Capítulo 6. Alinhamentos múltiplos de sequências macromoleculares. versão 0.5

Como vimos no capítulo anterior, o procedimento de alinhamento entre sequências de macromoléculas equivale ao estabelecimento de homologia sequencial dos monômeros dessas macromoléculas. Dentro da perspectiva evolutiva, estabelecer essa homologia significa gerar hipóteses de que dois monômeros de macromoléculas atuais, ou pelo menos um deles, estava em uma molécula de um organismo ancestral. No caso de três sequências ou mais, conceitualmente o alinhamento resulta na proposta de homologias sequenciais entre as macromoléculas consideradas.

Aqui cabe um aprofundamento do conceito de homologia, dada as peculiaridades que existem no estudos comparativos e evolutivos das macromoléculas. Ortologia e Paralogia

Logo que se iniciaram os estudos comparativos de macromoléculas, notou-se que algumas delas ocorriam em mais que uma cópia no genoma dos organismos. Essas versões diferentes de uma mesma macromoléculas foram postuladas como tendo sido resultado de duplicações gênicas, ou seja, um gene que existia em um ser vivo no passado, passou a existir em mais de uma cópia. Esses membros das chamadas famílias gênicas passaram a ser chamados de entidades parálogas, em contraposição às entidades ortólogas, que seriam aquelas que ocorrem em organismos diferentes, desde que as suas linhagens começaram a diversificar a partir do processo de especiação que ocorreu na espécie ancestral comum mais recente. Na figura 1 as relações de paralogia e ortologia são exemplificadas.

Figura 1. Paralogia e ortologia de genes em relação à história evolutiva deles. As duplicações gêniccas originam cópias parálogas.

Embora as cópias parálogas de macromoléculas possam sofrer os mesmos processos que levam à diferenciação entre elas ao longo do tempo (mutações seguidas de seleção natural ou deriva genética que levam às substituições ou aos indels), o fato de que cópias de um mesmo gene coexistam na mesma célula implica diferenças importantes nos processos relacionados com a evolução dessas cópias, em relação àquilo que ocorre nas macromoléculas ortólogas.

Em primeiro lugar, depois do evento de duplicação gênica, o que ocorre com as cópias é definido pelas dependências funcionais dos organismos em relação a essas cópias. Por exemplo, se verificou que um dos mecanismos de resistência de bactérias a antibióticos era a existência de cópias múltiplas de genes que codificam para proteínas que têm alguma atividade na metabolização e

consequente neutralização desses antibióticos, sendo que a função "primária" desses genes era bem diferente. Existem algumas situações em que a existência de cópias múltiplas de genes é evidentemente relacionada à necessidade de incremento da taxa de síntese dos produtos gênicos, que poderia ser um fator limitante metabólico em alguns contextos. Por exemplo, os cistrons ribossômicos existem em grandes números de cópias em diversos genomas, o que pode ser explicado facilmente pois o ribossomo participa da síntese proteica, sendo portanto um componente essencial no metabolismo celular. Se, entretanto, uma única cópia de um gene é suficiente para as situações enfrentadas por um organismo, após o evento de duplicação gênica, dois destinos têm sido verificados: a sub-funcionalização que pode culminar com a total perda de qualquer função, ou a neo-funcionalização. No caso de perda de função, a teoria prevê que aquela cópia que primeiro sofrer alguma mutação deletéria que aumente de frequência por deriva genética, tenderá a acumular mutações, já que a função desempenhada pela outra cópia estará presente. Isso implica um relaxamento na intensidade de seleção natural negativa, ou seja, uma molécula redundante terá maior liberdade de evolução, o que inclui as porções ditas conservadas, mais sensíveis às mudanças nas cópias integralmente funcionais. O acúmulo de mutações deletérias culminará no aparecimento de pseudogenes, ou seja, cópias de genes semelhantes àqueles funcionais, mas que permanecem no genoma como uma espécie de inércia evolutiva, simplesmente por que a intensidade de seleção num eventual "enxugamento genômico" é insuficiente para a eliminação por deleções aleatórias. Mais além disso, pode ser que os pseudogenes acumulem tantas mutações que a possibilidade de recuperação de homologia por falta de similaridade com genes funcionais deixe de existir. Assim, genes sub-funcionalizados podem passar a ser "fósseis moleculares" durante a fase de pseudogenes até ficarem irreconhecíveis, como uma analogia com os fósseis verdadeiros preservados em rochas que podem ser destruídos pela atividade orogenética.

A neo-funcionalização consiste na aquisição de uma função diferente daquela que era exercida pelo gene "original". Essa função pode ser semelhante àquela anterior ou até mesmo radicalmente diferente. O fenômeno de neo-funcionalização também é conhecido como cooptação, nesse caso quando é enxergado pela óptica da função. O problema do uso do termo cooptação é que é impregnado com o sentido de intencionalidade, algo que não se verifica no estudo da evolução. Os diferentes destinos de genes duplicados estão mostrados na figura 2.

Figura 2. Diferentes destinos de genes duplicados. A: Amplificação em tandem. Normalmente é resultado de pressão seletiva no aumento da taxa metabólica do produto correspondente. B: Silenciamento de uma das cópias, por acúmulo de substituições deletérias. C: Neofuncionalização, por divergência resultado de seleção natural para uma nova função metabólica.

A evolução de cópias parálogas pode ser semelhante à evolução de genes ortólogos, ou seja, desde a duplicação, cada uma das cópias pode acumular mutações de todos os tipos. Entretanto, existe m alguns fenômenos que podem promover a "homogeneização" de uma divergência acumulada ao longo das gerações. às vezes não há sentido em se falar em "original", pois quando da duplicação, os genes formados podem ser idênticos). Dois processos diferentes mas análogos podem ocasionar essa homogeneização: A conversão gênica e as recombinações chamadas desiguais. Ohnologia

Esse nome é resultado de uma homenagem feita ao cientista japonês Susumu Ohno, que fez importantes contribuições na questão de evolução por duplicações gênicas, em especial com suas hipóteses sobre o papel de duplicações de genomas inteiros na evolução de grandes grupos. Suas hipóteses foram extensivamente confirmadas com os sequenciamentos genômicos a partir do início do

século XXI. Moléculas ohnólogas são definidas como aquelas que são homólogas por um evento de multiplicação de genomas inteiros. A ohnologia pode ser considerada como um caso particular de paralogia. O fenômeno mais interessante da ohnologia, como se trata de um duplicação genômica "em massa", permite o estudo dos fenômenos de silenciamento gienico e de neofuncionalização de froma quantitativa, análoga ao estudo do decaimento radioativo. Assim como não se pode prever se um determinado isótopo instável decairá, não se pode prever, sem hipóteses ad hoc, qual será o destino de um gene duplicado. Entretanto, a coisa muda completamente de figura quando se tem uma amostra grande, tanto de isótopos como de genes duplicados.

Xenologia

A palavra tem o sufixo "Xeno", que em grego significa "estrangeiro", como em "xenofobia". Duas macromoléculas são ditas xenólogas quando houve um processo de transferência gênica lateral que envolveu a história evolutiva dessas macromoléculas. Nesse caso, organismos muito distantes em termos de parentesco podem compartilhar macromoléculas muito mais semelhantes entre si do que as demais. Em geral é esse o motivo que leva à formulação da hipótese de transferência lateral. Outro elemento que pode reforçar bastante essa suspeita é a ocorrência dos possíveis ancestrais nas mesmas localidades geográficas. Outro fator que pode reforçar ainda mais a suspeita de origem de genes por transferência lateral é a existência de algum viés de utilização de códons diferente daquele dos outros genes do genoma, no caso de sequências de ácidos nucleicos codificantes.

Figura 3. Transferência gênica lateral. Métodos para alinhamento múltiplo de sequências

Os algoritmos de alinhamento entre duas sequências já foram estudados com rigor e já foram demonstrados como capazes atingir o resultado ótimo, desde que fornecidos os parâmetros (p. ex., penalidades de abertura de lacuna, extensão de lacuna, inserção e deleção). É preciso deixar claro que algoritmos exatos, que chegam com certeza à solução ótima, podem não chegar à solução verdadeira! Lembre-se que o alinhamento nada mais é do que uma maneira de se hipotetizar homologia sequencial, e a evolução é um processo bastante contingencial.

Os algoritmos de alinhamento entre três ou mais sequências macromoleculares não atingiram ainda um ponto em que podem chegar a sr considerados como capazes de chegar a soluções exatas. O problema dos alinhamentos múltiplos é demasiadamente complexo para que haja soluções exatas e que sejam práticas ao mesmo tempo.

Programas que fazem alinhamento múltiplo disponíveis para serem utilizados atualmente são construídos a partir de diversos métodos, todos eles baseados em heurísticas, ou seja, procedimentos que se sabem ser eficientes, mas que podem levar a resultados errados. Abaixo serão descritos alguns dos métodos comumente utilizados.

1.- Programação Dinâmica Multidimensional Assim como em outras ciências, a bioinformática utiliza do método de programação

dinâmica para resolver seus problemas, neste método o problema é resolvido quebrando um problema mais complexo em subproblemas mais simples. Esse método pode ser utilizado em várias abordagens tais como dobramento de proteínas, predição de estrutura do RNA e ligação de proteína-DNA, além claro do alinhamento de sequências.

O princípio de programação dinâmica utilizado em alinhamentos par a par pode ser estendido para o alinhamento múltiplo de sequências. Entretanto o tempo necessário aumenta exponencialmente com o número de sequências e comprimentos delas tornando-se impraticável a não ser que seja aplicado para poucas sequências e que sejam também relativamente curtas.

Nesta abordagem, é assumido que as colunas do alinhamento são independentes estatisticamente e, também, que as lacunas são pontuadas com um custo linear de lacunas. E para cada n sequências é necessário construir de uma matriz equivalente com n dimensões formada a partir do alinhamento par a par entre as sequências. Na figura 4 um esquema de um alinhamento feito por programação dinâmica

 

Figura   4.   Alinhamento   entre   três   sequências   por   programação   dinâmica  multidimensional.   Ao   lado   esquerdo,   as   três   sequências   estão   dispostas   no  vértice   da   matriz   tridimensional,   conforma   as   direções   apontadas   pelas   setas.    Nas   faces,   estão   esquematizados   os   "caminhos"   dos   alinhamentos   par   a   par,  como   no     capítulo   anterior.   No   lado   direito   está   esquematizado   um   caminho  entre  as  três  sequências,  de  forma  análoga  ao  que  é  feito  com  duas  sequências.    

 

2.-­‐  Método  de  alinhamento  progressivo Este  método   provavelmente   é   o  mais   utilizando   nos   alinhamentos  

múltiplos   de   sequência.   Ele   utiliza   uma   heurística   conhecida   como   técnica  progressiva,   também   chamada   de   método   hierárquico   ou   de   árvore,   o   qual   é  desenvolvida  com  a  combinação  de  alinhamentos  par  a  par  das  sequências  que  se   inicia  com  o  alinhamento  mais  similar  e  progredindo  até  o  menos  similar.  A  maioria   dos   algoritmos   constroi   uma   árvore   guia   e   esta   é   uma   árvore   binária  cujas   folhas   representam   as   sequências   e   os   nós   interior   representam   os  alinhamentos.   O   nó   raiz   representa   o   alinhamento  múltiplo   completo   e   os   nós  que  se  afastam  da  raiz  representam  sequências  mais  similares.    

A  vantagem  deste  método  é  que  ele  é  rápido  e  eficiente  e,  na  maioria  dos   casos,  o   resultado  do  alinhamento  é   razoável.  Entretanto,   este  método  não  garante  o  alinhamento  ótimo  global.  O  principal  problema  desse  método  se  deve  

ao  fato  que  os  erros  ocorridos  nas  fases  iniciais  são  propagados  para  o  resultado  final.   Além   disso,   o   desempenho   é   particularmente   ruim   quando   todas   as  sequências,  no  conjunto,  são  muito  diferentes  entre  si.  

 

2.1.-­‐  Algoritmo  de  Feng-­‐Doolitle  Este  que  foi  o  primeiro  algoritmo  tipo  basicamente  é  feito  em  três  passos:  

I.-­‐   Calcular   a  matriz   diagonal   de   distâncias  N   (N   -­‐   1)   /   2   entre   todos   os  pares  de  sequências  de  N  por  alinhamento  par  a  par  padrão,  convertendo  pontuação  de  alinhamento  em  distâncias  aproximadas  entre  os  pares;  II.-­‐  Construir  uma  árvore  guia  a  partir  da  matriz  de  distância  usando  um  algoritmo  de  agrupamento;    III.-­‐  A  partir  do  primeiro  nó  adicionado  à  árvore,  alinhar  os  nós  filhos  que  pode   ser   duas   sequências,   uma   sequência   e   um   alinhamento,   ou   dois  alinhamentos.   Em   seguida   o   procedimento   é   repetido   para   todos   os  outros  nós  na  ordem  em  que  eles  foram  adicionados  à  árvore,  ou  seja,  dos  pares  mais  semelhantes  para  os  pares  menos  semelhantes,  até  que  todas  as  sequências  sejam  alinhadas.   O   método   para   a   conversão   de   pontuações   de   alinhamento   para   a  

distâncias  não  precisam  de  ser  tão  precisos,  já  que  o  objetivo  é  criar  uma  árvore  de   orientação   aproximada   que   não   é   uma   árvore   evolutiva.   Este   algoritmo  calcula  a  distância  D  com  a  seguinte  equação:  

em  que  Sobs  é  a  pontuação  do  alinhamento  par  a  par  observado;  Smax  é  a  

pontuação  máxima,   a  média  do  alinhamento  da   sequência   contra  ela  mesma;   e  Srand  é  a  pontuação  esperada  ao  alinhar  duas  sequências  aleatórias  com  a  mesma  composição   e   comprimento   (número   de   resíduos).   A   última   Srand   pode   ser  calculada   pelo   rearranjo   aleatório   das   duas   sequências   ou   calculada   por   uma  aproximação   dada   em   Feng   &   Doolittle.   A   pontuação   efetiva   Seff     é   vista   como  uma  percentagem  de  similaridade  normalizada,  é  esperado  que  um  decaimento  aproximadamente  exponencial  para  zero  com  o  aumento  da  distância  evolutiva,  daí   a   -­‐log   para   tornar   a  medida  mais   aproximadamente   linear   com   a   distância  evolutiva.  

Alinhamentos   par   a   par   de   sequências   é   feito   com   algoritmo   de  programação   dinâmica   usualmente   utilizados.   A   sequência   é   adicionada   a   um  grupo   existente,   alinhando-­‐a   aos   pares   para   cada   sequência   no   grupo,   por   sua  vez.   O   alinhamento   com   maior   pontuação   determina   como   a   sequência   será  alinhado   com  o   grupo.   Para   alinhar  um  grupo  de  um  grupo,   todos   os  pares  de  sequências   entre   os   dois   grupos   são   testados   e   o   melhor   alinhamento   da  sequência   de   pares   determina   o   alinhamento   dos   dois   grupos.   Deste   modo,   o  sistema  de  pontuação   é   essencialmente  determinado  pela  pontuação  par   a   par  com   a   penalidade   de   lacuna   afim.   No   final   do   alinhamento,   os   símbolos   das  lacunas   são   substituídos   com   um   carácter   X   neutro,   usualmente   utilizado   esse  caracter   é   o   “-­‐”.   A  mesma   regra   para   alinhamento   entres   sequência-­‐sequência  pode  ser  utilizada  para  sequência-­‐grupo  ou  grupo-­‐grupo.

Figura  5.  Etapas  de  um  alinhamento  do  tipo  hierárquico.  Todos  os  alinhamentos  entre  duas  sequências  diferentes  são  feitos,  calculando-­‐se  a  sua  pontuação,  onde  a   pontuação   maior   significa   que   houve   menos   penalidades   de   substituição   e  indels  entre  as   sequências.  Esses  valores  são  usados  para   fazer  uma  análise  de  agrupamento,  que  gerará  uma  "árvore  guia".  Essa  árvore  indicará  a  forma  que  as  sequências   serão   adicionadas   ao   alinhamento,   que   progredirá   com   a   adição  sucessivas  de  lacunas  onde  for  necessário.  

 2.2.-­‐    Algoritmo  com  refinamento  iterativo  

Um   problema   inerente   ao   algoritmo   anterior   é   que   os  subalinhamentos  são  congelados,  ou  seja,  uma  vez  que  um  grupo  de  sequências  de  ter  sido  alinhadas  em  um  estágio  posterior  este  alinhamento  não  poderá  ser  modificado   a   medida   que   mais   informação   é   incluída.   Métodos   interativos  tentam  contornar  esses  problemas.    

Nos   métodos   com   refinamento   iterativo   a   partir   dos   alinhamento  inicial   de   duas   ou   um   conjunto   de   sequências   é   gerado   um   perfil.   Este   perfil  contêm   informações   das   unidades   alinhadas   das   sequências,   seja   ela  aminoácidos   ou   nucleótidos,   em   cada   posição.   Deste   modo   se   houver   um  resultado  significativo  o  perfil  poderá  ser  otimizada  acarretando  um  aumento  da  pontuação   geral   ou   mantendo   a   mesma   pontuação   em   determinada   posição.  Outra(s)   sequência(s)   é(são)   escolhida(s)   e   realinhada(s)s,   e   assim   por   diante,  até   que   o   alinhamento   não   é   alterado.   O   procedimento   é   garantido   convergir  para   um   local   de   máxima   pontuação,   desde   que   todas   as   sequências   sejam  testadas  e  exista  uma  pontuação  máxima  devido  o  espaço  da  sequência  ser  finito.    

 2.3.  -­‐Algoritmo  Barton-­‐Sternberg  

 I.-­‐  Encontrar  as  duas  sequências  mais  similares  usando  um  alinhamento  

de   programação   dinâmica   par   a   par   padrão.   O   perfil   será   feito   baseado  nestas  sequências;  II.-­‐  Encontrar  a  sequência  mais  similar  ao  perfil  por  alinhamento  entre  a  sequência-­‐perfil.  Repetir  até  que   todas  as  sequências  sejam   incluídas  no  alinhamento  múltiplo;  III.-­‐  Remover  a  sequência  x1  e  realinhar  a  um  perfil  de  outras  sequências  alinhadas   x2,   …,   xn   pelo   alinhamento   de   sequência-­‐perfil.   Repetir   o  procedimento  para  sequências  x2,  …,  xn;  IV.-­‐   Repetir   o   passo   anterior   realinhando   um   determinado   número   de  vezes  ou  até  que  a  pontuação  de  alinhamento  convirja.  

As  idéias  de  alinhamento  de  perfil  e  refinamento  iterativo  está  muito  perto  da  formulação  de  probabilística  de  abordagens  que  utilizam  modelo  oculto  de  Markov  para  o  problema  de  alinhamento  múltiplo.

Figura  6.  Fluxograma  mostrando  um  alinhamento  interativo  com  o  emprego  do  algoritmo  de  Barton-­‐Sternberg.  

 

3.-­‐  Métodos  com  cadeias  ocultas  de  Markov  Modelos   ocultos   de  Markov   (Hidden  Markov  models  —  HMM,   sigla  

em  inglês)  são  modelos  probabilísticos  que  atribuem  probabilidades  para  todas  as  combinações  possíveis  de  lacunas,  correspondências  e  não-­‐correspondências  para  determinar  o  mais  provável  alinhamento  múltiplo  de  sequência  ou  conjunto  deles.   HMMs   podem   produzir   uma   única   saída   com   pontuação   mais   alta,   mas  também  pode  gerar  uma  família  de  alinhamentos  possíveis  que  podem  então  ser  avaliadas   para   se   escolher   baseado   em   significância   biológica   ou   algum   outro  critério.   HMMs   podem   produzir   alinhamentos   globais   e   locais.   Embora   os  métodos  baseados  em  HMM  tenham  sido  desenvolvido  há  relativamente  pouco  tempo,  eles  oferecem  melhorias  significativas  na  velocidade  de  cálculo.  

Nos   termos   de   um   típico   modelo   oculto   Markov,   os   estados  observados   são   as   colunas   de   alinhamento   individuais   e   os   estados   ocultos  representam   a   sequência   ancestral   presumida   a   partir   de   quais   sequências   no  conjunto   de   consulta   há   a   hipótese   de   ser   descendentes.   A   figura   7   ilustra   o  diagrama  de  um  perfil  de  HMM  para  um  alinhamento  global  de  sequências.  

Figura   7.   Alinhamento   com   cadeia   oculta   de   Markov.   Essa   figura   não   é   um  fluxograma.  Veja  explicação  no  texto.  

 Os   quadrados   na   figura   denotam   os   estados   em   que   há  

correspondência  (Mi),  os   losangos  são  estados  de   inserção  (Ij)  e  os  círculos  são  estados  de  deleção   (Dj),   também  conhecido   como  o  estado  em  silêncio,  pois   se  referem   as   lacunas   na   sequência.   As   possíveis   transições   entre   os   estados   são  representados  como  setas.  Observe  que  o  modelo  Markov  começa  num  estado  de  iniciar   que  permite   que  qualquer   número  de   estados  de   inserção   (I0)   antes   do  primeiro  estado  da  sequência.  Também  tem  um  estado  final,  que  pode  mudar  de  posição,   a   partir   de   uma   deleção   ou   inserção   de   estado   que   permite   a  comparação  de  uma  variedade  de  comprimentos  de  sequências.  

No   modelo   de   Markov,   precisamos   definir   os   parâmetros   que  descrevem  as  probabilidades  dos  estados  atuais  e  posterior.  Seja  ex(b)  definida  a  probabilidade   de   emitir   o   símbolo   b   no   estado   x   ϵ   {Mi,   Ij}.   Além   disso,   vamos  definir  uma  classe  de  parâmetros  axy  que  descreve  a  probabilidade  de  fazer  uma  transição   de   estado   x  →   y.   Voltando   à   Figura   X,   observa-­‐se   que   as   seguintes  transições  são  possíveis.

Mi Ii, → Di+1 ou Mi+1 Ii Ii, → Di+1 ou Mi+1 Di Ii, → Di+1 ou Mi+1

 Diversos   programas   que   implementam   algoritmos   de   alinhamento  

múltiplo   vem   sendo   desenvolvidos.   Embora   há   programas   que   adquiriram  grande  popularidade  para  essa  tarefa,  existem  programas  que  entram  e  saem  da  moda   tanto   quanto   cortes   de   cabelos.   Assim,   é   muito   importante   que   se  acompanhe  os  progressos  que  são  constantes  nessa  área.