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CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL DE BIOMATERIAL A BASE DE ZEÍNA

Crislene B. Almeida1*, José F. Lopes Filho1

1* Universidade Estadual Paulista - UNESP, Campus São José do Rio Preto - [email protected]

Com o propósito de agregar valor aos subprodutos da moagem úmida do milho, este trabalho teve como objetivos produzir materiais biodegradáveis (biofilmes) à base da proteína zeína em combinação com o ácido oléico puro e óleos comestíveis e identificar a estrutura básica dos biomateriais através de técnicas de microscopia e espectroscopia. Foi possível a formação de biofilmes em todas as formulações em questão (zeína-ác.oleico, zeína-óleo de macadâmia, zeína-óleo de buriti e zeína-azeite de oliva). As análises da microscopia eletrônica (MEV) e microscopia óptica permitiram concluir que o biofilme zeína-ácido oléico foi o mais homogêneo. Os poros encontrados através da MEV tratam-se, na realidade, de glóbulos de gordura conforme dados da microscopia óptica. A análise de FTIR-ATR sugere que os diferentes plasticizantes não afetaram a estrutura química e molecular da matriz de zeína. Palavras-chave: zeína, biofilmes, propriedades estruturais, biomaterial.

Structural characterization of the zein biomaterial

The aim of this study was to increase the value of the subprodutcs of the corn wet milling and to produce oleic-acid zein biofilms, besides other types of zein biofilms was produced with edible oils which had high concentration of oleic-acid (zein-oleic acid, zein-macadamia oil, zein-buriti oil and zein-olive oil). To determine the effect of the film composition in the effect of plasticizer type on the structural characteristics’ biofilms it was used techniques of microscopy and spectroscopy. Scanning Electronic Microscopy showed a homogeneous matrix for the zein-oleic acid with good lipids distribution. However, when the samples were investigated by Optical Microscopy, lipids’ globules in the control biofilm appeared larger and more dispersed in the matrix than the others samples. The FTIR-ATR analysis different plasticizantes did not affect the chemical and molecular structure of the matrix of zein. Keywords: zein, biofilms, structural properties, biomaterial. Introdução

A safra da produção mundial de milho 2007/2008 foi de 777 milhões de toneladas, 10,8%

maior que o volume obtido na produção anterior, quando foram colhidas 701 milhões. O consumo

mundial do grão é estimado em 770 milhões de toneladas, com os estoques mundiais próximos a

109 milhões (EMBRAPA, 2008). Do total produzido pelo Brasil (50 milhões de toneladas), estima-

se que aproximadamente 10 a 12% é destinado ao consumo industrial nos processos de moagem

seca e moagem úmida (ABIMILHO, 2008).

A moagem úmida é o segundo maior setor de consumo do milho no país depois da

alimentação animal. Este processo envolve transformações químicas, bioquímicas e operações

mecânicas com o objetivo de separar o grão de milho em frações relativamente puras: germe (com

alto teor de óleo), fibra (proveniente do pericarpo dos grãos), amido (61%) e glúten (7%) de alto

Anais do 10o Congresso Brasileiro de Polímeros – Foz do Iguaçu, PR – Outubro/2009

teor protéico (>60%) que é constituído pelas proteínas glutelina, globulina, albumina e zeína

(SINGH e ECKHOFF, 1996; ABIMILHO, 2008).

A zeína é a principal proteína do milho, solúvel em álcool e com um grau de polimerização

duas vezes maior que o necessário para produzir polímeros lineares de poliamida ou poliéster. Seu

processamento com ácido oléico, substância encontrada em diferentes tipos de óleos vegetais,

produz filmes plásticos flexíveis e transparentes, com propriedades que permitem seu uso tanto no

setor agrícola quanto no de alimentos.

Alguns óleos vegetais comestíveis apresentam alto teor de ácido oléico podendo também ser

utilizados como “plasticizantes” no processo de produção de biomateriais à base de zeína. Entre

estes óleos destacam-se o óleo de buriti, o de macadâmia e o de oliva, todos com teores de ácido

oléico maiores que 60%. O óleo de buriti e o de macadâmia, produzidos no Brasil, possuem alto

valor comercial e são de fácil aquisição. O óleo de oliva é altamente comercializado e consumido

no Brasil e tem grande importância pelas suas propriedades nutricionais. O óleo de buriti possui

76% de ácido oléico, é rico em beta-caroteno e quando misturado a polímeros, produz um plástico

capaz de assimilar radiação solar devido às suas propriedades ópticas (ERENO, 2005). O óleo de

macadâmia possui 61% de ácido oléico e é rico em vitamina E (VITALATMAN, 2007). O azeite de

oliva contém de 63,8 a 82,6% de ácido oléico, com uma relação ácido oléico/linoléico de 4,69 a

16,1/1 (ABOISSA, 2007).

A utilização destes óleos na confecção de biomateriais tem a vantagem de serem

biodegradáveis, além de serem comestíveis. Enquanto os plásticos comuns derivados de petróleo

levam de 200 a 450 anos para se decomporem, os biodegradáveis são prontamente assimilados pela

natureza contribuindo para a redução da poluição do meio ambiente.

Com o propósito de agregar valor aos subprodutos da moagem úmida do milho, este

trabalho teve como objetivos produzir materiais biodegradáveis (biofilmes) à base da proteína zeína

em combinação com o ácido oléico puro e óleos comestíveis (buriti, macadâmia e oliva) e

identificar a estrutura básica dos biomateriais através de técnicas de microscopia (varredura e

óptica) e espectroscopia (FTIR).

Experimental

Preparação dos biofimes de zeína

Para a formação dos biofilmes, a zeína (20g/100mL etanol) e o ácido graxo (70g /100g

proteína) foram solubilizados em solução aquosa de etanol 75% e agitados a 65°C seguindo Kleen

et al. (2002) a 250 rpm. Utilizou-se glicerol (30g/100g proteína) como coadjuvante do agente

plastificante (ácido graxo). Os plastificantes utilizados foram óleos naturais com alta porcentagem


de ácido graxo oléico em sua composição (óleo de macadâmia, azeite de oliva, óleo de buriti e o

ácido oléico puro).

Em seguida, essa solução foi aplicada, em placas retangulares de acrílico e o material

mantido à temperatura ambiente (25ºC) sobre superfície nivelada durante 48h para secagem. A

espessura foi obtida pela média aritmética dos valores de seis pontos aleatórios em diferentes

segmentos dos filmes, utilizando-se um micrômetro digital (modelo Digimess, resolução 0,001mm).

Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

A microestrutura superficial dos filmes foi avaliada por microscopia eletrônica de

varredura (MEV) no Depto de Biologia Animal da UNESP, campus de São José do Rio

Preto. A seqüência para a preparação do espécime incluiu: montagem sobre os stubs e

sputeering (metalização). Amostras dos filmes (aproximadamente 5mm x 5mm) foram

fixadas em suportes de alumínios (stubs) de cerca de 12mm de diâmetro, em duplicata, com

fita condutiva face dupla de cobre. E recobertas com ouro na espessura de 35nm

(EMITECH K550) por aproximadamente 2-3 minutos. Em seguida, as mesmas foram

observadas em microscópio eletrônico de varredura (LEO 435 VP) a 15 kV em sala

climatizada. A barra indicativa de aumento (escala), que corresponde a 10µm, está identificada nas

eletromicrografias das Figuras 1 e 2.

Microscopia Óptica

A microscopia óptica foi realizada no Laboratório de Microscopia da UNESP, campus de

São José do Rio Preto. Utilizou-se a técnica de coloração Xilidine Ponceau pH 2,5 (XP) onde após a

coloração, as lâminas foram secas em estufa (Odontobras ECB 1.2 Digital) por 24 horas a

aproximadamente 37°C. Após este período pingou-se 4 gotas de Bálsamo do Canadá sobre a lâmina

e adicionou-se a lamínula. Por 24h as lâminas secaram em temperatura ambiente (25°C) para então

serem analisadas em microscópio (Olympus BX60) com captador de imagens (Olympus DP-71, U-

CMAD-2, U-TV1X) com potência 10. Os aumentos e correspondentes escalas utilizados foram de

4x (1mm) e 10x (500µm).

Espectroscopia na região do Infravermelho por Transformada de Fourier acoplada à

técnica de Refletância Total Atenuada (FTIR-ATR)

A análise FTIR-ATR dos quatro tipos de filmes foi realizada no Depto de Física da UNESP,

campus de São José do Rio Preto. Amostras de aproximadamente 7x70mm foram fixadas no ATR


com o uso de espectrofotômetro Nicolet Nexus 670 Ft-IR ESP. Os espectros foram obtidos com 128

varreduras, na região de 4000 a 1200cm-1 (faixa permitida pelo equipamento utilizado), intervalo

2cm-1 e resolução 4cm-1.

Análise Estatística

A análise de variância (ANOVA) foi utilizada para afirmar a seleção das amostras mais

homogêneas quanto à sua espessura, pois inicialmente esta seleção é feita somente visualmente.

Realizou-se a partir de um delineamento inteiramente casualizado (DIC), com a utilização do teste

de Tukey, considerando-se um nível de significância p<0,05, segundo Banzatto e Kronka (2006),

utilizando o programa computacional ESTAT – Sistema para Análises Estatísticas, versão 2.0.

Resultados e Discussão

Todos os filmes selecionados para sua posterior caracterização apresentaram aspecto visual

homogêneo (livre de partículas insolúveis), espessuras semelhantes (de 0,12±0,01 a 0,13±0,03) e

boa maleabilidade, que os tornavam fáceis ao manuseio. Os filmes com características diferentes

destas foram excluídos.

Na análise estrutural dos biofilmes, através da MEV (Figuras 1 e 2), a barra indicativa de

aumento corresponde a 10µm. Observou-se nas eletromicrografias que os filmes com óleo de buriti

(Figura 1a) e óleo de macadâmia (Figura 1b) apresentaram estrutura muito semelhante, com

presença homogênea de orifícios/poros na superfície. A presença de lipídios foi verificada através

de estruturas arredondadas demonstrando que não houve a formação de uma camada contínua da

matriz filmogênica. Este fenômeno foi também observado em biofilmes de zeína nos trabalhos de

Corradini (2004); Ghanbarzadeh et al. (2007); Dong (2004) e Batista (2005); em biofilmes de

pectina estudados por Batista (2005); biofilmes de glúten de trigo (PALMU, 2003) e de gelatina

(BATISTA, 2004; DAVANÇO, 2006). Os filmes formados com ácido oléico (Figura 2a) e azeite de

oliva (Figura 2b) apresentaram menores quantidades de orifícios e diminuição nítida do tamanho

das gotas de gordura demonstrando, portanto, a formação de uma matriz mais homogênea.

a b

Figura 1. MEV dos biofilmes: a) zeina-óleo de buriti; b) zeina-óleo de macadâmia. A barra indicativa de aumento corresponde a 10µm.


a b

Figura 2. MEV dos biofilmes: a) zeina-ácido oléico; b) zeina-azeite de oliva. A barra indicativa de aumento (escala) corresponde a 10µm.

Para complementar a análise da microscopia de varredura (MEV) sobre a homogeneidade da

matriz dos biofilmes com relação aos poros/orifícios e ou glóbulos observados, realizou-se a

microscopia ótica através da coloração Xilidine Ponceau onde as proteínas são coradas de vermelho

e os glóbulos de gordura apresentam-se em tom de branco.

As imagens captadas para cada uma das amostras são mostradas na Figura 3 onde os

aumentos e correspondentes escalas das fotos foram de 4x (1mm) e 10x (500µm).

a b c d

e f g h

Figura 3. Microscopia óptica dos biofilmes, sendo a-b: zeina-óleo de buriti; c-d: zeína- óleo de macadâmia; e-f: zeina-azeite de oliva e g-h: zeina-ácido oléico.

Verifica-se nas micrografias que o biofilme testemunha (zeína-ácido oléico) foi o que se

apresentou mais homogêneo, confirmando a observação verificada na MEV (Figura 2a). O biofilme

zeína-óleo de macadâmia também se mostrou mais homogêneo que os de zeína- óleo de buriti e

zeína-azeite de oliva. Nestes dois últimos há uma heterogeneidade na dispersão dos glóbulos de

gordura que também são maiores. Além disto, observa-se grande quantidade de estrias causadas

possivelmente durante a secagem do material pela evaporação de água e etanol. Com estes

resultados e segundo Monterrey-Quintero e Sobral (2000), os poros observados anteriormente pela

MEV tratam-se na realidade de glóbulos de gordura.


Com a análise de Espectroscopia na região do Infravermelho por Transformada de Fourier

acoplada à técnica de Refletância Total Atenuada (FTIR-ATR) podemos verificar tanto o interior

quanto a superfície do material (JAWHARI et al., 1994) onde obtem-se informações sobre as

estruturas secundárias das proteínas, através de movimentos vibracionais ou rotacionais, que

resultam em uma alteração do momento dipolar. O espectro de infravermelho (IV) de uma proteína

é decorrente das absorções do grupo peptídico, que são conhecidos como bandas de amida I, II, III,

sendo que a banda de amida I é a responsável pela maior quantidade de informação sobre as

estruturas secundárias das proteínas (SCRAMIM, 2007).

Os resultados obtidos com o FTIR-ATR para os biofilmes de zeína estão representados na

Figura 4.

A proteína é caracterizada neste espectro (Figura 4) como bandas do grupo amida, sendo

observadas, a amida I (1650cm-1), amida II (1540cm-1) e amida A (3300cm-1). A banda de amida I é

devido principalmente ao estiramento C=O dos grupos peptídicos. A amida II deve-se ao

estiramento da ligação CN e dobramento da ligação NH e a amida A, de banda intensa e larga, é

devido principalmente ao estiramento do grupo NH (OSIRO, 2004). Estas bandas de amida I e II,

na região entre 1.500 – 1.800 cm-1 indicam a predominância de estruturas secundárias α e β.

(FORATO et al., 1998; MARCOTTE et al., 2007).

4000 3750 3500 3250 3000 2750 2500 2250 2000 1750 1500 1250

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

Amida I

Amida I

Amida II

Amida II

Amida A

Zeína-Buriti Zeína-Macadâmia Zeína-Ác. Oleico Zeína-Az. Oliva

Abs

orbâ

ncia

Número de Onda (cm-1)

Figura 4. Espectro de FTIR-ATR obtido para os biofilmes de zeína.

A proteína é caracterizada neste espectro (Figura 4) como bandas do grupo amida, sendo

observadas, a amida I (1650cm-1), amida II (1540cm-1) e amida A (3300cm-1). A banda de amida I é


devido principalmente ao estiramento C=O dos grupos peptídicos. A amida II deve-se ao

estiramento da ligação CN e dobramento da ligação NH e a amida A, de banda intensa e larga, é

devido principalmente ao estiramento do grupo NH (OSIRO, 2004). Estas bandas de amida I e II,

na região entre 1.500 – 1.800 cm-1 indicam a predominância de estruturas secundárias α e β.

(FORATO et al., 1998; MARCOTTE et al., 2007).

Nota-se, também, a presença de carboxilas (~1745 cm-1) a partir de ácidos graxos livres

como já observados em outros trabalhos com zeína (FORATO, 2004). A presença de bandas entre

2800-3100cm-1 indica vibrações e estiramentos CH de grupos funcionais CH3 e CH2, geralmente

ácidos graxos de membranas e da cadeia lateral de alguns aminoácidos (GEORGET et al., 2008).

Estas bandas ocorrem, provavelmente, pelo fato da zeína obtida comercialmente conter mais óleo

residual que as demais (obtidas em laboratório), devido ao processo de extração. Isto ambém foi

encontrado na análise da zeína em pó. Nos resultados obtidos verifica-se, também, a presença de

compostos alifáticos (CH) que geram bandas com picos múltiplos na região de 2900-3000 cm-1

(CORRADINI, 2004; SCRAMIM, 2007).

Conclusões

- Todos os filmes selecionados para sua posterior caracterização apresentaram aspecto visual

homogêneo, espessura uniforme e boa maleabilidade.

- As análises da microscopia eletrônica (MEV) e microscopia óptica permitem concluir que o

biofilme testemunha (zeína-ácido oléico) foi o mais homogêneo. Nestes filmes os ácidos graxos

foram capazes de formar matriz coesa e contínua. Os poros encontrados através da MEV tratam-se,

na realidade, de glóbulos de gordura conforme dados da microscopia óptica.

- A análise de FTIR-ATR indicou que o filme testemunha apresentou picos com maior intensidade

de absorbância, porém todos os picos ocorreram nas mesmas regiões de comprimento de onda para

todos os filmes. Isto sugere que os diferentes plasticizantes não afetaram a estrutura química e

molecular da matriz de zeína.

Agradecimentos

CAPES, FAPESP, Prof. Dr. Marinônio Lopes Cornélio (Depto. Física – UNESP, S. J. Rio Preto)

Referências Bibliográficas

1. ABIMILHO, Associação Brasileira das Indústrias Moageiras de milho. Disponível em: < http://www.abimilho.com.br>. Acesso em: junho de 2008.

2. ABOISSA, Óleos vegetais. Disponível em: < http://www.aboissa.com.br>. Acesso em: dez/2007.

3. D. A. Banzatto; S. N. Kronka, Experimentação Agrícola, FUNEP, Jaboticabal, 2006.


4. J.A. Batista, Dissertação de Mestrado, Universidade Estadual de Campinas, 2004. 5. J.A. Batista; P.S.T. Palmu; C.R.F. Grosso, Ciênc. Tecnol. Aliment. , 2005, 25 (4), 781-788. 6. E. Corradini, Tese de Doutorado, Universidade de São Paulo, 2004. 7. T. DavançO, Dissertação de Mestrado, Universidade Estadual de Campinas, 2006. 8. J. Dong; Q.S. Sun; J.Y Wang, Biomaterials, 2004, 25, 4691-4697. 9. EMBRAPA, Centro de inteligência do milho. Disponível em http://cimilho.cnpms.embrapa.br.

Acesso em maio de 2008. 10. D. Ereno, Rev. Pesq. Fapesp, 2005, 117, 76-77. 11. L.A. Forato; R. Bernardes-Filho; L.A. Colnago, Analytical Biochemistry, 1998, 259, 136-141. 12. B. Ghanbarzadeh;, M. Musavi; A.R. Oromiehie; K. Rezayi; E.R. Rad; J Milani, LWT, 2007, 40,

1191–1197. 13. D.M.R. Georget; S.A. Barker; P.S Belton, European Journal of Pharmaceutics and

Biopharmaceutics, 2008, 69,718-726. 14. L. A. Forato, V. E. Yushmano; L. A. Colnago, Biochemistry, 2004, 43, 7121-7126. 15. T. Jawhari; L.; J.M. Pastor, Journal of Applied Polymer Science, 1994, 51 (3), 463-471. 16. L. Marcotte; G. Kegelaer; C. Sandt; J. Barbeau; M. Lafleur, Analytical Biochemistry, 2007, 36,

17-47. 17. E.S. Monterrey-Quintero; P.J.A. Sobral, Pesq. Agropec. Bras., 2000, 35 (1). 18. D. Osiro; L.A. Colnago; A.M.M.B. Otoboni; E.G.M. Lemos; A.A. Souza; H.D. Coletta Filho;

M.A. Machado, FEMS Microbiology Letters, 2004, 236, 313-318. 19. P.S.T. Palmu, Tese de Doutorado, Universidade Estadual de Campinas, 2003. J.A. Scramin; D. Britto; O.B.G. Assis; L.A. Colnago; L.A. Forato In Anais do XI International

Macromolecular Colloquium & 6th Isnapol, Gramado, RS, 2007. Proceedings... Porto Alegre, RS : UFRGS/ABPol, 2007a. 4p. 1 CD-ROM. Paper 117.

20. VITALATMAN, Vital Âtman. Disponível em: < http://www.vitalatman.com.br>. Acesso em: dez/2007.

caracterizaÇÃo estrutural de biomaterial a … · anais do 10 o congresso brasileiro de...

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