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Bulks de DNA na Caracterização de

Germoplasma Vegetal

DDDDDocumentos ocumentos ocumentos ocumentos ocumentos 218218218218218

Pelotas, RS2007

ISSN 1806-9193

Dezembro, 2007Empresa Brasileira de Pesquisa AgropecuáriaCentro de Pesquisa Agropecuária de Clima TemperadoMinistério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento

Bulks de DNA naBulks de DNA naBulks de DNA naBulks de DNA naBulks de DNA nacaracterização decaracterização decaracterização decaracterização decaracterização degermoplasma vegetalgermoplasma vegetalgermoplasma vegetalgermoplasma vegetalgermoplasma vegetal

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Adriana Pires Soares BresolinCaroline Marques CastroAntonio Costa de Oliveira

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Bresolin, Adriana Pires Soares. BULKS DE DNA NA CARACTERIZAÇÃO DE GERMOPLASMA VEGETAL / / / / /Adriana Pires Soares Bresolin; Caroline Marques Castro; Antonio Costa deOliveira. -- Pelotas: Embrapa Clima Temperado, 2007. 26 p. -- (Embrapa Clima Temperado. Documentos, 218).

ISSN 1516-8840

Genética vegetal - DNA - Amostragem - Marcador molecular. I. Castro,Caroline Marques. II. Oliveira, Antonio Costa de. III. Título. IV. Série.

CDD 572.86

AutorAutorAutorAutorAutor

Adriana Pires Soares BresolinAdriana Pires Soares BresolinAdriana Pires Soares BresolinAdriana Pires Soares BresolinAdriana Pires Soares BresolinEng. Agrôn(a)Doutoranda em Fitomelhoramento([email protected])

Caroline Marques CastroCaroline Marques CastroCaroline Marques CastroCaroline Marques CastroCaroline Marques CastroEng. Agrôn(a)., Drª em GenéticaEmbrapa Clima Temperado, Pelotas, RS([email protected])

Antonio Costa de OliveiraAntonio Costa de OliveiraAntonio Costa de OliveiraAntonio Costa de OliveiraAntonio Costa de OliveiraEng. Agrôn., Ph.D. em GenéticaAssociado do do Departamento de Fitotecnia -FAEM/UFPel, Pelotas, RS([email protected])

ApresentaçãoApresentaçãoApresentaçãoApresentaçãoApresentação

A genética molecular tem tido um papel importante naconservação da biodiversidade. Os recursos genéticos vegetaissão parte importante dessa biodiversidade, pois compreendemplantas cultivadas e espécies silvestres com valor comprovadoou mesmo potencial.

O uso de técnicas moleculares na caracterização de recursosgenéticos tem permitido identificar o grau de diversidadegenética do germoplasma conservado, possibilitando ummanejo adequado desses recursos e informando a respeito danecessidade de novas coletas ou introduções de germoplasma,assim como para redundâncias no material conservado.

Marcadores moleculares associados ao uso de bulks de DNAem estudos de diversidade genética permitem avaliar umgrande número de populações em um curto espaço de tempo,isso porque reduz drasticamente o número de amostras aserem processadas preservando os alelos mais freqüentes decada população. Por isto, os bulks de DNA vêm sendofreqüentemente utilizados em análises moleculares queenvolvem principalmente espécies alógamas.

Esta revisão bibliográfica aborda o uso de bulks de DNA nacaracterização de recursos genéticos, suas vantagens elimitações.

Chefe-GeralEmbrapa Clima Temperado

João Carlos Costa Gomes

SumárioSumárioSumárioSumárioSumário

Bulks de DNA na caracterização deBulks de DNA na caracterização deBulks de DNA na caracterização deBulks de DNA na caracterização deBulks de DNA na caracterização degermoplasma vegetalgermoplasma vegetalgermoplasma vegetalgermoplasma vegetalgermoplasma vegetal ...........................................

Introdução Introdução Introdução Introdução Introdução ...............................................................

Definição de Bulks de DNADefinição de Bulks de DNADefinição de Bulks de DNADefinição de Bulks de DNADefinição de Bulks de DNA ...................................

Tipos de Bulks DNATipos de Bulks DNATipos de Bulks DNATipos de Bulks DNATipos de Bulks DNA ...............................................

Bulks Oriundos de Tecidos de Plântulas ...........................

Bulks Oriundos de Sementes .............................................

Uso de Bulks de DNA em análises molecularesUso de Bulks de DNA em análises molecularesUso de Bulks de DNA em análises molecularesUso de Bulks de DNA em análises molecularesUso de Bulks de DNA em análises moleculares

Influência do tamanho dos Influência do tamanho dos Influência do tamanho dos Influência do tamanho dos Influência do tamanho dos Bulks Bulks Bulks Bulks Bulks nasnasnasnasnas análises análises análises análises análises

VVVVVantagens do uso de Bulksantagens do uso de Bulksantagens do uso de Bulksantagens do uso de Bulksantagens do uso de Bulks ..................................

Limitações do uso de BulksLimitações do uso de BulksLimitações do uso de BulksLimitações do uso de BulksLimitações do uso de Bulks .................................

ConclusõesConclusõesConclusõesConclusõesConclusões ..............................................................

ReferênciasReferênciasReferênciasReferênciasReferências ..............................................................

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Bulks de DNA naBulks de DNA naBulks de DNA naBulks de DNA naBulks de DNA nacaracterização decaracterização decaracterização decaracterização decaracterização degermoplasma vegetalgermoplasma vegetalgermoplasma vegetalgermoplasma vegetalgermoplasma vegetal

IntroduçãoIntroduçãoIntroduçãoIntroduçãoIntrodução

Grande riqueza em termos de variabilidade genética deinúmeras culturas encontra-se disponível nos bancos degermoplasma ao redor do mundo. Porém, o uso eficiente destesrecursos requer inicialmente uma caracterização precisa davariabilidade existente dentro e entre as populações (SEGOVIA-LERMA et al., 2003). A constatação de que a caracterização dogermoplasma conservado em bancos genéticos é limitada não érecente (FRANKEL e BROWN, 1984), e a carência deinformações sobre os acessos depositados constitui-se em umdos grandes entraves para o uso desse acervo genético.

A caracterização de germoplasma vegetal refere-se àobservação, mensuração e documentação de caracteres daplanta que são herdáveis, consistentes e expressashomogeneamente em vários ambientes (FERREIRA et al., 2005).Este processo é realizado por meio da identificação e separaçãogenética dos acessos que compõem a coleção de germoplasmaquer morfologicamente, via descrição de caracteres

Adriana Pires Soares BresolinAdriana Pires Soares BresolinAdriana Pires Soares BresolinAdriana Pires Soares BresolinAdriana Pires Soares BresolinCaroline Marques CastroCaroline Marques CastroCaroline Marques CastroCaroline Marques CastroCaroline Marques CastroAntonio Costa de OliveiraAntonio Costa de OliveiraAntonio Costa de OliveiraAntonio Costa de OliveiraAntonio Costa de Oliveira

11Bulks de DNA na caracterização de germoplasma vegetal

morfológicos, quer, em nível do genoma, utilizando técnicasmoleculares.

A análise molecular permite acessar o polimorfismo genéticoque muitas vezes difere do polimorfismo derivado da análisefenotípica. A tecnologia molecular tem permitido a identificaçãode similaridade no DNA de gêneros separados há milhares deanos e cujo fenótipo mascara sua herança genética comum(JAUHAR, 1996; SOBRAL, 1996).

A caracterização molecular de coleções de germoplasma vemsendo realizada com o auxílio vários marcadores baseados naanálise direta do DNA (POWELL et al., 1995; OLIVEIRA et al.,1996; GALGARO et al., 1998; LEÓN et al., 1998; GILBERT et al.,1999; GIMENES et al., 2000; PUECHER et al., 2001; MELLISH etal., 2002; FU et al., 2003; SCHUSTER et al., 2004, HERRMANN etal., 2005). A genética molecular tem tido um papel importante naconservação da diversidade genética, identificandonecessidades de coletas ou introduções de germoplasma,assim como redundâncias nos recursos genéticosconservados.

O sistema de reprodução de uma espécie tem papelfundamental na determinação da estrutura genética daspopulações (RITLAND; JAIN, 1981; MURAWSKI;DAYANANDAN; BAWA, 1994). Segundo Hamrick (1983) eHamrick e Godt (1989), em espécies de autofecundação a maiorvariabilidade genética encontra-se entre populações, enquantoque em espécies de fecundação cruzada a variabilidade é maiordentro de populações (LOVELESS e HAMRICK, 1984). Oconhecimento do sistema reprodutivo é crítico na definição dotipo e número de amostras necessárias para assegurar umaestimativa precisa da diversidade genética.

No caso de populações geneticamente heterogêneas, comoaquelas mantidas por fecundação cruzada, não há uniformidadegenética dentro da população (WADT, 1997). Nesse caso, oestudo da variabilidade genética com marcadores de DNA pode

12 Bulks de DNA na caracterização de germoplasma vegetal

ser feito por meio de amostras de plantas individuais, emnúmero que possibilite a caracterização da variabilidadegenética dentro da população (CASTRO et al., 2003), ou pormeio de bulks de DNA (HERRMANN et al., 2005).

Definição de Definição de Definição de Definição de Definição de BulksBulksBulksBulksBulks de DNA de DNA de DNA de DNA de DNA

Os bulks de DNA são amostras constituídas pela combinaçãode várias plantas individuais de uma mesma população em umaúnica amostra (MICHELMORE et al., 1991). A estratégia dacomposição de bulks é originalmente baseada na mistura emiguais quantidades de DNA genômico extraído de plantasindividuais (GOLEMBIEWSKI et al., 1997; KONGKIATNGAM etal., 1996; SWEENEY e DANNEBERGER, 1995). Fu et al. (2003),avaliando a estratégia de bulks em análise de RAPDevidenciaram que tanto os bulks formados antes da extração doDNA, compostos por quantidades iguais de tecido vegetal dosdiferentes indivíduos, como aqueles formados após a extração,geraram dados consistentes com a análise.

Tipos de Bulks de DNATipos de Bulks de DNATipos de Bulks de DNATipos de Bulks de DNATipos de Bulks de DNA

Bulks oriundos de tecidos de plântulasBulks oriundos de tecidos de plântulasBulks oriundos de tecidos de plântulasBulks oriundos de tecidos de plântulasBulks oriundos de tecidos de plântulas

Na maioria dos protocolos de extração de DNA vegetal sãoutilizados tecidos de plântulas ou plantas, pois permitem oisolamento de elevadas concentrações de DNA por amostra(MCDONALD et al., 1994). Em geral, são usados entre 50-100ngde DNA por reação, este intervalo pode variar de acordo com atécnica de marcadores empregada (FERREIRA eGRATTAPAGLIA, 1998).

Bulks oriundos de sementesBulks oriundos de sementesBulks oriundos de sementesBulks oriundos de sementesBulks oriundos de sementes

O uso de DNA obtido diretamente de tecidos de sementes foipesquisado com sucesso em várias espécies (BENITO et al.,


1993; CHUNWONGSE et al., 1993; MCDONALD et al., 1994;SHATTERS Jr. et al., 1995; ZHANG et al., 1996; MARCOS FILHOet al., 1997; SALGADO, 2001). Schuster et al. (2004) detectarammistura varietal em lotes de sementes de soja por meio demicrossatélites, utilizando tanto amostras constituídas porDNA extraído a partir de sementes individuais como poramostras em bulk. Ramos et al. (2006) também constataram quea utilização de bulks de DNA oriundos de mistura de sementespodem ser perfeitamente utilizados na detecção de marcadoresmicrossatélites, apresentando nitidez e repetibilidade nadeterminação da pureza varietal de lotes de sementes delinhagens de milho, com sensibilidade para detecção deconcentrações de DNA iguais ou superiores a 0,01%.

Uso de BulksUso de BulksUso de BulksUso de BulksUso de Bulks de DNA em análisesde DNA em análisesde DNA em análisesde DNA em análisesde DNA em análisesmolecularesmolecularesmolecularesmolecularesmoleculares

Para conservar e manejar de forma adequada os recursosgenéticos é indispensável conhecer a diversidade genéticapresente nas populações. O desenvolvimento de marcadoresbaseados no DNA genômico como: RFLP (Restriction FragmentLength Polymorphisms) ou polimorfismo dos fragmentos derestrição, RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) ou DNApolimórfico amplificado ao acaso, AFLP (Amplified FragmentLength Polymorphisms) ou polimorfismo de comprimento defragmentos amplificados e SSR (Simple Sequence Repeats)seqüências simples repetidas, têm possibilitado o acesso aestimativas de diversidade genética em muitos organismos.Atualmente, grande parte dos trabalhos de caracterização degermoplasma inclui um ou mais tipos de marcadoresmoleculares baseados em PCR (Polymerase Chain Reaction)(GUTHRIDGE et al., 2001; FU et al., 2003; HERRMANN et al.,2005; RAMOS et al., 2006).

Aliados à aplicação prática de alguns marcadores, os bulks deDNA têm sido freqüentemente utilizados em estudos devariabilidade genética em várias espécies, incluindo Brassica


napus (DULSON et al., 1998), Agrostis stolonífera L.(GOLEMBIEWSKI et al., 1997), Lolium perenne (ROLDÁN-RUIZet al., 2001), Trifolium repens L. (KÖLLIKER et al., 2001), Daucuscarota (BRADEEN et al., 2002), Camellia sinensis (YUNG-GOOet al., 2002), Medicago sativa L. (SEGOVIA-LERMA et al., 2003) eTrifolium pratense (HERMANN et al., 2005).

Michelmore et al. (1991) desenvolveram uma metodologia,denominada Bulk Segregant Analysis (BSA) ou análise desegregantes em bulk, para identificar, em populaçõessegregantes, marcadores de DNA ligados a genes ou regiõesgenômicas de interesse. A partir deste trabalho, os bulkspassaram a ser utilizados com inúmeros propósitos, como porexemplo: em estudos de mapeamento de característicasquantitativas (CHURCHILL et al., 1993; WANG ePATERSON,1994); na identificação de marcador ligado àresistência a doenças (POULSEN et al., 1995) e a peso depanícula (MALONE et al., 2007); na análise de relação genéticaentre cultivares relacionadas (LOARCE et al., 1996); naidentificação de cultivares (KOGKIATNGAM et al., 1996;RAMOS et al., 2006); e na caracterização e análise dedivergência genética entre populações (SWEENEY;DANNEBERGER,1994, 1995; MARGALÉ et al., 1995; KÖLLIKER etal., 2001; HERRMANN et al., 2005).

Influência do tamanho dos BulksInfluência do tamanho dos BulksInfluência do tamanho dos BulksInfluência do tamanho dos BulksInfluência do tamanho dos Bulks nasnasnasnasnasanálisesanálisesanálisesanálisesanálises

Em geral o tamanho dos bulks tem sido definido de formaempírica, sendo ainda limitadas às informações a respeito doimpacto do seu uso em estimativas de variabilidade genéticapara algumas espécies. Quando o tamanho dos bulks não édefinido de forma empírica, o tamanho da amostra é baseadoem probabilidades estatísticas de acordo com a estrutura dapopulação a fim de que seja representativo da mesma e emfunção do marcador molecular utilizado levando em conta suanatureza dominante ou co-dominante. Na literatura podemos


encontrar tamanho de bulks variando de cinco (GILBERT et al.,1999) até 45 indivíduos (SWEENEY e DANNEBERGER, 1995).

Puecher et al. (2001) verificaram que a utilização de um bulk de10 indivíduos do gênero Bromus catharticus aliado à técnica deAFLP possibilitou a distinção entre as duas populaçõesavaliadas. Marcadores AFLP associados ao loco que determinao sexo em aspargo foram adequadamente identificados atravésde análises utilizando bulks de 10 indivíduos (REAMON-BÜTNER et al., 1998).

Fu et al. (2003), em estudo realizado para avaliar a estratégia douso de bulks em análise de marcadores RAPD em acessos deLinnum usitassimum L., constataram que bulks de 10indivíduos por população foram eficientes na detecção devariabilidade, enquanto que bulks com mais de 10 indivíduosnão foram necessariamente mais informativos.

Jorgensen e Shim (2000), explorando a variabilidade genéticaentre populações de Daucus carota L., optaram pela utilizaçãode bulks de 13-15 plantas por população e pela técnica de AFLP,obtendo avanços satisfatórios na pesquisa. Da mesma forma,MELLISH et al. (2002), fizeram uso de um bulk de 15 indivíduosem análise de AFLP para estudar a diversidade genética entrecultivares de uma espécie forrageira do gênero Agropyron, oque propiciou a diferenciação dos 12 cultivares avaliados. Deacordo com este autor, as amostras de DNA em bulk podem serusadas para estudos de filogenia de diferentes populações.

Kongkiatngam et al. (1996), testando o efeito de diferentestamanhos de bulks em análises com marcadores RAPD,concluíram que o bulk constituído por 20 indivíduos foirepresentativo da heterogeneidade das cultivares de trevo-vermelho.

A utilização de um bulk de 20 plantas revelou variabilidadegenética entre 52 cultivares e acessos de Trifolium repens edetectaram que aproximadamente 90% dos fragmentos


amplificados nas amostras individuais também estavampresentes nas amostras em bulks (Kölliker et al., 2001). Emestudos com Lolium perenne, utilizando marcadores AFLP, foieficiente o uso de bulks compostos de 20 plantas individuais naexploração de diversidade genética entre populações (Guthrigeet al., 2001).

Para explorar a diversidade genética entre e dentro depopulações de trevo-vermelho, não um, mas dois bulks, de 20indivíduos cada, representando uma única população, seriaconsiderado o ideal (Herrmann et al., 2005). A análise de doisbulks de 20 indivíduos por população resulta na detecção deaté 16% mais marcadores AFLP quando comparada com umaanálise baseada em um único bulk por população.

Embora a análise de vários bulks de uma mesma populaçãotenha sido previamente sugerida (GILBERT et al., 1999), umgrande número de estudos tem sido executado com apenas umbulk por população, com resultados bastante satisfatórios(KÖLLIKER et al., 2001; SAWKINS et al., 2001; SEGOVIA-LERMAet al., 2003). Segundo Segovia-Lerma et al. (2003), através demarcadores AFLP, um único bulk de 30 indivíduos pode serusado com precisão em estudos de diversidade genética em umgrande número de populações de alfafa.

VVVVVantagens do uso de Bulksantagens do uso de Bulksantagens do uso de Bulksantagens do uso de Bulksantagens do uso de Bulks

A utilização de bulks em estudos de diversidade genéticapermite avaliar um grande número de populações em um curtoespaço de tempo, isso porque reduz drasticamente o númerode amostras a serem processadas, preservando os alelos maisfreqüentes em cada população (MICHELMORE et al.,1991).

A estratégia de bulks de DNA tem a grande vantagem da rápidaverificação de diferenças entre populações, o que éespecialmente importante para um adequado manejo de bancosde germoplasma e para programas de melhoramento genético


(YANAKA et al., 2005). Esta estratégia é particularmenterelevante em bancos de germoplasma, onde os bulks podemser utilizados para reorganizar e confrontar os resultados comos previamente obtidos por descritores morfológicos, os quaissão muito influenciados pelo ambiente (WADT, 1997).

Segundo Sweeney e Danneberger (1994), a utilização de bulksde DNA objetiva diminuir o custo da análise molecular porreduzir consideravelmente o tempo, trabalho e reagentesempregados por reação. Além do que, Fu et al. (2003)evidenciaram que os bulks são capazes de gerar padrõesgenéticos compatíveis com os resultados obtidos por meio deamostras individuais.

Limitações do uso de BulksLimitações do uso de BulksLimitações do uso de BulksLimitações do uso de BulksLimitações do uso de Bulks

Michelmore et al. (1991) constataram que o tamanho da amostraem bulk pode afetar a sensibilidade das técnicas moleculares,impedindo que ocorra a amplificação de marcadores que seencontrem em baixa freqüência na amostra. Esses autoresverificaram que em amostras que continham menos de 4% dosindivíduos com um determinado marcador, este não foidetectado, enquanto que, para alguns locos, esse limite foi de10%. Em função dos resultados de Michelmore et al. (1991),vários autores têm considerado o limite de detecção de 4%(WANG e PATERSON, 1994; SWEENEY e DANNEBERGER, 1994,1995). Contudo, Loarce et al. (1996) verificaram que marcadorescom freqüência abaixo de 14% não foram detectados nos bulks,enquanto que Poulsen et al. (1995) não detectaram fragmentoscom freqüência inferior a 12,5%. Herrmann et al. (2005)evidenciaram que os marcadores detectados apresentavamuma freqüência de 20-30% nos bulks de trevo-vermelho. Estelimite de detecção de alelos raros corresponde a limitesencontrados em outras espécies como tremoço (GILBERT et al.,1999) e trevo-branco (KÖLLIKER et al., 2001).


Outro fator importante a ser considerado para que ummarcador seja identificado quando são analisados bulks é aintensidade com que o fragmento que identifica o marcador évisualizado no gel quando a analise é feita a partir de plantasindividuais (TREUREM, 2001). Esta diferença na intensidade dofragmento provavelmente decorra da competição entreseqüências de DNA pelo iniciador na reação de amplificação(PCR - Polimerase Chain Reaction). Segundo Brummer et al.(1995), essas diferenças surgem porque os alelos raros podemnão ser amplificados devido à competição dos sítios maisfreqüentes que ocorre quando o DNA é misturado. No entanto,a amplificação de bulks de DNA pode não gerar os mesmosfragmentos gerados por amostras individuais (SWEENEY eDANNEBERGER, 1994).

Zhu et al. (1998) levantaram alguns questionamentos sobre aefetividade do uso de bulks de DNA em relação à baixasensibilidade na detecção de polimorfismo utilizandomarcadores AFLP. Guthridge et al. (2001) evidenciaram queperfis gerados em amostras individuais podiam estar ou nãopresentes nas amostras em bulk, demonstrando a granderelação entre a freqüência de ocorrência e a presença dosfragmentos nas amostras em bulk. Apenas fragmentospresentes em mais de 25% das amostras individuais estavampresentes nos bulks. Yanaka et al. (2005), por meio de análiserealizada com bulks, reunindo o DNA de 10 indivíduos de cadaacesso, relataram que bandas raras não foram detectadas.Gilbert et al. (1999) salientaram o risco de perda de identificaçãode alelos quando se avalia bulks formados de cinco plantas.Entretanto, vários autores, (Kongkiatngam et al., 1996; Dulsonet al., 1998; Mengoni et al., 2000; Kölliker et al., 2001) afirmaramque grandes bulks (20 indivíduos) são eficientes, pois nãomodificam substancialmente os resultados independente daquantidade e estrutura do polimorfismo. Segundo Sweeney eDanneberger (1995) e Margalé et al. (1995), mesmo com alimitação na detecção de alelos raros, o uso de bulks tem sidoeficiente em estudos de divergência genética.


ConclusõesConclusõesConclusõesConclusõesConclusões

Esta revisão mostra que os bulks de DNA vêm sendofreqüentemente utilizados em análises moleculares queenvolvem principlamente espécies alógamas. No entanto, aanálise em bulks pode subestimar a diversidade genética realexistente entre as populações. Desta forma, quando existe ointeresse de uma caracterização detalhada de populaçõesespecíficas de interesse à pesquisa pode ser refinada por meioda análise de genótipos individuais de cada população. Poroutro lado, quando o objetivo é caracterizar um grande númerode populações, o uso de bulks de DNA é extremamenteinteressante, uma vez que reduz o número de amostras a seremprocessadas permitindo a caracterização de um grande númerode acessos de forma mais rápida e econômica.

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