biorremediaÇÃo de solos contaminados … · universidade federal do rio grande escola de quÍmica...
TRANSCRIPT
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE
ESCOLA DE QUÍMICA E ALIMENTOS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA E CIÊNCIA DE ALIMENTOS
BIORREMEDIAÇÃO DE SOLOS CONTAMINADOS UTILIZANDO
BIOSSURFACTANTES OBTIDOS DE RESÍDUOS AGROINDUSTRIAIS
Quím. ROQUE LOURENÇO ZILIO
Prof. Dr. Jorge Alberto Vieira Costa
Orientador
RIO GRANDE, RS
2011
ii
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE
ESCOLA DE QUÍMICA E ALIMENTOS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA E CIÊNCIA DE ALIMENTOS
BIORREMEDIAÇÃO DE SOLOS CONTAMINADOS A PARTIR DE
BIOSSURFACTANTES OBTIDOS DE RESÍDUOS AGROINDUSTRIAIS
Quím. ROQUE LOURENÇO ZILIO
Dissertação de mestrado
apresentada ao Curso de Pós-
Graduação em Engenharia e Ciência
de Alimentos da Universidade
Federal do Rio Grande como
requisito para obtenção do título de
Mestre.
Prof. Dr. Jorge Alberto Vieira Costa
Orientador
RIO GRANDE, RS
2011
iii
AGRADECIMENTOS
À Deus
Pela vida e forças para seguir em frente.
Ao meu orientador Prof. Dr. Jorge Alberto Vieira Costa
Pela experiência transmitida, exemplo, orientação, apoio e amizade.
Ao meu co-orientador Prof. Dr. Fabrício Butierres Santana
Pela co-orientação, apoio e amizade.
Aos meus pais Ivalino (in memórium) e Ires
Pela educação que me proporcionaram pelo carinho e amor e pelo que sou hoje.
As minhas irmãs Claudete e Bernardete (in memórium)
Pelo carinho, amizade e amor que nunca me faltou.
A minha filha Luísa M. Zarpellon Zilio
Pelo amor, carinho e compreensão em minhas faltas.
A minha esposa Daniela Gimenes Nuñes
Pelo amor, carinho e dedicação.
Ao Prof. Julio Carlos Reguly (in memórium)
Pelos ensinamentos e grande amizade
Ao amigo Paulo R. S. Munhoz esposa Tonia, filhas, Lauren, Lívia e Lorena
Pela confiança, amizade e apoio.
Á Mara Alice Medeiros, Islanda Passos, Luismar Duarte Souza
Pela ajuda, apoio, dedicação e coleguismo.
À Elisangela Martha Radmann
Pela grande contribuição ao trabalho, experiência, apoio e pela grande amizade.
iv
À Roberta Guimarães Martins e Ana Cláudia Freitas Margarites
Pela grande ajuda em parte do trabalho, amizade e paciência.
A Joice Aline Borges
Pelo apoio e disposição em ajudar.
Aos professores da pós-graduação
Pelos conhecimentos e experiências passados, em especial as professoras Leonor Almeida
Sousa Soares e Eliana Badiale Furlong.
As professoras, Vilásia Guimarães Martins e Cristiane Ogrodowski
Pelo apoio no desenvolvimento deste trabalho.
Aos graduandos Jefferson C. P. Holz , Pamela Goulart e Mariana Souza de Oliveira
Pela ajuda indiscutível neste trabalho.
Ao Vitor Badiale Furlong
Pelo apoio técnico e incontestável tempo disponível para o bom desempenho deste
trabalho.
A BRASKEM
Pelo apoio técnico e financeiro.
A todo o pessoal do LEB
Que de uma maneira ou outra sempre me ajudaram e contribuíram para a concretização
deste trabalho.
v
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS ................................................................................................................. VIII
LISTA DE QUADROS ................................................................................................................ IX
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................................... X
RESUMO ................................................................................................................................. XII
ABSTRACT ............................................................................................................................ XIII
CAPÍTULO I - INTRODUÇÃO GERAL...................................................................................... 13
1.1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 14
1.2 OBJETIVOS ............................................................................................................ 16
1.2.1 Objetivo geral ................................................................................................... 16
1.2.2 Objetivos específicos........................................................................................ 16
1.3 JUSTIFICATIVA ...................................................................................................... 17
CAPÍTULO II - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................. 20
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .............................................................................................. 21
2.1 FERMENTAÇÃO ......................................................................................................... 21
2.1.1 Fermentação em estado sólido ........................................................................ 22
2.1.1.1 Substratos para a fermentação em estado sólido.................................. 25
2.2 SURFACTANTES/BIOSSURFACTANTES ........................................................................ 26
2.2.1 Classificação e propriedades dos biossurfactantes .......................................... 29
2.2.2 Produção de biossurfactante ............................................................................ 34
2.2.3 Fatores que diferenciam na produção de biossurfactantes ............................... 36
2.2.3.1 Temperatura ......................................................................................... 36
2.2.3.2 pH ......................................................................................................... 37
2.2.3.3 Aeração ................................................................................................ 37
2.2.3.4 Fonte de carbono .................................................................................. 38
2.2.3.5 Fonte de nitrogênio ............................................................................... 39
2.2.3.6 Concentração salina ............................................................................. 39
2.3 BIORREMEDIAÇÃO ..................................................................................................... 40
2.3.1 Aceptores de Elétrons na biorremediação Anóxica .......................................... 41
2.3.2 Utilização de Nitrato como Aceptor de Elétrons ................................................ 43
2.3.3 Dispersante químico ......................................................................................... 44
2.4 BIOAUMENTAÇÃO E BIOESTIMULAÇÃO ......................................................................... 46
vi
2.4.1 Aplicações dos biossurfactantes ...................................................................... 47
3 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................. 49
CAPÍTULO IV – ARTIGOS........................................................................................................ 57
4 ARTIGOS ........................................................................................................................... 58
4.1 BIORREMEDIAÇÃO DE SOLO ARENOSO CONTAMINADOS POR DERRAME
SIMULADO COM BENZENO, TOLUENO E XILENO ............................................................. 59
4.1.1 RESUMO ......................................................................................................... 59
4.1.2 ABSTRACT ...................................................................................................... 59
4.1.3 INTRODUÇÃO ................................................................................................. 60
4.1.4 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................. 62
4.1.4.1 Produção do biossurfactante ................................................................. 62
4.1.4.2 Extração do biossurfactante .................................................................. 63
4.1.4.3 Tensão superficial do biossurfactante ................................................... 64
4.1.4.4 Biorremediação ..................................................................................... 64
4.1.5 RESULTADOS E DISCUSSÕES...................................................................... 71
4.1.6 CONCLUSÕES ................................................................................................ 75
4.1.7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................. 76
4.2 ESTUDO DA DEGRADAÇÃO DE HIDROCARBONETOS AROMÁTICOS
POLICÍCLICOS (HAPS) E DE HIDROCARBONETOS TOTAIS DE PETRÓLEO (HTP) COM
A UTILIZAÇÃO DE BIOSSURFACTANTES E DISPERSANTE QUÍMICO .............................. 79
4.2.1 RESUMO ......................................................................................................... 79
ABSTRACT ................................................................................................................. 79
4.2.2 INTRODUÇÃO ................................................................................................. 80
4.2.3 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................. 81
4.2.3.1 Produção dos biossurfactantes ............................................................. 81
4.2.3.2 Biorremediação ..................................................................................... 84
4.2.4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................ 90
4.2.5 CONCLUSÕES ................................................................................................ 98
4.2.6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................. 98
CAPÍTULO V - CONCLUSÕES GERAIS ................................................................................ 104
5 CONCLUSÃO GERAL ..................................................................................................... 105
6 SUGESTÕES PARA FUTUROS TRABALHOS ............................................................... 106
APÊNDICES ........................................................................................................................... 107
SUMÁRIO V
vii
APÊNDICE 1 - RESULTADOS REFERENTES AO ARTIGO 1 - BIORREMEDIAÇÃO DE SOLO ARENOSO
CONTAMINADOS POR DERRAME SIMULADO COM BENZENO, TOLUENO E XILENO 108
ANEXO 1 – ESCALA DE WENTWORTH UTILIZADA PARA A CLASSIFICAÇÃO DO SOLO 126
ANEXOS ................................................................................................................................. 125
ANEXO 1 - Escala de Wentworth .................................................................................... 12626
viii
LISTA DE TABELAS
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
TABELA 1 COMPOSIÇÃO QUÍMICA DO FARELO DE TRIGO ............................................................26
TABELA 2 COMPOSIÇÃO QUÍMICA DA CASCA DE ARROZ .............................................................26
TABELA 3 PRINCIPAIS CLASSES DE BIOSSURFACTANTES E MICRO-ORGANISMOS ENVOLVIDOS .....30
TABELA 4 FONTES MICROBIANAS E PROPRIEDADES DE BIOSSURFACTANTES...............................33
TABELA 5 COMPARAÇÃO ENTRE CMCS DE BIOSSURFACTANTES E SURFACTANTES QUÍMICOS .....34
TABELA 6 ACEPTORES DE ELÉTRONS UTILIZADOS POR DIFERENTES MICRO-ORGANISMOS NA
BIODEGRADAÇÃO DE HIDROCARBONETOS .........................................................................42
TABELA 7 PROPRIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS DO DISPERSANTE QUÍMICO COMERCIAL. ..................45
TABELA 8 PRINCIPAIS APLICAÇÕES COMERCIAIS DOS BIOSSURFACTANTES .................................48
ARTIGO 1 - BIORREMEDIAÇÃO DE SOLO ARENOSO CONTAMINADOS POR
DERRAME SIMULADO COM BENZENO, TOLUENO E XILENO
TABELA 1 VALORES REAIS DAS VARIÁVEIS DE CONCENTRAÇÃO DO ACEPTOR DE ELÉTRONS E DO
BIOSSURFACTANTE..........................................................................................................68
TABELA 2 CLASSIFICAÇÃO DO SOLO ARENOSO .........................................................................71
TABELA 3 TEMPERATURAS MÁXIMAS E MÍNIMAS REGISTRADAS DURANTE O PERÍODO DE
BIORREMEDIAÇÃO ...........................................................................................................72
TABELA 4 VALORES MÁXIMOS E MÍNIMOS PARA OS PARÂMETROS AVALIADOS PARA BENZENO,
TOLUENO E XILENO ..........................................................................................................72
TABELA 5 CONCENTRAÇÕES DE BENZENO TOLUENO E XILENO (MG.KG-1), DETECTADAS NOS
ENSAIOS .........................................................................................................................74
ARTIGO 2 - ESTUDO DA DEGRADAÇÃO DE HIDROCARBONETOS AROMÁTICOS
POLICÍCLICOS (HAPS) E DE HIDROCARBONETOS TOTAIS DE PETRÓLEO (HTP) COM
A UTILIZAÇÃO DE BIOSSURFACTANTES E DISPERSANTE QUÍMICO
TABELA 1 CONCENTRAÇÃO DO BIOSSURFACTANTE E DISPERSANTE QUÍMICO .............................85
TABELA 2 VALORES MÁXIMOS E MÍNIMOS PARA OS PARÂMETROS AVALIADOS PARA
HIDROCARBONETOS TOTAIS DE PETRÓLEO E HIDROCARBONETOS AROMÁTICOS POLICÍCLICOS
......................................................................................................................................91
TABELA 3 TEMPERATURA MÁXIMAS E MÍNIMAS (ºC) E DESVIO PADRÃO DOS ENSAIOS,
HIDROCARBONETOS TOTAIS DE PETRÓLEO E HIDROCARBONETOS AROMÁTICOS
POLICÍCLICOS. ................................................................................................................92
TABELA 4 CONCENTRAÇÃO DE HIDROCARBONETOS AROMÁTICOS POLICÍCLICOS (ΜG.L-1) NO
DRENADO .......................................................................................................................95
ix
LISTA DE QUADROS
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA QUADRO 1 BACTÉRIAS ANAERÓBIAS QUE UTILIZAM HIDROCARBONETOS COMO FONTE DE CARBONO
......................................................................................................................................44
x
LISTA DE FIGURAS
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Figura 1 Fermentação em estado semi-sólido em biorreatores de coluna ............................ 23
Figura 2 Biorreatores do tipo erlenmeyer.............................................................................. 24
Figura 3 Estruturas básicas formadas por biossurfactantes.................................................. 27
Figura 4 Diagrama esquemático da variação da tensão superficial, interfacial e solubilidade
em função da concentração de surfactante. .................................................................. 28
Figura 5 Estruturas químicas de alguns biossurfactantes: (a) raminolipídios, (b)
soforolipídios, (c) lipopeptídio e (d) surfactina. .............................................................. 31
Figura 6 Ação esquematizada pelo Ultrasperse II na ação com o óleo em meio aquoso: (a)
Incompatibilidade óleo/água; (b) aplicação do dispersante; (c) quebra da mancha com
mínimo de energia. ........................................................................................................ 46
ARTIGO 1 - BIORREMEDIAÇÃO DE SOLO ARENOSO CONTAMINADOS POR
DERRAME SIMULADO COM BENZENO, TOLUENO E XILENO
Figura 1 Esquema de cultivo em estado sólido em biorreator de coluna .............................. 63
Figura 2 Medição da tensão superficial em tensiômetro ...................................................... 64
Figura 3 Preparo do solo preparado para biorremediação .................................................... 65
Figura 4 Reatores de PVC – Ensaio1 com solo arenoso ...................................................... 66
Figura 5 Reatores de captação de água proveniente da lixiviação por precipitação
pluviométrica ................................................................................................................. 67
Figura 6 Pontos de amostragens dos reatores ..................................................................... 67
Figura 7 Medição dos máximos e mínimos valores de temperatura ..................................... 70
ARTIGO 2 - ESTUDO DA DEGRADAÇÃO DE HIDROCARBONETOS AROMÁTICOS
POLICÍCLICOS (HAPS) E DE HIDROCARBONETOS TOTAIS DE PETRÓLEO (HTP) COM
A UTILIZAÇÃO DE BIOSSURFACTANTES E DISPERSANTE QUÍMICO
Figura 1 Propagação dos inóculos em ágar nutriente ........................................................... 82
Figura 2 Esquema de cultivo em estado sólido em biorreator de coluna. ............................. 83
Figura 3 Medição da tensão superficial em tensiômetro ....................................................... 84
Figura 4 Coleta de solo do landfarming ................................................................................ 85
Figura 5 Reatores para a biorremediação solo landfarming.................................................. 86
Figura 6 Reatores de captação de água proveniente da lixiviação por precipitação
pluviométrica ................................................................................................................. 87
Figura 7 Pontos de amostragens dos reatores ..................................................................... 88
xi
Figura 8 Medição dos máximos e mínimos valores de temperatura ..................................... 89
Figura 9 Concentração de HAPs ao longo do tempo para ensaios com solo landfarming .... 93
Figura 10 Concentração de HAPs ao longo do tempo para ensaios com biossurfactante .... 94
Figura 11 Concentração de HAPs ao longo do tempo para ensaios com dispersante químico94
Figura 12 Concentração de HTP ao longo do tempo para ensaios com landfarming,
biossurfactante e dispersante químico .......................................................................... 96
xii
RESUMO
Os biossurfactantes são compostos de origem microbiana que possuem a capacidade de reduzir a tensão superficial, entre a fase líquido-gás ou a tensão interfacial, entre as fases líquido-líquido imiscíveis. Essas moléculas anfipáticas possuem uma porção hidrofílica (parte polar) e outra hidrofóbica (parte apolar). Diversos micro-organismos têm sido relatados como produtores de surfactantes, e que possuem propriedades emulsificantes. São importantes em indústrias de alimentos, biorremediação e em fármacos. A maior parte dos surfactantes comerciais é de origem sintética, de alto custo e na maioria das vezes, poluentes, produzidos a partir de derivados de petróleo. Os micro-organismos produtores de surfactantes naturais são uma alternativa aos produtos já existentes. O uso de rejeitos das indústrias de alimentos como substrato para o crescimento de micro-organismos é uma alternativa de produzir compostos bioativos de baixo custo, entre eles os biossurfactantes. Os biossurfactantes podem ser produzidos por bactérias, fungos filamentosos e leveduras. A biorremediação é um processo limpo e ecologicamente correto de descontaminação de solos e águas, principalmente em derrames de petróleo e seus derivados. A Universidade Federal do Rio Grande, tem uma vocação voltada ao ecossistema costeiro e através de seus pesquisadores vem desenvolvendo alternativas que possam diminuir impactos ambientais que ocorram pelo derrame de petróleo e seus derivados. O objetivo do presente trabalho a foi produção e utilização de biossurfactantes em biorremediação de solos contaminados com petróleo e derivados. A produção de biossurfactantes foi realizada pela bactéria Corynebacterium aquaticum, cultivada em processo aeróbio em estado semi sólido, com duração de 144 h em biorreatores de coluna com leito fixo utilizando farelo de trigo (85%) e casca de arroz (15%) com adição de nutrientes inorgânicos. A umidade foi ajustada para 65%, a temperatura 30 ºC, a aeração 60 mL.g-1.h-1 e o pH 6,5. O processo foi monitorado a cada 24 h. A biorremediação foi realizada ex situ, em solo arenoso não estéril do terminal de Rio Grande da BRASKEM e em solo não estéril do landfarming da unidade de Triunfo da mesma empresa. Para o estudo da degradação do benzeno, tolueno e xileno (BTX) junto ao solo arenoso foi utilizado um aceptor de elétrons (NO3
-), na proporção de 100% com o balanço estequiométrico e 200% de concentração de biossurfactante calculado em relação ao resultado do teste de emulsão dos contaminantes. No derrame simulado de benzeno, tolueno e xileno (BTX) em solo arenoso não estéril não foi possível avaliar a ação do biossurfactante e do aceptor final de elétrons, mas com a concentração utilizada no teste de 5 mL de cada contaminante, estes não ofereceram risco de percolação até a profundidade de 0,40 m e não oferecem risco de chegar ao lençol freático (neste caso de 2 m da superfície). Foi realizado o estudo no processo de descontaminação no solo landfarming com diminuição da concentração de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs) e hidrocarbonetos totais de petróleo (HTP), através da ação dos biossurfactantes produzido pela C. aquaticum em relação dispersante comercial. Neste ensaio de biorremediação, com duração de 90 d, comprovou-se a ação degradante do biossurfactante extraído da C. aquaticum sobre os compostos analisados de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs) e hidrocarbonetos totais de petróleo (HTP). Os HAPs apresentaram maior degradação (93,75%) em confronto com o ensaio controle. Os compostos benzo (g,h,i) pirileno, dibenzona (a,h) antraceno, indo (1,2,3-cd) e pireno benzo (k) fluoranteno foram degradados completamente.
Palavras-chave: Biorremediação, biossurfactante, Corynebacterium aquaticum.
xiii
ABSTRACT
Biosurfactants are microorganism synthesized compounds which posses the ability to reduce the superficial tension among in a liquid-gas interface or the interfacial tension in a non miscible liquid-liquid interaction. These amphipatic molecules are formed by a hydrophilic end (polar portion) and a hydrophobic end (apolar portion). Several microorganism have been reported as a biosurfactant producer, and capable of generating emulsifier properties. Therefore, such microorganisms are important to the food, bioremediation and pharmacy. The vast majorities of commercial surfactants are synthetic, obtain from petroleum refining, generates high costs and, generally pollutants to the environment. Therefore, surfactants from natural sources are an alternative to existing products. The utilization of food industries byproducts is an alternative for low coast bioactive compounds production, among them are biosurfactants. Such metabolites may be synthesized by bacteria, filamentous fungi and yeast. Bioremediation is a non-pollutant, environmentally correct decontamination procedure of soils and water, mainly in order to inactivate oil products and its derivates. Federal University of Rio Grande is a coastal ecosystem focus institution, therefore its researches have been developing alternatives that may decrease environmental damage generated by oil and its derivates leakages. This work objective is biosurfactants production and utilization of such product in oil and derivates contaminated soils bioremediation. Biosurfactant production was realized by Corynebacterium aquaticum bacteria, cultivated in semi-solid state anaerobic process during 144h in column bioreactors using a fixed bed composed by wheat bran (85%), rice husk (15%) and inorganic nutrients. The moisture content in the experiment was regulated to 65%, the temperature was 30ºC, aeration 60 mL.g-1.h-1 and pH 6.5. The procedure was monitored each 24 h. Bioremediation was carried in non-sterile sand soil obtained in BRASKEM’s Rio Grande cargo terminal and non-sterile landfarming from the same company Triunfo unit. In order to evaluate benzene, toluene and xylene (BTX) degradation in sand soil a final electron acceptor (NO3
-) was utilized in the full proportion to the stoichiometric carbon balance and 200% biosurfactant concentration in relation to the quantity obtained from the emulsification experiments. In this simulated BTX leakage, the final electron acceptor an biosurfactant effect could not be evaluated, although, in the 5 ml of each contaminant volume, the penetration did not reached 0.40 m deep, therefore, posing no threat to the groundwater stock (2 m deep in this case). In landfarming decontamination the decrease in Polyciclic Aromatic Hydrocarbons (PAH) and Total Petroleum Hydrocarbons (TPH) was studied by comparing the efficiency of C. aquaticum produced biosurfactant and commercial dispersant. In the landfarming experiments, after 90 days, the C. aquaticumextracted biosurfactant degrading action was proven for PHA and TPH. PHA presented the highest decrease rate (93.75%) when compared to the control experiment. The compounds benzo(g,h,i)pirilen, dibenzone(a,h)antracene, indene(1,2,3-c,d)pirene, benzo(k)flueroentene were completely degraded.
Key-words: Bioremediation, biosurfactant, Corynebacterium aquatic.
CAPÍTULO I - INTRODUÇÃO GERAL
14
1.1 INTRODUÇÃO
Biossurfactantes são compostos de origem biológica que possuem a capacidade
de influenciar nas interfaces polares e apolares. Possuem características importantes frente
aos surfactantes sintéticos, tais como a alta biodegradabilidade, baixa toxicidade,
apresentando maior taxa de redução de tensão superficial, solubilidade em água alcalina,
estabilidade em diferentes temperaturas e variações de pH, e são resistentes a grandes
concentrações salinas. São compostos de superfície ativa, produzidos na superfície da
célula microbiana, ou excretados extracelularmente, que reduzem tensões interfaciais e
apresentam propriedades de emulsificação (KIM et al., 1997). Os micro-organismos que
possam lisar, degradar, adaptar, crescer e proliferar em ambientes contendo petróleo e seus
derivados como contaminantes, possuem papel muito importante para a degradação
biológica deste tipo de poluição.
A biodegradação de compostos ricos em hidrocarbonetos é dependente de sua
estrutura química, e do tamanho de sua cadeia carbonada, quanto menor a cadeia mais
solúvel e rápida será sua degradabilidade.
A maioria dos surfactantes disponíveis no mercado são sintéticos e são
produzidos a partir dos derivados de petróleo. Entretanto, a crescente preocupação com o
meio ambiente combinado com novas legislações de controle ambiental levaram à procura
por surfactantes naturais como uma alternativa aos produtos já existentes no mercado
(CASTIGLIONI, 2006).
Pesquisas vinculadas à utilização dos biossurfactantes vêm crescendo nos
últimos anos, devido a seu potencial de utilização em diferentes áreas, como é o caso da
indústria alimentícia, agrícola, farmacêutica, de óleos, petroquímica, de papel, entre outras.
Os biossurfactantes vêm sendo testados na biorremediação de vários compostos
de cadeias carbonadas, dentre eles o petróleo e seus derivados, como uma alternativa
eficiente e economicamente viável no tratamento de regiões contaminadas. A
biorremediação é definida como um processo de uso inteligente do potencial que os micro-
organismos apresentam na degradação de compostos poluentes, reduzindo o grau de
contaminação (BOOPATHY, 2000).
Os detergentes sintéticos usados para a limpeza geral e em derrames de óleo
têm conduzido a uma maior contaminação do meio ambiente por sua difícil degradação,
toxidade e acúmulo nos ecossistemas. A vantagem mais importante dos biossurfactantes
com relação aos surfactantes químicos é a sua biodegradabilidade (HEALY et al., 1996).
Pela origem de sua diversidade estrutural (glicolipídios, lipopeptídios, ácidos
graxos, entre outros), baixa toxicidade e biodegradabilidade, os biossurfactantes podem ser
15
amplamente utilizados em cosméticos, processos farmacêuticos e processos de produção
de alimentos como emulsificantes, umectantes, conservantes e detergentes. Além disso,
estes são ecologicamente seguros e podem ser aplicados em biorremediação e tratamento
de resíduos (MAKKAR & CAMEOTRA, 2002).
Apesar dos biossurfactantes apresentarem diversas vantagens ainda não são
amplamente utilizados devido ao alto custo de produção em relação aos surfactantes
sintéticos. (NITSCHKE & PASTORE, 2002). A empresa denominada “Jeneil Biosurfactant
Company” (EUA) em 1998 patenteou a produção comercial de biossurfactante do tipo
raminolipídio. O elevado custo de produção tem limitado suas aplicações, no momento esta
mesma empresa não está mais produzindo o biossurfactante. O desenvolvimento de novas
técnicas na produção de biossurfactantes com maior rendimento, utilizando substratos
agroindustriais de menor custo, busca torná-los mais competitivos financeiramente.
(MULLIGAN, 2005).
A poluição por óleos é um problema ambiental de grande repercussão. Micro-
organismos degradadores de hidrocarbonetos, adaptados para crescerem em ambientes
contaminados com óleo, têm um importante papel no tratamento biológico desta
contaminação, pois podem produzir biossurfactantes de diversas naturezas químicas e
massas molares. Estes compostos de superfície ativa aumentam a área interfacial de
substratos hidrofóbicos insolúveis em água e aumentam a sua biodisponibilidade, desse
modo aumentam o crescimento dos micro-organismos e a taxa de biorremediação (RON &
ROSENBERG, 2002).
Desta maneira, o presente projeto de pesquisa visou produzir biossurfactante
utilizando resíduos agroindustriais gerados na região, e utilizá-lo na biorremediação de solos
contaminados com petróleo e seus derivados de forma a acrescentar mais uma alternativa
para diminuir os impactos ambientais ocasionados pelo derrame desses produtos. A
Universidade Federal do Rio Grande, com sua vocação voltada para o ecossistema costeiro,
tem aqui mais uma importante oportunidade de inserir-se no contexto através de seus
pesquisadores, a utilização de tecnologias limpas e aceitáveis ecologicamente em
processos de descontaminação.
16
1.2 OBJETIVOS
1.2.1 Objetivo geral
Estudar a biorremediação dos poluentes presentes em solos contaminados
através do uso de biossurfactantes, surfactante químico e aceptores finais de elétrons.
1.2.2 Objetivos específicos
- Produzir o biossurfactante pela bactéria Corynebacterium aquaticum.
- Determinar a atividade emulsificante dos biossurfactantes;
- Avaliar o efeito dos biossurfactantes e aceptor finais de elétrons em solo
arenoso contaminados por derrame simulado com benzeno, tolueno e xileno (BTX) em
escala laboratorial;
- Avaliar o efeito de degradação dos compostos de hidrocarbonetos aromáticos
policíclicos (HAPs) e hidrocarbonetos totais de petróleo (HTP) pelos biossurfactantes
extraído da Corynebacterium aquaticum, e de um dispersante químico comercial em solo
argiloso de landfarming.
17
1.3 JUSTIFICATIVA
A demanda de petróleo vem crescendo mundialmente, e a necessidade do uso
deste e de seus derivados para fins diversos vem aumentando as possibilidades de
contaminações ambientais, sendo as principais fontes de contaminação causadas por
extração, transporte, refino e abastecimento. A grande preocupação é devido ao alto teor
poluente, que o petróleo e seus derivados oferecem ao meio ambiente. Os compostos
orgânicos do petróleo são produtos de grandes cadeias carbonadas apolares, altamente
tóxicos, o que os tornam de difícil e lenta degradação. O petróleo mesmo sendo uma das
principais fontes energéticas do momento é um produto tóxico para os organismos e
implacável poluidor dos ecossistemas. É por isto que se faz necessário o uso de tecnologias
limpas para prováveis problemas que possam vir a ocorrer.
Processos biológicos estão ganhando cada vez mais importância no tratamento
de solos contaminados com petróleo e seus derivados.
Para o município do Rio Grande RS é expressiva a preocupação que um
acidente desta natureza venha acontecer, uma vez que o município reúne uma rede de
atividades correlatas que podem causar riscos ambientais, tais como: refinaria de petróleo,
oleoduto que vai do píer de descarga até a refinaria, terminais de armazenamento e
distribuição de petróleo e derivados, transporte de derivados de petróleo por via marítima,
lacustre, rodoviário e ferroviário, porto com entrada e saída de embarcações de grande
porte e estas com grande quantidade de combustíveis, e indústrias com significativos
estoques de óleos combustíveis e derivados.
Inúmeros seriam os problemas, no caso de ocorrência de acidentes por
vazamento ou derrame do petróleo ou de seus derivados. Os danos sociais, econômicos e
ambientais certamente seriam de grande abrangência. Além destes, o turismo que também
é fonte de empregos e renda para muitos seria seriamente atingido. No plano social a
repercussão de um desastre ambiental atingiria milhares de pescadores que tiram seu
sustento do mar.
Quando um acidente por derrame de petróleo ocorre, geralmente com enormes
quantidades deste poluente, alastram-se rapidamente, nas superfícies aquosas formando
grandes manchas oleosas altamente destrutivas, provocando agressões junto a fauna e
flora, as quais na maioria das vezes irreversíveis. A flutuação do petróleo provoca efeitos
devastadores no ecossistema, seres autótrofos fotossintetizantes, as algas são impedidas
de fazer a fotossíntese por não receber a claridade suficiente, já que os raios solares não
ultrapassam a superfície contaminada, outros processos metabólicos podem ocorrer
inclusive a eutrofização e quando isto ocorre, a mortandade de espécies marinhas é
18
inevitável. Conhecidas como Marés Negras não afetam apenas as superfícies marinhas,
mas também zonas costeiras, afetando as praias e seres que a habitam.
Estima-se que a cada ano 600.000 toneladas de petróleo bruto são derramadas
em acidentes durante o transporte, perfuração de poços de petróleo, descargas ilegais de
efluentes industriais e limpeza de tanques de navios no mar. O petróleo derramado flutua e
alastra-se progressivamente, formando extensas manchas negra, de efeitos altamente
destruidores. Além dos seus efeitos imediatos, bem evidentes, há também os efeitos em
longo prazo, com repercussões não menos graves. Quando as marés negras atingem as
zonas costeiras, colocam em risco a fauna e flora pela intoxicação de peixes, moluscos e
alguns mamíferos, representando um perigo para o homem através da cadeia alimentar. Há
também prejuízos à atividade pesqueira e pelo forte impacto negativo na atividade turística,
já que os resíduos petrolíferos, de difícil remoção, impedem por muito tempo a utilização das
praias (DAMAS et al., 2000; NADARAJAH et al., 2002; citados por COLLA & COSTA, 2003).
Micro-organismos ativos desempenham melhor função na remediação, e
medidas biocorretivas tendem a aumentar a população microbiana criando condições
ambientais ideais para o seu desenvolvimento, adição de nutrientes, como nitrogênio,
fósforo e potássio (NPK), pH ótimo, umidade e temperatura são fatores que resultam em
melhora no seu desempenho. Diferentes micro-organismos degradam diferentes
substâncias, estas medidas podem ser aplicadas em condições aeróbicas ou anaeróbicas.
No processo aeróbico micro-organismos desenvolvem-se usando o oxigênio que, em
quantidade suficiente, transformam grande quantidade de contaminantes em dióxido de
carbono e água. Em condições anaeróbicas, a atividade biológica acontece na ausência de
oxigênio, de tal forma que os micro-organismos decompõem os compostos orgânicos do
solo para liberar a energia que necessitam, este processo de degradação é muito mais lento
que o aeróbico.
As medidas biocorretivas podem ser usadas para descontaminação de solo e
água e são classificadas sob duas categorias: in situ e ex situ. No caso das medidas in situ,
o tratamento do solo contaminado ou da água subterrânea é feito no próprio local. As
medidas biocorretivas ex situ consistem em retirar o solo contaminado ou extrair a água
subterrânea por bombeamento para aplicar o tratamento em outro local.
O uso da biorremediação é uma destas técnicas a ser utilizada. O
biossurfactante produzido por micro-organismos atende em muito este fim, mas o maior
problema, mesmo utilizando produtos de baixo custo, que é o caso de subprodutos
agroindustriais para sua produção, não existe produção em alta escala tornando-os
economicamente inviáveis, ao lado dos surfactantes sintéticos produzidos a partir de
19
produtos derivados do petróleo, que, mesmo estes não sendo ecologicamente corretos,
ainda são os mais comercializados no momento.
Mesmo que a produção do surfactante fosse a alta escala, ainda assim sofreria
problemas, pois a purificação envolve vários processos o que os tornam inviáveis no
momento.
O Rio Grande do Sul é grande produtor de arroz e trigo e os subprodutos
resultantes do seu beneficiamento tornaria mais favorável a produção de biossurfactantes
em escala industrial minimizando assim seu custo final
A grande quantidade de casca de arroz e de subprodutos de indústrias de
beneficiamento de grãos concentradas na região sul do Estado, apresenta a perspectiva de
produção de biossurfactante por cultivo aeróbio em estado sólido, em larga escala, o que
poderia torna-se mais competitiva e viável e menos poluente sua produção.
Desde 1998, o Laboratório de Engenharia Bioquímica (LEB) da FURG vem
desenvolvendo pesquisas sobre a produção de biossurfactantes e sua utilização em
biorremediação de hidrocarbonetos, demonstrando a sua preocupação com a utilização de
resíduos agroindustriais e a redução de impactos ambientais (RADMANN, 2011; COLLA,
2009; MARTINS et al., 2008; PINTO, 2008; CERQUEIRA, 2007; CASTIGLIONI, 2006;
CAMERINI e CHANIN, 2005; COSTA, 2004; JUNIOR et al., 2003; SANTOS et al., 2001;
GANDRA et al., 2000; LINDE, 2000; MORAES, 1999; HASAN, 1998; TREICHEL et al.,
1998).
CAPÍTULO II - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
21
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Fermentação
Fermentação é uma manifestação fisiológica da célula viva, podendo ser definida
como desassimilação (catabolismo da matéria orgânica) de carboidratos, gorduras,
proteínas, através de reações acopladas, catalisadas por enzimas intra e extracelulares,
acarretando formação de substâncias intermediárias dos produtos finais da oxidação
biológica total; ou, então, derivados dessas substâncias. Pode ainda ser definida como uma
oxidação incompleta que se manifesta por uma liberação de elétrons, onde uma substância
orgânica originada da degradação do substrato, serve de aceptor de elétrons e prótons, que
quando ocorre em meio anaeróbio todos os prótons liberados servem para reduzir um
substrato orgânico, e em meio aeróbio, parte dos prótons liberados servem para reduzir o
oxigênio liberado (REGULY, 1996).
Processo fermentativo é um somatório de etapas, onde o meio de fermentação,
convenientemente preparado para fornecer ao micro-organismo responsável pelo processo
os nutrientes de que necessita, é com frequência esterilizado, com o objetivo de eliminar
micro-organismos contaminantes indesejáveis. No fermentador, esse meio recebe o inoculo,
suspensão do micro-organismo capaz de garantir a fermentação do meio em condições
econômicas. O processo de fermentação é, então, controlado (temperatura, pH, agitação,
concentração de nutrientes,) de modo a manter condições favoráveis a atuação do micro-
organismo. Quando o processo é aeróbio, há necessidade de fornecer ar ao sistema, ar
esse quase sempre esterilizado. Completada a fermentação, o líquido é encaminhado aos
tratamentos finais, com vista à separação de produtos e de subprodutos ao tratamento dos
resíduos (BORZANI et al., 1975).
Os processos fermentativos são comumente classificados quanto à condução do
processo (descontínuos, semicontínuos ou contínuos), quanto ao modo de cultivo (processo
em estado sólido ou submerso) e quanto ao suprimento de oxigênio (processos aerados ou
não aerados). (REGULY, 2000).
A fermentação, de um modo geral, se caracteriza pela aplicação do metabolismo
microbiano na transformação de uma matéria-prima simples em produtos de maior valor
agregado, como por exemplo, ácido cítrico, antibióticos, entre outros (TREVAN et al., 1990
citado por CASTIGLIONI, 2006).
22
2.1.1 Fermentação em estado sólido
A fermentação em estado sólido (FES) é definida como sendo o processo
fermentativo envolvendo sólidos na ausência total ou parcial de água livre. Os substratos
utilizados neste tipo de processo devem possuir umidade suficiente na forma complexada ou
absorvida, para permitir o crescimento e metabolismo dos micro-organismos. O teor de
umidade máximo é função do tipo de substrato, ou seja, função da propriedade que este
possui de absorver água (ROBINSON et al., 2001; PANDEY, 2003; RAGHAVARAO et al.,
2003).
A umidade é o elemento chave do controle e otimização destes processos. Muita
umidade compacta o substrato, diminui a penetração de oxigênio e facilita a contaminação
por crescimento de bactérias. Por outro lado, a baixa umidade inibe este crescimento, ativa
as enzimas e torna acessíveis os nutrientes (SARAIVA et al., 1998).
Muitos micro-organismos são capazes de crescer em substratos sólidos, mas
somente fungos filamentosos podem se desenvolver na ausência de água livre. Bactérias e
leveduras crescem em substratos sólidos com níveis de 40-70% de umidade, mas o
crescimento e a proliferação dos organismos unicelulares sempre requerem água livre
(RAGHAVARAO et al., 2003).
Existem vários fatores importantes, os quais afetam os processos de
fermentação em estado sólido. Entre estes, está à escolha de cepas e substratos
adequados, a preferência de processos (físicos, químicos e bioquímicos) são determinantes.
A seleção do substrato para o processo de fermentação em estado sólido depende de vários
fatores, principalmente relacionados a custos de produção e disponibilidade de matérias-
primas.
Na fermentação em estado sólido (FES), o substrato não apenas fornece os
nutrientes para o crescimento microbiano, mas também serve como um suporte para as
células. O substrato é que proporciona todos os nutrientes necessários para o crescimento
dos micro-organismos, e deve ser considerado como o substrato ideal. No entanto, alguns
dos nutrientes podem estar disponíveis em concentrações sub-ótimas, ou até mesmo não
presente nos substratos. Nestes casos, deve ser feito um pré-tratamento químico ou
mecânico em alguns substratos antes do uso nos processos de fermentação em estado
sólido, o que faz com que eles se tornem mais facilmente acessíveis para o crescimento
microbiano. (PANDEY et al., 2000).
Resíduos agroindustriais são os substratos mais utilizados na FES (PANDEY et
al., 2000). A preparação e o pré-tratamento do substrato incluem: redução de tamanho;
suplementação com nutrientes (fósforo, nitrogênio, sais), adequação do pH e conteúdo de
23
umidade, e tratamento térmico com vapor para eliminação de possíveis contaminações
(RAIMBAULT, 1997, citado por HASAN et al., 1998).
Entre os inúmeros fatores que são importantes para o crescimento e atividade
microbiana em um determinado substrato, o tamanho da partícula e o coeficiente de
umidade são os mais críticos. Comumente, partículas pequenas de substrato originam maior
área de contato para ataque microbiano, sendo considerado um fator desejável. Mas, no
entanto, partículas de substrato muito pequenas podem, na maioria dos casos, resultarem
em aglomeração ou compactação do substrato, o que pode interferir na respiração
microbiana e aeração, resultando em menor taxa de crescimento. Ao mesmo tempo,
partículas maiores promovem melhor respiração e eficiência de aeração, devido ao aumento
do espaço entre as partículas, mas proporcionam superfície de contato limitada para o
ataque microbiano. Deste modo, seria necessário determinar o tamanho de partícula
adequado para determinado processo (PANDEY et al., 2000).
A adição de um suporte inerte ao meio, além de proporcionar uma textura porosa
ao meio, aumenta a retenção de água e oferece maior firmeza ao meio, quando diminuída
pelo tratamento térmico (COSTA, 1996).
Os biorreatores para fermentação em estado sólido podem ser de vidro,
bandejas, esteiras rolantes, coluna e tambor rotativo (MARTINS, 2005). Os biorreatores de
coluna são os mais apropriados, pois a aeração forçada permite controle de parâmetros da
fermentação através da manipulação da taxa fluida e da temperatura do ar usado na
fermentação (SANGSURASAK & MITCHELL, 1995). Segundo Costa (1996) biorreatores de
coluna podem consistir em um tubo de vidro ou de plástico, colocado na vertical e com um
leito fixo de substrato, podendo possuir encamisamento externo para controle de
temperatura, utilizando circulação de água (Figura 1).
Figura 1 Fermentação em estado sólido em biorreatores de coluna
FONTE: Laboratório de Engenharia Bioquímica – FURG
24
Figura 2 Biorreatores do tipo erlenmeyer
FONTE: Laboratório de Engenharia Bioquímica – FURG
Os principais parâmetros que devem ser medidos e controlados na FES são:
temperatura, aeração, pH e conteúdo de água (MAUREL et al., 2003).
Devido às atividades metabólicas dos micro-organismos e dependendo da altura
da camada de substrato, uma grande quantidade de calor pode ser produzida durante o
processo fermentativo. Como a temperatura afeta diretamente a germinação dos esporos, o
crescimento e a esporulação dos micro-organismos e a formação de produto, o calor
produzido deverá ser imediatamente dissipado, para que o aumento da temperatura não
prejudique a fermentação desejada (BORZANI, 2001).
A aeração forçada no biorreator é utilizada para remoção de calor e também
para abastecer a demanda de O2 e remoção de CO2. O uso de ar em excesso elimina o
problema da remoção de calor, porém ocasiona diminuição da concentração de biomassa,
pois conduz o meio sólido à níveis desfavoráveis de umidade, mesmo com o uso de ar
saturado pois pode ocorrer arraste de umidade (HASAN et a., 1998).
O conteúdo de água é considerado ótimo para a saturação do substrato, quando
varia entre 30 e 85% dependendo do tipo de substrato (MAUREL et al., 2003).
As principais vantagens da fermentação em estado sólido com relação à
fermentação submersa são: maior produtividade; alta concentração dos produtos finais;
baixa demanda de água e, portanto, menor probabilidade de contaminação; a possibilidade
de utilização de substratos baratos, como os resíduos agroindustriais (MITCHELL et al.,
2000).
Variações no pH resultam do consumo do substrato (ex: hidrólise de proteína) ou
da produção de metabólitos (ex: ácidos orgânicos). Eles são indicadores de mudanças na
atividade metabólica. Na fermentação em estado sólido, não existem eletrodos que possam
registrar o pH no meio sólido devido a ausência de água livre. Alguns autores sugerem o
25
uso de um eletrodo potenciométrico, ou um eletrodo padrão para medida de pH, depois da
suspensão da amostra em água destilada (MAUREL et al., 2003).
Por sua vez, as desvantagens mais significativas da fermentação em estado
sólido são: os micro-organismos utilizados são limitados àqueles que crescem em baixos
níveis de umidade; dificuldades para remoção do calor gerado pelo processo de respiração
do micro-organismo; dificuldade na medida e controle dos níveis de umidade, pH, oxigênio e
gás carbônico; escassez de dados de engenharia e de projetos para fermentadores;
dificuldade do aumento de escala (COSTA, 1996; MITCHELL et al., 2000).
2.1.1.1 Substratos para a fermentação em estado sólido
Pesquisas na seleção de substratos adequados para a fermentação em estado
sólido têm se fixado principalmente em resíduos e produtos agroindustriais. Estes incluem
produtos tais como mandioca, soja, açúcar de beterraba, batata, batata doce, resíduos como
farelo de trigo, farelo de arroz, bagaço de cana-de-açúcar e mandioca, resíduos do
processamento de frutas, entre outros (MAKKAR & CAMEOTRA, 2002).
A utilização de resíduos industriais, provenientes da agroindústria, é uma forma
de gerar recursos de produtos considerados de baixo custo. A casca de arroz e o farelo de
trigo são subprodutos com grande potencial como insumo para o desenvolvimento de
processos fermentativos em estado sólido, uma vez que o conteúdo de carboidratos é
bastante elevado. Outro fator relevante e de extrema importância para seu aproveitamento é
a sua grande disponibilidade a nível regional, sendo que o Rio Grande do Sul é um dos
maiores produtores e processadores de arroz e trigo (SILVA et al., 2001).
A casca de arroz é um subproduto do beneficiamento do arroz polido ou
parboilizado, correspondendo cerca de 22% do peso do grão, e sua utilização até o
momento não é muito difundida, sua maior utilidade é na produção de energia para a
geração de vapor. Já o farelo de arroz é fonte natural de fibras, proteínas, minerais e
vitaminas. No Brasil, o farelo de trigo é empregado principalmente como matéria-prima em
ração. O farelo de trigo é um subproduto do processo de moagem industrial do grão, para a
obtenção da farinha de trigo. O farelo é rico em proteínas e carboidratos, porém não
apresenta quantidades significativas de lipídios. Sendo assim, é considerado um ótimo
substrato na fermentação em estado sólido (NANDINI & SALIMATH, 2001). A Tabela 1
apresenta os principais constituintes do farelo de trigo. A Tabela 2 apresenta os principais
constituintes da casca de arroz.
26
Tabela 1 Composição química do farelo de trigo.
Constituintes Farelo de trigo(%)
Lipídios 3,43
Proteínas (%N x 6,25) 19,79
Fibras 43,69
Carboidratos digeríveis 27,92
Cinzas 6,33
FONTE: RAUPP et al., (2000)
Tabela 2 Composição química da casca de arroz
Constituintes Casca de arroz (%)
Gordura 0,3 – 0,8
Proteína 2,0 – 2,8
Fibras 34,5 – 45,9
Carboidratos 22,0 – 34,0
Cinzas 13,2 – 21,0
FONTE: FAO (2011)
2.2 Surfactantes/Biossurfactantes
Os micro-organismos decompositores de hidrocarbonetos podem produzir
agentes de superfície ativa, os biossurfactantes. Esses agentes são moléculas pequenas de
surfactantes que afetam a redução das tensões superficial e interfacial, e macromoléculas
anfifílicas que estabilizam a emulsão (BENTO et al., 2005b).
Dentre os surfactantes existentes e que estão disponíveis no mercado, a sua
maioria são sintéticos e produzidos a partir de derivados de petróleo. Entretanto, o
crescimento da preocupação ambiental entre os consumidores, combinado com novas
legislações de controle do meio ambiente, levaram à procura por surfactantes naturais como
alternativa aos produtos já existentes. Os surfactantes são moléculas anfipáticas
constituídas de uma porção hidrofóbica e outra hidrofílica. A porção apolar é geralmente
uma cadeia hidrocarbonada, enquanto que a porção polar pode ser iônica (aniônica ou
catiônica), não iônica ou anfótera (NITSCHKE & PASTORE, 2002; DESAI & BANAT, 1997).
Os surfactantes formam uma classe importante de compostos químicos
amplamente utilizados em diversos setores industriais (NITSCHKE & PASTORE, 2002).
27
BOGNOLO (1999) afirma que 70 a 75% dos surfactantes produzidos quimicamente são
consumidos por países industrializados.
COSTA (2004) utilizando o fungo filamentoso Aspegillus fumigatus, em meio
sem fonte adicional de carbono, obteve resultado satisfatório na indução a produção de
biossurfactantes.
O uso de biossurfactantes microbianos vêm crescendo durante a última década.
Além de sua aplicação modelar como emulsificantes de hidrocarbonetos, estes podem ser
usados na proteção ambiental, recuperação de óleo cru, processamento de alimentos,
indústria de produtos de limpeza e em vários campos da biomedicina (CAMEOTRA &
MAKKAR, 2004).
Monômeros de surfactantes desenvolvem estruturas esféricas ou laminares com
pseudofase orgânica no seu interior, de acordo com a Figura 3 (CHAMPION, 1995). Este
fato coincide com a menor tensão superficial e interfacial atingida, como pode ser observado
na Figura 4. A mínima concentração em que isso ocorre é denominada de concentração
micelar crítica (CMC) (MULLIGAN et al., 2001).
Figura 3 Estruturas básicas formadas por biossurfactantes
FONTE: CHAMPION et al. (1995)
28
Figura 4 Diagrama esquemático da variação da tensão superficial, interfacial e solubilidade
em função da concentração de surfactante. FONTE: MULLIGAN, 2005
Segundo Mulligan et al. (2001) o item mais utilizado para avaliar a eficiência de
um surfactante é a concentração micelar crítica (CMC) que pode variar de 1 a 200 mg.L-1,
que se caracteriza como sendo a solubilidade de um surfactante dentro da fase aquosa ou a
concentração mínima requerida para atingir a mais baixa tensão superficial ou interfacial.
Moléculas de surfactantes em solução aquosa, ao atingirem a concentração
micelar crítica passam a se agruparem na forma de micela, estas são as responsáveis pela
solubilização das gorduras. Razão principal que leva os monômeros de surfactante se
integrar sob a forma de micela é a diminuição da área de contato entre as cadeias
hidrocarbônicas do surfactante e a água.
Os surfactantes iônicos possuem dois tipos de comportamento em solução aquosa.
Abaixo da CMC, os monômeros comportam-se como eletrólito forte. Após a micelização,
cada monômero adicionado contribui para a formação de micelas. A micela não é
completamente ionizada, apenas uma fração, a de íons fica livre na solução. Após a CMC o
incremento da condutividade da solução com a adição de surfactante é menor. Acima da
CMC, a solubilidade do óleo aumenta devido à agregação das micelas de surfactantes
(MULLIGAN et al., 2001).
Segundo Cameotra & Makkar (2004) o mecanismo de atuação da maioria destas
combinações ainda não está bem esclarecido, embora seja provável que as propriedades de
superfície da membrana representem um papel importante.
29
2.2.1 Classificação e propriedades dos biossurfactantes
Biossurfactantes são emulsificantes naturais de hidrocarbonetos e podem ser
produzidos por bactérias, bolores e leveduras. São polímeros, total ou parcialmente
extracelulares (BICCA et al., 1999).
Segundo Banat (2000), os biossurfactantes podem ser classificados como:
a) glicolipídios, como por exemplo, trealose, soforose e raminopídio;
b) lipossacarídios, como os emulsificantes que possuem alta massa molar,
produzidos extracelularmente pela degradação de hidrocarbonetos por bactérias tais como
Acinetobacter calcoaceticos;
c) lipopeptídeos, como o Subtilisin, produzido pelo Bacillus subtilis, tido como o
biossurfactante mais ativo conhecido até este momento;
d) fosfolipídios, que, apesar de presente em muitos micro-organismos, existem
poucos exemplos de produção extracelular, sendo o mais notável deles, o biossurfactante
produzido pelo Corynebacterium lepus;
e) ácidos graxos e lipídios neutros, como o ácido ustálgico, ácidos
corinomicolicos e as proteínas hidrofóbicas.
As principais classes de micro-organismos envolvidos na produção de
biossurfactantes estão mostradas na Tabela 3.
Micro-organismos sintetizam uma ampla variedade de bioemulsificantes de alta e
baixa massas molares. Os bioemulsificantes de alta massa molar são polissacarídios
anfipáticos, proteínas, lipopolissacarídios, lipoproteínas ou misturas complexas desses
biopolímeros. Os bioemulsificantes de baixa massa molar são geralmente glicolipídios como
trealose, lipídios, soforolipídios e raminolipídios, ou lipopeptídios como a surfactina. Os
bioemulsificantes de alta massa molar são mais efetivos para estabilizar emulsões óleo em
água, enquanto que os de baixa massa molar reduzem as tensões superficial e interfacial
(ROSENBERG & RON, 1999). A Figura 5 apresenta as estruturas de alguns
biossurfactantes.
30
Tabela 3 Principais classes de biossurfactantes e micro-organismos envolvidos
Tipo de Biossurfactante Micro-organismo
Glicolipídios
- ramnolipídios Pseudomonas aeruginosa
- soforolipídios Torulopsis bombicola, T. apicola
- trehalolipídios Rhodococcus erythropolis, Mycobacterium
sp.
Lipopeptídios e lipoproteínas
- Peptídio-lipídio Bacillus licheniformis
- Viscosina Pseudomonas fluorescens
- Serrawetina Serratia marcescens
- Surfactina Bacillus subtilis
- Subtilisina Bacillus subtilis
- Gramicidina Bacillus brevis
- Polimixina Bacillus polymyxa
Ácidos graxos, lipídios neutros e
fosfolipídios
- Ácidos graxos Corynebacterium lepus
- Lipídios neutros Nocardia erythropolis
- Fosfolipídios Thiobacillus thiooxidans
Surfactantes poliméricos
- emulsan Acinetobacter calcoaceticus
- biodispersan Acinetobacter calcoaceticus
- liposan Candida lipolytica
- carboidrato-lipídio-proteína Pseudomonas fluorescens
- manana-lipídio-proteína Candida tropicalis
Surfactantes particulados
- vesículas Acinetobacter calcoaceticus
- células Várias bactérias
FONTE: NITSCHKE & PASTORE (2002)
31
(a)
Mono-raminolipídio
Di-raminolipídio
(b)
(c)
(d)
Figura 5 Estruturas químicas de alguns biossurfactantes: (a) raminolipídios, (b)
soforolipídios, (c) lipopeptídio e (d) surfactina.
FONTE: SANDOVAL et al., (1999); CAMEOTRA & MAKKAR (1998); BOGNOLO (1999);
HEALY et al., (1996); KOWALL et al., (1998)
32
Surfactantes sintéticos são estruturas relativamente recentes, apresentam
propriedades que proporcionam avanços nos mais diversos ramos industriais, porém a sua
substituição pelos surfactantes biológicos apresenta vantagens por serem menos tóxico,
menos alergênicos, biodegradáveis, o que reflete em um menor impacto ambiental
(TURKOVSKAYA et al., 1999).
Os biossurfactantes vêm sendo testados em aplicações ambientais tais como a
biorremediação, na dispersão de efluentes oleosos, na otimização e recuperação de óleos e
transferência de óleo cru, e são possíveis e prováveis pretendentes a substituir os
surfactantes químicos no futuro em vários setores industriais (MAKKAR & CAMEOTRA,
2002).
Segundo Bognolo (1999) opondo-se aos surfactantes químicos, destacam-se
algumas vantagens dos biossurfactantes frente aos sintéticos, tais como:
- Tolerância à temperatura: alguns biossurfactantes e sua atividade superficial
não são afetados, mesmo a altas temperaturas (90 ºC);
- Tolerância a força iônica: os biossurfactantes não precipitam em soluções
salinas de até 10%, enquanto que soluções de 2-3% de sal são suficientes para desativar os
surfactantes químicos;
- Biodegradabilidade: os biossurfactantes são facilmente degradados tanto na
água quanto no solo;
- Emulsões feitas com biossurfactantes podem ser facilmente quebradas por
adição de enzimas, como, por exemplo, a depolimerase, que pode quebrar a emulsão de
hidrocarbonetos em óleo.
O potencial de aplicação de compostos de superfície ativa, produzidos a partir de
micro-organismos, é baseado nas propriedades de emulsificação, separação,
umedecimento, solubilização, de-emulsificação, inibição de corrosão, redução de
viscosidade de líquidos e redução da tensão superficial. Essas propriedades são aplicadas
em campos diversos da agricultura, construção, nas indústrias alimentícias, de bebidas,
papel, metal, têxtil, farmacêutica, cosmética e podem ser utilizados na formulação de
xampus, géis de cabelos, desodorantes e loções pós-barba (NITSCHKE & PASTORE, 2002;
MULLIGAN et al., 2001; BOGNOLO, 1999).
Devido à demanda pelos consumidores, os emulsificantes naturais estão se
tornando cada vez mais importantes na indústria alimentícia frente aos agentes
emulsificantes sintéticos, para os quais a popularidade está diminuindo, devido ao perigo
potencial que representam à saúde humana (LUKONDEH et al., 2003).
33
A Tabela 4 mostra as propriedades de micro-organismos quanto ao tipo de
biossurfactante produzido por estes alem da tensão superficial, concentração micelar crítica
e tensão interfacial.
Tabela 4 Fontes microbianas e propriedades de biossurfactantes
Biossurfactante Micro-organismo Tensão superficial
(mN.m-1)
CMC
(mg.L-1)
Tensão interfacial
(mN.m-1)
Glicolipídios
Raminolipídios P. aeruginosa
Pseudomonas sp.
29
25-30
0,1-10
0,25
1
Trealose
lipídios
R. erythropolis
N. erythropolis
Mycobacterium sp.
32-36
30
38
4
20
0,3
14-17
3,5
15
Soforolipídios T. bombicola
T. apicola
T. petrophilum
33
30
1,8
0,9
Lipopeptídios e
lipoproteínas
Lipopeptídio
Viscosina
Surfactina
Subtilisina
B. licheniformis
P. fluorescens
B. subtilis
B. subtilis
27
26,5
27-32
12-20
150
23-160
0,1-0,3
1
Ácidos graxos C. lepus 30 150 2
Lipídios
neutros
N. erythropolis 32 3
Fosfolipídios T. thiooxidans
Surfactantes
poliméricos
Emulsan
Biodispersan
Liposan
A.calcoaceticus
A.calcoaceticus
C. lipolytica
CMC: Concentração micelar crítica. FONTE: DESAI & BANAT (1997)
Na indústria alimentícia, os biossurfactantes são empregados como
emulsificantes no processamento de matérias-primas. Compostos de superfície ativa são
utilizados em produtos de panificação e cárneos, onde os mesmos influenciam as
34
características reológicas da farinha ou emulsificam a gordura presente. Um
bioemulsificante obtido da Cândida utilis tem sido utilizado em molhos de saladas (MAKKAR
e CAMEOTRA, 2002). A emulsificação tem um papel importante na formação da
consistência e textura, bem como na dispersão de fases e na solubilização de aromas
(BANAT, 2000).
Um dos usos para os biossurfactantes que tem recebido constante atenção é
conhecido por MEOR (Microbial-Enhanced Oil Revovery), cujo processo envolve a
introdução de micro-organismos em reservatórios de óleo cru para melhorar a mobilização
da borra oleosa e recuperar frações de hidrocarbonetos. A indústria petrolífera é o maior
mercado para os biossurfactantes, onde são utilizados diretamente na produção de petróleo
ou são incorporados nas formulações de óleos lubrificantes (DYKE et al., 1991). Outro uso
está relacionado com o potencial de recuperação de derivados de petróleo na limpeza de
tanques, preparo de misturas óleo-álcool para combustíveis e dispersão de óleos
derramados em ecossistemas aquáticos (LIMA, 1996).
A concentração micelar crítica (CMC) dos biossurfactantes geralmente varia de 1
a 200 mg.L-1 (LANG & WAGNER, 1993), sendo considerada pequena quando comparada
com a de surfactantes químicos, conforme mostra a Tabela 6. A CMC de um biossurfactante
é critério de avaliação de sua eficiência (FOX & BALA, 2000).
Tabela 5 Comparação entre CMCs de biossurfactantes e surfactantes químicos
Origem Tipo de surfactante CMC (mg.L-1)
Natural Raminolipídios 20
Surfactina 11
Química Sulfato de alquilbenzeno linear 590
Sódio lauril sulfato 2000-2900
FONTE: BOGNOLO (1999)
2.2.2 Produção de biossurfactante
Os biossurfactantes são produzidos principalmente por micro-organismos
aeróbios, em meio aquoso, a partir de uma fonte de carbono. Como exemplo, tem-se os
carboidratos, hidrocarbonetos, óleos e gorduras ou mistura destes. Os emulsificantes são
excretados extracelularmente ou como parte da membrana celular durante o crescimento do
micro-organismo, ajudando no transporte de substratos insolúveis através da membrana
celular (BOGNOLO, 1999).
35
Os biossurfactantes podem ser produzidos extra ou intracelularmente, durante o
crescimento do micro-organismo em diferentes substratos, podendo estes variar desde
carboidratos até hidrocarbonetos (COOPER, 1986). A maioria dos biossurfactantes são
liberados no meio de cultura durante o estado estacionário, ou então na fase de crescimento
exponencial (RON & ROSENBERG, 2002; CAMEOTRA & MAKKAR, 1998).
A produção de biossurfactante requer o desenvolvimento de processos
economicamente viáveis e o uso de materiais de baixo custo, visto que estes correspondem
a aproximadamente 30% do custo total de produção. Substratos adicionais têm sido
sugeridos para a produção de biossurfactantes, especialmente resíduos agroindustriais.
Também têm sido evidenciados estudos utilizando efluentes de indústrias contendo resíduos
oleosos, gordura animal, soro de leite, resíduos ricos em amido, entre outros (MANEERAT,
2005; MAKKAR & CAMEOTRA, 2002).
Os biossurfactantes apresentam diferentes propriedades químicas e tamanhos
moleculares. Enquanto os surfactantes microbianos de baixa massa molar são em geral
glicolipídios, os de alta massa molar são heteropolissacarídios ou complexos glicoprotéicos.
O rendimento dos biossurfactantes depende do substrato utilizado para a produção, do
crescimento microbiano e da linhagem utilizada (KARANTH et al., 1999).
Alguns micro-organismos podem produzir biossurfactantes quando crescem em
diferentes substratos, estes podem variar desde carboidratos até hidrocarbonetos. A
mudança de substratos altera a estrutura do biossurfactante e consequentemente, as
propriedades emulcionantes. Estas mudanças podem ser benéficas quando se deseja
propriedades específicas para uma aplicação direcionada (COOPER, 1986).
Os hidrocarbonetos e carboidratos estão envolvidos na síntese das porções
hidrofóbicas e hidrofílicas, respectivamente, das moléculas de biossurfactantes. Os
caminhos para a síntese desses dois grupos de precursores são diversos e utilizam grupos
específicos de enzimas. Em muitos casos, as primeiras enzimas para a síntese desses
precursores são enzimas regulatórias; portanto, apesar da diversidade, existem algumas
características comuns da sua síntese e regulação. As seguintes possibilidades existem
para a síntese das diferentes porções das moléculas de biossurfactantes e seu
acoplamento: (a) as porções hidrofóbicas e hidrofílicas são sintetizadas de forma
independente; (b) a porção hidrofílica é sintetizada enquanto a síntese da porção hidrofóbica
é induzida pelo substrato; (c) a porção hidrofóbica é sintetizada, enquanto a síntese da
porção hidrofílica é dependente do substrato; e (d) a síntese de ambas as porções
hidrofóbica e hidrofílica é dependente do substrato (DESAI & BANAT, 1997).
Segundo Raghavarao (2003) o cultivo submerso com bactérias é predominante
para a produção de biossurfactante. Porém, bactérias e leveduras podem crescer em
36
substratos sólidos em níveis de 40 – 70% de umidade. Os fungos filamentosos têm recebido
a maioria das atenções nas pesquisas utilizando fermentação em estado sólido, pois podem
crescer na ausência de água livre.
2.2.3 Fatores que diferenciam na produção de biossurfactantes
Estudos têm indicado que o meio e as condições de crescimento podem
influenciar o tipo e o rendimento dos biossurfactantes produzidos. O crescimento celular e o
acúmulo de produtos metabólicos são fortemente influenciados pelos constituintes do meio,
como as fontes de carbono, de nitrogênio e de outros nutrientes. Fatores ambientais e
condições de crescimento como o pH, temperatura, agitação e disponibilidade de oxigênio
também afetam a produção de biossurfactante (RODRIGUES et al., 2006; DESAI & BANAT,
1997).
Para que ocorra um aumento na produção de biossurfactantes é de fundamental
importância o estudo de parâmetros nutricionais que mostrem as mais adequadas e
melhores condições para o desenvolvimento do processo.
2.2.3.1 Temperatura
A temperatura é um dos parâmetros mais importantes na regulação para o
desenvolvimento das atividades microbianas, em ambientes naturais. A temperatura tem
influencia direta na taxa de crescimento dos micro-organismos, bem como na atividade
enzimática, composição celular, produção de metabólitos e requerimentos nutricionais.
As cepas dos micro-organismos termofílicos são capazes de sobreviver e
crescer a temperaturas que variam de 42 a 100 ºC. Nos estudos realizados por Acevedo &
Mclnerney (1996) com a finalidade de determinar a capacidade de micro-organismos
termofílicos de produzirem biossurfactante e/ou bioemulsificante, isolou-se bioemulsificante
de Methanobacterium thermoautotrophium, o qual foi ativo a temperaturas acima de 80 ºC.
Os emulsificantes foram eficazes na formação de emulsões viscosas, mas não na redução
da tensão superficial da água e a tensão interfacial entre água e hexadecano.
Cameotra & Makkar (1998) depois de selecionar mais de 22 micro-organismos
sob condições termofílicas citaram a produção de biossurfactantes surfactina produzido por
duas cepas de Bacillus subtilis. A atividade superficial destas cepas foi de 27 mNm1 e
evidenciou suas capacidades como produtoras de biossurfactantes. Os biossurfactantes
produzidos por estas cepas foram estáveis, demonstrando a capacidade destes micro-
organismos de crescerem em condições termofílicas.
37
Micro-organismos psicrófilos têm uma temperatura ótima de crescimento de 15
ºC ou menos, uma temperatura máxima de crescimento de aproximadamente 20 ºC e uma
temperatura mínima para o crescimento de 0 °C ou menos. Bactérias psicrófilas têm sido
isoladas de diversos ambientes naturais. Pruthi & Cameotra (1997) estudaram a produção
de biossurfactantes por Arthrobacter (uma cepa Antártica). O biossurfactante foi produzido
durante o crescimento do micro-organismo em uma fonte de carbono imiscível em água, n-
hexadecano, e foi capaz de reduzir a tensão superficial do meio de 68,0 para 30,6 mN.m-1 e
mostrou ótima capacidade emulsificante.
2.2.3.2 pH
O controle do pH do meio de cultivo tem se mostrado importante na produção de
biossurfactantes. Estudos mostraram que a máxima produção de ramnolipídios por
Pseudomonas spp foi obtida na faixa de pH entre 6,0-6,5 o que não foi constatado em pH
acima de 7,0. Mas quando utilizado Nocardia corynbacteroides, a faixa de pH de 6,5 a 8,0
não afetou a produção de biossurfactantes, e também verificou-se que o biossurfactante
permaneceu estável sobre uma larga faixa de pH (DESAI & BANAT, 1997).
2.2.3.3 Aeração
Em estudos realizados por Adamczak & Bednarski (2000) foi verificado que o
rendimento de biossurfactantes produzidos por Candida antarctica na fermentação
submersa dependiam especialmente da fonte de carbono e condições de aeração no meio
de cultivo. Testes utilizando taxas de aeração de 1 e 2 vvm foram realizados, e observaram
que o maior rendimento na produção de biossurfactantes foi alcançado com aeração de 1
vvm.
Veenanadig et al. (2000) estudaram a produção de biossurfactante, através de
fermentação em estado sólido, por Bacillus subtilis em biorreator de coluna contendo farelo
de trigo como meio de cultivo, testando diferentes vazões de aeração, variando de 10 a 20
L.min-1. Os resultados obtidos mostraram que a vazão de ar de 20 L.min-1 proporcionou
maior produção de biossurfactante.
As bactérias do gênero Corynebacterium são parasitas obrigatórios das
membranas, mucosas e pele de mamíferos, embora possam ser ocasionalmente,
encontradas em outras fontes. Podem apresentar células retas ou levemente curvadas,
arranjadas sozinhas ou em pares frequentemente no formato V, ou em várias células
paralelas. São anaeróbias facultativas e comumente requerem meios ricos nutricionalmente
38
(HOLT et al., 1994). Estas evidências explicam o alto crescimento da bactéria
Corynebacterium aquaticum em meio sólido encontrado, já que a mistura farelo de trigo e
casca de arroz suplementada com solução nutriente propicia um meio altamente nutritivo.
Apesar do gênero ser anaeróbio facultativo, observou-se que a espécie estudada se
desenvolve melhor quando o cultivo sólido é aerado. Células levemente curvadas ou unidas
no formato V podem ter facilitado a aderência, bastante visível, nas partículas sólidas do
meio. A aeração forçada é utilizada para remoção de calor do biorreator, e também para
suprir a demanda de oxigênio e remoção de gás carbônico (PINTO, 2008)
2.2.3.4 Fonte de carbono
A fonte de carbono é um dos fatores mais importantes para a produção de
biossurfactantes. A composição do meio de cultivo tem influência na quantidade e
características dos biossurfactantes produzidos. A fonte de carbono comumente usada pode
ser dividida em três categorias: carboidratos, hidrocarbonetos e óleos vegetais. Alguns
micro-organismos produzem biossurfactantes somente utilizando fonte de carbono
hidrofóbica, hidrocarbonetos ou óleos vegetais, outros somente usam carboidratos, e outros
ainda usam diversas fontes de carbono, em combinação ou individualmente (KIM et al.,
1997).
Bonilla et al (2005) avaliaram a produção de biossurfactantes por Pseudomonas
putida ML2, em meios contendo etanol, glicerol, fenantreno e naftaleno, e verificaram que o
surfactante foi produzido somente em glicerol, etanol e naftaleno.
Produção de biossurfactantes pela bactéria Rhodococcus ruber e Rhodococcus
erythropolis foi estudada por Bicca et al (1999) utilizando diferentes fontes de carbono
(querosene, heptano, pentano, benzeno, diesel e óleo lubrificante). Os resultados obtidos
mostraram que esta bactéria foi capaz de crescer e produzir biossurfactantes em todos os
substratos utilizados.
Estudo realizado por Spoeckner et al. (1999) avaliaram a produção de
biossurfactantes do tipo glicolipídios pelo fungo Ustilago maydis crescendo em óleo de
girassol e em seus derivados. Rendimento de 30 g.L-1 de glicolipídios foi alcançado
utilizando 45 g.L-1 de ácidos graxos de óleo de girassol. Estudos iniciais demonstraram que
Ustilago maydis foi capaz de crescer em triglicerídeos contendo ácido oléico, metil ésteres
ou ácidos graxos livres.
39
2.2.3.5 Fonte de nitrogênio
A fonte de nitrogênio afeta a produção de biossurfactante, tanto na quantidade
como na sua composição. Em estudos realizados para avaliar o efeito da fonte de nitrogênio
na produção de biossurfactante por Pseudomonas aeruginosa e Rhodococcus spp., foi
verificado que as máximas produções foram alcançadas utilizando nitrato como fonte de
nitrogênio (DESAI & BANAT, 1997).
Fernandes et al. (2005) avaliaram o efeito da concentração de nitrogênio na
produção de biossurfactante ramnolipídico por Pseudomonas aeruginosa LBI, quando
cultivada em resíduos do refino de óleos vegetais, testado em diferentes concentrações de
nitrato de sódio (NaNO3 ) (4, 5, 6 e 7 g.L-1), onde verificaram que a concentração de 4 g.L-1
foi obtido o maior rendimento do bioproduto.
Em estudos realizados por Makkar & Cameotra (1997), em diferentes fontes de
nitrogênio (0,3%) foram testadas na produção de biossurfactantes por Bacillus subtilis, onde
verificaram que nitrato de sódio, nitrato de potássio e uréia foram as melhores fontes de
nitrogênio testadas.
Entre as fontes de nitrogênio de sais inorgânicos testados as que obtiveram
melhor resultado para a produção de biossurfactantes por Arthrobacter paraffineus ATCC
19558 foram a uréia e sais de amônio (BENTO et al., 2006). A limitação de nitrogênio no
meio de cultivo do micro-organismo também pode auxiliar na produção de biossurfactantes
(BENTO et al., 2006).
2.2.3.6 Concentração salina
Certo grupo de micro-organismos pode crescer e continuar a viver sob uma
ampla faixa de concentração salina (CAMEOTRA & MAKKAR 1998), estudaram o
isolamento de bactéria hidrocarbonoclástica halófila, mostrando que a metabolização do
hidrocarboneto pode ocorrer em condições hipersalinas.
Abu-Ruwaida et al. (1991) verificaram que concentrações salinas afetaram a
produção de biossurfactantes. Alguns biossurfactantes, no entanto, não foram afetados por
concentrações salinas acima de 10%, embora pequenas reduções nas CMCs fossem
detectadas. Já Yakimov et al. (1995) citado por Cameotra & Makkar (1998), estudaram a
produção de surfactantes lipopeptídios por Bacillus licheniformis, e verificaram que esta
cepa foi capaz de produzir biossurfactantes em concentrações salinas superiores a 13%.
Cameotra & Makkar (1997) analisaram a produção de biossurfactante por
Bacillus subtilis em diferentes concentrações de NaCl (0,01- 4%), e foi verificado que altas
40
concentrações de NaCl no meio de cultivo não afetaram a capacidade do micro-organismo
em sintetizar o biossurfactante. No entanto, a biossíntese destes compostos foi reduzida em
concentração de 4% de NaCl.
2.3 Biorremediação
A biorremediação é o processo de tratamento que utiliza micro-organismos para
decompor substâncias toxicamente perigosas transformando-as em substâncias menos ou
não tóxicas. Os biossurfactantes vêm sendo testados na biorremediação como uma
alternativa eficiente no tratamento de regiões contaminadas pela presença de petróleo e
seus derivados (MARTINS et al., 2003).
De acordo com Balba et al. (1998) quando se utiliza biossurfactantes no
tratamento de solos contaminados, estes apresentam várias vantagens com relação aos
surfactantes sintéticos e que o sucesso da sua utilização dependerá do conhecimento dos
mecanismos dos biossurfactantes a serem empregados em áreas com determinadas
propriedades físicas e químicas.
A biorremediação de petróleo é carreada por micro-organismos capazes de
utilizar hidrocarbonetos como fonte de carbono e energia. Estes micro-organismos são
capazes de degradar vários tipos de hidrocarbonetos, tanto os de cadeia curta como as de
cadeia longa, e inúmeros compostos aromáticos. Sendo assim, não é surpreendente que os
micro-organismos que crescem sobre substratos imiscíveis em água comumente produzem
emulsificantes potenciais. Os surfactantes produzidos ajudam a dispersar o óleo,
aumentando a área superficial para o crescimento e ajudam a desprender o micro-
organismo do óleo (RON & ROSENBERG, 2002).
A biorremediação envolve a aceleração de processos biodegradativos naturais
em ambientes contaminados pela melhoria da disponibilidade de materiais (nutrientes e
oxigênio), condições (pH e umidade), e a predominância de micro-organismos. Desta
maneira, a biorremediação usualmente consiste na aplicação de fertilizantes como
nitrogênio e fósforo, ajustando o pH e conteúdo de água, se necessário, fornecendo ar e
frequentemente adicionando micro-organismos. A adição de emulsificantes é vantajosa
quando o crescimento bacteriano é lento (a temperaturas baixas ou na presença de altas
concentrações de poluentes), ou quando os poluentes consistem em compostos que são de
difícil degradação, como os hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs) (RON &
ROSENBERG, 2002).
Solos contaminados por óleo é um problema comum, porém, as técnicas que
envolvem escavação, incineração, entre outros, podem ser complicadas ou
41
economicamente inviáveis. Os métodos mais econômicos incluem as biorremediações in
situ (BANAT, 1995). No entanto, tratamentos biológicos surgem para ser um dos mais
promissores métodos no processo de degradação de contaminantes orgânicos. A tecnologia
é ainda ambientalmente segura, pois resulta em compostos inócuos (BALBA et al., 1998).
A biorremediação é uma alternativa para a remoção dos HAPs do solo, na qual
os micro-organismos degradadores irão transformá-los em substâncias inertes, CO2 e água.
Em vista da maioria dos micro-organismos do solo não possuírem a capacidade de degradar
estes compostos, há necessidade de se isolar e selecionar os micro-organismos
degradadores. A baixa biodisponibilidade de HAPs aos micro-organismos degradadores,
devido à sorção à fase sólida orgânica ou mineral do solo, também pode limitar a
biorremediação. Visando superar todas estas limitações bióticas e abióticas que influenciam
a biorremediação, foram desenvolvidas várias técnicas, entre estas a biorremediação
passiva, a bioaumentação, a bioestimulação, a fitorremediação, o landfarming, a
compostagem e o uso de biorreatores (JACQUES et al., 2007)
Rodrigues et al. (2002) demonstraram que os fungos Aspergillus fumigatus e
EFB1 possuem capacidades de crescer e degradar fontes de carbono hidrofóbicas, tais
como, óleo de soja, óleo diesel, hexano e tolueno.
Martins (2005) realizou um experimento de biorremediação in situ de um solo
contaminado por óleo diesel, utilizando biossurfactante produzido pelo fungo filamentoso
Aspergillus fumigatus. Os resultados obtidos demonstraram a eficiência do biossurfactante,
tanto na redução de hidrocarbonetos alifáticos que foi de 99% em 180 dias e para a redução
da concentração de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs), com 3 anéis de 99%
em um período de 15 dias.
2.3.1 Aceptores de Elétrons na biorremediação Anóxica
Os micro-organismos aeróbios precisam da presença de oxigênio molecular para
seu crescimento e para converter os hidrocarbonetos em CO2, H2O e biomassa. Já os micro-
organismos facultativos podem crescer na presença (aerobiose) ou ausência (anaeróbios)
de oxigênio (BERTHE-CORTI & FETZNER, 2002; PETERS et al., 2005).
Os micro-organismos anaeróbios estritos utilizam diferentes aceptores como,
nitratos (NO3-), sulfatos (SO4
2-) e íons férricos (Fe3+) para metabolizar hidrocarbonetos.
Enquanto, outros anaeróbios (aero tolerantes) crescem na presença de concentrações-
traços de oxigênio dissolvido, porém não utilizam este gás metabolicamente (MADIGAN et
al., 1997; BERTHE-CORTI & FETZNER, 2002).
42
Vários compostos orgânicos, incluindo o tolueno, são rapidamente degradados
em condições aeróbicas, onde o oxigênio serve como aceptor de elétron durante a
biorremediação (MESTER, 1995).
Segundo Alexander (1999) em certos ambientes contaminados a propagação de
oxigênio dentro dos solos é insuficiente para manter os níveis necessários da atividade
aeróbica para a efetiva remediação. Na ausência de oxigênio, a biodegradação pode ocorrer
numa variedade de meios anaeróbicos que incluem a desnitrificação, redutores de sulfato,
metanogênicos e redutores do ferro
Já Chayabutra & Ju (2000) propuseram uma estratégia para a biorremediação
sequencial de hidrocarbonetos. Relataram que existe uma necessidade inicial do oxigênio
para o início da biorremediação e que os metabólitos podem então ser degradados sob
condições anaeróbicas quando tratados com aceptores alternativos de elétron e altamente
solúveis em água.
Ball & Reinhard (1996) concluíram que o excesso de utilização de aceptores é
uma importante observação, já que o requerimento total de aceptor de elétron pode ser
muitas vezes maior que a estequiometria teórica.
A Tabela 7 mostra alguns micro-organismos, seus aceptores de elétrons e os
principais produtos gerados a partir da biodegradação de componentes do petróleo
(HOLLAND et al., 1987).
Tabela 6 Aceptores de elétrons utilizados por diferentes micro-organismos na
biodegradação de hidrocarbonetos
Micro-organismos Aceptores de elétrons Produtos
Aeróbios O2 CO2
Metanogênicas - CH4 e CO2
Metanogênicas CO2 CH4
BRS SO42- H2S
Denitrificantes (Veillonella alcalescens,
Selenomonas ruminantium, Clostridium
perfringens)
NO3- NO2
-
Denitrificantes (Propionibacterium pentosaceum) NO2- N2
Outros anaeróbios Fumarato Succinato
FONTE: Adaptado de HOLLAND et al. (1987)
43
2.3.2 Utilização de Nitrato como Aceptor de Elétrons
A desnitrificação é uma opção atrativa para a biorremediação in situ de solos.
Bactérias desnitrificantes estão presentes nos solos e geralmente exibem extensa
capacidade metabólica. Nitrato (NO3-) é um ânion altamente solúvel em água, que dispersa
rapidamente em solos úmidos e serve como aceptor de elétron para biodegradação.
Durante a biodegradação do contaminante, o nitrato é reduzido através de uma série de
passos para nitrito, óxido nitroso e então gás nitrogênio, com a oxidação concomitante do
substrato carbonado (ALEXANDER, 1999).
O nitrato tem sido pesquisado e indicado para ser uma fonte efetiva de energia
para a degradação dos hidrocarbonetos aromáticos (DOLFING et al., 1990). O seu uso é
conveniente, pois o nitrato é altamente solúvel em água e, portanto pode ser facilmente
misturado com a pluma (CORSEUIL, 1994). Ball & Reinhard (1996) estudaram a
biotransformação anaeróbica de muitos hidrocarbonetos aromáticos encontrados na
gasolina, incluindo benzeno, tolueno, etilbenzeno, m-xileno, p-xileno e o-xileno (BTEX) em
ensaios anaeróbicos de bancada em laboratório. Foram utilizados os aceptores de elétrons
sulfato e nitrato, foram definidos vários meios anaeróbicos para estimar as taxas de
biodegradação e para sugerir as condições sob as quais a biorremediação anaeróbica
poderia aumentar. A adição de nitrato estimulou as condições redutoras de nitrato e
incrementou as taxas de biotransformação anaeróbica de tolueno do BTEX.
O Quadro 1 mostra algumas destas bactérias que são capazes de utilizar
hidrocarbonetos como fonte de carbono em ambientes anóxicos.
44
Quadro 1 Bactérias anaeróbias que utilizam hidrocarbonetos como fonte de carbono
Bactéria Hidrocarboneto Tipo de metabolismo Referência
Azoarcus sp. EB1 Etilbenzeno Denitrificante Ball et al., 1996
Dechloromassp. JJ Benzeno,
tolueno Denitrificante Coates et al., 2001
Cepa OcN1 C8-C12 Denitrificante Ehrenreich et al., 2000
Marinobacter sp.
BC36 -C18 Denitrificante Bonin et al., 2004
Pseudomonas sp.
NAP-3 Naftaleno Denitrificante Rockne et al., 2000
Marinobacter sp.
BC42 C6-C15 Denitrificante Bonin et al., 2004
Cepa TD3 C8-C12 Sulfato-redutora Rueter et al., 1994
Cepa Hxd3 C12-C20 Sulfato-redutora Aeckersberg et al.,
1991
Cepa Pnd3 C14-C17 Sulfato-redutora Aeckersberg et al.,
1998
Desulfobacterium
cetonicum Tolueno Sulfato-redutora Rabus et al., 2001
Desulfatibacilum
aliphaticivorans
CV2803
C13-C18 Sulfato-redutora Cravo-Laureau et al.,
2004
Clone B1-B3 -C16 Metanogênica Zengler et al., 1999
FONTE: Adaptado de VAN HAMME et al., 2003 e WENTZEL et al., 2007
2.3.3 Dispersante químico
Os dispersantes são formulações químicas de natureza orgânica, destinadas a
reduzir a tensão superficial entre o óleo e a água, auxiliando a dispersão do óleo em
gotículas no meio aquoso. São constituídos por ingredientes ativos, denominados
surfactantes, cuja molécula é composta por uma cadeia orgânica, basicamente apolar, com
afinidade por óleos e graxas (oleofílica) e uma extremidade de forte polaridade, com
afinidade pela água (hidrofílica). Além dos surfactantes, os dispersantes também são
constituídos por solventes da parte ativa que permitem a sua difusão no óleo (CETESB,
2003)
45
Outro dispersante químico é produzido por uma mistura de álcool e éster graxo
etoxilado este produto é especialmente desenvolvido para uso como dispersante para
derramamento de óleo no mar. Este dispersante apresenta HLB (balanço hidrofílico-
lipofílico), apropriado para favorecer a concentração do tenso-ativo concentrar-se na
interface óleo-água, reduzindo a tensão superficial e interfacial, com conseqüente aumento
da área de contato, e formação de gotas de óleo com diâmetro reduzido. Este efeito
promove uma excelente dispersão do óleo na água, que pode facilitar a metabolização pelos
micro-organismos presentes.
O dispersante químico possui algumas vantagens que justificam o seu uso:
- Alta eficiência na dispersão de óleo em água doce ou salgada;
- Ausência de aromáticos;
- Baixa toxidade na vida animal e aquática;
- Atende exigências internacionais como dispersante de óleos.
A Tabela 8 apresenta algumas propriedades físico-químicas de um dispersante
químico comercial.
Tabela 7 Propriedades físico-químicas do dispersante químico comercial
Características do Dispersante
Aspecto líquido Amarelado
Viscosidade (BKF, 20ºC, mPa.s-1) 125
pH, solução aquosa 5%, 5 a 7,5
Ponto de fulgor, vaso aberto (°C) 78
FONTE: JUNIOR (2008)
A Figura 6 mostra a ação de um surfactante comercial.
46
Figura 6 Representação da ação do dispersante sobre uma mancha de óleo (IPIECA, 1993).
2.4 Bioaumentação e bioestimulação
As duas abordagens gerais para a biorremediação são a bioestimulação e a
bioaumentação (BALBA et al., 1998; BENTO et al., 2005a).
O processo de bioestimulação consiste em introduzir nutrientes adicionais na
forma de fertilizantes em um sistema contaminado, o que causa o aumento da população de
micro-organismos nativos. Os hidrocarbonetos são, supostamente, decompostos mais
rapidamente do que no processo de degradação natural, devido à elevação do número de
micro-organismos causado pelo aumento dos níveis de nutrientes (SARKAR et al., 2005).
A bioaumentação ou a adição de micro-organismos que degradam óleo para
suplementar a população nativa, tem sido proposta como uma alternativa estratégica para a
biorremediação de ambientes contaminados com óleo. A razão para essa abordagem é que
populações microbiota nativa podem ser incapazes de degradadar a ampla variedade de
substratos presentes em misturas complexas como o petróleo (ZHU et al., 2004).
47
2.4.1 Aplicações dos biossurfactantes
O potencial de aplicação de compostos de superfície ativa, produzidos a partir de
micro-organismos são baseados em suas propriedades funcionais, que incluem:
emulsificação, solubilização, de-emulsificação, detergência, capalimentícias, farmacêuticas,
têxtil, cosmética e petrolífera (NITSCHKE & PASTORE, 2002).
Os biossurfactantes são usados na agricultura especialmente em formulações de
herbicidas e pesticidas. Os compostos ativos destas formulações são geralmente
hidrofóbicos, sendo necessários agentes emulsificantes para dispersá-los em soluções
aquosas (NITSCHKE & PASTORE, 2002).
Na indústria de alimentos, os biossurfactantes são geralmente utilizados como
emulsificantes. A emulsificação tem função importante na formação de textura e
consistência, bem como na dispersão de fases e na solubilização de aromas. Os agentes
tensoativos têm aplicação, por exemplo, em panificação e produtos derivados de carne,
onde influenciam as características reológicas da farinha e na emulsificação de gorduras
(NITSCHKE & PASTORE 2002; BANAT et al., 2000).
Atualmente, o maior mercado para os biossurfactantes é a indústria petrolífera,
onde são utilizados na produção de petróleo ou incorporados em formulações de óleos
lubrificantes. Aplicações de crescente interesse incluem biorremediação e dispersão em
derrames de óleos, remoção e mobilização de resíduos de óleo em tanques de estocagem,
e recuperação terciária de petróleo (NITSCHKE & PASTORE, 2000).
A Tabela 5 apresenta algumas funções e aplicações comerciais dos
biossurfactantes.
48
Tabela 8 Principais aplicações comerciais dos biossurfactantes
Funções Campos de aplicação
Emulsionantes e dispersantes Cosméticos, tintas, biorremediação, óleos, alimentos
Solubilizantes Produtos farmacêuticos e de higiene
Agentes molhantes e penatrantes Produtos farmacêuticos, têxteis e tintas
Detergentes Produtos de limpeza, agricultura
Agentes espumantes Produtos de higiene, cosméticos e flotação de minérios
Agentes espessantes Tintas e alimentos
Sequestrantes de metais Mineração
Formadores de vesículas Cosméticos
Fator de crescimento microbiano Tratamento de resíduos oleosos
Demulsificantes Tratamento de resíduos, recuperação de petróleo
Redutores de viscosidade Transporte em tubulações, oleodutos
Dispersantes Misturas carvão-água, calcáreo-água
Fungicida Controle biológico de fitopatógenos
Agentes de recuperação Recuperação terciária de petróleo (MEOR)
FONTE: BANAT et al. (2000); NITSCHKE & PASTORE (2002)
49
3 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABU-RUWAIDA A. S.; BANAT, I. M.; HADITIRTO, S.; KHAMIS, A. Nutritional requirements
and growth characteristics of a biosurfactant- producing Rhodococcus bacterium. World
Journal of Microbiology and Biotechnology, 7, 53–6, 1991.
ACEVEDO, T. G.; MCINERNEY, M. J. Emulsifying activity in thermophilic and extremely
thermophilic microorganisms. Journal of Industrial Microbiology, 16, 1 –7, 1996.
ADAMCZAK, M.; BEDNARSKI, W. Influence of medium composition and aeration on the
synthesis of biosurfactants produced by Candida antarctica. Biotechnology Letters 22, 313-
316, 2000.
ALEXANDER, M. Biodegradation and Biorremediation. Academic Press. 2º Ed., New York,
453p., 1999.
BALBA, M. T.; AL-AWADHI, N.; AL-DAHER, R. Biorremediation of oil-contamined soil:
microbiological methods for feasibility assessment and field evaluation. Journal of
Microbiological Methods, 32, 155-164, 1998.
BALL, H. A.; REINHARD, M. Monoaromatic Hydrocarbon Transformation Under Anaerobic
Conditions at Seal Beach. Environmental Toxicology and Chemistry, 15, 114-122, 1996.
BANAT, I. M. Biosurfactants Production and Possible Uses in Microbial Enhanced Oil
Recovery and Oil Pollution Remediation: A Review Biosurfactants Production and
Aplications. 1995.
BANAT, I. N.; MAKKAR, R. S.; CAMEOTRA, S. S. Potential commercial applications of
microbial surfactants. Applied Microbiology and Biotechnology, 53, 495-508, 2000.
BENTO, F. M.; CAMARGO, F. A. O.; GAYLARDE, C. C. Biossurfactantes. Microbiologia
ambiental, Embrapa, 2°Ed., 2006.
BENTO, F. M.; CAMARGO, F. A. O.; OKEKE, B. C.; FRANKENBERGER, W. T. Comparative
bioremediation of soils contaminated with diesel oil by natural attenuation, bioestimulation
and bioaumentation. Bioresource Technology. 96, 9, 1049-1055, 2005a.
BENTO, F. M.; CAMARGO, F. A. O.; OKEKE, B. C.; JÚNIOR, W. T. F. Diversity of
biosurfactant producing microorganisms isolated from soils contaminated with diesel oil.
Microbiological Research. 160, 249-255, 2005b.
BERTHE-CORTI, L.; FETZNER, S. Bacterial Metabolism of n-Alkanes and Ammonia under
Oxic, Suboxic and Anoxic Conditions. Acta Biotechnology. 2002, 3-4, 299-336.
50
BICCA, F. C.; FLECK, L. C.; AYUB, M. A. Z. Production of biosurfactant by hydrocarbon
degrading Rhodococcus ruber and Rhodococcus erythropolis. Revista de Microbiologia, 30,
231–236, 1999.
BITTENCOURT. L. Produção de Biossurfactante Bacteriano por Fermentação em Estado
Sólido e sua Aplicação em Biorremediação Graduação em Engenharia de Alimentos
Universidade Federal do Rio Grande-RS,2008.
BOGNOLO, G. Biosurfactants as emulsifying agents for hydrocarbons. Colloids and
Surfaces. 152, 41-52, 1999.
BONILLA, M.; OLIVARO, C.; CORONA, M.; VAZQUEZ, A.; SOUBES, M. Production and
characterization of a new bioemulsifier from Pseudomonas putida ML2. Journal of Applied
Microbiology, 98, 456-463, 2005.
BOOPATHY, R. Factors limiting bioremediation technologies. Bioresource Technology, 74,
63-67, 2000.
BORZANI, W. AQUARONE, E.; LIMA, U. A. Tecnologia das Fermentações. Vol. 1, São
Paulo-SP, Editora da Universidade de São Paulo, 1975.
CAMEOTRA, S. S.; MAKKAR, R. S. Recent applications of biosurfactants as biological and
immunological molecules. Current Opinion in Microbiology, 7, 262–266, 2004.
CAMEOTRA, S. S.; MAKKAR, R. S. Synthesis of biosurfactants in extreme conditions.
Applied Microbiology and Biotechnology, 50, 520-529, 1998.
CAMERINI, F. V; CHANIN, C. Produção de biossurfactantes fúngico por fermentação em
estado sólido. Trabalho de Conclusão de Curso em Engenharia de Alimentos. Universidade
Federal do Rio Grande-RS, 2005.
CASTIGLIONI, G. L. Modelagem e simulação da produção de biossurfactante e lipase por
fermentação em estado sólido. Dissertação de Mestrado em Engenharia e Ciência de
Alimentos. Universidade Federal do Rio Grande. Rio Grande-RS, 2006.
CERQUEIRA, V. S. Produção de biossurfactante por Aspergillus fumigatus cultivado em
estado sólido e avaliação da biorremediação em derrames de óleos e derivados.
Dissertação de Mestrado em Engenharia e Ciência de Alimentos. Universidade Federal do
Rio Grande. Rio Grande-RS, 2007.
CETESB. Derrames de óleo no mar: aspectos preventivos e corretivos. São Paulo-SP. p
299, 2003.
51
CHAMPION, J.T.; GILKEY, J.C.; LAMPARSKI, H.; RETTERER, J.; MILLER, R.M. Electron
microscopy of ramnolipid (biosurfactant) morphology: effects of pH, cadmium and
octadecane. Journal of Colloid and Interface Science, 170, 569-574, 1995.
CHAYABUTRA, C.; JU, L. Degradation of n-hexadecane and is metabolites by
pseudomonas aeruginosa under micro aerobic denitrifying conditions. Applied and
Environmental Microbiology, 66, 493-498, 2000.
COLLA, L. M. Otimização da produção biotecnológica de lipases e correlação com a
produção de biossurfactantes. Tese de Doutorado em Engenharia e Ciência de Alimentos.
Universidade Federal do Rio Grande. Rio Grande-RS, 2009.
COLLA, L. M.; COSTA, J. A. V. Obtenção e aplicação de biossurfactantes. Revista Vetor.
13, 85-103, 2003.
COOPER, D. G. Biosurfactants. Microbiological Sciences, 3, 5, 145-149, 1986.
CORSEUIL, H. X. Influência do Receptor de Elétrons na Biorremediação de Águas
Subterrâneas Contaminadas por Derramamentos de Gasolina. VI Simpósio Luso Brasileiro
de /engenharia Sanitária e Ambiental, Vol. I, p.68-75, Florianópolis, 1994.
COSTA, E. Produção de biossurfactante por fermentação em estado sólido utilizando fontes
de carbono fóssil e não fóssil. Dissertação de Mestrado em Engenharia e Ciência de
Alimentos. Universidade Federal do Rio grande. 2004.
COSTA, E. Produção e avaliação das propriedades de biossurfactantes produzido em
fermentação fúngica em estado sólido. Dissertação de Mestrado em Engenharia e Ciência
de Alimentos – Universidade Federal do Rio Grande. Rio Grande-RS, 2004.
COSTA, J. A. V. Produção de amiloglicosidase por fermentação em estado sólido em
biorreator de coluna. Tese de Doutorado em Engenharia de Alimentos – Universidade
Estadual de Campinas. Campinas-SP, 1996.
COSTA, R. J. Produção de Biossurfactante e Biorremediação. Graduação em
DAMAS, A.; ANTUNES, C.; SILVA, N.; ALVES, S. As marés negras e os seus efeitos tóxicos
na fauna marinha. Universidade Técnica de Lisboa, Faculdade de Medicina Veterinária,
1999/2000.
DESAI, J. D.; BANAT, I. M. Microbial production of surfactants and their commercial
potential. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 61, 1, 47-64, 1997.
52
DOLFING, J.; ZEYER, P. J.; BINDER-EICHER, R.; SCHWARZENBACH, P. Isolation and
Characterization of a Bacterium that Mineralizes Toluene in the Absence of Molecular
Oxigen. Archives of Microbiology, 336-341, 1990.
DYKE, M. I.; LEE, H.; TREVORS, J. T. Applications of Microbial Surfactants. Biotechnology
Advances. 9, 241-252, 1991.
Engenharia de Alimentos - Universidade Federal do Rio Grande, Fundação Universidade
Federal do Rio Grande,RS.2006
Engenharia de Alimentos) - Universidade Federal do Rio Grande, Fundação Universidade
Federal do Rio Grande- RS.2006
Engenharia de Alimentos. Universidade Federal do Rio Grande, Fundação Universidade
Federal do Rio Grande-RS, 2006.
FAO. Food and Agriculture Organization. Disponivel em:http//www.fao.org/docrep/t0567e/T0
567E08 Acesso em:23 maio 2011.
FOX, S. L.; BALA, G. A. Production of surfactant from Bacillus subtilis ATCC 21332 using
potato substrates. Bioresource Technology, 75, 235-240, 2000.
GANDRA, E. A.; FONSECA, G. G.; CORRÊA, A. P. A.; SCLOWITZ, L. F. Produção de
cogumelos comestíveis utilizando resíduos agroindustriais. Trabalho de Conclusão de Curso
em Engenharia de Alimentos. Universidade Federal do Rio Grande-RS, 2000.
HASAN, S. D. M. Modelagem e simulação da transferência de calor em fermentação semi-
sólida de farelo de arroz. Dissertação de Mestrado em Engenharia de Alimentos.
Universidade Federal do Rio Grande-RS, 1998.
HASAN, S. D. M.; COSTA, J. A. V.; SANZO, A. V. L. Heat transfer simulation of solid state
fermentation in a packed-bed bioreactor. Biotechnology Techniques. 12, 10, 787-791, 1998.
HEALY, M. G.; DEVINE, C. N.; MURPHY, R. Microbial production of biosurfactants.
Resources, Conservation and Recycling, 18, 41-47, 1996.
HOLLAND, K. T.; KNAPP, J. S.; SHOESMITH, J. G. Anaerobic Bacteria, 1th ed., Blackie &
Son, New York, 1987.
HOLT, J. G.; KRIEG, N. R.; SNEATH, P. H. A.; STALEY, J. T.; WILLIAMS, S. T. Bergey’s
Manual of Determinative Bacteriology. 9th ed., Baltimore, Maryland, USA, 1994.
IPIECA, Dispersants and their role in Oil Spill Response. IPIECA Report Series.London, UK,
V. 5, p. 24, 1993.
53
JACQUES, R. J. S.; BENTO, F. M.; ANTONIOLLI, Z. A.; CAMARGO, F. A. O.
Biorremediação de solos contaminados com hidrocarbonetos aromáticos policíclicos.
Ciência Rural. 37, 4, 1192-1201, 2007.
JUNIOR, A. P. C. Petróleo: Caracterização identificação, situação atual, meio ambiente e
perspectivas Ultrasperse II. Trabalho conclusão de curso. Universidade Federal Rural do Rio
de Janeiro, Instituto de Agronomia Departamento de Geociência. Rio de Janeiro/RJ, 2008.
JUNIOR, C. G.; VENDRUSCOLO, F.; PIAIA, J. C. Z.; RODRIGUES, R. C. Produção de
biossurfactantes utilizando o processo de fermentação em estado sólido. Projeto de
Conclusão do Curso de Engenharia de Alimentos. Universidade Federal do Rio Grande. Rio
Grande-RS, 2003.
KARANTH, N. G. K.; DEO, P. G.; VEENANADIG, N. K. Microbial production of biosurfactant
and their importance. Current Science. 77, 1, 116-126, 1999.
KIM, S. G.; LIM, E. J.; LEE, S. O.; LEE, J. D.; LEE, T. H. Purification and characterization of
biosurfactants from Nocardia sp. L – 417. Biotechnology Applied Biochemistry, 31, 249-253,
1997.
KOWALL, M.; VALTER, J.; KLUGE, B.; STEIN, T.; FRANKE, P.; ZIESSOW, D. Journal of
Colloid and Interface Science, 204, 1, 1998.
LANG, S.; WAGNER, F. Biosurfactants from marine microorganisms. In: Kosaric N, editor.
Biosurfactants: production, properties, applications (surfactant Science Series). New York:
Marcel Dekker; 48, 391–417, 1993.
LIMA, A. S. Produção, estabilidade e isolamento de bioemulsificante obtido a partir da
fermentação de óleo-diesel comercial por Saccharomyces lipolytica. Tese de Mestrado em
Engenharia de Alimentos – Universidade Estadual de Campinas. Campinas-SP, 1996.
LINDE, G.A. Produção de pectinase por fermentação semi-sólida em biorreator de coluna.
Dissertação de Mestrado em Engenharia de Alimentos. Universidade Federal do Rio
Grande-RS, 2000.
LUKONDEH, T.; ASHBOLT, N. J.; ROGERS, P. L. Evaluation of Kluyveromyces marxianus
FII 510700 grown on a lactose-based medium as a source of a natural bioemulsifier. Journal
of Industrial Microbiology & Biotechnology. 30, 715-720, 2003.
MADIGAN, M. T.; MARTINKO, J. M.; PARKER, J. Brock Biology of Microorganisms. 8ª ed.
New Jersey, Prentice-Hall., 606-768, 1997.
54
MAKKAR, R. S.; CAMEOTRA, S. S. An update on the use of unconventional substrates for
biosurfactant production and their new application. Applied Microbiology and Biotechnology.
58, 428-434, 2002.
MAKKAR, R. S.; CAMEOTRA, S. S. Production of biosurfactant at mesophilic and
thermophilic conditions by a strain of Bacillus subtilis. Journal of Industrial Microbiology &
Biotechnology. 20, 48–52, 1998.
MANEERAT, S. Production of biosurfactants using substrates from renewable-resources
Songklanakarin. Journal of Science and Technology, 27, 3, 675-683, 2005.
MARTINS, A.; DINARTI, A. L.; FORMAGI, V. M.; LOPES, T. A.; BARROS, R. M.;
CONEGLIAN, C. M. R.; BRITO, N. N.; SOBRINHO, G. D.; TONSO, S.; PELEGRINI, R.
Biorremediação. III Fórum dos Estudos Contábeis, Faculdades Integradas Claretianas, Rio
Claro-SP, 2003.
MARTINS, R. G. Produção de Biossurfactante Bacteriano por Fermentação em Estado
Sólido e sua Aplicação em Graduação em Engenharia de Alimentos - Universidade Federal
do Rio Grande-RS, 2008.
MARTINS, V. G. Produção de biossurfactante por fermentação em estado sólido e sua
utilização em biorremediação. Dissertação de Mestrado em Engenharia e Ciência de
Alimentos – Fundação Universidade Federal do Rio Grande. Rio Grande-RS, 2005.
MAUREL, V. B.; ORLIAC, O.; CHRISTEN, P. Sensors and measurements in solid state
fermentation: a review. Process Biochemistry. 38, 881-896, 2003.
MESTER, K. G. Field evaluation of in situ denitrification for bioremediation of contaminates
soils and groundwater. New Brunswick, 155p., New Jersey,1995.
MITCHELL, D. A.; KRIEGER, N.; STUART, D. M.; PANDEY, A. New developments in solid-
state fermentation II. Rational approaches to the design, operation and scale-up bioreactors.
Process Biochemistry. 35, 1211-1225, 2000.
MORAES, A. F. Enriquecimento protéico do farelo de arroz por fermentação semi-sólida em
biorreator de leito fixo. Dissertação de Mestrado em Engenharia de Alimentos. Universidade
Federal do Rio Grande-RS, 1999.
MULLIGAN, C. Environmental applications for biosurfactants. Environmental Pollution, 133,
183-198, 2005.
MULLIGAN, C. N.; YONG, R. N.; GIBBS, B. F. Surfactant-enhanced remediation of
contaminated soil: a review. Engineering Geology, 60, 371-380, 2001.
55
NADARAJAH, N.; SINGH, A.; WARD, O. P. Evaluation of a mixed bacterial culture for de-
emulsification of water-in-oil petroleum oil emulsions. World Journal of Microbiology &
Biotechnology, 18, 435–440, 2002.
NANDINI, C. D.; SALIMATH, P. V. Carbohydrade composition of wheat, wheat bran and
bajra with good chapatti/roti (Indian flat bread) marking quality. Food Chemistry, 2001.
NASCIMENTO, D. S. Biorremediação de Produtos Químicos I Graduação em
NITSCHKE, M.; PASTORE, G. M. Biossurfactantes: propriedades e aplicações. Química
Nova. 25, 5, 772-776, 2002.
PANDEY, A.; SOCCOL, C. R.; MITCHELL, D. New developments in solid state fermetation:
I-bioprocesses and products. Process Biochemistry. 35, 1153-1169, 2000.
PEREIRA, M, R. Biorremediação de Produtos Químicos II Graduação em
PETERS, K. E.; WALTERS, C. C.; MOLDOWAN, J. M. The Biomerker Guide: Biomarkers
and Isotopes in the Environment and Human History. vol. 1, 2nd Ed, Cambridge University
Press. 2005.
PINTO, M. H. Produção de biossurfactante bacteriano e fúngico por fermentação em estado
sólido e submersa utilizando resíduos agroindustriais. Dissertação de Mestrado em
Engenharia e Ciência de Alimentos – Universidade Federal do Rio Grande. Rio Grande-RS,
2008.
PRUTHI, V.; CAMEOTRA, S. S. Rapid identification of biosurfactant-producing bacterial
strains using a cell surface hydrophobicity technique. Biotechnology Techniques, 11 (9),
671– 674, 1997.
RADMANN, E. M. Cultivo de microalgas para produção de biossurfactantes. Tese de
Doutorado em Engenharia e Ciência de Alimentos. Universidade Federal do Rio Grande. Rio
Grande-RS, 2011.
RAGHAVARAO, K. S. M. S.; RANGANATHAN, T. V.; KARANTH, N. G. Some engineering
aspects of solid-state fermentation. Biochemical Engineering Journal, 13, 127-135, 2003.
RAIMBAULT, M.; ALAZARD, D. Culture method to study fungal grow in solid fermentation.
European Journal Applied Microbiology, 9, 199-209, 1980.
RAUPP, D. S.; CARRIJO, K. C. R; COSTA, L. L. F.; MENDES, S. D. C.; BANZATTO, D. A.
Propriedades funcionais-digestivas e nutricionais de polpa-refinada de maçã. Scientia
Agricola. 57, 3, 2000.
56
REGULY, J. C. Biotecnologia dos Processos Fermentativos. Vol. 1, Pelotas/RS, Editora e
Gráfica Universitária – UFPEL1996
REGULY, J. C. Biotecnologia dos Processos Fermentativos. Vol. 3, Pelotas/RS, Editora e
Gráfica Universitária – UFPEL, 2000.
ROBINSON, T.; SINGH, D.; NIGAM, P. Solid-state fermentation: a promising microbial
technology for secondary metabolite production. Applied Microbiology and Biotechnology,
55, 284-289, 2001.
RODRIGUES, L.; MOLDES, A.; TEIXEIRA, J.; OLIVEIRA, R. Kinetic study of fermentative
biosurfactant production by Lactobacillus strains. Biochemical Engineering Journal. 28, 109-
116, 2006.
RODRIGUES, R. C.; VENDRUSCOLO, F.; PIAIA, J. C. Z.; JUNIOR, C. G. Produção de
biossurfactante utilizando o processo de fermentação em estado sólido. Projeto de
Conclusão do Curso de Engenharia de Alimentos. Universidade Federal do Rio Grande. Rio
Grande-RS, 2002.
RON, E. Z.; ROSENBERG, E. Biosurfactants and oil bioremediation. Current Opinion in
Biotechnology. 13, 249-252, 2002.
ROSENBERG, E.; RON, E. Z. High and low-molecular-mass microbial surfactants. Applied
Microbiology and Biotechnology. 52, 154-162, 1999.
SANDOVAL, J. C. M.; KARNS, J.; TORRENTS, A. High-performance liquid chromatography
method for the characterization of ramnolipid mixtures produced by Pseudomonas
aeruginosa UG2 on corn oil. Journal of Chromatography, A-864, 211-220, 1999.
SANGSURASAK, P.; MITCHELL, D. A. Incorporation of death kinetics into a 2D dynamic
heat transfer model for solid state fermentation. Journal of Chemical Technology and
Biotechnology, 64, 253-260, 1995.
SANTOS, L. O.; MAGNANI, G.; COLLA, E. Amiloglicosidade e pectinases via fermentação
semi-sólida em fermentador de tambor rotativo. Trabalho de Conclusão de Curso em
Engenharia de Alimentos. Universidade Federal do Rio Grande, 2001.
SARAIVA, C. P.; TREICHEL, H.; WENDT, R.; OGRODOWOSKY, R. Estudo de um
Biorreator Tipo Tambor para o Enriquecimento Protéico do farelo de Arroz. Trabalho de
conclusão de curso em Engenharia de Alimentos - Universidade Federal do Rio Grande. Rio
Grande/RS, 1999.
SARKAR, D.; FERGUSON, M.; DATA, R.; BIRNBAUM, S. Bioremediation of petroleum
hydrocarbons in contaminated soils: Comparison of biosolids addition, carbon
57
supplementation, and monitored natural attenuation. Environmental Pollution. 136, 187-195,
2005.
SILVA, M. A., SANCHES, C., AMARANTE, E. R. Farelo de arroz: composição e
propriedades. Revista Óleos e Grãos, 2001.
SPOECKNER, S.; WRAY, V.; NIMTZ, M.; LANG, S. Glicolipids of the smut fungus Ustilago
maydis from cultivation on renewable resources. Applied Microbiology and biotechnology,
51, 33-39, 1999.
TREICHEL, H.; WENDT, R.; SARAIVA, C.; OGRODOWSKI, R. Estudo de um biorreator tipo
tambor rotativo para o enriquecimento protéico do farelo de arroz. Trabalho de Conclusão de
Curso em Engenharia de Alimentos. Universidade Federal do Rio Grande, 1998.
TREVAN, M. D. T.; BOFFEY S.; GOULDING K. H.; STANBURYK, P. Biotecnologia:
Princípios biológicos; Editora Acribia, S.A.; Zaragoza – Espanha, 284p.; 1990.
TURKOVSKAYA, O. V.; DMITRIEVA, T. V.; MURATOVA, A. Y. A Biosurfactant-Producing
Pseudomonas aeruginosa Strain. Applied Biochemistry and Microbiology, 37, 1, 71-75, 1999.
VAN HAMME, J. D.; SINGH, A.; WARD, O. P. Microbiology Molecular Biology Review. 67
(4), 503-549, 2003.
VEENANADIG, N. K.; GOLTHAMAN, M. K.; KARANTH, N. G. K. Scale up studies for the
production of biosurfactant in packed column bioreactor. Bioprocess Engineering, 22, 95-99,
2000.
WENTZEL, A.; ELLINGSEN, T. E.; KOTLAR, H-K.; ZOTCHEV, S. B.; THRONE-HOLST, M.
Applied Microbiology and Biotechnology, 76, 1209-1221, 2007.
YAKIMOV, M. M.; TIMMIS, K. N.; WRAY, V.; FREDRICKSON, H. L. Characterization of a
new lipopeptide surfactant produced by thermotolerantand halotolerant subsurface Bacillus
licheniformis BAS50. Applied and Environmental Microbiology, 61,1706–1713, 1995.
ZHU, X.; VENOSA, A. D.; SUIDAN, M. T. Literature review on the use of commercial
bioremediation agents for cleanup of oil-contaminated estuarine environments. United States
Environmental Protection Agency. EPA, 600, R-04, 075, 2004.
CAPÍTULO IV – ARTIGOS
58
4 ARTIGOS
Para apresentação e compreensão dos resultados obtidos, o trabalho foi dividido
em dois artigos:
ARTIGO 1: Biorremediação de solo arenoso contaminados por derrame simulado com
benzeno, tolueno e xileno;
ARTIGO 2: Estudo da degradação de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs) e de
hidrocarbonetos totais de petróleo (HTP) com a utilização de biossurfactantes e dispersante
químico.
59
4.1 BIORREMEDIAÇÃO DE SOLO ARENOSO CONTAMINADOS POR DERRAME
SIMULADO COM BENZENO, TOLUENO E XILENO
Roque Lourenço Zílio e Jorge Alberto V. Costa*
*Laboratório de Engenharia Bioquímica, Escola de Química e Alimentos, Universidade Federal do Rio Grande, Caixa Postal 474, CEP 96201-900, Rio Grande, RS, Brasil. Fax: +55-53-3233 8745. E-mail: [email protected]
4.1.1 RESUMO Biorremediação é um processo em que micro-organismos são empregados para decompor parcialmente ou em sua totalidade poluentes do meio ambiente. Surfactantes possuem moléculas anfipáticas com uma porção hidrofílica (parte polar) e outra hidrofóbica (parte apolar). Biossurfactantes são compostos de origem microbiana que possuem a capacidade de reduzir a tensão superficial entre as fases líquido-gás ou a tensão interfacial entre as fases líquido-líquido imiscíveis. Os biossurfactantes têm recebido uma grande atenção e aceitabilidade na degradação de produtos poluentes principalmente nos derivados de petróleo pela sua baixa toxicidade e biodegradabilidade, além de serem produzidos a partir de subprodutos industriais o que tende a viabilizá-los na diminuição dos custos da sua produção em comparação aos surfactantes sintéticos produzidos por derivados do petróleo. O objetivo do presente trabalho foi estudar a biorremediação de solos contaminados por derrame simulado de benzeno tolueno e xileno (BTX), avaliando o efeito da adição de biossurfactantes produzido pela da Corynebacterium aquaticum e aceptor final de elétrons (NO3
-) além da percolação destes. A biorremediação foi realizada ex situ, em solo arenoso não estéril utilizando reatores de Policloreto de Vinila (PVC) com diâmetro interno de 100 mm e 2 m de altura, em quatro condições diferentes de adições de biossurfactantes e NO3
-. No derrame simulado de BTX em um solo arenoso, não estéril, utilizou-se 5 mL de cada composto, resultando em 16,06 g da mistura que foram colocados em uma área de 78,5 cm2. Nestas condições estes compostos não ofereceram risco de percolação até a profundidade de 0,4 m e, portanto, não há risco de contaminação do lençol freático (2 m da superfície). Palavras-chave: Biossurfactante, BTX, Corynebacterium aquaticum. 4.1.2 ABSTRACT Bioremediation is a procedure were micro-organism, or a product produced by them, are used to decompose partially or totally pollutants in a environment. Surfactant are amphipatic molecules, formed by a hydrophilic end (polar portion) and a hydrophobic end (apolar portion). Biosurfactants are microorganism synthesized compounds which posses the ability to reduce the superficial tension among in a liquid-gas interface or the interfacial tension in a non miscible liquid-liquid interaction. These metabolites have received a large amount of attention and acceptability in oil and derivates degradation duo to its low toxicity and stable biodegradability, besides been generated from industrial sub-products, which increase coasts reduction probability when compared to synthetic oil-based surfactants. Therefore, this work objective is to evaluate benzene, toluene and xylene (BTX) bioremediation in sand soil by Corynebacterium aquaticum produced biosurfactant and final electron acceptor (NO3
-
), and the penetration of all. Bioremediation was realize ex situ in non- sterile sand soil, using polyvinyl chloride (PVC) reactors with internal diameter of 100 mm and 2 m high, in four different biosurfactant and final electron acceptor concentrations. In the simulated BTX leakage, 5 ml of each contaminant were combined, generating a mixture containing 16,06g, which was poured in a 78,5 cm2 area. In such condition the compounds did not penetrated to a depth of 0,4 m, there is no risk of contamination of the groundwater stock (2 m from the surface). Key-words: Biosurfactant, BTX, Corynebacterium aquaticum.
60
4.1.3 INTRODUÇÃO
A grande preocupação mundial é a liberação de hidrocarbonetos para o meio
ambiente, proveniente de atividades industriais e de derramamentos acidentais de petróleo
e seus derivados. Micro-organismos que possam lisar, degradar, adaptar, crescer e
proliferar em ambientes contendo hidrocarbonetos tem um papel importante no ensaio
biológico deste tipo de poluição.
Biossurfactantes são emulsificantes naturais de hidrocarbonetos e podem ser
produzidos por bactérias, bolores e leveduras. São polímeros, total ou parcialmente
extracelulares (BICCA et al., 1999). Segundo Banat (2000) podem ser classificados
quimicamente como glicolipídios, lipossacarídios, lipopeptídios, fosfolipídios, ácidos graxos e
lipídios neutros.
Em função da presença de grupos polares e apolares na mesma molécula, os
biossurfactantes tendem a se distribuir nas interfaces com diferentes graus de polaridade
(água/óleo ou ar/água), reduzindo a tensão interfacial e superficial, o que os tornam
adequados para diversas aplicações industriais, como detergência, emulsificação,
lubrificação, capacidade espumante, solubilização e dispersão de fases (GOUVEIA et al.,
2003; NITSCHKE & PASTORE, 2002; MAYER & SOBERON-CHAVES,2000).
Bognolo (1999) destaca que os surfactantes biológicos são mais aceitáveis que
os químicos, pois possuem características relevantes como tolerância a temperatura, onde
sua atividade superficial não é afetada, tolerância a força iônica, salinidade de até 10% não
os precipitam, possuem alta biodegradabilidade tanto em água ou no solo, e a emulsão
formada pode ser facilmente quebrada por enzimas no caso a dipolimerase que quebra a
emulsão de hidrocarbonetos em óleo.
A maioria dos surfactantes disponíveis no mercado são sintéticos, produzidos a
partir dos derivados de petróleo. Entretanto, o crescimento da preocupação ambiental entre
os consumidores, combinado com novas legislações de controle do meio ambiente levaram
à procura por surfactantes naturais (biossurfactantes) como uma alternativa aos produtos já
existentes.
Os biossurfactantes vêm sendo testados em aplicações ambientais como na
biorremediação, dispersão de efluentes oleosos na otimização e recuperação de óleos. São
compostos que podem substituir os surfactantes químicos no futuro, principalmente nas
indústrias de alimentos, cosmética e farmacêutica, produtos de limpeza industrial, produtos
químicos agroindustriais e no processo de biorremediação, já que são biodegradáveis, baixa
toxidade e possuem estabilidade em extremos de pH, temperatura e salinidade (CHEN et
al.,2007; MAKKAR & CAMEOTRA,2002).
61
Os surfactantes, em particular, podem interagir com os compostos presentes e
aumentar a solubilidade dos mesmos em água. Desta forma, a presença de surfactantes,
naturais e ou sintéticos, aumenta a disponibilidade dos contaminantes aos microrganismos,
e conseqüentemente à biorremediação (RIZZO et al, 2006).
Os micro-organismos anaeróbios estritos utilizam diferentes aceptores como,
nitratos (NO3-), sulfatos (SO4
2-) e íons férricos (Fe3+) para metabolizar hidrocarbonetos.
Enquanto outros anaeróbios (aerotolerantes) crescem na presença de concentrações-traços
de oxigênio dissolvido, porém não utilizam este gás metabolicamente (MADIGAN et al.,
1997; BERTHE-CORTI & FETZNER, 2002). Os micro-organismos aeróbios precisam da
presença de oxigênio molecular para seu crescimento e para converter os hidrocarbonetos
em CO2, H2O e biomassa. Já os micro-organismos facultativos podem crescer na presença
(aerobiose) ou ausência (anaeróbios, fermentação) de oxigênio (BERTHE-CORTI &
FETZNER, 2002; PETERS et al., 2005).
Segundo Alexander (1999) em certos ambientes contaminados a propagação de
oxigênio nos solos é insuficiente para manter os níveis necessários da atividade aeróbica
para a efetiva remediação. Na ausência de oxigênio, a biodegradação pode ocorrer numa
variedade de meios anaeróbicos que incluem a desnitrificação, redutores de sulfato,
metanogênicos redutores do ferro.
Assim é importante avaliar os possíveis danos causados pelos compostos
presentes na gasolina, cuja composição é uma mistura complexa de hidrocarbonetos com
diferentes graus de volatilização, como compostos alifáticos (alcanos, cicloalcanos e
alquenos), aromáticos (benzeno, etilbenzeno, tolueno e xilenos - BTEX) e aditivos, com
cadeias carbônicas compreendidas na faixa de 5 a 10 carbonos por molécula. Dentre os
hidrocarbonetos, os monoaromáticos BTEX têm maior solubilidade em água e, portanto, são
os poluentes que primeiro irão atingir o lençol freático (MORAIS e TAUK-TORNISIELO,
2004). Os compostos BTEX podem causar sérios riscos à saúde humana, principalmente
devido ao caráter tóxico, mutagênico e carcinogênico.
O objetivo deste trabalho foi avaliar a biorremediação de solo arenoso
contaminado por derrame simulado de benzeno tolueno e xileno, (BTX), avaliando o efeito
da adição de biossurfactante e aceptor final de elétrons, (NO3-) além da percolação destes.
62
4.1.4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1.4.1 Produção do biossurfactante
Crescimento e manutenção do micro-organismo
Para a realização dos ensaios foi utilizada a bactéria Corynebacterium
aquaticum, cedida pelo Laboratório de Microbiologia de Alimentos da Faculdade de
Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas (FEA/UNICAMP).
As culturas de bactérias foram mantidas sob refrigeração, em tubos de ensaio e
em erlenmeyers contendo ágar nutriente, que foi formulado conforme a seguir (g.L-1): extrato
de carne (1,0); extrato de levedura (2,0); peptona (5,0); NaCl (5,0) e ágar-ágar (15,0)
(MAKKAR & CAMEOTRA, 1998).
A propagação dos inóculos foi realizada em frascos erlenmeyers contendo ágar
nutriente, formulado conforme a seguir (g.L-1): extrato de carne (1,0); extrato de levedura
(2,0); peptona (5,0); NaCl (5,0), onde foi inoculada a cultura e seu crescimento foi
acompanhado por 48 h a 30 ºC. Após, foi realizada a raspagem da superfície do ágar com
meio nutriente e ao atingir a densidade ótica 0,8-0,9 em comprimento de onda de 600 nm,
as suspensões foram utilizadas como inóculos, sendo adicionadas ao meio de cultura na
concentração de 2% (v/v) (MAKKAR & CAMEOTRA, 1998).
Cultivo em processo aeróbio
O cultivo aeróbio foi realizado em estado semi sólido em biorreatores de coluna
de leito fixo, com dimensões internas 50 x 250 mm (diâmetro e altura). O ar do compressor
(modelo, marca, país) que alimentou às colunas passou primeiramente por filtros
preenchidos com lã de vidro, e sua vazão foi regulada por rotâmetros (Cole-Parmer
Instrument Company, EUA) previamente calibrados. A corrente de ar foi umidificada, e em
seguida, realizada a remoção das gotas, sendo posteriormente injetado nas colunas. A
temperatura de incubação do meio foi mantida constante em 30 ºC por um banho
termostatizado (modelo Q 214m2, Quimis, Brasil), pela circulação de água através do
encamisamento do biorreator. O material utilizado foi todo esterilizado a 121 ºC por 15 min
em autoclave (modelo AY 137, Phoenix, Brasil) (MARTINS et al., 2007a). A umidade foi
fixada em 65%. Os cultivos aeróbios foram conduzidos durante 144 h.
O meio de cultivo foi composto de casca de arroz e farelo de trigo nas
proporções 15 e 85%, respectivamente, com adição de solução nutriente composta por: 4 g
63
de NH4NO3; 0,822 g de KH2PO4; 0,0008 g de CaCl2; 10,7182 g de Na2HPO4; 0,1971 g de
MgSO4; 0,0011 g de FeSO4 e 0,0015 g de EDTA, e elevado ao volume final de 1 L
(adaptado de COOPER et al., 1987). Não foi adicionada fonte de carbono, visto que esta é
proveniente do farelo de trigo e casca de arroz. O farelo de trigo a ser utilizado foi recolhido
em peneiras de diâmetros 0,42 a 0,50 mm.
A Figura 1 apresenta esquema do cultivo em estado sólido em biorreator de
coluna.
Figura 1 Esquema de cultivo em estado sólido em biorreator de coluna
Fonte: COSTA (1996)
4.1.4.2 Extração do biossurfactante
A extração do biossurfactante foi realizada com água a 90 °C na proporção 1:9
(farelo fermentado:solvente) (MARTINS et al., 2007b). Após a adição do solvente, a amostra
foi submetida à agitação em shaker (B. Braun Certomat BS-1, USA) a 160 rpm e 50 °C por
30 min, após sendo filtrada à vácuo para a retirada de excesso de sólidos presentes. O
filtrado foi centrifugado (Presvac,CT12,Argentina) a 7000 rpm por 15 min, o sobrenadante foi
recolhido e utilizado para o processo de biorremediação (MARTINS, 2005).
64
4.1.4.3 Tensão superficial do biossurfactante
A tensão superficial foi determinada em tensiômetro (Kruss Processor
Tensiometer K-9, Alemanha), usando o método do anel Du Nouy, conforme Figura 2. Este
tensiômetro determina tensões superficiais e interfaciais com a ajuda de um anel suspenso
e fixado em um tensiômetro. A amostra a ser analisada sempre líquida é colocada em um
recipiente específico do aparelho, o anel é mergulhado no líquido e zerado. A amostra é
então abaixada, de forma que o filme líquido produzido abaixo do anel é alongado. Quando
o filme líquido é estendido, uma força máxima é determinada e medida, obtendo-se a tensão
superficial. A tensão superficial foi determinada com a amostra em contato com o ar
(COSTA et al., 2006; RODRIGUES et al., 2006).
Figura 2 Medição da tensão superficial em tensiômetro
FONTE: Laboratório de Engenharia Bioquímica da FURG
4.1.4.4 Biorremediação
Coleta da amostra de solo
A coleta do solo arenoso foi realizada em um terminal marítimo de
armazenamento de produtos químicos junto ao terminal portuário de Rio Grande (RS)
latitude 32º04´09”S e longitude 52º05´15”W.
A Figura 3 apresenta o solo coletado, pesado e preparado para o preenchimento
dos reatores.
65
Figura 3 Solo preparado para biorremediação
Montagem dos ensaios
Os ensaios foram realizados na parte externa do Laboratório de Engenharia
Bioquímica da FURG, em ambiente aberto expostos às condições ambientais naturais, tanto
de temperatura quanto umidade e suas variações. A biorremediação ocorreu durante 57
dias em biorreatores de Policloreto de Vinila (PVC) com diâmetro interno de 100 mm e 2 m
de altura, posicionados na vertical com a parte inferior vedada e a superior aberta, um total
de 4 reatores foram preparados para recolher o drenado e outros 28 reatores que foram
sacrificados para a retiradas das amostras (Figura 4).
Os quatro biorreatores usados para a coleta do drenado foram adaptados com
uma tela de 200 mesh na parte inferior do reator vedada com um tampão externo e instalado
um dreno para a coleta da água proveniente da lixiviação, quando de precipitação
pluviométrica. As amostras drenadas eram recolhidas para posterior análise.
66
Figura 4 Biorreatores de Policloreto de Vinila (PVC) – Ensaio1 com solo arenoso
No processo de biorremediação, cada biorreator com diâmetro de 100 mm e 2 m
de altura foi totalmente preenchido com 22 kg de areia não estéril. Posteriormente foi
realizada a contaminação utilizando 15 mL de mistura benzeno, xileno e tolueno (BTX) na
proporção de 1:1:1. A seguir foi adicionado a estes o extrato de biossurfactantes extraído da
C. aquaticum e a quantidade do aceptor de elétrons (NO3-) estequiometricamente
calculados.
A quantidade de água inicial foi ajustada para que os ensaios apresentassem o
teor máximo de umidade de 15%, sem ajuste até o seu final dos ensaios.
As amostras foram retiradas dos biorreatores através de cisões axiais
destrutivas de 50 mm cada uma, abaixo da superfície e acima da base e mantendo o centro
para as outras amostragens nas distâncias 0,40 m, 0,80 m, 1,20 m e 1,60 m, conforme
Figura 6, totalizando 6 amostras para cada experimento.
A Figura 5 mostra os reatores de captação de água proveniente da lixiviação por
precipitação pluviométrica.
67
Figura 5 Biorreatores de captação de água proveniente da lixiviação por precipitação
pluviométrica
Figura 6 Pontos de amostragens dos Biorreatores
A Tabela 1 apresenta os valores reais das variáveis de concentração do aceptor
de elétrons e do biossurfactante que foram estudadas para o solo arenoso. A umidade inicial
foi 15% para todos os ensaios.
68
Tabela 1 Valores reais das variáveis de concentração do aceptor de elétrons e do
biossurfactante
Ensaio Conc. do aceptor (%) Conc. de biossurfactante (%)
1 0 0
2 100 0
3 100 200
4 0 200
O cálculo para 100% do aceptor nitrato (NO3-) foi referenciado com relação ao
número de carbono existente na amostra através de balanceamento estequiométrico.
Adição do biossurfactante
O solo foi tratado com concentrações de 200% de biossurfactantes extraído do
farelo proveniente do crescimento aeróbio da C. aquaticum calculados após a análise, de
emulsão dos compostos em análise, benzeno, tolueno e xileno (BTX) na proporção de 1:1:1.
Foram testados os biossurfactantes produzidos pela C. aquaticum. A quantidade
(200%) de biossurfactante adicionada foi calculada com base na atividade emulsificante
determinada no início dos ensaios.
Aceptor de elétrons
Foi testado o aceptor nitrato (NO3-) na proporção de 100%, o mesmo foi
referenciado com relação ao número de carbono existente na amostra através de
balanceamento estequiométrico conforme equações abaixo:
Benzeno
C6H6 + 15/2 O2 6 CO2 + 3H2O (1)
5 NO3 5/2 N2 + 15/2 O2 (2)
C6H6 + 5 NO3 6 CO2 + 3 H2O + 5/2 N2 (3)
Xileno
C8H10 + 21/2 O2 8 CO2 + 5H2O (4)
7 NO3 7/2 N2 + 21/2 O2 (5)
C8H10 + 7 NO3 8 CO2 + 5 H2O + 7/2 N2 (6)
69
Tolueno
C7H8 + 18/2 O2 7CO2 + 4H2O (7)
6 NO3 6/2 N2 + 18/2 O2 (8)
C7H8 + 6 NO3 7 CO2 + 4 H2O + 6/2 N2 (9)
Amostragem
Os ensaios de biorremediação tanto para as amostra sólidas como para as
amostras líquidas (drenado) foram analisados durante 57 dias, sendo as mesmas coletadas
em 0, 2, 7, 14, 21, 30 e 57 dias para as determinações de benzeno, tolueno e xileno (BTX),
nitrogênio, umidade, tensão superficial, temperatura e pH.
Preparo do experimento
Em 22 kg de um solo arenoso não estéril com uma área superficial de 78,5 cm2
foi contaminada com 15 mL de uma mistura de benzeno, tolueno e xileno na proporção
1:1:1. Neste derrame simulado foi testada a ação do biossurfactantes extraído de um
crescimento aeróbio da bactéria C. aquaticum, na proporção de 200% em relação à análise
de emulsão da mistura dos compostos e do aceptor de elétrons NO3– na proporção de 100%
calculada estequiometricamente em relação ao número de carbono dos contaminantes
Determinações analíticas para a biorremediação
Os máximos e mínimos valores de temperatura foram verificados diariamente no
local da biorremediação, através de um centro de aquisição de dados (Fieldchrt, Novus, 8C,
U.S.A), desde o fundo do reator até a superfície com uma distância de 40 cm entre os outros
pontos totalizando seis (6) pontos de medição (Figura 7), distâncias estas iguais as dos
pontos de amostragens e com um intervalo de tempo de 30 min em cada tomada de
temperatura, com o uso do referido registrador.
70
Figura 7 Medição dos máximos e mínimos valores de temperatura
No processo de biorremediação, a medição do pH foi realizada em todos os
pontos de amostragens, nos tempos 0, 2, 7, 14, 21, 30 e 57 dias, através de potenciômetro
digital (modelo Q-400PM, Quimis, Brasil) utilizando eletrodo combinado tipo espada (modelo
V627, Analion, Brasil).
O teor de umidade foi determinado segundo metodologia da AOAC (2001),
baseada na perda de peso após a secagem em estufa a 105 ºC até peso constante.
O teor de nitrogênio dos ensaios foi determinado pelo método Macro-kjeldahl
segundo STANDARD METHODS (2005).
As análises de benzeno, tolueno e xileno (BTX) foram realizadas por
cromatografia a gás utilizado Cromatógrafo gasoso (Autosystem, U.S.A) equipado com
coluna capilar HP5 Cross Linked Metil Silicone - 30 m de comprimento, 0,32 mm de
diâmetro, filme de 5% metil-fenil-silicone com espessura de 0,25 µm usando amostrador
Headspace Perkin Elmer HS 40xl, (EPA 5021-96,1996) com gás de arraste Nitrogênio, fluxo
de 6mL min-1 e modo de injeção por Headspace: À concentração dos compostos foi
realizada diretamente pelo software, Totalchrom ou pelo cálculo das áreas obtidas dos
cromatogramas.
A classificação geral do solo foi realizada segundo metodologia proposta por
SUGUIO (1973). O peneiramento do solo foi realizado utilizando peneiras com Tyler entre 8
e 200 (4,0 e 0,062 mm, respectivamente), sendo a massa retida em cada uma das peneiras
comparada à Escala de Wentworth (SUGUIO, 1973), a mesma encontra-se no Anexo 1,
Tabela 1.
71
As análises de tensão superficial foram realizadas em tensiômetro (Kruss
Processor Tensiometer K-9, Alemanha) usando o método do anel Du Nouy, sendo a tensão
medida com a amostra em contato com o ar (COSTA et al., 2006; RODRIGUES et al.,
2006).
4.1.5 RESULTADOS E DISCUSSÕES
Com o peneiramento do solo, este foi classificado como areia média por atingir
um percentual de 74,83% em massa retido em peneira de 0,250 mm. Foram utilizadas
peneiras de 4,00 a 0,062 mm, sendo a massa retida em cada uma das peneiras conforme
Tabela 2, comparada à Escala de Wentworth (SUGUIO, 1973).
Tabela 2 Classificação do solo arenoso
Tyler Abertura (mm) Classificação Solo retido (%)
-5+9 4,00 a 2,00 Grão 0,00
-9+16 2,00 a 1,00 Areia muito grossa 3,11
-16+32 1,00 a 0,50 Areia grossa 1,45
-32+60 0,50 a 0,250 Areia média 74,83
-60+115 0,250 a 0,125 Areia fina 19,05
-115+250 0,125 a 0,062 Areia muito fina 1,50
FONTE: SUGUIO (1973)
Os ensaios de biorremediação foram realizados durante 57 dias em sistemas
abertos expostos às condições ambientais e naturais, tanto de temperatura quanto umidade.
A temperatura foi monitorada ao longo do processo de biorremediação, sendo a mínima
detectada no local 2,5 ºC e a máxima 28,1 ºC conforme Tabela 3. O pH variou de 4,6 a 8,6.
Para o líquido drenado o maior valor de pH detectado foi 10,2 e o menor valor 7,9.
Nas amostras de solo, o nitrogênio não teve variação na concentração máxima
nos diferentes ensaios. Nos ensaios 1 e 4 o nitrogênio foi reduzido em 5,5 vezes, e nos
ensaios 2 e 3 seu consumo foi 10 vezes o seu valor máximo detectado.
72
Tabela 3 Temperaturas máximas e mínimas registradas durante o período de
biorremediação
Tempo (dia) Tmax média (ºC) Tmax (ºC) Tmin média (ºC) Tmin (ºC)
0 17,15±2,6 21 6,6±1,3 5,3
2 19,05±2,6 23,1 7,8±1,7 5,5
7 16,72±0,8 18,2 13,2±0,4 12,5
14 16,55±1,8 18,8 5,7±1,7 4,2
21 17,45±1,3 19,8 7,2±1,6 5,3
30 24,3±1,9 28,1 13,2±1,0 12,1
57 14,5±1,5 16,7 3,5±0,7 2,5
Tmax média: temperatura máxima média do dia ± desvio padrão; Tmax: temperatura máxima alcançada no
dia; Tmin média: temperatura mínima média do dia ± desvio padrão; Tmin: temperatura mínima alcançada
no dia.
Tabela 4 Valores máximos e mínimos para os parâmetros avaliados para benzeno, tolueno
e xileno
Parâmetros Ensaio 1 Ensaio 2 Ensaio 3 Ensaio 4
Máx Mín Máx Mín Máx Mín Máx Mín
pH 8,6 7,1 8,6 4,6 8,6 4,6 8,3 6,5
Umidade (%) 21,5 3,6 21,2 2,8 21,2 2,8 23,8 4,0
Nitrogênio (% bs) 0,11 0,02 0,11 0.01 0,10 0.01 0,11 0,02
Tensão superficial
(mN.m-1) 71,5 59,2 71,8 53,5 71,8 53,5 71,5 56,6
Máx: valor máximo; Mín: valor mínimo
A maior variação do pH ocorreu nos ensaios dois e três, quando foi utilizado
nitrato como aceptor. Segundo Borden et al.(1995) o aumento nos valores de pH pode ser
creditado ao consumo de íons H+ durante a redução de íons férricos ou de nitrato, o que não
foi efetivado nestes ensaios.
Quando utilizou-se biossurfactante ensaio quatro a variação do pH foi menor e
seus valores registrados foram de 8,3 a 6,5. Esta faixa de pH é o ótimo para o
desenvolvimento de bactérias, o que torna a decomposição dos poluentes mais rápida.
Par et al. (1983) relataram que a atividade microbiológica no solo é fortemente
afetada pela disponibilidade de nutrientes, compostos tóxicos e pela tolerância dos próprios
micro-organismos às variações do pH. Alguns micro-organismos têm uma maior tolerância a
variações de pH enquanto outros suportam apenas pequenas variações. Bactérias têm seu
73
pH ótimo próximo a 7,0. Se o pH é ácido, normalmente os micro-organismos não
conseguem competir com os fungos, devido aos nutrientes disponíveis.
A menor tensão superficial (TS) ocorreu quando foi utilizado apenas o aceptor,
variando de 71,8 a 53,5 mN.m-1. Quando consorciado aceptor e biossurfactante o valor da
TS reduziu de 71,5 para 53,5 mN.m-1. Para o ensaio realizado com biossurfactante a TS
variou de 71,5 a 56,6 mN.m-1 durante o processo de biorremediação.
Uma provável situação para a menor TS quando se utilizou nitrato como aceptor
é a existência de micro-organismos na biota nativa, já que a amostra utilizada não era
estéril, ocasionando aumento no número de micro-organismos com características
denitrificantes, e estes por sua vez produzirem biossurfactante extra ou intracelular,
reduzindo assim a tensão superficial, que uma variação de 71,8 para 53,5 mN.m-1.
Os valores das concentrações de benzeno, tolueno e xileno (BTX) estão
apresentados na Tabela 5. Valores acima de 0,01 mg.kg-1, pela toxicidade dos compostos
aromáticos, são considerados elevados (lista holandesa de valores,6530). Os resultados
obtidos estão associados à fração volátil, no entanto, há possibilidade de que uma
quantidade destes aromáticos possivelmente tenha sido adsorvida pela sílica da matriz
utilizada como adsorvente no experimento, tornando os valores reais maiores que os
detectados.
Em todos os ensaios realizados, o benzeno, tolueno e xileno (BTX) foram
detectados até o segundo dia de amostragem (apenas na superfície), não sendo detectado
no segundo ponto de amostragem a 0,40 m abaixo da superfície. Isto sugere que a
percolação nas condições de estudo não ocorreu em níveis detectáveis em nenhum dos 4
ensaios realizados, o que não significa que não viesse a ocorrer se os níveis de
contaminantes fossem mais elevados.
Neste estudo as lixiviações provenientes das precipitações pluviométricas
ocorridas no período de detecção, não proporcionaram o arraste dos compostos benzeno,
tolueno e xileno para um possível lençol freático de 2 m de profundidade, possivelmente
porque seus coeficientes de solubilidade em água são baixos (0,07%, 0,05% e insolúvel,
respectivamente) (PERRY & CHILTON, 1980)
O biossurfactante age como redutor da tensão superficial e interfacial. O
decréscimo dessa tensão faz com que haja um aumento da área de contato e a quebra dos
compostos na forma de micela, diminuindo a área de contato entre as cadeias
hidrocarbônicas do surfactante e a água, facilitando a dispersão dos contaminantes no
ambiente e sua consequente metabolização pelos micro-organismos presentes no meio.
Para metabolizar hidrocarbonetos, micro-organismos anaeróbios estritos utilizam
diferentes aceptores, um deles o nitrato, cuja função é aumentar a ação redutora em uma
74
série de etapas sucessivas. Com a oxidação dos contaminantes, na degradação dos
compostos carbonados, o aceptor é reduzido a nitrito (óxido nitroso) e então gás
dinitrogênio, aumentando assim a ação dos micro-organismos (ALEXANDER, 1999)
A Tabela 5 apresenta as concentrações de benzeno, tolueno e xileno,
determinadas para os ensaios: (1) zero de aceptor e zero de biossurfactante, (2) 100% de
aceptor e zero de biossurfactante, (3) 100% de aceptor e 200% de biossurfactante, (4) zero
de aceptor e 200% de biossurfactante. A simbologia utilizada na identificação de cada
amostra foi a seguinte: i.ii e iii, onde (i) número do ensaio (ii) local da amostragem e (iii)
tempo de coleta em dias.
Tabela 5 Concentrações de Benzeno Tolueno e Xileno (mg.kg-1), detectadas nos ensaios
Ensaios Benzeno Tolueno Xileno
1.1.0 980 2137 2938
1.1.2 < 1 < 1 27
1.1.7 < 1 < 1 < 1
1.1.14; 1.1.21; 1.1.30; 1.1.57 < 1 <1 <1
2.1.0 10609 2381 3315
2.1.2 < 1 < 1 28
2.1.7 < 1 < 1 < 1
2.1.14; 2.1.21; 2.1.30; 2.1.57 < 1 <1 <1
3.1.0 688 1382 1918
3.1.2 < 1 < 1 < 1
3.1.7 < 1 < 1 < 1
3.1.14; 3.1.21; 3.1.30; 3.1.57 < 1 < 1 < 1
4.1.0 97 488 1178
4.1.2 < 1 < 1 6
4.1.7 < 1 < 1 < 1
4.1.14; 4.1.21; 4.1.30; 4.1.57 < 1 < 1 < 1
75
Tabela 6 Propriedades físico-químicas dos contaminantes
PF (ºC) PE (ºC) Viscosidade (cp, 20 ºC) PM (g.mol-1)
Benzeno 5,5 80,1 0,625 78,11
Tolueno -95,0 110,8 0,590 92,14
Xileno 13,3 144,0 6,475 106,16
PF: ponto de fusão; PE: ponto de ebulição; PM: peso molecular. FONTE: PERRY & CHILTON, 1980
Analisando as propriedades físico-químicas dos contaminantes (Tabela 6) e os
níveis detectados na cromatografia extraídos do Headspace (Tabela 5) foi observado que no
caso do benzeno (menor ponto de ebulição) obteve menor concentração que o controle,
visto que era esperado no caso de ser associado ao aceptor ou ao biossurfactante. O
aceptor (ensaio 2) não afetou a distribuição dele na porção volátil, ou seja, estava em maior
concentração que os demais em função de sua maior volatilidade. Em presença do
aceptor/biossurfactante (ensaio 3) o efeito de volatilização do benzeno está reduzido, como
mostra a sua menor concentração na mistura de vapores. No ensaio 4 (biossurfactante) a
presença de benzeno na superfície volátil foi cerca de 10 vezes menor que o controle.
Os contaminantes tolueno e xileno por possuírem pontos de ebulição e massa
molar maior que o benzeno, quando tratados com aceptor/biossurfactante (ensaio 3) e
biossurfactante (ensaio 4) apresentaram concentrações menores que o controle o que não
ocorreu quando estes foram tratados apenas com o aceptor de elétrons (ensaio 2), logo a
possibilidade de retenção destes pela ação do biossurfactante quando analisados por
Headspace tornou-se notória.
No ensaio 2, com aceptor de elétrons, todos os contaminantes estavam na
camada volátil da superfície tratada. A concentração no ensaio 4 foi a que menos favoreceu
a volatilização.
Considerando a viscosidade e a massa molar do contaminante xileno, fica
evidente a associação deste com o biossurfactante, visto pela migração ao longo do tempo
para as camadas mais profundas. Esperava-se que o xileno com uma viscosidade
aproximadamente 10 vezes superior aos demais (benzeno e tolueno) e massa molar
elevada, mostrasse maior migração, o que não foi verificado.
4.1.6 CONCLUSÕES
Nas condições de contaminação, com mistura equivalente a 5 mL de cada
solvente (benzeno, xileno e tolueno) por 22 kg de areia não estéril com 15% de umidade
inicial. O ensaio com biossurfactante influenciou a concentração dos contaminantes. Dos
76
contaminantes usados para a biorremediação, o xileno foi o que permaneceu por mais
tempo na superfície contaminada. Um tempo maior de retenção deste contaminante deve-se
ao fato deste possuir maior ponto de fusão 13,3 ºC, ponto de ebulição 144 ºC e viscosidade
de 6,475 cp a 20 ºC em relação aos outros contaminantes, benzeno e tolueno.
Os contaminantes utilizados no derrame simulado não ofereceram risco de
percolação, para uma profundidade de 0,40 m no reator utilizado e que com a proporção
1:1:1 totalizando 15 mL da mistura de benzeno tolueno e xileno (BTX), estes contaminantes
não oferecem riscos de percolação até o lençol freático, neste caso situado a 2 m da
superfície, pois não foram detectados nas amostras recolhidas pelo processo de lixiviação
natural decorrente de chuvas coletadas no final do reator.
4.1.7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALEXANDER, M. Biodegradation and Biorremediation. Academic Press. 2º Ed., New York,
453p., 1999.
AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION, Standard Methods for the Examination of
Water and Wastewater, 19th ed. APHA, Washington, DC., 1995.
AOAC- Association of Official Chemists. Official Methods of Analysis. 17th, 2001 CD-Rom.
BANAT, I. N.; MAKKAR, R. S.; CAMEOTRA, S. S. Potential commercial applications of
microbial surfactants. Applied Microbiology and Biotechnology, 53, 495-508, 2000.
BERTHE-CORTI, L.; FETZNER, S. Bacterial Metabolism of n-Alkanes and Ammonia under
Oxic, Suboxic and Anoxic Conditions. Acta Biotechnology. 2002, 3-4, 299-336.
BICCA, F. C.; FLECK, L. C.; AYUB, M. A. Z. Production of biosurfactant by hydrocarbon
degrading Rhodococcus ruber and Rhodococcus erythropolis. Revista de Microbiologia, 30,
231–236, 1999.
BOGNOLO, G. Biosurfactants as emulsifying agents for hydrocarbons. Colloids and
Surfaces. 152, 41-52, 1999.
BORDEN, R. C.; GOMEZ, C. A.; BECKER, M. T. Geochemical indicators of intrinsic
bioremediation. Ground Water, 33 (2), 180-189, 1995.
CHEN, S. Y.; LU, W. B.; WEI, Y. H.; CHEN, W. M.; CHANG, J. S. Improved production of
biosurfactant with newly isolated Pseudomonas aeruginosa S2. Biotechnol Prog, 23,661–6,
2007
77
COOPER, D. G.; GOLDENBERG, B. G. Surface-active agents from two Bacillus species.
Applied and Environmental Microbiology. 53, 2, 224-229, 1987.
COSTA, J. A. V. Produção de amiloglicosidase por fermentação em estado sólido em
biorreator de coluna. Tese de Doutorado em Engenharia de Alimentos – Universidade
Estadual de Campinas. Campinas-SP, 1996.
COSTA, S. G. V. A. O.; NITSCHKE, M.; HADDAD, R.; EBERLIN, M. N.; CONTIERO, J.
Production of Pseudomonas aeruginosa LBI ramnolipids following growth on Brasilian native
oils. Process Biochemistry. 41, 483-488, 2006.
GOUVEIA, E. R.; LIMA, D. P. A.; DUARTE, M. S.; LIMA, G. M. S.; ARAÚJO, J. M. Bactérias
produtoras de biossurfactantes – Produção de biossurfactantes por bactérias isoladas de
poços de petróleo. Revista Biotecnologia Ciência e Desenvolvimento, 30, 2003.
LISTA HOLANDESA DE VALORES 6530 CTESB-GTZ
Www.cetesb.sp.gov.br/soloarea_contaminados/anexo/ 6530
MADIGAM, M. T.; MARTINKO, J. M.; PARKER, J. Brock Biology of Microorganisms. 8ª ed.
New Jersey, Prentice-Hall., 606-768, 1997.
MAKKAR, R. S.; CAMEOTRA, S. S. Production of biosurfactant at mesophilic and
thermophilic conditions by a strain of Bacillus subtilis. Journal of Industrial Microbiology &
Biotechnology. 20, 48–52, 1998.
MARTINS, R. G.; PINTO, M. H.; SILVA, M. A.; COSTA, J. A. V. Biossurfactante bacteriano e
fúngico: produção através de fermentação em estado sólido utilizando resíduos
agroindustriais. Artigo publicado no XXII Congresso Regional de Iniciação Científica e
Tecnológica em Engenharia. Universidade de Passo Fundo. Passo Fundo-RS, 2007b.
MARTINS, R. G.; PINTO, M. H.; SILVA, M. A.; RADMANN, E. M.; COSTA, J. A. V. Influência
do teor de umidade e estudo da condição de extração na produção de biossurfactante pela
bactéria Corynebacterium aquaticum em processo fermentativo em estado sólido. Resumo
publicado no XIX Salão de Iniciação Científica. Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
Porto Alegre-RS, 2007a.
MAYER, R. M.; SOBERON-CHAVEZ, G. Pseudomonas aeruginosa rhamnolipids:
biosynthesis and potential applications. Applied Microbiology and Biotechnology, 54, 625-
633, 2000.
MORAIS, E.B., TAUK-TORNISIELO, S.M. Crescimento de bactérias isoladas de solo em
gasolina. Arquivos do Instituto biológico, 71, 272-274, 2004.
78
NITSCHKE, M.; PASTORE, G. M. Biossurfactantes: propriedades e aplicações. Química
Nova. 25, 5, 772-776, 2002.
PAR, J. F.; SIKORA, L. J.; BURGE, W. D. Factors affecting the degradation and inactivation
of waste constituents in soil. In Land Treatment of Hazardous Wastes Parr, J.F., Kla, J.M.
(eds).Park Ridge, NJ, Noyes Data Corp. 20-49,321-337, 1983.
PERRY, R. H.; CHILTON, C. H. Manual de engenharia química, 5ª ed., Guanabara Dois, Rio
de Janeiro, 1980.
PETERS, K. E.; WALTERS, C. C.; MOLDOWAN, J. M. The Biomerker Guide: Biomarkers
and Isotopes in the Environment and Human History. vol. 1, 2nd Ed, Cambridge University
Press. 2005.
RIZZO, A.C.L., LEITE, S.G.F., SORIANO, A.U., SANTOS, R.L.C., SOBRAL, L.G.S.
Biorremediação de solos contaminados por petróleo: ênfase no uso de biorreatores. Série
tecnologia Ambiental. STA-37, CETEM/MCT, 2006.
RODRIGUES, L.; MOLDES, A.; TEIXEIRA, J.; OLIVEIRA, R. Kinetic study of fermentative
biosurfactant production by Lactobacillus strains. Biochemical Engineering Journal. 28, 109-
116, 2006.
SUGUIO, K. Introdução à Sedimentologia. Ed. Edgard Blücher, 1973.
79
4.2 ESTUDO DA DEGRADAÇÃO DE HIDROCARBONETOS AROMÁTICOS
POLICÍCLICOS (HAPS) E DE HIDROCARBONETOS TOTAIS DE PETRÓLEO (HTP)
COM A UTILIZAÇÃO DE BIOSSURFACTANTES E DISPERSANTE QUÍMICO
Roque Lourenço Zílio e Jorge A. V. Costa*
* Laboratório de Engenharia Bioquímica, Escola de Química e Alimentos, Universidade Federal do
Rio Grande, Caixa Postal 474, CEP 96201-900, Rio Grande, RS, Brasil. Fax: +55-53-3233 8745. E-
mail: [email protected]
4.2.1 RESUMO
Hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs) e hidrocarbonetos totais de petróleo (HTP) são grupos de compostos que têm sido elementos de muitas pesquisas. Devido ao seu grande potencial tóxico, são considerados poluentes orgânicos prioritários em estudos ambientais. Estudos comprovam que algumas bactérias que vivem na crosta terrestre podem degradar componentes do petróleo. A procura por alternativas de remediação que possam minimizar seus efeitos em áreas contaminadas estão voltados para processos biológicos denominados biorremediação e pode ser definido como a utilização de micro-organismos que apresentam capacidade de metabolizar estes compostos e irá transformá-los em substâncias inertes, CO2 e água. O objetivo do presente trabalho foi estudar a biorremediação ex situ, em solo argiloso de Landfarming utilizando reatores de Policloreto de Vinila (PVC) com diâmetro de 100 mm e 2 m de altura com biossurfactante produzido pela bactéria Corynebacterium aquaticum, por crescimento aeróbico semi-sólido comparando-o com uma remediação química. A quantificação e identificação dos compostos hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs) e hidrocarbonetos totais de petróleo (HTP) foram realizados por cromatógrafo em fase gasosa com espectrometria de massa e cromatógrafo em fase gasosa com detector de ionização de chama, respectivamente. O ensaio com o biossurfactante extraído da bactéria C. aquaticum alcançou uma redução de 93,75% de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos enquanto que o dispersante químico Ultraspense II reduziu 50% destes compostos em 90 dias. O dispersante químico foi 43,75% menos efetivo no processo de degradação do que os biossurfactantes produzido pela C. aquaticum. Palavras-chave: Biossurfactante, Corynebacterium aquaticum, dispersante químico.
ABSTRACT
Polyciclic Aromatic Hydrocarbons (PAH) and Total Petroleum Hydrocarbons (TPH) have been have been the focus point of several research branchs, due to its great toxic potential, they are considerate primary organic pollutants in environmental studies. Literature describes several bacteria from the earth’s crust that may degrade such oil components. The search for alternatives in contaminated areas remediation, decreasing its effects in the surroundings, trough biotechnological alternatives is denominated bioremediation, and may be defined by the utilization of micro-organism, or a product produced by them, in order to reduce toxic compounds to inert substances, carbon dioxide and water. Therefore, this work objective was the landfarming soil bioremediation in polyvinyl chloride (PVC) reactors with internal diameter of 100 mm and 2 m high with Corynebacterium aquaticum produced biosurfactant in anaerobic semi-solid process and synthetic surfactant, in order to compare efficiencies. PAH and TPH identification and quantification was realize by gas chromatography coupled with mass spectrometry and flame ionization detector, respectively.
80
The essay with Corynebacterium aquaticum produced biosurfactant reached a 93,75% PAH decrease while the commercial surfactant Ultrapense II obtained 50% decrease after 90 days. Therefore, the synthetic surfactant was 43,75% less effective in the degradative process than the Corynebacterium aquaticum produced biosurfactant. Key-words: Biosurfactant, Corynebacterium aquaticum, chemical surfactant.
4.2.2 INTRODUÇÃO
A industrialização mundial está voltada e montada em sua capacidade
energética no petróleo e seus derivados. Com isto cresce a possibilidade de contaminação
por derrames inusitados degradando ambientes, geralmente atingindo grandes áreas
terrestres, marítimas, lacustres. O uso de novas tecnologias que visam minimizar os efeitos
destes contaminantes vem sendo estudados por vários seguimentos, sendo um destes a
biorremediação, que permite utilizar micro-organismos para a degradação destes
compostos, em sua maioria altamente prejudiciais a saúde humana.
Solos contaminados com hidrocarbonetos tendem a adsorver estes compostos.
Este problema pode ser minimizado pelo uso de surfactantes que agem como tensoativos
específicos para aumentar a relação de equilíbrio hidrofóbico/hidrofílico, que é de
importância crucial no processo de biodegradação. A biotecnologia vem apresentando
inúmeras vantagens de pesquisas para estes fins.
A variedade de poluentes orgânicos gerados pelo constante aumento da
atividade industrial é uma das causas diretas dos problemas relacionados ao meio ambiente
e à saúde (SPAIN et al., 2000; PAUL et al., 2005).
Segundo Sarkar et al. (2005) o petróleo e seus derivados são exemplos de
compostos químicos amplamente utilizados na sociedade moderna. Com a massiva
quantidade de combustível necessária para mover automóveis e gerar energia, o número de
vezes que um barril de petróleo é armazenado, extraído, transportado ou transferido, a
possibilidade de contaminação está propícia a suceder. Como o petróleo contém uma
variedade de compostos químicos como benzeno, tolueno, etilbenzeno, xileno, naftaleno,
dentre outros, esta contaminação pode ser perigosa para a saúde de plantas, animais e
humanos.
Em geral, a transformação química exercida por micro-organismos envolve, mais
comumente, a completa destruição ou a imobilização dos contaminantes, evitando assim, a
simples transferência de um compartimento ambiental para outro, como ocorre nos métodos
de ensaio químico como a incineração ou a extração, nos quais muitas vezes o poluente é
removido do solo, exigindo várias ações complementares para que não haja disponibilização
para a atmosfera. Além disso, a biorremediação é, reconhecidamente, de menor custo do
que muitas das melhores tecnologias de ensaio disponíveis (ULRICI, 2000).
81
Ghazali (2001) destaca que as técnicas de biorremediação, quando comparada
a outros procedimentos de recuperação ambiental, apresentam como vantagem a completa
destruição do contaminante, menor custo, maior segurança e menor interferência no meio
ambiente.
Muitos fatores influenciam a eficiência nos processos de biorremediação. Dentre
eles, citam-se a presença de micro-organismos apropriados, a disponibilidade de nutrientes,
a temperatura e o pH. A consideração e a correta otimização desses fatores é fundamental
para o sucesso da implementação de sistemas de biorremediação (COLLINA et al., 2004)
O termo biorremediação engloba uma série de tecnologias e técnicas distintas
para ensaio não só de solos, mas também de águas contaminadas e outros resíduos, que
podem ser classificadas em processos de ensaio in-situ ou ex-situ. Os processos de ensaio
in-situ são baseados no estímulo à biodegradação natural de contaminantes na sub-
superfície do solo, sem a escavação de sua camada superficial, através da adição de
nutrientes (principalmente nitrogênio, fósforo e potássio), oxigênio e, em alguns casos,
micro-organismos. Por outro lado, os processos de ensaio ex-situ são aqueles que
envolvem a remoção física do material contaminado do local e o seu encaminhamento para
outro local de ensaio (BOOPATHY, 2000).
Mulligan et al. (2001) relataram que o ensaio in situ é preferível por ter um custo
menor e ser menos destrutivo do que o ensaio ex situ. No entanto existem muitas
dificuldades com o processo in situ, por ser de difícil controle.
O objetivo do presente trabalho foi estudar a degradação ex situ de compostos
derivados de petróleo com agente biológico e químico.
4.2.3 MATERIAL E MÉTODOS
4.2.3.1 Produção dos biossurfactantes
Crescimento e manutenção do micro-organismo
Para a realização dos ensaios foi utilizada a bactéria Corynebacterium
aquaticum, cedida pelo Laboratório de Microbiologia de Alimentos da Faculdade de
Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas (FEA/UNICAMP).
As culturas de bactérias foram mantidas sob refrigeração, em tubos de ensaio e
em erlenmeyers contendo ágar nutriente, que foi formulado conforme a seguir (g.L-1): extrato
de carne (1,0); extrato de levedura (2,0); peptona (5,0); NaCl (5,0); e ágar-ágar (15,0)
(MAKKAR & CAMEOTRA, 1998).
82
A propagação dos inóculos foi realizada em frascos erlenmeyers contendo ágar
nutriente (g.L-1): extrato de carne (1,0); extrato de levedura (2,0); peptona (5,0); NaCl (5,0),
onde foi inoculada a cultura e seu crescimento foi acompanhado por 48 h a 30 ºC. Após, foi
realizada a raspagem da superfície do ágar com meio nutriente e ao atingir a densidade
ótica 0,8-0,9 em comprimento de onda de 600 nm, as suspensões foram utilizadas como
inóculo, sendo adicionadas ao meio de cultura na concentração de 2% (v/v) (MAKKAR &
CAMEOTRA, 2002).
Figura 1 Propagação dos inóculos em ágar nutriente
Cultivo em processo aeróbio
O cultivo aeróbio foi realizado em estado semi-sólido em biorreatores de coluna
de leito fixo, com dimensões internas 50 x 250 mm (diâmetro e altura). O ar que alimentou
as colunas passou primeiramente por filtros preenchidos com lã de vidro e posteriormente
sua vazão controlada por rotâmetros devidamente calibrados (Cole-Parmer Instrument
Company, USA). A corrente de ar foi umidificada, e em seguida realizada a remoção das
gotas, sendo posteriormente injetado nas colunas. A temperatura de incubação do meio foi
mantida constante em 30 °C proveniente de um banho termostatizado( Quimis Q 214M2
Brasil) pela circulação de água através do encamisamento do biorreator. O material utilizado
foi esterilizado a 121 °C por 15 min (MARTINS et al., 2007a). A umidade foi fixada em 65%.
Os cultivos aeróbios foram conduzidos durante um período de 144 h.
O meio de cultivo foi composto de casca de arroz e farelo de trigo nas
proporções 15 e 85%, respectivamente, com adição de solução nutriente composta por: 4 g
de NH4NO3; 4,0822 g de KH2PO4; 0,0008 g de CaCl2; 10,7182 g de Na2HPO4; 0,1971 g de
MgSO4; 0,0011 g de FeSO4 e 0,0015 g de EDTA e elevado ao volume final de 1 L (adaptado
de COOPER et al., 1987). Não foi adicionada fonte de carbono, visto que esta é proveniente
83
do farelo de trigo e casca de arroz. O farelo de trigo utilizado foi recolhido em peneiras de
diâmetro de 0,42 a 0,50 mm.
A Figura 2 apresenta esquema do cultivo em estado sólido em biorreator de
coluna.
Figura 2 Esquema de cultivo em estado sólido em biorreator de coluna. FONTE: COSTA (1996)
Extração do biossurfactante
A extração do biossurfactante do cultivo aeróbio em estado sólido foi realizada
com água aquecida a 90 °C na proporção 1:9 (farelo fermentado:solvente) (MARTINS et al.,
2007b). Após a adição do solvente, a amostra foi submetida à agitação em shaker (B. Braun
Certomat BS-1) a 160 rpm e 50 °C por 30 min, após sendo filtrada à vácuo para a retirada
de excesso de sólidos presentes. O filtrado foi centrifugado a 7000 rpm por 15 min, o
sobrenadante foi recolhido e utilizado para o processo de biorremediação (MARTINS, 2005).
Determinação da tensão superficial
A tensão superficial foi determinada em tensiômetro (Kruss Processor
Tensiometer K-9, Alemanha), usando o método do anel Du Nouy (Figura 3). Este
84
tensiômetro determina tensões superficiais e interfaciais com a ajuda de um anel l suspenso
e fixado em um tensiômetro. A amostra a ser analisada sempre líquida é colocada em um
recipiente específico do aparelho, o anel é mergulhado no líquido e zerado. A amostra é
então abaixada, de forma que o filme líquido produzido abaixo do anel é alongado. Quando
o filme líquido é estendido, uma força máxima é determinada e medida, obtendo-se a tensão
superficial. A tensão superficial foi determinada com a amostra em contato com o ar
(COSTA et al., 2006; RODRIGUES et al., 2006).
Figura 3 Medição da tensão superficial em tensiômetro FONTE: Laboratório de Engenharia Bioquímica da FURG
4.2.3.2 Biorremediação
Coleta da amostra de solo
A coleta de solo do landfarming foi realizada na célula de nº 3 da empresa
BRASKEM situada em Triunfo, Brasil, no Estado do Rio Grande do Sul, latitude 29°52ʼ
27,6ʼʼ S e longitude 51°23ʼ03,7ʼʼW. A Figura 4 apresenta coleta do solo do
landfarming.
85
Figura 4 Coleta de solo do landfarming
Preparo da amostra
Para os ensaios com o solo argiloso, não estéril proveniente do landfarming, os
biorreatores de Policloreto de Vinila (PVC) com diâmetro interno de 100 mm e 2 m de
comprimento, foram preenchidos com 22,0 kg de amostra deste solo previamente pesados
em balança semi-analítica esta amostra foi tratada com biossurfactantes e dispersante
químico.
Para a homogeneização utilizou-se um misturador tipo betoneira( CSM com as
seguintes características: capacidade do tambor de 130 L, Brasil) e rotação do tambor de 34
rpm com um tempo de 5 min para cada tipo de mistura. Em todos os ensaios foi avaliada a
ação dos biossurfactantes extraídos da C. aquaticum e do dispersante comercial, conforme
Tabela 1.
Tabela 1 Concentração do biossurfactante e dispersante químico
Ensaio Biossurfactante Dispersante 1/100
1 0 0
2 200% 0
3 0 100%
86
Montagem dos ensaios
Os ensaios foram realizados na parte externa do Laboratório de Engenharia
Bioquímica da FURG, em ambiente aberto expostos às condições ambientais naturais de
temperatura, umidade e suas variações. A biorremediação ocorreu durante 90 dias em
biorreatores de Policloreto de Vinila (PVC) com diâmetro interno de 100 mm e 2 m de
comprimento, posicionados na vertical com a parte inferior vedada e a superior aberta, um
total de3 biorreatores foram preparados para recolher o drenado e outros 21 reatores que
foram sacrificados para a retiradas das amostras (Figura 5), totalizando em 3 ensaios e 21
reatores.
Figura 5 Biorreatores para a biorremediação solo landfarming
Outros 3 biorreatores foram adaptados com uma tela de 200 mesh na parte
inferior do reator juntamente com um tampão externo e instalado um dreno para a coleta da
água proveniente da lixiviação, quando de precipitação pluviométrica. As amostras eram
recolhidas para posterior análise de hidrocarbonetos totais de petróleo (HTP) e
hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs). A Figura 6 apresenta os amostradores
utilizados na coleta das amostras proveniente da lixiviação.
87
Figura 6 Biorreatores de captação de água proveniente da lixiviação por precipitação
pluviométrica
No processo de biorremediação cada reator foi preenchido com 22 kg de solo
argiloso não estéril proveniente da célula de nº 3 do landfarming previamente tratados com
biossurfactante ou dispersante químico.
A quantidade de água não foi modificada, permanecendo em 21,15% no início
do processo de degradação. Foi utilizado biossurfactantes extraídos do crescimento aeróbio
em estado sólido da C. aquaticum e dispersante químico A concentração de biossurfactante
e do dispersante químico foram calculados pela média dos compostos em relação ao total
de hidrocarbonetos totais de petróleo (HTP).
Surfactante Químico
O surfactante comercial utilizado é uma mistura de álcool de éster graxo
etoxilado é espacialmente desenvolvido para uso como dispersante para derramamento de
óleo no mar. Segundo o fabricante do surfactante apresenta HLB (balanço hidrofílico-
lipofílico), apropriado para favorecer a concentração do tenso-ativos concentrar-se na
interface óleo-água, reduzindo a tensão superficial e interfacial, com conseqüente aumento
da área de contato, e formação de gotas de óleo com diâmetro reduzido. Este efeito
promoveria uma dispersão do óleo na água, que poderia facilitar a metabolização pelos
micro-organismos presentes.
88
Amostragem
Os ensaios de biorremediação tanto para as amostras sólidas como para as
líquidas (drenado) foram analisados durante 90 dias, sendo as mesmas coletadas em, 0, 7,
14, 21, 30, 60 e 90 dias para as determinações de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos
(HAPs) e hidrocarbonetos totais de petróleo (HTP), umidade, tensão superficial, temperatura
e pH. O teor de nitrogênio foi determinado nos tempos, 0, 30, 60 e 90 dias (somente para
amostras sólidas).
Coleta da amostra
As amostras foram retiradas dos biorreatores através de cisões axiais destrutivas
de 50 mm cada uma, abaixo da superfície e acima da base e mantendo o centro para as
outras amostragens nas distâncias de 40, 80, 120 e 160 cm, totalizando 6 amostras para
cada experimento. A Figura 7 mostra as distâncias dos pontos de coleta dos reatores e a
altura de cada corte para retirada das amostras.
Figura 7 Pontos de amostragens dos reatores
89
Determinações analíticas para a biorremediação
Os máximos e mínimos valores de temperatura foram verificados diariamente no
local da biorremediação, através de um centro de aquisição de dados (Fieldchrt, Novus , 8C,
U.S.A.) (Figura 8), desde o fundo do reator até a superfície com uma distância de 40 cm
entre os outros pontos totalizando 6 pontos de medição, distâncias estas iguais as dos
pontos de amostragens e com um intervalo de tempo de 30 min de diferença em cada
tomada de temperatura, com o uso do referido registrador.
Figura 8 Medição dos máximos e mínimos valores de temperatura
No processo de biorremediação, a medição do pH foi realizada em todos os
pontos de amostragens, nos tempos 0, 7, 14, 21, 30, 60 e 90 dias, através de potenciômetro
digital modelo Q-400PM (Quimis) utilizando eletrodo combinado tipo espada modelo V627
(Analion, Brasil), em todas as amostras coletadas.
O teor de umidade das amostras foi determinado no mesmo intervalo de tempo,
nos dias de amostragens, segundo metodologia da AOAC (2001), baseada na perda de
peso após a secagem em estufa a 105 ºC até peso constante segundo Association of
Official Chemists (2001).
O teor de nitrogênio das amostras coletadas no tempo zero, 30, 60 e 90 dias da
biorremediação foi analisado pelo método Macro-kjeldahl segundo STANDARD METHODS
(2005).
A amostra em análise foi pesada e diluída em uma proporção de 1:9
(soluto:solvente), o solvente universal foi aquecido a 90 ºC e adicionado a amostra. A
amostra foi homogeneizada, filtrada à vácuo com filtro qualitativo e o filtrado foi utilizado
90
para a determinação da tensão superficial dos ensaio no período da biorremediação
(MARTINS et al., 2007b).
A análise de tensão superficial foi realizada em tensiômetro (Kruss Processor
Tensiometer K-9) de fabricação alemã, usando o método do anel, sendo a tensão medida
com a amostra em contato com o ar (RODRIGUES et al., 2006). Neste método, um
recipiente contendo a amostra a ser analisada é suspenso até que o contato com a
superfície do anel seja registrado. O contato da amostra com o anel é desfeito, de maneira
que o filme líquido produzido abaixo do anel é alongado, sendo determinada a força máxima
necessária para a extensão do filme, obtendo-se a tensão superficial (RODRIGUES et al.,
2006).
As determinações de HAPs foram realizadas no laboratório da INNOLAB do
Brasil de acordo com ABNT NBR ISSO/IEC 17025 utilizando GC-MS (Cromatógrafo em fase
gasosa com espectrometria de massa) - Fabricante: Varian (GC-3800 e MS 2200 U.S.A.);
Tipo de coluna: capilar DB-5MS 30 m x 0,25 mm x 0,25 mm. Para arraste foi utilizado gás
hélio com velocidade de 1 mL.min-1 e a injeção realizada por meio líquido. À concentração
dos compostos é realizada diretamente pelo software Star Advanced versão 4.52 Varian.
As determinações de HTP foram realizadas no laboratório da INNOLAB do
Brasil, de acordo com ABNT NBR ISSO/IEC 17025 utilizando GC-FID (Cromatógrafo em
fase gasosa com detector de ionização de chama) Varian (GC-3800, U.S.A.) coluna capilar
DB-1MS 30 m x 0,25 mm x 0,25 mm. Para arraste foi utilizado gás hidrogênio com
velocidade de 1 mL.min-1 e a injeção realizada por meio líquido. À concentração dos
compostos foi realizada diretamente pelo software Star Workstation.
4.2.4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os ensaios de biorremediação foram realizados durante 90 dias utilizando solo
de landfarming em sistemas abertos expostos às condições ambientais e naturais, tanto de
temperatura quanto umidade e suas variações. A temperatura foi monitorada ao longo do
processo de biorremediação, sendo a mínima 6,0 ºC detectada no local e a máxima 34,1 ºC.
O pH variou de 5,31 a 7,43. Para o líquido drenado o maior valor de pH detectado foi 8,60 e
o menor 4,47. Nas amostras de solo a umidade variou de 6,84% a 28,27%, o nitrogênio sob
base seca teve uma variação de 0,25% a 0,15% e a tensão superficial apresentou maior
variação no ensaio 1, conforme Tabela 2.
91
Tabela 2 Valores máximos e mínimos para os parâmetros avaliados para hidrocarbonetos
totais de petróleo e hidrocarbonetos aromáticos policíclicos
Parâmetros Ensaio 1 Ensaio 2 Ensaio 3
Máx Mín Máx Mín Máx Mín
pH 7,43 6,15 7,24 5,31 7,28 5,31
Umidade % 28,27 6,84 24,78 7,42 23,30 10,95
Nitrogênio % (bs) 0,24 0,16 0,25 0,14 0,21 0,15
Tensão superficial (mN.m-1) 71,1 54,6 71,0 58,5 71,2 63,1
Máx: valor máximo; Mín: valor mínimo
As maiores variações de pH detectados no processo de biorremediação
ocorreram nos ensaio 2 e 3, estes registros mostraram que os valores detectados foram
próximos da neutralidade para valores ligeiramente ácido. Esta variação não afetou o
processo de biorremediação. Segundo Aislabie et al. (2006) os ácidos orgânicos podem se
acumular durante a biodegradação, sendo que a redução do valor do pH pode indicar
elevada atividade microbiológica no solo tratado.
É provável que esta variação no valor do pH ocorreu pela ação do surfactante e
do dispersante químico, aumentando a superfície de contato e por consequência facilitando
a ação dos micro-organismos. O pH ótimo para a ação dos micro-organismos é usualmente
próximo da neutralidade, mas muitos micro-organismos presentes podem agir sem prejuízos
de suas funções para valores de pH entre 5,0 e 9,0 (CORSEUIL & ALVAREZ, 1996).
O pH do solo influencia a carga de superfície de várias partículas de tamanho
coloidal do solo, principalmente em solos argilosos. Em solos de carga variável, uma
diminuição do pH torna menor a rede de cargas negativas, reduzindo a repulsão dos ânions
e aumentando a adsorção aniônica. O pH pode influenciar na solubilidade, mobilidade e nas
formas ionizadas dos contaminantes (JRB ASSOCIATES, INC., 1984).
A umidade do solo é outro fator de grande importância na biorremediação do
solo, visto que reduções relativamente pequenas de umidade resultam em significativas
reduções da atividade microbiológica do solo (JACQUES et al., 2007). O conteúdo de água
é considerado ótimo para a saturação do substrato, quando varia entre 30 e 85%
dependendo do tipo de substrato (MAUREL et al., 2003).
A umidade máxima detectada nos ensaios (28,27%) ficou um pouco abaixo dos
padrões segundo Maurel et al., 2003. Já o mínimo valor detectado de umidade (6,84%)
manteve-se bem abaixo do ideal, e mesmo assim o processo de biorremediação ocorreu,
pois houve uma alta taxa de degradação dos compostos em estudo.
92
A determinação da fonte de nitrogênio é essencial para o processo de
biorremediação, pois o nitrogênio está intimamente relacionado ao metabolismo dos micro-
organismos. Das várias formas de nitrogênio encontradas na natureza, os micro-organismos
assimilam mais facilmente na forma de amônia. Porém, micro-organismos que possuem
enzimas nitrato reductase e nitrito reductase, apresentam a capacidade de assimilar,
respectivamente, nitrato ou nitrito, reduzindo nitrato a nitrito, e nitrito à amônia (PUTZKE,
2002).
A provável diminuição nas concentrações de nitrogênio deve ter ocorrido devido
à micro-organismos anóxicos em sua maioria consumirem nitrogênio pela suas vias
metabólicas, já que a amostra utilizada não era estéril.
A redução nos valores da tensão superficial observada nos 3 ensaios, deve-se
provavelmente ao aumento da carga microbiana, podendo apresentar propriedades
biossurfactantes extra ou intracelular. O ensaio 3 (com dispersante químico) apresentou
menor redução para tensão superficial. Um dos motivos pode ser devido a alguma
toxicidade deste dispersante químico, visto que quando ausente (ensaios 1 e 2), a redução
na tensão superficial foi mais acentuada, já que há um aumento do número de micro-
organismos no ensaio 1 e uso do biossurfactante no ensaio 2.
Tabela 3 Temperatura máximas e mínimas (ºC) e desvio padrão dos ensaios,
Hidrocarbonetos Totais de Petróleo e Hidrocarbonetos Aromáticos Policíclicos.
Tempo (dia) Tmax Tmax média Tmin Tmin média
0 34,10 26,15±4,0 14,9 15,68±0,7
7 21,30 19,65±1,0 13,4 14,35±0,8
14 28,40 23,5±2,4 6,0 7,35±0,9
21 28,10 24,1±2,0 10,8 11,78±0,8
30 27,20 22,5±2,5 11,4 12,56±1,1
60 22,10 18,88±2,1 7,7 8,916±1,1
90 28,30 26,77±1,3 18,2 19,55±1,0
Tmax: temperatura máxima alcançada no dia;Tmax média: temperatura máxima média do dia ± desvio
padrão; Tmin: temperatura mínima alcançada no dia;Tmin média: temperatura mínima média do dia ±
desvio padrão.
A temperatura é um dos fatores ambientais mais importantes que influenciam a
atividade e a sobrevivência dos micro-organismos (CORSEUIL & ALVAREZ, 1996).
Em geral, a temperatura ótima para a atividade de micro-organismos mesófilos
se situa na faixa entre 25 e 30 ºC, embora ainda sejam capazes de manter o seu
93
metabolismo ativo em temperaturas um pouco acima ou abaixo dessa faixa de modo mais
lento (MADIGAN et al., 2004; MOREIRA & SIQUEIRA, 2006). A diminuição da temperatura
reduz a atividade microbiana, principalmente pelo enfraquecimento das ligações entre as
proteínas, o que compromete a fluidez da membrana celular e, por conseguinte, a entrada
de nutrientes e saída dos produtos do metabolismo. Por outro lado, o aumento da
temperatura provoca a desnaturação das proteínas celulares (enzimas) inviabilizando as
reações metabólicas (MADIGAN et al., 2004; MOREIRA & SIQUEIRA, 2006).
Figura 9 Concentração de Hidrocarbonetos Aromáticos Policíclicos ao longo do tempo para
ensaios com solo landfarming
94
Figura 10 Concentração de Hidrocarbonetos Aromáticos Policíclicos ao longo do tempo para
ensaios com biossurfactante
Figura 11 Concentração de Hidrocarbonetos Aromáticos Policíclicos ao longo do tempo para
ensaios com dispersante químico
95
As Figuras 9 a 11 apresentam os ensaios de biorremediação realizados no
período de 90 dias para os compostos de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs).
Em solos com alto teor de argila e contaminados com altas concentrações de compostos
hidrofóbicos, a técnica de biorremediação sofre limitações, tendo em vista que estes
compostos, por estarem sorvidos na matriz do solo, estão pouco disponíveis para ação dos
micro-organismos (BANAT, 1995; DESCHÊNES et al., 1996; LIN, 1996; BOGNOLO, 1999;
MAYER & CHAVEZ, 2000; MORAN et al., 2000; OU, 2000; NITSCHKE & PASTORE, 2002;
NOORMAM et al. 2002; MULLIGAN et al., 2001). Dessa maneira, a adição de
biossurfactantes e/ou surfactantes auxiliam a técnica de biorremediação aumentando a
disponibilidade dos hidrocarbonetos para iniciar o ataque dos micro-organismos presentes
no solo.
Nas Figuras 9 (amostra) e 11 (dispersante químico) a ação de extração dos
compostos sorvidos na matriz foi mais rápida, ocorrendo no 14º dia do processo. Quando foi
utilizado biossurfactante, esta ação foi detectada no 21º dia da biorremediação, mesmo com
um período maior de adsorção dos compostos, este obteve maior degradação dos
hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs) no fim do processo de biorremediação. Uma
provável ação no aumento do tempo pode ter possibilitado a uma melhor adaptação dos
micro-organismos da biota nativa, existentes no meio e por consequência uma maior ação
no processo de biorremediação.
Tabela 4 Concentração de Hidrocarbonetos Aromáticos Policíclicos (µg.L-1) no drenado
Tempo (dia) Ensaio 1 Ensaio 2 Ensaio 3
0 NA NA NA
7 ND ND ND
14 1,80 ND 4,12
21 0,55 1,57 1,00
30 ND ND ND
60 ND ND 1,00
90 ND ND ND
ND: não detectado, NA: não analisado
Quando os compostos hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs) que
estavam sorvidos na amostra foram liberados, estes começaram a se dissipar para o meio,
sendo arrastado pelo processo de lixiviação e então detectado nas amostras líquidas
recolhidas do drenado a 2 m da superfície do reator. Na Tabela 4 pode-se verificar que os
ensaios 1 e 3 arrastaram mais compostos poluentes para um possível lençol freático que o
96
ensaio 2, quando foi utilizado o biossurfactante como agente dispersante. Neste caso é
provável que a ação dos biossurfactantes foi mais eficiente por aumentar o tempo de
retenção dos poluentes possibilitando uma maior degradação dos compostos e por
consequência arrastar menor quantidade para a amostra líquida que os outros ensaios,
landfarming e o dispersante químico.
Figura 12 Concentração de hidrocarbonetos totais de petróleo ao longo do tempo para
ensaios com landfarming, biossurfactante e dispersante químico
Os três ensaios realizados, durante 90 dias o processo de biorremediação,
apresentaram uma peculiaridade conforme visualiza-se na Figura 12, uma redução no HTP,
sendo que em todos os ensaios realizados na amostra que é proveniente do landfarming,
suas concentrações de hidrocarbonetos totais de petróleo (HTP) estiveram sempre superior
aos outros dois ensaios (biossurfactante e dispersante químico) e que a partir do 30º dia
começou a ocorrer um acréscimo dos compostos analisados, sendo provável que estes
estivessem sorvidos pela matriz e que com o decorrer do tempo os mesmos foram sendo
extraídos do meio e detectados em maiores concentrações. Outra provável situação é que
estes foram sendo degradados e modificando suas estruturas químicas, podendo dar origem
a outros compostos e por fim começarem a ser degradados. Estas mudanças podem
97
aumentar as quantidades de compostos que acabam sendo detectados pelo método
cromatográfico como HTP.
Nos últimos 30 dias da biorremediação, o ensaio com biossurfactante mostrou-
se mais eficiente que o landfarming, já o dispersante químico foi mais eficiente pela
diferença em sua concentração detectada em relação aos demais.
Zemo & Foote (2003) relatam que os componentes não dissolvidos do petróleo,
podem ficar retidos dentro das amostras de solo, e que os hidrocarbonetos não polares que
estão presentes nas amostras, derivados de fontes naturais e de processos de oxidação
química e biológica, podem ser um problema para a identificação dos HTP durante as
análises típicas destes compostos.
A etapa limitante na biorremediação é o baixo nível de disponibilidade de certos
hidrocarbonetos, seja por estarem sorvidos na matriz do solo ou por possuírem baixa
solubilidade em sistemas aquosos, ambos impossibilitam o ataque microbiano. Entretanto,
os biossurfactantes podem auxiliar na biodisponibilidade através da dessorção do óleo cru
sorvido no solo e pelo aumento da solubilidade dos mesmos (MORAN et al., 2000; OU,
2000).
Outro fator a ser considerado é que pequenas concentrações de HTP foram
detectadas no líquido proveniente da lixiviação nos três ensaios no 21º dia e no final do
processo de biorremediação que neste caso foi de 90 dias, o que torna provável que estes
pela mudança de suas polaridades tornaram-se mais polares e aumentaram sua
solubilidade sendo arrastados pela água (Tabela 5).
Tabela 5 Concentração de Hidrocarbonetos Totais de Petróleo detectada no drenado
(µg.L-1)
Tempo (dia) Ensaio 1 Ensaio 2 Ensaio 3
0 NA NA NA
7 ND ND ND
14 ND ND ND
21 <150 <225 <300
30 ND ND ND
60 ND ND ND
90 <900 <4500 <1380
ND: não detectado NA: não analisado
98
4.2.5 CONCLUSÕES
A distribuição dos contaminantes observada no período de biorremediação (90
dias) mostrou que ao longo do tempo de coleta o ensaio com os biossurfactantes extraídos
da C. aquaticum afetou de maneira positiva a degradação dos hidrocarbonetos aromáticos
policíclicos (HAPs) em 93,75% dos compostos analisados, sendo 43,75% superior ao
dispersante químico, além de gerar menor arraste destes compostos para o coletor de
líquido a 2 m da superfície do reator, um possível lençol freático.
A baixa umidade detectada nos reatores não afetou negativamente o processo
de biorremediação dos compostos analisados e provavelmente também permitiu a
permeação dos contaminantes para o interior das células microbianas da biota nativa,
quando utilizado surfactantes produzido pela C. aquaticum.
Este trabalho mostrou a viabilidade do uso de biossurfactantes produzido via
processo aeróbio pela C. aquaticum na dispersão e degradação do petróleo e seus
derivados.
4.2.6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AISLABIE, J.; SAUL, D. J.; FOGHT, J. M. Bioremediation of hydrocarbon-contaminated polar
soils. Extremophiles, 10:171–9, 2006.
AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION, Standard Methods for the Examination of
Water and Wastewater, 19th ed. APHA, Washington, DC., 1995.
AOAC- Association of Official Chemists. Official Methods of Analysis. 17th, 2001 CD-Rom.
BANAT, I. M. Biosurfactants Production and Possible Uses in Microbial Enhanced Oil
Recovery and Oil Pollution Remediation: A Review Biosurfactants Production and
Aplications. 1995.
BOOPATHY, R. Factors limiting bioremediation technologies. Bioresource Technology, 74,
63-67, 2000.
COOPER, D. G.; GOLDENBERG, B. G. Surface-active agents from two Bacillus species.
Applied and Environmental Microbiology. 53, 2, 224-229, 1987.
CORSEUIL, H. X. Influência do Receptor de Elétrons na Biorremediação de Águas
Subterrâneas Contaminadas por Derramamentos de Gasolina. VI Simpósio Luso Brasileiro
de /engenharia Sanitária e Ambiental, Vol. I, p.68-75, Florianópolis, 1994.
99
COSTA, J. A. V. Produção de amiloglicosidase por fermentação em estado sólido em
biorreator de coluna. Tese de Doutorado em Engenharia de Alimentos – Universidade
Estadual de Campinas. Campinas-SP, 1996.
COSTA, S. G. V. A. O.; NITSCHKE, M.; HADDAD, R.; EBERLIN, M. N.; CONTIERO, J.
Production of Pseudomonas aeruginosa LBI ramnolipids following growth on Brasilian native
oils. Process Biochemistry. 41, 483-488, 2006.
DESCHÊNES, L.; LAFRANCE, P.; VILLENEUVE, J. P.; SAMSOM, R. Adding sodium
dodecyl sulfate and Pseudomonas aeruginosa UG2 biosurfactant inhibits polycyclic aromatic
hydrocarbon biodegradation in a weathered creosote contaminated soil. Applied
Microbiology and Biotechnology, 46 (5-6), 638-646, 1996.
GHAZALI, F. M. Bioremediation of petroleum hydrocarbons by microbial consortia. Proc.
NSF Workshop. 1-5, 2001.
JACQUES, R. J. S.; BENTO, F. M.; ANTONIOLLI, Z. A.; CAMARGO, F. A. O.
Biorremediação de solos contaminados com hidrocarbonetos aromáticos policíclicos.
Ciência Rural. 37, 4, 1192-1201, 2007.
JRB ASSOCIATES, Inc. “Summary reaport: Remedial Response at Hazardous Waste Site”.
Prepared for Municipal Environmental Research Laboratory. Cincinnati, OH, 1984.
LIN, S-C. Biosurfactants:recent advances. Journal of Chemical Technology and
Biotechnology.,, 66, 109-120, 1996.
MADIGAN, M. T.; MARTINKO, J. M.; PARKER, J. Brock Biology of Microorganisms. 8ª ed.
New Jersey, Prentice-Hall., 606-768, 1997.
MAKKAR, R. S.; CAMEOTRA, S. S. An update on the use of unconventional substrates for
biosurfactant production and their new application. Applied Microbiology and Biotechnology.
58, 428-434, 2002.
MARTINS, R. G.; PINTO, M. H.; SILVA, M. A.; COSTA, J. A. V. Biossurfactante bacteriano e
fúngico: produção através de fermentação em estado sólido utilizando resíduos
agroindustriais. Artigo publicado no XXII Congresso Regional de Iniciação Científica e
Tecnológica em Engenharia. Universidade de Passo Fundo. Passo Fundo-RS, 2007b.
MARTINS, R. G.; PINTO, M. H.; SILVA, M. A.; RADMANN, E. M.; COSTA, J. A. V. Influência
do teor de umidade e estudo da condição de extração na produção de biossurfactante pela
bactéria Corynebacterium aquaticum em processo fermentativo em estado sólido. Resumo
publicado no XIX Salão de Iniciação Científica. Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
Porto Alegre-RS, 2007a.
100
MARTINS, V. G. Produção de biossurfactante por fermentação em estado sólido e sua
utilização em biorremediação. Dissertação de Mestrado em Engenharia e Ciência de
Alimentos – Fundação Universidade Federal do Rio Grande. Rio Grande-RS, 2005.
MAUREL, V. B.; ORLIAC, O.; CHRISTEN, P. Sensors and measurements in solid state
fermentation: a review. Process Biochemistry. 38, 881-896, 2003.
MAYER, R. M.; SOBERON-CHAVEZ, G. Pseudomonas aeruginosa rhamnolipids:
biosynthesis and potential applications. Applied Microbiology and Biotechnology, 54, 625-
633, 2000.
MORÁN, A. C.; OLIVEIRA, N.; COMMENDATORE, M. ESTEVES, J. L.; SINERIZ, F.
Enhancement of hydrocarbon waste biodegradation by addition of a biosurfactant from
Bacillus subtilis, Biodegradation, 11, 65-71. 2000.
MOREIRA, M. S. F.; SIQUEIRA, J. O. Microbiologia e bioquímica do solo. Editora UFLA,
626p. 2002.
MULLIGAN, C. N.; YONG, R. N.; GIBBS, B. F. Surfactant-enhanced remediation of
contaminated soil: a review. Engineering Geology, 60, 371-380, 2001.
MULLIGAN, C. N.; YONG, R. N.; GIBBS, B. F. Surfactant-enhanced remediation of
contaminated soil: a review. Engineering Geology, 60, 371-380, 2001.
NITSCHKE, M., PASTORE, G.M. Biossurfactantes: propriedades e aplicações. Química
Nova, 25, 772-776, 2002.
NOORDMAN, W. H.; WACHER, J. J. J.; BOER, G. L.; JANSSEN, D. B. The enhancement by
biosurfactants of hexacadene degrade by Pseudomonas aeruginosa varies with substrate
availability. Journal of Biotechnology, 94; 195-121. 2002.
OU, Z. Q. “Separate and combinate environmental behavior of surfactants and polycyclic
aromatic hydrocarbons (PAHs)”. Disponível em: Ihttp://tumb1.biblio.tu
muenchen.de/publ/diss/ww/2000/ou.pdf. Acessado em março 2002.
PUTZKE, J.; PUTZKE, M. T. L.; Reino dos Fungos, Vol. 2. Editado por EDUNISC. 630-632,
2002.
RODRIGUES, L.; MOLDES, A.; TEIXEIRA, J.; OLIVEIRA, R. Kinetic study of fermentative
biosurfactant production by Lactobacillus strains. Biochemical Engineering Journal. 28, 109-
116, 2006.
SARKAR, D.; FERGUSON, M.; DATA, R.; BIRNBAUM, S. Bioremediation of petroleum
hydrocarbons in contaminated soils: Comparison of biosolids addition, carbon
101
supplementation, and monitored natural attenuation. Environmental Pollution. 136, 187-195,
2005.
ULRICI, W. Contaminated soil areas, different countries and contaminants monitoring of
contaminants. Biotechnology, 11b, 5-42, 2000.
CAPÍTULO V - CONCLUSÕES GERAIS
105
5 CONCLUSÃO GERAL
Nos ensaios com benzeno, tolueno e xileno nas concentrações utilizadas e na
área do derrame simulado, pode-se afirmar que estes compostos não oferecem risco de
percolação para uma profundidade de 0,4 m abaixo da superfície, quando utilizado como
matriz solo arenoso.
Os biossurfactantes produzidos pela C. aquaticum utilizados para o processo de
biorremediação foram eficientes na redução dos hidrocarbonetos aromáticos policíclicos
(HAPs), sendo que em 90 dias alcançou uma redução de 93,75% em relação à amostra
landafarming.
A menor concentração de hidrocarbonetos totais de petróleo (HTP) detectados
nas amostras líquidas provenientes da lixiviação também foi registrada quando utilizou-se
biossurfactante.
O dispersante químico utilizado mostrou uma eficiência menor (43,75%) quando
comparado com os biossurfactantes extraídos da bactéria C. aquaticum.
Baixas taxas de umidades não afetaram o processo de biorremediação quando
foi utilizado biossurfactantes provenientes da bactéria C. aquaticum.
Este estudo mostra a viabilidade do uso de biossurfactantes produzido via
processo aeróbio pela C. aquaticum na dispersão e degradação do petróleo e seus
derivados.
106
6 SUGESTÕES PARA FUTUROS TRABALHOS
− Avaliar diferentes subprodutos como fonte adicional de carbono;
− Avaliar diferentes métodos para extração dos biossurfactantes;
− Estudar diferentes concentrações de BTX e avaliar a sua percolação;
− Diminuir os intervalos de amostragens para BTX;
− Estudar outros métodos de determinação para BTX;
− Testar outras aplicações do biossurfactante na indústria;
− Avaliar a ação do surfactante em outros compostos hidrofóbicos, gorduras vegetais e
animal;
− Testar diferentes taxas de umidades menores de 15%;
− Avaliar tempo de degradação total dos compostos HAPs;
− Estudar a ação do surfactante em meios líquidos;
− Testar consórcios com diferentes concentrações de biossurfactantes e aceptores;
− Estudar concentrações menores do surfactante;
− Estudar custo de produção em escala industrial.
107
APÊNDICES
108
APÊNDICE 1 - Resultados referentes ao artigo 1 - Biorremediação de solo arenoso
contaminados por derrame simulado com benzeno, tolueno e xileno
Data: 07/06/2010
ensaio 1 pH Umidade (%)
TS (ajustada)
N (%) base seca
Benzeno mg/Kg
Xileno mg/Kg
Tolueno mg/Kg
1.1.0 7,07 8,09±0,30 65,9±0,17 0,082 980 2938 2137 1.2.0 7,46 9,38±0,00 65,3±0,20 0,093 <1 <1 <1 1.3.0 7,63 9,51±0,36 60,7±0,92 0,059 <1 <1 <1 1.4.0 7,46 18,47±0,08 63,4±0,12 0,096 na na na 1.5.0 7,5 16,36±0,28 62,9±0,35 0,076 <1 <1 <1 1.6.0 7,48 16,22±1,25 65,6±0,60 0,046 <1 <1 <1
drenado 8,02 - 66,3±1,76 na <1 <1 <1
Data: 07/06/2010
ensaio 2 pH Umidade
(%) TS
(ajustada) N (%)
base seca Benzeno mg/Kg
Xileno mg/Kg
Tolueno mg/Kg
2.1.0 6,82 7,42±0,07 66,3±0,93 0,061 10609 3315 2381 2.2.0 6,89 7,93±0,27 67,3±0,47 0,049 <1 <1 <1 2.3.0 6,55 10,25±0,27 65,4±0,25 0,072 <1 <1 <1 2.4.0 4,59 18,85±0,41 63,7±0,23 0,065 <1 <1 <1 2.5.0 6,64 17,62±0,57 63,4±0,86 0,06 <1 <1 <1 2.6.0 6,88 16,87±1,34 61±0,15 0,077 <1 <1 <1
Drenado 8,19 - 60,1±0,20 na <1 <1 <1
Data: 07/06/2010
ensaio 3 pH Umidade
(%) TS
(ajustada) N (%)
base seca Benzeno mg/Kg
Xileno mg/Kg
Tolueno mg/Kg
3.1.0 6,84 10,32±0,32 53,5±1,63 0,05 688 1918 1382 3.2.0 6,61 8,59±0,03 60,4±,46 0,068 <1 <1 <1 3.3.0 6,76 9±0,06 58,9±015 0,074 <1 <1 <1 3.4.0 6,7 9,97±0,12 58,9±1,76 0,046 <1 <1 <1 3.5.0 6,62 12,25±1,12 61,6±,86 0,064 <1 <1 <1 3.6.0 6,64 16,47±0,53 62,9±1,51 0,046 <1 <1 <1
drenado 8,2 - 70,2±0,64 na <1 <1 <1
Data: 07/06/2010
ensaio 4 pH Umidade (%)
TS (ajustada)
N (%) base seca
Benzeno mg/Kg
Xileno mg/Kg
Tolueno mg/Kg
4.1.0 7,02 8,54±0,18 64,8±0,70 0,05 97 1178 488 4.2.0 7,33 8,14±0,28 66,5±0,06 0,044 <1 <1 <1 4.3.0 7,44 10,02±0,46 64,3±0,98 0,028 <1 <1 <1 4.4.0 7,29 17,82±0,46 66,1±0,21 0,057 <1 <1 <1 4.5.0 7,31 17,92±0,82 64,4±0,40 0,073 <1 <1 <1 4.6.0 7,51 17,72±0,26 65,5±0,17 0,074 <1 <1 <1
drenado 8,15 - 65,5±0,15 na <1 <1 <1
109
Data: 09/06/2010
ensaio 1 pH Umidade% TS
(ajustada) N (%)
base seca Benzeno mg/Kg
Xileno mg/Kg
Tolueno mg/Kg
1.1.2 7,4 5,21±0,02 71±0,06 0,075 <1 27 1 1.2.2 7,44 8,99±0,67 69,5±1,11 0,095 <1 <1 <1 1.3.2 7,34 8,33±0,12 69,1±0,55 0,074 <1 <1 <1 1.4.2 7,29 20,17±0,79 69,9±0,29 0,074 <1 <1 <1 1.5.2 7,45 18±0,98 69,5±0,49 0,075 <1 <1 <1 1.6.2 7,32 16,37±0,92 71,1±0,15 0,114 <1 <1 <1
drenado 8,4 - 72,3±0,10 na <1 <1 <1
Data: 09/06/2010
ensaio
2 pH Umidade% TS (ajustada)
N (%) base seca
Benzeno mg/Kg
Xileno mg/Kg
Tolueno mg/Kg
2.1.2 6,53 2,78±0,07 70,4±0,78 0,07 <1 28 <1 2.2.2 6,76 7,22±0,10 70,6±0,62 0,063 <1 <1 <1 2.3.2 6,65 19,64±0,35 70,8±0,84 0,071 <1 <1 <1 2.4.2 6,84 20,71±1,06 70,8±0,98 0,099 <1 <1 <1 2.5.2 6,72 18,15±0,03 70,4±0,71 0,089 <1 <1 <1 2.6.2 6,69 17,06±0,46 71,8±0,00 0,055 <1 <1 <1
drenado 8,15 - 72,1±0,06 na <1 <1 <1
Data: 09/06/2010
ensaio
3 pH Umidade% TS (ajustada)
N (%) base seca
Benzeno mg/Kg
Xileno mg/Kg
Tolueno mg/Kg
3.1.2 6,72 3,47±0,10 67,8±0,20 0,071 <1 20 1 3.2.2 6,55 6,88±0,20 70,2±0,38 0,099 <1 <1 <1 3.3.2 6,8 14,09±0,44 69,9±0,40 0,073 <1 <1 <1 3.4.2 6,65 20,05±0,50 71,2±0,59 0,099 <1 <1 <1 3.5.2 6,63 16,98±0,06 68,4±0,23 0,085 <1 <1 <1 3.6.2 6,73 17,53±1,38 71,2±0,31 0,07 <1 <1 <1
drenado 8,4 - 73±0,10 na <1 <1 <1
Data: 09/06/2010 ensaio
4 pH Umidade% TS (ajustada)
N (%) base seca
Benzeno mg/Kg
Xileno mg/Kg
Tolueno mg/Kg
4.1.2 7,25 4,05±0,06 70,9±00,66 0,079 <1 6 <1 4.2.2 7,44 8,19±0,04 70,6±0,36 0,074 <1 <1 <1 4.3.2 6,48 8,31±0,15 71±0,10 0,085 <1 <1 <1 4.4.2 7,44 23,51±1,82 70,7±0,61 0,095 <1 <1 <1 4.5.2 7,49 17,87±0,11 70,4±1,37 0,073 <1 <1 <1 4.6.2 7,43 15,55±0,04 70,5±0,95 0,076 <1 <1 <1
drenado 8,3 - 72,5±0,12 na <1 <1 <1
110
Data: 14/06/2010
ensaio 1 pH Umidade% TS
(ajustada) N (%)
base seca Benzeno mg/Kg
Xileno mg/Kg
Tolueno mg/Kg
1.1.7 7,4 3,6±0,04 67,6±0,15 0,055 <1 <1 <1 1.2.7 7,44 6,86±0,06 65,7±2,16 0,06 <1 <1 <1 1.3.7 7,34 9,15±0,96 66,2±,36 0,07 <1 <1 <1 1.4.7 7,29 17,21±0,39 66,5±,21 0,063 <1 <1 <1 1.5.7 7,45 16,77±0,04 61,3±1,59 0,07 <1 <1 <1 1.6.7 7,32 15,04±0,14 68,3±1,48 0,084 <1 <1 <1
drenado 8,4 - 66,1±,87 0,001g/L <1 <1 <1
Data: 14/06/2010
ensaio
2 pH Umidade% TS (ajustada)
N (%) base seca
Benzeno mg/Kg
Xileno mg/Kg
Tolueno mg/Kg
2.1.7 6,53 4,39±0,08 57,2±0,76 0,059 <1 <1 <1 2.2.7 6,76 6,08±0,17 61,8±0,35 0,061 <1 <1 <1 2.3.7 6,65 11,09±0,35 53,5±0,38 0,082 <1 <1 <1 2.4.7 6,84 16,85±0,21 57,4±0,35 0,092 <1 <1 <1 2.5.7 6,72 16,03±0,34 59,7±0,47 0,073 <1 <1 <1 2.6.7 6,69 14,64±0,21 55,9±0,38 0,072 <1 <1 <1
drenado 8,15 - 65±0,40 0,001 g/L <1 <1 <1
Data: 14/06/2010
ensaio
3 pH Umidade% TS (ajustada)
N (%) base seca
Benzeno mg/Kg
Xileno mg/Kg
Tolueno mg/Kg
3.1.7 6,72 5,13±0,00 64,2±0,70 0,066 <1 <1 <1 3.2.7 6,55 7,17±0,23 68,5±0,90 0,064 <1 <1 <1 3.3.7 6,8 11,97±0,14 67,5±1,00 0,069 <1 <1 <1 3.4.7 6,65 19,45±0,26 67,1±0,70 0,066 <1 <1 <1 3.5.7 6,63 16,1±0,86 67,3±0,80 0,087 <1 <1 <1 3.6.7 6,73 14,76±0,06 67,7±0,80 0,064 <1 <1 <1
drenado 8,4 - 71,7±0,53 0,004g/L <1 <1 <1
Data: 14/06/2010 ensaio
4 pH Umidade% TS
(ajustada) N (%)
base seca Benzeno mg/Kg
Xileno mg/Kg
Tolueno mg/Kg
4.1.7 7,25 4,54±0,19 68,9±1,39 0,056 na na na 4.2.7 7,44 7,58±0,56 68±0,17 0,058 na na na 4.3.7 6,48 13,78±0,31 67,2±0,15 0,077 na na na 4.4.7 7,44 18,85±0,02 68,3±0,53 0,061 na na na 4.5.7 7,49 16,71±0,99 64±1,07 0,075 na na na 4.6.7 7,43 15,05±0,07 65,3±0,52 0,047 na na na
drenado 8,3 - 71,5±0,53 0,001g/L <1 <1 <1
111
Data: 21/06/2010
ensaio 1 pH Umidade% TS (ajustada)
N (%)base seca
Benzeno mg/Kg
Xileno mg/Kg
Tolueno mg/Kg
1.1.14 7,51 4,01±0,19 71±0,52 0,074 <1 <1 <1 1.2.14 7,71 6,98±0,01 70,8±0,46 0,055 <1 <1 <1 1.3.14 7,84 18,59±1,41 68±0,06 0,091 <1 <1 <1 1.4.14 7,65 16,05±0,86 68,9±0,32 0,076 <1 <1 <1 1.5.14 7,6 15,83±0,43 71±0,40 0,097 <1 <1 <1 1.6.14 7,64 18,41±5,04 69,2±0,35 0,101 <1 <1 <1
drenado 8,06 - 74,2±0,29 0,00308 <1 <1 <1
Data: 21/06/2010
ensaio 2 pH Umidade% TS
(ajustada) N (%)base
seca Benzeno mg/Kg
Xileno mg/Kg
Tolueno mg/Kg
2.1.14 8,16 4,61±0,68 71,8±0,38 0,046 <1 <1 <1 2.2.14 8,09 6,97±0,01 71,8±0,35 0,066 <1 <1 <1 2.3.14 6,95 20,21±0,22 71,1±0,99 0,076 <1 <1 <1 2.4.14 6,93 16,21±0,29 71,9±0,12 0,078 <1 <1 <1 2.5.14 7,49 16,84±0,15 71,1±0,35 0,082 <1 <1 <1 2.6.14 7,12 14,89±0,27 70,3±0,29 0,075 <1 <1 <1
drenado 7,9 - 63,9±0,36 0,0046 <1 <1 <1
Data: 21/06/2010
ensaio 3 pH Umidade% TS
(ajustada) N (%)base
seca Benzeno mg/Kg
Xileno mg/Kg
Tolueno mg/Kg
3.1.14 7,87 4,55±0,41 70,6±0,72 0,081 <1 <1 <1 3.2.14 8,16 9,76±0,06 69,5±0,70 0,06 <1 <1 <1 3.3.14 6,98 19,44±0,39 70,2±0,89 0,07 <1 <1 <1 3.4.14 6,95 16,24±0,35 71,6±0,35 0,092 <1 <1 <1 3.5.14 7,18 15,41±1,44 70,5±0,42 0,109 <1 <1 <1 3.6.14 6,99 14,94±0,52 68,8±0,70 0,073 <1 <1 <1
drenado 8,8 - 68,5±0,40 0,00693 <1 <1 <1
Data: 21/06/2010
ensaio 4 pH Umidade% TS (ajustada)
N (%) base seca
Benzeno mg/Kg
Xileno mg/Kg
Tolueno mg/Kg
4.1.14 7,86 5,99±0,11 70,8±0,50 0,083 <1 <1 <1 4.2.14 7,85 12,88±0,17 69,9±0,74 0,088 <1 <1 <1 4.3.14 7,91 10,92±0,09 69,7±0,12 0,067 <1 <1 <1 4.4.14 7,52 17,95±0,37 68,4±0,50 0,092 <1 <1 <1 4.5.14 7,66 16,6±0,17 68±0,83 0,084 <1 <1 <1 4.6.14 7,94 15,15±0,35 68,5±1,11 0,07 <1 <1 <1
drenado 8,74 - 71,4±0,75 0,00539 <1 <1 <1
112
Data: 28/06/2010
ensaio 1 pH Umidade %
TS (ajustada)
N (%) base seca
Benzeno mg/Kg
Xileno mg/Kg
Tolueno mg/Kg
1.1.21 8,35 5,57±0,26 71,4±0,10 0,023 <1 <1 <1 1.2.21 8,16 17,47±0,06 71,5±0,50 0,035 <1 <1 <1 1.3.21 7,37 21,53±0,85 70,5±0,12 0,052 <1 <1 <1 1.4.21 7,47 16,64±0,18 64,8±0,12 0,031 <1 <1 <1 1.5.21 7,78 16,06±0,16 66,5±0,38 0,032 <1 <1 <1 1.6.21 8 15,17±0,34 59,2±1,19 0,022 <1 <1 <1
Drenado 8,6 na 71,9±0,40 0,005 <1 <1 <1
Data: 28/06/2010
ensaio 2 pH Umidade
% TS
(ajustada) N (%)
base seca Benzeno mg/Kg
Xileno mg/Kg
Tolueno mg/Kg
2.1.21 8,03 6,22±0,16 68,7±0,49 0,012 <1 <1 <1 2.2.21 8,3 9,33±0,13 70,4±0,85 0,021 <1 <1 <1 2.3.21 7,02 16,47±0,44 71±1,20 0,029 <1 <1 <1 2.4.21 7,15 16,39±0,04 69,7±1,00 0,031 <1 <1 <1 2.5.21 7,12 16,33±0,09 65,3±0,39 0,027 <1 <1 <1 2.6.21 7,37 14,77±0,28 64,7±1,19 0,031 <1 <1 <1
Drenado 8,1 na 72,3±0,40 0,004 <1 <1 <1
Data: 28/06/2010
ensaio 3 pH Umidade
% TS
(ajustada) N (%)
base seca Benzeno mg/Kg
Xileno mg/Kg
Tolueno mg/Kg
3.1.21 7,79 5,38±0,87 69,4±0,40 0,015 <1 <1 <1 3.2.21 8,21 9,24±0,05 68±0,87 0,033 <1 <1 <1 3.3.21 7,18 16,98±0,26 70±1,10 0,029 <1 <1 <1 3.4.21 7,14 16,91±0,33 65,7±1,64 0,046 <1 <1 <1 3.5.21 7,15 16,09±1,10 67,8±1,55 0,028 <1 <1 <1 3.6.21 7,36 15,53±0,05 69,8±0,75 0,047 <1 <1 <1
Drenado 9,06 - 72±0,15 0,003 <1 <1 <1
Data: 28/06/2010
ensaio 4 pH Umidade %
TS (ajustada)
N (%) base seca
Benzeno mg/Kg
Xileno mg/Kg
Tolueno mg/Kg
4.1.21 7,79 6,9±0,23 67,6±0,59 0,032 <1 <1 <1 4.2.21 8,26 7,43±0,24 69,9±0,44 0,02 <1 <1 <1 4.3.21 7,3 19,69±1,80 57,7±1,19 0,02 <1 <1 <1 4.4.21 7,16 17,81±0,15 62,7±0,38 0,02 <1 <1 <1 4.5.21 7,36 18,15±1,53 68,1±1,57 0,034 <1 <1 <1 4.6.21 7,99 14,91±0,05 66,8±0,50 0,03 <1 <1 <1
Drenado 9,18 - 71±117 0,0069 <1 <1 <1
113
Data: 07/07/2010
ensaio 1 pH Umidade %
TS (ajustada)
N (% ) base seca
Benzeno mg/Kg
Xileno mg/Kg
Tolueno mg/Kg
1.1.30 8,43 4,01±0,21 66,5±1,53 0,046 <1 <1 <1 1.2.30 8,52 7,61±0,01 67,2±0,49 0,045 <1 <1 <1 1.3.30 7,79 15,85±0,92 66,3±0,53 0,055 <1 <1 <1 1.4.30 7,61 17,63±0,33 67,2±0,15 0,045 <1 <1 <1 1.5.30 7,76 16,5±0,82 70,3±0,21 0,056 <1 <1 <1 1.6.30 7,65 16,26±0,23 67,7±0,06 0,026 <1 <1 <1
Drenado 9,06 - 70±0,62 0,002 <1 <1 <1
Data: 07/07/2010
ensaio 2 pH Umidade %
TS (ajustada)
N (%) base seca
Benzeno mg/Kg
Xileno mg/Kg
Tolueno mg/Kg
2.1.30 8,55 3,95±0,55 68,9±0,64 0,008 <1 <1 <1 2.2.30 8,64 7,77±0,11 64,3±0,17 0,012 <1 <1 <1 2.3.30 7,75 15,38±0,44 64,4±0,21 0,027 <1 <1 <1 2.4.30 7,36 16,7±0,14 62,8±0,85 0,025 <1 <1 <1 2.5.30 7,3 16,6±0,40 61,8±1,04 0,024 <1 <1 <1 2.6.30 8 14,87±0,02 58±0,21 0,027 <1 <1 <1
Drenado 9,48 - 63,6±0,06 0,002 <1 <1 <1
Data: 07/07/2010
ensaio 3 pH Umidade %
TS (ajustada)
N (%) base seca
Benzeno mg/Kg
Xileno mg/Kg
Tolueno mg/Kg
3.1.30 8,2 5,08±0,76 64,1±0,87 0,015 <1 <1 <1 3.2.30 8,62 7,72±0,36 59,7±1,10 0,014 <1 <1 <1 3.3.30 7,46 16,67±0,39 67±0,06 0,031 <1 <1 <1 3.4.30 7,3 17,16±0,25 61,8±0,55 0,014 <1 <1 <1 3.5.30 7,38 16,11±0,00 61,9±1,07 0,027 <1 <1 <1 3.6.30 7,45 15,18±0,40 60,4±0,44 0,022 <1 <1 <1
Drenado 9,2 - 61,2±0,35 0,007 <1 <1 <1
Data: 07/07/2010
ensaio 4 pH Umidade %
TS (ajustada)
N (%) base seca
Benzeno mg/Kg
Xileno mg/Kg
Tolueno mg/Kg
4.1.30 7,62 4,22±0,16 56,6±0,21 0,028 <1 <1 <1 4.2.30 8,37 8,09±0,31 60±1,14 0,038 <1 <1 <1 4.3.30 7,92 17,42±0,28 64,6±1,57 0,031 <1 <1 <1 4.4.30 7,47 17,24±1,28 62,4±0,31 0,024 <1 <1 <1 4.5.30 7,54 16,31±1,07 59,8±0,51 0,026 <1 <1 <1 4.6.30 8,23 15,61±0,34 67,3±0,55 0,024 <1 <1 <1
Drenado 9,64 - 65,2±0,36 0,001 <1 <1 <1
114
Data: 02/08/2010
ensaio 1 pH Umidade % TS (ajustada)
N (%) base seca
Benzeno mg/Kg
Xileno mg/Kg
Tolueno mg/Kg
1.1.57 7,08 6,92±1,40 69,9±0,72 0,065 <1 <1 <1 1.2.57 7,79 15,63±1,07 70,4±0,29 0,061 <1 <1 <1 1.3.57 7,83 16,39±0,38 71,5±0,10 0,05 <1 <1 <1 1.4.57 7,38 17,97±0,22 71,5±0,15 0,056 <1 <1 <1 1.5.57 7,36 16,26±0,00 70,4±0,55 0,066 <1 <1 <1 1.6.57 7,79 15,88±0,25 70,6±0,72 0,061 <1 <1 <1
Drenado 10,12 - 70,7±0,06 0,003 <1 <1 <1
Data: 02/08/2010
ensaio 2 pH Umidade % TS (ajustada)
N (%) base seca
Benzeno mg/Kg
Xileno mg/Kg
Tolueno mg/Kg
2.1.57 7,63 21,25±0,23 67,5±0,40 0,089 <1 <1 <1 2.2.57 7,87 19,25±0,56 68,1±0,70 0,092 <1 <1 <1 2.3.57 6,83 17,35±0,48 69,8±0,70 0,078 <1 <1 <1 2.4.57 7 16,46±0,18 69,7±0,91 0,074 <1 <1 <1 2.5.57 7,53 15,89±0,32 69,9±0,46 0,086 <1 <1 <1 2.6.57 7,83 15,32±0,17 70,8±0,10 0,107 <1 <1 <1
Drenado 9,79 - 72,9±0,30 0,001 <1 <1 <1
Data: 02/08/2010
ensaio 3 pH Umidade % TS (ajustada)
N (%) base seca
Benzeno mg/Kg
Xileno mg/Kg
Tolueno mg/Kg
3.1.57 7,49 24,3±2,94 71,1±0,20 0,086 <1 <1 <1 3.2.57 7,53 21,31±1,10 71,7±0,12 0,069 <1 <1 <1 3.3.57 7,29 17,41±0,39 71,1±0,40 0,059 <1 <1 <1 3.4.57 7,27 13,48±2,36 71,5±0,15 0,044 <1 <1 <1 3.5.57 7,08 16,74±0,63 70,8±0,77 0,024 <1 <1 <1 3.6.57 7,84 15,47±0,10 70±0,35 0,033 <1 <1 <1
Drenado 10,16 - 71,7±0,29 0,003 <1 <1 <1
Data: 02/08/2010
ensaio 4 pH Umidade % TS (ajustada)
N (%) base seca
Benzeno mg/Kg
Xileno mg/Kg
Tolueno mg/Kg
4.1.57 7,7 23,76±0,28 70,8±0,61 0,065 <1 <1 <1 4.2.57 7,52 20,82±1,36 71,4±0,10 0,074 <1 <1 <1 4.3.57 7,26 17,95±0,06 71,5±0,25 0,063 <1 <1 <1 4.4.57 7,11 18,07±1,11 71,2±0,23 0,045 <1 <1 <1 4.5.57 7,37 17,47±0,04 71,4±0,38 0,079 <1 <1 <1 4.6.57 8,2 15,69±0,16 71,4±0,51 0,057 <1 <1 <1
Drenado 9,3 - 72,9±0,30 0,002 <1 <1 <1
115
Ensaio 1 drenado
tempo dias pH TS N (%) Benzeno mg/Kg
Xileno mg/Kg
Tolueno mg/Kg
0 8,02 66,3 na <1 <1 <1 2 8,4 72,3 na <1 <1 <1 7 8,4 66,1 0,002 <1 <1 <1 14 8,06 74,2 0,003 <1 <1 <1 21 8,6 71,9 0,005 <1 <1 <1 30 9,06 70 0,002 <1 <1 <1 60 10,12 70,7 0,003 <1 <1 <1
Ensaio 2 drenado
tempo dias pH TS N (%) Benzeno mg/Kg
Xileno mg/Kg
Tolueno mg/Kg
0 8,19 60,1 na <1 <1 <1 2 8,15 72,1 na <1 <1 <1 7 8,15 65 0,002 <1 <1 <1 14 7,9 63,9 0,005 <1 <1 <1 21 8,1 72,3 0,004 <1 <1 <1 30 9,48 63,6 0,002 <1 <1 <1 60 9,79 72,9 0,001 <1 <1 <1
Ensaio 3 drenado
tempo dias pH TS N (%) Benzeno mg/Kg
Xileno mg/Kg
Tolueno mg/Kg
0 8,2 70,2 na <1 <1 <1 2 8,4 73 na <1 <1 <1 7 8,4 71,7 0,005 <1 <1 <1 14 8,8 68,5 0,007 <1 <1 <1 21 9,19 71 0,003 <1 <1 <1 30 9,2 61,2 0,007 <1 <1 <1 60 10,16 71,7 0,003 <1 <1 <1
Ensaio 4 drenado
tempo dias pH TS N (%) Benzeno mg/Kg
Xileno mg/Kg
Tolueno mg/Kg
0 8,15 65,5 na <1 <1 <1 2 8,3 72,5 na <1 <1 <1 7 8,3 71,5 0,002 <1 <1 <1 14 8,74 71,4 0,005 <1 <1 <1 21 9,18 71 0,069 <1 <1 <1 30 9,64 65,2 0,001 <1 <1 <1 60 9,3 72,9 0,002 <1 <1 <1
116
APÊNDICE 2 - Resultados referentes ao artigo 2 - estudo da degradação de
hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPS) e de hidrocarbonetos totais de
petróleo (HTP) com a utilização de biossurfactantes e dispersante químico
Ensaio 1 Amostra sob base seca HAPs
tempo em dias Naftaleno acenaftileno Acenafteno Fluoreno Fenantreno
0 25,5 71,79 99,41 143,58 605,2 7 71,35 115,17 209,72 237,17 805,89
14 264,11 114,69 206,67 315,59 1064,06 21 126,93 85,29 183,5 265,78 351,95 30 45,15 175,56 86,39 117,55 397,27 60 21,66 23,91 31,81 51,15 210,54 90 6,81 16,14 21,06 34,8 141,32
tempo em dias
Antraceno Fluorantraceno Pireno Benzo(a) antraceno
Criseno
0 76,37 74,46 177,44 37,23 45,25 7 168,21 150,34 264,35 118,87 76,36
14 313,31 228,46 335,78 191,68 112,07 21 247,88 148,79 329,23 98,59 103,96 30 202,42 104,19 167,98 50,62 66,7 60 18,33 32,75 68,77 21,42 35,24 90 16,58 21,25 42,12 8,7 13,18
tempo em dias
Benzo(b) fluoranteno
Benzo(k) fluoranteno
Benzo(a) mpireno
Indo (1,2,3-cd)
pireno
Dibenzona (a-h)antraceno
Benzo (g,h,i) pirilen
o 0 16,67 8,59 28,51 nd nd nd 7 22,32 19,25 70,66 nd 9,47 10,66 14 34,28 26,29 66,12 2,56 7,87 9,93 21 40,52 15,05 47,76 12,3 5,33 9,49 30 24,11 10,55 26,5 6,14 2,54 7,18 60 10,56 7,08 10,7 nd 1,54 nd 90 1,58 0,82 5,04 nd nd nd
117
Ensaio 2 biossurfactante sob base seca HAPs.
tempo em dias Naftaleno acenaftileno Acenafteno Fluoreno Fenantreno
0 30,79 52,2 94,19 134,49 551,69 7 44,39 86,56 111,06 162,86 564,4
14 72,95 145,51 120,46 553,77 682,21 21 99,56 100 185,4 285,34 1136,15 30 154,69 154,7 84,6 112,16 403,7 60 15,92 25,84 56,39 84,89 347 90 7,35 12,16 15,85 27,94 118,12
tempo em dias Antraceno
Fluorantraceno Pireno
Benzo(a)antraceno Criseno
0 49,49 58,12 140,96 30,91 32,52 7 194,97 118,66 193,13 34,85 54,58
14 194,8 107,6 205,99 93,25 59,34 21 140,16 169,42 379,69 113,78 112,59 30 176 95,12 152,82 43,32 42,07 60 27,39 84,71 84,71 24,72 25,53 90 12,95 18,29 33,73 7,79 11,37
tempo em dias
Benzo(b)fluoranteno
Benzo(k)fluoranteno
Benzo(a) pireno
Indo(1,2,3-cd) pireno
Dibenzona (a-h)
antraceno
Benzo (g,h,i)
pirileno
0 9,22 5,95 18,26 nd nd nd 7 17,03 13,55 34 nd 6,78 7,55 14 18,92 14,42 35,49 0,76 4,62 6,01 21 35,33 19,61 53,57 16,65 2,94 9,95 30 20,03 3,32 21,38 4,87 1,77 10,15 60 6,94 4,03 10,1 nd nd nd 90 0,75 nd 0,75 nd nd nd
118
Ensaio 3 sob base seca HAPs tempo em
dias Naftaleno acenaftileno Acenafteno Fluoreno Fenantreno
0 60,77 39,25 85,81 112,29 475,53 7 49,15 107,49 119,37 212,29 639,38 14 95,5 160,81 174,25 228,94 970,7 21 93,67 68,33 131,81 196,98 636,59 30 40,98 85,82 71,59 86,28 339,32 60 13,78 126,67 30,85 51,76 197,71 90 9,84 13,98 21 36,92 146,02
tempo em dias Antraceno Fluorantracen
o Pireno Benzo(a)antraceno Criseno
0 33,97 53,66 127,14 26,23 27,3 7 180,53 115,43 191,09 92,36 59,72 14 259,5 167 289 121,19 78,19 21 77,66 116,74 252,27 70,98 72,62 30 173,03 107,03 130,68 38,2 35,82 60 20,46 31,29 57,77 19,59 21,65 90 16,68 19,52 45,77 10,59 14,04
tempo em dias
Benzo(b)fluoranteno
Benzo(k)fluoranteno
Benzo(a)pireno
Indo(1,2,3-c,d) pireno
Dibenzona(a,h)antrace
no
Benzo(g,h,i) pirileno
0 11,07 3,77 14,97 nd nd nd 7 17,82 15,51 37,83 nd 7,36 6,19 14 22,87 18,44 42,62 0,68 5,06 7,19 21 23,64 11,53 36,12 9,96 1,7 7,56 30 17,47 2,97 18,46 4,25 1,51 4,91 60 6,51 3,13 9,7 nd nd nd 90 1,5 1,63 4,2 nd nd nd
Ensaio 1
20/09/2010 Amostra tempo em
dias pH Umidade TS ajustada N (%) TPH mg/kg PHA mg/kg
1.1.0 6,96 21,03±0,23 63,9±0,35 0,21±0,002 4112 128,56 1.2.0 6,98 22,05±0,14 59,6±0,14 0,24±0,000 2100 163,4 1.3.0 7,16 21,57±0,09 55,3±0,81 0,19±0,013 1914 153,25 1.4.0 7,13 22,26±0,05 61,8±0,63 0,20±0,000 3275 199,8 1.5.0 7,11 21,58±0,06 57,7±0,15 0,23±0,000 3506 242,9 1.6.0 6,94 22,18±0,31 60,5±0,51 0,16±0,001 3100 273,4
119
Ensaio 2
Biossurfactante
tempo em dias pH Umidade TS ajustada N(%) TPH mg/kg PHA
mg/kg
2.1.0 5,31 22,28±0,85 60,7±0,66 0,22±0,027 2891 266,15 2.2.0 6,88 22,29±1,46 60,7±0,06 0,19±0,000 2639 155,5 2.3.0 6,66 21,61±0,86 63,5±0,20 0,25±0,075 2051 163,7 2.4.0 6,9 19,61±1,76 58,8±1,48 0,19±0,002 1945 139,3 2.5.0 6,95 20,93±1,06 66,7±0,29 0,19±0,007 1767 178,45 2.6.0 6,96 21,42±1,58 68,1±0,00 0,19±0,005 1838 56,8
Ensaio 3 Dispersante tempo em
dias pH Umidade TS ajustada N (%) TPH mg/kg PHA mg/kg
3.1.0 5,31 20,65±1,51 67,1±0,58 0,20±0,000 2082 123,6 3.2.0 7,08 21,4±0,11 67,2±0,72 0,19±0,001 2728 171,45 3.3.0 6,99 23,22±9,14 64±0,26 0,17±0,013 2806 128,4 3.4.0 6,97 21,56±0,18 65±0,74 0,21±0,016 2582 157,35 3.5.0 6,89 21,49±1,66 66,2±1,31 0,20±0,003 2339 126,6 3.6.0 6,91 21,25±0,03 67,4±0,25 0,20±0,011 3043 150,35
Ensaio1 27/09/2010 Amostra tempo em
dias pH Umidade TS ajustada N (%) TPH mg/kg PHA mg/kg
1.1.7 6,57 15,26±1,97 65,6±0,20 NA 2939 392,05 1.2.7 6,97 20,9±0,14 68,9±0,46 NA 1604 319,05 1.3.7 6,87 23,06±1,09 68,8±0,26 NA 1662 435,8 1.4.7 6,94 21,59±1,70 68,8±0,11 NA 1745 184,15 1.5.7 6,81 22,13±0,45 67,4±0,32 NA 1723 183,4 1.6.7 6,95 22,03±0,29 67±0,26 NA 2051 312,05
Ensaio 2 Biossurfactante tempo em
dias pH Umidade TS ajustada N (%) TPH mg/kg PHA mg/kg
2.1.7 6,96 15,22±0,49 66,4±0,32 NA 2499 162,25 2.2.7 7,13 20,76±0,29 60,5±0,90 NA 1691 164,6 2.3.7 6,96 22,62±0,59 64,5±0,25 NA 1380 167,5 2.4.7 6,9 22,22±0,19 63,9±0,20 NA 1920 235,15 2.5.7 6,91 21,78±0,53 68,4±0,26 NA 760 307,25 2.6.7 7,1 23,17±1,05 67,9±0,64 NA 1161 315,4
120
Ensaio 3 Dispersante
tempo em dias pH Umidade TS ajustada N (%) TPH mg/kg PHA mg/kg
3.1.7 6,88 12,08±0,00 64,8±0,45 NA 5270 284,4 3.2.7 7,01 21,91±1,48 67,4±0,06 NA 880 204,4 3.3.7 6,82 21,4±0,00 64,8±0,15 NA 1196 283,45 3.4.7 6,87 22,12±1,16 65,8±0,32 NA 1172 251,45 3.5.7 6,71 22,31±0,21 66±0,06 NA 923 192,5 3.6.7 6,8 20,16±0,45 66,1±0,40 NA 2044 266,25
Ensaio 1 04/10/2010 Amostra tempo em
dias pH Umidade TS ajustada N (%) TPH mg/kg PHA mg/kg
1.1.14 7,11 10,11±0,19 70±0,32 NA 5398 222,7 1.2.14 6,16 21,84±0,34 70,5±0,17 NA 2729 1439,55 1.3.14 6,93 20,6±1,45 70,3±0,21 NA 2223 286,6 1.4.14 6,83 19,97±1,74 70,8±0,15 NA 2826 221,6 1.5.14 6,79 21,54±0,36 71,1±0,12 NA 2106 189,8 1.6.14 6,73 21,8±2,21 70,6±0,12 NA 2767 277,95
Ensaio 2 Biossurfactante tempo em
dias pH Umidade TS ajustada N (%) TPH mg/kg PHA mg/kg
2.1.14 6,72 14,35±4,93 71±0,06 NA 4504 345,75 2.2.14 6,66 21,26±0,05 70,7±0,15 NA 728 107,85 2.3.14 6,7 23,07±1,15 70,8±0,10 NA 1695 269,55 2.4.14 6 21,98±0,25 70,7±0,15 NA 1978 210,45 2.5.14 6,7 20,37±0,95 71±0,00 NA 1464 205,2 2.6.14 6,83 24,78±0,37 69,9±0,06 NA 1766 398,3
Ensaio 3 Dispersante tempo em
dias pH Umidade TS ajustada N (%) TPH mg/kg PHA mg/kg
3.1.14 6,55 13,7±0,35 71±0,06 NA 3506 439,25 3.2.14 6,74 20,51±1,44 71±0,10 NA 2607 269,05 3.3.14 6,93 20,88±1,84 71,2±0,06 NA 1558 272,65 3.4.14 6,76 21,88±0,10 70,8±0,00 NA 1607 326,25 3.5.14 6,59 22,11±0,35 69,8±0,10 NA 1623 500,3 3.6.14 6,74 20,92±0,06 69,6±0,06 NA 1261 306,05
121
Ensaio 1 11/10/2010 Amostra tempo em
dias pH Umidade TS ajustada N TPH mg/kg PHA mg/kg
1.1.21 7,04 12,00±1,38 62,4±0,10 NA 2101 503,1 1.2.21 7,21 21,41±1,06 65,6±0,10 NA 1284 457,05 1.3.21 6,88 20,65±1,35 66±0,06 NA 935 232,8 1.4.21 6,48 20,71±0,70 67,2±0,15 NA 594 166,15 1.5.21 6,62 21,64±0,45 67,7±0,22 NA 945 501,6 1.6.21 6,64 23,07±1,67 64,7±0,21 NA 1033 198,9
Ensaio 2 Biossurfactante tempo em
dias pH Umidade TS ajustada N (%) TPH mg/kg PHA mg/kg
2.1.21 5,92 11,33±1,38 64,3±0,42 NA 1836 406,1 2.2.21 6,88 19,74±1,06 63,8±0,06 NA 887 237,45 2.3.21 6,77 22,13±1,35 62,6±0,15 NA 1086 239,85 2.4.21 6,84 19,38±0,70 62,8±0,10 NA 1018 686,45 2.5.21 7,11 23,18±0,45 66±0,25 NA 787 283,65 2.6.21 6,85 25,42±1,67 62,3±0,56 NA 699 427,3
Ensaio 3 Dispersante tempo em
dias pH Umidade TS ajustada N (%) TPH mg/kg PHA mg/kg
3.1.21 6,72 15,31±0,77 67,1±0,35 NA 2475 141,95 3.2.21 6,7 20,79±0,59 68,7±0,15 NA 863 233,5 3.3.21 6,5 20,65±0,75 66,6±0,12 NA 1155 136,4 3.4.21 6,45 23,24±4,10 69,4±0,25 NA 930 243,85 3.5.21 6,91 22,1±0,91 67,4±0,32 NA 919 514,8 3.6.21 6,59 21,97±0,08 68,8±0,45 NA 988 206,75
Ensaio 1 20/10/2010 Amostra tempo em
dias pH Umidade TS ajustada N (%) TPH mg/kg PHA mg/kg
1.1.30 7,02 6,84±0,48 58±0,10 0,21±0,022 3928 158,65 1.2.30 6,98 21,66±1,24 63,8±0,00 0,18±0,014 6153 178,04 1.3.30 6,99 23,71±2,57 67,1±0,12 0,18±0,007 4529 187,98 1.4.30 6,78 21,06±1,19 68,7±0,12 0,20±0,002 4744 154,87 1.5.30 6,66 21,61±0,67 69±0,31 0,23±0,002 3818 365,83 1.6.30 6,7 28,27±2,31 69,8±0,10 0,16±0,014 3612 196,86
122
Ensaio 2 Biossurfactante
tempo em dias pH Umidade TS ajustada N (%) TPH mg/kg PHA mg/kg
2.1.30 5,85 13,78±0,15 67,1±0,26 0,23±0,002 4308 200,51 2.2.30 7,15 18,96±0,34 66,5±0,38 0,17±0,010 4689 178,3 2.3.30 6,93 22,07±0,83 67,5±0,23 0,20±0,010 3830 190,57 2.4.30 6,94 23,13±0,74 70,3±0,17 0,20±0,011 4113 188,29 2.5.30 6,99 22,02±1,34 70,8±0,12 0,21±0,011 6036 164,24 2.6.30 6,93 22,95±0,16 70,4±0,10 0,20±0,010 2045 188,62
Ensaio 3 Dispersante tempo em
dias pH Umidade TS ajustada N (%) TPH mg/kg PHA mg/kg
3.1.30 6,19 10,95±0,95 68,7±0,12 0,19±0,002 3833 162,84 3.2.30 6,81 20,79±0,80 70,3±0,06 0,18±0,001 3659 176,07 3.3.30 5,97 22,77±0,92 70,3±0,06 0,18±0,022 12545 127,89 3.4.30 5,52 19,23±2,96 69,9±0,06 0,2±0,009 3810 131,85 3.5.30 6,64 23,1±1,38 67,9±0,15 0,19±0,013 3229 177,81 3.6.30 6,8 22,08±0,72 67,8±0,06 0,21±0,011 3023 195,58
Ensaio 1 19/11/2010 Amostra tempo em
dias pH Umidade TS ajustada N (%) TPH mg/kg PHA mg/kg
1.1.60 6,95 9,98±0,41 66,1±0,35 0,23±0,006 11573 62,15 1.2.60 7,15 19,02±0,37 62,9±0,12 0,20±0,022 28877 38,65 1.3.60 7 20,63±0,29 65,3±0,26 0,16±0,030 5541 132 1.4.60 6,77 21,44±0,31 65,2±0,32 0,18±0,020 3759 75,25 1.5.60 6,64 23,35±1,43 67,6±0,20 0,17±0,003 8268 64,7 1.6.60 7,02 23,68±0,83 67,1±0,35 0,19±0,026 8134 88,35
Ensaio 2 Biossurfactante
tempo em dias pH Umidade TS ajustada N (%) TPH mg/kg PHA mg/kg
2.1.60 6,93 7,42±0,07 64,2±0,10 0,2±0,027 7263 219 2.2.60 7,24 20,17±0,25 65,9±0,21 0,21±0,005 5580 80,05 2.3.60 6,98 20,46±1,12 67,2±0,25 0,20±0,013 9237 91,05 2.4.60 6,62 21,46±1,38 64,1±0,10 0,19±0,001 4243 82,95 2.5.60 6,58 23,09±0,41 67,2±0,10 0,18±0,011 4648 65,7 2.6.60 6,85 23,26±0,86 66,7±0,17 0,20±0,008 9784 71,3
123
Ensaio 3 Dispersante
tempo em dias pH Umidade TS ajustada N (%) TPH mg/kg PHA mg/kg
3.1.60 5,51 11,37±0,15 68,8±0,06 0,21±0,001 4446 52,7 3.2.60 6,83 20,96±0,51 69±0,15 0,20±0,003 7104 70,5 3.3.60 6,62 21,41±1,26 70,3±0,35 0,20±0,022 8414 83,8 3.4.60 6,75 21,12±0,94 68,7±0,15 0,15±0,049 6230 36,95 3.5.60 6,81 23,49±0,29 68,7±0,12 0,22±0,009 5734 33,65 3.6.60 6,74 22,31±0,25 68,4±0,10 0,19±0,025 4079 112,15
Ensaio 1 20/12/2010 Amostra tempo em
dias pH Umidade TS ajustada N (%) PHA mg/kg TPH mg/kg
1.1.90 6,15 14,36±0,45 60,2±0,21 0,18±0,006 87,55 5908 1.2.90 7,43 20,6±0,66 56,4±0,00 0,16±0,008 31,15 5104 1.3.90 7,12 20,23±0,37 54,6±0,23 0,23±0,010 46,15 5357 1.4.90 7,22 21,17±0,05 57,8±0,23 0,18±0,013 14,15 5458 1.5.90 6,89 23,68±0,52 60,3±0,21 0,18±0,003 41,25 5196 1.6.90 7,27 24,22±1,02 59±0,55 0,16±0,004 40,95 5088
Ensaio 2 Biossurfactante tempo em
dias pH Umidade TS ajustada Nitr (%) PHA mg/kg TPH mg/kg
2.1.90 7,12 14,15±2,06 58,8±0,06 0,18±0,004 51,9 5373 2.2.90 7,22 20,5±0,54 57,2±0,67 0,19±0,017 9,56 4138 2.3.90 7,12 19,86±0,64 58,5±0,61 0,18±0,002 41,55 9071 2.4.90 7,22 19,85±0,31 60,3±0,23 0,14±0,001 35,6 6447 2.5.90 6,97 23,73±0,42 66,7±0,06 0,15±0,016 35,3 3653 2.6.90 7,21 23,94±0,83 62,7±1,84 0,24±0,009 40,8 4260
Ensaio 3
Dispersante tempo em
dias pH Umidade TS ajustada N (%) PHA mg/kg TPH mg/kg
3.1.90 7,21 14,41±0,18 65±0,06 0,15±0,009 87,8 5995 3.2.90 7,28 18,13±0,71 63,7±0,15 0,19±0,008 22,8 4888 3.3.90 6,9 21,00±0,76 64,6±0,35 0,20±0,027 37,15 3603 3.4.90 7,13 21,80±0,42 64,2±0,15 0,15±0,006 19,5 4390 3.5.90 6,17 22,88±0,74 63,1±0,12 0,18±0,001 31,1 4520 3.6.90 7,15 23,30±1,35 61,7±0,10 0,19±0,012 88,35 3802
124
HAPs Drenado Tempo (dia) Ensaio 1 (µg.L-1) Ensaio 2 (µg.L-1) Ensaio 3 (µg.L-1)
0 NA NA NA 7 ND ND NA 14 1,8 ND 4,12 21 0,55 1,57 1,0 30 ND ND ND 60 ND ND 1,0 90 ND ND ND
HTP Drenado Tempo (dia) Ensaio 1 (µg.L-1) Ensaio 2 (µg.L-1) Ensaio 3 (µg.L-1)
0 NA NA NA 7 ND ND ND
14 ND ND ND 21 < 150 < 225 < 300 30 ND ND ND 60 ND ND ND 90 <900 <4500 <1384
125
ANEXOS
126
ANEXO 2 – Escala de WENTWORTH utilizada para a classificação do solo
Tabela 1 Escala de Wentworth
Peneira (mm) Escala (diâmetro) Classificação
4,00 -2,00
Grão
3,36 -1,75
2,83 -1,50
2,38 -1,25
2,00 -1,00
1,68 -0,75
Areia muito grossa 1,41 -0,50
1,19 -0,25
1,00 0,00
0,84 0,25
Areia grossa 0,71 0,50
0,59 0,75
0,50 1,00
0,42 1,25
Areia média 0,35 1,50
0,30 1,75
0,250 2,00
0,210 2,25
Areia fina 0,177 2,50
0,149 2,75
0,125 3,00
0,105 3,25
Areia muito fina 0,088 3,50
0,074 3,75
0,062 4,00
FONTE: SUGUIO, 1973.