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AF060 – Biotecnologia Vegetal
Professores responsáveis:
Prof. Dr. Luiz Antônio Biasi
Prof. Dr. João Carlos Bespalhok Filho
Profa Dra Renata Faier Calegario
Mestranda: Laudiane Zanella
Tópicos
•Cultura de Tecidos Vegetais:
- Organização do laboratório
- Meios de Cultura (componentes e preparo)
- Assepsia
- Organogênese
- Embriogênese
Cultura de Tecidos Vegetais
FINALIDADE:
Pesquisa X Comercial- Qualidade - Custo
- Logística
ORGANIZAÇÃO DO LABORATÓRIO
Cultura de Tecidos Vegetais
VANTAGENS E DESVANTAGENS:
ORGANIZAÇÃO DO LABORATÓRIO
Alto custo;
Mão de obra especializada;
Contaminação;
Oxidação;
Declínio do vigor;
Grande nº de mudas;
Controle das condições de trabalho;
Livres de doenças;
Crescimento rápido;
Multiplicar plantas que não produzem ou produzem poucas sementes.
Cultura de Tecidos Vegetais
BÁSICOS:
• Eletricidade:
- Gerador
- Estabilizador
• Água:
- Destilada
- Deionizada
- Água MiliQ
• Acesso
- Limitado para transgênico/CTNBio
- CQB/ CIBio
ORGANIZAÇÃO DO LABORATÓRIO
www.ebiotecnologia.org
Cultura de Tecidos Vegetais
BÁSICOS:
• Contaminações:
- Evitar
• Manter a assepsia:
- Lavar as mãos
- Toca de cabelo/ Luvas/ Pés limpos
ORGANIZAÇÃO DO LABORATÓRIO
Cultura de Tecidos Vegetais
ESTRUTURA
• Depende da técnica a ser utilizada:
- Micropropagação
- Transformação genética
- Cultura de anteras
- Cultura de meristemas
- Protoplastos
ORGANIZAÇÃO DO LABORATÓRIO
Cultura de Tecidos Vegetais
DIVISÕES
• Preparo de meio de cultura
• Lavagem e esterilização
• Sala asséptica
• Sala de crescimento
• Aclimatação
• Outros
ORGANIZAÇÃO DO LABORATÓRIO
Cultura de Tecidos Vegetais
PREPARO DE MEIO DE CULTURA
• Geladeira
- Soluções estoque
• Freezer
- Reguladores de crescimento
- Antibióticos
• Balança de precisão
• pHmetro
• Agitador
ORGANIZAÇÃO DO LABORATÓRIO
• Deionizador • Forno de microondas • Pipetas automáticas
Cultura de Tecidos Vegetais
PREPARO DE MEIO DE CULTURA
Organização/Cuidados
• Cálculo das concentrações
• Cuidado com rótulo
- Prejuízo
• Nome do Produto
- Concentração
- Data
- Quem fez
• Rótulo das culturas
- Diferentes concentrações
ORGANIZAÇÃO DO LABORATÓRIO
Cultura de Tecidos Vegetais
PREPARO DE MEIO DE CULTURA
Equipamentos
Autoclave:
ORGANIZAÇÃO DO LABORATÓRIO
www.solucoesindustriais.com.br es.tuttnauer.com
Cultura de Tecidos Vegetais
LAVAGEM E ESTERILIZAÇÃO
• Pias fundas
• Locais para armazenar vidros sujos
• Lavagem
- Detergente
- Hipoclorito (NaClO)
• Estufa para secagem
• Descarte de material
- Produtos químicos
- Material transgênico
ORGANIZAÇÃO DO LABORATÓRIO
Cultura de Tecidos Vegetais
LAVAGEM E ESTERILIZAÇÃO
ORGANIZAÇÃO DO LABORATÓRIO
www.mpcaldeiraria.com
Cultura de Tecidos Vegetais
SALA ASSÉPTICA
• Cabine de fluxo laminar – Luz UV
ORGANIZAÇÃO DO LABORATÓRIO
www.posgrad.epm.br
Cultura de Tecidos Vegetais
SALA ASSÉPTICA
• Lupa
• Bicos de busen/Lamparina/Esterilizador
ORGANIZAÇÃO DO LABORATÓRIO
wikiciencias.casadasciencias.orgwww.casaarco.com.br www.lojalab.com.br
Cultura de Tecidos Vegetais
SALA DE CRESCIMENTO
• Sala
- Luminosidade - 16 h• Timer
• Lâmpadas
• Prateleiras
- Temperatura• Ar condicionado
- 23 ºC ± 2ºC
ORGANIZAÇÃO DO LABORATÓRIO
Cultura de Tecidos Vegetais
SALA DE CRESCIMENTO
• B.O.D
- Temperaturas diferentes
- Luminosidade- (≠ Foto período/ escuro)
• Fitotron®
- Umidade controlada
• Agitadores
- Células em suspensão
• Biorreator
- Multiplicação em larga escala
ORGANIZAÇÃO DO LABORATÓRIO
www.splabor.com.br
www.embrapa.br
Cultura de Tecidos Vegetais
ACLIMATAÇÃO
• Casa de Vegetação
- Climatizada
- Nebulização
ORGANIZAÇÃO DO LABORATÓRIO
Cultura de Tecidos Vegetais
CUIDADOS
• Corte com vidros quebrados ou bisturi;
• Queimaduras com material da autoclave;
• Incêndio com álcool (lamparina ou assepsia);
ORGANIZAÇÃO DO LABORATÓRIO
Cultura de Tecidos Vegetais
CUIDADOS
• Fonte de informações
• Máximo de informações
• Deve ficar no laboratório
ORGANIZAÇÃO DO LABORATÓRIO
Cultura de Tecidos Vegetais
ORGANIZAÇÃO DO TRABALHO
• Espaço multi usuário
• Necessidade de programação para:- Preparo de meio
- Autoclavagem
- Câmera de fluxo laminar
- Sala de cultivo
- Lavagem e descarte de materiais
ORGANIZAÇÃO DO LABORATÓRIO
Cultura de Tecidos Vegetais
• Componentes
– Água
– Macronutrientes
– Micronutrientes
– Vitaminas
– Carboidratos
– Reguladores do crescimento
– Ágar e outros geleificantes
– pH
Meios de Cultura
Cultura de Tecidos Vegetais
• Macronutrientes
– Nitrogênio (N)
– Fósforo (P)
– Potássio (K)
– Cálcio (Ca)
– Magnésio (Mg)
– Enxofre (S)
Meios de Cultura - Componentes
Cultura de Tecidos Vegetais
• Micronutrientes
– Ferro (Fe)
– Manganês (Mn)
– Zinco (Zn)
– Boro (Bo)
– Cobre (Cu)
– Molibdênio (Mo)
– Outros• Cobalto e Iodo
Meios de Cultura - Componentes
Cultura de Tecidos Vegetais
• Vitaminas e Inositol
– Tiamina
– Ácido Nicotínico
– Piridoxina
– Mio Inositol
Meios de Cultura - Componentes
Cultura de Tecidos Vegetais
• Reguladores do crescimento
– Auxinas• AIA, AIB, 2,4-D, ANA, 2iP
– Citocininas• CIN, BAP, TDZ
– Giberilinas• GA3
– Ácido Abscísico• ABA
Meios de Cultura - Componentes
Cultura de Tecidos Vegetais
• Ágar e outros geleificantes
– Ágar
6 a 10 g/L
– Gelrite/phytagel
1 a 2 g/L
Meios de Cultura - Componentes
Cultura de Tecidos Vegetais
• pH
– Deve ficar na faixa de 5 a 5,8
– Ajustar pH adicionando solução de NaOH (base) ou HCl(ácido)
– pH influencia
• Disponibilidade de nutrientes• Consistência do gel
Meios de Cultura - Componentes
Cultura de Tecidos Vegetais
• Preparo
– Soluções estoque: preparo e armazenamento
– Distribuição nos frascos
– Autoclavagem do meio
Meios de Cultura - Componentes
Cultura de Tecidos Vegetais
• Meio MS
– Murashige e Skoog (1962)
– Mais utilizado na cultura de tecidos
– Rico em Nitrogênio
Meios de Cultura - Componentes
Cultura de Tecidos Vegetais
• Eliminação de microrganismos patogênicos na forma vegetativa,presentes em superfícies inertes, mediante aplicação de agentesquímicos e físicos.
Assepsia
Cultura de Tecidos Vegetais
• Lavagem com água esterilizada;
• Hipoclorito de Sódio (NaClO);
• Etanol;
• Cloreto de Mercúrio (HgCl2);
• Detergentes (Twin 20);
• As concentrações variam de acordo com o tempo que o material será exposto ao produto
Concentração Tempo e vice-versa.
Assepsia
Cultura de Tecidos Vegetais
1. Retirar as folhas da coroa até expor as gemas;
2. Lavar em água corrente (esponja e detergente levemente);
3. Excisar as gemas da coroa formando uma base triangular na gema;
4. Álcool 70% por 30 segundos;
5. Hipoclorito comercial a 25% por 15 minutos;
6. Lavar 3 vezes em água deionizada e autoclavada;
7. Introduzir em meio de cultura
Assepsia do Abacaxi
www.cefetbambui.edu.br
Cultura de Tecidos Vegetais
Organogênese
www.abctp.org.br agro.unc.edu.ar
• Regeneração em cultura de tecidos a partir da formação de um órgão
– Gema/ Broto
– Raíz
• Monopolar
Cultura de Tecidos Vegetais
• Direta
– Sem formação de calo
• Indireta
– Com formação de calo
Organogênese
jbioleng.biomedcentral.com
Cultura de Tecidos Vegetais
• Principais fatores que afetam a organogênese
– Espécie/genótipo
– Explante
• Juvenil x Maduro
– Meio de cultura
– Fitoregulador
• Tipo e concentração
- Gemas: citocininas (BAP ou cinetina)
Organogênese
Cultura de Tecidos Vegetais
• Aplicações
- Micropropagação
- Organogênese direta
- Transformação genética
• Desvantagem: origem multicelular
Organogênese
Cultura de Tecidos Vegetais
•Organogênese
- Formação de um órgão
•Embriogênese
- Formação de um embrião
Embriogênese
Cultura de Tecidos Vegetais
• Processo de formação de um embrião a partir de um tecidosomático.
• Embrião somático é bipolar
– Ápice caulinar
– Radicular
Embriogênese
Cultura de Tecidos Vegetais
• Embriogênese direta
- Sem formação de calo
• Embriogênese indireta
- Com formação de calo
Embriogênese
nptel.ac.in
www.scielo.cl
Cultura de Tecidos Vegetais
• Estágios de desenvolvimento
– globular, cordiforme, torpedo e cotiledonar
Embriogênese
Cultura de Tecidos Vegetais
• Indução (indireta)
– Auxinas (2,4-D) – desdiferenciação – formação do calo embriogênico
• Formação do embrião
– Retirada/Diminuição da concentração de auxinas
Embriogênese
Cultura de Tecidos Vegetais
• Fatores que afetam
– Espécie/genótipo
– Explante
– Meio de cultura Alta concentração de sais, principalmente Nitrogênio
– Luz Indução geralmente é feita no escuro
Embriogênese
Cultura de Tecidos Vegetais
• Aplicações
– Sementes sintéticas
– Transformação genética
– Origem unicelular (evitar formação de quimeras)
Embriogênese
www.seedbiology.de