Produção de Vacinas

Vacinas BacterianasVacinas Virais

Apontamento Histórico

� Jenner (1749-1823)� Vacinação da Varíola remonta ao sec VI

na China� Vacinação controlou 9 doenças em

algumas partes do mundo:varíola, sarampo, difteria, pliomielite, rubéola, febre amarela, tétano

� Progressos: contra a gripe, hepatite B

Vacina da Varíola (trabalhos de Jenner)

� Ordenhadeiras �lesões nas mãos � Durante epidemias elas não contraiam a

doença (variante humana)

� Retirou material das lesões da varíola bovina

� Injectou em si próprio� VACINAS derivado do termo latino VACCA

Antigenes do vírus da varíolahumana

Antigenes do vírusda varíolabovina≈

Mas com gravidade diferente

Antigenes????

Antigene

� Substâncias de natureza proteica, polissacaridica ou constituídos por outros compostos ligados às proteínas

antigenesEstimulaProdução de anticorpos

Hospedeiro

Microrganismo

Antigene Hospedeiro

Induz o mecanismo de defesa a produzir anticorpos

IMUNIZAÇÃOO hospedeiro nãocontrai a doença provocada pelomicrorganismoinvasor

Tipos de imunidade conferida por vacinas

� Baseia-se em:• Resistência específica � é activa contra um

determinado microrganismo patogénico (ex: anticorpos que neutralizam vírus da raiva)

• Imunidade do hospedeiro (inespecífica ou natural) � activas contra diferentes espécies de microrganismos

Imunização activa

� Artificialmente adquirida � indução da formação de anticorpos através da introdução artificial do antigene

� Naturalmente adquirida � introdução do antigene acidental (ferida, via oral)

Ex: Poliomielite – penetra pelo trato digestivo. Se houver no sangue anticorpos específicos induzidos em número suficiente, que impeçam que o vírus atinja o sistema nervoso central, não há problema.

Imunização passiva

� Naturalmente adquirida �transferência de anticorpos para o feto através da placenta

� Artificialmente adquirida �os anticorpos são injectados no organismo proporcionando protecção imediata

(ex: soro antidiftérico (contendo anticorpos de cavalo contra a exotoxina diftérica)

Acção de antibiótico ≠ soro diftérico O antibiótico impede a reprodução e excreção da toxina mas

não é eficaz contra a substância já presente

Principais tipos de vacinas

� Cólera (Vibrio cholerae)

� Febre Tifoide (Salmonellatyphi)

� Tuberculose (Mycobacteriumbovis)

� Difteria (Corynebacteriumdiphterae)

� Tétano (Clostridium tetani)

� Peste (Yersinia pestis)

� Meningite (Neisseriameningitidis)

� Pneumonia Lombar ( Diplococcus pneumoneae)

� Poliomielite� Varíola� Raiva� Rubéola� Influenza� Sarampo� Febre amarela

Fermentação na produção de vacinas

Volume do inoculo necessário depende de:

� Condução dos processos fermentativos, logo da [microrganismos] e [antigenes] obtidos;

� Via de aplicação da vacina (parenteral ou oral)� Posterior purificação do antigene

• > nº requerido para pureza especificada�

• > o volume necessário a 1 dose humana

Ampliação de Escala (obstáculos)

� A) vacinas virais preparadas e rotina com matéria prima (ex: pele de bezerro, ovos de galinha) são problemáticos quando em grande escala

� B) Alguns processos ainda são desenvolvidos em institutos e laboratórios

� C) cultivo de bactérias patogénicas e vírus exigem condições complexas.

Produção de Vacinas (processo unitário)

a) Temperaturas de cultivo ≈ 37ºC

b) Meios de cultivo com composição complexa

c) Volumes de meios de cultura < do que noutros processos industriais (25-3500L)

Produção de Vacinas (processo unitário)

d) A natureza complexa dos meios, o pH óptimo ≈ 7,5 e a temperatura, sendo condições favoráveis à proliferação de larga gama de microrganismos patogénicos, exige estrita assepsia e protecção especial dos operadores contra infecções acidentais

e) As substâncias de interesse (os antigenes) não constituem o principal produto metabólico

Produção de Vacinas (processo unitário)

f) Os efeitos colaterais decorrente da aplicação da vacina devem ser minorizados

g) Nem sempre é possível saber a eficácia da vacina durante o processo de cultivo, a mesma baseia-se em efeitos observados em animais de laboratório

Vacinas BacterianasClassificação/Processos de

Produção

� Segundo localização do antigene (corpo bacteriano ou meio):

• Partículas (ex: cólera, BCG, febre tifoide)

• Não particuladas (toxoides: diftérico tetânico)

Pode influenciar tratamento final aquando da produção da vacina

Vacina contra cólera e febre tifóide (enterobacterianas)

� Infecção transmitida Homem – Homem, alimentos e água;

� Bactérias Gram-

� Problemas no trato gastro-intestinal

� Reproduzem-se em meios simples

� Igual meio de cultivo e processamento posterior;

Cólera - Apontamento Histórico

� Vibrio cholerae – descoberto por KocK� Doença originária na India e Paquistão� Melhoria das condições sanitárias restringiu a

doença� Variedade benigna “El Tor”� Melhor imunidade conseguida por uma vacina

contendo estirpe atenuada (Inaba e Ogawa)� Aplicação da metodologia do DNA

recombinante

Febre Tifoide – Apontamento Histórico

� Doença descrita por Budd em 1856

� Bacilo responsável descrito por Berthem 1880

� Isolado por Gaffky (disc. Kock) 1884

� Salmonella typhi penetra pela via digestiva e atinge corrente sanguínea

Vacina

� Bacterias de S. typhi (estirpe Tyz de Felix)

� Inactivada pelo calor a 53ºC por 1 hora� Preservada em fenol a 0,5 %

Ou

acetona ou álcool + suspensão da bactéria �liofilização

tradicional

Cultivos submersos podem ser realizados em fermentador:

- Meio de cultura simples (c/ ext.Levedura e glicose, adicionada aos poucos senão � teor de antigenes )

- pH 7,3 -7,6- Tendo em consideração que são

aeróbios obrigatórios

- Fase estacionária ao fim de 6-8 horas de fermentação

BCG – Apontamento Histórico

� 1882 – relacionou a etiologia da tuberculose à Mycobacterium tuberculosis(tipo humano)

� Crescimento muito lento em meio sólido

� Kock tentou obter vacina inactivando o agente por calor, formalina, outros quimicos

Continuação

� Calmette (1921) suspeita que imunidade éadquirida pela presença de microrganismos vivos

� Desenvolvimento de uma estirpe atenuada de Mycobacterium bovis

� Foram precisas 250 sub-culturas com meio de batata, glicerina e bilis bovina

� Estirpe conhecida por Bacilo Calmette-Guerin(BCG)

� Administração oral (-eficaz) ou parenteral

Método de Cultivo

Cultivo estático- elevado nº de frascos- p/ compensar crescimento lento e

dispersão bacilar �desagregação com esferas em moinho de bolas (que causa morte de 40-60%)

- Adição de tensioactivos p/ facilitar a dispersão bacilar sem gd agitação

Cultivo submersoProduto final mais viável (7x) para mesma

quantidade de biomassa

Bactérias cultivadas em profundidade mais resistentes a posterior liofilização.

Combinação meio/estirpe/geometria de fermentos

� � perda de viabilidade durante cultivos prolongados

� � efeitos tóxicos dos tensioactivos� Manutenção de assepsia dt 8 dias de cultivo

com agitação� O facto do pH ser +- 7,5 � o risco de

contaminação� < imunogenicidade em cobaias quando

comparado com a estática� Respeitar normas da OMS

Toxoides – mléculas de toxina modificada

� As toxinas:

- São de natureza proteica- Posteriormente submetidas a um

destoxificação

- Sem alterar propriedades imunogenicas

Método para detectar presença de toxinas no meio

Toxina Soro com anticorpos contra esta toxina(antitoxina)

Floculação visível a olho nu

+

� Exotoxinas –• termolábeis• Originam anticorpos específicos• + facilmente excretadas pela célula

� Endotoxinas –• termoestáveis• Não induzem formação de anticorpos específicos• Além de proteínas contêm lipopolissacáridos

Classificação das exotoxinassegundo tipo de libertação

a) Toxinas ligadas firmemente às células libertadas (ex: toxina da Pasteurella pestis)

b) Difundem-se livremente no meio de cultura durante a reprodução microbiana [intracelular]≈[extracelular] (ex: toxina diftérica)

c) Difundem-se no meio mas [intracelular]>[extracelular] (ex: Clostridium sp.)

Toxoide Diftérico

� Corynobacterium diphtheriae (35ºC)� Vacina descoberta por Behring� Toxina é um polipeptido, molécula com dois

fragmentos A ( responsável pela toxicidade) e B (responsável pela penetração na célula).

� Anticorpos para B protegem da infecção� Há efeitos colaterais (febre) devido à presença

de proteínas estranhas no toxoide

Método de cultivo

� Meio de cultura desenvolvido por Linggod e Fenton, inclui extracto de carne bovina, ext. levedura e Maltose

� A presença de ferro é prejudicial à formação da toxina

� A quantidade dissolvida no meio proveniente do inox dos contentores está abaixo do prejudicial

� O crescimento bacteriano não é inibido

� podem ser usados outros materiais como vidro e alumínio;

� Formação da toxina não está associada àreprodução bacteriana

� Actividade torna-se mensurável a partir da fase de declínio (48h de fermentação)

� pH baixa de 7,8 → 7,5� Com arejamento insuficiente pH baixa de 7,8 →6,5 � < produção de toxina

Maltose Glicose Ác. orgânicos CO2 + H2O1 2 3

Depende:Disponibilidade do oxigénio livre���� arejamento ����+ lentalogo acumulação dos ác. Orgânicose acentuada ���� do pH

FormicoAcéticoLacticoPropionicoSuccínico

Acumulação dos ácidos depende da rapidez de fornecime nto da glucose e de oxidação dos ácidos

����[ácidos] �������� [toxina] > arejamento > produção toxina

Processo Industrial

Fermentação

Filtração Tangencial

Filtração Molecular

Cromatografia

Destoxificação

Cromatografia

Filtração esterilizanteMistura com toxoide tetânico

Separação das bactérias, do meio onde se encontra toxina

Separação dos nutrientes residuais e dos metabolitosda toxina

Moléculas separadas por tamanho e carga

Purifica e concentra toxoidesnos padrões estabelecidos

Desnaturar a toxina pela acção do formaldeido a 37ºC, 4-6 semanas

Tétano – Apontamento Histórico

� Clostridium tetani – Bacilo Gram +

� 1884 – descoberta natureza infecciosa� 1889 – Kitasato isola microrganismo in

vitro

� 1890 – descoberta da toxina por Faber

Toxoide TetânicoCultivo de bactérias

� Produz esporos termoestáveis� É estritamente anaeróbio� N insuflado pode levar a contaminação

acidental� Meio de cultura desenvolvido por Mueller e

Miller (modificado por Latham) constituído por um produto da digestão enzimática da caseína (N2case), infusão de coração de bovino, sais minerais e vitaminas

Toxina Tetânica ≠ Toxina Diftérica

� Tetânica:� Já está presente no

interior da célula em quantidade considerável em estágios precoces da fermentação

� Diftérica:� Não se observa

acumulação intracelular na fase de crescimento.

Processo Industrial

Fermentação

Filtração Tangencial

Filtração Molecular

Cromatografia

Destoxificação

Cromatografia

Filtração esterilizante

Usar formaldeido, mistura permanece a incubar a 37ºC, 4 semanas – fazer controlo de toxoides – se houver toxicidade adicionar mais formaldeido

Filtro de 0,22 Ø µm

Controlo do Toxoide

� Toxicidade específica

� Ausência de contaminantes� Conteúdo e potência do antigene

Engenharia Genética – esforços para obtenção de peptidosSintéticos para diminuir os efeitos colaterais

Vacinas Virais

� Reprodução dos vírus em culturas invitro � em células animais (em órgãos como rins de macaco ou cobaia)

� Cultura estática

� Cultura submersa

Cultura estática

� Cultura sem agitação em 1 ou mais camadas de células até a superfície do meio ficar coberta destas

�Inoculação com os vírus

�que se propagam podendo causar lise ou não

�separação, purificação inactivação (ou não)

Desvantagens

� Frequentes operações de inoculação de frascos, trocas de meio e colheitas

�

> risco de contaminação

Cultura submersa

� Em condições homogéneas, submersa, em suspensão

� �

� Reprodução de células

� Constante agitação do meio

� Em biorreactores (apropriados)

Vantagens

� � risco de contaminação� < mão de obra envolvida� Já há equipamento para controlo das

condições (pH, O2 dissolvido, temperatura, volume de entrada e saída)

�Condições ambientais constantemente favoráveis

�> Uniformidade dos lotes de vacinas obtidos

Desvantagens

1) Difícil manter uma suspensão de células individuais (pode-se promover a adesão dessas células sobre esferas microscópicas ou microcarregadoresque permanecem em suspensão graças à agitação mecânica do meio)

Desvantagens

2) Quando � a escala2.1. problemas na definição de necessidades nutricionais

de cultivo2.2. acumulação de subprodutos do metabolismo e sua

remoção2.3. transferência de O2 no biorreactor2.4. Sensibilidade das células às restrições físicas e

fisiológicas no crescimento (tensões devido à agitação, limitações de transporte em situação de alta [células]

2.5. adopção de métodos de monitorização e controlo do processo

Sistemas de agitação

Devem:

� Permitir adesão das células aos microcarregadores

� Evitar efeitos mecânicos decorrentes da agitação que levem ao rompimento das membranas celulares

� Evitar arejamento excessivo

Vacinas

Varicela

Herpes

Doença de Newcastle

Raiva

Febre bovina efémera

Influenza

Encefalite equinaRubéola

RaivaSarampo

Febre AftosaPoliomielite

VeterináriosHumanos

Advances inBiotechnological ProcessesAnimal and Human VirusVaccines

Esquema do processo de vacina da Influenza