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Caracterização dinâmica da deformação de eritrócitos de sangue de cavalo em microcanais

António Domingos Simões Maximiano

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em

Engenharia Mecânica

Júri

Presidente: Professor Doutor Mário Costa Orientador: Professor Doutor Viriato Sérgio de Almeida Semião

Co-orientador: Doutor Alexandre Marie Desire Omar Tilly Vogal: Professor Doutor Luís Rego da Cunha de Eça

Maio de 2013

i

Agradecimentos

Antes de mais gostaria de agradecer ao Professor Viriato Semião por toda a confiança, ajuda e orientação

ao longo deste trabalho. Ao Doutor Alexandre Tilly por me ter ensinado a lidar com situações que até então

não tinha encontrado.

Não posso deixar de expressar a minha imensa gratidão à empresa ProBiológica, nomeadamente ao

Doutor Mário Velhinho, por ter disponibilizado o sangue de cavalo utilizado nesta tese, assim como pela

simpatia e disponibilidade demonstrada.

Outra empresa a quem deixo publicamente o meu apreço é a RFS telecomunicações Lda., pela discussão,

amabilidade e altruísmo com que os seus funcionários colaboraram comigo durante o desenvolvimento da

fotomáscara em suporte de microfilme.

Aos meus pais, sem os quais este trabalho não existiria, que me deram a possibilidade de estudar, que me

ensinaram a fazê-lo, que me apoiaram ao longo destes 5 anos, e ainda contribuíram financeiramente para a

realização deste trabalho. Agradeço ainda ao meu irmão, por ser como é, e por me ter ajudado ao longo de

todo este percurso, embora não o saiba.

Agradeço ainda a todos os amigos, principalmente os que fiz neste percurso universitário, que foram

determinantes para o meu sucesso académico e formação pessoal.

Por último, mas não menos importante, o meu agradecimento à Marta Vasconcelos, que ao longo deste

trabalho conseguiu sempre ajudar-me, mesmo quando eu achava que não precisava de ajuda, mesmo quando

era ela que precisava de ajuda. Não é possível expressar a sua importância na tarefa de levar esta tese a bom

porto.

ii

Resumo

O potencial da deformabilidade eritrocitária enquanto ferramenta de diagnóstico de algumas doenças é

indiscutível. No entanto, o caminho a percorrer até ao fabrico de testes de diagnóstico em ambiente micro

passa por uma melhor compreensão desta deformabilidade, quer à escala celular quer a nível de escoamento.

O objectivo deste trabalho é caracterizar a deformabilidade eritrocitária em condições dinâmicas de

escoamento, em dois tipos de microcanais, um da ordem da dimensão do eritrócito (7µm), e outro de

dimensões superiores (97 µm e 725 µm). Foram medidos o índice de deformação elíptico (ID), a orientação dos

eritrócitos em relação ao eixo do canal, o diâmetro eritrocitário e a distância à parede. Ensaiou-se diferentes

caudais, hematócritos e tempos de armazenamento do sangue. Desenvolveu-se um procedimento de fabrico

de microcanais de dimensão inferior a 10 µm, assim como um programa, em ambiente Matlab®, para o

processamento digital de imagens utilizado neste trabalho.

Os resultados mostram um aumento do ID e orientação com as linhas de corrente para maiores tensões de

corte. Maiores tempos de armazenamento resultaram numa menor deformabilidade eritrocitária. Mostrou-se

a importância relativa do gradiente de pressão transversal na deformação eritrocitária em contracções. O

fenómeno da hemólise foi observado e quantificado, observando-se uma deformabilidade reduzida destes

eritrócitos em relação à restante população.

Palavras-chave: deformabilidade eritrocitária, microcanais, Hemoreologia, Índice de deformabilidade

elíptica, eritrócito, glóbulo vermelho, tempo de armazenamento do sangue.

iii

Abstract

The potential use of red blood cell (RBC) deformability as a diagnostic tool for several diseases is well

known, but, in order to establish this type of diagnosis in a miniaturized environment, a better understanding

of the erythrocyte deformability in a microchannel flow is needed.

The present work aims to characterize the cellular deformation of RBC in cell-sized constriction

microchannels (7µm), as well as microchannels whose size is 17 (97µm) and 130 (700 µm) times bigger than

the cell. Measurements of an elliptical deformation index (DI), cell orientation to streamlines, diameter and

wall distance were taken in predefined regions at different flow rates, storage time and hematocrit.

Microchannels were built using soft lithography principles and a custom digital image processing method was

developed in Matlab®. Defibrinated horse blood sample is used.

The results show an increase in ID and streamline orientation in the high shear stress area. Higher storage

times show a more rigid cell population. The transverse pressure gradient was shown to have an important role

in the RBC deformation in a rectangular nozzle geometry. Hemolysis is visualized and quantified in terms of

impaired deformability versus the normal RBCs.

Keywords: red blood cell deformability, microchannel, Hemorheology, Elliptical deformation index,

erythrocyte, red blood cell, blood storage time.

iv

Índice

Agradecimentos......................................................................................................................................... i

Resumo ..................................................................................................................................................... ii

Abstract ................................................................................................................................................... iii

Índice ....................................................................................................................................................... iv

Lista de Figuras ....................................................................................................................................... vii

Lista de Tabelas ..................................................................................................................................... xiii

Lista de Abreviaturas ..............................................................................................................................xiv

1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 1

1.1 Âmbito e objectivos do trabalho ......................................................................................................... 1

1.2 Componentes constituintes do sangue ............................................................................................... 2

1.2.1 O Plasma ............................................................................................................................................ 3

1.2.2 Elementos figurados .......................................................................................................................... 3

1.3 Revisão bibliográfica ........................................................................................................................... 5

1.3.1 Deformação eritrocitária ................................................................................................................... 5

1.3.2 Técnicas de medição da deformação eritrocitária ............................................................................. 5

1.3.2.1 Sistemas de escoamento ............................................................................................................ 6

1.3.2.2 Sistemas unicelulares ................................................................................................................. 8

1.3.3 Resultados relevantes da literatura para a deformabilidade de eritrócitos ...................................... 9

1.3.4 Técnicas de processamento digital de imagens ............................................................................... 10

1.3.5 Hemólise .......................................................................................................................................... 11

1.3.6 Contribuições do trabalho ............................................................................................................... 12

1.3.7 Estrutura da dissertação .................................................................................................................. 13

2. INSTALAÇÃO EXPERIMENTAL ............................................................................. 15

2.1 Materiais e Equipamentos ................................................................................................................ 15

2.1.1 Fabrico dos microcanais................................................................................................................... 15

2.1.2 Caracterização de glóbulos vermelhos em escoamento: Instalação Experimental ......................... 18

2.1.2.1 Ensaios em microcanais: Sistema óptico .................................................................................. 19

v

2.1.2.2 Ensaios em microcanais: Fluido de trabalho e sua manipulação ............................................. 20

2.2 Microcanais: geometria e fabrico ...................................................................................................... 21

2.2.1 Microcanal com válvula ................................................................................................................... 21

2.2.2 Microcanal de constrição ................................................................................................................. 22

2.2.3 Método empírico desenvolvido para o fabrico dos microcanais de constrição .............................. 23

2.2.3.1 Fabrico do molde ...................................................................................................................... 23

2.2.3.2 Obtenção dos canais ................................................................................................................ 25

2.3 Procedimentos experimentais .......................................................................................................... 28

2.3.1 Observação do escoamento dos eritrócitos em microcanais .......................................................... 28

2.3.2 Processo de fabrico .......................................................................................................................... 29

3. PROCESSAMENTO DIGITAL DE IMAGENS ........................................................... 34

3.1 Caracterização de eritrócitos por zona .............................................................................................. 34

3.1.1 Obtenção da máscara binária .......................................................................................................... 34

3.1.2 Filtrar ruído ...................................................................................................................................... 38

3.1.3 Extracção da informação ................................................................................................................. 40

3.1.4 Apresentação de Resultados ........................................................................................................... 40

3.2 Seguimento manual de eritrócitos .................................................................................................... 41

3.2.1 Obtenção da máscara binária .......................................................................................................... 41

3.2.2 Introduzir melhorias ........................................................................................................................ 41

3.2.3 Apresentação de Resultados ........................................................................................................... 42

3.3 Análise de erros e limitações do processamento digital de imagens ................................................. 42

3.3.1 Limitações conceptuais e simplificações adoptadas ........................................................................ 42

3.3.2 Limites de detecção dos parâmetros medidos ................................................................................ 43

3.3.2 Erros do sistema de aquisição de imagem ....................................................................................... 44

3.3.3 Erro sistemático de subestimação de diâmetro .............................................................................. 44

4. MEDIÇÃO DA QUEDA DE PRESSÃO .................................................................... 45

4.1 Princípio de medição......................................................................................................................... 45

4.2 Corantes testados ............................................................................................................................. 45

4.3 Limitações dos corantes e rejeição da medição da queda de pressão ............................................... 46

vi

5. ANÁLISE E DISCUSSÃO DE RESULTADOS ............................................................. 48

5.1 Microcanal com válvula .................................................................................................................... 48

5.1.1Caracterização da deformação de eritrócitos da zona A e A2 .......................................................... 48

5.1.1.1 Baixo Hematócrito (Zona A) ..................................................................................................... 48

5.1.1.2 Hematócrito elevado (Zona A2) ............................................................................................... 51

5.1.2 Caracterização da deformação de eritrócitos da zona C ................................................................. 52

5.1.3 Comparação e discussão dos resultados das zonas A,A2 e C .......................................................... 54

5.1.3.1 Considerações gerais ................................................................................................................ 54

5.1.3.2 Comparação entre as zonas A e C ............................................................................................ 56

5.1.3.3 Comparação entre as zonas A e A2 .......................................................................................... 59

5.1.4 Seguimento Manual: Zona B ............................................................................................................ 61

5.1.4.1 Ensaio 1: Q=1 µL/min e 3 dias de armazenamento .................................................................. 62

5.1.4.2 Ensaio 2: Q=5 µL/min e 3 dias de armazenamento .................................................................. 64

5.1.4.3 Ensaio 3: Q=1 µL/min e 18 dias de armazenamento ................................................................ 66

5.1.4.4 Comparação e discussão dos ensaios da zona B ...................................................................... 68

5.2 Microcanal de constrição .................................................................................................................. 70

5.2.1 Discussão dos resultados obtidos .................................................................................................... 72

5.3 Hemólise ........................................................................................................................................... 73

6. CONCLUSÕES E TRABALHO FUTURO .................................................................. 76

6.1 Síntese conclusiva ............................................................................................................................. 76

6.2 Sugestões de trabalho futuro ............................................................................................................ 78

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................. 79

ANEXO A: GRÁFICOS DO SEGUIMENTO DE ERITRÓCITOS NA ZONA B ............................ I

vii

Lista de Figuras

Figura 1.1 - Componentes do sangue [12]. ..................................................................................................... 3

Figura 1.2 – Dimensões típicas de um eritrócito humano[12-14]. .................................................................. 4

Figura 1.3- Modo de calcular o índice de deformação (ID) utlizado na ectacitometria como medição da

deformação induzida pelas tensões de corte que o escoamento transmite ao eritrócito. Notar que a forma

discóide normal do eritrócito traduz um DI nulo, significando que as tensões de corte que actuam na célula não

alteram a sua forma. Quanto maior for a deformabilidade da célula maior é a deformação verificada, mais

vincado o carácter elipsóide e, consequentemente, maior é o valor do DI [18]. ................................................... 7

Figura 1.4 - Histograma e digrama polar do índice de deformabilidade (DI ou δ) [22]. 1) Histograma típico

que se pode obter por reoscopia, com a curva esperada para um indivíduo saudável sobreposta a uma curva

obtida num ensaio genérico, sendo demonstrada a forma de determinar as porções hipodeformáveis,

híperdeformáveis e a porção normal da população de eritrócitos ensaiada. 2) Diagrama com a orientação

do eixo maior da elipse em relação às linhas de corrente, em função do índice de deformabilidade (δ) medido

para uma população saudável. 3) Amostra de um paciente com eliptocitose hereditária [22]. ............................ 8

Figura 1.5 – a) Variação do ID medido por dois métodos semelhantes com o aumento de caudal, para as

zonas indicadas em b) [18]. b) Representação do microcanal usado por Yaginuma et al (2011) com as zonas A e

B representadas. c) Modelo teórico de Korin et al (2007)., para um módulo de cisalhamento do eritrócito de 3,7

µN/m, comparado com algumas observações experimentais. d) Variação do ID com a distância ao centro do

canal utilizado como forma de diagnosticar talassemia (microcanal de secção 50µm x 1 mm) [25] ..................... 9

Figura 1.6 – a) Hemólise de uma célula tornada esférica numa constrição de secção 5µm×5µm. b)

Velocidade do eritrócito a tracejado e da partícula traçadora a cheio. c) Variação da perda de pressão induzida

pelo trânsito da célula mostrada em a) [36]. ........................................................................................................ 12

Figura 2.1- Armário de Fluxo Laminar Vertical ESCO AVC-4D1 ..................................................................... 16

Figura 2.2 - Wafer de vidro utilizada no processo de fabrico como suporte do molde. São visíveis alguns

resíduos de PDMS. ................................................................................................................................................ 16

Figura 2.3- Spin Coater SPS 150 Spin com uma wafer circular a preto no seu interior ................................. 16

Figura 2.4- UV-KUB ........................................................................................................................................ 17

Figura 2.5- Gerador de corrente de alta frequência utilizado para aplicar o tratamento de plasma. Os três

terminais encontram-se na figura, sendo utilizado aquele que está colocado na arma. ..................................... 17

Figura 2.6 - Fotomáscara utilizada neste trabalho. ....................................................................................... 17

Figura 2.7- Instalação experimental utilizada na aquisição de imagens do escoamento dos eritrócitos em

microcanal. ............................................................................................................................................................ 18

Figura 2.8- Fonte de luz fria com garras flexíveis. ......................................................................................... 20

Figura 2.9 - Nexus 6000 da Chemyx Syringe Pump Company® com uma seringa colocada. ........................ 20

Figura 2.10- Microcanal com válvula e suas dimensões. O canal tem uma altura h≈100µm. Encontram-se

representadas as zonas onde foi feita aquisição de imagem. Zona A: Localiza-se dentro da válvula. Zona A2:

viii

Localiza-se dentro da válvula. Zona B: Localiza-se sobre a contracção da válvula. C: Localiza-se sobre o canal a

jusante da contracção. .......................................................................................................................................... 21

Figura 2.11- Dimensões de projecto da zona de aquisição de imagem do microcanal de constrição com o

software Clewin 5. Durante essa aquisição o escoamento dá-se da direita para a esquerda. A altura do

microcanal são 4µm. ............................................................................................................................................. 23

Figura 2.12- Esquema da obtenção do molde sobre a wafer. a) Limpeza da wafer b) Aplicação da resina

através do spin-coater c) Exposição a radiação UV por intermédio de uma fotomáscara d) Utilização de um

agente revelador para remover a resina exposta à radiação UV. ......................................................................... 24

Figura 2.13- Foto-máscaras testadas. a) A primeira foto-máscara feita em suporte de microfilme. b) A foto-

máscara no mesmo suporte após adaptação do processo comercial da empresa RSF telecomunicações. c) Foto-

máscara de crómio comprada e utilizada para fabricar o molde. d) Máscara construída em papel normal

revestido em papel de alumínio , com os microfilmes a preto colados a 3 lamelas da vidro. .............................. 24

Figura 2.14- Evolução do processo de fabrico do molde. a) Não existe constrição e os canais estão

interrompidos b) Os canais apresentam alguns defeitos mas têm continuidade até à constrição c) Apenas a

constrição não é passada para o molde d) Molde em perfeitas condições. ......................................................... 25

Figura 2.15-Esquema da produção dos microcanais em PDMS. ................................................................... 26

Figura 2.16- Colapso da zona de entrada do microcanal. Na imagem da esquerda temos o canal em PDMS

imediatamente antes de colar o vidro, apresentando alguns detritos decorrentes da furação. A imagem da

direita foi obtida imediatamente após o processo de ligação, sendo possível notar o colapso total da estrutura

de entrada. ............................................................................................................................................................ 27

Figura 2.17- Evolução do processo de obtenção de canais em PDMS. a) Colapso do microcanal b)

Distorções e defeitos presentes no canal c) Pequeno defeito a encarnado na zona de análise d) Canal obtido

sem nenhum defeito. ............................................................................................................................................ 27

Figura 2.18 – Chip com o microcanal utilizável. ............................................................................................ 27

Figura 2.19- Revestimento de um gobelé com um canto de um saco de plástico, preso por um elástico.

Esta solução impede o PDMS de aderir ao gobelé. ............................................................................................... 32

Figura 3.1- Fluxograma do programa desenvolvido em ambiente Matlab® para o processamento digital de

imagens. ................................................................................................................................................................ 35

Figura 3.2- Método de substração do segundo plano. a) imagem genérica da zona A com eritrócitos em

escoamento b) imagem de segundo plano calculada como a média aritmética de todas as imagens contidas na

directoria. Apresenta-se a máscara binária obtida para vários valores do threshold. Note-se que quanto maior o

valor do threshold mais informação é rejeitado como pertencente ao segundo plano. ...................................... 36

Figura 3.3- Técnica de melhoramento de contraste e seu resultado. a1) Histograma da imagem original a2)

Pormenor da imagem original b) Função transferência aplicada, saturando 1% dos pixels em cada extremidade

de escala c1) Histograma obtido após aplicar a função de transferência mencionada c2) Pormenor da imagem

com contraste melhorado. .................................................................................................................................... 38

Figura 3.4 - Dilatação de imagem e eliminação de ruído. a) Imagem da zona C com um aglomerado de

eritrócitos em escoamento b) Máscara binária obtida, com ruído e o aglomerado constituído por pequenas

ix

áreas c) Máscara binária que, após a remoção do ruído de alta frequência, foi dilatada com um elemento

estruturante com a forma de um disco de raio equivalente a 4 pixel, ligando digitalmente as áreas do

aglomerado e permitindo a sua correcta eliminação. .......................................................................................... 39

Figura 3.5 - Aplicação do critério de forma. a) Imagem genérica da zona C b) Máscara binária obtida por

subtracção do segundo plano c)Máscara binária após aplicação do critério das áreas, com o parâmetro

adimensional de forma apresentado para cada objecto. A utilização de um limite superior a 0,4 e inferior a 0,86

permite filtrar correctamente esta imagem. ........................................................................................................ 39

Figura 3.6 – Distribuição normal multivariada. A verde está representada uma elipse cujo ajuste depende

da medida de dispersão utilizada. ........................................................................................................................ 40

Figura 3.7 - Ajustamento de uma elipse a um eritrócito da zona C. a1) Imagem na escala original com a

elipse ajustada a2) Ampliação do eritrócito, onde se pode ver a elipse a vermelho e o contorno não tratado a

verde. As imagens b1) e b2) são as mesmas de a1) e a2) após melhoramento do contraste. ............................. 41

Figura 4.1 – Interface a jusante dos canais, com o escoamento da esquerda para a direita. A tracejado

apresenta-se a zona de comparação onde a interface é avaliada. [35] ................................................................ 45

Figura 4.2 – Imagens do ensaio dos corantes alimentares, escoando a solução do corante em água

destilada (1:5) no canal inferior e água destilada no superior. Ambos os caudais são 0,005 µL/min. a) Corante

amarelo (E102). Não existe uma interface visível e há formação de resíduos no canal inferior e na zona de

comparação. b) Corante verde (E104 e E142). Existem indícios de uma interface mas há grande quantidade de

resíduos formados, principalmente no canal de controlo. c) Corante azul (E131). Existe uma interface visível

sem formação de resíduos. d) Corante encarnado (E122). Não existe uma interface visível e existem poucos

resíduos. ................................................................................................................................................................ 46

Figura 4.3 – Testes realizados com o corante azul (E131) com o caudal da solução com corante constante e

igual a 0,005µL/min, variando o caudal de água destilada (Qa) que circula no canal de teste. a) Qa =

0,005µL/min. b) Qa=0,007µL/min. c) 0,010µL/min. d) Canal após limpeza. Nota-se resíduos de tinta azul nos

locais onde a interface esteve previamente. ........................................................................................................ 47

Figura 5.1 – Localização das zonas de aquisição de imagem no microcanal de válvula. Ver Figura 2.10. .... 48

Figura 5.2 – Resultados da zona A. Histograma da deformabilidade (esquerda), histograma do diâmetro

(direita) e histograma angular da orientação dos eritrócitos, com a respectiva convenção de sinal. .................. 49

Figura 5.3 a) Histograma da distância à parede. Apresentação do gráfico de dispersão entre: b) ID e

distância à parede, c) ID e diâmetro eritrocitário, d) diâmetro eritrocitário e distância à parede. Para os dois

últimos não é evidente nenhum indício de relação entre os parâmetros. ........................................................... 50

Figura 5.4 - Resultados da zona A2. Histograma da deformabilidade (esquerda), histograma do diâmetro


Figura 5.5 – Gráfico de dispersão do ID em função do diâmetro eritrocitário para a zona A2. .................... 52

Figura 5.6 - Resultados da zona C. Histograma da deformabilidade (esquerda), histograma do diâmetro


x

Figura 5.7 - a) Histograma da distância à parede. Apresentação do gráfico de dispersão entre: b) ID e

distância à parede, c) ID e diâmetro eritrocitário, d) diâmetro eritrocitário e distância à parede. Em todos os

gráficos é notória uma camada sem eritrócitos (de plasma) com uma espessura de 4,8µm. .............................. 53

Figura 5.8 – Formação de bolhas na válvula do microcanal ensaiado. a) (Q=1µL/min, ampliação 40×).

Bolhas na zona de entrada da microválvula resultam numa distribuição não homogénea dos eritrócitos nesta.

b) (Q=1µL/min, ampliação 40×) Bolhas na zona de saída da microválvula resultam numa distribuição não

homogénea dos eritrócitos para o canal. c) (Q=5µL/min, ampliação 10×). Formação de bolhas fortemente

assimétricas após mais de 2 horas do início do ensaio. d) (Q=1µL/min, ampliação 40×) Formação de bolhas

fortemente assimétricas após mais de 3 horas do início do ensaio. Os círculos encarnados representam grandes

aglomerados de eritrócitos fixos ao canal. ........................................................................................................... 55

Figura 5.9 – Variação da viscosidade com o hematócrito para diferentes taxas de deformação [52]. ........ 58

Figura 5.10 – Trajectórias do ensaio 1 do seguimento manual. A tracejado encontra-se a separação entre

as trajectórias centrais e laterais. A amarelo estão representadas as trajectórias lineares por troços de cada

eritrócito medido, com o eritrócito mais deformável e o de controlo marcados (vide Figura 5.13). É ainda

apresentada a coordenada S com os sinais ‘+’ sobre as trajectórias, em que cada marcação limita intervalos de

10% da distância total. Ordem dos eritrócitos da esquerda para a direita: L2,L4,L3,L1 ; C2, C4, C1, C6, C3, C5. . 62

Figura 5.11 – Resultados obtidos para o ensaio 1 das trajectórias centrais. Na figura da esquerda

apresenta-se um diagrama de caixa de bigodes para o ID, agrupado por secções da trajectória percorrida. A

linha encarnada representa a mediana, os limites superiores e inferior da caixa azul o 3º e 1º quartil,

respectivamente. Os limites traçados a preto representam os pontos extremos medidos. Cruzes encarnadas

representam os pontos que foram considerados outliers. Na figura da direita está um diagrama de caixa de

bigodes para a velocidade dos eritrócitos. ........................................................................................................... 63

Figura 5.12 - Resultados obtidos para o ensaio 1 das trajectórias laterais. Na figura da esquerda apresenta-

se um diagrama de caixa de bigodes para o ID, agrupado por secções da trajectória percorrida. A linha

encarnada representa a mediana, os limites superiores e inferior da caixa azul o 3º e 1º quartil,


representam os pontos que foram considerados outliers. É ainda representado com asteriscos encarnados um

eritrócito extremamente deformável. Na figura da direita está um diagrama de caixa de bigodes para a

velocidade dos eritrócitos. .................................................................................................................................... 63

Figura 5.13 - Comparação entre as deformações do eritrócito de maior deformabilidade e um eritrócito de

controlo para as mesmas zonas do trajecto. ........................................................................................................ 64

Figura 5.14 - Trajectórias do ensaio 2 do seguimento manual. A tracejado encontra-se a separação entre as

trajectórias centrais e laterais. A amarelo estão representadas as trajectórias linearizadas de cada eritrócito

medido. É ainda apresentada a coordenada S com os sinais ‘+’ sobre as trajectórias, em que cada marcação

limita intervalos de 10% da distância total. Ordem dos eritrócitos da esquerda para a direita: L1, L4, L8, L7, L2,

L9, L5, L3, L6, C1 .................................................................................................................................................... 64

Figura 5.15 – Apresentação dos resultados obtidos para o eritrócito central do ensaio 2. ......................... 65

xi

Figura 5.16 - Resultados das trajectórias laterais obtidos no ensaio 2. Na figura da esquerda apresenta-se

um diagrama de caixa de bigodes para o ID, agrupado por secções da trajectória percorrida. A linha encarnada

representa a mediana, os limites superiores e inferior da caixa azul o 3º e 1º quartil, respectivamente. Os

limites traçados a preto representam os pontos extremos medidos. Cruzes encarnadas representam os pontos

que foram considerados outliers. Na figura da direita está um diagrama de caixa de bigodes para a velocidade

dos eritrócitos. ...................................................................................................................................................... 65

Figura 5.17 - Trajectórias do ensaio 3 do seguimento manual. A tracejado encontra-se a separação entre as

trajectórias centrais e laterais. A amarelo estão representadas as trajectórias linearizadas de cada eritrócito

medido. É ainda apresentada a coordenada S com os sinais ‘+’ sobre as trajectórias, em que cada marcação

limita intervalos de 10% da distância total. São ainda indicadas as trajectórias dos eritrócitos mais deformáveis

e daqueles que foram usados como controlo na Figura 5.19. Ordem dos eritrócitos da esquerda para a direita:

C6, C9, C7, C1, C2, C3, C5, C10, C4, C8. ................................................................................................................. 66

Figura 5.18 - Resultados obtidos para o ensaio 3 das trajectórias centrais. Na figura da esquerda




representam os pontos que foram considerados outliers. É ainda representado com asteriscos verdes (C8) e

azuis (C3) os dois eritrócitos mais deformávei. Na figura da direita está um diagrama de caixa de bigodes para a

velocidade dos eritrócitos. .................................................................................................................................... 67

Figura 5.19 - Comparação entre as imagens originais dos dois eritrócitos mais deformáveis, com

trajectórias centrais, e de um eritrócito de controlo para as mesmas zonas do trajecto. ................................... 67

Figura 5.20 - Resultados obtidos para o ensaio 3 das trajectórias laterais. Na figura da esquerda apresenta-

se um diagrama de caixa de bigodes para o ID, agrupado por secções da trajectória percorrida. A linha

encarnada representa a mediana, os limites superiores e inferior da caixa azul o 3º e 1º quartil,


representam os pontos que foram considerados outliers. É ainda representado com asteriscos verdes (E2) o

eritrócito mais deformável. Na figura da direita está um diagrama de caixa de bigodes para a velocidade dos

eritrócitos. ............................................................................................................................................................. 68

Figura 5.21 - Comparação entre as imagens originais do eritrócito deformável E2, com trajectória lateral, e

de um eritrócito de controlo para as mesmas zonas do trajecto. ........................................................................ 68

Figura 5.22 – Representação das trajectórias dos eritrócitos pela constrição superior e inferior. Cada cor de

círculos representa o trajecto de um eritrócito. Ambas as contrições se encontram divididas por secções, sendo

o canal superior dividido em 4 e o inferior em 3. As cruzes pretas representam eritrócitos presos que se

mantiveram imóveis durante todo o ensaio. ........................................................................................................ 71

Figura 5.23 - Resultados obtidos para os 10 eritrócitos na constrição inferior. Na figura da esquerda




xii



Figura 5.24 - Resultados obtidos para os 10 eritrócitos medidos na constrição superior. Na figura da

esquerda apresenta-se um diagrama de caixa de bigodes para o ID, agrupado por secções da trajectória

percorrida. A linha encarnada representa a mediana, os limites superiores e inferior da caixa azul o 3º e 1º

quartil, respectivamente. Os limites traçados a preto representam os pontos extremos medidos. Cruzes

encarnadas representam os pontos que foram considerados outliers. Na figura da direita está um diagrama de

caixa de bigodes para a velocidade dos eritrócitos. ............................................................................................. 72

Figura 5.25 – Enchimento deficiente de uma zona de saída. ........................................................................ 72

Figura 5.26 - Representação das trajectórias dos eritrócitos pela constrição superior até ocorrer a sua

hemólise. Cada cor de círculos representa o trajecto de um eritrócito. A hemólise ocorreu até 6 µm dentro do

canal (azul escuro). Um dos eritrócitos (azul claro) colapsou 5,4 µm antes do início da constrição. ................... 73

Figura 5.27 - Resultados obtidos para os 5 eritrócitos em que se verificou hemólise. Na figura da esquerda






Figura 5.28 – Sucessão de imagens capturadas durante a hemólise de um eritrócito. A seta encarnada

mostra o local onde o conteúdo da célula é expelido e a seta verde o ponto de rotura da membrana. ............. 75

xiii

Lista de Tabelas

Tabela 1.1- Propriedades mecânicas dos eritrócitos [3, 4, 7]. ........................................................................ 6

Tabela 2.1- Características das objectivas do microscópio utilizadas ........................................................... 19

Tabela 2.2- Frame rate máxima para várias resoluções da câmara CMOS. .................................................. 19

Tabela 2.3 - Características da bomba de seringa utilizada. ......................................................................... 21

Tabela 2.4- Parâmetros que definem as duas rotinas que foram programadas e utilizadas no spin coater. 30

Tabela 2.5- Parâmetros implementados na rotina de exposição no UV-KUB. .............................................. 30

Tabela 3.1- Parâmetro de forma adimensional R e índice de deformabilidade elíptico (definido na Figura

1.3) para elipses com diferentes proporções entre o eixo maior A e o eixo menor b. ......................................... 39

Tabela 3.2- Limite máximo do ID capturado pelos parâmetros utilizados no processamento de imagem .. 43

Tabela 3.3 - Limite superior e inferior do diâmetro capturado pelos parâmetros utilizados no

processamento de imagem ................................................................................................................................... 43

Tabela 3.4- Parâmetros utilizados pelo programa desenvolvido na obtenção dos resultados apresentados

no capítulo 5. ........................................................................................................................................................ 44

Tabela 3.5 - Erro relativo da discretização espacial em pixel ........................................................................ 44

Tabela 3.6 –Erro sistemático de subestimação do diâmetro do procedimento automático. ....................... 44

Tabela 5.1 – Comparação do diametro experimental e teórico. .................................................................. 56

Tabela 5.2 – Parâmetros retirados da Figura 5.2e Figura 5.6, utilizados para comparar a distribuição da

orientação dos eritrócitos da zona A e C. ............................................................................................................. 57

Tabela 5.3 – Largura da camada de plasma .................................................................................................. 58

Tabela 5.4 - Parâmetros retirados da Figura 5.2 e Figura 5.4,utilizados para comparar a distribuição da

orientação dos eritrócitos da zona A e A2. ........................................................................................................... 61

Tabela 5.5 – Resumo dos dados apresentados para o seguimento manual. Variação da mediana do ID para

os ensaios da zona B. ............................................................................................................................................ 69

Tabela 5.6 – Comparação do diametro experimental e teórico. .................................................................. 69

Tabela 5.7 - Diferença da mediana do ID para os eritrócitos que atravessaram o canal superior com e sem

hemólise. ............................................................................................................................................................... 75

Tabela 5.8 - Diferença da mediana da velocidade para os eritrócitos que atravessaram o canal superior

com e sem hemólise. ............................................................................................................................................ 75

Tabela 6.1- Limitações do processamento digital de imagem ...................................................................... 77

xiv

Lista de Abreviaturas

ID- Índice de deformabilidade elíptica.

PDMS - Polidimetilsiloxano.

UV - Ultravioleta

1

1. Introdução

1.1 Âmbito e objectivos do trabalho

O estudo do sangue remonta à Grécia Antiga, onde se verificou que deixando uma amostra de sangue

algum tempo num recipiente transparente levava à formação de diversas camadas, sendo a proporção entre

elas utilizada como ferramenta de diagnóstico. Este fenómeno é muito possivelmente o primeiro estudo da

ciência agora denominada de hemorreologia [1].

O estudo do sangue só viria a conhecer desenvolvimentos significativos em meados do séc.XVII, quando o

médico inglês William Harvey (1578 – 1657) descobriu que a existência da circulação sistémica, bombeada pelo

coração e previu a existência de vasos sanguíneos com diferentes dimensões, ficando pela primeira vez

evidente a importância das características que regulam o escoamento do sangue. A existência da

microvasculatura só foi comprovada mais tarde por Marcelo Malphigi (1628-1694), que foi o primeiro a

observá-la, fazendo a ligação entre o sangue arterial e venoso. Outra contribuição fundamental deste médico

italiano foi a descoberta de que o sangue não era um líquido homogéneo mas sim uma suspensão de células.

Coube a Anton van Leeuvenhoek (1632–1723) a descrição destas células, os chamados glóbulos vermelhos ou

eritrócitos, verificando pela primeira vez a sua deformabilidade na microcirculação, postulando que alterações

na deformabilidade destas células podem causar doenças. Este cientista alemão estimou ainda o diâmetro

destas células em 8,5 µm e verificou a agregabilidade dos eritrócitos, sendo considerado um dos fundadores da

hemoreologia enquanto ciência [1].

Após estes desenvolvimentos iniciais os estudos do sangue prosseguiram no sentido de caracterizar as

propriedades do seu escoamento, com grandes contribuições ao nível do estudo da viscosidade por parte de

Jean Marie Poiseuille (1797-1869), ou no desenvolvimento do teste da velocidade de hemossedimentação por

Robin Fåhræus (1888-1968), ainda hoje um dos ensaios clínicos mais utilizados [1].

O estudo sistematizado dos eritrócitos, e em particular da sua deformabilidade, só viria a afirmar-se nos

anos 60 do século passado, com a descoberta da influência deste parâmetro na viscosidade do sangue.

Inicialmente estas medições eram feitas por micropipetas, um sistema apenas disponível nos centros de

investigação mais avançados. O desenvolvimento do método de filtração surge como alternativa barata, sendo

o desenvolvimento do primeiro modelo comercial (St George’s Filtrometer) um passo importante na

disseminação do estudo da deformabilidade eritrocitária, permitindo a comparação dos resultados entre os

vários laboratórios [1]. Desde então o estudo da deformabilidade eritrocitária expandiu-se, utilizando diversas

técnicas com directrizes estabelecidas para realização de medições de deformabilidade [2]. O estudo da

deformabilidade eritrocitária tem sido desenvolvido em paralelo com o potencial de diagnosticar várias

doenças [3, 4], como a anemia falciforme [4], malária [4, 5] ou até leucemia [6].

Uma das técnicas emergentes de medição da deformabilidade eritrocitária baseia-se no fabrico e

utilização de microcanais [3, 4, 7].

A partir da segunda metade do século XX surgiu a tendência de miniaturização de componentes

electrónicos, suportados pelo desenvolvimento de tecnologias de microfabricação. Esta tendência rapidamente

2

se espalhou a outros campos científicos, entre eles a mecânica de fluidos, com o nascimento da microfluídica,

que estuda sistemas fluídicos cuja dimensão característica se encontra entre 1 e 1000 μm[8-11] .

Contudo, o grande interesse pela microfluídica surge do facto de proporcionar ferramentas para análises

(químicas, biológicas, biomédicas) com inúmeras vantagens sobre os sistemas actuais [10]. A diminuição do

volume das amostras a analisar e dos reagentes necessários, o melhor controlo sobre as concentrações de

determinada solução ou tempos de resposta inferiores aos dos sistemas macroscópicos convencionais são

algumas das vantagens da miniaturização de sistemas de análises. De facto, as plataformas µTAS (micro total

analysis systems) onde se enquadram o Lab-on-a-Chip ou Lab-on-a-CD são exemplos de sistemas microfluídicos

que podem integrar uma série de processos (separações, misturas, reacções) que prometem revolucionar o

campo das análises laboratoriais [8-11].

Relativamente às técnicas de fabrico, grandes progressos foram atingidos no começo do presente século

com a utilização do polímero Polidimetilsiloxano (PDMS) como material de eleição na construção dos

microcanais utilizados em microfluidos e microbiologia. O PDMS é um material barato e a sua flexibilidade

permite a utilização de métodos de fabrico mais simples e mais rápidos. Para além disso, é um material que

permite a análise de fluidos biológicos (como sangue), devido à sua boa biocompatibilidade [9-11]. As

plataformas microfluídicas em PDMS vieram, então, viabilizar o estudo e desenvolvimento de ferramentas de

diagnóstico clínico, sendo o sangue um dos fluidos corporais com mais informação clínica, fazendo com que

seja o fluido mais analisado para efeitos de diagnóstico [8, 10, 11].

A utilização de aplicações microfluídicas na análise de sangue apresenta algumas vantagens, como o uso

de menores amostras de sangue, reduzidos custos das análises e obtenção rápida de resultados fiáveis. Estas

vantagens traduzem-se num maior conforto para o utente, uma vez que os tempos de espera são mais

reduzidos e o método de extracção de sangue torna-se menos intrusivo e, consequentemente, menos doloroso

para o paciente [11].

No entanto é necessário desenvolver estudos no sentido de compreender o escoamento de sangue à

microescala, de forma a desenhar dispositivos eficazes nas análises dos parâmetros de interesse [9-11]. Dada a

importância do sangue nas análises clínicas, e nomeadamente o potencial da medição da deformabilidade

eritrocitária como forma de diagnosticar várias doenças, o estudo deste fenómeno à microescala torna-se

particularmente relevante [9-11]. O presente trabalho insere-se neste âmbito, tendo como objectivo principal

estudar a deformabilidade dos eritrócitos em dois casos diferentes: escoamentos em canais cujo tamanho é da

ordem de grandeza dos diâmetros dos eritrócitos (microcanal de constrição), e escoamentos em canais com

dimensão muito superior aos diâmetros dos eritrócitos (microcanal com válvula).

1.2 Componentes constituintes do sangue

O sangue é um tipo de tecido conjuntivo constituído por elementos figurados e plasma. Os elementos

figurados são as células e os fragmentos de células que representam 45% do volume total de sangue, sendo o

restante uma substância coloidal constituída maioritariamente por água, denominada plasma. Num adulto

médio existem entre 4 a 5 litros de sangue nas mulheres e 5 a 6 litros nos homens, representando cerca de 8%

do seu peso corporal (ver Figura 1.1)[12].

3

1.2.1 O Plasma

O plasma é a parte líquida do sangue na qual os elementos figurados se encontram em suspensão [13]. É

constituído por cerca de 91% de água, sendo os restantes 9% constituídos por outras substâncias como

proteínas e solutos [12]. É uma substância coloidal uma vez que contém substâncias em suspensão que não

depositam, a maioria das quais são proteínas plasmáticas [12, 14].

Figura 1.1 - Componentes do sangue [12].

Os iões são os solutos com menor peso molecular, da ordem das dezenas de Dalton, e representam

apenas 1% do plasma em peso. Existem vários iões presentes no plasma como K+, Ca

2+, Mg

2+, Cl

-, Fe

2+ PO4

2-, H

+,

HCO3-, no entanto o ião com maior concentração é o Na

+ e pode ter efeitos sobre a dimensão dos eritrócitos e

viscosidade do sangue [13].

As proteínas plasmáticas constituem a maior parte das moléculas presentes no plasma, com peso

molecular que varia desde as dezenas de milhar até aos milhões de Dalton e são responsáveis por cerca de 7%

do peso do plasma. Estas proteínas dividem-se em albumina (58%), globulinas (38%) e fibrinogénio (4%). O

fibrinogénio actua na coagulação sanguínea tendo um papel determinante no comportamento reológico do

sangue devido à sua influência na agregação eritrocitária. Outra importante contribuição para o

comportamento do sangue está na influência destas moléculas na viscosidade do plasma. Tomando como

referência a água, que a 37ºC tem uma viscosidade de 0,69 mPa.s, o sangue, em condições normais, apresenta

uma viscosidade do plasma de 1,25±0,10 mPa.s para a mesma temperatura, sendo esta diferença quase

inteiramente justificada pela existência das proteínas plasmáticas[13].

1.2.2 Elementos figurados

Os elementos figurados são as células e fragmentos de células que se encontram em suspensão no

plasma. Cerca de 95% do volume destes elementos consiste em glóbulos vermelhos, sendo o restante

composto por glóbulos brancos e plaquetas. A percentagem relativa em volume destes elementos no sangue

pode ser medida através da centrifugação de uma amostra de sangue num tubo cilíndrico. Desta forma obtém-

se a separação entre estes elementos e o plasma conforme se pode ver na figura Figura 1.1. Esta percentagem

é denominada packed cell volume [13].

4

Os glóbulos vermelhos, eritrócitos ou hemácias constituem a maioria dos elementos figurados, sendo

cerca de 700 vezes mais abundantes que os glóbulos brancos e 17 vezes mais abundantes que as plaquetas

[12]. Um adulto saudável do sexo masculino tem cerca de 5,4 milhões de eritrócitos por microlitro de sangue,

enquanto para o sexo feminino este número desce para os 4,8 milhões por microlitro [12, 14]. Um importante

conceito para o estudo do sangue é o volume ocupado pelos glóbulos vermelhos em relação ao volume total

do sangue, denominado hematócrito. Este parâmetro é sensível a vários factores: volume de plasma presente

no sangue que pode variar com o grau de hidratação; número de glóbulos vermelhos presentes no sangue; e a

dimensão dos eritrócitos [13, 14]. Os valores normais de hematócrito estão entre os 40% e 50% para os

homens e entre 36% e 46% para as mulheres. Esta abundância de glóbulos vermelhos é a principal razão para o

enorme impacto que estas células têm no comportamento reológico do sangue [13].

A morfologia dos glóbulos vermelhos é outra das razões para a sua relevância a nível reológico [13]. Os

eritrócitos são células sem núcleo com a forma de discos bicôncavos com diâmetro médio entre 7,5 e 8,5 µm e

uma espessura média que varia entre 2 e 2,4 µm [12, 13](Figura 1.2). A sua forma bicôncava permite uma

maior razão entre a área superficial e o volume do que seria possível com um disco simples [14], o que facilita

assim as trocas gasosas através da superfície, permite que o glóbulo se deforme para atravessar mais

facilmente os vasos sanguíneos de menor dimensão e que se alinhe na direcção do escoamento [12-14].

A deformabilidade eritrocitária e a tendência destas células se juntarem em estruturas que fazem lembrar

moedas empilhadas, denominadas roleaux, são dois factores determinantes no comportamento reológico do

sangue. Estas duas propriedades contribuem para que a viscosidade do sangue seja bastante diferente da

viscosidade do plasma e conferem ao sangue o seu carácter não Newtoniano [13].

Figura 1.2 – Dimensões típicas de um eritrócito humano[12-14].

Os glóbulos brancos ou leucócitos são células com núcleo e, em condições normais, existem entre 5 a 9

mil destas células por microlitro [13, 14]. Sendo a sua concentração volumétrica bastante inferior à dos

glóbulos vermelhos, têm pouca influência na viscosidade do sangue [13].

A sua importância para a reologia do sangue é no campo da microcirculação e deve-se principalmente a

dois factores. Um deles é o seu interior relativamente mais complexo que o dos glóbulos vermelhos, com a

existência de núcleo, organelos, fibras e citoplasma granulado, que se traduz na exibição de um

comportamento viscoelástico mais marcado. O outro é o facto de todos os tipos de leucócitos possuírem

volumes superiores aos apresentados pelos glóbulos vermelhos [13].

As plaquetas ou trombócitos são fragmentos de células constituídos por uma membrana plasmática que

envolve uma pequena quantidade de plasma e actuam ao nível da coagulação sanguínea. As plaquetas são

5

pequenos discos com diâmetro entre 2 e 3 µm e, num indivíduo saudável, existem cerca de 250 a 400 mil

trombócitos por µL de sangue [12]. Apesar de existirem em números entre 40 a 50 vezes superiores aos

leucócitos, devido ao reduzido volume dos trombócitos, estes representam a menor percentagem em volume

dos elementos figurados. Este facto, aliado ao reduzido tamanho das plaquetas, torna estas células pouco

relevantes a nível reológico [13].

1.3 Revisão bibliográfica

A revisão bibliográfica começa por abordar os aspectos relevantes da deformabilidade eritrocitária,

apresentando os factores responsáveis por esse comportamento, a importância da deformabilidade dos

eritrócitos e conclui apresentando uma tabela com as medições das propriedades mecânicas encontradas na

literatura. Uma abordagem às técnicas usuais de medição de deformabilidade é feita, explicando sucintamente

cada método. Finalmente é apresentada uma revisão dos resultados publicados na literatura relevantes para

este trabalho.

É ainda abordado o fenómeno da hemólise e as técnicas de processamento digital de imagem, concluindo

assim a revisão bibliográfica.

1.3.1 Deformação eritrocitária

Cada glóbulo vermelho percorre a microcirculação mais de mil vezes por dia; tendo em conta que o seu

período médio de vida são 120 dias, um eritrócito realiza em média cerca de 120 mil passagens pela

microcirculação. Durante a sua vida, o eritrócito é sujeito a tensões impostas pelo escoamento e forçado a

atravessar vasos e orifícios cuja dimensão é até quatro vezes inferior ao seu próprio tamanho [4]. A

deformabilidade de um glóbulo vermelho torna-se assim um factor crucial para a longevidade e eficácia destas

células [4, 7].

Essencialmente existem três factores que influenciam a deformabilidade de um eritrócito: a viscosidade

do citoplasma; a geometria da célula, nomeadamente a razão entre a área superficial e o volume celular; e a

membrana celular, nomeadamente a rede de proteínas subjacente, chamada citoesqueleto [4, 7, 15-17].

Os factores acima mencionados materializam-se nas propriedades expostas na Tabela 1.1. Várias revisões

recentes na literatura [3, 4, 7] apresentam as gamas de valores encontrados para as propriedades mecânicas

dos eritrócitos, sendo aqui apresentado um resumo destas revisões com os valores e técnicas utilizadas para

determinar estas propriedades.

1.3.2 Técnicas de medição da deformação eritrocitária

O estudo da deformabilidade debruça-se sobre as complexas relações que existem entre a biologia celular

do eritrócito e o comportamento mecânico deste, obtendo medições genéricas que resultam desta interacção

[3].

A deformabilidade depende de vários parâmetros, expostos na Tabela 1.1, que podem ser ou não medidos

de forma independente. Existem várias técnicas de medição de deformabilidade com diferentes graus de

maturação na comunidade científica e diferentes princípios de medição. No entanto, todas pretendem

estabelecer relações empíricas entre a força que actua sobre a célula e a deformação verificada. Para cumprir

6

esta missão é necessário que o factor que induz a deformação seja definido e quantificável e que a

consequente deformação seja medida, directa ou indirectamente, com adequada resolução e reprodutibilidade

[3].

Tabela 1.1- Propriedades mecânicas dos eritrócitos [3, 4, 7].

Parâmetro Valor Notas

Volume 80-100 μm3

Medido com um automated cell counter

Área 110-140 μm2

Medido em microcanais paralelos

Viscosidade citoplasmática 6-7 mPas Extremamente sensível à

hemoglobina Viscosidade da superfície da

membrana 0,3-2.8 mPas

Medido por pinça óptica e aspiração em micropipeta

Tensão de cisalhamento 1-13 μN/m Medido por pinça óptica e

aspiração em micropipeta

Resistência à flexão (0,13-3)x10-19

Nm Medido por aspiração em

micropipeta Tempo de recuperação da

forma original 0,1-0,27 s

Medido com pinça óptica e aspiração em micropipeta

Módulo de elasticidade de expansão de área

300-600 mN/m

Cerca de 4 ordens de grandeza superior ao módulo de

cisalhamento. Demonstra a extrema resistência à alteração da

área.

1.3.2.1 Sistemas de escoamento

Estas técnicas são caracterizadas por alguns denominadores comuns: existência de escoamento de uma

suspensão de glóbulos vermelhos; centenas de células são analisadas a cada medição efectuada; pretende

simular a hemodinâmica do escoamento dentro dos vasos sanguíneos, ou seja, pretende representar as

condições in vivo, seja a deformação constante verificada nos maiores vasos sanguíneos ou as deformações

rápidas e intensas encontradas na microvasculatura [3].

A simulação dos maiores vasos sanguíneos tira partido do facto de os glóbulos vermelhos se alongarem

em elipses com o seu maior eixo mais ou menos alinhado com o escoamento. Este alongamento resulta do

facto de a membrana poder rodar em torno do citoplasma. Quando a membrana se encontra sujeita a

diferentes tensões de corte actuantes na sua superfície, começa a rodar, num movimento conhecido na

literatura como tank-treading. A utilização deste fenómeno como forma de averiguar a deformabilidade dá

pelo nome de ectacitometria. A medição da deformação pode ser efectuada através de imagens directas

(reoscopia) ou por métodos indirectos (análise do padrão de refracção), sendo o princípio comum o mesmo:

ajustar a forma do erictrócito a um elipsóide, determinar os seus eixos e calcular um índice de deformabilidade

(ID no acrónimo português ou DI para o inglês) que é tanto maior quanto mais marcada for a elipse [3]. Este

processo encontra-se ilustrado na Figura 1.3.

Nos casos em que a intenção é simular as deformações rápidas usualmente encontradas na

microvasculatura utilizam-se poros ou constrições de pequenas dimensões através dos quais a suspensão de

glóbulos vermelhos é forçada a passar [3]. Nestes sistemas o parâmetro de medição é o tempo necessário para

uma suspensão atravessar o filtro ou um índice de deformação adaptado à geometria específica [3]. Este tipo

7

de sistemas tem grande aplicação em rotinas médicas onde a avaliação de uma grande amostra de eritrócitos

Figura 1.3- Modo de calcular o índice de deformação (ID) utlizado na ectacitometria como medição da deformação induzida pelas tensões de corte que o escoamento transmite ao eritrócito. Notar que a forma discóide normal do eritrócito traduz um DI nulo, significando que as tensões de corte que actuam na célula não alteram a sua forma. Quanto maior for a deformabilidade da célula maior é a deformação verificada, mais vincado o carácter elipsóide e, consequentemente, maior é o valor do DI [18].

permite obter valores médios de deformabilidade que sejam mais representativos do que os resultados obtidos

em análises a células individuais [19]. A possibilidade de apresentar o índice de deformação enquanto

histograma permite identificar subpopulações de eritrócitos com diferentes deformabilidades, aumentando a

informação que se obtém com estes sistemas [3, 19].

Os principais métodos dos sistemas de escoamento são a filtração, os reoscópios e a ectacitometria.

A filtração foi um método pioneiro na medição da deformabilidade eritrocitária, tendo sido a técnica mais

utilizada no passado devido à sua simplicidade e baixo custo [2, 4, 19]. Estas características permitiram

desenvolver diversas variantes ao longo dos anos, mas todas com o princípio subjacente: medir a facilidade

com que os eritrócitos atravessam um filtro seja através do tempo necessário para um determinado volume ser

filtrado, ou pela relação entre pressão e caudal [2, 4, 19, 20]. Estes sistemas podem impor pressão a montante

do filtro, criar uma subpressão a jusante deste, ou simplesmente utilizar a gravidade como forma escoar o

fluido. Esta técnica, actualmente, já não é muito utilizada devido à limitada reprodutibilidade associada ao

fabrico dos filtros, existindo diferenças consideráveis entre dois filtros do mesmo lote [19, 20].

A determinação de um tempo de trânsito ou filtração não permite quantificar as propriedades mecânicas

do glóbulo vermelho. No entanto, partindo de modelos teóricos que simulam o escoamento de eritrócitos em

poros cilíndricos, concluiu-se que o tempo de trânsito varia com o módulo de cisalhamento e com a dimensão

dos eritrócitos devido à relação diâmetro da célula/diâmetro do poro, sendo insensível à viscosidade do

citoplasma [21].

Os reoscópios são uma simbiose entre um microscópio e um viscosímetro, onde o compartimento onde o

fluido é sujeito a uma taxa de deformação permite a observação do seu interior através de um microscópio [3].

O compartimento onde se encontra o sangue a ser estudado pode assumir várias formas: um cilindro em que

as bases são transparentes e rodam em direcções opostas, onde a velocidade angular de ambas as bases, assim

como a posição axial do eritrócito, determinam a taxa de deformação aplicada ao fluido [22]; um microcanal

transparente cuja geometria permite assumir um perfil de velocidades unidimensional, tornando a tensão de

corte igual ao gradiente de velocidade [23]; um microcanal em que pelo menos uma dimensão é da ordem do

diâmetro dos eritrócitos testados [24]. As técnicas utilizadas neste trabalho inserem-se nesta categoria, sendo

o compartimento os microcanais produzidos.

8

As imagens captadas durante a medição são processadas e os dados obtidos representam uma população

de eritrócitos, o que permite extrair um valor médio de deformabilidade e um histograma da mesma. Este

histograma permite identificar subpopulações com diferentes deformabilidades, sendo uma mais-valia em

relação ao simples valor médio [3].

Um factor importante nestes instrumentos é o facto de a visualização directa dos eritrócitos permitir

identificar se existe alguma patologia associada à não orientação da célula com as linhas de corrente, como a

anemia falciforme ou eliptocitose [22]. A orientação dos eritrócitos torna-se assim mais um parâmetro que

pode ser analisado, sendo possível construir diagramas para sangue saudável e comparar os resultados para

detectar anomalias em análises sanguíneas, conforme ilustra a Figura 1.4.

Nos casos em que são utilizados microcanais com dimensões suficientemente grandes é ainda possível

observar a distribuição do índice de deformabilidade em relação à distância do eritrócito ao centro do canal

[25]. A distância ao centro do canal influencia a tensão de corte a que uma célula está sujeita, sendo expectável

que esta aumente à medida que, num escoamento totalmente desenvolvido, se aumenta a distância ao centro

do canal [3]. Assim, o índice de deformabilidade também aumenta à medida que os eritrócitos se afastam do

centro do canal, voltando a decrescer perto das paredes devido à migração dos eritrócitos mais rígidos para

este local [25].

Analisando a variação do índice de deformabilidade com a distância ao centro do canal, e comparando

com o comportamento expectável para uma amostra saudável, é possível identificar anomalias ao nível da

deformabilidade. Este método foi utilizado com sucesso para identificar uma amostra de eritrócitos de um

paciente com talassemia, utilizando um meio hiperviscoso na suspensão de eritrócitos analisada, de forma a

aumentar a migração lateral dos eritrócitos de acordo com a sua deformabilidade [25].

Figura 1.4 - Histograma e digrama polar do índice de deformabilidade (DI ou δ) [22]. 1) Histograma típico que se pode obter por reoscopia, com a curva esperada para um indivíduo saudável sobreposta a uma curva obtida num ensaio genérico, sendo demonstrada a forma de determinar as porções hipodeformáveis, híperdeformáveis e a porção normal da população de eritrócitos ensaiada. 2) Diagrama com a orientação do eixo maior da elipse em relação às linhas de corrente, em função do índice de deformabilidade (δ) medido para uma população saudável. 3) Amostra de um paciente com eliptocitose hereditária [22].

1.3.2.2 Sistemas unicelulares

Os sistemas unicelulares de medição de deformação de eritrócitos caracterizam-se por analisar cada

eritrócito individualmente, sendo uma medição sinónimo de avaliar uma célula[3]. Torna-se assim óbvio que,

para obter resultados estatisticamente relevantes, estes métodos requerem muitas horas de trabalho

exaustivo e técnicos muito especializados [3]. Uma vantagem do método é a possibilidade de escolher que

9

célula analisar, ou seja, numa população heterogénea de células é possível analisar uma subpopulação de

células sem necessidade de pré-tratamentos ou marcadores [3]. Estas técnicas podem ser usadas para

determinar propriedades mecânicas específicas das células [3], sendo as principais fontes dos dados

apresentados na Tabela 1.1.

Devido à escala envolvida, é necessária uma forma de micromanipulação com contacto entre alguma

ferramenta e a própria célula. As técnicas mais comuns são a aspiração por micropipeta (já existente desde os

anos cinquenta), pinças ópticas e microscópio de força atómica ou AFM [3]. Uma revisão detalhada destes

métodos é apresentada em [26].

1.3.3 Resultados relevantes da literatura para a deformabilidade de eritrócitos

Dado que as medições efectuadas neste trabalho foram realizadas em dois sistemas de escoamento

microfluídicos, um cuja dimensão crítica (menor dimensão do canal) é da ordem de grandeza do eritrócito, e

outro de tamanho superior, apresentam-se nesta secção os resultados obtidos em condições semelhantes

encontrados na literatura.

O índice de deformabilidade (ID) é um dos parâmetros mais medidos na literatura, seja na sua forma

elíptica para canais largos [18, 25, 27-30] ou adaptada para constrições de tamanho inferior aos eritrócitos [6,

24, 31].

Figura 1.5 – a) Variação do ID medido por dois métodos semelhantes com o aumento de caudal, para as zonas indicadas em b) [18]. b) Representação do microcanal usado por Yaginuma et al (2011) com as zonas A e B representadas. c) Modelo teórico de Korin et al (2007)., para um módulo de cisalhamento do eritrócito de 3,7 µN/m, comparado com algumas observações experimentais. d) Variação do ID com a distância ao centro do canal utilizado como forma de diagnosticar talassemia (microcanal de secção 50µm x 1 mm) [25]

A variação do ID elíptico aumenta com o aumento da tensão de corte aplicada aos eritrócitos [18, 25, 27],

sendo essa variação mais acentuada para pequenas tensões de corte (até cerca de 10 Pa) até tender para um

valor assimptótico (ID≈0.6) à medida que se aumenta a tensão aplicada [27] (ver Figura 1.5).

a)

c) d)

b

)

10

A migração dos eritrócitos ao longo da espessura do caudal é também um fenómeno observado

experimentalmente em canais rectangulares com o escoamento totalmente desenvolvido [25]. O ID varia com

a distância ao centro do canal, apresentando baixas deformabilidades no centro do canal, e aumentando essa

deformabilidade à medida que estes se aproximam da parede, para descer novamente junto as paredes devido

à migração dos eritrócitos mais rígidos para estas zonas. Este andamento do ID é justificado pela variação da

tensão de corte, sendo o ID maior nas zonas onde é maior a tensão de corte [25, 27] (ver Figura 1.5.c).

O aumento da tensão de corte provocado por um aumento do canal, também se reflecte num maior ID

medido para os maiores caudais [18, 24]. Numa contracção hiperbólica, Yaginuma et al (2011). mostram que

um aumento para um caudal 5 vezes superior reflecte-se num aumento do ID medido que é muito superior na

zona final da contracção do que no seu início (ver Figura 1.5).

1.3.4 Técnicas de processamento digital de imagens

Nesta secção é feita uma revisão dos métodos utilizados em condições semelhantes às ensaiadas neste

trabalho, ou seja, em condições de baixo hematócrito com aquisição de imagens em escala de cinzentos, cujo

objectivo é identificar e medir os eritrócitos. Em geral o processamento digital de imagens consiste na

alteração da natureza de uma imagem de modo a realçar aspectos que melhorem a percepção humana dessa

imagem, ou trabalhá-la de forma a poder ser tratada autonomamente em processos computacionais [32].

Nos procedimentos descritos na literatura para este tipo de aplicações, invariavelmente o interesse recai

no pré-tratamento com o objectivo de processar autonomamente um conjunto de imagens substancial [18, 25,

31, 33].

As imagens binárias, como sugerido pelo seu nome, apresentam pixels cujo valor é 0 (preto) ou 1 (branco),

sendo particularmente eficientes no processamento digital de imagem devido aos baixos requisitos de

memória. As imagens na escala de cinzentos são definidas por pixels cuja intensidade varia entre 0 (preto) e

255 (branco), sendo suficiente para o correcto reconhecimento da maior parte dos objectos naturais [32].

Para as imagens em escala de cinzentos é intuitivo falar de histogramas, enquanto gráficos que mostram a

frequência de cada nível nessa escala. A partir destes histogramas é possível obter várias informações sobre

uma imagem, nomeadamente o contraste. De facto existem várias técnicas de melhoramento de contraste que

se baseiam na aplicação de funções que mapeiam a frequência dos níveis da escala de cinzentos, noutra

distribuição mais conveniente [32].

As imagens obtidas em escala de cinzentos são frequentemente subtraídas a uma imagem de fundo, num

processo chamado subtracção do segundo plano ou background subtraction. Este processo é particularmente

eficaz para salientar objectos que se movem sobre um plano de fundo estático e imutável, como é o caso que

se pretende estudar nesta tese [18, 25, 31, 33].

A partir desta subtracção existem casos em que se obtém um histograma aproximadamente bimodal,

onde uma das distribuições representa o background homogeneizado e a outra os eritrócitos (objectos a

identificar na imagem) [31]. Neste caso a aplicação de métodos estabelecidos de thresholding, como o método

de Otsu, é directa, devido à sua eficácia no tratamento de histogramas bimodais [31, 32]. Outros autores

partem da subtracção do background para a aplicação de filtros por intermédio de software especializado

como o ImageJ(NIH)®, após os quais é aplicado um threshold obtendo uma imagem binária dos eritrócitos [18].

11

Outra alternativa é a identificação de zonas com prováveis eritrócitos, ajustando elipses aos objectos que

surgem nessas zonas. Após esse ajustamento, as elipses são descartadas ou não, conforme dois parâmetros:

um baseado na diferença entre a área da elipse ajustada e área do objecto a ajustar; o outro mais complexo,

utilizado para remover ajustamentos a eritrócitos fora do plano focal [25, 30].

Um objectivo diferente encontrado na literatura é o seguimento automático de um mesmo eritrócito

enquanto este se desloca, identificando o mesmo eritrócito em imagens sucessivas. Para o caso de trajectórias

bem definidas, como em constrições, onde se sabe qual o percurso que o eritrócito irá seguir, este problema é

simplificado. Restringindo a análise aos locais onde o eritrócito pode passar e sabendo a direcção do

escoamento, a identificação do mesmo glóbulo em duas imagens sucessivas é simples [31].

Para os casos em que o escoamento não está confinado a regiões que impõem a circulação individual de

eritrócitos, a identificação do mesmo eritrócito em imagens sucessivas é mais complexa. Uma solução

apresentada consiste na avaliação de todas as elipses em ambas as imagens. Calculando a velocidade média do

escoamento é possível definir uma área aproximada onde se espera encontrar cada elipse na imagem seguinte.

Após definida esta zona, a elipse na sua proximidade que apresente maior semelhança com elipse da imagem

anterior, é considerada como a mesma elipse, sendo assim seguido o mesmo eritrócito em imagens

sucessivas[25].

Métodos mais complexos que se baseiam em calibrações utilizando pixels tridimensionais com densidade

óptica conhecida, permitem posteriormente determinar o volume de um eritrócito através de uma imagem

bidimensional [33].

No presente trabalho o processamento digital de imagens foi totalmente criado de raíz, utilizando

métodos de subtracção de background e thresholding conforme a situação analisada (método definido pelo

utilizador). Após obter a imagem binária por um dos anteriores métodos, são aplicados filtros de área, e de

forma (parâmetro adimensional de circularidade). Após estes filtros são ajustadas elipses aos eritrócitos e

retirados os parâmetros a avaliar. A identificação do mesmo eritrócito em imagens sucessivas, nos casos em

que esta análise é feita, é deixada à responsabilidade do utilizador. Este pode ainda editar o ajustamento da

elipse, caso o considere deficitário.

1.3.5 Hemólise

A hemólise é a ruptura da membrana do eritrócito, resultando na libertação do seu conteúdo

(hemoglobina) no sangue [12]. Este fenómeno foi estudado por técnicas de aspiração por micropipeta que

determinou uma tensão de cerca de 4kPa necessária para ocorrer hemólise em condições estáticas, em

eritrócitos esféricos [34].

Recentemente, o estudo da hemólise verificada em canais de 2 µm com medição da perda de pressão

revelou que a diferença de pressão sobe até um valor crítico de cerca de 3,8kPa antes de se dar a lise do

eritrócito [35]. Utilizando eritrócitos tornados esféricos através de desequilíbrios osmóticos, foi verificada a

hemólise destes ao atravessar um canal de 5 µm, para uma pressão crítica de 2,8kPa. Para o mesmo canal, os

eritrócitos inalterados nunca sofreram danos ao atravessar a constrição, sugerindo que a hemólise ocorre para

eritrócitos com menor deformabilidade (eritrócitos esféricos) [36].

12

Um resultado qualitativo, mas relevante para o presente trabalho, é a descrição do fenómeno da hemólise

feita por Abkarian et al (2008), que se apresenta de seguida acompanhado da Figura 1.6. Esta descrição é feita

para os casos em que a célula entope o canal, levando a uma diminuição do caudal, à medida que a perda de

pressão aumenta.

Assim que esta atinge o seu valor máximo é descrito o surgimento de um poro ou rotura na frente da

célula, onde os autores prevêem que a tensão de corte seja máxima. A partir deste poro o citoplasma sai em

forma de jacto do interior da célula, acompanhada de um decréscimo da perda de pressão. A célula vai

esvaziando e é transportada pelo escoamento.

Figura 1.6 – a) Hemólise de uma célula tornada esférica numa constrição de secção 5µm×5µm. b) Velocidade do eritrócito a tracejado e da partícula traçadora a cheio. c) Variação da perda de pressão induzida pelo trânsito da célula mostrada em a) [36].

1.3.6 Contribuições do trabalho

A importância da microfluidica no futuro das análises clínicas foi aqui mencionada. O desenvolvimento de

ferramentas eficazes na medição da deformabilidade eritrocitária em ambiente microfluidico é o primeiro

passo a dar para a utilização deste parâmetro como ferramenta de diagnóstico.

Nesse âmbito, encontra-se na literatura a medição de parâmetros como a distância à parede [29], o ID

[18], a orientação [22] ou a queda de pressão induzida pela passagem de um eritrócito numa constrição

inferior ao tamanho deste [35, 36]. Alguns trabalhos reúnem inclusivamente dois parâmetros como o volume e

o ID [30] ou a distância à parede e o ID [25]. No entanto, foi identificada uma escassez de estudos que

medissem simultaneamente mais do que dois parâmetros. Desta forma o presente estudo fornece medições

abrangentes da deformabilidade, medindo simultaneamente o ID, o diâmetro, a orientação e a distância à

parede, permitindo avaliar a possível existência de relações entre eles. O potencial demonstrado pela utilização

de mais de dois parâmetros da deformabilidade diferentes (e.g. o estudo de Won et al. (2007) que relaciona

13

três parâmetros diferentes, ID, tempo de trânsito e tempo de recuperação de forma na distinção entre sangue

saudável e sangue com leucemia) motiva o preenchimento da lacuna identificada na literatura.

Este tipo de análise, que mede simultaneamente centenas de eritrócitos, tem grande interesse do ponto

de vista clínico. No entanto, a compreensão da deformabilidade à escala individual é fundamental no

desenvolvimento de dispositivos cada vez menores e mais precisos, assim como na interpretação dos

resultados das análises clinicas. De forma a obter uma análise da deformação individual do eritrócito foram

utilizados microcanais com constrições de dimensão da ordem de grandeza do eritrócito, onde é possível seguir

manualmente cada eritrócito, observando a sua deformação ao longo do trajecto percorrido.

Estes ensaios permitiram visualizar ainda a hemólise de vários eritrócitos. Com o desenvolvimento de

microcanais cada vez mais pequenos e complexos, o estudo da hemólise nestes ambientes torna-se essencial

para poder desenhar dispositivos eficazes que permitam manobrar os eritrócitos sem os danificar.

No grupo de investigação em que este trabalho foi desenvolvido, ele é pioneiro no projecto e fabrico de

microcanais com dimensão inferior a 10 µm, contribuindo com a elaboração de um procedimento empírico

experimental que permitirá abrir o caminho do estudo de fenómenos a uma escala cada vez menor.

Foi ainda desenvolvido um programa em Matlab® que realiza todo o processamento digital de imagens

descrito na presente tese. O utilizador é convidado a introduzir vários parâmetros que ajustam o

processamento às necessidades em questão através de diversos métodos. O processamento automático

requer a introdução de alguns parâmetros e da directoria de imagens, sendo o resultado final mostrado ao

utilizador sem nenhuma necessidade de intervenção do mesmo. O processamento manual de eritrócitos

fornece ao utilizador a possibilidade de ver os resultados sobrepostos a cada imagem, permitindo que este a

edite conforme achar necessário, dando mais flexibilidade ao programa e uma avaliação intuitiva, imagem a

imagem, do que está a ser medido.

O programa é ainda capaz de organizar graficamente os resultados obtidos, e exportá-los para o Microsoft

Excel para posterior tratamento que não esteja contemplado no programa. O processamento digital de

imagens permitirá ao grupo de investigação realizar medições como aquelas aqui apresentadas, de forma

praticamente autónoma, sendo a possibilidade de expansão e melhoramento do programa desenvolvido um

desafio interessante para seguir vias mais refinadas na análise da deformação eritrocitária.

1.3.7 Estrutura da dissertação

Este trabalho encontra-se dividido em seis capítulos. No primeiro foi introduzido o tema do trabalho,

fazendo uma perspectiva das suas motivações. Foram ainda expostos os componentes do sangue, com especial

destaque para os constituintes que afectam a deformabilidade eritrocitária. Uma revisão bibliográfica foi

apresentada de seguida, com os parâmetros determinantes da deformabilidade eritrocitária e as técnicas para

a medir, sendo também expostos alguns resultados de deformabilidade obtidos em microcanais semelhantes

aos utilizados neste trabalho. Seguiu-se uma breve revisão dos métodos de processamento digital de imagem

utilizados em trabalhos semelhantes encontrados na literatura, e finalmente, uma pequena revisão do estudo

da hemólise utilizando microcanais.

No segundo capítulo apresentar-se-á a componente experimental deste trabalho, com a usual listagem

dos materiais e equipamentos utilizados. A descrição dos microcanais utilizados é apresentada, assim como o

14

aperfeiçoamento do método de fabrico utilizado nos microcanais. Segue-se a apresentação dos procedimentos

experimentais adoptados.

O terceiro capítulo dedica-se ao processamento digital de imagem, apresentando o algoritmo do

programa desenvolvido em ambiente Matlab® para o efeito. Ao longo deste capítulo são apresentados os

métodos utilizados assim como explicadas as várias técnicas de processamento de imagem adoptadas.

O quarto capítulo descreve a tentativa de medir a perda de pressão no microcanal de constrição,

apresentando o trabalho desenvolvido nesse sentido e discutindo as razões que impossibilitaram esta medição.

O quinto capítulo é reservado à apresentação e discussão dos resultados obtidos. Devido ao carácter dos

resultados obtidos optou-se por apresentar primeiro os resultados para o microcanal de válvula, fazendo a sua

discussão após apresentar todos os resultados obtidos com este canal. Seguindo a mesma lógica, são

apresentados os resultados obtidos no microcanal de constrição e posteriormente discutidos. Por fim é

apresentada e discutida uma análise da hemólise registada nos microcanais de constrição.

O último capítulo expõe as conclusões e sugestões de trabalho futuro, apresentando uma síntese

conclusiva do trabalho desenvolvido e indicando esforços adicionais de investigação que podem ser feitos no

seguimento do trabalho aqui apresentado.

15

2. Instalação Experimental

Este capítulo descreve o trabalho experimental realizado em laboratório. Aqui encontram-se enumerados

os equipamentos utilizados, assim como uma breve descrição dos mesmos. Seguidamente são apresentados os

procedimentos experimentais para o fabrico dos microcanais de constrição assim como para a obtenção dos

resultados a analisar no capítulo 5.

2.1 Materiais e Equipamentos

A natureza do trabalho experimental desenvolvido nesta tese permite distinguir duas fases distintas

realizadas no laboratório: uma primeira fase que se refere ao fabrico dos microcanais para os ensaios a

efectuar, e uma outra referente à caracterização da forma dos eritrócitos em escoamento. Optou-se por se

utilizar estas duas categorias na destrinça dos materiais e equipamentos utilizados para facilitar a organização

do texto, sendo ainda possível para a última categoria distinguir entre material destinado à manipulação do

fluido de trabalho (sangue de cavalo) e o sistema óptico utilizado na captura de imagens.

2.1.1 Fabrico dos microcanais

O fabrico dos microcanais é feito por duas etapas. A primeira consiste na obtenção de um molde com a

geometria dos canais. Este molde é criado através da colocação de uma resina especial sobre um substrato

(wafer), que por intermédio de uma fotomáscara é exposta a uma fonte de radiação ultravioleta. Esta

exposição altera quimicamente a resina, e após um processo de revelação, a resina não exposta à radiação UV

é dissolvida, criando assim o molde e completando a primeira etapa do processo. A segunda etapa consiste em

verter um polímero misturado com um agente que promove a sua gradual solidificação sobre o molde, de

forma a obter o molde negativo da etapa anterior. Após a solidificação do polímero este é separado do molde,

recortado e ligado a lamelas de vidro por intermédio de um tratamento de plasma, selando o canal entre o

polímero e o vidro e concluindo o processo de fabrico.

Este processo requer a utilização de equipamento especializado, assim como materiais e reagentes

adequados. De seguida é feita a exposição dos equipamentos e materiais considerados mais relevantes.

Armário de Fluxo Laminar Vertical ESCO AVC-4D1

Este equipamento permite criar um ambiente limpo com baixa concentração de poeira microscópica. Em

particular, este é um equipamento de classe 4 conforme a norma ISO 14644-1, certificando que no máximo

existem 83 partículas por metro cúbico cujo diâmetro é superior a 1µm.

O spin-coater, placa de aquecimento, UV-KUB e o gerador de alta frequência foram colocados dentro

deste armário. A Figura 2.1 mostra uma fotografia do armário descrito.

Balança Denver Instruments TC-403

Este equipamento foi utilizado para realizar a mistura entre o PDMS e o agente de cura, e tem um limite

máximo de 410g, sendo a sua menor escala de 0,001g.

16

Figura 2.1- Armário de Fluxo Laminar Vertical ESCO AVC-4D1

Wafer

A wafer também chamada de substrato ou bolacha, é um disco circular de vidro com um diâmetro de

cerca de 10cm, utilizado como suporte para o fabrico do molde. Na Figura 2.2 encontra-se uma imagem de

uma wafer utilizada neste trabalho.

Figura 2.2 - Wafer de vidro utilizada no processo de fabrico como suporte do molde. São visíveis alguns resíduos de PDMS.

Spin-Coater SPS Spin 150

A função deste equipamento (que é mostrado na Figura 2.3) é realizar uma distribuição homogénea de

resina sobre a wafer com uma altura bem definida. A wafer é centrada sobre um eixo rotativo ao qual é fixa

por intermédio de uma bomba de vácuo. A rotação imposta cria uma força centrífuga que expele o excesso de

resina da wafer para um recipiente no interior do equipamento. Assim, a regulação da altura da camada de

resina pode ser feita ajustando a velocidade de rotação, sendo disponibilizada pelo fornecedor da resina a

relação entre ambos. Este aparelho é programável e permite definir a velocidade de rotação, a sua duração e a

aceleração usada, assim como criar ciclos com diferentes parâmetros. A velocidade máxima é de 10000rpm e a

aceleração de 2000rpm2.

Figura 2.3- Spin Coater SPS 150 Spin com uma wafer circular a preto no seu interior

Chloé UV-KUB

Este equipamento ilustrado na Figura 2.4 permite expor a wafer a uma fonte programável de radiação

ultravioleta num ambiente hermeticamente fechado. É possível escolher entre exposição contínua ou pulsada,

17

assim como determinar o tempo de cada pulso e a intensidade ao nível da wafer. Com uma intensidade

máxima de 25 mW/m2, a fonte emite na gama λ=365nm±10% (UV) atingindo uma resolução máxima de 2µm.

Figura 2.4- UV-KUB

Gerador de corrente de alta frequência BD-20 da Electro-technic Product, INC

Este equipamento, mostrado na Figura 2.5, é utilizado para aplicar um tratamento de plasma à superfície

do PDMS, cuja função é alterar a sua estrutura local permitindo fazer uma ligação permanente entre o PDMS e

a lamela de vidro utilizada para selar o canal. Existem três peças com geometrias diferentes que podem ser

colocadas na arma. A que se encontra colocada na Figura 2.5 é a geometria que foi utilizada no presente

trabalho.

Figura 2.5- Gerador de corrente de alta frequência utilizado para aplicar o tratamento de plasma. Os três terminais encontram-se na figura, sendo utilizado aquele que está colocado na arma.

Fotomáscara

Este componente é colocado entre a wafer e a fonte de radiação ultravioleta, permitindo uma exposição

selectiva da resina. As especificações de cada máscara estão fortemente ligadas ao tipo de projecto a realizar,

nomeadamente ao tamanho da menor estrutura pretendida (dimensão crítica), tolerância permitida, tipo de

resina utilizada, entre outras.

A máscara utilizada encontra-se na Figura 2.6, e foi produzida pela empresa JDPhotomask (Inglaterra).

Esta é feita em vidro de cal sodada banhada a crómio com tratamento anti-reflector. Este material permite

exposições para gamas acima dos λ=350nm. As tolerâncias utilizadas no fabrico desta máscara foram de 0,6 µm

para a dimensão crítica (4 µm) e 0,85 µm para as restantes dimensões. Esta máscara permite passar 6

microcanais para uma wafer de 10cm.

Figura 2.6 - Fotomáscara utilizada neste trabalho.

18

Resina foto-resistente

Esta resina é colocada sobre a wafer e, através de um processo de exposição ultravioleta e consequente

revelação, permite criar estruturas definidas pela zona exposta a esta fonte radiativa. A resina utilizada tem o

nome comercial de K-CL-010 e é fornecida pela Kloé (França). Esta é uma resina negativa, ou seja, a parte que

não é exposta ao ultravioleta é solúvel no agente de revelação (álcoois). As alturas permitidas por esta resina

variam entre os 2 e os 10µm. As restantes especificações técnicas, assim como a variação da altura em função

da velocidade de rotação do spin coater ou o tempo de exposição em função da altura utilizada podem ser

consultados na documentação do fornecedor [37].

Polidimetilsiloxano (PDMS)

Este polímero é um líquido fornecido em conjunto com um agente de reticulação polimérica. Uma vez

adicionados os reagentes começa o processo de ligação cruzada que irá formar a borracha sólida que constitui

os microcanais. Este polímero é o constituinte dos microcanais utilizados e fabricados.

2.1.2 Caracterização de glóbulos vermelhos em escoamento: Instalação Experimental

A instalação experimental, que se encontra esquematizada na Figura 2.7, pode ser dividida nos

componentes relacionados com o sistema óptico e os relacionados com a manipulação de fluido.

Na Figura 2.7 apresenta-se a instalação experimental utilizada para efectuar a caracterização da forma dos

eritrócitos em escoamento nos microcanais. Esta instalação pode ser decomposta num sistema óptico,

relacionado com a aquisição de imagens, e num sistema de manipulação de fluido, responsável pelo

escoamento imposto no microcanal.

O sistema óptico utilizado consiste no conjunto microscópio, câmara CMOS, software de aquisição de

imagens e fonte de luz fria, enquanto o sistema de manipulação abrange a bomba de seringa, a própria seringa.

Inicialmente são expostos os constituintes do sistema óptico e, posteriormente, os equipamentos que são

abrangidos pela categoria de manipulação de fluido assim como a descrição do fluido de trabalho utilizado.

Figura 2.7- Instalação experimental utilizada na aquisição de imagens do escoamento dos eritrócitos em microcanal.

19

2.1.2.1 Ensaios em microcanais: Sistema óptico

O sistema óptico utilizado consiste no conjunto microscópio, câmara CMOS, software de aquisição de imagens e fonte de luz fria. Estes equipamentos serão brevemente descritos nesta secção.

Microscópio Olympus® CX41 UIS2

Este microscópio foi utilizado em conjunto com as duas objectivas PlanC N da mesma marca apresentadas

na Tabela 2.1.

Tabela 2.1- Características das objectivas do microscópio utilizadas

Lente NA Distâncial Focal[mm]

PlanC N 40x 0,65 0,6 PlanC N 100x 1,25 0,13

A objectiva com uma ampliação de 100× requer a utilização de um óleo de imersão, de modo a aumentar

a distância focal e assegurar a integridade da lente. O óleo usado foi o Olympus® 8CC, que tem um índice de

refracção de 1,518 (a 23°C). No caso da objectiva de 40×, o uso de óleo não é necessário e o fluido entre o

objecto a analisar e a objectiva é o ar (índice de refracção de 1,003 a 23°C).

Câmara CMOS Optronis® CR600x2

Esta câmara é utilizada para a aquisição de imagens e encontra-se montada no microscópio mencionado

anteriormente, possuindo uma memória de 4GB. A sua resolução máxima é 1280x1024 pixel para a qual

apresenta um frame rate máximo de 500fps. Estes dois parâmetros estão correlacionados negativamente, já

que para obter um maior frame rate é necessário reduzir a resolução da imagem obtida e, consequentemente,

estabelecer um compromisso entre resolução temporal e resolução espacial (vide Tabela 2.2). O software de

aquisição utilizado em conjunto com esta câmara é o Timebench 2.3.1 desenvolvido pela Optronics. Este

software permite regular vários parâmetros da câmara como a frame rate, o tempo de exposição, a resolução,

entre outros.

Tabela 2.2- Frame rate máxima para várias resoluções da câmara CMOS.

Fonte de luz fria Schott KL 1500 LCD

Este equipamento, que se mostra na Figura 2.8, utiliza uma lâmpada de halogénio como fonte de luz fria,

permitindo regular a sua dispersão e intensidade. Foi utilizado um aparelho com duas garras flexíveis

posicionadas de modo a iluminar de forma adequada os microcanais.

Resolução Frame rate máxima [fps]

1280x1024 500 800x600 1200 512x512 2000 256x256 6350 128x128 16000

20

Figura 2.8- Fonte de luz fria com garras flexíveis.

2.1.2.2 Ensaios em microcanais: Fluido de trabalho e sua manipulação

Nesta secção descrevem-se os equipamentos utilizados durante a caracterização da forma eritrocitária

nos escoamentos em microcanais para manipular o fluido de trabalho, assim como uma breve descrição do

fluido de trabalho utilizado (sangue).

Sangue

Foi utilizado sangue desfibrinado estéril de cavalo para realizar os ensaios. O processo de desfibrinação

remove agentes responsáveis pela coagulação (fibrina), permitindo a conservação do sangue sem a adição de

anticoagulantes. O sangue utilizado foi disponibilizado pela empresa Probiológica, tendo sido conservado

hermeticamente fechado a 4°C, conforme indicação do fornecedor, e utilizado à temperatura ambiente. O

sangue foi recebido no dia 12 de Janeiro, tendo os ensaios sido realizados nos dias 15 e 31 do referido mês. Na

literatura, o diâmetro médio dos eritrócitos do sangue de cavalo oscila entre 5,2 e 6 µm[38-40].

Bomba de seringa

O modelo utilizado para bombear o sangue de uma seringa fazendo-o escoar através dos microcanais foi a

Nexus 6000 da Chemyx Syringe Pump Company® ( Figura 2.9). Esta bomba funciona impondo uma deslocação

ao êmbolo de uma seringa colocada no seu suporte fixo. Esta deslocação é determinada pelo software da

própria bomba de forma a garantir o caudal seleccionado pelo utilizador após ser dado a conhecer o diâmetro

interno da seringa utilizada. Este diâmetro interno pode ser escolhido de uma base de dados existente na

bomba ou introduzido manualmente. Na Tabela 2.3 encontram-se as especificações técnicas relevantes da

bomba.

Figura 2.9 - Nexus 6000 da Chemyx Syringe Pump Company® com uma seringa colocada.

A seringa utilizada é de vidro com volume máximo de 1mL da marca Hamilton GASTIGHT® Syringes, 1000

Series. Este modelo está listado na base de dados da bomba com um diâmetro interno de 4,610mm.

21

Tabela 2.3 - Características da bomba de seringa utilizada.

Característica Valor

Volume de seringa 0,5 μL – 200 mL Força Linear 204 – 250 kg

Precisão ±0,35% Erro de Replicabilidade ±0,05%

Caudal Mínimo 1,56 pL/min Caudal Máximo 200 mL/min

2.2 Microcanais: geometria e fabrico

O objectivo deste trabalho é estudar a deformabilidade dos eritrócitos em dois casos diferentes:

escoamentos em canais com dimensão superior ao diâmetro do eritrócito, e escoamentos em canais cujo

tamanho é da ordem de grandeza do diâmetro do eritrócito. Para o primeiro caso foi utilizado um canal com

uma válvula (expansão seguida de contracção) já existente no laboratório, permitindo efectuar medições na

expansão (

) e no canal (

). O segundo caso, devido à necessidade de um microcanal

com dimensão da ordem do eritrócito, levou ao projecto e fabrico de microcanais de constrição.

Nesta secção apresentam-se as características geométricas dos canais utilizados, assim como os locais

onde se realizou a aquisição de imagens. O processo de tentativa e erro utilizado para aperfeiçoar o fabrico dos

microcanais de constrição é também discutido.

2.2.1 Microcanal com válvula

Uma parte do trabalho foi realizada num microcanal já existente no laboratório. Este microcanal é

constituído por uma entrada e uma saída de fluido ligadas por um canal rectangular recto. A meio deste canal

rectangular encontra-se uma válvula cujas dimensões são apresentadas na Figura 2.10. As zonas do canal onde

foi feita aquisição de imagens encontram-se na mesma imagem e serão explicadas de seguida.

Figura 2.10- Microcanal com válvula e suas dimensões. O canal tem uma altura h≈100µm. Encontram-se representadas as zonas onde foi feita aquisição de imagem. Zona A: Localiza-se dentro da válvula. Zona A2: Localiza-se dentro da válvula. Zona B: Localiza-se sobre a contracção da válvula. C: Localiza-se sobre o canal a jusante da contracção.

22

Zonas A e A2

As zonas A e A2 estão localizadas dentro da válvula, em locais onde as linhas de corrente se esperam ser

paralelas à parede do canal, tendo tensões de corte semelhantes. Entre as três zonas estudadas (A,B e C) é

aquela onde os eritrócitos serão sujeitos a uma menor tensão de corte. O objectivo é analisar o maior número

de eritrócitos possível, de forma a estabelecer parâmetros médios que representem o seu comportamento

nesta zona. Na realidade, a deformabilidade é analisada em duas situações, hematócrito reduzido (Zona A) e

hematócrito elevado (Zona A2).

A zona A2 é ligeiramente a jusante da zona A. Esta diferença de posicionamento está relacionada com

assimetrias na distribuição dos eritrócitos pelo canal, introduzidas pela formação de bolhas de ar nos cantos da

válvula. Este fenómeno encontra-se discutido em 5.1.3.1.

Outra diferença entre a aquisição feita nestas zonas é a idade do sangue, apesar de ambas escoarem

amostras da mesma colheita, a aquisição da zona A é feita 15 dias mais tarde do que a aquisição na zona A2.

Assim da zona A2 para a zona A variou o hematócrito e o tempo de armazenamento do sangue, para o mesmo

caudal de 1µL/min, permitindo averiguar os efeitos destas variáveis nos parâmetros medidos. Variando dois

parâmetros é necessária alguma cautela na análise dos resultados obtidos, conforme descrito em 5.1.3.

Zona B

Centrada na contracção válvula, esta zona B foi utilizada para fazer o seguimento manual de eritrócitos à

medida que estes saem da válvula para o canal a jusante. Os caudais testados foram 1 µL/min e 5 µL/min, e o

tempo de armazenamento 3 e 18 dias. Ao contrário das outras zonas, o objectivo deste estudo é perceber

como é que os parâmetros que caracterizam a deformabilidade dos eritrócitos variam à medida que estes

percorrem a sua trajectória, sendo sujeitos a um gradiente de velocidade e pressão transversal que variam com

o tipo de trajectória. Os ensaios desta zona foram feitos com baixo hematócrito para possibilitar o seguimento

manual dos eritrócitos.

Zona C

Esta zona foi escolhida no canal, a jusante da válvula, onde se espera um escoamento sem perturbações

(linhas de corrente paralelas). O estudo desta zona C, como o da zona A, pretende determinar parâmetros

médios representativos do comportamento dos eritrócitos nesta zona. Assim torna-se possível estabelecer

uma comparação entre ambas as zonas, onde a principal diferença se considera ser uma maior tensão de corte

que actua na zona C em relação à zona A.

2.2.2 Microcanal de constrição

Estes canais foram desenhados e projectados com o objectivo de observar e quantificar a deformação de

eritrócitos em canais cujas dimensões são da ordem de grandeza da própria célula. Assim, a sua região de

interesse, inspirada por Abkarian et al[35], foi desenhada com esse intuito e as suas dimensões de projecto

encontram-se na Figura 2.11. Uma possibilidade desta geometria seria a medição da queda de pressão induzida

pelo trânsito de um glóbulo na constrição, através de um micromanómetro diferencial[35, 41, 42]. Esta

possibilidade não foi concretizada conforme explicado no capítulo 4.

23

Figura 2.11- Dimensões de projecto da zona de aquisição de imagem do microcanal de constrição com o software Clewin 5. Durante essa aquisição o escoamento dá-se da direita para a esquerda. A altura do microcanal são 4µm.

O canal fabricado e, efectivamente utilizado durante a aquisição de imagens feita nesta geometria, tem

dimensões ligeiramente diferentes. A dimensão de maior relevância para o ensaio é a largura do canal, cujo

valor de projecto é 4µm, no entanto o valor medido do canal utilizado ronda os 7µm. Esta discrepância é

justificada por oscilações indesejadas no método de fabrico.

2.2.3 Método empírico desenvolvido para o fabrico dos microcanais de constrição

Para obter o procedimento experimental exposto em 2.3.3, foi necessário um longo processo empírico de

tentativa e erro até ser possível estabilizar o procedimento e obter microcanais utilizáveis e operacionais. Esta

secção aborda o progresso feito e as principais dificuldades encontradas nesse processo.

Para o fabrico destes microcanais foram utilizadas técnicas de litografia de polímeros, denominadas

técnicas de soft lithography. Esta técnica pode ser dividia em duas etapas: a obtenção de um molde em resina

com a forma dos canais pretendidos, e a produção dos canais propriamente ditos utilizando o molde fabricado.

2.2.3.1 Fabrico do molde

Na Figura 2.12 encontra-se o esquema das fases necessárias à obtenção do molde de fabrico do

microcanal.

Partindo de uma wafer limpa (Figura 2.12.a), é aplicada uma camada homogénea de resina por intermédio

do spin coater onde, por indicação do fornecedor de resina, a uma velocidade de rotação de 1500rpm durante

30 segundos corresponde uma altura de resina de 4 µm (Figura 2.12.b).

Após a aplicação da resina é necessário evaporar os solventes líquidos da mesma, sendo para isso

necessário aplicar um tratamento térmico chamado soft-bake. As características deste tratamento dependem

do tipo de resina e da sua espessura, sendo esse tratamento sugerido pelo fabricante.

A fase seguinte é a exposição à radiação ultravioleta (UV). Nesta fase, através da aplicação de uma

máscara, é possível realizar uma exposição selectiva da resina (Figura 2.12.c). A resina exposta à radiação UV

forma ligações cruzadas que fortalecem a sua estrutura. Desta forma, por intermédio de um agente que

24

dissolve a resina não ligada, é possível remover a resina que não foi exposta à radiação ultravioleta e obter um

padrão em relevo na resina (Figura 2.12.d), concluindo assim o molde.

As fases mais problemáticas da obtenção do molde foram o soft-bake e a obtenção duma máscara com a

precisão necessária cujos custos não fossem proibitivos. Estas duas questões serão explicadas de seguida.

Figura 2.12- Esquema da obtenção do molde sobre a wafer. a) Limpeza da wafer b) Aplicação da resina através do spin-coater c) Exposição a radiação UV por intermédio de uma fotomáscara d) Utilização de um agente revelador para remover a resina exposta à radiação UV.

Foto-máscara

Restrições financeiras nos órgãos centrais do IST face a aquisições motivaram a procura de alternativas às

máscaras usuais de crómio utilizadas para as dimensões bastante reduzidas dos microcanais envolvidos neste

projecto. A alternativa mais explorada foi a utilização de microfilmes, uma vez que esta já foi aplicada com

sucesso, conforme vem descrito na literatura, para dimensões maiores[43-46]. Esta alternativa consiste numa

revelação fotográfica em formato A3 do desenho do microcanal que será posteriormente reduzida

fotograficamente 21 vezes para um formato de microfilme.

Figura 2.13- Foto-máscaras testadas. a) A primeira foto-máscara feita em suporte de microfilme. b) A foto-máscara no mesmo suporte após adaptação do processo comercial da empresa RSF telecomunicações. c) Foto-máscara de crómio comprada e utilizada para fabricar o molde. d) Máscara construída em papel normal revestido em papel de alumínio , com os microfilmes a preto colados a 3 lamelas da vidro.

25

O processo de produção de microfilme foi desenvolvido em parceria com a empresa RFS

telecomunicações, e foi adaptado para a obtenção de uma foto-máscara. Apresentam-se na Figura 2.13 (a,b)

duas máscaras produzidas através do uso dessa técnica.

Os moldes que foram produzidos com estas máscaras feitas a partir de papel de alumínio e microfilmes

(Figura 2.13.d) não obtiveram resultados satisfatórios, dando origem a canais parcialmente obstruídos e

extremamente irregulares sem o aparecimento da constrição no molde.

Este método demonstrou produzir máscaras utilizáveis para canais de largura superior a 50 µm para

aplicações em que a precisão não seja determinante. No entanto, para as dimensões pretendidas neste estudo,

a solução encontrada acabou por ser a compra, a título pessoal, da máscara de crómio descrita em 2.1.2, que

se apresenta para efeitos de comparação na Figura 2.13.c.

Soft-Bake

O fornecedor da resina sugere um tratamento em forno de convecção consoante a altura da camada de

resina, sendo sugerido o tratamento de 3 minutos a 60°C para alturas inferiores a 5µm. Dado que este passo foi

efectuado numa placa de aquecimento houve a necessidade de ajustar a temperatura e a duração do processo.

O objectivo do referido tratamento é aquecer a resina o suficiente para os solventes evaporarem, mas sem

secar demasiado a resina. Após várias tentativas empíricas, conclui-se que duplicar o tempo sugerido pelo

fabricante mantendo a temperatura a 60°C, era a melhor alternativa.

Foi necessário realizar um total de 11 wafers até obter um molde com 5 dos 6 canais correctamente

representados, tendo sido este o molde utilizado como ponto de partida para a etapa seguinte do processo de

fabrico. Na

Figura 2.14 apresenta-se a evolução da qualidade do molde até chegar ao resultado final.

Figura 2.14- Evolução do processo de fabrico do molde. a) Não existe constrição e os canais estão interrompidos b) Os canais apresentam alguns defeitos mas têm continuidade até à constrição c) Apenas a constrição não é passada para o molde d) Molde em perfeitas condições.

2.2.3.2 Obtenção dos canais

Nesta fase é utilizado o molde produzido para criar réplicas em PDMS que serão posteriormente coladas

ao vidro, formando o canal. Na Figura 2.15 estão apresentadas as etapas desta fase. O PDMS necessita de ser

26

preparado, misturando 10 partes da base com 1 parte do agente de reticulação polimérica. Após obter uma

mistura homogénea é necessário colocá-la em vácuo para remover as bolhas formadas devido à agitação.

Vertendo a mistura sem bolhas sobre o molde é feita uma cura do PDMS que acelera o processo de

solidificação. Após a solidificação do PDMS sobre o molde este é removido, ficando o PDMS com a forma do

molde na sua superfície inferior.

Os furos de ligação às tubagens de entrada e saída do canal são feitos sobre os locais apropriados dos

canais e, após tratamento de plasma, o PDMS é ligado irreversivelmente a uma lamela de vidro, fechando-se

assim o canal.

O principal problema encontrado neste processo foi a ligação PDMS-vidro, devido ao colapso do tecto do

canal, ficando colado ao vidro (ver Figura 2.16).

Figura 2.15-Esquema da produção dos microcanais em PDMS.

Colapso dos canais

Este fenómeno mostrou-se particularmente problemático nas zonas de entrada e saída, devido à razão

elevada entre o diâmetro dos círculos e a altura do canal (

), sendo na literatura aconselhado a evitar

razões superiores a 4 precisamente por este motivo [47].

Várias alterações empíricas foram sendo introduzidas no processo até se conseguir algum sucesso na

prevenção deste colapso, embora se tenha verificado que, em média, por cada cinco canais produzidos, um

colapsa. Estas alterações prenderam-se principalmente com o processo de cura e tratamento de plasma. A cura

(vide Figura 2.15) é iniciada assim que o PDMS é colocado sobre o molde, sendo este colocado na placa de

aquecimento por 4 horas a 60°C. No entanto, a separação entre o PDMS e o molde só é feita 20 horas após o

tratamento térmico, ficando esta etapa com uma duração total de 24horas.

O tratamento de plasma é aplicado de igual forma sobre a superfície do PDMS e do vidro e após testar

vários tempos de exposição (desde 10 segundos a 5 minutos), optou-se por aplicar uma duração de 30

segundos de plasma em cada superfície[48]. Para prevenir o colapso motivado por acção gravítica, a ligação foi

feita colocando o vidro sobre o PDMS, aplicando apenas uma ligeira pressão para motivar a adesão entre as

superfícies. Após a adesão inicial estar completa os canais são colocados na placa de aquecimento,

previamente revestida a alumínio para prevenir a colagem do PDMS à placa. Este tratamento térmico é

27

aplicado durante 3 horas a 60°C para fortalecer a ligação. Os canais são colocados na placa térmica novamente,

com o vidro sobre o PDMS para evitar o colapso induzido pela gravidade.

Durante esta segunda fase do processo foram necessários 10 tentativas, num total de 60 microcanais

produzidos, até se conseguir produzir 4 chips utilizáveis a partir dos 5 canais correctamente representados no

molde. Apresenta-se na Figura 2.17 imagens da evolução deste processo.

Figura 2.16- Colapso da zona de entrada do microcanal. Na imagem da esquerda temos o canal em PDMS imediatamente antes de colar o vidro, apresentando alguns detritos decorrentes da furação. A imagem da direita foi obtida imediatamente após o processo de ligação, sendo possível notar o colapso total da estrutura de entrada.

Figura 2.17- Evolução do processo de obtenção de canais em PDMS. a) Colapso do microcanal b) Distorções e defeitos presentes no canal c) Pequeno defeito a encarnado na zona de análise d) Canal obtido sem nenhum defeito.

Fazendo um balanço ao processo de fabrico global, foram necessários 22 wafers (12 para obter o molde e

10 para obter os canais), 66 microcanais em PDMS, 138 inspecções ao desenho do canal entre moldes e

microcanais, totalizando um tempo estimado de 330 horas de tempo laboratorial para obter e aperfeiçoar o

método de fabrico, obtendo chips utilizáveis como o da Figura 2.18.

Figura 2.18 – Chip com o microcanal utilizável.

28

2.3 Procedimentos experimentais

Expostos os materiais e equipamentos mais relevantes utilizados neste trabalho, procede-se agora à

descrição dos diversos procedimentos experimentais utilizados em laboratório. Existem dois procedimentos

principais: a observação do escoamento dos eritrócitos em microcanais e o processo de fabrico.

2.3.1 Observação do escoamento dos eritrócitos em microcanais

Esta fase do trabalho experimental utiliza o equipamento esquematizado Figura 2.7 e requer alguns

cuidados de forma a evitar a existência de fugas ou a captura de imagens desnecessárias. De seguida

apresenta-se o procedimento experimental adequado de forma detalhada. Antes de iniciar este procedimento

é necessário verificar a limpeza do material, evitando poeiras ou humidades.

1. Preparação do sangue.

1.1. Ligar o armário de fluxo vertical e aguardar que este fique operacional.

1.2. Remover o sangue do frigorífico e encher a seringa com 1mL.

1.2.1. Garantir que não ficam bolhas dentro da seringa.

1.3. Colocar novamente o frasco do sangue no frigorífico.

1.4. Colocar a seringa numa posição vertical, com a agulha para cima, dentro do armário de fluxo vertical.

1.5. Aguardar cerca de meia hora.

2. Preparação do chip com o microcanal.

2.1. Colocar o microcanal no centro do adaptador do microscópio. Apertar os parafusos e confirmar a sua

correcta fixação.

2.2. Colocar o adaptador na platina do microscópio. Evitar que os tubos do microcanal fiquem presos na

platina. Confirmar a correcta colocação das pinças de forma a prender o adaptador.

3. Sistema de alimentação.

3.1. Mantendo a seringa na posição vertical, envolvê-la em papel absorvente e colocá-la na bomba de

seringa.

3.2. Verificar se a seringa ficou bem acondicionada com o papel e os fixadores da bomba.

3.3. Seleccionar o modo Standart Infusion, definir os parâmetros apresentados.

3.3.1. Escolher o diâmetro interno procurando o modelo da seringa na base de dados do seu

software.

3.3.2. Seleccionar um volume total a ser dispensado. Nunca seleccionar um valor igual ou superior ao

que está na seringa, uma vez que esta poderá partir-se.

3.3.3. Seleccionar o caudal pretendido.

3.3.4. Colocar o atraso a zero.

3.4. Avançar o motor até sair uma gota de sangue na ponta do tubo.

3.5. Ligar o tubo da seringa ao tubo do microcanal.

3.6. Ligar os tubos de saída do microcanal aos tubos que desemboquem num gobelé de descarga.

4. Sistema Óptico

4.1. Ligar o microscópio, a câmara CMOS e o software Timebench.

29

4.2. Verificar que o software está operacional e focar o microscópio na região de interesse do microcanal

utilizando a lente apropriada.

4.2.1. Ao utilizar a objectiva 100x colocar uma gota do óleo de imersão sobre o microcanal antes de a

focar.

4.2.2. Caso se utilize a objectiva de ampliação 100x colocar as garras da fonte de luz fria por baixo da

platina. Procurar colocar ambas as garras numa posição que provoque a menor sombra possível.

Utilizar a intensidade máxima.

4.3. No software seleccionar os parâmetros de captura de imagem adequados, nomeadamente a frame

rate, a resolução, o tempo de exposição, o ganho e o tempo de gravação.

5. Aquisição de imagens

5.1. Iniciar o funcionamento da bomba e verificar na imagem apresentada no computador se o

hematócrito é adequado ao objectivo pretendido. Caso seja superior (inadequado), aguardar até que

baixe o suficiente.

5.2. Assim que o valor do hematócrito for aceitável confirmar que a focagem está adequada e iniciar a

gravação.

5.3. Rever as imagens para aferir a sua qualidade.

5.4. Exportar as imagens para um dispositivo de armazenamento externo.

6. Novas gravações

6.1. Para realizar novas medições voltar ao ponto 4.2 e repetir.

7. Limpeza dos microcanais.

7.1. Substituir a seringa na bomba por outra com água destilada.

7.2. Fazer passar o volume de água necessário até que os tubos de descarga libertem água límpida.

7.3. Repetir 7.1 com uma seringa com ar.

7.4. Verificar no microscópio que o canal está seco antes de terminar de escoar ar pelos canais.

7.5. Armazenar os microcanais dentro do armário de fluxo vertical.

2.3.2 Processo de fabrico

Para o fabrico dos microcanais de constrição dupla foram utilizadas técnicas da litografia de polímeros,

denominadas por técnicas de soft lithography. Depois de estabelecidos os passos principais a seguir, cada

passo é progressivamente actualizado num processo de tentativa e erro até se obter o resultado final desejado,

sendo que o ponto de partida é o sugerido pelos fornecedores da resina e equipamentos.

Conforme descrito em 2.2.3, a técnica utilizada pode ser dividida em duas fases: O fabrico do molde e o

fabrico dos canais. A primeira fase envolve pequenas rotinas programadas no spin coater e no UV-KUB que

serão descritas de seguida. Após esta pequena exposição das rotinas segue-se o procedimento experimental

detalhado das duas fases do processo de fabrico.

Rotinas do spin coater

Existem duas rotinas que foram programadas no spin coater: uma tem como objectivo secar a wafer

enquanto a outra almeja uma distribuição da resina sobre a wafer que seja homogénea e de altura bem

30

definida. Esta última rotina tem dois momentos diferentes: o primeiro de duração reduzida que opera

enquanto se coloca a resina sobre a wafer, após o qual se segue a fase que determina em pormenor a altura

atingida pela camada de resina. Os parâmetros de cada rotina encontram-se na Tabela 5.

Tabela 2.4- Parâmetros que definem as duas rotinas que foram programadas e utilizadas no spin coater.

Rotina 1ª Etapa 2ª Etapa

Velocidade

[rpm] Aceleração

[rpm2]

Tempo [s] Velocidade

[rpm] Aceleração

[rpm2]

Tempo [s]

Secagem 5000 1000 60 - - - Resina 100 1000 4 1500 1000 30

Rotina do UV-KUB

A exposição da resina foto-resistente à radiação ultravioleta é feita por pulsos. Neste regime o software do

UV-KUB define um ciclo como um período de exposição UV (ON) seguido de outro período sem exposição

(OFF). Desta forma é necessário especificar a duração do período ON, do período OFF e o número de ciclos a

efectuar. Outro parâmetro ajustável é a intensidade da fonte radiativa, definido em percentagem da

intensidade máxima. Todos estes parâmetros estão expostos na Tabela 2.5.

Tabela 2.5- Parâmetros implementados na rotina de exposição no UV-KUB.

Tempo de Ciclo[s] Intensidade Número de Ciclos

ON OFF 2 1 92% 50

Concluída a apresentação das rotinas do UV-KUB e do spin coater apresenta-se o procedimento

experimental empiricamente aperfeiçoado, dividido entre a obtenção do molde e o fabrico dos chips com os

microcanais.

1. Obtenção do Molde

1.1. Preparação do substrato

Esta fase de limpeza da wafer é feita devido à reutilização de wafers com resina de outras

experiências. A solução de piranha utilizada é extremamente perigosa e existe o risco de explosão,

quer da solução quer dos gases libertados.

1.1.1. Remover os resíduos de resina da wafer a utilizar com uma lâmina de barbear.

1.1.2. Limpar a wafer com água e sabão até que todos os resíduos soltos pela lâmina desapareçam. É

de extrema importância que a wafer tenha o menor número de resíduos possíveis.

1.1.3. Secar a wafer no spin-coater.

1.1.4. Colocar 30 mL de ácido sulfúrico numa caixa de petri de pyrex, ou o volume adequado a

submergir totalmente a wafer. Não colocar a wafer dentro da caixa de petri. Aquecer na placa

de aquecimento a 65°C.

1.1.5. Adicionar lentamente 6 mL de peróxido de hidrogénio ao ácido, ou um quinto do volume de

ácido utilizado.

1.1.6. Colocar a wafer na solução de piranha e aguardar 15 minutos.

1.1.7. Remover a wafer e passar abundantemente por água destilada.

1.1.8. Secar a wafer no spin-coater com uma rotação de 5000rpm durante 30 segundos.

31

1.1.9. Desligar a placa de aquecimento e deixar a solução de piranha arrefecer e respirar durante uma

hora antes de a deitar fora.

1.2. Coating

1.2.1. Retirar o frasco de resina do congelador. Colocar dentro do armário de fluxo vertical e esperar

45 minutos.

1.2.2. Retirar 4 mL de resina para uma seringa evitando a formação de bolhas de ar. Colocar a seringa

em repouso na posição vertical com o êmbolo para cima. Evitar mexer na seringa.

1.2.3. Colocar a wafer já limpa centrada o melhor possível no spin-coater.

1.2.4. Colocar a seringa no local de dispensa no topo do spin-coater.

1.2.5. Iniciar a rotina do spin-coater e imediatamente esvaziar a seringa para a wafer.

1.2.6. Remover a seringa e aguardar pelo fim da rotina.

1.3. Soft-bake

1.3.1. Colocar a wafer com a resina virada para cima sobre a placa de aquecimento previamente

aquecida a 60°C durante 6 minutos.

1.3.2. Remover a wafer da placa de aquecimento e colocá-la centrada na gaveta do UV-KUB, deixando

arrefecer durante 10 minutos.

1.4. Exposição

1.4.1. Colocar a fotomáscara sobre a wafer, por cima da resina.

1.4.2. Correr a rotina de exposição.

1.4.3. Remover a máscara da wafer.

1.4.4. Efectuar a limpeza da máscara, passando-a abundantemente por metanol e acetona e secando-

a com ar presurrizado.

1.5. Revelação

1.5.1. Colocar a wafer numa caixa de petri e colocar propanol suficiente para submergir a wafer.

Agitar suavemente durante 30 segundos.

1.5.2. Passar a wafer abundantemente por propanol novo.

1.5.3. Repetir 1.5.1 e agitar até se conseguir visualizar os padrões na wafer.

1.5.4. Repetir 1.5.2 e secar no spin-coater com a rotina de secagem.

1.6. Inspecção

1.6.1. Colocar a wafer sobre o microscópio e verificar a qualidade do molde.

1.6.2. Desenhar com caneta de acetato na superfície inferior ao molde a localização dos padrões, e

indicar qual é o lado que tem molde.

1.7. Armazenagem

1.7.1. Colocar a wafer dentro de uma caixa de petri, sempre com o padrão na face superior. Fechar a

caixa de petri e colocá-la dentro do armário de fluxo vertical.

32

2. Fabrico dos microcanais

2.1. Preparação do PDMS

2.1.1. Colocar o canto de um saco de plático dentro de um gobelé preso com um elástico, como se

mostra na Figura 2.19.

Figura 2.19- Revestimento de um gobelé com um canto de um saco de plástico, preso por um elástico. Esta solução impede o PDMS de aderir ao gobelé.

2.1.2. Fazer a tara da balança com o gobelé supracitado em cima do prato.

2.1.3. Colocar 25 gr de PDMS dentro do gobelé e tarar novamente.

2.1.4. Colocar 5 gr do agente de reticulação polimérico.

2.1.5. Mexer a mistura com uma vareta revestida de forma semelhante ao gobelé, até se obter uma

mistura esbranquiçada cheia de bolhas de ar.

2.1.6. Colocar o gobelé em vácuo durante 1 hora até as bolhas desaparecerem e se obter uma mistura

transparente.

2.2. Verter sobre o molde

2.2.1. Forrar a caixa de petri mais pequena onde caiba a wafer-molde com plástico.

2.2.2. Colocar a o molde dentro da caixa de petri.

2.2.3. Verter a mistura sobre o molde tentando minimizar as bolhas formadas.

2.2.4. Colocar a caixa de petri no vácuo durante 30 minutos para remover as bolhas de ar.

2.3. Cura do PDMS

2.3.1. Colocar a caixa de petri numa placa de aquecimento a 60°C durante 4 horas. Garantir que esta

fica perfeitamente horizontal.

2.3.2. Aguardar 24 horas antes de passar para o passo seguinte.

2.4. Remoção do PDMS

2.4.1. Remover o plástico da caixa de petri e separá-lo do molde com PDMS.

2.4.2. Raspar o limite da wafer com uma lâmina de barbear para que o PDMS não agarre à parte

debaixo da wafer.

2.4.3. Marcar os limites de cada canal com caneta de acetato por cima do PDMS.

2.4.4. Afastar gentilmente os limites do PDMS da wafer, soltando uma pequena borda do PDMS a

toda a volta da wafer.

2.4.5. Separar suavemente o PDMS da wafer até a separação ficar completa.

2.4.6. Colocar o molde na caixa de petri utilizada para o seu armazenamento.

33

2.4.7. Colocar o PDMS sobre um tapete de corte com a superfície que estava em contacto com o

molde virada para cima. É de extrema importância que esta superfície esteja o mais limpa

possível: qualquer dedada, cabelo ou pequena partícula pode estragar o chip.

2.4.8. Recortar o PDMS com um X-acto limpo pelas marcações feitas em 2.4.3, obtendo seis chips

rectangulares.

2.5. Furação dos tubos de entrada e saída

2.5.1. Após encontrar o local de saída/entrada, fazer o furo de forma perpendicular à superfície.

2.5.2. Colocar os chips furados, virados para cima, dentro da gaveta do UV-KUB, uma vez que é

hermeticamente fechada pode servir de local seguro de armazenamento enquanto se prepara a

fase seguinte.

2.6. Ligação Vidro-PDMS

2.6.1. Limpar 8 lamelas de vidro com a solução de piranha sugerida em 1.1.4 do procedimento para o

fabrico do molde.

2.6.2. Colocar um chip e uma lamela sobre uma superfície isolante.

2.6.3. Passar com o gerador de corrente de alta frequência durante 30 segundos sobre cada superfície

com o arame onde o plasma é produzido a cerca de 1cm das superfícies. Acertar o potencial de

modo a obter uma produção de plasma o mais uniforme e estável possível.

2.6.4. Colocar as superfícies tratadas em contacto, colocando o vidro por cima do PDMS. Este passo

permite alguns segundos enquanto o reajustamento é possível antes da ligação se tornar

irreversível.

2.6.5. Forrar a placa de aquecimento a papel de alumínio e coloca-la a 60°C. Colocar os canais já

colados sobre a placa de aquecimento durante 3 horas.

2.6.6. Repetir para todos os chips de PDMS.

2.6.7. Deixar arrefecer os canais e marcá-los com uma caneta de acetato.

2.7. Inserir tubagem nos microcanais

2.7.1. Verificar que as ligações metálicas a serem utilizadas não estão entupidas.

2.7.2. Unir um dos lados da ligação metálica a um tubo com cerca de 6 cm de comprimento.

2.7.3. Colocar as ligações metálicas nos furos de entrada e saída, de forma a ficarem ligeiramente

acima do vidro. A inserção dessas ligações deve ser feita com cuidado para não danificar o

PDMS e evitar fugas.

2.7.4. Preparar uma pequeníssima quantidade de PDMS, sem necessidade de remover bolhas, e

colocar uma gota dessa mistura sobre o ponto onde a ligação penetra o PDMS, isolando assim

as ligações do canal à tubagem.

2.7.5. Colocar sobre a placa de aquecimento forrada a alumínio a 65° durante uma hora para curar o

PDMS isolador.

2.7.6. Repetir para todos os canais.

34

3. Processamento digital de imagens

Após a aquisição de imagens torna-se necessário submetê-las a um processo de tratamento digital de

modo a isolar a informação relevante. Este é o objectivo do processamento digital de imagens que foi

implementado neste trabalho e que será abordado neste capítulo.

A realização desta etapa foi feita totalmente em ambiente Matlab®, tendo sido desenvolvido um

programa que, consoante a análise a efectuar, corre de forma mais, ou menos, autónoma. Na Figura 3.1

encontra-se o fluxograma do programa implementado, cuja ordem e classificação servem como estrutura deste

capítulo, sendo expostos os princípios de processamento digital de imagens e as sub-rotinas utilizadas à

medida que vão sendo chamadas.

Começa-se por distinguir os dois casos de interesse para este trabalho no processamento de imagens: o

seguimento manual de eritrócitos, realizado quer no microcanal com uma válvula quer no microcanal de

constrição; e a caracterização de eritrócitos por zona, realizado apenas no microcanal com válvula. No primeiro

caso o objectivo é seguir no tempo, ou seja, em imagens sucessivas, o mesmo glóbulo enquanto este percorre

a sua trajectória caracterizando o eritrócito em função desse movimento. No segundo caso, o objectivo é

caracterizar uma larga amostra de eritrócitos, permitindo inferir estatisticamente os parâmetros que definem a

população amostrada.

3.1 Caracterização de eritrócitos por zona

O objectivo desta análise é obter alguns parâmetros que caracterizam os glóbulos vermelhos em

escoamento numa dada zona, sendo eles: o índice de deformação elíptico, o diâmetro circular, a orientação do

glóbulo em relação ao eixo do canal e, quando possível, a distância do centróide do eritrócito à parede. Os

parâmetros usados neste trabalho são os mais usuais na literatura, conforme abordado em 1.3.

Para atingir este objectivo é necessário obter uma máscara binária das imagens analisadas, filtrar o seu

ruído, e extrair a informação necessária para avaliar os parâmetros supracitados. Outro aspecto importante é a

utilização de um passo, introduzido pelo utilizador, entre as imagens a avaliar, com o objectivo de garantir que,

entre duas imagens processadas, não haja repetição de eritrócitos.

3.1.1 Obtenção da máscara binária

Esta etapa recebe a imagem original cuja unidade é o pixel, numa escala de cinzentos (0-255), que contém

a informação que se pretende extrair (eritrócitos), imersa num mar de ruído (informação sem interesse), como

aglomerados de eritrócitos, paredes do canal, o plasma, sujidades, etc.

Esta etapa é realizada de duas formas distintas, consoante o hematócrito do sangue das imagens em

análise.

Baixo hematócrito

Neste caso é feita a média de todas as imagens presentes na directoria, resultando numa imagem que

representa de forma fidedigna tudo o que não está em movimento na gravação (ruído), ou seja, representa o

segundo plano (Background) da imagem.

35

Figura 3.1- Fluxograma do programa desenvolvido em ambiente Matlab® para o processamento digital de imagens.

Assumindo que cada imagem é constituída por objectos em movimento que atravessam esse segundo

plano, ao subtrairmo-lo de cada imagem obtemos somente os objectos em movimento, o chamado primeiro

plano ou foreground. O facto de cada gravação ter menos de quatro mil imagens, torna exequível utilizar a

média aritmética de todas as imagens como forma de definir a imagem de segundo plano , onde

é a imagem original k, e os índices dos pixels que definem a matriz da imagem.

∑

(1)

36

Esta definição permite perceber a utilização deste método para as imagens de sangue com baixo

hematócrito. Quanto menor for o número de eritrócitos ao longo das k imagens, mais fidedigna é a

representação do plano de fundo, ou por outras palavras, menos poluído será o background pelos objectos em

movimento.

Definida a imagem do segundo plano, a determinação de cada pixel da máscara binária é

determinado da seguinte forma:

{ | |

| |

(2)

A existência de um limite mínimo, ou threshold, permite maior controlo do utilizador sobre a sensibilidade

do filtro aplicado. Factores como a existência de um segundo plano homogéneo, iluminação com pouca

variação ou inexistência de movimentos cíclicos no segundo plano, tornam possível a utilização do algoritmo

mais simples de subtracção do segundo plano. Na Figura 3.2 apresenta-se o resultado deste método aplicado

na zona A.

Figura 3.2- Método de substração do segundo plano. a) imagem genérica da zona A com eritrócitos em escoamento b) imagem de segundo plano calculada como a média aritmética de todas as imagens contidas na directoria. Apresenta-se a máscara binária obtida para vários valores do threshold. Note-se que quanto maior o valor do threshold mais informação é rejeitado como pertencente ao segundo plano.

Elevado hematócrito

Para as gravações com alto hematócrito, como a maior parte do canal está constantemente ocupada por

eritrócitos em movimento, a média de um pixel dentro do canal ao longo da gravação retorna um valor que

não representa o segundo plano, inviabilizando assim a utilização da técnica anteriormente descrita.

Neste caso é mais complexa a realização um processamento digital de imagens eficaz, reunindo uma série

de dificuldades, tais como: o objecto a segmentar ter uma intensidade que varia em toda a escala de cinzentos;

existem objectos a segmentar sobrepostos em diferentes planos assim como agregados no mesmo plano; as

imagens obtidas terem um fraco contraste.

37

Desta forma optou-se por se utilizar várias simplificações:

1. Apenas os eritrócitos que apresentam uma intensidade na escala de cinzentos inferior a certo limite

(thresholding) são validados, o que em termos mais intuitivos, significa que qualquer eritrócito mais

claro que o nível de cinzento estabelecido é descartado.

2. Todos os eritrócitos que se considerem agregados são também descartados, como de resto acontece

com todo o processamento digital de imagens desenvolvido neste trabalho.

3. Evitar lidar com objectos em diferentes planos focais, utilizando um threshold restrito que assegure

que a maior parte dos eritrócitos identificados pertencem ao primeiro plano (plano focal).

Antes de iniciar o processo de thresholding indicado em 1, optou-se por utilizar uma técnica de

melhoramento de contraste. O melhoramento do contraste de uma imagem realça pormenores que se

encontram menos claros, tornando possível utilizar um limite ou threshold de forma mais eficaz.

Antes de introduzir o método de melhoramento de contraste é necessário definir o conceito de

histograma de uma imagem. Como se pode ver na Figura 3.3, o histograma representa a distribuição dos pixels

por cada nível da escala de cinzento e, é comum ser apresentado num gráfico com a frequência absoluta ou

relativa em função do nível da escala de cinzentos. O método de melhoramento de contraste utilizado baseia-

se num remapeamento dos pixels da imagem a tratar, de forma a obter um histograma que faça um uso mais

conveniente da escala de cinzentos.

O histograma da imagem original não tratada (ver Figura 3.3) mostra que as intensidades ocorrem

maioritariamente em torno de um valor no meio da escala, não ocupando totalmente a gama disponível. Para

melhorar o contraste utilizou-se a transformação definida pela Equação(3) que satura 1% dos pixels em cada

extremo da escala, transformando linearmente para as intensidades intermédias (ver Figura 3.3). Este

remapeamento pode ser definido como

(3)

Os valores de e são determinados através de um histograma cumulativo , como os valores

na escala de cinzentos até ao qual se encontram 1% e 99% de todos os pixels da imagem, respectivamente (

equações 4.a e 4.b).

∑

(4.a)

∑

(4.b)

A máscara binária pode agora ser definida através de um processo de threshold, aplicado na imagem de

contraste melhorado , da seguinte forma:

{

(5)

38

3.1.2 Filtrar ruído

Uma vez obtida a máscara binária é necessário separar o que são glóbulos vermelhos do que é ruído. Para

cumprir este objectivo aplicaram-se dois filtros sucessivos, um relacionado com a área dos objectos

identificados e outro relacionado com a sua forma, implementados através das sub-rotinas LimpaAreas e

Roundness, respectivamente.

Figura 3.3- Técnica de melhoramento de contraste e seu resultado. a1) Histograma da imagem original a2) Pormenor da imagem original b) Função transferência aplicada, saturando 1% dos pixels em cada extremidade de escala c1) Histograma obtido após aplicar a função de transferência mencionada c2) Pormenor da imagem com contraste melhorado.

Critério das Áreas

Nesta filtragem pretende-se eliminar dois tipos de ruído: um ruído de alta frequência, caracterizado por

pequenas variações locais de iluminação; e um ruído de baixa frequência, que representa os aglomerados de

eritrócitos que não serão abordados neste trabalho. Em ambos os casos é feito o levantamento das áreas de

cada objecto e todas as que estiverem fora da gama definida pelo utilizador são descartadas.

Para a eliminação do ruído de baixa frequência a aplicação de um valor mínimo é feita directamente sobre

a máscara binária, enquanto a detecção de aglomerados requer um pré-tratamento para melhorar a sua

eficácia.

O pré-tratamento consiste numa operação morfológica de dilatação. Esta operação consiste em expandir

a imagem por intermédio de um elemento estruturante, resultando na dilatação dos objectos (ver Figura 3.4).

Como o objectivo é eliminar aglomerados de eritrócitos que se traduzem na máscara binária em objectos

muito perto um do outro, definindo um elemento estruturante suficientemente grande, é possível ligar estes

objectos, eliminando-os facilmente devido às suas áreas consideravelmente superiores às dos eritrócitos

isolados.

39

Critério da forma

A filtragem por área, por si só, não garante que os objectos seleccionados nas imagens sejam eritrócitos

válidos (ver Figura 3.5). Assim tornou-se necessário utilizar mais um filtro que impõe restrições ao nível da

forma dos objectos. Este filtro define um parâmetro adimensional que toma o valor unitário para formas

circulares e que se afasta da unidade à medida que a forma se afasta do círculo. Este parâmetro é definido

como

, onde é a área do objecto. Após ser calculado para cada objecto, excluem-se aqueles

que estejam abaixo do valor mínimo imposto pelo utilizador.

Figura 3.4 - Dilatação de imagem e eliminação de ruído. a) Imagem da zona C com um aglomerado de eritrócitos em escoamento b) Máscara binária obtida, com ruído e o aglomerado constituído por pequenas áreas c) Máscara binária que, após a remoção do ruído de alta frequência, foi dilatada com um elemento estruturante com a forma de um disco de raio equivalente a 4 pixel, ligando digitalmente as áreas do aglomerado e permitindo a sua correcta eliminação.

Considerando uma elipse de eixo maior A e eixo menor b, apresentam-se na Tabela 3.1 os valores do

parâmetro adimensional R assim como o respectivo índice de deformação elíptico.

Tabela 3.1- Parâmetro de forma adimensional R e índice de deformabilidade elíptico (definido na Figura 1.3) para elipses com diferentes proporções entre o eixo maior A e o eixo menor b.

b/A

1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 R 1 0,996 0,982 0,954 0,909 0,841 0,745 0,616 0,447 ID 0 0,053 0,111 0,176 0,250 0,333 0,429 0,538 0,667

A utilização destes critérios representa um compromisso entre a necessidade de eliminar falsos positivos

da fase de medição e o número de eritrócitos que podem ser abrangidos pelo método. Quanto mais restrito for

o parâmetro R, menor a deformabilidade máxima (ID máximo) que é possível encontrar.

Figura 3.5 - Aplicação do critério de forma. a) Imagem genérica da zona C b) Máscara binária obtida por subtracção do segundo plano c)Máscara binária após aplicação do critério das áreas, com o parâmetro adimensional de forma apresentado para cada objecto. A utilização de um limite superior a 0,4 e inferior a 0,86 permite filtrar correctamente esta imagem.

40

3.1.3 Extracção da informação

Após a aplicação dos processos de filtragem atrás descritos a uma imagem, todos os objectos que

permanecem nesta são considerados eritrócitos válidos e confirmados, pelo que a informação contida na

imagem é finalmente extraída. Esta etapa é executada pela sub-rotina ObtemResultados.

A cada objecto presente na imagem é aproximada uma elipse, a partir da qual se calculam os parâmetros

de interesse. Este processo está ilustrado na Figura 3.7, onde se apresentou também a imagem de contraste

melhorada para fins ilustrativos.

Esta aproximação é feita construindo uma elipse que possui o mesmo momento central normalizado de

segunda ordem que o objecto na imagem. Dado que os pixels são bidimensionais, este momento é a matriz de

covariância. A determinação desta matriz representa uma aproximação à distribuição normal multivariada (ver

Figura 3.6) distribuição esta, cujos contornos para uma dada variância formam uma elipse.

Figura 3.6 – Distribuição normal multivariada. A verde está representada uma elipse cujo ajuste depende da medida de dispersão utilizada.

Uma vez obtida a matriz covariância dos pontos do objecto, a direcção dos eixos da elipse é a mesma dos

vectores próprios da matriz de covariância e o seu comprimento é determinado pelos valores próprios da

matriz. Sabendo os parâmetros que definem a elipse ajustada ao objecto, obtêm-se os parâmetros de interesse

da seguinte forma:

√

A distância à parede é calculada após a determinação das coordenadas da parede, sabendo as

coordenadas do centróide da elipse é trivial obter a distância à parede.

Desta forma já se encontram determinados os valores do diâmetro circular equivalente, do índice de

deformação elíptica, da orientação do eixo maior da elipse em relação ao eixo x e das coordenadas do

centróide da elipse. Toda esta informação é armazenada para cada eritrócito e posteriormente exportada para

um ficheiro Excel.

3.1.4 Apresentação de Resultados

Esta etapa pode ser encarada como o pós-processamento deste programa, na medida em que, trabalha os

resultados em bruto apresentando-os de forma intuitiva. A sub-rotina responsável por esta fase é a gráficos

que, como o nome indica, organiza os dados obtidos, calcula alguns parâmetros adicionais e apresenta-os da

forma exposta no capítulo 5.

41

Figura 3.7 - Ajustamento de uma elipse a um eritrócito da zona C. a1) Imagem na escala original com a elipse ajustada a2) Ampliação do eritrócito, onde se pode ver a elipse a vermelho e o contorno não tratado a verde. As imagens b1) e b2) são as mesmas de a1) e a2) após melhoramento do contraste.

3.2 Seguimento manual de eritrócitos

Este ramo do programa preocupa-se em seguir, em imagens sucessivas, um eritrócito enquanto este

atravessa uma zona, monitorizando o índice de deformação elíptico, o diâmetro circular e a orientação do

glóbulo em relação ao eixo do canal. O passo torna-se obsoleto neste caso, sendo substituído pelo intervalo de

imagens a analisar como parâmetro a ser introduzido pelo utilizador.

As etapas deste processamento são idênticas às já mencionadas, pelo que só se fará referência ao que foi

implementado de forma diferente para este caso.

3.2.1 Obtenção da máscara binária

O seguimento manual só é possível de fazer para baixos hematócritos, como tal, esta etapa apenas utiliza

o método de subtracção de uma imagem do segundo plano, definido exactamente da mesma forma descrita

em 3.1.1.

3.2.2 Introduzir melhorias

Uma vez obtida a máscara binária, o utilizador é chamado a intervir para avaliar a qualidade da

segmentação do eritrócito a seguir. Caso não esteja bem segmentado o utilizador é confrontado com uma

imagem com o contraste melhorado pelo método descrito anteriormente, a partir da qual pode introduzir

pontos que complementem o contorno do eritrócito. No pior caso, em que o eritrócito não foi capturado na

42

máscara binária, é necessária a introdução manual de pontos suficientes para representar o eritrócito.

Considerando todas as imagens a analisar para obter uma amostra significativa, o processo acaba por se tornar

demorado.

Para o microcanal de constrição, devido a certas características da aquisição de imagem (sombra, fraco

contraste, entre outros), é preferível simplesmente analisar todas as imagens em modo de edição total, isto é,

ignorar a obtenção da mascara binária e partir directamente para a introdução manual da fronteira do

eritrócito.

De forma a reduzir o número de pontos a introduzir, é utilizada uma dilatação morfológica seguida de uma

erosão morfológica. Utilizando um elemento estruturante suficientemente grande, é possível reconstruir a

forma de um eritrócito com cerca de 8 a 12 pontos introduzidos manualmente. A utilização de uma dilatação

seguida de uma erosão com o mesmo elemento estruturante tem o nome de fecho morfológico e, é utilizada

para fechar contornos ou unir objectos que estejam próximos. Este modo de edição total é implementado pela

sub-rotina LimpaAreas.

Após introduzir manualmente as alterações que o utilizador considerar adequadas, este é confrontado

com o resultado final. Ao sobrepor a elipse ao eritrócito o utilizador tem a possibilidade de fazer uma avaliação

imediata do ajustamento, e, inclusivamente, fazer novamente alterações até ficar satisfeito com o seu

resultado (Ver Figura 3.7).

3.2.3 Apresentação de Resultados

O processamento e apresentação de resultados para o seguimento manual são análogos aos descritos

anteriormente. As únicas alterações prendem-se com certos parâmetros que não são utilizados neste caso,

como a distância à parede, ou a forma de apresentar os resultados, conforme exposto no capítulo 5.

3.3 Análise de erros e limitações do processamento digital de imagens

Esta secção pretende quantificar, tanto quanto possível, os erros cometidos pelo método de

processamento digital de imagem, assim como discutir as suas limitações.

3.3.1 Limitações conceptuais e simplificações adoptadas

O microcanal de válvula, com uma altura de 100 µm e largura igual (zona C) ou superior (zonas A, A2 e B) a

essa altura, permite a existência de fenómenos tridimensionais no escoamento do sangue e, portanto dos

eritrócitos.. A natureza bidimensional do processo de aquisição de imagens estabelece um plano focal,com

uma dada espessura óptica(h=50 µm), onde os objectos estão bem definidos. Qualquer eritrócito que circule

abaixo ou acima deste plano surge desfocado, com um rácio sinal/ruído na imagem suficientemente reduzido

para que seja eliminado da imagem durante o processo de tratamento digital. Por outro lado, no referido plano

focal, os eritrócitos podem ter um movimento descrito na literatura como tumbling[28, 49, 50], onde o

eritrócito, para além de translação, apresenta também uma rotação em torno de um ou mais eixos. Para o caso

do seguimento manual (zona B), foram escolhidos eritrócitos que não exibiam movimento de tumbling. Estes

efeitos tridimensionais não são tratados neste trabalho devido às constrições de tempo, pelo que o

processamento digital de imagens desenvolvido não possui qualquer metodologia para lidar com estes

43

fenómenos. Assim, para cada imagem obtida, assume-se que os eritrócitos (assim como todos os objectos

capturados na obtenção da imagem binária se assumem localizados no plano focal) apenas possuem um

movimento de translação. Desta forma é feita uma simplificação do escoamento tridimensional para uma

situação idealizada bidimensional para o processamento automatizado das zonas A, A2 e C.

Os resultados obtidos no microcanal de constrição têm uma influência negligenciável dos efeitos

tridimensionais supracitados, uma vez que a altura do microcanal de 4 µm impede a ocorrência de tumbling,

assim como a circulação de eritrócitos acima ou abaixo do plano focal.

3.3.2 Limites de detecção dos parâmetros medidos

A utilização dos filtros de área e de forma estabelecem limites para os quais um objecto pode, ou não, ser

considerado um eritrócito, sendo estes limites dependentes dos parâmetros utilizados nos filtros.

A limitação de um parâmetro de forma circular restringe o ID máximo que pode ser medido, uma vez que

quanto mais vincada a elipse (maior ID) menor é o valor deste parâmetro. A correspondência entre o limite do

parâmetro R e o ID máximo medido encontra-se na Tabela 3.1. Para os valores utilizados na obtenção dos

resultados expostos no capítulo 5 os valores máximos detectáveis do ID apresentam-se na Tabela 3.2.

Tabela 3.2- Limite máximo do ID capturado pelos parâmetros utilizados no processamento de imagem

Zona A Zona A2 Zona C

R máximo 0,9 0,9 0,71 ID máximo 0,23 0,23 0,48

A utilização de valores das áreas para eliminar ruído também coloca uma limitação ao tamanho do

eritrócito detectável, sendo qualquer eritrócito maior ou menor que estes limites considerado ruído e não

analisado. Na Tabela 3.3 apresentam-se os limites máximos e mínimos do diâmetro circular equivalente que

um eritrócito pode ter para não ser considerado ruído.

Tabela 3.3 - Limite superior e inferior do diâmetro capturado pelos parâmetros utilizados no processamento de imagem


Diâmetro mínimo [µm] 3,18 2,78 2,76 Diâmetro máximo [µm] 5,74 7,37 5,95

Comparando com os valores da literatura para o diâmetro médio dos eritrócitos de cavalo (5,2-6 µm) [38-

40], é evidente que as medições da zona A e C estão no limite desse valor, ignorando assim toda a população

eritrocitária com diâmetros superiores aos indicados acima.

Os parâmetros que foram utilizados no processamento digital de imagem foram obtidos analisando cerca

de 800 imagens para cada zona, para as quais se registou o tamanho do menor e maior eritrócito identificado,

os tamanhos mínimos dos aglomerados, tamanhos máximos do ruído de alta frequência e os valores do

parâmetro de circularidade para cada um destes objectos. Os parâmetros escolhidos apresentam-se na Tabela

3.4,.e foram determinados de forma a obter o número mínimo de falsos positivos possível, ou seja, foram

adoptados valores conservadores para assegurar que os objectos identificados correspondem a eritrócitos. A

qualidade dos resultados depende da qualidade dos parâmetros introduzidos, e a forma encontrada de

44

escolher os parâmetros adequados requer, para cada gravação em condições diferentes, um novo processo de

selecção de parâmetros.

Tabela 3.4- Parâmetros utilizados pelo programa desenvolvido na obtenção dos resultados apresentados no capítulo 5.

Threshold Área mínima

(pixel) Area máxima

(pixel) Parâmetro de circularidade

Passo (nº de imagens)

Zona A 15 400 1300 0,9 25 Zona A2 (0-50) 50 350 0,9 25 Zona C 15 300 1400 0,71 7

3.3.2 Erros do sistema de aquisição de imagem

O erro da discretização espacial da imagem é da ordem do pixel, ou seja, 0,14µm e 0,35 µm para uma

ampliação de 100× e 40×, respectivamente. Para os valores de diâmetro medidos este erro relativo é dado na

Tabela 3.5.

Tabela 3.5 - Erro relativo da discretização espacial em pixel


Diâmetro mínimo [µm] 3,18±4% 2,78±13% 2,76±5% Diâmetro máximo[µm] 5,74±2% 7,37±5% 5,95±2%

3.3.3 Erro sistemático de subestimação de diâmetro

O processamento digital de imagem, quando efectuado de forma automática (zona A, A2 e C), apresenta

um erro sistemático de subestimação do diâmetro eritrocitário superior ao erro de discretização, evidente na

análise da Tabela 3.6. A origem deste erro está no compromisso entre a quantidade de informação capturada e

o ruído introduzido aquando da decisão do threshold utilizado na obtenção da máscara binária. Este erro na

determinação do tamanho eritrocitário não tem impacto no ID, dado que este índice só depende da relação

entre os eixos da elipse e não do tamanho da mesma.

Tabela 3.6 –Erro sistemático de subestimação do diâmetro do procedimento automático.

Automático

(zonas A,A2 e C)

Manual

(zona B)

Manual

(canal de constrição)

Número da amostra 1275 34 25

Diâmetro experimental (µm) 3,91±9% 5,43±3% 5,27±3%

Diâmetro Literatura[38-40] Diâmetro médio varia entre 5,2 e 6 µm

Diferença relativa (%) 25 - -

A utilização de um escoamento com partículas de tamanho previamente conhecido poderia servir como

forma de calibrar o threshold utilizado, permitindo diminuir ou até eliminar este erro. No entanto, a utilização

de partículas que se comportem da mesma forma que os eritrócitos, nomeadamente ao nível da distribuição

da escala de cinzentos, dificulta a determinação de um procedimento de calibração totalmente eficaz que

permita eliminar totalmente este erro. Outra hipótese passa por uma melhor iluminação do escoamento,

permitindo obter imagens mais nítidas, sem sombreamentos que dificultam a determinação dos limites dos

eritrócitos.

45

4. Medição da queda de pressão

Uma possibilidade decorrente do projecto dos canais, e que era objectivo inicial deste trabalho, consiste

na medição da perda de pressão que ocorre quando um eritrócito atravessa a constrição, através de um

micromanómetro diferencial que se projectou e fabricou do decurso desta tese. No entanto não foi possível

obter esta medição de uma forma consistente. A forma de efectuar esta medição é apresentada neste capítulo,

seguida do trabalho desenvolvido nesse sentido e, por fim, discutem-se os factores que impossibilitaram esta

medição.

4.1 Princípio de medição

O princípio subjacente a esta medição baseia-se na utilização de dois canais idênticos, um canal de teste e

um de controlo, cada qual escoando um fluido diferente. Se considerarmos o sentido de escoamento

apresentado na Figura 4.1, esta geometria origina, a jusante das constrições, dois escoamentos adjacentes (um

proveniente de cada constrição), cujas linhas de corrente são paralelas. Ambos os fluídos são miscíveis e, de

forma a visualizar a sua interface a jusante, é introduzido um corante no fluido do canal de controlo.

A passagem de um eritrócito na constrição do canal de teste aumenta a perda de pressão, provocando um

deslocamento da interface. Após um processo de calibração que permite relacionar a diferença de pressão com

o deslocamento da interface, torna-se possível determinar quantitativamente a perda de pressão dinâmica à

medida que o eritrócito atravessa a constrição.

Figura 4.1 – Interface a jusante dos canais, com o escoamento da esquerda para a direita. A tracejado apresenta-se a zona de comparação onde a interface é avaliada. [35]

Outra vantagem que este tipo de ensaios propiciaria, seria a visualização simultânea, na mesma imagem,

da deformação do eritrócito, da sua posição na constrição e da alteração da interface resultante. Desta forma,

todas estas medições seriam obtidas utilizando apenas um sistema de aquisição de imagens.

4.2 Corantes testados

O corante ideal para esta aplicação tem que satisfazer três critérios de selecção: diferenciar claramente os

dois fluídos, não formar resíduos potenciadores do bloqueio do canal e obter uma interface bem definida na

zona de comparação. O primeiro aspecto prende-se com a intensidade da coloração obtida e, para o mesmo

corante, pode ser aumentada com a concentração deste, dentro dos limites da solubilidade. O segundo

aspecto envolve a pureza do corante utilizado, o seu método de preparação e a sua solubilidade, dependendo

assim das propriedades intrínsecas do corante e do seu fornecedor. O último aspecto está directamente

46

relacionado com o coeficiente de difusão do corante no meio, sendo a definição da interface tanto melhor,

quanto menor for o coeficiente de difusão.

Foram testados quatro corantes alimentares comerciais, três dos quais produzidos pela Vahiné: encarnado

(E122), amarelo (E102), azul (E131), e um verde (E104 e E142) produzido pela Globo.

4.3 Limitações dos corantes e rejeição da medição da queda de pressão

Cada corante foi misturado em água destilada numa proporção de 1:5 em volume, tendo sido escoado no

canal de controlo, enquanto a água destilada circulava no canal de teste.

De forma a evitar poeiras ou resíduos em suspensão, as soluções foram preparadas e armazenadas dentro

do armário de fluxo vertical laminar e deixadas em repouso durante 48 horas antes de realizar qualquer ensaio.

Vários ensaios preliminares foram efectuados com estas soluções para aferir qualitativamente qual o

corante mais adequado. Os resultados destes ensaios encontram-se na Figura 4.2.

Figura 4.2 – Imagens do ensaio dos corantes alimentares, escoando a solução do corante em água destilada (1:5) no canal inferior e água destilada no superior. Ambos os caudais são 0,005 µL/min. a) Corante amarelo (E102). Não existe uma interface visível e há formação de resíduos no canal inferior e na zona de comparação. b) Corante verde (E104 e E142). Existem indícios de uma interface mas há grande quantidade de resíduos formados, principalmente no canal de controlo. c) Corante azul (E131). Existe uma interface visível sem formação de resíduos. d) Corante encarnado (E122). Não existe uma interface visível e existem poucos resíduos.

Devido ao reduzido tamanho dos canais em questão a sua obstrução ocorre facilmente para a dimensão

dos resíduos observados, sendo apenas uma questão de tempo até bloquear completamente o escoamento e

inutilizar (descolagem/quebra do vidro) o canal. Tendo em conta que cada canal utilizado requer um processo

de calibração antes de efectuar medições, e que qualquer alteração nos canais torna essa calibração obsoleta,

a inexistência de resíduos no corante utilizado torna-se imprescindível para a obtenção de resultados

reprodutíveis e precisos. Aliás, esta é a razão para todos os canais serem diferentes na Figura 4.2, uma vez que

os canais utilizados com cada corante ficaram inutilizados devido a bloqueios no canal de controlo.

Outro factor essencial para a escolha do corante é a obtenção de uma interface visível. A visibilidade da

interface pode ser alterada aumentando a concentração do corante na solução escoada. No entanto este

47

aumento poderá também resultar no aparecimento de resíduos. A concentração do corante utilizado terá que

ser inferior ao limite imposto pela formação de resíduos e superior ao limite imposto pela boa visibilidade da

interface.

Na Figura 4.2 constata-se que o corante amarelo e encarnado apresentam resíduos sem uma interface

visível, o que os exclui sem necessidade de testar outras concentrações. O corante verde apresenta uma fraca

interface e a maior formação de resíduos. Desta forma foram testadas concentrações mais baixas para

averiguar se era possível obter uma interface sem resíduos. Diluindo a solução do corante verde para obter

uma concentração 1:10 foi repetido o ensaio, verificando-se a inexistência de interface e existência de

resíduos. Desta forma o corante verde foi excluído.

O corante azul é aquele demonstrou ter melhores condições de ser utilizado. No entanto, após o ensaio

realizado, procedeu-se à limpeza do canal e verificou-se a existência de resíduos. Esta limpeza consiste em

escoar água destilada em ambos os canais até sair água sem corante pela tubagem de descarga, sendo

posteriormente escoado ar para secar o interior do canal. Após este procedimento verificou-se que

permaneceram resíduos do corante na zona de comparação e ao longo do canal, o que não só impede uma boa

definição dos limites da interface para os ensaios subsequentes, como levará ao inevitável bloqueio do canal

(Figura 4.3).

A formação de resíduos durante o escoamento e/ou após o procedimento de limpeza observado, tem

como consequência o facto de nenhum dos corantes estudados permitir atingir os objectivos pretendidos, na

medida em que nenhum corante garante a reprodutibilidade dos ensaios. Mesmo utilizando os microcanais de

forma descartável, isto é, um microcanal para efectuar uma bateria de medições até este bloquear, a

necessidade de um processo de calibração prévio, que depende da resistência hidrodinâmica de ambos os

canais, impossibilita a obtenção de dados adequados. Devido a limitações de tempo para testar outros

corantes optou-se por abandonar a medição deste parâmetro adicional neste trabalho.

Figura 4.3 – Testes realizados com o corante azul (E131) com o caudal da solução com corante constante e igual a 0,005µL/min, variando o caudal de água destilada (Qa) que circula no canal de teste. a) Qa = 0,005µL/min. b) Qa=0,007µL/min. c) 0,010µL/min. d) Canal após limpeza. Nota-se resíduos de tinta azul nos locais onde a interface esteve previamente.

48

5. Análise e discussão de resultados

Os resultados da deformação de eritrócitos em diferentes condições dinâmicas de escoamento obtidos

neste trabalho serão apresentados e discutidos neste capítulo. Começa-se por apresentar os resultados obtidos

para o microcanal com válvula, organizados pelas zonas descritas em 2.2.1 e recordadas aqui na Figura 5.1,

sendo posteriormente feita a comparação entre as diferentes zonas. Segue-se a discussão destes resultados.

Figura 5.1 – Localização das zonas de aquisição de imagem no microcanal de válvula. Ver Figura 2.10.

A segunda parte deste capítulo concentra-se nos resultados obtidos no microcanal de constrição descrito

em 2.2.2, divididos pela constrição em que foram observados e, respectiva discussão.

É ainda apresentada uma breve análise, qualitativa e quantitativa, da hemólise registada no microcanal de

constricção seguida da respectiva discussão.

5.1 Microcanal com válvula

Conforme descrito em 2.2.1, as observações feitas neste microcanal estão divididas em três zonas, A, B e

C. As zonas A e C têm como objectivo aferir propriedades médias da população de eritrócito para determinadas

condições de escoamento, enquanto na zona B se pretende seguir a variação dessas propriedades à medida

que o eritrócito percorre o seu trajecto. Os resultados obtidos neste microcanal encontram-se apresentados

por estas duas categorias.

5.1.1Caracterização da deformação de eritrócitos da zona A e A2

5.1.1.1 Baixo Hematócrito (Zona A)

Com os parâmetros utilizados no processamento digital de imagens foram identificados e medidos 169

eritrócitos no escoamento com baixo hematócrito na zona A. Para estes eritrócitos foram medidos o índice de

deformabilidade elíptico (ID), o diâmetro circular equivalente, a distância do centróide à parede, e, finalmente,

o ângulo entre o eixo maior da elipse ajustada ao eritrócito e o eixo do canal. Estes resultados são

apresentados sob a forma de histograma e, quando relevante, apresentados uns em função dos outros.

49

Figura 5.2 – Resultados da zona A. Histograma da deformabilidade (esquerda), histograma do diâmetro (direita) e histograma angular da orientação dos eritrócitos, com a respectiva convenção de sinal.

Índice de deformabilidade elíptico (ID)

Como se pode ver no histograma do ID da Figura 5.2, os eritrócitos medidos nesta zona têm um ID

reduzido, com cerca de 95% de todos os glóbulos a apresentarem um valor dessa variável inferior a 0,105. A

média da amostra é de 0,042 e a sua variância é 8,5×10-4

.

Outro aspecto relevante é a baixa dispersão resultados, medida pela variância. Para uma população de

eritrócitos, existirão subpopulações caracterizadas por maior ou menor capacidade de deformação. A

capacidade de identificar subpopulações é tanto maior quanto maior a tensão de corte aplicada. No entanto,

para baixas tensões de corte, estas diferenças são diluídas, não permitindo as pequenas deformações exigidas

aos eritrócitos distinguir entre estas subpopulações.

Diâmetro

O diâmetro circular equivalente, obtido a partir da área da elipse ajustada, é apresentado no histograma

da Figura 5.2.

É possível verificar que 88% dos eritrócitos apresenta um diâmetro entre 3,105µm e 3,605 µm, tendo a

amostra uma média de 3,44 µm e variância igual a 0,057 µm2. Este parâmetro caracteriza uma propriedade

inerente a toda a população de eritrócitos, uma vez que é a mesma amostra de sangue que é escoada em série

por todas as zonas aqui apresentadas.

Orientação

A orientação dos eritrócitos, definida como o ângulo entre o eixo maior da elipse ajustada e o eixo do

canal, encontra-se representado na Figura 5.2.Esta figura é apresentada num histograma angular por ser a

0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0.16 0.18 0.20

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

Índice de deformabilidade elíptico

Fre

quência

rela

tiva e

m p

erc

enta

gem

(n=

169) 𝜇

𝜎 8 × −

3 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 4 4.1 4.2 4.3 4.4 4.50

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

30

Diametro [m]

Fre

quência

rela

tiva e

m p

erc

enta

gem

(n=

169) 𝜇 µm

𝜎 µm

50

forma mais intuitiva e elucidativa de visualizar este parâmetro. A orientação dos eritrócitos encontra-se

distribuída por toda a gama, tendo 37% dos eritrócitos uma orientação compreendida entre -30˚ e 30˚, com

48% dos eritrócitos medidos a apresentarem orientação negativa.

Distância à parede e relação ID/Diâmetro.

Na Figura 5.3 apresenta-se o histograma da distância entre o centróide do eritrócito e a parede da válvula.

Como se pode verificar, os eritrócitos encontram-se distribuídos por toda a largura da zona A, com excepção de

uma pequena zona junto à parede, onde, até 33 µm desta não se encontra estatisticamente nenhum eritrócito.

A informação contida no histograma mencionado pode ser complementada com a variação do ID ou do

diâmetro em função da distância à parede.

Da variação do ID em função da distância à parede (Figura 5.3.b) salientam-se os seguintes aspectos: entre

os 33 µm e os 61 µm, a deformabilidade máxima verificada aumenta de forma linear com a distância. Após os

61 µm, a deformabilidade máxima não varia significativamente com a distância. A deformabilidade no geral

não parece exibir uma tendência variacional definida em função da distância à parede.

A variação do diâmetro em função da distância à parede (Figura 5.3.d) mostra uma distribuição

homogénea, não revelando nenhuma evidência organizacional dos eritrócitos por tamanho dentro do canal.

Outra questão levantada é se a deformabilidade depende do tamanho do eritrócito. Analisando a Figura

5.3.c conclui-se que não há uma correlação entre a deformação e o diâmetro dos eritrócitos.

Figura 5.3 a) Histograma da distância à parede. Apresentação do gráfico de dispersão entre: b) ID e distância à parede, c) ID e diâmetro eritrocitário, d) diâmetro eritrocitário e distância à parede. Para os dois últimos não é evidente nenhum indício de relação entre os parâmetros.

51

5.1.1.2 Hematócrito elevado (Zona A2)

Para um hematócrito elevado o método descrito no capítulo 3 permitiu identificar 973 eritrócitos. Os

parâmetros avaliados são os mesmos mencionados em 5.1.1.1, à excepção da distância à parede. Esta

excepção deve-se ao facto de a aquisição de imagem com elevado hematócrito ter sido feita numa zona central

da válvula, não capturando assim a parede, conforme ilustrado na Figura 2.10.

Outra diferença fundamental, para além da diferença no hematócrito do sangue, é o seu tempo de

armazenamento. Para o ensaio com elevado hematócrito a aquisição de imagens foi efectuada 3 dias após a

sua colheita, enquanto para o baixo hematócrito foi escolhido um intervalo de 18 dias entre a sua colheita e

análise. Desta forma o sangue usado no ensaio com baixo hematócrito tem mais 15 dias de tempo de

armazenamento que o ensaiado com elevado hematócrito.

Figura 5.4 - Resultados da zona A2. Histograma da deformabilidade (esquerda), histograma do diâmetro (direita) e histograma angular da orientação dos eritrócitos, com a respectiva convenção de sinal.

Índice de deformabilidade (ID)

A Figura 5.4 apresenta o histograma do ID obtido para a aquisição de imagens feita na zona A2. Esta

amostra tem uma média de 0,107 e uma variância de 4,2×10-2

Diâmetro

O histograma do diâmetro é apresentado na Figura 5.4. É evidente a distribuição quase homogénea de

eritrócitos por uma larga gama de valores, resultando numa grande dispersão de resultados ( σ2=0,375 µm

2).

Esta amostra tem uma média de 3,95 µm.

52

Orientação

Este parâmetro apresenta uma distribuição em histograma angular muito dispersa ao longo de toda a

gama de orientações, com 50,7% dos eritrócitos com uma orientação negativa, segundo o critério

demonstrado na Figura 5.4. No intervalo de -30° a 30° encontram-se 38,6% dos eritrócitos medidos.

Variação do ID com o diâmetro

Na Figura 5.5 é mapeado o ID em função do seu diâmetro. Os resultados encontram-se dispersos, sem

nenhum padrão que possa ser identificado. Assim, não existe nenhum indício de uma relação entre o ID e o

diâmetro do eritrócito.

Figura 5.5 – Gráfico de dispersão do ID em função do diâmetro eritrocitário para a zona A2.

5.1.2 Caracterização da deformação de eritrócitos da zona C

A aplicação dos métodos de processamento digital de imagens referidos no capítulo 3, utilizando os

parâmetros aí descritos, permitiu identificar 133 eritrócitos. Os parâmetros avaliados são os mesmos da secção

5.1.1.1, ou seja, o ID, o diâmetro, a orientação e a distância à parede. Seguidamente são apresentados os

resultados para cada parâmetro individual, sendo no fim apresentadas algumas relações de parâmetros que se

identificaram.

Índice de deformabilidade

Através do histograma do ID da Figura 5.6 é possível notar a elevada dispersão de resultados (σ2=7,7×10

-3),

assim como média amostral de 0,121. Outro factor a salientar, é a existência de dois picos, um para ID=0,04 e

outro para ID=0,11, com 9,77% e 8,27% de frequência relativa, respectivamente.

Diâmetro

Os resultados obtidos para o diâmetro encontram-se expostos no histograma da Figura 5.6. Esta amostra

possui um diâmetro médio de 4,04 µm e uma variância igual a 0,32 µm2.

Orientação

O histograma angular apresentado na Figura 5.6 permite observar o alinhamento preferencial dos

eritrócitos com o eixo de simetria do canal, com uma clara tendência para ângulos positivos (mais de 80% dos

eritrócitos apresentam ângulos positivos). De facto, cerca de 70% dos eritrócitos apresentam uma orientação

compreendida entre -30° e 30°.

53

Figura 5.6 - Resultados da zona C. Histograma da deformabilidade (esquerda), histograma do diâmetro (direita) e histograma angular da orientação dos eritrócitos, com a respectiva convenção de sinal.

Figura 5.7 - a) Histograma da distância à parede. Apresentação do gráfico de dispersão entre: b) ID e distância à parede, c) ID e diâmetro eritrocitário, d) diâmetro eritrocitário e distância à parede. Em todos os gráficos é notória uma camada sem eritrócitos (de plasma) com uma espessura de 4,8µm.

54

Distância à parede

Uma vez que a aquisição de imagem da zona C permitiu capturar ambas as paredes do canal, a distância à

parede é apresentada fazendo-se uso da simetria do canal. Independentemente de o eritrócito estar mais

perto da parede direita ou esquerda, a sua distância é expressa na Figura 5.7.a entre 0 e 45 µm, sendo este

último valor o meio do canal.

O histograma da distância à parede (Figura 5.7.a) permite identificar uma zona onde nenhum eritrócito foi

estatisticamente identificado, com o centróide do eritrócito mais perto da parede a circular a 4,8 µm desta. É

ainda de salientar que cerca de 30% dos eritrócitos circulam a uma distância da parede entre 7,5 µm e 13,5 µm,

ou seja, em 13% da escala. Outro factor revelante, é que cerca de 98% dos eritrócitos circulam do lado

esquerdo do canal. Esta assimetria será discutida em 5.1.3.1.

Observando o ID e função da distância à parede (Figura 5.7.b) conclui-se que não há indícios de uma

relação entre estes dois parâmetros. De igual modo se conclui o mesmo sobre o ID e o diâmetro eritrocitário

(Figura 5.7.c) e sobre o diâmetro e a distância à parede (Figura 5.7.d).

5.1.3 Comparação e discussão dos resultados das zonas A,A2 e C

Nesta secção serão discutidos os resultados obtidos no microcanal de válvula, começando por se discutir

algumas considerações gerais acerca de factores e parâmetros que são transversais às áreas mencionadas, e

posteriormente apresenta-se a comparação directa entre zonas.

5.1.3.1 Considerações gerais

Para todos os ensaios realizados no microcanal de válvula, ao fim de um certo tempo, surgem bolhas de ar

nos cantos da válvula (Figura 5.8.a e Figura 5.8.b). Estas bolhas vão crescendo lentamente de forma

assimétrica, alterando a sua forma à medida que o tempo passa (Figura 5.8.c e Figura 5.8.d). Quando atingem

um certo tamanho estas bolhas colapsam, deixando bolhas reduzidas nos cantos da válvula e enviando a maior

parte do ar com o escoamento, e recomeçando assim o ciclo de crescimento assimétrico e colapso. O tempo de

duração de cada ciclo para os caudais testados é superior a cerca de 4 horas.

A alteração do escoamento provocada pelas bolhas tem efeitos na distribuição do hematócrito a jusante

destas. Conforme se pode ver na Figura 5.8.a, as bolhas aí expostas provocaram uma maior concentração de

eritrócitos do lado esquerdo da válvula.

Na zona C também é possível encontrar uma distribuição heterogénea dos eritrócitos, com uma maior

concentração destes do lado esquerdo junto ao canal, visível qualitativamente na Figura 5.8.b e

quantitativamente no histograma da distância à parede apresentado na Figura 5.7.a. Esta distribuição permite

observar que 30% dos eritrócitos circulam a uma distância da parede esquerda entre 7,5 µm e 13,5 µm, ou

seja, em 6,5% da escala. Outro factor relevante é que cerca de 98% dos eritrócitos circula do lado esquerdo do

canal, evidenciando bem a heterogeneidade do hematócrito e mascarando qualquer distribuição natural dos

eritrócitos ao longo do canal

A variação do tamanho das bolhas pode ser desprezável para a escala de tempo característica da aquisição

de imagem (8s para a zona A2 e 6,5s para as restantes). A principal influência destas bolhas assimétricas e

instáveis é o efeito deletério que tem sobre a reprodutibilidade dos ensaios, alterando as condições do

55

escoamento para medições que sejam feitas num intervalo de tempo igual ou superior à escala de tempo dos

ciclos de formação/colapso das bolhas. Veja-se como exemplo a diferença entre as imagens expostas na Figura

5.8, obtidas no mesmo dia, separadas por algumas horas.

Figura 5.8 – Formação de bolhas na válvula do microcanal ensaiado. a) (Q=1µL/min, ampliação 40×). Bolhas na zona de entrada da microválvula resultam numa distribuição não homogénea dos eritrócitos nesta. b) (Q=1µL/min, ampliação 40×) Bolhas na zona de saída da microválvula resultam numa distribuição não homogénea dos eritrócitos para o canal. c) (Q=5µL/min, ampliação 10×). Formação de bolhas fortemente assimétricas após mais de 2 horas do início do ensaio. d) (Q=1µL/min, ampliação 40×) Formação de bolhas fortemente assimétricas após mais de 3 horas do início do ensaio. Os círculos encarnados representam grandes aglomerados de eritrócitos fixos ao canal.

Esta variabilidade reflecte-se na comparação entre ensaios com diferentes hematócritos (zona A e zona

A2), dado que o método utilizado para baixar o hematócrito consiste em aguardar que a sedimentação dos

eritrócitos dentro do tubo e na seringa, diminua o hematócrito no canal. Enquanto a aquisição de imagens para

elevado hematócrito pode ser realizada imediatamente após iniciar o escoamento, para baixo hematócrito é

necessário esperar cerca de uma hora antes de efectuar a medição, tempo suficiente para a formação das

bolhas apresentadas na Figura 5.8.a e Figura 5.8.b. Esta distribuição beneficia a localização da zona A junto à

parede, permitindo medir mais eritrócitos do que em condições normais.

56

Tensão de corte

A quantificação da tensão de corte que actua sobre os eritrócitos não é feita neste trabalho, dado as

instabilidades no escoamento já referidas. No entanto relação qualitativa entre as tensões de corte actuantes

nas várias zonas é utilizada na interpretação e comparação de resultados.

Diâmetro

Não é expectável que ocorra uma diferença entre os diâmetros encontrados nas várias zonas, uma vez

que a amostra de sangue escoada é sempre a mesma. No entanto, a diferença entre os valores obtidos para as

diferentes zonas é considerável (ver Tabela 5.1). De facto, aplicando um teste de hipóteses, podemos rejeitar a

igualdade das distribuições do diâmetro da zona A e C aos níveis usuais de significância usuais (p> 0,999),

existindo fortes indícios que os diâmetros medidos em C fazem parte de uma população cuja média é inferior à

população medida em A. Esta conclusão está claramente em desacordo com o contexto da medição, no

entanto serve para demonstrar a importância da variação encontrada na medição das áreas.

Tabela 5.1 – Comparação do diametro experimental e teórico.


Diâmetro médio experimental [µm] 4,04 3,95 3,44 Erro experimental [%] 3,5 3,5 4 Diâmetro literatura[38-40] Diâmetro médio varia entre 5,2 e 5,6 µm Diferença relativa entre literatura e experimental [%] 22,3 24,0 33,9

Os valores usualmente encontrados na literatura são superiores aos determinados pelo processamento

digital de imagens automatizado.

O facto de os eritrócitos observados na zona A2, somente com 3 dias de armazenamento, apresentar a

mesma tendência de subestimação da área que os medidos com 18 dias de armazenamento, sugere que a

origem desta subestimação não está relacionada com o tempo de armazenamento, mas sim um erro

sistemático de subestimação do método utilizado.

5.1.3.2 Comparação entre as zonas A e C

Ambas as zonas A e C foram ensaiadas para o mesmo caudal de 1µL/min, escoando sangue com igual

tempo de armazenamento (3 dias) e hematócrito baixo considerado idêntico. Estas condições permitem

estudar os efeitos da variação tensão de corte nos parâmetros medidos. A zona A corresponde ao escoamento

dentro da microválvula, que apresenta uma área transversal cerca de 7 vezes superior à encontrada na zona C

(vide Figura 2.10). A zona C é mais estreita e, consequentemente, apresenta uma velocidade superior. Este

aumento de velocidade origina gradientes mais intensos do que os verificados na zona A, resultando numa

maior tensão de corte aplicada aos eritrócitos que atravessam a zona C.

De seguida será feita a discussão por parâmetro avaliado.

Deformabilidade

Efectuando um teste de hipóteses cuja hipótese nula é a igualdade das médias do ID para ambas as zonas,

e a alternativa que a média da zona C (ID=0,121±0,088; n=133) é superior à zona A (ID=0,042±0,029; n=169), é

possível rejeitar a hipótese nula em favor da hipótese alternativa para os níveis usuais de significância (t-

57

student, p<0,001). Este valor do p-value indica a forte consistência dos dados obtidos com a hipótese de maior

deformabilidade dos eritrócitos que se escoam na zona C em relação aos da zona A.

A maior deformabilidade da zona C explica-se pela maior tensão de corte a que estão sujeitos os

eritrócitos, por oposição à zona A onde ocorrem menores tensões de corte. Estes resultados são consistentes

com a literatura, onde para um mesmo caudal, a avaliação do ID na secção de menor área transversal é

superior à de maior área transversal [18].

É importante notar que um baixo valor de ID não significa que a amostra é pouco deformável, mas apenas

que, para as condições de tensão de corte a que os eritrócitos estão sujeitos na zona A, 95% destes podem ser

ajustados a uma elipse cujo rácio entre o eixo maior e menor não excede 1,1. De facto a zona C encontra-se a

jusante da zona A, pelo que é a mesma população de eritrócitos que é avaliada, uma vez sob a tensão de corte

característica da zona A e posteriormente sob uma maior tensão de corte na zona C.

Orientação

Ao passar da zona A para a zona C é notório o aumento de eritrócitos cuja orientação se aproxima do eixo

do canal, conforme se sintetiza na Tabela 5.2. A zona A apresenta uma distribuição muito dispersa e quase

homogénea, com cerca de 37% dos eritrócitos a apresentarem uma orientação compreendida entre -30° e 30°,

apresentando 48% dos eritrócitos uma orientação negativa. Ao avaliar a zona C observamos um histograma

muito mais centralizado em torno dos 0°, com 70% dos eritrócitos concentrados entre -30° e 30°, e 80% com

ângulos positivos.

O aumento da frequência de eritrócitos que apresentam orientações na gama -30° e 30°, justifica-se pelo

aumento da tensão de corte, e é consistente com resultados da literatura [3, 15, 22]. Este alinhamento dos

eritrócitos para maiores tensões de corte encontra-se documentada na literatura [15] e explica-se com o facto

de esta forçar elipses mais vincadas (conforme se vê pela variação do ID discutida acima).

Tabela 5.2 – Parâmetros retirados da Figura 5.2 e Figura 5.6, utilizados para comparar a distribuição da orientação dos eritrócitos da zona A e C.

Zona Frequência relativa acumulada

entre -30° e 30° Frequência relativa de orientações

positivas

A 0,37 0,48 C 0,70 0,80

A razão para o aumento relativo de eritrócitos com orientação positiva reside na formação das bolhas

mostradas na Figura 5.8.b, que originam uma distribuição não uniforme de eritrócitos ao longo da largura do

canal. O maior número de eritrócitos que circulam do lado esquerdo junto à parede, como evidenciado na

Figura 5.7, origina um aumento das orientações positivas (eritrócitos virados para o centro do canal) devido à

tendência destes em migrarem para o centro do canal, onde ocorrem gradientes de velocidade mais suaves.

Esta migração encontra-se descrita na literatura [3, 25].

Distância à parede

A distribuição dos eritrócitos pela largura do canal é aproximadamente homogénea para a zona A. No

entanto a zona C apresenta uma maior percentagem de eritrócitos que circulam do lado esquerdo conforme

58

explicado em 5.1.3.1. Esta distribuição dos eritrócitos na zona C é imposta pelas assimetrias do escoamento,

mascarando eventuais tendências naturais de migração dos eritrócitos.

Em ambas as zonas é possível definir uma camada junto à parede onde não foram encontrados eritrócitos.

Esta camada de plasma é um fenómeno bem documentado na literatura [51, 52] tendo sido inclusivamente

observado noutro trabalho realizado no mesmo laboratório [53]. Os resultados observados são apresentados

na Tabela 5.3. A camada de plasma é determinada através da distância mínima do centróide de um eritrócito à

parede, sendo de 33 µm para a zona A e de 4,8 µm para a zona C. Adimensionalizando a camada de plasma

pela largura do canal, é possível verificar uma tendência de aumento deste parâmetro com a velocidade. A

mesma tendência foi identificada usando sangue de coelho com hematócrito elevado num trabalho realizado

no mesmo laboratório [53].

Tabela 5.3 – Largura da camada de plasma

Zona Largura da camada de plasma adimensionalizada

pela largura do canal Velocidade média do

canal Largura/altura da

secção

A 0,045 5,7 mm/s 7,29 C 0,050 43 mm/s 0,97

Uma diferença entre a medição aqui feita e os resultados acima referenciados é o baixo hematócrito. Um

dos principais efeitos da camada de plasma é funcionar como lubrificante entre a camada com as células e a

parede, reduzindo a perda de pressão devido à menor viscosidade desta camada em relação à camada celular

[51-53]. Através da Figura 5.9 é perceptível a diminuição da viscosidade com a redução do hematócrito. No

limite, o hematócrito igual a zero corresponde somente a plasma, tornando o efeito de lubrificação inexistente

(camada de plasma junto à parede tem exactamente a mesma constituição da camada central). Assim para os

baixos hematócritos utilizados os ensaios efectuados, o efeito de lubrificação da camada de plasma é muito

reduzido, quando comparado ao efeito em escoamentos com maior hematócrito.

Figura 5.9 – Variação da viscosidade com o hematócrito para diferentes taxas de deformação [52].

Relação entre parâmetros

A distribuição dos eritrócitos ao longo da largura do canal pode ser mostrada em função de alguns

parâmetros de forma a evidenciar a existência ou não de padrões de comportamento.

59

Uma das propriedades avaliadas em função da distância à parede foi o diâmetro dos eritrócitos. Quer na

zona A quer na zona C não foi identificada nenhuma tendência definida na distribuição dos eritrócitos em

função do seu diâmetro, sendo obtidas distribuições dispersas e aparentemente aleatórias.

Outra questão colocada foi se o ID apresentaria algum tipo de relação com a distância à parede. Os

resultados na zona A parecem evidenciar uma dimensão da mesma ordem de grandeza da que se observa na

camada de plasma, para a qual a deformabilidade máxima aumenta linearmente com a distância. Após essa

distância a deformabilidade máxima estabiliza em torno de 0,12 ( ver Figura 5.3). Este resultado é consistente

com os trabalhos encontrados na literatura [52], que constatam uma migração dos eritrócitos mais rígidos para

as extremidades do canal.

A zona C não apresenta nenhuma tendência discernível na distribuição do ID com a distância à parede. No

entanto como já foi visto anteriormente, a distribuição enviesada de eritrócitos nesta zona, imposta pela

formação de bolhas de ar, discutidos em 5.1.3.1, sobrepõe-se a qualquer tendência natural existente.

Para averiguar se a deformabilidade eritrocitária está relacionada com o diâmetro do eritrócito foi

apresentado o ID em função do diâmetro (Figura 5.3 e Figura 5.7). Em ambas as zonas não se verificou

nenhuma relação entre os parâmetros avaliados. Embora na literatura seja possível encontrar resultados que

relacionam o maior volume de um eritrócito com a sua maior deformabilidade [30], neste trabalho não existem

evidências que suportem essa conclusão.

Síntese da comparação entre a zona A e C

A deformabilidade medida na zona C (ID=0,121±0,088; n=133) foi superior à medida na zona A

(ID=0,042±0,029; n=133) (t-student, p <0,001), sendo consistente com resultados da literatura em semelhantes

condições[18].

Os eritrócitos apresentam um maior alinhamento com as linhas de corrente para a zona C (70% entre -30°

e 30°) do que na zona A (38% 70% entre -30° e 30°). A maior tendência de orientação dos eritrócitos com as

linhas de corrente para maiores tensões de corte é consistente com a literatura [3, 15, 30].

Na zona A é possível verificar a existência de eritrócitos mais rígidos (menos deformáveis) junto à parede,

até uma distância da ordem da camada de plasma encontram-se eritrócitos cada vez mais deformáveis, até o

ID máximo estabilizar em 0,12 para o resto do canal. Na zona C a distribuição dos eritrócitos é imposta pelas

perturbações causadas pelas bolhas de ar, mascarando qualquer tendência organizacional natural que possa

existir. Os resultados observados na zona A estão de acordo com a literatura [52].

É observada uma camada de plasma que, quando adimensionalizada pela largura do canal, aumenta com

a velocidade no canal conforme observado noutro trabalho com maior hematócrito [53].

Não é possível identificar tendências entre o diâmetro e a deformabilidade, embora existam algumas

evidências de maior deformabilidade para eritrócitos com maiores volumes referidos na literatura[30].

5.1.3.3 Comparação entre as zonas A e A2

Entre a zona A e a zona A2 variam dois parâmetros: o hematócrito e o tempo de armazenamento. A zona

A é caracterizada pelo escoamento de sangue com um baixo hematócrito e 18 dias de armazenamento,

enquanto o ensaio A2 é feito com sangue com 3 dias de armazenamento e elevado hematócrito.

60

Apesar de a viscosidade do sangue ser diferente devido à variação de hematócrito, resultando numa

diferença na tensão de corte aplicada, considera-se que a tensão de corte em ambos os casos é da mesma

ordem de grandeza. Desta forma considera-se o efeito do tempo de armazenamento como o maior

responsável nas diferenças encontradas. No entanto a variação destes dois parâmetros requer algum cuidado

na interpretação dos resultados.

Deformabilidade

A amostra da zona A apresenta um ID médio de 0,042, com uma variância de 8,5x10-4

, enquanto a

amostra A2 tem 0,107 de média para o ID e uma variância de 0,375. Confrontando a hipótese nula de que

ambas as populações têm a mesma média contra a hipótese de a zona A2 apresentar uma média superior à da

zona A, é possível rejeitar a hipótese nula aos níveis usuais de significância (p <0,01). Desta forma os dados

obtidos são consistentes com a maior deformabilidade dos eritrócitos na zona A2 em relação à zona A. Estes

resultados estão de acordo com as teorias usualmente encontradas na literatura, de que o envelhecimento dos

eritrócitos provoca a degradação da sua deformabilidade [3, 4, 54]. O efeito do tempo de armazenamento na

deformabilidade dos eritrócitos está bem documentada para o caso de sangue humano, nomeadamente

devido aos bancos de sangue [54], provocando uma diminuição da deformabilidade eritrocitária com o

aumento do tempo de armazenamento.

Para o sangue de cavalo não foram encontrados estudos semelhantes da literatura, no entanto é

expectável que o mesmo fenómeno ocorra sendo, no entanto, necessário mais estudos sobre este fenómeno

para o sangue de equino.

Dado que entre a zona A e A2 variam o hematócrito e o tempo de armazenamento, um destes dois

factores, ou uma combinação de ambos, será responsável por esta alteração. O hematócrito, sendo a

concentração volúmica de eritrócitos no sangue, não é conotado com alterações de deformabilidade individual

dos eritrócitos. No entanto a maior viscosidade correspondente ao maior hematócrito dá origem a maiores

tensões de corte aplicadas aos eritrócitos da zona A2, quando comparada com a tensão de corte aplicada na

zona A. Desta forma quer a redução de deformabilidade do sangue da zona A devido ao maior tempo de

armazenamento, quer as maiores tensões de corte aplicadas aos eritrócitos na zona A2 contribuem para um

maior ID observado na zona A2.

Na literatura foram efectuadas medições do ID de eritrócitos humanos que concluíram que do quinto dia

de armazenamento (eritrócitos numa solução de adenina a 4°C) para o vigésimo houve uma redução de mais

de 50% na deformabilidade eritrocitária [54]. Estes resultados são da ordem de grandeza dos obtidos no

presente trabalho, o que leva a crer que o tempo de armazenamento dá a contribuição mais relevante na

variação de deformabilidade verificada.

Orientação

Os histogramas da orientação dos eritrócitos de ambas as zonas são muito semelhantes, apresentando

ambos uma distribuição muito dispersa ao longo de toda a gama, conforme se pode ver na Tabela 5.4.

61

Tabela 5.4 - Parâmetros retirados da Figura 5.2 e Figura 5.4,utilizados para comparar a distribuição da orientação dos eritrócitos da zona A e A2.

Zona Frequência relativa acumulada

entre -30° e 30° Frequência relativa de orientações

negativas

A 0,37 0,48 A2 0,38 0,51

A semelhança na orientação dos eritrócitos que, como visto na comparação entre a zona A e C, varia com

a tensão de corte aplicada, parece reforçar que o tempo de armazenamento é o maior determinante na

variação da deformabilidade medida. É de notar que o tempo de armazenamento não tem impacto visível na

orientação dos eritrócitos.

Relação entre parâmetros

A zona A2, ao ser filmada no centro da válvula, sem capturar qualquer parede, não permite efectuar

medições viáveis da distância à parede. Desta forma, a única relação comparável é entre a deformabilidade e o

diâmetro.

Para averiguar se a deformabilidade eritrocitária está relacionada com o diâmetro do eritrócito foi

apresentado o ID em função do diâmetro (Figura 5.3 e Figura 5.5, para a zona A e A2,respectivamente). Em

ambas as zonas não se verificou nenhuma relação entre os parâmetros avaliados.

Síntese da comparação entre a zona A e A2

A deformabilidade medida na zona A2 (ID=0,107±0,375; n=973) foi superior à medida na zona A

(ID=0,042±0,029; n=133) (t-student, p <0,001). Para este comportamento contribui principalmente o maior

tempo de armazenamento da zona A2, sendo a maior tensão de corte existente na zona A2 adjuvante

secundário desta tendência.

A orientação dos eritrócitos com as linhas de corrente na zona A (37% entre -30° e 30°) é idêntica à zona

A2 (38% 70% entre -30° e 30°). Este resultado é consistente com a hipótese do tempo de armazenamento ser

mais relevante na descrição das diferenças entre estas zonas do que a tensão de corte.

Não é possível identificar tendências entre o diâmetro e a distância à parede, embora existam algumas

evidências de maior deformabilidade para eritrócitos com maiores volumes referidos na literatura[30].

5.1.4 Seguimento Manual: Zona B

Foram feitos três ensaios de seguimento manual na zona B descrita na secção 2.2.1, com diferentes

características de escoamento. Dois deles foram efectuados 3 dias após a colheita do sangue, um com caudal

de 1 µL/min e outro com 5 µL/min. O terceiro ensaio realizou-se 15 dias após os primeiros ensaios e utilizou um

caudal de 1 µL/min. O objectivo destes ensaios é seguir a deformabilidade individual dos eritrócitos para

diferentes caudais e diferentes tempos de armazenamento. Para os dois primeiros ensaios foram seguidos 10

eritrócitos, enquanto no terceiro ensaio foram seguidos 14, totalizando 34 células seguidas manualmente.

Cada eritrócito seguido percorre uma trajectória diferente estando, portanto sujeito a diferentes tensões

de corte, assim como gradientes transversais de pressão responsáveis pela curvatura das linhas de corrente do

escoamento. Mais, o mesmo eritrócito, à medida que vai percorrendo a sua trajectória, encontra diferentes

tensões de corte e gradientes transversais de pressão. O objectivo do seguimento manual é observar e

62

quantificar a variação do estado de deformação de um eritrócito, à medida que este percorre a sua trajectória.

Os gráficos individuais com esta análise são apresentados no Anexo A.

No entanto, de forma a obter uma noção comparativa dos resultados obtidos em diferentes eritrócitos,

são estabelecidos dois tipos de trajectórias: as centrais, caracterizadas por uma baixa curvatura; e as laterais,

que apresentam uma curvatura mais vincada. Devido a fenómenos que serão discutidos na secção 5.1.4.4,

existe uma escassez de eritrócitos que circulam pelo lado direito e, como tal, optou-se por excluí-los desta

análise.

Para apresentar a variação da deformação à medida que o eritrócito percorre a sua trajectória, optou-se

efectuar uma parametrização linear da trajectória. Sucintamente, esta define uma coordenada, S, como a

distância percorrida desde o início da trajectória, variando entre 0 e 1.

Os resultados dos diferentes eritrócitos que partilham o mesmo tipo de trajectória são agrupados em

intervalos de 10% da trajectória percorrida e apresentados ao longo desta secção.

5.1.4.1 Ensaio 1: Q=1 µL/min e 3 dias de armazenamento

Neste ensaio foram seguidos 10 eritrócitos, divididos pela sua trajectória conforme se mostra na Figura

5.10, sendo os resultados apresentados para cada grupo.

Figura 5.10 – Trajectórias do ensaio 1 do seguimento manual. A tracejado encontra-se a separação entre as trajectórias centrais e laterais. A amarelo estão representadas as trajectórias lineares por troços de cada eritrócito medido, com o eritrócito mais deformável e o de controlo marcados (vide Figura 5.13). É ainda apresentada a coordenada S com os sinais ‘+’ sobre as trajectórias, em que cada marcação limita intervalos de 10% da distância total. Ordem dos eritrócitos da esquerda para a direita: L2,L4,L3,L1 ; C2, C4, C1, C6, C3, C5.

Trajectórias centrais

Para os 6 eritrócitos considerados centrais, apresenta-se na Figura 5.11 o ID em função da percentagem

de trajectória percorrida. O ID oscila entre 0,04 e 0,06 à medida que a trajectória é percorrida, no entanto não

é visível nenhuma relação entre ambos. Observando individualmente o ID dos eritrócitos em questão no Anexo

A, é possível constatar que nenhum apresenta correlação entre estes parâmetros.

63

A velocidade dos eritrócitos, apresentada na Figura 5.11, demonstra um claro aumento do seu valor à

medida que o eritrócito percorre a sua trajectória, praticamente triplicando entre o início e o fim da trajectória,

o que é natural dado a redução da área transversal ao escoamento.

Trajectórias laterais

Os resultados para os 4 eritrócitos que percorrem trajectórias laterais (ver Figura 5.10) são apresentados

na Figura 5.12. O ID varia entre 0,04 e 0,13 com um pequeno pico de deformabilidade entre os 20% e os 40%.

No entanto não existe nenhuma tendência visível na variação deste parâmetro com a trajectória percorrida.

Recorrendo aos gráficos individuais é possível notar que este pico ocorre nas duas trajectórias com maior

curvatura.

Figura 5.11 – Resultados obtidos para o ensaio 1 das trajectórias centrais. Na figura da esquerda apresenta-se um diagrama de caixa de bigodes para o ID, agrupado por secções da trajectória percorrida. A linha encarnada representa a mediana, os limites superiores e inferior da caixa azul o 3º e 1º quartil, respectivamente. Os limites traçados a preto representam os pontos extremos medidos. Cruzes encarnadas representam os pontos que foram considerados outliers. Na figura da direita está um diagrama de caixa de bigodes para a velocidade dos eritrócitos.

.

Figura 5.12 - Resultados obtidos para o ensaio 1 das trajectórias laterais. Na figura da esquerda apresenta-se um diagrama de caixa de bigodes para o ID, agrupado por secções da trajectória percorrida. A linha encarnada representa a mediana, os limites superiores e inferior da caixa azul o 3º e 1º quartil, respectivamente. Os limites traçados a preto representam os pontos extremos medidos. Cruzes encarnadas representam os pontos que foram considerados outliers. É ainda representado com asteriscos encarnados um eritrócito extremamente deformável. Na figura da direita está um diagrama de caixa de bigodes para a velocidade dos eritrócitos.

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

0.16

0.18

0.2

0-10 10-20 20-30 30-40 40-50 50-60 60-70 70-80 80-90 90-100Percentagem da trajectoria percorrida

ID

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26


0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26


Velo

cid

ade [

mm

/s]

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4


ID

64

A velocidade dos eritrócitos aumenta com o trajecto percorrido apresentando, no entanto uma larga

dispersão de valores, como se pode ver pelo intervalo entre os quartis apresentados na Figura 5.12

É ainda de salientar que o eritrócito que percorre a trajectória lateral mais perto das centrais (ver Figura

5.10) apresenta a maior deformabilidade verificada. É interessante verificar a extrema deformabilidade deste

eritrócito quando comparado com os restantes, nomeadamente o facto de o pico de deformabilidade ocorrer

entre os 50% e os 80%, ou seja, na zona com maior curvatura, correspondente à zona de maior gradiente de

pressão transversal. Na Figura 5.13 são apresentadas imagens deste eritrócito durante o seu percurso, em

oposição a um eritrócito de controlo indicado na Figura 5.10.

Figura 5.13 - Comparação entre as deformações do eritrócito de maior deformabilidade e um eritrócito de controlo para as mesmas zonas do trajecto.


Neste ensaio foram seguidos 10 eritrócitos cujas trajectórias se encontram distribuídas conforme se

mostra na Figura 5.14. A escassez de eritrócitos com trajectórias centrais será discutida mais à frente.

Figura 5.14 - Trajectórias do ensaio 2 do seguimento manual. A tracejado encontra-se a separação entre as trajectórias centrais e laterais. A amarelo estão representadas as trajectórias linearizadas de cada eritrócito medido. É ainda apresentada a coordenada S com os sinais ‘+’ sobre as trajectórias, em que cada marcação limita intervalos de 10% da distância total. Ordem dos eritrócitos da esquerda para a direita: L1, L4, L8, L7, L2, L9, L5, L3, L6, C1

65

Trajectória central

Os resultados obtidos para o único eritrócito central apresentam-se na Figura 5.15. O ID varia ao longo da

trajectória, no entanto não revela sinais de uma dependência entre os parâmetros. A velocidade aumenta à

medida que o eritrócito progride na sua trajectória, duplicando o seu valor entre o ponto inicial e final.


Neste ensaio seguiram-se 9 eritrócitos cujas trajectórias foram consideradas laterais. Os resultados

apresentam-se na Figura 5.16. O ID apresenta indícios de aumentar com a trajectória percorrida, até um pico

de deformabilidade de 0,2 entre os 50% e 60% da trajectória, após o qual estabiliza num valor inferior a 0,15.

Observando individualmente os eritrócitos com recurso ao Anexo A, podemos concluir que o pico de

deformabilidade ocorre na zona de maior curvatura, ou seja, de maior gradiente de pressão transversal, sendo

este facto especialmente evidente nas 5 trajectórias mais próximas da parede. Mais, todos os eritrócitos

apresentam um aumento de deformabilidade com o trajecto percorrido.

A velocidade aumenta claramente com o percurso efectuado, sendo a velocidade final cerca de duas vezes

superior à inicial.

Figura 5.15 – Apresentação dos resultados obtidos para o eritrócito central do ensaio 2.

Figura 5.16 - Resultados das trajectórias laterais obtidos no ensaio 2. Na figura da esquerda apresenta-se um diagrama de caixa de bigodes para o ID, agrupado por secções da trajectória percorrida. A linha encarnada representa a mediana, os limites superiores e inferior da caixa azul o 3º e 1º quartil, respectivamente. Os limites traçados a preto representam os pontos extremos medidos. Cruzes encarnadas representam os pontos que foram considerados outliers. Na figura da direita está um diagrama de caixa de bigodes para a velocidade dos eritrócitos.

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 140

45

50

55

60

65

70

Percentagem da trajectoria percorrida

Velo

cid

ade [

mm

/s]

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

0.16

0.18

0.2


ID

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80


Velo

cid

ade [

mm

/s]

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4


ID

66


Para este ensaio foram analisados um total de 14 eritrócitos, 10 dos quais descrevem trajectórias

consideradas centrais e os 4 restantes seguem trajectórias laterais, conforme mostrado na Figura 5.17.

Figura 5.17 - Trajectórias do ensaio 3 do seguimento manual. A tracejado encontra-se a separação entre as trajectórias centrais e laterais. A amarelo estão representadas as trajectórias linearizadas de cada eritrócito medido. É ainda apresentada a coordenada S com os sinais ‘+’ sobre as trajectórias, em que cada marcação limita intervalos de 10% da distância total. São ainda indicadas as trajectórias dos eritrócitos mais deformáveis e daqueles que foram usados como controlo na Figura 5.19. Ordem dos eritrócitos da esquerda para a direita: C6, C9, C7, C1, C2, C3, C5, C10, C4, C8.


Os resultados obtidos para os eritrócitos, cujas trajectórias se consideraram centrais, encontram-se na

Figura 5.18. A deformabilidade no geral apresenta uma ligeira tendência de crescimento em função da

trajectória percorrida. Os valores da mediana do ID obtidos oscilam entre os 0,06 e os 0,12, oscilando um dos

eritrócitos mais deformáveis entre 0,18 e 0,34 e o outro entre 0,27 e 0,33. Estes eritrócitos apresentam

também uma tendência de crescimento mais evidente.

Analisando individualmente a variação do ID apresentada no Anexo A é possível constatar que dos 8

eritrócitos centrais (sem contar os dois mais deformáveis), metade exibe uma ligeira tendência de crescimento

(C1, C2,C7 e C10), enquanto o restante não evidencia essa tendência.

A velocidade aumenta à medida que o eritrócito se aproxima do fim da sua trajectória, duplicando de

valor entre o início e o fim do seu percurso.

Na Figura 5.19, encontram-se apresentados os estádios de deformação dos eritrócitos mais deformáveis,

em contraste com um eritrócito do grupo usado como controlo. As trajectórias destes 3 eritrócitos encontram-

se sinalizadas na Figura 5.17.


Os resultados para os 4 glóbulos laterais encontram-se na Figura 5.20, assim como os valores do eritrócito

mais deformável.

67

A mediana do ID toma valores entre 0,05 e 0,1, enquanto o eritrócito mais deformável oscila entre os 0,05

e os 0,25. Não existe nenhuma relação identificável entre o ID e a trajectória percorrida, e recorrendo ao Anexo

A, verifica-se facilmente a oscilação do ID. Outro factor a salientar é o facto de o pico de deformabilidade do

eritrócito mais deformável ocorrer, novamente, para a zona de maior curvatura, ou seja, maior gradiente de

pressão transversal.

A velocidade dos eritrócitos aumenta com a trajectória percorrida, mais do que duplicando entre o início e

o fim do seu percurso. A mediana da velocidade varia entre 4 mm/s e 13 mm/s.

O eritrócito lateral mais deformável é apresentado na Figura 5.21, de forma visualizar-se a sua

deformação por oposição a um eritrócito de controlo. As trajectórias de ambos os eritrócitos encontram-se

marcadas na Figura 5.17.

Figura 5.18 - Resultados obtidos para o ensaio 3 das trajectórias centrais. Na figura da esquerda apresenta-se um diagrama de caixa de bigodes para o ID, agrupado por secções da trajectória percorrida. A linha encarnada representa a mediana, os limites superiores e inferior da caixa azul o 3º e 1º quartil, respectivamente. Os limites traçados a preto representam os pontos extremos medidos. Cruzes encarnadas representam os pontos que foram considerados outliers. É ainda representado com asteriscos verdes (C8) e azuis (C3) os dois eritrócitos mais deformávei. Na figura da direita está um diagrama de caixa de bigodes para a velocidade dos eritrócitos.

Figura 5.19 - Comparação entre as imagens originais dos dois eritrócitos mais deformáveis, com trajectórias centrais, e de um eritrócito de controlo para as mesmas zonas do trajecto.

0

3

6

9

12

15

18

21

24

27

30


Velo

cid

ade [

mm

/s]

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

0.16

0.18

0.2

0.22

0.24

0.26

0.28

0.3

0.32

0.34

0.36


ID

68

Figura 5.20 - Resultados obtidos para o ensaio 3 das trajectórias laterais. Na figura da esquerda apresenta-se um diagrama de caixa de bigodes para o ID, agrupado por secções da trajectória percorrida. A linha encarnada representa a mediana, os limites superiores e inferior da caixa azul o 3º e 1º quartil, respectivamente. Os limites traçados a preto representam os pontos extremos medidos. Cruzes encarnadas representam os pontos que foram considerados outliers. É ainda representado com asteriscos verdes (E2) o eritrócito mais deformável. Na figura da direita está um diagrama de caixa de bigodes para a velocidade dos eritrócitos.

Figura 5.21 - Comparação entre as imagens originais do eritrócito deformável E2, com trajectória lateral, e de um eritrócito de controlo para as mesmas zonas do trajecto.

5.1.4.4 Comparação e discussão dos ensaios da zona B

Os resultados da zona B, obtidos por seguimento manual, pretendem medir a variação do estado de

deformação de um eritrócito à medida que este percorre a sua trajectória na contracção da válvula, sendo

sujeito a diferentes tensões de corte e gradientes de pressão transversal ao longo do seu percurso.

A formação de bolhas de ar descrita anteriormente em 5.1.3.1 também afecta estas medições,

nomeadamente na distribuição dos eritrócitos, influenciando a frequência com que cada tipo de trajectória

ocorre (e.g. o ensaio 2 foi obtido em condições de escassez de eritrócitos com trajectórias centrais).

As trajectórias centrais são caracterizadas por estarem sujeitas a menores gradientes de velocidade e de

pressão transversal, e consequentemente, sofrerem menores tensões de corte do que as trajectórias laterais.

Estes factos justificam a maior variação do ID verificada para as trajectórias laterais do que nas centrais,

excepto no ensaio 3 onde apresentam a mesma variação, conforme resumido na Tabela 5.5.

0

3

6

9

12

15

18

21

24

27

30


Velo

cid

ade [

mm

/s]

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4


ID

69

Tabela 5.5 – Resumo dos dados apresentados para o seguimento manual. Variação da mediana do ID para os ensaios da zona B.

Ensaio 1

(Q=1µl/min, tempo de armazenamento 3 dias)

Ensaio 2 (Q=5µl/min, tempo de

armazenamento 3 dias)

Ensaio 3 (Q=1µl/min, tempo de

armazenamento 18 dias)

Gama do ID n Gama do ID n Gama do ID n Trajectórias

centrais 0,04-0,07 6 0,11-0,15 1 0,08-0,12 8


0,04-0,13 3 0,09-0,20 9 0,07-0,11 3

Diâmetro

A média dos diâmetros dos eritrócitos identificados em cada ensaio está exposta na Tabela 5.6. O

objectivo desta análise é comparar com os resultados obtidos no processamento automático, de forma a

esclarecer as origens da discrepância nas medições de área efectuadas ao longo deste trabalho.

Tabela 5.6 – Comparação do diametro experimental e teórico.

Ensaio 1 Ensaio 2 Ensaio 3

Diâmetro médio experimental [µm] 5,5 5,4 5,6 Erro experimental [%] 3 6 3 Diâmetro literatura [38-40] Diâmetro médio varia entre 5,2 e 5,6 µm Diferença relativa entre a literatura e experimental [%] 2 4 -

A comparação desta tabela com a Tabela 5.1 permite concluir que o facto de o utilizador editar

manualmente os resultados do processamento automático aproxima os valores medidos dos valores

encontrados na literatura. Este facto revela a existência de um erro sistemático de subestimação da área no

processamento automático das zonas A, A2 e C, mencionado anteriormente em 3.3.3.

Efeito do caudal

O aumento de caudal manifesta-se num aumento da velocidade média no canal, criando gradientes de

velocidade mais intensos, que sujeitam os eritrócitos a uma maior tensão de corte. A variação da tensão de

corte ao longo do canal é semelhante para os dois caudais, mas a magnitude dessa tensão de corte é superior

para o ensaio 2, onde o caudal é 5 vezes superior.

A comparação entre as trajectórias centrais carece de relevância estatística, uma vez que apenas um

eritrócito central é identificado no ensaio 2.

As trajectórias laterais do ensaio 2 apresentam não só medianas superiores às do ensaio 1, como uma

tendência crescente mais acentuada. Estes resultados são consistentes com a magnitude e variação da tensão

de corte supracitados.

Outro facto a salientar é a correspondência encontrada entre a zona de maior curvatura e os valores

máximos do ID. Para o ensaio 2, os 5 eritrócitos com trajectórias laterais mais marcadas apresentam o seu valor

máximo de deformação na zona de maior curvatura (50% <s <70%), sendo esta a zona de maior gradiente de

pressão transversal. Para o ensaio 1, os eritrócitos laterais com maior deformabilidade são os que possuem as

trajectórias mais curvas, no entanto o seu pico de deformabilidade ocorre entre os 20% e 40%, não coincidindo

totalmente com a zona de maior curvatura.

70

Efeito do tempo de armazenamento

Entre estes ensaios varia somente o tempo de armazenamento, sendo o caudal escoado igual em ambos

os casos. As trajectórias centrais do ensaio 3 (com maior tempo de armazenamento) apresentam um valor do

ID geralmente superior, assim como uma tendência de crescimento, ainda que ligeira. Para o ensaio 1 não é

evidente nenhuma tendência. Estes resultados indiciam que os eritrócitos estão sujeitos a uma variação de

tensão de corte insuficiente para realçar as diferenças de deformabilidade entre ambos os ensaios.

Quanto às trajectórias laterais, o ensaio 1 apresenta uma maior variação do ID que o ensaio 3, mas não é

possível tirar nenhuma tendência inequívoca uma vez que ambos os comportamentos são muito semelhantes.

Outro factor relevante é o facto de o pico de deformabilidade do eritrócito lateral mais deformável do ensaio 3

ocorrer na zona de maior curvatura. De forma similar, as maiores deformabilidades nas trajectórias laterais do

ensaio 1 ocorrem nas trajectórias sujeitas a um maior gradiente de pressão transversal ( mais curvas), com o

valor máximo de deformabilidade a ocorrer imediatamente antes da zona de maior curvatura (20%<s<40%).

Estas observações não são consistentes com o decréscimo de deformabilidade dos eritrócitos com o

tempo de armazenamento, como os resultados obtidos aquando da comparação entre a zona A e a zona A2.

No entanto o carácter individual desta análise leva à comparação de amostras pequenas (n<10), com todos os

problemas daí decorrentes.

Síntese das conclusões

O ensaio com maiores velocidades (ensaio 2) permitiu medir maiores variações na deformabilidade

individual, com um comportamento crescente da deformabilidade em relação ao trajecto percorrido. Os

ensaios com igual caudal e diferentes tempos de armazenamento não apresentam diferenças significativas

entre si.

A ocorrência dos maiores picos de deformação nas trajectórias laterais, nomeadamente na zona de maior

curvatura (ou nas suas imediações no caso do ensaio 1), mostram a importância do gradiente de pressão

transversal no mecanismo da deformação eritrocitária em contracções, sendo este contributo

consideravelmente maior para o maior caudal ensaiado (ensaio 2).

5.2 Microcanal de constrição

A análise feita neste microcanal consiste no seguimento manual de eritrócitos que são forçados a passar

por uma constrição cuja dimensão é da ordem de grandeza do seu diâmetro. Os parâmetros analisados são o

ID e a velocidade dos eritrócitos para um caudal imposto de 0,01µL/min.

Tendo em conta que existem duas constrições, os resultados são apresentados em função daquela que o

eritrócito atravessa. Foram medidos 10 eritrócitos para cada constrição.

A trajectória efectuada pelos eritrócitos é aproximadamente linear, variando muito pouco na direcção

transversal ao canal. Assim, a coordenada axial do centróide do eritrócito em pixel, Z(i), é utilizada como forma

de medir a distância percorrida, s(i), sendo adimensionalizada pela distância total em pixel:

Foram definidas zonas de semelhança para cada canal, para as quais foram agrupadas as medições cuja

coordenada s se encontra dentro os limites dessas zonas. O microcanal superior foi dividido em 4 zonas e o

71

inferior em 3. Esta diferença justifica-se pela existência de eritrócitos presos junto da divisão do canal,

identificados na Figura 5.22, que introduzem assimetrias na convergência das contrições. A zona S2 do canal

superior é utilizada para medir a deformação dos eritrócitos ao contornarem o obstáculo assinalado.

Figura 5.22 – Representação das trajectórias dos eritrócitos pela constrição superior e inferior. Cada cor de círculos representa o trajecto de um eritrócito. Ambas as contrições se encontram divididas por secções, sendo o canal superior dividido em 4 e o inferior em 3. As cruzes pretas representam eritrócitos presos que se mantiveram imóveis durante todo o ensaio.

Constrição inferior

Os resultados obtidos para os 10 eritrócitos estudados que atravessam a constrição inferior encontram-se

na Figura 5.23. A mediana do ID varia entre 0,08 e 0,13, não apresentando indícios de variar com a trajectória

percorrida. A velocidade dos eritrócitos já sugere um aumento de velocidade com a trajectória percorrida. A

sua mediana varia entre 74mm/s e 106 mm/s.

Figura 5.23 - Resultados obtidos para os 10 eritrócitos na constrição inferior. Na figura da esquerda apresenta-se um diagrama de caixa de bigodes para o ID, agrupado por secções da trajectória percorrida. A linha encarnada representa a mediana, os limites superiores e inferior da caixa azul o 3º e 1º quartil, respectivamente. Os limites traçados a preto representam os pontos extremos medidos. Cruzes encarnadas representam os pontos que foram considerados outliers. Na figura da direita está um diagrama de caixa de bigodes para a velocidade dos eritrócitos.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

secção 1 secção 2 secção 3

Velo

cid

ade[m

m/s

]

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

secção 1 secção 2 secção 3

ID

5

µm

72

Constrição superior

A Figura 5.24 apresenta os resultados obtidos para os 10 eritrócitos que atravessam a constrição superior.

A mediana do ID apresenta um pico de 0,22 na secção 2 (S2 da Figura 5.22), decrescendo para 0,11 na secção 4.

Na análise da velocidade é necessário juntar as duas primeiras secções, uma vez que a primeira secção

apenas possui uma medição de cada eritrócito. O cálculo da velocidade requer a localização do centróide do

eritrócito em duas imagens seguidas. Como neste caso o centróide na segunda imagem já se encontra dentro

da secção seguinte, optou-se por fundir ambas as secções. A velocidade apresenta uma tendência de

crescimento com a trajectória percorrida, passando de 80 mm/s na secção 1 e 2 para 172mm/s na secção da

constrição.

Figura 5.24 - Resultados obtidos para os 10 eritrócitos medidos na constrição superior. Na figura da esquerda apresenta-se um diagrama de caixa de bigodes para o ID, agrupado por secções da trajectória percorrida. A linha encarnada representa a mediana, os limites superiores e inferior da caixa azul o 3º e 1º quartil, respectivamente. Os limites traçados a preto representam os pontos extremos medidos. Cruzes encarnadas representam os pontos que foram considerados outliers. Na figura da direita está um diagrama de caixa de bigodes para a velocidade dos eritrócitos.

5.2.1 Discussão dos resultados obtidos

As medições efectuadas com o microcanal de constrição não são reprodutíveis, devido ao bloqueio do

canal pelos eritrócitos que, mais tarde ou mais cedo, acabam por inutilizá-lo. A estabilização do escoamento

nunca é conseguida, uma vez que o canal entope sempre primeiro, acabando por ficar inutilizado. Esta demora

está relacionada com os baixos caudais utilizados (da ordem dos 0,01 µL/min), que não são capazes de

preencher totalmente a zona de saída circular conforme mostrado na Figura 5.25. De facto, durante os ensaios,

nunca chegou a sair sangue para o reservatório de descarga, ficando sempre o sangue no início do tubo de

saída.

Figura 5.25 – Enchimento deficiente de uma zona de saída.

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

secção 1 secção 2secção 3 secção 4

ID

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

secção 1+2 secção 3 secção 4

Velo

cid

ade[m

m/s

]

73

Os resultados obtidos sugerem que a maior deformabilidade ocorre antes de o eritrócito entrar na zona

convergente, decrescendo para o valor mais baixo enquanto este atravessa o canal.

Para o canal superior a maior deformabilidade (0,22) ocorre em S2, onde o eritrócito é forçado a passar

numa zona de dimensão equivalente ao canal, entre a parede e um obstáculo, chegando mesmo a contorná-

lo.. A passagem para a zona de convergência, mais larga que a zona S2, é consistente com a redução do estado

de deformação do eritrócito. No entanto a redução do estado de deformabilidade dentro da constrição já não

é consistente com o aumento da tensão de corte nessa zona.

Os eritrócitos do canal inferior aparentam diminuir o seu estado de deformação com a trajectória

percorrida, não sendo consistente com a hipótese de uma maior tensão de corte dentro da constrição.

Este comportamento pode residir numa variação de caudal indesejada. Esta pode ser provocada pelo

aumento de resistência induzida pela entrada do eritrócito na constrição, diminuindo o caudal escoado nesse

canal e aumentando o caudal escoado no outro, reduzindo assim a tensão de corte aplicada ao eritrócito

dentro da constrição.

A variação das velocidades medidas sugere que o canal superior tem um maior caudal que o inferior, o

que supõe uma tensão de corte superior. A maior deformabilidade dos eritrócitos observada neste canal é

consistente com a hipótese de maior tensão de corte no canal superior, assim como o facto de apenas ocorrer

hemólise neste canal, como se verá na próxima secção.

5.3 Hemólise

Durante os ensaios feitos nos microcanais de constrição foi possível registar vários eritrócitos cuja

membrana se rompia. Este fenómeno dá pelo nome de hemólise. A análise da deformação e velocidade até

ocorrer a ruptura são os parâmetros utilizados na caracterização deste fenómeno, acompanham-se ainda os

resultados com algumas imagens elucidativas da hemólise.

Este fenómeno foi observado somente na constrição superior, num total de 5 eritrócitos. Na Figura 5.26

apresenta-se o canal superior com os pontos onde foram efectuadas as medições até ocorrer a hemólise. O

local de ruptura pode ser visto na Figura 5.26, tendo 4 dos eritrócitos colapsado até 6 µm dentro da constrição,

e um deles na zona de convergência, a 5,4 µm do início da constrição.

Figura 5.26 - Representação das trajectórias dos eritrócitos pela constrição superior até ocorrer a sua hemólise. Cada cor de círculos representa o trajecto de um eritrócito. A hemólise ocorreu até 6 µm dentro do canal (azul escuro). Um dos eritrócitos (azul claro) colapsou 5,4 µm antes do início da constrição.

74

Como se pode ver na Figura 5.27, o ID é reduzido, diminuindo com a trajectória percorrida, variando entre

0,08 na primeira secção e 0,03 nas duas últimas. A velocidade não apresenta uma dependência notória da

trajectória percorrida, oscilando entre 48 mm/s e 68 mm/s. Quer o ID, quer a velocidade dos eritrócitos com

hemólise são inferiores aos obtidos para os eritrócitos que não colapsam, conforme se encontra sintetizado na

Tabela 5.7 e

Tabela 5.8, respectivamente. Estes resultados indiciam que, para as mesmas condições de tensão de corte,

os eritrócitos com menor capacidade de deformação (ver Tabela 5.7) são os mais propensos a colapsar. Assim,

os resultados obtidos são consistentes com os resultados da literatura[35, 36], onde um dos principais factores

responsáveis pela hemólise é uma deficiente capacidade de deformação.

É interessante constatar que a discrepância entre as velocidades aumenta com a redução da área da

secção transversal, indicando que, quanto mais extremas forem as forças aplicadas ao eritrócito, mais evidente

é a sua insuficiência a nível de deformabilidade, até por fim ocorrer a sua hemólise (ver

Tabela 5.8).

Na Figura 5.28 apresenta-se a sequência de imagens de uma hemólise registada como exemplo qualitativo

do fenómeno. As etapas observadas coincidem com a descrição feita do fenómeno observado noutros

trabalhos em condições semelhantes [35, 36]. Esta descrição relata algumas características observadas na

Figura 5.28, nomeadamente o rompimento da membrana na frente do eritrócito (seta verde), libertando o

citoplasma do seu interior (seta vermelha). O eritrócito é posteriormente esvaziado e transportado pelo

escoamento.

Figura 5.27 - Resultados obtidos para os 5 eritrócitos em que se verificou hemólise. Na figura da esquerda apresenta-se um diagrama de caixa de bigodes para o ID, agrupado por secções da trajectória percorrida. A linha encarnada representa a mediana, os limites superiores e inferior da caixa azul o 3º e 1º quartil, respectivamente. Os limites traçados a preto representam os pontos extremos medidos. Cruzes encarnadas representam os pontos que foram considerados outliers. Na figura da direita está um diagrama de caixa de bigodes para a velocidade dos eritrócitos.

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

S1 S2 S3 S4

ID

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

S1 S2 S3 S4

Vel

ocid

ade[

mm

/s]

75

Tabela 5.7 - Diferença da mediana do ID para os eritrócitos que atravessaram o canal superior com e sem hemólise.

S1 S2 S3 S4

ID n ID n ID n ID n Sem hemólise 0,169 10 0,220 19 0,175 9 0,105 41 Com hemólise 0,084 7 0,050 13 0,030 13 0,036 8 Diferença relativa (%) 50,3 - 77,3 - 82,9 - 65,7 -

Tabela 5.8 - Diferença da mediana da velocidade para os eritrócitos que atravessaram o canal superior com e sem hemólise.

S1 e S2 S3 S4

V [mm/s] n V [mm/s] n V [mm/s] n Sem hemólise 81 19 132 9 172 41 Com hemólise 67 15 54 13 47 8 Diferença relativa (%) 17,3 - 59,1 - 72,7 -

Figura 5.28 – Sucessão de imagens capturadas durante a hemólise de um eritrócito. A seta encarnada mostra o local onde o conteúdo da célula é expelido e a seta verde o ponto de rotura da membrana.

76

6. Conclusões e trabalho futuro

6.1 Síntese conclusiva

O trabalho desenvolvido nesta tese teve como objectivo principal estudar a deformabilidade dos

eritrócitos em dois casos diferentes: escoamentos em canais cujo tamanho é da ordem de grandeza dos

diâmetros dos eritrócitos (microcanal de constrição), e escoamentos em canais com dimensão muito superior

aos diâmetros dos eritrócitos (microcanal com válvula).

O microcanal com válvula já existia no laboratório, mas o microcanal de constrição teve de ser fabricado

em PDMS, e selado com uma lamela de vidro para permitir a visualização dos eritrócitos. Devido ao seu

tamanho reduzido (largura mínima e altura de 4 µm), foi necessário aperfeiçoar o método de fabrico utilizado

no laboratório para atingir os objectivos pretendidos. O microcanal utilizado nas medições de eritrócitos

apresenta uma largura mínima de 7 µm e altura de 4 µm devido à imprecisão do processo de fabrico. Durante

esta etapa foi desenvolvida uma abordagem alternativa que se revelou utilizável para dimensões superiores a

50 µm sem restrições a nível da rugosidade do canal.

O sangue utilizado foi sangue de cavalo, desfibrinado para impedir a sua coagulação. O sangue foi testado

após 3 dias de armazenamento a 4°C e novamente após 18 dias nas mesmas condições de armazenamento.

Os resultados foram obtidos através de um processamento digital de imagem totalmente desenvolvido

em ambiente Matlab®. Os eritrócitos foram segmentados a partir das imagens originais (em escala de

cinzentos 0-255), obtendo uma imagem binária (0 ou 1) através de uma de duas técnicas escolhidas pelo

utilizador: subtracção do segundo plano (‘Background Subtraction’); e aplicação de limites no nível de

intensidades de cinzento (Thresholding). A imagem binária foi posteriormente filtrada para remover objectos

cujas dimensões excedessem os limites definidos pelo utilizador, assim como objectos cuja forma geométrica

apresentasse um parâmetro adimensional de circularidade inferior ao definido pelo utilizador. Caso o utilizador

deseje, pode editar os resultados obtidos após estes filtros terem sido aplicados. Este método de edição foi

utilizado para os microcanais de constrição e para o seguimento individual de eritrócitos como forma de medir

sempre o mesmo eritrócito.

Após os eritrócitos estarem segmentados, foi ajustada uma elipse com o mesmo momento central

normalizado de segunda ordem que o objecto na imagem. A partir desta elipse foram obtidos os parâmetros

medidos: índice de deformabilidade elíptica (ID), definido como a razão entre a diferença dos eixos da elipse e

a soma destes; diâmetro circular equivalente, calculado para o círculo com a mesma área que a elipse; ângulo

entre o maior eixo da elipse e o centro do canal; distância à parede e velocidade (quando possível). Após obter

estes parâmetros foi feito um pós-processamento que consistiu em apresentar a informação sob a forma de

gráficos, histogramas e caixas de bigodes.

Os ensaios realizados no microcanal com válvula concentraram-se em 3 locais diferentes: dentro da

válvula (zona A e A2) onde a largura é maior (724 µm), ocorrendo baixas tensões de corte; no canal após a

válvula (zona C) onde a menor largura (90 µm) justifica maiores tensões de corte do que na válvula; na zona da

contracção da válvula (zona B), onde a variação da tensão de corte a que os eritrócitos estão sujeitos permite o

seguimento individual de várias células, registando a variação da sua deformação. O objectivo das medições

nas zonas A,A2 e C é a inferência estatística dos parâmetros que caracterizam a população de eritrócitos que

77

circula naquelas áreas. Para tal, foi feita uma análise sem edição manual, com um passo entre imagens

analisadas que assegurasse a não medição do mesmo eritrócito duas vezes, já que o objectivo é medir o maior

número de diferentes eritrócitos possível. A zona B foi utilizada para seguir um eritrócito e estudar a variação

das suas propriedades à medida que o eritrócito atravessa a contracção, sendo o processamento digital

editado manualmente quando necessário.

A deformabilidade medida na zona de maior tensão de corte (zona C: ID=0,121±0,088; n=133) foi superior

à medida em condições de menor tensão de corte (zona A: ID=0,042±0,029; n=169) (t-student, p <0,001). Os

eritrócitos apresentam um maior alinhamento com o eixo de canal para a maiores tensões de corte (zona C:

70% entre -30° e 30°) do que para menores tensões de corte (zona A: 38% entre -30° e 30°).Os eritrócitos que

com 3 dias de armazenamento apresentaram um ID superior (zona A2: ID=0,107±0,612; n=973) aos testados no

mesmo local mas com 18 dias de armazenamento (zona A: ID=0,042±0,029; n=169).

O aumento do ID com o trajecto percorrido é evidente para um caudal de 5 µL/min, não existindo indícios

do mesmo comportamento para um caudal de 1 µL/min. A sistemática ocorrência dos valores máximos do ID

nas trajectórias laterais, assim como o pico de deformabilidade desses eritrócitos ocorrer maioritariamente

para as zonas de maior curvatura, evidência a importância do gradiente transversal de pressão na

deformabilidade dos eritrócitos desta zona, particularmente para os caudais mais elevados.

O andamento da deformabilidade obtida experimentalmente nos microcanais de constrição não é

consistente com o facto da maior tensão de corte ocorrer na constrição. Os resultados apresentam uma

diminuição da deformabilidade à medida que o eritrócito se desloca na direcção da constrição (ou seja, de

maior tensão de corte). Algumas limitações destes ensaios, como a obtenção de resultados em regime

transiente poderão explicar estes resultados. É necessário efectuar mais medições assim que forem

ultrapassadas estas limitações.

Foi ainda observado o fenómeno da hemólise nestes microcanais de constrição. Os eritrócitos colapsaram

numa região entre 5,4 µm antes da constrição e 6 µm após entrada na constrição. A deformabilidade medida

para estes eritrócitos (ID=0,03÷0,08) é cerca de 50 a 83% inferior à obtida para eritrócitos que atravessa

incólumes a constrição (ID=0,11÷0,22). A velocidade dos eritrócitos colapsados (47 mm/s - 67 mm/s) é 17 a

73% inferior ao caso normal (81 mm/s - 172 mm/s). Estes resultados são consistentes com a literatura, no

sentido em que os eritrócitos de pouca deformabilidade são mais propensos à hemólise.

O processamento digital de imagem apresenta limitações ao nível do ID máximo que pode medir, assim

como diâmetros mínimos e máximos detectáveis, consoante os parâmetros utilizados (ver Tabela 6.1). Foi

também detectado um erro sistemático de subestimação do diâmetro para o processamento automático (zona

A, A2 e C).

Tabela 6.1- Limitações do processamento digital de imagem


Diâmetro mínimo [µm] 3,18 2,78 2,76 Diâmetro máximo [µm] 5,74 7,37 5,95 ID máximo 0,23 0,23 0,48

78

O escoamento no microcanal com válvula leva à formação de bolhas de ar instáveis nos cantos da válvula.

Estas bolhas, ao alterarem o seu tamanho, criam assimetrias no escoamento, alterando a distribuição de

eritrócitos dentro da válvula e do canal, assim como as tensões de corte a que os eritrócitos estão sujeitos. Este

facto, aliado à escolha grosseira do hematócrito utilizado, resulta numa fraca reprodutibilidade destes ensaios.

Os ensaios feitos no microcanal de constrição não têm reprodutibilidade uma vez que o canal é inutilizado

após a medição. A não reprodutibilidade resulta da combinação da irregularidade do processo de fabrico, do

reduzido tamanho dos canais e da impossibilidade de controlar eficazmente o hematócrito da amostra. As

imagens têm que ser recolhidas em contra-relógio, uma vez que é uma questão de tempo até o canal bloquear

e ficar inutilizado. A impossibilidade de estabilizar o caudal antes de o canal bloquear é outra limitação do

estudo aqui efectuado, tendo os resultados sido obtidos em regime transiente.

6.2 Sugestões de trabalho futuro

Este trabalho foi pioneiro no laboratório na medida em que nunca se tinha fabricado ou ensaiado

microcanais de tamanho tão reduzido. Este facto revela vastas possibilidades para trabalho futuro, não

necessariamente relacionado com o escoamento de sangue.

Os resultados obtidos no microcanal de válvula podem ser complementados, fazendo mais medições com

diferentes tempos de armazenamento, de forma a obter uma melhor compreensão deste parâmetro

fundamental em bancos de sangue, na deformabilidade eritrocitária. De facto, uma vez que as ferramentas de

processamento digital de imagem estão desenvolvidas, pode-se testar a influência dos mais diversos

parâmetros na deformabilidade eritrocitária. A comparação de sangue saudável com sangue doente, a

comparação de sangue de diversas espécies ou a comparação do efeito de diversos anticoagulantes, são

estudos interessantes que podem ser feitos.

Para o microcanal de constrição são necessários mais ensaios de forma a validar ou infirmar os resultados

aqui obtidos. No entanto, é necessário desenvolver um esforço no sentido de permitir a reprodutibilidade

deste tipo de ensaios. Para tal é fundamental garantir um correcto e rápido enchimento de todas as zonas do

canal com líquido, permitindo efectuar medições em regime estacionário.

No seguimento do estudo da deformabilidade eritrocitária, fica por aperfeiçoar o método de medição da

perda de pressão através do micromanómetro diferencial. O teste de um maior número de corantes de forma a

encontrar um corante sem resíduos e com intensidade suficiente é um passo crucial para o desenvolvimento

deste dispositivo. Com este micromanómetro diferencial desenvolvido é possível partir para o estudo da perda

de pressão causada pela passagem de um eritrócito, relacionando-a com a deformabilidade desse eritrócito, ou

medir a variação de pressão durante os fenómenos de hemólise aqui registados.

Outra possibilidade consiste no melhoramento e expansão do programa de processamento digital de

imagem, com possíveis melhoramentos ao nível do tratamento de fenómenos tridimensionais, interface para o

utilizador ou até a implementação de outros métodos que aumentam a versatilidade e eficiência do programa.

79

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I

Anexo A: Gráficos do seguimento de eritrócitos na zona B

Este anexo apresenta os gráficos obtidos do seguimento individual caso a caso.

Ensaio 1


0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4


ID

Deformação do eritrócito C1 do ensaio 1 da zona B

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

3

6

9

12

15

18

21

24

27

30


Velo

cid

ade [

mm

/s]

Velocidade do eritrócito C1 do ensaio 1 da zona B

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4


ID


0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

3

6

9

12

15

18

21

24

27

30


Velo

cid

ade [

mm

/s]


0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4


ID


0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

3

6

9

12

15

18

21

24

27

30


Velo

cid

ade [

mm

/s]


0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4


ID


0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

3

6

9

12

15

18

21

24

27

30


Velo

cid

ade [

mm

/s]


0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4


ID


0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

3

6

9

12

15

18

21

24

27

30


Velo

cid

ade [

mm

/s]


II

Trajectórias laterais:

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4


ID


0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

3

6

9

12

15

18

21

24

27

30


Velo

cid

ade [

mm

/s]


0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4


ID

Deformação do eritrócito E1do ensaio 1 da zona B

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80


Velo

cid

ade [

mm

/s]

Velocidade do eritrócito E1 do ensaio 1 da zona B

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4


ID


0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80


Velo

cid

ade [

mm

/s]


0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4


ID


0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80


Velo

cid

ade [

mm

/s]


0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4


ID


0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80


Velo

cid

ade [

mm

/s]


III

Ensaio 2


0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4


ID


0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80


Velo

cid

ade [

mm

/s]


0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4


ID


0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80


Velo

cid

ade [

mm

/s]


0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4


ID


0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80


Velo

cid

ade [

mm

/s]


0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4


ID


0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80


Velo

cid

ade [

mm

/s]


0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4


ID


0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80


Velo

cid

ade [

mm

/s]


IV

Ensaio 3


0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80


Velo

cid

ade [

mm

/s]


0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4


ID


0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80


Velo

cid

ade [

mm

/s]


0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4


ID


0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4


ID


0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80


Velo

cid

ade [

mm

/s]


0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4


ID


0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80


Velo

cid

ade [

mm

/s]


0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4


ID


0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

3

6

9

12

15

18

21

24

27

30


Velo

cid

ade [

mm

/s]


V

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4


ID


0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

3

6

9

12

15

18

21

24

27

30


Velo

cid

ade [

mm

/s]


0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4


ID


0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

3

6

9

12

15

18

21

24

27

30


Velo

cid

ade [

mm

/s]


0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4


ID


0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

3

6

9

12

15

18

21

24

27

30


Velo

cid

ade [

mm

/s]


0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4


ID


0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

3

6

9

12

15

18

21

24

27

30


Velo

cid

ade [

mm

/s]


0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4


ID


0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

3

6

9

12

15

18

21

24

27

30


Velo

cid

ade [

mm

/s]


0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4


ID


0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

3

6

9

12

15

18

21

24

27

30


Velo

cid

ade [

mm

/s]


VI

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4


ID


0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4


ID


0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

3

6

9

12

15

18

21

24

27

30


Velo

cid

ade [

mm

/s]


0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4


ID


0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

3

6

9

12

15

18

21

24

27

30


Velo

cid

ade [

mm

/s]


0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

3

6

9

12

15

18

21

24

27

30


Velo

cid

ade [

mm

/s]


VII

Trajectórias laterais:

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4


ID


0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

3

6

9

12

15

18

21

24

27

30


Velo

cid

ade [

mm

/s]


0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4


ID


0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

3

6

9

12

15

18

21

24

27

30


Velo

cid

ade [

mm

/s]


0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4


ID


0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

3

6

9

12

15

18

21

24

27

30


Velo

cid

ade [

mm

/s]


0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4


ID


0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

3

6

9

12

15

18

21

24

27

30


Velo

cid

ade [

mm

/s]


caracterização dinâmica da deformação de eritrócitos de ... · 1.2 componentes constituintes...

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