos. Contudo, as demais

espécies de insetos fitófagos não devem ser negligenciadas por conta do

aparecimento de novas pragas. Todo o conhecimento gerado pelas instituições de

pesquisa e, por que não, pelo produtor,deve ser utilizado para que se possa reduzir

a probabilidade de haver prejuízos aos produtores e à sociedade como um todo.

14

O controle biológico de pragas é considerado por Valicente e Cruz (1991)

como o “uso de organismos vivos para manter a população de determinada praga

em equilíbrio no agrossistema, de modo a não ocasionar danos econômicos ao

produtor”. Segundo Moscardi(1984), os bioinseticidas são uma alternativa ecológica

e sustentável, contribuindo para se manter o equilíbrio do ecossistema.

No controle biológico pode-se utilizar parasitóides, predadores e patógenos

(VALICENTE, 1989). Recomenda-se que o controle da praga deve ser feito quando

a infestação representar 20% das plantas e estas estiverem menores que 30-40 cm

de altura. Mas é bom salientar que o monitoramento, que tem como base a

precaução e visitas periódicas ao campo, é a melhor maneira para possibilitar a

escolha da época mais adequada.

O mercado brasileiro de biopesticidas ou dos agentes de biocontrole gira em

torno de 1 a 2% do total de agrotóxicos comercializados (US$97 milhões a US$194

milhões). Mesmo as estimativas mais conservadoras de crescimento do mercado de

agentes de biocontrole são bastante otimistas em nível mundial, com projeções de

atingir US$6,1 bilhões em 2022. Entretanto, com a entrada consistente das grandes

empresas de pesticidas na área de biocontrole, as novas projeções elevam esse

valor para US$25 bilhões em 2030. Para atingir essas cifras, porém, um longo

caminho deverá ser percorrido, especialmente no desenvolvimento de produtos com

características que viabilizem seu uso comercial em maiores escalas.

O controle biológico de alguns Lepidópteros é feito também utilizando a

bactéria Bacillus thuringiensis (Bt), que é uma bactéria gram positiva, encontrada no

solo, água, palhada e insetos mortos.Possui formato de bastonete, formadora de

esporos e capaz de produzir inclusões cristalinas durante a esporulação, que são

responsáveis pela atividade tóxica desta espécie (GLARE&O’CALLAGHAM, 2000).

Como esse microrganismo não é considerado um entomopatógeno com grande

agressividade e nem sempre esporula em insetos, antes ou após a sua morte,

dificilmente é encontrado em epizootia natural em insetos, porém alguns trabalhos

relatam este fato (POLANCZYK& ALVES, 2004).

15

Possíveis locais de reprodução incluem o solo, a rizosfera, o filoplano ou

outros tecidos da planta, insetos vivos ou mortos e outros invertebrados

(RAYMONDetal., 2010).

O gênero Bacillus possui uma fase de esporulação característica no seu

desenvolvimento na qual o esporo bacteriano e cristais proteicos(Figura 1) são

simultaneamente formados, sendo estes últimos sob forma de inclusões

parasporais.

Figura 1: Bacillus thuringiensisem formato de bastonetes (lado esquerdo); cristal

(seta inferior); esporo vegetativo (seta superior).

As inclusões cristalinas produzidas pelo Bt(proteínas Cry), as quais são

tóxicas a diferentes ordens de insetos tais como Lepidóptera, Coleóptera, Díptera e

ainda nematoides e ácaros (FEITELSONetal., 1992), são formadas por polipeptídeos

denominados δ-endotoxinas, que são liberadas junto ao esporo no momento da lise

celular (DEAN, 1984; HANNAY&FITZ-JAMES, 1995).

O modo de ação das toxinas Cry tem sido caracterizado principalmente em

insetos lepidópteros. Estudos mencionam que a ação primária dessa toxina é lisar

as células epiteliais do intestino médio do inseto-alvo pela formação de poros na

membrana microvilosa apical das células do mesêntero (ARONSON &SHAI, 2001;

de MAAGD etal., 2001, BRAVOetal., 2005). As protoxinas inativas ingeridas por

16

larvas suscetíveis dissolvem-se no meio alcalino do intestino, são solubilizadas e

clivadas por proteases do intestino médio produzindo proteínas resistentes a

proteases de 60-70 kDa (BRAVOetal., 2005). A ativação da toxina envolve a

remoção proteolítica de um peptídeo N-terminal (25-30 aminoácidos para toxinas

Cry1, 58 para Cry3A e 49 para Cry2Aa) e cerca de metade das proteínas restantes

da porção C-terminal, no caso de protoxinasCry longas. A toxina ativada então se

liga a receptores de glicoproteínas específicos na borda da membrana das células

epiteliais do intestino médio (de MAAGDetal, 2001; BRAVOetal, 2005) antes de

inserir na membrana. Esses receptores, na verdade, desempenham um papel

fundamental na determinação de suscetibilidade/resistência a uma toxina particular

de B. thuringiensis, estando sua natureza sob intensa investigação

(ALCÂNTARAetal., 2004). A inserção da toxina se dá de forma rápida e irreversível,

levando à formação de poros líticos nas microvilosidades da membrana apical

(ARONSON &SHAI, 2001; BRAVOetal., 2005). Posteriormente ocorre a lise celular

e, muito provavelmente, resulta na permeabilidade seletiva de cátions. Ocorre então

a ruptura do epitélio do intestino médio, liberando o conteúdo da célula, fornecendo

um meio com esporos germinando e, como consequência, uma septicemia grave (de

MAAGD etal., 2001; BRAVOetal., 2005) e/ou levando à paralisia do intestino,

cessando a alimentação e, como consequência, a morte por fome (inanição), o que

ocorre geralmente após 1-3 dias (ALIetal., 2010).

De forma resumida, a ação do Bt se da através do consumo de alimento

tratado com endotoxinas que geralmente resulta na parada da alimentação de larvas

de lepidópteros devidoaparalisação do intestino, que retarda a passagem de material

vegetal ingerido e permite que os esporos germinem e passem a crescer

vegetativamente. Quando as larvas se alimentam com altas doses da toxina sofrem

uma paralisia geral seguida de morte. Com doses mais baixas ou em insetos menos

susceptíveis, o dano às células intestinais é suficiente para parar a secreção normal

do intestino, o qual abaixa o pH do lúmem, permitindo a germinação dos esporos.

A eficiência de determinada proteína não está associada apenas ao fato dela

ser ou não ativada, mas também a uma associação com os receptores do inseto

alvo e o seu grau de solubilização. Por exemplo, Cry1Ac liga-se bem aos receptores

de membrana da lagarta da beterraba (Spodoptera exigua), mas há muito pouca

17

toxicidade a este inseto (GARCZYYNSKIetal., 1991). Já a proteína Cry1Ab, que não

se liga aos receptores de membrana da mariposa cigana (Lymantriadispar)é mais

tóxica do que Cry1Ac, (WOLFERBERGER, 1990).

As diversas linhagens de Btproduzem, em adição às endotoxinas, uma série

de outras toxinas que podem ou não participar da ação entomopatogênica, tais

como as proteínas Cyt (Cytolytic) e VIP (Vegetative insecticidal proteins )

(LERECLUSetal., 1993).

Tais cristais em Bt, também chamados de δ-endotoxinas, são codificados

pelos chamados genes cry e vêm sendo utilizados nos últimos 40 anos na

formulação de bioinseticidas comerciais que forneceram níveis adequados e

consistentes de controle biológico para diversas espécies de insetos-praga na

agricultura (ESTRUCHet al., 1997; SCHNEPFet al., 1998). As proteínas

(δendotoxinas) que formam estes cristais somam entre 20 a 30% das proteínas

totais da bactéria na fase de esporulação.

Proteínas Cry são δ-endotoxinas especialmente tóxicas para as ordens de

insetos Lepidoptera, Coleoptera, Hymenoptera e Diptera, e também aos nematóides.

A definição de uma proteína Cry é bastante ampla: uma inclusão protéicaparasporal

(cristal) de B. thuringiensis que exibe algum efeito tóxico experimentalmente

verificável para um organismo alvo ou qualquer proteína que tenha similaridade de

sequencia para uma proteína Cry conhecida (CRICKMOREetal., 1998).

Porém, o Bt também produz outras toxinas, como por exemplo a β-exotoxina,

que é solúvel em água, termoestável e dialisável.A sua estrutura química é um

derivadade fosforilado de adenina. Encontramos vários tipos de beta-exotoxinas e,

ao contrárioda delta, elas não são produzidas por todas as cepas de Bt. A sua

produção está associada com certos sorotipos como H1, H4, H8, H9 e H10

(FERNANDÉZ & VEGA, 2002). Mas há um empecilho para a produção de

bioinseticidas a base de Bt que contenham esta toxina. É que além de ser tóxica

para uma quantidade grande de insetos, ela é tóxica para vertebrados, não sendo,

portanto, liberadasa sua produção e comercialização.

18

As duas maiores aplicaçõesdas toxinas de Bt são: o controle de pragas no

campo e vetores de doenças humanas através de bioinseticidas e o

desenvolvimento de plantas geneticamente modificadas resistentes a insetos.

Visando a produção de bioinseticida, oBt pode ser cultivado em meio sólido,

líquido e semi-sólido.O uso comercial de meios alternativos como fonte de nutriente

para o crescimento desta bactériapode ser uma forma econômica para a produção

de biopesticida para o controle, por exemplo, da lagarta do cartucho do milho.

O meio de cultura é uma solução de nutrientes utilizada para promover o

crescimento de microrganismo em laboratório e deve conter uma série de fatores

químicos e físico-químicos (ambientais) para proporcionar à bactéria um crescimento

próximo ao ideal. Dentre os fatores químicos podemos citar a água, macro e micro

nutrientes e fatores de crescimento.Com relação aos fatores ambientais temos

temperatura, pH, pressão osmótica e O2.

Para o crescimento do Bt, devem ser adicionados ao meio de cultura os

macronutrientes: Carbono, como fonte de energia e que é componente de

aminoácidos, ácidos orgânicos, bases nitrogenadas e é necessário para todos os

compostos orgânicos que constituem uma célula viva; e o Nitrogênio, que após o

Carbono é o elemento mais abundante nas células,sendo fundamental na síntese de

DNA, RNA e ATP. Além disso, é importante a presença de micronutrientes como

Magnésio (possui importante papel na estabilização de ribossomos, membranas

celulares e ácidos nucleicos), Ferro, Zinco e Manganês, sendo este último um dos

principais responsáveis pela formação do cristal protéico, que é tóxicoaLepidópteros.

Além disso, fatores ambientais como temperatura, que deve ser ótima para que não

ocorra aceleração nem retardamento do crescimento microbiano, pH ideal, evitando

a desnaturação de enzimas e promovendo de maneira eficiente as reações químicas

dentro da célula, pressão osmótica para evitar a absorção ou perda de água em

excesso pela bactéria para o meio de cultura ou vice-versae oxigenação constante

para otimizar o crescimento, são também essenciais para o bom crescimento e

desenvolvimento da bactéria.

19

MATERIAL E MÉTODOS

Cepa de Bacillus thuringiensis utilizada

A cepa de Bacillusthuringiensis utilizada no trabalho foi a 1644, pertencente

ao banco de microrganismos da Embrapa Milho e Sorgo.

Para a utilização desta cepa foi necessário realizaranteriormente uma analise

quanto à presença de β-exotoxina que, como jácitado, é uma toxina produzida

naturalmente pelo Bt e que é toxica para vertebrados, não sendo, portanto,

aceitapara produção de inseticidas biológicos contendo esta toxina.

Para a análise molecular quanto à presença de genes tóxicos às pragas cuja

eficiência deste inseticida foi testada, foi utilizada a técnica da PCR (Reação em

Cadeia da Polimerase) para detecção de presença de tais genes. Para a utilização

desta técnica há a necessidade da extração e purificação de DNA de tal cepa.

Extração do DNA de Bacillus thuringiensis

O DNA da cepa estudada foi extraído e purificado de acordo com Shuhaimiet

al. (2001), com algumas modificações. A cepa foi plaqueada em meio LB sólido e

mantida à temperatura de 30°C durante 16h. Com o auxílio de uma alça de platina,

toda a massa celular foi raspada e transferida para um microtubo e ressuspendida

em 700µL de solução tampão (50 mMde Glicose, 25 mMde Tris/HCl e 10 mMde

EDTA pH 8,0) e lizosima na concentração de 20 mg.mL-1, sendo levado ao banho-

maria a 37°C por 30 min. Em seguida adicionaram-se 25 µL de SDS 10% e 5 µL de

proteinase K (20 mg.mL-1) seguido de incubação a 60°C por 1h.

Após esse período, 500 µL de fenol/clorofórmio/octanol (25:24:1) foram

adicionados seguido de centrifugação por 2 min a 12000g. Do sobrenadante

transferiu-se 300 µL para um novo tubo, acrescentou-se o mesmo volume de acetato

de potássio 3M e 600 µL de isopropanol, verteu- se suavemente e centrifugou-se a

12000g por 10 min.

20

O sobrenadante foi cuidadosamente descartado, o pellet foi lavado com 300

µL de etanol 70% gelado e novamente centrifugado a 12000g por 5 min. Novamente

descartou-se o sobrenadante e secou-se o pellet de forma que não ficasse resíduo

de etanol e ressuspendeu-se em 150 µL de TE (TRIS HCl 10 mM; EDTA 1mM pH

8,0).

A integridade do DNA extraído foi constatada através de corrida eletroforética

em gel de agarose 1% e sua quantificação se deu através do aparelho Nanodrop

16(ND-1000 V3.1.2). Em seguida a amostra foi diluída para uma concentração de

10ng.L-1. A amostra de DNA original foi armazenada a –20°C e a amostra de

trabalho, diluída e armazenada a 4°C.

Para a caracterização molecular foram utilizados iniciadores para os genes

Cry já descritos na literatura (CERÓNet al., 1994; CERÓNet al., 1995; VALICENTEet

al., 2010; ESPINASSEet al., 2003; HERNÁNDEZ-RODRÍGUEZet al., 2009;

IBARRAet al., 2003) (Tabela 1), além de iniciadores definidos por nossa equipe e

ainda não publicados.

Foi testada a presença dos genes:Cry1Ab/1Ac,Cry 1Aa/1Ad,Cry 1Ac,Cry 1B,

Cry 1D,Cry 1C, Cry 1Fa/1Fb,Cry 1G,Cry 1A5,Cry1Ab,Cry 1Fb,Cry 1Fa1/1Fb,Cry

1I,Cry 1H,Cry 2Aa, Cry 2Ab,Cry 2Ac,Cry 2 Ad,Cry 9,Cry 9A,Cry 9Be Cry 9D.

21

Tabela 1. Sequencia e temperatura de anelamento dos iniciadores utilizados na

detecção de genes Cry em cepa de Bacillus thuringiensis.

Iniciador Sequencia (5'-3')

N° de Pares de Bases

Tm (°C)

Referência

Cry9D Iniciadoraindanãopublicado

- - Silva-Fagundes

Cry 9B Iniciadoraindanãopublicado

- - Silva-Fagundes

Cry1Ac GTTAGATTAAATAGTAGTGG

180 53 Ceronet. al., 1994

Cry2Ad Iniciador ainda não publicado

- - Silva-Fagundes

Cry1D CTGCAGCAAGCTATCCAA

290 55 Ceronet. al., 1994

Cry1 A5 CGCCACAGGACCTCTTATC

231 55 Valicente etal., 2010

Cry9 Iniciador ainda não publicado

- - Silva-Fagundes

Cry9Aa Iniciador ainda não publicado

- - Silva-Fagundes

Cry 1H Iniciadoraindanãopublicado

- - Silva-Fagundes

Cry1Ab AATTTGCCATCCGCTGTA

418 55 Valicente etal., 2010

Cry 1B CTTCATCACGATGGAGTAA

367 55 Ceronet. al., 1994

Cry1Aa/Cry1Ad TTG GAG TCT CAA GGT GTA A

246 pb 53 Ceronet. al., 1994

Cry1Ab/Cry1Ac CTC TTA TTA TAC TTA CAC TAC

216 pb 55 Ceronetal., 1994

Cry1C CAA ACT CTA AAT CCT TTC AC

130 pb 55 Ceronetal., 1994

Cry1Fa/Cry1Fb CGG TTA CCA GCC GTA TTT CG

177 pb 50 Ceronetal., 1995

Cry1Fa1/Cry1Fb TAA TAG GGC GGA ATT TGG AG

283 pb 55 Valicente etal., 2010

Cry1I Iniciadoraindanãopublicado - - Silva-Fagundes

Cry2Aa Iniciadoraindanãopublicado

- - Silva-Fagundes

Cry2Ab Iniciadoraindanãopublicado - - Silva-Fagundes

22

Cry2Ac Iniciadoraindanãopublicado -- - Silva-Fagundes

968F

1494R

CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGCGGGGGCACGGGGGGGAACGCCAA GAACCTTACTGACTGACTGAGGYTACCTTGTTACGACTT

600 pb - Nubeletal. (1996) e Lane (1991)

*Código universal para bases degeneradas: R=A, G; Y=C, T; M=A, C; S=G, C; H=A, T, C; D=G, A, T; N=A, C, G, T. Tm: Temperatura de anelamento .

Para eliminação de falso negativo foram utilizadosiniciadorespara

amplificação do gene 16S ribossomal, sendo esta subunidade encontrada no RNA

ribossomal de procariontes. (968F e 1494R).

Para as reações de amplificação foram utilizados microtubos de 0,2 mL

contendo um volume final de 10 µl, com 30 ng de DNA, 3mM de MgCl2, 1 µl de

tampão 10× (Tris 20 mM e KCl50 mM), 250 µM de dNTPs (A, T, C, G), 10 µM de

cada iniciador e 1 unidade de Taq DNA Polimerase. As amplificações foram

realizadas em termocicladorVeriti® 96-“Well ThermalCycler” (AppliedBiosystems)

utilizando o seguinte programa:95°C por 2 minutos, seguido de 30 ciclos de 95°C por

1 minuto, temperatura de anelamento específica para cada iniciador (Tabela 1) por 1

minuto e 72°C por 1 minuto, seguido de um ciclo de 72°C por 10 minutos.

Os produtos de amplificação foram separados por eletroforese em géis de

agarose (1,5% ou 2,0%, variando de acordo com o tamanho do fragmento

amplificado). Foi utilizado Gel Red (BIOTIUM) para a visualização do produto de

PCR de acordo com as instruções do fabricante. Após a corrida o gel foi visualizado

sob luz ultravioleta. As imagens foram captadas pelo fotodocumentador Kodak Gel

Logic 200 Imaging System.

Após a detecção destes genes foi feita uma comparação de genes tóxicos a

algumas pragas descritas em Kees van Frankenhuyzen (2009), que relaciona a

presença do gene com a toxicidade a algumas ordens de inseto.

23

Produção do bioinseticida

Para a produção do pré-inóculo foi utilizado o meio de cultura LB (Luria

Bertani)sólido (12g de Bacto Ágar), acrescido de sais (0,002 g.L-1 de FeSO4 , 0,02

g.L-1de ZnSO4 , 0,02 g.L-1de MnSO4 , 0,3 g.L-1de MgSO4), pH ajustado para 7,5. A

incubação foi realizadapor 24 horas a 28°C. Posteriormente as placas foram

raspadas e o material foi retirado e inoculado em meio de cultura LB + sais líquido e

deixadosob agitação constante de 200 RPM por 16 horas a 28°C.

Para averiguação da quantidade de esporos presentes no pré inoculo foi feita

uma contagem inicial em câmera de Newbauer utilizando microscopia de contraste

de fase. Após esta etapa foi realizado um teste rápido de mortalidade quanto à

toxicidade desta cepa às três espécies testadas (Spodoptera frugiperda, Helicoverpa

zea e Diatrea saccharalis).

Após confirmação da quantidade de esporos presentes e da eficiência da

cepa para o controle de tais pragas, o pré-inoculo foi adicionado ao meio de cultura

proposto em Valicente e Mourão (2008), composto por 4,0% de glicose de milho

(fonte de Carbono), 3,0% de farinha de soja (fonte de Nitrogênio), além dos

micronutrientes (FeSO4, ZnSO4, MnSO4 e MgSO4), que são essenciais para o

crescimento e desenvolvimento da bactéria, pH ajustado para 7,5 e mantido sob

agitação (200 RPM) e temperatura (28°C) constantes. Amostras foram coletadas em

períodos pré determinadose armazenadas para posterior realização dos testes

(Tabela 2).

Foi feita a inoculação de 5% do pré inoculo no meio de cultura a ser avaliado.

Foram feitas 3 repetições e os erlenmeyers foram deixados em shaker com agitação

constante (200rpm) por 72 horas a 28°C.

Tabela 2. Horários de coleta das amostrasdo produto em processo de fermentação

e testes realizados.

Amostra Horas após inoculação

pH Densidade ótica

Massa celular

Contagem de esporos

Mortalidade

24

01 00 x x x x x 02 02 x x 03 04 x x 04 06 x x 05 08 x x x x x 06 24 x x x x x 07 26 x x 08 28 x x 09 30 x x 10 32 x x x x x 11 48 x x x x x 12 50 x x 13 52 x x 14 54 x x 15 56 x x x x x 16 72 x x x x x

Parâmetros avaliados durante o crescimento

Densidade Ótica

Amedição da densidade ótica (DO) a 600nm do meio de cultura foi realizada

utilizando-se espectrofotômetro.

Biomassa

Amostras de 100 ml foram centrifugadas a 10.000rpm durante 20 min. O

sobrenadante foi descartado e o pellet foi liofilizado. O peso seco foi calculado e

expressoem gramas por litro.

Contagem de esporos

25

As amostras coletadas foram submetidas a diluições seriadas e a contagem

de esporos realizada em câmera da Newbauer, microscopia de contraste de fase,

em três repetições.

pH

O pH do meio foi ajustado inicialmente para 7,5 ± 0,1 com NaOHapós a

esterilização, e foi medida a intervalos regularesdurante 72h do processo de

fermentação utilizando-se um medidor de pH de bancada.

Teste de toxicidade

O complexo de cristais de esporos produzidos em diferentes horários foi

testado contra lagartas de dois dias de idade(S. frugiperda, H. zea e H. armigera) e

de cinco dias de idade (D. saccharalis) criadas em laboratório. A fim dedeterminar a

toxicidade, a cultura foi amostrada em 8, 24, 32,48, 56 e 72horas após inicio do

processo de fermentação.

Foi utilizado o método de superfície para testar a toxicidade, no qual foi

aplicado 165 µl da suspensão de esporos/cristais sobre um pedaço de dieta artificial

com aproximadamente 3,5 cm3 de volume. Após inoculação as lagartas foram

mantidas em BOD a27°C, 70% de UR (Umidade Relativa) efoto período de 16 horas

de luz e 8 horas de escurodurante 7 dias. Após este período foi avaliada a

eficiência/taxa de mortalidade das lagartas.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

26

PCR

Dos 20 iniciadorestestados para a identificação dos genes Cry presentes na

cepa 1644, dez tiveram resultados positivos, como mostrado na Tabela 3.

Tabela 3. Detecção de genes Cry na cepa 1644 de Bacillus thuringiensis.

Genes Presença / ausência cry1Ab/1Ac + cry1Aa/1Ad +

cry1Ac - cry1B + cry1C + cry1D -

cry1Fa/1Fb - cry1A5 + cry 1Ab +

cry1Fa1/cry1Fb1 - cry 1I +

cry 1 H + cry2Aa - cry2Ab + cry2Ac - cry2Ad -

cry9 + cry9Aa - cry9B - cry9D -

Levando em consideração os relatos em Kees van Frankenhuyzen (2009), as

classes de genes aqui analisadas e detectadas nesta cepa (Cry1A, Cry1B, Cry1C,

Cry1I, Cry1H, Cry2Ae Cry9) apresentam certa toxicidade àordem Lepidóptera, que

são os insetos alvo deste estudo.

Neste mesmo trabalho, analisando a nível de espécie, podemos citar cinco

genes (Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1aC, Cry1Ad e Cry2Ab) presentes nesta cepa que são

tóxicos a pelo menos uma espécie de lagarta testada. Deve-se considerar que há a

27

possibilidade da presença de outros genes tóxicos a estas lagartas que não foram

testados ou até mesmo detectados nesta cepa.

Contagem de esporos e mortalidade das lagartas

Foram feitas três contagens de número de esporos do pré inoculo em câmara

de Newbauer, podendo-se observar uma concentração de 3,175 x 107esporos.mL-

1.Já as taxas de mortalidade foram de 95% pra S. frugiperda, 70% para H. zea e

65% para D. saccharalis.

Densidade ótica

A leitura da densidade ótica (DO) de uma cultura bacteriana em

espectrofotômetro nos da uma estimativa da concentração celular no meio. Como

podemos observar na Figura 2, houve um aumento da DO entre 8 e 24 horas após a

inoculação,sendo que após 24 horas essa variação é bem menor, se mantendo

quase estável. Resultado similar foi relatado por Ernandesetal. (2007), no qual foi

observado um crescimento exponencial de Bt entre 12 e 24 horas de inoculação.

28

Figura 2. Leitura de densidade ótica das amostras de Btcoletadas em

espectrofotômetro a 600nm.

Biomassa

A maior produção de biomassa foi observada 72 horas após a

inoculação,sendo de 3,83 g.L-1. A Figura3mostra o crescimento bacteriano expresso

em g.L-1. Resultados similares foram relatados por Valicente et. al(2010) após

trabalho no qual também foram utilizados meios de cultura alternativos contendo

Nitrogênio e Carbono como fonte de nutrientes para o Bt.

Densidade ótica

Tempo de fermentação

0h 8 hs 24 hs 32 hs 48 hs 56 hs 72 hs

Abso

rbân

cia

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

29

Figura 3. Produção de massa celular das amostras coletadasem função do tempo

de cultivo.

Contagem de esporos

Assim como relatado em Valicente et.al(2010) e Valicente e Mourão (2008),

após um período de crescimento há uma queda na concentração de esporos a partir

de 72 horas após a inoculação, apesar de terem sido feitos testes com meio de

cultura diferentes. Já no presente trabalho é possível observaruma redução na

concentração de esporos após 56 horas de inoculação (Figura 4).

Biomassa

Tempo de fermentação

0h 8 hs 24 hs 32 hs 48 hs 56 hs 72 hs

g/L

0

1

2

3

4

5

6

30

Figura 4. Variação do número de esporos de Btpor mL do meio de cultura em

função do tempo de cultivo.

Correlação entre concentração de esporos, biomassa e densidade ótica

Assim como relatado em diversos trabalhos de fermentação e produção de

bioinseticidas (ANEGELO etal, 2010; VALICENTEetal. 2010; VALICENTE e

MOURÃO 2008; ERNANDES etal., 2007; VIEIRAetal., 2008), há uma tendência que

com o passar do tempo, após a inoculação do Bt em meio de cultivo, a massa

celular, densidade ótica e concentração de esporos também aumente, pois estas

tem uma relação direta entre si. Na Figura 5 podemos observarumacorrelação entre

crescimento, massa celular e a concentração de esporos, sendo que no inicio (0

horas a 24 horas) a densidade ótica também seguiu essa tendência, mas após esse

período a cultura entrou no estágio estacionário.

Concentração de esporos

Tempo de fermentação

0h 8 hs 24 hs 32 hs 48 hs 56 hs 72 hs

Esp

oro

s / m

L

0

1e+8

2e+8

3e+8

4e+8

31

Figura 5. Comparação entre concentração de esporos de Bt,biomassa e densidade

ótica ao longo do tempo de cultivo.

pH

Vários autores relatam a queda do pH no inicio da fermentação seguida do

aumento do pHapós 96 horas de crescimento. Na Figura 6 é possível observar uma

redução no pH um pouco mais significativa entre 8 a 24 horas de

inoculação,ocorrendo um aumento após este período. Valores de pH maiores que 7

talvez não tenham sido alcançados neste experimento pelo fato da fermentação ter

sido encerrada com 72 horas de crescimento.

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

0,00E+00

5,00E+07

1,00E+08

1,50E+08

2,00E+08

2,50E+08

3,00E+08

3,50E+08

0 h 8 hs 24 hs 32 hs 48 hs 56 hs 72 hs

Concentração de esporos x Biomassa x D. O

Contagem de esporos

(esp/mL)

Massa celular (gr/mL)

Densdidade ótica

32

Figura 6.Determinaçãodo pH em diferentes tempos de crescimento de Bt após o

inicio do processo fermentativo.

Toxicidade

Uma eficiência na toxicidade do Bt a espécies de insetos pragas é o principal

objetivo quando se inicia um processo fermentativo. Em testes já realizados no

laboratório de Controle Biológico da Embrapa Milho e Sorgo com esta cepa e

utilizando o meio de cultura LB + sais, foi possível encontrar até 100% de

mortalidade para algumas destas pragas testadas neste estudo. Porém, como pode

ser observado naFigura 7, em nenhum momento foi observada toda essa eficiência,

sendo as maiores eficiências observadas para S. frugiperdaapós 72 horas da

inoculação (81,75%), para H. zeaapós 72 horas da inoculação (58,75%) e para D.

saccharalis após 56 horas da inoculação (50,00%).

pH

Tempo de fermentação

0h 8 hs 24 hs 32 hs 48 hs 56 hs 72 hs

pH

4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

6,5

7,0

33

Figura 7. Toxicidade de Bt a diferentes insetos pragas do milho, em diferentes

tempos de cultivo.

Mortalidade

Tempo de fermentação

0h 8 hs 24 hs 32 hs 48 hs 56 hs 72 hs

% m

ortos

0

20

40

60

80

100

Spodoptera frugiperda Helicoverpa zea

Diatrea saccharalis

34

CONCLUSÕES

De uma forma geral os resultados de pH, densidade ótica, biomassa e concentração de esporos corroboraram com os resultados de vários outros trabalhos. Os resultados obtidosacompanharam o que é comumente encontrado quando se trabalha com fermentação de Bacillusthuringiensis. O resultado mais importante relaciona-se com aeficiência no controle das pragas Diatreasaccharalis, Helicoverpazea e Spodopterafrugiperda. Porem não houve controle satisfatório de tais pragas, sendo recomendável novos estudos e o teste de meios de cultura alternativos com diferentes composições e proporções de fontes de Carbono e Nitrogênio como fontes de nutriente para se obter um biopesticida eficiente a partir do crescimento deBt. Pois esta mesma cepa testada com o meio de cultura padrão do laboratório (LB + sais), apresentou eficiência no controle de tais pragas acima de 90%, porem o alto custo de meio, pode inviabilizar a produção do biopesticida em escala comercial.

35

REFERENCIAS

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