11Biologia Molecular AplicadaBIOQUMICA CLNICA2006Rosario D.C. HirataFCFUSP2Wooster & Weber. NEJM 348:2339, 200323Organizao do Genoma Humano Genoma humano 3 bilhes bp Cromossoma (mdia)150 milhes bp Gene (mdia) 50 mil pp Sequencia codificante (mdia) 3 mil bp Unidade do codigo gentico 3 bp Densidade gnica varivel4Organizao do Genoma HumanoDensidades gnicasbaixa densidadealta densidade (HLA) 35Variabilidade do DNA Humano Rearranjos cromossmicos Duplicao gnica Pseudogenes (sequncias exnicas no transcritas com altahomologia a um gene expresso) SNPs (single nucleotide polymorphisms) Insdels (inseres e delees) Sequncias repetidas Microsatlites - repeties consecutivas de dois ou mais nucleotideos Alu repeties insterspersed (espalhadas)http://www.doh.wa.gov/SBOH/Priorities/Genetics/GTF2002_01-03/documents/Tab05-DaveEatonPowerPoint.ppt#206Variabilidade do DNA Humano47Marcadores de variao gentica Polimorfismo: variao gentica com frequencia >1% em umapopulao Tipos de polimorfismos Single NucleotidePolymorphism (SNP): GAATTTAAGGAATTCAAG Simple Sequence Length Polymorphism (SSLP): NCACACACANou VNTR / STR NCACACACACACACAN NCACACACACACAN Insertion/Deletion: GAAATTCCAAGGAAA[ ]CCAAG8Determinantes Genticos de Doenas Humanas Anormalidades cromossomicas Perda ou ganho de cromossomos Perda ou ganho de regies cromossomicas Translocao de cromossomos Mutaes gnicas Regies codificantes perda, ganho ou alterao na funoda protena Regies regulatrias expresso aumentadas, diminuida ouinadequada Doenas polignicas ou multifatoriais Mutaes em multiplos genes Interaes Gene/Gene e Gene-Ambientehttp://www.doh.wa.gov/SBOH/Priorities/Genetics/GTF2002_01-03/documents/Tab05-DaveEatonPowerPoint.ppt#2059Alterao em um nico gene Alterao em um nico gene Alteraes em vrios genes Alteraes em vrios genesMutaes MutaesMutaes e Mutaes ePolimorfismos Polimorfismos (>1%) (>1%)X X Y YOutros genes Outros genesFatores ambientais Fatores ambientaisDoenaDoena Polignica Polignica normal normalX X Y YDoena monognica Doena monognicaHingorani, Atherosclerosis, 2000Alteraes Genticas10Guttmacher & Collins. NEJM 347:1512, 2002611Testes genticosMtodos12Reao em Cadeia pela Polimerase( PCR )955572Produtos de PCREletrofofese emgel de agaroseTermociclador (~30 ciclos)Reagentes de PCRDNA molde Iniciadores (primers)dNTPs (dATP; dCTP; dGTP; dTTP)Taq DNA polimerase(termoestvel)Mg2+713Etapas da PCR14PCR-RFLPPolimorfismo de Tamanho de Fragmento de Restrio Endonucleases de restrio - Arber, Nathans & Smith, 1962. EcoRI Escherichia coli (cepa RY13) GAATTCGAATTC CTTAAG CTTAAG GAATTCGAGTTC CTTAAG CTCAAG815

5NH23COOH112TGCCys158TGCCys5NH23COOH112TGCCys158CGCArg5NH23COOH112CGCArg158CGCArg SNPs do gene APOE (exon 4) 16Gentipos E2/2 E3/4E3/3 ME3/3E3/491 bp72 bp48 bp83 bp35 bp91 bpSNPs do gene APOE (HhaI) PAGE 15% 917GenePhor DNA Separation SystemAmershamBioscienceswww.amonline.net.au/. ../tour/sscp.htmPCR-SSCPPolimorfismo de conformao de fita simpleshttp://promo.amershambiosciences.com/na/k4042wb/genephor.asp18 EXON 6 EXON 6 EXON 9 EXON 9 EXON 11 EXON 11EXON 8 EXON 8 EXON 12 EXON 12PCR-SSCPTriagem de mutaes no gene RLDLSalazar e cols. Hum Genet, 20021019Sequenciamento de DNA por PCRmedstat.med.utah.edu20Eletroforese de altaresoluo com detecoautomtica em tempo realSeqenciamento de DNA1121medstat.med.utah.edu/.../ Formosa/menu.htmlSeqenciamento de DNA Visualizao do Resultado22Sistema TaqManDeteco por sondas marcadasFiguras cedidas por Applied Biosystems Inc.1223Sistema TaqManOBASE1OOBASE 2OO OHNNNOOBASE nO-OOP OP OO-OP OOO-OOP O O-O-HOReporter Dye:3'-PhosphateQuencher Dye:X =Cl, Y =H: TETX =Cl, Y =Cl: HEXX =H, Y =H:6-FAMTAMRALinkerArm Nucleotide (LAN)Figura cedida por Applied Biosystems Inc.24PCR em tempo realGrfico1325PCR em tempo realSistema de deteco LightCyclerhttp://www.roche-applied-science.com/lightcycler-online/26PCR em tempo realCurva Padrohttp://www.roche-applied-science.com/lightcycler-online/1427Sistema TaqMan - Anlise de expresso gnica18SSCAPDeltaCTFotografia cedida por LBMAD FCF/USP28Sistema TaqMan - Anlise de SNPsHeterozigoto VIC e FAMHomozigoto para alelo 2 FAMHomozigoto para alelo 1 VICIndica... Aumento na fluorescncia...http://keck.med.yale.edu/affymetrix/ABIgenotyping.htm1529Johnson e cols.Citokyne (27): 135-141, 2004 Fluorescncia 6FAMFluorescncia VICSistema TaqMan - Anlise de SNPs30PCR em tempo RealDeteco por SYBR Greenhttp://www.roche-applied-science.com/lightcycler-online/1631Multiplex PCR - LightCycler