capacidade de colonizaÇÃo e expressÃo ...“não nascemos prontos. e talvez, nunca estaremos....
TRANSCRIPT
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
CAPACIDADE DE COLONIZAÇÃO E EXPRESSÃO IMUNOMODULADORA DE
Salmonella Heidelberg E Salmonella Typhimurium EM POEDEIRAS LIVRES DE
PATÓGENOS ESPECÍFICOS
Ursula Nunes Rauecker
Orientadora: Profa. Dra. Cíntia S. Minafra e Rezende
GOIÂNIA
2019
ii
iii
URSULA NUNES RAUECKER
CAPACIDADE DE COLONIZAÇÃO E EXPRESSÃO IMUNOMODULADORA DE
Salmonella Heidelberg E Salmonella Typhimurium EM POEDEIRAS LIVRES DE
PATÓGENOS ESPECÍFICOS
Tese apresentada ao curso de
Doutorado em Ciência Animal
da Escola de Veterinária e
Zootecnia da Universidade
Federal de Goiás
Área de Concentração:
Saúde animal, Tecnologia e Segurança de alimentos
Linha de Pesquisa:
Epidemiologia, diagnóstico e controle de doenças infecciosas
Orientador:
Profa. Dra. Cíntia S. Minafra e Rezende
Comitê de Orientação:
Profa. Dra. Maria Auxiliadora Andrade – EVZ/UFG
Dra. Sabrina Castilho Duarte – CNPSA Embrapa
GOIÂNIA
2019
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v
vi
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À Deus
Aos meus pais, Idiana e José Carlos
Aos meus irmãos, Karolyne e José Carlos
Aos meus sobrinhos, Carlos Eduardo e Lívia
Dedico
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AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus. Obrigado, meu Deus, por me dar muito mais do
que eu preciso e por me abençoar muito mais do que eu mereço!
À Universidade Federal de Goiás, em especial ao Programa de Pós-Graduação em
Ciência Animal, por permitir esta valiosa experiência e à CAPES e CNPq pela concessão de
bolsa de doutorado no período de março de 2015 a fevereiro de 2019.
À Profª. Drª. Cíntia Silva Minafra e Rezende, minha orientadora, pela
compreensão, confiança, paciência, sabedoria e amizade.
À Dra. Sabrina Castilho Duarte, pela amizade, confiança e apoio durante o
desenvolvimento do presente trabalho. Sem você nada disso seria possível.
Aos professores da Escola de Veterinária e Zootecnia da UFG. Em especial à
Profa. Dra. Maria Auxiliadora Andrade, minha coorientadora, Profa. Dra. Iolanda A. Nunes e
prof. Dra. Valéria de Sá Jayme, trio que me ensinou que lugar de mulher também é na ciência.
Aos pesquisadores, técnicos e estagiários do Núcleo Temático de Sanidade de
Aves e Núcleo Temático de Produção de Aves da Embrapa Suínos e Aves, que tornaram a
execução do experimento possível: Dra. Monica Corrêa Ledur, Dra. Fatima Regina Ferreira
Jaenisch, Dra. Jane de Oliveira Peixoto, Dr. Maurício Cantão, Dr. Francisco Noé Fonseca,
Dra. Adriana M. Guaratini Ibelli, Germana Vizzotto Osowski e Lana Flávia Baron.
Aos diretores, cordenadores de curso, colegas de trabalho e alunos da UEG - São
Luís de Montes Belos. Agradeço a compreensão e suporte. Agradeço especialmente Gabriella
Riad Iskandar e sua família pela amizade, carinho e hospitalidade.
Aos amigos do Centro em Pesquisa em Alimentos CPA/EVZ/UFG: Aline Pedrosa
Oliveira, Fernanda Antunha de Freitas, Janaína Feistel, Julierme Oliveira, Marília Cristina
Sola, Cristyene G. Benício, Camila S. de Carvalho Costa, Ervaldo L. Souza Sena, Hudson
Ferraz, Bianca dos Santos e José Carlos Lopes. Obrigada por todos os momentos e boas
risadas. Aos amigos e colegas de Pós-graduação, obrigada pela convivência e amizade.
Aos amigos Ana Helena Vilela Resende, Marcele Tadaieski Arruda, Vanessa
Silvestre Ferreira de Oliveira, Alexsander Augusto da Silveira, Júlia de Miranda Moraes, José
Gabriel Amoril, Khawaja Naveed Shaukat, Leandro do Prado Assunção e Sergio Wilians de
Oliveira Rodrigues, pelo apoio, gentileza e sensibilidade.
A todos aqueles que fizeram e fazem parte de minha existência.
Gratidão!
ix
“Não nascemos prontos.
E talvez, nunca estaremos.
Somos construção. ”
Mario Sergio Cortella
x
SUMÁRIO
CAPÍTULO 1- CONSIDERAÇÕES GERAIS................................................. 1
CAPÍTULO 2 – DISSEMINAÇÃO EM ORGÃOS, CONTAMINAÇÃO DE
OVOS E EXCREÇÃO FECAL DE Salmonella Heidelberg e Salmonella
Typhimurium EM POEDEIRAS INOCULADAS
EXPERIMENTALMENTE................................................................................. 33
Introdução........................................................................................................... 35
Material e Métodos.............................................................................................. 36
Resultados............................................................................................................ 39
Discussão............................................................................................................. 44
Conclusões........................................................................................................... 50
Referências.......................................................................................................... 50
CAPÍTULO 3 - EXPRESSÃO DE TLR-4, IL1β, IL6 E IL10 EM BAÇO,
MAGNO E ÚTERO DE POEDEIRAS INFECTADAS COM Salmonella
Heidelberg E Salmonella Typhimurium............................................................. 55
Introdução............................................................................................................ 57
Material e Métodos............................................................................................. 58
Resultados........................................................................................................... 62
Discussão............................................................................................................ 70
Conclusões........................................................................................................... 71
Referências.......................................................................................................... 72
CAPÍTULO 4 - CONSIDERAÇÕES FINAIS................................................... 76
ANEXO 1............................................................................................................ 78
xi
LISTA DE FIGURAS
Capítulo 1
FIGURA 1 Elementos de T3SS (flagelo, T1 e T2) destacando seus
respectivos componentes homólogos como estrutura basal,
extensões para o espaço extracelular e translocon associado à
membrana da célula hospedeira...................................................... 04
FIGURA 2 Dinâmica de infecção por Salmonella enterica, destacando a
expressão de SPI-1, SPI-2 durante a invasão do epitélio intestinal
e sobrevivência intrafagocitária...................................................... 06
FIGURA 3 Interação entre hospedeiro, enteropatógeno e microbiota
simbiótica intestinal. Fonte: Adaptado de Leslie & Young18......... 08
FIGURA 4 Reconhecimento antigênico por meio da interação PAMP-PRR.
Fonte: Adaptado de Tizzard 26........................................................ 10
FIGURA 5 Mecanismos de invasão e colonização de células epiteliais do
oviduto de galinhas envolvendo a expressão de genes contidos
em SPI-1 e SPI-2 de Salmonella sp. Fonte: Adaptado de
Raspoet36........................................................................................ 15
FIGURA 6 Formação do ovo no trato reprodutivo de poedeiras e
contaminação de diferentes componentes por Salmonella sp. de
acordo com o segmento colonizado Fonte: Adaptado de Gantois
et al.8............................................................................................... 17
FIGURA 7 Contaminação de ovos por Salmonella sp., incluindo adesão
fimbrial ao oviduto e secreções e mecanismos de sobrevivência
ao ambiente hostil do oviduto do hospedeiro e ovo. Fonte:
Adaptado de Raspoet36.................................................................... 20
Capítulo 2
FIGURA 1 Distribuição de Salmonella Heidelberg (A) e Salmonella
Typhimurium (B) por segmento de trato reprodutor e por
poedeira infectada, sete DPI........................................................... 41
Capítulo 3
FIGURA 1 Associação entre os quatro genes avaliados. Círculos
representam genes e linhas de conexão representam interações
entre genes. (A) Linhas mais grossas representam associações
xii
fortes. (B). As cores diferentes das linhas mostram os modos de
ação. (C). As cores das linhas representam associações de acordo
com diferentes tipos de evidências.................................................
64
FIGURA 2 Associação preditiva entre os quatro genes avaliados e cinco
genes parceiros funcionais de resposta imune. (A) Linhas mais
grossas representam associações fortes. (B). As cores diferentes
das linhas mostram os modos de ação. (C). As cores das linhas
representam associações de acordo com diferentes tipos de
evidências...................................................................................... 65
FIGURA 3 Modificações na expressão relativa em amostras de baço, magno
e útero de poedeiras experimentalmente infectadas Salmonella
Typhimurium e Salmonella Heidelberg. (A) mRNA do gene
TLR4, 7 DPI. (B) mRNA do gene TLR4,14 DPI. (C) mRNA do
gene IL1β, 7 DPI. (D) mRNA do gene IL1β,14 DPI. (E) mRNA
do gene IL6, 7 DPI. (F) mRNA do gene IL6, 14 DPI. (G) mRNA
do gene IL10,7 DPI. (H) RNAm mRNA do gene IL10, 14
DPI.................................................................................................. 69
xiii
LISTA DE QUADROS
Capítulo 3
QUADRO 1 Iniciadores, tamanho do amplicons e número de acesso no
Genbank, utilizados para análise de expressão gênica em Gallus
gallus infectados experimentalmente por Salmonella
Typhimurium e Salmonella Heidelberg.......................................... 61
QUADRO 2 Descrição dos genes parceiros funcionais em resposta imune de
Gallus gallus................................................................................... 63
xiv
LISTA DE TABELAS
Capítulo 2
TABELA 1 Excreção fecal de Salmonella Heidelberg e Salmonella
Typhimurium em poedeiras em diferentes períodos pós
inoculação oral................................................................................ 39
TABELA 2 Recuperação de Salmonella Heidelberg e Salmonella
Typhimurium de órgãos de poedeiras em diferentes períodos pós
inoculação oral................................................................................ 40
TABELA 3 Detecção de Salmonella Heidelberg e Salmonella Typhimurium
em pool de casca e pool de gemas de ovos obtidos de poedeiras
em diferentes períodos pós inoculação oral.................................... 42
Capítulo 3
TABELA 1 Resultados de qPCR para baço, magno e útero por gene
constitutivo e entre grupos experimentais...................................... 66
xv
LISTA DE ABREVIATURAS
APC – célula apresentadora de antígenos
AvBD – beta defensina aviária
CAMP – peptídeo de ação antimicrobina
CD11/CD18 – proteína de superfície celular para reconhecimento de receptor de células T
cDNA – DNA complementar
Células NK – células natural killer
Ct – ciclo limiar
DPI – dias pós inoculação
GALT – tecido linfoide associado ao intestino
GAPDH – gliceraldeído fosfato desidrogenase
IFN-γ – Interferon gama
Ig - imunoglobulina
IgA – Imunoglobulina A
IgE – Imunoglobulina E
IgG – Imunoglobulina G
IL – interleucina
IL- 2 – interleucina 2
IL- 4 - interleucina 4
IL- 5 – interleucina 5
IL- 8 ou CXCL8 – interleucina 8
IL-10 – interleucina 10
IL-12 – interleucina 12
IL-13 – interleucina 13
INF - interferon
LB – linfócito B
LPS – Lipopolissacarídeos
LT – linfócito T
MALT – tecido linfoide associado à mucosas
MHC – complexo de histocompatibilidade principal
mRNA – RNA mensageiro
OTAP-92 – peptídeo antimicrobiano 92
OVAX – proteína X
OVAY – proteína Y
xvi
PAMPS – padrão molecular associado ao patógeno
pb – pares de bases
PMN - polimorfonuclear
qPCR – reação em cadeia da polimerase quantitativa
RI – resposta imune
RIA – resposta imune adaptativa
RII – resposta imune inata
rpm – rotações por minuto
RRP – receptor de reconhecimento de padrão
SPI – ilha de patogenicidade de Salmonella
T3SS – Sistema de Secreção tipo três
TCR1 – receptor 1 de células T
TE – Tris-EDTA
Th1 – Células T auxiliar tipo 1
Th2 – Células T auxiliar tipo 2
TLR – receptor do tipo toll
TNF- α – fator de necrose tumoral alfa
xvii
RESUMO
As aves de postura e corte constam como possíveis reservatórios para Salmonella enterica e o
caráter zoonótico compõe estudos preditivos quanto aos atributos para infecção e
multiplicação em plantéis e, por consequência, contaminação dos alimentos. Objetivou-se
avaliar o potencial de colonização de orgãos, excreção fecal e contaminação de ovos por
Salmonella Heidelberg e Salmonella Typhimurium, assim como avaliar a influência da
infecção pelos sorovares Heidelberg e Typhimurium na expressão de TLR-4, IL1β, IL6 e
IL10 em baço, magno e útero de poedeiras inoculadas experimentalmente. Foram
selecionadas 45 poedeiras White Leghorn com 28 semanas de idade, livres de patógenos
específicos, foram divididas em três grupos mantidos em unidades isoladoras. No primeiro
grupo, SH, inoculou-se em cada ave, via oral, 1,2 x 107 UFC de Salmonella Heidelberg, no
segundo grupo, ST, 1,0 x 107 UFC de Salmonella Typhimurium. No grupo controle, as aves
receberam igual volume de solução salina esterilizada. Aos sete, 14 e 21 dias pós inoculação,
cinco poedeiras/grupo foram submetidas à eutanásia e necropsia. Baço, fígado, ovários,
magno, istmo, útero, intestino delgado e ceco foram colhidos e destinados aos ensaios
histopatológicos e bacteriológicos. Ovos foram colhidos diariamente e excretas a cada três
dias, antes e durante o período de realização do experimento e analisados. Foi realizado qPCR
para análise de expressão dos genes TLR-4, IL6, IL10 e IL1B em baço, magno e útero. Os
resultados obtidos foram normalizados, utilizando os genes constitutivos RPLP-1 e β-actina e
a expressão foi calculada pela razão entre as diferenças de média do grupo controle e grupos
desafio dos genes alvo. Nenhumas das poedeiras apresentou sinais clínicos após a inoculação.
A excreção fecal foi intermitente e durou 12 dias para ambos sorovares. O sorovar Heidelberg
foi identificado em todos os tecidos avaliados sete DPI, assim como Salmonella
Typhimurium, identificada em todos os tecidos avaliados, exceto ovário, sete DPI. Salmonella
Heidelberg persistiu no ceco e baço, de forma viável, 14 DPI, enquanto que o sorovar
Typhimurium não foi identificado em nenhum tecido, considerando o mesmo período. A
inoculação experimental gerou infecção com resolução em 14 DPI em poedeiras ST e 21 DPI
para poedeiras SH. Salmonella Heidelberg permaneceu por mais tempo no hospedeiro, com
isolamento microbiológico persistente em ceco e baço associado a pouca indução de resposta
inflamatória nos órgãos avaliados. Os dois sorovares foram capazes de contaminar os ovos
produzidos no período pós inoculação, sendo isolados em casca a partir de três DPI e gema
até 12 DPI. As alterações histopatológicas encontradas foram de escore discreto, sem
alterações em baço. Existem interações fortes entre os genes TLR4, IL1B, IL6 e IL10, sendo
evidenciada a presença de cinco genes parceiros funcionais STAT3, IL10RA, TRAF6,
TICAM1 e LY96. Os resultados evidenciam diferença do reconhecimento antigênico e
resposta imune determinada pela expressão de mRNA dos genes TLR-4, IL1B, Il6 e IL10 nas
poedeiras infectadas por Salmonella Heidelberg e Salmonella Typhimurium.
Palavras-chave: infecção paratífica, postura, resposta imune
xviii
ABSTRACT
Laying hens and broilers are potential reservoirs for Salmonella enterica and the zoonotic risk
composes predictive analyses, regarding the attributes for infection and multiplication in
poultry flocks and, consequently, food contamination. The aim of this study was to evaluate
the potential of internal organ colonization, fecal shedding patterns and egg contamination by
Salmonella Heidelberg and Salmonella Typhimurium, and evaluate the influence of infection
by Heidelberg and Typhimurium serovars on TLR-4, IL1β, IL6 and IL10 expression in
spleen, magnus and uterus of experimentally inoculated layers. 28-week-old White Leghorn
laying hens were selected, free of specific pathogens, divided into three groups kept in
isolation units. In the first group, SH, 1.2 x 107 CFU of Salmonella Heidelberg was inoculated
orally in each bird, in the second group, ST, 1.0 x 107 CFU of Salmonella Typhimurium. In
the control group, birds received equal volume of sterile saline solution. At seven, 14 and 21
days after inoculation, five layers / group were euthanized and necropsied. Spleen, liver,
ovaries, magnum, isthmus, uterus, small intestine and caecum were collected and destined for
histopathological and bacteriological tests. Eggs were collected daily and excreted every three
days, before and during the period of the experiment and analyzed. qPCR was performed for
expression analysis of TLR-4, IL6, IL10 and IL1B genes in spleen, magnus and uterus.
Results were normalized using constitutive genes RPLP-1 and β-actin and expression was
calculated by the ratio of the mean differences between the control group and the target gene
in challenge groups. None of the layers showed clinical signs after oral inoculation. Fecal
excretion was intermittent and lasted 12 days for both serovars. Heidelberg serovar was
identified in all tissues evaluated seven DPI, as well as Salmonella Typhimurium, identified in
all tissues evaluated, except ovary, seven DPI. Salmonella Heidelberg persisted 14 DPI in the
cecum and spleen, while Typhimurium serovar was not identified in any tissue over the same
period. Experimental inoculation generated infection with 14 DPI resolution in ST layers and
21 DPI in SH layers. Salmonella Heidelberg persisted longer in the host, with microbiological
isolation in the caecum and spleen associated with discrete induction of inflammatory
response in the evaluated organs. Both serovars were able to contaminate the eggs produced
in the post inoculation period, being isolated in shell from three DPI and yolk up to 12 DPI.
The histopathological alterations found were of discrete score, without alterations in the
spleen. There are interactions between the TLR4, IL1B, IL6 and IL10 genes, evidencing the
presence of five functional partner genes STAT3, IL10RA, TRAF6, TICAM1 and LY96. The
results show differences in antigen recognition and immune response determined by mRNA
expression of TLR-4, IL1B, Il6 and IL10 genes in laying hens infected with Salmonella
Heidelberg and Salmonella Typhimurium.
Palavras-chave: egg laying, immune response, paratyphoid infection
1
CAPÍTULO 1- CONSIDERAÇÕES INICIAIS
1. Introdução
A grande capacidade de manutenção e disseminação no meio ambiente
são grandes desafios para o controle de Salmonella sp. na cadeia de produção
avícola1. Bactérias do gênero Salmonella continua sendo uma das causas mais
comuns de doença bacteriana veiculada por alimentos, principalmente em associação
com o consumo de ovos crus ou alimentos contendo ovos mal cozidos2,3. A
contaminação de ovos por Salmonella sp. pode ocorrer através de mecanismos
verticais e horizontais. A transmissão vertical é primariamente associada à
Salmonella Enteritidis e ocorre quando a bactéria infecta o oviduto da poedeira,
contaminando o conteúdo interno dos ovos durante o desenvolvimento4. A
transmissão vertical de outros sorovares paratíficos, incluindo Salmonella
Typhimurium foi documentada, mas em muito menor extensão do que Salmonella
Enteritidis2,5,6. A contaminação horizontal ocorre quando um ovo entra em contato
com um ambiente contaminado4. As bactérias podem aderir à superfície do ovo e
migrar através dos poros da casca do ovo4 ou formar biofilmes na superfície da
casca7, representando um risco de contaminação cruzada de itens alimentares.
Estudos recentes alertam sobre o predomínio de Salmonella Heidelberg em algumas
regiões do Brasil, destacanto suas características de resistência e manutenção no
ambiente1.
A transmissão de Salmonella paratífica para aves normalmente ocorre
por via fecal-oral, causando gastroenterite e disseminação sistêmica em aves jovens,
com idade inferior a duas semanas de idade, com mortalidade que varia de acordo
com a linhagem infectada2. Algumas aves podem sofrer colonização persistente por
Salmonella no intestino e/ou trato reprodutor, podendo eliminar o agente nas
excretas, produzir ovos contaminados e contribuir para a contaminação ambiental6,8.
Diferente dos mamíferos, os embriões das aves não se desenvolvem em
ambiente seguro como o útero, protegido pelo sistema imunológico da mãe. A
estrutura dos ovos possui diversos mecanismos de proteção incluindo barreiras
físicas inespecíficas e substâncias de ação antimicrobiana também presentes em sua
formação no oviduto4. A grande habilidade de alguns sorovares de Salmonella em
2
colonizar o trato reprodutor das aves, contaminar ovos e sobreviver no seu interior,
virulência e capacidade de disseminação na cadeia de produção de alimentos,
evidenciam sua importância em saúde pública9,10.
No controle de salmonelose humana e em animais, diversas pesquisas
foram desenvolvidas tendo como principal alvo Salmonella enterica. Entretanto, a
competência imunológica desempenha papel primordial na produção animal, visto
que animais infectados pela mesma dose e cepa de Salmonella podem tanto morrer,
eliminar totalmente o agente ou podem tornar-se portadores assintomáticos11.
Avaliar nas aves, características de imunocompetência, em especial os
mecanismos de defesa do trato reprodutor sobre a patogenicidade relacionada a
infecções por sorovares de Salmonella é elemento chave para o controle do agente
nos plantéis comerciais de produção de ovos. Com o intuito de melhor compreender
a dinâmica de infecção em poedeiras, este trabalho foi desenvolvido objetivando
avaliar o potencial de invasão, colonização de orgãos internos e contaminação de
ovos, além de caracterizar o perfil de expressão de genes de resposta imune em
diferentes orgãos de poedeiras submetidas à infecção por Salmonella Heidelberg e
Salmonella Typhimurium.
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Salmonella enterica: colonização intestinal e infecção sistêmica em poedeiras
Em aves, as infecções sistêmicas por Salmonella sp. podem ser divididas
em fase de invasão, envolvendo o trato intestinal, estabelecimento de infecção
sistêmica e resolução. A interação do agente com elementos da resposta imunológica
do hospedeiro determina se o indivíduo infectado será capaz de sobreviver, eliminar
totalmente o agente ou se tornará portador inaparente10,12.
A contaminação do trato reprodutor de poedeiras por Salmonella sp.
ocorrerá em animais que sofreram infeção sistêmica, após colonização do trato
gastrointestinal e que se tornaram portadores inaparentes, com a persistência do
agente no organismo da ave10. Após a ingestão, o alimento contaminado permanece
no inglúvio em pH 4-5, desencadeando mecanismos de resposta ao estresse ácido em
Salmonella sp. que auxiliam em sua sobrevivência durante a passagem pelo
proventrículo e ventrículo do animal12.
3
Durante o curso da salmonelose em aves, a interação inicial entre o
agente e o hospedeiro ocorre no epitélio intestinal. A progressão da infecção e a
resposta imunológica são relacionadas ao sorovar e às características genéticas do
hospedeiro. Alguns sorovares de Salmonella frequentemente são invasivos em aves,
determinando infecção sistêmica e resposta imune associada às mucosas. Em animais
imunocompetentes, a infecção é transitória e o agente é totalmente eliminado pela
resposta imune10.
A interação entre o agente e macrófagos no foco da infecção e em orgãos
linfoides secundários é a chave para a progressão de infecção sistêmica em
mamíferos e aves13, facilitando a disseminação do agente para orgãos como fígado e
trato reprodutor14. Salmonella enterica possui mecanismos de sobrevivência
intrafagocitária, associados a Ilha de Patogenicidade de Salmonella 2 (SPI-2) que
codifica genes de expressão do Sistema de Secreção tipo 3 (T3SS)15. As ilhas de
patogenicidade não se apresentam como segmentos homogêneos de DNA e sim
como estrutura semelhante a um mosaico, sugerindo aquisições a partir de diferentes
doadores16.
O termo ilhas de patogenicidade foi usado pela primeira vez em 1994 por
Jörg Hacker para descrever um segmento do cromossomo que quando removida,
determinava a expressão de fenótipo não virulento de Escherichia coli17.
Frequentemente essas regiões cromossômicas acomodam genes que contribuem para
a expressão de um fenótipo virulento, que se apresenta durante um período específico
no processo infeccioso. Para muitas enterobactérias, uma única ilha de
patogenicidade pode converter um microrganismo normalmente benigno em um
patógeno, contribuindo para a emergência de novos agentes infecciosos18. Porém, é
importante destacar que a aquisição de uma ilha de patogenicidade nem sempre
garante a transformação da bactéria em patógeno, visto que a expressão genes de
virulência e patogenicidade depende muito da interação entre microrganismo e
hospedeiro19.
No gênero Salmonella, existem 17 SPI descritas e sua presença no
cromossomo varia de acordo com o sorovar considerado20. As mais conhecidas são
SPI-1, SPI-2, SPI-3, SPI-4 e SPI-5 que desempenham funções distintas durante a
progressão da infecção21.
A SPI-1 foi a primeira a ser descrita no gênero Salmonella19 relacionada
com a invasão de células não fagocitárias, como as do epitélio intestinal, importante
4
nos estágios iniciais da doença. Não parece estar envolvida em estágios mais tardios
e sistêmicos, como a SPI-2, necessária para sobrevivência do agente no interior de
fagócitos e disseminação no hospedeiro19,22.
A habilidade de alguns sorovares de Salmonella em sobreviver no
interior de células, incluindo macrófagos, é fator determinante de patogenicidade. Os
macrófagos além de produzirem compostos reativos de oxigênio como o óxido
nítrico, com atividade antimicrobiana, produzem citocinas e atuam como células
apresentadoras de antígenos (APCs), sendo importantes elementos de ativação de
linfócitos T23.
Considerando a patogenicidade de Salmonella Heidelberg e
Typhimurium em poedeiras, destaca-se as SPI-1 e SPI-2, cada uma composta por
40kb21,24. Juntas. codificam elementos do Sistema de Secreção Tipo 3 (T3SS),
representados na Figura 1, envolvendo proteínas efetoras e reguladores
transcricionais responsáveis25,26. O T3SS (Figura 1) é um sistema formado por mais
de 20 proteínas, abrange a membrana interna e externa da célula bacteriana, capaz de
promover motilidade por meio da síntese de flagelina e de liberar proteínas efetoras
no citosol da célula hospedeira, pela formação de uma estrutura em agulha ou
“microseringa”, possibilitando a internalização da bactéria nas células hospedeiras24.
FIGURA 1 – Elementos de T3SS (flagelo, T1 e T2) destacando
seus respectivos componentes homólogos como
estrutura basal, extensões para o espaço
extracelular e translocon associado à membrana
da célula hospedeira. Fonte: Arquivo pessoal,
2019.
5
Quando ocorre a aderência de Salmonella sp. ao intestino da poedeira,
mecanismos relacionados ao T3SS são desencadeados, tais como a produção de
flagelina e ativação de T127. Usando este sistema de secreção, a bactéria adere-se a
superfície da célula epitelial por meio do translocon que possui afinidade com o
colesterol28. Esse contato permite a translocação de proteínas bacterianas SipB, SipC,
e SipD, no citosol de células do hospedeiro19 e posteriormente proteínas efetoras,
como SptP, SopE e SopE2, capazes de alterar as funções celulares e induzir rearranjo
do citoesqueleto da célula do hospedeiro, produzindo ondulações na superfície da
membrana celular e facilitando a internalização de bactérias21,24,29.
Outras proteínas efetoras de SPI-1, como SopA, Sopb e SopD,
translocadas pelo sistema TSS3, foram associadas com disrupções das tight junctions
e alterações nos canais de cloro, desencadeando perda de eletrólitos e
extravasamento de fluidos para o lúmen intestinal provocando diarreia30. A invasina
SipB codificads por SPI-1 também pode induzir a apoptose em fagócitos, resultando
na liberação de citocinas como IL-8 e alteração no processo inflamatório31.
De modo geral, Salmonella, patógeno intracelular facultativo, consegue
entrar em células não fagocitárias por dois mecanismos, diferenciados de acordo com
a forma de remodelamento da membrana celular do hospedeiro32. O mecanismo de
invasão descrito anteriormente é conhecido como Trigger e envolve reorganizações
drásticas no citoesqueleto, semelhantes a ondas ou pregas promovida pela
translocação de proteínas efetoras bacterianas pelo TSS3. Já no mecanismo Zipper,
ou entrada mediada por receptores, a invasão bacteriana é facilitada pela forte adesão
à superfície da membrana por meio da interação de proteínas bacterianas (invasinas)
com receptores localizados na superfície celular, com pequeno rearranjo do
citoesqueleto33.
Bactérias do gênero Salmonella são capazes de internalizar em células
não fagocíticas utilizando os dois mecanismos33. Dessa forma, a invasão de células
do hospedeiro (Figura 2) não é determinada unicamente pelo T3SS determinado por
SPI-1 e pode envolver a síntese de adesinas, invasinas e hemolisinas34. Infecções
experimentais conduzidas com mutantes ΔSPI-1 de Salmonella Enteritidis em aves
demonstraram que a ausência da expressão de TSS3 não impediu a invasão do
epitélio intestinal mas comprometeu a disseminação e colonização do agente em
orgãos internos35.
6
FIGURA 2 – Dinâmica de infecção por Salmonella enterica,
destacando a expressão de SPI-1, SPI-2 durante a
invasão do epitélio intestinal e sobrevivência
intrafagocitária. Fonte: Arquivo pessoal, 2019.
Após a invasão do epitélio intestinal, as bactérias podem ser encontradas
no interior de células fagocitárias, em vesículas, submetidas à diminuição da oferta
de nutrientes, redução de pH e expostas a estresse oxidativo27. Esse novo ambiente
determina a expressão de um novo perfil, inibição de SPI-1 e indução da ativação da
SPI-2, que altera o transporte de substâncias entre citosol e interior do vacúolo. A
função de SPI-2 é proteger o patógeno contra os mecanismos da imunidade inata do
hospedeiro, prevenindo a concentração de oxido nítrico e outros intermediários de
oxigênio e nitrogênio reativos no interior das vesículas que contém Salmonella. SPI-
2 favorece a multiplicação intracelular da bactéria e resultam na persistência da
infecção36.
Em camundongos, a virulência de Salmonella Enteriditis é totalmente
dependente de SPI-2, porém que sua função varia de acordo com o modelo animal
estudado, visto que em aves e bovinos sua deleção determinou apenas atenuação do
agente37. A presença de SPI-2, detectada apenas em Salmonella enterica é
considerada um passo evolucionário recente que facilita a disseminação do agente
em hospedeiros de sangue quente18,38.
Observa-se que a expressão de SPI-1 e SPI-2 de Salmonella sp. é
regulada de forma diferenciada, considerando induções in vivo e in vitro. In vivo, os
genes SPI-1 são expressos principalmente quando presente no lúmen intestinal,
7
associada à celulas epiteliais ou enterócitos39, considerando a participação das
proteínas codificadas em SPI-1 para a invasão do epitélio intestinal, colonização
intestinal e consequente inflamação40.
Os genes SPI-2, in vivo, associam-se com a sobrevivência e replicação
dentro de células fagocitárias, contribuindo para a disseminação e determinação de
um quadro sistêmico41,42. São expressos principalmente quando as bactérias são
encontradas no interior das células epiteliais ou macrófagos, no interior de vacúolos,
no lúmen intestinal, lâmina própria ou na mucosa subjacente39.
In vitro, os genes contidos em SPI-1 e SPI-2 são expressos quando
Salmonella é cultivada em meios ricos em nutrientes, embora sejam diferencialmente
regulados nas fases de crescimento exponencial e estacionária. Entretanto, a
expressão dos genes SPI-2 é incrementada quando Salmonella é cultivada em
ambiente nutricionalmente pobre, com pH ácido, contendo baixas concentrações de
fosfato, cálcio, e magnésio43. A SPI-1 é controlada por um conjunto de genes
reguladores internos de transcrição Hild, HILA e invF que induzem a expressão dos
genes dentro desta ilha em forma de cascata41,44.
A persistência do agente, determinando estado de portador
inaparente, pode ocorrer, com a manutenção do agente em baixas concentrações
ao longo da vida da ave, podendo ocorrer recrudescência da infecção. A
capacidade do agente de sobreviver em ambiente intracelular associado a TSS3,
é um dos elementos envolvidos em sua manutenção no hospedeiro10,15.
Além da interação entre hospedeiro e agente infeccioso, nas
salmoneloses paratíficas, deve-se considerar a presença da microbiota simbiótica do
trato gastrointestinal do indivíduo e o seu papel na determinação de sensibilidade ou
resistência do animal45 (Figura 3). Nesse contexto, observa-se que a microbiota
simbiótica desenvolve interações metabólicas com o hospedeiro46 e possui atividades
imunomoduladoras, sendo capazes de gerar estímulos para a resposta imunológica47.
8
FIGURA 3 – Interação entre hospedeiro, enteropatógeno e microbiota
simbiótica intestinal. Fonte: Adaptado de Leslie &
Young45.
A microbiota simbiótica também interage com o patógeno, seja por meio
de inibição direta, pela produção de bacteriocinas48 ou por meio da competição por
nutrientes49. Sabe-se que alterações nas populações que colonizam o trato
gastrointestinal, como nas antibioticoterapias, podem tornar o indivíduo mais
sensível a infecções45.
2.2 Interação de Salmonella sp. e resposta imune em aves
2.2.1 Componentes da resposta imune
Em mamíferos e aves, a resposta contra a infecção microbiana é mediada
pelas reações precoces da imunidade inata (RII) e respostas da imunidade adaptativa
(RIA) ou específica. Apesar da semelhança com alguns mecanismos do sistema
imunológico de mamíferos, as aves apresentam algumas particularidades associadas
à anatomia, diferenciação e função dos órgãos e células da resposta imune50,51.
Durante o desenvolvimento embrionário e dias após a eclosão, as aves
permanecem transitoriamente protegidas frente a toxinas, micro-organismos e
parasitas por meio de anticorpos maternos transferidos via gema. As
imunoglobulinas maternas sofrem redução progressiva em sua concentração52. As
aves desenvolvem seus mecanismos de defesa durante o período embrionário,
entretanto a imunocompetência começa a atuar uma semana após a eclosão, quando
finalizam a organização estrutural de orgãos linfoides secundários, que se tornam
capazes de produzir resposta específica51.
9
Orgãos linfoides em aves
Os componentes do sistema imune das aves podem ser divididos em
órgãos linfoides centrais ou primários e órgãos linfoides secundários ou periféricos51.
A bursa de Fabricius, medula óssea e timo são órgãos linfoides primários. São locais
de maturação e diferenciação de linfócitos B e T, recebendo células imaturas
formadas no desenvolvimento embrionário53. A bursa de Fabricius é estrutura
exclusiva de aves e localiza-se na porção distal da cloaca54. Possui folículos linfoides
onde ocorre o desenvolvimento dos linfócitos B, com função semelhante à
desempenhada pela medula óssea em mamíferos51. Após o processo de maturação, os
linfócitos B se deslocam para orgãos linfoides secundários. A bursa atinge tamanho
máximo oito a dez semanas após a eclosão da ave e sofre redução significativa
quando a ave atinge maturidade sexual53.
O timo apresenta-se como órgão lobulado, na forma de dois cordões de
sete a oito lobos cada, dispostos paralelamente ao longo da veia jugular e nervo
vago51. Nesse local ocorre o desenvolvimento e diferenciação de diferentes linhagens
de linfócitos T, cada com sua função na resposta imune humoral e celular55.
Como orgãos linfoides secundários, além do baço, as aves possuem
tecido linfóide associado a mucosas (MALT), tecido linfoide associado aos
brônquios (BALT), tecido linfoide associado ao intestino (GALT), além de tecido
linfoide nos olhos e conjuntivas (glândula de Harder), genitais e pele51. Ao contrário
dos tecidos linfoides primários, não são locais de diferenciação e proliferação celular,
mas são responsivos à presença de antígenos56.
No trato gastrointestinal, primeiro local de colonização e invasão por
Salmonella sp. em infecções por via oral encontra-se o GALT, composto por tonsilas
esofagianas, tonsilas pilóricas, Placas de Peyer, divertículo de Meckel e tonsilas
cecais, além de agrupamentos linfoides e folículos distribuídos no epitélio. Nessas
regiões são encontrados linfócitos T, B, plasmócitos e macrófagos57.
As tonsilas cecais e placas de Peyer de galinhas possuem estrutura
organizada denominada de linfoepitélio, contendo células M, região sub-epitelial,
estrutura folicular e áreas entre foliculos. Os folículos associados ao epitélio são
caracterizados pela presença de linfócitos e células M, contendo linfócitos B (LB) e
linfócitos T (LT) CD8+58. A caracterização dos leucócitos intestinais de galinhas
revelou que 80% são linfócitos, 10-20% de macrófagos e menos de 1% são células
polimorfonucleares (PMN) e plasmócitos34,59.
10
Reconhecimento antigênico e resposta celular da resposta imune inata
A imunidade inata, composta por barreiras físicas, químicas e celulares,
constitui a primeira linha de defesa contra agentes infecciosos. Possui componentes
celulares capazes de detectar a presença de micro-organismos53. O reconhecimento
antigênico na RII é determinado pela interação entre padrões moleculares associados
ao patógenos (PAMPs) com os receptores de reconhecimento (PRRs) localizados na
membrana de células epiteliais e de resposta imune inata10,60. Considerando
Salmonella sp., os principais PAMPs reconhecidos são componentes estruturais do
agente, como lipopolissacarídeos (LPS), peptideoglicanos, DNA sem metilação e
flagelina10,61.
Os receptores PRRs do tipo Toll (TLR), presentes na superfície de
células epiteliais de diferentes orgãos e células de resposta imune inata (Figura 4),
são determinantes de ativação e indução de cascata de sinalização associada à RII e
RIA. Em aves, são dez PRRs do tipo Toll conhecidos: TLR1-1, TLR1-2, TLR2-1,
TLR2-2, TLR-3, TLR-4, TLR-5, TLR-7, TLR-15 e TLR-2110.
FIGURA 4 – Reconhecimento antigênico por
meio da interação PAMP-PRR.
Fonte: Adaptado de Tizzard 53.
Sua distribuição no trato reprodutor de poedeiras varia de acordo com o
segmento considerado37. Sua expressão pode ser aumentada ou reduzida, sofrendo
influência da exposição antigênica e idade do animal10. O reconhecimento de
Salmonella sp. por esses receptores estimula a liberação de diversas citocinas,
quimiocinas, peptídeos catiônicos antimicrobianos (CAMPs), além do influxo de
células de defesa para o local de reconhecimento62.
11
A presença de LPS no trato reprodutor de aves foi capaz de aumentar a
expressão de TLR-4 em ovário e oviduto, também induzindo a produção de IL-1, IL6
e IL-8 e estimulando atividade oxidativa e degranulação de heterófilos63.
A infecção oral por Salmonella sp. induz na ave resposta celular e
humoral61. A produção de citocinas pró-inflamatórias IL-17, IL-8, IL-1β, IL-6, IL-22
por fagócitos teciduais e células epiteliais pode ser observada nos primeiros dias pós-
infecção, relacionando-se com a atividade de células da RII11. Também nos primeiros
dias, ocorre aumento nos níveis de compostos proteicos de RII, como C3 do sistema
complemento e avidinas11. A consequência da ativação da imunidade inata é o
influxo de células PMN para o intestino. Apesar de desencadear danos associados à
inflamação, também são responsáveis por limitar a disseminação sistêmica do
agente10.
Em aves, os heterófilos são células equivalentes aos neutrófilos de
mamíferos, envolvendo-se na fagocitose de antígenos extracelulares. Apesar de
capazes de produzir compostos reativos de oxigênio, sua produção é menos
expressiva do que a observada em neutrófilos de mamíferos, não produzindo
mieloperoxidase53. Nas infecções por Salmonella sp., os heterófilos se acumulam na
lâmina própria do ceco nas primeiras 24 horas após exposição64,65 e podem ser
observados em infiltrados inflamatórios em ovário e oviduto61.
A contribuição de células da RII na resistência às infecções por
Salmonella tem sido demonstrada, visto que heterófilos de linhagens de poedeiras
mais resistentes expressam níveis mais elevados de citocinas pró-inflamatórias,
incluindo IL-6, IL-8 e IL-1, e apresentam valores mais baixos de TGF-β466,67.
Nos primeiros dias subsequentes à inoculação do agente, ocorre aumento
na expressão de elementos típicos de RII, como IL-8 e Il-17, lisozima G2 e
Interferon tipo 1 (IFIT5). Quatro dias após a infecção, ocorre elevação da expressão
de genes relacionados à resposta de heterófilos e macrófagos e proteínas de fase
aguda IRG1, SAA, ExFABP, TRAP6, MRP126, iNOS, IL1B e AVD (AH221),
assim como expressão do gene MMP7 envolvido na alteração da permeabilidade do
epitélio intestinal e diapedese11.
Linhagens de aves resistentes à infecção possuem macrófagos com maior
atividade oxidativa68 ou expressam citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias de
forma mais rápida e/ou maiores quantidades de IL-18 que aves sensíveis69. A
exposição de macrófagos de aves a PAMPs derivados de Salmonella desencadeia
12
aumento na produção de óxido nítrico, expressão de IL-6, expressão de TLR e
redução na sobrevivência intracelular do agente70. Outras células da RII podem atuar
como APCs, envolvidas na ativação de LT e LB em orgãos linfoides secundários,
como células dendríticas e células M, sendo essa atividade intensa nas tonsilas
cecais71.
Defensinas
Como os heterófilos de aves não possuem mieloperoxidase e
desencadeiam reduzido efeito oxidativo durante a fagocitose, outros agentes
antimicrobianos catiônicos denominados defensinas tornam-se os principais
elementos de ação rápida frente a micro-organismos63. São conhecidas 14 beta-
defensinas aviárias (AvBD) em galinhas72.
O mecanismo de ação das defensinas associa-se à sua natureza catiônica,
interagindo de forma eletrostática com o potencial elétrico gerado na membrana
celular bacteriana, alterando sua permeabilidade e provocando a morte celular.
Quando transportados para o interior da célula bacteriana podem interferir com a
síntese de DNA, RNA e proteínas72,73. As AvBD desempenham papel primário na
eliminação de micro-organismos e possuem efeito de quimiotaxia sobre células da
RII74. São produzidas por diversas células, como células epiteliais do intestino e
oviduto75,76
Ação antibacteriana de AvBD foi demonstrada contra bactérias Gram-
positivas e negativas, incluíndo Salmonella Enteritidis e Typhimurium61. AvBD1 é
efetiva contra os sorovares Enteritidis e Typhimurium77, assim como AvBD4, 5 e 678.
Apesar de Salmonella sp. ser resistente a ação de peptídeos catiônicos ao alterar as
cargas aniônicas da parede celular, AvBD5 é capaz de interagir com a parede celular
modificada79.
A expressão de AvBD no trato gastrointestinal de aves é importante na
proteção contra patógenos entéricos durante os primeiros dias após a eclosão e sua
expressão tecidual aumenta após contato com antígenos80. Considerando os orgãos
linfoides de aves, a expressão de AvBD é maior na Bursa de Fabricius, em
comparação ao baço e timo72.
Com exceção da AvBD11, a expressão das avidinas ocorre ao longo de
todo trato digestório de aves, inclusive nas glândulas anexas72. Em aves adultas, a
expressão de avidinas é superior a de aves jovens, indicando o efeito das exposições
13
a antígenos sobre a sua produção61. Na boca, esôfago e ingluvio, são produzidas
AvBD3, 5 e 978. No proventrículo e ventrículo, a produção de AvBD é baixa,
detectando-se AvBD9 e AvBD1381. As AvBD8, AvBD9 e AvBD10 foram
detectadas no fígado e vesícula biliar81,82. AvBD1 e 2 foram detectadas no ceco83,
AvBD13 no colon82 e AvBD1, 2 e 10 foram encontradas na cloaca84,85.
A distribuição das AvBD nos diferentes segmentos do trato reprodutor de
poedeiras varia de acordo com a idade, exposição a agentes infecciosos, sendo LPS
de Salmonella sp. capaz de elevar sua expressão in vivo e in vitro62. No ovário foram
detectadas AvBD1, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10 11 12 e 14. AvBD6 e 13 não foram
encontradas e AvBD2, apesar de presente, demonstrou expessão em níveis muito
baixos86. A administração oral de Salmonella sp. resultou em elevação da expressão
de AvBD4, 5, 7, 11 e 12 no ovário e elevação de AvBD5, 7, 10, 11,12 e 14 no
segmento vaginal86,87. Entretanto, a presença das AvBD no oviduto de aves com
início de produção de ovos (18 semanas) sofreu redução, indicando o envolvimento
de hormônios sexuais sobre sua expressão72.
Recentemente, uma nova família de defensina, denominada ovodefensina
foi introduzida na classificação. Sua expressão foi demonstrada no oviduto de
poedeiras, magno, istmo e útero. Foi capaz de inibir o crescimento de E. coli,
entretanto, sua ação antibacteriana sobre Salmonella Enteritidis e Typhimurium não
foi demonstrada88.
Resposta imune adaptativa em aves expostas a Salmonella sp.
Após o estabelecimento de infecção sistêmica, a eliminação do agente
depende da atuação de elementos da resposta imune adaptativa (RIA)12. Bactérias do
gênero Salmonella são consideradas patógenos intracelulares facultativos e a
imunidade mediada por células possui papel muito importante para a eliminação da
bactéria dos tecidos89.
Os componentes da RIA são capazes de reconhecer, diferenciar e reagir a
vários de antígenos, envolvendo mecanismos de resposta celular e resposta humoral,
associadas aos linfócitos T e anticorpos produzidos por LB. Sua ativação
desencadeia a diferenciação de células de memória, responsáveis por proteger o
animal em exposições subsequentes ao mesmo agente infeccioso10.
A ativação de resposta Th1 possui papel mais importante na eliminação
de Salmonella sp. em aves, do que o efeito de neutralização determinado por
14
anticorpos10. Em decorrência da localização intracelular do agente, a eficiência das
vacinas depende do potencial de gerar, além da produção de anticorpos, resposta
celular12,90.
Em animais desafiados, a resposta imune adaptativa inicia-se no
intestino, principalmente na região do ceco, observa-se grande influxo de linfócitos T
e expressão de INF gama, IL-12 e IL-18, determinando ativação da resposta Th1,
considerada a mais importante na eliminação do agente após infecção
sistêmica91,92,93. Verifica-se que em aves sensíveis à infecção por Salmonella, ocorre
a produção de citocinas como IL-4, e IL-13, responsáveis por determinar resposta
Th2, frequentemente observada em animais com infecção persistente94.
No ceco, a população de LT CD8+ possui grande papel na resposta
adaptativa76. Além disso, em aves infectadas, observa-se a participação de LT de
ação reguladora, assim como a produção de IL-10, responsáveis por modular a
resposta imune, principalmente na região do ceco. Acredita-se que esse efeito
imunomodulador observado em aves é contribui para a persistência do agente nesses
animais, diferente da resposta imune observada em mamíferos10.
Em aves são encontrados três tipos de imunoglobulinas: imunoglobulina
A (IgA), imunoglobulina M (IgM) e imunoglobulina Y (IgY). As três classes podem
ser detectadas no soro, trato intestinal, oviduto e bile de aves desafiadas com
diferentes cepas de Salmonella sp. e podem ser utilizadas como parâmetro na
avaliação da resposta imune do animal95. A presença de anticorpos em aves pode ser
detectada uma semana após o contato com Salmonella sp.10.
A IgA é o principal anticorpo presente nas mucosas. Sua presença reduz
a aderência de bactérias no epitélio, prevenindo desta maneira, o desenvolvimento de
doenças. Nas aves, mais de 75% da imunoglobulina IgA que é produzida migra para
a circulação e pode ser transportada para o fígado e lançada no canículo biliar. Desta
maneira, a bile é a principal via pela qual a IgA atinge o intestino nesta espécie54. Em
animais submetidos à inoculação experimental com Salmonella sp., observou-se
expressão máxima de imunoglobulinas IgY e IgA 22 dias após o contato, tendo como
principal alvo, antígenos T-independentes como LPS encontrado na parede
celular11,96.
15
2.3 Contaminação de ovos
2.3.1 Colonização do trato reprodutor
A persistência de Salmonella sp. na ave, por meio de mecanismos de
evasão às respostas celular e humoral pode implicar na transmissão do agente para os
ovos12. Após os estágios iniciais de infecção aguda, a presença de Salmonella sp. no
fígado e baço sofre redução gradativa após 7-14 dias, com eliminação total do agente
em 28 dias12. Em alguns animais, o agente persiste nesses orgãos por até 12 semanas
após exposição90, em ambiente intracelular. Sua sobrevivência envolve, além de
TSS3, modulação da expressão de MHC-1 nas células infectadas, reduzindo a
atividade de LT de ação citolítica/citotóxica (CD8+). Além disso, em animais com
infecção persistente, observou-se aumento na produção de citocinas reguladoras
como IL-1012.
A colonização do trato reprodutor sofre influência de fatores fisiológicos
e hormonais de efeito imunossupressor em aves que atingem maturidade
sexual10,12,95. A maturidade sexual em poedeiras exerce efeito sobre os linfócitos,
com uma redução em seu número, em particular LT CD4+ localizados no trato
reprodutor, elevando a sensibilidade ao agente ou recrudescência da infecção em
animais portadores10. A colonização do trato reprodutivo de aves por Salmonella sp.
envolve mecanismos semelhantes aos da infecção do trato digestório, de invasão e
sobrevivência intracelular determinados pelo T3SS97,98. Destaca-se a participação das
ilhas SPI-1 e SPI-2 (Figura 5).
FIGURA 5 – Mecanismos de invasão e colonização de células
epiteliais do oviduto de galinhas envolvendo a
expressão de genes contidos em SPI-1 e SPI-2 de
Salmonella sp. Fonte: Adaptado de Raspoet61.
16
A SPI-1 é relacionada com a invasão de células não fagocitárias, como as
do epitélio intestinal, nos estágios iniciais da infecção e na colonização do oviduto,
em infecções persistentes. SPI-2 é necessária para sobrevivência do agente no
interior de células, importante para a disseminação e manutenção do agente no
hospedeiro99,100.
Os genes contidos em SPI-2 estão envolvidos no potencial de
disseminação e colonização de orgãos, incluindo o trato reprodutor de aves. Nesse
processo, reconheceu-se a participação do gene ssrA, regulador de SPI-2. Sua
deleção não determina alteração na capacidade do agente em colonizar intestino mas
reduz a colonização de orgãos internos, ovário e oviduto, resultando em lesões no
trato reprodutor menos evidentes101.
Além disso, a proteína efetora pipB, codificada por SPI-2 e liberada por
T3SS, é capaz de inibir a expressão de peptídeos de atividade antimicrobiana
produzidos por células epiteliais do oviduto, aumentando a capacidade do micro-
organismo de sobreviver em ambiente desfavorável102.
A presença de lipopolissacarídeos (LPS) na composição da parede celular
de bactérias do gênero Salmonella atua na colonização do trato reprodutor de
poedeiras62. Um de seus componentes, denominado de Antígeno-O, é composto por
subunidades e sua síntese envolve a presença de polimerase (wzy), que determina as
dimensões de suas cadeias. Bactérias contendo cadeias mais curtas de Antígeno-O
apresentaram-se menos eficientes em colonizar ovário e oviduto103. A presença de
LPS altera a carga elétrica de superfície, tornando a bactéria refratária a peptídeos
catiônicos de ação antimicrobiana, facilitando a multiplicação e persistência do
agente no trato reprodutor62.
As fímbrias, componentes celulares que participam da adesão da bactéria a
superfícies, também foram alvo de diversos estudos. Na superfície das células
epiteliais do oviduto de aves identificou-se a presença de glicoesfingolipídeos que
atuam como sítios de aderência para fímbrias do tipo 1 (SEF21) de Salmonella sp., o
que explicaria o tropismo do agente por essa região104. As fímbrias do tipo 1 também
se associam a secreções do oviduto, facilitando a incorporação do agente aos
componentes do ovo durante a sua formação105. Cepas não produtoras de fímbrias
(ΔfimD) apresentaram redução no potencial de contaminação de ovos106.
17
Além da disseminação sistêmica, a bactéria pode alcançar o oviduto por
meio de infecção ascendente pela cloaca, sendo incorporada ao ovo durante sua
produção84,62,107.
2.3.2 Formação e contaminação de ovos
A formação do ovo em poedeiras dura cerca de 26 horas4 e envolve
sequência de eventos que ocorrem em diferentes segmentos do trato reprodutor da
ave, com produção de diversas substâncias (Figura 6).
FIGURA 6 – Formação do ovo no trato reprodutivo de
poedeiras e contaminação de diferentes
componentes por Salmonella sp. de acordo
com o segmento colonizado Fonte: Adaptado
de Gantois et al.4.
A gema, produzida nos ovários, é captada pelo infundíbulo, porção
inicial do oviduto e segue para magno, onde ocorre a síntese do albúmen. Na região
do istmo ocorre a formação da membrana da casca e no útero ou glândula da casca,
secreção dos componentes pela que darão origem à casca. A vagina da ave é
responsável pelo transporte do ovo para o meio externo (ovoposição)4.
Salmonella sp. é capaz de colonizar todos os segmentos envolvidos na
produção do ovo/postura4. Dependendo do local de instalação, pode ser incorporada
em diferentes componentes, incluindo a membrana vitelínica e gema, caso o agente
colonize o ovário e infundíbulo da poedeira, como consequência de sua
disseminação4,108,109. Entretanto, não se observa penetração do agente através da
membrana da gema à temperatura de 42ºC110, sugerindo que a contaminação ocorra
18
após a postura dos ovos, em temperatura de 25-30ºC111,112, associada a alteração na
viscosidade da gema e redução da integridade da membrana da gema111.
A colonização do magno e istmo pode acontecer após disseminação
sistêmica do agente ou determinada migração de bactérias presentes no ovário4. A
presença de bactérias nessas regiões do oviduto associa-se com a contaminação do
albúmen e da membrana da casca, sendo a colonização da região do magno a mais
comum4, 107.
Não existe consenso relativo à região mais predisposta à infecção por
Salmonella sp. Alguns trabalhos apontam o magno como a região mais comumente
colonizada4,107, outros propõem o istmo92 e junção infundíbulo-magno98. Os
componentes do ovo mais propensos a apresentar contaminação são o albúmen e a
superfície da membrana vitelínica112,113.
O contato ambiental da casca com Salmonella sp. proveniente de excretas
de animais infectados pode determinar contaminação do ovo. Esta forma de
contaminação, denominada de horizontal, pode determinar a penetração do agente
através da casca e membrana de ovos já formados, permitindo a contaminação de seu
interior. O potencial de penetração de Salmonella sp. pela casca já foi avaliado em
diversos estudos114,115,116 e é mais rápida e intensa imediatamente após a postura,
quando a superfície imatura e a perda de calor entre o ovo e o ambiente favorecem a
porosidade da casca114.
A contaminação pode ocorrer durante a postura, com o contato da casca
do ovo com a cloaca contaminada do animal. Já se observou que aves que
eliminavam o agente nas excretas nem sempre produziam ovos contaminados por
Salmonella sp.117,118,119.
Em condições normais o trato reprodutor de aves é ambiente estéril,
apenas com a presença de micro-organismos do gênero Lactobacillus que podem ser
isolados do segmento vaginal120. Entretanto, no curso da infecção, Salmonella sp.
presente na região da cloaca é capaz de colonizar vagina e útero de forma
ascendente, determinando contaminação da casca ou da superfície da casca do
ovo121.
2.3.3 Sobrevivência de Salmonella sp. em ovos
Existem vários agentes antimicrobianos presentes nos ovos, responsáveis
por proteger o embrião em desenvolvimento de perigos biológicos como peroxidase,
19
AvBD, ovodefensinas, imunoglobulinas, lisozima, agentes quelantes e inibidores de
protease. Foi demonstrada a presença de cinco AvBD na casca do ovo: AvBD3,
AvBD9, AvBD10, AvBD11 e AvBD1. Na gema e albúmen detectou-se AvBD9 e
AvBD11, respectivamente76,122. No albúmen, a presença de ovodefensinas também
foi evidenciada123.
A lisozima é capaz de atuar sobre peptideoglicanos da parede celular,
alterando sua integridade62. Na parede celular de bactérias Gram-negativas, sua
atividade é comprometida pela ação do LPS, localizados externamente à camada de
peptideoglicanos124. Entretanto, são formados peptídeos derivados de lisozima
capazes atravessar a parede celular de Gram-negativas, formando poros na
membrana celular125.
No ovo são encontrados agentes quelantes que se ligam a nutrientes,
dificultando sua utilização pelos micro-organismos. O elemento quelante mais
conhecido é a ovotransferrina, capaz de se ligar a íons de ferro (Fe3+), privando as
bactérias deste componente necessário para o crescimento bacteriano. Além disso,
em condições de elevação de pH e alteração do potencial de oxi-redução, a
ovotransferrina é clivada, liberando domínios funcionais de ação bactericida, como o
peptídeo antimicrobiano 92 (OTAP-92)126. Outros quelantes também podem ser
encontrados nos ovos, como a avidina, proteína de ligação à biotina (BBP), proteína
de ligação à riboflavina, proteína plasmática de ligação ao retinol e proteína de
ligação à vitamina D, responsáveis pela manutenção dos níveis de biotina,
riboflavina, retinol e vitamina D para o embrião61.
Três tipos de imunoglobulinas foram identificados na gema e albúmen,
IgA, IgM e IgY, liberadas pelo ovário e oviduto. Dos ovos produzidos por aves
infectadas por Salmonella Enteritidis, foram extraídas e purificadas imunoglobulinas
específicas, capazes de interferir na capacidade de crescimento de Salmonella
Enteritidis e Typhimurium in vitro127.
Isolados de Salmonella sp. encontrados no oviduto e interior de ovos
contaminados expressam de forma intensa genes envolvidos com a estrutura e
integridade da parede celular, tornando o agente mais resistentes à ação de
componentes antimicrobianos (Figura 7)128. A habilidade de modificar a estrutura do
LPS, reduzindo sua carga negativa, é um mecanismo que previne a adesão de
CAMPs62. Salmonella sp. sintetiza um inibidor de lisozima (PliC), mas sua
relevância na sobrevivência do agente durante a formação dos ovos ainda não foi
20
definida129. O dano à parede, membrana celular e DNA bacteriano são minimizados
pela ação de enzimas de reparo yafD e exonuclease III e pela expressão dos genes de
resposta universal ao estresse uspBA62,130.
FIGURA 7 – Contaminação de ovos por Salmonella sp., incluindo adesão fimbrial ao
oviduto e secreções e mecanismos de sobrevivência ao ambiente hostil do
oviduto do hospedeiro e ovo. Fonte: Adaptado de Raspoet61.
Apesar da restrição de nutrientes como Fe3+ provocada pela ação de
agentes quelantes, Salmonella sp. possui elevada afinidade ao elemento, sendo capaz
de desenvolver mecanismos de sequestro de ferro da ovotransferrina62. Por meio da
presença de proteínas de canal na membrana externa (TolC) e bombas na membrana
interna (MDR-pumps), ocorre a secreção de sideróforos bacterianos como
enterobactina e salmoquelina para o meio externo131. TolC também se relaciona com
a ação de bombas de efluxo, conhecidas por sua atuação em mecanismos de
resistência antibióticos132 e acredita-se que também participa da remoção de avidinas
do meio intracelular61.
Diversos dão os mecanismos de defesa presentes no processo de
formação do ovo, reduzindo a contaminação e persistência de agentes infecciosos. A
presença de Salmonella viável após postura, evidencia sua capacidade do agente de
sobreviver ao ambiente hostil do oviduto e ovo em associação com a temperatura
corporal elevada do hospedeiro61. Ao contaminar os ovos e permanecer viável em
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33
CAPÍTULO 2 –DISSEMINAÇÃO EM ORGÃOS, CONTAMINAÇÃO DE
OVOS E EXCREÇÃO FECAL DE Salmonella Heidelberg e Salmonella
Typhimurium EM POEDEIRAS INOCULADAS EXPERIMENTALMENTE
Resumo
Objetivou-se avaliar o potencial de colonização de orgãos, excreção fecal e
contaminação de ovos por Salmonella Heidelberg e Salmonella Typhimurium em
poedeiras inoculadas experimentalmente. Foram selecionadas 45 poedeiras White
Leghorn com 28 semanas de idade, livres de patógenos específicos, foram divididas
em três grupos mantidos em unidades isoladoras. No primeiro grupo, inoculou-se em
cada ave, via oral, 1,2 x 107 UFC de Salmonella Heidelberg, no segundo grupo, 1,0 x
107 UFC de Salmonella Typhimurium. No grupo controle, as aves receberam igual
volume de solução salina esterilizada. Aos sete, 14 e 21 dias pós inoculação, cinco
poedeiras/grupo foram submetidas à eutanásia e necropsia. Baço, fígado, ovários,
magno, istmo, útero, intestino delgado e ceco foram colhidos e destinados aos
ensaios histopatológicos e bacteriológicos. Ovos foram colhidos diariamente e
suabes cloacais a cada três dias, antes e durante o período de realização do
experimento e analisados. As alterações histopatológicas encontradas foram de
escore discreto e circunscritas a pequenas porções teciduais, não caracterizando
reação aguda, sendo observada presença de infiltrado leucocitário e hiperemia
discreta. O sorovar Heidelberg foi identificado em todos os tecidos avaliados sete
DPI, assim como Salmonella Typhimurium, identificada em todos os tecidos
avaliados, exceto ovário, sete DPI. Salmonella Heidelberg persistiu no ceco e baço,
de forma viável, 14 DPI, enquanto que o sorovar Typhimurium não foi identificado
em nenhum tecido, considerando o mesmo período. Os dois sorovares foram capazes
de contaminar os ovos produzidos no período pós inoculação, sendo isolados em
casca a partir de 3 DPI e gema até 12 DPI. A inoculação experimental gerou infecção
com resolução em 14 DPI em poedeiras ST e 21 DPI para poedeiras SH. Salmonella
Heidelberg permaneceu por mais tempo no hospedeiro, com isolamento
microbiológico persistente em ceco e baço associado a pouca indução de resposta
inflamatória nos órgãos avaliados, elementos chave para emergência do sorovar na
cadeia produtiva.
Palavras-chave: poedeiras, produção de ovos, salmonelose
34
ORGANS DISSEMINATION, EGG CONTAMINATION AND FECAL
EXCRETION OF Salmonella Heidelberg and Salmonella Typhimurium IN
EXPERIMENTALLY INFECTED LAYING HENS
Abstract
The aim of this study was to evaluate the potential of organ colonization, fecal
excretion and eggs contamination by Salmonella Heidelberg and Salmonella
Typhimurium in experimentally infected laying hens. We selected 45 White Leghorn
hens at 28 weeks of age, free from specific pathogens, divided into three groups kept
in isolation units. In the first group, 1.2 x 107 CFU of Salmonella Heidelberg was
inoculated into each bird, in the second group, 1.0 x 107 CFU of Salmonella
Typhimurium. The birds of the control group received an equal volume of sterile
saline solution. At seven, 14 and 21 days after inoculation, five laying hens / group
were submitted to euthanasia, necropsy and spleen, liver, ovaries, magno, isthmus,
uterus, small intestine and cecum were submitted to histopathological and
bacteriological assays. Eggs were harvested daily and cloacal swabs every three
days, before and during the period of the experiment and analyzed. The
histopathological changes were discrete score and confined to small tissue portions,
not characterizing an acute reaction, with leukocyte infiltrate and discrete hyperemia.
The Heidelberg serovar was identified in all tissues evaluated seven days after
inoculation, as well as Salmonella Typhimurium, identified in all tissues, except
ovary, seven DPI. Salmonella Heidelberg persisted in the cecum and spleen, viable,
14 days after inoculation, whereas the serovar Typhimurium was not recovered from
any tissue, considering the same period. The two serovars were able to contaminate
the eggs produced in the post inoculation period, being isolated in shell from 3 days
after inoculation and yolk up to 12 days after inoculation. Experimental inoculation
generated infection with 14 days after inoculation resolution for ST animals and 21
days after inoculation for SH animals. Salmonella Heidelberg showed persistent
microbiological isolation in cecum and spleen, associated with low induction of
inflammatory response in the organs evaluated, key elements for emergence of the
serovar in the productive chain.
Key words: egg production, laying hens, reproductive organs, salmonellosis
35
1. Introdução
As aves são reservatórios para Salmonella enterica e a infecção para
seres humanos é comumente associada a produtos avícolas contaminados,
especialmente ovos1,2,3. Apesar dos esforços internacionais em controlar a veiculação
alimentar de patógenos, estudos de vigilância ativa indicam que a incidência de
infecções humanas pelo gênero Salmonella continuam sendo uma preocupação
global de saúde pública4,5.
A observação de um um perfil de multi resistencia a antibióticos em
isolados de origem aviária, envolvendo especialmente os sorovares Heidelberg,
Enteritidis e Typhimurium6, associado a habilidade de alguns sorovares em colonizar
o trato reprodutor das poedeiras, contaminar ovos disseminar-se na cadeia de
produção de alimentos, evidenciam sua importância em saúde pública7,8.
A infecção do trato reprodutor de aves adultas por Salmonella sp.
ocorrerá em animais que sofreram infeção sistêmica, após colonização do trato
gastrointestinal9. Além da disseminação linfática e hematogênica, a bactéria pode
alcançar o oviduto por meio de infecção ascendente pela cloaca, sendo incorporada
ao ovo durante sua produção10,11,12. A maioria das infecções é auto limitante13,14, mas
algumas poedeiras podem apresentar infecção persistente, elevando o potencial de
contaminação horizontal e produção de ovos contaminados8,15,16. A persistência do
agente, determinando estado de portador inaparente, pode ocorrer, com a manutenção
do agente em baixas concentrações ao longo da vida da ave, podendo ocorrer
recrudescência da infecção. A capacidade do agente de sobreviver em ambiente
intracelular, é um dos elementos envolvidos em sua manutenção no hospedeiro8,17.
Salmonella enterica é capaz de colonizar todos os segmentos envolvidos
na produção do ovo e postura10. Embora a doença veiculada por ovos seja
principalmente atribuída a Salmonella Enteritidis, outros sorovares, principalmente
Salmonella Heidelberg e Salmonella Typhimurium, também foram implicados18,19.
A presença do agente viável nos ovos após postura evidencia a
capacidade do agente de sobreviver ao ambiente hostil do oviduto e ovo em
associação com a temperatura corporal elevada da ave20. Ao contaminar ovos e
permanecer viável em seu interior, comprometem a segurança da cadeia de produção
de alimentos.
36
A interação entre poedeiras e o sorovar Enteritidis já foi bem
estabelecida18,21,22. Como resultado, foram desenvolvidas medidas de controle mais
efetivas limitando a circulação do sorovar, colonização de aves e contaminação de
ovos. Entretanto, os sorovares de Salmonella podem diferir quanto a sua capacidade
de invadir e colonizar o hospedeiro, sobreviver em oviduto e ovos23. Sorovares
distintos apresentam diferentes perfis e padrões de expressão de genes que propiciam
a colonização do hospedeiro, estimulando resposta imunológica, o aparecimento de
lesões e a definição do estado de doença. Diante destas considerações, foi proposto
para este estudo avaliar a colonização de orgãos, excreção fecal e contaminação de
ovos pelos sorovares Heidelberg e Typhimurium em poedeiras livres de patógenos
específicos (SPF).
2. Material e Métodos
2.1 Local de realização do experimento e seleção das poedeiras
Os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética da
Embrapa Suínos e Aves nº 008/2014 (Anexo 1).
O experimento foi realizado no setor de isolamento da Unidade
Experimental de Aves (UEA) e no Laboratório de Sanidade e Genética Animal
(LSGA) da Embrapa Suínos e Aves, Concórdia, Santa Catarina. Foram utilizadas 45
poedeiras, White Leghorn, linhagem Embrapa 011, com 28 semanas de idade
provenientes da Unidade de Produção de Aves livres de patógenos específicos (SPF)
da Embrapa Suínos e Aves.
As poedeiras foram divididas em três grupos de 15 aves/cada, mantidos
em duas unidades isoladoras para aves por grupo, com lotação de seis a sete
poedeiras por isolador, com programa de luz de 16 h luz/8 h escuro. Os isoladores
eram dotados de ninhos artificiais, bebedouros do tipo nipple com fornecimento de
água clorada e comedouros abastecidos com ração, ad libitum.
2.2 Preparação do inóculo
Os inóculos foram elaborados com cepas de campo de Salmonella
Typhimurium e Salmonella Heidelberg do Laboratório Nacional Agropecuário,
Campinas, SP (LANAGRO-SP). Os isolados foram previamente sorotipificados pelo
37
Laboratório de Enterobactérias do Departamento de Bacteriologia da Fundação
Instituto Oswaldo Cruz no Estado do Rio de Janeiro (IOC/FIOCRUZ). A partir de
cultura pura plaqueada em ágar triptona de soja (TSA), colônias isoladas foram
individualmente inoculadas em 3 mL de caldo infusão de cérebro e coração (BHI) e
incubadas a 37ºC por 18 - 24 horas. A concentração do inóculo foi ajustada em
solução salina a 0,85% conforme tubo 0,5 da escala de MacFarland e diluída 1:10
para uma concentração final de aproximadamente 1,0 x 107 UFC/mL. As
concentrações foram confirmadas por meio de plaqueamento de diluições decimais
seriadas em ágar TSA, com posterior incubação a 37 ºC por 18 - 24 horas,
apresentando inóculos de 1,2 x 107 UFC/ mL para Salmonella Heidelberg e 107 UFC/
mL para Salmonella Typhimurium.
2.3 Inoculação experimental e obtenção de amostras
Em todas as poedeiras do primeiro grupo, denominado de ST,
inocularam-se, via oral, 1 mL do inóculo contendo Salmonella Typhimurium. As
aves do segundo grupo, denominado SG, receberam 1 mL do inóculo contendo
Salmonella Heidelberg enquanto que os animais do grupo controle (GC) receberam
igual volume de solução salina esterilizada.
Para a avaliação da excreção fecal de Salmonella sp., foram colhidas
individualmente amostras por meio de suabes cloacais, imediatamente antes da
inoculação, três dias pós inoculação (DPI), seis DPI, nove DPI, 12 DPI, 18 DPI e 21
DPI, totalizando sete colheitas. Ovos de cada isolador foram colhidos diariamente,
sendo que a cada três dias, um pool de dez a cinco ovos de cada grupo foi destinado
ao isolamento bacteriológico de Salmonella em casca e gema. Os ovos excedentes
foram autoclavados e descartados.
Aos sete, 14 e 21 DPI, cinco aves/ grupo foram submetidas à eutanásia
por deslocamento cervical. Após necropsia e exame macroscópico, foram colhidos
fígado, magno, istmo, útero, ovário, intestino delgado e ceco. As amostras foram
divididas em alíquotas individualizadas por orgãos e destinadas aos ensaios
histopatológicos e bacteriológicos. Os tecidos para às análises bacteriológicas foram
mantidos em caixas isotérmicas com gelo reciclado, posteriormente refrigerados e
analisados no máximo em quatro horas. Os tecidos para às análises histológicas
foram, logo após a colheita, transferidos para recipientes contendo formalina
tamponada 10%.
38
2.4. Ensaios analíticos
2.4.1. Cultivo Bacteriológico
De cada poedeira, fragmentos do fígado, baço, ovário, magno, istmo,
útero e intestino delgado e ceco foram, individualmente, macerados e cerca de um
grama foi transferido para tubos de ensaio contendo água peptona a 1 % na
proporção 1:10 e incubados a 37 °C por 24 h. A cada três dias, os ovos obtidos de
cada grupo, eram submetidos à desinfecção com álcool 70 %, quebrados e porções da
casca e gemas foram separadas assepticamente e colocados em um recipiente
esterilizado. De cada grupo, foram analisadas amostras compostas por pool de 10
cascas e pool de 10 gemas. As amostras foram homogeneizadas individualmente e 25
g da casca e 25 mL da gema foram colocados em Erlenmayer contendo 225 mL de
solução peptonada a 1%. As amostras em água peptonada a 1 % foram incubadas a
37 oC/ 18 - 20h.
Após o período de incubação das amostras de orgãos e ovos, alíquotas de
1,0 mL da água peptonada a 1 % foram transferidas para 9 mL caldo selenito cistina
(CS) e 0,1 mL para 10 mL de caldo Rappaport e incubados a 37 °C por 18 - 24 h.
Posteriormente, com o auxílio de uma alça níquel-cromo, foram realizados repiques
nos ágares verde brilhante (VB) e Xylose-Lysine-Tergitol4 (XLT4) e incubadas a 37
°C por 18 - 24 h. De cada um dos meios foram selecionadas de três a cinco colônias
com características morfológicas de Salmonella e repicadas em ágar tríplice açúcar-
ferro (TSI), seguindo-se incubação a 37° C por 18 - 24 h. As culturas em TSI com
crescimento sugestivo de Salmonella foram submetidas aos testes de: produção de
indol, motilidade, urease, descarboxilação da lisina, vermelho de metila, utilização
do malonato e citrato de Simmons.
2.4.2. Análise histopatológica
Os tecidos destinados à análise histopatológica foram fixados em
formalina tamponada 10 % por 36 horas, lavados em água corrente por 24 horas e
armazenados em etanol 70 %. A seguir, foram desidratados em soluções com
concentrações crescentes de álcool, seguido pela diafanização em xilol. A inclusão
em parafina foi feita através da passagem dos tecidos em três banhos de parafina a 60
°C por uma hora cada um. O material foi colocado em caixas devidamente
identificadas com parafina líquida e posteriormente foi feita a confecção das lâminas
39
e coloração com hematoxilina-eosina. As lâminas foram examinadas em microscópio
binocular equipado com sistema de fotomicrografia digital.
2.4.3 Análise estatística
Para os estudos de colonização intestinal de Salmonella Heidelberg e
Salmonella Typhimurium foi utilizado teste descritivo considerando a frequência
encontrada nas variáveis.
3. Resultados
3.1 Análises bacteriológicas
3.1.1 Excreção fecal
Não houve mortalidade nas poedeiras infectadas por Salmonella
Heidelberg e Salmonella Typhimurium neste experimento, assim como não foram
observadas manifestações clínicas entre as aves inoculadas. Considerando a excreção
fecal de Salmonella, nenhuma das amostras colhidas antes da inoculação das
poedeiras foi positiva para Salmonella sp., assim como todas as amostras
provenientes do grupo controle GC, durante as sete colheitas realizadas.
Considerando os dois sorovares, a excreção fecal apresentou diferentes percentuais
de recuperação nos períodos avaliados (Tabela 1).
TABELA 1 – Excreção fecal de Salmonella Heidelberg e Salmonella Typhimurium em
poedeiras em diferentes períodos pós inoculação oral.
Grupos experimentais DPI Suabes cloacais + (%)
SH 3 80 (12/15)a
6 20 (3/15)
9 80(8/10)
12 50 (5/10)
18 0 (0/5)
21 0 (0/5)
ST 3 26,7(4/15)
6 0 (0/15)
9 90 (9/10)
12 30 (3/10)
18 0 (0/5)
21 0 (0/5)
SH= S. Heidelberg; ST= S. Typhimurium
DPI= dias pós inoculação a. amostras positivas/amostras colhidas
40
Três dias após a inoculação, 80 % (12/15) das aves SH e 26,7 % (4/15)
das aves ST apresentaram resultados positivos. Após seis dias (6 DPI), 20 % (3/15)
dos animais SH apresentaram excreção fecal do agente, enquanto que entre os
animais ST, os resultados foram negativos.
Nas amostras colhidas 9 DPI, 80% (8/10) e 90% (9/10) foram positivas,
considerando as poedeiras SH e ST, respectivamente. O percentual de excreção
fecal 12 DPI foi de 50% entre as aves inoculadas com Salmonella Heidelberg e
30% entre as aves do grupo ST. Nas amostras colhidas 18 DPI e 21 DPI,
Salmonella Heidelberg e Salmonella Typhimurium não foram isoladas das excretas.
3.1.2 Colonização de orgãos
Os resultados das análises bacteriológicas dos orgãos encontram-se
descritos na Tabela 2. As poedeiras do Grupo Controle (GC), apresentaram resultado
negativo para Salmonella durante todo o período, indicando a eficiência do sistema
de isolamento entre as unidades que separavam os grupos experimentais.
TABELA 2 - Recuperação de Salmonella Heidelberg e Salmonella Typhimurium de órgãos
de poedeiras em diferentes períodos pós inoculação oral.
Grupos DPI Número de positivas/número de aves testadas
Fígado Baço Ovario Magno Istmo Utero ID Ceco
SH 7 80 (4/5) 80 (4/5) 20 (1/5) 20 (1/5) 40 (2/5) 40 (2/5) 60 (3/5) 100 (5/5)
14 0 (0/5) 20 (1/5) 0 (0/5) 0 (0/5) 0 (0/5) 0 (0/5) 20 (1/5) 60 (3/5)
21 0 (0/5) 0 (0/5) 0 (0/5) 0 (0/5) 0 (0/5) 0 (0/5) 0 (0/5) 0 (0/5)
ST 7 80 (4/5) 80 (4/5) 0 (0/5) 40 (2/5) 60 (3/5) 40 (2/5) 20 (1/5) 100 (5/5)
14 0 (0/5) 0 (0/5) 0 (0/5) 0 (0/5) 0 (0/5) 0 (0/5) 0 (0/5) 0 (0/5)
21 0 (0/5) 0 (0/5) 0 (0/5) 0 (0/5) 0 (0/5) 0 (0/5) 0 (0/5) 0 (0/5)
DPI= dias pós inoculação; SH= S. Heidelberg; ST= S. Typhimurium; ID= intestino delgado
Das 40 amostras de orgãos dos animais SH da primeira necropsia (7
DPI), identificou-se Salmonella Heidelberg em todos os tecidos avaliados, 55%
foram positivas (22/40). Na segunda necropsia, das 40 amostras colhidas, Salmonella
Heidelberg foi recuperada em cinco amostras (12,5%), sendo o ceco o segmento com
maior identificação do agente (3/5), seguido por baço e intestino delgado (1/5). Nos
animais ST, o sorovar Typhimurium foi detectado em todos os orgãos colhidos na
primeira necropsia, exceto em ovários, totalizando 21 amostras positivas (52,5 %). O
sorovar Typhimurium não foi recuperado nas amostras de orgãos colhidos a partir de
14 DPI.
41
Avaliando-se o trato reprodutor das poedeiras, observa-se que o sorovar
Heidelberg foi o único capaz de colonizar ovário, em apenas um animal. O sorovar
Heidelberg colonizou útero e istmo de 40% das aves (2/5), sendo encontrado também
em um animal em magno. Nas poedeiras do grupo ST, observou-se que o segmento
mais colonizado foi o istmo (60%), seguido de magno e útero (40%), sete DPI.
Ambos sorovares não foram identificados nos segmentos de oviduto e ovário, 14
DPI, indicando imunocompetência das aves em eliminar os agentes. Os resultados
referentes à de colonização de trato reprodutor, por segmento e por poedeira, sete
DPI encontram-se na Figura 1.
FIGURA 1 – Distribuição de Salmonella Heidelberg (A) e
Salmonella Typhimurium (B) por segmento
de trato reprodutor e por poedeira infectada,
sete DPI.
42
Ainda considerando a colonização de trato reprodutor, observa-se entre
as cinco poedeiras SH, sete DPI, duas não apresentaram colonização de orgãos
reprodutores pelo sorovar Heidelberg. Uma das aves apresentou colonização de
ovário e útero, simultaneamente e apenas um animal evidenciou colonização de
magno, istmo e útero simultaneamente. Em uma das aves inculadas a presença da
bactéria no trato reprodutor se restringiu ao istmo, conforme Figura 1A.
Das cinco poedeiras ST (Figura 1B), sete DPI, Salmonella Typhimurium
foi identificada em quatro. A colonização simultânea de magno, istmo e útero foi
evidenciada em apenas um animal. A colonização simultânea de istmo e útero
cocrreu em uma ave, assim como colonização simultânea de magno e istmo. A ave
que não apresentou colonização de oviduto por Salmonella Typhimurium, apresentou
resultados positivos apenas em fígado e ceco.
3.1.3 Contaminação de ovos
O Tabela 3 apresenta os resultados da identificação de Salmonella em
pool de casca e pool de gema das aves inoculadas, em diferentes períodos pós
inoculação.
Tabela 3 – Detecção de Salmonella Heidelberg e Salmonella Typhimurium em pool de casca e
pool de gemas de ovos obtidos de poedeiras em diferentes períodos pós
inoculação oral.
Grupos experimentais DPI Pool de Cascas Pool de Gemas
SH 3 Negativo Negativo
6 Positivo Negativo
9 Positivo Negativo
12 Negativo Positivo 15 Negativo Positivo 18 Negativo Negativo
21 Negativo Negativo
Total de positivos SH 28,57% (2/7) 28,57% (2/7)
ST 3 Negativo Negativo
6 Positivo Negativo
9 Positivo Negativo
12 Negativo Negativo
15 Positivo Negativo
18 Negativo Negativo
21 Negativo Negativo
Total de positivos ST 42,8% (3/7) 0 (0/7)
SH= ovos de poedeiras inoculadas com S. Heidelberg; ST= ovos de poedeiras inoculadas com
S. Typhimurium; DPI= dias pós inoculação
43
Observou-se que tanto o sorovar Heidelberg quanto Typhimurium foram
identificados em ovos colhidos após a inoculação. Ambos os sorovares foram
identificados nas cascas dos ovos, em ovos do grupo SH colhidos seis DPI e nove
DPI, cascas de ovos do grupo ST, seis DPI, nove DPI e 15 DPI. Considerando as
amostras provenientes das poedeiras inoculadas com o Salmonella Heidelberg, a
partir do 12 DPI, o agente não foi identificado nas cascas dos ovos analisadas, apesar
das análises de intestino delgado e ceco das aves SH, indicarem colonização pelo
agente. Para o sorovar Typhimurium, resultados negativos consecutivos foram
registrados após o 18 DPI.
Apenas o sorovar Heidelberg foi identificado nas amostras de pool de
gemas dos ovos colhidos 12 e 15 DPI.
3.2 Análises histopatológicas
Em geral, as alterações histológicas descritas foram de escore discreto a
moderado, não caracterizando reação aguda. As lesões observadas nos diferentes
tecidos foram presença de infiltrado leucocitário e hiperemia. Não foram observadas
lesões microscópicas em amostras de baço, em nenhum dos grupos experimentais,
em nenhuma das colheitas.
O fígado foi o órgão que apresentou maior número de alterações. No
grupo ST, sete DPI, foram observados escores moderados de hiperemia e infiltrado
leucocitário (IL) em 60% das amostras. No mesmo período, considerando o grupo
SH, observou-se hiperemia e infiltrado leucocitário leve em 20% das amostras e
degeneração leve em 20%. Considerando os grupos inoculados, 14 DPI, em 80 % das
amostras ST observou-se discreta hiperemia e IL. Nas amostras SH, as alterações
inflamatórias foram menos frequentes, identificando-se discreta hiperemia e IL em
40 % das amostras e alterações degenerativas discretas em 20%. Nos grupos SH e
ST, 21 DPI, não foram observadas alterações microscópicas nos tecidos avaliados.
Aos sete DPI, a análise de segmento de intestinos demonstrou infiltrado
leucocitário moderado em 80% das amostras do tratamento SH. Não foram
identificadas alterações microscópicas nos tecidos do GT, no mesmo período.
Infiltrado leucocitário de escore discreto foi observado na segunda colheita (14 DPI)
em 20% das amostras do grupo SH e ST. Na colheita 21 DPI, não foram detectadas
lesões em fragmentos de intestino, em nenhum dos dois tratamentos.
44
Considerando lesões no trato reprodutor, observou-se no útero de uma
ave, 21 DPI, hiperemia discreta. No grupo ST, 21 DPI, observou-se hiperemia
moderada, IL discreta e áreas de hemorragia discreta em 25% das amostras. No
grupo SH, sete DPI e 14 DPI, 20% dos tecidos apresentaram infiltrado heterofílico
discreto. Não foram observadas lesões no grupo SH, 21 DPI.
Quanto às lesões observadas em segmentos de magno e istmo, verificou-
se equivalência entre a presença, distribuição e severidade das lesões encontradas
nos grupos ST e SH, com discreta hiperemia e infiltrado leucocitário nas amostras
colhidas sete DPI e infiltrado leucocitário discreto nas amostras obtidas 14 DPI.
4. Discussão
No presente estudo, não ocorreu mortalidade, sinais clínicos ou redução
na produção de ovos entre as poedeiras infectadas. Entretanto, McWhorter &
Chousalkar19, em trabalho desenvolvido com poedeiras SPF de 18 semanas de idade
que receberam por via oral inóculo contendo 1,0 × 109 UFC de Salmonella
Typhimurium, relataram que 24 horas após a inoculação, observou-se excreção de
fezes mucóides e com sangue entre os animais do grupo desafiado, retornando à
normalidade quatro DPI, observando-se alimentação, consumo de água e produção
de ovos normais pelas aves. Tal diferença pode ser associada à linhagem utilizada,
idade das aves, características da cepa utilizada, assim como concentração do
inóculo.
Considerando a cepa inoculada, quando avaliada a dinâmica da
multiplicação de diferentes sorovares de Salmonella enterica em diferentes espécies
animais, pode-se supor que o ambiente em que os animais estão expostos, nutrição,
bem como perfil imunitário são fatores que se associam e determinam a dinâmica da
replicação do patógenos em indivíduos contaminados por via oral e menor
permanência da Salmonella no trato intestinal, pelas limitações de multiplicação o
que pode ter ocorrido na presente pesquisa em similaridade ao identificado por
Kuźmińska-Bajor et al.24. Definem também sua manutenção e multiplicação nos
nichos iniciais de invasão, que por consequência culminam nas manifestações
clínicas esperadas. Por outro lado, o comportamento do sorovar no animal definirá o
45
tempo em que haverá excreção e disseminação no ambiente, sem que
necessariamente observe-se doença instalada.
Sabe-se que aves adultas infectadas pelos sorovares paratíficos
apresentam-se normalmente assintomáticas13,14. Entretanto, a ausência de sinais
clínicos em animais infectados por salmonelas paratíficas, permite a circulação dos
agentes entre os animais e amplifica sua disseminação ambiental, aumentando o risco
de infecção humana5.
A redução na excreção fecal de Salmonella entre os dias três e seis DPI
pode ser determinada pela eliminação mecânica de bactérias do trato intestinal, assim
como envolvimento de mecanismos de competição da microbiota normalmente
encontrada no intestino delgado e ceco dos animais. Observa-se também, que a
eliminação fecal de Salmonella sp. apresenta perfil intermitente em aves infectadas e
mesmo animais que apresentam colonização intestinal podem não eliminar o agente
nas excretas.
McWhorter & Chousalkar19 registraram redução de excreção do agente,
em poedeiras adultas inoculadas com o sorovar Typhimurium, registrando
percentual de recuperação do agente inferior a 40 %, 12 DPI.
Não se identificou Salmonella Heidelberg e Salmonella Typhimurium
nas excretas a partir de 18 DPI. Em decorrência do período de tempo de 21 dias de
realização de análises, não se pode utilizar resultados negativos de análises
bacteriológicas como indicativo de eliminação total do agente pelas aves.
McWhorter & Chousalkar19 monitoraram a excreção intermitente de ST por
poedeiras durante 60 semanas pós inoculação, onde resultados semanais negativos
consecutivos de análises bacteriológicas e por PCR precederam resultados
positivos.
É importante ressaltar que o presente estudo foi conduzido utilizando
poedeiras adultas de linhagem da Embrapa. Trabalhos anteriores demonstraram
diferenças entre a a excreção fecal do sorovar Enteritidis entre diferentes linhagens
de aves adultas, atribuídas à seleção genética de características de resistência à
Salmonella sp 25,26.
Devido ao comportamento identificado para ambos sorovares, pode-se
considerar que a eliminação fecal das bactérias sugere que há escape de seu nicho
intracelular de volta ao lúmen intestinal como parte de seu ciclo infeccioso.
Knodler et al.27 discorreram sobre este fenômeno, em que Salmonella sai do epitélio
46
polarizado cooptando um mecanismo normalmente usado pelo hospedeiro para
remover células senescentes do epitélio da mucosa.
Outro elemento de interesse que corrobora para a suposição de
resistência do hospedeiro ao patógeno é reforçado pelo fato de que o aparato
genômico para virulência de Salmonella Typhimurium tem ação de excelência com
ativação de ilhas de patogenicidade específicas, plasmídeos de patogenicidade,
adesinas, flagelos e proteínas codificadoras de formação de biofilme28. No entanto,
alguns mecanismos regulatórios do hospedeiro são acionados e estranhamente
observa-se limitação do patógeno que parece tornar-se menos efetivo, buscando
outras rotas de disseminação para sua perpetuação em outros órgãos.
Gast et al.16 apontaram que a seleção de resistência entre diferentes
linhagens de poedeiras se manifesta proeminentemente na colonização do trato
intestinal, sem impacto relevante sobre a disseminação do agente em outros orgãos.
Estudos de inoculação feitos em camundongos24 com diferentes
sorovares Salmonella enterica demonstraram que a divergência entre a disseminação
intestinal, diminuída e a disseminação sistêmica, amplamente acentuada. Isto, pela
rápida resposta inflamatória intestinal, dependente do sorovar. Ou seja, a infecção
intestinal foi debelada. Ainda, identificaram que a resposta foi ampliada em virtude
da indução de ativação imunológica para produção de interleucinas, desencadeada
pelo estímulo de fímbrias que desempenham relevante função na patogenicidade de
Salmonella24.
No presente estudo, Salmonella Heidelberg colonizou todos os tecidos
avaliados e o sorovar Typhimurium foi detectado em todos os orgãos, exceto em
ovários. Nair et al.29 discorreram sobre a habilidade de colonização e disseminação
de S. Heidelberg em perus adultos, fato similar os achados deste estudo. Os autores
demonstraram que a taxa de recuperação foi mais alta no ceco, seguida de baço e
fígado. As aves, embora positivas para o patógeno no ceco, responderam bem contra
a disseminação de S. Heidelberg no fígado e no baço29.
Os resultados indicam a capacidade dos dois sorovares de invadir e
colonizar enterócitos, ultrapassando as barreiras intestinais em poedeiras adultas.
Porém, observa-se diferenças entre a capacidade dos dois sorovares de colonizar
determinados orgãos, fato evidenciado ao se comparar os resultados obtidos em
amostras de ovário.
47
O sorovar Heidelberg foi o único capaz de colonizar ovário, em apenas
um animal infectado. Sabe-se que resultados de estudos que avaliaram a capacidade
de colonização em ovário são controversos. Alguns apontam o sorovar Enteritidis
com maior potencial de colonização do ovário enquanto que outros demonstram
colonização equivalente pelos sorovares Enteritidis e Typhimurium30. Essas
diferenças podem ser atribuídas por variações metodológicas, tais como cepa e
concentração do inoculo utilizado, método de inoculação e linhagens de poedeiras
utilizadas16.
A presença de Salmonella no oviduto das aves, pode ser consequência da
infecção sistêmica, ou determinada por contaminação ascendente pela cloaca, visto
que a presença dos agentes foi evidenciada no intestino10,11,12.
Não há consenso relativo segmento do trato reprodutor mais predisposto
à infecção por Salmonella enterica. Alguns trabalhos apontam o magno como a
região mais comumente colonizada10,12, outros propõem o istmo31 e junção
infundíbulo-magno13. Os componentes do ovo mais propensos a apresentar
contaminação são o albúmen e a superfície da membrana vitelínica que recobre a
gema13,32. Além disso, sabe-se que os ciclos de postura são associados à flutuação
hormonal, capaz de gerar efeito imunossupressor8,33,34, sendo potencial gerador de
variabilidade na colonização do trato reprodutor das poedeiras avaliadas no presente
estudo, mesmo considerando idade e genótipo semelhantes.
Os resultados obtidos sugerem maior capacidade do sorovar Heidelberg
em persistir nos animais infectados, em comparação com Salmonella Typhimurium.
Tal informação pode ser relacionada com os resultados obtidos por Moraes et al35,
avaliando poedeiras de descarte, em final de ciclo produtivo, com mais de 76
semanas de idade. Salmonella Heidelberg foi um dos sorovares mais identificado nas
poedeiras assintomáticas.
Os resultados obtidos indicam a ocorrência de contaminação de
superfície da casca dos ovos pelos dois sorovares. Tal fato indica que, mesmo em
animais adultos, a exposição aos sorovares permite a produção de ovos
contaminados, evidenciando a importância da adoção de práticas adequadas de
manipulação de ovos dentro ou fora das granjas para reduzir o risco de contaminação
cruzada.
A ausência de Salmonella Heidelberg e Salmonella Typhimurium nas
cascas de alguns ovos avaliados, apesar da sua presença em intestino e oviduto pode
48
ser explicada pela variação na carga microbiana presente nos dias subsequentes a
inoculação experimental, excreção bacteriana intermitente, assim como pela
interação das bactérias com substâncias de atividade antimicrobiana presentes na
casca. Além disso, em trabalhos anteriores, já se observou ausência de contaminação
em ovos produzidos por animais que eliminavam o agente nas excretas22,29,30.
Chousalkar et al.36, afirmaram em alguns países, apesar da prevalência de Salmonella
sp. em poedeiras ser alta, registram-se frequências baixas de ovos positivos para o
agente.
O sorovar Heidelberg foi o único identificado nas amostras de pool de
gemas dos ovos colhidos. Considerando que a contaminação da gema pode ser
relacionada à colonização de ovários e infundíbulo, observa-se no presente
experimento que, considerando a colonização de orgãos, o sorovar Heidelberg foi o
único sorovar capaz de colonizar ovário. A presença do agente incorporado à
membrana vitelínica e gema é indicativa de colonização de ovário e
infundíbulo10,37,38, caracterizando contaminação vertical, apesar da penetração após a
postura dos ovos ser possível13,39, influenciada pela alteração na temperatura,
viscosidade da gema e redução da integridade da membrana da gema39. A presença
de excretas no ambiente dos isoladores também pode ser associada à contaminação
horizontal dos ovos.
Deve-se notar que, no presente estudo, nenhum conteúdo interno do ovo
foi positivo para Salmonella Typhimurium, apesar da presença do sorovar
Typhimurium em magno, istmo e útero ter sido evidenciada entre as poedeiras
inoculadas. Este resultado é consistente com os resultados descritos por Pande et al.40
e McWhorter & Chousalkar19, em ovos de poedeiras inoculadas com sorovar
Typhimurium, onde não se recuperou o agente da gema.
Alguns trabalhos relatam a incapacidade de alguns sorovares em
sobreviver no interior do ovo. Em infecções experimentais feitas em poedeiras com
Salmonella enterica serovar Oranienburg, o agente foi isolado de baço (86.9 %),
ovários (31.6 %) e oviduto (15.8 %) de poedeiras, entretanto não foi verificada sua
presença no interior de ovos, apenas na superfície de ovos com indícios de
contaminação fecal41.
Em estudo comparativo conduzido por Gast et al.42, empregando
Salmonella Enteritidis, Salmonella Heidelberg e Salmonella Hadar em infecções
experimentais, não existiu diferença significativa dos sorovares na colonização de
49
ovário e oviduto de poedeiras. Entretanto, foi verificada contaminação interna apenas
nos ovos produzidos pelas aves infectadas com os sorovares Enteritidis e
Heidelberg42.
A abordagem de disseminação e multiplicação de Salmonella enterica
tem grande amplitude de ação. Dentro do que foi descrito anteriormente,
acrescentam-se elementos que cabem destaque. Estas abordagens forneceram
informações mais detalhadas sobre os eventos subjacentes à dinâmica de replicação,
disseminação e eliminação de Salmonella nos órgãos e tecidos do hospedeiro.
Watson & Holden43 contrastando seus resultados com de outros pesquisadores
abordaram um fator de grande importância para os estágios de multiplicação de
Salmonella. Eles descreveram que altas taxas de replicação ocorrem ao atingir órgãos
sistêmicos, apesar do início da morte bacteriana. Em seguida, ocorre uma segunda
fase, caracterizada por declínio populacional atribuído a uma mudança no papel do
estresse oxidativo de ação bactericida para ação bacteriostática43.
Nas análises de histopatológico, observou-se presença de infiltrado
leucocitário, com predominância de heterófilos, relaciona-se ao início da resposta
imunológica, seguido do aumento de linfócitos e demais células plasmáticas44. Ao
relacionar os resultados das análises bacteriológicas com as histopatológicas,
verifica-se que nem sempre a presença e persistência da bactéria nos orgãos foi
acompanhada de reação inflamatória ou lesão. Tal condição foi evidenciada nas
amostras baço sete DPI dos animais ST e SH, sem alterações microscópicas
observadas, mas com isolamento bacteriológico em 80% nos animais.
A inoculação dos dois sorovares de Salmonella permitiu a colonização de
orgãos das poedeiras, mas não foram observados sinais de lesão macroscópica ou
microscópica sugestiva de inflamação, o que indica que a presença dos agentes nos
órgãos internos não resulta, necessariamente, no aparecimento de sinais clínicos. O
intestino seria principal região de ativação da imunidade inata e influxo de células
de defesa. Considerando infecções de rota fecal-oral, danos associados à inflamação
são responsáveis por limitar a disseminação do agente8. Agentes de atividade
imunogênica mais discreta, tais como as salmonelas paratíficas, apresentam maior
potencial de sobrevivência intracelular e persistência no organismo45.
Poedeiras submetidas à inoculação apresentam infecção sistêmica
transitória, com eliminação dos dois sorovares8. Entretanto, os dois sorovares
apresentaram diferente perfil de colonização e excreção fecal, o que determina
50
impacto sobre o potencial de contaminação ambiental e contaminação de ovos.
Salmonelas paratíficas tendem a causar pouca ou nenhuma alteração no
desempenho das poedeiras infectadas46, o que pode justificar as alterações discretas
observadas nas análises histológicas. A ausência de reação inflamatória aguda
também pode ser associada ao fato de bactérias do gênero Salmonella serem
consideradas patógenos intracelulares facultativos. Sua interação com as células do
hospedeiro pode resultar em redução de estímulos antigênicos capazes de
desencadear resposta inflamatória e recrutamento leucocitário33.
5. Conclusões
Observa-se diferença entre os sorovares Heidelberg e Typhimurium na
colonização de orgãos e excreção fecal de poedeiras, apesar de Salmonella
Typhimurium não mostrar tropismo pelo ovário. Aves infectadas pelos sorovares
Heidelberg e Typhimurium produzem ovos com bactérias viáveis na casca e o
sorovar Heidelberg contamina e sobrevive no interior dos ovos. A infecção
experimental por via oral gerou infecção auto limitante, provocando inflamação
discreta e moderada, circunscrita a algumas regiões dos orgãos avaliados.
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55
CAPÍTULO 3 – EXPRESSÃO DE TLR-4, IL1β, IL6 E IL10 EM BAÇO,
MAGNO E ÚTERO DE POEDEIRAS INFECTADAS COM Salmonella
Heidelberg E Salmonella Typhimurium
Resumo
Objetivou-se com este estudo, avaliar a influência da infecção por Salmonella
Heidelberg e Salmonella Typhimurium na expressão de TLR-4, IL1β, IL6 e IL10 em
baço, magno e útero de poedeiras. Foram utilizadas 45 poedeiras com 28 semanas de
idade provenientes da Unidade de Produção de Aves SPF, divididas em três grupos e
mantidas em isoladores. No primeiro grupo, inoculou-se, via oral, 1 x 107 UFC de
Salmonella Typhimurium e no segundo, 1,2 x 107 UFC de Salmonella Heidelberg.
Poedeiras do grupo controle receberam igual volume de solução salina esterilizada.
Aos sete, 14 e 21 dias pós infecção, cinco poedeiras/grupo foram submetidas à
eutanásia e necropsia. Baço, magno e útero foram colhidos, congelados em
nitrogênio líquido e destinados à ensaios de biologia molecular. Após extração de
RNA e síntese de cDNA, foi realizado qPCR para análise de expressão dos genes
TLR-4, IL1β, IL6 e IL10. Os resultados de Ct obtidos foram normalizados,
utilizando os genes constitutivos RPLP-1 e β-actina e a expressão foi calculada pela
razão entre as diferenças de média do grupo controle e grupos desafio dos genes
alvo. Existem interações fortes entre os genes TLR4, IL1B, IL6 e IL10, sendo
evidenciada a presença de cinco genes parceiros funcionais STAT3, IL10RA,
TRAF6, TICAM1 e LY96. Os resultados evidenciam diferença do reconhecimento
antigênico e resposta imune determinada pela expressão de mRNA dos genes TLR-4,
IL1B, Il6 e IL10 nas poedeiras infectadas por Salmonella Heidelberg e Salmonella
Typhimurium.
Palavras-chave: expressão gênica, infeccção inaparente, resposta imune
56
Abstract
TLR-4, IL1β, IL6 AND IL10 EXPRESSION IN SPLEEN, MAGNUS AND
UTERUS OF EXPERIMENTALLY INFECTED LAYING HENS BY
Salmonella Heidelberg AND Salmonella Typhimurium
The aims of this study were to evaluate the characterize the expression profile of
immune system genes in laying hens infected with Salmonella Heildelberg and
Salmonella Typhimurium. Thirty 28 weeks old White Leghorn SPF (Free of Specific
Pathogen Free) laying hens were selected and distributed evenly between three
groups (ST, SH and GC) and kept in a disease-containment facility. In the ST group,
1 x 107 CFU of Salmonella Typhimurium was inoculated oral, in SH group, 1,2 x 107
UFC of Salmonella Heidelberg were inoculated. GC birds received an equal volume
of sterile saline solution. On seven, 14 and 21 days post infection, five birds per
group were submitted to euthanasia, necropsy and samples of the cecum, spleen,
liver, magno and uterus were collected, frozen in liquid nitrogen and assigned to
molecular biology assays. qPCR was performed for expression analysis of the TLR-
4, IL6, IL10 and IL1B genes. The obtained Ct results were normalized using the
constitutive genes RPLP-1 and B-actin and the expression was calculated by the ratio
between the mean differences of the control group and challenge groups of the target
genes and the constitutive genes. There are strong interactions between the TLR4,
IL1B, IL6 and IL10 genes, with the presence of five functional partners genes
STAT3, IL10RA, TRAF6, TICAM1 and LY96. Quantitative real-time PCR analysis
revealed a difference in the antigenic recognition and immune response determined
by mRNA expression of the TLR-4, IL1B, IL6 and IL10 genes in laying hens
infected with Salmonella Heidelberg and Salmonella Typhimurium.
Key-words: gene expression, immune response, inapparent infection
57
1 – Introdução
A resposta imune inata (RII), constitui a primeira linha de defesa contra
Salmonella sp., apresentando combinação de barreiras físicas, químicas e
componentes celulares capazes de detectar a presença do agente1. A presença de
Salmonella determina interação entre padrões moleculares associados aos patógenos
(PAMPs) com os receptores de reconhecimento (PRRs) localizados na membrana de
células epiteliais e de resposta imune inata2,3. Considerando Salmonella enterica, os
principais PAMPs reconhecidos são componentes estruturais do agente, como
lipopolissacarídeos (LPS), peptideoglicanos, DNA sem metilação e flagelina3,4,5,
Os receptores PRRs do tipo Toll (TLR), presentes na superfície de
células epiteliais de diferentes orgãos e células de resposta imune inata, são os
principais PRR determinantes de ativação e indução de cascata de sinalização
associada à RII e resposta imune adaptativa (RIA)6,7. Em poedeiras, destaca-se TLR-
4 como o principal receptor envolvido no reconhecimento antigênico de LPS,
presente na parede celular de Salmonella sp.3,8.
A distribuição de TLR-4 nos tecidos sofre influência da exposição
antigênica, sexo e idade do animal9,10. O reconhecimento de Salmonella sp. estimula
a liberação de diversas citocinas, quimiocinas, peptídeos catiônicos antimicrobianos,
além do influxo de células de defesa para o local de reconhecimento11. LPS
bacterianos, presentes nos envelopes celulares de Salmonella são potentes
estimulantes do sistema imune inato e indutores de inflamação12. O contato com LPS
normalmente é capaz de aumentar a expressão de TLR-413, induzindo a produção de
IL1, IL6 e IL8, atividade oxidativa e degranulação de heterófilos14,15.
Apesar de existir uma uma visão dominante de que, em comparação com
os mamíferos, as aves são mais resistentes a LPS, sabe-se que existem algumas
semelhanças na resposta, sendo usado em estudos e modelos de infecção bacteriana
com Gallus gallus como estimulador imunológico e indutor da resposta de fase
aguda16,17. Estudos prévios revelaram algumas diferenças na resposta induzida pelo
LPS, especialmente entre as citocinas imunomoduladoras como IL1018.
A infecção oral por Salmonella sp. induz na ave resposta celular e
humoral4. A produção de citocinas como IL1β, IL6 e IL10 por fagócitos teciduais e
células epiteliais pode ser observada nos primeiros dias pós-infecção, relacionando-
se com a atividade de células da RII19. A consequência da ativação da imunidade
58
inata é o influxo de células PMN para o intestino. Apesar de desencadear danos
associados à inflamação, também são responsáveis por limitar a disseminação
sistêmica do agente9.
A contribuição a longo prazo de células da RII na resistência às infecções
por Salmonella tem sido demonstrada, visto que heterófilos de linhagens de
poedeiras mais resistentes expressam níveis mais elevados e rápidos de citocinas pró-
inflamatórias, incluindo IL-6, IL-8 e IL-1β20,21. Descreve-se macrófagos de linhagens
de poedeiras resistentes com maior atividade oxidativa que aves sensíveis22,23. Outras
células da RII podem atuar como APCs, envolvidas na ativação de LT e LB em
orgãos linfoides secundários, tais como células dendríticas, sendo essa atividade
intensa nas tonsilas cecais24.
Em poedeiras infectadas, observa-se a participação de LT de ação
reguladora, assim como a produção de IL-10, responsáveis por modular a resposta
imune, principalmente na região do baço. Acredita-se que esse efeito
imunomodulador observado em poedeiras contribui para a persistência do agente
nesses animais, diferente da resposta imune observada em mamíferos9,25.
Entender as mudanças determinadas pela infecção bacteriana na
expressão dos genes hospedeiro ajudará a elucidar a base do controle genético
molecular da resistência a doenças. Objetivou-se com o presente estudo, no aspecto
geral, avaliar a influência da infecção por Salmonella Heidelberg e Salmonella
Typhimurium na expressão de TLR-4, IL1β, IL6 e IL10 em baço, magno e útero de
poedeiras. Nos aspectos específicos, verificar se os genes constitutivos β-actina e
RPLP1 são estáveis em animais infectados por Salmonella sp., quais são as
interações entre os genes TLR-4, IL1β, IL6 e IL10, se a exposição ao agente é capaz
determinar respostas diferentes, em baço, magno e útero, além de identificar se
variações na expressão de genes de resposta imune em orgãos pode se relacionar com
maior colonização pelos agentes.
2. Material e Métodos
2.1 Seleção de animais, infecção experimental e obtenção de baço, magno e útero
Os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética da
Embrapa Suínos e Aves (nº 008/2014). O experimento foi realizado no setor de
isolamento da Unidade Experimental de Aves (UEA) e no Laboratório de Sanidade e
59
Genética Animal (LSGA) da Embrapa Suínos e Aves, Concórdia, Santa Catarina.
Foram utilizadas 30 poedeiras, White Leghorn linhagem Embrapa 011, com 28
semanas de idade provenientes da Unidade de Produção de Aves livres de patógenos
específicos (SPF) da Embrapa Suínos e Aves.
As poedeiras foram divididas em três grupos de 10 aves/cada, mantidos
em duas unidades isoladoras para aves por grupo, com lotação de seis a sete
poedeiras por isolador, com programa de luz de 16 h luz/8 h escuro. Os isoladores
eram dotados de ninhos artificiais, bebedouros do tipo nipple com fornecimento de
água clorada e comedouros abastecidos com ração, ad libitum.
Em todas as poedeiras do primeiro grupo, denominado de ST,
inocularam-se, via oral, 1,0 x 107 UFC de Salmonella Typhimurium. As aves do
segundo grupo, denominado SG, receberam 1,2 x 107 UFC de Salmonella Heidelberg
enquanto que os animais do grupo controle (GC) receberam igual volume de solução
salina esterilizada. Nos dias 7 e 14 pós infecção, cinco poedeiras/grupo foram
submetidas à eutanásia. Após necropsia, baço, magno e útero foram colhidos,
acondicionados em tubos criogênicos identificados, imediatamente congelados em
nitrogênio líquido e armazenados em ultrafreezer (-80 ºC) até o momento da
extração de RNA.
2.2 Seleção dos genes constitutivos e de resposta imune
Uma vez que são escassos os trabalhos que envolvem a identificação de
genes constitutivos estáveis à infecção por Salmonella sp. em baço, magno e istmo
de poedeiras, foi necessário verificar se os genes selecionados possuíam variação na
expressão, independente do estado fisiológico do animal. Para selecionar genes
constitutivos com menor variação de expressão, considerando os diferentes tecidos
avaliados, foram testados dois genes referência, sendo eles: β-actina (Beta actin),
com iniciadores B-Actin F 5' -CAACACAGTGCTGTCTGGTGGTA-3 e B-Actin R
5' -ATCGTACTCCTGCTTGCTGATCC-3', já descritos na literatura26 e RPLP1
(Ribosomal Protein Lateral Stalk Subunit P1), avaliado neste estudo.
Após a obtenção dos valores de Ct (crossing threshold) de cada gene
para cada grupo experimental e tecido, foi feita a análise estatística descritiva, para
obtenção de médias, desvio padrão e erro padrão. O programa normFinder de
normalização foi utilizado para verificar qual o gene constitutivo com menor
variação na quantificação relativa.
60
Para avaliação da resposta imune das poedeiras, foram selecionadas proteínas
que possuem participação no reconhecimento antigênico de bactérias Gram-
negativas, atividades pró-inflamatória e moduladora da resposta imune. A análise de
interação entre os genes que codificam as proteínas selecionados, TLR4, IL1B, IL6 e
IL10 foi conduzida in silico, utilizando o banco de dados STRING (http://string-
db.org/). Esse banco de dados possui ferramentas de bioinformática que permitem a
identificação das interações proteína-proteína, considerando associações físicas e
funcionais.
2.3 Ensaios analíticos
2.3.1 Extração de RNA
A extração de RNA total dos tecidos foi feita utilizando-se combinação
entre reagente TRIzol® (Invitrogen) na etapa de lise e o Kit RNAeasy® (Qiagen®),
nas etapas de purificação e eluição. Os tecidos mantidos em ultrafreezer a -80 ºC
foram triturados, sem descongelamento, em nitrogênio líquido com o auxílio de
almofariz e pistilo, devidamente tratados para uso com RNA. Para cada 50 a 100 mg
de tecido adicionou-se 1 mL do reagente TRIzol®, seguido por homogeneização e
incubação por 5 minutos a temperatura ambiente (25 ºC). A seguir, acrescentou- se
200 μL de clorofórmio, agitando-se por inversão por 15 segundos. Centrifugou-se a
12.000 rpm (rotações por minuto) a 4 ºC/15 minutos.
Após a centrifugação, aproximadamente 500 μL da fase superior aquosa
foi removida para um tubo de polipropileno esterilizado, adicionando-se igual
volume de etanol 70%. O tubo foi homogeneizado por inversão e o conteúdo
transferido para microtubos contendo coluna de purificação proveniente do Kit
RNAeasy®. As etapas posteriores seguiram as recomendações do fabricante. O RNA
extraído e purificado foi submetido à eluição em água ultrapura e os tubos mantidos
em gelo triturado, até a realização da avaliação de integridade e quantificação.
2.3.2 Quantificação e avaliação da qualidade do RNA
A integridade do RNA extraído foi avaliada por comparação de
intensidade luminosa das bandas em gel de agarose 1,5% corado com brometo de
etídio (20 µg/mL). A corrida eletroforética foi de 90 minutos a 60 V com tampão
TBE 1X (Tris-HCl, ácido bórico, EDTA) e a visualização das bandas feita em
transluminador UV.
61
A concentração de RNA nas amostras foi determinada por
espectrofotometria utilizando-se alíquotas de amostra da solução de RNA e o
equipamento Biodrop (Isogen Life Science™). O grau de pureza do RNA foi
estimado pela razão entre as absorbâncias medidas a 260 e 280 nm, que deve ser
igual ou superior a 1,9 e inferior a 2,1 para uma amostra de RNA pura, sem
contaminação por proteínas ou fenol27.
O RNA obtido de todas as amostras, após quantificação, foi diluído em
água ultrapura, obtendo-se uma concentração final de 200 ng/μL. Após a diluição, o
material foi armazenado em ultrafreezer a -80º C.
2.3.3 Síntese de DNA complementar
A síntese de DNA complementar (cDNA) foi feita a partir de RNA total
utilizando o Kit High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied
Biosystems™) e iniciador Oligo (dT)12-18 (Invitrogen™), de acordo com as
instruções do fabricante, em um volume final de 10µL. A síntese foi feita em placas
MicroAmp™ Fast 96-Well Reaction Plate (Applied Biosystems), em termociclador
GeneAmp® PCR System 9700 (Applied Biosystems), nas seguintes condições:
25°C, por 10 min, 37°C por 120 min e 4°C (conservação do cDNA).
2.3.4 Expressão gênica e RT-PCR
Na reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real foram
utilizados os iniciadores apresentados no Quadro 1. Todas as análises moleculares
foram realizadas em duplicata. Para a amplificação do fragmento alvo, foram
utilizados os componentes contidos no QuantiFast® SYBR® Green PCR Kit
(Qiagen®), nas concentrações recomendadas pelo fabricante e volume final de 25 µL.
QUADRO 1 – Iniciadores, tamanho do amplicons e número de acesso no Genbank, utilizados para
análise de expressão gênica em Gallus gallus infectados experimentalmente por
Salmonella Heidelberg e Salmonella Typhimurium.
Gene Primers 5’-3’ Amplicon
(pb)
Número
de acesso
Anelamento
(T ºC)
TLR-4 F: 5' -TGCCATCCCAACCCAACCACAG-3'
R: 5' -ACACCCACTGAGCAGCACCAA-3' 126
AY064697 59
IL1β F: 5' -GTGAGGCTCAACATTGCGCTGTA-3'
R:5' -TGTCCAGGCGGTAGAAGATGAAG-3' 214
HQ008778 56
IL6 F: 5' -CGTGTGCGAGAACAGCATGGAGA-3'
R: 5' -TCAGGCATTTCTCCTCGTCGAAGC-3' 110
HM17964
0
59
IL10 F: 5' -AGCAGATCAAGGAGACGTTC-3'
R: 5' -ATCAGCAGGTACTCCTCGAT-3' 330
AJ621614 52
62
Foram utilizadas placas MicroAmp® Optical 386-Well Reaction Plate
(Applied Biosystems®) na cor branca e vedação com adesivo MicroAmp® Optical
Adhesive Film (Applied Biosystems®), em todos os ensaios de qPCR. A
amplificação e análise dos dados foram realizadas no equipamento de qPCR em
tempo real QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System (Applied Biosystems®).
As condições de amplificação compreenderam a etapa de ativação
enzimática (HotStarTaq Plus DNA Polymerase) a 95 °C/5 min, seguida de 40 ciclos
de desnaturação a 95 °C/ 10 seg., anelamento a 52 - 60 °C (de acordo com os pares
de iniciadores) por 5 seg.e extensão 72 °C/10 seg. As análises das curvas de melting
foram obtidas por meio do aquecimento a 95 °C/15’, 60 ºC for 1 min, seguida de
aquecimento a 95 ◦C/15’.
2.4.5 Análise estatística para PCR tempo real
Para análise dos resultados obtidos pela técnica de qPCR em tempo real e
quantificação relativa foi escolhido o método do Ct comparativo (ΔΔCt). Para isto,
foi utilizado o software REST 2005 BETA v.1.9.12 (Relative Expression Software
Tool). O modelo matemático utilizado para obtenção das expressões relativas baseia-
se nas eficiências obtidas nas PCRs e nas variações obtidas entre as amostras do
grupo controle e grupos SH e ST, após normalização de dados empregando os dois
genes constitutivos. A expressão foi calculada pela razão entre as diferenças de
média do grupo controle e grupos desafio dos genes alvo e dos genes constitutivos
utilizados, ou R=2-(Ct amostra- Ctcontrole) ou R= 2-ΔΔCt. Os dados de razão de expressão
foram submetidos a ANOVA para obtenção dos níveis de significância.
3. Resultados
3.1 Associação entre genes
Interações fortes foram observadas entre todos os genes selecionados no
presente estudo: TLR-4, IL1β, IL6 e IL10 (Figura 1A). As funções biológicas
registradas entre eles foram de ativação (TLR4 sobre IL10, IL1β sobre IL6), inibição
(IL10 sobre TLR4, IL1β e IL6), regulação transcricional (TLR4 sobre IL6). Apesar
da interação entre TLR4 e IL1β não ter sido ainda especificada em aves, existem
registros de coexpressão de genes homólogos em outras espécies (Figura 1B). As
associações identificadas foram classificadas de acordo com diferentes tipos de
63
evidências (Figura 1C). A associação entre os genes IL10 e TLR4 foi determinada
experimentalmente e por meio de textmining. As associações entre os demais genes
foram baseadas em registros de co-expressão existentes no banco de dados.
A associação preditiva entre os genes avaliados foi realizada, sendo
identificados cinco genes parceiros funcionais de resposta imune: STAT3, IL10RA,
TRAF6, TICAM1 e LY96. Interações fortes foram identificadas entre os genes IL6,
TLR4, IL1β, IL10, STAT3, IL10RA, TRAF6, TICAM1 e LY96 (Figura 2A).
Inúmeras ligações funcionais foram registradas entre os genes, principalmente de
ativação, inibição, catálise, ligação, determinação de fenótipo, regulação
transcricional e modificação pós-traducional, conforme expresso na Figura 2B.
As funções biológicas dos genes parceiros funcionais identificados pela
análise de STRING encontram-se descritas no Quadro 2.
QUADRO 2 – Descrição dos genes parceiros funcionais de resposta imune de Gallus
gallus.
Gene/proteína Função Biológica
STAT3 Transdutor de sinal e ativador de transcrição 3. Se liga aos
elementos responsivos à IL-6
IL10RA Receptor de IL10 de Gallus gallus
TRAF 6 Fator receptor 6 de TNF
TICAM1 Molécula adaptadora 1 de receptor toll-like de Gallus gallus
LY96 Antígeno linfocitário 96. A proteína codificada por este gene está
envolvida na ligação do lipopolissacarídeo com TLR4
As associações entre os genes avaliados e genes parceiros funcionais
(Figura 2C) foram obtidas a partir de interações conhecidas, registradas em banco de
dados com curadoria, determinadas experimentalmente ou por meio de registro de
co-expressão e metanalise.
64
FIGURA 1- Associação entre os quatro genes avaliados. Círculos representam genes e linhas de conexão representam interações entre genes. (A)
Linhas representam nível de associação entre genes. (B). As cores diferentes das linhas mostram os modos de ação. (C). As cores das
linhas representam associações de acordo com diferentes tipos de evidências utilizadas na associação.
65
FIGURA 2- Associação preditiva entre os quatro genes avaliados e cinco genes parceiros funcionais de resposta imune. Círculos representam genes e
linhas de conexão representam interações entre genes. (A) Linhas mais grossas representam associações fortes. (B). As cores diferentes
das linhas mostram os modos de ação. (C). As cores das linhas representam associações de acordo com diferentes tipos de evidências.
66
3.2 Extração e Quantificação do RNA
As frações 28S, 18S e 5S do RNA ribossômico foram visualizadas como
paramêtro para avaliação de ocorrência de degradação do RNA obtido. Além da
avaliação em gel de agarose, foi feita a quantificação em espectrofotômetro para
verificar a concentração e pureza do RNA. Neste trabalho, para os RNAs extraídos a
partir de baço, magno e útero, a média das razões de absorbância A260/280 foi de
2,0 indicando alta qualidade e pureza dos RNAs obtidos.
O rendimento de RNA a partir de 100 mg de tecido teve média de 25,17
μg em extrações a partir de magno, 22,5 μg em extrações a partir de baço e 22,0 μg
em amostras de útero. As concentrações de RNA foram normalizadas para uma
concentração final de 200 ng/μL.
3.3 Avaliação de genes constitutivos
Os resultados da avaliação da estabilidade de expressão dos dois genes
constitutivos β-actina e RPLP-1, encontram-se descritos na Tabelas 1.
TABELA 1- Resultados de qPCR para baço, magno e útero por gene constitutivo e entre grupos
experimentais
Gene Grupo n Média Ct SD SE Ct Máx Ct Mín
Baç
o
β-actina ST 10 16.127A 1.02 0.416 17.96 15.10
SH 10 15.896A 0.741 0.262 17.36 15.01
GC 10 15.602A 0.329 0.109 16.34 15.18
RPLP1 ST 10 17.372B 0.823 0.823 24.62 15.55
SH 10 15.875B 0.160 0.160 16.71 15.25
GC 10 16.142B 0.206 0.206 17.43 15.30
Mag
no
β-actina ST 10 19.380C 1.387 0.462 22.26 17.93
SH 10 20.653C 2.986 0.995 28.55 18.98
GC 10 19.305C 0.950 0.359 20.25 17.61
RPLP1 ST 10 18.350D 0.921 0.291 20.77 17.56
SH 10 19.102D 2.912 0.921 27.37 17.89
GC 10 18.385D 0.273 0.086 18.75 17.83
Ute
ro
β-actina ST 10 17.427E 0.493 0.164 18.23 16.66
SH 10 21.307E 6.896 2.606 34.6 17.17
GC 10 17.266E 0.714 0.226 18.05 15.91
RPLP1 ST 10 16.540F 0.355 0.112 17.35 16.23
SH 10 17.810F 3.045 1.015 25.84 16.12
GC 10 17.071F 0.515 0.163 17.98 16.05
SH= Infectadas por Salmonella Heidelberg; ST= Infectadas por Salmonella Typhimurium; GC=
Grupo controle negativo; Ct= ciclo limiar; SD= desvio padrão; SE = erro padrão. ALetras iguais na
mesma coluna indicam ausência de diferença estatística (p>0,05).
Considerando os dados brutos, β-actina foi o gene constitutivo que
apresentou maior variação de Cts, desvio e erro padrão, para os tecidos avaliados.
67
Este gene codifica uma proteína estrutural do citoesqueleto e é um dos genes mais
usados para normalização em experimentos de expressão gênica.
Não foi observada diferença estatística (p>0,05) entre os resultados das
amostras GC, ST e SH, considerando os dois genes constitutivos testados, em cada
tecido. A infecção não provocou variação significativa na expressão dos genes β-
actina e RPLP1, permitindo a utilização de ambos na normalização de dados para
análise de expressão relativa.
3.4 Análise de expressão gênica
Os resultados da expressão relativa dos genes de TLR-4, IL1B, 1L6 e
1L10 em diferentes tecidos, 7 DPI e 14 DPI encontram-se na Figura 3. Considerando
o gene para TLR-4, 7 DPI (Figura 3A), observa-se que a infecção experimental tanto
por Salmonella Heidelberg quanto Salmonella Typhimurium determinou supressão
na expressão do receptor em baço. Em magno, não foi observada diferença estatística
(p>0,05) na expressão, considerando os animais GC, SH e ST. Em útero, a expressão
de TLR-4 foi superior aos animais do grupo controle, tanto nos animais SH quanto
ST.
Nas amostras 14 DPI (Figura 3B), observa-se que em baço ocorreu
elevação da expressão de TLR-4, tanto nos animais SH quanto ST. O aumento se
apresentou mais intenso entre os animais inoculados com Salmonella Typhimurium
que Salmonella Heidelberg. Em magno, observou-se aumento na expressão de IL10
apenas entre os animais ST, 7DPI. Após 14 DPI, observou-se supressão na expressão
de IL1β, IL6 e IL10 neste tecido (Figuras 3D, 3F e 3H), provavelmente determinada
pela eliminação do agente. Em útero, a expressão de TLR-4 foi superior ao
observado no GC e mais intensa entre animais SH que ST, semelhante ao observado
sete DPI.
Para IL1β e IL6 (Figuras 3C e 3E), observa-se que não existiu diferença
estatística (p>0,05) na sua expressão relativa em baço, sete DPI, enquanto que no
mesmo período, a expressão de IL10 sofreu supressão (Figura 3G). De forma
semelhante a TLR-4, o aumento na expressão de IL1β, IL6 e IL10 ocorreu
tardiamente em baço. Em magno, o aumento expressão relativa de IL1β e IL6, sete
DPI foi observado, tanto em animais SH quanto ST (Figura 3C e 3E). Após 14 DPI,
observou-se supressão na expressão de IL1β, IL6 e IL10 neste tecido (Figuras 3D, 3F
e 3H).
68
Em útero, observou-se elevação na expressão de mRNA de IL1β entre os
animais SH e ST (Figura 3C), sete DPI. Entretanto, ocorreu elevação de expressão de
forma mais tardia entre os animais ST, 14 DPI (Figura 3D). A expressão de IL-6 foi
suprimida em SH e ST, tanto nas amostras sete DPI quanto 14 DPI (Figura 3E e 3F).
A elevação da expressão de IL10 foi observada entre os animais SH e ST, de forma
mais intensa nas amostras colhidas sete DPI (Figura 3G), com subsequente redução
14 DPI (Figura 3H).
69
FIGURA 3 – Modificações na expressão relativa em amostras de baço, magno e útero de
poedeiras experimentalmente infectadas Salmonella Typhimurium e
Salmonella Heidelberg. (A) mRNA do gene TLR4, 7 DPI. (B) mRNA do
gene TLR4,14 DPI. (C) mRNA do gene IL1β, 7 DPI. (D) mRNA do gene
IL1β,14 DPI. (E) mRNA do gene IL6, 7 DPI. (F) mRNA do gene IL6, 14
DPI. (G) mRNA do gene IL10,7 DPI. (H) RNAm mRNA do gene IL10, 14
DPI.
70
4. Discussão
Para as análises de expressão gênica, considerando o gene TLR-4, a
supressão na expressão do receptor em baço foi observada tando em animais SH
quanto ST, o que poderia determinar impacto no reconhecimento e eliminação da
bactéria. Efeito semelhante na expressão de TLR-4 foi observado em trabalho
publicado por Liermann et al.29, em poedeiras inoculadas com LPS de Escherichia
coli, relatando-se redução na expressão de TLR4 em fígado e baço após a inoculação
e em estudo desenvolvido por Marin et al.30, em células intestinais.
A expressão de TLR-4 em útero das aves infectadas foi superior aos
animais do grupo controle, o que sugere que este segmento do trato reprodutor de
poedeiras reconhece componentes estruturais de bactérias de forma mais intensa que
outros órgãos, o dificultaria sua colonização por Salmonella Heidelberg e Salmonella
Typhimurium. Segundo Rickel et al.31, a expressão precoce de TLR-4 ocorre em aves
resistentes à infecção por Salmonella sp., sendo fator considerado nos programas de
controle genético da infecção por Salmonella. Considerando unicamente a expressão
de TLR-4 em oviduto, Zhang et al.32, observaram maior expressão de TLR-4 em
trato reprodutor de patos resistentes à infecção por Salmonella Enteritidis.
A resposta tardia observada de expressão de TLR-4 em baço pode ser
associada ao fato de ser órgão linfóide secundário, mais predisposto ao contato de
bactérias Gram-negativas que integram a microbiota do trato gastrintestinal. Já foi
demonstrado que a estimulação sequencial de macrófagos murinos com LPS pode
resultar numa redução transitória na expressão de mRNA do gene TLR433. Além
disso, a diminuição da expressão de TLR4 pode ser uma indicação do
desenvolvimento da tolerância ao LPS, já demonstrada após repetidas exposições a
de LPS em aves33,34. Macrófagos murinos pré-tratados com LPS também
apresentaram uma diminuição na expressão de mRNA de TLR433. O
desenvolvimento da tolerância ao LPS também pode ser uma explicação adicional
para a falta de uma resposta febril, que foi observada em aves após exposição a
sorovares paratíficos de Salmonella sp34.
O aumento de TLR-4 em baço, tanto em animais SH quanto ST foi
observado tardiamente, 14 DPI. O aumento se apresentou mais intenso entre os
animais inoculados com Salmonella Typhimurium que Salmonella Heidelberg.
Aumento tardio na expressão de TLR4 em fígado, baço e tonsilas cecais de poedeiras
71
já foi relatado por Liermann et al.29 e Tan et al35. Em magno, o aumento da expressão
de TLR-4 só ocorreu de forma significativa em relação aos animais GC para o
sorovar Typhimurium.
Em magno, o aumento expressão relativa de IL1β e IL6, tanto em
animais SH quanto ST pode ser relacionado com a ocorrência de reconhecimento
antigênico, desencadeando ativação celular e liberação de citocinas. O aumento da
expressão de IL1β foi associado por Bai et al.36, à efetividade na eliminação de
Salmonella Typhimurium. Após 14 DPI, observou-se supressão na expressão de
IL1β, IL6 e IL10 neste tecido, provavelmente determinada pela eliminação do
agente.
Os dados apresentados indicam a existência de mecanismos de
reconhecimento antigênico, ativação celular e modulação da resposta imune distintos
entre os orgãos avaliados, considerando os dois sorovares. Além disso, sugere-se que
a diferença no reconhecimento antigênico entre sorovares possa se relacionar com
maior susceptibilidade e persistência de Salmonella sp. em baço e magno,
especialmente ao sorovar Heidelberg e menor susceptibilidade de útero à
colonização.
5. Conclusões
Existem interações fortes entre a expressão dos genes TLR4, IL1β, IL6 e
IL10;
Os genes parceiros funcionais de TLR4, IL1β, IL6 e IL10 em Gallus gallus
são STAT3, IL10RA, TRAF6, TICAM1 e LY96;
A expressão de mRNA dos genes β-actina e RPLP1 é estável em Gallus
gallus infectados por Salmonella sp;
Existe diferença no reconhecimento antigênico e produção de citocinas das
poedeiras infectadas por Salmonella Heidelberg e Salmonella Typhimurium.
Baço apresenta expressão tardia de TLR-4, IL1β, IL6 e IL10;
Existe diferença na expressão de TLR-4, IL1β, IL6 e IL10 em magno e útero.
72
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76
CAPÍTULO 4- CONSIDERAÇÕES FINAIS
A busca por melhores ferramentas de controle das salmoneloses é uma
constante na avicultura industrial devido a preocupação com saúde pública e os
problemas relacionados a comercialização de produtos contaminados com este
patógeno. Os mecanismos de regulação do sistema imunológico de aves e sua
interação com Salmonella sp. têm sido alvo de diversos estudos nos últimos anos,
incluindo abordagens genômicas e transcriptômicas. Entretanto, os mecanismos
envolvidos na persistência do agente de forma específica no trato gastrointestinal e
reprodutor de aves ou mesmo dos fatores responsáveis pela eliminação total do
agente em animais infectados sistemicamente ainda não foram totalmente elucidados.
O presente estudo sugere que Salmonella Heidelberg e Salmonella Typhimurium
determinam interações distintas com poedeiras, e que a colonização de sistemas sofre
a influência das características dos orgãos avaliados, principalmente ao considerar
mecanismos de reconhecimento antigênico determinado por TLR-4.
A compreensão da interação do agente com os diferentes componentes da
resposta imunológica das aves é fundamental para a adoção de critérios de seleção de
linhagens de poedeiras que incluam características de resistência à infecção por
sorovares emergentes. Os resultados obtidos neste trabalho evidenciam que aves
resistentes à sorovares mais prevalentes, como Enteritidis e Typhimurium podem
apresentar maior sensibilidade a infecções por Salmonella Heidelberg.
As condições de produção de ovos deverão ser revistas nos próximos
anos, considerando critérios de bem-estar animal, impacto sobre a imunocompetência
das aves e a manutenção de fatores de risco associados à disseminação de doenças
infecciosas presentes no modelo atual.
Características como precocidade de maturação de orgãos linfoides
secundários, maior expressão de receptores de reconhecimento antigênico e
velocidade de resposta de componentes de resposta imune inata devem ser
considerados, avaliando componentes de trato gastrintestinal, orgãos linfoides e trato
reprodutor. Além disso, a seleção genética pode buscar poedeiras capazes de
produzir ovos com concentrações mais elevadas de componentes de ação
antimicrobiana no albúmen, inviabilizando a sobrevivência de Salmonella
Heidelberg e Salmonella Typhimurium no seu interior.
77
Além dos componentes da resposta imune, a compreensão sobre o
impacto da composição da microbiota natural do intestino de aves sobre a capacidade
de colonização do trato gastrointestinal por Salmonella Heidelberg e Salmonella
Typhimurium pode constituir grande avanço na adoção de medidas de controle do
agente em plantéis comerciais que sejam sorovar-específicas. Atualmente, pouco se
sabe sobre o microbioma intestinal de aves e o seu efeito sobre parâmetros
produtivos, resistência a doenças e saúde geral.
A compreensão de fatores que predispõem à contaminação vertical de
ovos por Salmonella sp. é crucial para o desenvolvimento de programas dinâmicos
de seleção de linhagens mais resistentes. Deve-se considerar informações de
monitoramento e vigilância epidemiológica, avaliando modificações na distribuição
espacial e temporal de sorovares em plantéis, alimentos e amostras clínicas. Frente a
isso, recomenda-se que constante estudo sobre mecanismos de invasão e virulência,
assim como monitoramento e vigilância que envolvam avaliação preditiva da
variação de sorovares, especialmente emergentes e reemergentes, determinando
maior segurança na cadeia de produção de alimentos.
78
ANEXO 1