biotecnologia: cultivo de células vegetais

Semana da Biologia

Minicurso - Biotecnologia: cultivo de células vegetais

Cederj - Volta Redonda

Nathalia Torres Dutra 1

Biotecnologia: cultivo de células vegetais – Aula 1

Bem vindo ao nosso curso sobre Cultura de células e tecidos vegetais in

vitro. Será um prazer ensinar um pouquinho sobre essa magnífica técnica, suas

aplicações e utilidades no nosso cotidiano. Talvez ainda não tenha percebido,

mas a Biotecnologia vegetal já está presente no seu dia-a-dia e através

desse curso você observará isso.

Nesta aula você deverá aprender:

O que é a biotecnologia/biotecnologia vegetal e suas aplicações;

O crescimento e desenvolvimento vegetal;

O princípio da técnica de cultura de tecidos vegetais;

O que é explante, sua diversidade e como eles são utilizados na

cultura de células e tecidos vegetais;

Diferenciar embriogênese somática e organogênese, e seu

desenvolvimento de modo direto e indireto.

Qualquer dúvida entre em contato através do nosso fórum, disponível na

página do curso.

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O que é Biotecnologia?

Desmembrando o termo Biotecnologia temos “bio” que significa vida e

“tecnologia” que segundo o Minidicionário da Língua Portuguesa (Dermival R.

Rios) significa: ciência ou tratado das artes e ofícios em geral; aplicação dos

conhecimentos científicos à produção em geral. De maneira ampla, a

biotecnologia consiste na aplicação de uma diversidade de princípios científicos

e técnicas, principalmente, de biologia celular e biologia molecular em

organismos vivos - no caso da biotecnologia vegetal o organismo vivo utilizado

são as plantas ou “partes” delas - visando à obtenção de produtos e serviços. A

utilização da biotecnologia se torna pertinente quando é sócio-econômica e

culturalmente aceitável, sustentável e ambientalmente segura contribuindo para

o desenvolvimento técnico-científico e proporcionando benefícios mensuráveis.

A biotecnologia engloba conceitos de diversas matérias que você já

estudou ou ainda estudará: Biologia celular, Biologia molecular, Bioinformática,

Genética, Bioquímica, Bioética, Cultura de células e tecidos, Química entre

outras (Figura 1).

Figura 1: Áreas científicas envolvidas no estudo da biotecnologia. (Fonte:

http://pt.wikipedia.org/wiki/Ficheiro:Biotecnologia.jpg)

http://pt.wikipedia.org/wiki/Ficheiro:Biotecnologia.jpg

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O que é cultivar células ou tecidos in vitro

Com certeza você já deve ter ouvido falar nas expressões “cultivo

celular” e “in vitro”. No nosso cotidiano, cada vez com mais intensidade, vemos

notícias sobre pesquisas com células tronco, formação de tecidos artificiais,

produção de embriões através da fertilização in vitro, produção de biomoléculas

(como hormônios) através de organismos geneticamente modificados (...). O

que essas pesquisas têm em comum: todas realizam o cultivo in vitro seja de

células procarióticas mais simples ou mais complexas como as células e

tecidos animais ou vegetais.

Cultivar células e tecidos significa, em síntese, manter vivas células e

tecidos retirados de um organismo. Essa manutenção geralmente é feita em

tubos de ensaio, garrafas ou placas de petri (Figura 2) em ambiente estéril

(livre de contaminação por microrganismos) contendo um meio de cultura

nutritivo. Nos dias de hoje esses recipientes podem ser feitos de plástico, mas

antigamente todos eram de vidro. Daí o surgimento da expressão in vitro.

Figura 2: Recipientes utilizados para o cultivo de células in vitro. (Fonte: A- http://www.frilabo.pt/fcms/index.php?option=content&task=view&id=49, B- http://www. quebarato.com.br/tubo-de-ensaio-acrilico-para-lembrancinha-r-0-79__15BC7B.html C- http://www.duran-group.com/en/products-solutions/laboratory-glassware/products/ boiling-flasks-and-general-laboratory-glassware/erlenmeyer-flask.html, D- http://www. spectrun.com.br/site/index.php?pag=visualiza_cat&id=1553&cat=4

A B A

C D

http://www.frilabo.pt/fcms/index.php?option=content&task=view&id=49

http://www.duran-group.com/en/products-solutions/laboratory-glassware/products/%20boiling-flasks-and-general-laboratory-glassware/erlenmeyer-flask.html

http://www.duran-group.com/en/products-solutions/laboratory-glassware/products/%20boiling-flasks-and-general-laboratory-glassware/erlenmeyer-flask.html

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Crescimento e desenvolvimento vegetal

O desenvolvimento vegetal se inicia na embriogênese que transformará

uma célula única – o zigoto - em um embrião multicelular. Esse, ainda no início

do seu desenvolvimento, já estabelecerá e apresentará o plano básico do

corpo da planta e formará os primeiros meristemas que darão origem aos

tecidos e órgãos da planta adulta (Figura 3).

A embriogênese é o processo através do qual o embrião é

formado e se desenvolve. Embora geralmente o embrião se

desenvolva a partir da formação do zigoto, células somáticas

também podem sofrer embriogênese em condições

especiais. Calma! Isso será visto ao longo do curso!

Meristema pode ser definido como um tecido constituído de

células indiferenciadas que possuem a capacidade de se

dividir continuamente e originar novas células

indiferenciadas e também de células diferenciadas. Isto

significa que uma célula meristemática pode originar

qualquer tipo de célula especializada do corpo do vegetal.

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Figura 3: A organização apical-basal de tecidos e órgãos vegetais é estabelecida bem

cedo e em regiões específicas do embrião. (Fonte: A= http://www.ufpel.tche.br/cenbiot

/DiferenciacaoVegetal2009.pdf, B= Livro Fisiologia Vegetal – Lincoln Taiz e Eduardo

Zeiger 3ª Edição

No período pós-embrionário as células meristemáticas através da

divisão, expansão e diferenciação celular vão gerar tecidos e órgãos com

funções especializadas e padrões específicos que vão determinar o tamanho, a

forma e a estrutura definitiva da planta. Através da figura 4 observamos que a

planta apresenta tecidos altamente organizados e diferenciados. Os fatores

que levam uma célula indiferenciada a formar células totalmente especializadas

são muito estudados e ainda apresentam muitas perguntas sem respostas,

mas sabe-se que são regulados pela expressão diferenciada de genes e

também através da interação do organismo vegetal com o ambiente.

http://www.ufpel.tche.br/cenbiot%20/DiferenciacaoVegetal2009.pdf

http://www.ufpel.tche.br/cenbiot%20/DiferenciacaoVegetal2009.pdf

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Figura 4: Estrutura da planta adulta com seus tecidos altamente especializados.

(Fonte: Material didático de Claudete Santa Catarina e Vanildo Silveira)

Princípio da cultura de tecidos vegetais

A cultura de células e tecidos vegetais é uma técnica biotecnológica em

que células ou fragmentos de tecidos isolados – chamados de explantes - são

cultivados in vitro sob condições químicas e ambientais controladas. Esses

explantes se dividem e se desenvolvem igualmente às plantas em seus

ambientes naturais. O objetivo é desenvolver um novo organismo idêntico ao

original, no caso a planta matriz (planta em que se retiraram as células ou

fragmentos de tecidos), ou seja, é realizada uma clonagem vegetal. (Figura 5).

Essa técnica se baseia na teoria da totipotencialidade.

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Figura 5: Desenvolvimento de uma nova planta a partir de explantes de uma planta

matriz. Fonte: http://www.biotecnologia.com.br/revista/bio01/1hp_11.pdf Clonagem de

plantas in vitro: uma realidade. Gilberto B. Kerbany. Instituto de Biociência da

Universidade de São Paulo.

Além da clonagem vegetal, essas células e tecidos cultivados in vitro

podem ser utilizados para estudos básicos na área de biologia molecular,

biologia celular, genética, bioquímica. Muito do que você aprende na faculdade

foi descoberto através de pesquisas utilizando técnicas como estas que você

está aprendendo nesse curso.

Totipotência é a capacidade de uma única célula se dividir e

reconstituir um organismo inteiro. Através da técnica de

cultivo in vitro uma célula somática diferenciada de um

organismo pluricelular é capaz de originar um indivíduo

idêntico a sua matriz doadora (clone), comportando-se como se

fosse uma célula-ovo ou zigoto. Você verá isso com mais

detalhes quando falarmos de embriogênese somática.

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Um pouco de história

A teoria da totipotencialidade foi formulada por Matthias Schleiden &

Theodor Schwann, em 1838, constituindo um dos primeiros fundamentos da

cultura in vitro. Essa teoria afirma que cada célula possui o potencial genético

para reconstituir um organismo inteiro, nesse caso uma planta completa. É

claro que essa capacidade se manifesta sob condições especiais de estímulo.

Haberlandt, um fisiólogo vegetal austro-húngaro, por volta de 1902, foi o

primeiro a manipular um sistema de cultura in vitro de plantas, procurando

estabelecer e consolidar um sistema de micropropagação (produção rápida de

milhares de clones de uma planta). Infelizmente, por limitações técnicas da

época, seus esforços falharam. Contudo, alguns anos mais tarde a partir dos

trabalhos de Robbin (1922) e White (1934) em ponta de raízes; cultura de

embriões, por La Rue (1936); cultura de calos, por Gautheret Nobécourt (1939);

enriquecimento de meios nutritivos com leite de coco, por van Overbeek, 1941;

uso de plantas de tabaco como modelo experimental para estudo de

morfogênese, por Skoog, desde 1944, e uso de meristemas apicais na

obtenção de plantas livres de vírus, por Morel & Martin,1952, abriram-se os

caminhos que a cultura de tecido de plantas percorreria triunfalmente ao longo

de todo o século XX, com mais e mais descobertas e aplicações. (Fonte: L.

Pedro Barrueto Cid).

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Fontes de explantes

Como foi dito anteriormente, explantes são as células ou fragmentos de

tecidos de uma planta doadora que são cultivados in vitro originando uma nova

planta idêntica a matriz.

Esses explantes podem ser obtidos de várias partes da planta. Cada

espécie devido a suas diversidades genéticas, condições ambientais em que

vive, diferenças morfológicas e diversos outros fatores vai apresentar um tecido

“mais favorável a gerar” novas plantas. Abaixo listamos alguns tecidos vegetais

que são comumente utilizados para o cultivo de plantas in vitro.

Cultura de meristema: consiste no estabelecimento da cultura vegetal

através do meristema apical vegetal, originando normalmente um único

broto (Figura 6).

Figura 6: Fonte: A= Modificado de http://www.botanica.cnba.uba.ar/Trabprac/Tp4/

Lagerminacion.html; B= http://professores.unisanta.br/maramagenta/

meristemastecidos.asp

http://www.botanica.cnba.uba.ar/Trabprac/Tp4/%20Lagerminacion.html

http://www.botanica.cnba.uba.ar/Trabprac/Tp4/%20Lagerminacion.html

http://professores.unisanta.br/maramagenta/%20meristemastecidos.asp

http://professores.unisanta.br/maramagenta/%20meristemastecidos.asp

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Cultura de ápices caulinares: é o estabelecimento in vitro a partir de

ápices caulinares maiores do que aqueles utilizados para iniciar a cultura

de meristema, tendo alguns primórdios foliares. Essas brotações apicais

podem produzir múltiplas brotações. (Figura 7).

Figura 7: A) ápice isolado; B) ápice recém-transferido in vitro; C) enraizamento de

ápice após vinte dias da transferência in vitro; D) brotações foliares após 20 dias da

transferência in vitro. (SILVA, P.P. et al, 2010).

Cultura de segmentos nodais: Contém segmentos caulinares que

carregam gemas simples ou múltiplas. Cada gema desenvolve para

formar uma única brotação (Figura 8). Gemas são regiões

meristemáticas, ou seja, regiões compostas por células que ainda não

se diferenciaram.

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Figura 8: (A) Segmento nodal e (B) gema lateral. (Fonte: A= http://en.wikipedia.

org/wiki/Plant_stem e B= http://www.feiradeciencias.com.br/sala26/26_feira_06.asp)

Cultura de embriões: É iniciada a partir de embriões zigóticos, ou seja,

os embriões que são extraídos das sementes. Os embriões germinam

originando plântulas (Figura 9).

Figura 9: Embrião da semente de mamão. Fonte: Cid (2003).

A B

http://www.feiradeciencias.com.br/sala26/26_feira_06.asp

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Discos de folhas e segmentos de raiz (Figura 10).

Figura 10: Folha e regiões da raiz. Fonte: A= http://pt.wikipedia.org/wiki/Folha; B=

http://www.portalsaofrancisco.com.br/alfa/reino-plantae/estrutura-da-raiz-3.php

Assepsia dos explantes

Para a escolha do explante devemos levar em consideração a idade, as

condições fisiológicas e fitossanitárias da planta matriz e suas necessidades

específicas para o cultivo in vitro. Além disso, os explantes antes de serem

inoculados ao meio de cultura devem passar por um processo de assepsia.

Assim como o meio de cultura será nutritivo para favorecer o crescimento da

nova planta, ele também será para o crescimento de microrganismos

indesejáveis. Desta forma, realizamos a assepsia para eliminar fungos,

bactérias e demais microrganismos que porventura estejam presentes no

explantes e, assim, mantendo as culturas isentas de contaminação (Figura 11).

http://pt.wikipedia.org/wiki/Folha

http://www.portalsaofrancisco.com.br/alfa/reino-plantae/estrutura-da-raiz-3.php

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Figura 11: A assepsia dos explantes elimina fungos, bactérias, vírus e protistas

possibilitando a indução e manutenção de uma cultura isenta de microrganismos.

A assepsia é realizada utilizando soluções aquosas contendo agentes

desinfestantes. Esses são utilizados em concentrações específicas e devem

ficar em contato com o explante por tempo determinado já que em grandes

concentrações ou longos períodos de tempo são tóxicos para as células.

Abaixo uma tabela lista os principais desinfestantes utilizados para a assepsia

de explantes vegetais.

BACTÉRIAS

FUNGOS

VÍRUS PROTISTAS

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Agente

desinfestante

Concentração

do ingrediente

ativo

Fitotoxicidade Tempo de

desinfestação

Hipoclorito de

sódio (água

sanitária

comercial 40%)

0,25 – 1% Moderada 5 a 20 min.

Hipoclorito de

cálcio

9-10% Moderada 5 a 20 min.

H202 3-10% Alta 5 a 20 min.

Etanol 70% Alta 0,5 a 1 min.

De forma geral, o protocolo para a assepsia do explante se divide em

duas fases. A primeira pode ser realizada na própria bancada do laboratório e

consiste em lavar seu explante de 4 a 5 vezes com água associada a uma gota

de detergente. Após deve-se lavar com álcool 70% de 1 a 5 minutos e

posteriormente de 10 a 30 minutos com Hipoclorito de sódio – ou o

desinfestante mais propício - associado a uma gota de detergente. A segunda

fase consiste na lavagem do explante por 4 vezes com água destilada

autoclavada. Autoclavar é um processo em que o material – no caso a água - é

submetida à esterilização, ou seja, torna-se isenta de qualquer microrganismo

ou esporo desse. Essa lavagem com água destilada deverá ser realizada no

fluxo laminar – um aparelho que possui um fluxo direcionado de ventilação com

filtros especiais que proporcionam um ambiente com condições assépticas

também essenciais para se evitar a contaminação da sua cultura.

Você deve ter reparado que nós estamos falando o tempo todo de

assepsia, solução estéril. Isso é muito importante! Deve ficar sempre claro que

toda a manipulação de células e tecidos vegetais deve ser realizada em um

ambiente o mais livre de contaminação possível, afinal, como dissemos

anteriormente queremos que nossa planta se desenvolva livre de qualquer

contaminação que possa prejudicá-la.

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Após a assepsia, o explante é transferido para o ambiente in vitro

contendo o meio de cultura estéril. O desenvolvimento do explante pode

ocorrer por diferentes caminhos morfogenéticos, ou seja, a divisão, expansão e

diferenciação celular para a formação da nova planta poderá se realizar por

diferentes rotas.

Os explantes no início do seu crescimento e/ou desenvolvimento in vitro

podem se multiplicar formando uma cultura de tecidos desorganizada na forma

de calos ou suspensões (Figura 12). Calos são várias células agregadas de

forma desorganizada que se originam da proliferação desordenada a partir de

tecidos ou órgãos cultivados in vitro. Suspensões celulares são a proliferação

de células isoladas ou pequenos aglomerados de células dispersos em um

meio líquido, sob agitação.

Figura 12: A= Calo embriogênico de eucalipto (Fonte: Cid, 2003). B= cultura em

suspensão celular (Fonte: Koehler, 2006)

Mas também podem se desenvolver de forma organizada através da

formação de tecidos vegetais. (Figura 13).

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Figura 13: Desenvolvimento vegetal in vitro por organogênese. Fonte:

http://www.danielafafe.blogspot.com/

Além disso, de acordo com explante escolhido e os estímulos aplicados

a ele, podemos ter o desenvolvimento de um embrião, que de acordo com a

teoria da totipotencialidade, se transformará em uma nova planta. Essa forma

de desenvolvimento é chamada embriogênese somática. Lembrando que se

diz embrião somático, pois o embrião terá origem de tecidos ou células já

diferenciadas de uma planta matriz e não da união dos gametas para formação

do zigoto. Ou podemos ter o desenvolvimento direto de órgãos vegetais (sem a

formação do embrião) até a formação do organismo inteiro – essa forma de

desenvolvimento se chama organogênese. Esses conceitos de embriogênese e

organogênese são muito importantes e também serão abordados em aulas

posteriores.

Unindo todos esses conceitos que foram apresentados até aqui temos

que a partir da transferência do explante para o meio de cultura poderemos

obter:

http://www.danielafafe.blogspot.com/

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A embriogênese somática direta: a partir do explante já há formação do

embrião somático que formará de uma nova planta.

A embriogênese somática indireta: a partir do explante se forma o calo

que é um tecido desorganizado que após crescimento e diferenciação celular

originará o embrião somático.

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A organogênese direta: a partir do explante já há formação de tecidos

organizados e diferenciados que continuaram o seu desenvolvimento até a

formação de uma nova planta.

A organogênese indireta: a partir do explante se forma o calo que é um

tecido desorganizado que após crescimento e diferenciação celular originará

diretamente os tecidos vegetais organizados e diferenciados (sem a formação

de embrião).

Na próxima aula, será abordado como é realizada a manutenção das

culturas vegetais, a constituição e preparação de meios de culturas e como

esses podem influenciar no desenvolvimento dos explantes nas diferentes

rotas mencionadas acima.

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Fontes:

Alves, C.; Oliveira, J.R.; Reis, E.S.; Corrêa, R.M.; Souza, J.; Silva,

J.C.O.; De Paula, J.C.R.; Rofrigues, R.H.F.; De Souza, M.A.; Mendonça,

M.R. A cultura de tecidos na agricultura. I Jornada Científica e VI FIPA

do CEFET Bambuí. [http://www.cefetbambui.edu.br/str/artigos

_aprovados/Ci%C3%AAncias%20Agrarias/14-PT-12.pdf]

Fisiologia Vegetal – Lincoln Taiz e Eduardo Zeiger, 3ª Edição

Guerra M. P.; NODARI R. O. Apostila de Biotecnologia vegetal. Apostila

de aula. [http://www.cca.ufsc.br/lfdgv/Apostila.htm]. 2007.

L. Pedro Barrueto Cid; A propagação in vitro de plantas. O que é isso? –

Cultura de tecidos, 2003.

Silva, P.P; Contim, L.A.S; Freitas, D.V; Aride, P.H.R; Santos, A.L.W.

Estabelecimento in vitro de ápices caulinares de Sumaúma (Ceiba

pentandra L. Gaertn), 2010.

Santa-Catarina, C; Silveira, V. INTRODUÇÃO À CULTURA DE

TECIDOS VEGETAIS. Apostila de aula, 2010;

Santa-Catarina, C; Silveira, V. CONDIÇÕES PARA A CULTURA IN

VITRO. Apostila de aula, 2010;

Torres AC, Caldas LS, Buzzo JÁ. (Eds). Cultura de Tecidos e

Transformação Genética de Plantas. v.1. e 2. Brasília, Embrapa,

1998.1999.

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