Métodos de alinhamento de sequencias biológicas

DRA. ADRIANA DANTASUERGS, BENTO GONÇALVES, RS

Introdução

- Uma forma rápida de agregar alguma informação sobre uma sequência desconhecida é compará-la com um banco de dados de sequências com funções conhecidas

- Esta comparação é feita através de alinhamentos par a par entre as sequências. Isto é, se o banco de dados possuir 1000 sequências conhecidas serão realizados 1000 alinhamentos

?

- Tipicamente são usados os bancos de dados mundiais (NCBI, EMBL)

Fonte: http://www3.ebi.ac.uk/Services/DBStats/

- Atualmente uma busca nesses bancos faz 100,000,000 de alinhamentos

Existem vários programas de alinhamentos com diferentes metodologias, sendo que o mais utilizado é o BLAST

Relevância biológica

- Para o biólogo é essencial que esses alinhamentos indiquem uma real similaridade entre as sequências (estatisticamente significantes)

- Similaridade x HomologiaSimilaridade x Homologia

- identidade = número que indica a quantidade de nucleotídeos alinhados

- similaridade = considera a probabilidade do alinhamento ter ocorrido por acaso (e-value). Considera todos os outros possíveis alinhamentos

- homologia = dividem a mesma ancestralidade com significado evolutivo

Outras aplicações

- Reconstrução da sequência consensu a partir de sobreposições de fragmentos de sequências (montagens de sequencias de DNA)

- Alinhamento entre sequências de ESTs e DNA genômico

- Comparação entre proteínas e DNA

- Construção de mapas físicos

- Comparação entre genomas

- ...

AlinhamentosAlinhamentos

o A comparação entre sequências de DNA de organismos diferentes é baseada no conceito de que estes organismos originaram-se de um ancestral comum.

o No contexto de evolução as sequências de DNA sofrem mutações. Estas modificações locais entre os nucleotídeos podem ser :

o Inserções : inserção de uma base ou várias bases na sequência

o Deleções : deleção de uma base ou mais bases na sequência

o Substituições : substituição de uma base por outra

o Portanto um programa de alinhamento de sequências biológicas tem que considerar essas mutações

Exemplo :

Match = 1

Mismatch = -1

Gap = -2

- Gaps representam as inserções e deleções entre as sequências

- O melhor alinhamento entre duas sequências é aquele que maximiza o score :

- Score = #Matchs * (1) + #Mismatch * (-1) + #Gaps * (-2)

= 24 – 4 – 10 = 10

Modelos para alinhamentosModelos para alinhamentos

- Alinhamento globalAlinhamento global

- útil quando as duas sequências tem tamanhos próximos

- Exemplo de programa : CLUSTAL

-Alinhamento localAlinhamento local

- útil para alinhamento entre sequências de tamanhos diferentes e também para sequências com apenas alguns trechos conservados

- Exemplo de programa : BLAST E FASTA

-Alinhamento semi-global (ou pontas livres)Alinhamento semi-global (ou pontas livres)

- útil para encontrar sobreposições de fragmentos de sequenciamento

- Exemplo de programa : PHRAP E CAP3

Alinhamento globalAlinhamento global- Alinhamento de GACATTG com GATCAATG

1a linha e 1a coluna de M são fáceis de computar: - G A C A T T G - 0 -2 -4 -6 -8 -10 -12 -14 G -2 A -4 T -6 C -8 A -10 A -12 T -14 G -16

G-

GA - -

Lembre-se, penalidade de 1 gap = -2 e de dois gaps = -4

http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/stretcher-simple.html

- G A C A T T G - 0 -2 -4 -6 -8 -10 -12 -14 G -2 A -4 T -6 C -8 A -10 A -12 T -14 G -16

[i,j]=p(i,j)

- Para um elemento da matriz [i,j] qualquer, temos p(i,j) = 1 se for um match e p(i,j) = -1 se for um mismatch.

- G A C A T T G - 0 -2 -4 -6 -8 -10 -12 -14 G -2 A -4 T -6 C -8 A -10 A -12 T -14 G -16

[i,j][i-1,j]

[i,j-1][i-1,j-1]

= max([i-1,j] - 2, [i-1,j-1] + p(i,j), [i,j-1] - 2)

- O valor de [i,j] é definido exclusivamente pelos elementos [i-1,j-1] (diagonal), [i,j-1] (esquerda) e [i-1,j] (acima).

0

-2

-4

-6

1

-3

-8

-1

-2

-1

0

-4

-4 -6

-3

-2

-1

-1

A

A

A

A

C

CG

-2

-5

- Construindo o alinhamento

No alinhamento global o alinhamento deve ser construído a partir do extremo da matriz

- G A C A T T G - 0 0 0 0 0 0 0 0 G 0 A 0 T 0 C 0 A 0 A 0 T 0 G 0

[i,j][i-1,j]

[i,j-1][i-1,j-1]

= max([i-1,j] - 2, [i-1,j-1] + p(i,j), [i,j-1] – 2,

0 zero)

- No alinhamento local a primeira linha e coluna são inicializadas com zeros e os valores [i,j] da matriz inteira nunca ficam menores que zero

Alinhamento local (Smith-Waterman)http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/water.html

No alinhamento local o alinhamento deve ser construído partir do maior score da matriz e para quando encontrar um score=0

Alinhamento semi-global

- Não penaliza espaços nas extremidades do alinhamento.

- Exemplo CAGCA –CTTGGATTCTCGC | | | | | | - - - CAGCGTGG - - - - - - - -- No global teríamos,

CAGCA – CTTGGATTCTCGCCAGC - - - - - - G - T - - - - - -

- Qual dos dois alinhamentos é mais interessante ?

- No alinhamento semi-global a primeira linha e coluna são inicializadas com zeros. O resto é igual ao alinhamento global

- A abordagem de programação dinâmica é importante pois garante o melhor alinhamento entre duas seguências, mas ainda temos um problema :

- Lembram-se disso : se o alinhamento de 2 sequências de 100 pb leva 1 segundo, o alinhamento de sequências de 10 Mpb (genoma de Saccharomyces) leva 377 anos

- A abordagem alternativa é conhecida como o método de k-tuplas, no qual não é garantido encontrar o alinhamento ótimo (heurística) mas é significantemente mais rápido. Com esse método os conceitos de alinhamento discutidos acima foram modificados dando origem aos programas de alinhamento local :

- BLAST (Basic Local Align Sequence Tool) : Nucleic Acid Research 25 (1990), 3389

- FASTA : PNAS 85 (1988), 2444-2448

- Basicamente este método identifica uma série de palavras curtas em uma das sequências (word size) e depois realiza uma busca exata por essas palavras nas sequências a serem comparadas, filtrando assim os possíveis candidatos.

Alinhando proteínas

- Alinhamento proteína-proteína

- Alinhamento nucleotídeo-proteína

- Alinhamento proteína-nucleotídeo

- Alinhamento nucleotídeo-nucleotídeo (feito em proteínas)

Matrizes de substituição- BLOSUM (BLOcks of amino acid SUbstitution Matrix )

- I e V => Hidrofóbicos

- D e W => D (carga negativa) e W (aromático)

- C => pontes de sulfeto (estrutural)

- A matriz foi construída a partir de alinhamentos múltiplos globais de 504 grupos de proteínas

- BLOSUM 62 : grupos com similaridade >62%

- BLOSUM 80 : grupos com similaridade >80%

- BLOSUM 45 : grupos com similaridade >45%

Query Length Substitution Matrix

<35 PAM-30

35-50 PAM-70

50-85 BLOSUM-80

>85 BLOSUM-62 PNAS 89 (1992), 10915-19919

BLAST

• Basic Local Alignment Search Tool• Algoritmo BLAST (Alstchul et al.; 1990 – J. Biol., 215, 403-

410)• Implementações: NCBI BLAST e WU-BLAST• Acesso via web / local (linux)• Consulta de seqüências em BDs biológicos (nt ou proteínas)• Alinhamento – sobreposição de trechos semelhante de duas

seqüências (seqs). BLAST traz pontuação e mostra alinhamentos.

• Similaridade – grau de semelhança de seqs num alinhamento. • Homologia – genes com ancestral comum

• BDs – nucleotídeos, proteínas, domínios, genomas específicos, dados particulares

• Blastp – prot / prot (distantes)

• Blastn – nt / nt (próximos)

• Blastx – nt trad / prot (novas seqs)

• Tblastn – prot / nt trad (regiões não anotadas)

• Tblastx – nt trad / nt trad

Query BD Compara Programant nt nt blastn

nt (trad) aa aa blastxaa aa aa blastpaa nt (trad) aa tblastn

nt (trad) nt (trad) aa tblastx

Query = formato da seq de entrada.BD = formato das seqs do BD.nt (trad) = seq em nt traduzida pelo programa.Compara = o que é comparado, nucleotídeos (nt) ou

aminoácidos (aa).Programa = um dos cinco principais tipos de blast.

BLAST – resultado

Escolher BD

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/

Domínio encontrado

ID facilita busca

ERRO!!

Link

Corte 1e-

5

1

subject

query

71

1 64

134

BLAST – exemplos>nucleotídeo 1GTACAAAAAAGTTGGATTTAACTTTAATAGCTATATTAGTCAGTAATGTTATTGTTTGATGAAGGATTTTTTTATTAATAACTATTATTTTTATTTTGTTAAATAAAGGAAATAAGAGTTATAGAGGAATTTTTAATTATTTTGTTATTCAAGAAACTCTAGGATTGTTGTTTTTATTTTTTTCTAGTAATTATATTCAGTTTATTATTTTAATAATGAAGATTGGAGTACCACCATTTCACTTTTGGGTTTTTAGTGTTACTAATAGTATTTTTAATTATGGGTTAGTGTGGTTTTTAACTATACAGATGTTACCTTTACTGGTAGTTTTATTACAGTTATTTGCTTCTGATATAGTGTATTTATTTCTTTTTGGTTTGTTTAGTTGTTATCAAGAGATGTTTATGCTGAAGGTATACAGTACTTTATTAGTTGTATCATCAACTGAGTCTTTTAATTGA >proteína 1MSLKDFFERIEPDFEKGGKYEKFYALFEAAYTIFYTPGKVNKGKTHVRDNLDLKRMMITVWACAFPAMFVGMYNVGLQAQLALVAGFATPDVWQVSLFSMFGTELTANSGWPALMWYGACFFLPIYAVTFAVGGIWEVLFASIRGHEVNEGFFVTSILFALTLPATIPLWMVALGITFGVVVAKEVFGGTGRNFLNPALAGRAFLFFAYPLNMSGDTSWVVADGYSGATALSQAAAGTLDYAINQNWWDSFFGFIPGSVGEVSTLAILLGGLVIIYTRIASWRIVGGVMVGMIAISTLLNVVGSDTNPMFAMPWYWHLVLGGFAFGMMFMATDPVSASFTNQAKWAYGILIGAMAVFIRVINPAFPEGMMLAILFANLFAPLFDHFVVQANIKRRIARG

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/

• Pode ser instalado localmente (Linux)• BDs e atualizações• Facilidades

– Velocidade de buscas– Maleabilidade– Automatização– Dados locais– Independe de internet

BLAST local

-Download

- ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast

- Preparação do banco de dados

- formatdb –i <arquivo fasta db> -p T/F :

- <arquivo fasta db> é o arquivo que contêm todas as sequências em nucleotídeo ou proteína que formarão o banco de dados do blast

- -p T para arquivo fasta de proteínas e –p F para nucleotídeos

- Comparação via blast

- blastall –i <arquivo fasta> -p blastn/blastx/blastp/tblastx/tblastx –d <arquivo fasta db> -o <arquivo de saída> -e 1e-5

- -i arquivo fasta a ser comparado com o banco <arquivo fasta db>

- -p tipo de comparação a ser realizada

- -d banco de dados utilizado na comparação

- -o arquivo de saída

- -e evalue de corte

Resumo

- Revisão BLAST

- PHI-BLAST

- PSI-BLAST

-BLAST2SEQS

Revisão

Query BD Compara Programant nt nt blastn

nt (trad) aa aa blastxaa aa aa blastpaa nt (trad) aa tblastn

nt (trad) nt (trad) aa tblastx

Query = formato da seq de entrada.BD = formato das seqs do BD.nt (trad) = seq em nt traduzida pelo programa.Compara = o que é comparado, nucleotídeos (nt) ou

aminoácidos (aa).Programa = um dos cinco principais tipos de blast.

1

subject

query

71

1 64

134

PHI-BLAST- É um blastp com a opção de passar uma outra sequência curta ou um padrão servindo como um vínculo para a consulta

Ex :

[CG](5)TG{A}N(1,5)C

N - Qualquer nucleotídeo

N(3) - Uma sequência de três nucleotídeos

N(2,4) - Uma sequência de 2,3 ou 4 nucleotídeos

[AC] - pode ser um A ou um C

{AG} - não pode ser nem A e nem G

PSI-BLAST- É um blastp interativo no qual a matriz (BLOSUM), após a primeira interação, é refeita com base nos alinhamentos entre as proteínas resultantes da consulta :

- uma posicão conservada no alinhamento recebe um score alto e uma posição não conservada um score baixo

- É útil para encontrar membros distantes de famílias de proteínas

BL2SEQS

- http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/bl2seq/wblast2.cgi

- Faz um blast de uma sequência contra a outra (blastn/blastx/blastp/tblastx/tblastn