vacinas gênicas
TRANSCRIPT
História
1774- Benjamin Jetsy / Fazendeiro The Dorset / England Imunizou seus 2 filhos e sua esposa com
“cowpox” a fim de evitar a varíola
1796- Edward Jenner / Médico Gloucestershire / England Imunizou uma criança chamada James
Phipps
Prevenção
Epidemiologia Patogênese
Imunologia Quimioterapia
Importância das vacinas no controle e erradicação de doenças infecciosas
Método preventivo Redução rápida da transmissão Relação benefício-custo alta Erradicação da varíola no mundo
Características de uma vacina efetiva
Segura Capaz de induzir altos níveis de proteção Induzir níveis de proteção duradouros Induzir anticorpos neutralizantes Induzir linfócitos T efetores Baixo custo Estabilidade Fácil administração Poucos ou nenhum efeitos colaterais
Efeito da vacinação contra poliomielite no Brasil
Anos (Ministério da Saúde)
1979 1980 1981 1982 1983 1984 1985 1986 1987 1988 1989
Inci
dênc
ia d
e po
limie
lite
por
100.
000
habi
tant
es
0
20
40
60
80
100
Cob
ertu
ra d
a va
cina
(%)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Efeito da vacinação contra poliomielite no mundo
Composição químicas da vacinas existentes
- Vírus vivos atenuados- Vírus inativados- Bactérias vivas atenuadas- Bactérias mortas- Toxóides- Polissacarídeos- Componentes antigênicos- obtidos por engenharia genética
Vírus vivos atenuados
Anti-varíola Anti-febre amarela Anti-caxumba Anti-poliomielítica (Oral
Sabin) Anti-rubéola Anti-sarampo
Vírus inativados Anti-poliomielítica
injetável (Salk) Anti-rábica
Anti-Tuberculose (BCG)Bactérias vivas atenuadas
Bactérias mortas Anti-colérica Anti-coqueluche Anti-febre tifóide
Toxóides Anti-tétano Anti-diftérica
Polissacarídeos Anti-H. influenza do tipo b Anti-meningocócica Anti-pneumocócica
Componentes antigênicos obtidos por engenharia genética
Anti-hepatite B
Vantagens
Múltiplos antígenos Simples produção Baixo custo relativo
Desvantagens
Formulação antigênica complexa
Toxicidade Resposta imune complexa
Vacinas convencionais
Razões que dificultam a geração de uma vacina contra alguns microrganismos patogênicos
Ausência de cultura axênica
Necessidade de grande suprimento de células humanas para o crescimento in vitro
Alto custo
Alto risco
Possíveis soluções para a produção de antígeno vacinas sintéticas
Peptídios Sintéticos
Proteínas recombinantes
Microrganismos geneticamente modificados
Vacinas de DNA
RESEARCH PRIORITIES FOR PRODUCTION OF NEW AND IMPROVED VACCINES
hepatitis types A, B, C, and D enteric pathogens including rotavirus, shigella, and cholera sexually transmitted diseases (genital herpes, gonorrhea, and chlamydia) croup and pneumonia in infants and children caused by respiratory
syncytial virus AIDS respiratory diseases caused by pneumococcus group B streptococcus influenza malaria tuberculosis Ieprosy
Doenças
Vacina recombinante ideal
Múltiplos antígenos Antígenos expressos em diferentes fase
do parasito Composta de antígenos com um
polimorfismo limitado Capaz de induzir múltiplos tipo de
resposta imune protetora Alta eficácia e baixo custo
Direcionamento da pesquisa
Determinação dos mecanismos imunológicos de proteção
Isolamento dos genes que codificam para antígenos destes microrganismos
Identificação de epítopos relevantes e com baixa variação antigênica entre as cepas
E como foram definidos os mecanismos imunológicos de proteção?
Transferência passiva de imunidade
Anticorpos monoclonais Clones de linfócitos T CD4 ou CD8
PROTEÍNAS RECOMBINANTES
Sistemas de expressão de proteínas recombinantes
Procariotos (E.coli)
Eucariotos - Leveduras (S. cerevisae)
Baculovírus
Vacina contra hepatite B recombinante
Antígeno S
Purificação
Levedura
Plasmídio
Vacina
Gene ag S
Proteína
Antígeno S da Hepatite B
PartículaMembranosa
Anticorpos
Vacinas recombinantes contra a hepatite B
Engerix-B SmithKline Beecham/US
Recombivax HB Merck/US
GenHevac B Pasteur/France
• Mais de 1 bilhão de doses (1982-presente).
• Produzida em leveduras (S. cerevisiae)
VÍRUS RECOMBINANTES
Vacinas gênicas
VACINAS DE DNA
Vetores preparados para transferir genes
DNA
VírusSelvagem
Gene exógeno
Célula hospedeira
Proteína recombinante
VírusRecombinante
Vírus recombinantes
Geração de vírus recombinantes
Vírus utilizados
Vaccinia (vacina contra varíola) Influenza (vacina contra gripe) Adenovirus (vacina contra infecção por
adenovirus) Vírus da Pólio (vacina contra pólio) Vírus da febre amarela (vacina contra
febre amarela).
Estrutura dos flavivírus
Dímero da proteína doenvelope
Modelo estrutural de um dímero da proteína do envelope do vírus da Febre Amarela
Bonaldo et al. (2002) Epítopos exógeno
Estrutura do vírus influenza
hemaglutinina do vírus da influenza
Estrutura do vírus vaccinia
Estrutura do Adenovírus
Formas de inoculação
Sub-cutânea Intra-muscular Por via de mucosas
Propriedades adjuvantes
Interferons IL-6 Outros?
Imunização com vírus recombinantes
Anticorpos Linfócitos T CD4 TH1
Linfócitos T CD8
Vírus recombinante
• Já usado como vacina• Produção em larga escala • Diversos tipos de resposta
imune• Grande quantidade de
Informação (vírus de DNA)
• Limitação da quantidade a ser inoculada
• Limitação da quantidade de antígeno produzido
• Pouca antigenicidade
Vantagens Desvantagens
VACINAS DE DNA
Plasmídio vetor deexpressão
Geneexógeno
Promotor forteCitomegalovírus
Cauda Poli-A
Formas de inoculação
Sub-cutânea Intra-muscular Por via de mucosas
Micro-bombardeamento com partículas (“gene gun”)
Microenhancer array
Propriedades adjuvantes
Interferons IL-12 Outros?
Núcleo
ProteínaExógenaCélula hospedeira
Plasmídio epissomal
Injeção intra-muscular de DNA plasmidal marcado com rodamina
DNA plasmidial Núcleo Overlay
Expressão da proteína exógena após imunização intramuscular
b-galactosidase
Expressão da proteína exógena após injeção s.c.
GFP
b-galactosidase
Imunização com DNA
Anticorpos Linfócitos T CD4 TH1
Linfócitos T CD8
Vacinas de DNA
Sem proteína Grande quantidade de informação
genética Vários tipos de resposta imune Produção da proteína “in situ” Simples, estável e de baixo custo
relativo
Sistema novo e pouco conhecido
Possibilidade de integração do vetor de expressão no genoma
Vantagens Desvantagens
Immunização com DNA no homem?
Hepatitis B DNA vaccine induces protective antibody responses in human non-responders to conventional vaccination.
Rottinghaus ST, Poland GA, Jacobson RM, Barr LJ, Roy MJ.
Department of Internal Medicine, Mayo Clinic, 55905, Rochester, MN, USA
Vaccine. 2003. 21:4604-8.
Linfócitos T CD8 ab
Restritas por MHC classe I
1996
Nobel Prize of Medicine:
Peter C. Doherty and Rolf Zinkernagel
Citotóxicos para células infectadas por vírus
MCH classe I + peptídeo MCH classe II + peptídeo
Linfócitos T CD8 ab Linfócitos T CD4 ab
Cutting edge: CD4 and CD8 T cells are intrinsically different in their proliferative responses.Foulds KE, Zenewicz LA, Shedlock DJ, Jiang J, Troy AE, Shen H. J Immunol. 2002 Feb 15;168(4):1528-32.
Linfócitos T CD8 proliferam e se diferenciam mais rápido que
linfócitos T CD4
107 linfócitos T CD8 específicos por baço
105 linfócitos T CD4 específicos por baço
Durante a infecção experimental por LCMV
Durante a infecção experimental por LCMV
Células CD8 de memória
Apoptose da célula alvo infectada
Mecanismos efetores mediados por linfócitos T CD8
Lise da célula alvo infectada
Secreção de linfocinas (Interferon-g, TNF, quimiocinas, etc.)
Vírus (HIV, etc)
Patógenos cuja a imunidade mediada por CD8 é crítica
Bactérias (M. tuberculosis, etc.)
Protozoários intracelulares (Plasmodium, T. cruzi, Toxoplasma)
Vírus HIV
GagPolGenoma viral
Env
Diferentes estratégias para a indução de linfócitos T CD8 específicos
Vírus Recombinante (DNA or RNA) DNA plasmidial Combinação (prime-boost heterólogo)
Rodrigues et al., 1994 and Miyahiara et al., 1995
ELISPOT for detection of peptide-specifc CD8 T cells.
Tetramer/Pentamer staining for detection of peptide-specifc CD8 T cells
D=DNA plasmidial V=Vaccinia A=Adenovírus
Prime-boost heterólogo e ativação de linf. T CD8
DNA plasmidial
Vaccinia recombinante : MVA
DNA plasmidial +CRL (adjuvante)
Adenovirus (Ad5) recombinante
DNA plasmidial +MPL (adjuvante)
DNA plasmidial +CRL / Ad5
DNA plasmidial +CRL / MVA
Vírus Recombinante (DNA)
DNA plasmidial
Combinação (prime-boost heterólogo)
Vacinação experimental de macacos contra a infecção por SHIV
DNA MVA
DNA+CRL Ad5
DNA+MPL
DNA+CRL / Ad5DNA+CRL / MVA
Freqüência de linfócitos T CD8 específicos
Céls. CD4 RNA Viral no Plasma
Controle
DNA
DNA+CRL
DNA+MPL
MVA
Ad5
Control
DNA+CRL/MVA
DNA+CRL/Ad5
DNA MVA SHIV DNA MVA SHIV
Carga viral (RNA no plasma) Contagem de CD4 no sangue
Controles
Controles
Desafio = intrarrectal
A Randomised, Double-Blind, Controlled Vaccine Efficacy Trial of DNA/MVA ME-TRAP Against Malaria Infection in Gambian AdultsVasee S. Moorthy, Egeruan B. Imoukhuede, Paul Milligan, Kalifa Bojang, Sheila Keating, Pauline Kaye, Margaret Pinder, Sarah C. Gilbert, Gijs Walraven, Brian M. Greenwood, Adrian S. V. Hill.
http://www.malaria-vaccines.org.uk/
Recombinant virus against malaria (Clinical trials = humans)
2005
http://www.vacinashiv.unifesp.br/
Conclusões
Conhecimento básico para o desenvolvimento de vacinas recombinantes
Conhecimento importante dos mecanismos imuno-protetores contra microrganismos patogênicos
Já existe várias vacinas comerciais contra hepatite B Existem várias vacinas recombinantes sendo testadas.
Os estudos para o desenvolvimento de vacinas recombinantes têm trazido: