biotecnologia_03

7/25/2019 BIOTECNOLOGIA_03

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Curso de

Biotecnologia

MDULO III

Ateno:O material deste mdulo est disponvel apenas como parmetro de estudos paraeste Programa de Educao Continuada. proibida qualquer forma de comercializao domesmo. Os crditos do contedo aqui contido so dados aos seus respectivos autoresdescritos nas Referncias Bibliogrficas.


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4.1 Vetores de Expresso

Vetores de expresso, assim como j definido no mdulo II, so

aqueles de clonagem que contm os elementos genticos necessrios

expresso de genes, de acordo com o tipo celular que est sendo utilizado

como hospedeiro. Eles podem ser de dois tipos, os de expresso procariotos e

os de expresso eucariotos. Apesar desta classificao distinta, muitas

caractersticas estruturais dos vetores so similares, diferindo apenas no fato

de que as sequncias genticas utilizadas so isoladas de procariotos ou de

eucariotos, respectivamente. Estas estruturas fornecem funcionalidades eresultados distintos.

A biotecnologia uma cincia de interesse industrial. Por isso, a

quantidade em que determinado bem produzida se torna fator crucial para a

implantao de um determinado protocolo. Diversas estruturas envolvidas com

a produo de protenas foram manipuladas, visando aperfeioar todos os

aspectos envolvidos neste processo: a transcrio, a traduo, a estabilidade

da protena e a sua secreo para o meio. Para isso, diferentes elementosgenticos tm sido modificados e testados na construo de novos vetores de

expresso procariotos e eucariotos. De maneira geral, as principais

caractersticas que tm sido manipuladas para aumentar os nveis de

expresso de protenas recombinantes so:

I. As sequncias relacionadas com a transcrio, como os

promotores e os terminadores;

II. O nmero de cpias do gene clonado, alm da localizao dasequncia codificadora em um plasmdeo ou integrado ao cromossomo;

III. A eficincia da traduo no organismo hospedeiro;

IV. A afinidade do stio de ligao do ribossomo;

V. A estabilidade da protena no hospedeiro;

VI. A localizao final da protena sintetizada.

As caractersticas citadas acima permitem concluir que a expresso


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eficiente de protenas recombinantes dependente do aproveitamento de

todos os passos, incluindo a transcrio, a traduo e o processamento

proteico. Neste contexto, um dos aspectos iniciais que devem ser

aperfeioados o nvel de transcritos. Para obt-los em altas quantidades,

estudos vm sendo realizados na busca de elementos genticos envolvidos

com o incio da transcrio, como o isolamento e caracterizao de sequncias

promotoras.

4.2 Sequncias Promotoras

A eficiente transcrio de genes se inicia pelo reconhecimento das

sequncias promotoras. Os nveis de expresso esto diretamente

relacionados com a afinidade da RNAP a esta regio, permitindo que a

sequncia de interesse seja frequentemente transcrita. Para que uma

determinada sequncia promotora seja utilizada em processos biotecnolgicos,

h a necessidade de se controlar de maneira precisa a taxa de transcrio.

Para isso, devem-se conhecer os mecanismos envolvidos com a regulaognica do promotor.

Por exemplo, a sequncia promotora do operon lac bem estudada e

seus mecanismos de regulao so bem elucidados. Por isso, frequentemente

ela utilizada na construo de vetores de expresso. Outros promotores com

propriedades distintas tambm so teis sob determinadas condies de

expresso gnica e, por isso, pesquisas foram conduzidas de forma a isolar e

caracterizar novas sequncias promotoras.Promotores de diferentes organismos, tanto procariotos como

eucariotos, foram isolados, caracterizados e, finalmente, utilizados na

construo dos diferentes vetores de expresso j disponveis comercialmente.

Apesar disso, a maioria de estudos deste tipo conduzida tendo como

organismo modelo, a bactria E. coli. A explicao para esta escolha se baseia

no fato de este micro-organismo ter o genoma sequenciado e ter sido bem

estudado, o que facilita a manipulao das ferramentas genticas.


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Alm disso, a expresso de protenas de interesse nesta bactria

apreciada devido aos nveis elevados do produto de interesse geralmente

alcanados neste sistema. Estas caractersticas tornam o micro-organismo de

eleio para estudos iniciais de produo de protenas recombinantes. Por este

motivo, a maioria das caractersticas dos vetores de expresso descrita nesta

apostila se refere aos elementos genticos de E. coli. Casos especficos de

expresso em outros micro-organismos sero detalhados separadamente.

4.2.1 Isolamento de Sequncias Promotoras

O isolamento de sequncias promotoras pode ser realizado de diversas

maneiras. Uma delas consiste no uso de genes reprteres, os quais codificam

um produto cujas caractersticas fenotpicas podem ser prontamente

visualizadas. A maioria destes marcadores permite que a seleo seja

realizada por um mtodo colorimtrico, que apresenta uma alta sensibilidade e

praticidade. O isolamento de sequncias promotoras pode ser realizado por

meio do uso de vetores que contenham um gene reprter clonado na ausnciade um promotor.

A metodologia envolvida neste processo envolve a ligao de uma

sequncia de DNA aleatria, ou que se suspeite conter o promotor, a jusante

deste gene. A insero de uma sequncia promotora no vetor reconhecida

pela visualizao das caractersticas do agente seletor utilizado. Como a

transcrio se inicia aps o reconhecimento do promotor pela RNAP, a

expresso do gene marcador somente ocorrer caso a sequncia clonadacontenha uma sequncia promotora. Dois tipos de vetores podem ser utilizados

com este propsito: o plasmdeo pBR316 e o pKO1.

4.2.1.1 Seleo de Sequncias Promotoras pelo Plasmdeo pBR316

O plasmdeo pBR316 foi utilizado em E. coli para o isolamento de

diversos promotores. Para alcanar este objetivo, primeiramente alguns


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procedimentos de modificao do vetor devem ser realizados. Aps a extrao

e purificao do vetor, ele submetido a uma digesto enzimtica com a

enzima HindIII. O stio de restrio para esta enzima se localiza na regio

promotora do gene codificador do antibitico tetraciclina. A digesto enzimtica

resulta na gerao de um plasmdeo linearizado e de extremidades coesivas.

Em seguida, estes vetores podem ser submetidos ao tratamento com duas

enzimas diferentes, a nuclease S1 ou a DNAP I. A protena S1 digere a

sequncia de fita simples das extremidades do vetor pBR316; por outro lado, a

DNAP I completa esta sequncia. Portanto, ao final deste procedimento sero

gerados dois plasmdeos distintos, os quais contm extremidades cegas deDNA fita dupla.

As extremidades das duas verses lineares do vetor pBR316 so ento

ligadas a um adaptador contendo o stio de restrio para EcoRI. Esta

alterao final gera dois plasmdeos diferentes, que apresentam um nico stio

de restrio para a enzima EcoRI. Um detalhe desta modificao a

localizao do adaptador, o qual interrompe o promotor do gene da tetraciclina.

Consequentemente, no haver expresso do gene que codifica o antibitico e,portanto, os transformantes alterados so sensveis e no cresceram em meio

onde esta droga acrescentada. Os procedimentos utilizados na modificao

deste plasmdeo esto ilustrados na Fig. 50.


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Figura 50: Formao de dois plasmdeos distintos a partir do vetor pBR316.

Inicialmente, o plasmdeo pBR316 digerido com a enzima HindIII,

interrompendo o promotor do gene da tetraciclina. As extremidades coesivas

geradas so ento submetidas a tratamentos diferentes. Uma opo a

digesto de fita simples pela nuclease S1; a outra corresponde sua

complementao com a DNAP I. Estes procedimentos geraro extremidades

cegas. Estas so unidas novamente aps a ligao a um adaptador contendo

AAGCTT

TTCGAA

A AGCTT

TTCGA A

A T

T A

A GAATTC T

T CTTAAG A

AAGCT AGCTT

TTCGA TCGAA

AAGCT GAATTC AGCTT

TTCGA CTTAAG TCGAA

Plasmdeo pBR316

Stio restrio HindIII

Digesto HindIII

Digesto

nuclease S1

Preenchimento

DNAP1

Ligao do adaptador contendo o stio

de restrio para EcoRI

AAGCTT

TTCGAA

AAGCTT

TTCGAA

A AGCTT

TTCGA A

A AGCTT

TTCGA A

A T

T A

A T

T A

A GAATTC T

T CTTAAG A

A GAATTC T

T CTTAAG A

AAGCT AGCTT

TTCGA TCGAA

AAGCT AGCTT

TTCGA TCGAA

AAGCT GAATTC AGCTT

TTCGA CTTAAG TCGAA

AAGCT GAATTC AGCTT

TTCGA CTTAAG TCGAA

Plasmdeo pBR316

Stio restrio HindIII

Digesto HindIII

Digesto

nuclease S1

Preenchimento

DNAP1

Ligao do adaptador contendo o stio

de restrio para EcoRI


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um stio de restrio para EcoRI. Ao final, so gerados dois plasmdeos

diferentes. (Fonte: figura modificada de Glick & Paternak, 1994).

Os vetores modificados do plasmdeo pBR316 foram testados pelos

pesquisadores quanto ao seu potencial no isolamento de promotores funcionais

em E. coli. Para isso, fragmentos derivados da digesto do DNA genmico de

diversas espcies procariotas foram clonados no stio de restrio de EcoRI.

Como o promotor do gene da tetraciclina est inativo, somente a clonagem dos

fragmentos de DNA que contenham uma sequncia promotora funcional em E.

coli ser capaz de crescer em meio contendo tetraciclina.

O isolamento de promotores funcionais em E. coli obteve sucesso pormeio do uso dos vetores derivados do pBR316. Apesar do potencial

apresentado por esta estratgia, o uso deste plasmdeo exibe como

desvantagem a falta de conhecimento a respeito da fora do promotor. Por

isso, outros vetores foram construdos, como o plasmdeo pKO1.

4.2.1.2Seleo de Promotores pelo Plasmdeo pKO1

O plasmdeo pKO1 foi desenvolvido para ser utilizado na seleo de

promotores fortes. Com esta finalidade, sua estrutura foi construda de forma a

apresentar alguns requisitos, como:

I. Um gene reprter que permita a pronta deteco de uma

sequncia promotora quando esta for clonada a jusante do gene;

II. Um marcador de seleo, que, no caso, corresponde a um

antibitico;III. Um stio mltiplo de clonagem que deve se localizar antes da

sequncia do gene reprter;

IV. Um plasmdeo que seja estvel na clula hospedeira, com o

nmero de cpias conhecido.

Estruturalmente, o vetor pKO1 contm como marcador de seleo o

gene da ampicilina, o que permite a seleo de clones que foram

transformados com o vetor. Seu stio mltiplo de clonagem inclui stios de


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restrio nicos reconhecidos por diferentes enzimas. Alm disso, possui trs

cdons de paradas nas trs fases de leitura, evitando que a transcrio

continue alm da sequncia de interesse, o que pode gerar um resultado falso-

positivo. O gene reprter utilizado na construo do plasmdeo pKO1 uma

quinase derivada do operon gal de E. coli. Este constitudo pelos genes galE,

galT e galK, que codificam uma epimerase, uma transferase e uma quinase,

respectivamente. A quinase uma protena cuja deteco ocorre por mtodos

relativamente simples e sensveis, medindo os nveis da galactose-1-fosfato.

Para a seleo de promotores funcionais em E. coli, sequncias de

DNA suspeita de conterem promotores so digeridas e clonadas no pKO1. Amistura de DNA contendo os possveis recombinantes so ento utilizadas

para transformar uma E. colide gentipo galE+, galT+ e galK-. Esta linhagem,

quando alterada com um plasmdeo expressando a quinase, facilmente

selecionada por sua habilidade de crescer em meio cuja nica fonte de carbono

a galactose. Os transformantes com o vetor pKO1, nos quais foi clonada uma

sequncia promotora, so diferenciados pelas caractersticas fenotpicas de

colorao no meio McConkey.A expresso do gene da quinase gera uma enzima com atividade

fermentadora, o que resulta em colnias que apresentam colorao vermelha

no meio de eleio. Os vetores cuja sequncia clonada no contm um

promotor funcional em E. coli no expressam a quinase, sendo distinguidas

pela colorao branco-amarelada das colnias.

A seleo dos clones pelas caractersticas fenotpicas utilizadas no

vetor pKO1 ainda permite a distino entre a fora das sequncias promotorasclonadas. Para isso, inicialmente este vetor foi testado com sequncias

promotoras j conhecidas. O que se utilizou como base para a diferenciao foi

o crescimento das colnias. Promotores fortes induzem uma superexpresso

da enzima quinase, produzindo colnias vermelhas de crescimento lento. Isto

demonstra que altos nveis de transcrio de genes heterlogos representam

um esforo metablico significativo para a clula. Este resultado confirma a

potencialidade deste vetor no diferenciamento da fora dos promotores.


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O plasmdeo pKO1 foi originalmente desenvolvido para o isolamento de

sequncias promotoras. Apesar disso, este vetor tambm demonstrou a sua

utilidade no isolamento e caracterizao de sequncias terminadoras. Com

este propsito, os fragmentos que os contenham so inseridos entre um

promotor conhecido e o gene galK. Os resultados destes experimentos

demonstraram uma reduo de 50 vezes nos nveis de expresso da quinase,

apesar das colnias ainda se apresentarem vermelhas.

Se o terminador fosse inserido em um vetor contendo um promotor

mais fraco, os nveis de expresso eram reduzidos de tal forma que as colnias

chegavam a apresentar-se de colorao branco-amarelada. Portanto, apresena destas colnias indica que uma sequncia terminadora foi clonada no

vetor pKO1, quando este contm uma sequncia promotora conhecida. Estes

resultados demonstram a utilidade do plasmdeo pKO1 para o isolamento e

caracterizao, tanto de sequncias promotoras, como de terminadoras.

O isolamento e a caracterizao de sequncias promotoras um dos

passos iniciais para atingir altas produes de uma protena de interesse.

Contudo, esta caracterstica deve ser analisada com cautela. Altos nveis deexpresso e de forma constitutiva podem ser prejudiciais clula hospedeira.

Isto constitui um grande gasto energtico, podendo at mesmo impedir

algumas de suas funes vitais. Por isso, as pesquisas a respeito da

caracterizao de promotores prosseguiram com a finalidade de isolar os que

apresentassem uma expresso indutvel ao invs de constitutiva.

4.2.2 Promotores Induzveis

Diversos tipos de promotores induzveis j foram caracterizados e so

frequentemente utilizados na construo de vetores de expresso. Entre eles,

esto os promotores derivados do operon lac e do triptofano (trp). Todos

interagem com protenas repressoras, permitindo que a induo e a represso

da transcrio sejam reguladas. O promotor do operon lac, assim como

descrito no mdulo I, regulado pela protena repressora LacI. Na ausncia de


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lactose, esta protena se liga ao operador, impedindo que a RNAP prossiga

com a polimerizao de uma cadeia de RNA.

Portanto, neste caso a transcrio inibida. Contudo, na presena de

do indutor, a protena repressora sofre alteraes alostricas, perdendo sua

afinidade ao operador. Isto resulta no desligamento do repressor da sequncia

de DNA, permitindo o incio da transcrio pela RNAP.

Considerando os conhecimentos genticos a respeito da regulao da

transcrio gnica do operon lac, a biotecnologia tem aproveitado o seu

promotor e as suas sequncias reguladoras na construo de vetores cuja

expresso pode ser regulada. A induo da transcrio pode ser feita comduas molculas diferentes: a lactose, como descrito nos estudos deste operon,

e outra molcula sinttica e anloga da primeira, o isopropil--D-tiogalactosideo

(IPTG).

Os dois indutores tm aes semelhantes na regulao da transcrio

do operon Lac, inibindo a ligao da protena repressora ao operador, o que

permite o acesso e a atividade de polimerizao da RNAP. O uso do IPTG

apresenta vantagens significativas sobre a lactose. Ele no metabolizadopela clula e, por isso, sua concentrao se mantm constante durante o ciclo

celular. Esta caracterstica faz com que o IPTG seja o indutor

preferencialmente eleito para experimentos de expresso gnica.

Os experimentos de expresso com o promotor lac resultaram na

expresso de diversas protenas. Entretanto, os nveis de expresso obtidos

no so significativos e a fora do promotor considerada moderada. A

biotecnologia uma cincia inovadora, cujas ferramentas esto submetidas aum processo de aperfeioamento contnuo. Sob este aspecto, novos

promotores foram sendo estudados com o objetivo de obter nveis mais

expressivos dos produtos de interesse. Considerando esta perspectiva, uma

opo desenvolvida foi um promotor derivado do promotor lac, o lacUV5.

O promotor lacUV5 um variante do promotor lac. A diferena entre os

dois consiste em alteraes de nucleotdeos em relao sequncia consenso.

O promotor lacUV5 contm um nucleotdeo diferente da sequncia consenso;


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por outro lado, a mesma comparao pode ser feita com o promotor selvagem

lac, o qual apresenta trs nucleotdeos diferentes (Fig. 51). Os nveis de

expresso obtidos pela variante so maiores se comparados aos obtidos pelo

promotor lacselvagem.

Figura 51: Comparao das sequncias promotoras lacUV5 e lac selvagem com a

sequncia consenso.

Observa-se que o promotor lacUV5 difere da sequncia consenso em

apenas um nucleotdeo na regio -35. O mesmonucleotdeo tambm varia no

promotor lac; entretanto, este ainda apresenta mais duas alteraes de

nucleotdeos na regio -10 se comparado sequncia consenso. Osnucleotdeos alterados so apresentados na figura na pela cor vermelha.

Outra opo de sequncia promotora a isolada do operon triptofano.

O promotor trp negativamente regulado pela ligao do complexo formado

entre o triptofano e a protena repressora. Portanto, a regulao do promotor

realizada de uma maneira distinta da observada para o promotor lac, pois a

protena repressora se liga ao operador somente na presena do triptofano

(Fig. 52). Para induzir a transcrio gnica, necessria a remoo dotriptofano ou a adio do cido 3-indoleacrlico ao meio.

lac UV5 TTTACA -- 18 -- TATAAT

lac TTTACA -- 18 -- TATGTT

Seqncia consenso TTGACA -- 17 -- TATAAT


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Figura 52: Regulao da transcrio do promotor trp.

A figura apresenta as modificaes alostricas que a protena

repressora assume aps a sua ligao ao triptofano, afetando a sua ligao ao

operador. Quando esta molcula est disponvel, a protena repressora assume

uma conformao que lhe permite se ligar ao operador. Esta interao impede

Triptofano

Repressor + Triptofano Repressor

Quando triptofano est disponvel:

Promotor

RNA polimerase

Quando triptofano est indisponvel:

x

RNA polimerase

Incio da

transcrioRepressor incapaz de

se ligar ao operador

Triptofano

Repressor +Triptofano Repressor

Quando triptofano est disponvel:

Promotor

RNA polimerase

Quando triptofano est indisponvel:

x

RNA polimerase

Incio da

transcrioRepressor incapaz de

se ligar ao operador


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fisicamente a ligao da RNAP ao promotor, no havendo consequentemente a

transcrio do gene de interesse. Na ausncia de triptofano, a protena

repressora assume outra conformao que no permite a sua ligao ao

operador; assim, a RNAP pode iniciar a transcrio.

A busca por novos promotores que apresentassem altos nveis de

expresso no cessou, e dois outros foram gerados, o tac e o trc. Ambos so

variantes hbridas dos promotores lac e trp, sendo formados pela regio -35 do

promotor trp e pela regio -10 do operon Lac, incluindo o operador deste

ltimo. A diferena entre os dois promotores a constituio do espao

intergnico. Ambos exibem nveis de expresso gnica significativamente maiselevados se comparado aos promotores que lhes deram origem.

Os altos nveis de expresso obtidos com os promotores tac e trc

justificam o grande nmero de vetores de expresso comercialmente

disponveis portando estas sequncias. Um deles est ilustrado na Fig. 53. A

induo da expresso se faz de maneira idntica utilizada para o promotor

lac. Apesar de o operador ser o mesmo entre os promotores, os vetores

atualmente disponveis em regra utilizam um mecanismo de regulao distintoao do promotor lac.

Figura 53: Vetor de expresso pGEX.


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Este vetor de expresso, comercialmente disponvel, contm o forte

promotor tac (em destaque no boxe vermelho). Como os nveis de expresso

obtidos pelos promotores tac e trc so significativamente mais elevados, foi

exigido um mecanismo que permitisse uma regulao mais apropriada.

Considerando este fato, os vetores frequentemente utilizam como estratgia

para regular a expresso gnica dos promoteres tac e trc uma variante da

protena repressora LacI, a LacIq(Fig. 54).

A diferena entre as duas uma mutao na sequncia promotora da

ltima, que permite uma produo mais elevada do repressor. A imposio deuma regulao mais forte importante para manter as funes metablicas da

clula e para inibir nveis de expresso basal de protenas txicas para a

hospedeira.

Figura 54: Vetor de expresso pProEx-Hta (Gibco).


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Este vetor contm a sequncia do promotor trc, sendo que seus nveis

de expresso so regulados pela protena repressora LacIq (destacada na

figura pelo boxe vermelho). (Fonte: Coelho, 2007). A questo de obter nveis de

expresso gnica significativos ainda enquadra outro promotor muito utilizado

em vetores de expresso, o pT7. Este promotor derivado do fago T7 e

representa uma sequncia de alta afinidade para a RNAP, gerando altos nveis

de transcritos. A fora deste promotor impulsionou o desenvolvimento de

vetores de expresso como os pET, tornando-os a escolha para a expresso

de genes de interesse (Fig. 55).

Figura 55: Figura representativa do vetor de expresso pET.

A ilustrao mostra os elementos genticos constituintes do vetor de

expresso pET. Destaque para o promotor pT7, o qual induz altos nveis de

expresso gnica. As sequncias reguladoras deste vetor geralmente so

aquelas derivadas do operon lac.


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Os mecanismos envolvidos com a transcrio das sequncias clonadas

nos vetores pET exige o conhecimento de certas particularidades. A transcrio

a partir do promotor pT7 dependente da ao da enzima RNAP do fago T7.

Isto constitui uma vantagem deste sistema de expresso, pois, como no h

estoques em E. coli desta enzima, no se observa nveis basais de expresso.

Contudo, esta afirmao um paradoxo, pois ao mesmo tempo em que esta

caracterstica uma vantagem, ela tambm representa uma desvantagem. A

necessidade da presena da RNAP do fago T7 impe a restrio da linhagem

de E. coli que pode ser utilizada como hospedeira na expresso das protenas

de interesse; estas devem ser capazes de expressar a enzima referida.A linhagem utilizada na expresso de protenas a partir do sistema pET

a BL21. Ela contm a sequncia codificadora da RNAP do fago T7 integrada

em seu cromossomo sob a regulao do promotor lacUV5 e das sequncias

reguladoras do operon lac(Fig. 56). Assim, de maneira geral, a adio do IPTG

cultura de clulas transformadas com o vetor recombinante induz a

expresso da RNAP do fago T7. Esta ento capaz de interagir com o

promotor pT7 presente no vetor pET, iniciando ento a transcrio do gene deinteresse.

Figura 56: Constituio gentica da linhagem BL21.

A sequncia codificadora da RNAP do fago T7 est inserida ao DNA


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cromossomal da linhagem BL21 de E. coli. A regulao da transcrio desta

protena est sob a regulao de sequncias derivadas do operon Lac. Alm

dos promotores induzveis pela adio de alguma substncia, outros vetores

carregam sequncias promotoras induzidas por mudanas de temperatura,

como o pL (Fig. 57). Este promotor derivado do fago lambda e pode ser

controlado pelo repressor termossensvel cI.

Em linhas gerais, as clulas transformadas com vetores que

contenham o promotor em questo so cultivadas a uma temperatura entre 28

a 30C, faixa dentro da qual o repressor capaz de se ligar ao operador.

Quando a cultura alcana a fase de crescimento desejada, ela submetida auma mudana de temperatura para 42C. Sob estas condies, o repressor

inativado, permitindo o incio da transcrio.

Figura 57: Vetor de expresso constitudo pelo promotor pL.

A figura ilustrao vetor de expresso pdeltablue, representando um dos

vetores comerciais cuja transcrio se inicia no promotor pL (que est

destacado, na figura, pelo boxe vermelho). Um dos pontos essenciais para

obter nveis de expresso significativos da protena de interesse obter um alto

nmero de transcritos. Este objetivo pode ser alcanado com o uso de


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promotores fortes na construo de vetores de expresso, como discutido

anteriormente. Apesar de diversas opes de promotores estarem disponveis,

o aprimoramento do processo de transcrio somente no garante alcanar

este objetivo. Outra opo consiste em clonar em tandem cpias mltiplas da

sequncia de interesse no vetor de expresso.

A desvantagem desta escolha est nas dificuldades tcnicas de

clonagem das sequncias, uma seguida da outra. Os procedimentos

envolvidos dificultam obter uma construo contendo a orientao correta para

a transcrio e traduo de todas as sequncias clonadas. Outra desvantagem

a instabilidade em nvel de DNA que estas construes podem apresentar.Por isso, durante a multiplicao da cultura celular, algumas ou todas as cpias

so eliminadas do plasmdeo.

Outra opo para aumentar os nveis de transcritos consiste em

aumentar o nmero de cpias do vetor utilizado. Contudo, isto representa uma

carga metablica significativa para a clula. Alm da replicao do vetor, h um

gasto energtico com a transcrio e com a replicao de todos os genes

presentes no plasmdeo. Com isso, algumas clulas tendem a expulsar o vetor,permitindo um crescimento celular acelerado se comparadas ao obtido pela

clula portadora do plasmdeo.

Este fato resulta em uma cultura onde haver o predomnio de clulas

que no contenham o vetor recombinante aps alguns ciclos de diviso celular.

Sob o ponto de vista biotecnolgico, isto representa uma perda relevante, pois

os nveis de expresso esto diretamente relacionados com a densidade

celular que contm o vetor de expresso.Altos nveis de expresso ainda so responsveis pelo fenmeno de

instabilidade do plasmdeo. Para a manuteno de clulas que o contenha,

uma opo consiste em adicionar antibitico ou metablitos essenciais para a

clula cultura, mantendo uma presso seletiva sobre as transformadas.

Apesar de manter em cultura, preferencialmente, as clulas transformadas, o

uso de drogas seletivas representa um alto custo para a indstria. Alm disso,

h uma preocupao quanto segurana do consumo de produtos derivados


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deste tipo de cultura por humanos, uma vez que certos indivduos apresentam

respostas alrgicas aps ingerir estas substncias.

A instabilidade do plasmdeo e de algumas construes utilizadas nos

vetores de expresso constituem um agravante para a perpetuao da

tecnologia de expresso heterloga. Apesar de ser um mtodo bastante

simples e prtico, suas desvantagens so a causa da busca de alternativas

para solucionar este problema. Uma delas que vm sendo especulada a

integrao da sequncia de interesse no cromossomo da clula hospedeira.

4.3 Integrao do DNA no Cromossomo da Clula Hospedeira

A integrao do material gentico, que possui a sequncia de

interesse, ao DNA cromossomal da clula hospedeira uma estratgia que

aumenta a estabilidade do DNA exgeno durante as divises celulares. O

interesse nesta opo ainda apresenta uma vantagem extremamente relevante

sob o ponto de vista tecnolgico: a liberao do consumo de micro-organismos

geneticamente modificados.Este processo permite que as sequncias indesejadas dos vetores,

como os genes que codificam antibiticos, sejam eliminadas do micro-

organismo modificado. Desta maneira, o gene de interesse mantido durante

as geraes na ausncia de agentes seletivos, facilitando a liberao deste

produto ao consumo de humanos e prevenindo a contaminao ambiental.

A insero de uma sequncia de interesse no DNA cromossomal da

clula hospedeira deve ocorrer em um stio especfico de eleio. A sualocalizao deve considerar a proximidade a um promotor forte, o qual deve ser

preferencialmente regulvel, e excluir aquelas regies gnicas que codifiquem

produtos essenciais clula. Estas caractersticas asseguraro uma expresso

eficiente sob condies normais de crescimento da clula hospedeira.

O vetor onde a sequncia de interesse est clonada deve conter uma

regio homloga sequncia de DNA do hospedeiro. Alguns autores sugerem

que o tamanho desta homologia deva ser de aproximadamente 51


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nucleotdeos, assegurando a troca fsica entre as molculas de DNA. Este

evento denominado recombinao. Este processo envolve certas etapas,

como:

I. Identificar a sequncia que ser interrompida no DNA

cromossomal do hospedeiro, para a insero do gene de interesse;

II. Isolar a sequncia homloga selecionada e clon-la em um vetor

do tipo integrativo. A clonagem do stio de insero deve ocorrer nas regies

flanqueadoras da sequncia de interesse a ser clonada;

III. O vetor a ser utilizado com esta finalidade no deve ser do tipo

replicativo na clula hospedeira;IV. Seleo dos clones que tiveram a sequncia de interesse

integrada ao seu genoma.

A insero do gene clonado catalisada por uma enzima do

hospedeiro, sendo que somente a sequncia de interesse ou mesmo todo o

plasmdeo pode ser inserido. No primeiro caso, diz-se que houve um duplo

crossing-over. Este o evento ideal, pois evita que as sequncias indesejadas

presentes no vetor, como as regies codificadoras de antibiticos, estejampresentes na nova linhagem recombinante.

Um evento simples de recombinao, que permite a insero de todo o

vetor, normalmente diferenciado do duplo crossing-over pela seleo por

antibiticos. Apesar de ser indesejado, este tipo de seleo pode ser til para

obter clones com duas ou mais cpias do gene de interesse. Esta estratgia foi

utilizada em Bacillus subtilis para obter nveis de expresso mais elevados da

protena

-amilase. Neste caso, os transformantes originais foram crescidos napresena de altos nveis de cloranfenicol. Somente clulas que tiveram uma

duplicao espontnea do inserto foram capazes de sobreviver sobre estas

condies de seleo.

Por mtodos imunolgicos, foram identificados clones que continham

diferentes nmeros de cpias do gene da -amilase. Os nveis de expresso

obtidos pelo clone que continha nove cpias da sequncia de interesse foram

maiores que os obtidos quando o hospedeiro em questo foi transformado com


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um plasmdeo com nmero de 20 a 40 cpias por clula.

A integrao de sequncias ao DNA cromossomal tambm possui

desvantagens. Os principais argumentos contra a sua adoo se referem

dificuldade de manipulao para a integrao do DNA, frente a uma simples

transformao da clula hospedeira, e a reduo dos nveis de expresso

quando somente uma cpia integrada. Mesmo diante de opes que

permitam aumentar os nveis de transcritos e a estabilidade das clulas

transformadas, isto no assegura uma quantidade significativa de protenas

expressas. Outras caractersticas devem ser aperfeioadas, tais como a

eficincia da traduo da sequncia de interesse.

4.4 Eficincia de Traduo

A eficincia com que um RNAm traduzido o diferencial para obter

entre centenas/milhares de uma cadeia proteica ou entre algumas cpias

somente. De fato, os nveis de transcritos obtidos de diferentes RNAm chega a

ser bem diferente em clulas de procariotos. Uma explicao para a diferenana eficincia da traduo est nas bases moleculares, o stio de ligao do

ribossomo (RBS). Esta sequncia, que contm o Shine Dalgarno, est ligada

com a afinidade a qual o ribossomo tem pelo RNAm. Quanto maior essa

relao, maiores so os nveis de transcritos.

A relao direta entre a afinidade do ribossomo ao seu stio de ligao

no RNAm e a eficincia da traduo utilizada no desenvolvimento de vetores

de expresso (Fig. 58). Alm de permitir altos nveis da protena de interesse,esta estratgia permite o reconhecimento pela maquinaria celular de

sequncias codificadoras tanto de procariotos como de eucariotos.


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Figura 58: Incluso do stio de ligao ao ribossomo em vetores de expresso.

A figura ilustra o vetor de expresso comercial pQE-100 (Qiagen),mostrando o acrscimo do RBS (destacado na figura pelo boxe vermelho). A

maior eficincia da traduo est ligada a alguns requisitos que devem ser

estabelecidos na construo do vetor de expresso. Em primeiro lugar, o stio

de ligao ao ribossomo deve estar localizado a uma distncia precisa do

cdon de incio. Os vetores de expresso foram construdos de forma a

conterem o RBS, sendo que a distncia adotada em relao ao cdon de incio

testada para estabelecer a que favorece a traduo.

Apesar do stio de ligao do ribossomo ser fixo entre os vetores de

expresso, vale ressaltar que em determinadas situaes preciso adaptar a

distncia para cada gene. O segundo requisito que deve ser analisado para

aumentar a eficincia da traduo a prpria estrutura do RNAm. A sequncia

5 destes transcritos, regio que inclui o stio de ligao do ribossomo, no

deve conter sequncias de nucleotdeos complementares entre si.

A complementaridade dentro da cadeia permite a formao de


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estruturas secundrias no RNAm, o que dificulta a ligao do ribossomo ao

transcrito. Este tipo de problema deve ser analisado para cada sequncia em

especfico. A eficincia da traduo ainda pode ser aumentada usando os

cdons preferenciais de cada hospedeiro. Como descrito no mdulo I, os

micro-organismos utilizam com maior frequncia alguns dos cdons que

codificam um determinado aminocido. Esta caracterstica est relacionada

com a disponibilidade dos RNAt que so mais transcritos por um determinado

tipo de clula. A incompatibilidade entre os cdons apresentados na sequncia

de um RNAm, transcrito a partir de uma sequncia heterloga, com aqueles

frequentemente utilizados pela clula hospedeira diminuem a eficincia datraduo.

Em outras palavras, os RNAt cujos anticdons reconhecem cdons,

que so raramente utilizados pelo micro-organismo esto menos disponveis, o

que dificulta a traduo da sequncia de interesse. Para solucionar esta

questo, pode-se sintetizar quimicamente a sequncia de interesse, utilizando

os cdons preferenciais do organismo que ser utilizado como hospedeiro.

A sntese qumica de sequncias codificadoras, utilizando a estratgiade cdons preferenciais, tem sido adotada com sucesso por alguns grupos de

pesquisa. Apesar disso, como discutido no mdulo II, o alto custo deste

procedimento pode tornar esta alternativa invivel. Dentro deste contexto,

foram desenvolvidas linhagens de E. coli em que o nmero de RNAt limitantes

para algumas espcies foi aumentado.

A linhagem RosettaTM(Novagen) um exemplo deste tipo de bactria

modificada. Derivadas da linhagem BL21, a Rosetta

TM

uma E. colitransformada com plasmdeos que codificam os RNAt cujos anticdons

reconhecem os cdons AGG, AGA, AUA, CUA, CCC e GGA frequentemente

utilizados na expresso de genes eucariotos. Estas bactrias modificadas

constituem exemplos de hospedeiros que proveem uma espcie de traduo

universal de genes heterlogos.

O aperfeioamento de estratgias que permitam aumentar a eficincia

da traduo tem obtido sucesso para aumentar os nveis de expresso de


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protenas de interesse. Complementando isto, outro aspecto que deve ser

utilizado com o mesmo propsito a anlise das opes que permitam

aumentar a estabilidade proteica.

4.5 Estabilidade de Protenas

A estabilidade das protenas um ponto chave para obter uma alta

produo dos produtos desejados. A instabilidade das mesmas se deve,

principalmente, degradao a que esto expostas. Este aspecto

dependente de diferentes fatores, como: a espcie hospedeira, que est sendoutilizada para produzir as protenas recombinantes, e a prpria estrutura da

macromolcula.

4.5.1 Espcie Hospedeira

A linhagem que est sendo utilizada para a expresso de protena

recombinante afeta a estabilidade e a estrutura da macromolcula produzida.Este fato est diretamente relacionado com a presena e concentrao de

proteases produzidas naturalmente pelas clulas hospedeiras.

As proteases podem estar presentes tanto no meio intracelular como

na membrana externa. Dentre elas, as mais estudadas so a protena Lon, e a

OmpT. Linhagens deficientes para estas duas proteases j se encontram

disponveis comercialmente, como as BL21 (DE3), BL21 (DE3) pLysS e a BL21

(DE3) pLysE (Invitrogen). A ausncia destas duas proteases demonstrou que aexpresso nestas linhagens de bactrias modificadas apresenta uma reduo

na degradao das protenas produzidas.

O uso de bactrias deficientes em proteases demonstrou seu valor na

expresso de protenas heterlogas e a reduo da degradao de

macromolculas aumentou os nveis de produo. Outra estratgia para

alcanar o mesmo objetivo a modificao da estrutura da protena.


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4.5.2 Aumento da Estabilidade Proteica pela Modificao da sua Estrutura

A estrutura das protenas uma caracterstica intrnseca que pode

propiciar a degradao destas cadeias. Sequncias internas dentro das

protenas esto envolvidas com o seu reconhecimento por enzimas

proteolticas. Um exemplo a presena de sequncias internas ricas em

prolina, cido glutmico, serina e treonina. Elas so genericamente conhecidas

como sequncias PEST. Estes sinais so frequentemente flanqueados por

grupos de aminocidos carregados positivamente. Alguns autores sugerem que

a estabilidade da protena pode ser aumentada por manipulaes genticasque possibilitem a alterao destas regies.

A meia-vida de muitas protenas citoslicas est relacionada com os

resduos de aminocidos presentes na poro N-terminal. Alguns autores

sugerem que estes resduos possibilitam uma rpida ubiquitinao, resultando

na degradao das macromolculas pelo complexo do proteassoma. A

presena dos aminocidos arginina, lisina, fenilalanina, leucina ou triptofano na

regio N-terminal da cadeia proteica tem sido associada com uma meia-vidacurta das protenas.

Por outro lado, a presena dos aminocidos cistena, alanina, serina,

treonina, glicina, valina ou metionina na mesma regio relacionada com uma

meia-vida longa. Nestes casos, as cadeias proteicas so mais resistentes ao

ataque proteoltico. Por esta razo, estes aminocidos so denominados como

estabilizadores. Uma comparao evolutiva interessante que um aminocido

estabilizador, a metionina, adicionado poro N-terminal das protenasrecm-sintetizadas, o que suporta a ideia da importncia da relao entre a

estrutura proteica e a sua estabilidade.

A alterao da estrutura proteica para aumentar a sua estabilidade tem

sido utilizada, demonstrando resultados promissores. Entretanto, esta opo

algumas vezes no possvel, pois a modificao implica em mudana da

sequncia da protena, resultando em perda de funo. Outra estratgia para

evitar estes problemas o uso de protenas de fuso.


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4.6 Protenas de Fuso

A construo de uma protena de fuso significa estabelecer uma unio

entre a sequncia do gene clonado com outra derivada de uma protena

expressa de maneira estvel pela clula hospedeira. Esta combinao resulta

em maiores nveis de expresso, pois h a proteo da sequncia de interesse

da ao das proteases celulares. Alguns estudos compararam a degradao

da protena quando a expresso feita a partir da sua sequncia somente ou

da associao a uma protena de fuso. Os resultados demonstraram que aprotena fusionada mais resistente protelise.

Protenas de fuso so construdas em nvel de DNA pela ligao da

regio codificadora de dois genes diferentes. Para isto, normalmente se utiliza

um vetor que j possui a sequncia de um gene da clula hospedeira e que

permite que a outra de interesse seja inserida e ligada primeira. As duas

sequncias devem ser clonadas de forma que a fase de leitura de ambas

esteja correta.Diversos tipos de protenas de fuso podem ser utilizados. Um exemplo

a fuso da protena alvo com o segmento na poro 5 terminal do gene

ompF de E. coli, que codifica uma protena de membrana fusionada a uma

poro do gene LacZ. Esta protena de fuso, alm de aumentar a estabilidade

da protena, facilita a identificao da macromolcula expressa.

O uso de protenas de fuso pode beneficiar o pesquisador de diversas

maneiras. Assim como a protena LacZ, outras utilizadas com o mesmopropsito podem ter outras utilidades, como facilitar a purificao da protena

recombinante. Isto se deve utilizao em colunas de purificao de

substncias que apresentem afinidade protena de fuso. Este protocolo

permite selecionar, dentro do extrato bruto de protenas, somente aquelas de

interesse ao pesquisador.

Diversos vetores de expresso permitem a opo pelo uso de

protenas de fuso. A maioria dos fabricantes justifica seu uso como escrito no


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pargrafo anterior: para aumentar a estabilidade da protena e facilitar a sua

purificao. Estas mesmas caractersticas podem ser obtidas pela escolha de

uma estratgia diferente, a secreo de protenas.

4.7 Aumento da Secreo de Protenas Recombinantes

A secreo de protenas recombinantes uma caracterstica desejvel

sob alguns aspectos biotecnolgicos. A secreo pode aumentar a estabilidade

de determinadas protenas, como no caso da insulina. Experimentos

demonstraram que a expresso desta protena em E. coli e a secreo noespao periplasmtico aumentaram em aproximadamente 10 vezes a

estabilidade da protena se comparado ocorrida no citoplasma. Alm disso,

protenas secretadas so mais fceis de purificar.

A secreo de protenas um processo dependente de uma sequncia

que se localiza na poro N-terminal da protena, o peptdeo sinal. Este permite

o endereamento proteico para a membrana celular. Aps isso, a maquinaria

de secreo capaz de reconhec-lo, clivando-o. O processo de secreofinaliza com a liberao da protena para o periplasma, no caso de bactrias

gram-negativas, ou para o meio extracelular.

Algumas sequncias podem ser manipuladas para permitir a sua

secreo. Neste caso, a sequncia de interesse clonada em um vetor de

expresso que contenha um peptdeo sinal. A maioria dos vetores de

expresso apresenta duas verses, a que permite a expresso citoplasmtica e

a que contm a sequncia de um peptdeo sinal, facilitando o endereamentoproteico. Apesar destas possibilidades j disponveis comercialmente, esta

modificao no garante altos nveis de protenas secretadas. Alm disso, a

secreo de protenas em bactrias Gram-negativas frequentemente

direcionada para o espao periplasmtico e no para o meio extracelular.

Uma alternativa para aumentar a eficincia da secreo de protenas

para o meio extracelular consiste em optar por outras clulas hospedeiras,

como as bactrias gram-positivas. Estas so os micro-organismos de escolha


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quando o experimento requer a secreo de protenas recombinantes, pois as

macromolculas so liberadas diretamente no meio externo. Esta caracterstica

diferencial entre organismos gram-negativos e gram-positivos se deve

organizao da parede celular, os ltimos no possuem o espao

periplasmtico. Portanto, vetores de expresso que contenham o peptdeo sinal

permitem que a protena expressa, quando secretada de forma adequada, seja

liberada diretamente no meio.

Alm do uso de bactrias gram-positivas para a expresso de

protenas que devam ser secretadas, certos organismos eucariotos so

opes. Entre eles, h relatos de alta eficincia da secreo de protenas como uso de fungos filamentosos, como ser discutido mais adiante.

A eficincia da secreo de protenas por micro-organismos gram-

positivos questionada por alguns autores. Apesar desta caracterstica

benfica apresentada, os nveis de expresso obtidos nestes micro-organismos

deixam a desejar. Por isso, geralmente os pesquisadores optam por expressar

protenas na E. coli. Considerando este aspecto, a tecnologia do DNA

recombinante est sendo utilizada na manipulao das caractersticas dasequncia que permitam o endereamento proteico.

Alm do peptdeo sinal, foi observado um mecanismo interessante em

algumas bactrias gram-negativas envolvido com a secreo da protena

bacteriocina. Uma cascata de eventos coordenados resulta na ativao da

fosfolipase, presente na membrana interna da bactria. Esta protena age de

forma a permeabilizar a membrana interna e externa da bactria. Neste

momento, algumas protenas presentes no citoplasma e no espaoperiplasmtico so liberadas para o meio.

A partir da elucidao dos mecanismos envolvidos com a secreo da

bacteriocina, a biotecnologia desenvolveu uma estratgia para aumentar a

secreo de protenas expressas ao meio extracelular. A bactria deve ser

transformada com dois plasmdeos, cuja expresso esteja sob o controle das

mesmas sequncias reguladoras. Um dos vetores conter a sequncia do gene

da protena responsvel por ativar a fosfolipase D; o outro ter a sequncia de


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interesse fusionada a um peptdeo sinal. Assim, a induo da expresso ativar

a transcrio dos dois genes, sendo que a protena que libera a bacteriocina

induzir a permeabilizao da membrana, e a protena de interesse ser ento

secretada para o meio.

Os sistemas de expresso procariotos so largamente utilizados para a

produo de diferentes tipos proteicos, at mesmo de protenas eucariotas.

Nestes casos, frequentemente se utiliza o cDNA como sequncia codificadora

a ser clonada no vetor de expresso. Apesar de que em alguns casos esta

estratgia ser utilizada com sucesso, algumas protenas eucariotas so

produzidas de maneira instvel ou no apresentam atividade biolgica.A funcionalidade de protenas eucariotas requer que a mesma

apresente a maior identidade possvel sua apresentao original, tanto em

nveis bioqumicos como biofsicos. A ausncia de atividade biolgica de

protenas expressas em organismos procariotos pode ser devida expresso

em uma conformao inadequada, principalmente, pela incapacidade destes

sistemas em gerar determinadas modificaes ps-traducionais. Entre elas,

pode-se citar:I. Formao de pontes dissulfeto. Esta reao dependente da

atividade da enzima chamada isomerase dissulfeto. A ausncia desta

modificao est relacionada com uma conformao proteica instvel e com

a falta de atividade biolgica;

II. Clivagem proteoltica do precursor da protena. Neste

procedimento, determinados segmentos da sequncia de aminocidos so

removidos para produzir uma protena funcional;III. Glicosilao, onde frequentemente so adicionados resduos de

acar serina e treonina. Esta modificao est relacionada com a

estabilidade e com propriedades diferenciais da protena;

IV. Modificao de determinados aminocidos dentro da cadeia

proteica, como a acetilao e a fosforilao.

Dentre as modificaes da cadeia proteica que exibem menor

probabilidade de realizao por organismos procariotos so a glicosilao e a


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modificao de aminocidos da cadeia proteica. A questo conformacional de

protenas expressas em organismos procariotos no o nico problema na

expresso de protenas eucariotas em sistemas procariotos. Outro ponto crtico

na obteno de produtos expressos nestes micro-organismos se refere

presena de contaminantes txicos para humanos, resultando em efeitos

colaterais indesejveis. Para solucionar estes problemas, pesquisadores tm

desenvolvido sistema de expresso eucarioto para a expresso de protenas

teraputicas para humanos e animais.

4.8 Expresso em Sistemas Eucariotos

Sistemas de expresso eucariotos so muito similares aos de

procariotos. Eles so constitudos por vetores de clonagem que contm os

elementos genticos que permitem a expresso do gene de interesse em

clulas eucariotas. Logo, estes vetores so constitudos por:

I. Uma sequncia que permita a seleo do transformante em

clulas eucariotas;II. Sequncias que permitam uma eficiente transcrio de genes

eucariotos, como um promotor eucarioto,

III. Sequncia de poliadenilao, permitindo a adio da cauda poliA

ao RNAm.

Um exemplo de vetor de expresso eucarioto est representado na Fig.

59. O pVAX um vetor que possui todos os elementos genticos para a

expresso gnica em clulas de mamferos. um vetor muito utilizado nodesenvolvimento de vacinas de DNA.


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Figura 59: Mapa do vetor pVAX (Invitrogen).

Este vetor possui todos os elementos genticos necessrios para a

expresso gnica em clulas de mamferos, como o promotor do

citomegalovrus humano (CMV), que permite altos nveis de expresso; o sinal

de poliadenilao derivado da sequncia codificadora do hormnio bovino

(BGH), que confere maior eficincia na terminao da transcrio e da

poliadenilao do RNAm. Alm disso, o vetor foi construdo de acordo com as

normas do Food and Drug Administration (FDA), contendo somente as

sequncias necessrias replicao em E. coli ou para a expresso em

clulas de mamferos. (Fonte: Coelho, 2007).

Assim como discutido para os organismos procariotos, outras

sequncias importantes tambm podem ser adicionadas ao vetor de expresso

eucarioto, dependendo dos objetivos. No caso de o vetor ser um plasmdeo, o

qual se replicar de maneira independente aos cromossomos, este deve conter


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uma origem de replicao eucariota. Contudo, como a manipulao deste tipo

de clulas um processo mais complicado, geralmente os procedimentos se

realizam inicialmente em clulas procariotas, para depois prosseguirem em

eucariotas.

Para isso, frequentemente se utilizam plasmdeos que possuam duas

origens de replicao: uma procariota e outra eucariota. Estes vetores so

conhecidos como shuttle. Alm da origem de replicao, estes plasmdeos

so construdos contendo dois genes que permitam a seleo das clulas

transfectadas com o vetor recombinante.

Assim como a origem de replicao, uma das sequncias estrelacionada com a seleo em clulas procariotas e, a outra, em clulas

eucariotas. Estes vetores shuttle tm sido desenvolvidos para a expresso de

protenas recombinantes em leveduras e para clulas de insetos e de

mamferos.

Uma alternativa expresso em plasmdeo consiste na integrao

desta sequncia ao DNA cromossomal da clula hospedeira. Neste caso, o

vetor deve conter um segmento de DNA homlogo a uma regio docromossomo do hospedeiro o stio de integrao cromossomal para permitir

o processo de recombinao homloga.

Apesar do desenvolvido e aperfeioamento de vetores de expresso

eucarioto, no h um sistema que atenda todas as modificaes proteicas de

interesse. Por isso, devem-se analisar as caractersticas da protena de

interesse e, a partir disso, examinar diferentes sistemas de expresso e tipos

celulares a serem utilizados na produo da protena de interesse.

4.8.1 Sistemas de Expresso Eucariotos

Diversos tipos de organismos so utilizados como clulas hospedeiras

para a expresso de protenas eucariotas, como as leveduras, as clulas de

insetos e as clulas de mamferos. As leveduras compartilham muitas

caractersticas bioqumicas, genticas e moleculares com outros organismos


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eucariotos. Este fato propicia um ambiente intracelular favorvel s

modificaes de protenas, necessrias para que estas apresentem atividade

biolgica. Alm disso, muitas leveduras contm uma via de secreo e de

sinalizao idnticas s presentes em clulas de mamferos, possibilitando

ento a expresso de protenas tanto intracelularmente como na forma

secretada.

As vantagens do uso de leveduras ainda incluem as caractersticas de

manuteno da cultura, como a relativa simplicidade e facilidade na

manipulao, rapidez de crescimento, atingindo uma alta densidade celular e o

baixo custo de manuteno. Estas so as mesmas caractersticas quefavorecem a escolha de E. coli como sistema procarioto para a expresso de

protenas. Outro fator relevante para a eleio da expresso em leveduras a

segurana do sistema, que livre de endotoxinas e de oncogenes.

Outro aspecto vantajoso do uso de leveduras se baseia no fato de que

algumas delas j possuem o genoma completamente sequenciado. Isto facilita

as manipulaes genticas, propiciando o aprimoramento dos vetores de

expresso. Este fato permitiu, por exemplo, o isolamento e a caracterizao depromotores fortes que permitem atingir altos nveis de expresso da protena

de interesse. Isto facilitou a produo de protenas em larga escala e em menor

custo, se comparado aos nveis obtidos com a expresso em clulas de

mamferos.

Os vetores de expresso desenvolvidos apresentam elementos

genticos especficos que permitem uma maior produo de acordo com a

levedura que est sendo utilizada como clula hospedeira. Entretanto, umacaracterstica em comum que facilitou a transformao das leveduras com o

vetor de expresso foi o uso de vetores shuttle. A ligao do inserto a este

vetor produzida in vitroe ento utilizada para transformar primeiramente E.

coli.

Este procedimento utilizado, pois a manipulao desta bactria um

processo mais simples e que permite a construo de uma gama maior de

estruturas a serem utilizadas na expresso. Alm disso, este procedimento


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facilita a seleo da construo correta; depois da confirmao, parte-se para a

transformao da levedura com o vetor recombinante correto. As vantagens da

utilizao de leveduras na expresso de protenas recombinantes

impulsionaram muitas pesquisas no assunto. Um exemplo a utilizao da

tecnologia do DNA recombinante por grupos de pesquisa da Universidade de

Braslia e da USP para desenvolver linhagens de leveduras capazes de utilizar

o amido.

Estes novos organismos foram modificados e contm genes de

amilases para o processamento do amido presente na mandioca e na batata

doce, o que est sendo testado na produo de etanol. Diversos tipos deleveduras tm sido testados quanto ao seu potencial na expresso de

protenas recombinantes. Entre elas, uma das mais utilizadas a

Saccharomyces cerevisiae.

4.8.1.1 Expresso em Saccharomyces Cerevisiae

S. cerevisiae uma levedura constituda por uma nica clula, a qualpode se apresentar de forma esfrica ou oval (Fig. 60A). A multiplicao destas

clulas d um aspecto em gar semelhante a uma bactria (Fig. 60B).

A B

Figura 60: (A) Clulas de S. cerevisiae e (B) colnias da mesma Levedura.


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S. cerevisiae foi um dos primeiros organismos de eleio para a

expresso de protenas eucariotas. Muitos fatores contribuem para esta

escolha:

I. uma levedura cujas condies fisiolgicas so bem conhecidas;

II. Seu genoma j foi totalmente sequenciado;

III. Cresce facilmente tanto a nvel laboratorial como em escala

industrial;

IV. Diversas sequncias promotoras fortes j foram isoladas e

caracterizadas;V. Foram isolados plasmdeos naturais de S. cerevisiae, os quais

podem ser utilizados na construo de vetores de expresso;

VI. S. cerevisiae capaz de realizar diversas modificaes ps-

traducionais;

VII. capaz de secretar protenas para o meio, caracterstica utilizada

pela engenharia gentica para facilitar o processo de purificao;

VIII. Este organismo considerado como seguro. Isto explica porqueele tem sido muito utilizado na indstria para a produo de diversos bens com

fins teraputicos para humanos, sem ter que passar por experimentaes que

comprovem o seu uso.

Algumas protenas produzidas por S. cerevisiae esto sendo testadas

em fins diagnsticos ou teraputicos; outras j esto disponveis

comercialmente como antgenos vacinais. Os estudos de gentica molecular

com S. cerevisiae se aprofundaram no final da dcada de 70, quando estalevedura foi ento sequenciada. A partir disso, vrios tipos de vetores de

expresso foram desenvolvidos.

4.8.1.1.2 Vetores de Expresso de s. Cerevisiae

H trs classes de vetores utilizados na expresso de protenas

recombinantes por S. cerevisiae:


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I. Plasmdeo

II. Vetores de integrao

III. Cromossomo artificial de levedura

Os plasmdeos foram testados com sucesso para a expresso de

protenas, tanto na forma extracelular como na intracelular. Contudo, sua

desvantagem a instabilidade que esta construo apresenta sob grandes

escalas de produo, como acima de 10 litros. Alm disso, os nveis de

expresso obtidos ainda so considerados baixos. Alguns pesquisadores

tentaram clonar a sequncia codificadora em tandem, com vrias cpias.Contudo, esta construo instvel. Tentativas para aumentar os nveis de

expresso consistem em estudos de crescimento da levedura, visando

reconhecer as condies mais adequadas que aumentem a estabilidade do

plasmdeo.

A vantagem de utilizar vetores de integrao em relao aos

plasmdeos que aps a integrao da sequncia de interesse no genoma do

hospedeiro, ela apresentar maior estabilidade. Contudo, as desvantagensincluem a complexidade do processo, e somente uma cpia inserida, o que

resulta em baixos nveis de expresso.

Assim como os vetores de integrao, os cromossomos artificiais de

levedura apresentam como principal vantagem a estabilidade da construo

recombinante. Contudo, esta estratgia no tem sido utilizada comercialmente

para a expresso de protenas recombinantes, mas para outras opes como a

formao de bibliotecas genmicas de DNA de cromossomos humanosindividualmente.

4.8.1.1.3 Expresso Direta em S. Cerevisiae

A expresso direta um termo utilizado para descrever vetores que

permitem o acmulo de protenas no citoplasma aps a sua expresso. Muitos

grupos de pesquisa tm dedicado uma ateno especial a este tipo de vetor de


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expresso, os quais possuem estruturalmente a mesma caracterstica bsica.

Um exemplo destes vetores inclui um vetor shuttle, com uma origem de

replicao de E. coli e outro para a levedura. O plasmdeo possui um marcador

de seleo derivado do gene de ampicilina, um gene que codifica a sntese de

leucina (leu2) e um stio para a clonagem de cDNA (pois, clulas de levedura

no so eficientes na remoo de introns, e, por isso, deve-se usar cDNA ou

insertos sintetizados quimicamente).

O stio de clonagem do inserto flanqueado pelo promotor do gene da

dehidrogenase gliceraldedo fosfato (GAPD), que apresenta expresso

constitutiva, e pela sequncia contento os sinais de terminao da transcrio ede poliadenilao do RNAm do mesmo gene. Este vetor recombinante

utilizado na transformao de uma linhagem de levedura defectiva para leucina

(leu2-). Em seguida, a cultura plaqueada em um meio onde falta a leucina.

Este permite ento a seleo dos transformantes, os quais estaro

expressando este aminocido. Esta estratgia foi utilizada com sucesso na

expresso da protena superoxidismutase de humanos.

A primeira iniciativa para a expresso dela foi em E. coli. Contudo, aexpresso neste sistema no produziu a acetilao da cadeia proteica, como

ocorre com a protena de humanos. Assim, a tentativa seguinte foi a expresso

em S. cerevisiae. Neste experimento, altos nveis de expresso proteica da

superoxidismutase foram obtidos, sendo que a mesma apresentava-se

acetilada, assim como a protena isolada de humanos. Portanto, este exemplo

ilustra a eficcia da expresso de protenas eucariotas em S. cerevisiae.

O sistema de expresso de protenas recombinantes deve serdinmico, permitindo ao pesquisador testar diferentes estratgias de clonagem

e expresso. Diferentes vetores que proporcionam meios eficazes de

expresso em S. cerevisiae foram construdos. Alm de alcanar altos nveis

de produo de protena eucariotas em uma conformao adequada, os

vetores ainda oferecem opes ao pesquisador, como o endereamento

proteico. Sobre este aspecto, um dos mais visados em processos

biotecnolgicos a possibilidade de produzir protenas e secret-las ao meio


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externo.

4.8.1.1.4 Secreo de Protenas Heterlogas por S. Cerevisiae

A secreo de protenas heterlogas por S. cerevisiae exerce um papel

chave nas modificaes ps-traducionais, como a glicosilao. Somente as

protenas secretadas por esta levedura recebem a adio de acares cadeia

proteica. A construo de vetores de expresso que permitam a secreo de

protenas recombinantes muito similar ao protocolo utilizado em procariotos.

Com este propsito, um peptdeo sinal clonado a jusante da sequnciacodificadora. Esta sequncia sinal reconhecida pela maquinaria de secreo

de S. cerevisiae, permitindo que a protena assim expressa seja eficientemente

secretada.

Durante o processo compreendido entre a traduo e a secreo da

protena de interesse, estas macromolculas sofrem algumas modificaes

ps-traducionais, como a formao de pontes dissulfeto e a clivagem

proteoltica. Ao chegar membrana celular, o peptdeo sinal permite que aprotena passe atravs dela. Em seguida, o peptdeo sinal reconhecido e

removido da protena recombinante por uma endoprotease que reconhece o

dipeptdeo Lys-Arg.

Esta sequncia posicionada imediatamente antes da sequncia

codificadora da protena de interesse. Assim, a protena exibir a sequncia de

aminocidos correta na sua poro N-terminal. A liberao da protena para o

meio se completa aps a clivagem do peptdeo sinal.A utilizao primordial de vetores que permita a secreo de protenas

expressas em S. cerevisiae a glicosilao de protenas eucariotas.

Entretanto, outros proveitos de interesse biotecnolgico podem ser obtidos com

esta estratgia. Assim como a escolha destes vetores para organismos

procariotos, a secreo das protenas expressas facilita a purificao de

protenas recombinantes. Portanto, o uso de vetores de expresso de S.

cerevisiae contendo a sequncia do peptdeo sinal tem como vantagem a


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induo de modificaes ps-traducionais e purificao facilitada das protenas

expressas neste hospedeiro.

Muitas protenas tm sido expressas com sucesso em S. cerevisiae,

como o antgeno de superfcie do vrus da Hepatite B. Contudo, a expresso

nesta levedura tambm apresenta desvantagens, como os baixos nveis de

expresso obtidos para algumas protenas. Outros problemas relatados

incluem:

I. A perda de plasmdeos no decorrer de geraes em produes de

larga escala;

II. A hiperglicosilao de protenas heterlogas. Neste caso,observa-se que os resduos de manose receberam cerca de 100 resduos de

acar, sendo que o normal varia de 8 a 13. Estas unidades extras podem

alterar a atividade biolgica ou mesmo mudar a imunogenicidade da protena;

III. Em alguns casos, observou-se que protenas secretadas ficam

presas no espao periplasmtico, o que prejudica a purificao de protenas.

Frente a estas desvantagens apresentadas pelo sistema de expresso

em S. cerevisiae, pesquisadores estudaram mtodos para aperfeioar aexpresso de protenas. Para isso, tem-se estudado alternativas, como a

construo de novos vetores de expresso, alm da possibilidade de utilizar

diferentes hospedeiros.

A escolha de novas leveduras como sistema de expresso depende da

apresentao de algumas caractersticas desejadas para a expresso de

protenas. Dentre elas, incluem-se:

I. A disponibilidade de vetores apropriados;II. Sistemas de expresso com sequncias reguladoras apropriadas

para cada hospedeiro em especfico;

III. A habilidade de transformar os diferentes hospedeiros com os

vetores de interesse;

IV. Obteno de altos nveis de expresso;

V. Habilidade do organismo hospedeiro em crescer sob condies

industriais.


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Candidatos de leveduras para a expresso de protenas heterlogas

incluem Pichia pastoris e Schizosaccharomyces pombe. Estas leveduras so

denominadas convencionais, pois so as mais utilizadas atualmente com

propsitos biotecnolgicos. Outras no convencionais incluem:

Kluyveromyces lactis, que foi utilizado comercialmente para a produo da -

galactosidase; Yarrowia lipolytica; Hansenula polymorpha; Arxula

adeninivorans.

Dentre as duas opes de leveduras convencionais, grupos de

pesquisa tm relatado sucesso obtido aps a expresso de protenas na

levedura Pichia pastoris. Por isso, grande ateno e investimentos tm sidodirecionados para esta levedura, visando seu aperfeioamento como sistema

de expresso.

4.8.1.2 Pichia Pastoris

Pichia pastoris uma levedura metilotrfica, o que significa que ela

capaz de crescer em meio de cultura contendo metanol como nica fonte decarbono. Historicamente, o que chamou a ateno quanto a esta levedura

que a mesma cresce facilmente em meio de cultura barato sob produes a

nvel industrial.

Outros aspectos, alm dos baixos custos de manuteno da cultura de

Pichia pastoris, so vantajosos para a utilizao desta levedura para processos

biotecnolgicos. A sua cultura no apresenta um alto nvel de fermentao.

Este processo resulta na gerao de etanol, um componente que em culturasde alta densidade celular pode atingir nveis txicos. A toxicidade desta

substncia inviabiliza o crescimento da cultura de leveduras.

Por apresentar baixos nveis de fermentao, isto constitui uma

vantagem do uso de Pichia pastoris como hospedeiro para a expresso de

protenas em comparao a S. cerevisiae, pois a cultura de Pichia pastoris

pode alcanar altas densidades celulares. H relatos de que o crescimento em

peso seco obtido pode atingir cerca de 100g/L, ou mesmo, quantidades


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maiores. Considerando todas as vantagens descritas e o fato de que a

densidade celular est diretamente relacionada com a quantidade de protenas

produzidas, ideias surgiram com a finalidade de transformar Pichia pastoris

como um sistema de produo de protenas recombinantes.

Um dos experimentos iniciais com a levedura para a expresso de

protenas de interesse comercial foi a tentativa de expressar, em altos nveis, o

antgeno de superfcie do vrus da hepatite B. Para isso, foi desenvolvido um

sistema de expresso do tipo integrativo, que continha a sequncia promotora

e a terminadora derivadas do gene da enzima lcool oxidase.

Atualmente, esta uma das caractersticas que tornam esta leveduracomo uma hospedeira atraente para a expresso de protenas heterlogas,

pois este vetor permite obter altos nveis de expresso proteica. O vetor de

expresso constitudo do promotor, da sequncia terminadora e do sinal de

poliadenilao derivados do gene que codifica a enzima lcool oxidase. O

plasmdeo um vetor shuttle, contendo uma origem de replicao para Pichia

pastoris e outra para E. coli.

Alm disso, o vetor contm a sequncia codificadora da ampicilina, oque permite a seleo dos plasmdeos recombinantes em E. coli. Outro gene

encontrado no plasmdeo o codificador da enzima histidiol desidrogenase

(his4). Esta marca permite a seleo de transformantes prototrficos His+

quando os vetores so transformados em uma linhagem de Pichia pastoris

deficiente para a expresso deste gene, as his4. Portanto, somente as clulas

transformadas sero hbeis para crescer em meio deficiente em histidina. O

mapa do vetor est demonstrado na Fig. 61.


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Figura 61: Mapa do Vetor pPICZ para a expresso em Pichia pastoris (Invitrogen).

Os vetores de expresso utilizados em Pichia pastoris geralmente so

integrativos. O objetivo permitir que a sequncia de interesse, clonada entre a

regio promotora e terminadora, se integre ao genoma do hospedeiro, a fim de

evitar problemas de instabilidade do plasmdeo. Estes vetores possuem em sua

estrutura sequncias de DNA homlogas s do DNA do cromossomo da

levedura nas regies proximais do gene histidiol desidrogenase, o que tem por

finalidade facilitar a integrao do material gentico transformado por

recombinao homloga.

O processo de recombinao homloga est envolvido com dois fatos

interessantes. O primeiro que a sua concluso ocorre com a troca do gene

AOX1 pela sequncia de interesse. Isto permite uma segunda forma de

seleo dos transformantes. H um segundo gene funcional presente no

cromossomo da clula hospedeira, o AOX2. Este gene, apesar de funcional,

menos efetivo, resultando em um crescimento lento da levedura na presena


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de metanol. Outro ponto a considerar que vrias cpias podem ser integradas

ao genoma, o que est relacionado com os nveis de expresso.

O promotor AOX1 regulado transcricionalmente pelo substrato

metanol. O uso deste indutor vantajoso sob o ponto de vista econmico, pois

seu custo considerado como relativamente barato. A regulao da

transcrio, a partir deste promotor, tambm ocorre pela presena de glicose

na cultura. A ativao de AOX1 e, portanto, o incio da transcrio somente se

inicia na ausncia completa de glicose.

Aps a induo da expresso com o metanol so obtidos altos nveis

de expresso, equivalentes queles obtidos por genes altamente expressos eque esto sob o controle dos promotores envolvidos com a via glicoltica. Na

presena de metanol observa-se que os nveis de expresso da enzima lcool

oxidase representam cerca de 30% da protena celular total de Pichia pastoris,

o que confirma os altos nveis de expresso obtidos a partir deste promotor.

Alm disso, esta sequncia promotora fortemente regulada, sendo

reprimida em condies de crescimento com a ausncia de metanol. Assim,

por a transcrio ser fortemente regulada, a expresso da protena de interesse acionada e desligada em tempos determinados. Esta caracterstica impede a

expresso por perodos inapropriados de protenas txicas cultura celular e

dificulta a proliferao, na cultura de leveduras, daquelas que no expressem o

gene de interesse.

As protenas expressas por este sistema podem ser apresentadas

tanto como intracelulares como sendo secretadas. Esta caracterstica depende

da adio ao vetor de expresso de um peptdeo sinal que permita oendereamento proteico. Nestes casos, frequentemente utilizado o peptdeo

sinal derivado de S. cerevisiae (Fig. 62).


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Figura 62: Mapa do vetor pMET (Invitrogen).

A figura ilustra as duas verses de vetores disponveis comercialmente,

uma para a expresso citoplasmtica e outra para a secretada. Neste ltimo

caso, o vetor construdo com a adio do peptdeo sinal derivado de S.

cerevisiae, o fator alfa. A secreo de protenas recombinantes est

relacionada com uma caracterstica essencial da estrutura da protena

expressa, a glicosilao. Assim como ocorre em S. cerevisiae, a glicosilao de

protenas somente ocorre com aquelas que so secretadas.

Os tamanhos das cadeias de carboidratos adicionados por Pichia


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pastoris so menores que os observados em S. cerevisiae. Portanto, a

glicosilao em Pichia pastoris outra vantagem sobre a expresso em S.

cerevisiae, pois neste ltimo h a hiperglicosilao que altera a atividade das

protenas. O uso desta levedura como vetor de expresso tem se tornado

popular, sendo relatada a expresso de mais de 200 protenas de vrus,

bactrias, fungos, animais, plantas e de humanos. Contudo, a expresso em

Pichia pastoris tambm apresenta algumas desvantagens. Uma delas est

relacionada aos vetores de expresso disponveis.

Embora muito utilizados, os vetores de expresso apresentam como

desvantagem o grande tamanho que varia em torno de 8kb. Outradesvantagem dos mesmos consiste no fato de possurem poucos stios de

restrio que permitam a clonagem do gene heterlogo. H vetores de

expresso alternativos, que so plasmdeos menores. Um exemplo uma

famlia de vetores que apresenta como mecanismo de seleo dos

transformantes o gene sh ble, conferindo resistncia droga zeomicina. Apesar

de esta seleo ser eficiente tanto em E. coli como em Pichia pastoris, a droga

apresenta um custo elevado, o que inviabiliza a sua utilizao.Outro vetor desenvolvido consiste em um plasmdeo cuja expresso

est sob o controle do promotor gap. Esta sequncia derivada do gene

gliceraldedo-3-fosfato desidrogenase e apresenta uma forte expresso

constitutiva. A expresso obtida a partir deste promotor em culturas crescidas

em glicose apresenta nveis de expresso comparveis queles obtidos com o

promotor AOX1 em culturas crescidas em metanol.

A vantagem do promotor gapconsiste em no ser necessria a trocado meio de cultura antes de induzir a expresso do gene de interesse. A

desvantagem da sua utilizao consiste no fato de que a expresso constitutiva

no desejvel para a expresso de genes deletrios para a clula. Alm

disso, o gasto celular para este tipo de expresso significante para a cultura

se comparada obtida por um promotor regulvel, como o AOX1. Outra

desvantagem da expresso em Pichia pastoris consiste em baixos nveis de

expresso obtidos para algumas protenas. A soluo para este problema est


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em aprimorar novos vetores de expresso. Contudo, assim como em outros

organismos eucariotos, a regulao da expresso complicada, o que exige

tempo para desenvolver estratgias eficazes.

O aumento dos nveis de expresso foi verificado em linhagens que

continham trs cpias integradas ao genoma. A deteco destes clones se d

por mtodos imunolgicos. Neste caso, necessria a disponibilidade de

anticorpos especficos para a protena heterloga. O mtodo permitiu a

identificao de clones que expressam a protena de interesse em diferentes

nveis.

A glicosilao efetuada por Pichia pastoris nem sempre se d com aconformao adequada. Apesar de ser similar que ocorre em mamferos,

esta levedura no capaz de adicionar manoses terminais com ligaes -1,3,

como em S. cerevisiae, o que faz com que as protenas expressas em Pichia

pastoris sejam menos imunognicas que as expressas em S. cerevisiae.

Ainda, assim como em S. cerevisiae, outro problema relacionado com a

glicosilao que ocorre em algumas protenas expressas em Pichia pastoris a

hiperglicosilao. Apesar de algumas protenas receberem cadeias curtas deoligossacardeos, no se conhece um fenmeno capaz de explicar os

diferentes padres de glicosilao apresentados pela Pichia pastoris.

As leveduras apresentam vantagens significativas que justificam seu

uso na expresso de protenas eucariotas, como os altos nveis de expresso a

baixo custo, alm de sua capacidade de realizar modificaes ps-traducionais.

Quanto a esta ltima caracterstica, ela pode ser considerada um paradoxo.

Apesar de ser uma vantagem, estas modificaes tambm so pontos dedesvantagem da expresso em leveduras.

A explicao para esta ambiguidade de afirmaes est ligada ao fato

da falta de identidade destas modificaes ps-traducionais que ocorrem entre

a expresso em leveduras e em clulas de mamferos. A forma com que os

oligossacardeos so adicionados cadeia proteica por leveduras difere

estruturalmente da que ocorre em mamferos. Este ponto crtico na produo

de protenas de interesse teraputico, pois a diferena estrutural pode afetar a


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atividade biolgica da macromolcula expressa.

Alternativas promissoras vm sendo desenvolvidas com a finalidade de

expressar protenas eucariotas de maneira a apresentar a maior identidade

quelas expressas em clulas de mamferos. Entre elas, especula-se a

possibilidade de produzir leveduras capazes de realizar a glicosilao de forma

mais similar observada em humanos. Alm destas estratgias, outros tipos

de hospedeiro tambm vm sendo testados, como os fungos filamentosos.

4.8.1.3 Fungos Filamentosos

Os fungos filamentosos so assim, como as leveduras, um sistema em

teste que tem ganhado cada vez mais espao na biotecnologia para a

expresso de protenas recombinantes. Entre os fungos utilizados com este

propsito esto o Filamentous fungus, o qual exibe alta capacidade de

secreo de protenas, e os fungos Aspergillus niger eAspergillus oryzae, que

tm sido, h algum tempo, utilizados na produo de alimentos. Outros fungos,

como o Metarhizium anisopliae, vm sendo testados quanto ao seu potencialno controle de insetos.

O uso de fungos filamentosos apresenta propriedades que os tornam

hospedeiros potenciais para a expresso de protenas eucariotas. Contudo,

este sistema tambm apresenta desvantagens como o baixo nvel de

expresso. Apesar de estudos na rea terem apontado alternativas potenciais

para solucionar o problema, estes hospedeiros ainda apresentam como

desvantagem a escassez de conhecimentos, o que dificulta a sua manipulaoe o desenvolvimento de ferramentas para a expresso de protenas. Enquanto

isso, uma opo o uso de outros hospedeiros, como os baculovrus.

4.8.1.4 Baculovrus

A produo de protenas recombinantes por meio de baculovrus uma

opo interessante para a expresso de protenas eucariotas. O uso deste


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166Este material deve ser u

biotecnologia_03

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