caracterizaÇÃo genÉtica da raÇa bovina...
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Caria Sofia Rodrigues Leal
CARACTERIZAO GENTICA DA RAA BOVINA BARROS
Estudos de gentica bioqumica, familiar e populacional
Dissertao de Mestrado em Ecologia
Aplicada apresentada Faculdade de Cincias
da Universidade do Porto.
Porto
1998
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Agradecimentos
Quero aqui apresentar o meu agradecimento ajuda prestada por certas pessoas, sem a qual
no era possvel a realizao do presente trabalho.
Ao Prof. Doutor Nuno Ferrand de Almeida, agradeo a oportunidade e o apoio constante que
demonstrou durante a realizao deste trabalho, as indicaes que forneceu na estruturao e
elaborao do mesmo, pela cedncia de bibliografia, bem como as crticas e sucessivas revises do
manuscrito.
Ao Prof. Doutor Paulo Alexandrino quero agradecer o apoio na realizao deste mesmo
trabalho, assim como todas as indicaes que forneceu para a sua realizao prtica.
Ao Prof. Doutor Jorge Eiras, pelas facilidades concedidas na utilizao do laboratrio de
Bioqumica do Departamento de Zoologia e Antropologia, e ao ICETA pelas facilidades concedidas na
utilizao dos laboratrios de Gentica Animal.
comisso do Mestrado, na figura da Prof. Dra. Leonor Fidalgo e ao respectivo corpo docente,
os importantes conhecimentos transmitidos durante o ano curricular deste mestrado.
AMIBA (Associao do Minho dos Criadores de Bovinos de Raa Barros), principalmente
ao Sr. Miguel Machado e Dr. Jos Leite, pelo apoio dado, pela ajuda na recolha de amostras de sangue
e pelo simptico acolhimento que demonstraram na sua associao, estando sempre prontos a dispensar
os seus servios.
D.R.A.E.D.M. (Direco Regional de Agricultura de Entre Douro e Minho), em especial ao
Sr. Eng. Corte Real Santos (Estao de Produo Animal da Zona Agrria do Vale do Ave), agradeo
todo o apoio e encorajamento que demonstrou.
Quero tambm agradecer a colaborao e o tempo despendido nas vrias sadas de campo, aos
funcionrios do Livro Genealgico (ao Sr. Guilherme em especial) e aos funcionrios das brigadas de
Sanidade Animal de Vieira do Minho e Pvoa de Lanhoso.
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A todos os colegas de mestrado e de laboratrio, pela amizade, pelo apoio e pelo ambiente de
camaradagem existente entre todos, em especial Madalena Branco, ao Joo Alexandrino, ao
Agostinho Antunes, Graa Lopes, ao Filipe Castro e Rita Campos.
Junta Nacional de Investigao Cientfica e Tecnolgica (JNICT) agradeo a Bolsa de
Mestrado (PRAXIS XXI/BM/8799/96) que me foi concedida, o que possibilitou a minha
disponibilidade para a realizao da parte prtica de investigao deste trabalho.
Aos meus amigos, em especial Dra. Graa Loureiro, ao Dr. Armando Loureiro e Dra. Filipa
Carvalho pela pacincia, pelo apoio constante que revelaram ao longo deste trabalho e pelas suas
crticas ao manuscrito.
minha me e ao meu marido, que tornaram possvel este percurso que me conduziu at aqui.
A eles, dedico todo este trabalho.
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INDICE
1 - INTRODUO 1 1.1 - A DOMESTICAO 3
1.1.1- Evidncia histrica da domesticao do gado bovino 3
1.1.2- Paleontologia / arqueozoologia 4
1.1.3- Anlise gentica 7
1.2 - A DIVERSIDADE DAS RAAS BOVINAS 10
1.2.1-Asraas ibricas 10
1.2.2 - A raa Barros 11
Aspectos histricos da disperso e evoluo do efectivo populacional 11
Aspectos morfolgicos 15
Origem 15
2 - MATERIAL E MTODOS 17
2.1- AMOSTRAGEM E CONSERVAO DAS AMOSTRAS 17
2.1.1-Amostragem 17
2.1.2 - Obteno e conservao das amostras de sangue 17
2.2- BATERIA DE MARCADORES GENTICOS SELECCIONADOS 18
2.3 - TRATAMENTO DAS AMOSTRAS 24
2.4 - MTODOS DE SEPARAO 26
2.5 - MTODOS DE DETECO 34
2.6 - MTODOS DE CLCULO 38
3 - RESULTADOS E DISCUSSO 39
3.1- ANLISE DOS MTODOS DE SEPARAO 39
3.2 - ANLISE FAMILIAR 51
3.3 - ANLISE POPULACIONAL LOCUS A LOCUS 54
3.4 - ANLISE POPULACIONAL CONJUNTA 72
3.4.1 - Diversidade gentica na raa Barros 72
3.4.2 - Comparao com outra raas Ibricas 74
3.4.3 - Diferenciao gentica 77
4 - CONDIDERAES FINAIS 86
5 - CONCLUSES 88
6 - REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS 90
ANEXO
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Introduo
1 - INTRODUO
O crescente interesse demonstrado pelas raas bovinas autctones permitiu o
aparecimento, nos ltimos anos, de uma conjuntura poltica e econmica claramente favorvel
sua conservao. Este interesse reflecte-se, por exemplo, na criao de incentivos produo
(ajudas comunitrias e medidas agroambientais) ou no apelo ao consumo de produtos de
qualidade certificada. Estas circunstncias implicam, contudo, a necessidade de uma maior
capacidade de produo que, em sistemas agrcolas tecnicamente pouco desenvolvidos, poder
estar associada a programas de melhoramento gentico e, consequentemente, a eventuais
perdas de diversidade gentica (FAO, 1994; LoFTUS et ai,1994; FERNANDES, 1996).
Em Portugal existe um nmero considervel de raas bovinas autctones que se
encontram, ainda, pouco estudadas. Na verdade, a maior parte dos trabalhos sobre elas
realizados envolve anlises fenotpicas, estando ainda por investigar a estrutura gentica das
suas populaes, o seu grau de proximidade, a sua origem e evoluo recente.
No seio das raas nacionais, a raa Barros apresenta um conjunto de caractersticas
morfolgicas muito peculiares, que incluem um perfil cncavo da cabea, uma salincia das
arcadas orbitarias e cornos em forma de lira alta. Este conjunto de particularidades tem
suscitado opinies controversas sobre a sua origem (GONALVES GARCIA, 1964; GARCIA et ai, 1981; LEAL, 1995). Por outro lado, claramente uma raa emblemtica da regio noroeste de Portugal, associada a uma agricultura de subsistncia e a um patrimnio cultural que se
torna necessrio conservar (GONALVES GARCIA, 1964; GARCIA et ai, 1981; LEAL, 1995).
A sua rea de distribuio abrange apenas 17 concelhos pertencentes a 4 distritos: Vila
Real, Viana do Castelo, Braga e Porto. Actualmente, a existncia de problemas de produo
responsvel pela progressiva diminuio de alguns ncleos populacionais, apesar dos esforos
de certas entidades para o evitar (MARTINS, 1982; LEAL, 1995).
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Introduo
Em face do exposto, torna-se necessrio alargar a investigao sobre esta raa bovina,
nomeadamente atravs da sua caracterizao gentica. Espera-se, assim, poder contribuir para
o estabelecimento de um plano de conservao da Barros e, simultaneamente, aprofundar o
estado actual do conhecimento sobre a gentica das suas populaes.
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Introduo
1.1. - A DOMESTICAO
1.1.1. - Evidncia histrica da domesticao do gado bovino
H cerca de 15.000 anos, verificavam-se profundas mudanas climticas na Terra. Os
glaciares recuaram para Norte, a temperatura tornou-se mais amena, uma maior rea
geogrfica tornou-se habitvel. O Homem teve ento de vencer dificuldades impostas pela
Natureza, inventando a agricultura e a criao de gado, passando de caador nmada a
agricultor e a pastor (SARAIVA, 1993).
O incio da agricultura e a primeira domesticao de animais por parte do Homem est
datada de 10.000 anos a.C. (final do Paleoltico), numa regio conhecida por Crescente Frtil,
no Prximo Oriente. O primeiro animal domesticado ter sido o co, seguindo-se a ovelha, a
cabra e o gado bovino j no Neoltico (8.000 anos a.C.) (HEMMER, 1990; CLUTTON-BROCK,
1992).
A domesticao do gado bovino foi, provavelmente, um processo gradual. natural
que, no princpio, apenas alguns animais (essencialmente fmeas) fossem retirados das manadas
de auroques selvagens e criados isoladamente, no levando de imediato ao aparecimento de
diferenas morfolgicas claras. Esta hiptese apoiada por registos arqueozoolgicos, onde a
forma "proto-domesticada" no se distingue da forma selvagem (LOFTUS et ai, 1994).
A expanso neoltica em direco Europa ter levado milhares de anos, seguindo uma
via martima (mar Mediterrneo) e uma via continental (atravs dos Balcs e pelo curso do
Danbio). Da Siclia, a revoluo neoltica espalhou-se por toda a bacia mediterrnea
ocidental, atingindo a Pennsula Ibrica e a costa atlntica e trazendo consigo a arte, a
agricultura e a criao de gado. Desta forma, s no 5 milnio a.C, chegaram Pennsula
Ibrica as prticas agrcolas e a pastorcia (SARAIVA, 1993).
Desde o Neoltico que o gado bovino domesticado (Bos taurus) tem um papel muito
importante para o Homem. As grandes civilizaes da Antiguidade do-nos testemunhos
escritos e trabalhos artsticos indicando a sua importncia na alimentao (carne, leite), nos
trabalhos agrcolas, na guerra, na arquitectura e mesmo na religio.
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Introduo
Durante o perodo compreendido entre o incio do Neoltico at s idades do Cobre e
do Bronze, a domesticao dos bovinos levou a uma contnua diminuio do tamanho corporal
dos animais na Europa. Posteriormente, este processo ter sido interrompido com a introduo
de gado bovino trazido de Roma, e muitas raas extinguiram-se aps a queda do Imprio
Romano (EPSTEIN & MASON, 1984).
Esta tendncia continuou a observar-se durante a Idade Mdia e s com a Revoluo
Industrial e a necessidade de abastecer as grandes cidades se produziu um incremento na
criao de gado (EPSTEIN & MASON, 1984).
Neste domnio, a modernizao da agricultura e a produo intensiva de alimentos ter
originado uma contnua diminuio dos efectivos populacionais de muitas raas autctones,
evidente sobretudo durante a ltima metade deste sculo. Estas circunstncias determinaram,
assim, a sensibilizao da sociedade para as consequncias do empobrecimento de diversidade
gentica do gado bovino, permitindo o estabelecimento de linhas de investigao destinadas
sua gesto e conservao (BROWN et ai, 1993; FAO, 1996).
1.1.2. - Paleontologia / arqueozoologia
De acordo com os actuais dados paleontolgicos, o mais antigo ruminante do "Velho
Mundo" ter aparecido no Mioceno (Gelocus), caracterizando-se pela ausncia de incisivos na
mandbula superior e possuindo j uma conformao do esqueleto idntica dos bovinos
actuais (IGLESIAS, 1989 e GARCIA et ai, 1992). Esta forma viria a originar, posteriormente, os
quatro gneros actuais de ruminantes: Ovis, Capra, Antilope e Bos (IGLESIAS, 1989).
A evidncia paleontolgica indica, tambm, que tero existido na Europa diferentes
espcies de bovdeos, actualmente extintas. Destas, apenas o auroque sobreviveu at Idade
Mdia, havendo documentos escritos que se referem ao local e data da morte do ltimo
exemplar (Polnia, 1627) (LOFTUS et ai, 1994).
As primeiras representaes de bovinos feitas pelo Homem devem, precisamente,
referir-se a auroques, sendo um dos exemplos mais conhecidos constitudo pelas pinturas
rupestres das grutas de Lascaux (Frana) (figura 1.1.1).
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Introduo
Figura 1.1.1: Pintura rupestre nas paredes de grutas em Lascaux, Frana. Datando de h cerca de 15.000 anos. Reproduzido de FORBES (1986).
S mais tarde surge a evidncia de que o processo de domesticao se poder ter
iniciado. De facto, alguns achados neolticos (8.000 a 5.500 anos a.C.) provenientes da
Anatlia, parecem indicar a presena de animais j domesticados. Esta regio do Sudoeste
Asitico poder, assim, constituir o centro de domesticao do gado bovino a partir de
populaes selvagens da subespcie asitica do auroque (Bos primigenius namadicus)
(EPSTEIN & MASON, 1984).
Outra evidncia adicional fornecida pela descoberta de ossos e dentes de um animal
sensivelmente mais pequeno do que o auroque (Iraque, 5.000 anos a.C), bem como por um
primeiro testemunho escrito onde se descreve, em placas de argila, uma cabea de vaca
(Mesopotmia, 5.000 anos a.C.) (ROGERSON, 1991).
Muitos outros achados arqueolgicos e paleontolgicos foram encontrados na
Mesopotmia (4.000 anos a.C.) e no vale do rio Nilo (4.000 anos a.C), mostrando um bovino
totalmente domesticado e de longos cornos (EPSTEIN & MASON, 1984).
A consolidao do processo de domesticao , a partir desta altura, inquestionvel,
tornando-se abundantes os registos de bovinos domesticados na Mesopotmia e vale do Nilo.
A este respeito, devem referir-se especialmente as numerosas esculturas, relevos, pinturas e
textos em papiro que relatam pormenores da vida quotidiana do povo egpcio e onde aparecem
diversas cenas que mostram a importncia do gado bovino na agricultura e na alimentao
(figura 1.1.2).
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Introduo
Figura 1.1.2: Desenho ilustrativo de uma ordenha, 5a dinastia. Reproduzido de BAINES
& MLEK (1980).
A partir desta altura, as descobertas arqueozoolgicas so testemunho de uma
expanso do gado bovino. Assim, existem registos datados de h cerca de 2.000 e 3.000 anos
a.C. que sugerem a ocorrncia, no Norte de frica, de animais de enormes cornos em forma de
lira (EPSTEIN & MASON, 1984).
Tal expanso d-se, tambm, pela Turquia, indo at ao Cucaso e Rssia, e chega
tambm Europa, onde nas regies do Norte foram encontrados objectos de arte da idade do
Cobre e do Bronze que representam bovinos e datam do incio do Cristianismo (EPSTEIN &
MASON, 1984).
A migrao para oriente est, tambm, bem documentada atravs de numerosos restos
arqueozoolgicos descobertos em toda a sia. , contudo, nesta regio geogrfica que se
pode observar a transio de gado bovino sem bossa (Bos taurus) para outro com bossa (Bos
indicus). Segundo alguns autores, as raas de Bos indiens, ou gado zebu, derivariam das raas
de Bos taurus, ou gado taurino, atravs de um processo de seleco (EPSTEIN & MASON,
1984). Alternativamente, estes dados podem tambm ser interpretados como a ocorrncia de
dois processos de domesticao independentes, seguidos do contacto entre as duas populaes
domsticas de gado bovino.
Adicionalmente, deve salientar-se que a evidncia descrita ainda muito incompleta,
pelo que a interpretao dos dados deve ser feita com bastante precauo. A ttulo de
exemplo, refiram-se os achados arqueozoolgicos efectuados na Pennsula dos Balcs e na
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Introduo
Macednia Grega (6.200 anos a.C). Segundo EPSTEIN & MASON (1984) estes achados
sugerem que o Sul da Europa poderia constituir o primeiro centro de domesticao do gado
bovino, a partir de onde se teria iniciado a sua expanso em direco ao resto do continente
europeu, Rssia e Sudoeste Asitico.
1.1.3. - Anlise gentica
A investigao sobre a gentica das diferentes raas de gado bovino tem contribudo de
forma muito significativa para a compreenso da sua histria, dos padres de diversidade que
actualmente as caracterizam, e do seu grau de parentesco. Os resultados actualmente
disponveis reportam-se a trs domnios principais: grupos sanguneos, variao gentica de
protenas e polimorfismos do DNA (DNA mitocondrial e microssatlites).
Grupos sanguneos
A primeira tentativa para avaliar o grau de diferenciao gentica entre raas bovinas e
caracterizar a sua diversidade data do incio de dcada de 70, e envolveu precisamente o
estudo dos diferentes grupos sanguneos que iam sendo descritos (RUSSELL, 1996; USHA,
1996). Contudo, a maior parte dos resultados no permitiu a obteno de concluses
definitivas pelo facto de se trabalhar com um nmero relativamente reduzido de loci que, adicionalmente, era pouco polimrfico. Deve, porm, referir-se que se dispe actualmente de
uma considervel quantidade de informao no que se refere distribuio da variabilidade dos
grupos sanguneos nas diferentes raas bovinas, conferindo a este conjunto de dados uma
importncia no desprezvel no estudo de eventuais alteraes da estrutura gentica de
populaes de gado bovino nos ltimos vinte anos (RUSSELL, 1996; USHA, 1996).
Protenas
A introduo de tcnicas electroforticas de separao de protenas permitiu aumentar
de forma muito considervel o nmero de sistemas genticos polimrficos conhecidos nas
raas bovinas, em especial no que se refere a protenas do sangue e do leite (USHA, 1996).
A anlise da sua distribuio populacional veio demonstrar a ocorrncia de dois grupos
principais de bovinos, ou duas subespcies (Bos primigenius taurus e Bos primigenius
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Introduo
indiens), cada um deles caracterizado pela presena de diversos alelos privativos em vrios loci
(BRAEND, 1971).
Estes resultados esto, de uma maneira geral, de acordo com dados morfolgicos,
histricos e ainda com a distribuio geogrfica conhecida dos principais grupos (EPSTEIN &
MASON, 1984). No entanto, o acrscimo de informao fornecido por este tipo de marcadores
foi, ainda, insuficiente para resolver muitas das interpretaes contraditrias publicadas sobre o
tema.
Polimorfismo do DNA
A introduo das tcnicas de anlise genmica directa e, em especial, a descoberta do
polimorfismo do DNA-mitocondrial (mtDNA) e dos microssatlites, forneceram os
instrumentos necessrios a uma detalhada caracterizao gentica das raas bovinas.
A anlise da variao da molcula de mtDNA permitiu verificar que Bos primigenius
taurus e Bos primigenius indicus tero divergido h cerca de 210.000 anos, uma data muito
anterior indicada pelos dados arqueolgicos para o incio do processo de domesticao. ,
assim, muito provvel que tenham ocorrido duas domesticaes independentes a partir de duas
subespcies diferentes do auroque: Bos primigenius namadicus ter dado origem ao gado
zebu, na sia (Vale do Indu), e Bos primigenius primigenius ao gado europeu, vindo do
Prximo Oriente (LOFTUS et ai, 1994a, 1994b).
Muito recentemente, BRADLEY et ai (1996) e MACHUGH et ai. (1997) sugerem, ainda,
uma terceira domesticao independente, ocorrida em frica. Esta evidncia resulta, tambm,
de anlise do polimorfismo do mtDNA, indicando uma separao entre os ancestrais do gado
europeu e africano anterior domesticao (22.000 - 26.000 anos). Este terceiro processo de
domesticao ter-se-ia, assim, efectuado a partir da subespcie africana do auroque (Bos
primigenius opisthonomus).
A descoberta dos microssatlites e do seu elevado grau de polimorfismo data do fim da
dcada de 80 (Lm & LUTY, 1989; WEBER & MAY, 1989) e constitui, provavelmente, a
metodologia mais adequada para estudar a histria recente da diversificao das raas bovinas
(MACHUGH et ai, 1994; ARRANZ et ai, 1996). Os primeiros resultados que envolvem uma
caracterizao em larga escala de diferentes populaes permitiram distinguir mais claramente
a estrutura gentica dos dois grandes grupos de gado bovino (Bos taurus e Bos indicus), e
constituem a base para futuros estudos mais especficos.
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Introduo
Por outro lado, os microssatlites permitiram, tambm, o incio do projecto de
cartografia do genoma bovino que, no fim de 1994, contabilizava 202 marcadores genticos
(dos quais 144 eram microssatlites) regularmente espaados em 90% do seu comprimento.
Cerca de um ano depois existiam, j, mais de 400 microssatlites (USHA et ai, 1995), levando
EGGEN et ai (1995) a apresentar um trabalho de reviso e consolidao de informao j
existente para evitar a ocorrncia de possveis redundncias.
A aplicao deste tipo de marcadores no se restringe apenas anlise da diversidade
gentica populacional e construo de mapas genticos. De facto, so actualmente escolhidos
para a realizao de testes de paternidade (GLOWATZKI-MULLIS et ai, 1995; USHA et ai. 1995;
ARRANZ et ai, 1996), deteco de loci que determinam a expresso de caractersticas
quantitativas (QTL) (RON et ai, 1994), determinao do sexo em embries, seleco animal
assistida, entre outros.
No seu conjunto, estes resultados tm permitido um avano notvel na compreenso da
evoluo das actuais raas bovinas. A prossecuo desta via de investigao poder levar ao
esclarecimento definitivo do nmero de domesticaes independentes que ter ocorrido
(EPSTEIN & MASON, 1984; LOFTUS et al, 1994a, 1994b; BRADLEY et al, 1996; MACHUGH et
al, 1997) a partir das populaes selvagens de auroque. Seguidamente, legtimo esperar que
venha a ser possvel analisar a uma escala mais fina o grau de parentesco gentico entre raas
que ocupem reas geogrficas mais reduzidas. Neste particular, ser extremamente interessante
incluir as populaes ibricas e, em especial, a raa Barros.
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Introduo
1.2. - A DIVERSIDADE DAS RAAS BOVINAS
A domesticao resultou na criao de milhares de raas de animais domsticos,
geneticamente diferentes e adaptadas s necessidades humanas e a uma grande variedade de
condies ambientais (FAO, 1993).
1.2.1. - As raas ibricas
A grande diversidade de raas bovinas da Pennsula Ibrica poder dever-se, em parte,
introduo de outras raas domsticas, que se cruzaram entre si e com bovinos j existentes
na Pennsula. A introduo de outras raas ter sido feita de duas formas distintas:
1 - atravs dos movimentos migratrios, acompanhando as vrias invases de povos
vindos do oriente, como o caso dos Fencios ( sc. X a.C), Gregos (sc. VII a.C.), e
Romanos (sc. III a.C). Estes ltimos dominaram completamente a Pennsula durante
7 sculos e tero contribudo para a diversificao do gado bovino pelo facto de
introduzirem animais de caractersticas diferentes. Supe-se que do seu cruzamento
com os bovinos ibricos se tero originado os troncos aquitnico e ibrico (MIRANDA
do VALE, 1949);
2 - atravs da introduo de animais do Norte de frica na sequncia da invaso de
povos como os Cartagineses (sc. V a.C.) e, j na era crist, os Mouros (711 d.C).
Estes tero introduzido descendentes de Bos primigenius opisthonomus, que poder
ter influenciado a formao de vrias raas ibricas, nomeadamente as raas Barros e
Cachena (APARCIO, 1960, in IGLESIAS, 1989, EPSTEIN & MASON, 1984). Estas
podero, assim, constituir uma linha que descende do tronco mauritnico (MIRANDA
do VALE, 1949).
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Introduo
Adicionalmente, provvel que povos oriundos do Norte da Europa, nomeadamente
os Visigodos, possam ter introduzido gado bovino dessa regio. Contudo, a sua eventual
contribuio para a diversidade de raas bovinas da Pennsula Ibrica est por esclarecer.
1.2.2. - A raa Barros
Aspectos histricos da disperso e evoluo do efectivo populacional
O centro de criao da raa Barros situa-se actualmente na zona do planalto da Serra
do Barroso, abrangendo os actuais concelhos de Montalegre, Boticas, Vieira do Minho
(freguesias de Campos e Ruives) e Cabeceiras de Basto (freguesia de Gondies). Esta regio
no possui condies agro-climatricas que permitam grandes exploraes agrcolas, pelo que
uma parte importante da populao se dedica criao de gado (GARCIA et ai, 1981;
FERNANDES, 1996).
Vivendo sobretudo em zonas montanhosas, a Barros utilizada, essencialmente, como
fora de trabalho e na produo de carne de excelente qualidade, motivo pelo qual a Unio
Europeia a reconhece com denominao de Origem Protegida (FERNANDES, 1996).
No sculo passado e incio do sculo XX existia um grande incentivo para a criao
desta raa devido procura da sua carne, muito apreciada em Inglaterra. Este incentivo
contribuiu, indirectamente, para que a estatura dos animais se elevasse (GARCIA et ai, 1981), e
para que a zona de criao se dispersasse pelas reas submontanhosas e pelas plancies do
Entre Douro e Minho at orla martima, chegando mesmo ao concelho de Vila Nova de Gaia
(figura 1.2.1). Nestas zonas fazia-se a criao de novilhos para explorao como bois de
trabalho e para produo de carne. Tal explorao est bem patente nos painis de azulejos da
estao de caminhos de ferro de S. Bento, no Porto, e mesmo nos desenhos das caladas nas
principais avenidas desta cidade.
li
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Introduo
B
. _ . . . . . . ' " ' - . . . : : ' !
Figura 1.2.1: A) Junta de bois de trabalho de raa Barros, B) Fmea adulta Barros, C) Macho adulto Barros. Fotografias datadas de 1949, gentilmente cedidas pela Direco Regional de Agricultura de Entre Douro e Minho - Centro de Produo Animal (D.R.A.E.D.M.).
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Introduo
Porm, a necessidade de maiores produes de carne foi conduzindo, durante a
segunda metade deste sculo, a um progressivo declnio no efectivo populacional da raa
Barros, tornando-se mesmo raro poder observar uma junta de bois. Recentemente, as
alteraes verificadas na poltica agrria e ambiental da Unio Europeia tero permitido
alguma recuperao. Nesse contexto, a criao, em 1981, do Livro Genealgico da raa
Barros constitui um passo importante para a certificao dos animais e o aumento do seu
valor. Actualmente, o seu efectivo populacional tem crescido continuamente, e essa tendncia
parece estvel.
Segundo dados fornecidos pelo Registo Zootcnico e pela Associao do Minho dos
Criadores de Bovinos de Raa Barros (AMTOA), existiam, em 1996, 38.002 fmeas
reprodutoras inscritas e 375 touros de cobrio (tabela 1.2.2.1), distribudos por vrios
concelhos dos distritos de Viana do Castelo, Braga, Vila Real e Porto (figura 1.2.2).
Tabela 1.2.2.1: Movimento do Registo Zootcnico relativo raa Barros.
Vacas Inscritas Postos de Cobrio Vitelos Anos Abatidas Registadas Inscritas Encerrados Recenseados Existncias Inscritos 1981 0 4884 4882 1 25 24 0 1982 19 6169 11032 6 42 60 532 1983 31 4436 15437 14 35 81 1593 1984 72 866 16231 13 14 82 2151 1985 47 604 16788 15 15 82 1767 1986 106 1027 17709 18 13 77 2414 1987 72 1186 18823 2 14 89 2632 1988 122 1192 19877 5 7 91 2574 1989 138 718 20506 14 26 103 2532 1990 89 1017 21440 8 7 102 2404 1991 159 1309 22590 14 26 114 2531 1992 52 1902 24440 6 17 125 3203 1993 0 4205 28645 37 87 175 4077 1994 0 6248 34893 58 111 228 4679 1995 340 2447 37000 0 112 340 5759 1996 120 1122 38002 26 61 375 5901
Fonte: Registo Zootcnico (cedido pela AM1BA).
Apesar desta situao favorvel, no se pode considerar que a raa Barros no corra,
ainda, perigo de extino. Na verdade, so vrios os factores que tm contribudo para a
diminuio da sua rea de criao, ou mesmo para a alterao das caractersticas destes
animais. De entre esses factores deve salientar-se i) a substituio de Barros por outras raas, autctones (Minhota, Mirandesa, Maronesa) ou importadas (Frsia, Gelbvieh e Parda Sua),
13
-
Introduo
que fornecem ao agricultor um rendimento superior, ii) a progressiva mecanizao da
agricultura e a diminuio das reas de pastagem, iii) o pequeno nmero de machos
reprodutores associado a um efectivo idoso, iv) uma baixa fertilidade mdia, grandes
intervalos entre partos e elevado nmero de abortos, e v) desmotivao dos produtores mesmo
em face das actuais condies de comercializao.
LEGENDA:
| j - -Concelhos de Entre Douro e Minho S Concelhos de Trs-os-Montes
ESCALA: 1:1380000
Figura 1.2.2: Mapa de distribuio do actual efectivo Barros.
14
-
Introduo
Aspectos morfolgicos
O bovino Barros apresenta uma estatura mediana, com 121-130 cm de altura
cernelha e pelagem de cor castanha (variando entre a cor de palha at a cor acerejada) (LEAL,
1995). A cabea curta e larga, encimada por uma cornamenta em forma de lira alta; os
cornos so muito compridos e espessos, de cor branca suja, com pontas escuras; o conjunto
ocular saliente, dando-lhe o aspecto de olhos de sapo; as orelhas so de tamanho mdio; os
membros so curtos e pouco ossudos e o pescoo curto, bem ligado cabea e com garrote
largo (MARTINS, 1982).
uma raa com caracteres sexuais secundrios bem diferenciados. Os touros so
normalmente mais escuros, particularmente no tero anterior, com maior corpulncia do que as
fmeas, mais robustos, com barbela mais desenvolvida, cabea mais curta e mais larga, cornos
mais grossos e ligeiramente mais curtos (GARCIA et ai, 1981; MARTINS, 1982). Esta raa apresenta duas particularidades morfolgicas que a distinguem de todas as
outras raas: grande desenvolvimento crneo e perfil cncavo da cabea com acentuado
prognatismo mandibular. O elevado crescimento crneo poder estar relacionado com a
seleco dos animais. De facto, nas populares chegas de touros, o animal que sai vencedor ser
o touro cobridor das vacas da aldeia. Este processo ter permitido a primazia de touros de
maior ossatura capital, mais potente musculatura cfalo-cervical, maior fora no ngulo trsico
e, consequentemente, grande desenvolvimento dos cornos (MIRANDA do VALE, in GONALVES GARCIA, 1964; ARAJO, 1986). No que se refere ao acentuado prognatismo
mandibular, possvel que, em parte, esteja relacionado com o grande desenvolvimento
crneo. Este ter exigido um desenvolvimento correlativo de certos ossos cranianos e o
atrofiamento dos ossos da face (GONALVES GARCIA, 1964).
Origem
A origem da raa Barros e o seu enquadramento com as outras raas da Pennsula
Ibrica est ainda por explicar, constatando-se uma grande heterogeneidade na opinio de
diversos autores a este respeito (MARTINS, 1982).
Alguns autores referem a existncia, no Norte de frica (vale do Nilo), de um gado
com caractersticas morfolgicas semelhantes actual raa Barros, em especial no que se
refere forma, tamanho e espessura dos cornos. Este gado normalmente associado
15
-
Introduo
designao subespecfica Bos primigenius opisthonomus (embora tambm se refira como Bos
primigenius mauritaniens e como Bos taurus desertorum), e ter chegado Pennsula Ibrica
atravs de vrias rotas migratrias dos povos norte-africanos. A raa Barros poderia, assim,
ser includa no tronco mauritnico, tendo como ancestral Bos primigenius mauritanicus
(GARCIA et ai., 1981).
Neste contexto, poder admitir-se que o gado que corresponde a este grupo se tenha
instalado na Pennsula Ibrica, provavelmente durante a longa ocupao Moura (GONALVES
GARCIA, 1964). Posteriormente, a raa Barros ter sido desalojada pelos troncos ibrico e
aquitnico, restando apenas um ncleo populacional confinado s zonas planlticas do
Barroso, onde permaneceu at hoje (GONALVES GARCIA, 1964).
Esta hiptese no , contudo, partilhada por outros autores, que lhe criticam a escassa
evidncia (forma e tamanho dos cornos) e, portanto, uma clara ausncia de base cientfica
(IGLESIAS, 1989).
Perante o exposto, pode verificar-se que a raa Barros apresenta aspectos
morfolgicos e histrico-evolutivos muito peculiares, sendo ainda hoje difcil proceder ao seu
enquadramento no seio das restantes raas bovinas ibricas. O aprofundamento da investigao
sobre a estrutura gentica das suas populaes poder ser, assim, uma via para o
esclarecimento das muitas questes que permanecem por responder. Nestas condies, este
trabalho pretende ser uma contribuio para o conhecimento da gentica das populaes da
raa bovina Barros atravs da consecuo dos seguintes objectivos:
1. estudo da variabilidade gentica da raa Barros ao nvel das protenas eritrocitrias
e plasmticas;
2. desenvolvimento e afinao de tcnicas de separao de protenas por electroforese
e focagem isoelctrica e sua deteco especfica (histoqumica e imunolgica);
3. anlise familiar dos polimorfismos encontrados;
4. avaliao do grau de diferenciao gentica existente entre a raa Barros e outras
raas bovinas.
16
-
Material e Mtodos
2. - MATERIAL E MTODOS
2.1. - AMOSTRAGEM E CONSERVAO DAS AMOSTRAS
2.1.1. - Amostragem
Foram recolhidas 356 amostras de sangue correspondente a 294 indivduos de raa
Barros (dos quais 141 estavam inscritos no Livro Genealgico), e 62 indivduos de raa
Minhota. As colheitas efectuaram-se em zonas de intensa criao da Barros, designadamente
nos concelhos de Arcos de Valdevez, Cabeceiras de Basto, Fafe, Pvoa de Lanhoso e
Mono, em finais de 1993, durante o ano de 1994 e ainda no perodo de 1996/ 1997, em
Vieira do Minho.
A recolha de sangue em indivduos de raa Minhota foi efectuada com a finalidade de
servir como termo de comparao gentica, uma vez que se realizam cruzamentos entre esta
raa e a Barros.
2.1.2. - Obteno e conservao das amostras de sangue
O sangue foi colhido da veia jugular, em tubos contendo 0,1 ml de EDTA (cido
etilnodiaminotetractico) dissdico a 10% ou em tubos heparinados.
As amostras de sangue foram centrifugadas (10 minutos a 13000 rpm), separando-se
em seguida o plasma dos eritrcitos. Aos eritrcitos foi adicionado meio de glicerol (seis
partes de uma soluo 5% de citrato trissdico 2H20 adicionados a quatro partes de glicerol)
numa proporo aproximada de 2:1; as amostras foram conservadas a -20C.
17
-
Material e Mtodos
2.2. - BATERIA DE MARCADORES GENTICOS SELECCIONADOS
No presente trabalho foi escolhida uma bateria de 12 marcadores genticos, dispersos
no genoma do bovino (figura 5): HB (Hemoglobina), CAII (Anidrase carbnica), PEPB
(Peptidase B), DIA (Diaforase), NP (Fosforilase nucleosdica), MDH (Desidrogenase do
malato), PGD (Desidrogenase do cido fosfoglucnico), GPI (Isomerase da fosfoglucose),
MPI (Isomerase da manose-6-fosfato), ALB (Albumina), TF (Transferrina) e GC
(Componente especfico de grupo).
CP SODl TF
PEPC IDH1
AMY1 AMY1A PGM1
4
LDHB PEPB
ADH2 PGM2 ALB GC SOD3
6
IADA
ALDH1
CAII
ME1 PGM3 SOD2
NP
10
CAT HBB,q22-q27
PGD IALDH2 DIA4
HP GPI,q22-q24
MPI iBF GLOl
LDHA MDH2
Figura 2.2.1: Localizao de vrios loci proteicos no genoma de Bos taurus. Com um tom mais carregado, indicam-se os marcadores estudados neste trabalho. Adaptado de FRIES et ai. (1993).
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Material e Mtodos
HB
A hemoglobina responsvel pelo transporte do oxignio dos pulmes para os tecidos.
A sua estrutura tetramrica, tendo cada uma das quatro subunidades um grupo prosttico -
- heme - com um tomo de ferro no centro. A fraco principal da hemoglobina de mamferos
adultos composta por duas cadeias a e duas cadeias P (BRAEND, 1971; CECCHINI & Nus,
1986).
O locus da HB foi um dos primeiros a ser estudado, apresentando polimorfismo em
vrios mamferos (CECCHJM & Nus, 1986; BRAEND et ai, 1988; CLARKE et ai, 1989; WANG
et ai, 1990; SELVARAJ et ai, 1991). Em 1955, CABANNE & SERAIN (in BRAEND, 1988),
descrevem pela primeira vez o polimorfismo da HB em bovinos do Norte da frica.
Posteriormente, muitos estudos foram efectuados descrevendo-se 13 variantes (raros na sua
maioria), com diferenas apenas nas cadeias beta (CECCHINI & Nus, 1986; BRAEND, 1988).
CAII-E.C.4.2.1.1
A CAII uma metaloenzima com grande distribuio nos animais e nas plantas
(TASHIAN, 1989). Catalisa de forma reversvel a hidratao do C02 em H2C03 (CECCHINI &
Nus, 1986; TASHIAN, 1989). O seu papel fisiolgico ainda no bem conhecido mas
possvel que tenha participao na manuteno do balano osmtico (TASHIAN, 1989).
A ocorrncia de variao gentica na CAII est descrita em muitas espcies de
mamferos, tendo sido descritos dois loci polimrficos (CAI e CAII) (TASHIAN & CARTER,
1976; CLARICE et ai, 1989; SELVARAJ et ai, 1991).
SARTORE et ai (1969) foram os primeiros a detectar polimorfismo electrofortico da
anidrase carbnica em bovinos domsticos e bfalos americanos. Nos eritrcitos de bovinos
apenas se exprime a anidrase carbnica II que apresenta geralmente 2 alelos codominantes
autossmicos (CAIPF e CAIPS) (SARTORE et ai, 1969; TASHIAN & CARTER, 1976). Mais
tarde, foram encontrados 3 novos alelos (C, Z e X) (CECCHINI & Nus, 1986).
19
-
Material e Mtodos
PEPB-E.C.3.4.12.
As peptidases formam um conjunto de enzimas capazes de hidrolisar di- e tripptidos,
caracterizando-se pela sua especificidade em relao a diversos substratos, bem como atravs
da sua distribuio tecidular.
A PEPB apresenta uma estrutura monomrica, tendo sido descrita como polimrfica
em algumas raas brasileiras de bovinos de origem europeia e indiana (DEL LAMA et ai,
1992).
DIA-E.C.1.6.4.3.
A enzima monomrica DIA (NADH - Methemoglobina redutase), tambm conhecida
por citocromo bs redutase, faz parte de um grupo de enzimas que catalisam a reduo da
methemoglobina (IGLESIAS, 1989; VIEIRA, 1993; kRAHhetal, 1986).
O seu polimorfismo gentico foi detectado em vrias espcies de Ungulados, incluindo
os bovinos (CLARKE et ai, 1989; IGLESIAS, 1989; SELVARAJ et ai, 1991; TATE & McEWAN,
1992).
NP-E.C.2.4.2.1.
A enzima NP encontra-se distribuda por vrios tecidos e rgos e catalisa
reversivelmente a fosforlise dos nucleosdeos purnicos, levando formao das respectivas
bases e ribose-1-fosfato (IGLESIAS, 1989).
O polimorfismo gentico desta enzima foi detectado em vrias espcies de mamferos,
incluindo os bovinos (ANSAY, 1973; HARRIS & HOPKINSON, 1978; TUKER & YOUNG, 1988;
CLARKE tal, 1989; IGLESIAS, 1989; FERRAND, 1995).
20
-
Material e Mtodos
MDH-E.C.l. 1.1.37
A MDH uma oxirredutase dimrica na maioria dos mamferos, responsvel pela
oxidao do L-malato em oxoglutarato, com NAD como aceitador. A reaco reversvel em
presena de NADH e oxaloacetato. A enzima diz-se NAD especfica pelo facto da reaco s
ocorrer na presena deste cofactor (MORAIS, 1992; PEREIRA, 1997).
A ocorrncia de variao gentica neste locus foi descrita para vrios mamferos
(HARRIS & HOPKINSON, 1978; TUNN et ai, 1989; SELVARAJ et ai, 1991). Contudo,
relativamente aos bovinos, no foi possvel encontrar referncias quanto ao seu polimorfismo.
PGD-E.C.1.1.1.44
A PGD uma enzima dimrica envolvida na via das pentoses-fosfato, catalisando a
converso de 6-fosfogluconato em ribose-5-fosfato.
O polimorfismo gentico do locus PGD est descrito em diversas espcies de
Ungulados (HERZOG, 1988; PENEDO et ai, 1988; BEKENEV & ORLO VA, 1991; KUROSAWA &
TANAKA, 1991; JANZEN & COTHRAN, 1991; FERNDALE et al, 1992). Contudo, relativamente
aos bovinos, no foi possvel encontrar referncias quanto ao seu polimorfismo.
GPI-E.C.5.3.1.9
A isomerase da fosfoglucose cataliza a reaco reversvel de converso de glucose-
-6-fosfato em frutose-6-fosfato (HARRIS & HOPKINSON, 1978; PRETSCHei ai, 1990).
uma enzima dimrica com polimorfismo gentico em vrias espcies de mamferos,
nomeadamente no co (ARNOLD & Bouw, 1989), no porco (VAN DE WEGHE et ai, 1988;
BEKENEV & ORLO VA, 1991), na ovelha (RASERO et ai, 1993), em lamas e alpacas (PENEDO et
ai, 1988) e no Homem (HARRIS & HOPKINSON, 1978).
21
-
Material e Mtodos
MPI-E.C.5.3.1.8
A MPI uma enzima monomrica de aco cataltica que permite a isomerizao de D-
-manose-6-fosfato em D-frutose-6-fosfato.
Em diversas espcies de mamferos, nomeadamente no Homem (RlTTER et ai, 1974),
em babunos (RITTER & SCHMITT, 1973) e ratos (NICHOLS et ai, 1973; VANDEBERG &
AIVALIOTIS, 1990), esta enzima no apresenta actividade em eritrcitos, sendo porm
detectada em diversos tecidos como rim, fgado e o msculo. Mais tarde, demonstrou-se a
possibilidade de proceder a esta deteco em hemolisados de cavalos, coelhos e lebres (HALL
et ai, 1991; VIEIRA & FERRAND, 1995; SANTOS, 1995).
O polimorfismo gentico de MPI em bovinos foi descrito por ANSAY (1973),
apresentando trs alelos autossmicos codominantes (MPPA, MPI*B e MPI*C).
ALB
A albumina a protena mais abundante no plasma dos mamferos e apresenta uma
estrutura monomrica. A sua funo est relacionada com processos de transporte e de
regulao do balano osmtico (CECCHTNI & Nus, 1986; CARTER et al, 1989).
O polimorfismo gentico da albumina est descrito em vrias espcies de Ungulados
(STORMONT et ai, 1963; BOWLING & CLARK, 1988; PENEDO et ai, 1988; ERHARDT, 1991;
SELVARAJtfa/., 1991;CRISTOFALO?/a/., 1992; ERHARDT & SlMIANER, 1993).
EFREMOV e ASHTON em 1965 (in CECCHTNI & Nus, 1986) descrevem pela primeira vez
polimorfismo gentico em raas bovinas inglesas. Inicialmente encontraram-se dois alelos
(ALB*A ou ALB*F, e ALB*B ou ALB*S), por electroforese cida. Mais tarde, descreveram-
-se outros alelos em raas britnicas (ALB*H e ALB*G), e em raas africanas (ALB*D,
ALB*E e ALB*F) (CECCHINI & Nus, 1986). ABE et ai. em 1971 descrevem, o alelo ALB*X
(in CECCHTNI & Nus, 1986).
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-
Material e Mtodos
TF
A transferrina uma 3-globulina srica responsvel pelo transporte do ferro. Possui
uma estrutura monomrica glicosilada (CECCHINI & Nus, 1986; WELCHS, 1990; PENHALLOW
et ai, 1991; CUNHA, 1994).
O polimorfismo gentico desta protena foi detectado em vrias espcies de Ungulados
(KRISTJANSSON, 1963; STORMONT et ai, 1963; ASHTON, 1965; GAHNE et ai, 1977; CECCHJNI
& Nus, 1986; ERHARD, 1986; KUROSAWA & TANAKA, 1988; PENEDO et ai, 1988; CLARKE et
ai, 1989; HERZOG, 1989; JUNEJA et ai, 1989; TSUJI et ai, 1989; SCHNEIDER et ai, 1990;
STRATIL et ai, 1990; WANG et ai, 1990; SELVARAJ et ai, 1991; DRATCH et ai, 1992;
VANKAN & BELL, 1992a; CZovket ai, 1993; ERHARD et ai, 1993).
ASHTON em 1965 descreveu, pela primeira vez, o polimorfismo gentico de TF em
bovinos, estando actualmente descritos sete alelos: TF*A, TF*B, TF*D1, TF*D2, TF*E,
TF*F e TF*G (CECCHTNI & Nus, 1986). A subdiviso do alelo TF*D em TF*D1 e TF*D2 foi
descrita por KRISTJANSSON & HICKMAN (1965).
Nos bovinos, os loci TF e CP encontram-se ligados, como tem sido descrito para vrias
espcies de mamferos (JUNEJA et ai, 1989).
GC
A GC apresenta uma estrutura monomrica e o seu polimorfismo gentico est descrito
em vrias espcies de Ungulados (GAHNE, 1963; KRISTJANSSON, 1963; JUNEJA et ai, 1987;
PENEDO et ai, 1988; PENEDO & JUNEJA, 1989; KALB et ai, 1990; ERHARDT, 1991; VANKAN
& BELL, 1992b; STERN et ai, 1992; ERHARDT & SIMIANER, 1993; STRATIL et ai, 1995).
Nos bovinos, o polimorfismo gentico da GC foi inicialmente descrito por GAHNE
(1963) e ASHTON (1963) {in GAHNE et ai, 1977), mas s mais tarde foi possvel obter
frequncias gnicas para este locus (alelos GC*A e GC*B) em diferentes raas europeias
(GAHNE et ai, 1977). A utilizao de novas tcnicas de separao permitiu distinguir um
terceiro alelo, GC*C (VAN DE WEGHE, 1982).
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Material e Mtodos
A existncia de ligao factorial entre os loci ALB e GC foi demostrada no Homem,
em primeiro lugar, e depois nos cavalos, nos bovinos e na ovelha (VAN DE WEGHE, 1982;
ERHARDT & SlMIANER, 1993).
2.3. - TRATAMENTO DAS AMOSTRAS
HB
A separao da molcula HB por focagem isoelctrica foi feita mediante a utilizao de
hemolisados diludos 1:8 em gua bidestilada.
CAII
A separao electrofortica de CAII foi realizada em gel de amido e em focagem
isoelctrica. No primeiro caso, as amostras foram simplesmente tratadas com tolueno,
enquanto no segundo se procedeu, ainda, sua reduo com uma soluo de ditiotreitol
(DTT) 120 mM (100 \ de amostra no diluda e 20 pi de DTT 120 mM) durante 1 h a 37C.
Quando se utilizou focagem isoelctrica, alm do tratamento j referido, foi necessrio
realizar uma diluio final de 1:10 com gua bidestilada.
PEPB; DIA; NP; MDH; PGP; GPI e MPI
As separaes electroforticas de PEPB, DIA, NP, MDH, PGD, GPI e MPI em gel de
amido foram efectuadas com hemolisados no diludos, submetidos ao mesmo tratamento
descrito para CAII quando separada por electroforese convencional.
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-
Material e Mtodos
ALB
Na separao de ALB por focagem isoelctrica utilizaram-se amostras de plasma
diludas com gua bidestilada na proporo de 1:70.
TF
Na separao de TF efectuada por focagem isoelctrica utilizaram-se amostras de
plasma submetidas a vrios tipos de tratamento, para comparao dos padres de bandas
obtidos:
1. Remoo dos resduos de cido silico da molcula de TF
diluio 1:3 com neuraminidase, durante 1 h a 37 C.
2. Remoo do Fe da molcula de TF
diluio 1:3 com EDTA-dissdico (20%) 2 h antes da aplicao para remoo dos
tomos de Fe da molcula de TF.
3. Saturao em Fe da molcula de TF
3.1 - diluio 1:3 com soluo de sulfato de amnio frrico 0,15% (p/v) em cido
ctrico 60 mM, seguida de incubao temperatura ambiente 18 h. A utilizao
de uma razo ligante / Fe de 20:1 permite uma rpida saturao da molcula de
TF (FERRAND, 1995).
3.2 - diluio 1:3 com soluo de sulfato de amnio ferroso 0,15% (p/v) em cido
ctrico 60 mM, seguida de incubao temperatura ambiente 18 h.
3.3 - diluio 1:3 com soluo de citrato de amnio frrico 0,15% (p/v) em cido
ctrico 60 mM, seguida de incubao temperatura ambiente 18 h.
3.4 - diluio 1:3 com soluo de citrato frrico 0,15% (p/v) em cido ctrico
60 mM, seguida de incubao temperatura ambiente 18 h.
3.5 - diluio 1:3 com soluo de cloreto de ferro 0,15% (p/v) em cido ctrico
60 mM, seguida de incubao temperatura ambiente 18 h.
25
-
Material e Mtodos
Antes da insero, as amostras foram parcialmente purificadas atravs da adio de 5
volumes de uma soluo de rivanol 0,6% (p/v) em tampo Tris / HC1 0,05 M (ajusta-se o pH
para valores de 9,1 com Tris 1 M), seguida de centrifugao.
G
A fim de proceder remoo dos resduos de cido silico existente nas cadeias de
hidratos de carbono ligadas molcula GC, as amostras de plasma foram submetidas a uma
incubao com uma soluo de neuraminidase {Clostridium perfringens, SIGMA type V, 1,8
U/ml) na proporo de 1:3 durante 18 h a 37C, acrescentando-se posteriormente gua
bidestilada at obteno de uma diluio final de 1:4. Paralelamente, procedeu-se a uma
diluio das amostras com gua bidestilada (1:9) para comparao dos padres de bandas
obtidos.
2.4. - MTODOS DE SEPARAO
Electroforese convencional
Nas tcnicas de electroforese convencional, foram utilizados vrios sistemas de tampo
para os gis e para as pontes, conforme a protena em estudo.
Focagem isoelctrica
Os sistemas de focagem isoelctrica utilizados na separao de protenas foram
realizados em matrizes de poliacrilamida (T = 5%; C = 3%) com dimenses 230xl00x0,3mm.
Os gis foram aplicados sobre uma pelcula de suporte GELFIX (SERVA), permitindo o seu
manuseamento adequado.
A adio de solues de TEMED 10% (p/v) e persulfato de amnio (PSA) 10% (p/v)
permitiu a polimerizao do gel temperatura ambiente (24 horas) ou a 37 C durante 1 h.
As separaes por focagem isoelctrica decorreram sobre placa de arrefecimento a
aproximadamente 10C (8 - 12C).
26
-
Material e Mtodos
HB
A separao da molcula de HB foi realizada por focagem isoelctrica em gradiente de
pH livre, segundo a tcnica descrita por FERRAND (1995), com algumas modificaes.
A composio da soluo de polimerizao e os parmetros elctricos utilizados esto
indicados nas tabelas 2.4.1 e 2.4.2, respectivamente.
Tabela 2.4.1: Soluo de polimerizao utilizada para a separao da molcula nativa de HB por focagem isoelctrica.
Componentes da soluo Quantidades
Acrilamida 28% (p/v)
Bisacrilamida 2% (p/v)
Sacarose
Anflitos 5-8 (SIGMA) 7-9 (PHARMACIA)
gua bidestilada TEMED 10% (v/v)
PSA 10% (p/v)
1,8 ml
0,8 ml
2 g
300 p.1
300 ul
at 10 ml volume final
10 ul
70 ul
Tabela 2.4.2: Parmetros elctricos utilizados na focagem isoelctrica de HB.
Voltagem (V) Corrente (mA) Potncia (W) Tempo (T)
Pr focagem 1500 25 1
2
3
30 min
15 min
15 min
Focagem 1500 25 15 2h 30 min
As solues para os elctrodos foram cido asprtico 0,04 M (nodo) e NaOH 0,1 M
(ctodo). As amostras foram aplicadas a 1,5 cm do ctodo, tendo sido inseridas com o auxlio
de um aplicador de borracha silicone (SERVA).
27
-
Material e Mtodos
CAII
A separao de CAII fez-se em gel de amido (15% p/v, SIGMA) conforme o descrito
por AMORIM (1983), com algumas modificaes, e ainda por focagem isoelctrica em
gradiente de pH livre.
Utilizam-se os seguintes sistemas tampo para a separao por electroforese em gel de
amido:
Tampo das Pontes: Tris 0,250 M pH = 7,6 cido ctrico 0,067 M
Tampo do Gel: Diluio 1:10 do tampo das pH = 7,6 pontes
As amostras foram inseridas em meio Sephadex G-200 (PHARMACIA) na proporo
de 1:1. As electroforeses foram realizadas em placa de arrefecimento (8C) e com um
gradiente de potencial de 5 V/cm durante 16 h.
A tcnica utilizada para a separao de CAII por focagem isoelctrica foi a descrita por
BOWLING et ai. (1990), com algumas modificaes. A composio da soluo de
polimerizao e os parmetros elctricos utilizados esto indicados nas tabelas 2.4.3 e 2.4.4,
respectivamente.
As solues para os elctrodos foram cido asprtico 0,04 M (nodo) e NaOH 0,1 M
(ctodo). As amostras foram inseridas com o auxlio de um aplicador de borracha silicone
(SERVA) colocado a 1,5 cm do ctodo.
28
-
Material e Mtodos
Tabela 2.4.3: Soluo de polimerizao utilizada na separao de CAII por focagem isoelctrica.
Componentes da soluo
Acrilamida 28% (p/v)
Bisacrilamida 2% (p/v)
Sacarose
Anflitos 4-6,5 (PHARMACIA)
Anflitos 3,5-10 (PHARMACIA)
gua bidestilada TEMED 10% (v/v)
PSA 10% (p/v)
Quantidades 1,8 ml
0,8 ml
2 g
500 |o.l
100 ul
at 10 ml volume final
10 ul
70 ul
Tabela 2.4.4: Parmetros elctricos utilizados na separao de CAII por focagem isoelctrica.
Voltagem (V) Corrente (mA) Potncia (W) Tempo (T)
Pr focagem 1500 25 1
3
5
30 min
15 min
15 min
Focagem 2500 25 8
10
12
30 min
30 min
30 min
PEPB
A separao da PEPB foi realizada em gel de amido (15% p/v, SIGMA) de acordo
com a tcnica descrita por POVEY et ai. (1972), com algumas modificaes.
29
-
Material e Mtodos
Utilizou-se o seguinte sistema tampo:
Tampo das Pontes: Tris 0,1 M
pH = 7,4 NaH2P04 0,1 M
Tampo do Gel: Diluio 1:10 do tampo das
pH = 7,4 pontes
As amostras so inseridas em meio Sephadex G-200 (PHARMACIA) na proporo de
1:1. As electroforeses foram realizadas em placas de arrefecimento (8C) e com um gradiente
de potencial de 5 V/cm durante 16 h.
DIA
No caso da separao de DIA a tcnica idntica utilizada para CAII: electroforese
em gel de amido (15% p/v, SIGMA) conforme o descrito por AMORIM (1983), com algumas
modificaes.
NP, MDH, PGD, GPJ e MPI
As separaes das enzimas NP, MDH, PGD, GPI e MPI fizeram-se em simultneo por
electroforese em gel de amido (15% p/v, SIGMA) conforme o descrito por AMORIM et ai.
(1982), com algumas modificaes.
Utilizou-se o seguinte sistema tampo:
1,130 M
0,400 M
0,020 M 0,010 M
Tampo das Pontes: NaOH
pH = 6,0 cido ctrico
Tampo do Gel: His/HCl
pH = 6,0 NaOH
30
-
Material e Mtodos
As amostras foram inseridas em meio Sephadex G-200 (PHARMACIA) na proporo
de 1:1. As electroforeses foram realizadas em placas de arrefecimento (8C) e com um
gradiente de potencial de 8 V/cm durante 15 h.
ALB
Nas tabelas 2.4.5 e 2.4.6 indicam-se, respectivamente, a composio da soluo de
polimerizao para a separao de ALB por focagem isoelctrica, segundo a tcnica descrita
por ROCHA et ai. (1991), com algumas modificaes, e os parmetros elctricos.
Tabela 2.4.5: Soluo de polimerizao utilizada para a separao de ALB por focagem isoelctrica.
Componentes da soluo Quantidades
Acrilamida 28% (p/v)
Bisacrilamida 2% (p/v)
Ureia
Anflitos 5-6 (PHARMACIA) Anflitos 5-8 (PHARMACIA) Anflitos 6-8 (PHARMACIA)
gua bidestilada TEMED 10% (v/v)
PSA 10% (p/v)
1,8 ml
0,8 ml
4,8 g
250 ni
250 ni
125 ul
at 10 ml volume final
30 ul
70 ul
Tabela 2.4.6: Parmetros elctricos utilizados na separao de ALB por focagem isoelctrica.
Voltagem (V) Corrente (mA) Potncia (W) Tempo (T)
Pr focagem 1500 25
Focagem 1500 25
1 30 min
2 15 min
3 15 min
4 3 h
5 30 min
31
-
Material e Mtodos
As solues para os elctrodos foram cido asprtico 0,04 M (nodo) e NaOH 1 M
(ctodo). As amostras foram aplicadas a 1,5 cm do ctodo, com o auxlio de um aplicador de
borracha silicone (SERVA).
TF
A separao da molcula de TF foi efectuada por focagem isoelctrica. A composio
da soluo de polimerizao e os parmetros elctricos utilizados esto indicados nas tabelas
2.4.7 e 2.4.8, respectivamente.
Tabela 2.4.7: Soluo de polimerizao utilizada para a separao da TF por focagem isoelctrica.
Componentes da soluo Quantidades
Acrilamida 28% (p/v)
Bisacrilamida 2% (p/v)
Sacarose
Anflitos 3,5-5(LKB)
Anflitos 4-6,5 (PHARMACIA)
gua bidestilada
TEMED 10% (v/v) PSA 10% (p/v)
1,8 ml
0,8 ml
2 g
100 ul
500 ul
at 10 ml volume final
30 ul
70 ul
Tabela 2.4.8: Parmetros elctricos utilizados na separao de TF por focagem isoelctrica.
Voltagem (V) Corrente (mA) Potncia (W) Tempo (T)
Pr focagem 1500 25
Focagem 2500 25
l 20 min
2 10 min
3 10 min
8 30 min
10 30 min
12 30 min
32
-
Material e Mtodos
As solues para os elctrodos foram de cido asprtico 0,04 M (nodo) e de NaOH
1 M (ctodo). As amostras foram aplicadas a 1,5 cm do ctodo, com o auxlio de um aplicador
de borracha silicone (SERVA).
GC
Nas tabelas 2.4.9 e 2.4.10 apresenta-se, respectivamente, a composio da soluo de
polimerizao e os parmetros elctricos utilizados na focagem isoelctrica de GC.
Tabela 2.4.9: Soluo de polimerizao utilizada para a separao da GC por focagem isoelctrica.
Componentes da soluo Quantidades
Acrilamida 28% (p/v)
Bisacrilamida 2% (p/v)
Sacarose
Anflitos 4,5-5,4 (PHARMACIA)
Anflitos 4-6 (LKB)
gua bidestilada TEMED 10% (v/v)
PSA 10% (p/v)
1,8 ml
0,8 ml
2 g
437 ul
188 (il
10 ml volume final
10 ul
70 ul
Tabela 2.4.10: Parmetros elctricos utilizados na separao de GC por focagem isoelctrica.
Voltagem (V) Corrente (mA) Potncia (W) Tempo (T)
Pr focagem 1500 25
Focagem 1500 25
1 30 min
2 15 min
3 15 min
4 3 h
5 30 min
33
-
Material e Mtodos
Para os elctrodos, foram utilizadas solues de cido asprtico 0,04 M (nodo) e de
NaOH 0,2 M (ctodo). As amostras foram inseridas com o auxlio de um aplicador de
borracha silicone (SERVA), colocado a 1,5 cm do ctodo.
2.5. - MTODOS DE DETECO
Aps a separao das protenas, os padres electroforticos foram geralmente obtidos
por deteco especfica, aproveitando a actividade cataltica das enzimas. Noutros casos, a
revelao foi feita por colorao geral de protenas.
HB
A visualizao da HB foi obtida mediante colorao geral de protenas, segundo o
seguinte procedimento:
Fixao:
Imerso do gel numa soluo de cido tricloroactico 12,5% (p/v), durante 10 minutos.
Colorao geral de protenas:
Colorao com uma soluo de Coomassie R-250 0,115% (p/v) numa mistura de cido
actico/etanol/gua destilada (4:25:71) aps aquecimento, seguida de filtrao, durante
5-10 minutos. A descolorao feita com cido actico, etanol e gua destilada,
aquecida a cerca de 60C, at se obter o contraste desejado.
CAII
Aps separao por electroforese em gel de amido, visualizou-se a CAII pela sua
actividade estersica, adicionando-se diacetato de fluorescena (em quantidades vestigiais que
34
-
Material e Mtodos
foram previamente dissolvidas em 200 \ de acetona) a uma soluo de incubao tamponada (pH = 6,6). Esta soluo de incubao composta por cido ctrico 27 mM e Na2HP04 116 mM, e foi aplicada sobre o gel de amido com o auxlio de papis de filtro Whatman nl.
Em seguida, incubou-se durante 30 minutos a 37C. A observao das bandas de CAII (devido
sua capacidade estersica) feita sob luz ultravioleta.
Aps separao por focagem isoelctrica, utilizou-se uma colorao geral de protenas
para visualizao da CAII, segundo o mtodo descrito para a HB, sem fixao.
PEPB
A deteco da PEPB aps a separao electrofortica foi feita atravs da aplicao,
sobre o gel de amido, de papis de filtro Whatman nl embebidos numa soluo de colorao,
seguindo-se uma incubao de 30 minutos a 37C.
A soluo de colorao contm o substrato da PEPB, L-leucilglicil-glicina 0,004 M,
veneno de cobra da espcie Agkistrodon piscivorus piscivorus 0,4% (p/v), MTT 2,4 mM e
metosulfato de fenazina (PMS) 0,3 mM num tampo de pH = 8,0 (Tris/ HC10,05 M).
DIA
Aps a separao por electroforese em gel de amido, a identificao da DIA foi obtida
pela adio de uma soluo de colorao a uma fatia do gel. A incubao decorreu durante 2
horas a 37C.
A soluo de colorao foi realizada em duas fases:
Io - colocou-se 2,6-diclorofenol-indofenol (DCIP) 0,1 mM com um tampo de
pH = 8,5 (Tris/ HC1 0,05M), adicionando-se mistura gua bidestilada at perfazer
50 ml. Em seguida filtrou-se a soluo.
2o - soluo filtrada adicionou-se MTT 0,3 mM e NADH 0,2 mM e agitou-se antes
de verter sobre a fatia de gel de amido.
35
-
Material e Mtodos
NP
A deteco da enzima NP, aps a separao por electroforese, foi feita atravs da
aplicao, sobre o gel de amido, de papis de filtro Whatman nl embebidos com a soluo de
colorao. Em seguida, incubou-se durante 15 minutos a 37C.
A soluo de incubao contm inosina 3,7 mM, MTT 2,4 mM, XOD 0,004 U/ml, uma
gota de azul de Meldola (SIGMA) (10 %, v/v em gua bidestilada) e uma soluo de tampo
de incubao pH = 7,5 constituda por KH2P04 0,05 M e NaOH 0,04 M.
MDH
Na deteco da actividade enzimtica de MDH foi utilizado o mtodo de sandwich,
aps a sua separao electrofortica em gel de amido. Em seguida, incubou-se durante 15
minutos a 37C. O mtodo de sandwich consiste na aplicao de uma fatia de gel de amido
entre duas folhas de papel de filtro Whatman nl embebido com a soluo de colorao.
A soluo de colorao utilizada na deteco da MDH contm NAD 1 mM, MTT
2 mM e piruvato de sdio (quantidades vestigiais). Esta soluo foi feita com um tampo de
incubao pH = 7,4 constitudo por cido mlico 0,222 M, Tris 0,50 M e MgCl2 0,02 M.
PGP
A deteco da actividade enzimtica de PGD foi feita pelo mtodo de sandwich, aps a
sua separao electrofortica em gel de amido.
A soluo de colorao contm quantidades vestigiais de cido 6-fosfoglucnico,
NADP, MTT, e uma gota de azul de Meldola (0,5%, p/v em gua bidestilada) dissolvidos num
tampo de pH = 7,4 constitudo por Tris 0,1 M, His/HCl 0,1 M, Imidazol 0,015 M e MgCl2 0,005 M.
36
-
Material e Mtodos
GPI
A deteco da actividade enzimtica de GPI foi feita pelo mtodo de sandwich, aps a
sua separao electrofortica em gel de amido.
A soluo de colorao contm frutose-6-fosfato 5,5 mM, NADP 2,2 mM, MTT
4 mM, desidrogenase da glucose-6-fosfato (G6PD) 1,4 U/ml e uma gota de azul de Meldola
(0,5%, p/v em gua bidestilada) dissolvidos num tampo de pH = 7,4 constitudo por Tris 0,1
M, His/HCl 0,1 M, Imidazol 0,015 M e MgCl2 0,005 M.
MPI
Detectou-se a actividade enzimtica de MPI pelo mtodo de sandwich, aps a sua
separao electrofortica em gel de amido.
A soluo de colorao contm manose-6-fosfato 4,2 mM, NADP 1,3 mM, MTT
2,4 mM, e uma gota de azul de Meldola (0,5%, p/v em gua bidestilada) dissolvidos num
tampo de pH = 7,4 constitudo por Tris 0,1 M, His/HCl 0,1 M, Imidazol 0,015 M e MgCl2
0,005 M. Por fim, adicionaram-se as enzimas isomerase da glucose-6-fosfato (GPI) 3 U/ml e
desidrogenase da glucose-6-fosfato (G6PD) 5 U/ml.
ALBeTF
A deteco de ALB e de TF foi efectuada atravs do mtodo de colorao geral de
protenas descrito para a HB, utilizando-se Coomasie R-250, sem fixao.
G
A visualizao de GC efectuou-se por deteco imunoenzimtica aps transferncia da
protena para uma membrana de nitrocelulose (0,45 pm; SCHLEICHER & SCHULL),
segundo a tcnica descrita por FERRAND (1995).
37
-
Material e Mtodos
Aps esse processo de transferncia, as membranas de nitrocelulose foram lavadas 3
vezes (15 minutos) numa soluo de Tween 20 (MERCK) 0,025% (v/v) em soro fisiolgico
tamponado com fosfato (PBS: Na2HP04 50 mM, KH2P04 18mM, NaCl 147 mM, pH = 7,1), e
bloqueadas numa soluo de leite em p magro (5% p/v em PBS) durante 18 h, com agitao
permanente e temperatura ambiente.
Depois da primeira lavagem, aplicou-se o antisoro (anti-GC humana, ATAB 81936),
diludo 1:170 em PBS com 1% (p/v) de albumina srica bovina (SIGMA), durante 1 h
temperatura ambiente.
Repetiu-se novamente a lavagem, segundo o processo j referido, seguindo-se a
aplicao do segundo antisoro (anticorpos contra imunoglobulinas caprinas desenvolvidos em
coelho, e conjugados com uma peroxidase; ATAB 83806), diludo 1:600 em PBS com 1%
(p/v) de albumina srica bovina (SIGMA), durante 1 h temperatura ambiente.
Depois de duas lavagens (5 minutos) com Tween 20/PBS, procedeu-se deteco da
GC com uma soluo de 9-amino-2-etilcarbazol 0,04% (p/v) e de metanol 20% (v/v) em PBS.
As bandas correspondentes actividade peroxidsica aparecem rapidamente, bloqueando-se a
reaco com gua bidestilada.
2.6. - MTODOS DE CLCULO
As frequncias gnicas foram calculadas por contagem directa de genes a partir da
distribuio fenotpica obtida.
O clculo dos valores de heterozigotia mdia (H), da proporo de loci polimrficos
(P), do nmero mdio de alelos por locus (ria), estatsticas F e frequncias fenotpicas
esperadas segundo o equilbrio de Hardy-Weinberg, foi efectuado com a utilizao do
programa BIOSYS verso 1.7 (SWOFFORD & SELANDER, 1989).
O clculo de distncias genticas e obteno de dendrogramas, foi efectuado com o
programa PHYLIP verso 3.5 (FELSENTEIN, 1993).
38
-
Resultados e Discusso
3. - RESULTADOS E DISCUSSO
3.1. - ANLISE DOS MTODOS DE SEPARAO
De entre os 12 loci estudados neste trabalho, detectaram-se 5 monomrficos
(PEPB, DIA, GPI, MDH e PGD) e 7 polimrficos (HB, CAII, NP, MPI, ALB, TF e GC).
Loci monomrficos
PEPB
A utilizao de tcnicas de electroforese em gel de amido permitiu a deteco de
um s fentipo (figura 3.1.1), correspondente a indivduos homozigticos para o alelo
PEPB*2, descrito por DEL LAMA et ai. (1992). No entanto, na raa Minhota detectou-se
um indivduo heterozigtico.
O fentipo PEPB 2 apresenta um padro com duas bandas, uma de grande
intensidade e outra secundria, mais andica, de menor intensidade. No indivduo
heterozigtico 2-1 (no representado) observou-se um padro de trs bandas, sendo a
terceira mais andica e menos intensa.
A quase inexistncia de PEPB*1 nas raas estudadas est de acordo com o referido
em DEL LAMA et ai. (1992), que sugere a fixao de PEPB*2 na maior parte das
populaes de bovinos de origem europeia (com excepo das raas italianas Marchigiana
e Chianina).
39
-
Resultados e Discusso
+
Figura 3.1.1: Fentipos de PEPB observados por electroforese convencional em gel de amido.
DIA
Os resultados obtidos para a enzima DIA revelaram ausncia de polimorfismo
electrofortico (figura 3.1.2). Resultados semelhantes foram tambm obtidos em vrias
raas autctones espanholas (GONZALEZ et ai, 1987; IGLESIAS, 1989; ARRANZ et ai,
1992).
MAKAVEEV (1979 in IGLESIAS, 1989) detectou polimorfismo desta enzima em
eritrcitos de bfalos da Bulgria e nas raas bovinas Frisia e Simmental, descrevendo dois
alelos codominantes, DIA*A e DIA*B.
Figura 3.1.2: Padro de DIA observado por electroforese convencional em gel de amido.
40
-
Resultados e Discusso
No se detectou variao electrofortica para o locus GPI. Estes resultados no se
podem comparar com os obtidos noutras raas por no ter sido possvel consultar outros
trabalhos onde se descrevesse variao do locus GPI em gado bovino.
A figura 3.1.3 apresenta o padro obtido para esta enzima, observando-se trs
bandas, duas com grande intensidade, e uma banda mais andica de menor intensidade.
Figura 3.1.3: Padro de GPI obtido em hemolisados por electroforese convencional em gel de amido.
MDH
A enzima MDH revelou-se monomrfca. Este resultado concordante com outros
estudos (ARRANZ et ai, 1992).
Na figura 3.1.4 observa-se o padro de bandas detectado por electroforese
convencional em gel de amido.
Figura 3.1.4: Padro de MDH observado por electroforese convencional em gel de amido.
41
-
Resultados e Discusso
PGD
A enzima PGD revelou-se monomrfica para as raas Barros e Minhota; tambm
neste caso no se encontrou qualquer referncia bibliogrfica relativa a um possvel
polimorfismo deste locus em gado bovino.
Na figura 3.1.5 observa-se o padro obtido para esta enzima. Em amostras
armazenadas por um longo perodo de tempo detectaram-se duas bandas, sendo a mais
andica a que revela menor intensidade; as amostras mais recentes apresentam um padro
electrofortico com uma s banda.
Figura 3.1.5: Padro de PGD observado por electroforese convencional em gel de amido.
Loci polimrficos
HB
A electroforese convencional no permite discriminar os electromorfos de HB. No
entanto, a utilizao de sistemas de focagem isoelctrica conduz deteco de
polimorfismo nesta protena, observando-se dois fentipos, HB A e HB AB.
Na figura 3.1.6 observa-se o padro electrofortico desta molcula, resultante da
expresso de dois alelos codominantes, HB*A e HB*B. Resultados idnticos esto
descritos em raas bovinas da Pennsulas Ibrica (VICENTE, 1978; KiDD et ai, 1980;
IGLESIAS, 1989).
42
-
Resultados e Discusso
+ -HB*B
HB*A
AB AB A A
Figura 3.1.6: Separao de hemoglobina nativa por focagem isoelctrica.
AH
A utilizao de electroforese em gel de amido e focagem isoelctrica permitiu
identificar trs fentipos, CAII F, CAII FS e CAII S, atribudos expresso de dois alelos
codominantes, CA*F e CA*S (figuras 3.1.7 e 3.1.8). Porm, a separao por electroforese em
gel de amido implica alguma morosidade (tempos de corrida muito longos) e, em amostras
coaguladas, o erro de leitura pode ser superior a 20%. Estas dificuldades so minimizadas
quando se recorre a focagem isoelctrica.
Assim, a separao da enzima CAII por focagem isoelctrica oferece vrias vantagens,
nomeadamente:
rapidez e simplicidade de execuo;
utilizao de pequenas quantidades de material biolgico;
maior nmero de amostras fenotipadas por corrida;
possibilidade de utilizao de amostras coaguladas.
43
-
Resultados e Discusso
F F F S FS FS F S FS
Figura 3.1.7: Fentipos de CAII observados sob luz ultravioleta, aps separao por electroforese convencional em gel de amido e colorao com diacetato de fluoresceina.
CAII*F
| CAII*S
Figura 3.1.8: Fentipos de CAII observados por focagem isoelctrica, aps colorao geral de protenas.
NP
A expresso fenotpica de NP resulta das combinaes possveis entre um alelo
dominante, NP*H, e um recessivo, NP*L (ANSAY, 1973). Este facto implica que apenas em
presena do feno tipo NP L possvel fazer corresponder um gentipo (j que o fentipo NP H
pode corresponder aos gentipos H/H e H/L e o fentipo NP L corresponde ao gentipo L/L).
Na figura 3.1.9 apresenta-se o padro obtido para a protena aps separao
electrofortica em gel de amido.
44
+
: . ' .w
FS FS ]
-
Resultados e Discusso
H L L H L L
Figura 3.1.9: Fentipos de NP detectados por electroforese convencional em gel de amido.
MPI
Na raa Minhota detectaram-se quatro fentipos, MPI AB, MPI B, MPI BC e MPI C,
anteriormente descritos por ANSAY (1973) em bovinos; na raa Barros apenas se observam
os trs ltimos fentipos. De acordo com o mesmo autor, os fentipos encontrados nesta raa
resultam da combinao de dois alelos codominantes, MPI*B e MPPC, enquanto que MPI*A
aparece na raa Minhota com uma frequncia reduzida.
Como se pode observar pela anlise da figura 3.1.10, MPI*A aparece como o alelo
mais andico, MPI*C como o mais catdico e o alelo mais frequente, MPI*B, situa-se numa
posio intermdia em relao aos anteriores. Contudo, a intensidade das bandas muito
fraca, tornando-se quase imperceptvel em alguns casos. Esta grande dificuldade em obter um
contraste de bandas adequado, mesmo aps longos perodos de incubao a 37C, poder,
eventualmente, levar a uma incorrecta interpretao dos fentipos. Assim, a utilizao de
sistemas de focagem isoelctrica na determinao destes fentipos seria aconselhvel, a fim
de verificar os resultados obtidos por electroforese convencional.
45
-
Resultados e Discusso
Figura 3.1.10: Fentipos de MPI observados por electroforese convencional em gel de amido.
ALB
A separao por focagem isoelctrica permitiu detectar polimorfismo em ALB. Cada
indivduo homozigtico aparece com trs bandas: duas de maior intensidade e uma mais
acdica, com menor intensidade; os indivduos heterozigticos podem apresentar at seis
bandas.
Esta heterogeneidade nos padres de ALB tem sido interpretada como o resultado da
capacidade desta protena se ligar a vrias substncias diferentes (FERRAND, 1995). Com a
incluso de ureia (8M) na matriz de separao, reagente que provoca a desnaturao da
protena levando a uma alterao do seu pi para uma zona mais bsica do gradiente,
conseguem-se obter padres de bandas mais simples e mais definidos (KAWAGUCHI, 1973;
FERRAND, 1995).
Na figura 3.1.11 apresentam-se os padres observados que foram interpretados como
sendo determinados por trs alelos codominantes, ALB*A, ALB*B e ALB*V.
GAHNE et ai. (1977) e IGLESIAS (1989) detectaram, por electroforese em gel de
poliacrilamida e de amido, respectivamente, dois variantes em gado bovino, ALB*A e
ALB*B. A utilizao de focagem isoelctrica veio confirmar a existncia destes dois alelos e
acrescentar um terceiro, designado por ALB*V, com uma mobilidade mais acdico do que
ALB*A.
46
-
Resultados e Discusso
A B A B A B B B A B A G
Figura 3.1.11: Fentipos de ALB determinados em amostras de plasma por focagem isoelctrica na presena de ureia 8M.
ARRANZ et ai. (1992) revelaram a existncia de um outro variante (ALB*D), com
mobilidade electrofortica intermdia entre ALB*A e ALB*B, ainda no descrito em
nenhuma raa autctone espanhola. Este alelo poder corresponder ao alelo ALB*V
encontrado neste trabalho, apesar de apresentar um pi mais cidico do que ALB*A (ARRANZ,
comunicao pessoal).
Desta forma, a tcnica de separao por focagem isoelctrica provou ser eficaz na
separao dos variantes de ALB, tal como j foi demonstrado no gato (BELL et ai, 1994), na
ovelha (ERHARDT & SIMIANER, 1993) e no coelho (FERRAND & ROCHA, 1992).
TF
A transferrina um dos marcadores mais importantes no estudo e caracterizao
gentica de raas bovinas devido ao seu elevado polimorfismo. No entanto, a sua fenotipagem
no simples, existindo frequentemente problemas de resoluo e de separao das bandas
(IGLESIAS, 1989).
A fim de averiguar qual a melhor forma de separar os diferentes produtos gnicos
descritos no locus TF, testaram-se vrios sistemas electroforticos em gis de agarose numa
vasta gama de sistemas tampo. Esta tcnica no ofereceu resultados satisfatrios, pelo que se
passou separao da TF por focagem isoelctrica, recorrendo a matrizes de poliacrilamida
47
-
Resultados e Discusso
com diferentes concentraes de ureia (6M e 8M); tambm neste caso no se conseguiram
resultados positivos.
Este tipo de dificuldades encontradas na fenotipagem da TF por focagem isoelctrica
tinham j sido descritos noutras espcies, nomeadamente na cabra (ERHARDT, 1986) e no
coelho (FERRAND, 1995). No entanto, TSUJI et ai. (1989) demostraram ser possvel fenotipar
esta protena em bovinos, por focagem isoelctrica, sem grandes problemas e sem qualquer
aditivo na matriz de poliacrilamida.
Desta forma, a utilizao de uma tcnica de focagem isoelctrica com um gradiente de
pH 3,5-6,5, reforado em 4,0-6,5, permitiu separar os produtos gnicos do locus TF. Contudo,
os padres obtidos nem sempre eram definidos, tornando-se dificilmente interpretveis.
Na tentativa de melhorar os padres de resoluo e de verificar se a variao detectada
no resultava de diferenas no estado frrico da molcula de TF, ou ainda da existncia de
cidos silicos ligados molcula, procedeu-se sua separao aps vrios tratamentos das
amostras.
A remoo dos cidos silicos atravs do tratamento das amostras com neuraminidase
no permitiu a obteno de bandas definidas; este tratamento no altera significativamente o
padro das bandas de TF de bovinos, como j tinha sido descrito por PENHALLOU et ai.
(1991).
A obteno de TF no estado apofrrico foi conseguida submetendo as amostras a um
tratamento com EDTA-dissdico. Neste caso observa-se que apoTF apresenta uma
mobilidade menor e um padro de bandas mais simples, mas ainda sem uma definio
adequada.
A forma Fe2TF foi obtida mediante vrios tratamentos com dadores de Fe (ver captulo
Material e Mtodos). Os resultados s se mostraram satisfatrios atravs da saturao da
molcula de TF com uma soluo de sulfato de amnio frrico, provavelmente por causar uma
maior estabilidade da molcula ao longo da sua separao por focagem isoelctrica com
elevadas voltagens, pois, segundo WELCHS (1990), a forma difrrica da transferrina mais
resistente desnaturao e ao calor do que a forma apoTF.
48
-
Resultados e Discusso
Esto descritos pelo menos oito alelos no locus TF: TF*Al, TF*A2, TF*B, TF*D1,
TF*D2, TF*E, TF*F e TF*G; os mais comuns no gado europeu (Bos taurus) so TF*A,
TF*D1, TF*D2 e TF*E (JAMIESON, 1965). No gado asitico e africano (Bos indicus) ocorrem,
alm das formas anteriores, os alelos TF*B e TF*F.
Na figura 3.1.12 apresenta-se o proteinograma obtido com a utilizao de amostras
saturadas com Fe. Esta tcnica permitiu a separao de TF*D em TF*D1 e TF*D2, e a
deteco de todos os outros fentipos descritos em bovinos europeus. Assim, observaram-se
quatro alelos codominantes, TF*A, TF*D1, TF*D2 e TF*E.
A expresso fenotpica dos alelos em homozigotia caracteriza-se pela presena de dois
dupletos de bandas, aparecendo a banda mais acdica de cada dupleto com intensidade mais
fraca. Os indivduos herozigticos podem apresentar at oito bandas.
Figura 3.1.12: Fentipos de TF determinados por focagem isoelctrica apartir de amostras saturadas com uma soluo de sulfato de amnio frrico.
IGLESIAS (1989) detectou TF*A e TF*D nas cinco raas de bovinos da Galiza, o
variante TF*E na raa Cachena espanhola e um outro variante raro, TF*R, com mobilidade
mais lenta, na raa Rubia Galega.
QQ
A GC uma protena plasmtica que demonstra um elevado grau de heterogeneidade
gentica em mamferos (FERRAND, 1995).
A separao de GC em focagem isoelctrica, seguida da utilizao de immunoblotting,
melhorou de forma considervel a capacidade de investigar a variao desta protena em
49
-
Resultados e Discusso
diferentes espcies (JUNEJA et ai, 1987, PENEDO & JUNEJA, 1989; STRATIL et ai, 1990;
KALB et ai, 1990; STERN et ai, 1992; VANKAN & BELL, 1992; FERRAND, 1995).
Nas figuras 3.1.13 e 3.1.14 apresentam-se alguns dos fentipos obtidos na separao
da GC por focagem isoelctrica. Verifica-se que em amostras tratadas com neuraminidase o
padro de bandas se apresenta mais simplificado, surgindo, no entanto, duas bandas (uma
mais bsica e uma mais acdica) de natureza desconhecida. Os padres observados foram
interpretados como sendo determinados por dois alelos, GC*F e GC*S.
GC*F
S F S FS S FS F F S FS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Figura 3.1.13: Fentipos de GC determinados por focagem isoelctrica; amostras 1, 8, 9 e 10 tratadas com neuraminidase; amostras 2 a 7 diludas em gua bidestilada.
'" '""S1 '" ' """$*" ,,,:,l,::: S-: -
FS S S S F S FS S FS F S
Figura 3.1.14: Fentipos de GC determinados em amostras de plasma tratados com neuraminidase aps focagem isoelctrica.
Nota-se a existncia de dois alelos codominantes, GC*F e GC*S, sendo o segundo
mais acdico do que o primeiro.
50
-
Resultados e Discusso
3.2. - ANLISE FAMILIAR
A realizao da anlise familiar relativo ao conjunto de loci polimrficos estudados
observa-se no estudo de 27 pares me/filho. Esta situao resulta da grande dificuldade
existente na obteno de informao sobre os machos.
Os resultados apresentam-se nas tabelas 3.2.1 a 3.2.6. no foi possvel testar o
equilbrio de Hardy-Weinberg devido ao reduzido tamanho da amostra, bem como ao facto de
vrios alelos ocorrerem em baixa frequncia.
Refira-se que no foi detectado qualquer caso de excluso me/filho.
Tabela 3.2.1: Sistema CAII. Distribuio fenotpica em 27 pares me/filho. Os valores esperados segundo o equilbrio de Hardy-Weinberg esto indicados entre parntesis.
Total
4 (3,2) 17
(12,2) 6
(11,6) 27
Tabela 3.2.2: Sistema NP. Distribuio fenotpica em 27 pares me/filho. Os valores esperados segundo o equilbrio de Hardy--Weinberg esto indicados entre parntesis.
Total
14
(11.4)
13
(15,6)
27
^ ^ ^ Filho
Me " " " - ^ F
Fentipos
F f~ (1,1)
FS 2
(2,1)
S
Total 3
Fentipos
FS S
3
(2,1)
10 5
(6,1) (4,0)
1 5
(4,0) (7,6)
14 10
- v ^ ^ Filho Fentipos
Me """'"- ^ H L
Fentipos
H 10 4
(7,7) (3,7)
L 5 8
(3,7) (11,9)
Total 15 12
51
-
Resultados e Discusso
Tabela 3.2.3: Sistema MPI. Distribuio fenotpica em 26 pares me/filho. Os valores esperados segundo o equilbrio de Hardy-Weinberg esto indicados entre parntesis.
^ Filho Fentipos Total
Me "" ^ ~ ^ A AB AC B BC c Fentipos
A 0 0 0 - - - 0
(0,0) (0,0) (0,0) (0,0)
AB 0 0 0 0 0 - 0
(0,0) (0,0) (0,0) (0,0) (0,0) (0,0)
AC 0 0 0 - 0 0 0
(0,0) (0,0) (0,0) (0,0) (0,0) (0,0)
B - 0 - 24 1 - 25
(0,0) (24,2) (0,6) (24,8)
BC - 0 0 1 0 0 1
(0,0) (0,0) (0,6) (0,6) (0,0) (1,2)
C - - 0 - 0 0 0
(0,0) (0,0) (0,0) (0,0)
Total 0 0 0 25 1 0 26
Tabela 3.2.4: Sistema ALB. Distribuio fenotpica em 27 pares me/filho. Os valores esperados segundo o equilbrio de Hardy-Weinberg esto indicados entre parntesis.
^ ^ Filho Fentipos Total
M e ^ ^ - s ^ ^ A AB AV B BV V
Fentipos
A 24 2 0 - - - 26
(25,1) (0,4) (0,2) (25,7)
AB 0 0 0 0 0 - 0
(0,4) (0,4) (0,0) (0,0) (0,0) (0,8)
AG 1 0 0 - . 0 0 1
(0,2) (0,0) (0,2) (0,0) (0,0) (0,4)
B - 0 - 0 0 -. 0
(0,0) (0,0) (0,0) (0,0)
BG - 0 0 0 0 0 0
(0,0) (0,0) (0,0) (0,0) (0,0) (0,0)
G - - 0 - 0 0 0
(0,0) (0,0) (0,0) (0,0)
Total 25 2 0 0 0 0 27
52
-
Resultados e Discusso
Tabela 3.2.5: Sistema TF. Distribuio fenotpica em 27 pares me/filho. Os valores esperados segundo o equilbrio de Hardy-Weinberg esto indicados entre parntesis.
\ Filho Fentipos Total
Me ^ A ADI AD2 AE Dl D1D2 DIE D2 D2E E
Fentipos
A 6
(5,1)
1
(1,4)
4
(2,1)
1
(0,3)
12
(8,9)
ADI 1 2 0 0 0 0 0 - - - 3 (1,4) (2,4) (0,6) (0,1) (0,4) (0,6) (0,1) (5,6)
AD2 2 0 5 0 - 0 - 2 0 - 9
(2,1) (0,6) (3,6) (0,1) (0,6) (0,8) (0,1) (7,9)
AE 0 0 0 0 - - 0 . - 0 0 0 (0,3) (0,1) (0,1) (0,6) (0,1) (0,1) (0,0) (1,3)
Dl " 0 (0,4)
" " 1
(0,1)
1
(0,2)
0
(0,0)
- " 2 (0,7)
D1D2 - 0 1 - 0 0 0 0 0 - 1 (0,6) (0,6) (0,2) (1,0) (0,0) (0,2) (0,0) (2,6)
DIE - 0 - 0 0 0 0 - 0 0 0 (0,1) (0,1) (0,0) (0,0) (0,2) (0,0) (0,0) (0,4)
D2 " " 0 (0,8)
" " 0 (0,2)
" 0 (0,3)
0
(0,1)
- 0 (1,4)
D2E - - 0 0 - 0 0 0 0 0 0
(0,1) (0,1) (0,0) (0,0) (0,1) (0,2) (0,0) (0,5) E " " 0
(0,0) " " 0
(0,0)
* 0 (0,0)
0
(0,0)
0
(0,0)
Total 9 3 10 1 1 1 0 2 0 0 27
Tabela 3.2.6: Sistema GC. Distribuio fenotpica em 27 pares me/filho. Os valores esperados segundo o equilbrio de Hardy-Weinberg esto indicados entre parntesis.
- - ^ F i l h o Fentipos Total
Me ^ ^ \ . 1 2-1 2
Fentipos
1 17 2 19
(15,6) (3,1) (18,7)
2-1 5 2 0 7
(3,1) (3,8) (0,6) (7,5)
2 _ 1 0 1
(0,6) (0,1) (0,7)
Total 22 5 0 27
53
-
Resultados e Discusso
3.3. - ANLISE POPULACIONAL LOCUS A LOCUS
Neste captulo faz-se a anlise populacional dos loci polimrficos, e ainda dos loci
PEPB e DIA, para os quais no se detectou variao na raa Barros. A sua incluso justifica-
-se pelo facto de serem polimrficos noutras raas bovinas, ou em espcies aparentadas.
PEPB
O locus PEPB revelou-se monomrfico nas trs populaes de bovinos de raa
Barros e Minhota, tendo sido detectado um nico produto gnico, PEPB*2 (observado um
indivduo heterozigtico da raa Minhota). No entanto, este locus referido como polimrfico
em raas bovinas criadas no Brasil, onde se detectaram dois alelos codominantes, PEPB*1 e
PEPB*2 (DEL LAMA et ai, 1992).
O alelo PEPB*2 est fixado nas raas de origem europeia, incluindo as estudadas neste
trabalho, excepto nas raas italianas Marchigiana e Chianina, nas quais PEPB*1 apresenta
frequncias gnicas entre 0,11 e 0,14 (tabela 3.3.1).
Tabela 3.3.1: Frequncias gnicas de PEPB em vrias raas bovinas.
N
Frequncias gnicas N PEPB*1 PEPB*2 Referncia
Barros inscrita 141 - 1,00 Este trabalho
Barros no inscrita 153 - 1,00 t i
Minhota 62 0,01 0,003 0,99 0,003 ec
Blonde d'Aquitaine 13 - 1,00 DEL LAMAetal.{ 1992)
Charolesa 118 - 1,00
Chianina 83 0,14 0,03 0,86 0,03 t t
Hereford 79 - 1,00 et
Frisia 125 - 1,00 t t
Jersey 139 - 1,00 "
Limousine 24 - 1,00 "
Marchigiana 85 0,11 0,02 0,89 0,02 te
Simmental 75 - 1,00 t t
54
-
Resultados e Discusso
DIA
Pela anlise da tabela 3.3.2 verifica-se no existir variao gentica neste locus nas
raas bovinas apresentadas, estando fixado o alelo DIA*S; os resultados obtidos esto de
acordo com os j publicados por outros autores (GONZALEZ et ai, 1987; IGLESIAS, 1989). Por
outro lado, nas populaes de bfalos, ocorre um segundo alelo, DIA*F, com frequncias
entre 0,19 e 0,21.
Tabela 3.3.2: Frequncias gnicas de DIA em vrias populaes de raas bovinas e bfalos.
Frequncias gnicas
N DIA*F DIA*S Referncia
Portugal
Barros inscrita 141
Barros no inscrita 153
Minhota 62
Espanha
Cachena 71
Caldelana 60
Frieiresa 33
Limiana 39
Rubia Gallega 168
Vianesa 40
Sayaguesa (Zamora) 147
Morucha (Salamanca) 101
Alistana Sanabresa 157
Blanca Cacerena 62
Crdena Andaluza 25
Asturiana de los Valls 127
Asturiana de la Montana 106
Bulgria
Bfalo 122
Murrah (Bfalo) 51
*/ IGLESIAS (1989)
- 1,00 Este trabalho
- 1,00 "
- 1,00 a.
- 1,00 IGLESIAS (1989)
- 1,00 "
- 1,00 "
- 1,00 "
- 1,00 "
- 1,00 "
- 1,00 GONZALEZ et al. (19
- 1,00 "
- 1,00 st
- 1,00 st
- 1,00 "
- 1,00 "
- 1,00 "
0,19 + 0,0 0,81 0,0 MAKAVEEV(1984
0,21 0,0 0,79 0,0
55
-
Resultados e Discusso
HB
Os resultados obtidos no estudo de HB permitiram distinguir dois fentipos, definidos
por dois alelos, HB*A e HB*B (tabela 3.3.3).
Tabela 3.3.3: Distribuio fenotpica de HB em populaes das raas Barros e Minhota. Os valores esperados de acordo com o equilbrio de Hardy-Weinberg esto indicados entre parntesis.
Fentipos N HBA HBAB HBB
Barros inscrita 141 141
Barros no inscrita 153 153
Minhota 62 56 6 0
(56,1) (5,8) (0,1)
As frequncias gnicas das raas estudadas, bem como outras j publicadas referentes a
vrias raas bovinas europeias e a duas espcies de bfalos, encontram-se discriminadas na
tabela 3.3.4.
A elevada frequncia do alelo HB*A nas raas estudadas (fixado na raa Barros)
situam-nas juntamente com outras raas bovinas do centro e sul da Europa, onde este alelo
ocorre com frequncias entre 0,80-0,98 (VICENTE, 1978). Nas restantes raas europeias,
HB*A ocorre com uma ampla margem de variao (0,38 - 1,00) apresentando-se, quase
sempre, como o alelo mais frequente.
No caso dos bfalos, observa-se uma inverso nos valores das frequncias gnicas,
sendo o alelo HB*B o mais frequente.
A presena de HB*B nos bovinos europeus, apesar de em baixa frequncia, pode ser
indicativo de uma origem a partir de raas asiticas ou africanas, j que nestes continentes
que este alelo ocorre com frequncia mais elevadas; as frequncias gnicas mais elevadas esto