bó g.a., moreno d., cutaia l., baruselli p.s. & reis, e.l ... sbte-2004 -...

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Acta Scientiae Veterinariae 32(Suplemento), 2004

MANIPULAÇÃO HORMONAL DO CICLO ESTRAL EM DOADORAS E RECEPTORASDE EMBRIÃO BOVINO

G.A. Bó1; D. Moreno1; L. Cutaia1; P.S. Baruselli2; E.L. Reis2

1Instituto de Reproducción Animal Córdoba (IRAC), J.L. de Cabrera 106, X5000GVD Córdoba,Argentina; 2Departamento de Reprodução Animal, FMVZ-USP, São Paulo, Brazil, 05508-000

RESUMO

Embora a transferência de embriões seja uma técnica amplamente empregada em todo o mundo, a variabilidadeda resposta ao tratamento superovulatório ainda é uma importante limitação. Essa variabilidade pode sercontrolada levando em consideração os conhecimentos da função ovariana. Em bovinos, recentes protocolospara o controle da dinâmica folicular e luteínica permitem iniciar o tratamento superovulatório em momentopredeterminado. A aspiração folicular guiada por ultra-sonografia (início do tratamento superovulatório 1 a 2dias após) e o tratamento com estrógeno e progesterona (início do tratamento superovulatório 4 dias após)têm sido amplamente utilizados em protocolos de superovulação, com produção embrionária equivalente adoadoras superovuladas com o sistema tradicional (início do tratamento superovulatório 8 a 12 dias após oestro). Em receptoras, recentes protocolos foram elaborados para controlar o status luteínico e folicular,possibilitando uma eficiente sincronização e permitindo a transferência de embriões sem a necessidade dedetecção de estro (TETF). O tratamento com GnRH, associado a prostaglandina F2α (PGF) 7 dias após ea uma segunda aplicação de GnRH 48h após a PGF (protocolo “Ovsynch”) têm apresentado aceitáveistaxas de prenhez após a inseminação artificial em tempo fixo em vacas de leite e em receptoras inovuladassem detecção do estro. Como alternativa, tratamentos com estrógeno e dispositivos contendo progesterona/progestágenos têm apresentado taxas de prenhez comparáveis àquelas obtidas em receptoras inovuladas 7dias após a detecção do estro. Além disso, o tratamento com estrógeno e progesterona associado a PGF eao eCG (administrado 1 dia após a emergência folicular) tem apresentado altas taxas de receptoras selecionadase de prenhez. Esse tratamento é freqüentemente utilizado para sincronização de um grande número de receptorasna América do Sul. Com esse protocolo 85 a 90% das receptoras tratadas são selecionadas para TE, comtaxa de prenhez (receptoras prenhes por receptoras tratadas) em torno de 40 a 50%. É possível obter umcusto benefício satisfatório com o emprego de um protocolo que resulte em 40 a 50% de prenhez, considerandoque o tratamento também elimina a necessidade de detecção do estro e reduz o intervalo entre o tratamentoe a prenhez.Palavras chave: desenvolvimento folicular, estrógeno, progesterona, transferência de embrião em tempofixo, superovulação

AknowledgmentsResearch was supported by the Agencia Córdoba Ciencia and Instituto de Reproducción Animal Córdoba(IRAC), Argentina. We also thank Syntex S.A., Argentina for DIB, InterAG, New Zealand for CIDR-B andBioniche Animal Health, for Folltropin-V. Special thanks to our colleagues of IRAC, U. of Saskatchewan andU. of São Paulo for technical assistance. e-mail: [email protected]

Bó G.A., Moreno D., Cutaia L., Baruselli P.S. & Reis, E.L. 2004. Manipulação hormonal do ciclo estral em doadoras e receptorasde embrião bovino. Acta Scientiae Veterinariae, 32 (Supl ): p.1-22.

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INTRODUÇÃO

Embora a transferência de embriões seja uma técnica amplamente empregada em todo o mundo, commais de 500 mil embriões transferidos por ano, a variabilidade da resposta ao tratamento superovulatórioainda é uma importante limitação (20). Maiores conhecimentos da função ovariana, recentemente adquiridospela ultra-sonografia, possibilitam controlar o desenvolvimento folicular e a ovulação. Recentes protocolos,que controlam a função folicular e luteínica, permitem iniciar o tratamento superovulatório e a sincronizaçãodas receptoras em momento predeterminado. O objetivo desse artigo é revisar esses protocolos e discutirseu impacto e aplicação em programas de transferência de embriões, com destaque especial na América doSul.

SINCRONIZAÇÃO DO ESTRO E DA OVULAÇÃO

A Prostaglandina F2α tem sido o tratamento mais empregado para a sincronização do estro em bovi-nos (revisado no artigo 64). Estudos anteriores mostraram que a maturidade do CL no momento da aplica-ção de PGF influenciou a resposta luteolítica e que a PGF não induziu efetiva luteólise durante 5 a 6 dias apóso estro (63). Além disso, em vacas que ocorreu a luteólise, o estro foi detectado ao longo de 6 dias (45).Estudos recentes mostraram que o intervalo entre o tratamento com PGF e a manifestação do estro é deter-minado pelo estágio de desenvolvimento do folículo dominante no momento do tratamento (37). Se a PGFfor administrada quando o folículo dominante estiver na fase final de crescimento ou no início da fase estática,a ovulação ocorrerá em 3 a 4 dias. Por outro lado, se o tratamento com PGF for realizado no momento emque o folículo dominante estiver no meio ou no final da fase estática, a ovulação do folículo dominante dapróxima onda de crescimento folicular ocorrerá após 5 a 7 dias (37). Esse intervalo é reflexo do temponecessário para que o folículo dominante da nova onda cresça e se desenvolva até o estágio pré-ovulatórioe enfatiza a necessidade do controle folicular e luteínico para a obtenção de altas taxas de prenhez emprogramas de IA e TE em tempo fixo, sem a necessidade de detecção do estro.

Geralmente, os tratamentos usados para a sincronização de receptoras consistem na administração deduas doses de PGF com intervalos de 11 a 14 dias (22). Se todas as receptoras estiverem ciclando, em tornode 80% delas apresentarão sinais de estro 5 dias após o tratamento. Entretanto, devido a baixa acurácia nadetecção do estro, apenas 50% das receptoras tratadas serão detectadas em cio, apresentarão CL e rece-berão um embrião 7 dias após o estro (20). Essa situação pode apresentar maiores comprometimentos se asreceptoras utilizadas forem Bos indicus ou cruza Bos indicus criadas a pasto. A tabela 1 exemplifica taxas deaproveitamento das receptoras em programas comerciais de transferência de embriões no Brasil e na Bolívia.A taxa total de prenhez foi em torno de 13% devido ao baixo número de receptoras detectadas em estro e/ou que apresentavam CL no momento da transferência dos embriões (Burry, comunicação pessoal, citadoem 20). Essa ineficiência afeta sobremaneira a viabilidade desses programas em receptoras criadas a pastona América do Sul.

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TRATAMENTOS HORMONAIS PARA O CONTROLE DA EMERGÊNCIA DA ONDA DE CRES-CIMENTO FOLICULAR E DA SINCRONIZAÇÃO DA OVULAÇÃO

GnRH

Tem sido demonstrado que a administração de GnRH induz a ovulação ou a luteinização do folículodominante presente no momento do tratamento (46). Várias pesquisas foram realizadas para tentar desen-volver protocolos que empregam GnRH e PGF para inseminação artificial em tempo fixo em bovinos de leitee de corte (65, 66, 69, 71, 74). Esse protocolo é conhecido como tratamento “Ovsynch” (66) e consiste naadministração de GnRH seguido de PGF 7 dias após, um segundo tratamento com GnRH 48 horas após aPGF e a inseminação artificial em tempo fixo 16 horas depois. A administração de GnRH induzirá um pico deLH, resultando na ovulação ou luteinização do folículo dominante e emergência de uma nova onda de cres-cimento folicular nos próximos 2 dias. A administração de PGF 7 dias após o primeiro GnRH induz aluteólise e o segundo GnRH promove outro pico de LH e sincroniza a ovulação do novo folículo dominante.Outros autores utilizaram um protocolo similar em bovinos de corte com intervalo de 6 dias entre a primeiraadministração de GnRH e o tratamento com PGF (55, 80).

O protocolo “Ovsynch” tem sido mais eficiente em vacas que em novilhas (66,55). Resultados derecentes estudos confirmaram que o tratamento com GnRH nem sempre induz a ovulação ou a luteinizaçãodo folículo dominante em novilhas. Verificou-se também, que a emergência da nova onda de crescimentofolicular é sincronizada somente quando o tratamento causa ovulação (54). Consequentemente, a ovulaçãoao segundo GnRH pode apresentar comprometimentos se o tratamento com o primeiro GnRH não sincroni-zar a emergência da nova onda de crescimento folicular. Ainda, foi verificado que algumas novilhas podemmanifestar sinais de estro antes do tratamento com o segundo GnRH. A prevenção de ovulações precocespode ser alcançada pela adição de um CIDR-B (Pfizer Animal Health) por 7 dias durante o protocolo“Ovsynch”, verificando aumento significativo na taxa de prenhez em novilhas inseminadas em tempo fixo(55).

O protocolo “Ovsynch” também tem sido utilizado para sincronizar a ovulação em receptoras deembriões produzidos in vivo (5, 36, 84) ou in vitro (2). Em dois estudos, novilhas (5, 84) e vacas (84) Bosindicus x Bos taurus foram tratadas com uma dose de PGF e submetidas a observação de estro por 5 diasou com o protocolo “Ovsynch” sem a detecção do estro. Sete dias após o estro (Grupo PGF) ou após asegunda administração de GnRH (grupo Ovsynch), as receptoras que apresentavam CL detectado por ultra-

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sonografia (5) ou por palpação retal (84) foram selecionadas para a transferência de embrião. Todas asreceptoras selecionadas receberam por transferência direta um embrião descongelado. A taxa de prenhez foimaior em receptoras tratadas com o protocolo “Ovsynch” (Tabela 2); nesse grupo um maior número dereceptoras foram inovuladas por não depender da detecção do estro. É também digno de nota que em umdos estudos (5), 53,7% das novilhas tratadas com PGF foram detectadas em estro, reflexo da dificuldade deobservação de cio em Bos indicus, confirmando a informação anteriormente mencionada nesse artigo (27).

Em outro estudo (10, 36), 499 vacas lactantes cruza Bos taurus (28 a 92 dias pós parto) foramdivididas em 3 grupos experimentais. As vacas do grupo controle foram tratadas com GnRH no dia 0, PGFno dia 7 e o estro foi detectado pelo sistema “Heat Watch” (GnRH + PGF). As vacas dos outros 2 gruposforam tratadas somente com o protocolo “Ovsynch” (Ovsynch) ou com o protocolo “Ovsynch” associado aum implante de norgestomet (SMB, Syncro-Mate-B, Merial) por 7 dias (Ovsynch + P4) e não foram sub-metidas a observação de estro. Seis a 8 dias após o estro (Grupo GnRH + PGF) ou sete dias após a segundaadministração de GnRH (Grupo Ovsynch e Ovsynch + P4) as vacas foram examinadas por palpação retal eaquelas que apresentavam CL receberam por transferência direta um embrião descongelado grau 1 ou 2.Apesar da taxa de concepção (receptoras prenhas/receptoras inovuladas) ter apresentado uma tendência(P<0,07) de melhores resultados nas vacas do grupo GnRH + PGF, a taxa de prenhez total não diferiusignificativamente entre os grupos, principalmente pelo maior numero de receptoras (P< 0,01) selecionadaspara transferência de embrião nos grupos Ovsynch e Ovsynch + P4 (Tabela 3). Os mesmos pesquisadorestambém fizeram experimentos a campo envolvendo 1637 receptoras tratadas com protocolo “Ovsynch”associado a um implante auricular SMB ou a um dispositivo intravaginal CIDR-B sem a detecção do estro,obtendo taxa de prenhez total de 59,9% (12). Resumidamente, os resultados desses estudos indicaram queaceitáveis taxas de prenhez podem ser obtidas quando embriões são transferidos para receptoras submeti-das à sincronização da ovulação sem a necessidade de detecção do estro. Na figura 1 está descrito oprotocolo.

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Figura 1. Protocolo “Ovsynch” ou “Ovsynch” associado a um dispositivo de progestágeno/progesterona(Ovsynch+P4) para TETF em fêmeas bovinas. O protocolo “Ovsynch” consiste na aplicação deGnRH no dia 0, seguido pela administração de PGF no dia 7 e uma segunda aplicação de GnRHno dia 9. No tratamento “Ovsynch” + P4, um implante de progestágeno ou um dispositivo liberadorde progesterona é inserido no dia 0 e removido no dia 7. Não é efetuada a detecção do estro e ainovulação é realizada no dia 16 (receptoras que apresentem CL).

Progesterona

Estudos realizados para avaliar diferentes protocolos a base de progestágenos/progesterona mostra-ram que tratamentos longos para regressão espontânea do CL (≥14 d), sincronizam o estro. No entanto,esses tratamentos levam à formação de folículos dominantes de maior tamanho (persistentes; 29, 40, 70, 73)e de reduzida fertilidade (68, 83). A baixa fertilidade é atribuída a maturação espontânea do oócito (quebrada vesícula germinativa e expansão do cúmulus) presente no folículo persistente (67). Tratamentos que indu-zem a regressão do folículo persistente e levam à emergência de uma nova onda de crescimento folicularmelhoraram as taxas de prenhez em programas de IA (38, 43). Baseado nos resultados de um estudoanterior acreditava-se que, o folículo persistente não afetava a qualidade do CL e a taxa de concepção emreceptoras (81). No entanto, nesse estudo as taxas de prenhez foram baixas (em torno de 30% em todos ostratamentos). Entretanto, resultados de um recente estudo indicaram que um CL de maior tamanho, origina-do de um folículo persistente, diminui as taxas de concepção (49).

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Progesterona e estrógeno

Nos últimos anos, o tratamento com estrógeno e progestágeno/progesterona tem sido cada vez maisempregado em programas de sincronização do estro em bovinos de leite e de corte (48, 18, 28, 38, 55). Otratamento consiste na inserção de um dispositivo contendo progestágeno/progesterona e na administraçãode estrógeno e progestágeno/progesterona no dia 0 (para emergência de uma nova onda de crescimentofolicular e prevenção de folículos persistentes), de PGF no momento da retirada do dispositivo nos dias 7, 8ou 9 (indução da luteólise), e subseqüente aplicação de reduzida dose de estradiol após 24 h (30) ou deGnRH/LH após 48 a 54 h (18, 55) para sincronização da ovulação. As taxas de prenhez à IATF mostraram-se similares às da IA com detecção de estro (38).

Uma série de experimentos foram realizados para avaliar o emprego de protocolos a base de estrógenoe progesterona para IATF na sincronização de receptoras para transferência de embriões em tempo fixo. Emum experimento (77), as vacas do grupo estrógeno/progesterona receberam um dispositivo intravaginal con-tendo progesterona CIDR-B, associado a 2 mg de benzoato de estradiol e 50 mg de progesterona im no dia0, PGF no momento da remoção do CIDR-B no dia 7 e 1 mg de BE no dia 8. Não observou-se estro e o dia9 foi considerado o dia do estro. As vacas do grupo controle foram tratadas com 2 doses de PGF com 14dias de intervalo e submetidas a observação de cio por 5 dias. Sete dias após o estro (grupo PGF) ou o diaesperado do estro (grupo CIDR-B), todos os animais que apresentavam um CL (> 15 mm estimado porpalpação retal) receberam por transferência direta um embrião descongelado. As taxas de prenhez (receptorasprenhas/receptoras tratadas) não diferiram entre os tratamentos (PGF: 32,0% vs CIDR-B: 37%; P>0,6).Estes resultados foram confirmados em outros 2 experimentos nos quais não observou-se diferença entrereceptoras tratadas com CIDR-B por 7 ou 8 dias (19) e DIB (Syntex, Argentina) por 8 dias (19).

Apesar do uso de estrógeno e progestágeno/progesterona ter eliminado a detecção do cio, as taxas deprenhez mantiveram-se em torno de 20 a 35%, necessitando serem aumentadas (20). Assim, 2 estudosforam realizados para verificar se o momento da administração de PGF no protocolo a base de estrógeno eprogestágeno/progesterona afetaria o número de receptoras selecionadas para TE. As vacas foram tratadascom dispositivo intravaginal contendo progesterona (DIB) associado a 2 mg de BE e 50 mg de P4 im no dia0, e foram divididas homogeneamente para receberem PGF no dia 4 (dia esperado da emergência da novaonda de crescimento folicular) ou no dia 8 (momento da retirada do DIB). No dia 9, todas as vacas recebe-ram 1 mg de BE im e o dia 10 foi considerado o dia do estro. As receptoras que apresentaram um CL ≥ 12mm de diâmetro no dia 17 receberam um embrião. No primeiro experimento, o desenvolvimento folicular foimonitorado por ultra-sonografia diária. A aplicação de PGF no momento da emergência folicular (Dia 4),comparada à aplicação de PGF no momento da retirada do dispositivo contendo progesterona (Dia 8),aumentou o diâmetro do folículo dominante (13,2±0,2 vs. 11,5±0,2 mm; P<0,05); antecipou o momento daovulação (66,6±0,4 vs 70,8±2,3 h; P<0,01) e aumentou a concentração plasmática de progesterona no diada inovulação (6,9±0,8 vs 5,2±0,6 ng/ml; P=0,08; 57). No segundo experimento, o tratamento com PGF nodia 4 aumentou a proporção de receptoras selecionadas para TE (70,5%; P<0,02) e a taxa de concepção(41,1%; P<0,004) comparado ao tratamento com PGF no dia 8 (52,7% e 21,5%, respectivamente). Alémdisso, foi colhida uma amostra de sangue em um grupo de animais e o tratamento com PGF no dia 4 (6,8±0,7

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ng/ml; n=43) aumentou a concentração plasmática de progesterona, comparado ao tratamento com PGF nodia 8 (4,0±0,4 ng/ml; n=27; P=0,008).

Tratamentos com eCG para aumentar a concentração plasmática de progesterona e a taxa deprenhez

Diversos estudos relacionaram as taxas de concepção com as concentrações plasmáticas de progesteronaem bovinos (revisado em 74). No entanto, a suplementação com progesterona tem apresentado resultadosinconsistentes na taxa de concepção. A inserção de uma dispositivo intravaginal de progeterona CIDR-B nomomento da TE aumentou 12,8% na taxa de concepção de receptoras cíclicas em lactação (47). Entretanto,nosso grupo não foi capaz de demonstrar nenhum benefício do CIDR-B em receptoras novilhas e vacas deleite, e em novilhas cruza Bos indicus (76). Bousquet (comunicação pessoal) foi capaz de verificar efeitobenéfico da suplementação com P4 após a TE somente em embriões de baixa qualidade, e Fuentes (32)relatou aumento nas taxas de concepção somente quando o PRID foi inserido em novilhas que apresentavamCL de tamanho reduzido. Em um estudo mais recente a inserção de um CIDR-B do dia 7 ao dia 20 do cicloestral não resultou em aumento significativo da concentração plasmática de P4 em novilhas (52). Uma alter-nativa para o aumento das concentrações plasmáticas de P4 pode ser a formação de um CL acessório pelaindução da ovulação do folículo dominate com hCG ou pela inserção do implante de deslorelina no dia 5 dociclo estral (revisado em 74). Em receptoras Bos indicus o tratamento com hCG no dia 7 aumentou aconcentração plasmática de P4 (52) e os tratamentos com GnRH, hCG, pLH ou CIDR-B aumentaram astaxas de concepção. Levando todos os trabalhos em consideração, os efeitos benéficos da maior concentra-ção de P4 parecem ser evidentes apenas quando as taxas de concepção das receptoras controle (nãotratadas) foram menores que o esperado, sugerindo que o escore de condição corporal, ciclicidade e/ouqualidade o embrião podem ser fatores que contribuem na eficiência dos programas de TE.

Outra estratégia para aumentar as concentrações circulantes de progesterona em receptoras é a induçãode múltiplas ovulações pela administração de eCG durante o protocolo de sincronização. Fuentes e de laFuente (33) foram os primeiros a reportar que o tratamento com 1000UI de eCG no dia 4 do tratamentocom PRID por 6,5 dias e com 17β estradiol em novilhas Holandesas resultou em múltiplos CLs (2 a 5 porovário), maior (P<0,05) número de receptoras selecionadas para TE (89,7%) e maior taxa de prenhez(58,6%) quando comparados às novilhas sincronizadas com o mesmo tratamento sem eCG (49,1% e 22,2%,respectivamente). As receptoras tratadas com dose única de PGF (44,8% e 19,0%, respectivamente) ouque receberam um embrião 7 dias após o cio natural (50,0% e 28,8%, respectivamente) também apresenta-ram menor eficiência. Em outro estudo (6), novilhas Bos taurus x Bos indicus foram tratadas com CIDR-Bpor 7,5 dias, combinado com 2mg de BE e 50mg de P4 im no dia 0. Metade das novilhas receberam 800UIde eCG no dia 5 e todas novilhas receberam PGF no dia 7 e 1 mg de BE im no dia 8. Todos animais foramexaminados por ultra-sonografia 1 dia antes da TE e uma amostra de sangue foi colhida para determinaçãoda concentração plasmática de P4. Os resultados mostrados na Tabela 4 revelaram que o tratamento comeCG aumentou o número de ovulações (número de CL), a concentração plasmática de P4 e a taxa deprenhez.

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É também digno de nota que, considerando apenas as receptoras com 1 CL, a área do CL (P<0,01)e a concentração plasmática de P4 (P=0,1) também foram maiores nas novilhas tratadas com eCG (2,9 ±0,6 cm2 e 2,3±1,6 ng/mL; n=8), que nas não tratadas com eCG (2,2±0,5 cm2 e 1,3±0,8 ng/mL; n=17).

Um posterior estudo foi realizado para avaliar se uma menor dose de eCG também poderia aumentaras taxas de prenhez em receptoras inovuladas em tempo fixo. Vacas Bos taurus x Bos indicus foram tratadascom DIB combinado com 2mg de BE e 50mg de P4 im no dia 0. Metade das vacas receberam 400UI deeCG im e todas receberam PGF no dia 5. O DIB foi retirado no dia 8 e 1mg de BE im foi administrado no dia9. Todas as vacas foram examinadas por ultra-sonografia um dia antes da TE. Embora esse tratamento nãotenha resultado em muitas múltiplas ovulações como nos estudos anteriores, o tratamento com eCG aumen-tou o diâmetro do CL e as taxas de prenhez (Tabela 5). Em uma amostra de 55 receptoras inovuladascolheu-se sangue para determinação das concentrações plasmática de P4. A concentração plasmática de P4em receptoras tratadas com eCG que apresentaram 2 ou 3 CLs (30,2±8,2 ng/mL; n=8) ou apenas 1 CL nomomento da TE (7,5±0,7 ng/mL; n=18) foi significativamente maior (P<0,01) que nas receptoras não trata-das com eCG (5,7±0,4 ng/mL; n=29).

Em outro experimento, nosso grupo de pesquisa comparou as taxas de prenhez de vacas tratadas comDIB e BE e foi induzida a ovulação com BE ou hCG (58). Foram utilizadas vacas de corte Bos taurus x Bosindicus com escore de condição corporal entre 2,5 e 3,5 (escala 1 a 5). No início de cada réplica (Dia 0)todos os animais receberam um DIB e 2 mg de BE associado a 50 mg de P4 im. No dia 5 todas as vacasforam tratadas com 400 UI de eCG e 500 µg de cloprostenol (Estroplan, Syntex), e o DIB foi removido no

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dia 8. Os animais foram divididos aleatoriamente para receberem 1 mg de BE im no dia 9ou 1500 UI de hCG(Ovusyn, Syntex Argentina) no dia 10. Como em outros experimentos, as receptoras não foram submetidasa observação de estro. No dia 17, todas as receptoras foram examinadas por ultra-sonografia e as queapresentavam CL > 12 mm de diâmetro receberam por transferência direta um embrião fresco ou desconge-lado. O diâmetro do CL no dia 17 foi semelhante entre as receptoras tratadas com BE (21,1±0,6 mm) ouhCG (21,3±0,5 mm). Não observou-se efeito do embrião (fresco ou descongelado), da qualidade do em-brião ou do técnico sobre as taxas de prenhez (P>0,4). Além disso, as taxas de prenhez foram semelhantesentre as receptoras tratadas com BE e hCG (Tabela 6; P>0,09). Concluiu-se que os 2 tratamentos avaliadosapresentam eficiência semelhante na sincronização de receptoras Bos taurus x Bos indicus.

Apesar de estudos anteriores terem demostrado a eficiência desse protocolo, os animais são maneja-dos por, no mínimo, 4 vezes durante o tratamento. Dessa forma, um estudo recente foi realizado para tentarsimplificar o protocolo, reduzindo o número de dias ou de injeções durante o tratamento. O primeiro objetivofoi comparar as taxas de prenhez em receptoras tratadas com DIB e 400 UI de eCG no dia 5 (1 dia após aemergência da nova onda de crescimento folicular) ou no dia 8 (momento da retirada do DIB, 61). Osegundo objetivo foi determinar o efeito da P4 injetável, administrada im no momento da inserção do disposi-tivo e da administração de BE, sobre os mesmos parâmetros. Novilhas Bos taurus x Bos indicus foramdivididas homogeneamente em 4 tratamentos em um arranjo fatorial 2 por 2. Todos as novilhas receberamum DIB e 2 mg de BE im no dia 0, com ou sem a administração de 50 mg de P4. As novilhas foram tratadascom 150 µg D (-) cloprostenol im e 400 UI de eCG im no dia 5 ou no dia 8. O DIB foi removido no dia 8 eadministrou-se 1 mg de BE em todos os animais. No dia 17, todas as novilhas foram examinadas por ultra-sonografia para determinação da quantidade de CL e as receptoras com mais de 1 CL ou CL único comdiâmetro ≥ 18 mm foram inovuladas com um embrião produzido in vitro por transferência não cirúrgica pelomesmo veterinário. A proporção de receptoras inovuladas/tratadas (P=0,15) e prenhas/inovuladas (P=0,23)foram semelhantes. No entanto, a taxa de prenhez (receptoras prenhas/tratadas) apresentou tendência (P=0,1)de melhores resultados em novilhas tratadas com eCG no dia 5 que nas tratadas com eCG no dia 8. Nãoverificou-se efeito da P4 injetável em nenhum dos parâmetro avaliados (Tabela 7).

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Um grupo de 154 receptoras foi selecionado e foram colhidas amostras de sangue para determinaçãoda concentração plasmática de progesterona. O tratamento com eCG no dia 5 resultou em maior número deCL (1,4±0,1) e maior concentração plasmática de progesterona (2,4±0,3 ng/ml) no dia 17 (dia da TE) queem novilhas tratadas com eCG no dia 8 (1,1±0,1 CL e 1,7±0,2 ng/ml). Não se verificou efeito da P4injetável em nenhum dos parâmetros avaliados.

Os resultados sugerem que a o tratamento com eCG no dia 5 aumenta o número de CL, a concentra-ção plasmática de progesterona e tende a aumentar a taxa de prenhez em receptoras de embrião bovinosincronizadas com DIB e BE e inovuladas em tempo fixo. Estes resultados foram confirmados em um poste-rior estudo comparando diferentes doses de eCG administradas no dia 5 ou no dia 8. Não se verificou efeitoda dose de eCG (400 UI vs 500 UI vs 600 UI) nas taxa de prenhez. No entanto, como demonstrado naTabela 8, o tratamento com eCG no dia 5 apresentou maiores taxas de prenhez que o tratamento com eCGno dia 8.

Assim como existem diversos estudos relatando satisfatórias taxas de prenhez em receptoras sincroni-zadas com dispositivos de progesterona/progestágeno (42, 44, 58), como os descritos na presente revisão,

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existem relatos de reduzidas taxas de prenhez (41, 75, 82). A razão para essa divergência ainda não é clara,no entanto, relatou-se que a expressão do estro foi maior em animais tratados com progestágenos que emanimais tratados com PGF (82). Pelo menos um estudo em vacas de corte lactantes revelou que aproxima-damente 50% dos animais estavam em anestro; assim o tratamento com estradiol e progesterona podeinduzir o estro e a ovulação em vacas que não tenham um adequado período pós-parto ou inadequadacondição corporal, levando a reduzidas taxas de prenhez (75). Isso pode explicar a diferença entre os gruposcontrole (sem eCG) nos primeiros experimentos discutidos nesse capítulo. Embora tenham sido utilizadosanimais Bos taurus x Bos indicus em ambos os experimentos, é possível que as novilhas do primeiro expe-rimento (6) não apresentassem condição corporal satisfatória como no segundo experimento (78). Essesresultados enfatizam a importância do uso de vacas ou novilhas cíclicas em boa condição corporal comoreceptoras de embriões. De 842 receptoras sincronizadas com estrógeno/progesterona e eCG em um pro-grama comercial de TE, 709 (84,2%) receberam um embrião pelo método não cirúrgico e 392 (46,6%)ficaram gestantes. Considerando que um dos maiores custos em programas de TE é a alimentação dasreceptoras até tornarem-se gestantes (36), um protocolo com 45 a 50% de taxa de prenhez parece seradequado e de satisfatória relação custo/benefício, especialmente considerando que este tratamento tambémelimina a necessidade de detecção do estro. Na figura 2 está descrito o protocolo recomendado.

Figura 2. Protocolo para transferência de embrião em tempo fixo em bovinos. O tratamento consiste nainserção de um dispositivo liberador de progesterona e 2 mg de BE im no dia 0, PGF e 400 UI deeCG no dia 5, remoção do dispositivo no dia 8, e BE no dia 9. Não é efetuada a detecção do estroe a TE é realizada no dia 17.

MANIPULAÇÃO DA ONDA DE CRESCIMENTO FOLICULAR PARA SUPEROVULAÇÃO

O protocolo convencional de superestimulação ovariana no diestro foi baseado originalmente em in-formações empíricas e experimentais nas quais se verificou maior resposta superovulatória quando o trata-mento foi iniciado 8 a12 dias após o estro (revisado em 15). No entanto, nenhum desses estudos anterioresavaliou o status folicular no início dos tratamentos superovulatórios. Isso foi devido, principalmente, àsdificuldades encontradas por muitos grupos de pesquisa de monitorar o desenvolvimento folicular por ultra-sonografia nos estágios iniciais de desenvolvimento por não possuírem o equipamento.

Através das informações geradas pela ultra-sonografia, sabe-se que 8 a 12 dias após o estro (7 a 11

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dias após a ovulação) pode ser, aproximadamente, o dia da emergência da segunda onda de crescimentofolicular em ciclos de 2 ou 3 ondas (34), podendo um grupo de folículos em crescimento estar presente nesseperíodo. No entanto, o dia da emergência da segunda onda de crescimento folicular tem se mostrado dife-rente em ciclos de 2 ou 3 ondas (1 a 2 dias antes em ciclos de 3 ondas), assim como apresenta diferençasindividuais (34). Dessa forma, mostrou-se claramente que a resposta superovulatória foi maior quando otratamento foi iniciado no momento da emergência da onda de crescimento folicular que quando iniciadomais tarde (1,60). O início do tratamento apenas 1 dia após a emergência da onda reduziu significativamentea resposta superovulatória comparada a tratamentos no dia da emergência da onda de crescimento folicular(1,60).

A probabilidade do folículo dominante não ser funcional (fase estática final ou de regressão), baseadana duração das fases de crescimento do folículo dominante durante o ciclo estral é de, aproximadamente,30% (6 de 20 d) para novilhas com duas ondas e de 35% (8 de 23 d) para novilhas com 3 ondas. Ainda,apenas 20% (4 ou 5 d) dos dias do ciclo estral são adequados para o iniciar o tratamento superovulatório nomomento da emergência da onda de crescimento folicular. Assim, 80% do ciclo estral não é apropriado paraobtenção de ótima resposta superovulatória. A necessidade de se esperar até a metade do ciclo estral parainiciar o tratamento superovulatório implica na monitoração do estro e em obrigatório atraso. Para eliminaresses problemas, uma alternativa é iniciar o tratamento superovulatório após o controle exógeno da emer-gência da onda de crescimento folicular.

Um estratégia para controlar a dinâmica folicular é a ablação transvaginal guiada por ultra-sonografiade todos folículos ≥ 5 mm para emergência de uma nova onda de crescimento folicular sincronizada em diaaleatório do ciclo estral, seguida do tratamento com FSH (Folltropin-V, Bioniche Animal Health, Canada) 1dia após a ablação e com PGF 48 h após o início do tratamento com FSH (14, Tabela 9). Foi demonstradoque o momento do estro pôde ser controlado mais precisamente quando foi inserido um dispositivo contendoprogesterona/progetágeno durante a superovulação e quando foram administradas 2 aplicações de PGF nodia da remoção do dispositivo. As novilhas que não foram submetidas à ablação foram tratadas com FSH 8a 12 d após o estro e com PGF 48 h após. Combinando os dois experimentos, não se observou diferença naresposta superovulatória entre os grupos submetidos à ablação e os grupos controle (não submetidos àablação). Em outros experimentos, a ablação transvaginal guiada por ultra-sonografia de todos os folículos(35) ou apenas do folículo dominante (23, 35, 39) dois dias antes da superovulação (no meio do diestro),apresentou maior resposta superovulatória que em doadoras não submetidas à ablação do folículo dominan-te (Tabela 9). Em um estudo retrospectivo de respostas superovulatórias em vacas de leite, a ablação folicularresultou em maior número de estruturas colhidas, mas semelhante número de embriões transferíveis quevacas superovuladas 7 a 13 d após o estro (72; Tabela 9). Em um estudo recente, a ablação dos 2 maioresfolículos em dia aleatório do ciclo estral foi tão eficiente na sincronização da emergência da onda de cresci-mento folicular para superovulação quanto a ablação de todos os folículos ≥ 5 mm, eliminando a necessidadede determinar qual folículo é o dominante (3).

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Outra maneira de sincronizar a emergência da onda de crescimento folicular para superovulação envol-ve o uso de GnRH ou LH suíno (LHp). No entanto, os relatos de dispersão na emergência da onda decrescimento folicular (de 3 dias antes a 5 dias depois do tratamento) sugerem que este método não deve serempregado para a superovulação (54). Apesar da grande distribuição nos dias de emergência da onda decrescimento folicular relatada nesse estudo (54), a nova onda emergiu 3 d após o tratamento em 44 das 54(81%) novilhas. De fato, em um estudo envolvendo 3 diferentes experimentos (31), o tratamento com GnRHou LH apresentou resultados consistentes quanto ao baixo número de embriões colhidos comparados aos dotratamento com 17β estradiol e progesterona ou ablação folicular para a emergência da onda de crescimentofolicular. Desse modo, não recomendamos esta técnica para a sincronização da emergência da onda decrescimento folicular para a superovulação de bovinos.

Nossa técnica preferencial para a sincronização da onda de crescimento folicular para a superovulaçãoenvolve o tratamento com 17β estradiol e P4 im no momento da inserção do dispositivo contendo progesterona/progestágeno, seguido pelo tratamento com FSH 4 dias após (16). Resultados de experimentos (revisadoem 15) e de programas comerciais de superovulação (17,62) têm demonstrado que a resposta superovulatóriade doadoras tratadas com 17β estradiol e P4 em dia aleatório do ciclo estral é semelhante ou melhor quedoadoras superovuladas 8 a 12 d após a detecção do estro (20,62).

O 17β-estradiol não é permitido para o uso comercial em alguns países. Dessa forma, nosso grupo depesquisa investigou a possibilidade do uso de outros ésteres de estrógenos como o BE ou valerato deestradiol. O tratamento com 2,5 mg de BE e 50 mg de P4 no momento da inserção do CIDR-B induziu aemergência de uma nova onda de crescimento folicular sincronizada 3 a 4 dias após o tratamento (24). Asuperovulação iniciada 4 dias após o tratamento com 2,5 mg de BE e 50 mg de P4 resultou em respostassemelhantes àquelas iniciadas 4 dias após o tratamento com 5 mg (25) ou com 2,5 mg (26) de 17β-estradiolassociados a 50 mg de P4 (Figura 3 e Tabela 10) ou àquelas iniciadas 8 a 12 d após o estro (56). Otratamento com 5 mg de valerato de estradiol e 3mg de norgestomet apresentou menor sincronização daemergência da onda de crescimento folicular e menor resposta superovulatória que o tratamento com 5 mgde 17β-estradiol e 100 mg de P4 em vacas com dois implantes SMB (50). No entanto, menores doses devalerato de estradiol têm sido investigadas e doses de 1 ou 2 mg resultaram na emergência da onda folicularapós 3 a 4 dias, com baixa variabilidade (51). Estes resultados sugerem que menores doses podem serusadas na sincronização da emergência da onda de crescimento folicular para a superovulação. Mais estudossão necessários para confirmar esses resultados.

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Figura 3. Protocolo para superovulação de doadoras com benzoato de estradiol (BE) e dispositivo conten-do progesterona. O tratamento consiste na inserção de um dispositivo contendo progesterona e aaplicação de benzoato de estradiol e progesterona im no dia 0. O tratamento superovulatório teminício no dia 4, com duas aplicações diárias de FSH por 4 dias. As doadoras são tratadas comPGF na manhã e na tarde do dia 6 e o dispositivo contendo progesterona é removido no momentoda segunda aplicação de PGF. Os animais são inseminados artificialmente 12 e 24 h após a detecçãodo cio ou 48 e 60 h após a remoção do dispositivo contendo progesterona. Os embriões sãocolhidos no dia 15.

Estes estudos demonstraram que o controle exógeno da emergência da onda folicular oferece a vanta-gem de iniciar o tratamento superovulatório no momento mais adequado (recrutamento folicular), indepen-dentemente do estágio do ciclo estral. O tratamento é prático, simples de executar pelos funcionários dafazenda e, mais importante, não necessita da detecção do estro e da ovulação para aguardar o início dotratamento gonadotrófico 8 a 12 d após. A sincronização da emergência da onda de crescimento folicularpela ablação folicular ou pelo tratamento com estrógeno/progesterona tem apresentado semelhantes respos-tas superovulatórias (3,11,15).

É digno de nota que em estudos envolvendo superovulação no momento da emergência folicular, areposta à aplicação única de FSH não foi diferente da resposta a múltiplas aplicações (14,16). Os níveisbasais de FSH são responsáveis pela prevenção da emergência de uma nova onda folicular (13); a adminis-tração de FSH durante esse período pode levar ao crescimento de pequenos folículos anterior ao dia espe-rado da emergência da nova onda de crescimento folicular (os efeitos da supressão pelo folículo dominantesão diminuídos pelo FSH). Isso pode explicar como maiores doses de FSH exógeno em esquemas

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superovulatórios convencionais podem suprimir o ritmo endógeno e mascarar o efeito da onda na respostaovariana. Se o tratamento superovulatório for administrado por um longo período, o recrutamento folicularserá evidente, independente do estágio de desenvolvimento folicular no momento do tratamento gonadotrófico.No entanto, o recrutamento dessincronizado pode resultar em maior variabilidade na resposta folicular e naqualidade dos embriões colhidos (16,62).

Estudos recentes, principalmente realizados no Brasil, têm sido elaborados para o desenvolvimento deprotocolos de superovulação que possibilitem a IA em tempo fixo em bovinos da raça Nelore (4, 7, 9). Umdos tratamentos usados rotineiramente para superovulação de doadoras com IA em tempo fixo é semelhanteao tratamento descrito anteriormente, exceto pelo fato do dispositivo intravaginal contendo progesterona serremovido na manhã ou tarde do dia 7 (Dia 7 manhã e Dia 7 tarde; Tabela 11; 85). Todas as doadorastambém recebem 25 mg de LHp (Lutropin-V, Bioniche Animal Health) ou uma dose de GnRH na manhã dodia 8 e são submetidas à IATF 12 e 24 h após. Não verificou-se diferença quando o dispositivo de progesteronafoi removido no dia 7 pela manhã ou no dia 7 pela tarde (Tabela 11 e Figura 4) em vacas Nelore.

Figura 4. Protocolo para superovulação com inseminação artificial em tempo fixo em vacas Nelore. O trata-mento consiste na inserção de um dispositivo contendo progesterona e na aplicação de benzoatode estradiol (BE) e progesterona (P4) im no dia 0. Inicia-se o tratamento superovulatório no dia 4,com duas aplicações diárias de FSH por 4 dias. As doadoras são tratadas com PGF na manhã ena tarde do dia 6 e o dispositivo contendo progesterona é removido no momento da última aplica-ção de FSH, na tarde do dia 7. Os animais recebem pLH ou GnRH na manhã do dia 8 e sãoinseminados artificialmente 12 e 24 h após, sem a detecção do cio. Os embriões são colhidos nodia 15.

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Resultados preliminares de um experimento em andamento feito em vacas Holandesas sugerem quesão necessárias, pelo menos, 24 h de intervalo entre a retirada do dispositivo de progesterona/progestágenoe o tratamento com LHp ou GnRH (Rodrigues, comunicação pessoal). Nesse experimento, 40 vacas Holan-desas foram tratadas com 1 ou 2 Crestar associados a 3 mg de BE e 50 mg de P4 im no dia 0, o tratamentocom FSH foi iniciado no dia 4 e a PGF foi administrada na manhã e na tarde do dia 6. O Crestar foi removidona tarde do dia 7 e o GnRH foi administrado na manhã do dia 8 (12 h) ou na tarde do dia 8 (24 h). Nãoverificou-se diferença entre 1 e 2 Crestar. No entanto, o tratamento com GnRH 24 h após a retirada doCrestar resultou em menor número de folículos anovulatórios (1,7±0,3) que quando o GnRH foi administra-do 12 h após a retirada do Crestar (3,5±0,5). Esse resultado não resultou em aumento significativo donúmero de embriões transferíveis, mas os números claramente favorecem o tratamento com GnRH 24 h apósa remoção do Crestar (GnRH 24 h: 4,2±1,3 vs GnRH 12 h: 2,7±0,8). Um maior número de vacas sãonecessárias para se obter conclusões e recomendar o tratamento. Todavia, resultados de estudos atuais noBrasil e na Argentina sugerem que diferentes protocolos podem ser empregados em animais Bos taurus : 1)remoção do dispositivo de progesterona/progestágeno na tarde do dia 6 e observação de estro com IA 12e 24 h após ou 48 e 60 h após a remoção do dispositivo (Figura 3); 2) remoção do dispositivo de progesterona/progestágeno na manhã do dia 7 e administração de GnRH ou LHp na manhã do dia 8 com IA 12 e 24 hapós; ou 3) remoção do dispositivo na tarde do dia 7 e administração de GnRH ou LHp na tarde do dia 8com IA 12 e 24 h após. Provavelmente a colheita dos embriões pode ser realizada a tarde (segunda e naterceira alternativa), para evitar a colheita de mórulas iniciais, que não resistem bem ao processo de conge-lação. Mais experimentos devem ser realizados para determinar o melhor protocolo para IA em tempo fixoem doadoras Bos taurus.

Conclusões

A variabilidade da resposta continua a ser um dos maiores problemas associados aos programas desincronização do estro e superovulação em bovinos. A incorporação de técnicas para o controle da dinâmicadas ondas foliculares, como as discutidas nessa revisão, reduzirá a variabilidade ao tratamento de doadorasem diferentes estágios do ciclo estral. Esquemas de sincronização de estro baseados tanto no controle luteínicoquanto no controle folicular do ciclo estral permitem a IA em tempo fixo e eliminam a necessidade de detecçãode estro em receptoras de embriões. Estudos realizados até o momento ainda não minimizaram adequada-mente a variabilidade da resposta à superovulação, mas protocolos de sincronização da emergência da ondade crescimento folicular oferecem a conveniência de se iniciar os tratamento mais rapidamente e em momentopré determinado, sem a necessidade da detecção do estro e sem comprometimento dos resultados.

Referências

1. Adams GP, Nasser LF, Bo GA, Mapletoft RJ, Garcia A, Del Campo MR. Superstimulatory responseof ovarian follicles of wave 1 versus wave 2 in heifers. Theriogenology 1994; 42: 1103-1113.

2. Ambrose JD, Drost RL, Monson RL, Rutledge JJ, Leibfried-Rutledge ML, Thatcher MJ, Kassa T,

17


Binelli M, Hansen PJ, Chenoweth PJ, Thatcher WW. Efficacy of timed embryo transfer with fresh andfrozen in vitro produced embryos to increase pregnancy rates in heat-stressed dairy cattle. J Dairy Sci1999; 82:2369-2376.

3. Baracaldo MI, Martinez M, Adams GP, Mapletoft RJ. Superovulatory response following transvaginalfollicle ablation in cattle. Theriogenology 2000; 53:1239-1250.

4. Barros CM, Nogueira MFG. Embryo transfer in Bos indicus cattle. Theriogenology 2001; 56: 1483-1496

5. Baruselli PS, Marques MO, Carvalho NAT, Valentim R, Berber RCA, Carvalho Filho AF, MadureiraEH, Costa Neto WP. Ovsynch protocol with fixed-time embryo transfer increasing pregnancy rates inbovine recipients. Arq Fac Vet UFRGS, Porto Alegre, Brazil, 2000; 28 (Suppl): 205 abstr.

6. Baruselli PS, Marques MO, Madureira EH, Costa Neto WP, Grandinetti RR, Bo GA. Increasedpregnancy rates in embryo recipients treated with CIDR-B devices and eCG. Theriogenology 2001;55:157 abstr.

7. Baruselli PS, Marquez MO. Ultimos avances en superovulacion de donantes de razas cebuinas.Resúmenes del IV Seminario Internacional de Reproducción en Grandes Animales. CGR, BiotecnologíaReproductiva E.U. División Capacitación. Bogotá 25 al 27 de septiembre; Medellín 27 y 28 deseptiembre 2003; 116-120.

8. Baruselli PS, Reis EL. Sincronización de receptoras cruza cebú en condiciones tropicales. Resúmenesdel IV Seminario Internacional de Reproducción en Grandes Animales. CGR, BiotecnologíaReproductiva E.U. División Capacitación. Bogotá 25 al 27 de septiembre; Medellín 27 y 28 deseptiembre 2003; 53-62.

9. Baruselli PS, Marquez MO, Reis EL, Nasser LF, Silva RCP, Menegatti JA, Valentin R, Santos ICC.Adequacao da dose de FSH (Folltropin-V) em protocolos de superovulacao de vacas nelore (Bostaurus indicus) com inseminacao artificial em tempo fixo. XVII Reuniao Anual da Sociedade Brasileirade Technologia de Embrioes, Fortaleza; Acta Scientae Veterinarie 2003; 244-245.

10. Beal WB. Streamlining embryo transfer. 18th Annual Convention AETA, Colorado Springs, CO, USA,1999; 78-85.

11. Beal WB. Practical application of ultrasound in bovine embryo transfer. 18th Annual Convention AETA,Colorado Springs, CO, USA, 1999; 66-77.

12. Beal WE, Hinshaw RH. Synchronization of estrus and ovulation in bovine embryo transfer recipients.Proceedings of the Advanced Embryo Transfer Seminar 12. Annual Meeting of the American Asso-ciation of Bovine Practitioners, Vancouver, BC, Canada, 2001.

13. Bergfelt DR, Plata-Madrid H, Ginther OJ. Counteraction of inhibitory effect of follicular fluid byadministration of FSH in heifers. Can J Anim Sci 1994; 74:633-639.

14. Bergfelt DR, Bo GA, Mapletoft RJ, Adams GP. Superovulatory response following ablation-inducedfollicular wave emergence at random stages of the oestrous cycle in cattle. Anim Reprod Sci 1997;49:1-12.

15. Bo GA, Adams GP, Pierson RA, Mapletoft RJ. Exogenous control of follicular wave emergence incattle. Theriogenology 1995; 43:31-40.

16. Bo GA, Adams GP, Pierson RA, Mapletoft RJ. Effect of progestogen plus E-17β treatment on

18


superovulatory response in beef cattle. Theriogenology 1996; 45:897-910.17. Bo GA, Mapletoft RJ. Control del desarrollo folicular y su aplicación en programas de superovulacion

de donantes de embriones. Taurus 1999; 4:14-27.18. Bo GA, Medina M, Tegli JC, Costamagna A, Brogliatti GM. Fixed-time artificial insemination in CIDR-

B treated cows induced to ovulate with estradiol benzoate or GnRH. 14th International Congress onAnimal Reproduction, Stockholm, Sweden, 2000; 2:45 abstr.

19. Bo GA, Tribulo H, Caccia M, Tribulo R. Pregnancy rates in embryo recipients treated with progester-one vaginal devices and transferred without estrus detection. Theriogenology 2001; 55:357 abstr.

20. Bo GA, Baruselli PS, Moreno D, Cutaia L, Caccia M, Tríbulo R, Tríbulo H, Mapletoft RJ. The controlof follicular wave development for self-appointed embryo transfer programs in cattle. Theriogenology2002; 57:53-72.

21. Bó GA, Moreno D, Cutaia L, Caccia M, Tribulo RJ, Tribulo H. Transferencia de embriones a tiempofijo: tratamientos y factores que afectan los índices de preñez. Taurus 2004; 21:25-40 (2004).

22. Broadbent PJ, Stewart M, Dolmal DF. 1991. Recipient management and embryo transfer.Theriogenology; 35:125-140.

23. Bungartz L, Niemann H. Assessment of the presence of a dominant follicle and selection of dairy cowssuitable for superovulation by a single ultrasound examination. J Reprod Fert 1994; 101:583-591.

24. Caccia M, Bo GA. Follicle wave emergence following treatment of CIDR-B implanted beef heiferswith estradiol benzoate and progesterone. Theriogenology 1998; 49:341 abstr.

25. Caccia M, Tribulo R, Tríbulo H, Bo GA. Effect of different estrogen and progesterone treatments onsuperovulatory response in beef (Bos taurus) cattle. Arq Fac Vet UFRGS, Porto Alegre, Brazil, 1998;26 (Suppl): 211 abstr.

26. Caccia M, Tribulo R, Tribulo H. Superovulatory response of beef cows treated with progesteronedevices and estradiol-17β or estradiol benzoate. Theriogenology 2002; 57:762 abstr.

27. Cavalieri J, Fitzpatrick LA. Oestrus detection techniques and insemination strategies in Bos indicusheifers synchronized with norgestomet-oestradiol. Aust Vet J 1995; 72:177-182.

28. Colazo MG, Sefcheck M, Illuminati H, Meglia G, Schmidt EE, Bo GA. Fixed-time artificial insemina-tion in beef cattle using CIDR-B devices, progesterone and estradiol benzoate. Theriogenology 1999;51:404 abstr.

29. Custer EE, Beal WE, Wilson SJ, Meadows AW, Berardinelli JG, Adair R. Effect of melengestrolacetate (MGA) or progesterone-releasing intravaginal device (PRID) on follicular development, con-centrations of estradiol-17β and progesterone, and LH release during an artificially lengthened bovineestrous cycle. J Anim Sci 1994; 72:1282-1289.

30. Cutaia L, Moreno D, Villata ML, Bo GA. Synchrony of ovulation in beef cows treated with progesteronevaginal devices and estradiol benzoate administered at device removal or 24 hours later. Theriogenology2001; 55:244 abstr.

31. Deyo CD, Colazo MG, Martinez MF, Mapletoft RJ. The use of GnRH or LH to synchronize follicularwave emergence for superstimulation in cattle. Theriogenology 2001; 55:513 abstr.

32. Fuentes S. Utilizacion de tratamientos hormonales para la sincronizacion de receptoras de embriones.Producción Animal 2000; 160: 26-32.

19


33. Fuentes S, De la Fuente J. Different synchronization treatments for direct embryo transfer to recipientsheifers. Proc XIII Annual Meeting AETE, Lyon, France, 1997; 148 abstr.

34. Ginther OJ, Knopf L, Kastelic JP. Temporal associations among ovarian events in cattle during oestrouscycles with two and three follicular waves. J Reprod Fert 1989; 87:223-230.

35. Hill BR, Kuehner LF. Follicle aspiration prior to superovulation in cattle. Theriogenology 1996; 43:324abstr.

36. Hinshaw RH. Formulating ET contracts. Annual Meeting Soc for Theriogenology, Nashville, USA,1999; 399-404.

37. Kastelic JP, Ginther OJ. Factors affecting the origin of the ovulatory follicle in heifers with inducedluteolysis. Anim Reprod Sci 1991; 26:13-24.

38. Kastelic JP, McCartney DH, Olson WO, Barth AD, Garcia A, Mapletoft RJ. Estrus synchronization incattle using estradiol, melengestrol acetate and PGF. Theriogenology 1996; 46:1295-1304.

39. Kim HI, Son DS, Yeon H, Choi SH, Park SB, Ryu IS, Suh GH, Lee DW, Lee CS, Lee HJ, Yoon JT.Effect of dominant follicle removal before superstimulation on follicular growth, ovulation and embryoproduction in Holstein cows. Theriogenology 2001; 55:937-945.

40. Kinder JE, Kojima FN, Bergfeld EGM, Wehrman ME, Fike KE. Progestin and estrogen regulation ofpulsatile LH release and development of persistent ovarian follicles in cattle. J Anim Sci 1996; 74:1424-1440.

41. King ME, Odde KG, Lefever DG, Brown LN, Neubauer CJ. Synchronization of estrus of embryotransfer recipients receiving demi-embryos with Syncro-Mate-B or Estrumate. Theriogenology1986; 25:162 abstr.

42. Looney CR, Roberts JW, Jones M, Day ML, Anderson JC, Hafs HD, Forrest DW. Synchrony andconception to insemination or embryo transfer in beef females treated with an intravaginal progester-one-releasing device with or without an injection of estradiol. Theriogenology 1999; 51:266 abstr.

43. McDowell CM, Anderson LG, Kinder JE, Day ML. Duration of treatment with progesterone andregression of persistent ovarian follicles in cattle. J Anim Sci 1998; 76:850-855.

44. McGrath AB, Looney CR, Bluntzer JS, Odeon AJ, Massey JM. Comparison of norgestomet andprostaglandin F

2α (PGF) for estrus synchronization of recipients nursing embryo transfer (ET) calves.

Theriogenology 1985; 23:207 abstr.45. Macmillan KL, Henderson HV. Analyses of the variation in the interval from an injection of prostaglan-

din F2α to estrus as a method of studying patterns of follicle development during diestrous in dairy

cows. Anim Reprod Sci 1984; 6:245-254.46. Macmillan KL, Thatcher WW. Effects of an agonist of gonadotropin-releasing hormone on ovarian

follicles in cattle. Biol Reprod 1991; 45:883-889.47. Macmillan KL, Taufa VK, Hayman DL. Pregnancy rates in lactating dairy cows used as recipients for

frozen/thawed embryos and receiving supplemental progesterone. New Zealand Embryo TransferWorkshop, Hamilton, NZ, 1994; 34-35.

48. Macmillan KL, Burke CR. Effects of oestrus cycle control on reproductive efficiency. Anim ReprodSci 1996; 42:307-320.

49. Mantovani AP, Reis EL, Bó GA, Baruselli PS, Gacek F. Prolonged use of a progesterone-releasing

20


intravaginal device (CIDR®) on the induction of persistent follicles in bovine embryo recipients. 15thInternational Congress on Animal Reproduction, Porto Seguro, Brazil, 2004; abstr.

50. Mapletoft RJ, Martinez MF, Adams GP, Kastelic J, Burnley CA. The effect of estradiol preparation onfollicular wave emergence and superovulatory response in norgestomet-implanted cattle. Theriogenology1999; 51:411 abstr.

51. Mapletoft RJ, Colazo MG, Small JA, Ward DR, Kastelic J P. Effect of dose of estradiol valerate onovarian follicular dynamics in CIDR-treated beef cows. Reprod Fert Dev 2004; 16:130 abstr.

52. Marques MO, Madureira EH, Bo GA, Baruselli PS. Ovarian ultrasonography and plasma progesteroneconcentration in Bos taurus x Bos indicus heifers administered different treatments on Day 7 of theestrous cycle. Theriogenology 2002; 57: 548 abstr.

53. Marques MO, Nasser LF, Silva RCP, Bo GA, Baruselli PS. Increased pregnancy rates in bos taurus xbos indicus embryo recipients with treatments that increase plasma progesterone concentrations.Theriogenology 2003; 59:369 abstr.

54. Martinez MF, Adams GP, Bergfelt D, Kastelic JP, Mapletoft RJ. Effect of LH or GnRH on the domi-nant follicle of the first follicular wave in heifers. Anim Reprod Sci 1999; 57:23-33.

55. Martinez MF, Kastelic JP, Adams GP, Cook RB, Olson WO, Mapletoft RJ. The use of progestins inregimens for fixed-time artificial insemination in beef cattle. Theriogenology 57 2002; 1049-1059.

56. Meyer JA, Wideman DJr, Looney CR, Long CR, Bo GA, Day ML, Anderson JC, Forrest DW.Embryo production rates of cattle superovulated with and without the presence of an intravaginal pro-gesterone-releasing device. Theriogenology 2000; 53: 504 abstr.

57. Moreno D, Cutaia L, Villata ML, Caccia M, Gatti G, Tribulo R, Tribulo H, Bo GA. Effect of the timeof prostaglandin administration on pregnancy rates in embryo recipients treated with progesterone va-ginal devices and transferred without estrus detection. Theriogenology 2002; 57:552 abstr.

58. Moreno D, Cutaia L, Tribulo R, Caccia M, Tribulo H, Chesta P, Villata ML, Bo GA. Fixed-Timeembryo transfer in cows treated with progesterone vaginal devices and induced to ovulate with estradiolbenzoate or hCG. Theriogenology 2003; 59:307 abstr.

59. Moyaert I, Gielen JTh, Coryn M, Vandeplassche M. Estrus synchronization with Syncro-mate-B orprostaglandins in recipients for embryo transfer. Theriogenology 1987; 27:260 abstr.

60. Nasser L, Adams GP, Bo GA, Mapletoft RJ. Ovarian superstimulatory response relative to follicularwave emergence in heifers. Theriogenology 1993; 40:713-724.

61. Nasser LF, Reis EL, Oliveira AM, Bo GA, Baruselli PS. Effect of time of eCG pretreatment on preg-nancy rates in Bos indicus x Bos taurus recipients synchronized with progesterone vaginal devices andtransferred without estrus detection. Reproduction Fertility and Development 2004; 212 abstr.

62. Nigro M, Burry E, Villata ML, Bo GA. Effect of different estrogen and progestogen treatments onsuperovulatory response in beef and dairy cattle. Theriogenology 2002; 57:769 abstr.

63. Momont HW, Seguin BE. Influence of the day of estrous cycle on response to PGF2α products:

Implications for AI programs for dairy cattle. 10th International Congress on Animal Reproduction1984; 3:336.

64. Odde KG. A review of synchronization of estrus in postpartum cattle. J Anim Sci 1990; 68:817-830.

21


65. Pursley JR, Mee MO, Wiltbank MC. Synchronization of ovulation in dairy cows using PGF2α andGnRH. Theriogenology 1995; 44: 915-923.

66. Pursley JR, Kosorok MR, Wiltbank MC. Reproductive management of lactating dairy cows usingsynchronization of ovulation. J Dairy Sci 1997; 80:301-306.

67. Revah I, Butler WR. Prolonged dominance of follicles and reduced viability of bovine oocytes. J ReprodFert 1996; 106:39-47.

68. Roche JF. Synchronization of oestrous in heifers with implants of progesterone. J Reprod Fertil 1974;41:337-334.

69. Roy GL, Twagiramungu H. A fixed time AI program using the GnRH-PGF-GnRH method for beeffemales. J Anim Sci 1996; 74 (Suppl 1):462.

70. Savio JD, Thatcher WW, Morris GR, Entwistle K, Drost M, Mattiacci MR. Effects of induction of lowplasma progesterone concentrations with a progesterone-releasing intravaginal device on follicular turno-ver and fertility in cattle. J Reprod Fert 1993; 98:77-84.

71. Seguin B. Ovsynch: A method for breeding dairy cows without doing heat detection. The BovinePractitioner 1997; 31:11-14.

72. Shaw DW, Good TE. Recovery rates and embryo quality following dominant follicle ablation in su-perovulated cattle. Theriogenology 2000; 53;1521-1528.

73. Stock AE, Fortune JE. Ovarian follicular dominance in cattle: Relationship between prolonged growthof the ovulatory follicle and endocrine parameters. Endocrinology 1993; 132:1108-1114.

74. Thatcher WW, Moreira F, Santos JEP, Mattos RC, Lopez FL, Pancarci SM, Risco CA. Effects ofhormonal treatments on reproductive performance and embryo production. Theriogenology 2001; 55:75-90.

75. Tribulo H, Bo GA, Kastelic JP, Pawlyshyn V, Barth AD, Mapletoft RJ. Estrus synchronization in cattlewith estradiol-17β and CIDR-B vaginal devices. Theriogenology 1995; 43:340 abstr.

76. Tribulo R, Nigro M, Burry E, Caccia M, Tribulo H, Bo GA. Pregnancy rates in recipients receivingCIDR-B devices immediately following embryo transfer. Theriogenology 1997; 47:372 abstr.

77. Tribulo H, Bo GA, Gatti G, Tegli JC, Cutaia L, Moreno D, Brito M, Tribulo R. Pregnancy rates inembryo recipients treated with estradiol benzoate and CIDR-B vaginal devices to eliminate the need forestrus detection. 14th International Congress on Animal Reproduction, Stockholm, Sweden, 2000;2:115 abstr.

78. Tribulo H, Moreno D, Cutaia L, Gatti G, Tríbulo R, Caccia M, Bó GA. Pregnancy rates in embryorecipients treated with progesterone vaginal devices and eCG and transferred without estrus detection.Theriogenology 2002; 57:563 abstr.

79. Thibier M. More than half a million bovine embryos transferrred in 2002. Embryo Transfer Newsletter,IETS, December 2003; 12-19.

80. Twagiramungu H; Guilbault LA, Dufour JJ. Synchronization of ovarian follicular waves with agonadotropin-releasing hormone agonist to increase the precision of estrus in cattle: A review. J AnimSci 1995; 73: 3141-3151.

81. Wehrman ME, Fike KE, Melvin EJ, Kojima FN, Kinder JE. Development of a persistent ovarianfollicle and associated elevated concentrations of 17β-estradiol preceding ovulation does not alter the

22


pregnancy rate after embryo transfer in cattle. Theriogenology 1997; 47:1413-1421.82. Wenkoff MS. The management of drug-induced manipulation of the estrous cycle in normal cows and

heifers. Can Vet J 1987; 28:366-373.83. Wiltbank JN, Zimmerman DR, Ingalls JE, Rowden WW. Use of progestational compounds alone or in

combination with estrogen for synchronization of estrus. J Anim Sci 1965; 24: 990-994.84. Zanenga CA, Pedroso MS, Lima GS, Santos ICC. Embryo transfer without estrus observation. Arq

Fac Vet UFRGS, Porto Alegre, Brazil, 2000; 28(Suppl): 337 abstr.85. Zanenga CA, Marquez MO, Santos ICC, Valentin R, Baruselli PS. Comparacao entre dois protocolos

de superovulacao com inseminacao artificial em tempo fixo en vacas Nelore. XVII Reuniao Anual daSociedade Brasileira de Technologia de Embrioes, Fortaleza; Acta Scientae Veterinarie 2003; 626-627.

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AVANÇOS EM TRATAMENTOS HORMONAIS PARA A INSEMINAÇÃO ARTIFICIALCOM TEMPO FIXO (IATF) EM BOVINOS DE CORTE

Ciro Moraes Barros e Ronaldo Luiz Ereno

Departamento de Farmacologia, Instituto de Biociências, UNESP,Botucatu , São Paulo. [email protected]

RESUMO

A inseminação artificial (IA) é uma biotecnologia fundamental para o melhoramento genético do rebanhobovino. Entretanto, a detecção do cio, a qual requer tempo e pessoal adequadamente treinado, continua aser um dos principais fatores limitantes para a ampla utilização da IA.

Nesta última década, a melhor compreensão da fisiologia do crescimento folicular ovariano permitiu odesenvolvimento de tratamentos hormonais capazes de controlar o momento da ovulação e desta formapossibilitou a utilização da inseminação artificial com tempo fixo (ou seja, IA com tempo pré-determinado,sem a necessidade de observação do cio). Na América do Sul, principalmente no Brasil e Argentina, adisponibilidade comercial de diversos hormônios esteróides e protéicos, tem permitido o desenvolvimento deinúmeros protocolos hormonais visando a IATF. Nesta mini-revisão será dada ênfase a tratamentos hormonaisutilizados para a IATF de bovinos de corte, sobretudo vacas em anestro pós-parto.

INTRODUÇÃO

Os animais de raças zebuínas (sub-espécie Bos taurus indicus, Meirelles et al., 1999) constituem amaior parte do rebanho bovino de corte em regiões de clima tropical, devido a sua maior adaptação aosclimas quentes, maior tolerância ao estresse térmico e resistência aos parasitos, em relação aos animais deraças européias (sub-espécie Bos taurus taurus). No Brasil, entre as raças de corte, a Nelore é a que possuio maior contingente numérico (100 milhões do total de 176 milhões de cabeças), sendo considerada oalicerce da cadeia produtiva pecuária (ANUALPEC, 2002)

Há grande expectativa de crescimento da pecuária de corte no Brasil, não só pelo aumento do mercadonacional, mas também pela inserção de nosso País no mercado mundial da carne bovina. No entanto, éfundamental que se elevem os índices de produção e a eficiência reprodutiva do rebanho, para garantir maiorretorno econômico aos produtores.

A inseminação artificial pode trazer benefícios econômicos, a curto prazo, para a grande maioria dospecuaristas. Entretanto, a carência de pessoal treinado e deficiências básicas de manejo nas propriedadestêm limitado uma utilização mais ampla. Um dos principais fatores que determinam o sucesso de um programade inseminação artificial (IA) é a detecção do cio, a qual requer tempo e pessoal adequadamente treinado.

Barros C.M. & Ereno, R.L. 2004. Avanços em tratamentos hormonais para a inseminação artificial com tempo fixo (IATF) embovinos de corte. Acta Scientiae Veterinariae, 32 (Supl ): 23-34.

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Em fêmeas zebuínas, a curta duração do estro (cerca de 11 horas) dificulta a detecção do mesmo e prejudicaa implantação de programas convencionais de IA (Barros et al., 1995, Pinheiro et al., 1998, Misuta, 2003).

A partir do conhecimento detalhado da dinâmica folicular (Pierson & Ginther, 1988; Savio et al.,1988; Sirois & Fortune, 1988) tornou-se possível o desenvolvimento de tratamentos hormonais capazes deregular o crescimento folicular e o momento da ovulação, de forma a viabilizar a inseminação artificial comtempo fixo (IATF, ou seja, IA com tempo pré-determinado, sem a necessidade de observar cio) em taurinos(Twagiramungu et al., 1992a,b; Thatcher et al., 1993; Pursley et al., 1994) e zebuínos (Barros et al., 1998,2000; Fernandes et al., 2001).

O aperfeiçoamento e aplicação da IATF poderá incrementar a utilização da inseminação artificial e datransferência de embriões e, conseqüentemente, contribuir para o melhoramento genético, eficiência reprodutivae produtividade do rebanho nacional.

Nesta mini-revisão será dada ênfase a tratamentos hormonais utilizados para a IATF de bovinos decorte, sobretudo vacas em anestro pós-parto.

CICLO ESTRAL

O período entre dois estros consecutivos é denominado de ciclo estral e pode ser dividido em duasfases principais: folicular e luteal. A fase folicular tem início após a luteólise induzida pela prostaglandina F2α(PGF2α), com conseqüente queda nos níveis sangüíneos de progesterona (< 1 ng/ml) entre 12 e 36 horasapós o início da luteólise, seja ela natural ou induzida por PGF2α exógena (Dieleman et al.,1986). O incrementona freqüência de pulsos de LH estimula o desenvolvimento do folículo dominante que secreta quantidadescrescentes de estradiol induzindo o comportamento estral ou cio (Mukasa-Mugerwa, 1989).

O cio é caracterizado pelo desejo sexual, onde a fêmea permite ser montada (Blockey, 1980; Esslemontet al., 1980). A simples observação diária do comportamento sexual de vacas e novilhas permite a identificaçãodo cio, entretanto, a freqüência (2 a 4 vezes ao dia) e o tempo (15 a 60 minutos) dispendido nesta observaçãoinfluenciam na acurácia da detecção do cio (Vaca et al., 1985).

Nas raças européias (Bos taurus taurus ) o cio dura cerca de 16 a 18 horas e a ovulação ocorre, emmédia, entre 28 e 30 horas após o início do cio (Escobedo et al.,1989; Galina & Arthur, 1990), ou seja,entre 10 e 12 horas após o final do cio (Hansel & Echternkamp, 1972; Wishart, 1972; Hunter & Wilmut,1984). Por outro lado, em zebuínos, a receptividade sexual é, em média, de apenas 11 horas (Mukasa-Mugerwa, 1989; Galina & Arthur, 1990; Pinheiro et al., 1998) podendo variar de 1,3 a 20 horas (Mukasa-Mugerwa, 1989; Galina & Arthur, 1990). Pinheiro et al. (1998), utilizando a técnica de ultra-sonografia,verificaram que o intervalo entre o início do cio e a ovulação era de 26,6 ± 0,44 horas e a duração do cio deaproximadamente 11 horas em vacas Nelore, com estro natural ou induzido por tratamentos hormonais.Estes resultados foram confirmados por Misuta (2003) utilizando o sistema Heat-Watch para detectar oestro e a ultra-sonografia para observar a ovulação.

As quantidades crescentes de estradiol secretadas pelos folículos ovarianos induzem o estro e, atravésde retroalimentação positiva no hipotálamo/hipófise, um pico de LH, o qual induz a ovulação e a formação docorpo lúteo (CL). A presença do CL caracteriza a fase lútea do ciclo estral. Nesta fase, o CL produzprogesterona em quantidades crescentes do 4° ao 10° dia do ciclo estral, e a secreção se mantém estável até

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que ocorra a luteólise, entre o 15° e o 20° dia (Hafez, 1993).

Sincronização do estro

A partir da comprovação dos efeitos luteolíticos da PGF2α em bovinos por Rowson et al. (1972),vários análogos sintéticos desta luteolisina foram comercializados e amplamente utilizados para controlar ociclo estral (revisto por Odde, 1990).

A PGF2α pode ser utilizada em dose única, porém requer identificação prévia da presença do corpolúteo. A fim de evitar a fase inicial do ciclo estral, duas doses de PGF2α podem ser administradas comintervalo de 11 a 14 dias, obtendo-se assim melhores taxas de manifestação de cio após a segunda dose(Lauderdale et al., 1981; Odde, 1990; Chenault, 1992). Uma das limitações da utilização da PGF2α é abaixa taxa de sincronização na indução do cio. O tempo entre a aplicação da PGF2α e a manifestação doestro em bovinos varia de acordo com o estágio de desenvolvimento folicular no momento da administraçãoda PGF2α (Savio et al.,1990; Kastelic et al., 1990; Wiltbank et al., 1996). Por exemplo, o uso de PGF2αna presença de um folículo dominante em fase de crescimento permite rápida maturação e ovulação domesmo, enquanto que a administração de PGF2α no início da fase de atresia do folículo dominante, necessitaráde aproximadamente 4 a 6 dias para que um novo folículo dominante se desenvolva o suficiente para induziro estro.

Sincronização da ovulação

Protocolo “ovsynch” e similares

No final de década de oitenta, quando o advento da ultra-sonografia permitiu a caracterização dodesenvolvimento folicular bovino, Thatcher et al., (1989) e Macmillan & Thatcher (1991), utilizaram umanálogo do GnRH para alterar a dinâmica folicular e forneceram a base para o desenvolvimento de um novosistema de sincronização do estro.

Quando administrado em estágios aleatórios do ciclo estral, o GnRH causa ovulação do folículodominante e induz a emergência de uma nova onda de crescimento folicular dentro de 2 a 3 dias após otratamento (Thatcher et al., 1989; Guilbault et al., 1990, Macmillan & Thatcher, 1991; Twagiramungu et al.,1994; Pursley et al., 1995). Assim, 6 a 7 dias mais tarde, a maioria dos animais estarão em estágio dedesenvolvimento folicular similar no momento da administração de PGF2α e, conseqüentemente, haverámelhor sincronização do estro (Twagiramungu et al., 1992a,b; Thatcher et al., 1993, Wiltbank e al., 1996).

A administração de uma segunda dose de GnRH 1 a 2 dias após a PGF2α sincroniza o momento daovulação e os animais, tanto de raças européias (Pursley et al., 1995; Twagiramungu et al., 1995; Burke etal., 1996) quanto de zebuínas ( Barros et. al, 1998; Barros et al., 2000; Fernandes et al., 2001), podem serinseminadas com horário predeterminado. O GnRH injetado 24 ou 48 horas após a PGF2α concentra asovulações dentro de um período de 8 a 12 horas o que permite a realização da IA com tempo fixo 16 a 24horas após a segunda dose de GnRH (Pursley et al., 1994, 1995, 1997ab; Wiltbank et al., 1996; Burke etal., 1996, Barros et al., 2000; Fernandes et al., 2001). Esta seqüência de tratamentos hormonais (GnRH-

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PGF-GnRH), que permite a inseminação artificial em tempo fixo, passou a ser conhecida como protocolo“ovsynch”. Para simplificar nesta revisão será adotada a sigla GPG no lugar de GnRH-PGF-GnRH.

Uma forma de diminuir o custo do protocolo GPG é substituir a segunda dose de GnRH por benzoatode estradiol (BE, 1,0 mg para vacas e 0,75 mg para novilhas; via IM, Protocolo GPE). Neste caso, após aluteólise induzida pela PGF2α, o BE, por meio de retroalimentação positiva no hipotálamo/hipófise, induz opico pré-ovulatório de LH cerca de 40 a 44 h após sua administração, ou seja, cerca de 10 a 12 horas maistarde do que quando se utiliza GnRH (Barros et al., 2000). Portanto, os animais devem ser inseminados, semobservação de cio, 30 a 36 horas após a aplicação de BE. O protocolo GPE foi eficiente em sincronizar aovualação de vacas Nelore ciclando, resultando em taxas de prenhez de 40 a 45% após uma única inseminaçãocom tempo fixo (Barros et al., 2000; Fernandes et al., 2001). Entretanto, quando os protocolos GPG ouGPE foram testados em vacas em anestro, as taxas de prenhes após a IATF foram bem mais baixas: 14,9%no grupo GPG (n = 67) e 19,1% no GPE (n = 68). Portanto, estes tratamentos não foram efetivos em animaisem anestro e devem ser utilizados somente em vacas que estão ciclando (Fernandes et al., 2001). Alémdisso, as taxas de prenhez em novilhas (entre 21 e 43%) geralmente são menores do que as observadas emvacas (de 41 a 48%) após a utilização destes protocolos (McGowan, 1999, Fernandes al., 2001; Williamset al., 2002).

Existem outras variações do protocolo “ovsynch” (GPG) que tem sido utilizadas principalmente emgado de leite. O protocolo denominado pré-synch, é o ovsynch precedido por duas aplicações de PGF2α(realizadas em um intervalo de 11 a 14 dias), com o objetivo de iniciar-se o tratamento GPG durante umafase do crescimento folicular mais responsiva ao pico de LH, induzido pela primeira aplicação de GnRH.Apesar de apresentar resultados um pouco melhores do que os observados após o protocolo GPG, o pré-synch também só é efetivo quando aplicando em animais ciclando.

A remoção temporária de bezerros (RTB) realizada antes da primeira aplicação de GnRH e/ou após aadministração de PGF2α, induz aumento na pulsatilidade de LH (Edwards, 1985), e pode melhorar a repostade vacas em anestro ao tratamento GPG (Geary et al., 2001) ou GPE (Vilela et al., 1999, 2001).

Progesterona/progestágenos associados a estrógenos

A ação da progesterona na sincronização do ciclo estral em bovinos tem sido relatada há décadas(Lamond, 1964; Gordon, 1976). Os animais recebiam doses diárias de progesterona por períodos de até20 dias. Estes tratamentos resultavam em altas taxas de sincronização do estro, no entanto apresentavambaixa fertilidade, além de serem pouco práticos (Macmillan e Peterson, 1993). Com o passar do tempoforam desenvolvidos métodos mais práticos de administração de progesterona.

Existem atualmente no mercado brasileiro produtos (Crestar e Syncro-Mate-B) que são implantadosnas orelhas (via subcutânea), com a finalidade de manter níveis sangüíneos elevados de um progestágeno(norgestomet) e, desta forma, diminuir a liberação endógena do hormônio luteinizante, simulando a fase lúteado ciclo estral. A regressão do CL é alcançada pela aplicação de valerato de estradiol no início do tratamentoou pela administração de PGF2α no momento da remoção do implante. O implante hidrônico de Syncro-Mate-B contém 6 mg de norgestomet, enquanto que o implante silástico de Crestar apenas 3 mg. Segundo

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Kesler et al. (1995), o implante de silicone provoca a liberação do progestágeno de forma mais homogêneae linear, enquanto que o implante hidrônico libera norgestomet em quantidades mais altas nos primeiros doisdias, diminuindo nos dias subsequentes.

Tem sido demonstrado que a utilização de implantes de norgestomet, induz o estro em mais de 90%dos animais, porém as taxas de concepção variam de 33 a 68% (Odde et al., 1990). Cavalieri et al. (1997)verificaram que o tratamento com gonadotrofina coriônica equina (eCG) promove maior sincronização dopico de LH e da ovulação em vacas tratadas com implantes de norgestomet. Os autores sugerem que autilização de eCG pode melhorar a eficiência de tratamentos de sincronização da ovulação para inseminaçãoartificial com tempo fixo.

Em uma série de artigos, Bó e colaboradores demonstraram que a associação de estrógenos adispositivos que liberam progesterona promove atresia do folículo dominante e induz a emergência de umanova onda de crescimento folicular cerca de 4 dias após a aplicação destes esteróides (revisto por Bó et al.,1995, 2003). Esta possibilidade de sincronizar a onda de crescimento folicular por meio do uso concomitantede progesterona e estrógenos possibilitou o desenvolvimento de vários protocolos hormonais, especialmenteúteis para realização de IATF em animais que se encontram em anestro e, portanto, não respondem bem aoprotocolo “ovsynch” e similares.

Nos últimos anos tornaram-se disponíveis no Brasil vários dispositivos intravaginais que liberamprogesterona (CIDR®, DIB®, PRID®, Cronipress® e algumas Esponjas). O uso destes dispositivos intravaginaisliberadores de progesterona (P4) associados à administração de BE é um dos tratamentos mais utilizadospara a IATF de bovinos (Macmillan & Burke, 1996; Bó et al., 2002, 2003). O tratamento mais popularconsiste na administração de benzoato de estradiol (BE; 2,0 mg, via IM) no momento da inserção do dispositivo(Dia 0), aplicação de PGF2α quando o dispositivo intravaginal for removido (Dia 8) e 1,0 mg de BE (viaIM) 24 h mais tarde. A IATF é realizada 30-36 h após a ultima administração de BE. Portanto, nesteprotocolo são utilizados os seguintes hormônios: progesterona-estrógeno-prostaglandina-estrógeno (protocoloPEPE, veja Figura 1).

Figura 1. Associação de progesterone (P4) e benzoato de estradiol (BE) para inseminação artificial comtempo fixo (IATF, protocolo PEPE).

O protocolo PEPE tem sofrido modificações na tentativa de melhorar ainda mais o crescimento foliculare a sincronização da ovulação. Trabalhos recentes sugerem que no protocolo PEPE, logo após a aplicaçãode PGF2α a administração de eCG (400 UI, via IM, protocolo PEPE/eCG) tende a aumentar a taxa deprenhez de vacas em anestro pós-parto (Baruselli et al., 2003; Cutaia et al., 2003).

Um recurso interessante a ser utilizado em vacas no anestro pós-parto é a remoção temporária debezerros (RTB = 54 horas), realizada entre a aplicação de PGF2α e a IATF (protocolo RTB/PEPE).Barreiros et al. (2003) testaram, num experimento realizado em duas fazendas, se a RTB seria capaz demelhorar o protocolo PEPE. Na primeira fazenda, a RTB (Grupo RBR/PEPE) não melhorou as taxas de

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prenhez quando comparada ao Grupo PEPE (45/84; 53,6% vs 44/87; 50,6%), entretanto, na segundafazenda a RTB aumentou significativamente a taxa de prenhez (48/71; 67,6% vs 35/77; 45,6%, p<0,05).Estes resultados indicam que a RTB pode ter efeitos benéficos quando associada ao protocolo PEPE. Noentanto, novos experimentos devem ser realizados para confirmar esta possibilidade.

Associação da RTB ao protocolo GPE/eCG

Um dos maiores obstáculos ao uso do protocolo GPE em bovinos de corte é sua ineficácia em animaisem anestro. Acredita-se que após o parto as vacas necessitam de um primeiro contato com a progesterona(“priming”) para que se desenvolva um corpo lúteo com vida funcional normal (Hunter, 1991; Garverick etal., 1992; Yavas & Walton, 2000). Tanto é que na primeira ovulação pós-parto (isto é, sem o “priming” deprogesterona) geralmente se forma um corpo lúteo com vida curta, devido a liberação prematura de PGF2αpelo endométrio uterino ( Peter et al., 1989; Stagg et al., 1998; Yavas & Walton, 2000).

Mais recentemente, Mann et al. (2000) propuseram que a vida curta do primeiro CL pós-parto estarelacionada ao fato do folículo dominante não se desenvolver o suficiente para produzir elevadas concentraçõesde estradiol, que seriam responsáveis pela diminuição (“down regulation”) dos receptores do próprio estradiolno endométrio uterino. Se houver disponibilidade de receptores no endométrio uterino, a interação do estradiolcom os mesmos desencadeará eventos que resultarão na síntese de PGF2α no endométrio uterino e liseprematura do corpo lúteo.

Levando-se em consideração a hipótese levantada por Mann et al. (2000), o protocolo GPE foimodificado com o objetivo de se induzir, em vacas de corte com 40 a 70 dias pós-parto, a formação de umfolículo dominante capaz de produzir quantidades suficientes de estradiol para promover “down regulation”dos receptores para estradiol, de forma a evitar a liberação prematura de PGF2α. Neste novo protocolo(RTB/GPE/eCG) o tratamento GPE é precedido pela RTB durante 48 horas, a fim de diminuir o efeitoinibitório da amamentação e presença do bezerro na liberação das gonadotrofinas. Além disso, é feita aplicaçãode eCG, logo após a administração de PGF2α, para acelerar o crescimento e maturação folicular. Vinte equatro horas mais tarde é administrado BE para induzir pico pré-ovulatório de LH e ovulação (veja Figura2). É de se esperar que o BE tenha um efeito aditivo com o estradiol endógeno, produzido sobretudo pelofolículo dominante, para diminuir (“down regulation”) os receptores endometriais de estradiol e,consequentemente, evitar a lise prematura do corpo lúteo.

No protocolo RTB/GPE/eCG, mesmo que a administração de GnRH não promova ovulação e formaçãode CL (“priming” de progesterona), de acordo com a teoria proposta por Mann et al. (2000), os níveis deestradiol provocados por este tratamento, deverão ser suficientes para evitar a lise prematura do CL emanter a gestação resultante da IATF.

Resultados preliminares indicam que a remoção temporária de bezerro pode ser benéfica ao protocoloGPE/eCG. Souza et al. (2004) reportaram que vacas (40 a 70 dias pós-parto), cujos bezerros foram removidospor 48 h antes do tratamento GPE/eCG, apresentaram aumento na taxa de prenhez, quando comparadas asdo grupo GPE/eCG sem RTB (34/66; 51,2%, vs 21/74; 28,4%, respectivamente, p<0,05), tanto em animais“ciclando” (17/31; 54,8% vs 11/33; 33,3%,) como em anestro (17/35; 48,5%, vs 10/41; 24,3%, a “ciclicidade”dos animais foi determinada pela presença de CL, antes do início dos tratamentos).

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Figura 2. Associação da remoção temporária de bezerro (RTB) e aplicação de eCG ao tratamento GPE,para a inseminação artificial com tempo fixo (IATF) de vacas em anestro pós-parto (protocoloRTB/GPE/eCG).

Na tentativa de corroborar a hipótese discutida acima, será testado, em vacas de corte em anestro, seo tratamento RTB/GPE/eCG reduz a liberação de PGFM (metabólito da PGF2α), induzida pelo desafiocom ocitocina, e mantém um CL funcional durante as primeiras semanas após a IATF. Novos experimentosse encontram em andamento para confirmar ou não o efeito benéfico da RTB no protocolo GPE/eCG.

CONCLUSÃO

Existem vários protocolos hormonais que possibilitam a utilização da inseminação com tempo fixo em bovinosde corte, alguns necessitam que os animais estejam “ciclando” para serem efetivos (“Ovsynch” e similares) eoutros tem apresentado taxas de prenhez aceitáveis, mesmo em vacas em anestro pós-parto (PEPE associadoou não ao eCG ou RTB). A escolha do tratamento mais apropriado dependerá da relação custo/benefíciopara cada situação relacionada ao manejo da fazenda e a condição reprodutiva dos animais. À medida queo conhecimento sobre a fisio-farmacologia da reprodução dos bovinos avança, aumentam as possibilidadesde se desenvolverem tratamentos para IATF cada vez mais baratos e efetivos.

Agradecimentos

Agradecemos aos pós-graduandos Marcelo Pegorer, Alfredo F. Souza e Vinicius G. Pinheiro, porterem contribuído para a realização dos experimentos mais recentes com IATF. Agradecemos também aFAPESP pelo auxílio financeiro e a CAPES, CNPq e FAPESP pelas bolsas de estudo e a Syntex (Argentina)e Tecnopec (Brasil) pelos hormônios utilizados em alguns dos experimentos.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ANUALPEC 2002: Anuário da Pecuária Brasileira. São Paulo: FNP Consultoria e Comércio/Argos,400p., 2002.

BARREIROS, T.R.R., SENEDA, M.M., BALARIN, O.F., REIS, E.L., BARUSSELI, P.S., PEGORER,M., ERENO, R.L., BARROS, C.M. Effect of temporary calf removal on synchronization of ovulation forfixed timed artificial insemination. Acta Scientiae Veterinariae, v.31, p.238-239, 2003.

BARROS, C.M.; FIGUEIREDO, R.A.; PINHEIRO, O.L. Estro, ovulação e dinâmica folicular em zebuínos.

30


Rev. Bras. Reprod. Anim., v.19, p.9-22, 1995.

BARROS, C.M., MOREIRA, M.B.P., FERNANDES,P. Manipulação farmacológica do ciclo estral paramelhorar programas de inseminação artificial ou de transferência de embriões. Arq. Fac.Vet. UFRGS,Supl.26, p.179-89, 1998.

BARROS, C.M.; MOREIRA, M.B.P.; FIGUEIREDO, A.R.; TEIXEIRA, A.B.; LA TRINCA.Synchronization of ovulation in beef cows (Bos indicus) using GnRH, PGF2α and estradiol benzoate.Theriogenology, v.53, p.1121-1134, 2000.

BARUSELLI, P.S., MARQUES, M.O., NASSER, L.F., REIS, E.L., BÓ, G.A. Effect of eCG on pregnancyrates of lactating zebu beef cows treated with CIDR-B devices for timed artificial insemination. Theriogenology,v.59, p.214 (abstract), 2003.

BLOKEY, M.A. Sheep and cattle mating behavior. Vet. Rural. Sci., v.4, p.53-62, 1980.

BO, G.A.; ADAMS, G.P.; CACCIA, M.; MARTINEZ, M.; PIERSON, R.A.; MAPLETOFT, R.J. Ovarianfollicular wave emergence after treatment with progestogen and estradiol in cattle. Anim. Reprod. Sci. V39,p.193-204, 1995.

BO, G.A., BARUSELLI, P.S., MORENO, D., CUTAIA, L., CACCIA, M., TRÍBULO, R., TRÍBULO,H., MAPLETOFT, R.J. The control of follicular wave development for self-appointed embryo transfer programsin cattle. Theriogenology.v.57, p.53-72, 2002.

BÓ, G.A.; BARUSELLI, P.S.; MARTINEZ, M.F. Pattern and manipulation of follicular development in BosIndicus cattle. Animal Reproduction Science. V.78, p.307-326, 2003.

BURKE, J.M.; DE LA SOTA, R.L.; RISCO, C.A.; STAPLES, C.R.; SCHIMITT, E.J.P.; THATCHER,W.W. Evaluation of timed insemination using a gonadotropin-releasing hormone agonist in lactating dairycows. J. Anim. Sci., v.79, p.1385-93, 1996.

CAVALIERI, J.; RUBIO, L.; KINDER, J.E.; ENTWISTLE, K.W.; FITSPATRICK, L.A. Synchronizationof estrus and ovulation and associated endocrine changes in Bos indicus cows. Theriogenology, v.47,p.801-814, 1997.

CHENAULT, J.R. Pharnaceutical control of estrous cycles. In: LARGE DAIRY HERD MANAGEMENT.H.H. Van Horn and C.J. Wilcox, An. Dairy Sci. Assoc., Savoy, I.L., p153, 1992.

CUTAIA, L., TRÍBULO, R., MORENO, D., BÓ, G.A. Pregnancy rates in lactating beef cows treated withprogesterone releasing devices, estradiol benzoate and equine chorionic gonadotropin (eCG).Theriogenology, v.59, p.216 (abstract), 2003.

DIELEMAN, S. J., BEVERS, M. M, VAN TOL, H. T. M., WILLEMSW, A H. Peripheral plasmaconcentrations of estradiol, progesterone, cortisol, LH and prolactin during the estrous cycle in the cow,with emphasis on the peri-oestrus period. Anim. Reprod. Sci., v.10, p.275-92, 1986.

EDWARDS, S. The effect of short term calf removal on pulsatile LH secretion in the postpartum beef cow.Theriogenology, v.23, p.777-785, 1985.

31


ESCOBEDO, F.; ENCISO, A.; GOMEZ, G.; SISNEROS, E.; COPUY, A.; CALLEGOS, J.; KINDER,J.E.; GARCIA-WINDER, M. Norgestomet induces estrous but not ovulation in prepupertal Bos Taurus XBos indicus. J. Anim. Sci., v,67, p.410-, 1989.

ESSLEMONT, R.J.; GLENCROSS, R.G.; BRYANT, M.J.; POPE, G.S. A quantitative study of pre-ovulatorybehavior in cattle (British Friesian heifers). Appl. Anim. Ethol., v.6, p.1-17, 1980.

FERNANDES, P.; TEIXEIRA, A.B.; CROCCI, A.J.; BARROS, C.M. Timed artificial insemination in beefcattle using GnRH agonist, PGF2α and estradiol benzoate (EB).Theriogenology, v.55, p.1521-1532, 2001.

GALINA, C.S.; ARTHUR, G.H.; Review on cattle reproduction in the tropics. Part4. Oestrus cycles. Anim.Breed. Abst., v.58, p.697-707, 1990.

GARVERICK, H.A., ZOLLERS, W.G., SMITH, M.F. Mechanisms associated with corpus luteum lifespanin animals having normal or subnormal luteal function. Anim. Reprod. Sci., v.28, p.111-124, 1992.

GEARY, T.W.; WHITTIER, J.C.; HALLFORD, D.M.; MACNEIL, M.D. Calf removal improves conceptionrates to the Ovsynch and Co-Synch protocols. J Anim .Sci. v.79, p.1-4, 2001.

GORDON, I. Controlled breeding in cattle. Part.1. Hormones in the regulation, oestral control, and set-timeartificial insemination. Anim. Breed. Abst., v.44, p.265-75, 1976.

GUILBAULT, L.A.; LUSSIER, J.G.; GRASSO, F.; MATTON, P. Influence of a GnRH analogue on folliculardynamics in cow pretreated or not with FSH-P. Theriogenology, v.33, p.240, 1990.

HAFEZ, E.S.E. Reproduction in farm animal. 6 ed. Philadelphia, Lea & Febiger, 585p. 1993

HANSEL, W.; ECHTERNKAMP, S.E. Control of ovarian functions in domestic animals. Am. Zool. V.12,p.225-43, 1972.

HUNTER, R.H.F.; WILMUT, I. Sperm transport in the cow: peri-ovulatory redistribuition of viable cellswithin the oviduct. Reprod. Nutr. Dev., v.24, p.597-608, 1984.

HUNTER, M.G. Characteristics and causes of the inadequate corpus luteum. J. Reprod. Fertil., v.43,p.91-99, 1991.

KASTELIC, J.P., KNOPF, L., GINTHER, O.J. Effect of day of prostaglandin F2α treatment onselection and development of the ovulatory follicle in heifers. Anim. Reprod. Sci., v.23., p.169- 80, 1990.

KESLER, D.J.; FAVERO, R.J.; TROXEL, T.R. Comparasion of hydron and silicone implants in the bovinenorgestomet and estradiol valerate synchronization procedure. Drug Dev. Ind. Pharm., v.21, p.475-85,1995.

LAMOND, D.R. Synchronization of ovarian cycles in sheep and cattle. Anim. Breed. Abstr., v. 32, p. 269-285, 1964.

LAUDERDALE, J.W.; MACALLISTER, J.F.; KRATZER, D.D.; MOODY, E.L. Use of prostaglandinF2α in cattle breeding. Acta Vet. Scand., v.77, p.181, 1981.

MACMILLAN, K.L., BURKE, C.R. Effects of oestrus cycle control on reproductive efficiency.

32


Anim.Reprod.Sci.v.42, p.307-320, 1996.

MACMILLAN, K.L., PETERSON, A.J. A new intravaginal progesterone realising device for cattle(CIDR - B) for estrous synchronization, increasing pregnancy rates and the treatment of post-partumanestrous. Anim. Reprod. Sci., v.33, p.1-25, 1993.

MACMILLAN, K.L.; THATCHER, W.W. Effect of an agonist of gonadotropin releasing hormone on ovarianfollicles in cattle. Biol. Reprod., v.45, p.883-9, 1991.

MANN, G.E.; LAMMING, G.E. The role of sub-optimal preovulatory oestradiol secretion in the aetiologyof premature luteolysis during the short oestrus cycle in the cow. Anim.Reprod.Sci. v.64, p.171-180, 2000.

MCGOWAN, M.R. Sincronización de cellos y programas de inseminación artificial a tiempo fijo en ganadoBos indicus y cruza Bos indicus . Bó. G.A ., Caccia M (Eds). Resúmenes Tercer Simposio Internacionalde Reproducción Animal. Carlos Paz, Córdoba, Argentina, p.71-82, 1999.

MEIRELLES, F.V.; Rosa, A.J.M.; Lôbo, B.R. et al. Is the American Zebu really Bos indicus? Geneticsand Molecular Biology, v.22, p.543-547, 1999.

MIZUTA, K. Estudo comparativo dos aspectos comportamentais do estro e dos teores plasmáticosde LH, FSH, Progesterona e Estradiol que precedem a ovulação em fêmeas bovinas Nelore (Bostaurus indicus), Angus (Bos taurus taurus) e Nelore x Angus (Bos taurus indicus x Bos taurustaurus). São Paulo, 2003, 98p. dissertação (doutorado em Reprodução Animal) – Faculdade de MedicinaVeterinária e Zootecnia – Departamento de Reprodução Animal – Universidade de São Paulo.

MUKASA-MUGERWA, E. A review of reproductive performance of female Bos indicus (Zebu) cattle.ILCA monog. v.6, p. 1-34, 1989.

ODDE, K.G. A review of synchronization of estrus in postpartum cattle. J. Anim. Sci. V.68, p.817-30,1990.

PETER, A.T, Bosu, W.T.K., Liptrap, R.M., Cummings, E. Temporal changes in serum prostaglandin F2αand oxytocin in dairy cows with short luteal phases after the first postpartum ovulation. Theriogenology,v.32, p.277-284, 1989.

PIERSON, R.A.; GINTHER, O.J. Ultrassonic imaging of the ovaries and uterus in cattle. Theriogenology,v.29, p.21-37, 1988.

PINHEIRO, O.L., BARROS, C.M., FIGUEREDO, R.A., VALLE, E.R., ENCARNAÇÃO, R.O.,PADOVANI, C.R., Estrous behavior and the estrous to ovulation interval in Nelore cattle (Bos indicus) withnatural estrus or estrus induced with prostaglandin F2α or norgestomet and estradiol valerate.Theriogenology, v.49, p.667-81, 1998.

PURSLEY, J.R.; MEE, M.O.; BROWN, M.D.; WILTBANK, M.C. Synchronization of ovulation in dairycattle using GnRH and PGF2α. J. Anim. Sci., v.72, p.230, 1994.

PURSLEY, J.R.; MEE, M.O.; WILTBANK, M.C. Synchronization of ovulation in dairy cattle using GnRHand PGF2α. Theriogenology, v.44, p.915-23, 1995.

33


PURSLEY, J.R.; WILTBANK, M.C.; STEVENSOM, J.S.; OTTOBRE, J.S.; BARVERICK, H.A.;ANDERSOM, L.L. Pregnancy rates per artificial insemination for cows and heifers inseminated at asynchronized ovulation or synchronized estrus. J. Anim. Sci., v.80, p.295-300, 1997a.

PURSLEY, J.R.; KOSOROK, M.R.; WILTBANK, M.C. Reproductive management of lactating dairycows using synchronization of ovulation. J. Dairy Sci., v.80, p.295-300, 1997b.

ROWSON, L.E.A.; TERVIT, R.; BRAND, A. The use of prostaglandin for synchronization of estrus incattle. J. Reprod. Fertil., v.29, p.145, 1972.

SAVIO, J.D.; KEENAN, L.; BOLAND, M.P; ROCHE, J.F. Pattern of growth of dominant follicles duringthe oestrus cycle of heifers. J.Reprod. Fert., v.83, p.663-71, 1988.

SAVIO, J.D., BOLAND, M.P., HYNES, N., MATTIACI, M.R., ROCHE, J.F. Will the first dominantfollicle of the estrous cycle of heifers ovulate following luteolysis on day 7? Theriogenology, v.33, p.677,1990.

SIROIS, J., FORTUNE, J.E. Ovarian follicular dynamics during the estrus cycle in heifers monitored byReal-Time Ultrasonography. Biol. Reprod., v.39, p.308-17, 1988.

SOUZA, A.F., PINHEIRO, V.G., ERENO, R.L., BARROS, C.M. Taxa de prenhez , em vacas Nelore,após a remoção temporária de bezerros (RTB) e utilização de protocolos hormonais com eCG. Acta ScientiaeVeterinariae, abstract, 2004 (in press).

STAGG, K.; SPICER, L.J.; SREENAN, J.M., ROCHE, J.F.; DISKIN, M.G. Effect of calf isolation onfollicular wave dynamics, gonadotropin and metabolic hormone changes, and interval to first ovulation in beecows fed either of two energy levels postpartum. Biol. Reprod., v.59, p.777-783, 1998.

THATCHER, W.W.; MACMILLAN, K.L.; HANSEN, P.J.; DROST, M. Concepts for regulation of corpusluteum function by the conceptus and ovarian follicles to improve fertility. Theriogenology, v.31, p.149-64,1989.

THATCHER, W.W.; DROST, M.; SAVIO, J.D.; MACMILLAN, K.L.; ENTWISTLE, K.W.; SCHIMITT,E.J.; DE LA SOTA, R.L.; MORRIS, G.R. New clinical uses of GnRH and its analogues in cattle. Anim.Reprod. Sci., v.33, p.27-49, 1993.

TWAGIRAMUNGU, H.; GUIBAULT, L.A.; PROULX, J.; VILLEUVE, P.; DUFOUR, J.J. Synchronizationof estrus and fertility in beef cattle with two injections of buserelin and prostaglandin. Theriogenology, v.38,p.1131-44, 1992a.

TWAGIRAMUNGU, H.; GUIBAULT, L.A.; PROULX, J.; VILLEUVE, P.; DUFOUR, J.J. Influence of naagonist of Gonadotropin-Releasing Hormone (Buserelin) on estrus synchronization and fertility in beef cows.J. Anim. Sci., v.70, p.1904-10, 1992b.

TWAGIRAMUNGU, H.; GUIBAULT, L.A.; PROULX, J.; DUFOUR, J.J. Influence of corpus luteum andinduced ovulation on ovarian follicular dynamics in postpartum cyclic cows treated with buserelin andcloprostenol. J. Anim. Sci., v.72, p.1796, 1994.

34


TWAGIRAMUNGU, H.; GUILBAULT, L.A.; DUFOUR, J.J. Synchronization of ovarian follicular waveswith a gonadotropin-releasing hormone agonist to increase the precision of estrus in cattle: A review. J.Anim. Sci., v.73, p.3141-51, 1995.

VACA, L.A.; GALINA, C.; FERNANDEZ, B.S. Oestrus cycle, oestrus and ovulation of the zebu in theMexican tropics. Vet. Rec., v.117, p.434-7, 1985.

VILELA, E.R., Vasconcelos, J.L.M., Figueiredo, R.A., Alessandri, A.M.M., Cerri, R.L.A., Wechister, F.S.,Barros, C.M.Efeito da remoção dos bezerros, em dois diferentes momentos durante protocolo de sincronizaçãona taxa de ovulação em vacas Nelore. Rev. Bras. Reprod. Anim., v.23, p.314-317, 1999.

VILELA, E.R. et. al. Efeito da remoção dos bezerrons na taxa de prenhez à IA com tempo fixo e à montanatural nos primeiros 30 dias da estação de monta em vacas Nelore. Rev. Bras. Reprod. Anim., v. 27,p.288-289, 2001.

WILTBANK, M.C.; PURSLEY, J.R.; FRICKE, P.M.; VASCONCELOS, J.LM; GUENTHER, J.N.,GIBBONS, J.R.; GINTHER, O.J. Development of IA and ET programs that do not require detection ofestrus using recent information on follicular growth. In: ANNUAL CONVENTION PORTLAND, 15, 1996,Oregon. Proceedings...Oregon: American Embryo Transfer Association, 1996, p.23-44.

WILLIAMS, S.W., STANKO, R.L., AMSTALDEN, M., WILLIANS, G.L. Comparison of three approachesfor synchronization of ovulation for timed artificial insemination in Bos indicus-influenced cattle managed onthe Texas gulf coast. J. Anim. Sci. v.80, p.1173-1178, 2002.

WISHART, D.F. Observations on the oestrus cycle of the Friesian heifers. Vet. Rec., v.90, p.595-7, 1972.

YAVAS, Y.; WALTON. Postpartum acyclicity in suckled beef cows: a review. Theriogenology, v.54, p.25-55, 2000.

35


FERTILIZAÇÃO E MORTE EMBRIONÁRIA EM BOVINOS

R. Sartori

Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília, DF, Brasil; Department of Dairy Science,University of Wisconsin, Madison, WI, USA E-mail: [email protected]

RESUMO Em um programa de manejo reprodutivo de bovinos, além dos aspectos relacionados ao sêmene técnicas de inseminação ou monta natural, alterações na qualidade ovocitária também afetam os índices defertilização e de desenvolvimento embrionário. Dentre os fatores que podem comprometer o transporte degametas, fertilização dos ovócitos, integridade ovocitária, ou a viabilidade embrionária e fetal em bovinos,encontram-se fatores ambientais, genéticos, metabólicos, nutricionais e infecciosos. A maioria dos estudosque avaliaram embriões coletados do oviduto ou útero de vacas inseminadas com sêmen de boa qualidaderelatou elevada taxa de fertilização (80 a 100%), independentemente de idade, raça, ou estágio de lactação.Resultados inferiores na taxa de fertilização foram observados em vacas com alta produção leiteira sobcondições de estresse térmico (55%) e em vacas leiteiras repetidoras de cio (62 a 72%). Embora, namaioria dos casos, falha na fertilização não seja um entrave para o estabelecimento da prenhez, perdaembrionária é considerada a causa mais importante para o aumento do intervalo entre partos nos rebanhos.A maioria das perdas pré-natais ocorre durante o período embrionário (≤ 42 d) em bovinos de corte e leite,sendo que dentre essas perdas embrionárias a maior parte ocorre durante os primeiros dias após a fertilizaçãoe durante o processo de implantação do embrião no útero. Estudos que avaliaram vacas de corte com altaincidência de infertilidade, observaram em torno de 30% de perda embrionária até o dia 7 após o estro. Poroutro lado, estudos com novilhas de corte de fertilidade elevada, descreveram altas taxas de sobrevivênciaembrionária até o dia 8. A maioria das mortes embrionárias nesses estudos ocorreu entre o dia 8 e 18 apósIA. Estudos mais recentes que coletaram embriões de vacas de alta produção de leite não superovuladas,observaram taxas de perda embrionária elevadas. Em geral, apesar da elevada taxa de fertilização (80 a90%), a taxa de embriões viáveis coletados 5 a 7 dias após a IA foi de 50 a 60%. Estudos que avaliarammorte embryonária/fetal entre os dias 25 e 60 de gestação através de ultra-sonografia transretal relataramentre 10 e 30% de perda em vacas leiteiras lactantes e ≤ 10% de mortalidade em bovinos de corte e novilhasde leite. Em conclusão, a elevada morte embrionária durante os primeiros dias de gestação é considerada aprincipal causa responsável pela baixa eficiência reprodutiva, especialmente em vacas de alta produção deleite. A utilização de biotecnologias reprodutivas tais como tratamentos hormonais e transferência de embriõesprovenientes de animais com elevada fertilidade tem se mostrado alternativas viáveis para o incremento daeficiência reprodutiva. Além disso, o uso de técnicas adequadas de IA e a redução de problemas sanitários,nutricionais e ambientais são condições essenciais para a obtenção de elevados índices de fertilização emanutenção da gestação, culminando no sucesso dos programas reprodutivos em bovinos.

Palavras-chave: bovino, fertilização, embrião, mortalidade.

Sartori, R. 2004. Fertilização e morte embrionária em bovinos. Acta Scientiae Veterinariae, 32 (Supl ): 35-50.

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1. INTRODUÇÃO

Na reprodução de bovinos, além dos aspectos relacionados ao sêmen e técnicas de inseminação oumonta natural, alterações na qualidade ovocitária, ou no ambiente uterino e de ovidutos também podemafetar os índices de fertilização e de desenvolvimento embrionário. Dentre os fatores que podem comprometero transporte de gametas, fertilização dos ovócitos, integridade ovocitária, ou a viabilidade embrionária e fetalem bovinos, encontram-se fatores ambientais, genéticos, metabólicos, nutricionais e infecciosos. Esta revisãoprocura descrever e discutir resultados de diversos estudos que avaliaram taxas de fertilização e de morteembrionária em bovinos com ovulação única ou superovulados. Além disso, apresenta dados de morteembrionária em receptoras de embriões produzidos in vivo e in vitro.

2. TAXAS DE FERTILIZAÇÃO EM FÊMEAS BOVINAS COM OVULAÇÃO ÚNICA (NÃOSUPEROVULADAS)

Durante a monta, o touro deposita bilhões de espermatozóides na vagina da vaca. Entretanto, devidoao fato da cérvix ser o maior obstáculo ao transporte espermático, o número de espermatozóides que alcançamo corpo uterino não ultrapassa 1% (Harper, 1982). Na IA, o sêmen é depositado diretamente no útero,ultrapassando a cérvix e permitindo o uso de um número reduzido de espermatozóides. Após a monta ou IA,o sêmen é exposto a uma série de ambientes distintos que alteram significativamente o número e a funçãoespermática. Muitos espermatozóides são perdidos no trato genital feminino pelo transporte retrógrado(Mullins e Saacke, 1989). Espermatozóides viáveis que são retidos no trato genital feminino devem atravessaro útero, passar para o oviduto pela junção útero-tubárica, interagir com o epitélio do oviduto e sofrer capacitaçãoantes de poder fertilizar o ovócito (Berger, 1996).

Na fêmea bovina, ao início do estro, altas concentrações de LH desencadeadas pelas elevadasconcentrações circulantes de estradiol (E2) induzem o reinício da meiose no ovócito (revisado por Mermillodet al., 1999) e iniciam uma seqüência de eventos que levam à ovulação. Quando o folículo se rompe, oovócito rodeado por células do cumulus é liberado na cavidade peritoneal e capturado pelas células epiteliaisciliadas do infundíbulo. O ovócito é então transportado através da ampola para a junção istmo-ampolar,onde ocorre a fertilização.

Diversos estudos têm relatado que a taxa de fertilização após IA de estruturas coletadas de oviduto ouútero de vacas não superovuladas é alta, independente de idade ou raça (Tabela 1). Estudos com novilhas decorte ou leite observaram 82 a 100% de taxa de fertilização após uma única IA. Taxas de fertilizaçãosimilares (75 a 100%) foram também relatadas em vacas de corte (Tabela 1). Resultados inferiores na taxade fertilização, entretanto, foram observados em algumas circunstâncias específicas. Vacas com alta produçãoleiteira sob condições de estresse térmico apresentaram taxas de fertilização de apenas 55% (Tabela 1).Vacas leiteiras repetidoras de cio (“repeat-breeders”) tiveram 62 e 72% de fertilização, como descrito porAlmeida (1995) e O’Farrell et al. (1983), respectivamente. Em um experimento em que vacas holandesasnão lactantes foram inseminadas somente no momento do início do estro, a taxa de fertilização foi ao redor de

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67% (Tabela 1). Portanto, embora em geral as taxas de fertilização são elevadas em bovinos, algumascondições especiais tais como estresse térmico, ou momento inadequado da IA, podem comprometer afertilização em vacas.

TABELA 1

Após a fertilização, o zigoto passa por uma série de divisões celulares (clivagem) e permanece nooviduto até o dia 3 ou 4, quando então entra no útero. A porcentagem de ovócitos que não são capturadospelo infundíbulo após a ovulação ou a porcentagem de embriões/óvulos que não são transportados ao úteroapós 3 a 4 dias do pico de LH, não é conhecida, mas é muito provável que alguns embriões/óvulos sãoperdidos antes de alcançarem o útero. De fato, diversos estudos que lavaram o oviduto ou útero de bovinoscom o propósito de avaliar taxa de fertilização ou qualidade embrionária entre os dias 3 e 14 após IA emvacas não superovuladas (Breuel et al., 1993; Ryan et al., 1993; Almeida, 1995; Dunne et al., 2000; Daltonet al., 2001a; Sartori et al., 2002b) ou superovuladas (Kelly et al., 1997; Sartori et al., 2003b; 2004b)coletaram abaixo de 85% de embriões e/ou óvulos por corpo lúteo (CL). Caso de fato nem todos os óvulosalcançam o sítio de fertilização, é provável que as taxas de fertilização relatadas na literatura estejamsuperestimadas. Além disso, os estudos que avaliaram taxas de fertilização em bovinos foram conduzidossob condições experimentais controladas, que podem não refletir completamente a realidade nas fazendas.

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3. TAXAS DE FERTILIZAÇÃO EM FÊMEAS BOVINAS SUPEROVULADAS

Vacas e novilhas submetidas a tratamentos hormonais com o propósito de produzirem ovulaçõesmúltiplas, geralmente apresentam uma alta porcentagem de ovócitos não fertilizados no lavado uterino (Tabela2). Entre os trabalhos citados na Tabela 2, as menores taxas de fertilização após superovulação foramobservadas em vacas repetidoras de cio (Hawk e Tanabe, 1986), vacas inseminadas no início do estro(Dalton et al., 2000), e novilhas inseminadas com espermatozóides sexados (Sartori et al., 2004b). Emcontraste, quando fêmeas superovuladas foram inseminadas com sêmen de alta qualidade e no momentoapropriado em relação ao estro (Dalton et al., 2000; Sartori et al., 2004b), as taxas de fertilização relatadasforam superiores a 80%. Apesar disso, nos estudos que compararam diretamente vacas não superovuladasàs superovuladas (Elsden et al., 1976; Saacke et al., 1998 [Tabelas 1 e 2]), taxas menores de fertilizaçãoocorreram nas superovuladas. Como discutido por Kafi e McGowan (1997), a menor taxa de fertilizaçãoem bovinos superovulados pode ser decorrência de distúrbios no transporte de espermatozóides e ovócitos,além da qualidade inferior dos ovócitos. De fato, conforme Hyttel et al. (1991), tratamentos superovulatóriostêm efeitos adversos na maturação ovocitária ou das células da granulosa, comprometendo não somente afertilização mas também a viabilidade embrionária.

TABELA 2

4. DESENVOLVIMENTO E SOBREVIVÊNCIA EMBRIONÁRIA

Diversos estágios do desenvolvimento embrionário inicial são importantes para o desenvolvimento esobrevivência do embrião. O embrião move-se do oviduto para o útero no estágio de 8 a 16 células (Grealyet al., 1996). Com 5 a 6 d de idade o embrião atinge o estágio de 16 a 32 células e estas células começama se juntar para se formar uma esfera compacta denominada mórula. A compactação celular e as junçõesintercelulares representam o primeiro estágio crítico em que o embrião começa a atuar como um organismoindividual. Nos dias 7 ou 8 uma cavidade se forma e as células do blastocisto inicial diferenciam-se em massacelular interna, destinada a formar o feto, e trofoblasto, destinado a formar a placenta (revisado por Sreenanet al., 2001). Entre os dias 9 e 10, o blastocisto expandido eclode da zona pelúcida e continua a se expandirantes de começar a elongar por volta do dia 13. O elongamento ocorre ao redor do momento doreconhecimento materno da gestação e é acompanhado por um aumento na atividade metabólica e secreçãode interferon τ (revisado por Mann et al., 1999; Thatcher et al., 2001). A fixação do embrião ao endomério

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começa aproximadamente no dia 19. A implantação embrionária está completa no dia 42. A sobrevivênciado embrião e estabelecimento da gestação envolvem comunicação ativa e passiva entre o embrião e o útero.A manutenção do CL, como resultado dos sinais embrionários para a mãe, garante a produção continuadade progesterona (P4), a qual é necessária para preparar o endométrio para implantação e nutrição embrionária.A presença do embrião por volta do dia 16 do ciclo inibe a síntese e liberação de PGF2α do endométrio(revisado por Geisert et al., 1994; Mann et al., 1999; Thatcher et al., 2001; Okuda et al., 2002), prevenindoassim a luteólise e o conseqüente declínio na produção de P4.

Embora falha na fertilização após inseminação não pareça ser um grande problema para o estabelecimentoda gestação em bovinos, mortalidade embrionária é considerada a principal causa responsável pelo aumentono intervalo entre partos nos bovinos. A maioria das perdas embrionárias ocorre durante o período embrionárioda gestação (< 45 d) tanto em bovinos de corte quanto de leite (Thatcher et al., 1994; Vanroose et al., 2000;Sreenan et al., 2001), e de acordo com Wathes (1992), a maioria das mortes embrionárias ocorre nosprimeiros dias após fertilização e durante o processo de implantação.

As condutas utilizadas para avaliar mortalidade embrionária precoce em bovinos têm sido abater animaisem intervalos específicos após a inseminação e coletar embriões/óvulos do oviduto ou útero, e maisrecentemente, coletar embriões in vivo do útero utilizando-se lavados uterinos. Diversos estudos sobreperda embrionária inicial foram realizados há mais de 20 anos (Boyd et al., 1969; Ayalon et al., 1978; Diskine Sreenan, 1980; Roche et al., 1981; Maurer e Chenault, 1983). Estudos que avaliaram vacas de corte comalta incidência de infertilidade (“repeat-breeders”), observaram em torno de 30% de perda embrionária atéo dia 7 após o estro (Ayalon et al., 1978; Maurer e Chenault, 1983). Por outro lado, estudos com novilhasde corte de fertilidade elevada, descreveram altas taxas de sobrevivência embrionária até o dia 8. A maioriadas mortes embrionárias nesses estudos ocorreu entre o dia 8 e 18 após IA (Diskin e Sreenan, 1980; Rocheet al., 1981). Em um estudo mais recente, Dunne et al. (2000) não observaram diferenças na sobrevivênciaembrionária nos dias 14, 30 ou ao parto em novilhas de corte. Os autores sugeriram que a maioria dasperdas embrionárias nas novilhas havia ocorrido antes do dia 14. A Tabela 3 resume resultados de diversosestudos sobre desenvolvimento e sobrevivência embrionária inicial em bovinos de corte, novilhas de leite evacas de leite não lactantes. Em geral, com exceção de vacas que ovularam folículos persistentes, a porcentagemde embriões viáveis coletados entre os dias 3 e 16 foi elevada na maioria dos estudos (78% de média).

TABELA 3

Contrastando com o elevado número de embriões viáveis observado em bovinos de corte, e fêmeas

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de leite não lactantes, estudos que avaliaram o desenvolvimento embrionário inicial em vacas de leite lactantes,demonstraram índices muito mais baixos de sobrevivência embrionária entre os dias 3 e 14, especialmenteem vacas com alta produção leiteira (Tabela 4). Um estudo mais antigo (Boyd et al., 1969) relatou 70% desobrevivência embrionária até o dia 26 da gestação. Entretanto, estudos mais recentes que coletaram embriõesdo útero de vacas com alta produção de leite não superovuladas (Wiebold, 1988; Ryan et al., 1993; Sartoriet al., 2002b; Cerri et al., 2004) demonstraram uma incidência muito mais elevada de mortalidade embrionáriaprecoce. Wiebold (1988) coletou 25 embriões de 23 vacas lactantes no dia 7 e notou que todas as estruturasestavam fertilizadas (Tabela 1), sendo que 12 eram embriões normais e 13 anormais. Dos 13 anormais, pelomenos 9 eram degenerados e possuiam = 8 células. Ryan et al. (1993) coletaram embriões nas estaçõesquente e fria do ano na Arábia Saudita e observaram uma porcentagem baixa de embriões viáveis nos dias 6ou 7 (59% durante o verão e 52% durante o inverno). Vacas coletadas nos dias 13 ou 14 durante o invernodemonstraram porcentagens similares de embriões viáveis em relação aos dias 6 ou 7 (60%). Entretanto,vacas coletadas nos dias 13 ou 14 durante o verão tiveram uma porcentagem ainda menor de embriõesviáveis (27%). Nos experimentos relatados por Sartori et al. (2002b), entre os embriões coletados no dia 6após IA de vacas holandesas com alta produção leiteira não superovuladas, 67% não estavam viáveis noexperimento durante o verão e 52% não eram viáveis no experimento do inverno (Tabela 4). No mesmoestudo, novilhas holandesas geraram 72% de embriões viáveis no verão e vacas holandesas não lactantesgeraram 82% de embriões viáveis no inverno (Tabela 3). Um estudo recente (Cerri et al., 2004) que avaliouos efeitos de dietas com fontes de gordura com diferentes perfis de ácidos graxos na taxa de fertilização equalidade embrionária em vacas lactantes sincronizadas com o protocolo Ovsynch (Pursley et al., 1995),relatou que 26 a 48% dos embriões coletados no dia 5 após IA eram de qualidade pobre ou degenerados.Quando os dados apresentados na Tabela 4 foram agrupados, apenas 51% dos embriões coletados devacas lactantes entre os dias 3 e 14 eram viáveis. Portanto, em vacas com alta produção leiteira, a maioriados embriões pode estar com sua viabilidade comprometida antes do dia 13 da gestação. Além disso, amaior parte desses embriões parece já estar comprometida antes do dia 7 em vacas com alta produçãoleiteira não superovuladas.

TABELA 4

Estudos que avaliaram mortalidade embrionária em bovinos entre os dias 25-28 e 42 com auxílio de

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ultra-sonografia transretal e mortalidade fetal precoce entre os dias 42 e 60-70 observaram resultados muitodistintos, que em geral estavam associados à raça, idade, lactação, ou procedência dos embriões (Tabela 5).Quando mortalidade embrionária tardia foi comparada à mortalidade fetal precoce, a maioria das perdasocorreu antes do estágio fetal (Beal et al., 1992; Vasconcelos et al., 1997; Tabela 5). Os poucos estudos queavaliaram mortalidade embrionária tardia/fetal precoce em bovinos de corte, ou novilhas de leite descreveramincidências baixas (≤10%) de perda (Tabela 5), com exceção de novilhas e vacas de corte receptoras deembriões produzidos in vitro (Reis et al., 2004). Contrastando com a baixa perda embrionária/fetal embovinos de corte e novilhas de leite, trabalhos recentes em vacas de leite lactantes têm demonstrado umaincidência mais elevada de mortalidade embrionária tardia/fetal precoce. Valores entre 15 e 30% de mortalidadeforam os mais comumente observados na maioria dos estudos (Tabela 5), mesmo quando embriões congeladosproduzidos em novilhas superovuladas e de esperada fertilidade alta foram trasferidos em vacas lactantes(Sartori et al., 2003a). Após exaustiva pesquisa na literatura, encontramos apenas um estudo recente emvacas leiteiras lactantes que descreveu baixas taxas de mortalidade entre os dias 28 e 42 de gestação (Silkeet al., 2002; Tabela 5). Uma peculiaridade desse estudo, entretanto, foi que as vacas eram manejadas apasto, diferentemente dos demais estudos descritos na Tabela 5. Esses resultados conflitantes sugerem queníveis de produção de leite, e especialmente fatores nutricionais e de manejo (conforto animal) possam estarinfluenciando direta ou indiretamente a sobrevivência embrionária/fetal em bovinos.

TABELA 5

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5. DISCUSSÃO

Como mencionado anteriormente, há diversos fatores que podem estar envolvidos com a falha nafertilização ou mortalidade embrionária/fetal em bovinos. Problemas de fertilização ou abortamentos podemser causados por doenças infecciosas (Bearden e Fuquay, 2000; Vanroose et al., 2000), ou infecções localizadase restritas a órgãos específicos tais como útero (Nakao et al., 1992; Loeffler et al., 1999a,b; Gröhn e Rajala-Schultz; 2000), ou glândula mamária (Moore et al., 1991; Loeffler et al., 1999a,b; Schrick et al., 2001;Santos et al., 2004). Causas não infecciosas, entretanto, provavelmente contribuem para a maioria dasperdas (Christianson, 1992; Thatcher et al., 1994; Labèrnia et al., 1996; Vanroose et al., 2000). Algumasdessas causas são anormalidades cromossômicas, fatores externos (por exemplo, estresse, produtos tóxicos,teratogênicos ou abortivos, e nutrição), e fatores maternos (por exemplo, desbalanços hormonais, lactação eidade). Aspectos técnicos ou relacionados à anatomia e fisiologia que estão associados à fertilidade reduzidaem bovinos também foram estudados e incluem: ambiente tubárico e/ou uterino inapropriados (Wiebold,1988; Binelli et al., 1999), fertilidade ovocitária reduzida devido a anormalidades foliculares (Eicker et al.,1996; Emanuelson e Oltenacu, 1998), técnica de IA inapropriada em relação ao momento do estro (Sengeret al., 1988; López-Gatius, 2000; Dalton et al., 2001a,b), e problemas espermáticos ou de fertilização(López-Gatius, 2000; Dalton et al., 2001a,b; López-Gatius et al., 2002).

A maior incidência de mortalidade embrionária/fetal, e conseqüentemente, baixa fertilidade em vacasde alta produção leiteira quando comparadas às demais fêmeas bovinas, tem estimulado pesquisadores ainvestigar com maiores detalhes os aspectos fisiológicos que possam estar associados à subfertilidade nestegrupo distinto de animais. Raça não parece ser o fator mais relevante associado à baixa fertilidade debovinos leiteiros, porque estudos sobre associações genéticas com fertilidade têm demonstrado que ahereditariedade para caracteres de fertilidade é baixa (Weller e Ezra, 1997; Dematawewa e Berger, 1998).Além disso, a continuada fertilidade elevada em novilhas de leite sugere que qualquer componente genéticorelacionado à fertilidade reduzida nas vacas lactantes teria interações com lactação, manejo, ou idade. Diversosestudos avaliaram possíveis causas nutricionais da baixa fertilidade em gado leiteiro, incluindo: balançoenergético negativo evidenciado pela perda de escore de condição corporal (Nebel e McGilliard, 1993;Ruegg e Milton, 1995; Domecq et al., 1997; Loeffler et al., 1999a,b; Moreira et al., 2000; Butler, 2001;López-Gatius et al., 2002), efeitos detrimentais de níveis elevados de energia na dieta (Dunne et al., 1999),efeitos tóxicos da uréia e nitrogênio (Ferguson e Chalupa, 1989; Butler, 1998; Sinclair et al., 2000; Dawudaet al., 2002), e deficiências de vitamina e/ou minerais (Ingraham et al., 1987; Arechiga et al., 1994; 1998).Alguns peptídeos, tais como a leptina e fatores de crescimento (IGF-1 e IGF-2), cujas concentrações variamna circulação em função do estado metabólico do animal, especialmente durante o período pós parto emvacas leiteiras, aparentemente estão envolvidos na mediação dos efeitos da nutrição na função reprodutiva(O’Callaghan e Boland, 1999; Boland et al., 2001; Lucy, 2001).

Vacas leiteiras em lactação têm capacidade reduzida de responder a aumentos de temperatura ambienteou outras formas de estresse (Lucy et al., 1986; Sartori et al., 2002b). Estresse térmico reduz a eficiênciareprodutiva, particularmente em vacas lactantes, através da redução da expressão/detecção de estro e peladiminuição nas taxas de concepção (Stevenson et al., 1984; Ryan et al., 1993). O efeito do estresse térmicona fertilidade parece estar associado a quedas na taxas de fertilização e elevação na perda embrionária (Al-

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Katanani et al., 1999, 2002; Hansen et al., 2001; Rivera e Hansen, 2001; Sartori et al., 2002b).Muitos dos mecanismos envolvidos no transporte de gametas, fertilização e desenvolvimento embrionário

inicial sofrem influência dos hormônios esteróides ovarianos E2 e P4. Alterações nas concentrações séricasde esteróides, que ocorrem em vacas de alta produção leiteira podem comprometer a eficiência reprodutiva.Pesquisadores relataram que o crescimento prolongado do folículo ovariano em vacas com baixos níveiscirculantes de P4 resultou em fertilidade reduzida (Mihm et al., 1994; Ahmad et al., 1995). Por exemplo, emum experimento (Ahmad et al., 1996), a produção de um folículo persistente dramaticamente reduziu a taxade concepção de 54% para 15% em vacas lactantes. Essa persistência do folículo dominante (que talvezocorra naturalmente na vaca de alta produção leiteira) está associada à exposição prolongada de elevadasconcentrações de E2 antes da ovulação (Ahmad et al., 1996; Bigelow e Fortune, 1998), porém, ainda estápor ser determinado se essa elevação prolongada de E2 circulante ou intra-folicular antes da ovulaçãocompromete a fertilidade. O estrógeno também está associado à retenção do ovócito no oviduto, enquantoque a P4 acelera o transporte (Bearden e Fuquay, 2000). Alteração nas concentrações séricas dos esteróidespode afetar fertilização ou transporte do embrião/óvulo. Além disso, proteínas secretórias dependentes deE2 parecem ser parte essencial de um ambiente tubárico de suporte para capacitação espermática, fertilizaçãoe desenvolvimento embrionário inicial (King et al., 1994; DeSouza e Murray, 1995; Binelli et al., 1999).Binelli et al. (1999) observaram um ambiente tubárico alterado em vacas com folículos dominantes persistentes.Eles sugeriram que esse microambiente inapropriado contribui com a fertilidade reduzida em vacas comfolículos persistentes. É esperado que vacas de alta produção leiteira tenham concentrações séricas de P4mais baixas do que novilhas (Sartori et al., 2002a; 2004a). Reduzidas concentrações séricas de P4 noperíodo periovulatório poderiam ser responsáveis, pelo menos em parte, pela redução na fertilidade de vacasleiteiras. Vacas com concentrações mais baixas de P4 antes da IA tiveram fertilidade reduzida (Folman et al.,1973; Fonseca et al., 1983) e suplementação de P4 antes da IA aumentou a taxa de concepção (Folman etal., 1990; Wehrman et al., 1993; Xu et al., 1997). Baixas concentrações séricas de P4 permitem um aumentona freqüência de pulsos de LH (Roberson et al., 1989; Bergfelt et al., 1991; Adams et al., 1992), causandomaturação prematura dos ovócitos (Revah e Butler, 1996), queda na qualidade ovocitária no momento daovulação e conseqüente qualidade embrionária inferior após a fertilização (Ahmad et al., 1995). Concentraçõesreduzidas de P4 após a IA também estão associadas à fertilidade reduzida (Lukaszewska e Hansen, 1980;Mann et al., 1995; Ahmad et al., 1996; Larson et al., 1997). Essa redução na fertilidade pode ser devido àsbaixas concentrações séricas de P4 que talvez atrasem o desenvolvimento embrionário (Mann et al., 1998;Mann e Lamming, 2001), e/ou permitam uma indução precoce da luteólise (Mann e Lamming, 1995; Mannet al., 1995).

6. CONSIDERAÇÕES FINAIS

A elevada morte embrionária durante os primeiros dias de gestação é considerada a principal causaresponsável pela baixa eficiência reprodutiva, especialmente em vacas de alta produção de leite. A utilizaçãode biotecnologias reprodutivas tais como tratamentos hormonais e transferência de embriões provenientes deanimais com elevada fertilidade tem se mostrado alternativas viáveis para o incremento da eficiência reprodutiva.

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Além disso, o uso de técnicas adequadas de IA e a redução de problemas sanitários, nutricionais e ambientaissão condições essenciais para a obtenção de elevados índices de fertilização e manutenção da gestação,culminando no sucesso dos programas reprodutivos em bovinos.

7. REFERÊNCIAS

Adams GP, Matteri RL, Kastelic JP, Ko JC, Ginther OJ. Association between surges of follicle-stimulatinghormone and the emergence of follicular waves in heifers. J Reprod Fertil 1992; 94: 177-188.

Ahmad N, Beam W, Butler WR, Deaver DR, Duby RT, Elder DR, Fortune JE, Griel LC, Jones LS, MilvaeRA, Pate JL, Revah I, Schreiber DT, Townson DH, Tsang PCW, Inskeep EK. Relationship of fertility topatterns of ovarian follicular development and associated hormonal profiles in dairy cows and heifers.Cooperative Regional Research Project. J Anim Sci 1996; 74: 1943-1952.

Ahmad N, Schrick FN, Butcher RL, Inskeep EK. Effect of persistent follicles on early embryonic losses inbeef cows. Biol Reprod 1995; 52: 1129-1135.

Al-Katanani YM, Paula-Lopes FF, Hansen PJ. Effect of season and exposure to heat stress on oocytecompetence in Holstein cows. J Dairy Sci 2002; 85: 390-396.

Al-Katanani YM, Webb DW, Hansen PJ. Factors affecting seasonal variation in 90-day nonreturn rate tofirst service in lactating Holstein cows in a hot climate. J Dairy Sci 1999; 82: 2611-2616.

Almeida LAP. Early embryonic mortality in “repeat-breeder” cows. ARS Veterinaria 1995; 11: 18-34.

Arechiga CF, Ortiz O, Hansen PJ. Effect of prepartum injection of vitamin-E and selenium on postpartumreproductive function of dairy-cattle. Theriogenology 1994; 41: 1251-1258.

Arechiga CF, Vazquez-Flores S, Ortiz O, Hernandez-Ceron J, Porras A, McDowell LR, Hansen PJ. Effectof injection of beta-carotene or vitamin E and selenium on fertility of lactating dairy cows. Theriogenology1998; 50: 65-76.

Ayalon N. Review of embryonic mortality in cattle. J Reprod Fertil 1978; 54: 483-493.

Beal WE, Perry RC, Corah LR. The use of ultrasound in monitoring reproductive physiology of beef-cattle.J Anim Sci 1992; 70: 924-929.

Bearden HJ, Fuquay JW. Applied animal reproduction. Upper Saddle River, NJ: Prentice Hall; 2000.

Berger T. Fertilization in ungulates. Anim Reprod Sci 1996; 42: 351-360.

Bergfelt DR, Kastelic JP, Ginther OJ. Continued periodic emergence of follicular waves in non-bredprogesterone-treated heifers. Anim Reprod Sci 1991; 24: 193-204.

Bigelow KL, Fortune JE. Characteristics of prolonged dominant versus control follicles: follicle cell numbers,steroidogenic capabilities, and messenger ribonucleic acid for steroidogenic enzymes. Biol Reprod 1998; 58:1241-1249.

Binelli M, Hampton J, Buhi WC, Thatcher WW. Persistent dominant follicle alters pattern of oviductal secretoryproteins from cows at estrus. Biol Reprod 1999; 61: 127-134.

45


Boland MP, Lonergan P, O’Callaghan D. Effect of nutrition on endocrine parameters, ovarian physiology, andoocyte and embryo development. Theriogenology 2001; 55: 1323-1340.

Boyd H, Bacsich P, Young A, McCracken JA. Fertilization and embryonic survival in dairy cattle. Br Vet J1969; 125: 87-97.

Breuel KF, Lewis PE, Schrick FN, Lishman AW, Inskeep EK, Butcher RL. Factors affecting fertility in thepostpartum cow - Role of the oocyte and follicle in conception rate. Biol Reprod 1993; 48: 655-661.

Butler WR. Nutritional effects on resumption of ovarian cyclicity and conception rate in postpartum dairycows. In: 26 Occ Publ Br Soc Anim Sci (ed.) Fertility in the high producing dairy cow. 2001: 133-145.

Butler WR. Review: Effect of protein nutrition on ovarian and uterine physiology in dairy cattle. J Dairy Sci1998; 81: 2533-2539.

Cerri RLA, Bruno R, Chebel RC, Galvão KN, Rutgliano H, Thatcher WW, Luchini D, Santos JEP. Effect ofsource of fatty acids on fertilization rate and embryo quality in early postpartum high producing dairy cows. JDairy Sci 2004; 87 (Suppl.) (Abstract in press).

Chebel RC, Santos JEP, Cerri RLA, Galvao KN, Juchem SO, Thatcher WW. Effect of resynchronizationwith GnRH on day 21 after artificial insemination on pregnancy rate and pregnancy loss in lactating dairycows. Theriogenology 2003; 60: 1389-1399.

Christianson WT. Stillbirths, mummies, abortions, and early embryonic death. Vet Clin North Am 1992; 8:623-639.

Dalton JC, Nadir S, Bame JH, Noftsinger M, Nebel RL, Saacke RG. Effect of time of insemination onnumber of accessory sperm, fertilization rate, and embryo quality in nonlactating dairy cattle. J Dairy Sci2001a; 84: 2413-2418.

Dalton JC, Nadir S, Bame JH, Noftsinger M, Saacke RG. The effect of time of artificial insemination onfertilization status and embryo quality in superovulated cows. J Anim Sci 2000; 78: 2081-2085.

Dalton JC, Nadir S, Bame JH, Noftsinger M, Saacke RG. Towards the enhancement of pregnancy rate: Theeffect of insemination time on sperm transport, fertilization rate and embryo quality in dairy cattle. In: Fertilityin the high producing dairy cow. 26 Occ Publ Br Soc Anim Sci; 2001b: 161-174.

Dawuda PM, Scaramuzzi RJ, Leese HJ, Hall CJ, Peters AR, Drew SB, Wathes DC. Effect of timing of ureafeeding on the yield and quality of embryos in lactating dairy cows. Theriogenology 2002; 58: 1443-1455.

Dematawewa CMB, Berger PJ. Genetic and phenotypic parameters for 305-day yield, fertility, and survivalin Holsteins. J Dairy Sci 1998; 81: 2700-2709.

DeSouza MM, Murray MK. An estrogen-dependent secretory protein, which shares identity with chitinases,is expressed in a temporally and regionally specific manner in the sheep oviduct at the time of fertilization andembryo development. Endocrinology 1995; 136: 2485-2496.

Diskin MG, Sreenan JM. Fertilization and embryonic mortality-rates in beef heifers after artificial-insemination.J Reprod Fertil 1980; 59: 463-468.

Domecq JJ, Skidmore AL, Lloyd JW, Kaneene JB. Relationship between body condition scores and conceptionat first artificial insemination in a large dairy herd of high yielding Holstein cows. J Dairy Sci 1997; 80: 113-

46


120.

Dunne LD, Diskin MG, Boland MP, O’Farrell KJ, Sreenan JM. The effect of pre- and post-inseminationplane of nutrition on embryo survival in beef heifers. Anim Sci 1999; 69: 411-417.

Dunne LD, Diskin MG, Sreenan JM. Embryo and foetal loss in beef heifers between day 14 of gestation andfull term. Anim Reprod Sci 2000; 58: 39-44.

Eicker SW, Grohn YT, Hertl JA. The association between cumulative milk yield, days open, and days to firstbreeding in New York Holstein cows. J Dairy Sci 1996; 79: 235-241.

Elsden RP, Hasler JF, Seidel GE, Jr. Non-surgical recovery of bovine eggs. Theriogenology 1976; 6: 523-532.

Emanuelson U, Oltenacu PA. Incidences and effects of diseases on the performance of Swedish dairy herdsstratified by production. J Dairy Sci 1998; 81: 2376-2382.

Ferguson JD, Chalupa W. Impact of protein nutrition on reproduction in dairy-cows. J Dairy Sci 1989; 72:746-766.

Folman Y, Kaim M, Herz Z, Rosenberg M. Comparison of methods for the synchronization of estrous cyclesin dairy cows. 2. Effects of progesterone and parity on conception. J Dairy Sci 1990; 73: 2817-2825.

Folman Y, Rosenberg M, Herz Z, Davidson M. The relationship between plasma progesterone concentrationand conception in post-partum dairy cows maintained on two levels of nutrition. J Reprod Fertil 1973; 34:267-278.

Fonseca FA, Britt JH, McDaniel BT, Wilk JC, Rakes AH. Reproductive traits of Holsteins and Jerseys.Effects of age, milk yield, and clinical abnormalities on involution of cervix and uterus, ovulation, estrouscycles, detection of estrus, conception rate, and days open. J Dairy Sci 1983; 66: 1128-1147.

Fricke PM, Caraviello DZ, Weigel KA, Welle ML. Fertility of dairy cows after resynchronization of ovulationat three intervals following first timed insemination. J Dairy Sci 2003; 86: 3941-3950.

Geisert RD, Short EC, Morgan GL. Establishment of pregnancy in domestic species. In: Geisert RD, ZavyMT (eds.), Embryonic mortality in domestic species. Florida: CRC Press; 1994: 23-53.

Grealy M, Diskin MG, Sreenan JM. Protein content of cattle oocytes and embryos from the two-cell to theelongated blastocyst stage at day 16. J Reprod Fertil 1996; 107: 229-233.

Grohn YT, Rajala-Schultz PJ. Epidemiology of reproductive performance in dairy cows. Anim Reprod Sci2000; 60: 605-614.

Hansen PJ, Drost M, Rivera RM, Paula-Lopes FF, al-Katanani YM, Krininger CE, 3rd, Chase CC, Jr.Adverse impact of heat stress on embryo production: causes and strategies for mitigation. Theriogenology2001; 55: 91-103.

Harper MJK. Sperm and egg transport. In: Austin CR, Short RV (eds.), Reproduction in mammals: 1. GermCells and Fertilization. Cambridge: Cambridge University Press; 1982: 102-127.

Hawk HW, Tanabe TY. Effect of unilateral cornual insemination upon fertilization rate in superovulating andsingle-ovulating cattle. J Anim Sci 1986; 63: 551-560.

47


Hyttel P, Callesen H, Greve T, Schmidt M. Oocyte maturation and sperm transport in superovulated cattle.Theriogenology 1991; 35: 91-108.

Ingraham RH, Kappel LC, Morgan EB, Srikandakumar A. Correction of subnormal fertility with copper andmagnesium supplementation. J Dairy Sci 1987; 70: 167-180.

Kafi M, McGowan MR. Factors associated with variation in the superovulatory response of cattle. AnimReprod Sci 1997; 48: 137-157.

Kelly P, Duffy P, Roche JF, Boland MP. Superovulation in cattle: Effect of FSH type and method of administrationon follicular growth, ovulatory response and endocrine patterns. Anim Reprod Sci 1997; 46: 1-14.

King RS, Anderson SH, Killian GJ. Effect of bovine oviductal estrus-associated protein on the ability ofsperm to capacitate and fertilize oocytes. J Androl 1994; 15: 468-478.

Labernia J, López-Gatius F, Santolaria P, López-Bejar M, Rutllant J. Influence of management factors onpregnancy attrition in dairy cattle. Theriogenology 1996; 45: 1247-1253.

Lamb GC, Miller BL, Traffas V, Corah LR. Estrus detection, first service conception, and embryonic death inbeef heifers synchronized with MGA and prostaglandin. Kansas AES Report of progress. 1997; 783:97.

Larson SF, Butler WR, Currie WB. Reduced fertility associated with low progesterone postbreeding andincreased milk urea nitrogen in lactating cows. J Dairy Sci 1997; 80: 1288-1295.

Loeffler SH, de Vries MJ, Schukken YH, de Zeeuw AC, Dijkhuizen AA, de Graaf FM, Brand A. Use of AItechnician scores for body condition, uterine tone and uterine discharge in a model with disease and milkproduction parameters to predict pregnancy risk at first AI in holstein dairy cows. Theriogenology 1999a; 51:1267-1284.

Loeffler SH, de Vries MJ, Schukken YH. The effects of time of disease occurrence, milk yield, and bodycondition on fertility of dairy cows. J Dairy Sci 1999b; 82: 2589-2604.

López-Gatius F, Santolaria P, Yaniz J, Rutllant J, López-Bejar M. Factors affecting pregnancy loss fromgestation Day 38 to 90 in lactating dairy cows from a single herd. Theriogenology 2002; 57: 1251-1261.

López-Gatius F. Site of semen deposition in cattle: A review. Theriogenology 2000; 53: 1407-1414.

Lucy MC, Stevenson JS, Call EP. Controlling 1st service and calving interval by prostaglandin-f2-alpha,gonadotropin-releasing-hormone, and timed insemination. J Dairy Sci 1986; 69: 2186-2194.

Lucy MC. Reproductive loss in high-producing dairy cattle: Where will it end? J Dairy Sci 2001; 84: 1277-1293.

Lukaszewska J, Hansel W. Corpus luteum maintenance during early pregnancy in the cow. J Reprod Fertil1980; 59: 485-493.

Mann GE, Lamming GE, Robinson RS, Wathes DC. The regulation of interferon-t production and uterinehormone receptors during early pregnancy. J. Reprod. Fertil. (Suppl.) 1998: 317-328.

Mann GE, Lamming GE, Fray MD. Plasma estradiol and progesterone during early-pregnancy in the cowand the effects of treatment with buserelin. Anim Reprod Sci 1995; 37: 121-131.

Mann GE, Lamming GE, Robinson RS, Wathes DC. The regulation of interferon-tau production and uterine

48


hormone receptors during early pregnancy. J Reprod Fertil 1999: 317-328.

Mann GE, Lamming GE. Relationship between maternal endocrine environment, early embryo developmentand inhibition of the luteolytic mechanism in cows. Reproduction 2001; 121: 175-180

Maurer RR, Chenault JR. Fertilization failure and embryonic mortality in parous and nonparous beef-cattle. JAnim Sci 1983; 56: 1186-1189.

Mermillod P, Oussaid B, Cognie Y. Aspects of follicular and oocyte maturation that affect the developmentalpotential of embryos. J Reprod Fertil 1999: 449-460.

Mihm M, Baguisi A, Boland MP, Roche JF. Association between the duration of dominance of the ovulatoryfollicle and pregnancy rate in beef heifers. J Reprod Fertil 1994; 102:123-130.

Moore DA, Cullor JS, Bondurant RH, Sischo WM. Preliminary field evidence for the association of clinicalmastitis with altered interestrus intervals in dairy-cattle. Theriogenology 1991; 36: 257-265.

Moreira F, Risco C, Pires MFA, Ambrose JD, Drost M, DeLorenzo M, Thatcher WW. Effect of bodycondition on reproductive efficiency of lactating dairy cows receiving a timed insemination. Theriogenology2000; 53: 1305-1319.

Mullins KJ, Saacke RG. Study of the functional anatomy of bovine cervical mucosa with special reference tomucus secretion and sperm transport. Anat Rec 1989; 225: 106-117.

Nakao T, Moriyoshi M, Kawata K. The effect of postpartum ovarian dysfunction and endometritis onsubsequent reproductive-performance in high and medium producing dairy-cows. Theriogenology 1992; 37:341-349.

Nebel RL, Mcgilliard ML. Interactions of high milk-yield and reproductive-performance in dairy-cows. JDairy Sci 1993; 76: 3257-3268.

O’Callaghan D, Boland MP. Nutritional effects on ovulation, embryo development and the establishment ofpregnancy in ruminants. Anim Sci 1999; 68: 299-314.

O’Farrell KJ, Langley OH, Hartigan PJ, Sreenan JM. Fertilization and embryonic survival rates in dairy-cows culled as repeat breeders. Vet Rec 1983; 112: 95-97.

Okuda K, Miyamoto Y, Skarzynski DJ. Regulation of endometrial prostaglandin F(2alpha) synthesis duringluteolysis and early pregnancy in cattle. Domest Anim Endocrinol 2002; 23: 255-264.

Pursley JR, Mee MO, Wiltbank MC. Synchronization of ovulation in dairy cows using PGF2α

and GnRH.Theriogenology 1995; 44: 915-923.

Reis EL, Nasser LF, Nichi M, Baruselli PS. Embryonic mortality in recipients (Bos indicus x Bos taurus)superovulated with eCG. Acta Scientiae Veterinariae 2004; 32 (Abstract in press).

Revah I, Butler WR. Prolonged dominance of follicles and reduced viability of bovine oocytes. J ReprodFertil 1996; 106: 39-47.

Rivera RM, Hansen PJ. Development of cultured bovine embryos after exposure to high temperatures in thephysiological range. Reproduction 2001; 121: 107-115.

Roberson MS, Wolfe MW, Stumpf TT, Kittok RJ, Kinder JE. Luteinizing hormone secretion and corpus

49


luteum function in cows receiving two levels of progesterone. Biol Reprod 1989; 41: 997-1003.

Roche JF, Bolandl MP, Mcgeady TA. Reproductive wastage following artificial-insemination of heifers. VetRec 1981; 109: 401-404.

Rodrigues CFM. Ocorrência de mortalidade embrionária em programa de transferência de embriões. ARSVeterinaria 1995; 11: 76-78.

Ruegg PL, Milton RL. Body condition scores of Holstein cows on Prince-Edward-Island, Canada -Relationships with yield, reproductive-performance, and disease. J Dairy Sci 1995; 78: 552-564.

Ryan DP, Prichard JF, Kopel E, Godke RA. Comparing early embryo mortality in dairy-cows during hot andcool seasons of the year. Theriogenology 1993; 39: 719-737.

Saacke RG, DeJarnette JM, Bame JH, Karabinus DS, Whitman SS. Can spermatozoa with abnormal headsgain access to the ovum in artificially inseminated super- and single-ovulating cattle? Theriogenology 1998;50: 117-128.

Santos JEP, Cerri RLA, Ballou MA, Higginbotham GE, Kirk JH. Effect of timing of first clinical mastitisoccurrence on lactational and reproductive performance of Holstein dairy cows. Anim Reprod Sci 2004; 80:31-45.

Sartori R, Gümen A, Guenther JN, Souza AH, Wiltbank MC. Comparison of artificial insemination (AI)versus embryo transfer (ET) in lactating dairy cows. J Dairy Sci 2003a; 86: 238-239 (Abstract).

Sartori R, Haughian, J. M., Shaver, R. D., Rosa, G. J. M., Wiltbank M. C. Comparison of ovarian functionand circulating steroids in estrous cycles of Holstein heifers and lactating cows. J. Dairy Sci. 2004a; 87: 905-920.

Sartori R, Rosa GJM, Wiltbank MC. Ovarian structures and circulating steroids in heifers and lactating cowsin summer and lactating and dry cows in winter. J Dairy Sci 2002a; 85: 2813-2822.

Sartori R, Sartor-Bergfelt R, Mertens SA, Guenther JN, Parrish JJ, Wiltbank MC. Fertilization and earlyembryonic development in heifers and lactating cows in summer and lactating and dry cows in winter. J DairySci 2002b; 85: 2803-2812.

Sartori R, Souza AH, Guenther JN, Caraviello DZ, Geiger LN, Schenk JL, Wiltbank MC. Fertilization rateand embryo quality in superovulated Holstein heifers artificially inseminated with X-sorted or unsorted sperm.Braz J Anim Reprod 2004b (in press).

Sartori R, Suárez-Fernández CA, Monson RL, Guenther JN, Rosa GJM, Wiltbank MC. Improvement inrecovery of embryos/ova using a shallow uterine horn flushing technique in superovulated Holstein heifers.Theriogenology 2003b; 60: 1319-1330.

Schrick FN, Hockett ME, Saxton AM, Lewis MJ, Dowlen HH, Oliver SP. Influence of subclinical mastitisduring early lactation on reproductive parameters. J Dairy Sci 2001; 84: 1407-1412.

Senger PL, Becker WC, Davidge ST, Hillers JK, Reeves JJ. Influence of cornual insemination on conceptionin dairy-cattle. J Anim Sci 1988; 66: 3010-3016.

Silke V, Diskin MG, Kenny DA, Boland MP, Dillon P, Mee JF, Sreenan JM. Extent, pattern and factorsassociated with late embryonic loss in dairy cows. Anim Reprod Sci 2002; 71:1-12.

50


Sinclair KD, Kuran M, Gebbie FE, Webb R, McEvoy TG. Nitrogen metabolism and fertility in cattle: II.Development of oocytes recovered from heifers offered diets differing in their rate of nitrogen release in therumen. J Anim Sci 2000; 78: 2670-2680.

Sreenan JM, Diskin MG, Morris DG. Embryo survival rate in cattle: a major limitation to the achievement ofhigh fertility. In: Fertility in the high producing dairy cow. 26 Occ Publ Br Soc Anim Sci; 2001: 93-104.

Stevenson JS, Johnson SK, Medina-Britos MA, Richardson-Adams AM, Lamb GC. Resynchronization ofestrus in cattle of unknown pregnancy status using estrogen, progesterone, or both. J Anim Sci 2003; 81:1681-1692.

Stevenson JS, Schmidt MK, Call EP. Stage of estrous cycle, time of insemination, and seasonal effects onestrus and fertility of Holstein heifers after prostaglandin F2 alpha. J Dairy Sci 1984; 67: 1798-1805.

Tanabe TY, Deaver DR, Hawk HW. Effect of gonadotropin-releasing-hormone on estrus, ovulation, andovum cleavage rates of dairy-cows. J Anim Sci 1994; 72: 719-724.

Thatcher WW, Binelli M, Arnold D, Mattos R, Badinga L, Moreira F, Staples CR, Guzeloglu A. Endocrineand physiological events from ovulation to establishment of pregnancy in cattle. In: Fertility in the high producingdairy cow. 26 Occ Publ Br Soc Anim Sci; 2001: 81-91.

Thatcher WW, Staples CR, Danet-Desnoyers G, Oldick B, Schmitt E-P. Embryo health and mortality insheep and cattle. J Anim Sci 1994; 72 (Suppl. 3): 16-30.

Vanroose G, de Kruif A, Van Soom A. Embryonic mortality and embryo-pathogen interactions. Anim ReprodSci 2000; 60: 131-143.

Vasconcelos JLM, Silcox RW, Lacerda JA, Pursley JR, Wiltbank MC. Pregnancy rate, pregnancy loss, andresponse to head stress after AI at 2 different times from ovulation in dairy cows. Biol Reprod 1997; 56: 140(Abstract).

Wathes DC. Embryonic mortality and the uterine environment. J Endocrinol 1992; 134: 321-325.

Wehrman ME, Roberson MS, Cupp AS, Kojima FN, Stumpf TT, Werth LA, Wolfe MW, Kittok RJ, KinderJE. Increasing exogenous progesterone during synchronization of estrus decreases endogenous 17 beta-estradiol and increases conception in cows. Biol Reprod 1993; 49: 214-220.

Weller JI, Ezra E. Genetic analysis of somatic cell score and female fertility of Israeli Holsteins with an individualanimal model. J Dairy Sci 1997; 80: 586-593.

Wiebold JL. Embryonic mortality and the uterine environment in 1st-service lactating dairy-cows. J ReprodFertil 1988; 84: 393-399.

Xu ZZ, Burton LJ, Macmillan KL. Reproductive performance of lactating dairy cows following estrussynchronization regimens with PGF2 alpha and progesterone. Theriogenology 1997; 47: 687-701.

Zanenga CA, Pedroso MF. Early pregnancy check by ultrasound scanning in bovine embryo transfer. ARSVeterinaria 1995; 11: 151 (Abstract).

51


CONTROLE DE QUALIDADE DE LABORATÓRIOS DE PRODUÇÃO DE EMBRIÕES

Andrea Giannotti Galuppo

Laboratório de Reprodução Humana-Fac. de Medicina do ABC

INTRODUÇÃO

Cada um dos procedimentos realizados em um laboratório de fertilização in vitro (FIV) deve serexecutado com extrema atenção e responsabilidade, desde a obtenção dos oócitos, até a transferência dosembriões, passando pela manipulação dos meios de cultura e do sêmen (Llerena, 2002). Descuidos ou faltade atenção podem provocar danos ao desenvolvimento do embrião in vitro e conseqüentemente prejudicara qualidade dos resultados obtidos pelo laboratório.

Em geral um laboratório de reprodução assistida é avaliado apenas quanto as suas taxas de gestação.Entretanto não se pode esquecer que para definir a qualidade do serviço prestado por um laboratório, deve-se inicialmente saber qual o objetivo final desse serviço. Se este for apenas a obtenção da gestação, entãopossuir altas taxas de gestação seria um excelente parâmetro de qualidade (Alper et al., 2002). Porém, oobjetivo de um laboratório de FIV deve ser, além de se obter o maior número de gestações possíveis,promover também melhora na qualidade genética dos animais, evitar a transmissão de doenças infecciosas, efornecer um serviço diferenciado que possibilite competição no mercado tanto nacional quanto internacional.

Para tanto é necessário o estabelecimento de um programa de controle de qualidade. O controle dequalidade é um conjunto de normas que devem ser seguidas em um estabelecimento, permitindo a padronizaçãoe a otimização dos procedimentos realizados. O objetivo da implementação de um sistema de controle dequalidade é assegurar o melhor desenvolvimento e precisão dos procedimentos e técnicas utilizadas, almejandoa otimização dos resultados com maior segurança e fidelidade (WHO, 1999). Necessita-se de um controlerigoroso da rotina, da aparelhagem e do desempenho da equipe de laboratório, que deve estar apta a identificare corrigir eventuais problemas. Sendo assim serão aqui discutidos os pontos mais importantes para oestabelecimento de um programa de controle de qualidade eficiente.

Instalações do LaboratórioAntes de estruturar um laboratório de FIV, deve-se realizar um projeto cuidadoso e minucioso, no qual

o laboratório apresente um espaço físico que comporte os equipamentos necessários e permita uma circulaçãoadequada de pessoal durante a realização dos procedimentos (Gianaroli et al., 2000; Gonçalves et al.,2002). O local aonde irá se instalar o laboratório de FIV deve ser de uso exclusivo para esses procedimentose totalmente isolado do ambiente externo. Aconselha-se que não seja próximo a vias de grande movimentoe postos de gasolina, devido a grande quantidade de poluentes presente no ar nesses locais, o que podeprejudicar seriamente a qualidade dos resultados (Cohen et al., 1997; Cohen et al., 1998).

As áreas de trabalho devem ser devidamente delimitadas de forma a permitir o máximo de segurançae eficiência. O laboratório deve possuir um escritório, vestiário, estoque, área de lavagem e esterilização de

Galuppo, A.G. 2004. Controle de qualidade de laboratórios de produção de embriões. Acta Scientiae Veterinariae, 32 (Supl ):51-54.

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materiais, laboratórios de preparo dos meios de cultura, coleta e processamento seminal, coleta e manipulaçãodos oócitos, salas de transferência de embriões e criopreservação, além de um nicho externo para oarmazenamento dos cilindros de CO2 (Gianarolli et al., 2000). Todo laboratório de FIV deve possuir umgerador de emergência para o caso de falha de energia (Gianarolli et al., 2000).

AmbienteO laboratório deve fornecer um ambiente asséptico para a manipulação dos gametas. A temperatura

deve ser devidamente controlada, em torno de 25ºC (Gonçalves et al., 2002), pois este é um dos fatores quemais afetam a qualidade dos oócitos e embriões (Almeida et al., 1995). A iluminação deve ser adequadapara a manipulação de gametas e embriões (penumbra ou luz amarela não fluorescente) (Noda et al., 1994).Para manter uma boa qualidade do ar deve-se possuir, de preferência, um sistema de high efficiencyparticulate air filtration (HEPA) a fim de eliminar partículas de poeira e microrganismos antes que o ar sejainjetado no laboratório ou diretamente nas incubadoras (Cohen et al., 1998). A qualidade do ar dentro dolaboratório depende também de fatores como o número de pessoas presentes, que deve ser restrito, uso decosméticos, e tipo de roupas utilizadas, devendo-se optar por tecidos que não liberem fibras. Preferencialmenteas roupas devem possuir mangas longas a fim de cobrir ao máximo a superfície do corpo e, portanto, diminuiro número de partículas liberadas no ambiente. O uso de touca, máscara, pro-pés e luvas sem talco (Reddy etal., 1999) é essencial. Sabe-se que sem a indumentária adequada uma pessoa pode gerar cerca de 2 milhõesde partículas menores que 5µm/min (Llerena, 2002). Deve ser proibido o uso de qualquer material de limpezaque possa ser tóxico ou embriotóxico, como substâncias adstringentes, ceras, aerossóis, ou materiais deconstrução como fórmica, cola e tinta, durante a realização de procedimentos.

EquipamentosOs equipamentos devem ser adequados para o uso em reprodução assistida e de fácil limpeza (Gianarolli

et al., 2000). Uma fonte de água ultrapura é essencial para o bom funcionamento de um laboratório de FIV.Essa água pode ser utilizada no preparo de meios de cultura, na limpeza de materiais e bancadas. Esseequipamento necessita de manutenção constante, com a troca de filtros e desinfecção do sistema (Llerena,2002). Para laboratórios que não possuem esse tipo de equipamento a compra de água ultrapura pode seruma opção viável (Gonçalves et al, 2002).

O laboratório deve conter um fluxo laminar, que funciona filtrando o ar que irá circular em seu interior,excluindo partículas inclusive bactérias e fungos (Clitherow et al, 2001). Para a manipulação do sêmen deve-se utilizar de preferência um fluxo vertical classe II de biossegurança, que oferece maior proteção ao operador,por possuir uma tela de vidro, propiciando uma turbulência mínima do ar interno. Para manipulação dosoócitos e embriões utiliza-se normalmente um fluxo horizontal devido à necessidade do auxílio de uma lupapara a visualização desses. O fluxo deve ser limpo ao final de cada procedimento, com água ultrapura ouálcool 70%, e deve ter os filtros trocados de acordo com a recomendação do fabricante.

Recomenda-se ter pelo menos duas incubadoras, as quais devem ser periodicamente limpas, com umasolução desinfetante tipo Rocall, esterilizadas, e abertas o menor número de vezes possível. Parâmetroscomo: pressão de CO2, temperatura e umidade devem ser controlados com regularidade (Gianarolli et al.,2000). A pressão de CO2 pode ser controlada com o auxílio de um aparelho, o Fryrite (Bacharach Instruments,

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Pittsburg, PA, USA), ou através da medida do pH do meio de cultura, pois a pressão adequada (5% deCO2) mantém o pH do meio entre 7,2 e 7,4 (Clitherow et al, 2001). A temperatura pode ser controlada como uso de um termômetro aferido, mantido dentro da incubadora para comparação com a medida apresentadano visor. A umidade, em torno de 98%, é mantida pela adição de água deionizada ou ultrapura em umabandeja na base da incubadora, a qual deve ser trocada, pelo menos, a cada dez dias para evitar a proliferaçãode microrganismos, principalmente fungos (Llerena, 2002; Clitherow et al., 2001).

Os microscópios e lupas devem passar por manutenção pelo menos uma vez ao ano. Devem possuirplacas aquecedoras em sua superfície, a fim de minimizar a variação térmica sofrida pelos gametas durante amanipulação. A temperatura das placas aquecedoras também deve ser monitorada através do uso determômetros aferidos mantidos em sua superfície. As centrífugas devem ser reguladas para evitar oscilaçõesna rotação. O banho-maria deve ser lavado periodicamente e ter sempre sua temperatura verificada antes douso. Se possível deve-se optar pelo uso de uma geladeira especifica para laboratório, pois esta possui umsistema mais eficiente de controle de temperatura. No caso de uma geladeira residencial deve-se manter emseu interior um termômetro aferido para checagem da variação da temperatura (Giannaroli et al., 2000).Todos os aparelhos devem possuir certificação de manutenção periódica.

Materiais Descartáveis e Meios de CulturaPara manutenção da qualidade dos procedimentos deve-se utilizar sempre que possível materiais

descartáveis, estéreis e devidamente testados para laboratório de FIV. Os materiais não devem ser reutilizadosde um procedimento para outro, devendo ser descartados imediatamente após o uso.

Os meios de cultura produzidos comercialmente devem ser monitorados quanto à forma de transporte,armazenamento e integridade dos frascos. Devem ser mantidos refrigerados e abrigados da ação da luz paramanutenção de suas características físico-químicas, como osmolaridade e pH. O registro do controle dequalidade de cada produto deve ser fornecido pelo fabricante sempre que solicitado. É sempre recomendávelanotar o lote e data de validade dos meios e reagentes utilizados em cada procedimento (Giannaroli et al.,2000). Os meios devem ser sempre manipulados sob condições assépticas.

Qualificação do PessoalPara garantir as condições seguras de cultura o pessoal do laboratório deve estar bem capacitado

quanto as técnicas de assepsia e antissepsia. A manipulação de material biológico deve sempre ser realizadacom muito cuidado, devido a possibilidade de contaminação cruzada e transmissão de doenças infecciosas,tanto para os animais quanto para o pessoal do laboratório. É muito importante a lavagem correta das mãos,antes de iniciar qualquer procedimento laboratorial, e o uso de todos os equipamentos de segurança biológica,como luvas e óculos de proteção (Giannaroli et al., 2000). Toda a equipe deve passar constantemente porcursos de reciclagem e educação continuada, para que novas tecnologias possam ser aplicadas no laboratório,a fim de melhorar sua eficiência e resultados.

DocumentaçãoTodo material que chega ao laboratório deve estar devidamente identificado. Todos os procedimentos

devem ser documentados, incluindo resultados e intercorrências. Devem ser mantidos livros com as anotaçõesreferentes ao controle de qualidade do ambiente do laboratório (ex: temperatura), manutenção dos

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equipamentos (ex: trocas de filtros e revisão), limpeza do laboratório e etc. Os resultados devem ser avaliadosregularmente, principalmente quanto a taxas de fertilização, gestação, implantação e qualidade dos embriõesproduzidos (Gianarolli et al., 2000).

Conclusão

Para que um programa de controle de qualidade seja bem executado depende da participação ecooperação de toda a equipe. A falta de comprometimento com as normas pré-estabelecidas põe em riscoa segurança não só do indivíduo responsável, mas também, de toda a equipe e dos animais, podendo resultarem danos para os gametas e embriões e até na transmissão de doenças. Sendo assim é extremamenteimportante que todas as normas sejam respeitadas, para que ao final o produto obtido seja o de melhorqualidade possível, e que esta qualidade possa ser certificada através de toda a documentação produzidadurante a execução dos procedimentos.

Referências

Almeida, P.A.& Bolton, V.N. The effect of temperature fluctuations in the cytoskeletal organization andchromosome constitution of the human oocyte. Zygote, 3: 357-65, 1995.

Alper, M.M.; Brinsden, P.R.; Fisher, R. & Wikland, M. Is your IVF programme good? Hum. Reprod. 17(1):8-10, 2002.

Clitherow, B.; Froud, S.J. & Luker, J. Good laboratory practice in the cell culture laboratory. In: Basic cellculture. Ed Oxford press, EUA, cap10, p325, 2001.

Cohen, J.; Gilligan, A. & Willadsen, S. Culture and quality control of embryos. Hum.Reprod. 13(3): 137-144, 1998.

Cohen, J.; Gilligan, A.; Esposito, W.; Schimel, T.; Dale, B. Ambient air and its potential effects on conceptionin vitro. Hum.Reprod. 12(8): 1742-9, 1997.

Gianaroli, L.; Plachot, M.; Kooij, R.; Al-Hasani, S.; Dawson, K.; DeVos, A. et al. ESHRE guidelines forgood practice in IVF laboratories. Hum.Reprod. 15(10): 2241-2246, 2000.

Gonçalves, P.B.D; Visintin, J.A.; Oliveira, M.A.L.; Montagner, M.M.; Costa, L.F.S. Produção in vitro deembriões. In: Biotécnicas aplicadas à reprodução animal Ed Varela, São Paulo, cap10, p.195, 2002.

Llerena, P.V. Control de calidad en el laboratorio de reproducción asistida. In: Reproducción humana einfertilidad. Ed. Imp. Boutique creativa, Quito, cap10, p.475, 2002.

Noda, Y.; Goto, Y.; Umaoka, Y.; Shiotani, M. Culture of human embryos in alpha modification of Eaglemedium under low oxygen tension and low illumination. Fertil Steril, 62: 1022-7, 1994.

Reddy, V.R.; Thomas, T.S.; Wright, H.R.; Fisher, M.D.; Edlich, R.F. The scientific basis of surgical gloveselection in an in vitro fertilization laboratory. J.Biomed.Mater.Res., 48(4): 569-71, 1999.

World Healthy Organization. Quality control in the andrology laboratory. In: WHO laboratory manual for theexamination of human semen and sperm-cervical mucus interaction, 4th ed., Cambridge University Press,UK, cap4, p.36, 1999.

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TRANSFERÊNCIA DE OVÓCITOS E INJEÇÃO INTRACYTOPLASMATICA DEESPERMATOZÓIDE EM EQÜINOS

Marco A. Coutinho da Silva

Animal Reproduction and Biotechnology Laboratory Colorado State University,Fort Collins, CO 80523, USA

Introdução

Avanços nas técnicas de reprodução assistida tem ajudado na obtenção de gestações de animaissubférteis. Em humanos, e também em varias espécies de animais domésticos, a produção in vitro de embriõestem sido realizada com sucesso. Entretanto, em eqüinos, a produção de embriões in vitro ainda não é bemsucedida. Comparado com as outras espécies, as razões que podem ser atribuídas ao progresso retardadoda técnica de fertilização in vitro em eqüinos incluem: escassez de ovários para obtenção de ovócitos, e a faltade um método adequado para maturação dos ovócitos e para capacitação espermática. Atualmente, somentedois potros foram produzidos através de fertilização in vitro de ovócitos maturados in vivo(3, 50). Embora afertilização in vitro não tenha alcançado sucesso em eqüinos, métodos alternativos para a fertilização in vitroou in vivo de ovócitos eqüinos tem sido desenvolvidos, como a transferência de ovócito (OT), transferênciaintrafallopiana de gametas (GIFT) e a injeção intracitoplasmática de ovócitos (ICSI).

Transferência de Ovócito

OT envolve a transferência do ovócito da égua doadora para o oviduto da receptora, e inseminaçãointra-uterina da receptora com sêmen do garanhão desejado. OT é geralmente realizada em éguas valiosas,as quais não produzem mais embriões que possam ser coletados. Razões associadas com a falha na produçãode embriões viáveis incluem: falha na ovulação, falha na captação do ovócito, e patologias no oviduto, úteroe cervix[9]. Para OT, o ovócito é coletado antes da ovulação e, portanto, a única exigência para a éguadoadora é o desenvolvimento de folículos pré-ovulatórios.

A primeira OT realizada com sucesso em eqüinos ocorreu em 1988[46]. Entretanto, altas taxas deprenhez com OT só foram obtidas por Carnevale e Ginther em 1995, quando uma taxa de desenvolvimentoembrionário de 92% foi obtida após a transferência de ovócitos de doadoras jovens para receptoras jovens.O sucesso da OT depende da qualidade do ovócito, da receptora, e do sêmen utilizados.

Coleta, cultivo e transferência de ovócito.

Ovócitos podem ser coletados em diferentes estágios de maturação. Ovócitos utilizados em experimentossão geralmente coletados de ovários obtidos em abatedouro ou de éguas vivas. Entretanto, a qualidade dos

Coutinho da Silva, M.A. 2004. Transferência de ovócitos e injeção intracytoplasmatica de espermatozóide em eqüinos. ActaScientiae Veterinariae, 32 (Supl ) 55-64.

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ovócitos coletados de ovários de abatedouro tem sido inconsistente[5, 6]. A coleta de ovócitos de éguas vivaspermite um maior controle de fatores que afetam a qualidade do ovócito, como a idade da doadora, o estagiodo ciclo reprodutivo, prenhez, e condição corporal da doadora[1, 4, 25].

Vários métodos já foram utilizados para a coleta de ovócitos em eqüinos, entre eles: laparotomia[60],punção transcutanea pelo flanco[51] e aspiração transvaginal guiada por ultra-som (TVA;[22]). Atualmente, emnosso laboratório, o método utilizado para a coleta de ovócitos e a TVA utilizando um transdutor linear deultra-som, como descrito por Carnevale e Ginther (1993). TVA tem a vantagem de ser um procedimentonão-cirúrgico, permitindo coletas repetidas de ovócitos. Durante o procedimento, a probe do ultra-som,colocada em um prolongador de plástico que contem o guia da agulha, e introduzida na porção cranial davagina. O ovário é colocado sobre o transdutor através de manipulação retal, e o folículo e visualizado. Umaagulha é introduzida no folículo e o conteúdo folicular é removido utilizando-se aspiração a vácuo e lavagemdo folículo com meio.

As taxas de recuperação de ovócitos utilizando-se a TVA variam de acordo com o estágio dedesenvolvimento do folículo. Taxas de recuperação para ovócitos eqüinos imaturos e baixa, variando de 12a 47%[7, 33, 40, 48, 58]. Em comparação, as taxas de recuperação de ovócitos apos a indução da ovulação variamentre 50 e 85%[4, 11, 12, 14, 22-24, 43]. O aumento da taxa de recuperação de ovócitos pre-ovulatorios em comparaçãocom ovócitos imaturos pode ser explicada por alterações morfologias nas conexões entre o ovócito e aparede do folículo que ocorrem durante a expansão das células do cumulus[35].

As taxas de maturação de ovócitos eqüinos in vitro (IVM) são baixas quando comparadas com as deoutras espécies. Alem disto, o desenvolvimento embrionário de ovócitos maturados in vitro também é baixo,variando entre 10 e 18%[52,58]. Em comparação, a transferência de ovócitos coletados de folículos pré-ovulatorios resulta em melhores taxas de desenvolvimento embrionário.

Geralmente, os ovócitos são coletados aproximadamente entre 24 e 36 h apos a administração degonadotropina corionica humana (hCG). Ovócitos coletados as 24 h após a administração de hCG encontram-se em metáfase I e necessitam cultivo in vitro para completarem a maturação [13]. Esses ovócitos são cultivadosa 38,5 ºC em uma atmosfera de 5 to 6% CO2

em ar por aproximadamente 12 h. A maioria dos ovócitoscoletados a 36 h apos a administração de hCG encontram-se em metáfase II[4] e, portanto, podem sertransferidos imediatamente para o oviduto da receptora. As taxas de recuperação de ovócitos edesenvolvimento embrionário para ovócitos coletados as 24 ou 36 h apos a administração de hCG sãosemelhantes[24, 38].

A transferência de ovócitos para o oviduto da receptora é realizada através de laparotomia peloflanco[10, 14]. Após sedação e anestesia local, uma incisão e feita no flanco do animal e o ovário e o ovidutosão exteriorizados. O ovócito e um pequeno volume de meio (< 150 µl) são aspirados em uma pipeta devidro. A abertura do infundíbulo é localizada e a pipeta e introduzida de dois a três cm no oviduto, onde oovócito e depositado. O ovário é reposicionado na cavidade abdominal e as camadas musculares e a pelesão suturadas. As receptoras recebem phenylbutazona (2 g por dia) durante a cirurgia e por mais dois dias.O antibiótico (Penicilina G Procaína, 20,000 IU/kg, i.m., por dia) é administrado durante a cirurgia e por maiscinco dias após a transferência.

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Éguas receptoras

Durante OT, o transporte e a capacitatação espermática, bem como a fertilização e o desenvolvimentoembrionário, ocorrem no trato reprodutivo da receptora. Portanto, a seleção de éguas receptoras paraserem utilizadas em um programa de OT é muito importante. Éguas jovens (3 a 10 anos) são selecionadasapós um completo exame físico e reprodutivo, e somente éguas em perfeito estado são selecionadas. Alémdisto, durante o exame reprodutivo, o comprimento do ligamento largo é avaliado para determinar se osovários podem ser facilmente expostos durante a transferência; éguas com um comprimento pequeno doligamento largo não são utilizadas como receptoras de ovócitos.

As receptoras de ovócitos podem ser cíclicas ou acíclicas. O uso de éguas cíclicas como receptorasenvolve a sincronização entre a doadora e a receptora, e também a remoção do ovócito pré-ovulatório dareceptora[10]. Portanto, as receptoras recebem 2000 I.U. de hCG ao mesmo tempo em que as doadoras, eo ovócito da receptora e coletado aproximadamente 24 h apos a administração do hCG. Somente sãoutilizadas as receptoras das quais o ovócito foi coletado. O uso de receptoras acíclicas elimina a necessidadede sincronização entre doadora e receptora e da coleta do ovócito da receptora antes da transferência[8].Receptoras acíclicas recebem 3 mg de estradiol diariamente, por aproximadamente 3 a 6 dias antes datransferência. Suplementação de progesterona ou progestagenos apos a transferência e necessária, usandoreceptoras cíclicas ou acíclicas. Embora haja a formação de um corpo lúteo apos a aspiração do folículopré-ovulatorio[39], a secreção de progesterona pode ser mais lenta e reduzida[46]. Em éguas acíclicas, aausência de corpo lúteo exige a suplementação de progesterona. Portanto, Altrenogest (0.044 mg/kg) ouprogesterona em óleo (200 mg/dia) é administrado[8].

Sêmen e inseminações

Para a fertilização ocorrer com sucesso, alem do ovócito maduro, e necessário que o espermatozóideesteja presente no oviduto. Para se obter uma alta taxa de fertilização, são necessários: numero suficiente despermatozoides na inseminação, com boa motilidade, morfologia normal, e habilidade de sofrer a capacitaçãoe a reação acrosomal. As receptoras de ovócitos devem ser inseminadas com um mínimo de 5 x 108

espermatozóides moveis, com sêmen fresco ou refrigerado. O uso de sêmen congelado para inseminação dereceptoras de ovócitos não e aconselhável, porque a fertilidade do sêmen congelado é geralmente menor doque o sêmen a fresco ou refrigerado[54, 55].

Quando sêmen fresco ou refrigerado de boa qualidade é utilizado, as receptoras de ovócitos podemser inseminadas apenas uma vez, aproximadamente 12 h antes da transferência. Em um estudo recente,Carnevale et al. (2002) inseminou as receptoras de ovócitos 12 h antes e 2 h depois da transferência comsêmen resfriado de garanhões diferentes; os autores observaram que 94% dos embriões produzidos foramoriginados da primeira inseminação. Entretanto, quando a qualidade espermática não e ótima, uma segundainseminação 2 h após a cirurgia pode aumentar as chances de fertilização.

O útero das receptoras é avaliado por ultra-sonografia por 2 a 3 dias após a transferência para adetecção de fluido intra-uterino. As receptoras que acumulam fluido são tratadas com 20 a 30 IU deocitocina a cada 12 h, ate a completa eliminação do fluido intra-uterino.

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Aplicação clinica da transferência de ovócito

OT vem sendo realizada comercialmente na Colorado State University desde 1998. As éguas doadorasdo programa de OT possuem historias de falha reprodutiva em programas de inseminação e transferência deembrião. Os procedimentos realizados no programa comercial são similares aos descritos acima. Quandose observa na doadora um folículo maior ou igual a 35 mm em diâmetro, juntamente com edema uterino, erelaxamento da cervix e útero, a doadora recebe uma combinação de GnRH e hCG. As doadoras recebemdeslorelin (Ovuplant®, 2.2 mg; Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, IA, USA) e, apos 4 h, 2000 I.U. dehCG. A coleta de ovócito e realizada aproximadamente 22 h apos a administração do hCG.

As receptoras utilizadas no programa comercial são éguas jovens, e podem ser cíclicas ou acíclicas.Dados obtidos das estações reprodutivas entre 1998 e 2002 demonstraram taxas de prenhez similares quandoos ovócitos foram transferidos em receptoras cíclicas (27/79, 34%) ou acíclicas (98/249, 39%). No dia datransferência, as receptoras começam a receber suplementação de progesterona injetável, em doses crescente(50, 100, 150 and 200 mg), ate que 200 mg de progesterona sejam administrados diariamente. O diagnósticode gestação e feito nos dias 12, 14 e 16 apos a transferência e, quando prenha, as receptoras começam areceber Altrenogest (ReguMate®, 0.044 mg/kg, daily; Intervet Inc., Millsboro, DE, USA) e a administraçãode progesterona injetável e interrompida. A suplementação de progestágenos e interrompida por volta de120 a 150 dias de gestação, desde que níveis elevados de progestágenos de origem placentária sejamobservados.

Em nosso programa comercial, a maioria das receptoras são inseminadas com sêmen refrigerado degaranhões com fertilidade variada. Como já foi mencionado, o uso de sêmen de boa qualidade e necessáriopara o sucesso da OT. Os proprietários são aconselhados a utilizar sêmen de garanhões férteis, e a enviarmúltiplas doses de sêmen por transferência para assegurar que um número suficiente de espermatozóidesestarão no oviduto no momento da fertilização. As receptoras são inseminadas aproximadamente 12 h antesda transferência e, se houver sêmen suficiente, novamente 2 h apos a transferência.

Durante a estação reprodutiva de 2003, nosso programa comercial realizou OT em 30 éguas doadoras,com idades entre 4 e 20 anos (media = 19.2 anos). No total, 148 folículos foram aspirados, em 122 ciclos,e 110 ovócitos foram recuperados, resultando em uma taxa de recuperação de ovócito de 74% por folículoaspirado, e 90% por ciclo. Um total de 102 transferências foram realizadas e as taxas de prenhez obtidasnos dias 16 e 50 apos a transferência foram de 43% e 35% respectivamente. Uma ou mais gestações foramobtidas de 22/30 (73%) doadoras em nosso programa. Portanto, OT provou ser uma técnica eficaz naprodução de gestações de éguas subférteis.

Transferência Intrafallopiana de Gametas

Embora as siglas OT e GIFT sejam utilizadas indistintivamente na literatura, algumas diferenças devemser mencionadas. Durante OT, o ovócito da doadora e transferido para o oviduto da receptora, e a receptorae inseminada no útero. GIFT envolve a transferência do ovócito e de um baixo número de espermatozóides(2 to 5 x 105 sperm) para o oviduto da receptora. Uma vez que a GIFT exige um baixo número deespermatozóides e os espermatozóides são depositados próximo ao local de fertilização, essa técnica tem o

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potencial para ser utilizada nos casos em que o número de espermatozóides disponíveis para a inseminaçãosão baixos, i.e., garanhões subférteis, sêmen congelado, e sêmen sexado.

Durante GIFT, os espermatozóides são depositados na região do infundíbulo ou ampola do oviduto,não passando pelo útero e a junção utero-tubarica. Portanto, os espermatozóides devem ser separados doplasma seminal, contaminação e debri. Além disto, spermatozoides com morfologia normal e móveis devemser selecionados do ejaculado. O método escolhido para separar espermatozóides para serem usados emGIFT foi o gradiente de Percoll[8, 9, 23, 24]. Nestes estudos, sêmen foi centrifugado através do gradiente dePercoll (90/45%), e aproximadamente 2 a 5 x 105 espermatozóides foram transferidos para o ovidutojuntamente com os ovócitos. A taxa de desenvolvimento embrionário com GIFT utilizando-se sêmen afresco (não diluído) variou de 27 a 82%, demonstrando que GIFT pode ser uma técnica alternativa a OT,quando o numero de espermatozóides disponível é baixo.

Entretanto, em programas comerciais, a maioria das inseminações de rotina são feitas com sêmenrefrigerado e congelado. Portanto, em um estudo recente, o uso de sêmen refrigerado e congelado paraGIFT foi investigado[24]. Quando as receptoras foram inseminadas com sêmen resfriado no útero (OT) ou nooviduto (GIFT), as taxas de desenvolvimento embrionário foram 83% (19/23) e 25% (4/16) respectivamente.O uso de sêmen congelado para GIFT resultou em uma taxa de desenvolvimento embrionário de apenas 8%(1/12). As baixas taxas de desenvolvimento embrionário encontradas com o uso de sêmen resfriado oucongelado podem ser causadas por fatores associados com os processos de refrigeração e congelamentoque prejudicam a fertilização quando o sêmen e depositado no oviduto. Estudos são necessários parainvestigar os efeitos do meio diluente, refrigeração e congelacão dos espermatozóides nas interações entreespermatozóide, oviduto e ovócito, apos a inseminação no oviduto. Para a indústria do cavalo, a utilizaçãobem sucedida de sêmen resfriado e congelado para GIFT resultaria em uma nova técnica de reproduçãoassistida para ser usada na produção de gestações de éguas e garanhões subférteis.

Injeção Intracitoplasmática de Espermatozóide

A fertilização in vitro (IVF) em eqüinos tem produzido resultados insatisfatórios. As taxas de fertilizaçãoapos IFV descritas na literatura variam de 4 a 33%[19, 29, 61], mas somente um laboratório, que obteve altastaxas de fertilização, publicou trabalhos subseqüentes utilizando a mesma técnica, e a taxas de fertilização nãoforam reproduzidas[27, 28]. Uma das razões para a falta de sucesso da IVF em eqüinos é a inabilidade doespermatozóide em penetrar a zona pelúcida. Isto pode ser atribuído a métodos ineficientes de capacitaçãoespermática in vitro e/ou alterações na zona pelúcida que a fazem resistente à penetração. Os problemasassociados com a penetração do espermatozóide na zona pelúcida podem ser superados pela injeção doespermatozóide através da zona pelúcida, em um procedimento chamado injeção intracitoplasmática deespermatozóide (ICSI). ICSI tem sido utilizada em eqüinos porque ela faz com que não sejam necessáriosalguns dos eventos críticos para a fertilização, como a capacitação espermática, reação acrosomal, aderênciae penetração da zona pelúcida, e fusão do espermatozóide com o ovócito.

Os ovócitos usados para ICSI podem ser coletados e maturados in vivo ou in vitro. O desenvolvimentoembrionário de ovócitos maturados in vitro (IVM) e geralmente menor do que o de ovócitos maturados in

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vivo, quando transferidos para o oviduto de receptoras[52, 58]. Entretanto, a maioria dos estudos realizadoscom ICSI utilizaram ovócitos coletados de ovários obtidos em abatedouros e maturados in vitro[2, 16-18, 20, 26-

28, 32, 36, 37, 43-45, 59]. Após a maturação, as células do cúmulos são removidas e somente os ovócitos queexpeliram o primeiro corpúsculo polar, e estão em metáfase II, são injetados com o espermatozóide.

Para se obter sucesso com a ICSI, algumas características devem ser observados com relação aoespermatozóide escolhido para a injeção. Na teoria, não ha necessidade de que o espermatozóide a serutilizado para ICSI seja móvel, uma vez que o espermatozóide e injetado dentro do ovócito. Entretanto,Lazzari et al. (2002) observaram baixas taxas de fertilização (9%) e ausência de desenvolvimento embrioná-rio quando espermatozóides sem motilidade foram utilizados para a ICSI. No mesmo estudo, quandoespermatozóides de garanhões subférteis com motilidade entre 10 e 30% foram utilizados, taxas de fertiliza-ção e morula/blastocisto de 79 e 36% foram observadas, respectivamente. Portanto, a utilização deespermatozóides móveis para ICSI resultou em maiores taxas de fertilização e desenvolvimento embrionário.

Durante a preparação do espermatozóide para ICSI, o flagelo do espermatozóide é danificado paraimobilizar o espermatozóide e também para lesar a membrana plasmática. Acredita-se que a ruptura damembrana plasmática facilite a liberação de fatores espermáticos para ativação do ovócito[30]. A ativação doovócito durante a fertilização induz oscilações dos níveis de cálcio intracelular, importantes para o reinicio dameiose, formação dos pronúcleos, síntese de DNA, e inicio das divisões celulares[15, 31, 42, 49]. Em eqüinos,existe controvérsia com relação a necessidade de se ativar o ovócito após ICSI. A ativação química dosovócitos após ICSI foi benéfica quando sêmen a fresco foi utilizado[37, 41, 56, 57]. Entretanto, quando se utilizousêmen congelado, taxas satisfatórias de formação de pronúcleo (50%) foram observadas sem a necessidadede ativação do ovócito[27, 28, 36, 47]. Além disto, Choi et al. (2002) obteve taxas de formação de pronúcleosimilares utilizando sêmen a fresco ou congelado, sem a ativação dos ovócitos. Portanto, a necessidade deativação dos ovócitos eqüinos apos ICSI permanece obscura; resultados similares podem ser obtidos com aICSI utilizando-se sêmen a fresco ou congelado.

Após a ICSI, os zigotos podem ser cultivados in vitro ou transferidos imediatamente para o oviduto dareceptora. Poucos estudos foram realizados na área de cultivo de embriões eqüinos e, ate o momento, nãoexiste um sistema adequado. O maior problema associado com a falta de pesquisa na área de cultivo deembriões eqüinos e o numero escasso de embriões disponíveis para pesquisa, uma vez que a produção deembriões in vitro não e bem sucedida. Alternativamente, os zigotos podem ser transferidos para o oviduto dareceptora após a ICSI. Em alguns estudos, os zigotos foram transferidos com sucesso para o oviduto deovelhas[34, 43], camundongo[36] e éguas[20, 47]. A transferência de zigotos para o oviduto de receptoras resultouem taxas de morula/blastocisto entre 19 e 50%. Hinrichs et al. (2004) obteve maiores taxas de blastocistoquando os zigotos foram transferidos para o oviduto de éguas (36%) comparado com vários métodos decultivo in vitro (0-20%). Além disto, McKinnon et al. (2000) observou uma redução significativa nas taxasde prenhez após a transferência de embriões cultivados por 24 (17%) ou 48 h (0%) apos a ICSI, comparadocom um cultivo de 4-6 h (38%). A transferência de zigotos apos a ICSI para o oviduto de receptorasproporcionou melhores condições para o desenvolvimento embrionário do que os métodos de cultivo invitro. Entretanto, somente 52 a 67% dos embriões transferidos foram recuperados do oviduto apos atransferência[16, 20].

Apesar das baixas taxas de desenvolvimento embrionário obtidas com a ICSI, alguns potros já foram

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produzidos com essa técnica[21, 45, 47, 59]. Além disto, durante a estação reprodutiva de 2003, nosso laborató-rio produziu 4 potros utilizando sêmen de um garanhão subfértil. Entretanto, ICSI exige um equipamentocaro e treinamento extensivo e, portanto, a utilização clinica desta técnica ainda e limitada. Em um futuropróximo, com a melhora nas taxas de desenvolvimento embrionário da ICSI devido aos avanços obtidoscom pesquisas nas áreas de maturação e ativação de ovócitos e cultivo de embriões, ICSI poderá serutilizada para a produção de gestações a partir de animais subférteis.

Referências

1. Ball B.A., Miller P.G. 1992. Survival of equine embryos co-cultured with equine oviductal epitheliumfrom the four- to eight-cell to the blastocyst stage after transfer to synchronous recipient mares.Theriogenology.37:979-991.

2. Bedford S.J., Kurokawa M., Hinrichs K., Fissore R.A. 2004. Patterns of intracellular calcium oscillationsin horse oocytes fertilized by intracytoplasmic sperm injection: possible explanations for the low successof this assisted reproduction technique in the horse. Biol Reprod.70:936-44.

3. Bezard J. 1992. In vitro fertilization in the mare. Proc Int Sci Conf Biotech Horse Reprod.12.4. Bezard J., Goudet G., Duchamp G., Palmer E. 1995. Preovulatory maturation of ovarian follicles and

oocytes in unstimulated and superovulated mares. Biol Reprod Monographs.1:261-271.5. Bezard J., Mekarska A., Goudet G., Duchamp G., Palmer E. 1997. Timing of in vivo maturation of

maturation of immature oocytes collected simultaneously. Equine Vet J Suppl.33-equine preovulatoryoocytes and competence for in vitro 7.

6. Blue B.J., McKinnon A.O., Squires E.L., Seidel G.E., Jr. 1989. Capacitation of stallion spermatozoaand fertilization of equine oocytes in vitro. Equine Vet J (suppl).8:111-116.

7. Bracher V., Parlevliet J., Fazeli A.R., Pieterse M.C., Vos P.L.A.M., Dieleman S.J., Taverne M.A.M.,Colenbrander B. 1993. Repeated transvaginal ultrasound-guided follicle aspiration in the mare. EquineVet J.15:75-78.

8. Carnevale E.M. 2000. Applications of intraoviductal transfer of gametes in the equine. Arq Fac VetUFRGS.28:89-97.

9. Carnevale E.M., Alvarenga M.A., Squires E.L. 1999a. Use of oocyte transfer in a commercial breedingprogram to obtain pregnancies from mares with reproductive pathologies. Proc 45th Ann Conv AmerAssoc Equine Pract.200.

10. Carnevale E.M., Alvarenga M.A., Squires E.L., Choi Y.H. 1999b. Use of noncycling mares as recipientsfor oocyte transfer and GIFT. Proc Ann Conf Soc for Theriogenology.44.

11. Carnevale E.M., Coutinho da Silva M.A., Maclellan L.J., Neves Neto J.R., Squires E.L. 2002. Effectsof culture media and time of insemination on oocyte transfer. Theriogenology.58:759-762.

12. Carnevale E.M., Ginther O.J. 1993. Use of a linear ultrasonic transducer for the transvaginal aspirationand transfer of oocytes in the mare. J Equine Vet Sci.13:331-333.

13. Carnevale E.M., Ginther O.J. 1995. Defective oocytes as a cause of subfertility in old mares. BiolReprod Monographs.1:209-214.

14. Carnevale E.M., Maclellan L.J., Coutinho da Silva M.A., Scott T.J., Squires E.L. 2000. Comparison ofculture and insemination techniques for equine oocyte transfer. Theriogenology.54:981-7.

62


15. Carroll J. 2001. The initiation and regulation of Ca2+ signalling at fertilization in mammals. Semin CellDev Biol.12:37-43.

16. Choi Y.H., Love C.C., Love L.B., Varner D.D., Brinsko S., Hinrichs K. 2002. Developmental competencein vivo and in vitro of in vitro-matured equine oocytes fertilized by intracytoplasmic sperm injection withfresh or frozen-thawed spermatozoa. Reproduction.123:455-65.

17. Choi Y.H., Love C.C., Varner D.D., Love L.B., Hinrichs K. 2003. Effects of gas conditions, time ofmedium change, and ratio of medium to embryo on in vitro development of horse oocytes fertilized byintracytoplasmic sperm injection. Theriogenology.59:1219-29.

18. Choi Y.H., Love L.B., Varner D.D., Hinrichs K. 2004. Factors affecting developmental competence ofequine oocytes after intracytoplasmic sperm injection. Reproduction.127:187-94.

19. Choi Y.H., Okada Y., Hochi S., Braun J., Sato K., Oguri N. 1994. In vitro fertilization rates of horseoocytes with partially removed zonae. Theriogenology.42:795-802.

20. Choi Y.H., Roasa L.M., Love C.C., Varner D.D., Brinsko S.P., Hinrichs K. 2004. Blastocyst formationrates in vivo and in vitro of in vitro-matured equine oocytes fertilized by intracytoplasmic sperm injection.Biol Reprod.70:1231-8.

21. Cochran R., Meintjes M., Reggio B., Hylan D., Carter J., Pinto C., Paccamonti D., Graff K.J., GodkeR.A. 2000. Production of live foals from sperm-injected oocytes harvested from pregnant mares. JReprod Fertil Suppl.56:503-512.

22. Cook N.L., Squires E.L., Ray B.S., Cook V.M., Jasko D.J. 1993. Transvaginal ultrasound-guidedfollicular aspiration of equine oocytes. J Equine Vet Sci.15:71-74.

23. Coutinho da Silva M.A., Carnevale E.M., Maclellan L.J., Preis K.A., Seidel G.E., Jr., Squires E.L.2004. Oocyte transfer in mares with intrauterine or intraoviductal insemination using fresh, cooled, andfrozen stallion semen. Theriogenology.61:705-13.

24. Coutinho da Silva M.A., Carnevale E.M., Maclellan L.J., Seidel G.E., Jr., Squires E.L. 2002. Effect oftime of oocyte collection and site of insemination on oocyte transfer in mares. J Anim Sci.80:1275-9.

25. Del Campo M.R., Donoso M.X., Parrish J.J. 1992. In vitro maturation of equine oocytes.Theriogenology.37:200.

26. Dell’Aquila M.E., Albrizio M., Maritato F., Minoia P., Hinrichs K. 2003. Meiotic competence of equineoocytes and pronucleus formation after intracytoplasmic sperm injection (ICSI) as related to granulosacell apoptosis. Biol Reprod.68:2065-72.

27. Dell’Aquila M.E., Cho Y.S., Minoia P., Traina V., Lacalandra G.M., Maritato F. 1997. Effects of follicularfluid supplementation of in-vitro maturation medium on the fertilization and development of equine oocytesafter in-vitro fertilization or intracytoplasmic sperm injection. Hum Reprod.12:2766-72.

28. Dell’Aquila M.E., Cho Y.S., Minoia P., Traina V., Lacalandra G.M., Maritato F. 1997. Intracytoplasmicsperm injection (ICSI) versus conventional IVF on abattoir-derived and in-vitro matured equine oocytes.Theriogenology.47:1139-1156.

29. Dell’Aquila M.E., Fusco S., Lacalandra G.M., Maritato F. 1996. In vitro maturation and fertilization ofequine oocytes recovered during the breeding season. Theriogenology.45:547-560.

30. Dozortsev D., Rybouchkin A., De Sutter P., Dhont M. 1995. Sperm plasma membrane damage prior tointracytoplasmic sperm injection: a necessary condition for sperm nucleus decondensation. HumReprod.10:2960-4.

31. Fissore R.A., Dobrinsky J.R., Balise J.J., Duby R.T., Robl J.M. 1992. Patterns of intracellular Ca2+

63


concentrations in fertilized bovine eggs. Biol Reprod.47:960-9.32. Franz L.C., Choi Y.H., Squires E.L., Seidel G.E., Jr., Hinrichs K. 2003. Effects of roscovitine on

maintenance of the germinal vesicle in horse oocytes, subsequent nuclear maturation, and cleavage ratesafter intracytoplasmic sperm injection. Reproduction.125:693-700.

33. Franz L.C., Squires E.L., O’Donovan M.K., Scott T.J., Carnevale E.M. 2001. Collection and in vitromaturation of equine oocytes from estrus, diestrus and pregnant mares. J Equine Vet Sci.21:26-32.

34. Galli C., Crotti G., Turini P., Duchi R., Mari G., Zavaglia G., Duchamp G., Daels P., Lazzari G. 2002.Frozem-thawed embryos embryos produced by ovum-pick up of immature oocytes and ICSI are capableof establish pregnancies in the horse. Theriogenology.58:705-708.

35. Goudet G., Bezard J., Duchamp G., Gerard N., Palmer E. 1997. Equine oocyte competence for nuclearand cytoplasmic in vitro maturation: effect of follicle size and hormonal environment. Biol Reprod.57:232-45.

36. Grondahl C., Hansen T.H., Hossaini A., Heinze I., Greve T., Hyttel P. 1997. Intracytoplasmic sperminjection of in vitro-matured equine oocytes. Biol Reprod.57:1495-501.

37. Guignot F., Ottogalli M., Yvon J.M., Magistrini M. 1998. Preliminary observations in in vitro developmentof equine embryo after ICSI. Reprod Nutr Dev.38:653-63.

38. Hinrichs K., Betschart R.W., McCue P.M., Squires E.L. 2000. Effect of timing of follicle aspiration onpregnancy rates after oocyte transfer in mares. J Reprod Fertil Suppl.56:493-498.

39. Hinrichs K., Rand W.M., Palmer E. 1991. Effect of aspiration of the preovulatory follicle on luteinization,corpus luteum function, and peripheral plasma gonadotropin concentrations in the mare. BiolReprod.44:292-8.

40. Kanitz W., Becker F., Alm H., Torner H. Ultrasound-guided follicular aspiration in mares. In: Sharp DC,Bazer FW, eds. Equine Reproduction. VI vol. Madison, WI: Society for the Study of Reproduction;1995:225-231.

41. Kato H., Seidel G.E., Squires E.L., Wilson J.M. 1997. Treatment of equine oocytes with A23187 afterintracytoplasmic sperm injection. Equine Vet J Suppl.51-3.

42. Kline D., Kline J.T. 1992. Repetitive calcium transients and the role of calcium in exocytosis and cellcycle activation in the mouse egg. Dev Biol.149:80-9.

43. Lazzari G., Crotti G., Turini P., Duchi R., Mari G., Zavaglia G., Barbacini S., Galli C. 2002. Equineembryos at the compacted morula and blastocyst stage can be obtained by intracytoplasmic sperminjection (ICSI) of in vitro matured oocytes with frozen-thawed sperm from semem of different fertilities.Theriogenology.58:709-712.

44. Li X., Morris L.H., Allen W.R. 2000. Effects of different activation treatments on fertilization of horseoocytes by intracytoplasmic sperm injection. J Reprod Fertil.119:253-60.

45. Li X., Morris L.H., Allen W.R. 2001. Influence of co-culture during maturation on the developmentalpotential of equine oocytes fertilized by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). Reproduction.121:925-32.

46. McKinnon A.O., Carnevale E.M., Squires E.L., Voss J.L., Seidel G.E., Jr. 1988. Heterogenous andxenogenous fertilization of in vivo matured equine oocytes. J Equine Vet Sci.8:143-147.

47. McKinnon A.O., Lacham-Kaplan O., Trounson O. 2000. Pregnancies produced from fertile and infertilestallions by intracytoplasmic sperm injection (ICSI) of single frozen-thawed spermatozoa into in vivomatured mare oocytes. J Reprod Fertil Suppl.56:513-517.

64


48. Meintjes M., Bellow M.S., Paul J.B., Broussard J.R., Li L.Y., Paccamonti D., Eilts B.E., Godke R.A.1995. Transvaginal ultrasound-guided oocyte retrieval from cyclic and pregnant horse and pony maresfor in vitro fertilization. Biol Reprod Monographs.1:281-292.

49. Nakada K., Mizuno J., Shiraishi K., Endo K., Miyazaki S. 1995. Initiation, persistence, and cessation ofthe series of intracellular Ca2+ responses during fertilization of bovine oocytes. J Reprod Dev.41:77-84.

50. Palmer E., Bezard J., Magistrini M., Duchamp G. 1991. In vitro fertilization in the horse. A retrospectivestudy. J Reprod Fertil Suppl.44:375-84.

51. Palmer E., Duchamp G., Bezard J., Magistrini M., King A., Bousquet D., Betteridge K.J. 1986. Recoveryof follicular fluid and oocytes of mares by non-surgical puncture of the preovulatory follicle.Theriogenology.25:178.

52. Preis K.A., Carnevale E.M., Coutinho da Silva M.A., Caracciolo di Brienza V., Gomes G.M., MaclellanL.J., Squires E.L. 2004. In vitro maturation and transfer of equine oocytes after transport of ovaries at12 or 22 degrees C. Theriogenology.61:1215-23.

53. Ray B.S., Squires E.L., Cook N.L., Tarr S.F., Jasko D.J., Hossner K.L. 1994. Collection and in vitromaturation of equine oocytes from estrus, diestrus and pregnant mares. J Equine Vet Sci.14:27-30.

54. Samper J.C. 2001. Management and fertility of mares bred with frozen semen. Anim Reprod Sci.68:219-28.

55. Samper J.C., Hellander J.C., Crabo B.G. 1991. Relationship between the fertility of fresh and frozenstallion semen and semen quality. J Reprod Fertil Suppl.44:107-14.

56. Schimid R.L., Kato H., Herickhoff L.A., Shenk J.L., McCue P.M., Chung Y.G., Squires E.L. 2000.Effects of follicular fluid or progesterone on in vitro maturation of equine oocytes before intracytoplasmicsperm injection with non-sorted or sex-sorted spermatozoa. J Reprod Fertil Suppl.56:519-525.

57. Schmid R.L., Kato H., Herickhoff L.A., Shenk J.L., McCue P.M., Chung Y.G., Squires E.L. 2000.Effects of follicular fluid or progesterone on in vitro maturation of equine oocytes before intracytoplasmicsperm injection with non-sorted or sex-sorted spermatozoa. J Reprod Fertil Suppl.56:519-525.

58. Scott T.J., Carnevale E.M., Maclellan L.J., Scoggin C.F., Squires E.L. 2001. Embryo developmentrates after transfer of oocytes matured in vivo, in vitro, or within oviducts of mares. Theriogenology.55:705-15.

59. Squires E.L., Wilson J.M., Kato H., Blaszczyk A. 1996. A pregnancy after intracytoplasmic sperminjection into equine oocytes matured in vitro. Theriogenology.45:306.

60. Vogelsang M.M., Kraemer D.C., Bowen M.J., Potter G.D. 1986. Recovery of equine follicular oocytesby surgical and non-surgical techniques. Theriogenology.25:208.

61. Zhang J.J., Muzs L.Z., Boyle M.S. 1990. In vitro fertilization of horse follicular oocytes matured in vitro.Mol Reprod Dev.26:361-5.

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APLICAÇÃO DE SÊMEN SEXADO EM ANIMAIS DE PRODUÇÃO

Mariano Medina

Centro de Reprodução Goyaike SAACIYF – Argentina:

Na atualidade Argentina dispõe comercialmemte da tecnologia de sexagem de sêmen através da empresaGoyake SA, utilizando de forma exclusiva em bovinos, eqüinos e ovinos e semi exclusiva para o Brasil, quetem a possibilidade de pré-selecionar o sexo das crias nas explorações pecuárias.

Esta tecnologia utiliza a citometria de fluxo para separar as células do espermatozóides de mamíferoscom uma exatidão de quase de 90% para o sexo que se quer, e alcançando porcentagens similares defecundação como sêmen não sexado. A quantidade de DNA, até o momento constitui a única diferença entreos espermatozóides com cromossomo sexual X e Y que permite a aplicação de uma técnica que se poderepetir para a separação. A diferença de conteúdo de DNA entre ambas sub-populações é de 3,8% embovinos, 3,6% em eqüinos e de 4.2% em ovinos.

Na década 80, L. Johnson desenvolveu um procedimento de separação de espermatozóides utilizandoa citometria de fluxo, baseado nas distintas intesidades de luz que emite o DNA dois espermatozóides comcromossomo X ou Y adulterados com uma cor de DNA florescente ao serem excitados com uma luzultravioleta. Uma vez detectada esta diferença, os espermatozóides podem ser separados eletricamente.

Numerosas metodologias foram propostas para conseguir esta separação: centrifugação e separaçãopor gradientes, migração por diferentes cargas elétricas, complexos antígeno-anticorpo. Mas não permitiramuma aplicação em forma efetiva e repetitiva.

Entre as vantagens que oferece a técnica que se destaca a possibilidade de intesificar a seleçãogenética sobre as amostras segumdo as características produtivas a um tempo e custo muito menores.

A possibilidade de utilizar a técnica associada a outras como a transferência embrionária, vertilizaçãoin vitro e ICSI sobre animais de alto mérito genético, permite acelerar ainda mais o progresso genético dossistemas produtivos.

TÉCNICA DE SEXAGEM DE ESPERMATIZOIDES POR CITOMETRIA DE FLUXO

Esta técnica brinda a vantagem de poder selecionar o sexo do produto no momento da concepção,com um acerto maior a 90 % e resultados que se podem repetir, sem impactos importantes de diminuição dasporcentagens de fecundação.

Se basea na diferença de conteúdo de DNA entre o espermatozóide que contêm cromossoma sexualX do que tem cromosoma sexual Y. O primeiro tem por volta de 4% mais de DNA. A citometria de fluxo ea separação de células é uma excelente ferramenta para a medição do conteúdo de DNA e separação decélulas a velocidades altas. Este é o único método com validade científica para a separação de espermatozóidesnas sub-populações X e Y.

Medina, M. 2004. Aplicação de sêmen sexado em animais de produção. Acta Scientiae Veterinariae, 32 (Supl ): 65-74.

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Para a medição do conteúdo de DNA na célula do espermatozóide ao passar pelo citómetro de fluxoé necessário colorir o DNA com uma cor fluorescente que colore de maneira uniforme o DNA da célula eque não produza danos celulares nem comprometa a fertilização ou o desenvolvimento do embrião e anormalidade do animal. Para isso se utiliza Hoechst 33342 e é excitado pela luz ultravioleta de um laser quefaz parte do citómetro. A imagem está represemtada por uma população com maior conteúdo de DNA e portanto com maior fluorescência que a outra, ao situar-se em distintas posições nas coordenadas X e Y. Umavez definida a quantidade de DNA que contem a célula, se seleciona a sub-população que queremos e sesepara carregando-a eletricamente em uma micro gota, cada uma destas células serão atraídas pelo campooposto. Para isso é necessário que os espermatozóides recorram os sistemas envolvidos em um fluido específicopara cada espécie animal que se está processando.

Assim, através desta saída, os espermatozóides são carregados eletricamente pela peça de cristalelétrica; orientados, enfrentando a luz ultravioleta e os detectores ópticos a saída imediata da pipeta. Osespermatozóides devem ser alienados corretamente e calculados de forma correta no tempo necessário paraque o espermatozóide iluminado e identificado como X ou Y possa ser carregado e separado eletricamentedo resto, do micro gotas no final do fluxo.

Todos estes eventos necessitam uma coordenação que permita uma certeza superior a 90% de que oespermatozóide selecionado e separado seja do sexo escolhido. A velocidade de separação é alta, alcançandoaté 4500 espermatozóides separados por segundo.

Para realizar a análise de pureza da produção de espermatozóides sexados em certo período deprodução, se separa uma amostra qualquer da produção e se realiza a leitura através do citómetro e se medea porcentagem que representa a população do sexo escolhido. Se descarta toda a produção que não alcançaum mínimo de 85 % de espermatozóides do sexo escolhido.

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SEXAGEM DE SÊMEN EM BOVINOS E SUA APLICAÇÃO COMERCIAL

O uso de sêmen sexado pode aumentar a rentabilidade da produção através da planificação dosserviços e maior progresso genético em prazos mais curtos, e criar diferentes linhas de animais segundo cadapropósito.

O procedimento para a obtenção do sexo sexado considera:

• Coleta do sêmen: a coleta do sêmen pode realizar-se por meio da vagina artificial, em casos específicos,com um eletro-ejacuador. Se registram as características do ejaculado: volume, aspeto e momento dacoleta. O ejaculado tem de ter de 60% de movilidade progressiva e mais de 75% dos espermatozóidesnormais.(1) Se recomenda o uso de ejaculados com uma concentração de espermatozóides por milímetroigual ou maior a 1,000.(2) Os antibióticos devem se agregar dentro dos 15 minutos da coleta do ejaculado.(1)

• Preparação da amostra para sexagem: a amostra do sêmen é diluída em XE TALP a 400 x 106

espermatozóides por ml para que se afecte com Hoechst 33342 (H33342; Sigma, Saint Louis, MO,USA), incubando a amostra a 35º C durante 30 – 40 minutos. Depois da incubação se agrega 2 ml deXE TALP com 4% de gema de ovo e 0.002 de F & C # 40 (Warner Jemkinson Compane Inc., SaintLouis, MO, USA). Se filtra a amostra por um filtro de 40 µm e logo se processa pelo citómetro de fluxousando um meio líquido que se baixa em meio a base de TRIS (SX MoFlo®, Cetomation Inc. FortCollins, CO, USA), operando a 40 psi.(1, 3)

• Procesamento do sêmen sexado: uma vez selecionado, os espermatozóides são coletados até alcançarum total de 15 ml ou 12 x 106 espermatozóides sexados totais por tubos plásticos de 50 ml com 2 mlmeio baseado em TRIS e 20% de gema de ovo, a temperatura ambiente.(1) Posteriormente se esfria ostubos com sêmen sexados durante 1.5 horas a 5º C como mínimo. Logo se centrifugam a 600 g durante15 minutos, se tira o sobrenadante e se ressuspendem os pellets em meio de congelação até ajustar a aconcentração a 20 x 106 espermatozóides por ml. Carrega-se o sêmen em palhetas de 0,25 ml e secongelam com curva de congelação padrão em congeladora automática de sêmen.

• Avaliação da qualidade seminal pos descongelado: uma palheta tomada ao acaso de cada ejaculadoprocessado é avaliada por motilidade progressiva pós descongelado, descartando aquelas que tenhammenos de 35% de motilidade progressiva. Ademais se realiza a avaliação da pureza no citómetro.

• Utilização na inseminação artificial: a palheta que se utiliza para inseminação deve ser descongelada 30segundos a 37º C, e ser utilizada o mais rápido possível.

A repetição dos resultados obtidos foram demonstrados nos ensaios realizados nos Estados Unidosem distintos Estados e estabelecimentos, utilizando sêmen sexado e controle convencional em novilhas

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inseminadas com diferentes touros.(4) Também se realizaram provas em distintos lugares de inseminação, comdiferentes doses inseminantes. Resultados obtidos na Argentina estandarizam a utilização de doses de 3 x 106

espermatozóides totais para a utilização em inseminação de novilhas a cio que se detectou e sincronização docio com prostagandinas.

TABELA 1

- Aplicação de sêmen sexado para potenciar outras tecnologias: o sêmen sexado foi posto a pontopara a utilização em transferência embrionária e fertilização in vitro. Para o caso de seu uso em umprograma de super-ovulação e transferência de embriões se utilizam 4 palhetas de 10 x 106

espermatozóides sexado totais, uma a tempo zero, duas as 12 horas e 1 as 24 horas da detecção docio.

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TABELA 2

Também foi utilizado em programas de congelação de embriões coletados in vivo. Os resultadosdemonstram que sua utilização não difere da do sêmen convencional.

Sua aplicação também foi levada ao laboratorio de FIV, obtendo resultados que permitem sua aplicaçãocom resultados similares ao sêmen convencional. Se recomenda o uso de três palhetas de sêmen sexado de3 x 106 espermatozóides totais cada uma, para a fertilização de aproximadamente 50 ovinhos.

Em todos os casos, os bezerros nascidos apresentaram iguais características físicas e fisiológicas queos nascidos de sêmen controle e seu crescimento, desenvolvimento e capacidades produtivas e reprodutivasnão se viram alteradas.(5, 18)

SÊMEN SEXADO EM OVINOS

A aplicação comercial da tecnologia de sêmen sexado por citometría de fluxo em bovinos, foi alcançadagraças a utilização de processos de criopreservação exitosos.(6)

O primeiro cordeiro produzido com sêmen sexado se obteve no ano 1996 mediante a técnica de ICSI.Os primeiros 4 cordeiros nascidos (13 % de prenhez) por inseminação com sexado de sêmen foram comsêmen sexado em fresco, no ano 1996, utilizando inseminação laparoscópica na ponta do corno e 100,000espermatozóides sexados totais.(7, 8)

Na Argentina se realizou um ensaio com sêmen sexado fresco na temporada reprodutiva 2002 comdois carneiros os resultados foram:

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O processo utilizado foi o seguinte: se coletou de sêmen de carneiros com vagina artificial e se utilizaramejaculados com mais de 60 % de motilidade progressiva. Se diluiu o sêmen com XE TALP com 10 %plasma seminal heterologo PH 7,4 a 400 x 106 espermatozóides/ml, 2 ml, e se agregou Hoechst 33342.Logo se agregaram 2 ml XE TALP PH 6,8 com 0.002 % de F & C # 40. As amostras foram processadasem um citómetro de fluxo com separador de células (SX MoFlo®, Cetomation Inc. Fort Collins, CO, USA),utilizando como Sheath Fluid, uma solução de PBS. Se coletaram 8 a 10 x 106 espermatozóides totaissexados em um tubo Falcom de 15 ml em 0,9 ml de XE TALP PH 6.8 com plasma seminal heterologo a10 %. Logo se centrifugou 12 minutos a 600 g e o pellet foi resuspendido a 300 µl com XE TALP complasma seminal a 10 %. A inseminação laparoscópica padrão se realizou com 8 x 106 espermatozóides totaispor ovelhas em cio que se detectou. O diagnóstico de gestação se realizou por ultra-sonografia aos 30 diasda inseminação e a porcentagem de acerto para o sexo escolhido foi de 100 %.

Os primeiros dados de prenhez obtidos com sêmen sexado congelado foram realizados na Austráliadurante a temporada reprodutiva 2002. Se utilizaram dois carneiros diferentes, dois lugares de inseminaçãolaparoscópica e dois processos de meios de cogelação distintos.(9)

A coleta do sêmen em carneiros se realiza em temporada reprodutiva por meio da vagina artificial e sóse utilizam ejaculados que contêm mais do 70 % de motilidade progressiva.(9)

Para a preparação da amostra para sexado se diluiu o sêmen em XE TALP(6) a 400 x 106

espermatozóides/ ml, 2 ml totais, com o agregado de Hoechst 33342 (H33342; Sigma, Saint Louis, MO,USA), incubando a amostra durante 1 hora a 34º C. A concentração de Hoechst que se utilizou foi determinadapreviamente por uma serie de provas para cada carneiro. Logo da incubação se agregaram 2 ml de XETALP com 4 % de gema de ovo (v/v) e 0.002 % de F & C # 40 (Warner Jemkinson Compane Inc., SaintLouis, MO, USA), levando a concetração final a 200 x 106 espermatozóides/ ml.(9)

As amostras foram processadas em um citómetro de fluxo com separador de células (SX MoFlo®,Cetomation Inc. Fort Collins, CO, USA). Uma vez coletados os espermatozóides do sexo desejado, estesforam centrifugados a 700 g durante 6 minutos a 30º C. Logo de aspirar o sobrenadante, o pellet de 80 µl foiresuspenso em dois meios de congelação distintos em relação 1:4 (sêmen: diluinte). Os meios utilizadosforam tampão TES com 20 % de gema de ovo e 3 % de glicerol(10), e Zwitterion tampão com 13,5 % degema de ovo e 6 % de glicerol(11). O sêmen convencional controle foi preparado em uma diluição 1:4 (sêmen: diluente) com os mesmos meios. O esfriado se levou a cabo em 1.5 horas até 4º C. Se congelou em formade pellet sobre gelo seco e logo se submergiram em nitrogênio líquido. A descongelação se realizou a 37º Ce a inseminação dentro dos 10 minutos de haver realizado a descongelação.(9)

Se utilizaram duas pastilhas de sêmen sexado e um total de 4 x 106 espermatozóides totais parainseminar, e 140 x 10 6 espermatozóides totais para o caso do controle.

A sincronização do cio das ovelhas se realizou colocando uma esponja intravaginal de progestágenosdurante 12 dias, se injetaram 400 UI de PMSG no momento de retirar a esponja e as 54-57 horas se realizoua inseminação artificial laparoscópica. Se compararam dois lugares de inseminação: standard e na união úterotubárica por meio de uma sonda.

Não houve diferenças significativas nos resultados de prenhez entre os dois lugares de inseminação,mas entre sexado e controle e entre os dois carneiros utilizados.(9)

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Na Argentina se realizou o primeiro ensaio na temporada reprodutiva 2002 utilizando um carneiro e osresultados foram: 3 ovelhas preñadas de 10 inseminadas (33 %), utilizando um processo similar ao utilizadoanteriormente em sêmen fresco mais o diluente em que se resuspendeu foi a base de TES, TRIS, frutose e4% de leite desnatado, 20% de gema de ovo e 6% de glicerol. O sêmen foi refrigerado durante 1.5 horas a4º C e envasado em mini palhetas com 5 x 106 espermatozóides totais por palheta, e congelado em congeladorautomático.

Os resultados foram os seguintes:

A inseminação laparoscópica padrão se realizou com 10 x 106 espermatozóides totais por ovelhas. Odiagnóstico de gestação se realizou por ultra-sonografia aos 30 dias da inseminação e a porcentagem deacerto para o sexo escolhido foi de 100 %.

Posteriormemte se realizou um ensaio em duas Estancias do sul da Argentina com um maior número defêmeas(12).

Na Austrália se realizaram provas com um protocolo baseado na utilização de soluções com tampãoTRIS em preparação da diluição da amostra de sexado, no Sheath Fluid e na solução que recebe osespermatozóides sexados.

Provas in vitro de integridade acrossomal, e capacidade de migração em mucus cervical nãodemonstraram diferenças entre sêmen sexado e não sexado congelado-descongelado.

Enquanto a capacidade de união dos espermatozóides a células do oviduto, não houve diferençasentre espermatozóides sexados e não sexado, embora os sexados se desprenderam mais rapidamente. Invivo, se obteve um 33 % de prenhez com 5 x 106 espermatozóides totais por palheta, versus um 59 % obtidocom 100 x 106 espermatozóides totais por palheta de sêmen controle convencional comercial.(13)

Durante a temporada 2003, utilizando o mesmo protocolo e a inseminação laparoscópica se realizouum ensaio com sincronização de ovulação e inseminação a tempo fixo versus a inseminação a cio detectadoe se obtiveram os seguintes resultados:

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Os resultados demonstraram que a pesar de que não há diferenças entre as porcentagens de prenhezentre os diferentes processos de inseminação, para o caso do uso de sêmen sexado Y, houve um porcentagemsignificativamente maior de prenhez com Inseminação Artificial a Tempo Fixo, que para o sêmen sexado X.Para o caso de sêmen sexado X houve um porcentagem significativamente maior de prenhez com Inseminaçãoa Cio Detectado que com sêmen sexado Y.

Também durante esta temporada se provarão os dois processos para obtenção de sêmen sexado: o jáprovado anteriormente na Argentina baseado em TALP e PBS, e o protocolo utilizado em Austrália baseadoem TRIS.

SÊMEN SEXADO EM EQUINOS

Na espécie eqüina, a possibilidade de selecionar o sexo do produto, brinda a possibilidade não somentede acelerar o progresso genético, como também de sua aplicação as melhoras na performance esportiva.

A aplicação do sêmen sexado em eqüinos no momento se encontra restringido a inseminação artificialprofunda com sêmen fresco, cujo os primeiros resultados em Colorado mostram um 37,5 % de prenhez(14).

O desenvolvimento da utilização da tecnologia de inseminação hiteroscópica na ponta do corno adoses baixas possibilita a utilização do sêmen sexado em eqüinos, já que permite baixar as doses inseminantesa 14 x 106 espermatozóides totais sem alterar as porcentagens de prenhez.(15)

Se encontram como limitantes que a congelação de sêmen sexado ainda apresenta baixos porcentagensde prenhez (13,3 % versus 37,5 % para o controle, utilizando 5 x 106 espermatozóides mótiles sexados totaise inseminação histeroscópica)(16), que não existe ainda um protocolo de superovulação com resultados repetíveispara sua aplicação em transferência embrionária(17) e que em algumas raças, as associações de criadores nãopermitem a aplicação de diferentes biotecnologias da reprodução.

Na Argentina se realizaram distintos ensaios ao longo das temporadas reprodutivas 2001 – 2003.Para estes experimentos se utilizaram garanhões de fertilidade conhecida.

- Coleta de sêmen e tratamento do ejaculado: os garanhões foram coletados com vagina artificial.Foram procesados aqueles ejaculados cujas características eram: motilidade maior que 55 % e maisdo 70 % de espermatozóides normais. Se utilizaram ejaculados livres de gel por filtração e foramliberados do plasma seminal por meio de diluição em diluente KMT e centrifugação durante 10minuto a 600 g, ou bem diluído a 25 x 106 espermatozóides por ml para transporte em Equitainer® eposterior conservação a 15º C até um máximo de 15 horas. Prévio a preparação da amostra, osêmen foi ajustado a 100 x 106 espermatozóides por ml.

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- Preparação de a dose inseminante de sêmen sexado: o sêmen já diluído foi alterado com Hoechst33342 para seu posterior processamento pelo citometro (SX MoFlo®, Cetomation Inc. Fort Collins,CO, USA). Os espermatozóides sexados foram coletados em tubos plásticos de 50 ml com 2 ml deextender KMT até alcançar 15 ml. Uma vez coletados uma quantidade total de 45 (IA profunda) o25 (IA histeroscópica) x 106 espermatozóides totais se utiliza uma alíquota de 0,5 ml para análise dapureza. Se descartaram aquelas doses com menos do 85 % de acerto ao sexo escolhido. Logo secentrifugaram os tubos a 850 g durante 20 minutos, e os pellet se resuspendem em um total de 0,5 mlde diluinte KMT e se colocou em uma palheta de 0,5 ml.

- Inseminação profunda da égua: cada égua foi revisada por ultra-sonografia e palpação retal até quese detectou um folículo maior a 35 mm. A partir de este momento se administrou uma dose de hCGpara sincronização da ovulação e se continuou revisando cada 4 - 6 horas até o momento maispróximo da ovulação. Se realizaram uma média de duas inseminações por égua. Se utilizou umfibroscópio para inseminação na ponta do corno na primeira temporada reprodutiva e na segunda, seprovou esta técnica versus a inseminação artificial profunda com pipeta.

Temporada 2001 - 2002

Se prenharam 6 éguas de 17 inseminadas, das quais 5 foram inseminadas depois de detectada aovulação.

Temporada 2003 – 2004

Se inseminaram 24 éguas de boa performance reprodutiva com IA profunda, e se prenharam 13.

A detecção de prenhez se realizou aos 30 dias de ovulação e o diagnóstico de sexo fetal a os 62 diascom confirmação no nascimento em alguns casos. Para todos os casos, o acerto do sexo foi do 100 %.

- Aplicação em transferência de embriões:

Temporada 2002- 2003

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Durante a temporada 2003 – 2004 se realizou um ensaio utilizando dois garanhões de fertilidadeconhecida e 18 égua ciclicas de 8 a 12 anos de idade com boa atitude reprodutiva. Das 18 coletas serecuperaram 11 embriões e se obtiveram 8 prenhez.

Atualmente a Argentina é o único país que possui a licença comercial exclusiva para a comercializaçãode sêmen sexado eqüino e produção de embriões com esta tecnologia.

REFERENCIAS CITADAS

(1) Schenk J.L., Suh T.K., Cran D.G., and Seidel Jr. Theriogenology 52: 1375-1391, 1999.

(2) Cattaneo L., Aguilar J., Caballero J., Perez S., Cerrate H. And Brogliatti G. Annual Meeting ofInternational Embryo Transfer Society, 2002.

(3) Campos Chillón L. F., De la Torre J. F. and Seidel Jr. Theriogenology , 2003.

(4) Seidel Jr., Schenk J.L., Herickhoff L.A., Doyle S. P., Brink Z., Green R.D. and Cran D.G. Theriogenology52: 1407-1420, 1999.

(5) Seidel Jr., Hasler J. P. Simposio Internacional de Reproducción Animal, Huerta Grande, Córdoba,Argentina, 2001.

(6) Schenk JL, Suh TK, Cran DG, Seidel Jr GE Theriogenology 52:1375-1391, 1999.

(7) Catt SL, Catt JW, Gomez MC, Maxwell WMC, Evans G. Vet Rec 139: 494-495, 1996.

(8) Cran DG, McKelvey WAC, King ME, Dolman DF, McEvoy TG, Broadbent PJ, Robinson JJ,Theriogenology 47: 267 (Abstr), 1997.

(9) Hollinshead F.J., O´brein J.K., He L., Maxwell W.M.C. and Evan G. Rep. Fert. And Dev., 2002.

(10) Johnson LA, Flook JP, Hawk HW Biol Reprod 41:199-203, 1989.

(11) Molinia FC, Evans G, Maxwell WMC Reprod Nutr Dev 36:21-29, 1996.

(12) Cattaneo L., Panarace M., Caballero J., Viteri B., Puyó E. Y Medina M. Proc. Of Annual Meeting ofInternational Embryo Transfer Society, 2003.

(13) Hollinshead FK, Gillan L, O’Brien JK, Evans G, Maxwell WM. Reprod, Fert. And Dev. 15 (6): 351-259, 2003.

(14) Lindsey AC, Bruemmer JE, Squires EL. Anim Reprod Sci 68 (3-4): 279-289, 2001.

(15) Morris LH, Tiplady C, Allen WR. Equine Vet J. 35(2):197-201, 2003.

(16) Lindsey AC, Schenk JL, Graham JK, Bruemmer JE, Squires EL. Equine Vet J. 34(2):121-7, 2002.

(17) Alvarenga MA, McCue PM, Bruemmer J, Neves Neto JR, Squire EL. Theriogenology 56 (5): 879-887, 2001.

(18) Tubman L. M., Brink Z., Suh T. K. and Seidel Jr. Journal of Anim Sci 82: 1029-1036, 2004.

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CLONAGEM ANIMAL E PLACENTAÇÃO

Maria Angélica Miglino

A clonagem animal traduz sem dúvida o grande avanço tecnológico obtido no campo da biotecnologiaanimal. Os recentes resultados de clonagem por transferência nuclear, abrem novas perspectivas no campoda biotecnologia da reprodução e produção animal, bem como sinaliza um futuro promissor para a preservaçãode espécies em extinção.

Embora muitas espécies têm sido clonadas com sucesso, sugerindo boas perspectivas para as aplicaçõespráticas, o processo não pode ainda ser considerado totalmente eficiente.

Sabe-se, hoje que apenas um número mínimo de gestações de clones é levado a termo, se comparadocom gestações de animais produzidos por fertilização “in vitro”. Outro dado muito relevante, que apareceem gestações de animais clonados, é a ocorrência de perdas embrionárias, fetais e pós-natais.

Segundo Bordignon(1), a baixa viabilidade dos embriões clonados é principalmente expressa pela reduçãona taxa de implantação, pelo aumento na taxa de mortalidade fetal e perinatal, e pelas diversas anomaliasobservadas nos animais recém-nascidos. Esses problemas ocorrem possivelmente porque os núcleos decélulas diferenciadas não são corretamente reconduzidos a um estádio embrionário nos embriões clonados,o que leva à expressão errônea de genes que são necessários para sustentar o desenvolvimento normal.Todavia, pelo menos em bovinos, uma pequena proporção dos animais clonados é fenotipicamente normal,cresce de forma saudável, possui um sistema imunitário funcional e pode reproduzir-se e produzir normalmente.Mesmo que ainda não existam provas definitivas de que os animais clonados sejam totalmente normais, osresultados desses estudos sugerem que, em certas condições específicas, pelo menos uma pequena proporçãodos núcleos diferenciados pode ser adequadamente reprogramada para voltar ao estádio embrionário.Identificar como essa condição pode ser conseguida representa um dos principais desafios para desenvolvermelhores protocolos para clonar animais.

A baixa eficiência do processo de clonagem animal envolve problemas, tais como anomaliascromossômicas, alocação anormal do número de células no botão embrionário e trofoectoderma e formaçãodeficiente do fuso mitótico.

Quando ocorre clivagem e desenvolvimento de blastocisto, a taxa de implantação é menor e as perdasfetais normalmente elevadas sugerem deficiências do processo normal de desenvolvimento biológico da espécie.

Apesar das causas do desenvolvimento anormal continuarem obscuras, genes que são marcados(imprinted) de forma diferente têm sido responsabilizados por essas anormalidades(2).

HILL et al.(3) demonstraram em bovinos, uma expressão anormal do complexo de histocompatibilidademaior do tipo I no trofoblasto, e um maior acúmulo de linfócitos T no endométrio de gestações produzidascom embriões clonados comparados com animais controle. Estes resultados sugerem que uma rejeiçãoimunológica também possa estar contribuindo para a grande incidência de perdas gestacionais com embriõesclonados.

Miglino, M.A. 2004. Clonagem animal e placentação. Acta Scientiae Veterinariae, 32 (Supl ): 75-78.

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Uma das causas apontadas por perdas gestacionais é a deficiência placentária. HILL et al(3) apontamque 82% de bovinos clonados por transferência nuclear não sobrevivem entre o 30o e 90o dias de prenhez.Os autores atribuem a essa viabilidade deficiente, o desenvolvimento de um corioalantóide rudimentar, quandocomparado àquele dos animais de controle. De outra parte, os problemas podem estar associados aosfatores que promovem o crescimento placentário e vascular e suas interações materno-fetais tais comoconexões placentárias e formação de vilos coriônicos. De acordo com Dinnyés(4), a deficiência dodesenvolvimento vascular placentário pode ser evidenciada nos ruminantes (bovinos) por estruturascotiledonárias reduzidas ou ausentes.

Fetos anormais, hepatomegalia, hemorragia dérmica(4) hidropsia em vacas receptoras de animaisclonados(5) são alterações constantes envolvidas no processo gestacional de clones, de maneira a sugerir queo desenvolvimento normal de gestações representa casos de exceção.

Placentações ineficientes em embriões clonados foram observadas em camundongos(6), bovinos eovinos(7,8). Tais anormalidades em ruminantes incluem irrigação sangüínea deficiente, aumento da ocorrênciade hidroalantóide, e redução do número e aumento do tamanho dos placentomas. Destas condições decorremas perdas gestacionais, as anomalias e a menor viabilidade de animais clonados.

Casos de hidroalantóide são normalmente detectados em bovinos durante o terceiro trimestre degestação, e estão associados ao aumento da concentração plasmática materna da glicoproteína (PSP60). APSP60 é produzida pelas células trofoblásticas binucleadas as quais desenvolvem um processo migratórioem direção ao epitélio uterino(9).

O número reduzido de placentomas - 39 - menor que em gestações normais e o diâmetro aumentadodestas estruturas - 21cm - maior que os grandes placentomas de gestações normais – 11cm(12), e o peso e aespessura exagerada dos mesmos - 153g , indicam que a placentação em bovinos clonados apresentaanormalidades dignas de maiores esclarecimentos(12) e (13).

De outra parte, áreas hemorrágicas aparentes sobre a superfície dos placentomas edemaciadocertamente sugerem comprometimento da gestação.

Estruturalmente existe total desorganização das “árvores vilosas” fetais, as quais aparecem inseridasnas criptas endometriais em placentas de bovinos clonados. Outro fato notável é a menor densidade de vilospresentes nos chamados megacotiledones. Soma-se a estes fatos a deficiente ramificação vascular sobre asuperfície das chamadas “árvores vilosas”, bem como as dilatações anormais das criptas endometriais ondeesses vilos se inserem.

Os capilares fetais (5-10µm de diâmetro) são menos calibrosos que aqueles observados em gestaçõesnormais (7-12µm). De maneira semelhante, os capilares maternos, são menos calibrosos (9-14µm), que osencontrados em gestações normais (14-28µm), porém mais ramificados.

A interface materno-fetal apresenta-se desorganizada e, as células trofoblásticas que se evidenciamcomo binucleadas encontram-se polinucleadas (tri, tetra, pentanucleadas), com alterações nuclearessignificativas(11,12).

Considerações à parte podem ser feitas com relação a problemas do desenvolvimento embrionário e/ou fetal associado à produção de esteróides e os fatores de crescimento endoteliais (VEGF) e os fatores decrescimento básicos dos fibroblastos (bFGF) com seus importantes papéis na vasculogênese e angiogêneseplacentários, assim como na esteroidogênese placentária(13).

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Com vistas a estudar comparativamente a produção de progesterona (P4) na placenta de bovinosclonados e não clonados (de termo), sob a influência do VEGF e bFGF, verificamos que as células placentáriasdas gestações de clones não são capazes de produzir progesterona, tal como as células placentárias degestações normais da mesma fase. Nestas, a estimulação de VEGF e bFGF poderia incrementar a produçãode progesterona nas células placentárias em 48 horas em cultura, enquanto ambos os fatores juntos induzemum incremento de P4 em 24 horas. De outra parte, as células placentárias de clones não respondem à adiçãodos fatores de crescimento. Isto pode ser explicado pelas diferenças na ativação gênica e expressão emanimais clonados e nas suas placentas.

Quando comparamos reações imunomarcadas de VEGF em cortes de placentomas de animais clonadose não clonados, verificamos que a marcação nos clonados é mais evidente que nos controles. Ao mesmotempo, a expressão do VEGFR-1 é menor nos placentomas de clones, enquanto que a marcação paraVEGFR-2 permanece a mesma ou é reduzida em relação ao controle. A expressão de bFGF foi reduzida emtodas as amostras dos placentomas de clones.

VEGF, VEGFR-1 e VEGFR-2 são regulados por fatores como hipóxia e níveis de hormôniosesteróides(14) os quais potencializam ou decrescem o sistema de transcrição do VEGF. Variações do sistemade expressão do VEGF podem comprometer o crescimento vascular, a permeabilidade e o suprimentotecidual. Um decréscimo da expressão de bFGF pode contribuir para os defeitos vasculogênicos eangiogênicos, assim como para as alterações da diferenciação das células trofoblásticas, como já relatadonas placentas dos clonados.

Nosso resultados demonstram que dois dos principais fatores controladores da vasculogênese eangiogênse da placenta estão alterados, os quais podem contribuir para a alta mortalidade destes embriões.

Referências bibliográficas

1. Bordingnon, V. “Clonagem de animais por transferência nuclear: Avanços e desafios”. Acta scientiaeveterinarie. Supl. 31, P. 64-73, 2003.

2. Bordignon, V.; Smith, L. “Clonagem animal por transferência nuclear” In: Gonçalves, P.B.D.;Figueiredo, J.R.; Freitas, V.J.F. Biotécnicas aplicadas à reprodução animal. São Paulo: Varela,p.281-303, 2002.

3. Hill, J.R.; Burghardt, R.C.; Jones, K.; Long, C.R.; Shin, T.; Spencer, T.E.; Thompson, J.A.; Winger,Q.A.; Wethusin, M.E. “Evidence for placental abnormality as the major cause of mortality in first-trimester somatic cell cloned bovine fetuses”. Biology of reproduction, v.63, p. 1787–1794, 2000.

4. Dinnyés, A.; Sousa, P.; King, T.; Wilmut, I. “Somatic cell nuclear transfer: recent progress andchallenges”. Cloning and stem cells, v.4, n.1, 2002.

5. Heyman, Y; Zhou, Qi; Lebourhis, D.; Chavatte-Palmer, P.; Renard, J.P.; Vignon, X. “Novel approachesand hurdles to somatic cloning in cattle”. Cloning and stem cells, v.4, n.1, 2002.

6. Tanaka S.; Oda M.; Toyoshima Y.; Wakayama T.; Tanaka M.; Yoshida N.; Hattori N.; Ohgane J.;Yanagimachi R.; Shiota K.: “Placentomegaly in cloned mouse concepti caused by expansion of thespongiotrophoblast layer”. Biology of reproduction. v.65(6), p.1813-21, 2001.

7. Hill, R.; Edwards, J.F.; Sawyer, N.; Blackwell, C.; Cibelli, J.B. “Placental anomalies in a viable

78


cloned calf”. Cloning, v.3, n.2, p.83-88, 2001.8. Allen, W.R.; Carter, A.M.; Chavatte-Palmer, P.; Dantzer, V.; Enders, A.C.; Freyer, C.; Leiser, R.;

Miglino, M.A. “Comparative placentation - a workshop report” Placenta. Apr; 24 Suppl A:S100-3, 2003.

9. Constant, F.; Guillomot, M.; Chavatte-Palmer, P.; Heyman, Y.; Berthelot, V.; Camous, S.; Turbe, A.;Renard, J.P. “Structural and functional studies on placenta of bovines somatic clones” Placenta,A.37, P.114 - Epg 2003.

10. Miglino, M.A. “Pesquisa anatômica sobre a ramificação e distribuição das artérias e veias da placentade bovinos” São Paulo, 1991. 303p. Tese de livre- docência - Faculdade de Medicina Veterinária eZootecnia, Universidade de São Paulo.

11. Miglino, M.A.; Verechia, F.T.; Visintin, J.A.; Mello, M.R.B.; Garcia, J.M.; Yamazaki, W.; Ambrósio,C.E.; Carvalho,A.F.; Braga, F.C.; Santos, T.C.; Leiser, R.; Carter, A.M. “placentação em bovinosclonados: arquitetura microvascular e estrutura”. Acta scientiae veterinarie. Supl. 31, p.484-485,2003a.

12. Miglino, M.A.; Verechia, F.T.; Visintin, J.A.; Mello, M.R.B.; Garcia, J.M.; Yamazaki, W.; Ambrósio,C.E.; Carvalho,A.F.; Braga, F.C.; Santos, T.C.; Leiser, R.; Carter, A.M. “Cloned cattle placentation:microvascular arquitecture and structure”. Placenta, A.37, P113, p.484-485, 2003b.

13. Campos, D.B.; Moura, C.E.B., Kfoury Jr, J.R., Miglino, M.A., Oliveira, C.A., Machado, U.F.,Pappa, P.C. Influence of vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor onprogesterone production by cultured placental cells, Placenta, 24(8/9) A 44, 2003.

14. Tsatsaris, V., Goffin, F., Munaut, C. et al. Overexpression of the soluble vascular endothelial growthfactor receptor in preeclamptic patients: pathophysiological consequences. J. Clin EndocrinolMetabol., v. 88, n. 11, p. 5555-5563, 2003.

15. Westhusin, M.E., Long, C.R., Shin, T et al. Cloning to reproduce desired genotypes. Theriogenology,v. 55, n. 1, p.35-49, 2001.

16. Reynolds, L.P., Redmer, D.A. Angiogeneses in the placenta, Biol. Reprod. v.64, p.1033-1040, 2001.17. Taniguchi F, Harada T, Yoshida S, et al. Paracrine effects of bFGF and KGF on the process of

mouse blastocist implantation. Mol Reprod Dev. v.50, p.54-62, 1998.

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MESA

REDONDA

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CRIOPRESERVAÇÃO DE EMBRIÕES PIVAlceu Mezzalira

CAV/UDESC – Lages SC

A viabilidade dos primeiros embriões congelados(20,21) dinamizaram a técnica de TE, desencadeandoprocessos de adequação e criação de novas metodologias. Para embriões produzidos in vivo, o métodoconvencional mostra-se adequado, embora com variações em diferentes raças. Já para embriões produzidosin vitro (PIV), há a necessidade de novas alternativas de criopreservação, dentre as quais candidatam-se ocongelamento ultra-rápido (UR) e a vitrificação. Estas inovações introduziram novos conceitos, além dosclássicos efeitos do gelo intracelular e da concentração de solutos(6 7).

O método UR possibilita o congelamento direto de embriões no nitrogênio(16,17), sendo muito empre-gado na década de 80 para embriões murídeos. Com esta tecnologia são relatados resultados de 92,9% deblastocistos eclodidos e 32% de fetos(9). Já com embriões bovinos, os dados de literatura são escassos.Taxas de eclosão de 17,3% após congelamento UR de Bi bovinos, em glicerol e sacarose e que subiram para56,4% de eclosão com Bx, demonstram a influência do estágio de desenvolvimento(3). É observada ainda,uma grande variação na viabilidade (18,5 a 67,7% de eclosão) com diferentes tempos (2 a 7min.) e tempe-raturas(4). No Brasil, poucos trabalhos utilizaram congelamento UR em bovinos, sendo descrito o primeironascimento em 1991(2). Taxas de 19,2% de nascimentos após transferência embriões congelados UR comglicerol 3,0M e sacarose 0,25M(11) e 17% e 13% de prenhez aos 45 dias, com etileno glicol 2,0 ou 3,0M +0,3M trealose(1), são descritas. Entretanto, poucos resultados positivos foram obtidos com embriões PIV. Jáa vitrificação, que possibilita a solidificação de uma solução sem a formação de gelo, vem crescendo emimportância na criopreservação oócitos e embriões PIV, com resultados significativos, principalmente com autilização de etileno glicol(13,14) ou a associação Etileno glicol + DMSO(18). MARTINO e colaboradores(5)

utilizando a metodologia adotada para preservar embriões de Drosophila(8), obtiveram os primeiros resulta-dos importantes, usando grades metálicas de microscopia eletrônica, imersas em nitrogênio. Com base nes-tes princípios, foi desenvolvido o sistema denominado OPS (Open Pulled Straw), que proporciona velocida-de de 20.000oC / minuto(18), sendo hoje a metodologia mais utilizada para criopreservar ovócitos, mostran-do-se adequada também para embriões, principalmente PIV. Mezzalira e colaboradores(10) obtiveram 47,1%de eclosão após vitrificação de blastocistos bovinos PIV em D7. Existe indicação da necessidade do ajustedo método aos requerimentos da estrutura a ser criopreservada(19). Com Bx PIV em D7, resultados seme-lhantes de eclosão (49,6 e 54,2%) foram obtidos com diferentes períodos de exposição aos crioprotetores(1 e 3 minutos) e diferentes concentrações de crioprotetores(12). Entretanto, com Bx em D8, o menor tempode exposição com maior concentração de crioprotetor resultou em maior taxa de eclosão (51,7%) em rela-ção ao tratamento com maior exposição e menores concentrações de crioprotetores (33,2%)(12). A influên-cia de diferentes formas de cultivo de embriões (em grupo X isolado), na viabilidade pós vitrificação, associ-ada a taxas de eclosão extremamente significativas (77,4 a 96,9%) em todos os grupos, foram obtidasrecentemente(15). Assim, o caminho a ser percorrido esta indicado, resta-nos buscar as melhores trilhas parachegar lá.

1. ALMEIDA, N.V. Congelamento ultra-rápido de embriões com etilenoglicol e trealose. 2001.

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Dissertação de Mestrado em Medicina Veterinária, Universidade Federal de Santa Maria, SantaMaria RS, 26p. 2001.

2. BERNARDI, M.L., RUBIN, M.I.B, COSTA, C.P.D., MEZZALIRA, A., SILVA, C. A.M. Conge-lamento ultra-rápido de embriões bovinos: Primeiro terneiro obtido no Brasil. In: REUNIÃO ANU-AL DA SBTE, 6, Curitiba, Anais... Curitiba: Sociedade Brasileira de Transferência de Embriões,1991. p.51.

3. CHUPIN, D. Quick freezing of bovine blastocysts. Theriogenology, v.25, n.1, p.147, 1986. Ab-stract.

4. CHUPIN, D. Quick freezing of day 7 bovine blastocysts: Optimum parameters of dehydration step.Theriogenology, v.27, n.1, p.219, 1987. Abstract.

5. MARTINO, A.; POLLARD J.W.; LEIBO, S.P. Effect of chilling bovine oocytes on their develop-mental competence. Mol. Reprod. Dev., v.45, p.503-512, 1996.

6. MAZUR, P. Cryobiology: The freezing of biological systems. Science, v.168, p.939-949, 1970.7. MAZUR, P.; LEIBO, S.P.; CHU, E.H.Y. A two-factor hypothesis of freezing injury. Exp. Cell

Res., v.71, p.345-355, 1972.8. MAZUR, P.; COLE, K.W.; HALL, J.W. et al. Cryobiological preservation of Drosophila embryos.

Science, v.258, p.1932-1935, 1992.9. MEZZALIRA, A. & RUBIN, M.I.B. Ultrarapid freezing and transfer of mouse morulae.

Theriogenology, v.37, n.1, p.257, 1992. Abstract.10. MEZZALIRA, A.; THALER NETO, A.; BARBIERI, D.P. Vitrificação de embriões bovinos PIV

tratados com Citocalasina B. Ver. Bras. Reprod. Animal, v.25, n.3, p.422-423, 2001.11. MEZZALIRA, A.; VIEIRA, A.D.; SILVA, L.F.A., KAJIYAMA, V.Y. Congelamento ultra-rápido

de embriões bovinos. Rev. De Ciências Agroveterinárias, v.2, p.115-119, 2002.12. MEZZALIRA, A.; MEZZALIRA, J.C.; BARBIERI, D.P. et al. Vitrificação de embriões bovinos

produzidos in vitro.: Avaliação de dois protocolos. Acta Scientiae Veterinariae, v.31, p.480-481,2003. Suplemento.

13. NOWSHARI, M.A. & BREM, G. Rapid-freezing of in vitro produced bovine embryos with ethyl-ene glycol. In Serono Symposia, 1998. Gametes Development and function, LAURIA, A. &GANDOLFI. F. Editors, Roma, 1998, p.585.

14. OLIVEIRA, A.T.D.:C; FORELL, F.; MEDEIROS, C.M.O. et al. Vitrificação de embriões bovinosproduzidos in vitro, usando etilenoglicol e sacarose. ARS Veterinária, 19 (2), p.191-201, 2003.

15. PEREIRA, D.C.; DODE, M.A.M.; CORRÊA, G.A.; RUMPF, R. Avaliação da sobrevivência deembriões bovinos produzidos in vitro cultivados em diferentes sistemas e vitrificados pelo métodoOPS. Acta Scientiae Veterinariae, v.31, p.524-525, 2003. Suplemento.

16. TAKAHASHI, Y. & KANAGAWA, H. Quick freezing of mouse embryos by direct plunge intoliquid nitrogen vapor: Effects of sugars. Jpn. Vet. Res., n.33, p.141-144, 1985.

17. TAKEDA, T.; ELSDEN, P.; SEIDEL Jr, G. E. Cryopreservation of mouse embryos by direct plung-ing into liquid nitrogen. Theriogenology, n.21, v.1, p.266, 1984. Abstract.

18. VAJTA, G.; HOLM, P.; KUWAYAMA, M. et al. Open pulled straw (OPS) vitrification: A new wayto reduce cryoinjuries of bovine ova and embryos. Mol. Reprod. Dev., v.51, p.53-58, 1998.

19. VAJTA, G. Criopreservação de ovócitos e embriões produzidos in vitro. Arq. Fac. Vet. da UFRGS.v.28, n.1, p.85-94, 2000. Suplem.

20. WHITTINGHAM, D.G.; LEIBO, S.P.; MAZUR, P. Survival of mouse embryos frozen to -196°Cand -296°C. Science, n.178, p.411-414, 1972.

21. WILMUT, I. & ROWSON, L.E.A. Experiments on the low-temperature preservation of cow em-bryos. Vet. Rec., n.92, v.26, p.686-690, 1973.

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CRIOPRESERVAÇÃO DE OÓCITOS BOVINOS

Vieira, A.D.1; Rodrigues, J.L.2

1MV. MSc. Aluno doutorado PPGCV/UFRGS, 2Prof. Dr. Pesquisador CNPqLaboratório de Embriologia e Biotécnicas da Reprodução UFRGS

Porto Alegre - RS. Caixa postal 15004. Endereço: [email protected]

O aumento na demanda de material genético para emprego nas diferentes biotécnicas de reprodução,gerou a necessidade da organização de bancos de germoplasma. Ao mesmo tempo, a crescente utilizaçãocomercial da produção in vitro de embriões bovinos (PIV) exige uma maior disponibilidade de oócitos. Umadas estratégias que vem sendo levada em consideração é o emprego de oócitos criopreservados em funçãoda flexibilidade de aplicação e facilidade na programação das atividades. A maioria dos experimentos vemsendo realizada utilizando oócitos maturados (metáfase II), por proporcionarem maiores taxas de desenvol-vimento em relação aos oócitos imaturos (vesícula germinativa). Entretanto, apesar da obtenção de taxas de25% desenvolvimento embrionário a partir de oócitos maturados vitrificados (Vajta et al., Mol. Reprod.Devel., n.51, p.53-58, 1998) e de prenhez com o uso do mesmo tipo de material como citoplastos recepto-res na fusão nuclear (Booth et al., Theriogenology, n. 51, p. 999-1006. 1999), a ocorrência de alteraçõesgenéticas determinadas por falhas na reorganização dos fusos meióticos limitam a viabilidade da criopreservaçãodestes oócitos. Por outro lado, do ponto de vista logístico os trabalhos com oócitos maturados dificultam oaproveitamento do potencial de animais criados em locais distantes de centros equipados para PIV, emfunção das limitações decorrentes da perda de viabilidade determinada pelo tempo de transporte e depen-dência do laboratório equipado para iniciar a maturação in vitro. Desta forma, a busca de soluções nacriopreservação de oócitos imaturos justifica-se pelo fato de que neste estádio o sistema de fusos não estáorganizado e o material genético encontra-se descondensado e protegido dentro do envelope nuclear, permi-tindo contornar os problemas observados com oócitos maturados. Resultados preliminares, com taxas de15% de desenvolvimento embrionário até o estádio de blastocisto (YAVIN & ARAV, Cryobiology. n. 43, p.331. 2001) e nascimentos de produtos normais (VIEIRA et al., Cryobiology, n. 45, p. 91-94. 2002) a partirde oócitos imaturos vitrificados confirmam a potencialidade da técnica. O incremento nas taxas de sobrevi-vência pós criopreservação de oócitos imaturos em níveis que tornem os resultados comercialmente atrati-vos, vai depender da adoção de estratégias experimentais, que permitam modificações e ajustes dos proto-colos empregados. O principal direcionamento é o da vitrificação com redução nos efeitos tóxicos e osmóticosdas soluções crioprotetoras com o aumento na velocidade de resfriamento. A associação da criopreservaçãode oócitos imaturos acondicionados em palhetas, através da vitrificação realizada nas condições de proprie-dade rural, com a aspiração folicular guiada com o auxílio do ultrasom, permitirá um melhor aproveitamentodo potencial reprodutivo de animais mantidos em locais distantes dos laboratórios equipados para PIV. Oaumento na viabilidade pós-criopreservação de oócitos imaturos deverá também possibilitar a expansão dasua utilização em outras biotécnicas de reprodução.

Palavras chave: gameta feminino, vitrificação, armazenamento, bancos genéticos.

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CRIOPRESERVAÇÃO DE EMBRIÕES BOVINOS PRODUZIDOS IN VITRO

Watanabe, Y.F.

Depto de Ciências Básicas FZEA-USPAv. Duque de Caxias Norte 225, Pirassununga – SP

E-mail: [email protected]

A aplicação comercial da produção in vitro de embriões bovinos a partir de oócitos imaturos temaumentado consideravelmente nos últimos anos. No entanto, a taxa de prenhez tem apresentado resultadossatisfatórios somente a partir da transferência a fresco dos embriões, deixando muito a desejar a viabilidadedestes após criopreservação, ou seja, o resultado tem se mostrado inferior e muito inconsistente quandocomparado aos embriões produzidos in vivo. Portanto, é de suma importância que os embriões possam sercongelados e descongelados para que esta tecnologia possa ser mais flexível e amplamente difundida.

Vários estudos têm divulgado taxa de prenhez e nascimento após transferência de embriões bovinosproduzidos in vitro pós-congelamento (Agca et al, 1998; Damiani et al, 1997; Hasler et al, 1997; Wright etal, 1995; Wurth et al 1994), onde tem se observado que a qualidade dos embriões produzidos in vitro éinferior daqueles in vivo. Vários autores relatam que as diferenças verificadas entre os dois grupos de embriões(in vitro versus in vivo) foram verificadas quanto aos aspectos morfológicos, ultraestruturais, metabólicos,bioquímicos e genômicos (Greve et al, 1993; Holm et al, 1998; Krurana et al, 2000; Khurana & Niemann etal, 2000).

Recentemente, tem observado que os diferentes sistemas de produção in vitro de blastocistos, comoos diferentes meios de cultivo, a co-cultura, a adição de soro, assim como a atmosfera gasosa utilizada noprocesso tem um forte impacto na eficiência da criopreservação dos embriões produzidos in vitro. Alemdisso, tem sido demonstrado que o período de cultivo pós-fecundação de embriões bovinos é consideradoum período crítico para a criopreservação dos blastocistos (Rizos et al, 2002) onde verificou que o cultivo invitro de zigotos produzidos in vivo, resultou em blastocistos com baixa tolerância a criopreservação.Entretanto, quando os zigotos produzidos in vitro foram cultivados em oviduto de ovelhas ate o estádio deblastocistos, estes apresentaram melhor viabilidade apos o congelamento.

Quanto aos processos de criopreservação, as técnicas mais utilizadas tem sido o congelamentocontrolado e a vitrificação. A vantagem da vitrificação é que esta evita os efeitos prejudiciais da formação decristais de gelo intra e extracelular, os quais danificam a membrana celular e as organelas. No entanto, paraevitar estes cristais é necessário uma alta concentração de crioprotetores, assim como uma rápida curva decongelamento e descongelamento, acarretando em danos celulares devido ao stress osmótico e toxicidadequímica (Papadopoulos et al, 2002; Vagta et al, 1998).

Deste modo, o propósito desta revisão é apresentar o efeito da criopreservação de embriões bovinosproduzidos em diferentes sistemas de cultivo in vitro, comparando com os embriões produzidos in vivo.Também serão relatados os diferentes resultados obtidos a partir de embriões in vitro congelados na presençade vários crioprotetores e curvas de congelação.

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RESUMOS

SELECIONADOS PARA

APRESENTAÇÕESORAIS

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SECREÇÃO DE INTERFERON-TAU EM EMBRIÕES BOVINOS PRODUZIDOSIN VITRO CRIOPRESERVADOS

Araujo, M.C.C.1; Ferreira, A.M.3 ; Sá, W.F.3; Barreto Filho, J.B.4; Serapião, R.V.3,5;Camargo, L.S.A.3 ; Silva, M.V.G.B.3; Vale Filho, V.R.2

1Universidade Presidente Antônio Carlos –UNIPAC, 2Escola de Veterinária da Universidade Federal deMinas Gerais, 3Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária – Embrapa Gado de Leite - Rua Eugênio doNascimento 570, Dom Bosco, Juiz de Fora, MG, 4Departamento de Medicina Veterinária da Universida-

de Federal de Lavras – UFLA, 5 Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro - UENF(Doutoranda) [email protected]

O interferon tau (IFN-τ) é uma citocina produzida pelo embrião, que possui atividade antiluteolítica,sendo responsável pelo reconhecimento materno da gestação em ruminantes. As taxas de gestação obtidascom embriões fertilizados in vitro são menores que aquelas observadas com embriões produzidos in vivo,e decrescem ainda mais quando são congelados. O objetivo do trabalho foi de avaliar a interferência dacriopreservação, estádio de desenvolvimento do embrião, tempo de eclosão e da qualidade do embrião,sobre a secreção de IFN-τ por embriões bovinos produzidos in vitro. Foram usados dois tratamentos: I)embriões não criopreservados (a fresco), II) embriões criopreservados. Os embriões na fase de blastocisto(a fresco ou imediatamente após o descongelamento dos criopreservados) continuaram a ser cultivadosindividualmente por mais sete dias. Do meio de cultivo em que foram mantidos os blastocistos, retiraram-sealíquotas com 24, 72, 120 e 168 horas do início do cultivo. Nas alíquotas de 72 e 168 horas utilizou-se obioensaio de atividade antiviral para quantificar a produção de IFN-τ pelos embriões cultivados pós-congelamento e a fresco. Os resultados mostram que os embriões congelados secretaram menos IFN-τ queaqueles não criopreservados (P<0,05), pois as alíquotas de 168 horas dos embriões cultivados a frescoapresentaram mais IFN-τ (P<0,05) que as de 168 horas dos embriões que passaram pela criopreservação.Verificou-se também que as alíquotas do meio de cultivo de embriões a fresco com 168 horas apresentavammaior quantidade de IFN-τ (P<0,05) que aquelas com 72 horas. Não houve diferença na secreção de IFN-τ entre os embriões que eclodiram até 48 horas e os que eclodiram entre 48 e 72 horas, não havendointeração na secreção de IFN-τ entre os tratamentos e o tempo de eclosão. A qualidade dos embriões (grauI e II) e seu estádio de desenvolvimento (blastocisto e blastocisto expandido) não influenciaram na secreçãode IFN-τ quando avaliados dentro de cada tratamento e entre os tratamentos (P>0,05). Conclui-se que asecreção de IFN-τ é menor nos embriões congelados em relação aos embriões frescos. Esta diferença foimais acentuada no 14° dia de desenvolvimento (168 horas de cultivo). Este fato pode influenciar noreconhecimento materno da gestação e o desenvolvimento do embrião pós-descongelamento.

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AUMENTO DA TAXA DE CONCEPÇÃO EM RECEPTORAS DE EMBRIÃO BOVINO COM MAIORES CONCENTRAÇÕES PLASMÁTICAS DE

PROGESTERONA NO DIA DA INOVULAÇÃO

Reis, E.L.1; Marques, M.O.1; Carvalho, N.A.T.1; Nasser, L.F.1;Costa Neto, W.P.2; Baruselli, P.S.1

1Departamento de Reprodução Animal, FMVZ-USP, CEP 05508-000, São Paulo-SP, Brasil. 2EmbriãoSC, Palmeral-MG, Brasil. - [email protected]

A progesterona é fundamental para o estabelecimento da gestação e desenvolvimento do embrião. Noentanto, os efeitos dos níveis plasmáticos de progesterona sobre a concepção de fêmeas bovinas ainda sãocontroversos. Este estudo retrospectivo teve como objetivo avaliar o efeito da concentração plasmática deprogesterona no dia 7 do ciclo estral sobre a taxa de concepção em receptoras Bos indicus x Bos taurus deembrião bovino. Foram analisadas 542 transferências de embriões realizadas em 3 propriedades diferentes,em um total de 4 réplicas. Os animais foram submetidos à sincronização do estro e da ovulação sem adetecção de cio em todas as réplicas com exceção de uma, em que foram tratados com PGF2α e submetidosa observação de cio. As receptoras foram submetidas a ultrassonografia ovariana 7 dias após o estro. Nasfêmeas consideradas aptas a receber um embrião (presença de CL com diâmetro >15mm) foram colhidasamostras de sangue por venopuncção para posterior dosagem da concentração plasmática de progesteronapor RIA. Os animais foram divididos em 5 grupos de acordo com a concentração plasmática de progesterona(G0: 0 a 0,99; G1: 1,00 a 1,99; G2: 2 a 2,99; G3: 3 a 3,99; G4: ≥ 4 ng/ml). A taxa de concepção em cadagrupo foi analisada pelo teste de qui-quadrado, adotando-se 5% de nível de significância. Não se verificouinteração entre as réplicas e os grupos. A taxa de concepção em cada réplica foi de 50,0% (111/222),48,7% (79/154), 43,7% (55/126) e 30% (12/40). As taxas de concepção de acordo com a concentraçãoplasmática de progesterona foram 39,2% (40/102)a para o G1, 44,6% (70/157)ab para o G2, 46,0% (52/113)ab para o G3, 55,7% (34/61)b para o G4 e 52,3%(57/109)b para o G4 (P<0,05). Os resultados indicamefeito positivo do aumento das concentrações plasmáticas de progesterona no dia 7 do ciclo estral sobre ataxa de concepção em receptoras de embrião bovino. Estratégias para o aumento das concentraçõesplasmáticas de progesterona durante o diestro podem ser utilizadas para aumentar a eficiência reprodutiva deprogramas de transferência de embriões.

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USO DE PROGESTERONA DE LONGA AÇÃO NA PREPARAÇÃO DE ÉGUAS NÃO-CICLANTES COMO RECEPTORAS DE EMBRIÃO

Rocha Filho A.N.1; Pessôa M.A.2; Gioso M.M.1; Alvarenga M.A.1

1Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária, FMVZ/UNESP, Botucatu-SP, 18.618-000, Brasil. 2MP Reprodução Eqüina, Bauru, SP, Brasil. - [email protected]

A utilização de receptoras de embrião não-ciclantes tratadas com progestágenos é prática interessanteem programas comerciais, especialmente no início da estação reprodutiva, quando o número de éguas ciclantesé limitado. Estudos acerca do uso de progestágenos na preparação de éguas ovariectomizadas (Hinrichs etal., Equine Vet. J. Suppl., v.3, p.74-75) ou intactas em fase transicional (Carnevale et al., Theriogenology,v.54, p.965-979) como receptoras de embrião se basearam no uso de progestágenos de curta ação e não deprogesterona injetável de longa ação. O objetivo deste trabalho foi comparar, retrospectivamente, taxas deprenhez e de morte embrionária precoce entre éguas receptoras de embrião ciclantes e não-ciclantessuplementadas com progesterona (P4) injetável de curta ou longa ação. Durante três estações reprodutivasconsecutivas, de Abril a Outubro, 264 embriões foram transferidos para éguas ciclantes (controle, n=152)ou não ciclantes (n=112) em um programa comercial de transferência de embriões no Brasil. Após dois diasde administração de estradiol (10 mg/dia, i.m.; ECP; Pharmacia and Upjohn Co., Kalamazoo, Michigan,USA), as éguas não-ciclantes receberam por via intramuscular 200 mg/dia (Tratamento 1, n=54) ou 400 mga cada 2 dias (Tratamento 2, n=13) de P4 de curta ação (P4; Northside Pharmacy, Lexington, USA), ou1500 mg de P4 de longa ação (P4 LA 150; B.E.T. Laboratories, Lexington, USA) a cada 7 (Tratamento 3,n=30) ou 6 (Tratamento 4, n=15) dias. Os embriões foram transferidos pela técnica transcervical parareceptoras ciclantes 4 a 8 dias após a ovulação e 5 a 8 dias após o início da suplementação com progesteronapara as éguas não-ciclantes. Diagnóstico de gestação foi realizado nos dias 12, 25 e 50 por ultra-sonografiatransretal. Os dados foram analisados por Qui-quadrado e a significância estatística indicada pela probabilidadede P<0,05. As taxas de prenhez nos dias 12 (75,0, 75,9, 76,9, 76,6 e 73,3%) e 50 (61,8, 61,1, 61,5, 53,3e 60,0%), bem como as de morte embrionária (17,5, 19,5, 20,0, 30,4 e 18,2%), foram similares (P>0,05)para as éguas controle e para os tratamentos 1, 2, 3 e 4, respectivamente, e entre as éguas controle e todasas não-ciclantes combinadas. Considerando-se as taxas de prenhez e de morte embrionária em receptorasnão-ciclantes, resultados similares (P>0,05) foram observados após transferências para receptorassuplementadas com progesterona por 5 a 8 dias antes da transferência, bem como após transferências realizadasdurante os meses de primavera e outono ou inverno. Adicionalmente, a administração diária de P4 injetávelde curta ação forneceu resultados similares (P>0,05) aos da administração de uma alta dose (400 mg) emdias alternados. O presente estudo demonstra a adequação do uso de receptoras não-ciclantes tratadascom progesterona injetável de longa ação por 5 a 8 dias antes da transferência, evitando a grande mão-de-obra e estresse animal resultantes das injeções diárias de preparações de curta ação.

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AVALIAÇÃO DA COLHEITA TRANSCERVICAL DE EMBRIÕESOVINOS DA RAÇA SANTA INÊS*

Silva, J.C1; Quintela, A. 1; Andrade Moura, J.C. 1; Resende, J. 1;Gordiano, H. 1; Martins, L.P.1; Chalhoub, M. 1; Ribeiro Filho, A. de L. 1; Gusmão, A.L1

1 Escola de Medicina Veterinária – UFBA. ([email protected])

Um dos fatores que limitam a utilização da TE em ovinos é a dificuldade de serem realizadas colheitaspelo método não cirúrgico, devido ao obstáculo da transposição do canal cervical, já que este é longo,sinuoso e de diâmetro reduzido nesta espécie (Habert, et al. Theriogenology, v.33, n.5, p. 977-992, 1990).Com o objetivo de avaliar a eficiência da colheita transcervical de embriões em ovelhas da raça Santa Inês,44 animais foram submetidos a um programa de MOET, sendo superovulados com 200mg de FSHp(Folltropin-V, Ventrepharm Inc., Canadá) em aplicações decrescentes a partir do 11º dia do programa einseminados laparoscopicamente com sêmen fresco 36 horas após a retirada do progestágeno. As fêmeasforam divididas em três grupos. O G1- grupo controle (n= 13) não recebeu nenhum tipo de tratamento paradilatar o cérvix, o G2 (n=17) recebeu uma aplicação de 50µg de cloprostenol (Ciosin, Coopers, Brasil) 12horas antes das colheitas, e no G3 (n=14) foi instilado 200µg de misoprostol (Cytotec, Searle, Brasil) nofundo de saco vaginal, cinco horas antes dos procedimentos. Estes medicamentos tinham como objetivoprovocar uma dilatação cervical, a fim de viabilizar a colheita não cirúrgica. O grupo controle (G1) nãopermitiu a passagem do cateter e foi dessa forma encaminhado à colheita cirúrgica, juntamente com asfêmeas que receberam dilatadores cervicais, e que mesmo assim não foi possível a transposição cervical. DoG2, 59% das doadoras foram colhidas transcervicalmente enquanto 50% das fêmeas do G3 permitiram esteprocedimento. Quanto à resposta superovulatória, a quantidade de estruturas totais colhidas por doadora foide 6,1, 6,5 e 7,0, e a relação de embriões viáveis nos grupos foi de 3,7, 3,3 e 4,0, respectivamente para osgrupos G1, G2 e G3, mostrando não haver uma diferença significativa entre os grupos trabalhados, deacordo com o programa de estatística SPSS 11.0 (P> 0,05). Conclui-se com os trabalhos realizados que atécnica de colheita transcervical de embriões de ovinos da raça Santa Inês é possível em ovelhas pluríparas,mas que existe uma grande variação individual no grau de complexidade na transposição cervical em ummesmo grupo racial, mesmo utilizando para isso um dilatador cervical farmacológico, e que o resultado dacolheita entre os grupos não diferiu, mostrando ser exeqüível a colheita transcervical de embriões em ovelhasSanta Inês em condições de campo.

*. Apoio: JICA – Agência Japonesa de Cooperação Internacional

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CRIOPRESERVAÇÃO E CULTIVO IN VITRO DE FOLÍCULOSPRIMORDIAIS CAPRINOS ISOLADOS

Rodrigues, A.P.R.1; Costa, S.H.F.1; Santos, R.R.; Lucci, C.M.2; Nunes, J.F. 1;Ohashi, O.M.3; Rondina, D. 1; Figueiredo, J.R. 1

1Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Pré-antrais – LAMOFOPA, Faculdade deVeterinária, Universidade Estadual do Ceará, Fortaleza, CE, Brasil. 2Universidade de Brasília, Brasília,

DF, Brasil. 3Universidade Federal do Pará, Belém, PA

Os objetivos deste estudo foram: 1) analisar a toxicidade do glicerol (GLI) versus etilenoglicol (EG), noexperimento 1, bem como do dimetilsulfóxido (DMSO) versus propanodiol (PROH) no experimento 2,em duas concentrações (1,5 M e 3 M) sobre folículos primordiais; 2) verificar a viabilidade desses folículosapós os procedimentos de congelação/descongelação e, 3) verificar a viabilidade dos folículos primordiaiscriopreservados após 24 h de cultivo in vitro. Para isso, uma gota de 100 µl de suspensão folicularcontendo os folículos primordiais isolados, frescos, expostos (teste de toxicidade) aos crioprotetores(GLI, EG, DMSO ou PROH) ou criopreservados utilizando-se os crioprotetores anteriormentemencionados foi adicionada de 5 µl de azul de trypan e, observados ao microscópio invertido. Apercentagem de folículos primordiais viáveis após o teste de toxicidade, criopreservação e cultivo in vitrofoi avaliada pelo Qui-quadrado a 5% de probabilidade. Para o experimento 1, a percentagem de folículosprimordiais viáveis após o teste de toxicidade variou de 77,6% (GLI 3 M) a 88,8% (EG 1,5 M) e foisimilar (P>0,05) ao controle ou folículos frescos (97,0%). Resultados similares foram encontrados após acriopreservação, exceto para o GLI 3 M (64,8%). Após 24 h de cultivo in vitro a percentagem defolículos primordiais criopreservados em EG 3 M (46,8%) foi significativamente inferior aos folículos nãocriopreservados (82,8%), bem como aos folículos criopreservados em GLI (64,0%) e EG (64,0%),ambos a 1,5 M. Para o experimento 2, antes do cultivo in vitro, a percentagem de folículos primordiaisviáveis após o teste de toxicidade (78,0%: PROH 1,5 M a 84,0% : DMSO 3 M) e criopreservação foisimilar (P>0,05) ao controle (92,0%). Por outro lado, após 24 h de cultivo in vitro, a percentagem defolículos primordiais criopreservados em DMSO 1,5 M (63,0%) ou PROH 1,5 M (63,0%) foisignificativamente inferior aos folículos não criopreservados, porém expostos (70,0%: DMSO 1,5 M e78,0% PROH 1,5 M) ou não (81,0%) aos crioprotetores. Concluindo, este estudo mostrou que folículosprimordiais criopreservados em GLI, EG, DMSO ou PROH na concentração de 1,5 M resulta emaproximadamente 50% de folículos viáveis após um curto período de cultivo in vitro.

Agradecimentos: Este trabalho foi financiado pelo CNPq e FUNCAP

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DESENVOLVIMENTO POTENCIAL DE EMBRIÕES BOVINOS APÓSFERTILIZAÇÃO DE OVÓCITOS IN VITRO COM CATALASE E GnRH

Martins Júnior, A.1; Calegari, R.S.1; Freitas, C.P.1; Zanon, J.E.O.1; Paschoal. D.M.1

1 Departamento de Clínica, Cirurgia e Reprodução Animal, UNESP, Araçatuba - SP, [email protected]

Estudos anteriores têm mostrado que o GnRH e a catalase adicionados aos meios de maturação e fertilização,respectivamente, aumentaram a produção de embriões bovinos in vitro. O objetivo deste estudo foi avaliarse a adição de GnRH e catalase ao meio de fertilização poderia incrementar os índices de clivagem e deblastocisto. Ovócitos imaturos obtidos a partir de folículos com 2 a 7 mm de diâmetro foram selecionadospara MIV após lavagem em meio de maturação base (MM-b), composto de Meio 199 com 2.2 mg/mL debicarbonato de sódio, 50 µg/mL de piruvato de sódio, 50 µg/mL de sulfato de gentamicina, 1 mg/mL deálcool polivinílico, 1 IU/mL de r-hFSH (Gonal-F; Serono) and 10% de SFB. O preparo do sêmen e ainseminação foram realizados em m-DM; grupos de 15 a 20 oovócitos foram co-incubados comespermatozóides em gotas de 50 µL de m-DM (modified-defined medium) na presença de catalase (100 µg/mL, Sigma Co.) e GnRH (Profertil, Tortuga), de acordo com o seguinte delineamento experimental: grupos I= 0 µg/mL; II = 0,01 µg/mL; III = 0,1 µg/mL; IV = 1 µg/mL; V = 10 µg/mL. Decorridas 5 horas dainseminação, os zigotos foram cultivados em 3 etapas designadas como horas pós-inseminação; etapa 1 (5 a72h), etapa 2 (72 a 144h) e etapa 3 (144 a 168h), em meio m-SOF+NEA sem glicose, mas com glutamina(etapa 1) e com glicose e 5% de SFB, porém sem glutamina (etapas 2 e 3). Os índices de clivagem (C, 72h)e percentagens de mórulas/blastocistos (Mo/Bl,144h) e blastocistos/blastocistos expandidos(Bl/Bx, 168h)são relatados baseados no número de ovócitos selecionados para maturação. ANOVA e o teste-t foramutilizados para as análises estatísticas. O índice de clivagem foi maior (p<0,05) para o grupo V (82,1%) doque para os grupos I ao IV (73,6, 74,1, 71,4 e 73,0%, respectivamente), com resultados similares entreesses grupos. Nenhuma diferença foi observada no desenvolvimento para Mo/Bl entre os grupos IV e V(76,6 vs. 77,7%) ou no desenvolvimento para Bl/Bx (42,3 vs. 40,2%). Ambos grupos IV e V produzirammais (p<0,05) Mo/Bl e Bl/Bx do que os grupos I (61,8 and 27,3%, respectivamente), II (57,1 e 28,6%) e III(59,8 e 30,3%), sendo que tais resultados não foram diferentes entre esses grupos. Os dados mostraram umefeito embriotrófico aditivo da catalase e do GnRH quando adicionados ao meio de FIV e fornecem uma útilcontribuição para melhorar a produção de embriões bovinos in vitro. Contudo, outros experimentos sãonecessários para investigar diferentes combinações entre esses compostos.Apoio FAPESP (98/15727-1) e Central AltaVR, Araçatuba-SP.

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EFEITOS DOS RETINÓIDES E DO IGF-I SOBRE A PRODUÇÃO DEEMBRIÕES BOVINOS IN VITRO

Oliveira, M.A.L.1; Lima, P.F.1; Reichenbach, H.-D.2; Weppert, M.3; Cavalcanti Neto,C.C.4; Pina, V.M.R.5; Santos, M.H. B.5; Lima-Verde, I.B.5

1Departamento de Medicina Veterinária/UFRPE-Recife/PE, ([email protected]). 2BayerischeLandesanstalt für Landwirtschaft/Poing-OT Grub – Germany. 3Bayerisches Forschungszentrum für

Fortpflanzungsbiologie/ Oberschleissheim – Germany. 4Departamento de Zootecnia/UFAL-Maceió/AL.5Programa de Pós-Graduação em Ciência Veterinária/UFRPE-Recife/PE

Experimentos foram desenvolvidos para investigar os efeitos da adição do retinol e do ácido retinóico (AR)no meio de maturação de oócitos e do IGF-I no meio de cultura de embriões. A maturação in vitro foirealizada em meio básico de maturação (bMM), constituído de TCM 199, piruvato de sódio (50 µg/ml),bicarbonato de sódio (2.6 mg/ml), sulfato de gentamicina (50 µg/ml), álcool polivinílico (1 mg/ml), FSH (10µg/ml), retinol (0,3 µM/ml) ou AR (0,5 µM/ml). A cultura de embriões foi efetuada em meio KSOMsuplementado ou não com IGF-I (50 ng/ml). No Grupo I, o bMM foi enriquecido com retinol e os presumíveiszigotos colocados em gotas de meio KSOM, por dois dias e, a seguir, embriões com 2 a 4 células foramtransferidos para novo meio KSOM suplementado ou não com IGF-I, por mais nove dias. As proporçõesde blastocisto foram avaliadas através do X2 e o número total de células pelo t-test. A suplementação dobMM com retinol e do meio KSOM com IGF-I (Grupo I) resultou no aumento (p < 0,05) do desenvolvimentodos embriões de 2-4 células para os estádios de blastocistos (bMM/retinol/KSOM: 20,18%; bMM/retinol/KSOM/IGF-I: 35.16%), blastocisto expandido (bMM/retinol/KSOM: 15,4%; bMM/Retinol/KSOM/IGF-I: 32,62%) e blastocisto eclodido (bMM/retinol/KSOM: 2,75%; bMM/retinol//KSOM/IGF-I: 15,45%)quando comparado com oócitos/embriões tratados com bMM/KSOM (blastocisto: 5,73%; blastocistoexpandido: 2,54%; blastocisto eclodido: zero) and bMM/KSOM/IGF-I (blastocisto 5,62%; blastocistoexpandido: 3,12%; blastocyst eclodido: 0,0%). No Grupo II, a suplementação do bMM com AR e do meioKSOM com IGF-I elevou (p < 0,05) a porcentagem de embriões (2 a 4 células) que se desenvolveram atéos estádios de blastocistos (bMM/AR/KSOM: 23,17%; bMM/AR/KSOM/IGF-I: 40,17%), blastocistoexpandido (bMM/AR/KSOM: 14.56%; bMM/AR/KSOM/IGF-I: 37,79%) e blastocisto eclodido (bMM/AR/KSOM: 4.26%; bMM/AR/KSOM/IGF-I: 19,6%) quando comparado with oócitos/embriões tratadoscom bMM/KSOM and bMM/KSOM/IGF-I (Grupo I). A adição do retinol ou do AR ao bMM e do IGF-I ao KSOM, aumentou (p < 0,05) o número de células embrionárias (bMM/retinol/KSOM: 71,08±7.61;bMM/retinol/KSOM/IGF-I: 94,24±5.89; bMM/AR/KSOM: 74,91±5.89; bMM/AR/KSOM/IGF-I:99,21±3.64) quando comparado com os grupos de oócitos/embriões sem a adição dos retinóides e IGF-I(bMM/KSOM: 48,12±5.45; bMM/KSOM/IGF-I: 50,46±7.84). Os resultados permitiram concluir que aadição de retinóides ao meio de maturação de oócitos e de IGF-I ao meio de cultura de embriões, aumentaa produção de embriões bovinos in vitro.

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UTILIZAÇÃO DE ESTUFA PORTÁTIL (LIFE®®®®®) PARA PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS

Siqueira-Pyles, E.S.C.1; Pedrazzi, C.A.F.2; Landim-Alvarenga, F.C.1

1Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária FMVZ/UNESP, Botucatu - SP,18618-000, Brasil. 2Ceafepe Tecnologia Veterinária Indústria e Comércio Ltda, Brasil.

[email protected]

O presente trabalho teve como objetivo testar um modelo de estufa portátil gaseificada (Life® - CeafepeTecnologia Veterinária Ltda -Brasil .) para a maturação de ovócitos e posterior fertilização e cultivo in vitrode embriões bovinos. Foram utilizados ovários de abatedouro para a obtenção dos ovócitos, os quais foramdivididos aleatoriamente entre três grupos: Gcontrole em placa, maturado em estufa convencional (ThermoForma); Gcontrole em criotubo, maturado em estufa convencional; e GLife em criotubo. Para a maturação invitro os ovócitos foram colocados em 400µL de meio de maturação em placas Nunc (Gcontrole em placa)ou em criotubos (Gcontrole em criotubo) em estufa convencional à 38,5ºC em 5%CO2 em ar, ou em criotuboscobertos com 300µL de óleo mineral na estufa Life à 38,5ºC em 5%CO2, 5%O2

e 90% N2 durante 22horas. Os ovócitos foram fertilizados (Dia D0) e após 18 horas colocados em co-cultivo nas placas oucriotubos de maturação na estufa convencional até o D7. A análise estatística foi realizada pelo teste deTukey para comparação de proporções, com p<0,05. No D3 foram observadas taxas de clivagem de69,5% (319/459) no Gcontrole em placa, 68,2% (90/132) no Gcontrole em criotubo e 73,0% (465/637) noGLife em criotubo, as quais foram estatisticamente semelhantes. No D7 de cultivo foram observadas taxasde produção de blastocistos de 28,6%a (63/220) no Gcontrole em placa, 40,4%ab (46/114) no Gcontrole emcriotubo e 47,5%b (210/442) no GLife em criotubo. O melhor índice de produção de blastocistos com autilização da estufa portátil Life® pode estar relacionado à atmosfera gasosa utilizada (5:5:90) que propiciauma menor formação de radicais livres no meio de cultivo. Os presentes resultados demonstraram ser viávela utilização da estufa portátil Life® para maturação de ovócitos bovinos e posterior produção in vitro deblastocistos.

Agradecimentos: FAPESP, Frigorífico FRIGOL e Profa. Lídia Raquel de Carvalho (Depto. BioestatísticaIB/UNESP).

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PRODUÇÃO DE EMBRIÕES EM VACAS NELORE COM A UTILIZAÇÃO ASSOCIADA DE FIV E TE

Nonato Jr., I.1; Rufino, F.A.2; Sanches, B.V.2; Pontes, J.H.F.1;Uvo, S.1; Ereno Jr., J.C.1; Seneda, M.M.2

1In Vitro Brasil – Central de Biotecnologia da Reprodução- Mogi Mirim -SP. 2Departamento de ClínicasVeterinárias , CCA, Universidade Estadual de Londrina, PR, 86051-990;

A produção in vivo de embriões (TE) tem sido substituída pelo processo in vitro (FIV), em grande parte dosprogramas de vacas zebuínas. O objetivo deste trabalho foi analisar o uso associado destes dois métodos naobtenção de embriões na raça Nelore. Vinte e três doadoras foram submetidas a 85 sessões de aspiraçãofolicular, com média de 3,7 por animal durante 4,6 meses. Foram realizadas 85 sessões de aspiração folicular,totalizando 2270 oócitos viáveis, com 840 embriões transferidos. Obteve-se média de 26,7 oócitos e 9,9embriões por cada sessão de aspiração. Intercalados aos procedimentos de FIV, foram realizadas 35 colheitasde embriões, sendo em média 1,5 por animal em 2,6 meses. Duzentos e vinte e seis embriões viáveis foramobtidos, com média de 6,4 transferidos por colheita. A taxa de prenhez para a FIV foi de 36,5 %, (310/849)enquanto que na TE foi de 46,5% (105/226). Os embriões obtidos in vivo viabilizaram maior percentual deprenhez, e os resultados parciais dos exames ultra-sonográficos têm mostrado uma melhor relação macho/fêmea. Os procedimentos de FIV resultaram em um maior número de embriões produzidos, considerando operíodo de tempo. A realização das aspirações foliculares após as colheitas permitiu intervalo pequeno entreas colheitas, pois a punção dos folículos constitui medida preventiva ao aparecimento de cistos foliculares.Além disso, a aspiração folicular constitui método eficiente para controle da dinâmica folicular, aumentando aeficiência dos protocolos de superovulação. Os resultados sugerem que a associação das duas técnicas évantajosa, pois há agregação dos aspectos favoráveis de cada uma delas.

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AVALIAÇÃO DA BIPARTIÇÃO COMO ALTERNATIVA PARA MELHORAROS ÍNDICES DE GESTAÇÃO NA TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES EQÜINOS

Silveira, L.L.1,2; Souza, R.V.2; Pimentel, C.M.1; Rumpf, R.2

1 Universidade de Brasília–UnB/ Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária–FAV, 70910-900,Brasília-DF, Brasil; 2 EMBRAPA Recursos Genéticos e Biotecnologia, Parque Estação Biológica, 70770-

900, Brasília-DF, Brasil. [email protected]

A transferência de embriões (TE) já vem sendo utilizada em eqüinos há pelo menos duas décadas, sempre apartir de ovulação simples. A baixa eficiência dos protocolos de superovulação em eqüinos, reforça anecessidade de avaliação de técnicas capazes de aumentar o número de potros por doadora ano. O presenteestudo avaliou a bipartição embrionária neste contexto. Foram utilizadas 21 éguas de diferentes padrõesraciais, com idade variando entre 4 e 15 anos de idade, pesando entre 270 a 480 kg. A partir da identificaçãodo cio (rufiação), os animais foram acompanhados através de exames ultrassonográficos trans-retais (Aloka500®) até o momento da ovulação, sendo que as receptoras, 1 vez ao dia e as doadoras 3 vezes ao dia. Asreceptoras utilizadas ovularam um dia antes ou até três dias depois das doadoras. As doadoras foram coletadasentre 144 e 156 horas após a ovulação (D0). Foram recuperados 20 mórulas em 29 coletas (68,96%),sendo que 10 embriões foram transferidos inteiros (T1), e 10 embriões foram bipartidos (T2), originando 20hemi-embriões e transferidos para 20 receptoras. Não houve diferença na taxa de prenhez entre os grupos,T1, 70% (7/10), e T2, 50% (10/20) (p> 0,05). Em relação ao número inicial de embriões em cada grupo(10), houve diferença na taxa de prenhez entre os grupos, T1, 70% (7/10) e T2, 100% (10/10) (p< 0,05).Estes resultados indicam um incremento no número de gestações obtidas quando é utilizada a técnica debipartição embrionária na transferência de embriões eqüinos em função do número inicial de embriõescoletados. Desta forma esta técnica pode melhorar os índices de produção de animais de qualidade superior.

Apoio financeiro: Embrapa/CNPq

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RESUMOS

SELECIONADOS PARA

COMPETIÇÃO DEESTUDANTES

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INDUÇÃO DA PUBERDADE E SINCRONIZAÇÃO DO ESTRO COMPROGESTERONA, BENZOATO DE ESTRADIOL, GNRH E ECG

EM NOVILHAS PRÉ-PÚBERES DA RAÇA NELORE

Tetzner, T.A.D.1 ; Diniz, E.G.1; Jacomini, J.O.1; Peres, R.F.G.1; Amorim, L.L.1

1 Faculdade de Medicina Veterinária - FAMEV/UFU, Uberlândia-MG, 38400-714, [email protected]

O presente trabalho objetivou verificar a indução da puberdade, sincronização e fertilidade do estro emnovilhas pré-púberes da Raça Nelore. O experimento foi conduzido na fazenda Capim Branco da UniversidadeFederal de Uberlândia, no período compreendido entre setembro de 2003 a março de 2004. As novilhaspossuíam de 14 a 16 meses de idade, peso médio de 242,45 Kg e escore corporal entre 4 a 6 (escala de 1a 9), divididas aleatoriamente em Grupo 1 (G1) (n = 20): inserção de DIB (DIB®) + aplicação de 2 mg debenzoato de estradiol (BE) IM (Estrogin®) no Dia 0; no Dia 9 remoção do DIB; após 24 horas aplicação de1,0 mg de BE IM; IA com observação de estro, Grupo 2 (G2) (n = 20): inserção de DIB no Dia 0; no Dia9 remoção do DIB e aplicação de 50 µg de Lecirelina IM, análogo de GnRH (Gestran Plus®); IATF 36 horasapós; Grupo 3 (G3) (n = 20): aplicação de 200 UI de eCG IM (Novormon 5000®) no Dia 0; aplicação de50 µg de Lecirelina IM, no dia 9; IATF 36 horas após, Grupo 4 (G4) (n = 20): somente observação de estro.As avaliações ovarianas e o diagnóstico de gestação foram realizados via palpação retal e ultra-sonografia(Scanner 100 Pie Medical). Baseado nas mensurações dos diâmetros dos ovários e do maior folículo presenteantes dos tratamentos verificou-se que não houve diferença estatística entre G1, G2, G3 e G4 (P<0,05), mashouve diferença após os tratamentos entre o G4 e os demais grupos. Houve diferença estatística antes e apósos tratamentos dentro do mesmo grupo, com exceção do G4. As taxas de estro (Te) e de concepção (Tc)foram para o G1 de 90% para Te (18/20) e de 65% para Tc (13/20), para o G2 de 65% para Te (13/20) ede 40% para Tc (08/20), para o G3 de 35% para Te (07/20) e de 15% para Tc (03/20) e para o G4 zeropara Te e Tc. Verificou-se diferença estatística (P<0,05) para todos os casos, com exceção para Tc entre G1e G2. Pode-se concluir que é possível antecipar a puberdade de novilhas, com estros férteis e taxas deconcepção satisfatórias.

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OTIMIZANDO O NÚMERO DE RECEPTORAS SINCRONIZADAS COM PROTOCOLO OVSYNCH

Beltrame, R.T.1; Barioni, L.G.2; Veloso, R.V.2; Saueressig, M.G.2.

1 Médico Veterinário, aluno do curso de Pós Graduação em Produção Animal –LMGA – CCTA -UENF, 2 Pesquisadores da Embrapa Cerrados Rod. Brasília Fortaleza BR 020 Km 18 Planaltina -

DF - Brasil CEP: 73301-970; Email: [email protected]

A técnica de transferência de embriões (TE) em bovinos se desenvolveu rapidamente na pecuária nacionalnos últimos 30 anos. Com ela surgiu uma nova ferramenta de melhoramento, acelerando o ganho genéticomesmo em pequenas propriedades. Porém, a utilização da técnica é ainda limitada, visto sua relação custo-benefício. O controle gerencial, visando estabelecimento de banco de dados, e a escassez de receptorasaptas, essenciais no desenvolvimento da biotécnica, são os principais entraves ao desenvolvimento de índicese estágios econômicos mais rentáveis. Um meio de melhorar a viabilidade econômica da TE em bovinosseria explorar o uso das técnicas de sincronização de estro e utilização de receptoras e doadoras bovinas,através da elaboração de um software aplicado a biotécnica da transferência de embriões. Desta forma,simulações, usando a técnica de Monte Carlo e análises de sensibilidade, foram realizadas para uma avaliaçãoex-ante da relação ótima entre o número de receptoras e doadoras da raça Simental (razão R/D) em programasde transferência de embriões. O menor custo por prenhez foi adotado como critério para a decisão sobre onúmero ideal de receptoras. Considerou-se o protocolo Ovsynch como o protocolo de sincronização dasreceptoras e custos de medicamentos, vacinas, honorários e outros insumos baseados em preços de mercadopraticados em agosto de 2002. A análise foi aplicada a dois casos: (1) determinista, no qual considerou-seo número de embriões produzidos em cada coleta como igual à média esperada, isto é: µ = 6,s = 0; (2)estocástica com congelamento, no qual o número de embriões por doadora foi gerado para cada coletaassumindo distribuição normal (µ = 6,s= 0) e ausência de covariância entre coletas. Para cada caso, adotaram-se coletas mensais de embriões e um período de simulação de 24 meses, considerando um rebanho de 100receptoras, mantido constante pela aquisição de novos animais. Para o segundo caso as simulações foramrealizadas 50 vezes, permitindo estimar a média, o desvio padrão do número de prenhezes e o custocorrespondente. Concluiu-se com base nas simulações do caso (2) que o custo mínimo por prenhez é atingidocom a utilização da razão R/D 16,7 para a situação estudada. A baixa eficiência do protocolo de sincronizaçãoleva a estimativas minimas de custo, superiores às apresentadas previamente por trabalho similar. Aindaobservou-se que a desconsideração da variabilidade na produção de embriões na análise determinista (caso1) repercutiu em: (a) estimativa equivocada da razão R/D ótima promovendo potencial aumento do custo porprenhez; e (b) superestimativa do número de prenhezes por doadora, com consequente subestimativa docusto por prenhez no programa de TE.

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AVALIAÇÃO DA MORFOLOGIA CITOPLASMÁTICA DE OVÓCITOS EQÜINOSMATURADOS IN VITRO EM DIFERENTES CONDIÇÕES DE CULTIVO

Fernandes, C.B.1; Siqueira-Pyles, E.S.C.1 ; Peres, K.R.1; Ponchiroli, C.B.1; Cordeiro Jr., F.2;Alvarenga, M.A.1; Landim-Alvarenga, F.C.1

1 Dep. Reprodução Animal – FMVZ - UNESP, Botucatu, Brasil, 2Universidade Estadual de Maringá,Maringá, Brasil. [email protected]

O objetivo deste experimento foi avaliar a ultraestrutura de ovócitos eqüinos maturados em meio TCM 199,SOFaa e HTF:BME (1:1) acrescido de FSH eqüino (eFSH), bovino (bFSH) e de Hormônio do CrescimentoEqüino (eGH), comparando com ovócitos eqüinos imaturos. Cada grupo de 150 ovócitos obtidos de ováriosde abatedouro foram maturados por 36 a 40 horas à 38,5 ºC em atmosfera de 5% de CO2 em ar (5repetições) divididos em 5 grupos. GTCM: TCM-199 + L-glutamina, piruvato de sódio, cisteina, taurina,cisteamina, 8mg/ml BSA, 50ng/ml EGF, 500ng/ml E2 (todos Sigma, St. Louis) and 5µg/ml bFSH (Foltropin-V®, Vetepharm, Canada); GSOF: SOFaa acrescido dos mesmos fatores do GTCM; GbFSH: HTF:BME(1:1) acrescido dos mesmos fatores do GTCM; GeFSH: HTF:BME (1:1) acrescido dos mesmos fatores doGTCM + 5 µg/ml eFSH (Bioniche, EUA); GeFSH+eGH: HTF:BME (1:1) acrescido dos mesmos fatoresdo GTCM + eFSH + 100 ng/ml eGH (EquiGenTM, BresaGen, EUA). A avaliação da maturação nuclear foirealizada em Hoechst 33342 e analisada por meio da ANOVA. A avaliação da morfologia citoplasmática foirealizada em cortes ultra-finos por meio da Microscopia Eletrônica de Transmissão. Não houve diferençaestatística significativa entre as taxas de maturação nuclear para os grupos, sendo 13,8%, 23,8%, 29,2%,25,8% e 29,8% para GTCM, GSOF, GbFSH, GeFSH e GeFSH+eGH, respectivamente (p=0,095). Naanálise da ultraestrutura a principal característica dos ovócitos imaturos examinados foi a grande quantidadede mitocôndrias por todo o ovoplasma, associadas à gotas de lipídeos, aos complexos de Golgi e ao retículoendoplasmático liso. Os complexos de Golgi apresentaram-se na periferia do ovoplasma, circundados porgrânulos corticais. No interior do espaço perivitelínico foram observadas junções do tipo gap. Na análiseultraestrutural dos ovócitos maturados por 36 a 40 horas nos grupos TCM e SOF os grânulos corticaisforam observados tanto na região central do ovoplasma como na periferia, com tamanho e eletron-densidadevariável. Na maioria dos ovócitos estudados nestes grupos, pôde-se observar que o espaço perivitelínico seencontrava preenchido por grande quantidade de restos e junções celulares. A análise citoplasmática mostrouque os ovócitos cultivados em HTF:BME acrescido de bFSH, eFSH e eFSH+eGH apresentaram umamenor quantidade de restos celulares no espaço perivitelínico, bem como uma distribuição dos grânuloscorticais mais homogênea e alinhada próximo a membrana externa do ovócito, mais evidente no grupo eFSH.Na análise ultraestrutural os ovócitos maturados em meio TCM 199 e SOFaa, apresentaram sinais de maturaçãocitoplasmática incompleta, e exibiram características de reação cortical prematura. A utilização do meioHTF:BME, aparentemente, foi benéfica à morfologia citoplasmática e a adição de eFSH ao meio HTF:BME,resultou em uma melhora significativa na morfologia citoplasmática.Agradecimentos: FAPESP e Frigorífico Rei do Gado, Santa-Fé-PR, Brasil.

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PRODUÇÃO DE EMBRIÕES BOVINOS POR INJEÇÃO INTRACITOPLASMÁTICADE ESPERMATOZÓIDE LIOFILIZADO. RESULTADOS PRELIMINARES

Martins, C.F.1,2; Dode, M.A.N.2; Pereira, D.C.2; Rumpf, R.2

1- Doutorando do Programa de pós-graduação em Biologia Molecular-UnB, 2- Pesquisador EmbrapaRecursos Genéticos e Biotecnologia - [email protected]

Recentemente, a liofilização tem sido aplicada para preservar espermatozóides mamíferos. O processo deliofilização ainda é agressivo, provocando grandes perdas estruturais nos espermatozóides, mas eles podemgerar embriões se utilizados pela técnica de injeção intracitoplasmática de espermatozóide (ICSI). O objetivodeste trabalho foi comparar dois tratamentos de liofilização na produção de embriões bovinos por ICSI.Para isso, espermatozóides frescos foram diluídos em dois meios de liofilização: T1 (TCM 199 Hanks +10% de SFB) e T2 (TCM 199 + 10% de soro fetal + 0.2 M de Threalose). As amostras foram tratadascomo em um congelamento convencional, e em seguida estas amostras permaneceram 12 horas a baixatemperatura (-43 ºC) e alto vácuo no liofilizador Labcanco, até a sublimação do gelo. As amostras foramavaliadas e armazenadas em temperatura ambiente até seu uso. Antes das ICSI, os ovócitos foram maturadospor 22 horas, desnudos e selecionados de acordo com a presença do primeiro corpúsculo polar. A ICSI foirealizada com espermatozóides do Tratamento T1(TCM 199 Hanks + 10% de SFB), T2 (TCM 199 + 10%de soro fetal + 0.2 M de Threalose), congelado (T3=controle) e sem célula (T4=controle). Após 1 hora daICSI, os ovócitos foram incubados em ionomicina por 5 minutos, cultivados em SOF por 3 horas e finalmenteincubados em 6-DMAP por 4 horas.. O cultivo definitivo foi realizado em SOF com cocultura de células docúmulus por 7 dias. Alguns ovócitos de cada tratamento foram fixados overnight em metanol e ácido acéticoe corados com lacmóide 1% para avaliação de descondensação de cabeça e formação pró-nuclear. Osresultados relacionados com a estrutura espermática após liofilização foram semelhantes aos encontradospor outros autores, porém, em média 95% dos espermatozóides nos dois tratamentos tiveram sua estruturaacrossomal preservada. Em todos tratamentos foram observadas descondensação e formação pró-nuclear,indicando participação do gameta masculino. As taxas de clivagem foram 36,70 %; 48,12%; 51,23% e40%, respectivamente para ICSI de T1, T2, T3 e T4. A produção de blastocistos foram 9,49%, 15.62%,17,28% e 10,8%, respectivamente para ICSI de T1, T2, T3 e T4. O destaque destes resultados foi que aICSI T2 não apresentou diferença significativa (P<0.05), em relação a ICSI com espermatozóide congelado(controle). Os resultados sugerem que os espermatozóides bovinos liofilizados podem gerar desenvolvimentoembrionário e a threalose parece apresentar efeito benéfico neste processo.Apoio financeiro: Embrapa/ CNPq

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IDENTIFICAÇÃO DA EXPRESSÃO DIFERENCIAL DA PI3K EM OÓCITOSE EMBRIÕES BOVINOS VIA DIFFERENTIAL DISPLAY PCR (DDPCR)

Ripamonte, P.1; Emanuelli, I.P.1; Mesquita, L.G.1; Cortezzi, S.S.1; Biase, F. H.3;Merighe, G.K.F.1; Caetano, A.R.2; Meirelles, F.V.1

1 FZEA/USP, Laboratório de Morfofisiologia Molecular e Desenvolvimento, Pirassununga – SP, 13635-970 – Brasil. 2EMBRAPA – Recursos Genéticos e Biotecnologia – Brasília, DF-Brasil. 3 FMRP/USP –

Departamento de Genética – Ribeirão Preto – SP – Brasil. [email protected]

Visando identificar genes associados ao desenvolvimento, bloqueio ou morte embrionária, três grupos deembriões bovinos produzidos in vitro foram selecionados: grupo R8 (embriões 8 células às 48 hpi e altopotencial de desenvolvimento), L4 (4 células às 48 hpi) e L8 (8 células às 90 hpi), ambos com baixa taxa dedesenvolvimento a blastocisto. O RNA foi extraído de grupos de 50 embriões e foi submetido a análise viaDDPCR (Differential Display PCR), em triplicata, com 3 primers âncora e 20 aleatórios. Os produtosamplificados foram separados em gel de poliacrilamida desnaturante 6,5%. Os fragmentos diferencialmenteexpressos entre os grupos de embriões rápidos e lentos foram isolados do gel, reamplificados e seqüenciados.Foram obtidos 176 fragmentos expressos diferencialmente, sendo 42% presentes em embriões R8, 28,2%em embriões L8 e 10,3% em L4, 10,9% presentes somente em embriões R8 e L4, e 6,9% e 1,7% apenasausentes em R8 e L4, respectivamente. Estes resultados confirmam que um grande número de transcritosestá sendo expresso no momento da ativação do genoma embrionário, em associação ao desenvolvimentoou bloqueio. Nos 23 fragmentos sequenciados identificou-se um transcrito presente em embriões L4,posteriormente confirmado nos demais grupos, com seqüência similar à subunidade catalítica daFosfatidilinositídeo 3-Kinase (PI3K). Visando a continuidade da carcterização do gene identificado viaDDPCR, a presença de mRNA da PI3K foi testada em grupos de 50 oócitos de qualidade A (cumuluscompleto e compacto), B (cumulus parcial e compacto), C (cumulus expandido) e D (ausência de cumulus).Os oócitos foram desnudados com Hialuronidase após a separação em cada grupo. O RNA extraído foireversamente transcrito e utilizado em reações de PCR. Foram amplificados um fragmento correspondente àPI3K de 453pb e duas possíveis isoformas de 350 e 290pb, aproximadamente. Pôde-se observar que coma diminuição da qualidade do oócito a proporção entre os diferentes fragmentos amplificados é alterada,resultando em um aumento da freqüência relativa da banda de 453pb nos oócitos de qualidade D. As PI3Ks,são responsáveis por vários processos biológicos, agindo como mediadores na maturação do oócito e tambémem processos associados à sinalização anti-apoptótica. Nossa hipótese é que o nível de expressão da PI3Kem oócitos pode estar correlacionado com um mecanismo de proteção anti-apoptótico. Os fragmentosestão sendo seqüenciados para a melhor caracterização e avaliação do modelo proposto.Apoio financeiro: FAPESP.

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AMPLIFICAÇÃO DE cDNA DE OÓCITOS BOVINOS

Biase, F.H.1, Mingoti, G.Z.2, Ripamonte, P.3, Cortezzi, S.S.3, Merighe, G.K.F.3,Martelli, L.1, Meirelles. F.V.3

1 Departamento de Genética - FMRP/USP, Ribeirão Preto-SP, 14049-900, Brasil. 2 Departamento deApoio, Produção e Saúde Animal - FMV/UNESP, Araçatuba-SP, 16050-680, Brasil. 3 Departamento de

Ciências Básicas - FZEA/USP, Pirassununga-SP, 13635-970, Brasil. [email protected]

A quantidade de RNA mensageiro (RNAm) presente em oócitos ou embriões tem sido limitante em técnicasque investigam a expressão gênica em larga escala, como construção de bibliotecas, hibridização em arranjosde cDNA, hibridização subtrativa, entre outras. O objetivo desse trabalho foi aplicar a técnica de amplificaçãode cDNA completo (acDNA) em oócitos bovinos. RNAm foi extraído de 50 oócitos maturados e 50 oócitosnão maturados (~1µg de RNAm) e submetido à reação de transcrição reversa com primers oligo(dT). Areação foi purificada por coluna de separação de ácidos nucléicos. Às extremidades 3’ do híbrido cDNA/RNAm foram adicionados dGTPs (~25nucleotídeos) em reação catalisada pela enzima Terminal Transferase.O cDNA foi amplificado por PCR com primers oligo(dT12) e oligo(dC12) por 20 ciclos, em 50µL de volumefinal. O produto amplificado foi dividido em 4 novas reações com as mesmas condições e primers da anterior,por mais 20 ciclos, em 50µL de volume final. A qualidade do cDNA amplificado foi avaliada por eletroforesede 15µL da reação em gel de agarose, corado com brometo de etídio. Para testar a eficiência do sistema,uma amostra da reação foi diluída 20 vezes e utilizada para amplificar, por PCR, cDNA de genes de expressãoconstitutiva e de baixa ocorrência. Foi possível observar amplificação de fragmentos de acDNA variando de100 a 1800 pares de bases. Os genes GAPDH, BAX, BCL2, PI3K e MATER foram amplificados por PCRa partir do equivalente a 0,025 oócitos. Esses resultados demonstram a viabilidade da amplificação docDNA de oócitos e que esta estratégia pode ser aplicada em técnicas que avaliam qualitativamente a expressãogênica em uma amostra limitada de oócitos ou embriões. Pretende-se, futuramente, padronizar a amplificaçãode cDNA para aplicação em métodos de avaliação quantitativa da expressão gênica.Apoio Financeiro: FAPESP:99/12351-3, CAPES e FAEPA/FMRP.

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RESUMOS

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DESENVOLVIMENTO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS DE MÁ QUALIDADE EM TRÊS DIFERENTES MEIOS DE CULTURA*

Alvarez, R.H.2; Pires, R.M.L.2; Martinez, A.C.2; Meirelles, F.V.3

2 Instituto de Zootecnia-APTA, Nova Odessa-SP, 13460-000, Brasil. 3 Depto de Ciências Básicas-FZEA-USP, Pirassununga-SP, Brasil. [email protected]

Os embriões bovinos de má qualidade (Grau 3) representam, em média, de 10 a 15% dos embriões produzidospor vacas superovuladas, sendo normalmente descartados. No caso de serem transferidos, a taxa de prenhezraramente ultrapassa 15%. O presente estudo objetivou avaliar a capacidade de desenvolvimento dessesembriões em três meios de cultura. Mórulas Grau 3, colhidas de doadoras superovuladas no sétimo dia apósa inseminação, foram cultivadas nos meios CR-2 (n=10), Holding Plus™ (n=10) e Earle + 10% de soro fetalbovino (SFB) (n=10) durante 48 horas em estufa com ambiente controlado (38,5 oC e 5% CO2). A taxa dedesenvolvimento até blastocisto, após 24 horas, foi de 60% no meio CR-2, de 50% no Holding Plus™ e de60% no Earle + SFB, respectivamente (P>0,05). Somente os embriões que evoluíram a blastocisto continuaramseu crescimento após 24 horas de cultura. Após 48 horas de cultura, 40% (CR-2), 30% (Holding Plus™) e50% (Earle + SFB) dos embriões eclodiram ou estavam em processo de eclosão. Esses resultados mostramque aproximadamente 50 a 60% dos embriões de má qualidade podem continuar seu desenvolvimento invitro, mesmo em meios de cultura mais simples. Falta por demonstrar se esses embriões, morfologicamentenormais, são capazes de continuar seu desenvolvimento após a transferência para receptoras.

* Apoio FAPESP

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ASSOCIAÇÃO DE ROSCOVITINA E ANTIOXIDANTES NA MATURAÇÃONUCLEAR IN VITRO DE OÓCITOS BOVINOS

Barretto, L.S.S.1; Tavares, D.C.2; Perecin, F.1; Mingoti, G.Z.3

1 DMVPRA, FCAV-UNESP, Jaboticabal-SP, Brasil. 2 Médica Veterinária Autônoma, Ribeirão Preto-SP,Brasil. 3 DAPSA, FMVA-UNESP, Araçatuba-SP, Brasil. E-mail: [email protected]

A roscovitina, uma purina conhecida especificamente por inibir a atividade do MPF em numerosos sistemascelulares, mantém oócitos bovinos no estádio de vesícula germinativa. Os antioxidantes (cisteamina e β-mercaptoetanol) protegem as células do estresse oxidativo nos meios de cultivo. Objetivamos avaliar osefeitos da roscovitina, cisteamina e β-mercaptoetanol na cinética da maturação nuclear in vitro de oócitosbovinos. Oócitos (n=606) foram maturados a 38,7oC em atmosfera de 5% CO2 em ar em meio TCM-199suplementado com 0,3% BSA, 0,5 µg FSH, 100 UI hCG e 1 µg estradiol/ml (controle), adicionado de 25µM de roscovitina (Rosc), 25 µM de roscovitina + 50 µM de cisteamina (Rosc+Cist) e 25 µM de roscovitina+ 50 µM de β-mercaptoetanol (Rosc+Merc). Os oócitos em meio suplementado com roscovitina foram pré-maturados por 24 horas, e depois transferidos para gotas com meio controle para maturação. Após 8, 16 e24 horas do início de maturação, os oócitos foram corados com Hoescht 33342 para avaliação da maturaçãonuclear. Os dados foram analisados por ANOVA (P<0,05). Com 8 horas do início de maturação, os oócitosapresentaram-se em metáfase I em 41,18%ª (controle), 39,02%ª (Rosc), 47,06%ª (Rosc+Cist) e 43,48%ª(Rosc+Merc). Após 16 horas de maturação, observou-se a fase de anáfase I/ telófase I em 30,77%ª(controle), 31,37%ª (Rosc), 35,29%ª (Rosc+Cist) e 36,36%ª (Rosc+Merc). Às 24 horas de maturação, osoócitos apresentaram-se em metáfase II em 58,62%ª (controle), 51,06%ª (Rosc), 37,74%ab (Rosc+Cist) e20%b (Rosc+Merc). O meio suplementado com roscovitina e β-mercaptoetanol foi mais eficiente no atrasoda maturação nuclear ao final das 24 horas, sendo semelhante ao meio com roscovitina e cisteamina, que nãodiferiu dos meios controle e roscovitina. Verificou-se, portanto, a reversão do bloqueio da progressão dameiose após a remoção do meio com roscovitina.Apoio Financeiro: FAPESP

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AVALIAÇÃO DE UM SISTEMA DE CULTIVO DE EMBRIOES BOVINOSPRODUZIDOS IN VITRO

Miranda, M.S.1; Amarante, M.2; Cordeiro M.S.1; Biondi, F.C.1; Sousa, J.S.; Ohashi, O.M.1

1 Laboratório de Fertilização In vitro – CCB – UFPA – Belém-PA; 2 Central Genética Campo de Boi –Ipixuna – PA. [email protected]

O objetivo deste trabalho foi avaliar um sistema “artesanal” de cultivo de embriões bovinos para reduzir ocusto de produção. O sistema consiste de um recipiente cilíndrico de acrílico com tampa superior, parcialmentemergulhado em banho Maria à 39°C, conectado a um cilindro contendo mistura gasosa (5% CO2, 5% O2 e90% N2). A composição da atmosfera gasosa foi criada pela injeção da mistura durante 5 minutos diariamenteou quando da abertura do recipiente. No Experimento 1, os ovócitos foram desnudados com hialuronidasee ativados partenogeneticamente com Ionomicina e 6-DMAP (Susko-Parrish et al.,1994; Susko-ParrishDev. Biology, 166, 729). No Experimento 2 os ovócitos foram maturados e fecundados in vitro. Em ambosos experimentos, os ovócitos foram selecionados e maturados in vitro em TCM-199 suplementado comFSH, LH e 10 ng/ml de fator de crescimento epidérmico (EGF) em estufa com 5% CO2 e máxima humidadedurante 24h. A fecundação in vitro foi realizada em estufa com 5% de CO2 durante 18h. Após a ativação oua fecundação, os ovócitos de cada grupo foram divididos aleatoriamente em dois grupos: CONVENCIONALe EXPERIMENTAL. No grupo CONVENCIONAL, foram cultivados em meio CR2 suplementado comBSA e 10% de SFB (Wang et al., 1997; Wang, Ani.Repr.Sci 48,37) em estufa com 5% de CO2. No grupoEXPERIMENTAL, foram cultivados em meio SOF (Holm et al., 1999; Holm Theriogenology, 52, 683)suplementado com BSA e 5% SFB. Nos quatro grupos, a taxa de clivagem foi avaliada no segundo dia e dedesenvolvimento embrionário (morulas e blastocistos) no sétimo dia de cultivo. Os resultados do Experimento1 mostraram que não houve diferença estatística significativa quanto ao desenvolvimento embrionário entreos grupos CONVENCIONAL e EXPERIMENTAL (32,5% vs. 37,6% respectivamente; p>0,05), assimcomo no Experimento 2 para os grupos CONVENCIONAL e EXPERIMENTAL (32,1% vs. 29,8%respectivamente; p>0,05). Estes resultados mostram que é possível cultivar eficazmente embriões bovinosproduzidos in vitro de forma alternativa e cerca de 20X mais barata que o convencional. Estão realizandoestudos para avaliar a qualidade dos embriões produzidos no sistema experimental e a eficácia do sistemanas outras etapas do processo de produção in vitro de embriões, como a maturação e a fecundação.

Apoio Financeiro: FINEP, CAPES, CNPq, SECTAM, Central Genética Campo de Boi.

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EFEITOS DO IBMX (3 ISOBUTIL, 1 METIL-XANTINA) SOBRE A MATURAÇÃONUCLEAR DE OÓCITOS BOVINOS IN VITRO

Tavares, D.C.1; Barretto, L.S.S.2; Mingoti, G.Z.3

1 Médica Veterinária Autônoma, Ribeirão Preto-SP, Brasil.2 DMVPRA, FCAV-UNESP, Jaboticabal-SP,Brasil. 3 DAPSA, FMVA-UNESP, Araçatuba-SP, Brasil. E-mail: [email protected]

Inibidores da fosfodiesterase, como o IBMX, inibem reversivelmente a maturação nuclear de oócitos, mantendoestacionado o estádio de vesícula germinativa. Desta forma, estes podem ter a oportunidade de adquirir umagrande competência no desenvolvimento, já que há mais tempo para aquisição da maturação do citoplasma.Para avaliar os efeitos do IBMX sobre a maturação nuclear, oócitos bovinos (N=458) foram maturados invitro (MIV) em meio TCM199 bicarbonato suplementado com 0,3% de BSA, 100 UI de hCG, 0,5 µg deFSH e 1 µg de estradiol/mL (Controle), adicionado de 0,5 mM de IBMX (IBMX), 0,5 mM de IBMX + 50µM de Cisteamina (IBMX+C) ou 0,5 mM de IBMX + 50 µM de β-Mercaptoetanol (IBMX+ME). Osoócitos em meio suplementado com IBMX foram pré-maturados por 24 horas e depois transferidos paragotas com meio controle para maturação. Após 8, 16 e 24 horas do início do cultivo de maturação, osoócitos foram corados com Hoescht 33342 para avaliação da maturação nuclear. Os dados foram analisadospor ANOVA (P<0,05). Após 8 horas do início do cultivo de maturação, o número de oócitos em MetáfaseI foi: C= 43,69%ª, IBMX = 18,73%ª, IBMX+C = 16,45%ª e IBMX+ME = 26,90%ª. Com 16 horas, opercentual de oócitos em Anáfase I/ Telófase I foi: C = 44,71%ª, IBMX = 40,83%ª, IBMX+C = 46,42%ªe IBMX+ME = 36,16%ª. Após 24 horas, o percentual de oócitos em Metáfase II foi: C = 51,58%ª, IBMX= 19,16%ª, IBMX+C = 57,71%ª e IBMX+ME = 34,57%ª. Os tratamentos suplementados com IBMX,IBMX+C e IBMX+ME não apresentaram resultados significativos quando comparados ao controle. Conclui-se que o inibidor IBMX não interferiu na cinética da maturação meiótica mesmo quando associado aosantioxidantes cisteamina e β-mercaptoetanol.

Apoio Financeiro: FAPESP

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AVALIAÇÃO DA FRAGMENTAÇÃO DE DNA EM EMBRIÕES BOVINOSPRODUZIDOS APÓS FECUNDAÇÃO DE OÓCITOS MATURADOS

IN VITRO EM MEIO SUPLEMENTADO COM DIFERENTESFONTES DE MACROMOLÉCULA

Lo Turco, E.G.1; Barretto, L.S.S.1; Perecin, F.1; Soria, G.1; Bertolla, R.P.2, Mingoti, G.Z.3

1Departamento de Reprodução Animal, FCAV – UNESP, Jaboticabal; 2Setor de Reprodução HumanaHospital São Paulo, UNIFESP, São Paulo; 3Departamento de Produção e Saúde Animal, FMVA –

UNESP, Araçatuba

A avaliação da fragmentação de DNA fita simples tem se mostrado satisfatória para medir a viabilidade deembriões bovinos em diversos estádios de desenvolvimento. O objetivo do presente trabalho foi analisar aintegridade da fita simples de DNA de embriões produzidos após fecundação in vitro de oócitos maturadosem meio suplementado com 3 diferentes tipos de macromoléculas: soro fetal bovino (SBF) ou albuminasérica bovina (BSA), sendo estes meios quimicamente indefinidos, ou ainda uma macromolécula quimicamentedefinida, o álcool polivinílico (PVA). O oócitos foram colhidos de ovários provenientes de abatedouro ematurados por 24 horas em meio de cultivo de maturação (TCM-199, 0,2 mM de piruvato, 25 mM debicarbonato de sódio, 75 µg/ml de Kanamicina, 1 µg de 17? estradiol/ml, 0,5 µg de FSH/ml, 100 UI de hCG/ml), acrescidos de 1% de PVA, ou 1% de BSA ou 10% de SFB (dependendo do grupo experimental), ematmosfera de 5% de CO2

em ar. Após a fertilização, os zigotos foram cultivados, todos em mesmo meio, até

o estádio de blastocisto (144 horas após fecundação) e submetidos a técnica do cometa. Os blastocistos dogrupo SFB apresentaram a maior fragmentação (44,38% ± 4,8a) diferindo dos grupos BSA e PVA (P<0,05),respectivamente 19,78 % ± 4,6b e 27,54 % ± 4,43b de fragmentação; estes últimos não diferiramestatisticamente (P>0,05). A macromolécula adicionada ao meio de maturação parece ter influenciado afragmentação de DNA fita simples de embriões bovinos cultivados até o estádio de blastocisto, todavia,ainda existem muitos mecanismos a serem investigados sobre a influência da macromolécula nos oócitosdurante a maturação.

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ANGIOTENSINA II REVERTE A AÇÃO INIBITÓRIA DAS CÉLULAS FOLICULARESNA MATURAÇÃO NUCLEAR DE OÓCITOS BOVINOS INDEPENDENTE

DA PRESENÇA DE IGF-I

Stefanello, J.R.1; Porciuncula, P.M.1; Costa, L.F.S.1; Oliveira, J.F.C.1; Gonçalves, P.B.D.1

1Universidade Federal de Santa Maria – UFSM, Laboratório de Biotecnologia e Reprodução Animal –BioRep, Santa Maria- RS, Brasil, 97105-900, FAX 55-2208484, e-mail: [email protected]

O objetivo deste trabalho foi verificar a interação entre o fator de crescimento semelhante a insulina-I (IGF-I) e angiotensina II (Ang II) na reversão do efeito inibitório das células foliculares na maturação nuclear deoócitos bovinos. Os complexos cumulus-oócitos (CCOs) foram aspirados de ovários bovinos obtidos emfrigorífico. O meio de maturação utilizado foi TCM-199 com sais de Earle e L-glutamina (Gibco Labs.,Grand Island, NY), suplementado com 25 mM de Hepes, 0,2 mM de ácido pirúvico, 2,2 mg/ml de bicarbonatode sódio, 0,4% de albumina sérica bovina livre de ácidos graxos (BSA; Sigma Chemical Company, St.Louis, MO), 100 UI/ml de penicilina e 50 µg/ml de estreptomicina. Os CCOs foram maturados em umatemperatura de 39 ºC e atmosfera de 5% de CO2 em ar e umidade saturada, contendo oito metades foliculares(folículos de 2-5 mm) em 200 µl de meio, por 7, 12 e 22 h na presença de Ang II (10-11 M; BACHEM,California); Ang II + IGF-I (10 ng/ml; Sigma) e dois grupos controles, sem Ang II e IGF-I, na presença(controle com células) e ausência (controle sem células) de células foliculares. Um segundo experimento foirealizado na presença de LH (5 µg/ml) e FSH (0,5 µg/ml; National Institute of Diabetes and Digestive andKidney Disease, NIDDK), respeitando o mesmo delineamento experimental anteriormente descrito. Apóssubmeter os dados a uma transformação logarítmica, a análise estatística foi realizada por ANOVA, atravésde um modelo em blocos casualizados, utilizando o PROC GLM. Os tratamentos foram comparados porcontraste no programa estatístico SAS. Em ambos experimentos, a Ang II reverteu a ação inibitória dascélulas foliculares nos estádios de rompimento da vesícula germinativa em 7 h (RVG: 34,8% e 35,2%, sem ecom LH e FSH, respectivamente), metáfase I em 12 h (MI: 39,8% e 46,3%) e metáfase II em 22 h (MII:82,8% e 88,4%), observada em comparação ao grupo controle com células foliculares (p<0,01; RVG:11,2% e 13,0%; MI: 6,7% e 8,6%; MII: 17,4% e 22,0%). Os CCOs cultivados na presença de Ang II +IGF-I e aqueles cultivados na ausência de células foliculares (controle sem células) atingiram índices dematuração similares aos do tratamento com Ang II. A Ang II é capaz de reverter a inibição da maturaçãonuclear em oócitos bovinos causada pelas células foliculares, independente da presença de IGF-I.Trabalho realizado com apoio do PRONEX/CNPq e FAPERGS.

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DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO E APOPTOSE EM EMBRIÕESBOVINOS PRODUZIDOS IN VITRO

Mesquita, L.G.1; Carambula, S.F.1; Emanuelli, I.P.1; Ripamonte, P.1; Merighe, G.K.F.1; Meirelles, F.V.1

1 Departamento de Ciências Básicas, Universidade de São Paulo, Pirassununga, São Paulo, Brasil, 13635-900. [email protected]

Durante a fase inicial de desenvolvimento a fragmentação de blastômeros e do DNA é indicativo de apoptose.No estudo da cronologia das características dessa morte celular observou-se que o aparecimento dacondensação do núcleo ocorre em embriões bovinos cultivados in vitro a partir de 6 células e in vivo a partirde 8 células. No entanto, ensaios de TUNEL indicam que ocorre fragmentação do DNA em embriões de 6células produzidos in vitro e somente a partir de 21 dias naqueles in vivo. O presente trabalho objetivouestudar o desenvolvimento embrionário e ativação da morte celular programada (apoptose) em embriõescom alto potencial de desenvolvimento (grupo rápido) e em embriões com elevado índice de bloqueio (grupolento). Os embriões foram produzidos in vitro e cultivados em meio CR2 modificado (Watanabe et al.,1999). Decorridas 48 horas post insemination (hpi), os embriões foram separados em dois grupos, lento(com menos de 5 células) e rápido (com 5 células ou mais). Embriões dos dois grupos foram processadospara a análise às 48 ou 90 horas de cultura, sendo submetidos à técnica de TUNEL para detecção dafragmentação do DNA. Não foi observada fragmentação do DNA nuclear em nenhum dos grupos avaliadosàs 48 hpi. Contudo, às 90 hpi, observou-se um aumento significativo (p<0,05) no aparecimento de núcleosTUNEL positivos. No entanto, os grupos rápido e lento apresentaram, respectivamente, 9,11% e 11,41%de células TUNEL positivas, não havendo diferença significativa entre os grupos (p>0,05). Estes resultadossugerem que a inibição da fragmentação durante as primeiras fases de desenvolvimento pode estar relacionadacom a presença de um fator de inibição da caspase, liberação do CAD ou deficiência de proteínas como aBAX , às 48 hpi.

Apoio Financeiro: FAPESP-Brasil

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INFLUÊNCIA DAS CÉLULAS DO CUMULUS E DO MEIO DE MATURAÇÃO IN VITRODE OÓCITOS BOVINOS SOBRE A MATURAÇÃO NUCLEAR E AQUISIÇÃO DA

COMPETÊNCIA DO DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO

Ancioto, K.L.1; Vantini, R.1; Garcia, J.M.1; Mingoti, G.Z.2

1 DMVPRA, FCAV-UNESP, Jaboticabal-SP, Brasil. 2 DAPSA, FMVA-UNESP, Araçatuba-SP, Brasil.E-mail: [email protected]

O objetivo do presente trabalho foi avaliar os efeitos do suplemento do meio de maturação e presença dascélulas do cumulus sobre a maturação nuclear in vitro de oócitos bovinos e subsequente desenvolvimentoembrionário. Complexos-cumulus-oócito (COC) ou oócitos desnudos (DO) (n=1.383) foram maturados a38,7oC em atmosfera de 5% CO2 em ar em meio TCM-199 suplementado com 0,5 µg FSH, 100 UI hCGe 1 µg estradiol/ml, adicionado de 10% de soro fetal bovino (SFB), 0,6% de albumina sérica bovina (BSA)ou 0,6% de polivinil álcool (PVA). Após 24 horas do início do cultivo de maturação, a expansão das célulasdo cumulus foi avaliada nos grupos COC (classificação por escores variando de 0 a 5; escore 0 indicanenhuma expansão e escore 5 indica máxima expansão, inclusive da corona radiata). Metade dos oócitosmaturados foi corada com Hoescht 33342 para avaliação da maturação nuclear e o restante foi fecundado.Os zigotos foram cultivados em meio mSOF suplementado com 0,5% BSA e 2,5% SFB, a 38,7°C durante168h. Os dados foram analisados pelo teste de ANOVA (P<0,05). Às 24 horas de maturação, os oócitosapresentaram-se em metáfase II em 75,4%ª (COC-SFB), 74,9%ª (COC-BSA), 85,6%a (COC-PVA),85,2%ª (DO-SFB), 78,0%ª (DO-BSA) e 73,9%a (DO-PVA). Nos grupos COC, a média do escore deexpansão das células do cumulus foi de 4,8ª (COC-SFB), 4,1b (COC-BSA) e 3,6c (COC-PVA). Odesenvolvimento embrionário até a fase de blastocisto foi 50,1%ª (COC-SFB), 47,3%ª (COC-BSA), 30,9%b

(COC-PVA), 22,7%b (DO-SFB), 25,9%b (DO-BSA) e 6,6%c (DO-PVA). Em conclusão, muito emboraos três meios e a presença ou ausência das células do cumulus tenham proporcionado semelhantes taxas dematuração nuclear, o desenvolvimento embrionário foi negativamente afetado quando IVM ocorreu em meioindefinido e na ausência de células do cumulus. Os dados sugerem a participação das células do cumulusnos processos fisiológicos do oócito durante a maturação.

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INFLUÊNCIA DAS CÉLULAS DO CUMULUS E DA RAÇA DO TOURO NODESENVOLVIMENTO DE EMBRIÕES BOVINOS, SUBMETIDOS A

ESTRESSE TÉRMICO CALÓRICO

Eberhardt, B.G.*; Kapinzaiki, C.R.L.; Satrapa, R.A; Barros, C.M.

Departamento de Farmacologia IBB/UNESP, Botucatu-SP.

Existem evidências de que os efeitos deletérios do estresse térmico calórico (ETC) são menos pronunciadosse as células do cumulus estiverem presentes no cultivo in vitro, devido provavelmente a moléculas termo-protetoras produzidas pelas mesmas. O objetivo do presente trabalho foi testar a hipótese de que embriões,nos estágios iniciais de desenvolvimento, cultivados em meio (TCM 199) contendo células do cumulus (TCM/CC) são mais resistentes ao ETC que embriões cultivados em meio sem células do cumulus (SOF). Alémdisso, avaliou-se a influência da raça do touro na resistência dos embriões ao ETC. Oócitos de vacas Bosindicus (Nelore) e Bos taurus x Bos indicus (mestiça), provenientes de ovários de abatedouro foram maturados22 h a 39º C sob 5% CO2

e fertilizados com sêmen de 2 touros Bos indicus e 2 Bos taurus. Os embriõesforam expostos ou a 39º C continuamente ou a 41º C por 12 h (12 horas pós-inseminação, hpi) e 39º C atéo fim. Os dados foram analisados por Regressão Logística (Proc GENMOD, SAS). O ETC por 12 h (12hpi) em meio TCM/CC alterou significativamente a taxa de clivagem de embriões Nelore [controle, 175/224(78,15%) vs ETC, 157/232 (67,8%); p=0,02], mas não de embriões mestiços [controle, 168/225 (74,65%)vs ETC, 172/240 (71,75%); p>0,05]. Por outro lado, em meio SOF, a taxa de clivagem para embriõesNelore não foi diminuída pelo ETC [controle, 162/231 (70,1%) vs ETC, 169/234 (72,3%); p>0,05], enquantoque os embriões mestiços foram afetados [controle, 192/226 (84,95%) vs ETC, 164/228 (71,9%); p<0,01].O uso dos dois meios (TCM/CC vs SOF) não alterou o efeito do ETC sobre a taxa de clivagem (p>0,05).Para os embriões submetidos ao ETC 12 hpi durante 12h, o número de oócitos que se desenvolveu atéblastocisto (blastocistos/oócito) no dia 8 foi: Nelore [103/224 (45,98%) a 39º C vs 63/232 (27,15%) a 41ºC/12 h, TCM/CC p<0,01; 116/231 (50,2%) a 39º C vs 83/234 (35,47%) a 41º C/12 h, SOF p<0,01] vsmestiços [101/225 (44,8%) a 39º C vs 75/240 (31,2%) a 41º C/12 h, TCM/CC p<0,01; 136/226 (60,1%)a 39º C vs 74/228 (32,4%) a 41º C/12 h, SOF p<0,01]. Tanto o uso do meio TCM/CC quanto do SOF nãoalterou o efeito do ETC sobre a taxa de blastocistos, indicando que as células do cumulus presentes no meioTCM não protegeram os embriões dos efeitos deletérios do ETC. Além disso, a raça do touro não teveefeito significativo na taxa de formação de blastocistos em nenhum grupo (p>0,05). Concluindo, os resultadosacima não confirmam a hipótese de que o meio de cultivo com células do cúmulus (TCM/CC) tenha umaação termo-protetora, em embriões submetidos ao ETC. Adicionalmente, o uso de sêmen de Bos indicus ouBos taurus não alterou a taxa de formação de blastocistos nos embriões submetidos ao ETC. Bolsista daCAPES.

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USO DE DIFERENTES MEIOS E TRATAMENTOS HORMONAIS NAMATURAÇÃO DE OÓCITOS SUÍNOS

Marques, M. G.; Gerger, R.P.C.; Oliveira, V.P.; Nascimento, A.B.; Visintin, J.A.

Departamento de Reprodução Animal – FMVZ/USP, São Paulo - SP, 055508-000, [email protected]

O objetivo deste estudo foi avaliar a maturação de oócitos suínos em quatro meios: TCM199 com 0,1%Álcool polivinílico (PVA), TCM199 com 10% Fluído Folicular Suíno (PFF), NCSU23 com 0,1% PVA eNCSU23 com 10% PFF. Cada meio recebeu quatro tratamentos hormonais: Tratamento 1 - incubação por22 horas - 50UI de EGF/ml e 10UI de eCG/ml, seguido de incubação por 22 horas - 50UI de EGF/ml e10UI de hCG/ml; Tratamento 2 - incubação por 22 horas - 50UI de EGF/ml, 10UI de hCG/ml e 10UI deeCG/ml, seguido de incubação por 22 horas - 50UI de EGF/ml; Tratamento 3 - incubação por 22 horas -10UI de eCG/ml, seguido de incubação por 22 horas - 10UI de hCG/ml; Tratamento 4 - incubação por 22horas - 10UI de eCG/ml e 10 UI de hCG/ml, seguido de incubação por 22 horas no respectivo meio dematuração. As incubações foram feitas em estufa à 38,5ºC, 5% de CO2 em ar e alta umidade. Ao final doperíodo de maturação (44 horas), cada grupo de oócitos teve as células do cumulus oophorus removidascompletamente por exposição à solução de hialuranidase (5 mg/ml). Em seguida os oócitos foram fixados,corados com 10µg de Hoechst 33342/ml em glicerol e avaliados no microscópio de epifluorescência. Paraanalisar os resultados foi empregado o teste do Qui-quadrado (χ2) com nível de significância de 5%. Quantoaos oócitos em Metáfase II, o tratamento 2 apresentou os índices com maior repetibilidade (54,5% - 61/112; 65,0% - 63/97; 54,6% - 65/119; 58,1% - 61/105, respectivamente, TCM + PVA; TCM + PFF;NCSU23 + PVA; NCSU23 + PFF), em comparação aos tratamentos 1 (43,8% - 53/121; 75,2% - 82/109;39,3% - 46/117; 52,9% - 73/138, respectivamente, TCM + PVA; TCM + PFF; NCSU23 + PVA; NCSU23+ PFF), tratamento 3 (47,7% - 53/111; 66,4% - 85/128; 63,8% - 67/105; 65,1% - 71/109, respectivamente,TCM + PVA; TCM + PFF; NCSU23 + PVA; NCSU23 + PFF) e tratamento 4 (49,6% - 56/113; 69,0% -89/129; 53,4% - 62/116; 66,2% - 90/136, respectivamente, TCM + PVA; TCM + PFF; NCSU23 + PVA;NCSU23 + PFF). Enquanto que o meio TCM 199 apresentou os índices com maior repetibilidade com PFF(75,2% - 82/109, 65,0% - 63/97, 66,4% - 85/128, 69,0% - 89/129, respectivamente, para os tratamentos1, 2, 3 e 4) ou PVA (43,8% - 53/121, 54,5% - 61/112, 47,7% - 53/111; 49,6% - 56/113, respectivamente,para os tratamentos 1, 2, 3 e 4), em relação aos demais meios. Os índices de maturação dos oócitos nosgrupos suplementados com PFF foram superiores aos com PVA.

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EFEITO DE MACROMOLÉCULAS SOBRE OS COMPLEXOS CUMULUS-OÓCITO E SUBSEQÜENTE DESENVOLVIMENTO DE EMBRIÕES BOVINOS IN VITRO

Emanuelli, I.P.1; Perecin, F.2 ; Marques, M.G.3 ; Mesquita, L.G.1; Cortezzi, S.S.1;Merighe, G.K.F.1; Meirelles, F.V.1

1 Departamento de Ciências Básicas – Laboratório de Morfofisiologia Molecular e Desenvolvimento,FZEA/USP, Pirassununga-SP, 13635-970 – Brasil. [email protected] 2 Departamento de Medicina

Veterinária Reprodução Animal, UNESP, Jaboticabal-SP 3Departamento de Reprodução Animal,FMVZ-USP, São Paulo, Brazil

O bloqueio do desenvolvimento embrionário em bovinos ocorre no quarto ciclo celular quando o controleembrionário torna-se evidente. Sabe-se que o potencial de desenvolvimento embrionário in vitro é influenciadopor diversos fatores, entre eles, as diferentes variações dos meios de maturação e de cultivo. Estes fatorespodem provocar alterações na maturação dos oócitos e das células do cumulus (CC), além de diferentestaxas de desenvolvimento. Com base nestas evidências, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito dasuplementação de macromoléculas sobre a maturação nuclear dos oócitos, a fragmentação nuclear das CCe o desenvolvimento embrionário. Foram selecionados 370 oócitos, distribuídos em 3 grupos quanto àsuplementação do meio de maturação e de cultivo: grupo SFB (10% de SFB nos meios MIV e CIV); grupoBSA (6 mg/mL de BSA nos meios MIV e CIV) e grupo PVA (6 mg/mL de PVA no meio MIV e 6 mg/mLde BSA no meio CIV). Os oócitos foram maturados em meio TCM 199 suplementado conforme os gruposexperimentais. Após 24h, 192 oócitos foram avaliados para maturação nuclear (experimento1) e grau defragmentação do DNA das CC através da técnica de Ensaio Cometa (Takahashi et al., 2000; experimento2). Os demais oócitos (n=182) foram submetidos à fecundação in vitro em meio Fert-TALP por 18h ecultivados em SOF à 38°C em 5%CO2 e 5%O2. No experimento 3 foram avaliadas a taxa de clivagem e dedesenvolvimento embrionário. A análise estatística foi realizada através dos testes t de Student e qui-quadrado.Não houve diferença significativa entre os grupos SFB, BSA e PVA para maturação nuclear (78,1%, 73,6%e 71,0%, respectivamente), bem como no grau de fragmentação nuclear das CC independente damacromolécula utilizada. Na avaliação da taxa de clivagem (85,2%; 55,6% e 54,7%) e de blastocisto (42,6%;34,4% e 31,6%) obteve-se uma maior percentagem no grupo SFB do que nos grupos BSA e PVA. Noentanto, quando se avaliou a taxa de blastocistos em relação aos embriões 8 células, o percentual destes quechegaram ao estádio de blastocisto foi maior (p<0.001) nos grupos BSA e PVA (SFB: 66,9%; BSA: 82,0%e PVA: 79,0%). Assim, quando o BSA e PVA foram utilizados na suplementação dos meios de cultivo, ummenor número de zigotos alcançaram o estágio de oito células. Em contrapartida, a maioria dos zigotos queatingiram 8 células ultrapassaram o bloqueio embrionário, desenvolvendo-se até o estágio de blastocisto. Emconclusão, a suplementação de SFB no meio de cultivo favoreceu o desenvolvimento embrionário até oquarto ciclo celular.Apoio financeiro: FAPESP.

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ANÁLISE DE PROTEÍNAS POR ELETROFORESE BI-DIMENSIONAL DE OÓCITOSBOVINOS MATURADOS IN VITRO NA PRESENÇA OU AUSÊNCIA DE

CÉLULAS DO CUMULUS

Ancioto, K.L.1; Vantini, R.1; Roncoleta, M.2; Mingoti, G.Z.3

1DMVPRA, FCAV-UNESP, Jaboticabal-SP, Brasil. 2Lagoa da Serra, Sertãozinho-SP, Brasil. 3DAPSA,FMVA-UNESP, Araçatuba-SP, Brasil. E-mail: [email protected]

Objetivamos avaliar os efeitos da presença ou ausência das células do cumulus sobre os padrões de proteínasconstitutivas em oócitos bovinos maturados in vitro. Complexos-cumulus-oócito (grupo COC) ou oócitosdesnudos (grupo DO) (n=4.409) foram maturados a 38,7oC em atmosfera de 5% CO2 em ar em meioTCM-199 suplementado com 0,5 µg FSH, 100 UI hCG e 1 µg estradiol/ml, adicionado de 10% de SFB,0,6% de BSA ou 0,6% PVA. Após 24 horas do início do cultivo de maturação, foi feita a remoção da zonapelúcida dos oócitos dos grupos COC e DO, sendo que os oócitos do grupo COC foram desnudadosanteriormente a este procedimento. Após, os oócitos foram lisados e as proteínas foram solubilizadas equantificadas para aplicação em gel de eletroforese. Para eletroforese, foi primeiramente realizada a focalizaçãoisoelétrica das proteínas (IPG strip pH 3-10; Amersham Biosciences), seguida de separação em SDS-PAGE (géis 13% de poliacrilamida). Os géis foram corados por nitrato de prata e as imagens foram analisadasem computador (programa Phoretix 2D, versão 2003.02). Foram determinados o peso molecular em kDa(PM), o ponto isoelétrico (pI) e o VION (volume dos “spots” normalizado pelo programa). Os dados foramanalisados pelo teste t-Student (P<0,05). A comparação do VION entre os grupos COC e DO demonstroudiferenças significativas entre o “spot” 29 (PM 63,49 e pI 4,86), “spot” 31 (PM 63,36 e pI 4,94) e “spot” 99(PM 68,15 e pI 5,19). O VION mensurado para os grupos COC e DO foi, respectivamente: 832,5a e 90,6b

(P<0,05) para o “spot” 29; 149,5a e 0,0b (P<0,05) para o “spot” 31; 1239,0a e 95,1b (P<0,05) para o“spot” 99. Os resultados demonstraram que determinadas proteínas estão presentes ou são mais intensamenteexpressas apenas quando a MIV ocorre na presença das células do cumulus. Estudos adicionais são necessáriospara determinar se estas proteínas estão relacionadas à aquisição da competência oocitária durante o processode maturação.Apoio Financeiro: CAPES, FUNDUNESP

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CULTIVO DE EMBRIÕES BOVINOS PRODUZIDOS IN VITRO: EFEITO DONÚMERO DE ZIGOTOS E DO VOLUME DE MEIO

Brum, D.S.1,2; Leivas, F.G.1,2; Fialho, S.S.2, Mozzaquatro, F.D. 1,2, Bernardi, M.L.3;Rubin, M.I.B.1,2; Silva, C.A.M.1,2

1 Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária, UFSM, Santa Maria, RS, Brasil. 2 Embryolab –Laboratório de Embriologia e Reprodução, 97.119-900, Santa Maria, RS.; 3 Departamento de Zootecnia,

Faculdade de Agronomia, UFRGS, Porto Alegre, RS. [email protected]

Oócitos bovinos recuperados através de aspiração folicular in vivo variam em qualidade e, devido ao reduzidonúmero, requerem condições adequadas para se desenvolver in vitro. Para determinar a influência do númerode embriões por gota e o do volume de meio sobre o desenvolvimento de embriões bovinos in vitro, 1428zygotos foram distribuídos aletoriamente, após a fecundação, em 3 grupos com 5, 10 e 20 zigotos, nasproporções de 1:1, 1:5 e 1:10 (zigotos:volume in µl), em 7 repetições. Os embriões foram produzidos a partirde complexos cumulus-oócitos (CCO) aspirados de folículos de 2-8mm, de ovários de matadouro. Amaturação in vitro (MIV) foi efetuada em grupos de 20 CCO/200µl de meio TCM-199, modificado com r-hFSH e 10% de soro de vaca no cio (SVE), por 24h, em estufa com 5% de CO2, em ar, a 38,5ºC e umidadesaturada. A FIV foi realizada com sêmen separado por migração ascendente com 1x106 espermatozóides/ml, em grupos de 20 oócitos/200µl de meio Fert-Talp + heparina + PHE, com incubação dos gametas por18h. O cultivo foi realizado em meio SOFaaci + 5% de SVE, pelo período de 8 dias. As avaliações foramefetuadas nos dias D2 (clivagem), D7 (blastocisto) e D9 (blastocisto expandido, em eclosão e eclodido),considerando-se a dia da fecundação como o dia zero (D0). Os dados foram submetidos à transformaçãoarco seno raíz quadrada e ANOVA e as médias comparadas em nível de 5% de significância. Os índices deeclosão foram comparados pelo teste Qui-quadrado. As percentagens de clivagem e eclosão foram similaresnos grupos com 5, 10 ou 20 zigotos e no D9, a produção de blastocistos nos grupos com 5 zigotos (16,2%)foi inferior à dos grupos com 10 (20,8%) e 20 (24,7%) zigotos. O índice de clivagem e eclosão entre asproporções de meio de 1:1, 1:5 e 1:10 foram similares. A produção de embriões no D9 foi inferior naproporção 1:1 (15,6%) em comparação com 1:5 (23,1%) e 1:10µl (23,0%). O índice de desenvolvimentoembrionário é afetado negativamente quando o cultivo é efetuado com reduzido número de embriões comotambém, quando não há suficiente meio por embrião.

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AVALIAÇÃO DE UMA BOMBA DE INFUSÃO CONTÍNUA COMO GERADORADE VÁCUO PARA OBTENÇÃO IN VIVO DE OÓCITOS BOVINOS

Rubin, K.C.P.1; Rigo, A.G.1; Schroeder, R.V.1; Silva, R.C.P.2;Marques, M.O.2; Seneda, M.M.1

1Departamento de Clinicas Veterinárias e Reprodução Animal- Universidade Estadual de Londrina,Londina –PR, 86051-990, Brasil, [email protected]. 2Geraembryo-Central de transferência de

embriões, Cornelio Procópio-PR, 86300-000, Brasil.

A técnica de FIV apresenta-se em franca expansão no Brasil, com crescente número de veterinários habilitando-se para obtenção de oócitos e envio dos mesmos para centrais de produção in vitro de embriões. Um fatorlimitante para um crescimento mais amplo consiste no alto custo dos equipamentos para a aspiração foliculartransvaginal. O objetivo deste trabalho foi avaliar um equipamento alternativo para a geração de vácuo, quefosse capaz de permitir a recuperação de oócitos em quantidade e qualidade compatíveis com bombas feitasespecificamente para este fim. Utilizou-se uma bomba de infusão contínua, cuja aplicabilidade para fins deaspiração foi possível graças ao modo inverso de utilização do equipo de infusão. A extremidade que deveriaficar ligada ao frasco de infusão foi acoplada no tubo de aspiração folicular, enquanto que a extremidade doequipo destinada ao catéter do paciente foi mantida livre. Desta forma, foi possível a manutenção constantede pressão negativa capaz de promover a aspiração dos folículos. Utilizando doadoras Nelore livres deproblemas reprodutivos, foram realizados 28 procedimentos de aspiração folicular com a bomba de infusãocontínua. Obtêve-se um total 704 oócitos, com média de 25,14 oócitos viáveis por sessão de aspiraçãofolicular. Estes números foram similares aos citados na literatura, com a utilização de equipamentos delineadosespecificamente para aspiração folicular. Como aspectos favoráveis da bomba de infusão, além de seu menorcusto, ressaltamos seu reduzido tamanho, controle eletrônico da vazão, e bateria com capacidade para seishoras de trabalho. Estes resultados preliminares sugerem que o equipamento proposto pode ser uma alternativaviável para obtenção in vivo de oócitos bovinos.

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ADIÇÃO DE RETINÓIDES E DE FSH AO MEIO DE MATURAÇÃO DE OÓCITOSE SEUS EFEITOS NA PRODUÇÃO DE EMBRIÕES BOVINOS IN VITRO

Lima, P.F.1; Oliveira, M.A.L.1; Reichenbach, H.-D.2; Weppert, M.3; Cavalcanti Neto, C.C.4;Pina, V.M.R.5; Santos, M.H.B.5; Loureiro, B.5

1Departamento de Medicina Veterinária/UFRPE-Recife/PE, 2Bayerische Landesanstalt für Landwirtschaft/Poing-OT Grub – Germany, 3Bayerisches Forschungszentrum für Fortpflanzungsbiologie/

Oberschleissheim – Germany, 4Departamento de Zootecnia/UFAL-Maceió/AL, 5Programa de Pós-Graduação em Ciência Veterinária/UFRPE-Recife/PE

O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da adição de retinol ou ácido retinóico (AR), com ou sem FSH,no meio de maturação de oócitos bovinos em condições quimicamente definidas. Um total de 936 oócitosforam selecionados para MIV, sendo incubados a 39º C em atmosfera úmida, com 5% de CO2, durante 24horas. Em ambos experimentos a MIV foi realizada em meio básico (bMM) constituído de TCM 199,piruvato de sódio (50 µg/ml), bicarbonato de sódio (2.6 mg/ml) e sulfato de gentamicina (50 µg/ml). Noexperimento 1 (Exp.1), este meio foi suplementado com álcool polivinílico (1 mg/ml), retinol (0.3 µM) ou AR(0.5 µM). No experimento 2 (Exp.2), o bMM foi suplementado com álcool polivinílico (1 mg/ml), retinol(0.3 µM) ou AR (0.5 µM) e FSH (10 µg/ml). A FIV foi realizada em mDM e para a cultura dos presumíveiszigotos e embriões foi utilizado o meio KSOM. Os dados foram avaliados através do X2. No Exp.1, a adiçãode retinol e AR ao bMM não aumentou (p> 0,05) as porcentagens de oócitos que evidenciaram maturaçãocitoplasmática (10,0% e 10,0%, respectivamente) quando comparadas com as do grupo controle (0%),todavia, a clivagem do grupo controle (1,24%) foi menor (p < 0,05) do nos grupos com retinol (27,4%) eAR (28,0%). No grupo controle não houve produção de blastocisto e as porcentagens de blastocistos eblastocistos expandidos obtidas, respectivamente, com retinol (4,57% e 1,30%) e AR (4,45% e 1,91%) nãodiferiram (p > 0,05) entre si. No exp.2, a adição de retinóides e de FSH ao bMM aumentou (p < 0,05) aporcentagem de oócitos que evidenciaram maturação citoplasmática depois do tratamento com retinol (70,0%)e AR (80,0%) quando comparada com à do grupo controle (40,0%). O tratamento com retinol e ARresultou em aumento das porcentagens de clivagem (retinol - 42,8%; AR - 39,3%), blastocisto (retinol -24,1%; AR - 22,1), blastocisto expandido (retinol - 9,7%; AR - 9,2%) e blastocisto eclodido (retinol -1,3%; AR - 1,9%) quando comparado com os percentuais obtidos com o grupo controle (17,8%, 8,3%,1,3% e 0,0%, respectivamente). Os resultados permitiram concluir que a adição de retinóides e FSH aobMM promovem um efeito positivo sobre o desenvolvimento de embriões bovinos, nas condições aquitestadas, e potencialmente pode ser utilizada para incrementar a produção de embriões in vitro.

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UTILIZAÇÃO DA INSULINA NA CO-CULTURA DE EMBRIÕES BOVINOS

Lima-Verde, I.B.3; Pina, V.M.R.3; Santos, M.H.B3.; Loureiro, B3.; Cavalcanti Neto, C.C2.; Iunes-Souza, T.C.4; Moura, R.T.N.3; Bartolomeu, C.C.5; Oliveira, M.A.L1.

1Departamento de Medicina Veterinária/UFRPE-Recife/PE, , 2Departamento de Zootecnia/UFAL-Maceió/AL; 3Programa de Pós-Graduação em Ciência Veterinária/UFRPE-Recife/PE; 4Curso de /

Graduação em Medicina Veterinária/UFRPE-Recife-PE; 5Departamento de Ciência Agrárias e Ambientais– UESC – Ilhéus- BA

Este trabalho teve como objetivo verificar a eficiência da PIV de embriões bovinos em meio KSOM acrescidode insulina. Foram utilizados 310 oócitos provenientes de ovários bovinos colhidos em abatedouro no municípiode Jaboatão dos Guararapes-PE. Folículos medindo de 2 a 8 mm foram aspirados com agulha 18G acopladaa seringa de 10 mL. Após lavagem em OWM e posterior seleção, os oócitos foram postos em TCM-199para maturação em estufa a 39° C por 24 horas em atmosfera úmida com 5% de CO2. Para a FIV, utilizou-se sêmen bovino congelado em palhetas de 0,5 mL, o qual após descongelação por 3 minutos a 37oC, foisubmetido ao “swim-up”. Após exposição aos espermatozóides na concentração final de 1x106, os oócitosforam incubados por 18 horas em gotas de mDM. Posteriormente, os presumíveis zigotos foram desnudadose distribuídos aleatoriamente nos grupos experimentais KSOM/controle (n=154) e KSOM+insulina (n=156)para a co-cultura com monocamada de células da granulosa. Depois de 48 horas foi efetuada uma leiturapara avaliar a taxa de clivagem e no sétimo dia da co-cultura foi realizada nova leitura para avaliação quali-quantitativa dos embriões. Os resultados foram comparados pelo teste exato de Fischer, utilizando o nível designificância de 5%. Foram obtidas 20,8% e 15,4% de estruturas não fecundadas, 57,8% e 66,6% dedegenerados e 21,4% e 18,0% de embriões nos estádios de mórula e blastocisto, respectivamente, nosgrupos KSOM/controle e no KSOM+insulina. Os resultados permitem concluir não existir necessidade daadição de insulina ao KSOM para incrementar a PIV de embriões bovinos, pelo menos no delineamentoexperimental adotado neste trabalho.

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UTILIZAÇÃO DA ÁGUA DE COCO NO MEIO DE MATURAÇÃO IN VITRODE OÓCITOS DA ESPÉCIE CANINA

Pina, V.M.R1.; Oliveira, M.A.L2; Lima, P.F.2; Moura, R.T.N.2; Alves, J.R.2;Araújo, S.S.3; Melo, A .N.4; Aguiar Filho, C.R.4

1Programa de Pós-Graduação em Ciência Veterinária/UFRPE. 2Deapartamento de Medicina Veterinária/UFRPE. 3Centro de Vigilância Ambiental da Cidade do Recife – PE. 4Curso de Graduação em Medicina

Veterinária. [email protected]

Este trabalho teve o objetivo de avaliar o efeito da água de coco no meio de maturação in vitro de oócitosda espécie canina. Foram utilizadas 53 cadelas sem raça definida, entre 2 a 7 anos de idade e em diferentesfases do ciclo estral provenientes do Centro de Vigilância Ambiental da Cidade do Recife – PE. Os ováriosforam obtidos após ovariosalpingohisterectomia (OSH) e transportados em solução salina acrescida de 50µgml de gentamicina, a 35°C. No laboratório, obteve-se o complexo cumulus/oócito, em um período máximode duas horas após a colheita. Foram utilizados 453 oócitos, com ooplasma escuro, homogêneo, contendouma ou mais camadas de células do cumulus. Uma vez selecionados, os oócitos foram colocados em gotasde 100 µl sob óleo de parafina, contendo o meio de maturação TCM 199/25 mM (Grupo Controle – GI).De acordo com o grupo experimental este mesmo meio foi acrescido de 25% (GII), 50% (GIII) e 75%(GIV) da solução de água de coco (SBAC), constituída de 50% de água de coco, 25% de água destilada e25% de citrato de sódio a 5%. Os oócitos foram maturados por 48 horas em atmosfera de 5% CO2, a 37°C.Subseqüentemente foram retirados, colocados em solução de citrato de sódio por 10 minutos e levados aovórtex para remoção das células do cúmulus. Para a avaliação da citogenética, os oócitos foram fixados emácido acético/metanol (1:3) e corados com aceto-orceína a 2%. Os resultados obtidos em estágio de vesículagerminativa imatura, em Metáfase I/Anáfase I/Metáfase II e em degeneração foram, respectivamente, paraos grupos: GI (Controle) - 31,3%, 11,3% e 57,4%; GII - 33,6%, 10,3% e 56,1%; GIII - 32,7%, 13,3% e54,0%; e GIV - 19,3%, 5,5% e 75,2%. Houve uma certa equivalência entre os grupos GI, GII e GIII,enquanto que o grupo GIV, apresentou resultados pouco satisfatórios. Não sendo, portanto, evidenciada ainfluência da água de coco no aumento dos índices de maturação dos oócitos. Todavia, de acordo com oteste de Tukey, não houve diferença significativa entre os grupos. Sendo assim, recomenda-se mais estudospara avaliar a contribuição da água de coco e a sua eficácia na maturação de oócitos da espécie canina.

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UTILIZAÇÃO DO SISTEMA POST HATCHING DEVELOPMENT (PHD) NOMONITORAMENTO DO DESENVOVLIMENTO DE EMBRIÕES BOVINOS PIV

Brandão, D.O.1,2,3; Vajta, G.2; Callesen, H.2; Rumpf, R.3

1 Universidade de Brasília–UnB/ Programa de Pós-graduação em Biologia Molecular, 70910-900,Brasília-DF, Brasil; 2Dept. Anim. Breeding and Genetics, Danish Inst. Agricultural Sciences, 8830 Tjele,

Denmark; 3EMBRAPA Recursos Genéticos e Biotecnologia, Parque Estação Biológica, 70770-900,Brasília-DF, Brasil. [email protected]

Apesar das elevadas taxas de blastocisto conseguidas na produção in vitro de embriões bovinos, cerca de40% das perdas embrionárias ocorrem entre 8 e 17 dias de gestação. Portanto, é possível que mesmoaparentemente normais e de boa qualidade, os blastocistos transferidos apresentem defeitos decorrentes deproblemas prévios não detectados. A investigação do desenvolvimento embrionário durante o período deimplantação poderia, portanto, ser uma importante fonte de informação sobre o status embrionário. Objetivandotestar a viabilidade do monitoramento do período pós-eclosão, blastocistos cultivados até o dia 7 sob óleode parafina, conhecidamente tóxico, continuaram o cultivo in vitro no sistema PHD (Brandão et al., 2004)até o dia 14. Para isto, ovócitos de vacas mestiças de abatedouro foram maturados, fecundados (dia 0) ecultivados em SOFaaci coberto com óleo mineral testado ou óleo de parafina tóxico (Brandão et al., 2003).No dia 8, os embriões degenerados foram removidos e foram adicionados 400µl de meio PHD em cadapoço (SOFaaci adicionado 0,5% glicose e 10% soro fetal bovino). No dia 11, 25 blastocistos foramselecionados (0,5 – 1,0 mm ∅, trofoblasto claro, com poucos pontos escuros, células da massa celularinterna compactas) e cultivados em sistema PHD e incubados a 38,5ºC e 5% CO2,

5% O2, 90% N2. Amorfologia e comprimento embrionários foram avaliados diariamente sob estereomicroscópio. No dia 14, foiobservado elongamento de 75% (10/12) dos embriões originados de óleo mineral e 38% (5/13) de óleoparafinado. Os embriões de óleo mineral apresentarem trofoblasto claro, com poucos pontos escuros, massacelular interna compacta e definida, e 6 embriões elongaram além de 1 mm. Já os embriões do óleo parafinadoapresentaram vários pontos escuros no trofoblasto, massa celular interna espalhada ou não identificável, eapenas 3 embriões elongaram além de 1mm. Os embriões elongados foram então processados para histologia.Nos embriões do óleo mineral foram identificados o hipoblasto e um epiblasto penetrante (Camada deRauber), definindo assim o disco embrionário. Os embriões do óleo parafinado apresentaram hipoblastoincompleto, vários pontos de extrusão celular no trofoblasto (correspondente aos pontos escurecidos), e oscomponentes do disco embrionário não puderam ser identificados. Os resultados apresentados mostrampela primeira vez o uso do cultivo prolongado no sistema PHD e a detecção de consequências advindas dosistema de cultivo, mas não reveladas no estágio de blastocisto. Este estudo reforça a importância domonitoramento do desenvolvimento embrionário e destaca como fundamental a investigação do embriãopós-eclosão na superação do principal período das perdas de gestações de embriões bovinos produzidos invitro.Apoio financeiro: Danish Institute of Agricultural Sciences, Tjele, Dinamarca.

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AVALIAÇÃO MORFOLÓGICA DE OÓCITOS SUÍNOS EXPOSTOSEXPERIMENTALMENTE AO VÍRUS DA PARVOVIROSE SUÍNA (PPV)

DURANTE PERÍODO DE MATURAÇÃO IN VITRO*

D’Angelo, M.; Athayde, C.S.; Souza, R.J.; Carvalho, J.F.; Zerio, N.M.C.;Melo, G.M.; Galuppo, A.G.; Bersano, J.G.

Centro de Sanidade Animal do Instituto Biológico de São Paulo Av. Conselheiro Rodrigues Alves, 1252,CEP 04014-002- São Paulo, BR [email protected]

A parvovirose suína é considerada uma das doenças que mais causam reabsorção embrionária, fetosmumificados e diminuição da leitegada. O vírus tem afinidade por tecidos de alta atividade mitótica, replica-se preferencialmente em tecidos fetais, embrionários e linfóides em adultos. Nesse estudo foram avaliadasalterações morfológicas em oócitos expostos experimentalmente ao vírus Porcine parvovirus (titulo 1:256em H.A.), durante o período de maturação in vitro. Complexos oócitos cumulus (COCs) foram coletadosatravés de aspiração de ovários provenientes de abatedouro. Após identificação, COCs foram divididos emgrupos controle e exposto às concentrações de 10µl e 30µl da suspensão viral. COCs foram então maturadosdurante 44 horas em meio NCSU23 em estufa à 39oC, 5% CO2 e 90% de umidade. Tanto o grupo controle,quanto o exposto a 10µl da suspensão viral, apresentaram expansão normal das células do cúmulus. O grupoexposto a 30µµl apresentou citoplasma granuloso e enegrecido, expansão irregular das células do cúmulus,culminando em individualização celular, com células esparsas e os oócitos quase desnudos. Sabe-se que, emsuínos, a expansão das células do cumulus não é usada como parâmetro na avaliação da maturação in vitro,porém alterações em sua morfologia são representativas em estudos sobre tais interações. Sendo assim, taisresultados nos mostram que, possivelmente, o PPV interage de alguma forma com o oócito, penetrando e semultiplicando nas células do cumulus, ou no oócito. Contudo, há a necessidade de estudos utilizando-setécnicas mais específicas sobre interações oócito/embrião/patógeno na área de sanidade em FIV para obtençãode resultados mais fidedignos a fim de, futuramente, contribuirmos na prevenção de doenças infecciosas quepodem estar sendo disseminadas biotecnologias na reprodução de animais.* Suporte financeiro: Embriocare/Cultilab

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AÇÃO CLASTOGÊNICA DO HERPESVÍRUS BOVINO TIPO 1 (BHV-1)EM OÓCITOS BOVINOS MATURADOS IN VITRO.

D’Angelo, M.; Melo, G.M.*; Athayde, C.S.; Souza, R.J.; Zerio, N.M.C.; Rojas, N.; Carvalho, J.F.; Suzuki, M.F.

Centro de Sanidade Animal do Instituto Biológico de São Paulo Av. Conselheiro Rodrigues Alves, 1252,CEP 04014-002- S.P., BR [email protected]

Inúmeras biotécnicas ligadas à reprodução animal têm sido desenvolvidas com o objetivo de otimizar aprodução animal. Tal fato levou-nos a uma preocupação com a transmissão de doenças infecciosas como arinotraqueíte infecciosa bovina, doença causada pelo BHV-1. Devido à vulnerabilidade do material genéticoà agressões impostas por agentes químicos, físicos e biológicos, surgiu a necessidade de se avaliar o danoocorrido no DNA de diversas células submetidas a tais fatores, através de técnicas que permitem a detecçãodo dano, como por exemplo, o teste do Cometa (“single-cell gel eletrophoresis”). Esse trabalho avaliou aspossíveis alterações clastogênicas no DNA de oócitos bovinos maturados in vitro, expostos ao vírus, peloteste do Cometa. Na maturação dos oócitos, 160 foram expostos à concentração de 30µL do BHV-1(amostra Los Angeles, com título de 105.5 TCID50/mL) e 160 mantidos sem o vírus, ambos os grupospermanecendo em estufa de CO2 à 37oC por 24, 48 e 72h (sendo 40 oócitos em cada período). Os oócitosforam submetidos ao ensaio do Cometa, no qual foram colocados em lâminas histológicas com agarose“normal melting” e foram cobertos com agarose “low melting”. Foram tratados com solução de lise por 2 h esubmetidas a corrida eletroforética por 30 minutos a 4oC. As lâminas foram coradas com 50µl de brometode etidio e examinadas em microscópio de fluorescência. A avaliação da alteração nuclear foi realizada pelacategoria de dano, onde foi observado ≅70, 50 e 40% de cometa-0 e ≅8, 20 e 26% de cometas grau 4,respectivamente nos oócitos dos grupos de 24, 48 e 72h independente da presença ou não do vírus; indicando,possivelmente, a não interferência do vírus no DNA da célula. Estamos complementando esses estudosutilizando oócitos in natura, e até o momento pudemos verificar um número irrelevante de cometas,demonstrando que, provavelmente, isso possa estar refletindo as mutações espontâneas que ocorrem nosorganismos quando há falhas no DNA de reparo; assim, os mesmos serão utilizados como controles positivos.Com base nesses dados, podemos supor que, nem sempre alterações morfológicas em oócitos de PIV sãodecorrentes de infecção por patógenos.

* Bolsista do CNPq.

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CONGELAMENTO E ESTOQUE DE MEIOS PRONTOS PARA USO: A ROTINASIMPLIFICADA DA PIV DE EMBRÕES BOVINOS

Brandão, D.O.1; Pereira, D.C.2; Dode, M.A.N.3; Rumpf, R.3

1 Universidade de Brasília–UnB/ Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária–FAV, 70910-900,Brasília-DF, Brasil; 2 Universidade de Brasília–UnB/ Programa de Pós-graduação em Biologia

MoleculaVeterinária–FAV, 70910-900, Brasília-DF, Brasil; 3 EMBRAPA Recursos Genéticos eBiotecnologia, Parque Estação Biológica, 70770-900, Brasília-DF, Brasil. [email protected]

A rotina da produção in vitro (PIV) de embriões exige uma crescente racionalização de trabalho, tempo econstância de resultados, aliados a redução de custos para maior eficiência da técnica. Neste sentindo, umapossibilidade interessante seria o estoque das soluções prontas para uso, já incluindo hormônios e sorobovino. Entretanto, este procedimento foi até o momento desencorajado por diminuir a eficiência doscomponentes dos meios por hipoteticamente desnaturar proteínas e/ou precipitar minerais, levando a umamenor produção de embriões in vitro. Para confirmar esta hipótese, foram comparadas as taxas de blastocistoproduzidos in vitro com meios frescos (feitos na semana de uso) ou meios prontos congelados e estocados.No congelamento, os meios de maturação (MIV) e cultivo (SOF) foram aliquotados (2 ml), acondicionadosem tubos plásticos de 15 ml e estocados em freezer a –80ºC. O descongelamento foi realizado overnight emgeladeira de 4-5oC e o meio estabilizado em estufa até 4 horas antes do uso. Ovócitos de vacas mestiças deabatedouro foram então coletados e distribuídos aleatoriamente em 4 grupos: Grupo 1 (MIV fresco, SOFfresco), Grupo 2 (MIV congelado, SOF fresco), Grupo 3 (MIV fresco, SOF congelado) e Grupo 4 (MIVcongelado, SOF congelado). Os meios e procedimentos de maturação, fecundação e cultivo foram realizadasde acordo com a rotina do laboratório e as taxas de blastocisto (%) no dia 7 foram comparadas. Os dadosde 5 réplicas foram analisados pelo método por Genmod-procedure (SAS Institute Inc.). As taxas de blastocistoforam similares no Grupo 1 (50± 5; 87/169), Grupo 2 (50±12; 83/167), Grupo 3 (48±9; 83/168) e Grupo4 (46±10; 77/168). Não foram observados nos meios congelados qualquer sinal de alteração de cor, pH ouprecipitação, bem como o aspecto morfológico dos embriões não diferiu entre os grupos. Os resultadosencontrados mostram que o congelamento dos meios, quando processados segundo o protocolo previamentedescrito, não prejudicam a qualidade e as taxas de blastocisto. Em conclusão, o uso de meios congeladosdeve ser considerado como uma nova alternativa para racionalização e uniformidade do trabalho, contribuindopara a redução de custos e maior eficiência na produção in vitro de embriões bovinos.

Apoio financeiro: Embrapa/ CNPq

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OBTENÇÃO DE CÉLULAS DA GRANULOSA BOVINAS POR ASPIRAÇÃOGUIADA POR ULTRA-SOM: RESULTADOS PARCIAIS

Vireque, A.A.1; Viana, J.H.M.2; Rosa e Silva , A.A.M.1; Sá W.F.2;Ferreira , A.M.2; Camargo, L.S.A.2

1Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, USP, São Paulo, SP2 Embrapa Gado de Leite, Juiz de Fora, MG

A recuperação, in vivo, de células da granulosa (CG) permite o cultivo de células somáticas ovarianas dediferentes fases do ciclo estral e de folículos em diferentes estádios de desenvolvimento, como o folículodominante. O estabelecimento de parâmetros mais precisos quanto a bioatividade in vitro destas células,cultivadas em meio quimicamente definido, é de grande relevância no estudo da fisiologia ovariana e nautilização em protocolos de produção in vitro de embriões (PIV). Foram utilizadas vacas holandesas (n=6),sincronizadas pela associação de prostaglandina e progesterona (CIDR) e pré-estimuladas com 300 UI deFSH (Foltropin, Vetepharm). A punção foi realizada por via transvaginal, utilizando-se um aparelho portátilde ultra-som (Scanner 100s, Pie-Medical) equipado com um transdutor setorial de 5,0/7,5 MHz. Folículosovarianos de 5 a 8 mm foram puncionados e o fluido folicular (FF) recuperado em tubos de 15 mL contendomeio α-MEM acrescido de antibióticos e hormônios, mantido a 37ºC. A suspensão celular obtida foicentrifugada a 500G durante 10 minutos e as células contadas por meio do método de exclusão do TrypanBlue para determinação do número de células viáveis a serem cultivadas. Em seguida, as CG foram semeadasem placas de 4 fossas na densidade de 5 x 105 células viáveis/fossa/ml de meio completo, contendo bicarbonatode sódio, hepes PVA a 1%, selenito de sódio, transferrina, Androstenediona, aminoácidos não-essenciais,IGF-I recombinante humano, insulina e antibióticos e cultivadas em atmosfera de 5% de CO2 a 38,5ºC. Asamostras de FF e dos meios de cultura retirados nos tempos 0h, 48h e 96h foram estocados a –20ºC paraas dosagens de esteróides. Foram aspirados 90 folículos em três coletas. A concentração média de célulasda granulosa viáveis, por folículo aspirado, foi de 8,4 x 104. O perfil esteroidogênico das CG após o cultivoserá determinado após dosagem de esteróides no FF e meios de cultura nos tempos preconizados noprocedimento experimental.Suporte Financeiro: FAPESP e Embrapa Gado de Leite

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UTILIZAÇÃO DE DOIS MEIOS DE MATURAÇÃO in vitro (MIV) EMOÓCITOS DE OVINOS IMPÚBERES E PÚBERES

Capezzuto, A.1 ; Meirelles, F.V.; Merighe, G.K.F., Traldi, A.S.1

1 Departamento de Reprodução Animal – FMVZ/USP, Pirassununga – SP, 13630-000, Brasil.2Departamento de Ciências Básicas– FZEA/USP – Pirassununga – SP, 13630-000, Brasil.

[email protected]

Condições de maturação, fertilização e cultivo in vitro têm sido estudadas em pequenos ruminantes, estimulandoa busca de novos protocolos que otimizem a técnica em caprinos e ovinos. A maturação dos oócitos representaa primeira etapa desse processo. Os objetivos do presente trabalho foram avaliar a competência aodesenvolvimento (taxa de maturação nuclear) de oócitos de ovinos de abatedouro, de acordo com o meio dematuração, a categoria animal, e a classificação dos oócitos. Os resultados foram analisados pelo teste qui-quadrado (χ2) segundo programa JMP, versão 2.0.4 SAS Institute (Carry, NC, EUA). Foram utilizados 107oócitos obtidos por aspiração folicular que após três lavagens foram selecionados e classificados em G1(cúmulus compacto), G2 (mais de 3 camadas de cúmulus) e G3 (2 a 3 camadas), e levados à maturação emmeios denominados “ovino” (M199 + 10% de Líquido Folicular (caprino ou ovino) + 100ng de FSH/ mL -Sigma) ou “bovino” (M199 + 0,5µg de FSH/mL + 50µg de LH/mL + 1µg estradiol/mL - Sigma + 10% SFB–Gibco), em microgotas de 90µL sob óleo mineral, à uma atmosfera úmida com 5% de CO2 em ar etemperatura de 38,5°C por 24 horas. Após avaliação da expansão do cúmulos e eliminação do mesmo, osoócitos foram fixados com paraformoldeído/triton10% e corados com Hoechst 33342, verificando-se aprogressão meiótica em microscopia epifluorescente. Os resultados não demonstraram diferença estatísticana taxa de maturação entre os meios testados (49,18% x 58,70%, “bovino” e “ovino”, respectivamente),quanto a origem do líquido folicular (44,44% e 88,46% para o líquido folicular, caprino e ovino,respectivamente), ou quanto ao número de camadas de cúmulus. A taxa de maturação dos oócitos de fêmeasimpúberes foi significativamente superior em relação a de fêmeas púberes (77,78% x 48,31%, respectivamente;p<0,05). Concluiu-se que os meios “ovino” e “bovino” podem ser utilizados na rotina de MIV de oócitos deovinos impúberes e púberes e que a presença de células do cúmulus, mesmo que em baixo número, permitesua maturação nuclear in vitro.

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USO DA ÁGUA DE COCO VAPORIZADA NA CAPACITAÇÃO ESPERMÁTICAIN VITRO EM SUÍNOS

Nascimento, A.B.1; Visintin, J.A.2; Oliveira, V.P.2; Marques, M.G.2;Gerger, R.P.C.2; Toniolli, R.1; Seneda, M.M.3

1Lab. de Reprodução Suína e Tecnologia de Sêmen – UECE, Fortaleza, Ceará, Brasil, e-mail:[email protected] 2Departamento de Reprodução Animal – FMVZ-USP, São Paulo, Brasil

3Departamento de Clínicas Veterinárias – UEL, Londrina, Paraná, Brasil

Vários trabalhos já demonstraram o sucesso da água de coco em biotecnologias da reprodução animal,como diluidor do sêmen de animais domésticos e meio de maturação e cultivo in vitro de oócitos e deembriões bovinos. Este estudo objetivou avaliar uma solução à base de água de coco vaporizada (ACP105)sobre a capacitação espermática in vitro em suínos. Foram colhidos 18 ejaculados de três varrões mestiçosdas raças Landrace e Duroc. As amostras de sêmen foram diluídas em ACP105 e em Beltsville ThawingSolution (BTS). O sêmen foi centrifugado à 400 g por 8 minutos e as amostras padronizadas para 2x107

espermatozóides/mL, sendo submetidas a capacitação espermática em meio TALP sem (controle) e com5mM de cafeína (CAF) e incubadas em estufa a 38,5ºC, 5% de CO2 e alta umidade por três horas. Foramavaliados quatro tratamentos: T1 (ACP105), T2 (ACP105+CAF), T3 (BTS) e T4 (BTS+CAF). Paraavaliação da capacitação espermática foram utilizados esfregaços com 5µl de sêmen corados com CoomansieBlue G, observando que os espermatozóides capacitados apresentaram coloração azul tênue e os nãocapacitados azul intenso. Não houve diferença (p>0,05) nos índices de capacitação espermática entre ostratamentos T1 e T3 (4,6% e 4,8%, respectivamente) e entre T2 e T4 (22,3% e 23,4%, respectivamente).Quanto à presença ou ausência de cafeína, houve diferença significante entre os tratamentos T1 e T2 (ACP105)e entre os tratamentos T3 e T4 (BTS) (p<0,05). Assim, concluiu-se que a solução ACP105 é uma boaopção para diluição do sêmen de suínos para capacitação espermática in vitro, sendo otimizada com oacréscimo de cafeína.

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AVALIAÇÃO DA CAPACITAÇÃO ESPERMÁTICA INDUZIDA PELAHEPARINA EM CÃES

Lucio, C.F.1; Vannucchi, C.I.1; Oliveira, V.P.1; Gonçalves, J.S.A.1; Visintin, J.A.1;Nichi, M.1; Assumpção. M.E.O. A.1

1Departamento de Reprodução Animal FMVZ – USP, São Paulo – Brasil - Visintin, J. A.,São Paulo-SP, Brasil. [email protected]

As biotécnicas em bovinos têm proporcionado grandes avanços na esfera reprodutiva, o que não ocorre emcães, portanto o desenvolvimento destas biotecnologias são importantes para a espécie canina. O objetivodeste estudo foi investigar a capacitação espermática em cães, empregando a heparina como agente capacitor.Foram utilizados dez animais com idade entre 11 meses e 6 anos, realizando duas colheitas de cada animal.Após cada colheita foi avaliada a viabilidade dos espermatozóides através de parâmetros microscópicos.Foram utilizadas 4 concentrações de heparina em meio TALP-STOCK (0µg/ml, 5µg/ml, 10µg/ml ou 20µg/ml) e dois tempos de incubação (4 ou 7 horas) dos espermatozóides em estufa a 39oC, 5%CO2 em ar e altaumidade. A avaliação da capacitação espermática foi realizada pela coloração Spermac® e pelas sondasfluorescentes iodeto de propídio e diacetato de carboxifluoresceína (IP/CFDA). A análise estatística foirealizada pelo teste t-Student. O índice de capacitação espermática detectado pelo IP/CFDA foi de 54,65,55,75, 56,10 e 48,95 para 4 horas de incubação e 64,90, 62,20, 67,70 e 64,30 para 7 horas, respectivamentepara 0, 5, 10 e 20 µg/ml de heparina. Já o Spermac® detectou 63,26, 61,97, 58,28 e 60,94 para 4 horas deincubação e 75,56, 70,91, 75,81 e 74,53 para 7 horas, respectivamente para 0, 5, 10 e 20 µg/ml deheparina. Tanto na coloração com IP/CFDA quanto no Spermac®, as diferentes concentrações de heparinanão apresentaram diferença significante, mas os melhores resultados de capacitação espermática foramobservados no tempo de incubação de 7 horas. Os resultados apontam uma tendência de aumento dacapacitação, quando os espermatozóides são submetidos a elevado tempo de incubação, não sendo possívelinferir o aumento da capacitação com a adição de heparina no meio. Adicionalmente aos resultados destetrabalho, serão necessários mais estudos para melhor entender os eventos reprodutivos em cães.

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PRÉ-TRATAMENTO DE ESPERMATOZÓIDES BOVINOS COM DITIOTREITOL(DTT) E HEPARINA PARA A INJEÇÃO INTRACITOPLASMÁTICA DO

ESPÉRMATOZÓIDE (ICSI)

Cortez, C.1, Fontes, R.S. 1, Matos, L.F. 1

1Lab. de Melhoramento Genético Animal – Setor de Reprodução Animal – CCTA / UENF, Campos dosGoytacazes / RJ, Brasil - [email protected]

As taxas de formação de pronúcleo e de clivagem após a Injeção Intracitoplasmática de Espermatozóide(ICSI) em oócitos bovinos são freqüentemente baixas. O ditiotreitol (DTT) e a heparina têm sido empregadaspara o tratamento dos espermatozóides antes da ICSI, por sua capacidade de induzir a descondensação dosespermatozóides in vitro. O presente trabalho teve por objetivo avaliar os efeitos de diferentes tratamentosquímicos, empregando-se DTT e heparina, na permeabilidade da membrana e alterações morfológicas deespermatozóides bovinos. Sêmen de um touro da raça Guzerá foi coletado a cada repetição e osespermatozóides viáveis separados por meio da técnica de “swim-up”. Em um primeiro experimento, osespermatozóides foram submetidos a quatro grupos de tratamento químico: controle (sem tratamento);incubação com heparina (100µg/ mL por 15min); incubação com DTT (5mM por 1h); e incubação comheparina (100µg/ mL por 15min) seguindo-se a incubação com DTT (5mM por 1h). Para a avaliação daviabilidade espermática utilizou-se a técnica de coloração de azul de tripan (integridade da membrana). Emum segundo experimento, os espermatozóides foram incubados por 1 hora em meio Sp-TALP com asseguintes concentrações de DTT: 0mM, 5mM, 10mM e 50mM. Após a incubação, o DTT foi removido porcentrifugação em meio sem DTT, e as amostras avaliadas em diferentes períodos: imediatamente, 1, 3 ou 5horas após a centrifugação. Os espermatozóides foram classificados de acordo com as alterações morfológicasencontradas, como normais (sem alteração visível), com alteração na cabeça (dobra ou aumento de volume),com alteração na cauda (dobra, quebra, ou aumento de volume da peça intermediária) ou alterações nacauda e na cabeça. O número de espermatozóides com membrana lesionada foi maior para os grupos deespermatozóides tratados quimicamente (49,3%; 45,1% e 53,0%, para heparina, DTT e DTT + heparina,respectivamente) que no grupo controle (29,5%, ANOVA, P<0,05). Não foram encontradas diferenças nonúmero de espermatozóides com alterações entre os períodos após a incubação com DTT (ANOVA, P>0,05).Contudo, a porcentagem de espermatozóides com alterações morfológicas foi significativamente maior paraas concentrações de 50mM (71,0%), em relação a 5mM e 10mM (29,5% e 42,2%). A porcentagem deespermatozóides com alterações do grupo controle 0mM (3%) foi menor que a dos grupos tratados (ANOVA,P<0,05). Concluímos que os tratamentos dos espermatozóides com heparina e/ ou DTT resultaram em umaelevada porcentagem de espermatozóides com alteração da membrana, o que poderia permitir o acesso desubstâncias do oócito responsáveis por promover a descondensação do espermatozóide microinjetado. Asalterações morfológicas de cauda e cabeça ocorreram de forma dose-dependente, com um maior número deespermatozóides com alterações quando se utilizou a concentração mais alta de DTT. Mais estudos sãonecessários sobre os efeitos desses pré-tratamentos espermáticos no desenvolvimento embrionário e naviabilidade após a ICSI.Financiamento: FENORTE, FINEP CAPES.

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TAXAS DE FORMAÇÃO DE PRONÚCLEOS E DESENVOLVIMENTO NÃO-PARTENOGENÉTICO DE EMBRIÕES BOVINOS PRODUZIDOS POR ICSI

Matos, L.F.1,2; Fontes, R.S.1; Quirino, C.R.1; Buitkamp, J.2; Weppert, M.3;Reichenbach, H.-D.2

1Lab. de Melhoramento Gen. Animal, CCTA-UENF, Campos / RJ, Brasil; 2Bav. State Res. Center forAgri., Inst. Anim. Breed. Poing/ Grub, Alemanha; 3Bav. Res. Center for Biol. of Reprod. (BFZF),

Oberschleissheim, Alemanha [email protected]

O presente trabalho teve por objetivo avaliar as taxas de formação de pronúcleos e de desenvolvimentonão-partenogenético de embriões bovinos, após a Injeção Intracitoplasmática de Espermatozóide (ICSI).Complexos cumulus-oócito (COCs) obtidos de ovários de matadouro foram maturados in vitro (18-20h),desnudados, e apenas os oócitos apresentando o primeiro corpúsculo polar (metáfase II) foram selecionadose centrifugados a 7000g/ 5 min. Os oócitos foram microinjetados com espermatozóides sem pré-tratamentoou pré-tratados com ditiotreitol-DTT (5mM/ 30 min), em combinação ou não com ativação química (5µMionomicina/ 5 min + 1.9mM 6-dimetilaminopurina/ 3 h). Utilizou-se para a microinjeção uma pipeta de vidro(diâmetro interno aproximado de 7 µm), acoplada a um piezo-micromanipulador (PiezoDrill®, Burleigh).Oócitos submetidos apenas ao protocolo de ativação ou fertilizados in vitro serviram como grupos controle.Para avaliar a taxa de formação de pronúcleos, uma parte dos supostos zigotos foi mantida em meio defertilização (Fert-TALP), por 18-22h após ICSI, FIV ou ativação, e fixados em ácido acético/ etanol. Outraparte dos oócitos foi cultivada por 9 dias em meio SOF para obtenção de blastocistos. Para a avaliação dataxa de desenvolvimento partenogenético após a ICSI, seqüências de microssatélites do DNA dos embriõese do sêmen utilizado para a FIV e para a ICSI foram amplificadas com os primers BM1824, BMS2113,ETH225 e TGLA227. As amostras foram processadas por um analisador genético (ABI Prisma 310 GeneticAnalyser, UK) e utilizando o programa GeneScanTT-35. Não houve diferenças significativas das taxas deformação de 2 pronúcleos (2PN), entre os grupos de oócitos microinjetados com espermatozóides não-tratados, espermatozóides tratados com DTT e espermatozóides tratados com DTT + ativação (64% vs49% vs 62%, respectivamente) (ANOVA, P>0,05). Contudo estas taxas foram superiores àquela obtidapara oócitos apenas ativados (20%, ANOVA, P<0,05). A taxa de formação de três pronúcleos foisignificativamente maior no grupo de oócitos microinjetados com espermatozóides tratados com DTT eativados (25%, ANOVA, P<0,05) em relação aos demais grupos. Os embriões produzidos por FIV foramclassificados como fertilizados (18/18, 100%), por apresentarem pelo menos um dos dois alelos igual ao dotouro e não serem homozigotos para os 4 primers. Os embriões de partenogênese foram classificados comonão-fertilizados, por apresentaram-se homozigotos para os quatro primers, podendo ou não os alelos seremidênticos ao do touro (17/ 17, 100%). A análise de microsatélites dos embriões obtidos por ICSI (n=19),revelou que a maior parte dos embriões de ICSI (16/19, 84%) havia sido corretamente fertilizados, sendoos demais classificados como não determinado ou partenogenético (3/19, 16%). Estes resultados mostramque o oócito bovino pode ser eficientemente fertilizado por meio da ICSI com um Piezo-manipulador.Financiamento: FENORTE, DAAD, FINEP e CAPES.

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EFEITO DE DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DO ÁCIDO 3-INDOL-ACÉTICONO CULTIVO DE FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS OVINOS

Andrade, E.R.1; Seneda, M.M.2; Alfieri, A.A.2; Oliveira, J.A.3; Boselli, C.C.2;Rubin, K.C.P.2; Figueiredo, J.R.1; Toniolli, R.1

1 Faculdade de Medicina Veterinária, PPGCV, Universidade Estadual do Ceará, Fortaleza-CE, CEP60740-000, Brasil. 2 Universidade Estadual de Londrina, Londrina-PR, CEP 86051-990, Brasil. 3

Universidade Estadual Paulista, FCAV, Jaboticabal-SP, CEP 14884-900, [email protected]

O objetivo deste trabalho foi avaliar a ativação e crescimento de folículos pré-antrais ovinos após o cultivo invitro do córtex ovariano em várias concentrações de ácido 3-indol acético (IAA). O córtex ovariano foidividido em fragmentos de aproximadamente 3x3mm (1 mm espessura). Um fragmento foi imediatamentefixado em Bouin (controle – dia 0) e os demais foram cultivados por dois ou seis dias em Meio EssencialMínimo (MEM) suplementado com ITS (insulina-transferrina-selênio), piruvato, glutamina, hipoxantina,albumina sérica bovina e antibióticos (MEM+) ou em MEM+ acrescido de 10, 40, 100, 500 ou 1000 ng/mlde IAA. Após dois ou seis dias de cultivo em cada tratamento, os fragmentos ovarianos foram fixados emBouin, desidratados em etanol, diafanizados em xilol e incluídos em parafina. Para cada fragmento de córtex,secções teciduais de 5µm foram montadas em lâminas e coradas pelo método hematoxilina-eosina. Osfolículos foram classificados de acordo com o estágio de desenvolvimento como primordiais ou em crescimento(primários e secundários). O teste de Tukey (P<0,05) foi usado para comparar a taxa de viabilidade foliculare a porcentagem de folículos primordiais ou em crescimento entre o controle e após cultivo por dois ou seisdias nos diferentes tratamentos. Os resultados mostraram que após seis dias de cultivo in vitro, a porcentagemde folículos primordiais e em desenvolvimento permaneceu inalterada em relação ao controle, exceto notratamento MEM+ suplementado com 40 ng/ml de IAA, em que foi observada uma redução de folículosprimordiais e aumento de folículos em desenvolvimento (P<0,05). Também foi constatado que o cultivoovariano por seis dias, em todos meios testados, reduziu a porcentagem de folículos pré-antrais normaisquando comparados ao controle. Ao contrário, após dois dias de cultivo in vitro, esta redução somente foiobservada nos tratamentos suplementados com 500 ou 1000 ng/ml de IAA. Com base nestes resultadosconcluímos que folículos pré-antrais ovinos podem ser ativados in vitro com sucesso após o cultivo emMEM+ suplementado com 40 ng/ml de IAA e que altas concentrações de IAA podem ser prejudiciais aestes folículos.

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EFEITO DA SOLUÇÃO SALINA 0,9% E TCM 199 EM DIFERENTESTEMPERATURAS E TEMPOS DE INCUBAÇÃO SOBRE A MORFOLOGIA

DE FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS BOVINOS

Celestino, J.J.H.¹; Santos, R.R.¹; Matos, M.H.T.¹; Costa, S.H.F.¹; Silva, J.R.V.¹;Martins, F.S.¹; Silva, G.A.¹; Figueiredo, J.R.

¹ Laboratório de Manipulação de Óocitos Inclusos em Folículos Ovarianos Pré-Antrais, UECE,Fortaleza-CE, Brasil

O objetivo do presente trabalho foi investigar a eficiência da solução salina 0,9% e TCM 199 na conservaçãode folículos pré-antrais bovinos in situ em diferentes temperaturas (4, 20 ou 39ºC) e tempos de incubação(2, 4, 12 ou 24h). No abatedouro, o par ovariano de cada animal foi dividido em 25 fragmentos. Umfragmento foi escolhido aleatoriamente e imediatamente fixado em Carnoy para avaliação morfológica (controle– tempo zero – tratamento 1). Os outros 24 fragmentos foram aleatoriamente distribuídos em tubos contendosolução salina 0,9% ou TCM 199 a 4, 20 ou 39 ºC, por 2, 4, 12 ou 24h (tratamentos 2-25). Os efeitos dassoluções, temperaturas e tempos de incubação sobre a porcentagem de folículos normais e degeneradosforam analisados pelo teste Qui-quadrado. Os valores foram considerados estatisticamente significativosquando P < 0,05. A análise histológica mostrou que a conservação de fragmentos ovarianos em soluçãosalina 0,9% a 20 ºC por 12 ou 24h, TCM 199 a 20 ºC por 24h e em ambas as soluções a 39 ºC já a partirde 2h de conservação aumentou significativamente (P < 0,05) a porcentagem de folículos pré-antraisdegenerados quando comparados ao controle. Ao contrário, a conservação a 4 ºC em ambas as soluçõesmanteve a porcentagem de folículos pré-antrais morfologicamente normais similar ao controle (69,36 %). Emambas as soluções, independente do tempo de incubação, a porcentagem de folículos morfologicamentenormais observada a 39 ºC foi significativamente inferior àquela a 4 e 20 ºC. Ao comparar a Solução Salinacom TCM 199, foi observada uma porcentagem superior (P < 0,05) de folículos normais em TCM 199conservados a 20 ºC por 12 e 24h e a 39 ºC por 12h. Em conclusão, este estudo mostra que folículos pré-antrais bovinos podem ser conservados eficientemente a 4 ºC por até 24h em ambas as soluções e a 20 ºCpor 4 e 12h em solução salina 0,9% e TCM 199, respectivamente. Além disso, folículos pré-antrais bovinossão bastante sensíveis à temperatura de 39 ºC mesmo por um período de conservação de 2h.

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DESENVOLVIMENTO DE FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS CAPRINOS EMSOLUÇÃO À BASE DE ÁGUA DE COCO

Martins, F.S.1; Santos, R.R.1; Celestino, J.J.H.1; Matos, M.H.T.1; Silva, G.A.1;Ferreira, F.V.A.2; Figueiredo, J. R.1

1LAMOFOPA – UECE e 2 Departamento de Patologia – UFC, Fortaleza-CE [email protected]

O desenvolvimento de sistemas de cultivo para ativar folículos primordiais (FP) é importante para estudar osfatores ligados ao inicio da foliculogênese. Avaliou-se o Meio Essencial Mínimo (MEM), Solução à Base deÁgua de Coco (SBAC) e MEM adicionado de SBAC sobre a morfologia e crescimento de FP caprinosapós o cultivo de córtex ovariano. Fragmentos de córtex foram cultivados por 1 e 5 dias em MEM, SBACou MEM adicionado de 5, 10, 20, 50, 80, 90 ou 95% de SBAC na presença de BSA, ITS, antibióticos,antifúngico, glutamina, piruvato e hipoxantina. No dia 0 e após 1 e 5 dias de cultivo, os fragmentos foramdestinados a histologia clássica. Os folículos foram classificados em FP ou FD (desenvolvimento), bem comoem normais ou atrésicos de acordo com a sua morfologia. O percentual de folículos normais e diâmetrofolicular foram comparados entre os tratamentos. A atividade mitótica das células da granulosa (CG) foiavaliada por imunolocalização do antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA). Teste do Qui–quadrado,ANOVA e Kruskal-Wallis foram utilizados com P<0,05. Concomitante com o aumento dos FD, o percentualde FP foi reduzido (P<0,05) após 5 dias de cultivo em todos os meios. A redução de FP ocorreu com oaumento do período de cultivo de 1 para 5 dias. Após 5 dias, as maiores taxas de ativação foram observadasapós cultivo em MEM e MEM adicionado de 5 e 10% de SBAC. Contudo, a adição de SBAC reduziuprogressivamente o percentual de folículos normais. Independentemente do meio, houve aumento (P<0,05)do diâmetro folicular no dia 5 em relação aos dias 0 e 1. Análise imunohistoquímica mostrou que o PCNAestá geralmente ausente em FP de córtex não-cultivado, mas foi observado após 5 dias de cultivo no oócitoe nas CG da maioria dos FD. Em conclusão, FP caprinos podem ser ativados e crescidos in vitro em MEM,SBAC ou MEM adicionado de SBAC. A substituição do MEM por até 10% de SBAC mantém as taxas deativação e viabilidade similar ao MEM. Além disso, proporções mais elevadas de SBAC aumentam a atresiafolicular.

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ANÁLISE CITOGENÉTICA DE EMBRIÕES BOVINOS E MURINOS

Marques, D.M.1; Carelli, J.B.2; Goldschmidt, B.3

1Mestranda em Reprodução Animal, UFF, [email protected]. 2Aluna de Graduação, UFF. 3ProfessoraLaboratório de Citogenética Animal. Faculdade de Veterinária-UFF.

Os avanços das técnicas citogenéticas permitiram a detecção de anomalias cromossômicas em embriões(OCAÑA-QUERO, et al. The Veterinary Journal, 58: 228-233). Anormalidades cromossômicas são ascausas mais comuns de mortalidade embrionária e fetal em mamíferos, tratando-se de uma das maiorescausas de perdas econômicas na produção animal (LONG, S. E. Journal of Reproduction and Fertility,58: 197-201; REICHENBACH, O embrião, p.3-6 Out/Nov/Dez). A maioria dos relatos de anomaliascrossômicas em embriões de animais domésticos descreve aberrações numéricas que compreendemaneuploidia, haploidia, poliploidia e mixoploidia (LONG, S. E. Journal of Reproduction and Fertility, 66:645-648; KAWARSKY S. J. et al. Biology of Reproduction, 54, 53-59). Entretanto, dificuldades na obtençãode cromossomos de embriões no estágio de pré-implantação ocorrem devido ao número limitado de célulasque podem ser avaliadas (McCAULEY, T. C. et el. Theriogenology, 60: 1569-1580; KING. W. A. VeterinaryScience Communications, 3, 51-56), e a necessidade da sincronização dos blastômeros em metáfase(BOOTH, P. J. et al. Biology of Reproduction, 68: 922-928). A partir da padronização das técnicas deobtenção e identificação de cromossomos, será possível revelar a existência de mais rearranjos cromossômicos(LONG, S. E. Journal of Reproduction and Fertility, 58: 197-201). Neste trabalho, foram estudados 35embriões viáveis de camundongos e 22 embriões bovinos degenerados, submetidos a três protocolos diferentes.Em 30 embriões murinos e 17 embriões bovinos foi realizado o método para obtenção de cromossomosdescrito por BENEVIDES-FILHO I. M. (Rev. Brasil. Genet. 11(3): 661-670) e TARKOWSKY, A. K.(Cytogenetics, 5: 394-400; KING. W. A. Veterinary Science Communications, 3, 51-56) commodificações. Utilizou-se incubação em estufa a 37ºC por 1-2 horas em meio RPMI 1640, suplementadocom 15% de soro fetal bovino e 200 µg/mL de colchicina. Após a incubação, os embriões foram transferidospara uma solução hipotônica de citrato de sódio 1%, onde permaneceram por 30-40 minutos. Foram fixadosem lâmina com solução de metanol e ácido acético glacial 3:1. A técnica direta, sem cultivo foi aplicada em 5embriões murinos, utilizando-se somente hipotonização por 8 a 10 minutos e fixação. Em 5 embriões bovinos,foi utilizada incubação em meio Emcare® (Auckland - New Zeland) acrescido de 200 µg/mL de colchicina emantido junto ao corpo por 1:30 horas, seguida de hipotonização em citrato de sódio 1% por 40 minutos efixação em lâmina. Dos 17 embriões bovinos e 30 murinos que foram submetidos ao processamento comcultivo em estufa, obteve-se somente uma metáfase de embrião bovino. Dos 5 embriões murinos que foramprocessados sem cultivo foram obtidas 3 metáfases de 2 embriões. Dos 5 embriões bovinos incubados juntoao corpo foi obtida uma metáfase. Os resultados sugerem que o grau de degeneração dos embriões bovinosestá diretamente relacionado à não obtenção de metáfases e que a técnica que não utiliza incubação, além detornar o procedimento mais prático, forneceu melhores resultados.

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FSH AUMENTA A EXPRESÃO GÊNICA DO RECEPTOR DE FATOR DECRESCIMENTO FIBROBLÁSTICO 3c (FGFR-3c) EM CÉLULAS

DA GRANULOSA BOVINAS CULTIVADAS

Buratini Jr., J.1; Cao, M.2; Castilho, A.C.S.1; Andrade, P.B.1; Price, C.A.2

1Departmento de Fisiologia, IB, UNESP, Botucatu, Brasil; 2Centre de Recherche en ReproductionAnimale, Faculty of Veterinary Medicine, University of Montreal, St. Hyacinthe, Canada.

[email protected]

O receptor para fator de crescimento fibroblástico 3c (FGFR-3c) é ativado por vários FGFs, incluindo oFGF-2 (bFGF) e FGF-8. A expressão gênica do FGF-8 foi relatada em oócitos de folículos em crescimentode camundongos e em células da teca (CT) e células da granulosa (CG) de folículos antrais bovinos pelonosso laboratório. O FGF-2 é majoritariamente expresso em CT de folículos estrogênicos na vaca. Nósrecentemente demonstramos a expressão do FGFR-3c em CT e CG bovinas, sendo que os níveis de RNAmem CG aumentam com o tamanho do folículo e conteúdo de estradiol. Tendo em vista as mudanças naexpressão gênica do FGFR-3c durante o desenvolvimento folicular, é de interesse identificar os fatoresreguladores. Portanto, este estudo testou a hipótese de que o FSH aumenta a expressão gênica do FGFR-3cem CG bovinas. Folículos pequenos (2-5 mm de diâmetro) foram isolados de ovários obtidos em matadouroe as CG foram colocadas em meio sem soro suplementado com insulina e 0; 0,1; 1; 10 ou 100ng/ml de FSHbovino. As células foram cultivadas por 6 dias, com troca de meio a cada 2 dias. No dia 6, as células foramrecuperadas em Trizol para extração de RNA total. A expressão do FGFR-3c foi examinada por RT-PCRsemiquantitativo com oligonucleotídeos iniciadores espécie-específicos. O RT-PCR semiquantitativo foivalidado pela escolha de números de ciclos de PCR e quantidade de RNA dentro da fase linear da curva deamplificação. A intensidade das bandas foi analisada por densitometria computadorizada. Os experimentosforam realizados em três “pools” independentes de células. A amplificação do RNAm da histona 2a (H2a) foiusado como controle interno no PCR e as médias comparadas pelo teste de Tukey-Kramer HSD. A expressãodo FGFR-3c (RNAm FGFR-3c/RNAm H2a; unidades arbitrárias) foi maior em células tratadas com 1; 10ou 100ng/ml de FSH (9,1±2,9; 9,4±3,4 e 12,9±3,5; respectivamente) do que em células tratadas com 0 ou0,1ng/ml de FSH (1,1±0.1 e 0,6±0,1; respectivamente). Em conclusão, os dados presentes indicam que oFSH aumenta a expressão do FGFR-3c em folículos antrais bovinos. Nós propomos que este receptorregulado pelo FSH pode desempenhar um papel importante durante a diferenciação e proliferação das CGem folículos antrais bovinos.Financiado pela FAPESP, Brasil e NSERC, Canadá.

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EXPRESSÃO GÊNICA DO FATOR DE CRESCIMENTO FIBROBLÁSTICO10 (FGF-10) EM FOLÍCULOS ANTRAIS BOVINOS

Pinto, M.G.L.1; Price, C.A.2; Giometti, I.C.1; Costa, I.B.3; Teixeira, A.B.1;Barros, C.M.3; Buratini Jr., J.4

1Departamento de Reprodução Animal, FMVZ, UNESP, Botucatu, Brasil; 2Centre de Recherche enReproduction Animale, Faculty of Veterinary Medicine, University of Montreal, St. Hyacinthe, Canada;

Departamentos de 3Farmacologia e 4Fisiologia, IB, UNESP, Botucatu, Brasil. [email protected]

Os fatores de crescimento fibroblásticos (FGF)-7 e 10, também conhecidos como fatores de crescimentodos queratinócitos 1 e 2, são reconhecidos como mediadores parácrinos de interações entre célulasmesenquimais e epiteliais que regulam proliferação e diferenciação celular. Há evidências de que o FGF-7 eFGF-10 regulam a morfogênese glandular endometrial na ovelha. Ambos os ligantes ativam uma única isoformade receptor para FGF, o FGFR-2b. No ovário, o FGFR-2b é predominantemente expresso em células dagranulosa (CG) e o FGF-7 em células da teca (CT), embora o oócito não tenha sido investigado. Nada sesabe sobre o padrão de expressão do FGF-10 no folículo. Para melhor caracterizar o padrão de expressãogênica do FGF-7 no folículo e determinar se o FGF-10 pode desempenhar papel na regulação dodesenvolvimento folicular bovino, foi investigado se o FGF-7 e 10 são expressos pelo oócito e mensurada aexpressão gênica do FGF-10 por RT-PCR semiquantitativo em CG e CT de folículos antrais em distintosestágios de desenvolvimento. Ovários bovinos foram obtidos em matadouro. Complexos cumulus-oócitoforam recuperados por aspiração folicular, as células do cumulus removidas e o RNA total extraído degrupos de 50 oócitos. Para a análise de CG e CT, folículos com diâmetro maior que 5mm foram dissecados,os tipos celulares separados e o RNA total extraído. As concentrações de esteróides no fluido folicular foramdeterminadas por RIE. Folículos com progesterona acima de 100ng/ml foram considerados atrésicos eexcluídos da análise. Os folículos restantes foram agrupados de acordo com a concentração de estradiol (E2)como se segue: (1) <5; (2) ≥5 and <20; (3) ≥20 and <100; and (4) ≥100ng/ml.. A expressão do FGF-10,mas não do FGF-7, foi detectada em oócitos bovinos. A expressão do FGF-7 e do FGF-10 foi detectadaem CT, porém não em CG. A expressão do FGF-10 diminuiu com o aumento da concentração de E2, tendosido maior no grupo 1 (172±19 unidades; P<0,05) comparado aos grupos 2 (105±21) e 3 (106±14), osquais, por sua vez, apresentaram valores maiores que o do grupo 4 (54±12; P<0,05). Em conclusão, osdados presentes sugerem um papel para o FGF-10 como mediador na sinalização parácrina do oócito ouCT para CG. Além disso, a diminuição no sinal do FGF-10 com o conteúdo de E2 indica que a transcriçãodo FGF-10 é regulada ao longo do desenvolvimento folicular bovino. Financiado pela FAPESP, Brasil eNSERC, Canadá.

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DETECÇÃO DA EXPRESSÃO DE RNA MENSAGEIRO (mRNA) IMPRINTED EMCÉLULAS DO CUMULUS, FIBROBLASTOS, PLACENTA E EMBRIÕES BOVINOS

Franco, M.M.1; Melo, E.O.1; Mundim, T.C.D.1; Pereira, D.C.1;Iguma, L.T.1; Ávila, F.F.1; Rumpf, R.1

1 Laboratório de Reprodução Animal, EMBRAPA Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília,DF, Brasil. Avenida W/5 Norte Final, PqEB, Prédio Biotecnologia, Sala 7B, 70770-900.

[email protected]

As tecnologias reprodutivas são importantes para a multiplicação de animais de alto mérito genético e paraotimizar o uso da fêmea bovina. Embora a transferência de embriões, a produção in vitro de embriões eprincipalmente a clonagem apresentarem baixa eficiência, elas são importantes para assistir o melhoramentoanimal. O imprint é uma modificação epigenética estabelecida durante a gametogênese de forma sexoespecífica, transmitida para o zigoto e mantida no embrião, mas apagada na linhagem germinativa para sernovamente reestabelecida (Pedone, P.V., FEBS Letters, 458, 45-50). A metilação no DNA está envolvidano processo de imprinting controlando a expressão de genes (Reik, W., Science, 293, 1089-1093; Li, E.,Nature Reviews, 3, 662-673) dentre eles o IGF2 e IGF2R que são importantes para o ovócito e odesenvolvimento embrionário. O cultivo in vitro pode alterar os padrões de metilação no DNA, alterando aexpressão destes genes (Khosla, S., Biology of Reproduction, 64, 918-926). Estudos de expressão degenes imprinted podem contribuir para o incremento da eficiência da TE, PIV e clonagem. O objetivo desteestudo foi detectar a expressão dos genes IGF2 e IGF2R em células do cumulus, fibroblastos, placenta eembriões. RNA total foi isolado de células do cumulus retiradas de 50 e 70 complexos cumulus-ovócitos nãomaturados e maturados in vitro, respectivamente, de 106 fibroblastos de pele cultivados in vitro, de 700 mgde placenta de um animal clone (Vitoriosa da Embrapa) e de 43 blastocistos PIV usando TRIzol Reagent(Invitrogen, USA) de acordo com recomendações do fabricante. A transcrição reversa foi feita usando o kitEZ-First Strand cDNA Synthesis Kit (Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Israel) de acordo comrecomendações do fabricante e 1-2 µg de RNA total. O gene da β-actina foi usado como controle constitutivoe as reações de PCR foram feitas em um termociclador PTC-100 MJ Research. Após um passo de 93°Cpor 4 min, a amplificação foi realizada usando 40 ciclos de 93°C por 40 seg, 56°C por 40 seg e 72°C por 1min, terminando com uma extensão final de 72°C por 5 min. As condições de reação foram: 2 U de TaqDNA polimerase, Tampão da enzima 1X, 2 mM MgCl2, 200 µM de cada dNTP, 0.5 µM de cada primer,e 10 µL of cDNA em um volume final de 20 µL. 12 µL de cada amostra foi utilizada para a eletroforese emgel de agarose 1,5%. A β-actina foi detectada em todas as amostras, IGF2 em células de cumulus maturadas,fibroblastos e placenta e IGF2R em todas as amostras exceto em células do cumulus não maturadas. Estesresultados são muito importantes pois pouco é conhecido sobre expressão de mRNA imprinted em bovinos,sendo que apenas o gene IGF2R está descrito até o momento. Além disso, estudos de detecção de expressãogênica são a base para qualquer experimento quantitativo e/ou comparativo.

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CARACTERIZAÇÃO DE FIBROBLASTOS FETAL E ADULTO DE BOVINOSNELORE PARA TRANSFERÊNCIA NUCLEAR

Caetano, H.V.A.1; Milazzotto, M.P.1, Assumpção, M.E.O.A.1, Visintin, J.A.1

1 Departamento de Reprodução Animal– FMVZ/USP São Paulo-SP, [email protected]

As biotécnicas reprodutivas mais atuais empregam a técnica de transferência nuclear na produção de animaistransgênicos, objetivando produzir proteínas de interesse humano e órgãos para xenotransplantes. Este estudotem como objetivo, padronizar linhagens primárias estáveis de fibroblastos fetal e adulto de bovinos da raçaNelore como fontes doadoras de núcleos na reconstrução de embriões. Os fibroblastos foram caracterizaçãopor aspectos morfológicos, ultra-estructurais e imunocitoquímicos. Os fibroblastos fetal foram obtidos apartir de pele de feto com 60 dias de idade e os fibroblastos adulto da pele auricular de animal adulto da raçaNelore. As culturas primárias foram mantidas em condições estéreis em meio TCM199, 10% SFB egentamicina a 39oC, 5% de CO2 e alta umidade. As culturas foram observadas em microscópio de contrastede fase diariamente, sendo identificadas as fases mitóticas e estabelecido as curvas de crescimento celular.Para confirmação da natureza das culturas, fibroblastos foram colhidos nas passagens 5, 10 e 15, detectou-se a proteína vimentina, pela técnica de imunocitoquímica indireta, utilizando-se os anticorpos primários anti-vimentina (cloneV9-1:40 –Sigma) e anti – citoqueratina (cloneV11 – 1:400 – Sigma) e como anticorposecundário igG anti – camundongo conjugado com fluoresceína (1:3000 – Sigma). As culturas primárias defibroblastos fetal e adulto na 2o passagem tiveram marcação positiva para citoqueratina em algumas célulasuma proteína de filamento intermediário típica de células epiteliais, não se repetetindo nas passagenssubsequentes. Nas passagens 5, 10 e 15, os fibroblastos fetal e adulto responderam positivamente à marcaçãoanti – vimentina e não houve marcação anti-citoqueratina (controle negativo). Ficou demonstrado que osfibroblastos continuam expressando vimentina e mantendo em cultivo as características morfológicas, apesardas várias passagens celulares. Fibroblastos adulto e fetal foram colhidos, processados e analisados emmicroscópio eletrônico de transmissão. A análise ultra - estrutural revelou a presença de organelas envolvidasna síntese de proteínas, retículo endoplasmático granular bem desenvolvido, cisternas do Golgi dilatadas epresença de poliribossomos. Também foi observada a presença de mitocôndrias alongadas dispostas aoredor desse complexo, sugerindo alta atividade metabólica. Ficou demonstrado que apesar das condiçõesimpostas pelo cultivo, os fibroblastos continuam desenvolvendo atividades biológicas e mantendo ascaracterísticas que os tornam aptos como doadores de núcleo para transferência nuclear. Essas foram utilizadascom sucesso na reconstrução de oócitos e obtenção de dois bovinos clonados.

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POTENCIAL DE DESENVOLVIMENTO DE EMBRIÕES BOVINOSSUBMETIDOS À TRANSFERÊNCIA NUCLEAR MEDIANTE

INIBIÇÃO MEIOTICA COM ROSCOVITINA

Merighe, G.K.F.1; Watanabe, Y.F.2; Leal, C.L.V.1; Meirelles, F.V.1

1Laboratório de Morfofisiologia Molecular e Desenvolvimento Departamento de Ciências Básicas -FZEA/USP, Pirassununga-SP, Brasil. 2Vitrogen - Pesquisa e Desenvolvimento em Biotecnologia da

Reprodução S/C Ltda. [email protected]

A roscovitina, um potente inibidor da atividade da quinase cdk2 componente do fator promotor da meiose(MPF), foi utilizada para facilitar a rotina de manipulação de transferência nuclear. Os oócitos foramselecionados e divididos em dois grupos: (1) grupo controle, submetidos apenas à maturação e (2) grupobloqueado, submetidos à pré-maturação com 25 µM roscovitina durante 8 horas e, em seguida, à maturação.Foi avaliado o grau de maturação nuclear de ambos os grupos, sendo que 93,3% dos oócitos do grupocontrole encontravam-se em MII após 18 horas de maturação. Uma taxa similar (80%) foi observada nogrupo bloqueado, 18 horas após liberação do bloqueio. Os oócitos enucleados e reconstruídos com célulassomáticas de animal adulto foram fundidos após 23 horas de maturação e as taxas de fusão não diferiramentre os grupos (65,3 ± 3,0% e 65,7 ± 2,9% para o grupo controle e grupo bloqueado, respectivamente).Após 24 horas de maturação, os oócitos foram ativados com ionomicina (5,0 µM) durante 5 minutos e pormais 3 horas em 6-DMAP (2,0 mM). A taxa de desenvolvimento até o estádio de blastocito foi maior parao grupo controle que para o bloqueado (21,6 ± 2,7% vs 7,1 ± 3,0%; p < 0,01). Embora não tenha sidoobservada diferença entre as taxas de fusão, é nítida a diversidade na produção de blastocistos, evidenciandouma falha no desenvolvimento dos oócitos bloqueados. A taxa de blastocistos observada nos oócitos ativados,também diferiu entre os grupos (31,6 ± 3,4% para os oócitos não bloqueados e 19,3 ± 4,5% para aquelesbloqueados; p < 0,05). Apesar da baixa taxa de desenvolvimento, os embriões produzidos por TN quealcançaram o estádio de blastocistos não apresentaram diferença na taxa de prenhez aos 30 dias (50%, n = 3e 50% n = 1 para os grupos não bloqueados e bloqueados, respectivamente). Maiores estudos estão sendorealizados para esclarecer a perda de competência dos oócitos bloqueados com roscovitina. O bloqueio éuma ferramenta importante na melhoria da eficiência da clonagem bovina.

Apoio: VITROGEN® e Pró-Reitoria de Pesquisa da USP

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ATIVAÇÃO PARTENOGENÉTICA DE OÓCITOS BOVINOS UTILIZANDOCITOCALASINA B OU D EM ASSOCIAÇÃO COM CICLOHEXIMIDE

Forell, F.; Feltrin, C.; Vieira, A.D.; Antoniolli, C.B.; Rodrigues, J.L.

Laboratório de Embriologia e Biotécnicas de Reprodução, FAVET, UFRGS - CP 15004, CEP 91501-970, Porto Alegre, RS, Brasil - [email protected]

A ativação do oócito é uma das etapas críticas para o sucesso das técnicas de clonagem. O objetivo destetrabalho foi comparar a eficiência da cictocalasina B (CB) e D (CD) em associação com cicloheximide(CHX), na indução da ativação partenogenética de oócitos, usando dois diferentes períodos de incubação.Oócitos foram coletados de ovários de abatedouro através da escarificação da córtex ovariana. Os oócitosbovinos foram maturados em TCM199 com 10% de SVE, 0,5 µg/mL de FSH e 0,03UI de hCG em atmosferaúmida contendo 5% CO2, em ar, durante 17 h. Após a remoção das células do cumulus oophorus emvortex em meio contendo 0,1% de hialuronidase, os oócitos em MII foram transferidos para gotas de meioHSOF com 0,4% de BSA sob óleo mineral, mantidos a 37ºC (mesa aquecedora) durante 7 h. Todos osoócitos foram expostos durante 5 min a 5 µM de ionomicina em HSOF sem proteína. Em seguida foramtransferidos para o meio SOFaa com 10% de SVE (SOFaaSVE) suplementado com 10 µg/mL de CHX ecitocalasina de acordo com os tratamentos: T1) 5 µg/mL CB por 3 h; T2) 5 µg/mL CB durante 5 horas; T3)2,5 µg/mL CD durante 3 h; ou T4) 2,5 µg/mL CD durante 5 h. Ao final da indução da ativação, os oócitosforam transferidos para gotas de 80µL de meio SOFaaSVE sob óleo mineral e cultivados em câmara decultivo a 39ºC em atmosfera úmida contendo 5% CO2, 5% O2 e 90% N2. Após três replicações, os dadosforam analisados pelo teste de qui-quadrado. A taxa de clivagem do T1 (37,2%-38/102) foi significativamentemais baixa (p<0,05) do que T2 (63,7%-65/102), T3 (53,1%-52/98) e T4 (56,4%-57/101), não havendodiferença significativa entre os T2, T3 e T4. Entretanto, quando analisamos a taxa de blastocistos, observamosque os T1 (13,7%-14/102) e T3 (20,4%-20/98) diferiram significativamente dos T2 (36,3%-37/102) e T4(35,6%-36/101), não havendo diferença significativa entre T1 e T3, e entre T2 e T4. As citocalasinas B e Dem associação com a CHX promovem ativação partenogenética em taxas similares. O período de incubaçãode 5 h foi mais eficiente do que o de 3 h.

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PRODUÇÃO DE EMBRIÕES PRONUCLEARES PARA MICROINJEÇÃO DE DNAEXÓGENO EM OVELHAS PELIBUEY SUPEROVULADAS COM FSH-P E GnRH.

Solano, R.F.1; De Armas, R,T.2; Castro, F.O.2; Aguilar, A.P.

1Escola de Medicina Veterinária do Maranhão (UEMA). 2Centro de Investigación de Ingeniería Genética eBiotecnología Habana, Cuba. [email protected]

O presente trabalho teve por objetivo a obtenção de embriões em estágio de pronúcleo, de ovelhas Pelibuey.Vinte e duas fêmeas foram sincronizadas durante a estação reprodutiva com esponjas vaginais de acetato deflurogestona (FGH), 40 mg divididas em dois grupos (A=10 e B=12 ovelhas respectivamente). A superovulaçãofoi obtida aplicando 18 mg de FSH (Folltropin-v) em doses decrescentes (4-4; 3-3; 2-2) Adicionalmente, ogrupo B recebeu 100 µg de GnRH, 24 horas após a retirada das esponjas.Os animais foram acasalados porcarneiros férteis. As ovelhas apresentaram estro entre 30 e 35 horas após a remoção das esponjas e cobertasentre 42 às 48 horas. O crescimento folicular e as ovulações foram monitorados por laparoscopia, monitorando-se 24 horas após a retirada das esponjas, continuando a cada 3 horas durante o estro. A colheita dasestruturas foi obtida pela técnica cirúrgica da linha média e o lavado dos oviductos foi realizado com 20 ml dePBS. (A análise de variância não revelou diferença significativa P>0,005) entre protocolos A e B (P>0,05).O número médio de folículos > 5 mm nos grupos A e B foram, 8,52 ± 0,61; 10,5 ± 0,53; de corpos lúteos6,52 ± 1,30; 8,35±1,08; de estruturas colhidas 4,05 ± 0,51; 7,70 ±2,01. As primeiras ovulações aconteceramàs 54,2 ± 6,41; 62,1 ± 3,50 horas após a retirada das esponjas, nos grupos A e B, respectivamente. Onúmero médio de embriões em estágio de pronúcleo no momento da colheita foi de 1,70± 2,90; 2,17±1,20;6 horas após das ovulações. A demais estrutura foi cultivada em meio TCM-199 acrescido de 20 % SFB; a37 o C; 100 % umidade relativa e 5 % de.CO2.

Um total de 2,35±1,50 e 3,25±1,20 estruturas atingiram afase de pronúcleo após 3 horas de cultivo. Conclui-se que a maior taxa de embriões em estágio de pronúcleopode-ser obtida entre 68,5±3,02 e 72,3±2,50 horas após a retirada das esponjas. O tratamento com GnRHsincronizou as ovulações, mas não aumentou o número de ovulações.

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PRODUÇÃO DE EMBRIÕES BOVINOS QUIMÉRICOS UTILIZANDO-SECÉLULAS DA MASSA CELULAR INTERNA OU CÉLULAS SEMELHANTES

ÀS TRONCO EMBRIONÁRIAS (ES-LIKE-CELLS) DE BOVINO*

Wolf, A.1; Gabaldi, S.H.2; Garcia, J.M.3

1 Dep. de Rep. An. e Rad. Vet. - FMVZ - UNESP - Botucatu, Brasil [email protected] ; 2Dep. de Rep. An. - FMVZ - USP - São Paulo, Brasil; 3 Dep. de Med. Vet. Prev. e Rep. An. - FCAV -

UNESP - Jaboticabal, Brasil

A produção de embriões bovinos quiméricos com a utilização da massa celular interna (MCI) de embriãobovino ou de células semelhantes às tronco embrionárias (ES-like-cells) bovinas é uma alternativa para aobtenção de bovinos transgênicos. O objetivo deste trabalho foi verificar a competência das células da MCIbovina na produção de embriões quiméricos, pela técnica da microinjeção em embrião de 16 células (E16), edas ES-like-cells, em blastocisto (Bl). Todos os embriões utilizados foram produzidos in vitro (PIV) a partirde ovários de abatedouro e cultivados em meio SOF+BSA, em estufa úmida (39°C e 5% de CO2, 5% de O2

e 90% de N2). No experimento I (Exp. I), as MCIs de blastocistos expandidos (Blx) PIV foram isoladasmecanicamente com pipeta de Pasteur de vidro. No experimento II (Exp. II), as linhas de ES-like-cellsforam isoladas da MCI de Blx PIV, implantadas e repicadas mecanicamente sobre uma monocamada defibroblasto de murino inativada com mitomicina C, e cultivadas em meio KnockoutTM D-MEM+15% deKnockoutTM SR+suplementos, em estufa úmida (39°C e 5% de CO2 em ar). No 3o repique, três linhas foramclassificadas como ES-like-cells, morfologicamente (Stice et al., Biol. Reprod., 54:100-10, 1996) e pelacoloração da fosfatase alcalina. As mitocôndrias das MCIs e das ES-like-cells foram coradas com MitoTracker Red CMXRos por 10 min. As MCIs foram microinjetadas em 77 embriões no estádio E16, e as ES-like-cells foram desagregadas com colagenase (0,25% em PBS) e microinjetadas na blastocele de 60 Blx.Estes embriões micromanipulados foram cultivados em meio SOF+BSA+SFB, durante 48h, e avaliados pormicroscopia óptica e de fluorescência. No Exp. I, 77,9% dos E16 microinjetados apresentaram desenvolvimentoa Blx ou eclodido e, 100% destes blastocistos apresentaram células fluorescentes na MCI, e poucas notrofoblasto. No Exp. II, 70% dos Blx apresentaram células fluorescentes na MCI, 20% no trofoblasto, 1,7%soltas na blastocele, 3,3% não apresentaram células fluorescentes e 5% degeneraram; porém, 36,7%apresentaram células fluorescentes tanto na MCI quanto no trofoblasto. Concluiu-se que a maioria dosembriões microinjetados com MCI ou ES-like-cells tornou-se quimera, pois as ES-cells presentes na MCIe as ES-like-cells cultivadas mostraram elevada afinidade em se agregar preferencialmente à MCI dos embriõesmicroinjetados.Suporte Financeiro: FAPESP - São Paulo, Brasil.

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ENUCLEAÇÃO QUÍMICA DE OÓCITOS BOVINOS COM COLCHICINA

Saraiva, N.Z.; Perecin, F.; Costa, P.F.; Ferreira, C.R.; Méo, S.C; Garcia, J.M

DMVPRA-FCAV-UNESP, Via de acesso Prof. Paulo D. Castellane s/n, CEP 14884-900, Jaboticabal –SP, Brasil. [email protected]

A enucleação química permite superar alguns importantes problemas da micromanipulação, permitindo umaprodução rápida e fácil de citoplastos receptores para a transferência nuclear (ELSHEIKH, J. Vet. Res.,v.45, p.217-220). Este experimento objetivou avaliar as taxas de enucleação promovidas pela colchicina, umagente anti-mitótico, capaz de interferir na ação da tubulina, uma proteína que constitui os microtúbulos efusos e responsável pela segregação cromossômica. Oócitos obtidos de ovários de vacas de abatedouro eapresentando citoplasma homogêno e cumulus compacto eram selecionados e transferidos para placas comquatro poços Nunc® com 500µL de meio de maturação [TCM 199 com sais de Earle (GibcoBRL) ebicarbonato de sódio (2,2mg/mL), suplementado com 10% de soro fetal bovino, 1µg/mL FSH, 50µg/mLhCG, 1µg/mL estradiol, 0,25mM piruvato de sódio e 75µg/mL amicacina] (50-60 oócitos/poço) e cultivadosa 38,5ºC e 5% CO2

em ar. Após 12 horas de MIV, os oócitos foram submetidos aos seguintes tratamentos:A) 0,5µM colchicina, B) 0,75µM colchicina, C) 1µM colchicina e D) grupo controle. Após 24 horas deMIV, as células do cumulus eram removidas com hialuronidase 0,2%. Os oócitos eram corados com Hoechst33342 (10µg/mL) e as taxas de enucleação avaliadas sob microscópio de epifluorescência. Os resultadosforam analisados por ANOVA e as médias pelo teste de Duncan. A análise estatística revelou diferença(P<0.05) entre o grupo controle [3 enucleados espontaneamente em 198 oócitos (1,16 ± 1,66%)] e tratados,onde observou-se: 41 enucleados em 244 oócitos tratados no grupo A (17,10 ± 3,59%), 58 enucleados em277 oócitos tratados no grupo B (21,19 ± 3,64%) e 46 enucleados em 275 oócitos tratados no grupo C(16,56 ± 4,69). Em estudos anteriores, observamos que concentrações mais elevadas de colchicina levarama grande fragmentação do DNA. Em murinos, a enucleação química está bem estabelecida, mas a razão paraesta diferença espécie-específica não é conhecida. Mais esforços são necessários para se compreender oprocesso biológico que conduz a segregação cromossômica, especialmente em bovinos.

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TRANSFECÇÃO IN VITRO DE MIOBLASTOS BOVINOS PARATRANSFERÊNCIA GÊNICA MEDIADA POR CÉLULAS

Milazzotto, M.P.1; Caetano, H.V.A.1; Nicácio, A.C.1; Simões, R.1; Yamada, C.1; Visintin, J.A.1

1 Depto de Reprodução Animal, FMVZ, USP 05508-900 – São Paulo, Brasil - [email protected]

Mioblastos adultos são células mononucleadas localizadas entre a lâmina basal e o sarcolema do músculo econtribuem para a reparação e hipertrofia muscular. A transferência gênica para essas células é uma importanteferramenta para o estudo do crescimento e desenvolvimento muscular. Além disso, o músculo é um excelentetecido para a transferência de proteínas recombinantes devido a sua habilidade de incorporar e expressarDNA exógeno. No entanto, estratégias eficientes para a manipulação genética de mioblastos bovinos aindanão foram desenvolvidas. O objetivo desse estudo foi determinar o método mais eficiente in vitro paraincorporação e expressão de gene repórter em células musculares bovinas. Mioblastos foram isolados dosmúsculos semitendinoso e semimembranoso de feto bovino de 6 meses. Cultura primária foi estabelecida emmeio mínimo essencial Dulbelco – DMEM (Sigma, Missouri-USA) contendo 10% de soro fetal bovino(Sigma, Missouri-USA) e 1% de antibióticos. Linhagens celulares miogênicas foram identificadas por ensaiode fusão de miotubos e presença de marcador músculo específico, miostatina, por RT-PCR. Quatro diferentesprotocolos para transfecção (Fosfato de Cálcio, eletroporação e dois lipídeos catiônicos comerciais Effectene®;Qiagen California-USA e FuGENE 6; Roche, Indiana-USA) foram testados para sua eficiência em transfectarmioblastos com o gene repórter GFP (green fluorescent protein) sob controle do promotor do CMV(citomegalovírus) em culturas semiconfluentes. Resultados de microscopia de fluorescência mostraram lipídeoscatiônicos como a mais eficiente metodologia para transferência gênica em mioblastos bovinos, tornando-seuma importante ferramenta em estudos de crescimento e desenvolvimento muscular.

Agradecimentos: FAPESP 03/0156-9

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EXPRESSÃO DO GENE DA MIOSTATINA EM MÚSCULO ESQUELÉTICODE FETOS NELORE (BOS PRIMIGENIUS INDICUS)

Milazzotto, M.P.1; Martins, L.1; Caetano, H.V.A.1; Feitosa, W.B.1;Assumpção, M.E.O.A.1; Visintin, J.A.1

1 Depto de Reprodução Animal, FMVZ, USP 05508-900 – São Paulo, Brasil - [email protected]

A superfamília dos fatores de crescimento transformantes beta compreendem um grande número de fatoresde crescimento e diferenciação que apresentam importantes papéis na regulação do desenvolvimento fetal ena manutenção da homeostase em animais adultos. A miostatina é um membro dessa superfamília com papelno controle e manutenção da massa muscular esquelética. Ela é uma proteína secretada que age comoregulador negativo do crescimento muscular esquelético. Durante a embriogênese, a miostatina é expressapelas células no miotomo e age regulando o número final de fibras musculares que serão formadas, tornando-se um importante fator no estudo do desenvolvimento corporal de animais de produção. O objetivo desseestudo foi caracterizar o padrão de expressão gênica da miostatina na musculatura esquelética durante odesenvolvimento fetal em animais Nelore, a raça mais adaptada no Brasil. Fetos Nelore de diferentes estágiosde desenvolvimento (20, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240 dias de gestação) foram obtidos de abatedouro.Fragmentos de aproximadamente 5mm3 foram retirados do músculo semitendinoso e estocados em N

2.

RNA total foi extraído desses fragmentos com TRIZOL® (Invitrogen, Califórnia-USA) and RT-PCR foiconduzido com a utilização de 5ng de RNA total, oligo dT e “Superscript II first strand synthesis for RT-PCR” (Invitrogen, Califórnia-USA). Reações de PCR semiquantitativo foram padronizadas para o gene damiostatina e da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase - GAPDH (controle interno). As amostras foramsubmetidas ao PCR semiquantitativo e os resultados mostraram que a expressão da miostatina ocorre desdeos primeiros estágios do desenvolvimento muscular (20 dias) até os estágios finais (240 dias) mostrando queo controle do desenvolvimento muscular é necessário durante todos os estágios da vida fetal. O aumento nopadrão de expressão foi observado nos dias 210 e 240 sugerindo que o controle mais acurado deve serrequerido ao final do período de desenvolvimento.Agradecimento: FAPESP 03/0156-9

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EXTRAÇÃO SIMULTÂNEA DE RNA, DNA E PROTEÍNAS DE TECIDOOVARIANO E TESTICULAR DE FETOS BOVINOS

Siqueira, F.1,2; Grisolia, A.B.1,2; Santos, S.E.C.2; Nunes, C.M.2; Lopes, C.R.1;Garcia, J.F.2

1Instituto de Biociências – Departamento de Genética – UNESP – Botucatu – SP – Brasil.;2Departamento de Apoio, Produção e Saúde Animal – LBBMA – UNESP – Araçatuba – SP – Brasil.

[email protected]

Técnicas de biologia molecular estão sendo utilizadas para análise de tecidos reprodutivos bovinos paraidentificar componentes moleculares e mecanismos envolvidos na expressão diferencial de genes. Análisesdo transcriptoma e proteoma necessitam de preparação de alta qualidade das macromoléculas e, em algunscasos, a grande quantidade de amostras biológicas é fator limitante. Para extração simultânea de RNA, DNAe proteínas, 100mg de ovário e testículo de fetos bovinos foram utilizados para 1ml de fenol isotiocianato deguanidina (TRIzol, Invitrogen Life Technologies). Os tecidos foram fragmentados em pequenos pedaços eimediatamente colocados em TRIzol e homogeneizados. Depois da completa remoção da fase aquosa, quecontinha o RNA, a interfase e a fase fenólica foram isoladas. Proteínas foram extraídas do sobrenadante fenoletanol obtido após precipitação do DNA com etanol utilizando hidrocloreto de guanidina em etanol 95%.Concentração de RNA, DNA e a razão A260/280nm foi determinada por espectrofotometria. A concentraçãode proteínas foi determinada por “BCA protein assay”. As quantidades de RNA, DNA e proteínas foram,respectivamente, 1,5µg/ml, 0,5µg/ml e 198µg/ml. Eletroforese em gel de formaldeído foi realizada para amostrasde RNA e gel de agarose 2% para DNA. As proteínas foram observadas em gel SDS page 7,5%. Aqualidade do RNA e do DNA foi determinada por RT-PCR (“Reverse Transcriptase Polimerase ChainReaction”) e por PCR (“Polimerase Chaim Reaction”), respectivamente. Genes GAPDH, FSHR, LHR, eGnRH foram empregados para essas análises. Embora a sensibilidade deste método seja mais baixa que oisolamento direto de RNA, DNA e proteínas, foi observado benefícios em redução de tempo e custo comotambém possibilita a preparação de RNA, DNA e proteínas de mesma amostra biológica.

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EXPRESSÃO DE MOLÉCULAS MHC NÃO CLÁSSICAS EM PLACENTASDE BOVINOS CLONADOS OU NÃO.

Puelker, R.Z.1; Kfouri Jr., J.R.2; Verechia, F.T. 3; Meirelles, F.V.1

1Departamento de Ciências Básicas – FZEA/USP, Pirassununga–SP, Brasil. 2Departamento deAnatomia e Cirurgia – FMVZ/USP, São Paulo–SP, Brasil. 3UNESP – Unidade Diferenciada de

Dracena–SP, Brasil. [email protected]

Em humanos e camundongos, estudos mostraram que moléculas MHC classe Ib que se ligam a receptoresinibidores de células NK protegem o trofoblasto da ação lítica destas células. Em camundongos, a expressãode um gene denominado Ped é conhecida por estar correlacionada com o desenvolvimento e sobrevivênciado embrião no período de pré-implantação e também no período de gestação. Este gene pertence ao MHCe tem como produto uma proteína classe Ib, o antígeno Qa-2. No bovino, pouco se sabe sobre o papel degenes do complexo BoLA nos mecanismos que envolvem a biologia do desenvolvimento embrionário e fetal.Desta forma, este trabalho tem como objetivos a identificação e o estudo da expressão de moléculas nãoclássicas do MHC classe I em placentas de bovinos, podendo contribuir para a compreensão de um fatorcrucial para o sucesso da produção de conceptos nesta espécie. Neste estudo, amostras de placentas decamundongos e bovinos provenientes de transferência nuclear ou não foram colhidas de forma asséptica,preservando-se a interface materno-fetal. Todas as amostras foram fixadas e incluídas em parafina. Oscortes em lâminas de vidro foram desparafinados, lavados em PSB e incubados por 30 minutos em soluçãode leite desnatado a 5% em PBS a 37oC. A seguir, os cortes foram lavados em solução de Twenn 20 a0,05% em PBS e incubados com anticorpo monoclonal de camundongo anti-Qa-2 marcado com FITC(clone 69h1-9-9, eBioscience, San Diego, CA). Após lavagem com PBS os cortes foram incubados comanticorpo secundário anti- FITC produzido em coelho (Alexa Fluor® 488, Molecular Probes, Oregon, USA)e a seguir lavados em PBS para então serem montados com glicerina e visualizados sob um filtro específicoem microscópio de epifluorescência. A análise das células que expressam ou não antígenos MHC classe Ibfoi realizada em amostras de placentas murinas (controle) e bovinas pela técnica de citometria de fluxo. Todoo procedimento de lavagem e separação celular foi realizado a 20°C com o meio RPMI 1640 de cultura a37°C. A suspensão celular foi incubada com o anticorpo anti-Qa-2 marcado com FITC e em seguida comanticorpo anti- FITC. Para controle negativo as células foram incubadas somente com anticorpo anti- IgGsde camundongo marcado com FITC. A leitura das lâminas submetidas a imunohistoquímica com anticorpoanti-Qa-2 mostrou a presença de poucas células positivas na porção materno-fetal dos tecidos controles ede bovinos coletados em matadouro. No entanto, foi possível visualizar um aumento no número de célulasapresentando sinal positivo para a presença de antígeno MHC classe Ib nos tecidos oriundos de bovinosproduzidos por TN. Dados qualitativos da análise por citometria de fluxo mostraram uma maior expressãode antígenos Qa-2 nas células presentes das populações encontradas no segundo terço (19,54%) da gestaçãode bovinos quando comparado ao primeiro (14%) e terceiro terços (14%).Apoio FAPESP.

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PLACENTAÇÃO EM BOVINOS CLONADOS

Pereira, F.T.V.1; Braga, F.C.2; Assis Neto, A.C.1; Ambrósio, C.E.2; Kfoury Jr., J.R.2; Oliveira,L.J.2; Papa, P.C.2; Carvalho, A.F.3; Santos, T.C.2; Visintin, J.A.2; Mello, M.B.2; Garcia, J.M.4;

Yamazaki, W.4; Rumpf, R.5; Iguma, L.T.5; Carter, A.M.6; Leiser, R.7; Miglino, M.A.2

1Universidade Estadual Paulista (UNESP-Dracena/SP); 2Universidade de São Paulo (FMVZ-USP);3UNIFEOB (São João da Boa Vista-SP); 4 Universidade Estadual Paulista (UNESP-Jaboticabal/SP);

5Embrapa-Cenargen (Brasília – DF); 6University of Southern Denmark, Odense, Denmark; Justus-LiebigUniversität Giessen, Germany. [email protected]

A fisiologia reprodutiva de animais clonados, incluindo as alterações que podem ocorrer na placenta, necessitamser melhor esclarecidas. O objetivo deste experimento foi o de comparar a morfologia de placentas bovinasnormais e de bovinos clonados através da macroscopia, microscopia de luz, microscopia eletrônica detransmissão e de varredura. Fetos clonados foram produzidos por transferência de células somáticas oufetais. Dados de gestações normais serviram como controle. Placentônios, regiões interplacentomais emembranas fetais foram examinadas para macroscopia e microscopia de luz (hematoxilina e eosina, azul deToluidina, Tricromo de Gomori + paraldeído-fucsina, Picrossírius, azul de metileno + fucsina básica e soluçãode nitrato de prata), microscopia eletrônica de transmissão e de varredura. Os placentônios (39) mostraramáreas hemorrágicas no corioalantóide. O diâmetro dos placentônios (21cm), a espessura (3,31cm) e o peso(150g) foram mensurados. No lado fetal, o tronco de poucas árvores vasculares é formado por uma únicaartéria e duas veias. Elas possuem um vilo de origem inserido em criptas vasculares na superfície materna. Aartéria de origem difere da gestação normal e o sistema capilar não parece ser um complexo muito denso deconvoluções capilares fetais e dilatações sinusoidais, como em placentação normal. Os capilares fetais (5-10µm diâmetro) eram menores do que o observado em bovinos normais (7 a 12 µm – terço médio degestação). O sistema de capilares maternos aparece mais ramificado, rodeando as criptas maternas. Dilataçõessinusoidais dos capilares maternos foram observados e seu diâmetro (9-14 µm) é significativamente menordo que em gestações normais (14-28 µm, 6 meses de gestação). Os vilos parecem ser mais curtos quandodeixam o eixo materno, e um arranjo desorganizado das árvores vilosas pôde ser observado, bem como ainterface materno-fetal, sugerindo uma falta de arquitetura capaz de suportar o crescimento fetal. Entre otopo do eixo materno e a base dos vilos fetais havia uma grande área hemófaga contendo pigmento hematógenoe conseqüentemente eritrofagocitose pelas células epiteliais da camada trofoblástica. A região interplacentomalmostrou áreas hemorrágicas também no endométrio, próximo às glândulas endometriais. As membranasfetais eram edematosas e as fibras colágenas mostraram um grande espaço entre elas, devido ao hidralantóide.O epitélio trofoblástico do córioalantóide possuía núcleo basal bem corado e muitas células trofoblásticasmostraram núcleos alterados. Então, podemos concluir que os placentônios de bovinos clonados exibiamalterações no padrão vascular e arranjo dos vilos maternos e fetais. O diâmetro dos capilares (9-14 µm) eramenor que o da gestação normal (14-28 µm, seis meses de gestação – Pfarrer, 2001) e o número total deplacentônios (39) é inferior que o da gestação normal (84 em Bos taurus - Miglino, 1991 e 89 em Bosindicus – Pereira da Silva, 2002). A média da mensuração dos placentônios foi 21cm (diâmetro), 3,31cm(espessura), e o peso foi de 150g em contraste à gestação normal onde a média de peso foi 89,87g. As áreashemorrágicas na interface materno-fetal e nas glândulas endometriais da placenta de bovinos clonados eramdiscrepantes em relação à placenta bovina normal.

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ERITROFAGOCITOSE PLACENTÁRIA EM BÚFALAS

Pereira, F.T.V.1; Braga, F.C.2; Kfoury Jr., J.R.2; Oliveira, L.J.2; Papa, P.C.2; Carvalho, A.F.3;Kohayagawa, A.4; Hamlett, W.C.5; Miglino, M.A.2

1Universidade Estadual Paulista (UNESP-Dracena/SP); 2Universidade de São Paulo (FMVZ-USP/SP);3UNIFEOB (São João da Boa Vista-SP); 4Universidade Estadual Paulista (UNESP-Botucatu/SP);

5Indiana University School of Medicine. [email protected]

A função da eritrofagocitose observada após o extravasamento de sangue na interface materno-fetal é indefinidaem várias espécies, incluindo a bufalina. Na ovelha, este processo foi muito estudado, e ocorre na zonaarcada do placentônio (topos dos septos maternos e base dos vilos fetais), região onde é realizado pelotrofoblasto. É possível que o ferro seja transferido para o feto mediante a eritrofagocitose trofoblástica nestaárea hemófaga da placenta e nas glândulas endometriais. Para este estudo foram utilizadas placentas debúfalas entre 2-3, 4-5, 6-7, 8-9 e 10 meses de prenhez, fixadas por perfusão com solução aquosa deformaldeído a 10% e paraformaldeído a 4%, para microscopia de luz, e glutaraldeído a 2,5%, para microscopiaeletrônica de transmissão, processadas e coradas para microscopia de luz (HE, azul de Toluidina, tricromode Gomori, Hematoxilina-floxina, Azul de metileno - fucsina básica), histoquímica (reação de Perls, PAS efosfatase ácida) além de microscopia eletrônica de transmissão. A metodologia utilizada permitiu-nos observarque as áreas hemófagas estavam presentes em determinadas regiões do placentônio, nas quais se identificavamáreas hemorrágicas entre o epitélio uterino e o trofoblástico, nas placentas de 4 a 10 meses de prenhez.Eritrócitos foram encontrados nas células trofoblásticas, elucidando, deste modo, a eritrofagocitose. A reaçãode PAS foi positiva, marcando substância mucóide, principalmente na base dos vilos fetais, células trofoblásticasbinucleadas e nas glândulas endometriais da região interplacentomal. A reação de Perls foi negativa nosplacentônios e positiva nas glândulas endometriais. A reação de fosfatase ácida foi positiva tanto nosplacentônios, quanto na região interplacentomal. A ultraestrutura da região das áreas hemófagas reveloueritrócitos ingeridos dentro das células trofoblásticas epiteliais em diferentes fases de digestão eeletrondensidades, várias vesículas endocíticas, cavéola, muitas gotículas lipídicas, retículo endoplasmáticorugoso bem desenvolvido e a presença de grande quantidade de mitocôndrias. O epitélio das glândulasendometriais da região interplacentomal é do tipo colunar com a presença de microvilos em seu ápice, enúcleos basais.

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DESENVOLVIMENTO MICROSCÓPICO DAS MEMBRANAS FETAIS DE BOVINOS

Assis Neto, A.C.1; Miglino, M.A.2; Verechia, F.T.1; Garcia, J.M.3

1 Unidade Diferenciada de Dracena – Faculdade de Zootecnia/UNESP, Dracena-SP, 17900-000;2Universidade de São Paulo (FMVZ-USP); 3Universidade Estadual Paulista (FCAV/UNESP-

Jaboticabal), Brasil. [email protected]

O objetivo do presente estudo foi de caracterizar o desenvolvimento dos anexos embrionários em bovinosnormais e assim estabelecer um padrão microscópico, contribuindo com futuras investigações na área debiotecnologia aplicada a reprodução animal. Foram analisados os aspectos microscópicos do cório, alantóide,âmnio e saco vitelínico em diferentes fases da gestação e mensurou-se o “Crown-rump” de 28 animais.Após, foram estabelecidas as idades aproximadas de acordo com a metodologia de Evans; Sack (1973). Asmembranas fetais foram fixadas em paraformoldeído a 4% e glutaraldeído a 2,5% e rotineiramente processadase incluídas em Histosec (Merck). As amostras foram coradas em HE e submetidas à reação de PAS. Amembrana cório-alantóide apresentou-se constituída por células globosas uni e binucleadas com arranjodesordenado e formando três a quatro camadas. Os núcleos apresentaram-se bem delimitados e com formatoovóide, o citoplasma claro com limites bem precisos. Os embriões com 10 dias de idade apresentavamcélulas com núcleos e citoplasma, respectivamente com 10,3µm e 19,6µm. Aos 15 dias as células uninucleadasmediam 18,9µm e as binucleadas 22,9µm, os núcleos apresentavam 10,4µm e 10µm respectivamente. Nosanimais de 20 dias as células binucleadas mediam 19,3µm e as uninucleadas 28,5µm. Aos 30 dias mostravamcélulas com 17.9µm e núcleos com 13,9µm. Aos 40 dias as células mediam 22,5µm e o núcleo, 9,8µm. Emcontato com a porção celular, observou-se tecido conjuntivo embrionário, formado por mesênquima extra-embrionário, no qual foram observados vasos sanguíneos de diversos diâmetros. Em alguns cortes observou-se células que constituíam a camada de cório, com a presença de grânulos citoplamáticos positivos para areação de PAS. O âmnio estava constituído por células achatadas ou pavimentosas contínuas organizadasem epitélio pavimentoso simples. O saco vitelínico apresenta-se formado por células cúbicas e colunaresorganizadas de forma contínua. O epitélio forma dobras que estão projetadas para a luz do saco. Nas fasesestudadas ainda observou-se a transição da transmissão de troca materno-fetal de metabólitos e o início daformação das vilosidades coriônicas.

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O TRATO REPRODUTIVO DA FÊMEA E A PLACENTA DE SUÍDEOSSUL AMERICANOS (Tayassu tajacu E Tayassu peccari)

Santos T.C. 1; Oliveira M.F.2; Miglino M.A.1; Dantzer V.3

1Departamento de Cirurgia, FMVZ/USP, São Paulo, Brasil 05508-000. [email protected] 2Escola Superiorde Agricultura de Mossoró, Brasil, 3 Institute of Anatomy and Physiology, Department of Anatomy, The

Royal Veterinary and Agricultural University, Copenhagen, Denmark.

O Tayassu tajacu (cateto) e o Tayassu peccari (queixada) pertencem a Família Tayassuidae, a super-família Suoidea e a ordem Artiodactila. Com 90 cm de comprimento e 30 kg o cateto é o menor dos pecariscom um colar de pêlos esbranquiçados ao redor do pescoço. O queixada é o maior deles, com 110 cm decomprimento e 40 kg de peso e possui pêlos brancos na mandíbula. Estes animais são muito bem adaptadosem todo o território brasileiro e reproduzem-se em todas as estações do ano. O período gestacional varia de144-148 dias no cateto e de 156-162 no queixada (Sowls, The peccaries, 1984). Estudos sobre morfologiae a fisiologia reprodutiva são necessários para o desenvolvimento da exploração zootécnica e a preservaçãodestas espécies. Estes animais podem ser excelentes modelos reprodutivos experimentais em estudos emsuídeos devido a sua similaridade morfológicas com os suínos domésticos e particularmente nos processosreprodutivos das espécies. Os animais foram obtidos na Fazenda São Pedro, São Paulo e no CEMAS, RioGrande do Norte. Dezesseis placentas oriundas de fêmeas prenhes em final de gestação (T. tayassu n=13,and T. pecari n=3) foram preparadas para macroscopia, histologia de luz e eletrônica de transmissão. Aimunolocalização de um dos mais potentes fatores de crescimento endotelial vascular (VEGF) e seus receptoresVGFR-1 e VEGFR-2 ou Flt-1 e KDR, respectivamente, fizeram parte deste estudo. A morfologia dosórgãos genitais destes animais mostrou aspectos interessantes. O trato reprodutivo feminino está compostopor ovários ovalados (1,6 cm), longas tubas uterinas (9,2 cm) e um útero bicornuado. O útero possui doiscornos uterinos curtos (11,5 cm) que voltam-se ventralmente em forma de hélice, um curto corpo uterino euma longa cérvix, com pregas circulares que projetam-se para o canal cervical. A placenta dos pecaris éepiteliocorial e difusa. O saco alantocoriônico é fusiforme e o padrão geométrico das interdigitações é difusoe mutuamente pregueado. A placenta em ambas as espécies é indeciduada com sub-unidades glândula-aréola para absorção das secreções glandulares. O VEGF, o Flt-1 e o KDR apresentam intensaimunoreatividade no epitélio uterino, no epitélio glandular uterino e no trofoblasto. As células endoteliais emusculares lisas dos vasos maternos e fetais também apresentam imunoreatividade. O sistema VEGF-receptorparticipa da regulação da placentação em suínos (Winther et al. Placenta, 20, 35-43, 1999), e nossos resultadosmostram que na placenta dos pecaris isto pode estar ocorrendo da mesma forma.

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ESTUDO DA ANGIOARQUITETURA VENOSA DOS ÓRGAOSGENITAIS DE FÊMEAS BOVINAS.

Gioso M.M.1; Costa E.P.2; Fernandes C.A.C.3; Paula T.A.2; Bittencourt, V.L.4;Guimarães J.D.2; Siqueira, L.G.B.5

1-Mestre em Reprodução Animal - LRA/DVT/UFV. Viçosa-MG, 36570-000, Brasil. 2- DVT/UFV,Viçosa-MG, 3- Pós-Doutorando, Bolsista Fapesp DRARV, UNESP-Botucatu, SP. 4- Setor Morfologia -

DVT/UFV, Viçosa-MG. 5- Discente- DVT /UFV - Viçosa-MG. [email protected].

O objetivo deste trabalho foi estudar a angioarquitetura venosa de órgãos genitais de fêmeas bovinas epossíveis anastomoses existentes entre os vasos provenientes da vulva e vagina com outros relacionados aoútero e ovário e tentar determinar o mecanismo pelo qual doses reduzidas de agentes luteolíticos possamalcançar o ovário quando administrados via submucosa vulvar (IVSM). Foram utilizados cinco órgãos genitaiscoletados em matadouro, sem patologias evidentes ou gestação inicial. No laboratório foram dispostos embandejas, à temperatura ambiente, e um ramo da veia vaginal caudal (próximo à região caudal da vagina) foilocalizado na superfície ventral do órgão e canulado com sonda uretral nº 6 recebendo cerca de 100 mL desoro fisiológico (0,9% NaCl) para a retirada completa de sangue. Posteriormente, este vaso foi infundido, nosentido cranial ao órgão, com contraste radiográfico intravascular (Hipaque® M60% - Schering–Plough,Brasil) em volumes que variaram de 50 a 70mL. A injeção foi contínua até que as veias ficassem preenchidase começando a se distender. Em seguida, os órgãos foram submetidos à radiografias e analisadas para averificação de possíveis anastomoses venosas existentes entrem a região da vagina e útero. Observou-se quea veia vaginal forma uma intensa rede de anastomoses na superfície ventral do útero entre os antímeros direitoe esquerdo (como descrito por Ginther, 1976; Veterinary Scope, v.20, n.1, p.1-17). Adicionalmente,anastomoses foram identificadas entre as veias que drenam a vagina e cérvix com as veias do corpo, cornosuterinos e veia útero-ovariana (drenagem principal uterina). Vale ressaltar que as infusões foram realizadasem um único sentido (cranial), não apresentando barreiras (ocasionadas pelas fortes valvas venosas) napassagem do contraste, sugerindo que o sangue venoso da vagina e cérvix é drenado do órgão genital nãoapenas pela veia vaginal, mas também pela veia útero-ovariana. Estes dois vasos desembocam na veia ilíacainterna. Por este experimento, concluiu-se que os órgãos genitais de fêmeas bovinas apresentam anastomosesentre os ramos da veia vaginal e as veias que drenam a cérvix, corpo e cornos uterinos, sugerindo que parteda dose de agentes luteolíticos administrados via submucosa vulvar pode ser transportada diretamente aoútero e, por conseguinte ao ovário por uma rota local sem atingir a circulação sistêmica.

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CRIOPRESERVAÇÃO DE EMBRIÕES DE COELHOS (Oryctogulus cuniculus)COM SACAROSE, GLICEROL E ETILENO-GLICOL

Solano, R.F.1; Solano.G.O.3; Chow, L.A.2

1Prof. PhD. Médico Veterinário da UEMA.; 2Médico Veterinário autônomo. 3Acadêmico bolsista deIniciação Científica - [email protected]

Escola de Medicina Veterinária - Universidade Estadual do Maranhão (UEMA)

O objetivo deste estudo foi avaliar a eficiência de três crioprotectores no congelamento controlado demórulas e blastocistos jovem de coelhas, utilizando glicerol l,4 M (G-1 n=40); etileno-glicol 1,5 M (G-IIn=41) e glicerol 1,4 M + sucrose 0,25 M (G-III n=45). Os embriões foram obtidos através de lavadodos oviductos e útero, três dias após do estro, com uma solução buferada (PBS+BSA 0,4%).Avaliadossegundo a morfologia estabelecida pela IETS e lavados em 10 gotas de PBS+BSA 0,4 % (Embryoholding, ENCARE) e posteriormente imersos nas soluções crioprotectoras (G-1; G-2 e G-3respectivamente) para seu equilíbrio durante 15 minutos à temperatura ambiente (28-30 °C), envasadosem palhetas de 0,25 ml, após foram imersas num equipamento (Freezing L-5000, Cryobiologic, LTD) atemperatura de –6° C, imediatamente imersa em nitrogênio líquido, iniciando o decréscimo da temperaturade acordo a programação (0,3 oC/min até atingir –32 oC). Os embriões foram descongelados no ar por10 segundos e na água a 37o C, por 20 segundos, e imerso no meio criopreservador em que foramcongelados em ordem decrescente (6,6; 3,3 e 0,0 M) lavados em sucrose ao 0,50 % M, posteriormenteem meio Holding (ENCARE) e cultivados em TCM-199 + 20 % SFB, a 37oC; 5 % CO2 e alta umidaderelativa. Foram considerados viáveis os embriões que alcançaram o estágio de blastocisto expandidoapós um período de 24 a 48 horas de cultivo in vitro. A taxa de viabilidade foi significativamente maior(P< 0,05) nos G-II e G-III (80,5 % e 82,2%) do que G-I (72,5 %). Conclui-se que a associação deSucrose com Glicerol demonstrou ser superior ao uso do Glicerol e Etileno-glicol puros.

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AVALIAÇÃO DA MORTE CELULAR EM EMBRIÕES FRESCOS ECRIOPRESERVADOS, EM CAMUNDONGOS

Coutinho, A.R.S.1; Mendes, C.M.1; Dagli, M.L.Z.2; Sinhorini, I.L.3;Visintin, J.A.1; Assumpção, M.E.O.A.1

1 Laboratório de Fecundação in vitro, Clonagem e Transgenia Animal, Departamento de Reprodução Animal.2Laboratório de Oncologia Experimental, Departamento de Patologia Animal. 3 Laboratório de Microscopia

Eletrônica, Departamento de Patologia Animal, Universidade de São Paulo – SP, 05508-000, [email protected]

Pesquisas na área de criopreservação de embriões mamíferos têm importância fundamental na aplicação debiotecnologias reprodutivas. A congelação controlada e vitrificação tem proporcionado grandes avanços noestudo da Criobiologia, porém a sobrevivência máxima de embriões, após a descongelação ainda não foiatingida. Deste modo o presente trabalho teve como objetivos comparar diferentes técnicas de detecção deinjúria celular e quantificar e diferenciar o tipo de morte celular em embriões frescos e criopreservados.Embriões de camundongos foram coletados, selecionados e divididos em 3 grupos: fresco, congelaçãocontrolada e vitrificação. Para o grupo fresco os embriões foram fixados e destinados à diferentes análises.No método de congelação controlada, os embriões foram expostos em 10% de etileno glicol (EG) por 10minutos e congelados na velocidade de 0,5°C/ minuto de – 7 a – 31°C, quando as palhetas foram imersas earmazenadas em nitrogênio líquido. Para a vitrificação (EFS) adotou-se duas etapas de equilíbrio. Os embriõesforam equilibrados em 10% de EG (EG10) e em 20% de EG (EG20), ambas etapas por 5 minutos. Apóseste período, os embriões foram expostos em solução de 40% de EG + 18% de Ficoll + 10% de sacarose(EFS) por no máximo 30 segundos, incluindo envase e imersão direta em nitrogênio líquido. O aquecimentofoi realizado em ar (10 segundos) e em água a 25oC (20 segundos) para o grupo congelação controlada ediretamente em água a 25oC (20 segundos) para o vitrificação. Após o aquecimento, os embriões foramavaliados quanto a sua qualidade e destinados à marcação dupla com Hoechst e Iodeto de Propídeo (H/IP),coloração com Hematoxilina e Eosina (HE), Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) e Cultivo invitro (CIV). A porcentagem de embriões grau I pós descongelação foi superior para o grupo congelaçãocontrolada (61,5%) em relação ao vitrificação (29,5%). Pela marcação com H/IP, o grupo vitrificaçãoapresentou maior quantidade de células mortas (69,7%) em relação ao congelação controlada (48,4%) e aofresco (13,8%) (p<0,05 Wilcoxon). A avaliação morfológica pela coloração com HE revelou que o grupovitrificação e o congelação controlada causaram picnose, com diminuição nuclear e condensação da cromatina.Figuras de mitose estavam presentes nos grupos fresco e congelação controlada, porém não foram visualizadasno vitrificação. A avaliação citoplasmática indicou alterações características de oncose no grupo vitrificação(rarefação do citoplasma e células degeneradas), enquanto que no grupo congelação controlada as alteraçõessão caracterísitcas de apoptose (condensação e eosinofilia do citoplasma). A MET confirmou os resultadosdescritos pela coloração com HE. A coloração com HE mostrou ser um método eficiente detectando oncosee apoptose em embriões criopreservados. Por estas análises podemos concluir que o método de vitrificaçãoutilizado provocou mais injúrias celulares, com predominância de oncose e conseqüentemente menordesenvolvimento in vitro.

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INFLUÊNCIA DO NÚMERO DE EMBRIÕES POR COLETA NAS TAXAS DEGESTAÇÃO DE EMBRIÕES BOVINOS CONGELADOS EM ETILENOGLICOL

Oliveira, E.R. 1; Fernandes, C.A.C. 2; Figueiredo, A.C.S.3; Gioso, M.M.4

1Biotran LTDA, R. Tatuin, 93, 37130-000-Alfenas-MG- [email protected]. 2Prof. Med.Vet.-Unifenas, Bolsista Fapesp. 3Profa. Inst. Ciências Agrárias-Unifenas. 4Doutoranda FMVZ-Unesp.

Botucatu.

Este trabalho foi elaborado para determinar a influência do número de embriões viáveis produzidos porcoleta na taxa de gestação destes. Foram utilizados 416 embriões de qualidade excelente (grau 1) produzidosnuma mesma Central (Embryo Plus–África do Sul), coletados de doadoras da raça Simental. De acordocom o número de embriões produzidos por coleta, estes foram divididos em 4 grupos: Grupo 1 – até 5embriões (n=97), Grupo 2 - de 6 a 9 embriões (n=111), Grupo 3 – de 10 a 15 embriões (n=109) e Grupo4 – mais de 15 embriões (n=99). Para o congelamento foi utilizado o etilenoglicol 1,5 M sem sacarose (ABTechnology-USA). Para o descongelamento as palhetas foram deixadas no ar por 10 segundos e colocadasem banho-maria a 32ºC por 30 segundos. Foram utilizadas como receptoras, novilhas mestiças, com escorecorporal entre 3 e 4 (escala 1-5), selecionadas pelo dia do ciclo estral (entre 6 e 8) e pelas características dogenital. As avaliações e inovulações foram feitas por um mesmo técnico, utilizando aplicador modelo Hannovere camisas sanitárias (IMV®). O embrião foi depositado o mais cranialmente possível no corno ipsilateral aocorpo lúteo. O diagnóstico de gestação foi feito por palpação retal e ultra-sonografia (Scaner Falco®-PieMedical) entre 50 e 60 dias após as inovulações. A taxa de gestação média foi de 35,10%. A taxa degestação foi de 30,93a %; 42,34a%; 41,28a% e 24,24b% para os grupos 1, 2, 3 e 4, respectivamente(P<0,05 - χ2). Embora a classificação morfológica dos embriões utilizados seja a mesma, quando o numerode embriões produzidos por coleta é muito elevado (acima de 15 embriões), a taxa de gestação dos mesmosé inferior, como também ocorre em inovulações a fresco. Provavelmente a simples avaliação morfológica nãoseja suficiente para avaliar a viabilidade dos embriões nestes casos.Palavras-chave: Bovino, embrião congelado, taxa de gestação.

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ESTÁGIO DE DESENVOLVIMENTO E TAXA DE GESTAÇÃO DE EMBRIÕESBOVINOS CONGELADOS EM ETILENOGLICOL

Fernandes, C.A.C.1; Oliveira, E.R. 2; Figueiredo, A.C.S.3; Gioso, M.M.4

1Prof. Med. Vet.-Unifenas, Bolsista Fapesp. R.Tatuin, 93, 37130-000-Alfenas- [email protected],MG. 2Biotran LTDA. 3Profa. ICA-Unifenas. 4Doutoranda FMVZ-Unesp. Botucatu.

O presente trabalho teve como objetivo comparar a taxa de gestação de embriões bovinos congelados emdiferentes estágios de desenvolvimento. Foram utilizados 416 embriões de qualidade excelente (grau 1)classificados quanto ao estágio de desenvolvimento em Mórula (M–n=79); Blastocisto Inicial (Bi-n=136),Blastocisto (B-n=103) e Blastocisto expandido (Bex-n=98). Os embriões utilizados foram produzidos numamesma Central (Embryo Plus – Brits – África do Sul), sendo coletados de doadoras da raça Simental,superovuladas pelos métodos convencionais. Para o congelamento foram utilizadas palhetas finas (0,25ml) eo etilenoglicol 1,5 M sem sacarose (AB Technology). Para o descongelamento as palhetas foram removidasdo N2, deixadas no ar por 10 segundos e colocadas em banho-maria a 32ºC por 30 segundos. Foramutilizadas como receptoras, novilhas mestiças, com escore corporal entre 3 e 4, selecionadas previamentepelo dia do ciclo estral (entre 6 e 8) e pelas características do genital. As avaliações e inovulações foramfeitas por um mesmo técnico, utilizando aplicador modelo Hannover e camisas sanitárias (IMV®). O embriãofoi depositado o mais cranialmente possível no corno ipsilateral ao corpo lúteo. O diagnóstico de gestação foifeito por palpação retal e ultra-sonografia (Scaner Falco®-Pie Medical) entre 50 e 60 dias após as inovulações.A taxa de gestação média foi de 35,10%. Para embriões nos diferentes estágios este valor foi de 44,30%a;31,07%b; 40,44%ab; 24,49%c (P<0,05-χ2), para embriões classificados como M; Bi; B e Bex,respectivamente. O trabalho mostra que embriões em estágio menos avançados de desenvolvimento, comoas mórulas, apresentam melhores resultados ao congelamento quando comparados a outros mais avançados,como os blastocistos expandidos.Palavras-chave: Bovino, embrião congelado, taxa de gestação.

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EFEITO DA INTERAÇÃO ENTRE CONGELAÇÃO E OUTRAS FONTES DE VARIAÇÃONA TAXA DE GESTAÇÃO DE EMBRIÕES F2 HOLANDËS X GIR

Freitas, C.1; Palhão, M.P.1; Viana, J.H.M.1; Arashiro, E.K.N.2; Nogueira, L.A.G.2; Sá W.F.1

1Embrapa Gado de Leite, Juiz de Fora, MG, 36038-330,2Universidade Federal Fluminense, Niterói, RJ, 24230-300

Os fatores que afetam a sobrevivência embrionária podem ser intrínsecos do embrião, ou relacionados aoambiente intra-uterino da receptora. A interação desses fatores é essencial para que ocorra o estabelecimentoda gestação. Objetivou-se, com este estudo, comparar-se as taxas de gestação obtidas utilizando-se embriõesF2 (Gir x Holandês) criopreservados em etilenoglicol ou não, de diferentes graus de qualidade e sincroniacom a fase do ciclo da receptora. Durante o período de fevereiro de 2002 a maio de 2003, foram realizadasum total de 347 inovulações, sendo transferidos embriões (180 descongelados e 167 a fresco) coletados devacas ½ sangue Holandês-Gir, previamente classificados de acordo com o estádio de desenvolvimento equalidade. As transferências foram realizadas pelo método não cirúrgico, nos dias 6, 7 ou 8 do ciclo, tomandocomo dia 0 o dia da observação do cio das receptoras. Diferenças nas taxas de gestação foram determinadaspelo método do λ2. A taxa de gestação obtida pela transferência de embriões a fresco não diferiu da taxaobtida com embriões previamente criopreservados (60,5% vs. 55,6%; P>0,05). Para os embriões transferidosà fresco, não se observou efeito significativo da qualidade (64,7% vs. 57,4% para graus I e II, respectivamente;P>0,05), do estádio de desenvolvimento (48,6%, 65,2% e 65,4% para mórula, mórula compacta e blastocisto,respectivamente; P>0,05) ou sincronia da receptora (54,4%, 60,6% e 62,2% para embriões transferidosnos dias 6, 7 ou 8 do ciclo estral, respectivamente; P>0,05) nas taxas de gestação. Para embriões descongelados,contudo, foram obtidas maiores taxas de gestação com embriões de grau I (57,3% vs. 33,3%; P<0,05), comembriões jovens (60,2%a, 52,4%ab e 37,5%b para mórulas, mórulas compactas e blastocistos,respectivamente; P<0,05) e com uma sincronia de 0 ou - 24h (60,4% e 60,8% vs. 37,8% para transferêncianos dias 6, 7 ou 8, respectivamente; P<0,05). Estes resultados demonstram a interação entre a congelação eos diferentes fatores que podem afetar os resultados da transferência de embriões.

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TAXA DE CONCEPÇÃO DE EMBRIÕES FRESCOS E CRIOPRESERVADOSTRANSFERIDOS EM VACAS HOLANDESAS DE ALTA PRODUÇÃO

Rodrigues, C.A.1; Ayres, H.2; Reis, E.L.2; Nichi, M.2; Bó, G.A.3; Baruselli, P.S.2

1Clínica Veterinária SAMVET de São Carlos, São Carlos-SP, Brasil. 2Departamento de ReproduçãoAnimal, FMVZ-USP, São Paulo-SP, Brasil. 3Instituto de Reproducción Animal Córdoba (IRAC),

Córdoba, Argentina. [email protected]

Vacas de leite criadas em condições tropicais freqüentemente apresentam decréscimo na taxa de prenhezquando submetidas a inseminação artificial (IA). Dessa forma a transferência de embriões (TE) pode ser umaalternativa para se minimizar esse efeito. O presente trabalho foi realizado em uma propriedade leiteira (AgrindusS/A, Descalvado – SP) e teve como objetivo comparar as taxas de concepção de vacas Holandesas de altaprodução (28,4 ± 2,3 kg/dia) submetidas à TE utilizando embriões frescos (n=654) ou criopreservados(n=1406) durante os anos de 2000, 2001, 2002 e 2003. Os animais foram submetidos à observação de cioe subsequente TE sete dias depois. Os embriões utilizados (frescos ou criopreservados) foram obtidos porMOET. Os dados foram analisados pelo teste de Qui-quadrado. Não foi verificada interação entre ano etipo de embrião (frescos e congelados) Encontrou-se maior taxa de concepção (P<0,05) para embriõesfrescos (45,6%; 296/654)a que para criopreservados (38,8%; 545/1406)b. Analisando as taxas de concepçãode acordo com estágio de desenvolvimento do embrião, encontrou-se respectivamente para embriões frescose criopreservados: 45,2% (196/434)a e 40,2% (422/1050)b para Mórula (redução de 5% na taxa de concepçãode embriões congelados; TCEC; P<0,05); 48,7% (19/39)a e 31,5% (29/92)b para Blastocisto inicial (reduçãode 17,2% na TCEC; P<0,05); 48,5% (66/136)a e 36,3% (77/212)b para Blastocisto (redução de12,2% naTCEC; P<0,05) e 33,3% (15/45) e 32,7% (17/52) para Blastocisto expandido (redução de 0,6% na TCEC;P>0,05). Os resultados sugerem que, em vacas Holandesas de alta produção criadas em condições tropicais,o uso de embriões frescos apresenta maior taxa de concepção que embriões congelados. O estágio deblastocisto expandido apresentou taxa de concepção semelhante para embriões frescos e criopreservados.

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UTILIZAÇÃO DE ETILENOGLICOL, DIMETILSULFÓXIDO E DIMETILFORMAMIDANA VITRIFICAÇÃO DE EMBRIOES BOVINOS EM OPEN PULLED STRAWS

Siqueira-Pyles, E.S.C.1; Fernandes, C.B.1, Landim-Alvarenga, F.C.1

1Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária FMVZ/UNESP, Botucatu - SP, 18618-000, Brasil. [email protected]

Com o objetivo de se avaliar o efeito dos agentes crioprotetores na viabilidade embrionária pós vitrificação,blastocistos bovinos produzidos in vitro foram vitrificados em Open Pulled Straws (OPS) utilizando-seetilenoglicol (EG), dimetilsulfóxido (DMSO) e dimetilformamida (DF). A Citocalasina B (CitB) foi adicionadaou não ao meio de vitrificação para ser analisado o seu efeito estabilizador de citoesqueleto. Para a obtençãodos blastocistos, ovócitos bovinos foram aspirados de ovários de matadouro e maturados (dia D-1), fertilizados(dia D0) e cultivados in vitro. No D7 de cultivo, 481 blastocistos foram divididos ao acaso em oito grupos,sendo: EG+DMSO, EG+DMSO+CitB, EG+DF, EG+DF+CitB, DF+DMSO, DF+DMSO+CitB, GC(controle de embriões não vitrificados) e GC+CitB (controle de embriões expostos à CitB e não vitrificados).De acordo com o grupo, os embriões foram expostos ou não a solução com 5µg/ml de CitB durante 20minutos antes de serem expostos aos crioprotetores. A solução de vitrificação foi composta por H-TCM199 acrescido de 20% de soro fetal bovino (SFB), 20% de cada crioprotetor, de acordo com o grupo, e0,5M de trealose. Cada embrião foi envasado em palheta esticada (OPS) a qual foi imediatamente imergidaem nitrogênio líquido.O aquecimento foi realizado em solução de 0,25M trealose aquecida à 39ºC, por cincominutos. Os embriões foram transferidos para uma solução de 0,15M trealose por mais cinco minutos, sendoentão transferidos para o meio H-TCM 199+20%SFB. Foram verificadas as taxas de re-expansão dosblastocistos após o aquecimento e retorno dos mesmos ao cultivo por mais dois dias (até o D9). A análiseestatística foi realizada pelo teste de Tukey para comparações múltiplas, com P<0,05, onde grupos seguidosde pelo menos uma letra igual não diferem estatisticamente. As taxas de re-expansão dos grupos EG+DMSO(0/61, 0%d), EG+DMSO+CitB (0/57, 0%cd), EG+DF+CitB (0/61, 0%d), DF+DMSO (4/54, 7,4%d) eDF+DMSO+CitB (0/64, 0%d) não diferiram estatisticamente entre si e foram estatisticamente inferiores àsdos grupos GC (38/70, 54,3%ab) e GC+CitB (17/57, 29,8%ab). As taxas de re-expansão de EG+DF (6/57,10,5%bc) diferiram de EG+DMSO, EG+DF+CitB, DF+DMSO e DF+DMSO+CitB, mas foram semelhantesas do grupo GC e GC+CitB. Estes resultados mostram que a exposição dos embriões bovinos à CitocalasinaB aparentemente diminui as taxas de re-expansão quando comparado aos embriões não expostos à essasolução. Entre os grupos estudados pode-se observar que as taxas de re-expansão dos grupos não vitrificados(GC e GC+CitB) não diferem estatisticamente do grupo EG+DF, no qual a associação destes agentescrioprotetores mostrou efeito benéfico ao embrião no processo de vitrificação. Contudo, busca-se aindamelhores taxas de re-expansão de blastocistos após a vitrificação através do estudo de diferentes protocolosde criopreservação de embriões bovinos.

Agradecimentos: FAPESP, Frigorífico FRIGOL e Profa. Lídia Raquel de Carvalho (Depto. BioestatísticaIB/UNESP).

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CRIOPRESERVAÇÃO E CULTIVO IN VITRO DE FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS OVINOS

Santos, R.R.¹; Rodrigues, A.P.R.¹; Costa, S.H.F.¹; Silva, J.R.V.¹; Martins, F.S.¹; Matos,M.H.T.¹; Celestino, J.J.H.¹; Silva, G.A.¹; Figueiredo, J.R.¹

1 Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Ovarianos Pré-Antrais – LAMOFOPA – FAVET -UECE, Fortaleza-CE, 60740-000, Brasil.

Este estudo avaliou a viabilidade de folículos pré-antrais (FOPA) ovinos cultivados a fresco ou após exposiçãoe/ou congelação com DMSO e EG 1,5 M. Cada par ovariano ovino foi submetido ao isolamento folicular.Dividiu-se a suspensão em 15 partes, sendo uma imediatamente avaliada com azul de trypan (controle). Das14 alíquotas restantes, 02 foram cultivadas por 1 e 5 dias, 6 foram somente expostas ao crioprotetor (ACP)e não congeladas, e 6 foram congeladas. Após exposição ou congelação, uma alíquota foi analisada (D0) eas demais cultivadas por 1 e 5 dias. Ao fim dos tratamentos, os FOPA foram classificados em viáveis ou nãoviáveis e o diâmetro folicular mensurado. O percentual de FOPA viáveis, bem como os diâmetros médiosforam comparados utilizando o teste Qui-quadrado e Turkey, respectivamente, a 5% de probabilidade.Antes e após 1 dia de cultivo, houve uma redução significativa de FOPA viáveis após exposição (65 e 62%)e congelação (51 e 52%) em relação aos frescos (91 e 71%). Após 5 dias, houve uma redução significativade FOPA congelados viáveis (42%) em relação aos frescos (60%) e aos somente expostos aos ACP (56%).Houve uma redução significativa e progressiva do percentual de FOPA viáveis após os Dias 1 e 5 nos FOPAfrescos. Comparando-se os FOPA somente expostos, bem como os congelados antes e após cultivo,observou-se uma redução significativa do percentual de FOPA viáveis após 1 e 5 dias. Ao cultivar FOPAsomente expostos, o aumento do diâmetro foi observado após o Dia 1 e manteve-se inalterado até o Dia 5.Entretanto, analisando-se os FOPA congelados cultivados, verificou-se que não houve crescimento folicularsignificativo. Comparando-se os tratamentos dentro de cada dia, observou-se que FOPA cultivados frescosou somente expostos apresentaram taxas similares de crescimento, sendo superiores àquelas de FOPApreviamente congelados. Em conclusão, o procedimento de congelação afeta a capacidade dos folículospré-antrais ovinos de serem cultivados in vitro.

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TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES BOVINOS PRODUZIDOS IN VITRO:EFEITO DA VITRIFICAÇÃO E DO TRANSPORTE.

Mezzalira, A.; Santos, R.M.; Barreta, M.; Cucco, D.; Mezzalira, J.C.;Wentz, K.C.; Cruz, F.B.

Laboratório de Reprodução Animal Prof. Assis Roberto de Bem – CAV Universidade doEstado de Santa Catarina –UDESC Lages SC Brasil. E-mail [email protected]

Para avaliar a viabilidade da vitrificação e do transporte, embriões produzidos in vitro frescos (n=30) ouvitrificados (n=30) foram transferidos para receptoras síncronas. Ovários de seis vacas Devon, quatro delasestimuladas com 70mg de FSH (Folltropin®) foram submetidos ao slicing, seguindo-se a busca e seleção dosovócitos, em meio TCM 199 adicionado de Hepes e 10% SFB. Obteve-se 39 ovócitos/vaca nas tratadascom hormônio e 17 ovócitos/vaca nas não tratadas. A maturação foi efetuada em meio TCM 199 sais deEarle com soro de vaca em estro (SVE) em estufa a 39°C, com atmosfera de 5% de CO2 e 95% deumidade relativa, por 24 horas. A fecundação foi realizada com 1 x 106 espermatozóides/mL, selecionadopelo processo de migração ascendente (Swim-up), em meio Talp-Sperm. A incubação dos ovócitos eespermatozóides foi realizada por 18-22 horas em 400µl de Talp-Fert, com 30µg de Heparina. O cultivo foirealizado em meio SOFaaci, por 192 horas, avaliando-se a taxa de embriões em D7 e D8 do cultivo. Quinzeembriões nos estágios de Blastocisto (Bl) e Blastocisto expandido (Bx) foram transportados por 6 horas àtemperatura ambiente (22 - 25°C), em TCM-Hepes +10% SVE, e transferidos para receptoras. Outrosquinze embriões nos estágios de Bl e Bx foram vitrificados em palhetas estiradas e abertas (OPS), através daexposição a uma solução de equilíbrio composta por 400µl de meio TCM-Hepes + 10% de SVE) acrescidode 50µl de EG e 50µl de DMSO, por 60 segundos. Em seguida foram transferidos para solução de vitrificaçãocomposta por 300µl de meio de manutenção acrescido de 100µl de EG e 100µl de DMSO, por 20 segundos.O reaquecimento foi realizado a 37-38°C, pela exposição (5 minutos) a soluções decrescentes de sacarose(0.30M e 0,15M). Todos os embriões (15 frescos e 15 vitrificados) foram transferido após 6 horas detransporte. O diagnóstico de gestação, realizado aos 35 dias, por ultra-sonografia, revelou taxa de prenhezde 33,3% (5/15) nos dois grupos. Os resultados permitem concluir que é possível transportar embriõesproduzidos in vitro, vitrificados ou não, por períodos de até 6 horas, obtendo-se resultados satisfatórios, eque a vitrificação é um método eficiente de criopreservação para estes embriões.

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VIABILIDADE DE OÓCITOS BOVINOS MATURADOS IN VITROEXPOSTOS A SOLUÇÃO DE TREALOSE

Martins, R.P.; Dias, A.J.B.; Quirino, C.R.

Setor de Reprodução Animal, Laboratório de Melhoramento Genético Animal-CCTA - UniversidadeEstadual do Norte Fluminense, Campos dos Goytacazes - RJ,Brasil - E-mail:[email protected]

Durante os procedimentos de criopreservação as células ficam expostas a soluções crioprotetoras, queapesar de necessárias, podem causar efeitos tóxicos e osmóticos. Na busca de crioprotetores menos tóxicos,várias substâncias têm sido testadas. Ultimamente a trealose tem sido utilizada na criopreservação de tecidos,células e gametas, produzindo resultados promissores devido a sua capacidade de estabilização da membranaplasmática. Mas, por ser um crioprotetor não penetrante, este dissacarídeo pode causar efeitos osmóticospor desidratação excessiva dos oócitos. Para avaliar a capacidade de oócitos bovinos suportarem adesidratação provocada por soluções hipertônicas de trealose, estes gametas foram expostos a soluções dediferentes concentrações deste açúcar. Para isso, oócitos aspirados de ovários de matadouro e classificadoscomo grau I e II foram maturados in vitro ( meio 199 com sais de Earle com 20mM NaHCO3, 5,0µg/mL deLH, 0,5µg/mL de FSH, 100UI/mL de penicilina, 100µg/mL de estreptomicina e 10% de soro fetal bovino-SFB) por vinte e duas horas. Posteriormente foram separados em três grupos e expostos por um período de10 min a cada uma das soluções de trealose: 0,15M (466mOsm); 0,35M (654 mOsm) e 0,5M (724 mOsm)em TCM 199, com 25mM de Hepes e 10% de SFB. Oócitos colocados em concentrações mais elevadaspassaram previamente pelas concentrações mais baixas. A reidratação foi feita em concentrações decrescentesde trealose, de forma inversa a desidratação, também durante 10 min. A cada dois minutos, a imagem dosovócitos foi capturada e realizada a medida do diâmetro (distância horizontal), com auxílio do programacomputacional AnalySIS. A redução máxima dessa medida foi de 14,5%; 21,0% e 29,1% para oócitosexpostos aos tratamentos às concentrações de 0,15M; 0,35M e 0,50M respectivamente. Após a reidratação,395 oócitos foram corados pelo azul de Tripan (0,4%) em PBS por 5 min, para avaliação da integridade damembrana plasmática. Oócitos com membrana íntegra foram observados em 95,0% (n=99); 91,0%(n=89);86,0% (n=103) e 80,0% (n=104) para os grupos controle (sem exposição); 0,15M; 0,35M e 0,50M detrealose, respectivamente. Para verificar a capacidade de desenvolvimento in vitro, 154 oócitos maturados,foram expostos a solução de 0,35M de trealose, conforme acima, enquanto 162 oócitos foram utilizadoscomo controle, fertilizados e cultivados in vitro. Os resultados foram analisados pela ANOVA (PROCGLM, SAS, 1996). As médias dos tratamentos foram comparadas pelo teste de Tukey, com nível designificância de 5%. Nesta concentração, valores médios da taxa de clivagem (66,4% ± 10.6 e 68,3% ± 8,7)e taxa de blastocistos em D7 (33,9%± 9,8 e 33,3% ± 12,2), não apresentaram diferença significativa (P>0,05),respectivamente para o grupo tratado (trealose) e o grupo controle. Nas condições deste trabalho, a trealosenão apresentou efeitos deletérios para oócitos bovinos maturados in vitro, em soluções até 0,35M. Abordagensda sua capacidade crioprotetora e alternativas que permitam sua introdução no citoplasma dos oócitos devemser testadas, visando definir protocolos mais eficientes para a criopreservação destas células.

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UTILIZAÇÃO DE OÓCITOS VITRIFICADOS DE SUÍNOS NO TESTE DEPENETRAÇÃO ESPERMÁTICA IN VITRO

Macedo Jr., M.M.1; Deschamps, J.C.; Lucia Jr., T.; Bordignon, J.; Serret, C.G.;Rambo, G.; Rheingantz, M.G.T.

Centro de Biotecnologia – Universidade Federal de Pelotas - 1e-mail: [email protected]

O teste de penetração espermática in vitro (TPIV) pode avaliar o potencial de penetração e capacidadefertilizante de amostras de sêmen suíno utilizando oócitos estocados em NL2. O objetivo deste experimentoé verificar alterações no potencial da capacidade fertilizante estimada através da motilidade espermática emorfologia, choque hipo-osmótico (CHIPO), teste de termo resistência (TTR) e TPIV usando amostras desêmen estocadas a 17 oC, avaliadas em 4 diferentes períodos de armazenamento (0, 24, 48 e 72 h). O TPIVfoi baseado na taxa de penetração in vitro (TxPIV) de oócitos vitrificados de suínos incubados em estufa deCO2 com espermatozóides homólogos. Estes teste foram realizados conforme descritos na literatura para aespécie suína (Macedo M.C Jr et al 2002, Pelotas: Faculdade de Veterinária da UFPel, Dissertação). Amotilidade, CHIPO e TTR foram avaliados através do teste LSD e a patologia espermática e o TPVI foramavaliados pelo teste de X2. Os testes de motilidade, morfologia espermática, CHIPO e TTR, não identificaramalterações na qualidade espermática, durante o período de estocagem do sêmen, nos dois machos estudados.Contudo quando se realizou o TPIV, foi verificado que o sêmen de ambos os machos diminuíram (P<0,05)suas taxas de penetração espermática in vitro (TxPIV) durante o período de estocagem. Porém esta diminuiçãofoi verificada em momentos diferentes para cada macho. Para o macho A, as TxPIV não diferiram (P>0,05)entre 0 h e 24 h de estocagem do sêmen (100, % e 98,1% respectivamente) bem como entre 48 h e 72 h(66,0%, 53,3% respectivamente), embora as TxPIV tenham sido maiores (P<0,05) no período de 0-24 h deestocagem do sêmen que durante o período de 48-72 h. Para o macho B, a TxPIV na 0 h (50,6%) foi maior(P<0,05) que nas 24 h, 48 h, e 72 h de estocagem do sêmen (34,3 %, 28,3% e 24,0% respectivamente), nãosendo observado diferenças (P>0,05) após 24 h de estocagem. O TPIV utilizando oócitos homólogosvitrificados foi o único teste capaz de verificar alterações na qualidade espermática durante as avaliaçõesrealizadas no período de 72 horas de armazenamento do sêmen.

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INFLUÊNCIA DO MÉTODO DE COLHEITA SOBRE OS PARÂMETROS SEMINAIS DE CARNEIROS DA RAÇA SANTA INÊS

Alves, S.G.G.1; Chalhoub, M.1; Bittencourt, R.F.1; Almeida, A.K.1; Portela, A.P.M.1;Freitas, D.S.1; Meneses, M.A.2; Ribeiro Filho, A. de L.1

1Escola de Medicina Veterinária – UFBA, Salvador-BA, 40.170-110, Brasil. 2Veterinário autô[email protected]

A inseminação artificial, pela sua facilidade de difusão das características desejáveis de um reprodutor, temsido utilizada como ferramenta necessária ao melhoramento genético de um rebanho. Entretanto, o métodode colheita do sêmen pode interferir negativamente sobre os parâmetros seminais, diminuindo assim a suaviabilidade. A colheita de sêmen pode ser efetuada por meio da eletroejaculação (EE) ou com o uso de umavagina artificial (VA). A não necessidade de uma fêmea em cio ou de um manequim é a principal vantagem daEE sobre a VA, contudo, a colheita utilizando a VA é a que mais se assemelha ao coito natural, propiciandoum ejaculado com parâmetros seminais mais próximos do fisiológico. Desta forma, este estudo teve comoobjetivo comparar a influência desses dois métodos de colheita de sêmen sobre o volume (VOL), motilidade(MOT), vigor (VIG), turbilhão (TURB), concentração (CONC), defeitos maiores (DMA), defeitos menores(DME) e defeitos totais (DT) do ejaculado de carneiros da raça Santa Inês; além disso, verificar as correlaçõesentre os métodos de colheita e os parâmetros seminais citados anteriormente. Para tanto, foram utilizados125 reprodutores dos quais 81 tiveram seu sêmen colhido por EE e 44 com o uso da VA. As análisesestatísticas foram realizadas utilizando o pacote estatístico SAS 1996 versão 6.1. Ao se comparar os métodosde colheita (VA x EE) observou-se diferença estatística nos seguintes parâmetros: VOL (1,22 ± 0,51 x 1,51± 0,77mL), MOT (77,5 ± 10,81 x 72,9 ± 11,20%), TURB (3,5 ± 0,65 x 3,1 ± 0,97), CONC (3.373x106

± 1.876,70 x 641x106 ± 1.015,15sptz/mL) e DT (5,18 ± 3,87 x 8,83 ± 10,66%). Não foram observadasdiferenças (P>0.05) para o VIG (3,46 ± 0,55 x 3,28 ± 0,65), DMA (3,43 ± 4,01 x 4,92 ± 4,23%) e DME(1,75 ± 1,41 x 2,44 ± 2,58%). As correlações estatisticamente significativas entre os parâmetros seminaisquando se colheu o sêmen com VA foram: VOL/DME (r=0,32; P<0,05), CONC/TURB (r=0,30; P<0,05),MOT/VIG (r=0,85; P=0,0001), MOT/TURB (r=0,54; P=0,0001), MOT/DMA (r=-0,30; P<0,05),MOT/DT (r=-0,34; P<0,05), VIG/TURB (r=0,57; P=0,0001) e DMA/DT (r=0,93; P=0,0001); já nacolheita por EE essas correlações foram: VOL/CONC (r=-0,31; P<0,005), VOL/DME (r=0,28; P>0,005),MOT/VIG (r=0,75; P=0,0001), MOT/TURB (r=0,53; P=0,0001), MOT/DMA (r=-0,32; P<0,005),MOT/DME (r=-0,23; P<0,05), MOT/DT (r=-0,34; P<0,005), VIG/TURB (r=0,52; P=0,0001), VIG/DMA (r=-0,25; P<0,05), VIG/DME (r=-0,30; P>0,005), VIG/DT (r=-0,36; P>0,0005), DMA/DT(r=-0,25; P<0,05) e DME/DT (r=-0,38; P=0,0005). A EE exerceu grande influência sobre o parâmetroCONC o que pode ser justificada pelo coeficiente de variação (158,13%) observado. Esses resultadosdemonstram, que os parâmetros seminais obtidos por meio da colheita de sêmen com VA em carneiros daraça Santa Inês estão dentro dos valores fisiológicos para a espécie ovina. Esse método de colheita deve sereleito quando se desejar um ejaculado para a criopreservação ou para ser utilizado em programas desuperovulação para transferência de embriões.

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CONCENTRAÇÃO DE CÁLCIO INTRACELULAR EM ESPERMATOZÓIDESTRATADOS COM BLOQUEADORES DE CANAIS DE ÍONS CÁLCIO *

Gabaldi, S.H.1; Esper, C.R. 2; Tedesco, A.C.3; Wolf, A.4; Oliveira, J.A.5

1 Dep. de Reprod. An. - FMVZ-USP, São Paulo, [email protected]; 2 Dep. de Med. Vet. Prev. eReprod. An. - FCAV-UNESP, Jaboticabal; 3 Dep. de Química - FFCLRP-USP, Ribeirão Preto, Brasil; 4

Dep. de Reprod. An.e Radiol. Vet. - FMVZ-UNESP, Botucatu, Brasil; 5 Dep. de Ciências Exatas -FCAV-UNESP, Jaboticabal, Brasil

Há relatos que bloqueadores de canais de íons cálcio, utilizados na terapia anti-hipertensiva, podem levar àinfertilidade masculina, pois o íon cálcio é importante na capacitação espermática e na reação acrossomal.Este experimento teve como objetivo verificar a influência dos bloqueadores de canais de íons cálcio voltagem-dependentes do tipo-L, verapamil, nifedipina e diltiazem, na concentração de cálcio intracelular emespermatozóide de hamsters. A colheita dos espermatozóides foi segundo Bavister (Gam. Res., 23:139-58,1989). Os gametas foram transferidos para o meio TALP sem cálcio (pH 7,4), a 37oC e, após a verificaçãoda viabilidade espermática, a sua concentração foi ajustada para 35 x 106 sptz/mL. Os espermatozóidesforam incubados por 30 minutos com 10µM de Fluo 3-AM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, F-6142) emestufa úmida a 37oC com 5% de CO2 em ar. Após o carregamento da sonda nos gametas, a mistura foicentrifugada por 4min a 300xg (1500 rpm) e descartado o sobrenadante. Os espermatozóides foramressuspendidos em 6mL de meio TALP livre de cálcio (aproximadamente 6x106 sptz/mL), acrescido deBSA (3mg/mL) e de PHE (10µL/mL). Em 2mL desta suspensão, a intensidade da fluorescência foi mensuradadurante 720seg no espectrofluorímetro (Hitachi F-4500, Japan) (excitação 496nm e emissão 525nm) comtemperatura controlada a 37oC, sob agitação magnética. Neste sistema, foi adicionado 50µM do bloqueadorde canais de cálcio (verapamil, nifedipina ou diltiazem) após 120seg, 2µM de íon cálcio após 280seg e 3µMde cálcio ionóforo A23187 (Sigma-Aldrich, C-7522) após 200seg. No grupo controle não foi adicionado osantagonistas de cálcio. Foram realizadas cinco repetições (animais) para cada experimento, sempre secomparando Grupo Controle x Grupo Bloqueador de Cálcio. A dosagem de cálcio intracelular foi calculadasegundo a equação de GRYNKIEWICZ et al. (J. Biol. Chem., 260:3440-50, 1985). Os resultados foramanalisados por ANOVA (p<0,05) no tempo de 100seg após administração do cálcio exógeno. A concentraçãomédia de cálcio intracelular nos espermatozóides do grupo controle (3,62µM) foi significativamente maiorque nos grupos verapamil (0,45µM), nifedipina (0,46µM) e diltiazem (0,40µM). Todos os bloqueadores decanais de íons cálcio inibiram a entrada do cálcio exógeno pelos canais de cálcio voltagem-dependentes.Concluiu-se que os espermatozóides possuem em sua membrana plasmática canais de íons cálcio sensíveisaos bloqueadores de canais de cálcio voltagem-dependentes do tipo-L, podendo, a terapia anti-hipertensiva,reduzir a taxa de capacitação e reação acrossomal e, conseqüentemente, a fertilidade masculina.Suporte financeiro:FAPESP - São Paulo, Brasil.

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AJUSTE NA CONCENTRAÇÃO DE ESPERMATOZÓIDES UTILIZADOS NAINSEMINAÇÃO DE VACAS NELORE SUPERESTIMULADAS, PARA EVITAR

DIMINUIÇÃO DA PRODUÇÃO DE EMBRIÕES

Nogueira, M.F.G.*; Barros, C.M.

Depto. de Farmacologia, Instituto de Biociências, UNESP, Botucatu-SP, 18618-000, [email protected]

A quantidade e qualidade do sêmen podem afetar a taxa de concepção após a inseminação artificial (IA), ea concentração de espermatozóides com movimento total pós-descongelação varia de acordo com a partidade sêmen e com o reprodutor utilizado. A concentração mínima de espermatozóides presentes numa palhetade sêmen foi determinada tendo em mente a fertilização de uma fêmea durante o ciclo estral normal. Entretanto,a superestimulação de doadoras de embriões resulta na disponibilidade de maior número de oócitos (cercade 10 a 20) para a fertilização, do que em uma simples IA (1 oócito). Neste trabalho objetiva-se verificar se,por meio do ajuste da concentração final de espermatozóides, é possível utilizar palhetas com baixa concentraçãoespermática e obter taxas de embriões viáveis semelhantes àquelas resultantes da utilização de palhetas comalta concentração. Vacas da raça Nelore foram superestimuladas com o protocolo P36 (Barros, Porto eNogueira, Theriogenology, 59:524, 2003), no qual a ovulação é induzida com LH (25 mg, Lutropin),administrado 36 h após a PGF2α. Uma amostra de cada partida de sêmen foi analisada pelo método CASA(Computer-Assisted Semen Analysis) e a concentração final de espermatozóides, com motilidade total pós-descongelação, foi ajustada para um mínimo de 25x106, que corresponde a aproximadamente 3x aconcentração de espermatozóides usada na IA de um animal não superovulado. A IA com tempo fixo(IATF) foi realizada 12, 24 e, quando aplicável, 36 h pós LH exógeno. O número de palhetas de sêmennecessário para atingir a concentração desejada variou entre 2 e 6 (Grupos 2, 3, 4, 5 e 6). O número deIATFs foi ajustado para o número total de palhetas utilizadas, isto é, 2 palhetas (IATF 12 e 24 h pós LH), e3 ou mais palhetas (12, 24 e 36 h pós LH). A média de estruturas totais (oócitos, embriões viáveis edegenerados), média de embriões viáveis obtidas por colheita e a taxa de viabilidade (porcentagem deembriões viáveis/estruturas totais) foram de 12,2; 8,9 e 73,6% (Grupo 2, n=19 colheitas); 13,5; 9,6 e 70,9%(Grupo 3, n=104); 13,3; 9,4 e 70,9% (Grupo 4, n=22); 5,5; 4,0 e 72,7% (Grupo 5, n=4) e 24,0; 13,0 e54,2% (Grupo 6, n=1). Quando os resultados dos grupos 4, 5 e 6 foram agrupados, a média de estruturastotais, de embriões viáveis obtidos e a taxa de viabilidade foram de: 12,5; 8,7 e 69,8% (n=27). Estes resultadosforam similares aos obtidos nos grupos 2 e 3 (p=0,61), e não houve diferença significativa entre os resultadosdos grupos 2 a 6 (p=0,17). Conclui-se que, apesar da utilização de palhetas de sêmen com baixa concentraçãode espermatozóides, foi possível, mediante o ajuste da concentração final de espermatozóides, obter taxasde viabilidade e de embriões viáveis semelhantes àquelas observadas quando utilizou-se sêmen com altaconcentração espermática. *Bolsista da Fapesp.

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INFLUÊNCIA DO NÚMERO DE ESPERMATOZÓIDES, LOCAL DE DEPOSIÇÃO DOSÊMEN E SELEÇÃO ESPERMÁTICA EM GRADIENTE DE PERCOLL SOBRE A

RESPOSTA INFLAMATÓRIA UTERINA APÓS INSEMINAÇÃO UTILIZANDO SÊMENCONGELADO DE GARANHÃO

Gomes, G.M.1; Leão, K.M. 1; Macedo, L.P.1; Jacob, J.C.F.2; Papa, F.O.1;Oliveira, J.V.1; Alvarenga, M.A.1

1Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária/ FMVZ-UNESP, Botucatu, Brasil2Departamento de Reprodução e Avaliação Animal/ I Z/ UFRRJ, Brasil. [email protected]

Sabidamente, o espermatozóide mais do que a contaminação bacteriana é responsável pela instalação de umprocesso inflamatório agudo pós-inseminação. O presente estudo teve como objetivo avaliar a influência donúmero de espermatozóides na dose inseminante e da seleção espermática em gradiente de Percoll sobre aresposta inflamatória uterina. Foi também estudado, a influência do local de deposição do sêmen (corpo doútero versus junção uterotubárica) em relação à endometrite provocada após as inseminações com sêmencongelado de garanhões. Foram utilizadas um total de 20 éguas para o estudo. Quando o folículo pré-ovulatório atingia 35 mm de diâmetro em média, 2500 UI de hCG (Vetecor®, Calier-SP) i.v. eram administradaspara indução de ovulação. A partir deste momento era realizado acompanhamento ultra-sonográfico a cada6 horas. Assim que se detectavam as ovulações as éguas eram inseminadas (15 inseminações - corpo doútero e 10 inseminações - junção úterotubárica por endoscopia) de forma aleatória, entre os gruposexperimentais: Grupo R1 (n=5) – Inseminação com a dose usual de sêmen congelado (800 x106 deespermatozóides totais) no corpo do útero; Grupo R2 (n=5) – Inseminação com 40 x 106 espermatozóidesmóveis no corpo do útero. Grupo R3 (n=5) – Inseminação com 40 x106 espermatozóides móveis porhisteroscopia na junção úterotubárica. Grupo R4 (n=5) – Inseminação com 40 x106 espermatozóides móveispreviamente selecionados em colunas de 45/90% de gradiente de Percoll (centrifugação a 300g por 15minutos) por histeroscopia. Grupo R5 (n=5) – Inseminação no corpo do útero com 40 x106 espermatozóidesmóveis previamente selecionados em gradiente de Percoll. A avaliação da resposta inflamatória do úterofrente às inseminações foi realizada através de citologia uterina 8h e 24hs após cada inseminação artificial. Foiutilizada a Análise de Variância de Perfil, seguida do teste de Tukey-Kramer para comparações múltiplasentre os grupos os dois momentos. Através da porcentagem de neutrófilos encontrados nos materiais verificou-se que a dose inseminante convencional de sêmen criopreservado de garanhão causou uma exacerbadaresposta inflamatória uterina. Quando do uso de uma baixa dose inseminante, não foi observada diferençaestatística (p>0.05) em relação à intensidade de resposta inflamatória ao utilizar sêmen selecionado depositadono corpo do útero (Grupo-R5) quando comparado com a deposição de sêmen sem prévia seleção nomesmo local (Grupo-R2), bem como, na papila uterotubárica (Grupo-R3). Não houve influência (p<0.05)em utilizar-se sêmen selecionado ou não, em relação à reação inflamatória uterina, tanto quando da deposiçãono corpo do útero quanto na papila uterotubárica. A inseminação histeroscópica (Grupo-R3) levou a umamenor (p<0.05) resposta inflamatória comparada à inseminação com a dose convencional. Não houve diferençaestatística (p<0.05) em relação à intensidade da resposta inflamatória, ao depositar um baixo número deespermatozóides no corpo do útero ou sobre a junção úterotubárica. Baseado nesses achados, a histeroscopiademonstrou ser um procedimento não agressivo e que, provavelmente não prejudique a fertilidade, comodemonstrado por Gomes et al.,2003 (Rev. Bras. Reprod. Anim. v.28, n.4, p.287-288). Podemos concluirtambém que o número de espermatozóides interfere na resposta inflamatória e que a seleção espermática porPercoll não minimiza a reação inflamatória pós-inseminação. Apoio: FAPESP

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EFEITO DO TOURO NA TAXA DE PERDA DE GESTAÇÃO EM VACAS HOLANDESAS LACTANTES

Lima, F.S.1; Vasconcelos, J.L.M.1; Garcia, P.H.2

1DPEA – FMVZ/UNESP, Botucatu SP, 18600-000; 2Fazenda São João, Inhaúma, [email protected]

Vacas mais produtivas são as que apresentam maior produção de leite por dia de intervalo entre partos. Ataxa de perda de gestação entre os dias 28 e 98 em vacas Holandesas é aproximadamente 20%(VASCONCELOS et al., Biol. of Reprod., suppl.1; v.56; p.140; 1997). O objetivo deste trabalho foi avaliarse raça do touro ou touro influenciam a taxa de perda de gestação. Este estudo foi realizado na Fazenda SãoJoão, Inhaúma, MG (janeiro e fevereiro de 2004), e foram utilizados dados de 279 vacas (25,3 ± 8,94 Kgde leite/dia e 259,9 ± 152,30 dias pós-parto no dia da IA) gestantes de 3 touros da raça Gir (201 gestações)e dois touros da raça Holandesa (78 gestações), diagnosticadas gestantes por ultra-sonografia entre os dias28 e 35 após a IA e submetidas a novo diagnóstico de gestação, por palpação retal, entre os dias 70 e 84após a IA. Foi considerada perda de gestação quando as vacas foram observadas em estro ou diagnosticadasvazias na palpação retal. Os dados foram analisados pelo GLM, sendo incluídas no modelo as variáveistouro, raça do touro (Gir vs. Holandês), dias pós-parto, produção de leite nos sete dias anteriores à IA,ordem de lactação, tipo de inseminação (IATF vs. IA 12 horas após a detecção do estro). Não foi detectadoefeito de raça do touro na taxa de perda de gestação (15,38 ± 3,93% para touros Holandeses vs. 13,43 ±2,45% para touros Gir). É interessante observar que foi detectado efeito de touro (P<0,05) na taxa de perdade gestação, sendo que os touros da raça Gir apresentaram taxa de perda de gestação de: 18,6 ± 5,24%(touro 1); 8,1±3,99% (touro 2) e 15,47 ± 3,75% (touro 3) e os touros da raça Holandesa: 10,0 ± 4,44%(touro 1) e 33,3 ± 8,10% (touro 2). Não foi detectado efeito do tipo de inseminação (16,9 ± 3,45% naIATF vs. 17,2 ± 2,95% na IA 12 horas após detecção estro) na taxa de perda de gestação. As variáveis diaspós-parto, produção de leite nos sete dias anteriores à IA e ordem de lactação também não influenciaram aperda de gestação. Estes dados indicam que alguns touros têm maior efeito na manutenção da gestação,independente da raça. Estes touros devem ser detectados e utilizados estrategicamente para aumentar a taxade parição de vacas Holandesas lactantes.

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EFEITO DO TOURO NA PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS GIROLANDO

Brum, D.S.1,2; Leivas, F.G.1; Palma, G.A.2,3; Olivier, N.2

1 Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária, UFSM, Santa Maria, RS, Brasil. 2 Embryo Tech,Carmelo, Uruguay. 3 Reprobiotec, 7600 Mar del Plata, Argentina. [email protected]

A Raça Gir é de grande importância para a produção de leite em países tropicais, sendo que a utilização daprodução in vitro de embriões (PIV) , pode aumentar a intensidade de seleção da raça, além de encurtar ointervalo entre gerações. Este estudo teve como objetivo avaliar a eficiência do sêmen de seis reprodutoresda raça Gir na PIV. Neste trabalho foram realizadas 4 repetições, os oócitos (n=5256) foram obtidos atravésda punção de folículos com diâmetro entre 2-8mm de ovários de vacas Holandesa abatidas em frigorífico,sendo descartados apenas os oócitos degenerados. A maturação in vitro (MIV) foi realizada em 400µl demeio MPM + rFSHh+ 5%SVE, por 24h em estufa com 5% de CO2 em ar, 39°C e umidade saturada. Osêmen após descongelado foi submetido a gradientes de Percoll (30,60,90%), sendo a fecundação in vitro(FIV) com 1 x 106 espermatozóides/ml. A FIV foi realizada em meio FERT TALP, adicionado de BSA,piruvato e 10µg de heparina/ml , por um período de 18-22h, nas mesmas condições atmosféricas da MIV. Ocultivo in vitro (CIV) foi conduzido em meio CR1 com 10% de soro de vaca em estro (SVE) por 6 dias emestufa com 5% de O2, %5 de CO2, 39°C e umidade saturada. Os índices de clivagem (D2) e blastocistos(D7), considerando dia zero (D0) o dia da fecundação foram analisados pelo teste do qui-quadrado. Astaxas de clivagem foram de 74% (401/540), 55% (843/1519), 51% (1003/1954); 48% (225/466); 42%(204/484) e 26% (77/293) para T1, T2, T3, T4, T5 e T6, respectivamente, sendo semelhante entre ostouros T3 e T4, assim como entre T4 e T5, diferindo entre os demais. Os índices de desenvolvimentoembrionário foram de 25%, 11%, 16%, 10%, 6% e 6% para os touros T1, T2, T3, T4, T5 e T6,respectivamente. O desenvolvimento embrionário foi semelhante apenas entre os touros T2 e T4 e T5 e T6,evidenciando o efeito do touro nos índices de produção. Os resultados obtidos neste trabalho sugerem quereprodutores destinados a programas de produção in vitro de embriões devem ser previamente testados, afim de se otimizar os índices de produção embrionária.

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AVALIAÇÃO DE DIFERENTES TÉCNICAS DE INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL EMÉGUAS UTILIZANDO UM BAIXO NÚMERO DE ESPERMATOZÓIDES

Leão, K.M.1; Puoli Filho, J.N.P.2; Alvarenga, M.A.1

1Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária, 2Departamento de Produção eExploração Animal, FMVZ/UNESP, Botucatu-SP, 18618-000, Brasil. [email protected]

Existe um grande interesse no desenvolvimento de técnicas que possam melhorar os índices de fertilidade emeqüinos, com a utilização de um pequeno número de espermatozóides, principalmente para a aplicação dosêmen congelado. O objetivo deste trabalho foi avaliar a taxa de fertilidade obtida utilizando diferentes técnicasde inseminação artificial e um baixo número de espermatozóides. Foram utilizadas vinte éguas, sendo asmesmas inseminadas em todos os seguintes grupos: Grupo I (GI; n=20), inseminação convencional (corpodo útero); Grupo II (GII; n=20), inseminação na extremidade do corno uterino ipsilateral à ovulação; GrupoIII (GIII; n=20), inseminação histeroscópica, com a deposição do sêmen sobre a junção útero-tubáricaipsilateral à ovulação, com auxílio de um colonoscópio; Grupo IV (GIV; n=20), inseminação intrafolicular,através de um sistema para ultra-sonografia trans-vaginal, munido de agulha descartável, em que por manipulaçãoretal o ovário era posicionado até que o folículo aparecesse na linha de punção no monitor do ultra-som eentão o fundo de vagina era perfurado e o sêmen depositado dentro do folículo pré-ovulatório; Grupo V(GV; n=20), inseminação intraperitoneal, através do mesmo equipamento utilizado no GIV, onde o ovário eraposicionado sob a linha de punção e após perfurado o fundo de vagina, o sêmen foi depositado sobre oovário. As inseminações de GI, GII, GIII e GIV foram realizadas com 20x106 espermatozóides móveis(0,5mL), oriundos do sêmen congelado de um único garanhão. O sêmen era descongelado a 46oC/20 segundos.As inseminações de GV eram realizadas com 100x106 espermatozóides móveis (2,0mL), oriundos do sêmenfresco do garanhão utilizado nos demais grupos. Após a colheita o sêmen era diluído 1:1 com meio Emcare(ICPbio Limited, Auckland, Nova Zelândia) centrifugado (10 minutos/600g) e o pellet final ressuspendidocom meio Emcare para uma concentração final de 50x106/mL. Quando os folículos atingiam 35mm dediâmetro, as éguas recebiam uma aplicação endovenosa de 2500UI de hCG (Vetecor, Callier, São Paulo-SP, Brasil), sendo que após 30 horas da indução da ovulação o controle folicular era realizado a cada seishoras. As inseminações de GI, GII e GIII eram realizadas assim que detectado as ovulações, e nos gruposGIV e GV quando detectávamos a proximidade da ovulação. Pelo fato das éguas utilizadas terem sidoinseminadas em todos os grupos experimentais, utilizou-se do teste estatístico de Cochran para comparar asporcentagens de prenhez entre os grupos. As taxas de prenhez de GI, GII e GIII foram respectivamente de15%, 40% e 45%. A despeito da diferença numérica não houve diferença estatística entre GI, GII e GIII.Nos grupos GIV e GV nenhuma gestação foi observada. Concluímos que as inseminações histeroscópica ena extremidade do corno uterino são eficientes quando se utiliza uma baixa dose de sêmen congelado degaranhões e que mais estudos são necessários para determinar os motivos do insucesso e aprimoramento dastécnicas de inseminação intrafolicular e intraperitoneal.Apoio: FAPESP

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EFEITO DE DIFERENTES COMPONENTES SANGÜÍNEOS NAMOTILIDADE ESPERMÁTICA EQÜINA.

Araújo, E.B.1; Silva, J.F.S.1; Souza, G.V.1; Detmann, E.2; Cunha, I.C.N.1;Fagundes, B.1; Carvalho, C.S.P.1

1 Laboratório de Melhoramento Genético Animal – Biotecnologia do Sêmen - CCTA/UENF Campos dosGoytacazes – RJ 28013-602 Brasil 2 Laboratório de Engenharia Agrícola - CCTA/UENF Campos dos

Goytacazes – RJ 28013-602 Brasil e-mail: [email protected]

A hemospermia ou hematospermia é caracterizada pela presença de sangue no sêmen dando-lhe um aspectoachocolatado, rosado ou mesmo avermelhado. O efeito da hemospermia em programas de reprodução sãodevastadores, e garanhões com sangramento evidente no ejaculado são considerados inférteis ou altamentesub-férteis. Algumas patologias como danos no processo uretral, defeitos vasculares no trato genital, cálculosprostáticos ou de ductos ejaculadores, obstrução dos ductos deferentes e vesículas seminais, cistos prostáticosou de condutos deferentes, carcinoma de células escamosas e infecções bacterianas aparentemente causadaspor Streptococcus ssp., E. coli e Pseudomonas aeuroginosa têm como conseqüência a hemospermia.Portanto, pelo fato da hemospermia estar presente numa grande variedade de patologias que afetam o aparelhoreprodutor masculino e causar sérios problemas na fertilidade do garanhão é que foi escolhido este tema depesquisa. O objetivo é o de identificar o componente sanguíneo que causa a diminuição da motilidade e emqual concentrações sanguíneas este efeito começa a ser observado. Neste estudo utilizou-se sangue e sêmende 2 garanhões. Após serem processados e misturados o sêmen foi analisado com relação a motilidade totale a progressiva utilizando o programa HTM-Ceros versão 10.8 da Hamilton Tom Research (HTR). Asanálises estatísticas mostraram que a adição dos componentes sangüíneos causou diminuição da motilidadeespermática com relação ao grupo controle, exceto no momento 4, 6 e 7 do segundo garanhão analisado,possivelmente pela redução do volume ejaculado ou inconsistência dos dados analisados de forma objetivadevido a presença das hemácias. Os componentes sangüíneos (sangue total, hemácias, plasma, soro, sorodecomplementado e soro decomplementado sem IgG) adicionados mostraram-se na análise estatísticasignificativa redução da motilidade no momento 0 com a adição de 10 % de todos os componentes comparadoscom a adição de 1%. A adição do sangue total e das hemácias no momento 0 mostraram maior efeito naperda da motilidade comparado com o soro decomplementado e soro decomplementado sem IgG. Nestetrabalho foram verificados que a adição do sangue total e das hemácias mostraram maior efeito na perda damotilidade comparado aos demais componentes e a adição destes na concentração de 10% foi a que apresentoumaior efeito. Até o momento não foram realizados testes visando identificar quais substâncias poderiamminimizar os efeitos deletérios do sangue.

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AVALIAÇÃO ESTRUTURAL E FUNCIONAL DA CÉLULA ESPERMÁTICA EQÜINAFRENTE A DIFERENTES SUBSTÂNCIAS CRIOPROTETORAS

Neves Neto, J. R.1; Fernandes, C.B.2; Landim-Alvarenga, F.C.2; Papa, F. O.2

1Universidade Paulista-UNIP. 2Departamento de Reprodução Animal e Radiologia VeterináriaFMVZ/UNESP – Botucatu – SP – Brasil

Muitas são as substâncias crioprotetoras utilizadas para a congelação do sêmen eqüino. O objetivo desteestudo foi comparar dois crioprotetores, o glicerol (G) a Dimetil-formamida (DF) e a associação entre estesatravés de diferentes metodologias de avaliação laboratorial: Avaliação da integridade de membrana plasmática(IM), análise ultra-estrutural do espermatozóide (UE), teste de ligação à monocamada de células de ovidutoeqüino (LO) e ensaios de fertilização em oócitos homólogos, livres de zona pelúcida (EF). Para a congelaçãodo sêmen, trinta e dois ejaculados de quatro garanhões, entre 4 e 10 anos de idade foram processados nosdiluidores: (1) FR-4 com 4% DF (Theriogenology, v.58 p. 273-276, 2002), (2) BME-adaptado com 5% deG (In: Society for Theriogenology 1998; Baltimore, p. 140-141) e (3) MP-50 com 3% de G mais 2% de DF(Vet. Bras. Reprod. Anim., v.26, n.3, 2002). Para avaliar a fertilidade, sessenta inseminações foram feitascom sêmen congelado utilizando os mesmos três diluidores. Após as colheitas, o sêmen foi envasado empalhetas de 0,5 ml com concentração de 100 x 106 de espermatozóides totais, congelado, e armazenado emnitrogênio liquido. O sêmen foi descongelado a 40°C por 30 segundos e avaliado nas diferentes metodogiaslaboratoriais. O diluidor MP-50 foi superior (p<0,05) em relação aos diluidores FR-4 e BME-adaptadopara, IM (55,4%, 44,5% e 43,7%) e em relação ao FR-4 para EF (81,25%, 98,75% e 39,58%); e similarpara UE (47%, 35% e 49%) e LO (82%, 73% e 63%) respectivamente. Para avaliar as taxas de prenhezcom sêmen congelado, foram utilizados vinte ciclos estrais por grupo, inseminados com 400 x 106

espermatozóides totais, antes e após a detecção da ovulação através de palpação retal e ultra-sonografia. Ataxa de prenhez para as éguas inseminadas com MP-50 (60%, 12/20) apresentou tendência a superioridadeem relação aos diluidores BME-adaptado (45%, 9/20) e FR-4 (40%, 8/20). Baseado nas metodologias deavaliação laboratorial e fertilidade à campo, a associação do glicerol mais dimetil-formamida mostrou seruma alternativa para a criopreservação do espermatozóide eqüino.Pesquisa financiada pela Fapesp.

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EFICIENCIA DE NOVO DILUENTE NA CONGELABILIDADE DE SÊMEN BOVINO

Alberti, K.1; Carmo, M.T.1; Oba, E.1; Mendonça, A.L.Z.1; Souza, D.B.1; Dell’Aqua Jr.,J.A.1; Vianna, F.P.1; Papa, F.O.1

1Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária, FMVZ – UNESP – Botucatu, [email protected]

Os bovinos por se tratarem de animais de produção, movimentam uma indústria altamente eficiente movidapor números, desta forma quaisquer avanços em seus índices refletem um grande retorno aos investimentosiniciais. A congelação de sêmen na espécie bovina apresenta resultados satisfatórios há muito tempo, assimsendo poucas modificações foram efetuadas em sua metodologia no decorrer dos anos. Diluidores quepromovam boa congelabilidade e tragam resistência aos espermatozóides podem contribuir para melhorestaxas de fertilidade. O objetivo deste trabalho foi comparar a eficiência de uma nova proposta de diluidordenominado de MC desenvolvido na área de Reprodução Animal da FMVZ-UNESP-Botucatu-SP, com odiluidor convencional glicina-gema (MG) (BICUDO et al., anais V SIRA, 173-179, 1993) em relação acongelabilidade e resistência espermática com sêmen de bovinos. Dezenove ejaculados de treze touros daraça nelore (Bos taurus indicus) foram submetidos a congelação utilizando-se os diluidores: glicina gema(MG) e o diluente MC composto basicamente de açucares, aminoácidos, soluções tampões, OEP (ovus estpaste) e gema de ovo. Os ejaculados foram divididos em duas alíquotas e diluídos no meio I (sem crioprotetor)de ambos diluentes (MG e MC), posteriormente o volume obtido foi dobrado com a diluição do meio II(com crioprotetor) dos mesmos diluentes e envasado em palhetas francesas de 0,5 mL. As palhetas foramsubmetidas à estabilização em geladeira a 5oC/4h, em seguida levadas à caixa de isopor permanecendo por20 minutos a 3 cm acima do nível do nitrogênio liquido e finalmente submergidas no nitrogênio. As amostrasforam descongeladas a 46oC/20 segundos e tiveram seus parâmetros avaliados por meio da análisecomputadorizada (CASA) e a integridade da membrana plasmática aferida pelo microscópio de epi-fluorescência. Estas palhetas foram lacradas e submetidas ao teste de termorresistência rápido (TTR) a46oC/30 minutos (ARRUDA et al., Braz. J. Vet. Res. Anim. Sci.,v.29, n.1, p.131-137, 1992) e após esteperíodo tiveram seus parâmetros novamente aferidos. A análise estatística foi efetuada pelo teste de Tuckey,havendo significância quando p<0,05. Os resultados mostraram haver diferença estatística pós-descongelaçãoentre os meios MC e MG quanto aos parâmetros: VAP (74±11 vs. 63±8), VSL (60±7 vs. 55±8) e VCL(116±29 vs. 90±18), entretanto a motilidade total (60±14 vs. 56±14), motilidade progressiva (44±10 vs.41±11) e a integridade de membrana através da fluorescência (41±1 vs. 38±3) não apresentaram diferençaestatística entre seus valores. Durante o TTR o diluente MC promoveu uma proteção significativa aosespermatozóides em relação a motilidade total (50±22 vs. 30±22) e a motilidade progressiva (40±22 vs.20±16) quando comparado ao MG respectivamente. O presente trabalho demonstrou que o diluente MCapresentou uma melhor taxa de resistência dos espermatozóides após o TTR quando comparado ao MG,podendo estes resultados contribuir na melhora dos índices de fertilidade em programas de IA com sêmencongelado bovino. Apoio: FAPESP.

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RECONGELAÇÃO DO SÊMEN DE GARANHÕES PANTANEIROS

Zúccari, C.E.S.N.1; Nunes, D.B.2; dePaula, F.A.L.3; Ferreira, C.S.3; Costa e Silva, E.V.4

1Departamento de Produção Animal – UFMS, Cx Postal 549, CEP: 79070-900. Campo Grande - MS;2Mestranda em Ciência Animal – UFMS; 3Bolsista Iniciação Científica/CNPq – UFMS; 4Departamento

de Medicina Veterinária – UFMS. [email protected]

As doses de sêmen eqüino congelado possuem, em geral, uma concentração de 400x106 espermatozóides/ml. Contudo, para inseminações sobre ou ao redor da papila útero-tubárica, concentrações bem inferiorestêm sido usadas com sucesso. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a taxa de recuperação da motilidadee de células íntegras após submeter o sêmen ao fracionamento e a recongelação. Foram analisados 45ejaculados provenientes de seis garanhões da raça Pantaneira, sendo 26 congelados com o diluidor Merck e19 com meio M-9, em palhetas de 0,5 ml. As amostras foram descongeladas a 37°C/30 segundos e apóscerca de 15 minutos, re-envasadas em palhetas de 0,25 ml e submetidas a dois tratamentos: TMTI – colocadasdiretamente no vapor de N2 líquido / 20 minutos seguida de imersão e; TMTII – mantidas por 1 hora sobrefrigeração a 5°C, antes da recongelação conforme o mesmo procedimento do primeiro tratamento. Asvariáveis analisadas pós-1a. descongelação foram motilidade espermática (MOT1) e percentagem de célulascom membrana plasmática íntegra (INT1), avaliada pela coloração com diacetato decarboxifluoresceína+iodeto de propídio. Após a 2a. descongelação, além da MOT2 e INT2, calculou-se astaxas de recuperação da motilidade (RMOT) e do percentual de espermatozóides íntegros (RINT), utilizando-se uma regra de três simples. Os dados foram transformados em arcoseno (X/100) antes de serem submetidosà análise de variância utilizando o procedimento GLM do SAS, considerando como variáveis fixas: Tratamento(TMT I e II), Garanhão (G1...G6), Diluidor (D1 e D2) e a interação TMT*D. As médias foram comparadaspor teste t de Student. Foi observado efeito de garanhão (p<0,05) para todas as variáveis estudadas e dediluidores (p<0,05) para MOT1, MOT2, INT2 e RINT. Não houve efeito significativo (p>0,05) da interaçãoTMT*D em nenhuma das variáveis estudadas. A motilidade e percentagem médias de íntegros a 1a.descongelação foram de 39,56 ± 1,14% e 35,22 ± 1,13%, respectivamente. A motilidade e percentagemmédias de espermatozóides íntegros alcançadas para os diferentes tratamentos foram significativamente maiores(p<0,05) para o TMTII: MOT2 = 12,00 ± 1,00 vs 14,78 ± 0,94% e INT2 = 9,69 ± 0,64 vs 13,44 ±0,86%, para os tratamentos I e II, respectivamente. A taxa de recuperação da motilidade e do percentual decélulas íntegras foi significativamente superior (p<0,05) para o TMTII: RMOT = 29,85 ± 1,76 vs 37,54 ±1,91% e RINT = 30,19 ± 2,61 vs 41,75 ± 3,13%, para os tratamentos I e II, respectivamente. De acordocom os resultados conclui-se que a refrigeração do sêmen pré-recongelação foi benéfica para a preservaçãoda qualidade seminal pós-2a. descongelação e resultou em melhor taxa de recuperação da motilidade.Palavras-chave: criopreservação; eqüino; sêmen

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CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN DE Leopardus tigrinus : COMPARAÇÃOENTRE DOIS CRIODILUENTES.

Tebet, J.M.1; Martins, M.I.M.1,2; Chirinea, V.H.1; Souza, F.F.1,3; Adania, C.H.4; Lopes, M.D.1

1 Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária – FMVZ/UNESP, Botucatu,SP, 18618-000. 2 UEL, Londrina, PR. 3 UNIRP, S.J. Rio Preto, SP. 4 Associação Mata Ciliar,

Jundiaí, SP. [email protected]

O sêmen criopreservado de felinos selvagens tem mostrado baixa eficiência quando utilizado em biotécnicasreprodutivas, principalmente devido aos danos sofridos durante o resfriamento até 5ºC (Pukazhenthi et al.,Biol. Reprod., 61, 135-41, 1999) e pela ação tóxica dos crioprotetores (Nelson et al., Theriogenology, 51,290, 1999). Neste trabalho, com auxílio do teste de Wilcoxon, comparamos a eficiência de dois diluentescom diferentes concentrações de crioprotetores, o TEG (tris-gema, SDS, 7% glicerol) e o MP-50 (3%glicerol, 2% dimetilformamida) (Papa et al., Rev. Bras. Reprod. Anim, 26, 184-5, 2002) para congelarsêmen de gato-do-mato-pequeno (Leopardus tigrinus, n=5, 15 ejaculados), utilizando uma curva lenta deresfriamento (0,4ºC/min). O sêmen foi colhido por eletroejaculação (Howard et al., J. Androl., 11, 204-15,1990), avaliado para motilidade, vigor, concentração e morfologia espermática em microscopia óptica (Popeet al., J. Zoo Wild. Med., 22, 87-95, 1991) e de transmissão. O volume foi dividido em duas alíquotas queforam centrifugadas (300g/10min) e os pellets diluídos nos criodiluentes (20 x 106 espermatozóides/mL). Osêmen acondicionado em palhetas (0,25 mL) foi mantido sob refrigeração por 60 minutos, permaneceu emvapor de nitrogênio (6 cm da coluna) por 20 minutos e foi imerso. Após a descongelação (42ºC/15 seg), foireavaliado. Não houve diferença estatística entre a eficiência dos diluentes (p=0,05). A queda média namotilidade foi de 55% e de 34,7% no vigor espermático, com elevação de 52% na incidência de defeitosmaiores, especialmente relacionados a alterações de acrossomo. A avaliação ultraestrutural dosespermatozóides confirmou lesões em acrossomo em diferentes graus decorrentes da criopreservação. Aalta taxa de contaminação dos ejaculados com urina (53%) somada ao tempo de exposição aos crioprotetoresdurante o equilíbrio foram prováveis fatores relevantes para o agravamento das lesões acrossômicas.Apoio: CNPq e FAPESP.

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TEMPERATURA RETAL, ESCROTAL E INTRATESTICULAR E DENSIDADE DEGLÂNDULAS SUDORÍPARAS EM ESCROTO DE BÚFALOS (Bubalus bubalis).

Satrapa, R.A.1; Satrapa, R.2; Diniz, E.G.2; Beleti, M.E.2; Eberhardt, B.G.1

1Médico Veterinário – Av. Petrarca Bachi, 213 Vila Maria Botucatu – SP [email protected] .2Professor adjunto IV da Faculdade de MedicinaVeterinária da Universidade Federal de Uberlândia.

Para a maioria dos mamíferos adultos a temperatura testicular é mais baixa que a corporal, o que garante umambiente térmico adequado para o curso normal da espermatogênese (MACDONALD, Theor. Biol., v.145, n. 4, p. 430). O mecanismo de termorregulação testicular envolve a participação do plexo pampiniforme,do escroto com suas glândulas sudoríparas e sua túnica dartos (DAHL, E. V., Surg. Gynec. Obstet., v. 108,p. 697-705). Objetivou-se determinar as temperaturas retal (TR), escrotal (TE) e intratesticular (TI) e onúmero de glândulas sudoríparas em escroto de búfalos. Foram utilizados 52 búfalos da raça Murrah, separadosem 2 grupos de igual número, sendo o grupo I constituído de animais com idade de 12 a 15 meses e o grupoII de 18 a 24 meses, criados extensivamente. As determinações das TR foram feitas com termômetro clínicoe as TE e TI com termômetro digital. Para identificação histológica das glândulas sudoríparas, preparou-selâmina de um fragmento de pele da região distal do escroto de cada animal coradas por hematoxilina-eosinae examinadas em microscopia óptica (número de glândulas por mm linear de epitélio). Os dados foramanalisados através do teste t de student. A média (±desvio padrão) da TR, TE e TI do grupo I foi 38,63°C±0,44,35,67°C±0,80 e 36,90°C±0,85, respectivamente e para o grupo II, 39,12°C±0,65, 36,03°C±0,96 e37,73°C±0,74, respectivamente. As TR, TE e TI foram diferentes (p<0,05) dentro de cada faixa etária, bemcomo entre elas, exceto para a TE entre as duas faixas (p=0,25). A média do número de glândulas sudoríparasdo grupo I (1,14) foi diferente (p<0,05) da do grupo II (1,42). Conclui-se que: a TE e TI foram inferiores àTR nos dois grupos estudados; o número de glândulas sudoríparas no escroto dos animais do grupo II foimaior.

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CIRCUNFERÊNCIA ESCROTAL EM CARNEIROS DA RAÇA SANTA INÊS EM DEZCATEGORIAS DE IDADE E SUA RELAÇÃO COM PESO CORPORAL, IDADE E

MEDIDAS CORPORAIS

Bittencourt, R.F.1; Chalhoub, M.1; Alves, S.G.G.; Portela, A.P.M.1; Almeida, A.K.1;Biscarde, C.E.A.1; Freitas, D.S.1; Ferreira, A.B.C.2; Ribeiro Filho, A. de L.1

1Escola de Medicina Veterinária – UFBA, Salvador-BA, 40170-110, Brasil. 2Veterinário autônomo. E-mail: [email protected]

Diversos estudos têm demonstrado a importância da utilização da circunferência escrotal (CE) como critériona seleção de reprodutores. Esta característica apresenta correlações significativas com parâmetrosespermáticos, além disso, verifica-se que animais mais precoces tendem a apresentar maiores CE, fatocomprovado pela correlação significativa entre CE e a idade a puberdade em carneiros da raça Santa Inês.Deve-se considerar também, que ao usar a CE como critério de seleção estar-se-á agregando as próximasgerações esse atributo, e consecutivamente todas as características reprodutivas e produtivas que apresentamafinidades genéticas com a mesma, considerando ser esta uma característica de boa herdabilidade. Foramcoletados os dados de circunferência escrotal (CE), peso corporal (PC) e as medidas corporais, altura degarupa (AG), altura de cernelha (AC), comprimento corporal (CC) e perímetro torácico (PT) de 415 carneirosda raça Santa Inês, de várias idades, apresentados em exposições entre 2002 e 2004. O objetivo desseestudo foi observar as médias e desvios padrão para as variáveis estudadas nas diferentes faixas etárias, etambém verificar a relação entre CE e PC e entre CE e as medidas corporais em diferentes categorias deidade, através de uma análise de correlações entre essas características. Observaram-se, também, correlaçõessimples entre CE x PC e CE x idade, considerando-se a população como um todo. As categorias, em meses,foram: 4-6 (C1), 6-8 (C2), 8-10 (C3), 10-12 (C4), 12-15 (C5), 15-18 (C6), 18-24 (C7), 24-30 (C8), 30-36 (C9) e acima 36 (C10). Para a análise estatística das características avaliadas, foi empregado o pacoteestatístico Statistical Analysis System (SAS) – versão 6.1. As médias e desvios padrão para a CE (cm),nas dez categorias, foram 28,44 ± 3,77 (C1), 31,41 ± 2,49 (C2), 32,26 ± 1,76 (C3), 32,86 ± 2,39 (C4),33,43 ± 2,33 (C5), 33,33 ± 2,67 (C6), 34,38 ± 2,60 (C7), 34,65 ± 2,21 (C8), 35,04 ± 1,85 (C9), 36,19± 2,8 (C10). As correlações entre CE e PC foram significativas nas categorias C1 (r=0,42; P<0,05), C2(r=0,41; P<0,01), C5 (r=0,40; P<0,01), C6 (r=0,52; P<0,0001), C7 (r=0,35; P<0,05), e C10 (r=0,64;P<0,005) e as correlações simples entre CE x PC e CE x idade, considerando-se todos os animais estudados,foram respectivamente r=0,63 (P<0,001) e r=0,49 (P<0,001). A utilização da CE na predição da PC,para a seleção de reprodutores ovinos pode ser recomendada nas categorias C1, C2, C5, C6, C7 e C10.As correlações simples entre a CE e CC, AC, AG e PT para toda a população foram respectivamente,r=0,49; r=0,56; r=0,54 e r=0,61 (p< 0,0001). Com base na correlação significativa entre CE e PC emalgumas categorias de idade, conclui-se que ao utilizar-se a CE como um dos critérios de avaliação decarneiros da raça Santa Inês, será favorecida a seleção de animais com alto ganho de peso e com melhorpotencial reprodutivo. Esse estudo também mostrou a existência de uma alta correlação entre CE e asmedidas corporais, o que significa que animais com maior CE apresentam um maior potencial produtivo ereprodutivo.

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IDENTIFICAÇÃO DE CÉLULAS DE LEYDIG EM TESTÍCULO DE CAPIVARA(Hydrochoerus hydrochaeris) ATRAVÉS DA LOCALIZAÇÃO DE SÍTIOS DE

AÇÃO DA AROMATASE CITOCROMO P450

Batalha, L.M.1; Oba, E.2; Laufer Amorim, R.3

1- PUCPR, Rod. BR376, km14, Costeira, Cx. Postal 129 CEP83010-500, São José dos Pinhais, PR,Brasil. [email protected]; 2- Department of Animal Reproduction and Veterinary Radiology, FMVZ/

UNESP Botucatu, Distrito de Rubião Jr, s/n, SP, CEP18618-000; 3- Centro Universitário de São José doRio Preto

Em esfregaço testicular de capivara obtido através de citologia aspirativa com agulha fina, observamos apresença de grande quantidade de células arredondadas uniformes, não - identificadas. Estas células, emboraainda não descritas, apresentavam-se morfologicamente muito semelhantes entre si, com núcleos isoladosde contorno regular, contendo um ou dois nucléolos, cromatina finamente granular com pontos decondensação distribuídos regularmente; o núcleo mostrava-se aproximadamente três vezes menor que o dacélula de Sertoli. Sugerimos, na ocasião, que as células não - identificadas pertencessem à populaçãopresente no interstício, baseado em estudos que descrevem a proporção de interstício X túbulos seminíferosem capivaras. Suspeitamos serem estas células de Leydig, mas não pudemos identificá-las com segurançapelas diferentes morfologias apresentadas por esta em diferentes espécies, e pelo seu conteúdo citoplasmáticocom grânulos de colesterol, que pode ser degradado pelo método de coloração. Para caracterizar estascélulas como Leydig, utilizamos a técnica de imunoistoquímica para coloração de sítios de atividade daenzima microsomal aromatase citocromo P450; esta se localiza no retículo endoplasmático liso e catalisa aconversão de andrógenos em estrógenos. Blocos de parafina com fragmentos de testículo serviram comobase para obtenção de cortes, e o material foi preparado segundo protocolo utilizado no Laboratório deImunoistoquímica do Departamento de Patologia Veterinária da FMVZ, UNESP / Botucatu. Para execuçãoda técnica, foi utilizado anticorpo policlonal de coelho anti - aromatase placentária humana citocromo P450

(Hauptman Woodward Medical Research Institute, Inc. Buffalo, New York ). As lâminas foram montadascom lamínulas utilizando-se o Permount (Fisher Scientific – cod. UN1294), e avaliadas quanto aimunomarcação em aumentos de x100 e x400. A técnica de imunoistoquímica permitiu caracterizar ascélulas de Leydig presentes no interstício testicular pela precipitação de imunocomplexos no citoplasma dasmesmas. Estas apareceram em grande quantidade formando uma massa quase compacta entre os túbulosseminíferos. As células imunopositivas apresentaram diferença de intensidade de marcação, o que pode serexplicado pela diferença de atividade celular no momento da fixação ou pela modulação da atividade destascélulas pela atividade das células do epitélio seminífero adjacente. Houve precipitação de imunocomplexona membrana do túbulo seminífero, e esta constitui reação inespecífica, já que o anticorpo utilizado é policlonal.Suporte Financeiro: FAPESP

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MASSA MOLAR DAS PROTEÍNAS DE PRÓSTATA E GLÂNDULA DE COAGULAÇÃODE CAPIVARA (Hydrochoerus hydrochaeris).

Batalha, L.M.1; Oba, E.2; Souza, F.F. de3

1PUCPR, Rod. BR376, km14, Costeira, Cx. P. 129 - 83010-500, São José dos Pinhais, PR, [email protected]; 2Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária - FMVZ/UNESP,

Botucatu-SP, 18618-000, Brasil; 3Centro Universitário de São José do Rio Preto

Existe uma grande variação entre as diferentes espécies com relação à anatomia, biologia e função dasglândulas sexuais acessórias e, embora presente em todos os mamíferos, a próstata apresenta diferentescaracterísticas anatômicas e bioquímicas entre as espécies. Atualmente, a classificação estrutural destaconsiste em próstata ventral, dorsolateral, duas porções laterais, e glândula de coagulação, considerada umlobo adicional da próstata localizada anteriormente. A principal função do plasma seminal é servir comomeio de transporte e sustentação para os espermatozóides; o estudo deste fluido desperta interesse umavez que os diluidores seminais atuais tentam, de alguma forma, substituí-lo. Secreções prostáticas de cincoanimais, e de glândula de coagulação de oito animais foram colhidas, após incisão das mesmas, em nomáximo 15 minutos após o abate em matadouro comercial. As amostras foram acondicionadas em criotubos,identificadas e mantidas em nitrogênio líquido até o momento da avaliação. O protocolo para execução daeletroforese foi efetuado segundo o descrito por Souza & Lopes (Rev. Bras. Reprod. Anim., 26: 75-7,2002), utilizando-se uma concentração de 12% de poliacrilamida no gel de separação. As imagens dos géisforam digitalizadas (VDS - Image VDS – Amersham Biosciences), e um programa analisador de imagens(Gel Pro-Analyzer v. 3.0 - Amersham Biosciences - Departamento de Física e Biofísica, Instituto deBiociências, UNESP, Botucatu, SP) foi utilizado para determinar o peso molecular para cada banda decada amostra no gel. Os géis foram montados entre papel celofane permeável com gelatina incolor, sobreuma placa de vidro. As análises indicaram um total de 42 bandas, variando de 250 a 10 kDa, na secreçãode glândula de coagulação e apenas 10 (63 kDa, 41 kDa, 31 kDa, 24 kDa, 21 kDa, 19 kDa, 17 kDa, 15kDa, 14 kDa e 11 kDa) estavam presentes nas oito amostras. A quantidade de bandas nas amostras variouentre 22 e 31. Na próstata foram identificadas 37 bandas de proteína e 14 (53 kDa, 49 kDa, 39 kDa, 35kDa, 34 kDa, 33 kDa, 31 kDa, 29 kDa, 24 kDa, 22 kDa, 19 kDa, 17 kDa, 16 kDa e 13 kDa) apareceramem todas as amostras. A quantidade de bandas nestas amostras variou entre 26 e 35. Acima do limitemáximo do marcador de peso molecular (250 kDa) foram observadas outras duas bandas para glândula decoagulação e uma banda para próstata. Abaixo do limite mínimo (10 kDa) do marcador de peso molecularforam encontradas outras 48 pequenas bandas em glândula de coagulação e 20 em próstata. A análisecomparativa entre as proteínas identificadas no gel de eletroforese da secreção de próstata e de glândula decoagulação de cada animal demonstrou não existir diferença significativa (p<0,05) na composição protéicadas secreções destas glândulas para cada animal, ou seja, a composição protéica da próstata é bastantesimilar à composição protéica da glândula de coagulação. Entre os animais a diferença de composiçãotambém não foi significativa. Estes resultados são os primeiros sobre descrição de perfil protéico de glândulade coagulação e próstata de capivara e servem como comparação para estudos futuros na espécie.Suporte Financeiro: FAPESP

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OTIMIZAÇÃO DO PROTOCOLO DE “POLIMERASE CHAIN REACTION” ( PCR )PARA SEXAGEM DE EMBRIÕES BOVINOS EM DIFERENTES ESTÁGIOS

DE PRÉ - IMPLANTAÇÃO

Polisseni, J.11111; Camargo, L.S.A.1; Sá, W.F.1; Machado, M.A.1; Ferreira, A.M.1;Oliveira, R. S.1; Ramos, A.1

1Embrapa Gado de Leite - Juiz de Fora - MG, 36038330, Brasil. - [email protected]

Objetivou-se elaborar um protocolo animal para estudo da sexagem de embriões bovinos, em diferentesestágios de desenvolvimento embrionário. Padronizou-se a técnica de PCR para avaliação da proporção dosexo dos embriões. Complexos cumulus-oócitos (CCOS), obtidos de folículos de ovários coletados deanimais abatidos, foram maturados in vitro, em meio TCM199, enriquecido com soro de vaca em cio eFSH, durante 24h, em 5% de CO2 a 38,8º C. Em seguida, foram fecundados in vitro, por 18h, com 2,0 x106 espermatozóides/ml obtidos através da técnica de swim up. Os possíveis zigotos foram colocados emmeio de cultivo definido, CR2aa, no mesmo ambiente atmosférico da maturação. Após a avaliação da taxade clivagem (n=78), e do desenvolvimento a estágio de blastocisto (n=44), 72h e 8 dias, respectivamente, osembriões foram colocados em contato com solução ácida Tyrode’s para a retirada da zona pelúcida. Emseguida os embriões foram lavados em meio PBS com 0,4% de BSA e congelados em tubos de PCR a -20ºC, contendo 11µl da solução tampão (PCR10X e 1,5mg/ml proteinase K). Para posterior realização dasexagem pela técnica de PCR, os tubos foram incubados a 50ºC, por 1h, visando a extração do DNA. Apósa digestão dos embriões, adicionou-se 9µl de uma mistura, contendo PCR10X, 25mM Mgcl2, 200µMdNTP, 1U taq polimerase e 0,5µM dos primers (Y=213pb e controle=269pb). O protocolo adaptado daEmbrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia utilizou como parâmetro 40 ciclos, consistindo de desnaturação,ligação dos primers e polimerização. Após o PCR, os produtos da amplificação foram submetidos aeletroforese em gel de poliacrilamida 8%, por 40 min a 500 voltes. Para melhor visualização da proporçãodos sexos, dividiu-se os embriões em grupos: grupo 1 = 2-8 células (n=61), grupo2 = 9-16 células (n=17) egrupo3 = blastocisto (n=44).Os resultados foram analisados pelo teste do Qui-quadrado. A proporção dossexos dos embriões, em diferentes estágios celulares, não diferiu entre os grupos 1, 2 e 3, apesar de parecerhaver uma tendência para detecção de um número maior de fêmeas (n= 37) no grupo1, e um número maiorde machos no grupo 3 (n= 24), quando comparado com os demais. Os resultados comprovam que o protocoloutilizado é tecnicamente viável, já que os dados da literatura relatam que, em experimentos in vitro, osembriões masculinos se desenvolvem a estágios mais avançados do que os embriões femininos (Avery, B.;Molecular Reproduction and Development, 32: 265- 270) , sendo necessário futuros estudos para oentendimento deste mecanismo, possivelmente influenciado por hormônios sexuais masculinos.

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AVALIAÇÃO DA VIABILIDADE IN VITRO DA MICROMANIPULAÇÃO DE EMBRIÕESBOVINOS PRODUZIDOS IN VIVO, VISANDO A IDENTIFICAÇÃO DO SEXO E A

OTIMIZAÇÃO DA TRANSFERÊNCIA DE EMBRIOES

Melo, L.F.1,2; Souza, R.V.2; Dode, M.A.N.2; Rumpf, R.2


900, Brasília-DF, Brasil. [email protected]

A micromanipulação de embriões envolve várias técnicas, entre elas a bissecção e a sexagem de embriões,assunto deste trabalho. O objetivo foi avaliar a viabilidade in vitro da bissecção e biópsia de embriõesproduzidos in vivo e cultivados individualmente em sistema WOW modificado (WOWm; Pereira et al.,2003) por 24 hs. O experimento foi realizado no Laboratório de Reprodução Animal da Embrapa RecursosGenéticos e Biotecnologia. Dez fêmeas cruzadas Simental x Nelore foram superovuladas quatro vezes, comintervalo de 60 dias entre as superovulações, segundo o protocolo de cio base induzido com reforço deProgesterona (CIDR®) e oito aplicações de FSH (PLUSET®) com doses decrescentes. As coletas foramrealizadas sete dias após a inseminação artificial e os embriões obtidos foram classificados segundo osparâmetros definidos pela IETS. Apenas os embriões Mc, Bi e Bl qualidade I foram utilizados nesteexperimento. Após a classificação, os embriões foram reunidos, lavados e mantidos em meio holding (DPBS+ 0,4%BSA) à temperatura ambiente, sendo distribuídos aleatoriamente em três tratamentos: T1 (controle);T2 (bipartido) e T3 (bipartido e biopsiado). A bissecção foi feita em gota de DPBS em placa de petri, como auxilio de um estéreomicroscopio, micromanipulador e lâmina própria. Os embriões e hemi-embriõesforam cultivados em gotas de 200 µl de meio SOFaaci , em placas de petri de 60 mm preparadas previamentecom o sistema WOWm, imerso em óleo de silicone em estufa à 39ºC, 5% de CO2

e umidade saturada por24 hs. A sexagem foi feita pela técnica da PCR (Polimerase Chain Reaction). Os resultados foram analisadospelo programa SigmaStat para Windows versão 3.0, Jandel Scientific Corporation, pelo teste de Qui-quadrado(χ2). Comparando T1, T2 e T3, as diferenças foram significativas quanto ao número de embriões degeneradosapós 24hs de cultivo (P≤0,001), considerando cada hemi-embrião como uma unidade embrionária (1, 25 e36, respectivamente). Não foram encontradas diferenças significativas quando comparados os tratamentosT2 e T3 (P=0,159). Quanto aos embriões e hemi-embriões que se desenvolveram após o cultivo em relaçãoao número de embriões iniciais, foi encontrado diferença entre T1 e T2 (69/70 e 92/60; P=0,081). Nãoforam encontradas diferenças entre os tratamentos T1 e T3 (69/70 e 83/60; P=0,195) e os tratamentos T2e T3 (92/60 e 83/60; P=0,752). Quanto a sexagem, não houve diferença entre a proporção macho e fêmea(28 e 19; P=0,35). Concluiu-se que a técnica da bissecção associada à biópsia e cultivo in vitro por 24 hsde embriões Mc, Bi e Bl de qualidade 1 podem contribuir para o aumento nos índices de transferência deembriões, além de possibilitar a identificação do sexo.Apoio financeiro: Embrapa/CNPq

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SEXAGEM FETAL EM OVINOS

Andrade, J.C.O.1; Guido, S.I.2; Sousa, B.P.A.1

1Av. Caxangá, 205, Sl 605, Madalena, Recife-PE, 50.610-230, Brasil. 2Programa de Pós-Grad. emCiência Veterinária/UFRPE, Recife-PE, Brasil. E-mail: [email protected]

A sexagem fetal por ultra-sonografia tem sido bastante aplicada em bovinos, através da identificação elocalização do tubérculo genital (TG). Todavia, em pequenos ruminantes tem sido implementada de maneiraincipiente. Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a acurácia da sexagem fetal em ovinos por ultra-sonografia transretal através da identificação e localização do TG. Receptoras Santa Inês (n=163), de umprograma de descongelamento de embriões da raça DORPER, foram submetidas ao diagnóstico de gestaçãoe posteriormente, a sexagem fetal (n=73). Para realização dos exames foi utilizando um aparelho Aloka SD500 equipado com um transdutor linear de 5,0 MHz acoplado a um cabo de PVC, para permitir seudirecionamento interno através de manipulação externa. Os animais foram contidos em estação e foi utilizadogel de contato para facilitar o exame. A determinação do sexo fetal foi realizada entre o 50º e o 72º dia degestação. Os fetos foram diagnosticados como machos quando o TG localizava-se imediatamente caudal aocordão umbilical e como fêmeas quando estava próximo a cauda, sendo posteriormente, confirmados aoparto. A taxa média de prenhez obtida foi de 44,8% (73/163). O sexo fetal foi determinado em todas asreceptoras (100%), sendo os diagnósticos corretos em 100% (38/38) dos fetos machos e em 94,3% (33/35) dos fetos fêmeas. Portanto, conclui-se que a sexagem fetal por ultra-sonografia transretal em ovinosapresenta uma elevada acurácia no período de gestação observado.

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UTILIZAÇÃO PRÉVIA DO PLUSET NA ASPIRAÇÃO FOLICULAR: IMPACTO NAPRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES EM VACAS Bos indicus

Blaschi, W.1; Andrade, E.R.1; Nonato Jr., I.2; Pontes, J.H.F.2; Ereno Jr., J.C.2;Uvo, S.2; Seneda, M.M.1

1Departamento de Clínicas Veterinárias , CCA, Universidade Estadual de Londrina, PR, 86051-990; 2InVitro Brasil – Central de Biotecnologia da Reprodução- Mogi Mirim -SP

A utilização do Pluset mostrou-se mais efetiva que Folltropin para a produção in vitro de embriões, considerandosua aplicação prévia à aspiração folicular (Nonato Júnior, Acta Sci Vet 2003; 31, 512). Baseado nestacitação, o objetivo deste trabalho foi avaliar o impacto da aplicação do Pluset antes da aspiração folicular,quanto ao número de oócitos e embriões produzidos in vitro. Foram realizadas 50 aspirações foliculares comutilização de Pluset e 44 sem o uso da gonadotrofina (Grupo Controle, GC). Todos as vacas utilizadas eramda raça Nelore (Bos indicus), aleatoriamente designadas para cada procedimento. Para sincronizar ocrescimento folicular, os folículos > 5 mm foram aspirados em um momento aleatório do ciclo estral denominadoDia Zero (D0). Após 24 horas (D1), procedia-se à aplicação do FSH, através de injeção intramuscular únicade 100 UI de Pluset. Depois de dois dias da aplicação do FSH (D3), procedia-se à nova aspiração folicular,sendo estes oócitos considerados para avaliar o impacto do FSH quanto ao número de embriões obtidos. OGC foi submetido à recuperação de oócitos em um estágio aleatório do ciclo estral. Nas vacas que receberamPluset obtêve-se um total de 740 oócitos e 216 embriões, com médias respectivas de 14,8 e 4,32. Osanimais do GC apresentaram totais de 810 oócitos e 238 embriões, com respectivas médias de 18,4 e 4,76.Não foi observado diferença na qualidade e nas médias de oócitos recuperados e de embriões produzidos invitro. De acordo com estes resultados, a utilização do Pluset não incrementou a produção in vitro deembriões em vacas Nelore. Estes dados são contraditórios a outros trabalhos presentes na literatura.Consideramos como provável explicação o fato deste trabalho ter sido conduzido com vacas zebuínas,contrastando com outros estudos realizados em gado europeu. De acordo com nossas observações, vacaszebuínas apresentam naturalmente maior número de folículos por onda, em comparação ao gado europeu.Talvez por este motivo o FSH tenha tido um impacto menor no crescimento folicular e conseqüentedisponibilização de oócitos para a produção de embriões. Ressalta-se que esses resultados são preliminares,e melhor uma avaliação destes resultados será possível com a continuidade dos trabalhos.

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PRÉ-SINCRONIZAÇÃO DE VACAS PARA COLETA DE COMPLEXOSCUMULUS-OÓCITO: RESULTADOS PARCIAIS

Viana, J.H.M.1; Palhão, M.P.1; Arashiro, E.K.N.2; Ferreira, A.M.1;Fonseca, J.F.3; Fernandes, C.A.C.4

1 Embrapa Gado de Leite, Juiz de Fora, MG 36038-330. 2 Universidade Federal Fluminense, Niterói, RJ24230-300. 3 Embrapa Caprinos, Sobral, CE 62011-970. 4 Universidade de Alfenas, Alfenas, MG

37130-000

A técnicas de punção folicular orientada por ultra-sonografia possibilita a recuperação de complexos cumulus-oócito (COC) para a produção in vitro de embriões. Contudo, a qualidade dos oócitos recuperados e,consequentemente, seu potencial de desenvolvimento, dependem do status do crescimento folicular no momentoda coleta. Objetivou-se neste trabalho avaliar o efeito da pré-sincronização do crescimento folicular sobre onúmero e qualidade dos COCs recuperados. Foram utilizadas 16 vacas da raça Gir, previamente selecionadasem função da população folicular média ao longo do ciclo. Quatro animais foram utilizados como grupocontrole, sendo coletados sem qualquer tratamento prévio, e os demais divididos em três grupos, pré-sincronizados pelo uso de um dispositivo intravaginal de progesterona (CIDR) e prostaglandina e submetidosà aspiração folicular em semanas alternadas. Após a retirada do dispositivo, foi feita a indução da ovulaçãopela administração de 0,1mg de gonadorelina. Os tratamentos foram programados de forma a que as sessõesde coleta nos animais pré-sincronizados fossem realizadas 84 a 96h após a ovulação. Os COCs recuperadose considerados viáveis foram levados ao laboratório de fertilização in vitro, onde foram maturados por 24hem TCM199. Os resultados estão apresentados na forma de média±D.P. Foram realizadas 24 coletas nosgrupos controle e pré-sincronizado, com a obtenção de 15,83±7,09 e 21,74±8,70 COCs por doadora,respectivamente. Não houve diferença no percentual de estruturas classificadas como viáveis entre os grupos(70,0% vs. 69,24%; P>0,05). O percentual de oócitos maturados após 24h de cultivo, contudo, foi maior nogrupo pré-sincronizado (85,20% vs. 76,32%, P<0,01). Estes resultados parciais sugerem que o uso da pré-sincronização do crescimento folicular é uma alternativa para a obtenção de COCs com maior potencial dedesenvolvimento no cultivo in vitro.

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SUPLEMENTAÇÃO DE DIETAS COM ÓLEO DE SOJA E TRATAMENTOCOM rBST NA PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS

Pivato, I.1,2; Sartori, R.2; Cavalieri, F.B.3; Pereira, D.C.2; Rumpf, R.2

1 CIDASC, Indaial-SC, 89130-000, Brasil. 2 Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília-DF,70770-900, Brasil. 3 Universidade Estadual de Maringá, Maringá-PR, 87020-900, Brasil.

[email protected]

A adição de gordura na dieta e a aplicação de somatotropina bovina recombinante (rBST) auxiliam nocrescimento folicular em bovinos. Este trabalho objetivou avaliar a taxa de formação de blastocistos bovinosin vitro após aspiração folicular (AF) em novilhas superestimuladas com FSH, alimentadas com diferentesníveis de gordura e recebendo ou não rBST. Quinze novilhas (Bos indicus x Bos taurus; 450 kg PV)mantidas em pastagem de braquiária foram divididas aleatoriamente em 3 grupos de 5 animais cada (Controle;Óleo de soja [OS]; e OS+rBST). Foi fornecida uma dieta suplementar (4 kg MS/animal/d) entre 25 d antesda primeira sessão de AF e o final do experimento. No grupo Controle, a dieta continha 2,4% de extratoetéreo (EE). Nos outros 2 grupos a dieta possuía 9,0% de EE devido à adição de óleo de soja. Além do óleode soja, o grupo OS+rBST recebeu aplicações de rBST (250 mg; sc) a cada 7 d. As fêmeas foramsuperestimuladas com uma injeção de FSH (180 UI; im) 72 h antes da AF, e receberam GnRH (50 µg; im)20 h antes da AF. Foram realizadas 5 sessões de AF com intervalo de 7 d cada. Os dados foram analisadospelo procedimento GLM do SAS. Durante o experimento, os animais ganharam em média 950 g PV/d. Nogrupo Controle houve um maior (P < 0,01) número de folículos aspirados (151) e de ovócitos recuperados(117), quando comparado aos grupos OS (122 folículos e 88 ovócitos) e OS+rBST (114 folículos e 80ovócitos). A porcentagem de ovócitos de qualidade superior não diferiu (P = 0.11) entre os grupos Controle(22,3%), OS (22,3%) e OS+rBST (31,6%). Além disso, nos 3 grupos o número e porcentagem de ovócitosque chegaram ao estágio de blastocisto foi baixa e similar (P > 0,05). Foram obtidos 6,8% de blastocistos nogrupo Controle, 11,4% no grupo OS e 13,4% no grupo OS+rBST. Em conclusão, a adição de óleo de sojaà dieta, associado ou não ao rBST, não aumentou a produção de blastocistos. Além disso, o excesso deníveis nutricionais parece ter comprometido essa produção nos 3 grupos experimentais.

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CONCENTRAÇÃO PLASMÁTICA DE PROGESTERONA E TAXA DE GESTAÇÃO EM RECEPTORAS DE EMBRIÃO

Fernandes, C.A.C.1; Oba, E.2; Figueiredo, A.C.S.3

1Prof. Med. Veterinária-Unifenas, Bolsista Fapesp. Rua Tatuin, 93, 37130-000-Alfenas, MG.2FMVZ-Unesp-Botucatu. 3Profa. Inst. Ciências Agrárias-Unifenas. [email protected]

O presente trabalho foi desenvolvido no sentido de correlacionar a concentração plasmática de progesteronano dia da transferência, em receptoras de embrião bovino com a taxa de gestação. Foram utilizadas 676novilhas mestiças, com escore corporal entre 3 e 4 (escala 1-5), inovuladas entre o 6º e 8º dia do ciclo estral.Foram utilizados embriões a fresco, qualidade 1 e 2, transferidos por um mesmo técnico, utilizando sempremesmo equipamento. No dia da inovulação o sangue foi colhido com tubos heparinizados. As amostras deplasma foram estocadas a -20ºC e analisadas posteriormente por RIA, utilizando Kits comerciais paradeterminação de progesterona (DPC-Medlab). De acordo com a concentração de progesterona as receptorasforam distribuídas em 5 grupos. Grupo A: até 1,5 ng/ml (n=21); B: de 1,6 a 3,0 ng/ml (n=159); C: de 3,1 a4,5 ng/ml (n=248); D: de 4,6 a 6,0 ng/ml (n=179) e E: acima de 6,0 ng/ml (n=69). O diagnóstico de gestaçãofoi feito entre 30 e 40 dias por ultra-sonografia. As taxas de gestação dos diferentes grupos foram comparadaspelo teste de χ2. A taxa de gestação média foi de 55,03%. Para os diferentes grupos as taxas de gestaçãoforam 38,01a; 50,31b; 61,69b; 55,31b e 46,38a%, para os grupos A,B,C,D e E, respectivamente. Osresultados demonstraram receptoras com níveis de progesterona intermediários, entre 1,6 a 6,0ng/mlapresentaram melhores taxas de gestação. Aquelas com concentrações muito elevadas deste esteróide(>6,0ng/ml) tiveram redução na taxa de gestação (p<0,05). Apenas 3,1% das receptoras utilizadasapresentavam no dia da transferência concentrações de progesterona ≤1,5ng/ml.

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ESTRUTURAS OVARIANAS EM DOADORAS DE EMBRIÃO E SUA RELAÇÃO COM O INTERVALO PGF-ESTRO

Fernandes, C.A.C.1; Viana,J.H.M.2; Oba, E.3; Figueiredo, A.C.S.4 Oliveira, E.R.5

1Prof. Med. Veterinária-Unifenas, Bolsista Fapesp. Rua Tatuin, 93, 37130-000-Alfenas, MG; 2EmbrapaGado de Leite, Juiz de Fora, MG; 3FMVZ-Unesp, Botucatu, SP; 4Profa. Inst. Ciências Agrárias-

Unifenas. 5Biotran LTDA [email protected]

Objetivou-se avaliar o número dos folículos no dia do estro e o de corpos lúteos no dia da colheita dosembriões e correlacionar estas variáveis com o intervalo deste a aplicação de prostaglandina até o início dasmanifestações de estro. O presente trabalho foi desenvolvido de fevereiro de 2003 a março de 2004 em trêspropriedades localizadas na região Sul do Estado de Minas Gerais, em 89 colheitas de embriões em fêmeasdas raças Simental, Angus e Nelore. Os animais foram avaliados utilizando-se um equipamento de ultra-sonografia com probe transretal bifreqüencial de 8/6 MHz (Scaner Falco –Pie Medical), no dia do estroapós a superovulação e também no dia da colheita dos embriões. Para os animais que não manifestaramestro após a superovulação, esta avaliação foi feita três dias após o final do tratamento de superovulação esete dias mais tarde. Todos os animais foram superovulados com protocolo convencional, utilizando implantesde progesterona (D0) (CIDR®–Pfizer) e doses decrescentes de FSH (D5-8 – PGF D8) (FolltropinV®–Vetrepharm). Os animais foram divididos em 5 grupos, de acordo com o intervalo PGF-Estro: Grupo A: até36 horas; B: de 37 a 48 horas; C: de 49 a 60 horas; D: mais de 60 horas e E: sem estro. O número deestruturas identificadas, em cada avaliação, foi comparado pelo teste de Tukey. O número médio de folículoscom diâmetro >7mm no dia do estro foi de 21,4±6,2a; 14,2±5,7b; 10,1±4,5b; 5,4±3,2c e 2,6±1,5c (p<0,05),e de corpos lúteos no dia da colheita foi de 17,5±6,3a; 12,8±6,6ab; 7,9±4,2b; 4,3±3,8c e 1,9±1,8c (p< 0,05)para os grupos A,B,C,D e E, respectivamente. Os resultados mostraram que o número de folículos de maiordiâmetro existentes nos ovários está diretamente relacionado como o intervalo aplicação de PGF-estro, eexiste correlação positiva entre o número destes folículos e o número de ovulações.

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PROTOCOLO P36 NÃO É DELETÉRIO PARA OÓCITOS DE VACAS NELORE (Bos indicus) DOADORAS DE EMBRIÕES

Melo, D.S.1a; Ferreira, M.M.G.1; Monteiro, F.M.1a; Potiens, J.R.2; Barros, C.M.1c.

1Departamento de Farmacologia, Instituto de Biociências, UNESP, Botucatu - SP. 2Central Bela Vista,Pardinho – SP.

cCorrespondência: [email protected]

O presente experimento foi realizado com o objetivo de avaliar se níveis sub-luteais de progesterona (P4)seriam prejudiciais ao oócito de vacas Nelore submetidas ao protocolo superestimulatório (SE) denominadoP36.Este protocolo consiste na colocação de um dispositivo intravaginal contendo P4 (1,0g; DIB®) associadaà administração IM de benzoato de estradiol (2,5 mg; Estrogin®). Cinco dias mais tarde (D5) inicia-se otratamento SE com pFSH (Folltropin-V®, dose total = 200 mg). No D7 (8:00 h) administra-se PGF2α(Prolise®) e a retirada do DIB é feita 36 h mais tarde (D8). A indução da ovulação é feita por meio daaplicação de LH (25,0 mg, Lutropin®) no dia 9 às 8:00 h. Os animais são inseminados em tempo fixo, sem aobservação de cio, 12 e 24 h após a aplicação de LH. Vacas Nelore (n=6) foram submetidas ao protocoloP36, exceto que após a retirada DIB® (D8), os oócitos foram aspirados (OPU) e encaminhados para olaboratório de PIV (Grupo P36-OPU). Como controle interno do laboratório foram utilizados oócitos deovários provenientes de abatedouro (Grupo PIV-Controle). As taxas de clivagem (27/36 = 75%) e deblastocisto (10/36 = 28%), obtidas a partir de oócitos provenientes de animais mantidos sob níveis sub-luteais de P4 por 36 h após a administração de PGF2α (Grupo P36-OPU), foram próximas das encontradasrotineiramente no laboratório (149/188 = 79% e 68/188 = 36%, respectivamente, Grupo PIV-Controle).Conclui-se que a manutenção de níveis sub-luteais de P4 (protocolo P36), não afetou a viabilidade dosoócitos, uma que vez os mesmos se desenvolveram até o estágio de blastocisto.Bolsitas da aCAPES.

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RESULTADO DA RELAVAGEM UTERINA NA TAXA DE RECUPERAÇÃOEMBRIONÁRIA EM CABRAS BOER

Machado, E.A.; Silva, A.P.; Farias Júnior, N.A.

Genoma Animal®, Bahia, Brasil, [email protected]

Visando aumentar a taxa de recuperação de estruturas embrionárias, doadoras Boer foram submetidas auma segunda lavagem uterina 30 minutos após a primeira. Foram realizadas 31 colheitas. Todas as doadoraseram da raça Boer, primíparas ou multíparas, obedecendo ao mesmo programa supeovulatório. No D0 foicolocado o dispositivo vaginal de progesterona. Entre o D10 e D12 os animais receberam o FSHp, emdoses decrescentes, IM (total de 200 mg NIH-FSH-P1, em 6 aplicações). No D12 foi retirado o dispositivovaginal de Progesterona e realizada a aplicação da PGF2α. As coberturas aconteceram entre D13 e D14.Para a colheita dos embriões no D19, foram consideradas quatro etapas: 1) contenção do animal; assepsiada região vaginal; e anestesia regional e epidural, com 10 ml de lidocaína 2%. 2) a cérvix foi pinçado etracionada com pinça de Allis, sendo passada a sonda1 com auxílio de um mandril de ponta romba; 3) oscornos esquerdo e direito foram lavados, com DPBS, separadamente, usando-se uma seringa de 20 ml,repetidamente, até completar 200 ml por corno; e 4) após 30 minutos em espera, os animais foram submetidosà segunda lavagem uterina, após assepsia, repetindo as etapas 2) e 3), totalizando, na relavagem, 100 ml deDPBS. Os lavados foram avaliados separadamente. Obteve-se na 1a lavagem, média de 9,65 ± 6,06 estruturas;e na 2a lavagem, média de 1,22 ± 1,78 estruturas. Foi observado, que o resultado negativo se repete quandona 1a lavagem não ocorrer recuperação de estruturas. Em alguns animais, o número de estruturas obtidas nasegunda lavagem, foi de 50 a 100% em relação à 1a lavagem. Conclui-se que a dupla lavagem uterinaincrementa a taxa de recuperação embrionária em cabras Bôer.

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ASSOCIAÇÃO ENTRE AS TÉCNICAS DE PUNÇÃO FOLICULAR ECOLETA DE EMBRIÕES EM VACAS GIR

Viana, J.H.M.1; Arashiro, E.K.N.2; Freitas, C.1; Palhão, M.P.1; Fonseca, J.F.3

1 Embrapa Gado de Leite, Juiz de Fora, MG 36038-330. 2 Universidade Federal Fluminense, Niterói, RJ24230-300. 3 Embrapa Caprinos, Sobral, CE 62011-970

A associação das técnicas de superovulação e aspiração folicular para produção in vitro de embriõesconstituem alternativas para a obtenção de embriões bovinos, sendo ambas largamente utilizadas na pecuárianacional. Uma das limitações de ambas as técnicas é a identificação de animais com potencial de resposta,particularmente na superovulação. Objetivou-se neste trabalho estudar o grau de associação entre a recuperaçãode complexos cumulus-oócito (COC) por punção folicular e a produção de embriões in vivo pelasuperovulação em doadoras Gir. Foram analisados resultados de nove animais que foram utilizados nasuperovulação para produção de embriões in vivo e, posteriormente, submetidos à coleta de oócitos paraprodução in vitro. As superovulações foram realizadas pelos métodos convencionais, i.e., oito aplicações deFSH em doses decrescentes, seguida de IA e coleta no sétimo dia. As aspirações foliculares foram realizadasutilizando-se um equipamento portátil de ultra-sonografia equipado com uma guia para aspiração folicular.Os resultados estão apresentados na forma de média±D.P. A produção média de embriões in vivo (33coletas, estruturas totais e viáveis) foi de 6,74±6,10 e 3,91±4,17, respectivamente, e de COCs (203 coletas)foi de 10,40±9,69 e 7,83±7,05. Como era esperado, o número de COCs recuperados apresentou uma altacorrelação com o número de folículos presentes antes da coleta (r=0,97; P<0,001). O número de estruturastotais recuperadas por punção e por coleta de embriões apresentaram uma correlação positiva (r=0,65;P<0,05). Resultado semelhante foi obtido quando se considerou apenas os resultados da primeira punção oucoleta de cada animal (r=0,66, P<0,05). Uma correlação mais baixa foi observada quando se computou asestruturas viáveis obtidas pelas duas técnicas (r=0,57, P=0,054). Estes resultados demonstram que a populaçãofolicular é a principal fonte de variação na recuperação de embriões e oócitos, e deve ser utilizada comocritério de seleção de doadoras. No caso da produção in vivo de embriões, variações na resposta ao FSH,na ovulação, no desenvolvimento embrionário e na eficiência de coleta respondem pelo restante da variação.

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PRENHEZ EM BOVINOS APÓS TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕESBIPARTIDOS E DE HEMI-EMBRIÕES CULTIVADOS in vitro *

Amaral, J.B.1; Oba, E.2; Pires, R.M.L.1

1 Instituto de Zootecnia APTA/SAA - SP. Centro de Pesquisa e Desenvolvimento de Genética eReprodução Animal. Rua Heitor Penteado, 56. Centro. Nova Odessa -SP. CEP: 13460-000, Brasil.

[email protected] 2 Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária - FMVZ/UNESP,Botucatu-SP, 18618-000, Brasil.

A bipartição é uma das principais biotécnicas complementares à transferência de embriões. O presenteestudo tem como objetivo avaliar a eficiência do método de bipartição de embriões bovinos, descrito porReichenbach et al. (1998), com modificações, associando ou não ao cultivo in vitro dos hemi-embriões, nataxa final de prenhez após transferência em receptoras. Avaliou-se ainda os fatores fisiológicos e ambientaisque influenciam a taxa de prenhez, eliminando os efeitos capazes de modificar os resultados. A resposta aostratamentos superovulatórios, em termos de produção de estruturas embrionárias transferíveis e não-transferíveis, foi avaliada em função dos grupos genéticos dos touros (Nelore e Caracu), grupos genéticos(Nelore, Caracu, Mantiqueira e mestiços) e idade das doadoras (maiores que 7 e menores ou iguais a 7anos) bem como tipos de acasalamentos (natural ou artificial). A taxa de prenhez nas receptoras foi analisadaem função da transferência de embriões (intactos, bipartidos frescos e biparidos cultivados in vitro), gruposgenéticos (Nelore, Caracu, Mantiqueira e mestiços), idade (menores que 7 e maiores ou iguais a 7 anos),número de transferências de embriões na reutilização de receptoras (1ª, 2ª ou 3ª), estação do ano (seca ouchuvosa), sincronia do estro com as doadoras (igual, 24h antes ou 24h depois), sítio de deposição doembrião (corno uterino direito ou esquerdo) e estágio de desenvolvimento embrionário (mórula ou blastocisto).Os dados foram analisados no GLM do SAS (1996). A produção média total de estruturas embrionárias foide 2,51±0,71. Das estruturas embrionárias transferíveis, o número médio de mórulas foi de 0,02 ± 0,01,enquanto que a obtenção de blastocistos foi de 1,30 ± 0,39. As estruturas não transferíveis apresentaramuma média de 1,54 ± 0,65. Para as análises da taxa de prenhez, em função das causas utilizadas, empregou-se o Teste do X2 a 5%de probabilidade. Evidenciou-se que não houve efeito significativo na taxa de prenhezem função das variáveis estudadas. A técnica de bipartição mostrou ser eficiente na obtenção de prenhezapós a transferência de hemi-embriões frescos ou cultivados in vitro. No entanto, o cultivo in vitro, nosmoldes realizados, não melhorou a taxa de prenhez de hemi-embriões transferidos. Quando avaliada aos 60dias, essa taxa foi de 28%. Após transferência de 36 hemi-embriões frescos, a taxa de prenhez, avaliada aos60 dias, foi de 30%, sendo diagnosticado dois pares de gêmeos monozigóticos.* Suporte financeiro: FAPESP e FMVZ/UNESP.

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EFICIÊNCIA DE DIFERENTES PROTOCOLOS PARA SINCRONIZAÇÃO DECIO EM RECEPTORAS DE EMBRIÃO EM BOVINOS

Barreiros, T.R.R.1; Borsato, E.A.2; Ludwig Jr., H.E.2; Marques, M.O.3;Ribeiro Jr., M.3 ; Silva, R.C.P.3; Seneda, M.M.4

1. Faculdades Integrado, Campo Mourão, PR; 2. Embriogen, Campo Mourão, PR, 3.Geraembrio, CornélioProcópio, PR; 4. Departamento de Clínicas Veterinárias, CCA, UEL, PR, 86051- 990

[email protected]

O objetivo deste trabalho foi avaliar a eficiência de diferentes protocolos de sincronização de estro. Foramutilizadas 524 novilhas Bos taurus X Bos indicus. No primeiro grupo (G-PGF), 180 animais foram previamenteexaminados por ultra-sonografia transretal (Aloka SSD 500, 5 MHz) e aqueles com CL receberam 150 µgde Cloprostenol (Prolise, Tecnopec, Brasil), por via IM e permaneceram sob observação de cio nas próximas72 horas. Sete dias após a manifestação do estro, os animais foram reavaliados por ultra-sonografia paraidentificação do CL, sendo 115 aproveitados(63,8% - 115/180). No segundo tratamento (G-P4), 105 novilhasreceberam, em estágios aleatórios do ciclo estral, um dispositivo intravaginal de 1,9 g de P4 (CIDR, Pfizer,Brasil) simultaneamente à aplicação intramuscular (IM) de 2 mg de BE (Estrogin, Farmavet, Brasil). Nooitavo dia os dispositivos foram retirados e os animais receberam 150 µg de Cloprostenol (Prolise, Tecnopec,Brasil) por via IM. Após 24h todos os animais receberam uma aplicação de 1 mg de BE, por via IM. Todosos animais foram examinados por ultra-sonografia transretal dezoito dias após o início do tratamento, paraidentificação do CL, sem o emprego prévio de métodos para observação de cio. Foram aproveitados 85dos 105 tratados perfazendo 80,9% de aproveitamento. No terceiro grupo (G-P4+eCG), 239 novilhasreceberam tratamento semelhante ao G-P4, antecipando aplicação de 150 µg de Cloprostenol para o quintodia, mais uma aplicação por via IM de 400 UI de eCG (Folligon, Intervet, Brasil). Neste grupo foramaproveitadas 172 receptoras das 239 tratadas, com aproveitamento de 71,9% após novo exame ultra-sonográfico para identificação do CL, também sem o emprego prévio de métodos para observação de cio.Não foram consideradas as taxas de concepção obtidas neste estudo em razão dos embriões seremprovenientes de diferentes métodos de obtenção, ou seja, embriões TE a fresco, congelados e produzidos invitro. Os tratamentos com os análogos da PGF implicam na observação de estro, em razão da variaçãoentre aplicação e manifestação do mesmo, além da identificação de corpo lúteo por palpação retal ou ultra-sonografia no início do tratamento. Em relação aos tratamentos com PGF, protocolos com P4 e BE associadosou não ao eCG, podem ser realizados em estágios aleatórios do ciclo estral e não necessitam de observaçãode estro, permitindo a transferência de embriões em tempo fixo, após a identificação do CL. O presenteresultado portanto, demonstra a possibilidade de se aumentar o número de receptoras aptas para transferênciade embriões com a utilização de protocolos com P4 e BE.

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PRODUÇÃO EMBRIONÁRIA E TAXA DE PRENHEZ EM DOADORAS DARAÇA NELORE SUPERESTIMULADAS E TRATADAS COM

hCG E LH COMO INDUTORES DA OVULAÇÃO

Nogueira, M.F.G. 1*; Buratini Jr., J.2; Barros, C.M.1

Departamentos de 1Farmacologia e 2Fisiologia, Instituto de Biociências, UNESP, Botucatu-SP, 18618-000, Brasil. [email protected]

O receptor do LH (LHr) presente nas células do folículo ovariano bovino é fundamental para a respostabiológica decorrente da sua ligação com o ligante (LH). Os eventos subseqüentes ao pico pré-ovulatório deLH estão relacionados à presença do LHr e sua afinidade pelo LH. Estudos de expressão gênica do LHr emcélulas da teca e granulosa de folículos bovinos têm demonstrado a presença de 4 isoformas de mRNA parao mesmo gene do LHr. Duas isoformas, das 4 detectadas, poderiam ser traduzidas em proteínas funcionais(receptores acoplados à proteína G) com afinidades distintas em relação aos ligantes. Uma das isoformas(completa ou “full”) tem afinidade pelo LH e hCG, enquanto que a segunda isoforma (com a deleção do exon10) somente pelo hCG. Com base nessas informações, o presente estudo testou a hipótese de que, em vacassuperestimuladas com FSH, a administração simultânea de LH e hCG, como uma tentativa de estimularqualquer variedade de LHr, resultaria em melhora na qualidade dos oócitos e/ou aumento nas taxas deovulação. Vacas Nelore foram superestimuladas com o protocolo P36 (Barros, Porto e Nogueira,Theriogenology, 59:524, 2003) e os embriões colhidos após 7 a 8 dias da administração do indutor daovulação. A ovulação foi induzida apenas com LH (pLH, 12,5 mg, im, Lutropin, Grupo 1) ou com LH (12,5mg) e hCG (1.500 UI, im, Pregnyl, Grupo 2). Ambos os grupos foram contemporâneos quanto àsuperestimulação e inovulação dos embriões. As médias (±EPM) de estruturas totais, embriões viáveis etaxa de viabilidade foram: 12,4±2,36; 10,0±2,38 e 80,8% (grupo 1, n=8 colheitas) e 12,2±2,03; 8,9±1,66e 73,1% (grupo 2, n=14), não havendo diferença estatística significativa (p=0,96; p=0,71 e p=0,18,respectivamente). Em um subgrupo de embriões (qualidades excelente, boa e regular) inovulados a fresco, ataxa de prenhez foi de: 43,8% (14/32; grupo 1) e 67,7% (21/31; grupo 2, p=0,077). Conclui-se que aadministração simultânea de hCG e LH, como indutores da ovulação em animais superestimulados, nãoalterou a produção de embriões viáveis ou a taxa de viabilidade. Contudo, houve uma tendência de aumentona taxa de prenhez de embriões inovulados a fresco, oriundos de animais tratados com hCG e LH, quandocomparados aos embriões obtidos de doadoras tratadas apenas com LH. Essa informação poderá serconfirmada brevemente, quando o diagnóstico de gestação for realizado nas 114 receptoras inovuladas comembriões produzidos pelos animais do grupo 2 (LH+hCG). *Bolsista da FAPESP.

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AVALIAÇÃO DA RESPOSTA OVARIANA DE NOVILHAS E VACAS DOADORASDE EMBRIÃO POR PALPAÇÃO RETAL E ULTRA-SONOGRAFIA

Leal, L.S.1; Oba, E.1; Fernandes, C.A.C.1; Sá Filho, O.G.1

1 Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária – Faculdade de Medicina Veterinária eZootecnia – UNESP – Botucatu. Distrito de Rubião Jr., s/n – CEP: 18618-000

A alta variabilidade de resposta à superestimulação ovariana pode ser decorrente do dia do início do tratamentohormonal, atividade biológica e dose da gonadotrofina utilizada, fatores individuais, idade e raça da doadora.O objetivo do presente trabalho foi analisar a resposta ovariana à superestimulação hormonal de novilhas evacas doadoras de embrião por exames de palpação retal e ultra-sonografia, no dia da colheita dos embriões.Para isto, foram realizadas 78 colheitas de embriões de 19 novilhas e 36 vacas doadoras das raças Limousin(12), Red Angus (16) e Simental (27). O protocolo de estimulação ovariana utilizado foi de oito dosesdecrescentes de FSH (Folltropin-V®), intervaladas de 12 horas, totalizando 160 ou 200 NIH-FSH-P1. Adose luteolítica de cloprostenol sódico (Ciosin®) foi administrada 96 e 108 horas após o início da aplicaçãode FSH. Os embriões foram colhidos pelo método não cirúrgico, sete dias após as inseminações. Os númerosmédios de corpos lúteos (CL) palpados nos ovários direito e esquerdo e a média do número total de CL àpalpação retal em novilhas foram de 7,35 ± 3,26 (n=26), 7,19 ± 3,30 (n=26) e 14,54 ± 5,96 (n=26),respectivamente. Para as vacas, estes valores foram de 7,10 ± 3,63 (n=52) para o ovário direito, 6,72 ±3,40 (n=51) para o ovário esquerdo e 13,86 ± 6,80 (n=51) para ambos os ovários. Os números médios deCL ao exame ultra-sonográfico nos ovários direito e esquerdo e a média do número total de CL identificadosao ultra-som em novilhas foram de 8,17 ± 4,21 (n=24), 7,74 ± 3,60 (n=23) e 16,22 ± 4,86 (n=23). Para asvacas, estes valores foram de 8,24 ± 4,15 (n=45) para o ovário direito, 7,43 ± 3,71 (n=44) para o ovárioesquerdo e 15,75 ± 7,40 (n=44) para ambos os ovários. O grupo das vacas apresentou diferença estatística(p <0,05) entre o número médio de CL no ovário direito e esquerdo ao ultra-som. Não foram encontradasdiferenças significativas (p >0,05) entre os valores de CL para novilhas e vacas à palpação retal e ao ultra-som, concluindo que a determinação do número de CL à palpação retal pôde ser utilizada para determinar aresposta ovariana ao tratamento superovulatório.

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MORTALIDADE EMBRIONÁRIA EM RECEPTORAS (BOS INDICUS x BOSTAURUS) SUPEROVULADAS COM eCG

Reis, E.L.; Nasser, L.F.; Nichi, M.; Baruselli, P.S.

Departamento de Reprodução Animal, FMVZ-USP. R. Prof. Orlando Marques de Paiva, 87, CEP05508-000, São Paulo-SP, Brasil. [email protected]

O corpo lúteo (CL) é a principal fonte de produção de progesterona em fêmeas bovinas gestantes. O embriãoe o feto dependem da progesterona para a manutenção da gestação nos primeiros 200 dias. López-Gatius etal. (Theriogenology 2002;57:1251–61) encontraram relação negativa entre corpos lúteos adicionais emortalidade embrionária em vacas de leite. O objetivo do presente trabalho é analisar o efeito da múltiplaovulação, pelo uso de eCG, em receptoras de embrião bovino produzidos in vitro sobre as perdas embrionáriasentre 30 e 60 dias de gestação. Foram analisadas 238 gestações resultantes de 495 transferência de embriões,diagnosticadas aos 30 e confirmadas aos 60 dias de gestação em receptoras Bos indicus x Bos taurus. Asnovilhas foram tratadas com Benzoato de estradiol (2 mg; BE) associado a progesterona (50 mg) IM (Index)no D0, dispositivo intravaginal de progesterona (DIB®, Syntex) do D0 ao D8, PGF2α (0,15 mg d-cloprostenol,Prolise®, ARSA) associado a 400, 500 ou 600 UI de eCG (Novormon®, Syntex) no D5 ou no D8 e 1 mg deBE no D9. Os resultados foram analisados pelo programa estatístico SAS for Windows e não se observouinteração entre dose e dia de aplicação de eCG sobre a variável analisada. Observou-se 17,5% (33/189) deperdas embrionárias em animais com 1 CL e 10,2% (4/49) para animais com 2 ou mais CLs (P= 0,1097).Agrupando-se os animais de acordo com o número de CLs observou-se uma tendência (P<0,1) para adiminuição das perdas embrionárias em animais com 4 ou mais CLs. Observou-se mortalidade embrionáriade 17,5% (33/189)a para 1 CL, 14,3% (4/28)ab para 2 CLs, 7,7% (1/13)ab para 3 CLs e 0% (0/8)b paraanimais com 4 ou mais CLs. Em um grupo de animais gestantes (n=110) foi mensurada a concentraçãoplasmática de progesterona (CPP) no dia da inovulação (Dia 7). Encontrou-se mortalidade embrionária de15,2% (5/33) para CPP entre 0 e 1,99 ng/ml, 17,9% (7/39) entre 2 e 3,99 ng/ml, 17,4% (4/23) entre 4 e5,99 ng/ml, 14,3% (1/7) entre 6 e 7,99 ng/ml e 12,5% (1/8) para ≥8 ng/ml. Os resultados mostraramtendência de redução da mortalidade embrionária em receptoras de embrião bovino de acordo com o aumentodo número de CLs. Estratégias para o aumento das concentrações plasmáticas de progesterona durante odiestro podem ser utilizadas para diminuir as perdas embrionárias em fêmeas bovinas com o objetivo deaumentar a eficiência reprodutiva de programas de transferência de embriões.Agradecimentos: Syntex e Tecnopec

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SINCRONIZAÇÃO DE RECEPTORAS PARA TRANSFERÊNCIA DEEMBRIÕES POR TEMPO FIXO(TETF)

Beltrame, R.T.1; Cavalca, L.G.2; Verneck, W.C.3; Santos, L.M.4; Detoni, A.L.4;Quirino, C.R.5; Fontes, R.S.5

1Médico Veterinário, aluno do curso de Pós Graduação em Produção Animal –LMGA – CCTA - UENF;2Médico Veterinário, professor da disciplina Fisiopatologia e Biotecnologia da Reprodução-CCA-UFES; 3

Acadêmico em Medicina Veterinária – CCA - UFES; 4Acadêmico em Medicina Veterinária – UVV-ES;5Professor associado do LMGA – CCTA - UENF; Email: [email protected]

Na transferência de embriões (TE), o descarte de receptoras após terem sido sincronizadas com insucessorepresenta uma grande parcela dos custos inseridos na atividade e a decisão quanto ao número adequado dereceptoras a serem usadas, é de grande importância para a eficiência econômica da TE. Fatores comonúmero insuficiente de receptoras, impedem que todos embriões coletados sejam inovulados, reduzindo onúmero de animais gerados e diminuindo, consequentemente, o retorno ao investimento no programa. Poroutra parte, um número excessivo de receptoras onera a TE, devido aos altos custos de aquisição e manutençãodesses animais. Assim, mais da metade do custo operacional de programas de TE podem ser devidos àsdespesas com receptoras. No presente trabalho objetivou-se avaliar a resposta a um protocolo desincronização e a taxa de aptidão ao momento da inovulação em programas de TETF. Foram utilizadosdados de campo envolvendo receptoras mestiças de duas propriedades do Estado do ES (P1=80; P2=48),em diferentes estágios do ciclo estral, com condição corporal de moderada a boa (2-4, escala de 1-5) emanejadas exclusivamente a pasto. O protocolo utilizado consistiu em: Dia 0 - DIB® + Estrogin® (2ml IM) –Dia 5 – Novormon® (1,5ml IM) – Dia 8 – retira DIB® Tecnopec+ Eurosin® (Pearson{2ml IM}) – Dia 9 –Estrogin® (1ml IM) – Dia 17 - Inovulação. A taxa de aptidão das receptoras foi determinada através depalpação retal e posterior caracterização do ovário, levando-se em conta a presença ou não de CL nomomento da inovulação, visto a não necessidade de observação de estro. Utilizou-se o teste qui-quadradoonde foi avaliada a presença ou não, do CL após o tratamento nas duas propriedades. Observou-se diferençana presença de CL no momento da inovulação dentro de cada propriedade (P < 0,05) antes e depois deaplicado o protocolo ( P1 antes 33%, P1 depois 80%; P2 antes 58%, P2 depois 81%). O diagnóstico degestação foi realizado cerca de 60 dias após inovulação através da palpação retal ( P1=56 %; P2

= 48%).Concluiu-se que a redução de custo gerada pela não necessidade de observação de estro somada a relevanteresposta ao protocolo, são fatores importantes na biotécnica. Entretanto as estimativas de custo devem sermelhor avaliadas visto as taxas de gestação encontradas.

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INCIDÊNCIA DE MORTE EMBRIONÁRIA APÓS TRANSFERÊNCIATRANSCERVICAL EM RECEPTORAS DE EMBRIÃO EQÜINO

Castro, R.P.R.1; Pinho, T.G.2; Queiroz, F.J.R.3; Oliveira, G.D.M.3;Costa, A.C.3; Monteiro, A.B.S.

1Mestranda em Reprodução Animal - UFF, Niterói- RJ. [email protected]. 2 Departamento deFisiopatologia da Reprodução- UFF, 3 Médico Veterinário

A morte embrionária é um fator limitante para o sucesso de programas de transferência de embriões, e podeocorrer por diversas causas. Fatores inerentes tanto às doadoras como às receptoras de embriões têm sidocada vez mais estudados com intuito de minimizar estas perdas. O objetivo deste trabalho foi avaliar ainfluência de fatores como a viabilidade dos embriões, dia da transferência na receptora e sincronia entredoadora e receptora sobre os índices de morte embrionária após a transferência transcervical de embriõeseqüinos. Foram utilizadas 92 éguas receptoras de embrião, da raça Campolina, no período de outubro de2003 a março de 2004. Os embriões foram recuperados de doadoras, nos dias sete, oito, ou nove após aovulação, e somente os classificados em graus 1 e 2, segundo McKinnon (The Veterinary Clinics of NorthAmerica Equine Practice, v. 4, p. 305-334) foram transferidos. As transferências de embriões foramrealizadas nas receptoras nos dias 2 a 8 após ovulação, que ocorreram dois dias antes até seis dias após aovulação da doadora (ou seja, +2 até -6 dias). O diagnóstico de gestação nas receptoras inovuladas foirealizado no dia dez após a ovulação, e a gestação acompanhada nos dias 17, 24, 31, 38 e 45. O índice demorte embrionária encontrado foi de 43,5% (40/92), sendo 41,3% (38/92) ocorrido entre a transferência eo dia 10 após a ovulação da receptora, e 2,2% (2/92), entre os dias 11 e 45. A incidência de morte embrionáriafoi de 53,5% (23/43) quando os embriões foram transferidos do dia 2 até o dia 4 após ovulação da receptorae, de 36,7% (17/49) do dia 5 até 8 após ovulação. Quanto à sincronia entre doadora e receptora, a morteembrionária encontrada foi 35,4% (17/48) para assincronia de +2 a -3 dias, e 52,3% (23/44) de -4 a -6dias. Embriões classificados como grau 1 e grau 2 apresentaram taxa de morte embrionária igual a 41,6%(37/89) e 100% (3/3), respectivamente. Conclui-se que tanto os fatores relativos aos embriões quanto dasreceptoras são de fundamental importância para o sucesso da transferência de embriões.

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INFLUÊNCIA DA ÉPOCA DO ANO SOBRE A EFICIÊNCIA DE DOADORAS E RECEPTORAS DE EMBRIÕES BOVINOS NA REGIÃO

MEIO-NORTE DO BRASIL

Souza, J.A.T.1; Carter, J.A.2; Bacelar, F.H.2; Portela, F.J.A.2; Corrêa, C.A.2;Santos, P.A.C.3

1 Depto. Clínica Veterinária – CCA/UFPI – [email protected]. 2 Profissionais Autônomos; 3 Pós-Graduando CCA/UFPI

Objetivou-se neste trabalho avaliar a influência da época do ano sobre a eficiência de doadoras e receptorasde embriões bovinos na região Meio-Norte do Brasil. Foram utilizados dados obtidos na Fazenda LagoAzul, município de Santa Inês – MA (latitude 03o08´S, longitude 45o42‘W). As médias anuais de precipitaçãoe de temperatura na região, nos últimos cinco anos, foram 1.938 mm e 27oC, respectivamente. As médiasdiárias de temperatura e a precipitação total média nos quatro trimestres do ano, correspondentes a esseperíodo, foram de 26, 26, 28 e 27 oC e 922, 588, 106 e 322 mm, respectivamente. Entre dez/98 e mar/04,foram realizados 17 programas de TE, com um total de 183 coletas, sendo 50, 22, 49 e 62 nos respectivostrimestres, envolvendo 96 doadoras bovinas da raça Nelore. Destas, 39 foram submetidas a um, 21 a dois e36 a três ou mais superovulações. As doadoras foram superovuladas com protocolos convencionais de FSH(Folltropin®-V ou Pluset®) e sincronizadas com progestágenos (CIDR® ou Crestar®) ou com PGF2α. Foramfeitas duas ou três inseminações por doadora e as coletas realizadas no sétimo dia após a primeira inseminação.Todas as atividades técnicas inerentes à coleta, classificação e inovulação das estruturas foram procedidaspelo mesmo profissional. Os dados médios registrados nos respectivos períodos, por coleta, foram: estimativade ovulações (por palpação retal) = 11,35; 10,95; 13,24 e 12,44; estruturas coletadas = 15,34; 11,18;13,82 e 14,05; estruturas viáveis = 9,66; 7,18; 5,57 e 8,89; estruturas não fertilizadas = 3,30; 1,73; 5,16 e3,24; estruturas degeneradas = 2,38; 2,27; 2,69 e 1,92; e embriões transferidos a fresco = 8,80; 6,64; 4,98e 6,58. Foram utilizadas 777 receptoras mestiças holandês-zebu (girolandas) e 461 zebuínas sem grau desangue definido (azebuadas), sincronizadas com progestágenos ou PGF2α e inovuladas com apenas umembrião, em um sincronismo de ±48 horas. No primeiro trimestre, sob maior precipitação e menor temperatura,o número de estruturas viáveis foi maior que no segundo e terceiro trimestre (p<0,05); já neste último, sobmenor precipitação e maior temperatura, o número de estruturas não fertilizadas e degeneradas foi maior quenos demais trimestres (p<0,05). A taxa de gestação aos 60 dias, de 62,62% para receptoras “girolandas”(53,05; 56,71; 45,54 e 43,51% nos respectivos trimestres) e de 37,38% para receptoras “azebuadas”(48,02; 58,33; 54,72 e 50,30% nos respectivos trimestres), teve diferença significante entre os grupos; nosegundo trimestre, sob condições ambientais ainda favoráveis, a taxa de gestação foi superior aos demaisperíodos (p<0,05), em ambos os grupos. Conclui-se que a época do ano influenciou a eficiência das doadorase receptoras de embriões.

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INFLUÊNCIA DA RAÇA, SINCRONISMO DO ESTRO, TIPO DE CORPO LÚTEO ECONCENTRAÇÕES DE P4 SOBRE A TAXA DE GESTAÇÃO DE RECEPTORAS DE

EMBRIÕES BOVINOS

Souza, J.A.T.1; Carter, J.A.2; Bacelar, F.H.2; Portela, F.J.A.2; Corrêa, C.A.2; Santos, P.A.C.3

1 Depto. Clínica Veterinária – CCA/UFPI – [email protected]. 2 Profissionais Autônomos; 3 Pós-Graduando CCA/UFPI.

Nos últimos cinco anos a Fazenda Lago Azul, Santa Inês, MA (latitude 03o08´S, longitude 45o42‘W),realizou 183 coletas de embriões, em 96 doadoras bovinas da raça Nelore, as quais foram superovuladascom protocolos convencionais de FSH, inseminadas duas ou três vezes e coletadas no sétimo dia após aprimeira inseminação. Receptoras e doadoras foram sincronizadas com progestágenos ou PGF2α. De 2.561estruturas coletadas, 1.465 (57%) foram viáveis, das quais, 1.238 (48%) transferidas, a fresco, para 777receptoras girolandas e 461 para receptoras azebuadas, na maioria novilhas, obtidas da própria região. Asatividades técnicas ligadas a TE foram procedidas pelo mesmo profissional. O sincronismo doadora / receptora,com base no início dos sintomas de estro, se concentrou em +24 a -24 horas, sendo 38% no momento “0”e 36% em “-12”, correspondendo ao momento da inovulação. Todas as receptoras foram previamenteavaliadas por palpação retal para diagnosticar o CL e inovular no corno correspondente. De 1.238 receptorasinovuladas, independendo do padrão racial, 280 tiveram registrado à palpação, o tipo de CL (incluso=28 ouexcluso=252) e à ultrassonografia, o diâmetro (média =1,9mm), área (média =2,9cm2) e a presença decratera (53%), estas, com área média de 0,6cm2. Entre as receptoras palpadas e com CL incluso, 7 (25%)foram descartadas à US, pela ausência de CL. As concentrações médias de P4 (0,8 ng/ml) nessas receptorasforam inferiores (p<0,05) às que apresentaram CL (6,3 µg/ml) e, entre estas, não houve diferença em funçãoda estrutura do CL. A P4 não interferiu na taxa de gestação (p>0,05), esta de 63 e 37 % para receptoras“girolandas” e “azebuadas”, respectivamente (p<0,05). Independendo da raça, as taxas de gestação, deacordo com o grau de sincronismo, foram de 3, 9, 36, 39 e 13%, para os grupos +24, +12, 0, -12, e -24,respectivamente. Conclui-se que as receptoras “girolandas” foram mais eficientes e que os índices de gestaçãoforam maiores quando inovuladas em sincronismo “0” e “-12” (P<0,05). A avaliação ultrassonográfica foideterminante no descarte de receptoras de embriões.

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INDUÇÃO DO PARTO EM OVELHAS DA RAÇA SANTA INÊS, UTILIZADAS COMORECEPTORAS EM UM PROGRAMA DE TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES

Chalhoub, M.1; Bittencourt, R.F.1; Portela, A.P.M.1; Alves, S.G.G.; Almeida, A.K.1;Freitas, D.S.1; Ribeiro Filho, A. de L.1

1Escola de Medicina Veterinária – UFBA, Salvador-BA, 40170-110, Brasil. e-mail: [email protected]

A morbidade e mortalidade perinatal dos indivíduos produzidos por biotécnicas da Reprodução Animal,recentemente desenvolvidas, são fatores que interferem negativamente no resultado final referente ao númerode produtos viáveis nascidos. Com a utilização destas técnicas há uma maior possibilidade de ocorrência departos distócicos. Um procedimento passível de reduzir essas perdas perinatais é a assistência apropriadadurante o parto. A indução do parto torna-se uma opção de manejo importante, por possibilitar a sincronizaçãodos nascimentos no rebanho, reduzindo o período de observação dos partos. Com isso, reduz-se apossibilidade de morte da cria no parto. Nas ovelhas os glicocorticóides podem ser usados para a induçãodo parto e além de induzirem o nascimento, asseguram a maturação fetal. Este estudo teve por objetivo,avaliar a eficácia da utilização de glicorcoticóide para a indução do parto em ovelhas. Além disso, verificou-se a correlação do intervalo de tempo entre a indução e nascimento (IND), com o sexo, peso e tipo de parto(simples ou gemelar). Para tanto, 31 receptoras da raça Santa Inês gestantes de embriões da raça Dorper,importados da África do Sul, tiveram seus partos induzidos com 10 mg de dexametasona (DEXA), administradapor via intramuscular aos 146 dias de gestação. Vinte e quatro horas após a administração, os animais foramobservados a cada hora, até o momento do parto. Os neonatos foram classificados quanto ao sexo, pesadose os nascimentos agrupados como simples ou gemelares. Para a análise estatística foi empregado o programaStatistical Analysis System (SAS), versão 6.1. O peso médio (Kg) ao nascimento foi de 3,9 ± 0,8. Ointervalo médio entre a administração da DEXA e o parto foi de 45,6 ± 10,1 horas. O peso ao nascimentofoi influenciado pelo tipo de parto, onde os neonatos provenientes de partos gemelares eram significativamentemais leves, em relação aos de parto simples (r=-0,43; P<0,05). Não foram observadas correlações entreIND, peso e sexo das crias. Não houve retenção de envoltórios fetais após o período de oito horas pós-parto, tempo considerado fisiológico para a espécie. A estimulação hormonal com DEXA também possibilitoua sincronização dos nascimentos, que se distribuíram entre 25 e 60 horas após a sua administração. Quatroanimais (12,9%) não pariram nesse intervalo e foram submetidas a cesariana. Concluiu-se que a administraçãode 10 mg de dexametazona é eficaz na indução do parto em ovelhas utilizadas como receptoras de embriões.

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MOMENTO DA PRIMEIRA INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL EM VACASSUPEROVULADAS PARA TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES

Sales, J.N.S.1; Souza, J.C.1

1Departamento de Zootecnia, Universidade Federal de Lavras, Lavras-MG, CEP: 37200-000,Cx Postal 37, Brasil. [email protected].

O momento ideal para iniciar as inseminações em programas de transferência de embriões é assunto aindacontroverso, de acordo com a literatura. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do momento daprimeira inseminação no número de embriões viáveis, degenerados e não fertilizados de doadoras da raçaholandesa. Vacas (n=22) e novilhas (n=50) holandesas foram sincronizadas utilizando Crestar® (IntervetInternational B.V., Boxmeer, Holanda) que consiste na aplicação de implante auricular subcutâneo de 3 mgde norgestomet, associado à aplicação intramuscular de 6 mg de norgestomet e 10 mg de valerato de estradiol(D0), no quinto dia iniciou-se o protocolo superovulatório com 8 aplicações decrescentes de FSH/LHp(Pluset®, Calier S.A., Barcelona, Espanha) em intervalos de 12 horas. No sétimo dia aplicou-se 0,5 mg, i.m.,de cloprostenol sódico (Sincrosin®,Vallée S.A., Montes Claros, Brasil) retirando-se o implante no nono dia.A coleta foi realizada sete dias após a 1ª inseminação artificial. Após a coleta, os embriões foram avaliadossegundo o padrão IETS (1999). Os animais foram alocados aleatoriamente para um de dois tratamentos,sendo T1(n=27) inseminados 0 e 12 horas e T2 (n=45) 12 e 24 horas após a observação do cio. As médiasde embriões viáveis, degenerados e não fertilizados foram analisadas pelo PROCGENMOD (SAS), sendocomparadas por contrastes. Não houve diferença entre os dois tratamentos (T1 vs T2) para viáveis (5.21±1.13vs 5.67±0.73), não fertilizados (1.09±0.48 vs 1.10±0.31) e degenerados (1.19±0.44 vs 1.21±0.29). Pode-se concluir que a 1ª inseminação pode ser feita no momento em que se observa o cio sem trazer prejuízospara a fertilização em programas de transferência de embriões.

Palavras chaves: Inseminação; transferência de embriões; bovinos.

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PRODUÇÃO DE EMBRIÕES EM OVELHAS MORADA NOVA (VARIEDADE BRANCA) SUBMETIDAS AO TRATAMENTO SUPEROVULATÓRIO

COM pFSH

Maia, E.L.M.M.1; Souza, A.L.1; Arruda, I.J.1; Lima, I.M.T.1; Almeida, K.C.1; Lopes-Júnior,E.S.1; Paula, N.R.O.1; Teixeira, D.I.A.1; Rondina, D.1; Villarroel, A.B.S.2; Freitas, V.J.F1.

1Laboratório de Fisiologia e Controle da Reprodução - FAVET/UECE, 60740-000, Fortaleza-CE, Brasil.2 Centro de Ciências Agrícolas - FZ/UFC, 60455-760, Fortaleza-CE, Brasil. [email protected]

Objetivando avaliar a produção de embriões em ovelhas Morada Nova (variedade branca) submetidas a umtratamento superovulatório com pFSH, vinte ovelhas cíclicas apresentando (média ± e.p.) 2,6 ± 0,2 anos deidade e 31,2 ± 1,1 kg foram utilizadas como doadoras de embriões. As ovelhas tiveram o estro sincronizadopelo uso de esponjas vaginais impregnadas com 60 mg de acetato de medroxiprogesterona (Progespon®,Syntex, Buenos Aires, Argentina) por 14 dias. O tratamento superovulatório iniciou-se 48 horas antes daretirada da esponja e consistiu na aplicação intramuscular de 200 UI de pFSH (Pluset®, Calier, Barcelona,Espanha), divididas em seis doses decrescentes (50/50, 25/25 e 25/25 UI), em intervalos de 12 horas. Umcarneiro fértil da mesma raça foi utilizado para detectar o estro das ovelhas a partir de 12 horas da remoçãoda esponja e a cada quatro horas, até que as fêmeas não apresentassem sinais de estro. A monta natural foirealizada no início do estro e 24 horas após. Seis dias após a primeira monta, as ovelhas foram submetidas auma laparoscopia para avaliação ovariana, sendo seguida da colheita de embriões por laparotomia. A ocorrênciade superovulação foi considerada quando da existência de, pelo menos, cinco corpos lúteos. Os embriõesrecuperados foram procurados e avaliados sob estéreomicroscópio (SMZ-1B, Nikon, Tóquio, Japão) a umaumento de 20 a 40X, sendo classificados quanto ao seu estádio de desenvolvimento e qualidade, obedecendoaos critérios morfológicos da IETS. Os dados são apresentados de forma descritiva, sendo expressos comomédia ± e.p. ou valor percentual. O estro foi observado em 90% das fêmeas tratadas e uma respostasuperovulatória em 75% (15/20), com uma taxa média de ovulação de 7,35 ± 0,91. A taxa de recuperaçãoembrionária foi 64,63% (5,00 ± 0,68 estruturas por ovelha). Após a avaliação, foi observada uma proporçãode 89,47% (85/95) de estruturas fecundadas e 10,53% (10/95) de não fecundadas. Dentre os embriõesrecuperados, 69,51%, 21,95%, 4,88% e 3,66% foram mórulas/blastocistos de graus I, II, III e IV,respectivamente. Em conclusão, ovelhas Morada Nova (variedade branca) apresentaram boa resposta aotratamento superovulatório com pFSH, podendo ser utilizadas como doadoras em um programa de preservaçãoe formação de banco de embriões.

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MANUTENÇÃO DE NÍVEIS SUB-LUTEAIS DE PROGESTERONA, APÓSTRATAMENTO SUPERESTIMULATÓRIO, PODE DIMINUIR A TAXA DE

RECUPERAÇÃO DE EMBRIÕES

Melo, D.S.1a; Ferreira M.M.G.1; Nogueira, M.F.G.1b; Barros, C.M.1c.

1Departamento de Farmacologia, Instituto de Biociências,UNESP, Botucatu - SP.cCorrespondência: [email protected]

Neste experimento objetivou-se avaliar se a manutenção de níveis sub-luteais de progesterona (P4) até omomento da colheita de embriões promoveria alterações no oviduto e/ou útero que poderiam comprometera fertilização e/ou desenvolvimento embrionário inicial de vacas Nelore submetidas a tratamentosuperestimulatório (SE). Em dia aleatório do ciclo estral (D0) vacas da Nelore (n=6) foram submetidas aoseguinte protocolo SE: colocação de um dispositivo intravaginal contendo P4 (1,0g; DIB®) associada àadministração IM de benzoato de estradiol (2,5 mg; Estrogin®). Cinco dias mais tarde (D5) pFSH (Folltropin-V®) foi administrado durante 4 dias consecutivos (dose total = 200 mg). No D7 (8:00 h) administrou-sePGF2α (Prolise®) e 48 h mais tarde a ovulação foi induzida com LH (25,0 mg, Lutropin®, via IM, D9). Asvacas foram inseminadas, sem observação de cio, 12 e 24 h após a aplicação de LH. A fonte de progesterona(DIB) foi removida somente no dia da colheita de embriões (D16), isto é, 216 h após a aplicação de PGF2α(Grupo P216). Mesmo com a administração de 25 mg de LH poucos folículos ovularam, resultando narecuperação de apenas 2 estruturas não clivadas (D16). Devido a este resultado inesperado o protocolo foimodificado, isto é, o DIB foi retirado no dia 8 (20:00 h) e o LH aplicado no dia 9 (8:00 h). Um novo DIB foicolocado 8 h após a aplicação de LH e retirado apenas no dia da colheita de embriões (Grupo P216-modificado). Esta alteração no protocolo foi eficaz em aumentar a taxa de ovulação, como indica a presençade um total de 64 corpos lúteos em 6 vacas, no dia da colheita de embriões. Entretanto, do total de 47estruturas recuperadas apenas 3 eram embriões viáveis. Levando-se em consideração experimento anteriorno qual concluiu-se que a manutenção de níveis sub-luteais de P4 por 36 h após a administração de PGF2α,não afeta a viabilidade dos oócitos, uma vez que os mesmos são capazes de se desenvolver “in vitro” até oestágio de blastocisto (veja resumo nestes anais), os resultados acima são indicativos de que a manutençãoprolongada de níveis sub-luteais de P4, promove alterações no oviduto e/ou útero, prejudicando a fertilizaçãoe/ou desenvolvimento embrionário inicial.Bolsitas da aCAPES ou bFAPESP.

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EFEITO DO PROTOCOLO DE SINCRONIZAÇÃO DO CICLO ESTRALSOBRE A RESPOSTA SUPEROVULATÓRIA EM UM PROGRAMA

DE TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES ZEBUÍNOS.

Ribeiro Filho, A. de L.1, Bittencourt, R.F. 1; Portela, A.P.M.1, Freitas, D.S.1; Almeida, A.K.1;Silva, A.A.B.1; Santana, R.C.M.1; Chalhoub, M.1

1Escola de Medicina Veterinária – UFBA, Salvador-BA, 40170-110, Brasil. E-mail: [email protected]

A superovulação é um dos elementos chaves da tecnologia da TE. Contudo, uma marcada variabilidade naresposta superovulatória e na taxa de recuperação embrionária, são os fatores que mais afetam a eficiênciadesta tecnologia. Um dos principais aspectos que contribuem para essa variação, é o status do desenvolvimentofolicular quando a superovulação é iniciada. Assim, o controle da emergência das ondas foliculares tem setornado uma importante ferramenta para a melhoria dos resultados obtidos na técnica da TE. Porém, 80%do rebanho bovino brasileiro é composto por animais zebus, sendo importante que os protocolos desincronização da onda folicular e superovulação sejam testados e ajustados às características intrínsecasdestes animais. Com o objetivo de avaliar a eficácia, de dois protocolos de sincronização do ciclo estral,sobre a resposta superovulatória em vacas zebus, 26 animais, em estágio aleatório do ciclo estral, foramsubmetidos aos seguintes protocolos: P1 (n=16) - os animais tiveram a onda folicular sincronizada com umimplante intravaginal contendo 1,9g de progesterona no Dia 1 e aplicação de 3mg de Benzoato de EstradiolIM no Dia 2, neste grupo o tratamento superovulatório foi iniciado no Dia 5 pela manhã. P2 (n=10) - osanimais receberam duas injeções de 75mg de D+Cloprostenol via submucosa-intravulvar, intervaladas por14 dias, e a superovulação foi iniciada nos dias nove ou dez após detecção do estro. O tratamentosuperovulatório consistiu de uma quantidade total de 250UI de gonadotropina hipofisária suína (Pluset®,Calier, Brasil) divididos em oito doses decrescentes (50UI Bid; 37,5UI Bid; 25UI Bid e 12,5UI Bid), com aquinta aplicação de FSH foi administrado 150mg de D+Cloprostenol IM e com a sexta dose de FSH asvacas receberam 75mg de D+Cloprostenol IM e no P1 os animais tiveram os implantes vaginais retirados.As inseminações foram realizadas 12 e 24 horas após o início do estro e os embriões colhidos sete dias apósa primeira IA. A resposta ovariana foi avaliada de acordo com o número de corpos lúteos diagnosticados napalpação retal. Os embriões recuperados foram classificados, quanto à qualidade e estádio de desenvolvimentode acordo com a IETS. Os dois grupos experimentais foram comparados com base em um delineamentointeiramente casualizado. Desta forma, foram confrontadas as variáveis, corpos lúteos (CL), estruturas colhidas(EC), embriões viáveis (EV), qualidade (QE) e estágio de desenvolvimento embrionário (EDE). Para asanálises estatísticas foi empregado o pacote estatístico SAS, utilizando-se o teste de Student – Newman –Keuls (SNK). As médias verificadas (X ± DP) para as variáveis CL, EC, EV, QE e EDE para o P1 foramrespectivamente, 11,80 ± 2,48; 12,50 ± 4,28; 8,00 ± 3,68; 2,64 ± 1,05 e 4,62 ± 1,46; enquanto, para o P2foram respectivamente, 8,50 ± 2,58; 4,30 ± 2,79; 1,90 ± 1,66; 2,56 ± 1,19 e 3,12 ± 1,91. Diferiram(P<0,0001) as seguintes variáveis: EC, EV, e EDE. Conclui-se, que o protocolo P1 obteve melhor desempenho,com maior número de estruturas recuperadas e embriões viáveis, e apresentou embriões em estágio dedesenvolvimento mais adiantado (entre mórula e blastocisto inicial).

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TRATAMENTO SUPEROVULATÓRIO ASSOCIADO A APLICAÇÕESFREQÜENTES DE GnRH

Melo, D.S.1a; Monteiro, F.M.1a; Nogueira, M.F.G.1b; Eberhardt, B.G.1a; Carvalho, L.M.1b;Sartorelli, E.S.1a; Trinca, L.A.1; Barros, C.M.1c

1Departamentos de Farmacologia e Bioestatística, IBB/UNESP,Botucatu,SP-Brasil. cCorrespondência:[email protected]

Este experimento foi realizado com a finalidade de restabelecer os pulsos de LH, que se encontram diminuídosdevido a superestimulação (SE) ovariana com FSH (Theriogenology, v.51, p.37-46, 1999), por meio deaplicações freqüentes de GnRH, na expectativa de se aumentar a taxa de ovulação e, conseqüentemente, aprodução de embriões. Vacas da raça Nelore (n=9) foram distribuídas aleatoriamente em 2 grupos: P36-Salina (controle) e P36-GnRH. Numa segunda etapa os animais foram trocados de grupo de maneira quetodas as doadoras foram submetidas aos dois tratamentos. Tanto os animais do grupo controle como doP36-GnRH foram tratados com o protocolo P36, que consiste na inserção de um dispositivo intravaginalcontendo progesterona (1,9g; CIDR-B®) associada à administração IM de benzoato de estradiol (2,5 mg;Estrogin®). Cinco dias mais tarde (D5) inicia-se o tratamento SE com pFSH (Folltropin-V®, dose total = 200mg). No D7 (8:00 h) administra-se PGF2α (Prolise®) e 36 h mais tarde (D8) o CIDR é removido. Aovulação é induzida com LH (25,0 mg, Lutropin®, via IM, D9 às 8:00 h) e as vacas são inseminadas, semobservação de cio, 12 e 24 h após a aplicação de LH. Durante o protocolo P36 foram realizadas váriasadministrações IV de solução salina (1,0 ml, Grupo controle) ou GnRH (5 µg de gonadorelina, Fertagyl®,Grupo P36-GnRH) nos dias 5 (às 14 e 24 h), 6 (às 8,12,16,20 e 24 h), 7 e 8 (às 4,8,12,16,20 e 24 h) e 9(às 4 h). O crescimento folicular foi acompanhado por meio de ultra-sonografia a partir do início da SE (D5)até a indução da ovulação com LH (D9). As colheitas de embriões foram realizadas 7 dias após a administraçãode LH (D16). Apesar do número médio de folículos no dia da administração de LH (18,8±4,6 e 21,2±3,6),da quantidade de corpos lúteos (10,3±1,5 e 12,2±2,1) e estruturas totais (5,6±0,6 e 8,3±1,1) não diferiremsignificativamente entre os grupos controle e P36-GnRH, respectivamente, houve uma tendência de aumentono número embriões viáveis nas doadoras tratadas com GnRH, quando comparadas as que receberamsolução salina (5,8±0,7 vs 3,5±0,7; respectivamente, P=0,07). Estes resultados são indicativos de queadministrações freqüentes de GnRH durante tratamento SE podem aumentar o número de embriões viáveis.Os resultados acima deverão ser confirmados em futuro experimento, no qual será utilizado um sistema deliberação contínua ou intermitente de GnRH.Bolsistas da CAPESa ou FAPESPb.

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AVALIAÇÃO DA DINÂMICA FOLICULAR EM ÉGUAS SUPEROVULADAS COMEXTRATO DE PITUITÁRIA EQÜINA E FSH EQÜINO PURIFICADO.

Machado, M.S.1; Carmo, M.T.1; Squires, E.L.2; Roser, J.F.3 ; Alvarenga, M.A.1

1Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária - UNESP-Botucatu/SP, 18618-000-Brasil -2Animal Reproduction and Biotecnology Laboratory, Colorado State University, Fort Collins, C.O.,USA -

3Animal Science, Endocrinology Laboratory, California University, Davis, [email protected]

O extrato de pituitária eqüina (EPE) é um preparado parcial de gonadotrofina eqüina, sendo o único compostoque regularmente induz ovulações múltiplas em éguas. Contudo, a resposta superovulatória e a taxa deembriões recuperados têm sido baixas, quando comparadas com outras espécies. Devido aos baixos índicesobtidos até o momento com superovulação em éguas, a proposta do nosso trabalho foi de caracterizar adinâmica de crescimento folicular em éguas tratadas com dois diferentes protocolos de EPE (doses constantese decrescentes) e FSH eqüino purificado (Bioniche-Canadá). Foram utilizadas seis éguas em bom estadonutricional e reprodutivo. Essas éguas passaram por quatro tratamentos: GI (EPE 25mg/IM, duas vezes aodia), GII (EPE em doses decrescentes 40, 35, 30, 25, 20, 15 e 10mg/IM, diariamente, duas vezes ao dia),GIII (FSH eqüino purificado 12,5mg/IM, duas vezes ao dia) e GIV (Controle). Essas éguas foram monitoradasdiariamente por ultra-sonografia para a detecção da ovulação e os tratamentos iniciados no sétimo dia pós-ovulação. Nos três grupos, o tratamento foi interrompido quando a maioria dos folículos atingiu diâmetro de≥35mm, neste momento foi administrado 3000UI de hCG. Os resultados foram analisados pelo Coeficientede Correlação de Pearson e Análise de Variância. Não houve diferença estatística no número médio defolículos de diferentes tamanhos (10-15, 16-20, 21-30 e >30mm de diâmetro) entre os primeiros quatro diasde tratamento. No entanto, no quarto dia de tratamento, os grupos II e III apresentaram valores numéricossuperiores aos demais grupos quanto ao número médio de folículos de 21-30mm de diâmetro (1,7±1,6,3,2±2,4, 3,2±1,6 e 1,2±1,5 para os grupos GI, GII, GIII e GIV, respectivamente). Os grupos II e III foram,estatisticamente, superiores ao GIV, e GI apresentou valor intermediário quanto ao número de folículos quealcançaram 30mm de diâmetro ao longo do tratamento (3,5±1,2ab, 4,2±1,6b, 5,0±1,5b, 1,0±1,0a, para GI,GII, GIII e GIV, respectivamente). Os números de ovulações foram de 3,3±1,6ab, 5,0±2,1a, 4,8±1,3a, 1,0±0b

para GI, GII GIII e GIV, respectivamente. Foi observada uma correlação positiva (r=0,77; p=0,06) entre apopulação de folículos de 16-20mm de diâmetro 48horas após o início do tratamento e o número de ovulaçõesem todos os grupos tratados. Não houve diferença estatística na taxa de crescimento diário folicular, entretanto,o GIII foi semelhante numericamente ao GIV (2,2±0,5, 2,2±0,8, 2,6±0,4, 2,5±0,2mm/dia para GI, GII,GIII e GVI, respectivamente), sendo superiores aos demais. Baseados nos resultados do presente estudo,concluímos que não houve diferenças na dinâmica folicular entre animais superovulados ou não, até o quartodia de tratamento; os tratamentos superovulatórios avaliados são capazes de aumentar o número de folículosde 30mm e ovulações em relação ao grupo controle; a taxa de crescimento folicular observada nos animaistratados com eFSH purificado foi similar ao controle, sendo assim, o que mais se aproximou das condiçõesfisiológicas. Apoio: FAPESP e Laboratório Bioniche.

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COMPARAÇÃO ENTRE DOSES CONSTANTES E DECRESCENTES DE EXTRATO DEPITUITÁRIA EQUINA NA INDUÇÃO DE SUPEROVULAÇÃO EM HAMSTER

Carmo, M.T1.; Siqueira-Pyles, E.S.C.; Landim-Alvarenga, F.C1.; Alvarenga, M.A1.

Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária, UNESP, Botucatu, [email protected]

Estudos realizados em bovinos demonstraram que altos níveis de LH presentes no preparado contendo FSHafetam adversamente a resposta superovulatória, a taxa de fertilização e a qualidade dos embriões, fazendo-se necessário à administração gradativa do FSH e LH em doses decrescentes. O presente experimentoobjetivou comparar o efeito da estimulação ovariana em hamster, utilizando-se o extrato de pituitária eqüina(EPE) através das administrações de doses constantes e decrescentes, utilizando um modelo animal de baixocusto. Objetivou também verificar a eficiência do EPE produzido em nosso laboratório, e se esta espécieutilizada é um bom modelo experimental para os estudos com o EPE. Foram utilizados 84 fêmeas hamsterscom idade entre 60 a 85 dias de vida, pesando entre 120 a 150gr e submetidas a fotoperíodo de 14 horas deluz ao dia em temperatura média de 22o C. Foram avaliados sete grupos (N=12/Grupo), em um delineamentointeiramente casualizado em três repetições por grupo, com a utilização do eCG em dose única e do EPE emdose constante ou dose decrescente, duas vezes ao dia durante quatro dias consecutivos, distribuídos nosseguintes grupos: G1-: EPE constante (0,01 mg / aplicação), G2-: EPE decrescente (0,016 mg, 0,012 mg,0,008 mg, 0,004 mg / aplicação), G3-: eCG (25UI), G4-: EPE constante (0,01 mg / aplicação) + hCG(25UI), G5-: EPE decrescente (0,016 mg, 0,012 mg, 0,008 mg, 0,004 mg / aplicação) + hCG (25UI), G6-: eCG (25UI) + hCG (25UI), G7-: controle (solução fisiológica). O hCG foi administrado via subcutânea emdose única para todos os grupos, sendo que o mesmo foi aplicado 48h após a administração do eCG e 12hapós a última aplicação dos grupos tratados com o EPE. Todos os animais foram eutanasiados 15h após aadministração do hCG. Com o auxilio de um esteroscópio os ovidutos foram dilacerados com agulha permitindoa saída dos oócitos em massa celular do cumulus oóphorus, sendo então avaliados e quantificados. Osovários foram pesados e tendo sido computados o número de estruturas lúteas e folículos ≥ 1 mm. Foiutilizada para a avaliação estatística, a análise de variância seguido do método de Tukey. O número médio defolículos contados foi em G1) 74,3±15,1ab; G2) 89,0±6,3a; G3) 39,0±26,1b; G4) 34,0 ±26,1c; G5) 36,7±3,8b;G6) 22,0±12,1c; G7) 8,3±0,6c; o número médio de corpos lúteos observados foi em G1) 49,7±19,5b; G2)29,3±9,7c; G3) 145,3±74,8ab; G4) 105,3±30,8abc; G5) 87,3±16,2abc; G6) 166,0±62,2a; G7) 24,0±4,0c. Onúmero de oócitos recuperados foi em G1) 8,7±3,5ab; G2) 14,3±12,4ab; G3) 30,0±26,2ab; G4) 18,7±11,5ab;G5) 54,0±5,5ab; G6) 56,7±33,2a; G7) 6,7±0,6b. O peso dos ovários (gr) foi para G1) 0,14±0,01c; G2)0,12±0,01d; G3) 0,20±0,009abc; G4) 0,20±0,02bc; G5) 0,20±0,03bc; G6) 0,30±0,05a; G7) 0,09±0,01d. Osresultados do presente experimento demonstraram que o uso de doses constantes de EPE induziu a distúrbiosna ovulação, levando a uma conseqüente redução do número de oócitos recuperados.Apoio: FAPESP/CAPES

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VIABILIDADE “IN VITRO” E ANÁLISE ULTRA-ESTRUTURAL DE EMBRIÕESEQÜINOS PROVENIENTES DE TRATAMENTO SUPEROVULATÓRIO

Peres, K.R.1; Fernandes, C.B.1; Siqueira-Pyles, E.S.C.1; Landim-Alvarenga, F.C.1;Alvarenga, M.A.1; Squires, E.L.2

1 Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária – Universidade Estadual Paulista,Botucatu, SP, Brasil, 18618-000. 2 Animal Reproduction Biotechnology Laboratory - Colorado State

University, Fort Collins, CO, USA, 80523. [email protected]

Apesar dos recentes avanços obtidos nos tratamentos superovulatórios em eqüinos, não existem estudos quecomparam a qualidade e a morfologia de embriões obtidos através desta biotécnica com embriões obtidosde éguas não tratadas. Vinte e sete éguas em transição de primavera foram distribuídas aleatoriamente em umdos dois grupos experimentais: Grupo Controle (n=13) e Grupo Tratamento (n=14), onde as éguas foramtratadas com 12,5 mg de FSH eqüino purificado (eFSH® - Bioniche Animal Health Inc., Canadá), IM, duasvezes ao dia, a partir da detecção de um ou mais folículos ≥ 25 mm. O tratamento foi realizado até que amaioria dos folículos apresenta-se tamanho pré-ovulatório (≥ 35mm). Neste momento foi administrado 2.500UI de hCG (Vetecor® - Lab. Calier do Brasil, SP, Brasil), intravenosamente, e as éguas foram inseminadascom 1 x 109 espermatozóides móveis, em dias alternados, até a detecção da ovulação (D0). Também foirealizada a indução da ovulação e a inseminação artificial nas éguas do grupo controle. A recuperação dosembriões foi realizada pelo método não-cirúrgico sete a oito dias após a detecção da ovulação. Foramrecuperados 9 embriões do grupo controle (0,69 embriões/égua), sendo: 2 Bi (22,2%), 3 Bl (33,3%) e 4 Bx(44,4%). No grupo submetido ao tratamento foram recuperados 28 embriões (2,0 embriões/égua) sendo 1mórula (3,6%), 5 Bi (17,9%), 8 Bl (28,6%), 11 Bx (39,2%) e 3 embriões degenerados (10,71%), além de6 oócitos. Aproximadamente 89% (8/9) dos embriões do grupo controle e 75% (21/28) dos embriões dogrupo tratado foram classificados como excelentes ou bons após exame visual por microscópio esteroscópico,e, 11,1% e 14,3%, respectivamente, apresentavam pequenas imperfeições. Posteriormente, embriões deambos os grupos foram avaliados através de microscópio invertido de fluorescência após serem incubadospor solução de DPBS + 0,4% BSA acrescida de 125µg/ml de Iodeto de Propídeo, por 10 minutos, e seremtransferidos para lâmina histológica contendo uma gota da solução de 10µg/ml de HOECHST 33342. Todosos embriões do grupo controle (7/7) e 70% (7/10) dos embriões do grupo tratado mostraram-se viáveis pelacoloração com sondas fluorescentes. Os embriões inviáveis pelo exame de fluorescência, do grupo tratamento,foram os mesmos classificados como degenerados após o exame visual. Para a análise da ultra-estrutura, emmicroscópio eletrônico de transmissão, foram utilizados 2 embriões do grupo controle e 3 do grupo tratado,colhidos aleatoriamente, sem seleção prévia da sua morfologia. Eles foram fixados em 2,5% de glutaraldeídoem tampão fosfato e pós-fixados em 1% de tetróxido de ósmio no mesmo tampão. Após a desidratação emséries crescentes de acetona os embriões foram incluídos em Epon. Os cortes ultra-finos foram obtidos comnavalha de diamante e corados com acetato de uranila e citrato de chumbo. Não foram detectadas diferençasmorfológicas entre os embriões. Desta forma, o estudo da viabilidade celular e a análise ultra-estruturaldemonstrou que embriões oriundos de tratamento superovulatório apresentam características e qualidadesimilar a embriões oriundos de colheitas convencionais.Agradecimentos: Bioniche Animal Health Inc., Canadá; Laboratórios Calier do Brasil, São Paulo, Brasil

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ANTECIPAÇÃO DA ESTAÇÃO REPRODUTIVA E INDUÇÃO DE MÚLTIPLASOVULAÇÕES EM ÉGUAS TRANSICIONAIS COM HORMÔNIO FOLÍCULO

ESTIMULANTE EQÜINO PURIFICADO (eFSH).

Peres, K.R.1; Fernandes, C.B.1; Siqueira-Pyles, E.S.C.1; Landim-Alvarenga, F.C.1;Alvarenga, M.A.1; Squires, E.L.2

1 Department of Animal Reproduction and Veterinary Radiology – University of São Paulo State,Botucatu, SP, Brazil, 18618-000. 2 Animal Reproduction Biotechnology Laboratory - Colorado State

University, Fort Collins, CO, USA, 80523. [email protected]

O FSH eqüino purificado (eFSH® - Bioniche Animal Health Inc., Canadá) foi utilizado para induzir odesenvolvimento de múltiplos folículos e a ovulação em éguas em transição. Vinte e oito éguas, de três aquinze anos, foram examinadas durante os meses de agosto a setembro de 2003 por ultra-sonografia duranteduas semanas antes do início do experimento para comprovar as características transicionais (nenhum folículo> 25 mm e nenhum corpo lúteo presente). Após este período, a partir do momento que as éguas adquiriramum folículo ≥ a 25mm, elas foram divididas alternadamente em dois grupos: 1) grupo controle – não tratado;2) grupo tratado com 12,5 mg de eFSH, duas vezes ao dia, até que metade dos folículos > 30 mm alcançassem35 mm. Quando a maioria dos folículos das éguas tratadas e quando o folículo das éguas controle adquiriramum tamanho pré-ovulatório (≥ 35 mm), foi administrado 2500UI de hCG (Vetecor® - Laboratórios CALIERdo Brasil Ltda, São Paulo), via endovenosa, para a indução da ovulação. Neste momento, as éguas foraminseminadas com sêmen fresco, em dias alternados, até a ovulação. O acompanhamento ultra-sonográficocontinuou até a detecção da ovulação e a recuperação embrionária foi realizada sete a oito dias após adetecção da ovulação. Para as análises estatísticas foi utilizado o teste t de Student. O tempo do início dotratamento até o primeiro folículo ≥ 35 mm e a ovulação foi mais curto (p<0,05) para as éguas tratadas (4,1e 6,6 dias) versus as éguas controle (14,9 e 18,0 dias), respectivamente. Contudo, após o tratamento luteolítico,o tempo para a segunda ovulação foi maior para as éguas tratadas (22,4 dias) do que para as éguas controle(10,9 dias). O período médio de tratamento foi igual a 4,79 ± 1,07 dias e 85,71% das éguas tiveram múltiplasovulações. O número de ovulações e embriões recuperados foi maior (p<0,05) para as éguas tratadas (5,6e 2,0) versus as éguas controle (1,0 e 0,7). Concluindo, o eFSH foi eficiente para acelerar o início da estaçãoreprodutiva, promover múltiplas ovulações e aumentar a recuperação embrionária.Agradecimentos: Bioniche Animal Health Inc., Canadá; Laboratórios CALIER do Brasil, Ltda, São Paulo,Brasil

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EFEITO DO TRATAMENTO SUPEROVULATÓRIO ASSOCIADO AO DISPOSITIVOINTRAVAGINAL DE PROGESTERONA E BENZOATO DE ESTRADIOL

NA CONCEPÇÃO DE RECEPTORAS BOVINAS

Sá Filho, O.G.1; Vasconcelos, J.L.M.1; Santos, R.M.1; Lara, C.S.2; Matos, S.P.M.2; Jacob, M.2

1Departamento de Produção e Exploração Animal – FMVZ/UNESP, Botucatu-SP, 18618-000. 2CenatteEmbriões, Caixa Postal 64, Pedro Leopoldo, MG, 33600-000. [email protected]

Este trabalho avaliou os resultados de 5.395 transferências de embriões, realizadas pela Cenatte Embriões,durante o ano de 2002. Os embriões utilizados foram obtidos de dois tratamentos superovulatórios:Tratamento-1) Observação de cio e início da superovulação 8 a 12 dias após; Tratamento-2) CIDR®+Estrogin®

(4mL) em dia aleatório do ciclo estral e início da superovulação no quinto dia. Os tratamentos superovulatóriosforam realizadas com Folltropin® ou Pluset®. As receptoras (Bos taurus x Bos indicus) receberam umaaplicação de PGF2α

(dia seis à tarde) e foram observadas em estro. Nas que apresentaram estro foi realizada

a avaliação do CL por palpação retal (incluso, 1<2<3) e as transferências realizadas pelo método não-cirúrgico 5 a 9 dias após o estro. Os dados foram analisados pelo GLM, sendo incluídas no modelo asvariáveis tratamento superovulatório, tipo de FSH, classificação do CL da receptora, sincronia doadora-receptora (-2, -1, 0, +1, +2), estádio de desenvolvimento embrionário (Mo, Bi, Bl, Bx, Be - IETS) equalidade do embrião (grau 1, 2, 3 - IETS). A taxa de concepção foi influenciada pela sincronia doadora-receptora (-2: 52,2±3,1%; -1: 65,8±2,0%; 0: 69,5±1,7%; +1: 65,4±1,9%; +2: 54,9±4,2%; P<0,001),estádio de desenvolvimento embrionário (Mo: 64,6±2,0%; Bi: 65,7±1,9%; Bl: 63,7±1,8%; Bx: 57,8±2,0%;Be: 56,0±5,1%; P<0,001) e qualidade do embrião (Grau 1: 66,5±1,7%; Grau 2: 59,6±1,8%; Grau 3:58,6±2,9%; P<0,001). Não foi detectado efeito do tamanho do CL na taxa de concepção das receptoras(incluso: 62,0±2,9%; grau 1: 64,0±2,9%; grau 2: 60,0±2,9% e grau 3: 60,0±2,9%; P=0,53), indicando quea sincronia é um parâmetro mais importante que o tamanho do CL na seleção das receptoras a sereminovuladas. É interessante observar que as receptoras que receberam embriões obtidos de doadorassubmetidas ao tratamento 2 apresentaram melhor taxa de concepção (63,1±1,8% vs. 60,0±1,9%; P=0,02)em relação às que receberam embriões obtidos de doadoras submetidas ao tratamento 1. Possivelmente, asincronização da onda folicular nas doadoras apesar de não alterar o número de embriões viáveis produzidos(BO et al., Theriogenology, v.45, p.897-910, 1996), proporcionou o desenvolvimento de um grupo defolículos mais uniforme quanto à idade e o diâmetro, o que pode ter beneficiado a qualidade intrínseca dosoócitos e dos embriões, que não pode ser avaliada visualmente. A sincronização da onda folicular em doadorascom utilização de dispositivos intravaginais de progesterona associado a aplicação de benzoato de estradiolpode aumentar o número de prenhezes/coleta através do aumento na concepção das receptoras, já que aquantidade de embriões recuperados não se altera com esses tratamentos.

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UTILIZAÇÃO DE DISPOSITIVO INTRAVAGINAL DE PROGESTERONA ASSOCIADO AO BENZOATO DE ESTRADIOL EM PROGRAMAS DE

SUPEROVULAÇÃO NA ESPÉCIE BOVINA

Vasconcelos, J.L.M.1; Sá Filho, O.G.1; Santos, R.M.1; Belisario, H.L.R.2;Alvin, M.T.T.2; Jaliba, W.P.2

1 Departamento de Produção e Exploração Animal – FMVZ/UNESP, Botucatu-SP, 18618-000. 2CenatteEmbriões, Caixa Postal 64, Pedro Leopoldo, MG, 33600-000. [email protected]

A transferência de embriões ainda encontra algumas limitações como alta variação dos resultados desuperovulação e a falta de programação das colheitas, fazendo com que o técnico gaste muito tempo com umúnico animal, o que aumenta os custos por embrião. O presente trabalho avaliou os resultados de 1.167coletas de embriões, realizadas pela Cenatte Embriões, durante o ano de 2002. As doadoras, das raçasNelore, Gir e Guzerá, foram divididas em: Tratamento-1) Observação de cio e início da superovulação após8 a 12 dias (n=379); Tratamento-2) CIDR®+Estrogin® (4mL) em dia aleatório do ciclo estral e início dasuperovulação no quinto dia (n=788). As superovulações foram realizadas com 8 aplicações de FSH emdoses decrescentes (Folltropin® ou Pluset®), duas vezes ao dia. A aplicação de PGF2α foi realizada nosétimo dia a tarde (sexta aplicação de FSH) e o dispositivo intravaginal de progesterona foi retirado no oitavodia pela manhã (sétima aplicação de FSH). Vacas detectadas em estro até às 12:00h do nono dia foraminseminadas às 20:00 e 6:00h e as detectadas em estro entre 12:00 e 18:00h foram inseminadas as 6:00 e18:00h. Vacas que não apresentaram estro até às 18:00h receberam 200µg de GnRH (Conceptal®) e foraminseminadas às 6:00 e 18:00h. As colheitas foram realizadas 7 a 8 dias após a IA. Os dados foram analisadospelo GLM, sendo incluídas no modelo as variáveis raça, tratamento, tipo de FSH, manifestação de estro e asinterações. Não foi detectado efeito de tratamento no número de estruturas viáveis (5,59±0,52 vs. 5,47±0,25;P=0,82) e não-viáveis (4,06±0,53 vs. 4,19±0,26; P=0,82). As doadoras que não foram detectadas emestro até 48h após a PGF2α

apresentaram menor número de estruturas viáveis (3,69±0,17 vs. 6,09±0,17;

P<0,001) e não-viáveis (2,84±0,38 vs. 4,94±0,17; P<0,001). Esses dados permitem concluir que o uso dedispositivos intravaginais de progesterona associado ao estrógeno para sincronizar a onda folicular, emprotocolos de superovulação, apresentam resultados similares aos protocolos que utilizam cio-base, podendoser utilizados para programar as colheitas, otimizando o manejo, o que reduz os custos por embrião.

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RESULTADOS DE OVULAÇÕES MÚLTIPLAS SUCESSIVAS EM DOADORASNULÍPARAS, BOS INDICUS DA RAÇA GIR E BOS TAURUS DA RAÇA HOLANDESA

Lopes, B.C.1; Ferreira, M.B.D.4; Souza, J.C.3; Azevedo, N.A.4; Freitas, C.2; Sales, J.N.S.5.

1DSc., MSc.,Médica Veterinária – av. Aimorés 512 b. Carmo cep 35400716 - Sete Lagoas MG – autônoma, e-mail:[email protected]. 2Pesquisador da EMBRAPA – Centro Nacional de Pesquisa em Gado de Leite, Faz Exp Santa

Mônica Valença RJ, e-mail: cé[email protected]. 3Professor adjunto – Departamento de Zootecnia da UFLA ;e-mail:[email protected]. 4Pesquisador da EPAMIG – Centro Tecnológico do Triângulo e Alto Paranaíba Cxp 351 cep 38001970

– Uberaba, MG, e-mail: [email protected]. 5MSc. Médico Veterinário, Aluno de Doutorado da UFLA.

O estudo foi realizado de janeiro a dezembro de 2003 na Fazenda Experimental Santa Rita, EPAMIG, SeteLagoas, MG. Avaliou-se a produção de embriões F1 Gir x Holandês advindos de nulíparas de cada umadestas subespécies, considerando-se os índices de fertilidade dentro da raça da doadora, em trêssuperovulações consecutivas, intervaladas de aproximadamente 60 dias. Utilizou-se 38 novilhas com atividadeluteal cíclica, sendo, 22 da raça Gir, com idade média de 33,63±4,46 meses e 16 da raça Holandesa, comaproximadamente, 22,27±3,68 meses. As fêmeas tiveram seus ciclos sincronizados com duas aplicações de500 µg de Cloprostenol (Ciosin®) intramuscular, intervaladas de 11 dias. O tratamento superovulatório foiiniciado entre o 8º e o 12º dia após o cio base, induzido pelo Ciosin®. As novilhas Gir receberam no total 100UI de FSH (Pluset®), diluídas em 3 ml de soro fisiológico e administradas por quatro dias consecutivos, emdoses intramusculares decrescentes, intervaladas de 12 horas. Administrou-se 500 µg de Cloprostenol juntocom a 6ª aplicação de FSH. Para as Holandesas repetiu-se o protocolo das Gir, porém a dose de FSH foi de200 UI. As novilhas foram re-sincronizadas após a 1ª e 2ª coleta, repetindo-se o protocolo inicial. Osovários foram avaliados por ultra-sonografia no dia do cio, pela contagem de folículos ≥ 7 mm nos ovários,no dia da coleta, foram contados os folículos não ovulados e os corpos lúteos. A coleta dos embriões foirealizada no 7º dia após o início do estro e as estruturas recuperadas foram avaliadas de acordo com asnormas da IETS. O método estatístico utilizado foi a análise de variância e as médias foram comparadas peloteste de T. O número médio de corpos lúteos palpáveis no dia da coleta foi similar entre a 1ª, 2ª e 3ª coleta,de : 7,86±5,7 (n=38); 8,08±5,2 (n=34) e 6,75±5,7 (n=16), bem como, o número de estruturas recuperadas,de 6,96±4,25; 5,50±3,9 e 6,09±5,6, o numero de embriões viáveis, de: 4,09±3,12; 2,92±2,3 e 4,45±4,7 eo numero de folículos não ovulados, de: 1,62±2,6; 1,19±2,0 e 0,80±2,2 respectivamente, para ambas asraças. Não houve diferença quanto ao número de folículos no dia do cio nos ovários entre a 1ª e a 2ª coleta,cujos valores foram de 17,55±10,3 e 13,57±7,7, respectivamente, para ambas as raças. Nas novilhasHolandesas, a resposta à ovulação múltipla na terceira estimulação (7,11±3,9), foi menor que na segunda(12,84±8,3; p<0,05). Na raça Gir, não registrou-se diferentes respostas quanto ao número de folículosovarianos no estro, de acordo com a ordem de superovulação (18,05±11,1; 13,96±7,5 e 13,57±7,5 para a1ª, 2ª e 3ª, respectivamente, p>0,05), registrando-se que, das 25 novilhas utilizadas em duas coletas e dassete superovuladas três vezes, todas gestaram normalmente após o experimento. Concluiu-se que a dose de100 UI de FSH, repetidas em três protocolos consecutivos, intervalados de 60 dias após a coleta, estimuloude maneira satisfatória os ovários de novilhas Gir, sem prejuízo para a atividade reprodutiva das mesmas. Osresultados sugerem que baixas doses de FSH podem ser eficientes para a superovulação de novilhas taurinase zebuínas.

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CONTROLE HORMONAL DO CICLO ESTRAL EM VACAS ACÍCLICAS

Dias, A.J.B.1; Matos, L.F.1; Fontes, R.S1

1 Setor de Reprodução Animal, Laboratório de Melhoramento Genético Animal – CCTA/ UENF,Campos dos Goytacazes-RJ, Brasil. [email protected]

O retorno ao cio pós-parto é um dos principais fatores que interferem na taxa de prenhez em rebanhosbovinos de corte, que utilizam uma estação de monta definida. O objetivo deste trabalho foi avaliar a utilizaçãodo tratamento hormonal com progesterona, na indução da ovulação em vacas acíclicas no final da estação demonta. Foram utilizadas vacas mestiças (europeu x Nelore, n=30), multíparas, que ao exame por ultra-sonografia apresentaram folículos maiores que 5 mm de diâmetro e ausência de corpo lúteo em ambos osovários. Todas as vacas eram lactantes, tinham mais de 90 dias pós-parto e encontravam-se no último mêsda estação de monta. Registrou-se o escore corporal (EC, escala de 1 a 5) dos animais ao início e ao final doexperimento. O grupo de animais submetidos ao tratamento hormonal foi composto por 24 vacas, quereceberam um dispositivo intravaginal de liberação controlada de progesterona (CIDR, 1,9 g). Este dispositivofoi mantido por dez dias, sendo o dia de sua colocação, considerado o dia zero (D0) do tratamento. Benzoatode estradiol (BE) foi aplicado por via intramuscular em D1 (2mg) e D11 (1mg). O grupo controle foi compostopor seis vacas, mantidas sob as mesmas condições do grupo tratado, nas quais não se realizou nenhumtratamento hormonal. Nestes animais foi feita apenas a observação do cio durante todo o período doexperimento. A inseminação artificial foi realizada doze horas após a observação do cio parado. Apenas umadas vacas do grupo tratado (1/24) não foi observada em cio, as demais foram inseminadas no dia seguinte daúltima aplicação do BE. Até o dia do diagnóstico de gestação, as seis vacas utilizadas no grupo controlepermaneceram anovulatórias, sem a observação de corpo lúteo ao exame ultra-sonográfico. O tratamentohormonal com progesterona e BE resultou na prenhez de 14 vacas (58%). Observou-se que vacas commaior EC (3,0-3,5) apresentaram melhores taxas de gestação (60-62%) do que as vacas com baixo EC(2,5; 50%). Os resultados demonstram que o tratamento hormonal com progesterona e BE é eficiente naredução do anestro pós-parto de vacas de corte, diminuindo o número de vacas vazias no final da estação demonta. Tais protocolos podem contribuir, de maneira econômica, para aumentar a eficiência do manejoreprodutivo da estação de monta.

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CONCENTRAÇÃO SÉRICA DE PROGESTERONA EM NOVILHAS CRUZADASNELORE/ANGUS TRATADAS COM DIFERENTES DISPOSITIVOS

INTRAVAGINAIS DE PROGESTERONA

Santos, R.M.; Vasconcelos, J.L.M.; Perez, G.C.; Sá Filho, O.G.; Maciel, A.B.B.

Departamento de Produção e Exploração Animal - FMVZ–UNESP, Botucatu, SP, 18.618-000, [email protected]

Os dispositivos intravaginais de progesterona (P4) são usados para induzir ciclicidade e sincronizar estro/ovulação, através da liberação de P4 na circulação. O objetivo foi determinar a concentração sérica de P4durante tratamento por 25 dias com os diferentes dispositivos intravaginais CIDR 1,38g, CIDR 1,9g,CRONIPRESS, DIB e PRID em novilhas cruzadas Nelore/Angus (n=64), previamente sincronizadas com oprotocolo Ovsynch modificado (GnRH, 50µg - 6d - PGF2α, 25mg - 48h – GnRH, 50µg). Sete dias após asegunda aplicação de GnRH, as novilhas sincronizadas (n=44) receberam uma aplicação de PGF2α e 24horas depois foram divididas: G1 (n=9) CIDR 1,38g; G2 (n=9) CIDR 1,9g; G3 (n=9) CRONIPRESS; G4(n=9) DIB e G5 (n=8) PRID. Somente as novilhas que regrediram o corpo lúteo (determinado pelo decréscimona concentração sérica de P4 entre os dias 6, 7, 7,5 e 8 após aplicação do segundo GnRH) foram mantidasno experimento (G1: n=5, G2: n=7; G3: n=7; G4: n=8; G5: n=5). A concentração sérica de P4 foi determinadapor RIA. O pico da concentração sérica de P4 foi avaliado 0, 1, 4, 8 e 12 horas após a inserção dosdispositivos, a concentração sérica durante os 25 dias de tratamento foi determinada a cada dois dias e odecréscimo foi determinado 0, 1, 4 e 8 horas após a remoção do dispositivo. Os dados foram analisados poranálise de variância. Duas novilhas do G2 (CIDR 1,9g) perderam o dispositivo (no dia 8 e no dia 25) e foramexcluídas das análises posteriores. Uma hora após a inserção dos dispositivos foi encontrado o pico daconcentração sérica de P4 nos grupos G1 (10,2±1,01ng/mL); G2 (6,8±0,86ng/mL); G3 (6,4±0,86ng/mL);G4 (6,9±0,80ng/mL) e este foi influênciado pelo tratamento (P<0,05). O pico do G5 (6,3±0,63ng/mL) foiobservado com 8 horas. A concentração de P4 foi mantida acima de 1ng/mL até o dia 13 no G4 (DIB); atéo dia 15 no G3 (CRONIPRESS); até o dia 22 no G5 (PRID) e até o dia 25 no G1 (CIDR 1,3g) e G2 (CIDR1,9g). O decréscimo na concentração sérica de P4 após a retirada do implante foi similar em todos osgrupos. No G1 (CIDR 1,38g) foi detectado o maior pico uma hora após a inserção do dispositivo. Este fatopode ser importante em protocolos de sincronização pois mudanças na concentração de P4 afetam apulsatilidade de LH e o “turnover” do folículo dominante, e consequentemente, a emergência da nova ondade crescimento folicular. Estes resultados também mostram que os dispositivos intravaginais de progesteronapodem ser utilizados mais de uma vez, de acordo com o número de dias que cada dispositivo mantém aconcentração de progesterona acima de 1ng/mL.

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TAXA DE PRENHEZ, APÓS INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL COM TEMPO FIXO(IATF), EM DOADORAS DA RAÇA NELORE SUBMETIDAS A

DIVERSAS COLHEITAS DE EMBRIÃO

Nogueira, M.F.G. *; Barros, C.M.

Departamento de Farmacologia, Instituto de Biociências, UNESP, 18618-000 Botucatu – São Paulo,Brasil - [email protected], [email protected]

O tratamento hormonal de superestimulação ovariana aliado aos possíveis traumas mecânicos e infecciososinerentes à colheita de embriões, constantemente são imputados como fatores de diminuição da fertilidade dedoadoras bovinas após o término da sessão de colheitas. Este trabalho tem o objetivo de comparar aperformance reprodutiva de animais Nelore submetidos à colheita embrionária e, posteriormente, tratadoscom protocolo de IATF. Vacas da raça Nelore foram superestimuladas com o protocolo P36 (Barros, Portoe Nogueira, Theriogenology, 59:524, 2003) e os embriões foram colhidos após 7 a 8 dias da administraçãodo indutor da ovulação (pLH, 25 mg, im, Lutropin). As doadoras (n=39) foram superestimuladas e colhidasentre 1 e 4 vezes (n=61 colheitas) antes de serem tratadas com o protocolo de IATF (entre 20 e 100 diasapós a última colheita realizada). Antes da IATF em cada doadora, a condição ovariana foi monitorada até acompleta regressão dos CLs oriundos da superovulação, além da ausência de cistos ou patologias ovarianas,do oviduto ou uterinas. Em dias aleatórios do ciclo estral (D0), os animais foram tratados com um dispositivointravaginal contendo progesterona e utilizado previamente (DIB, 1 g), concomitante à administração debenzoato de estradiol (BE, 2 mg, im, Estrogin). No D8 os animais foram tratados com prostaglandina (150µg, im, Prolise) e o DIB foi removido. Vinte e quatro horas após a remoção do DIB (D9) foi administrado 1mg de BE (IM) e todos os animais foram inseminados (IATF) entre 30 e 34 h após a administração do BE(D10). Os animais que não gestaram após a primeira IATF receberam um segundo tratamento. As taxas deprenhez, determinadas por palpação retal ao redor de 60 dias após a IATF, não diferiram significativamente(p>0,9) entre as doadoras submetidas previamente entre 2 e 4 colheitas (92,3%; 12/13) e aquelas colhidasapenas uma vez (88,5%; 23/26). Em média, foi necessária 1,23 dose de sêmen para cada prenhez obtida.Quando os animais foram analisados quanto ao número de prenhezes produzidas por colheita, as doadorasque foram colhidas 2 a 4 vezes produziram, em média, 4,4 prenhezes em cada colheita (153/35), com umamédia de 2,7 colheitas realizadas em cada doadora. Nos animais colhidos uma vez, foram produzidas 2,1prenhezes, em média, por colheita (53/26). Conclui-se que o aumento na freqüência de tratamentossuperovulatórios e de colheitas embrionárias, não alterou a taxa de prenhez após IATF.*Bolsista da FAPESP, no curso de pós-graduação da FMVZ-UNESP.

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TAXA DE CONCEPÇÃO À INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL E À TRANSFERÊNCIA DEEMBRIÕES EM VACAS HOLANDESAS DE ALTA PRODUÇÃO E REPETIDORAS DE

SERVIÇO

Rodrigues, C.A.1, Ayres, H.2, Reis, E.L.2, Nichi, M.2, Bo, G.A.3;Baruselli, P.S2

1Clínica Veterinária SAMVET de São Carlos, São Carlos-SP, Brasil. 2Departamento de ReproduçãoAnimal, FMVZ – USP, São Paulo – SP, 05508-000, Brasil. 3Instituto de Reproducción Animal Córdoba

(IRAC), Córdoba, Argentina. [email protected]

O presente trabalho teve como objetivo avaliar a taxa de concepção à inseminação artificial e à transferênciade embriões em vacas Holandesas de alta produção repetidoras de cio (≥ 4 serviços; repeat breeder). OExperimento foi realizado na fazenda Agrindus S/A, em Descalvado – SP. Foram utilizadas 2803 IAs e 2066TEs em vacas Holandesas de alta produção (28,4 ± 2,3 kg/dia) durante os anos de 2000, 2001, 2002 e2003. Os animais foram submetidos à observação de cio e subsequente IA (12h após) ou TE (7 dias após).Os embriões utilizados foram obtidos pela técnica de MOET. Os dados foram comparados de acordo como método (IA e TE) e com o mês do ano (janeiro a dezembro). Os dados foram analisados pelo teste de Qui-quadrado, adotando-se 5% de nível de significância. Não se verificou interação entre o ano e o método (IAe TE). A taxa de concepção em vacas repeat breeder foi superior (P<0,01) em animais inovulados (41,4%;855/2066) que em animais inseminados (18,2%; 511/2803). As taxas de concepção para IA e TE de janeiroa dezembro (anos agrupados) foram Jan: 12,4% (23/185)a vs 41,7% (70/168)b; Fev: 11,8% (27/228)a vs45,7% (79/173)b; Mar: 12,3% (38/309)a vs. 41,4% (82/198)b; Abr: 10,5% (31/296)a vs. 43,2% (73/169)b; Mai: 18,8% (54/287)a vs. 46,6% (103/221)b; Jun: 19,8% (64/323)a vs. 33,6% (49/146)b; Jul:28,4% (97/342)a vs. 40,0% (64/160)b; Ago: 26,9% (47/175)a vs. 42,8% (71/166)b; Set: 25,5% (40/157)a

vs. 48,1% (74/154)b; Out: 27,5% (39/142) vs. 30,1% (50/166); Nov: 21,2% (24/113)a vs 37,1% (76/205)b; Dez: 11,0% (27/246)a vs 44,4% (64/144)b, respectivamente (a≠b, P<0,05). Os resultados indicaramque a TE apresenta maior taxa de concepção que a IA ao longo do ano em vacas Holandesas de altaprodução repetidoras de cio (repeat breeder).

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AUMENTO DA TAXA DE PRENHEZ EM VACAS NELORE INSEMINADAS EM TEMPOFIXO COM O USO DE eCG EM DIFERENTES PERÍODOS PÓS PARTO

Rodrigues, C.A.1; Ayres, H.2; Reis, E.L.2; Madureira, E.H.2; Baruselli, P.S.2

1Clínica Veterinária SAMVET de São Carlos, São Carlos-SP, Brasil. 2Depart. de Reprodução Animal,FMVZ-USP, São Paulo-SP, Brasil. [email protected]

O objetivo desse estudo foi avaliar o efeito do eCG no protocolo para inseminação artificial em tempo fixo(IATF) a base de progestágeno em diferentes períodos pós-parto (PPP) de vacas Nelore lactantes. Foramutilizadas 298 vacas Nelore lactantes (76,1 ± 51,6 dias pós-parto) mantidas a pasto na região de Araraquara– SP. Em dia aleatório do ciclo estral (D0), todos os animais receberam 3 mg de Norgestomet e 5 mgValerato de Estradiol IM associados a um implante auricular contendo 3 mg de Norgestomet (Crestar®,Intervet). No D9, o implante foi removido e metade dos animais receberam 400 UI de eCG (Folligon®,Intervet). Todos os animais foram inseminados 54h após a retirada do implante. Os animais foram divididosem 4 PPPs e foi analisado o efeito do eCG em cada período. O P20-39 foi composto por animais com PPPde 20 a 39 dias, que receberam (n=25) ou não (n=25) 400 UI de eCG no momento da retirada do implante.O P40-49 foi composto por animais com PPP de 40 a 49 dias, com (n=21) ou sem (n=23) a administraçãode eCG. O P50-59 foi composto por animais com PPP de 50 a 59 dias, com (n=47) ou sem (n=39) aadministração de eCG. O P>59 foi composto por animais com PPP maior que 59 dias, com (n=56) ou sem(n=62) a administração de eCG. O diagnóstico de gestação foi realizado via ultra-sonografia 30 dias após aIATF. As taxas de prenhez foram analisadas pelo teste de Qui-quadrado. Verificou-se efeito positivo do eCGdentro de cada período: P20-39 [40,0% (10/25) vs. 12,0% (3/25), P=0,01]; P40-49 [42,9% (9/21) vs.21,7% (5/23), P=0,06]; P50-59 [59,6% (28/47) vs. 41,0% (16/39), P=0,04]; P>59 [66,1% (37/56) vs.46,8% (29/62), P=0,01]. Os resultados indicaram que o tratamento com eCG no momento da retirada doimplante auricular de Norgestomet aumentou a taxa de concepção à inseminação artificial em tempo fixo emtodos os períodos pós-parto, com exceção do P40-49 no qual se verificou uma tendência (P=0,06). Osdados mostram que é possível antecipar o primeiro serviço pós-parto com a utilização do eCG em programasde sincronização da ovulação para IATF.

Agradecimento: Intervet

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EFEITO DO eCG E DO GnRH NA TAXA DE PRENHEZ DE VACAS NELORELACTANTES INSEMINADAS EM TEMPO FIXO

Silva, R.C.P.1; Rodrigues, C.A.2; Marques, M.O.1; Ayres, H.3; Reis, E.L.3;Nichi, M.3; Madureira, E.H.3; Baruselli, P.S.3

1GERAEMBRYO, Cornélio Procópio-PR, Brasil. 2Clínica Veterinária SAMVET de São Carlos, SãoCarlos-SP, Brasil. 3Departamento de Reprodução Animal, FMVZ-USP, São Paulo-SP, Brasil.

[email protected]

Com o objetivo de aumentar as taxas de prenhez na inseminação artificial em tempo fixo (IATF), o presentetrabalho analisou o efeito da administração de eCG e de GnRH no tratamento com implante auricular deprogestágeno em vacas Nelore lactantes. Foram utilizadas 599 vacas Nelore lactantes (76,1 ± 51,6 diaspós-parto) mantidas a pasto na região de Brasilândia-MS (Agropecuária HORA) e de Araraquara-SP(Agropecuária NSA). Os animais foram divididos homogeneamente em quatro grupos experimentais (fatorial2x2). Em dia aleatório do ciclo estral (D0), os animais receberam 3 mg de Norgestomet e 5 mg de Valeratode Estradiol IM associados a um implante auricular contendo 3mg de Norgestomet (Crestar®, Intervet). NoD9, o implante foi removido e todos os animais foram inseminados 54h após. O grupo G-CON (n=152) nãofoi submetido a nenhum tratamento adicional. O G-GnRH (n=147) foi tratado com 100 µg de GnRH IM(Fertagyl®, Intervet) no momento da IATF. O G-eCG (n=151) foi tratado com 400 UI de eCG IM (Folligon®,Intervet) no momento da retirada do implante. O G-eCG+GnRH (n=149) foi tratado com 400 UI de eCGno momento da retirada do implante e com 100 µg de GnRH no momento da IATF. O diagnóstico degestação foi realizado por ultra-sonografia 30 dias após a IATF. As taxas de prenhez foram analisadas peloteste de Qui-quadrado. Não foi verificada interação entre os tratamentos. As taxas de prenhez para osgrupos G-CON, G-GnRH, G-eCG e G-eCG+GnRH foram de 27,6% (42/152)c, 40,1% (59/147)b, 47,7%(72/151)ab e 55,7% (83/149)a, respectivamente (P<0,05). Analisando-se os efeitos principais, verificou-seaumento na taxa de prenhez (P<0,05) pelo tratamento com eCG [51,8% (155/300)a vs. 33,8 (101/299)b] ecom GnRH [48,0 (142/296)a vs. 37,6% (114/303)b]. Os resultados indicaram que tanto o tratamento comeCG no momento da retirada do implante auricular de Norgestomet quanto o tratamento com GnRH nomomento da IATF aumentam a taxa de prenhez de vacas Nelore lactantes inseminadas em tempo fixo.

Agradecimento: Intervet

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EFEITO DO CIPIONATO E DO BENZOATO DE ESTRADIOL NA TAXA DEPRENHEZ DE VACAS NELORE INSEMINADAS EM TEMPO FIXO

Marques, M.O.1; Ayres, H.1; Reis, E.L.1; Mapletoft, R.J.2; Baruselli, P.S.1

1Departamento de Reprodução Animal, FMVZ – USP, São Paulo – SP, CEP 05508-000, Brasil.2Western College of Veterinary Medicine, University of Saskatchewan, Saskatoon, SK, Canada S7N

5B4. [email protected]

O presente experimento teve como objetivo comparar as taxas de prenhez com a administração de Benzoatode estradiol (BE) ou de Cipionato de estradiol (CE) na indução da ovulação em dois momentos distintos doprotocolo de inseminação artificial em tempo fixo (IATF) com progesterona (P4). Foram utilizadas 214vacas Nelore lactantes (60-90 dias pós-parto), mantidas a pasto em Brasilândia-MS. Os animais foramdivididos aleatoriamente em 4 grupos experimentais (fatorial 2x2) de acordo com o período pós-parto e como escore de condição corporal (1-5). Em dia aleatório do ciclo estral (Dia 0), os animais foram tratados com2 mg de BE IM (Estrogin®, Farmavet) e com dispositivo intravaginal contendo 1,9 g de P4 (CIDR®, Pfizer).No Dia 8, os dispositivos foram removidos e administrou-se 25 mg de Dinoprost IM (Lutalyse®, Pfizer)juntamente a 400 UI de eCG IM (Novormon®, Syntex). A partir desse momento os grupos experimentaisforam divididos quanto ao indutor de ovulação administrado e ao momento da administração. Grupo CE0(n=57): 0,5mg de CE (ECP®, Pfizer) no Dia 8 (retirada do dispositivo); Grupo CE24 (n=52): 0,5mg de CEno Dia 9 (24h após a retirada do dispositivo); Grupo BE0 (n=51): 1mg de BE no Dia 8; e Grupo BE24(n=54): 1mg de BE no Dia 9. A IATF foi realizada 54h após a remoção dos dispositivos intravaginais de P4em todos os grupos. O diagnóstico de gestação foi realizado por ultra-sonografia 30 dias após a IATF. Astaxas de prenhez foram comparadas pelo teste de Qui-quadrado. Não foi verificada interação entre osgrupos experimentais. As taxas de prenhez para os grupos CE0, CE24, BE0 e BE24 foram 45,6% (26/57),42,3% (22/52), 41,2% (21/51) e 42,6% (23/54), respectivamente (P>0,05). Analisando-se os efeitosprincipais, encontrou-se taxas de prenhez semelhantes (P>0,05) para o CE e para o BE [44,0% (48/109) vs.41,9% (44/105)] administrados no Dia 8 ou no Dia 9 [43,5% (47/108) vs. 42,5% (45/106)]. Os resultadosmostraram que o Cipionato e o Benzoato de estradiol administrados no momento da retirada do dispositivode progesterona ou 24h depois apresentam taxas de prenhez semelhantes em vacas Nelore lactantesinseminadas em tempo fixo.

Agradecimento: Pfizer

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EFEITO DO eCG E DO DESMAME TEMPORÁRIO NA TAXA DE PRENHEZ DE VACASNELORE LACTANTES INSEMINADAS EM TEMPO FIXO

Penteado, L.1; Ayres, H.2; Reis, E.L.2; Madureira, E.H.2; Baruselli, P.S.2

1ETAPA, Londrina - PR, Brasil. 2Departamento de Reprodução Animal, FMVZ -USP, São Paulo - SP,Brasil. [email protected]

Com o objetivo de aumentar as taxas de prenhez na inseminação artificial em tempo fixo (IATF), o presentetrabalho analisou o efeito do desmame temporário e da administração de eCG no tratamento com implanteauricular de progestágeno em vacas de Nelore lactantes. Foram utilizadas 457 vacas Nelore lactantes (40-100d pós-parto) mantidas a pasto na região de Camapuã-MS (Agropecuária Café no Bule). As vacas foramdivididas homogeneamente em 4 grupos experimentais (fatorial 2x2) de acordo o escore de condição corporal.Em dia aleatório do ciclo estral (D0), os animais receberam 3 mg de Norgestomet e 5 mg de Valerato deEstradiol IM associados a um implante auricular contendo 3 mg de Norgestomet (Crestar®, Intervet). NoD9, o implante foi removido e todos os animais foram inseminados 54h após. O grupo G-CON (n=118) nãofoi submetido a nenhum tratamento adicional. O G-eCG (n=112) foi tratado com 400 UI de eCG IM (Folligon®,Intervet) no momento da retirada do implante (D9). No G-DES (n=114) foi realizado o desmame temporáriopor 54h (retirada do implante à IATF). O G-eCG+DES (n= 113) foi tratado com 400 UI de eCG e submetidoao desmame temporário por 54h. O diagnóstico de gestação foi realizado por palpação retal 45 dias após aIATF. As taxas de prenhez foram analisadas pelo teste de Qui-quadrado. Não foi observada interação entreadministração de eCG e desmame temporário. As taxas de prenhez para os grupos G-CON, G-eCG, G-DES e G-eCG+DES foram de 37,3% (44/118)a, 52,7% (59/112)bc, 47,4% (54/114)ab e 58,4 (66/113)c,respectivamente (P<0,05). Analisando-se os efeitos principais, verificou-se aumento na taxa de prenhez(P<0,05) pelo tratamento com eCG [55,6% (125/225)a vs. 42,2% (98/232)b] e pela realização do desmametemporário [52,9% (120/227)a vs. 44,8% (103/230)b]. Os resultados indicaram que tanto o tratamento comeCG no momento da retirada do implante auricular de Norgestomet quanto o desmame temporário entre aretirada do implante e a IA aumentam a taxa de prenhez de vacas Nelore lactantes submetidas à IATF.

Agradecimentos: Intervet e Agropecuária Café no Bule

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EFEITO DO TRATAMENTO COM TRIU-B POR 7, 8 OU 9 DIAS EM PROGRAMAS DEINSEMINAÇÃO EM TEMPO FIXO EM VACAS E NOVILHAS CRUZA ZEBU

Balla, E.123; Cledou, G.4; Nosetti, L.5; Maraña Peña, D.2; Bó, G.A.13

1Universidad Católica de Córdoba, Argentina. 2Universidad Nacional de Córdoba, Argentina. 3Instituto deReproducción Animal Córdoba (IRAC), Jerónimo Luis de Cabrera 106, X5000GVD, Córdoba, 4Lab.

Biogénesis, 5Actividad Privada, Salliquelo, Argentina. e-mail: [email protected]

Foram realizados 3 experimentos para avaliar o efeito do tratamento com dispositivos Triu-B (no Brasil,Cronipres, Biogénesis) por 7, 8 ou 9 dias sobre as porcentagens de prenhez em novilhas e vacas secasInseminadas em Tempo Fixo (IATF). No experimento 1 foram utilizadas 447 novilhas cruza zebu de 20 a 26meses de idade e com condição corporal (CC) de 2,5 a 3,5 (escala 1 a 5). As novilhas receberam no Dia 0um Triu-B novo ou um Triu-B de 3º uso (suplementados com 3 anéis de 100mg de P4 cada uma) e 2 mg deBenzoato de Estradiol (EB; Bioestradiol, Biogénesis) por via intramuscular (IM). Ao mesmo tempo, asnovilhas foram subdivididas em três grupos para retirar o Triu-B no Dia 7, 8 ou 9. Todas novilhas receberam150 µg de D (+) Cloprostenol (Enzaprost-DC, Biogénesis) IM no momento em que foi retirado o Triu-B, 1mg de EB 24h mais tarde e foram IATF 28 a 32h depois. No Experimento 2 utilizaram 394 vacas secas cruzazebu e com uma CC de 2,0 a 3,0 que foram tratadas por 7, 8 ou 9 dias como no Experimento 1. Os Triu-Butilizados foram novos, de 2º uso ou de 3º uso. No experimento 3 utilizaram 129 vacas secas AberdeenAngus com uma CC de 2 a 2,5 que foram tratadas só com Triu-B novo por 7, 8, ou 9 dias. Os diagnósticosde prenhez foram realizados por ultra-sonografia aos 30 dias (Experimento 1 e 3) e 60 dias (Experimento 2)da IATF. Compararam as taxas de prenhez por Regressão Logística. No Experimento 1 não houve diferençanas taxas de prenhez entre os dias do tratamento (Triu-B 7 dias: 54,7%; 8 dias: 44,1% e 9 dias: 54,1%;P=0,98). Também não houve diferença entre os Triu-B novos (48,6%) e de 3º uso (53,2%; P=0,33). NoExperimento 2 também não observaram diferença entre os dias de tratamento (Triu-B 7 dias: 50,4%, 8 dias:48,9% ou 9 dias: 43,2%; P=0,28), nem entre Triu-B novos (47,7%), de 2º uso (48,9%) e de 3º uso (47,2%;P=0,91). Finalmente, não houve diferença nas porcentagens de prenhez obtidos no experimento 3 (Triu-B 7dias: 46,5%, 8 dias: 48,8% ou 9 dias: 53,5%; P=0,80). Os resultados demonstram que se pode utilizarprogramas de IATF de 7, 8 ou 9 dias com resultados similares de prenhez possibilitando a IATF de umgrande número de animais em três dias de trabalho de IA. Também não observaram diferença entre os Triu-B novos ou reutilizados até três vezes.

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EFEITO DA UTILIZACÃO DE DISPOSITIVOS CIDR-B NOVOS OU DETERCEIRO USO SOBRE AS PORCENTAGENS DE PRENHEZ EMVACAS CRUZA ZEBU INSEMINADAS EM TEMPO FIXO (IATF).

Bó, G.A.12 ; Balla, E.123; Venturini, M.2; Tribulo, R.13

1Universidad Católica de Córdoba, Argentina. 2Universidad Nacional de Córdoba, Argentina. 3Instituto deReproducción Animal Córdoba (IRAC), Jerónimo Luis de Cabrera 106, X5000GVD, Córdoba,

Argentina e-mail: [email protected]

Foi feito um experimento para avaliar as taxas de prenhez em vacas sincronizadas com dispositivos CIDR(1,9 g de progesterona; CIDR-B, Pfizer Salud Animal) novos ou CIDR previamente utilizados duas vezespor 8 dias (CIDR de 3º uso), nos campos da Argentina. O experimento 1 utilizaram 96 vacas secas cruzazebu com uma condição corporal (CC) de 2,5 a 3 (escala 1 a 5). No Dia 0, as vacas receberam umdispositivo CIDR novo ou um CIDR de 3º uso e 2 mg de benzoato de estradiol (EB, Estradiol 10, Lab. Ríode Janeiro) por via intramuscular (IM). No Dia 8 retiraram os CIDR e aplicaram uma dose de 500 µg decloprostenol (Estroplan, Syntex) IM e 24h mais tarde (Dia 9) foi aplicado 1 mg de EB IM. Os animais foramInseminados em Tempo Fixo (IATF) entre as 52 e 56h após a retirada do CIDR. No estabelecimento 2utilizaram vacas cruza zebu secas (n=23) e com cria ao pé (n=70), com uma CC de 2 a 2,5. As vacas foramtratadas da mesma maneira que no estabelecimento 1. Os diagnóstico de prenhez foram realizados porpalpação retal aos 60 dias da IATF no estabelecimento1 ou por ultra-sonografia transretal (100 Falco Vet.Pie Medical, com transdutor 8 MHz) aos 30 dias da IATF no etabelecimento 2. Foram comparadas as taxasde prenhez por Regressão Logística. Tanto para o estabelecimento 1 como 2, não foram encontradas diferençassignificativas nas taxas de prenhez entre as vacas tratadas com CIDR novos (estabelecimento 1: 21/49;42,9% e estabelecimento 2: 18/32; 56,3%) e as tratadas com CIDR de 3º uso (estabelecimento 1: 22/47;46,8% e estabelecimento 2: 33/61; 54,1% P>0,7). No estabelecimento 2 também não houve diferençasentre as vacas secas e com cria (P>0,6). Os resultados demonstram que se pode utilizar dispositivos CIDRem vacas cruza zebu até 3 vezes, sem que afetem significativamente as taxas de prenhez. Estes resultados sãoimportantes do ponto de vista prático, já que se pode diminuir significativamente o custo dos programas desincronização e IATF.

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EFEITO DO TRATAMENTO COM eCG E GnRH EM VACAS NELORE INSEMINADAS EM TEMPO FIXO

Duarte, R.A.1; Reis, E.L.2; Sá Filho, M.F.2; Bó, G.A.2; Baruselli, P.S.2; Kozicki, L.E.1

1UFPR, Curitiba/PR, Brasil. 2Depart. Reprod. Animal, FMVZ/USP, São Paulo/SP, Brasil. 3Inst.de Reprod. Animal Córdoba, Córdoba, Argentina. [email protected]

Este experimento teve como objetivo comparar o efeito da administração de eCG no momento da retiradado dispositivo intravaginal de progesterona (DP4) e da administração de GnRH para formação de CL acessório(indução da ovulação do folículo dominante da primeira onda de desenvolvimento folicular) em vacas Bosindicus (Nelore) submetidas à inseminação artificial em tempo fixo (IATF). Foram utilizadas 174 vacasNelore lactantes, mantidas a pasto em Francisco Beltrão-PR. Os animais foram divididos em 4 grupos(fatorial 2x2) de acordo com a condição corporal e ciclicidade (ultassonografia). No Dia 0, todos os animaisreceberam um DP4 (Cronipres®, Biogenesis) e 2 mg de BE IM (Estrogin®, Farmavet). No Dia 8, o DP4 foiremovido e administrou-se 0,15 mg de d-cloprostenol (Croniben®, Biogenesis). No dia 9, aplicou-se 1 mgde BE IM (24 horas após a retirada do DP4). A IATF foi realizada 54h após a remoção do DP4. Foirealizado um exame ultrassonográfico 12 dias após a IATF para detecção dos CL acessórios. O grupo G-CON (n=50) não recebeu nenhum tratamento adicional. O grupo G-GnRH (n=39) recebeu 0,2 mg deGonadorelina IM (GnRH, Fertagyl®, Intervet) cinco dias após a IATF. O grupo G-eCG (n=46) recebeu 400UI de eCG (Folligon®, Intervet) no momento da retirada do DP4. O grupo G-eCG+GnRH (n=42) foitratado com eCG e GnRH. O diagnóstico de gestação foi realizado por ultrassonografia 30 dias após a IATF.Analisou-se as taxas de prenhez (TXP) e o número de CL (NCL) pelo programa estatístico SAS for Windows.Não foi verificada interação entre os tratamentos. As médias para os grupos G-CON, G-GnRH, G-eCG eG-eCG+GnRH foram, respectivamente: TXP: 66,0% (33/50) vs. 53,8% (21/39) vs. 53,5% (23/43) vs.60,0% (29/42; P>0,05); NCL: 0,86±0,05a vs. 1,74±0,10b vs. 0,98±0,04a vs. 1,90±0,08b (P<0,05). Osefeitos principais não demostraram efeito sobre a TXP do tratamento com eCG [eCG: 61,2% (52/85) vs.não eCG: 60,7% (54/89); P>0,05] e com GnRH [GnRH: 61,7% (50/81) vs. não GnRH: 60,2% (56/93);P>0,05]. Observou-se efeito da aplicação de GnRH no NCL [GnRH: 1,82±0,06a vs. não GnRH: 0,91±0,03b,P<0,05]. Este efeito não foi observado no tratamento com eCG [eCG: 1,43±0,07 vs. não eCG: 1,26±0,07,P>0,05]. No presente experimento a administração de eCG no momento da retirada do DP4 e de GnRHcinco dias após a IATF não aumentaram a taxa de prenhez. No entanto, a administração de GnRH cinco diasapós a IATF foi eficiente para induzir a formação de CL acessório em vacas Nelore lactantes.Agradecimento: Biogenesis

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SINCRONIZAÇÃO DA OVULAÇÃO DE NOVILHAS COM PROGESTERONA EPROGESTÁGENO PARA INOVULAÇÃO EM TEMPO FIXO

Rodrigues, C.A.1; Mancilha, R.F.1; Reis, E.L.2; Mello, J.E.2; Ayres, H.2;Madureira, E.H.2; Baruselli, P.S.2

1Clínica Veterinária SAMVET de São Carlos, São Carlos-SP, Brasil. 2Depart. de Reprodução Animal,FMVZ – USP, São Paulo – SP, Brasil. [email protected]

Estudos anteriores mostraram satisfatória eficiência do tratamento com progesterona (P4) e eCG nasincronização da ovulação para inovulação em tempo fixo (ITF) em receptoras de embrião bovino. O presentetrabalho comparou a eficácia do tratamento com P4 ou progestágeno, associado ao Benzoato (BE) ou aoValerato de Estradiol (VE) no protocolo de superovulação de receptoras para ITF. Foram utilizadas 226novilhas B. taurus x B. indicus mantidas a pasto na região de São Carlos- SP. No D0, o Grupo 1 (G1;n=99), recebeu um implante auricular contendo 3mg de Norgestomet (NOR) juntamente com 5mg de VE e3mg de NOR IM (Crestar®, Intervet). No D6 administrou-se 500UI de eCG (Folligon®, Intervet) e no D9 osimplantes foram removidos. No D0, o Grupo 2 (G2; n=111) recebeu um implante auricular de NOR juntamentecom 2mg de BE e 50mg de P4 IM (Index). No D5, administrou-se 500UI de eCG e 150 mg d-cloprostenol(Preloban®, Intervet). A remoção do implante ocorreu no D8 e no D9 aplicou-se 1mg de BE IM. O Grupo3 (G3, n=116) recebeu o mesmo tratamento do G2, no entanto o implante auricular foi substituído por umdispositivo intravaginal de P4 (CIDR®; Pfizer). O dia do estro foi considerado o D11 para o G1, e o D10para o G2 e o G3. A avaliação ultrassonográfica ovariana foi realizada no momento da inovulação (9 diasapós a retirada da fonte de P4 ou progestágeno). Nas receptoras consideradas aptas (CL ≥ 13 mm dediâmetro) foi inovulado um embrião produzido in vitro. O diagnóstico de gestação foi realizado porultrassonografia 23 dias após a TE. Foram analisadas as taxas de aproveitamento (APRO), de concepção(CONC), de prenhez (PREN) e de superovulação (SOV), o número de CL por receptora (NCL) e odiâmetro do CL único (DCL) em cada grupo. Os resultados foram analisados pelo SAS for Windows. Asvariáveis não paramétricas (binomiais) foram avaliadas pelo teste de Wilcoxon (unicaudal) e as paramétricaspelo teste LSD de médias. As médias para os Grupos 1, 2 e 3 foram, respectivamente, APRO [72,7% (72/99)a, 84,7% (94/111)b e 88,8% (103/116)b; P < 0,05], CONC [38,9% (28/72), 46,8% (44/94), 39,8%(41/103); P>0,05], PREN [28,3% (28/99)a, 39,6% (44/111)b e 35,3% (41/116)ab; P<0,05], SOV [36,1%(36/72), 41,4% (39/94) e 47,6% (49/103); P>0,05], NCL (1,7±0,1; 1,8±0,1 e 2,0±0,2; P>0,05), DCL(18,2±0,4a, 20,2±0,6b e 19,5±0,5ab; P<0,05). Conclui-se que a substituição do VE por BE aumenta aeficiência do tratamento para ITF. O tratamento com progestágeno e BE apresentou a mesma eficiência queo tratamento com P4 e BE. Agradecimento: Intervet

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EFEITO DO TRATAMENTO COM eCG NA TAXA DE CONCEPÇÃO DE VACASNELORE COM DIFERENTES ESCORES DE CONDIÇÃO CORPORAL

INSEMINADAS EM TEMPO FIXO (ANÁLISE RETROSPECTIVA)

Baruselli, P.S.1; Madureira, E.H.1; Marques, M.O.2; Rodrigues, C.A.3; Nasser, L.F.1;Silva, R.C.P.2; Reis, E.L.1; Sá Filho, M.F.1

1Depart. de Reprodução Animal, FMVZ-USP, São Paulo-SP, Brasil. 2Geraembryo, Cornelio Procópio-PR, 3Clínica Veterinária SAMVET de São Carlos, São Carlos-SP, Brasil. [email protected]

O objetivo desse estudo foi avaliar o efeito do tratamento com eCG na retirada do dispositivo de progesteronana taxa de concepção em vacas Nelore lactantes com diferentes escores de condição corporal (ECC)inseminadas em tempo fixo. Estudos anteriores foram indicativos de que o tratamento com eCG aumenta ataxa de concepção apenas em animais em anestro (Baruselli et al., Theriogenology, v. 59, p. 214, 2003). Nopresente estudo, foram utilizadas 1984 vacas Nelore lactantes (análise de 5 experimentos) mantidas a pastonos estados de São Paulo e Mato Grosso do Sul. No início do tratamento os animais foram classificadosquanto ao ECC (escala de 1 a 5; 1 magra e 5 gorda). No dia da retirada do dispositivo de progesteronametade dos animais receberam 400 UI de eCG. Todos os animais foram inseminados 54h após a retirada dodispositivo. O diagnóstico de gestação foi realizado por ultra-sonografia em média 30 dias após a IATF. Nãose verificou interação entre tratamento (com ou sem eCG), lotes experimentais e ECC. Houve interação dotratamento com a condição corporal. As taxas de prenhez foram analisadas pelo teste de Qui-quadrado.Verificou-se diferenças estatisticamente significativas na taxa de concepção conforme o tratamento com eCGsomente nos animais com baixo escore de condição corporal [ECC 2,0, sem eCG=22,7% (5/22)a e comeCG=47,6% (20/42)b, P=0,02; ECC 2,5, sem eCG=42,8% (83/194)a e com eCG=56,9% (124/218)b,P=0,01; ECC 3,0, sem eCG=53,9% (253/469)a e com eCG=58,4% (261/447)b, P=0,08; ECC 3,5, semeCG=52,1% (136/261) e com eCG=51,7% (123/238), P=0,46; ECC > 4,0, sem eCG=69,6% (32/46) ecom eCG=63,8% (30/47), P=0,28]. Os resultados são sugestivos de que o tratamento com eCG no momentoda retirada do dispositivo de progesterona aumenta a taxa de concepção à inseminação artificial em tempofixo somente em animais que apresentam baixo escore de condição corporal (≤ 3,0). O efeito positivo dotratamento com eCG na taxa de concepção de animais com baixo ECC pode ser justificado pela alta freqüênciade anestro encontrada nessa categoria. Conclui-se que a resposta ao tratamento com eCG depende dacondição corporal no início do tratamento de sincronização da ovulação para IATF.

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ADEQUAÇÃO DA DOSE DE hCG (VETECOR®®®®®) PARA INDUÇÃO DA OVULAÇÃO DE VACAS EM PROTOCOLOS DE INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL EM TEMPO FIXO

Marques, M.O.1; Campos Filho, E.P.2, Mantovani, A. P.1; Reis, E.L.1;Nichi, M.1; Baruselli, P.S.1

1Departamento de Reprodução Animal, FMVZ – USP, São Paulo – SP, Brasil. 2Brangus Brasil, FazendaSobrado, São Manuel – SP, Brasil. [email protected]

O objetivo deste trabalho foi adequar a dose de hCG, para indução da ovulação, em vacas Bos taurus x Bosindicus lactantes inseminadas em tempo fixo (IATF), com ou sem a administração de eCG no momento daretirada do dispositivo intravaginal de progesterona. Foram utilizadas 521 vacas Bos indicus x Bos tauruslactantes (75,8 ± 20,5 dias pós-parto), mantidas a pasto em São Manoel - SP. Os animais foram divididosaleatoriamente em 6 grupos experimentais (fatorial 3x2). Em dia aleatório do ciclo estral (D0), os animais doGrupo 1 (G1) receberam 2mg de benzoato de estradiol (BE) IM (Estrogin®, Farmavet) e um dispositivointravaginal contendo 1,9g de P4 (CIDR®, Pfizer). No D8, os dispositivos foram removidos e administrou-se25mg de Dinoprost IM (Lutalyse®, Pfizer) e 400UI de eCG IM (Novormon®, Syntex). No D10 (54h apósa retirada do dispositivo) os animais foram inseminados e tratados com 500UI de hCG IM (Vetecor® Calier).Os animais do Grupo 2 (G2) e do Grupo 3 (G3) receberam o mesmo tratamento que os animais do G1, noentanto foram tratados com 1000 e 1500UI de hCG no momento da IATF, respectivamente. Os grupos G4,G5 e G6 foram tratados com o mesmo protocolo dos grupos G1, G2 e G3 respectivamente, no entanto nãoforam tratados com 400UI de eCG no momento da retirada do dispositivo. O diagnóstico de gestação foirealizado por palpação retal 45 dias após a IATF. As taxas de prenhez foram comparadas pelo teste de Qui-quadrado. Não foi verificada interação entre os grupos experimentais. As taxas de prenhez para os gruposG1, G2, G3, G4, G5 e G6 foram de 31,0% (27/87), 21,1% (16/76), 34,1% (30/88), 26,7% (24/90),34,4% (33/96) e 28,6% (24/84), respectivamente (P>0,05). Analisando-se os efeitos principais, não foiobservado efeito do tratamento com eCG [com eCG: 29,1% (73/251) vs. sem eCG: 30,0% (81/270);P>0,05] e das doses de hCG [500: 28,8% (51/177) vs. 1000: 28,5% (49/172) vs. 1500: 31,4% (54/172);P>0,05]. Apesar das baixas taxas de prenhez verificadas em todos os grupos, os resultados mostraram quea redução da dose de hCG de 1500UI para 500UI não comprometeu a taxa de prenhez em protocolos deIATF com dispositivo intravaginal de progesterona em vacas Bos indicus x Bos taurus lactantes. Não foiverificado efeito do tratamento com eCG no momento da retirada do dispositivo intravaginal de progesteronaem animais tratados com hCG para indução da ovulação.Agradecimento: Laboratórios Calier do Brasil

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USO DA INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL COMO ROTINA EM PROGRAMAS DEREPRODUÇÃO DE CADELAS DA RAÇA BULLDOG

Jacomini, J. O.1; Moreira, C.F.2; Cunha, G.N.2; Diniz, E.G.1

1Prof. da Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade Federal de Uberlândia-MG, Brasil. E-mail:[email protected]. 2Aluno do curso de Mestrado em Medicina Veterinária da FAMEV-UFU

A procura por biotécnicas aplicadas à reprodução de cães tem aumentado consideravelmente nos últimosanos. Especificamente para a raça Bulldog, a justificativa para o uso da inseminação artificial (IA) está norelato de proprietários que tiveram baixas taxas de prenhez e pequeno número de filhotes com monta natural,devido às dificuldades durante o acasalamento. Durante o ano de 2003, foram inseminadas artificialmentecom sêmen fresco, 16 cadelas da raça Bulldog e idade entre 10 e 33 meses, que apresentaram um a trêsestros antes da IA. Para a realização das IA, foi feito o acompanhamento por citologia vaginal quandoiniciado o pró-estro. As inseminações eram realizadas após o aparecimento de 100% de células superficiaiscom a maioria delas anucleadas. Utilizou-se o sêmen de três reprodutores com exame andrológico eespermiograma normais, coletado por manipulação do pênis em tubo cônico acoplado a um funil plástico. Atemperatura do tubo foi mantida apenas pela proteção com a mão. Utilizou-se uma bainha de transferênciade embriões bovinos cortada ao meio como pipeta de IA, conectada a uma seringa plástica por meio de umamangueira de silicone. A pipeta foi introduzida na vagina, primeiramente, em ângulo de 45º ventralmente e emseguida, na direção horizontal até encontrar um pouco de resistência quando, então, o sêmen foi depositadonum volume médio de três mL. A região pélvica da fêmea foi erguida por cinco a 10 minutos e durante estetempo massageou-se a vulva. Foram realizadas duas ou três IA em dias consecutivos ou alternados. Ficaramgestantes doze (75%) cadelas. A média de filhotes foi 6,20 por parto, com variação de dois a 10. A duraçãomédia da gestação foi de 62,50 (58 a 67) dias em relação à primeira IA e de 59,42 (57 a 63) dias em relaçãoao último procedimento. Setenta e cinco porcento dos partos necessitaram de cesariana. O uso da IA comsêmen fresco em cadelas da raça Bulldog mostrou ser eficiente com boa taxa de gestação e número médio defilhotes aceitável.

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PADRONIZAÇÃO DA TÉCNICA DE IMUNOISTOQUÍMICA PARA DETECÇÃODE RECEPTORES DE ESTRÓGENO E PROGESTERONA NO ENDOMÉTRIO

DE VACAS NELORE (Bos taurus indicus)

Martin, I.1; Ferreira, J.C.P.1; Laufer Amorim, R.2; Torres Neto, R.2; Vettorato, L.F.1

1 Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária – FMVZ/Unesp, Botucatu-SP, 18618-000, Brasil. [email protected]. 2 Departamento de Clínica Veterinária – Área de Patologia Veterinária –

FMVZ/Unesp, Botucatu-SP, 18618-000, Brasil.

O presente estudo teve como objetivo validar a técnica de imunoistoquímica para detecção de receptores deestrógeno e progesterona no endométrio de vacas Nelore. Foram utilizadas 16 fêmeas P.O., primíparas emultíparas, com escore corporal inicial entre 2,5 e 3,5. Estas foram mantidas em regime de estabulaçãoparcial recebendo feno, farelo de milho, sal mineral proteinado e água ad libitum. A colheita de amostrasendometriais foi realizada com uma pinça do tipo Yomann sempre no corno contralateral ao corpo lúteo. Asamostras foram fixadas em formalina tamponada a 10% durante 24h, e, posteriormente, mantidas em álcool70 até o momento da inclusão em parafina. Após a inclusão, cortes de 3µm forma obtidos e colocados emlâminas com extremidade fosca, previamente tratadas com Poly-L-lysina (Poly-L-lisine® – Sigma ChemicalCo.- P8920 – USA). Inicialmente realizou-se o processo de desparafinização e hidratação para posteriormenteproceder-se a técnica de imunoistoquímica. Para a detecção de receptores de estrógeno realizou-se arecuperação antigênica em solução de citrato 10 mM em pH 6,0 incubada em microondas durante 15 minutos;e para os receptores de progesterona utilizou-se solução de EDTA 10 mM em pH 8,0 e incubação embanho-maria a 96oC durante 40 minutos. Após o resfriamento da solução em temperatura ambiente, aslâminas foram lavadas com água destilada. A etapa seguinte foi o bloqueio da peroxidase endógena emsolução de água oxigenada 3%. Posteriormente as lâminas foram novamente lavadas em água destilada e emsolução tampão pH 7,4 – Tris (Trizma Base® – Sigma Chemical Co. – USA) e, subseqüentemente, procedeu-se a incubação com BSA 5% durante 1h em temperatura ambiente. Realizou-se, então, a incubação com oanticorpo primário, na diluição de 1:50, tanto para os receptores de estrógeno (Estrogen Receptor Ab-17®,rabbit polyclonal antibody - Labvision), como para os receptores de progesterona (Progesterone ReceptorAb-8 clone hPRa 2+hPRa 3®, mouse monoclonal antibody - Labvision), em câmara úmida durante 18h àtemperatura de 4oC. Procedeu-se, então, nova lavagem em solução tampão pH 7,4 – Tris durante 10 minutos,e incubação com o anticorpo secundário e complexo ABC (DakoCytomation - USA). Realizou-se novalavagem com solução tampão pH 7,4 – Tris e revelação com o cromógeno DAB (3,3´-diaminobenzidina -Liquid DAB Cromogen® – DakoCytomation – USA) durante 2 minutos ao abrigo da luz. Novamente aslâminas foram lavadas em solução tampão pH 7,4 – Tris e água destilada. A contracoloração foi realizadacom metil-green durante 3 minutos e, posterior lavagem com álcool isopropílico. Por fim realizou-se adesidratação dos cortes e montagem das lâminas. Como controle negativo utilizou-se lâminas sem o anticorpoprimário, incubadas com BSA pelo mesmo período e temperatura das demais. As células portadoras dereceptores hormonais de estrógeno ou progesterona, após o tratamento, passaram a apresentar seus núcleoscorados em marrom, demonstrando a eficiência da técnica em bovinos. Apoio financeiro: FAPESP eFundunesp.

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EFEITO DA CONCENTRAÇÃO PLASMÁTICA DE PROGESTERONA NA DINAMICAFOLICULAR DE NOVILHAS BOS INDICUS X BOS TAURUS

Mantovani, A.P.1; Sá Filho, M.F.1; Reis, E.L.1; Nichi, M.1; Bo, G.A.2; Baruselli, P.S.1

1Departamento de Reprodução Animal, FMVZ-USP, São Paulo, Brasil. 2Instituto de ReproducciónAnimal Córdoba, Córdoba, Argentina. [email protected]

O objetivo deste experimento foi avaliar o crescimento folicular e a taxa de ovulação sob diferentesconcentrações plasmáticas de progesterona (CPP) em novilhas Bos indicus x Bos taurus tratadas parainseminação artificial em tempo fixo (IATF). Quarenta novilhas cíclicas (detecção de CL por palpaçãoretal) foram sincronizadas com duas administrações de 25,0 mg de dinoprost IM (PGF2α, Lutalyse®,Pfizer) com 12 dias (D -24 e D -12) de intervalo. No D0, o grupo G1 (n=10) foi tratado com 2 mg debenzoato de estradiol (BE) IM (Estrogin®, Farmavet) e com um dispositivo intravaginal contendo 1,9g deprogesterona (CIDR®, Pfizer). No D8 administrou-se PGF2α. O G2 (n=10) recebeu o mesmo tratamentodo G1, no entanto a PGF2α foi administrada no D5. O G3 (n=9) e o G4 (n=11) receberam o mesmotratamento do G2, no entanto os dispositivos inseridos foram previamente utilizados por 8 e 14 dias,respectivamente. No D8, retirou-se os dispositivos e no D9 foi administrado 1 mg de BE em todos osanimais. Os exames ultrassonográficos foram realizados a cada 24h do D5 ao D9 e a cada 12h no D11 eno D12 para avaliação da dinâmica folicular do D5 à ovulação. Foram analisadas a CPP média durante otratamento (colheita de sangue D6, D7 e D8), a correlação da taxa de crescimento diária do FD do D6 aoD9 (CF) com as CPP, o diâmetro do folículo dominante no D8 (FD8) e no D10 (FD10) e a taxa deovulação (TOV). Os resultados foram analisados pelo SAS. A taxa de ovulação foi analisada por contrastesortogonais. Verificou-se diferença (P<0,05) nas CPP médias durante o tratamento (G1: 3,3±0,5a; G2:2,0±0,2b; G3:1,9±0,2b e G4:1,5±0,1b ng/ml). O CF foi negativamente correlacionado com a CPP (r = -0.41, P<0,05). Os resultados para o G1, G2, G3 e G4 foram, respectivamente - FD8: 0,76±0,04a vs.0,86±0,03ab vs. 0,85±0,06ab vs. 0,90±0,02b mm (P<0,05); FD10: 0,87±0,07b vs. 1,00±0,06a vs.1,04±0,07a vs. 1,06±0,03a mm (P<0,05); TOV: 60,0% (6/10)c vs. 80,0% (8/10)d vs. 77,8% (7/9)d vs.90,9% (10/11)d, P=0,06. Os resultados indicaram que maiores CPP promovem a redução do diâmetromáximo do folículo dominante e tendem a diminuir a taxa de ovulação em novilhas Bos indicus x Bostaurus tratadas com dispositivo intravaginal de progesterona para IATF. Estratégias para a diminuiçãodas CPP durante o tratamento com dipositivo intravaginal de progesterona para IATF podem ser usadaspara aumentar a taxa de prenhez em novilhas Bos indicus x Bos taurus.

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ACOMPANHAMENTO ULTRA-SONOGRÁFICO DA DINÂMICA UTERINA EMVACAS NELORE (Bos taurus indicus) DURANTE O CICLO ESTRAL

Martin, I.1; Ferreira, J.C.P.1; Vettorato, L.F.1; Gioso, M.M.1; Tavares, R.Z.1;Mota, A.V.1; Greatti, T.A.P.1; Oba, E.1

1 Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária – FMVZ/Unesp, Botucatu-SP,18618-000, Brasil. [email protected]

O presente estudo teve como objetivo caracterizar a dinâmica uterina ao longo do ciclo estral em vacaszebuínas da raça Nelore. Foram utilizadas 16 fêmeas P.O. provenientes do rebanho da Fazenda São Manuel–Unesp/Botucatu, primíparas e multíparas, com escore corporal inicial entre 2,5 e 3,5. Estas foram mantidasem regime de estabulação parcial recebendo feno, farelo de milho, sal mineral proteinado e água ad libitum.Para o controle uterino utilizou-se a ultra-sonografia transretal (Aloka SSD 500 - Aloka Co. Ltda, Tokyo/Japão com probe retal de 5,0 MHz). Os animais foram sincronizados com uma dose de GnRH (25µgLecirelina IM – Gestran Plus® – Tecnopec Ltda, SP, Brasil) e após 7 dias uma aplicação de prostaglandina(0,150mg d-Cloprostenol IM – Prolise® – Tecnopec Ltda, SP, Brasil). A partir do momento da administraçãode prostaglandina os animais foram avaliados diariamente até o momento da ovulação (dia zero/D0). Osexames ultra-sonográficos continuaram a ser realizados a cada 24 horas até a detecção de uma nova ovulação.Foram avaliadas a presença de coluna líquida em fundo vaginal e nos cornos uterinos, a textura uterina e amensuração, em centímetros, do diâmetro dos cornos uterinos nos aspectos dorsal, cranial e ventral. Para aavaliação da quantidade de fluido em fundo vaginal e nos cornos uterinos utilizou-se uma escala variando de0 a 3 onde um escore 0 indicava ausência de fluido, um escore 3 o acúmulo máximo visualizado e os escores1 e 2 valores intermediários. Quanto a textura ultra-sonográfica, esta foi classificada como característica dediestro (1 – cinza homogênea, sem evidência de edema intersticial), estro (3 – imagem heterogênea e edemaproeminente) ou em estágio intermediário (2 – edema e heterogeneidade moderadamente discerníveis). Osresultados encontrados foram, quanto ao acúmulo de líquido no fundo vaginal, uma queda acentuada a partirdo dia 3 ciclo estral e um aumento pronunciado a partir do dia 17, embora pequenas quantidades de fluidoestivessem sempre presentes durante todo o ciclo avaliado. Quanto ao acúmulo de líquido nos cornos uterinoshouve um decréscimo intenso entre os dias 3 e 4 do ciclo estral e uma elevação acentuada apenas a partir dodia 17; novamente pequenas quantidades de fluido foram sempre evidenciadas nos demais momentos. Atextura ultra-sonográfica uterina apresentou uma diminuição do edema e heterogeneidade a partir do dia 2,embora só tenha se tornado homogênea ao redor do dia 6, esta voltou a ser mais heterogênea por volta dosdias 15 e 16, mas alcançou heterogeneidade e edema máximos próximo ao dia 19 do ciclo estral. Em relaçãoàs mensurações dos cornos uterinos estas evidenciaram, no aspecto dorsal, cranial e ventral, uma marcadadiminuição ao redor do dia 3 do ciclo estral e uma evidente elevação próximo ao dia 17. Estas ainda semostraram semelhantes e constantes entre os dias 5 e 15 do ciclo estral. Os achados demonstram claramenteque o útero se modifica continuadamente durante o ciclo estral, caracterizando uma fase de domínioprogesterônico (luteal) e outra de domínio estrogênico (estral).Apoio financeiro: FAPESP e Fundunesp

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CARACTERÍSTICAS ULTRA-SONOGRÁFICAS DO CORPO LÚTEO E DO DIÂMETROFOLICULAR PRÉ-OVULATÓRIO DE VACAS NELORE

Martin, I..1; Vettorato, L. F.1; Tavares, R.Z.1; Greatti,T.A.P.1; Gioso, M.M.1; Mota, A.V.1;Oba, E.1; Ferreira, J.C.P.1

1Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária - FMVZ-Unesp. Distrito de RubiãoJunior S/N, CEP: 18.6188-000 - Botucatu - SP - Brasil - [email protected]

Apesar de ser a raça de bovino mais empregada para fins comerciais no Brasil, o Nelore, têm sido objeto deum número relativamente pequeno de estudos envolvendo a sua biologia reprodutiva, principalmente osrelacionados à anatomia funcional do sistema reprodutor feminino durante o ciclo estral. Buscando preencheresta lacuna, o presente trabalho dedicou-se a avaliação ultra-sonográfica do desenvolvimento luteal e dodiâmetro folicular de 16 vacas Nelore previamente submetidas ao seguinte protocolo de sincronização: GnRH(25 µg lecirelina, IM - Gestran Plus - Tecnopec) e sete dias mais tarde PGF2? (0,15 mg de D+Cloprostenol,IM - Preloban - Intevet). Através da ultra-sonografia transretal foi acompanhada a dinâmica folicular pós-sincronização e do ciclo estral subseqüente, o que possibilitou o registro do diâmetro do folículo ovulatórioem ambos os períodos. Observou-se que os primeiros sinais ultra-sonográficos de luteólise (diminuição daecogenicidade e do diâmetro do corpo lúteo) apareceram em média 2,4 ± 0,6 dias após aplicação daPGF2α e que os animais ovularam em média 3,9 ± 1,6 dias após essa aplicação, ocorrendo uma dispersãodas ovulações de 5 dias. O diâmetro médio dos folículos ovulatórios pós-sincronização foi de 13,1 ± 1,0mm, semelhante ao diâmetro médio mensurado no ciclo estral subseqüente à sincronização, que foi de 12,8± 1,2 mm. Tais medidas confirmam que este protocolo, apresentado por Barros et al. (Theriogenology, v.53, p. 1121-1134, 2000) não interfere diretamente no diâmetro do folículo ovulatório. Contudo, os diâmetrosfoliculares encontrados foram superiores aos observados por Figueredo et al. (Theriogenology, v.47, p.1489-1505, 1996), que estudando vacas Nelore, encontraram como medidas máximas 11,3 ± 0,3 e 10,4 ± 0,3mm, respectivamente, nos ciclos de duas ondas e três ondas. A visualização ultra-sonográfica do corpo lúteoapós a ovulação foi possível em média 4,6 ± 1,6 dias e o máximo diâmetro do mesmo, mensurado antes deseu desaparecimento ultra-sonográfico foi em média de 18,9 ± 3,8 mm, valores também superiores aosobtidos por Neves et al. (Rev. Bras. de Reprod Anim.,v.27, n.2, p.233-234, 2003), estudando ovários deanimais da raça Nelore abatidos, e de Figueredo et al. (Theriogenology, v.47, p.1489-1505, 1996) queestudou animais desta mesma raça ao ultra-som, observando medidas de aproximadamente 15,9 mm. Nesteestudo não foi observado correlação estatística positiva significativa entre o diâmetro do folículo ovulatório eo diâmetro do corpo lúteo em seu tamanho máximo (r = 0,3; P = 0,1). Os resultados obtidos demonstramque o corpo lúteo e o folículo pré-ovulatório, na raça nelore, podem alcançar diâmetros superiores aosregistrados pela literatura.Suporte Financeiro: Fapesp e Fundunesp

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DINÂMICA FOLICULAR DE VACAS NELORE LACTANTES EM ANESTROTRATADAS COM PROGESTÁGENO, eCG E GnRH

Sá Filho, M.F.1; Reis, E.L1; Viel Jr, J.O.1; Nichi, M.1; Madureira, E.H.1; Baruselli, P.S.1

1Depart. de Reprod. Animal, FMVZ-USP, São Paulo-SP, Brasil. [email protected]

Com o objetivo de avaliar os efeitos do uso do eCG e do GnRH em programas de inseminação artificial emtempo fixo analisou-se a dinâmica folicular de vacas em anestro tratadas com progestágeno, eCG e GnRH.Foram utilizadas 50 vacas Nelore lactantes (133,5 ± 16,6 dias pós-parto) em anestro (ausência de CL porultrassonografia nos dias –14 e –7) mantidas a pasto no Campus Administrativo da USP em Pirassununga-SP. Os animais foram divididos em 4 grupos experimentais (fatorial 2x2) de acordo com a condição corporale com o número de partos. No D0, todas as fêmeas receberam um implante auricular de Norgestomet(Crestar®, Intervet), juntamente com a aplicação de 3 mg de Norgestomet e 5 mg Valerato de Estradiol IM.No D9, o implante foi removido e os grupos diferiram quanto ao tratamento a partir desse momento. O grupoG-CON (n=12) não foi submetido a nenhum tratamento adicional. O G-eCG (n=13) foi tratado com 400 UIde eCG IM (Folligon®, Intervet) no D9. O G-GnRH (n= 12) foi tratado com 100 µg de GnRH IM (Fertagyl®,Intervet) 54 horas após a retirada do implante. O G-eCG+GnRH (n= 13) foi tratado com eCG na retiradado implante e com GnRH 54h após. Os exames ultrassonográficos foram realizados a cada 12 horas do D9à ovulação. Foram avaliados o diâmetro máximo do folículo ovulatório (DFO), taxa (TOV) e momento deovulação (MOV). Os resultados foram analisados pelo programa estatístico SAS. Não foi verificada interaçãoentre os tratamentos. Analisando-se os efeitos principais, não foi observado efeito do eCG e do GnRH sobreo DFO (eCG:1,30±0,06 vs. não eCG: 1,28±0,08 mm; GnRH: 1,29±0,07 vs. não GnRH: 1,30±0,06 mm,P>0,05). As fêmeas tratadas com GnRH apresentaram tendência de menor dispersão no MOV (GnRH:72,0±1,1x vs. não GnRH: 71,1±2.0 hy; Teste de Bartlet, P=0.06). Este efeito não foi observado nas tratadascom eCG (eCG: 70,9±2,0 vs. não eCG: 72,0±1,3 h; Teste de Bartlett, P>0,05). Os animais tratados comeCG apresentaram aumento na TOV [eCG 71,0 (19/26)a vs. não eCG 50% (12/24)b; P<0,05). Esteincremento não foi visto nas fêmeas que receberam GnRH [GnRH: 68,0% (17/25) vs. não GnRH: 56,0%(14/25), P>0,05]. Os resultados indicam que o tratamento com eCG no momento da retirada do implanteauricular de Norgestomet aumenta a taxa de ovulação e o tratamento com GnRH sincroniza as ovulações emvacas Bos indicus em anestro tratadas com norgestomet, valerato de estradiol e eCG para inseminaçãoartificial em tempo fixo.Agradecimentos: Intervet

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EFEITOS DO CIPIONATO E DO BENZOATO DE ESTRADIOL NA DINAMICAFOLICULAR E LUTEÍNICA DE VACAS NELORE

Reis, E.L.1; Gimenes, L.U.1; Marques, M.O.1; Carvalho, J.B.P.1;Mapletoft, R.J.2; Baruselli, P.S.1

1Departamento de Reprodução Animal, FMVZ – USP, São Paulo – SP, CEP 05508-000, Brasil.2Western College of Veterinary Medicine, University of Saskatchewan, Saskatoon, SK, Canada S7N

5B4. [email protected]

O presente experimento teve como objetivo verificar o efeito da administração de Benzoato de estradiol(BE) ou de Cipionato de estradiol (CE) como indutores de ovulação em dois momentos distintos no protocolode inseminação artificial em tempo fixo (IATF) a base de progesterona (P4). Foram utilizadas 47 vacasNelore lactantes (85,5 ± 23,2 dias pós-parto) mantidas a pasto em Pindamonhangaba-SP. Os animais foramdivididos em 4 grupos experimentais (fatorial 2x2) de acordo com o período pós-parto e com a ciclicidadeovariana avaliada por ultra-sonografia no dia de início do tratamento (A - presença de CL; B - fol(s) ≥ 8mm;C – fol(s) < 8mm). Em dia aleatório do ciclo estral (D0), os animais foram tratados com 2 mg de BE IM(Estrogin®, Farmavet) e com dispositivo intravaginal de progesterona (CIDR®, Pfizer). No D8, os dispositivosforam removidos e administrou-se 25 mg de Dinoprost IM (Lutalyse®, Pfizer) e 400 UI de eCG IM(Novormon®, Syntex). O grupo CE0 (n=12) recebeu 0,5 mg de CE (ECP®, Pfizer) no D8 (retirada dodispositivo). O grupo CE24 (n=12) recebeu 0,5 mg de CE no D9 (24h após a retirada do dispositivo). Ogrupo BE0 (n=12) recebeu 1 mg de BE no D8. O grupo BE24 (n=11) recebeu 1 mg de BE no D9. A partirdo D8 procedeu-se a ultra-sonografia ovariana a cada 12h para determinar o momento da ovulação. NoD20, em todas as fêmeas foi realizada colheita de sangue para dosagem da concentração plasmática de P4e ultra-sonografia ovariana para determinação da área do CL. Foram analisadas a taxa (TOV) e o momentode ovulação (MOV), o diâmetro máximo do folículo ovulatório (DFO) e a área do CL (ACL) em cadagrupo. Os resultados foram analisados pelo SAS for Windows. As médias para os grupos CE0, CE24, BE0e BE24 foram, respectivamente: TOV: 100,0 (12/12) vs. 91,7 (11/12) vs. 100,0 (12/12) vs. 100,0 % (11/11, P>0,05); MOV: 80,0 ± 4,8a,x vs. 85,1 ± 4,4a,x vs. 68,0 ± 1,7b,y vs. 75,3 ± 1,7ab,y h (P<0,05; Teste deBartlett); DFO: 1,37 ± 0,05a vs. 1,27 ± 0,04ab vs. 1,23 ± 0,03b vs. 1,39 ± 0,05a mm (P<0,05); ACL: 3,23± 0,24 vs. 2,77 ± 0,23 vs. 2,90 ± 0,27 vs. 3,04 ± 0,27 cm2 (P>0,05). Os resultados indicam que o CE e oBE proporcionam elevadas taxas de ovulação, independentemente do momento de aplicação no protocolode IATF. No entanto, o CE não sincroniza a ovulação em animais tratados com P4 para IATF.Agradecimento: Pfizer

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DINÂMICA FOLICULAR OVARIANA DA CABRA AVALIADA COM ULTRA-SOMPOR VIAS TRANSRETAL E TRANSVAGINAL

Tenório Filho, F.1; Santos, M.H.B.1; Moraes, E.P.B.X.1; Rocha, J.M.1; Oliveira, L.R.S.2;Oliveira, M.A.L.3; Lima, P.F.3

1Programa de Pós-Graduação em Ciência Veterinária/UFRPE. 2Curso de Graduação em MedicinaVeterinária/UFRPE. 3Departamento de Medicina Veterinária/UFRPE [email protected]

Este trabalho teve o objetivo de comparar a eficiência do transdutor linear utilizado por via transretal com ado micro-convexo endocavitário por via transvaginal para monitorar a dinâmica folicular ovariana de seiscabras da raça Anglo-Nubiana com idade entre 40 e 45 meses e peso de 35 a 40 Kg. Anteriormente aoperíodo experimental, as cabras foram observadas quanto a ciclicidade durante três ciclos consecutivos.Constatada a ovulação, as cabras continuaram sendo examinadas uma vez por dia com ambos os transdutores,ressaltando-se que em dias alternados, iniciava-se o exame com um tipo de transdutor. Os resultadosdemonstraram que as cabras apresentam um padrão dominante de quatro ondas foliculares. No primeirociclo, a emergência ocorreu nos dias 1,0 ± 0,0, 5,17 ± 1,83, 10,63 ± 3,49, 14,5 ± 0,58 e no segundodurante os dias 1,17 ± 0,41, 5,33 ± 0,82, 11,17 ± 2,32, 16,5 ± 1,73, não se registrando diferença (P > 0,05)entre os ciclos. No primeiro ciclo, o intervalo entre as ondas foliculares foi de 4,17 ± 1,83, 5,67 ± 1,86, 5,33± 1,21, 5,75 ± 1,26 e no segundo foram de 4,17 ± 0,75, 5,83 ± 1,83, 7,17 ± 1,72, 6,75 ± 1,26, não seregistrando diferença (P > 0,05) entre os ciclos. Em ambos os ciclos estrais, o diâmetro do folículo ovulatóriodas cabras que evidenciaram três ondas foi de 5,4 ± 0,8 mm e de 5,3 ± 0,4 mm naquelas que exibiram quatroondas. Não foi constatada diferença (P > 0,05) entre o tamanho dos folículos ovulatórios. Os resultadospermitem concluir que o padrão de crescimento folicular na cabra não varia de acordo com o ciclo estral,bem como comentar que o transdutor micro-convexo endocavitário provoca menor estresse ao animal,favorece uma rápida visualização dos ovários e produz imagens de qualidade superior ao transdutor linear.

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SINCRONIZAÇÃO DE ESTRO EM CABRAS TOGGENBURG DURANTE AESTAÇÃO DE ACASALAMENTO*

Fonseca, J.F.1; Bruschi, J.H.2; Santos, A.F.A.3; Maffili, V.V.3; Moraes, E.A.3;Pontes, R.A.3; Prosperi, C.P.3

1Embrapa Caprinos, Estrada Sobral/Groaíras, Km 4, CP D10, Cep 62.011-000, Sobral-CE, Brasil,[email protected]. 2Embrapa Gado de Leite, Rodovia MG 133, Km 42, 36.155-000, Cel

Pacheco-MG, Brasil. 3Departamento de Zootecnia, Universidade Federal de Viçosa, Av. P.H. Rolfs, s/n,Brasil, 36.571-000.

O objetivo deste estudo foi testar a eficiência de dois protocolos de sincronização de estro em cabrasToggenbur durante a esta cão de acasalamento. Foram utilizadas 30 cabras divididas aleatoriamente entredois tratamentos (T1 e T2) que receberam dispositivo intravaginal (CIDR®) removido seis dias depois. Osanimais receberam uma dose de 22,5 µg cloprostenol subvulvar no dia da inserção (T1, n=15) ou 24 horasantes da remoção do dispositivo (T2, n=15). Após a detectção de estro, os animais foram acasalados commachos férteis (T1=6 e T2=7) ou artificialmente inseminados (T1=8 e T2=7). A percentagem de animais emestro foi a mesma para T1 e T2 (93,3%). O intervalo da retirada do dispositivo ao início do estro não diferiu(P>0,05) entre T1 (40,3±12,0h) e T2 (41,1±9,3h). A duração do estro não foi afetada (P>0,05) por T1(43,6±13,4h) ou T2 (37,9±13,2h). A duração do estro não diferiu (P>0,05) entre acasalamento natural(36,5±10,4h) e inseminação artificialor (44,3±14,9h) e não houve interação (P>0,05) entre tratamentos etipo de acasalamento. A taxa de gestação não diferiu (P>0,05) entre T1 (64,3%) e T2 (64,3%) ou acasalamentonatural (64,3%) e inseminação artificial (64,3%). Durante a estação de acasalamento natural, o estro poseser eficientemente sincronizado em cabras Toggenburg lactantes pela implantação de dispositivo intravaginale administração de cloprostenol, independente do momento da aplicação de cloprostenol e uma boa fertilidadepode ser alcançada tanto pelo acasalamento natural quanto pela inseminação artificial.*Apoio financeiro: CNPq, FAPEMIG and Pfizer Saúde Animal.

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BAIXA DOSE DE DL-CLOPROSTENOL (50µµµµµg) ADMIINSTRADO NO PONTODE ACUPUNTURA BAI-HUI EM BÚFALAS

Teixeira, A.B.; Dell’Aqua Jr., J.A.; Joaquim, J.G.F.; Siqueira-Pyles, E.S.C.; Zahn, F.S.;Carvalho, F.A.; Azevedo, H.C.; Leão, K.M.; Nogueira, M.F.G.; Oba, E.

Depto de Reprodução Animal, FMVZ, UNESP, Botucatu, SP, Brasil;

A prostaglandina F2α (PGF) normalmente induz luteólise em vacas e búfalas quando administrada por via

intramuscular (IM). A utilização de menores doses de PGF (½ ou ¼) por via subcutânea ou submucosaintravulvar comparadas à dose normalmente utilizada por via IM foi descrita para induzir a luteólise econseqüentemente o estro nesses animais. O ponto de acupuntura BAI-HUI (BH; localizado no espaçolombo-sacro, entre o processo espinhoso da 5ª vértebra lombar e 1ª vértebra sacral) foi descrito como umavia alternativa para o uso de PGF em éguas e vacas, contudo não foram encontrados trabalhos, na literaturaconsultada, sobre a utilização dessa via para administração de PGF em búfalas. O objetivo desse trabalho foiavaliar o efeito luteolíco induzido por um décimo da dose de dl-cloprostenol (normalmente utilizada por viaIM para induzir luteólise) administrado no ponto de acupuntura BAI-HUI ou por via intramuscular. Paratanto, vinte búfalas mestiças Murrah foram selecionadas por meio de ultra-sonografia trans-retal e sincronizadasutilizando o protocolo: GnRH (acetato de buserelina1, 8 µg, IM, d0), PGF (dl-cloprostenol2, 500 µg, IM,d7) e GnRH (d9). Doze dias após a segunda aplicação de GnRH, os animais foram divididos em 3 gruposque receberam: G1 (n=5) - 2mL de água destilada no BH, G2 (n=6) - 50 µg de dl-cloprostenol diluídos em2mL de água destilada por via IM e G3 (n=7) - 50µg de dl-cloprostenol diluídos em 2mL de água destiladano BH. Amostras de sangue foram colhidas para posterior determinação da concentração plasmática deprogesterona pelo método de radioimunoensaio. Após a análise, dois animais foram descartados porapresentarem concentrações plasmáticas menores que 1 ng/mL em suas amostras durante todo o períodoexperimental. Os dezoito animais restantes sofreram luteólise 48 h após a administração de 500 µg de dl-cloprostenol do protocolo de sincronização, demonstrando o efeito luteolítico da PGF nesses animais. Aluteólise induzida foi utilizada como controle positivo nos grupos, sendo que a concentração plasmática deprogesterona antes e 48 h após a administração de PGF foi de 4,20±0,53 e 0,15±0,04 ng/mL (EPM),respectivamente. Após a sincronização nenhum dos animais que receberam água destilada (G1) sofreramluteólise, contudo alguns animais no G2 (2/6, 33%) e G3 (3/7, 42%) sofreram luteólise (p>0,05, Teste Exatode Fisher). A concentração plasmática de progesterona dos animais que sofreram luteólise antes e 48 h apósa administração de 50 µg de dl-cloprostenol foi de 3,53±0,33 e 0,12±0,11 (G2, IM) e 3,34±0,58 e 0,11±0,01ng/mL (G3, BH), respectivamente. Esses resultados sugerem que a eficácia da baixa dose de dl-cloprostenolna indução da luteólise em búfalas não foi dependente da via de administração uma vez que alguns animaissofreram luteólise em ambos os grupos G2 (IM) e G3 (BH), por outro lado o efeito luteolítico induzido pelada baixa dose de dl-cloprostenol foi mais dependente da sensibilidade individual dos animais que sofreramluteólise.Financiado pela FAPESP, Brasil.

1.Conceptal® - Intervet, São Paulo - Brasil2.Ciosin® - Schering-Plough Coopers, São Paulo – Brasil

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EFEITOS DA SUPLEMENTAÇÃO ORAL COM TAURINA NO DESEMPENHOREPRODUTIVO DE GATAS DOMÉSTICAS

Moreira, C.F.1; Jacomini, J.O.1; Antônio, F.I.1

1 Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade Federal de Uberlândia - UFU. Avenida Pará1720, Bairro Jardim Umuarama, Uberlândia – MG, cep 30408-283. [email protected].

A importância da taurina, um aminoácido essencial para os gatos, vem recebendo grande atenção nos últimosanos, principalmente no que se refere aos efeitos da sua insuficiência dietética. Com a descoberta de que amiocardiopatia dilatada, uma patologia causada pela carência de taurina, poderia ser totalmente revertidacom a suplementação desse aminoácido, houve um grande reforço das dietas comerciais para gatos com omesmo. No entanto, poucos estudos foram realizados para se analisar os efeitos, em longo prazo, dasuplementação de taurina nos diversos sistemas corpóreos, principalmente no desempenho reprodutivo. Oobjetivo deste trabalho foi determinar os efeitos da adição de taurina no desempenho reprodutivo de gatasdomésticas. Gatas adultas clinicamente saudáveis foram divididas em dois grupos de 8 animais, onde ambosreceberam a mesma dieta comercial seca e um dos grupos recebeu diariamente a suplementação oral de192mg de taurina, durante quatro meses. Após esse período, todas as gatas copularam com gatos férteis eforam ovariohisterectomizadas no oitavo dia pós-cópula, quando foram realizadas a coleta dos embriões e apreparação histológica dos ovários para observação em microscopia de luz, quantificando-se os folículosovarianos. As diferenças entre os números de corpos lúteos, folículos primordiais, primários, secundários eterciários por área (mm2) de tecido cortical ovariano e o número de embriões foram comparadas pelo testet de Student. Os valores médios e o desvio padrão para essas variáveis no grupo controle foram de 2,19±1,22;10,56±5,86; 1,68±2,26; 0,60±0,44; 0,73±1,19; 1,83±0,98, respectivamente. No grupo que recebeu ataurina, esses valores foram 2,13±1,13; 10,46±8,87; 1,47±0,90; 0,38±0,17; 0,55±0,39; 3,67±1,63,respectivamente. O número de embriões foi estatisticamente maior no grupo que recebeu a taurina, no entanto,nenhuma outra variável estudada foi estatisticamente significativa. A suplementação da dieta comercial paragatos com taurina, em longo prazo, não afetou o ganho de peso, apetite, comportamento e ciclo estral dasgatas. O desempenho reprodutivo foi melhor nas fêmeas suplementadas com taurina, que apresentarammaior número de embriões e com a mesma qualidade do outro grupo. Esses resultados indicam que o uso dasuplementação oral de taurina pode representar uma alternativa para melhorar o desempenho reprodutivo defelinos selvagens em risco de extinção mantidos em cativeiros.

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AVALIAÇÃO DO DIAGNÓSTICO PRECOCE DA GESTAÇÃO EM CABRAS MESTIÇAS ATRAVÉS DE ULTRA-SONOGRAFIA TRANS-RETAL

Cavalcante, P.V.T.H.²; Solano, R.F.¹ ²; Zaynette, F.T.; Moaraes Jr., F.J.²; Solano, G.O.²

¹Laboratorio de Biotecnologia da Reprodução Animal; ²Universidade Estadual do Maranhão (UEMA),Cidade Universitária Paulo VI, São Luís-MA, CEP. 65700-000, Brasil. [email protected]

Atualmente vem-se necessitando de um diagnóstico de gestação em estágios prévios devido as grandesincertezas ocasionadas com a má detecção de das gestações. A ultra-sonografia foi o método de eleição aser trabalhado, pois detecta a prenhez em seus primórdios e em níveis de segurança confiáveis. O objetivo dopresente trabalho foi predizer o momento ótimo para realizar o diagnóstico de gestação em fêmeas caprinasmestiças através do exame ultra-sonográfico (ALOKA, 580) via trans-retal; com transdutor de 7 MHzacoplado a um adaptador de policlorito de vinilo (PVC) para facilitar a manipulação, após a inseminaçãoartificial (IA) ou monta controlada (MC). Foram avaliadas 125 cabras, examinadas entre os dias 25; 30 e 35após a IA ou MC. Os resultados obtidos foram aplicados no teste do Qui X². a presença de gestação foi de28,9 % (11 / 38) com diagnóstico de prenhez positivo aos 25 dias, 73,1 % (30 / 41) aos 30 dias e 78,2 %(36 / 46) aos 35 dias. Entretanto os percentuais de falsos negativos foram de 52,5 %; 19,5 % e 21,7 % aos25; 30 e 35 dias respectivamente. O diagnóstico de gestação aos 25 dias foi significativamente menor (P <0,5) quando comparado com o diagnóstico aos 30 e 35 dias. Das 125 cabras avaliadas 76 % (12 / 95)chegaram ao parto. Conclui-se que o diagnóstico de gestação em fêmea caprina através de ultra-sonografiatrans-retal pode-se determinar com segurança a partir de 30 dias após a concepção, por isso a técnica éexeqüível tanto em fazendas como em centrais de IA.

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TAXA DE PRENHEZ, EM VACAS NELORE, APÓS REMOÇÃO TEMPORÁRIA DEBEZERROS (RTB) E UTILIZAÇÃO DE PROTOCOLOS HORMONAIS COM eCG.

Souza, A.F.; Pinheiro, V.G.; Ereno, R.L.; Barros, C.M.

Departamento de Farmacologia, Instituto de Biociências, UNESP, Botucatu - SP

Tanto a RTB quanto a aplicação de eCG são potencialmente úteis para melhorar a taxa de prenhez deanimais submetidos a tratamentos hormonais para IA com tempo fixo (IATF). Neste trabalho foram realizadosdois experimentos para comparar a eficiência da aplicação do eCG e/ou da RTB em protocolos para IATF,com ou sem progesterona exógena. No experimento 1, vacas Nelore lactantes (40 a 70d pós-parto, n=148)foram divididas em 2 Grupos. Em estágio aleatório do ciclo estral (D0), os animais do Grupo GPE/eCGforam tratados com GnRH (50 µg de licerelina, via IM, Gestran Plus®) e sete dias mais tarde (D7) receberamuma aplicação de PGF2α (150 µg de d-cloprostenol, via IM, Prolise®) e outra de eCG (300 UI, via IM,Novormon®). No D8, administrou-se benzoato de estradiol (BE, 1mg, Estrogin®) e 30-36h mais tarde osanimais foram inseminados (IATF). No Grupo DIB/eCG as vacas receberam, um dispositivo intravaginalcontendo progesterona (1,0 g, DIB®, D0) e BE (2,5 mg, IM). Oito dias mais tarde (D8) administrou-segonadotrofina coriônica equina (eGC, 300 UI, via IM, Novormon®) e dl-cloprostenol (150 µg), e o DIB foiremovido. Vinte e quatro horas após a remoção do DIB as vacas foram tratadas com BE (1,0 mg, IM) e 30-36 h depois os animais foram inseminados (IATF). Em todos os experimentos, inclusive nos descritos abaixo,foi realizado exame ultra-sonográfico dos ovários, dez dias antes e no dia do início dos tratamentos hormonaisou RTB, com a finalidade de determinar a presença de CL. As vacas do Grupo DIB/eCG apresentaram taxade prenhez (57,7%, 45/78) mais elevada do que as do grupo GPE/eCG (37,1%, 26/70, p<0,01). Alémdisso, apenas no Grupo GPE/eCG, a taxa de prenhez foi superior nos animais com CL (50%, 16/32) quandocomparados aos sem CL (26,3%, 10/38, p<0,03). No Experimento 2, testou-se o possível efeito benéficoda remoção temporária de bezerros (RTB) no protocolo GPE/eCG, em vacas Nelore lactantes (40 a 70dpós-parto, n=140). Os animais do Grupo GPE/eCG (controle) foram tratados de acordo com o descrito noexperimento 1, enquanto que no Grupo RTB/GPE/eCG os bezerros foram removidos das vacas durante 48h antes do início dos tratamentos. As vacas lactantes, nas quais realizou-se RTB, apresentaram aumentosignificativo na taxa de prenhez, quando comparadas às do grupo sem RTB (51,2%, 34/66 vs 28,4%, 21/74,respectivamente, p<0,01), tanto em animais com CL (54,8%, 17/31 vs 33,3%, 11/33) quanto sem CL(48,5%, 17/35 vs 24,3%, 10/41). Concluindo, os resultados indicam que a simples adição de eCG, aoprotocolo GPE, não foi suficiente para produzir resultados semelhantes aos obtidos com o tratamento DIB/eCG (Experimento 1). Entretanto, a RTB antes do protocolo GPE/eCG, promoveu aumento significativo nataxa de prenhez de animais ciclando ou em anestro (sem CL, Experimento 2).

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DIAGNÓSTICO ULTRA-SONOGRÁFICO DE GESTAÇÃO EM OVELHASUTILIZANDO AS VIAS TRANSRETAL E TRANSVAGINAL

Santos, M.H.B.1; Moraes, E.P.B.X.1; Guido, S.I.1; Lima-Verde, I.B.1; Rocha, J.M.1;Bezerra, F.Q.G.2; Iunes-Souza, T.C.2; Oliveira, M.A.L.3; Lima, P.F.3

1Programa de Pós-Graduação em Ciência Veterinária/UFRPE. 2Curso de Graduação em MedicinaVeterinária/UFRPE. 3Departamento de Medicina Veterinária/UFRPE ([email protected])

O presente estudo teve a finalidade de comparar a viabilidade dos transdutores micro-convexo (5,0 e 7,5MHz) por via transvaginal e linear (6,0 e 8,0 MHz) por via transretal no diagnóstico gestacional de 246ovelhas da raça Santa Inês. O tempo dispensado para a realização de cada exame foi de 3,15±2,46 minutoscom o transdutor linear e de 3,22±2,95 minutos com o transdutor micro-convexo. Ambos os transdutoresmostraram-se eficientes para diagnosticar a gestação entre o 28º e o 41º dia, ressaltando-se que a imagemdo transdutor micro-convexo foi de melhor resolução. A partir do 70º dia de prenhez, a utilização do transdutormicro-convexo por via transvaginal foi menos eficaz devido ao útero estar projetando-se em direção a cavidadeabdominal e não permitir que as ondas ultra-sônicas atingissem o alvo desejado. Após o 90º dia de prenhez,o transdutor linear mostrou-se ineficiente devido à profundidade em que se encontrava o feto. No que concerneao bem estar animal, ficou evidente que o transdutor micro-convexo proporcionou menor desconforto àsfêmeas, além de não ter provocado nenhum processo infeccioso no trato reprodutivo. Foi constatado quenas fêmeas obesas, o exame por via transretal torna-se mais difícil, sendo indicado, nestas ocasiões, o examepela via transvaginal em função da localização do transdutor. Das 246 ovelhas examinadas, 126 (51,22%)encontravam-se entre o 28º e 41º dia de prenhez, 69 (28,04%) com prenhez variando do 60º ao 75º dia, 27(10,98%) no 90º dia de gestação, 18 (7,32%) não se encontravam gestantes e em 6 (2,44%) animais não foipossível emitir o diagnóstico de gestação devido à obesidade. As observações aqui registradas permitemconcluir que ambas as vias são eficientes para diagnosticar precocemente a prenhez de ovelhas da raça SantaInês.

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ASSOCIAÇÃO DO DIAGNÓSTICO PRECOCE DE PRENHEZ A RESINCRONIZAÇÃODO ESTRO EM VACAS ZEBUÍNAS

Freitas, D.S.1; Portela, A.P.M.1; Almeida, A.K.1; Bittencourt, R.F.1; Gonzáles, S.G.1;Gusmão, A.L.1; Chalhoub, M.1; Ribeiro Filho, A. de L.1

1 Laboratório de Embriologia – Departamento de Patologia e Clínicas – EMV / UFBA, Salvador – BA,Brasil. [email protected]

Atualmente, a obtenção de taxas de concepção aceitáveis após o uso de protocolos de sincronização doestro e da ovulação para inseminação artificial em tempo fixo é uma realidade. Entretanto, nem todas asvacas sincronizadas tornam-se prenhes. Desta forma, a dificuldade da detecção do estro e portanto a diminuiçãoda taxa de serviço reaparecerá na medida em que as vacas não prenhes tiverem que ser re-inseminadas. Nointuito de proporcionar uma segunda oportunidade àquelas vacas que não conceberam após a inseminaçãoem tempo fixo, Ribeiro Filho et al. (Rev. Bras. Reprod. Anim., v. 25, p. 326-327, 2001) resincronizaramvacas zebuínas e alcançaram taxa de prenhez acumulada de 67,86%. Esse protocolo durou 35 dias e paraobtenção dessa taxa esses autores tiveram que detectar estro por três dias. Sendo assim, o propósito desteestudo foi desenvolver uma estratégia de resincronização que não utilize observação do estro de retorno eobtenha uma taxa de serviço de 100% para aquelas vacas que ficaram vazias após a primeira IA em tempofixo. Desta forma, 40 vacas da raça Tabapuã, receberam Dia 0 um dispositivo intravaginal contendo 1,9g deprogesterona e 2mg de Benzoato de Estradiol (BE) IM. No Dia 8 os dispositivos foram retirados e osanimais tratados com 75mg de D+Cloprostenol via submucosa-intravulvar (SIV) juntamente com 200UI deeCG IM. No Dia 9 foi aplicado 1mg de BE IM e no Dia 10, cerca de 52 a 56 horas após a retirada dosdispositivos, foi realizada a inseminação artificial em tempo fixo. Doze dias após as inseminações (Dia 22),metade dos animais, tiveram os implantes de progesterona reinseridos e receberam 1mg de BE IM. No Dia30, os dispositivos foram retirados e as vacas diagnosticadas como vazias por meio de ultrassonografiatransretal, receberam 75mg de D+Cloprostenol via SIV e 200UI de eCG IM, no Dia 31 esses mesmosanimais foram tratados com 1mg de BE IM e inseminados em tempo fixo no Dia 32. O diagnóstico degestação das vacas que não foram resincronizadas e dos animais que foram submetidos a uma segunda IA foirealizado no Dia 62, 52 e 30 dias após as respectivas inseminações. Para se comparar a taxa de prenhezentre os grupos experimentais, utilizou-se um estudo de dispersão de freqüências, e para tanto se empregouo teste de Qui-quadrado (χ2). As taxas de prenhes dos animais não resincronizados e dos submetidos àresincronização foram de respectivamente, 50 e 75% e não houve diferença estatística entre as mesmas.Apesar deste resultado, a resincronização elevou a taxa de prenhez em 50% e conseguiu em um período de32 dias sem necessidade de detecção de estro dar duas oportunidades de inseminação para todas as vacas.

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AVALIAÇÃO DA VIABILIDADE TÉCNICA DE PARTOS GEMELARES EMBOVINOS DE CORTE NO PLANALTO CENTRAL

Lucas, L.A.1,2; Pimentel, C.M.1; Pivato, I.3; Rumpf, R.2


900, Brasília-DF, Brasil.; 3Companhia Integrada de Desenvolvimento Agropecuário de Santa Catarina/CIDASC. [email protected]

Os índices zootécnicos da pecuária de corte nacional que ainda são baixos, podem ser melhorados pelaincorporação de novas tecnologias nos sistemas atuais. O objetivo deste trabalho foi avaliar a viabilidadetécnica de produzir bezerros oriundos de partos gemelares, em sistema de criação extensiva. Foram utilizadas117 vacas meio sangue Simental x Nelore, sendo que no tratamento 1 (T1-controle), 60 vacas foraminseminadas (I.A.) com sêmen de touro da raça Guzerá, enquanto que no tratamento 2 (T2) 57 vacas foraminseminadas, e 6 a 9 dias após a I.A. foram inovuladas no corno contralateral. Foram utilizados embriõescriopreservados em etilenoglicol de doadoras meio sangue Simental x Nelore inseminadas com sêmen domesmo touro usado na I.A. de T1 e T2. Ao exame ultra-sonográfico de gestação 35 a 45 dias após I.A.obteve-se 86,7% (n=52) de prenhez em T1 e 77,19% (n=44) em T2, sendo que 56,8% (n=25) das gestaçõeseram gemelares bilaterais. O período médio das gestações gemelares foi de 289 dias e de 294 dias para asgestações simples do T1 e T2. Todos os partos foram normais. A taxa de natalidade em T1 foi de 81,7%. Jáem T2 foi de 87,7%, porém a taxa de gemelaridade foi de apenas 48% sobre as 25 gestações gemelaresdiagnosticadas inicialmente por ultra-sonografia. A percentagem de aborto observada em T1 foi de 5,00%(n=3) e em T2 foi de 12,28% (n=7), p > 0,05. O peso médio ao nascimento foi em T1 33,38 kg e em T2 foide 36,40 kg e 24,27kg para partos simples e gemelares respectivamente (p< 0,0001). Aos noventa dias opeso médio dos bezerros do T1 foi de 111,21kg, no T2 parto simples foi de 124,64kg e o peso médio dosgêmeos foi de 93,31kg, (p< 0,0001). Embora exista viabilidade técnica para a produção de gêmeos embovinos de corte, questões básicas relativas as perdas fetais/abortos e de manejo das vacas gestantes, bemcomo a relação custo/benefício, devem ser melhor estudadas para emprego desta tecnologia no setor produtivo.Agradecimentos: Fazenda Sanga Puitã, Fazenda Santa Amélia, Integral – Nutrição Animal.

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ÍNDICE DE AUTORES

AAdania, C.H. ......................................................... 178Aguiar Filho, C.R. ................................................. 123Aguilar, A.P. .......................................................... 144Alberti, K. ............................................................. 176Alfieri, A.A. .......................................................... 134Almeida, A.K. ....................... 167; 180; 203; 207; 244Almeida, K.C. ....................................................... 205Alvarenga, M.A.89; 101; 170; 173; 209;210; 211; 212Alvarez, R.H. ........................................................ 107Alves, J.R. ............................................................ 123Alves, S.G.G. ........................................ 167; 180; 203Alvin, M.T.T. ......................................................... 214Amaral, J.B. .......................................................... 194Amarante, M. ....................................................... 109Ambrósio, C.E. ..................................................... 151Amorim, L.L. .......................................................... 99Ancioto, K.L. .................................................114; 118Andrade Moura, J.C. .............................................. 90Andrade, E.R. ............................................... 134; 186Andrade, J.C.O. .................................................... 185Andrade, P.B. ....................................................... 138Antônio, F.I. ......................................................... 240;Antoniolli, C.B. ...................................................... 143Arashiro, E.K.N. ................................... 160; 187; 193Araújo, E.B. .......................................................... 174Araujo, M.C.C. ....................................................... 87Araújo, S.S. ........................................................... 123Arruda, I.J. ............................................................ 205Assis Neto, A.C. ........................................... 151; 153Assumpção, M.E.O.A. ................. 131; 141; 148; 157Athayde, C.S. ............................................... 125; 126Ávila, F.F. .............................................................. 140Ayres, H. ................161; 219; 220; 221; 222; 223; 227Azevedo, H.C. ...................................................... 239Azevedo, N.A. ...................................................... 215

BBacelar, F.H. ................................................. 201; 202Balla, E. ........................................................ 224; 225Barioni, L.G. ......................................................... 100Barreiros, T.R.R. .................................................. 195Barreta, M. ........................................................... 164Barreto Filho, J.B. ................................................... 87Barretto, L.S.S. ...................................... 108; 110; 111Barros, C.M. ... 23; 115; 139; 169; 191; 196; 206; 208;

218; 242Bartolomeu, C.C. .................................................. 122Baruselli, P.S. ..... 1; 88; 161; 198; 219; 220; 221; 222;

223; 226; 227; 228; 229; 232; 235; 236Batalha, L.M. ................................................ 181; 182Beleti, M.E. ........................................................... 179

Belisario, H.L.R. .................................................. 214Beltrame, R.T. ............................................. 100; 199Bernardi, M.L. ..................................................... 119Bersano, J.G. ....................................................... 125Bertolla, R.P. ........................................................ 111Bezerra, F.Q.G. ................................................... 243Biase, F.H. ................................................... 103; 104Biondi, F.C. .......................................................... 109Biscarde, C.E.A. .................................................. 180Bittencourt, R.F. ................... 167; 180; 203; 207; 244Bittencourt, V.L. .................................................. 155Blaschi, W. ........................................................... 186Bó, G.A. ................... 1; 161; 219; 224; 225; 226; 232Bordignon, J. ........................................................ 166Borsato, E.A. ....................................................... 195Boselli, C.C. ......................................................... 134Braga, F.C. ................................................... 151; 152Brandão, D.O. ............................................. 124; 127Brum, D.S. ................................................... 119; 172Bruschi, J.H. ........................................................ 238Buitkamp, J. ......................................................... 133Buratini Jr., J. ....................................... 138; 139; 196

CCaetano, A.R. ...................................................... 103Caetano, H.V.A. .................................. 141; 147; 148Calegari, R.S. ......................................................... 92Callesen, H. ......................................................... 124Camargo, L.S.A. .................................... 87; 128, 183Cao, M. ................................................................ 138Capezzuto, A. ...................................................... 129Carambula, S.F. ................................................... 113Carelli, J.B. .......................................................... 137Carmo M.T. ......................................... 176; 209; 210Carter, A.M. ........................................................ 151Carter, J.A. .................................................. 201; 202Carvalho, A.F. .............................................. 151; 152Carvalho, C.S.P. ................................................... 174Carvalho, F.A. ...................................................... 239Carvalho, J.B.P. ................................................... 236Carvalho, J.F. ............................................... 125; 126Carvalho, L.M. ..................................................... 208Carvalho, N.A.T. ................................................... 88Castilho, A.C.S. ................................................... 138Castro, F.O. ......................................................... 144Castro, R.P.R. ...................................................... 200Cavalca, L.G. ....................................................... 199Cavalcante, P.V.T.H. ........................................... 241Cavalcanti Neto, C.C. ............................ 93; 121; 122Cavalieri, F.B. ...................................................... 188Celestino, J.J.H. ................................... 135; 136; 163Chalhoub, M. .................. 90; 167; 180; 203; 207; 244

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Chirinea, V.H. ...................................................... 178Chow, L.A. .......................................................... 156Cledou, G. ............................................................ 224Cordeiro Jr., F. ..................................................... 101Cordeiro M.S. ...................................................... 109Cortez, C. ............................................................. 132Cortezzi, S.S. ......................................... 103; 104; 117Costa e Silva, E.V. ............................................... 177Costa E.P. ............................................................ 155Costa Neto, W.P. ................................................... 88Costa, A.C. .......................................................... 200Costa, I.B. ............................................................ 139Costa, L.F.S. ......................................................... 112Costa, P.F. ............................................................ 146Costa, S.H.F. ...........................................91; 135; 163Coutinho da Silva, M.A. ......................................... 55Coutinho, A.R.S. .................................................. 157Cruz, F.B. ............................................................. 164Cucco, D. ............................................................. 164Cunha, G.N. ......................................................... 230Cunha, I.C.N. ...................................................... 174Cutaia, L. ................................................................. 1

DD’Angelo, M. ................................................125; 126Dagli, M.L.Z. ....................................................... 157Dantzer V. ............................................................ 154De Armas, R,T. ................................................... 144Dell’Aqua Jr., J.A. ........................................176; 239dePaula, F.A.L. .................................................... 177Deschamps, J.C. .................................................. 166Detmann, E. ......................................................... 174Detoni, A.L. ......................................................... 199Dias, A.J.B. ..................................................165; 216Diniz, E.G. ...............................................99; 179; 230Dode, M.A.N. ....................................... 102; 127; 184Duarte, R.A. ........................................................ 226

EEberhardt, B.G. ..................................... 115; 179; 208Emanuelli, I.P. .............................................. 103; 117;Ereno Jr., J.C. ................................................ 95; 186Ereno, R.L. .................................................... 23; 242Esper, C.R. ........................................................... 168

FFagundes, B. ........................................................ 174Farias Júnior, N.A. ............................................... 192Feitosa, W.B. ....................................................... 148Feltrin, C. ............................................................. 143Fernandes C.A.C. . 155; 158; 159; 187; 189; 190; 197Fernandes, C.B. .................... 101; 162; 175; 211; 212Ferreira, A.B.C. ................................................... 180Ferreira, A.M. ................................. 87; 128; 183; 187Ferreira, C.R. ....................................................... 146

Ferreira, C.S. ....................................................... 177Ferreira, F.V.A. .................................................... 136Ferreira, J.C.P. ...................................... 231; 233; 234Ferreira, M.B.D. .................................................. 215Ferreira, M.M.G. ..........................................191; 206Fialho, S.S. ............................................................ 119Figueiredo, A.C.S. ........................ 158; 159; 189; 190Figueiredo, J.R. ............................... 91; 135; 136; 163Fonseca, J.F. .........................................187; 193; 238Fontes, R.S. .................................. 132; 133; 199; 216Forell, F. ............................................................... 143Franco, M.M. ....................................................... 140Freitas, C. ............................................. 160; 193; 215Freitas, C.P. ........................................................... 92Freitas, D.S. .......................... 167; 180; 203; 207; 244Freitas, V.J.F. ....................................................... 205

GGabaldi, S.H. .................................................145; 168Galuppo, A.G. ................................................ 51; 125Garcia, J.F. ........................................................... 149Garcia, J.M. .......................... 114; 145; 146; 151; 153Garcia, P.H. ......................................................... 171Gerger, R.P.C. ............................................... 116; 130Gimenes, L.U. ...................................................... 236Giometti, I.C. ........................................................ 139Gioso, M.M. .................... 89; 155; 158; 159; 233; 234Goldschmidt, B. .................................................... 137Gomes, G.M. ........................................................ 170Gonçalves, J.S.A. ................................................ 131Gonçalves, P.B.D. ................................................. 112Gonzáles, S.G. ...................................................... 244Gordiano, H. ........................................................... 90Greatti, T.A.P. ...................................................... 233Greatti,T. .............................................................. 234Grisolia, A.B. ....................................................... 149Guido, S.I. .....................................................185; 243Guimarães J.D. .................................................... 155Gusmão, A.L. ................................................ 90; 244

HHamlett, W.C. ...................................................... 152

IIguma, L.T. ...................................................140; 151Iunes-Souza, T.C. .........................................122; 243

JJacob, J.C.F. ........................................................ 170Jacob, M. ............................................................. 213Jacomini, J.O. .........................................99; 230; 240Jaliba, W.P. ........................................................... 214Joaquim, J.G.F. ..................................................... 239

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KKarpinzaiki, C.R.L. ............................................... 115Kfoury, Jr., J.R. ..................................... 150; 151; 152Kohayagawa, A. .................................................. 152Kozicki, L.E. ........................................................ 226

LLandim-Alvarenga, F.C. 94; 101; 162; 175; 210; 211;

212Lara, C.S. ............................................................ 213Laufer Amorim, R. .......................................181; 231Leal, C.L.V. ......................................................... 142Leal, L.S. ............................................................. 197Leão, K.M. ........................................... 170; 173; 239Leiser, R. .............................................................. 151Leivas, F.G. ................................................... 119; 172Lima P.F. .............................................................. 121Lima, F.S. ............................................................. 171Lima, I.M.T. ......................................................... 205Lima, P.F. ........................................ 93; 123; 237; 243Lima-Verde, I.B. .....................................93; 122; 243Lo Turco, E.G. ...................................................... 111Lopes, B.C. .......................................................... 215Lopes, C.R. .......................................................... 149Lopes, M.D. ......................................................... 178Lopes-Júnior, E.S. ................................................ 205Loureiro, B. ...................................................121; 122Lucas, L.A. .......................................................... 245Lucci, C.M. ............................................................ 91Lucia Jr., T. .......................................................... 166Lucio, C.F. ........................................................... 131Ludwig Jr., H.E. ................................................... 195

MMacedo Jr., M.M. ................................................ 166Macedo, L.P. ........................................................ 170Machado M.S. ..................................................... 209Machado, E.A. ..................................................... 192Machado, M.A. ................................................... 183Maciel, A.B.B. ..................................................... 217Madureira, E.H. ............ 220; 221; 223; 227; 228; 235Maffili, V.V. ......................................................... 238Maia, E.L.M.M. ................................................... 205Mancilha, R.F. ...................................................... 227Mantovani, A.P. ............................................229; 232Mapletoft, R.J. ..............................................222; 236Maraña Peña, D. ................................................. 224Marques, D.M. .................................................... 137Marques, M.G. ...................................... 116; 117; 130Marques, M.O. 88; 120; 195; 221; 222; 228; 229; 236Martelli, L. ........................................................... 104Martin, I. ............................................... 231; 233; 234Martinez, A.C. ..................................................... 107Martins Júnior, A. .................................................. 92

Martins, C.F. ........................................................ 102Martins, F.S. .......................................... 135; 136; 163Martins, L. ........................................................... 148Martins, L.P. .......................................................... 90Martins, M.I.M. ................................................... 178Martins, R.P. ........................................................ 165Matos, L.F. ............................................ 132; 133; 216Matos, M.H.T. ...................................... 135; 136; 163Matos, S.P.M. ...................................................... 213Medina, M. ............................................................. 65Meirelles, F.V. 103; 104; 107; 113; 117; 129; 142; 150Mello, J.E. ............................................................ 227Mello, M.B. .......................................................... 151Melo, A.N. ........................................................... 123Melo, D.S. ............................................. 191; 206; 208Melo, E.O. ........................................................... 140Melo, G.M. ....................................................125; 126Melo, L.F. ............................................................ 184Mendes, C.M. ...................................................... 157Mendonça, A.L.Z. ............................................... 176Meneses, M.A. .................................................... 167Méo, S.C. ............................................................. 146Merighe, G.K.F. ............ 103; 104; 113; 117; 129; 142Mesquita, L.G. ...................................... 103; 113; 117Mezzalira, A. .................................................. 81; 164Mezzalira, J.C. ..................................................... 164Miglino, M.A. .......................... 75; 151; 152; 153; 154Milazzotto, M.P. .................................... 141; 147; 148Mingoti, G.Z. .................. 104; 108; 110; 111; 114; 118Miranda, M.S. ...................................................... 109Monteiro, A.B.S. .................................................. 200Monteiro, F.M. ..............................................191; 208Moraes Jr., F.J. .................................................... 241Moraes, E.P.B.X. ..........................................237; 243Moraes, E.A. ....................................................... 238Moreira, C.F. .................................................230; 240Moreno, D. ............................................................... 1Mota, A.V. .................................................. 233; 234;Moura, R.T.N. ..............................................123; 122Mozzaquatro, F.D. ................................................ 119Mundim, T.C.D. ................................................... 140

NNascimento, A.B. ......................................... 116; 130Nasser, L.F. ............................................88; 198; 228Neves Neto, J.R. ................................................. 175Nicácio, A.C. ....................................................... 147Nichi, M. ....... 131; 161; 198; 219; 221; 229; 232; 235Nogueira, L.A.G. ................................................. 160Nogueira, M.F.G. .......... 169; 196; 206; 208; 218; 239Nonato Jr., I. .................................................. 95; 186Nosetti, L. ............................................................ 224Nunes, C.M. ........................................................ 149Nunes, D.B. ......................................................... 177Nunes, J.F. ............................................................. 91

249


OOba, E. .. 176; 181; 182; 189; 190; 194; 197; 233; 239Ohashi, O.M. ................................................. 91; 109Oliveira M.F. ........................................................ 154Oliveira, E.R. ........................................ 158; 159; 190Oliveira, G.D.M. .................................................. 200Oliveira, J.A. .................................................134; 168Oliveira, J.F.C. ...................................................... 112Oliveira, J.V. ........................................................ 170Oliveira, L.J. .................................................151; 152Oliveira, L.R.S. .................................................... 237Oliveira, M.A.L. ..................... 93; 121; 123; 237; 243Oliveira, R.S. ........................................................ 183Oliveira, V.P. ......................................... 116; 130; 131Olivier, N. ............................................................. 172

PPalhão, M.P. .......................................... 160; 187; 193Palma, G.A. ......................................................... 172Papa, F.O. ............................................. 170; 175; 176Papa, P.C. .....................................................151; 152Paschoal, D.M. ...................................................... 92Paula T.A. ............................................................ 155Paula, N.R.O. ...................................................... 205Pedrazzi, C.A.F. ..................................................... 94Penteado, L. ......................................................... 223Perecin, F. ......................................108; 111; 117; 146Pereira, D.C. ................................. 102; 127; 140; 188Pereira, F.T.V. ...............................................151; 152Peres, K.R. ........................................... 101; 211; 212Peres, R.F.G. ......................................................... 99Perez, G.C. .......................................................... 217Pessôa M.A. .......................................................... 89Pimentel, C.M. ............................................... 96; 245Pina, V.M.R. ................................... 93; 121; 122; 123Pinheiro, V.G. ....................................................... 242Pinho, T.G. ........................................................... 200Pinto, M.G.L. ....................................................... 139Pires, R.M.L. ................................................107; 194Pivato, I. ......................................................... 188 245Polisseni, J. ........................................................... 183Ponchirolli, C.B. ................................................... 101Pontes, J.H.F. ................................................ 95; 186Pontes, R.A. ........................................................ 238Porciuncula, P.M. .................................................. 112Portela, A.P.M. ..................... 167; 180; 203; 207; 244Portela, F.J.A. ...............................................201; 202Potiens, J.R. ......................................................... 191Price, C.A. ....................................................138; 139Prosperi, C.P. ....................................................... 238Puelker, R.Z. ........................................................ 150Puoli-Filho, J.N.P. ................................................ 173

QQueiroz, F.J.R. ..................................................... 200Quintela, A. ............................................................ 90Quirino, C.R. .........................................133; 165; 199

RRambo, G. ............................................................ 166Ramos, A. ............................................................ 183Reichenbach, H.-D. ................................93; 121; 133Reis, E.L. ... 1; 88; 161; 198; 219; 220; 221; 222; 223;

226; 227; 228; 229; 232; 235; 236Resende, J. ............................................................. 90Rheingantz, M.G.T. .............................................. 166Ribeiro Filho, A. de L. .... 90; 167; 180; 203; 207; 244Ribeiro Jr., M. ...................................................... 195Rigo, A.G. ............................................................ 120Ripamonte, P. ................................................103; 104Rocha Filho A.N. ................................................... 89Rocha, J.M. ................................................... 237 243Rodrigues, A.P.R. .......................................... 91; 163Rodrigues, C.A. ............ 161; 219; 220; 221; 227; 228Rodrigues, J.L. ............................................... 83; 143Rojas, N. .............................................................. 126Roncoleta, M. ....................................................... 118Rondina, D. .................................................... 91; 205Rosa e Silva, A.A.M. .......................................... 128Roser, J.F. ............................................................ 209Rubin, K.C.P. ................................................120; 134Rubin, M.I.B. ........................................................ 119Rufino, F.A. ........................................................... 95Rumpf, R. 96; 102; 124; 127; 140; 151; 184; 188; 245

SSá Filho, M.F. ................................ 226; 228; 232; 235Sá Filho, O.G. ............................... 197; 213; 214; 217Sá, W.F. .......................................... 87; 128; 160; 183Sales, J.N.S. ..................................................204; 215Sanches, B.V. ........................................................ 95Santana, R.C.M. .................................................. 207Santos, A.F.A. ..................................................... 238Santos, L.M. ........................................................ 199Santos, M.H.B. ....................... 93; 121; 122; 237; 243Santos, P.A.C. ...............................................201; 202Santos, R.M. ................................. 164; 213; 214; 217Santos, R.R. .................................... 91; 135; 136; 163Santos, S.E.C. ...................................................... 149Santos, T.C. ..................................................151; 154Saraiva, N.Z. ........................................................ 146Sartorelli, E.S. ...................................................... 208Sartori, R. ....................................................... 35; 188Satrapa, R. ........................................................... 179Satrapa, R.A. ................................................ 115; 179Saueressig, M.G. .................................................. 100Schroeder, R.V. .................................................... 120

250


Seneda, M.M. ................. 95; 120; 130; 134; 186; 195Serapião, R.V. ........................................................ 87Serret, C.G. .......................................................... 166Silva, A.A.B. ........................................................ 207Silva, A.P. ............................................................ 192Silva, C.A.M. ........................................................ 119Silva, G.A. ............................................. 135; 136; 163Silva, J.C. ............................................................... 90Silva, J.F.S. ........................................................... 174Silva, J.R.V. ................................................ 135; 163;Silva, M.V.G.B. ...................................................... 87Silva, R.C.P. .................................. 120; 195; 221; 228Silveira, L.L. .......................................................... 96Simões, R. ............................................................ 147Sinhorini, I.L. ........................................................ 157Siqueira, F. ........................................................... 149Siqueira, L.G.B. ................................................... 155Siqueira-Pyles, E.S.C. ............ 94; 101; 162; 210; 211;

212;239Solano, G.O. ..................................................156; 241Solano, R.F. ........................................... 144; 156; 241Soria, G. ................................................................ 111Sousa, B.P.A. ....................................................... 185Sousa, J.S. ............................................................ 109Souza, A.F. ........................................................... 242Souza, A.L. .......................................................... 205Souza, D.B. .......................................................... 176Souza, F.F. de ................................................178; 182Souza, G.V. .......................................................... 174Souza, J.A.T. .................................................201; 202Souza, J.C. ....................................................204; 215Souza, R.J. ....................................................126; 125Souza, R.V. .................................................... 96; 184Squires, E.L. ......................................... 209; 211; 212Stefanello, J.R. ...................................................... 112Suzuki, M.F. ......................................................... 126

TTavares, D.C. ............................................... 108; 110Tavares, R.Z. ................................................233; 234Tebet, J.M. ........................................................... 178Tedesco, A.C. ...................................................... 168Teixeira, A.B. ...............................................139; 239Teixeira, D.I.A. .................................................... 205Tenório Filho, F. ................................................... 237Tetzner, T.A.D. ...................................................... 99Toniolli, R. ............................................................ 130Torres Neto, R. .................................................... 231Traldi, A.S. ........................................................... 129Tribulo, R. ............................................................ 225Trinca, L.A. ......................................................... 208

UUvo, S. ........................................................... 95; 186

VVajta, G. ............................................................... 124Vale Filho, V.R. ...................................................... 87Vannucchi, C.I. .................................................... 131Vantini, R. ..................................................... 114; 118Vasconcelos, J.L.M. ..................... 171; 213; 214; 217Veloso, R.V. ......................................................... 100Venturini, M. ........................................................ 225Verechia, F.T. ................................................150; 153Verneck, W.C. ..................................................... 199Vettorato, L.F. ....................................... 231; 233; 234Viana, J.H.M. ....................... 128; 160; 187; 190; 193Vianna, F.P. .......................................................... 176Vieira, A.D. ................................................... 83; 143Viel Jr, J.O. .......................................................... 235Villarroel, A.B.S. .................................................. 205Vireque, A.A. ...................................................... 128Visintin, J.A. . 116; 130; 131; 141; 147; 148; 151; 157;

WWatanabe, Y.F. ............................................... 84; 142Wentz, K.C. ......................................................... 164Weppert, M. ............................................93; 121; 133Wolf, A. ........................................................145; 168

YYamada, C. .......................................................... 147Yamazaki, W. ....................................................... 151

ZZahn, F.S. ............................................................. 239Zanon, J.E.O. ......................................................... 92Zaynette, F.T. ....................................................... 241Zerio, N.M.C. ...............................................125; 126Zúccari, C.E.S.N. ................................................ 177

bó g.a., moreno d., cutaia l., baruselli p.s. & reis, e.l ... sbte-2004 -...

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