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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

INSTITUTO DE CIÊNCIAS DO MAR – LABOMAR

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MARINHAS TROPICAIS

LYANDERSON FREITAS DE AQUINO

Biorremediação de sedimentos de manguezal contaminados com n-hexadecano

por consórcio de actinobactérias imobilizado em esferas de quitosana

Fortaleza

2015




Dissertação submetida a coordenação do programa de pós-Graduação em Ciências Marinhas Tropicais do Instituto de Ciências do Mar da Universidade Federal do Ceará, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre.

Área de concentração: Uso e manejo de ecossistemas marinhos e estuarinos

Orientador: Dra. Profa. Vânia Maria Maciel Melo

Fortaleza

2015

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Federal do Ceará

Biblioteca Rui Simões de Menezes

A668b Aquino, Lyanderson Freitas de.

Biorremediação de sedimentos de manguezal contaminados com n-hexadecano por consórcio de actinobactérias imobilizado em esferas de quitosana / Lyanderson Freitas de Aquino. – 2015.

54f.: il. color., enc. ; 30 cm. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Instituto de Ciências do Mar,

Programa de Pós-Graduação em Ciências Marinhas Tropicais, Fortaleza, 2015. Área de Concentração: Utilização e Manejo de Ecossistemas Marinhos e Estuarinos. Orientação: Profª. Drª. Vânia Maria Maciel Melo. 1. Microbiologia aplicada. 2. Biorremediação. I. Título.

CDD 660.62




Dissertação submetida a Coordenação do programa de pós-graduação em Ciências Marinhas Tropicais do Instituto de Ciências do Mar da Universidade Federal do Ceará, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ciências Marinhas Tropicais.

Área de concentração: Uso e manejo de ecossistemas marinhos e estuarinos

Aprovada em: 25 / JUNHO / 2015.

BANCA EXAMINADORA

_____________________________________________________________

Profª. Drª. Vânia Maria Maciel Melo (Orientadora)

Universidade Federal do Ceará (UFC)

_____________________________________________________________

Dra. Geórgia Barguil Colares – Instituto de Ciências do Mar, UFC

________________________________________________________

Prof. Dr. Afrânio Aragão Craveiro - PADETEC

À minha família, Carlos, Freirice e Allison.

Às minhas meninas, Yohana e Líllian.

AGRADECIMENTOS

Primeiramente agradeço a minha família, meus Pais Carlos e Freirice, e meu irmão e

parceiro inseparável, Allison, por seu amor, apoio, carinho dedicação e incentivo permitiram

além de tudo, que estivesse escrevendo esses agradecimentos;

À minha namorada, Yohana, pelo companheirismo e dedicação nestes 10 anos de

convívio, pelo amor, companheirismo e lealdade inabaláveis. Espero que muito em breve eu

finalmente possa trocar o termo de namorada por esposa.

À Professora Drª. Vânia Maria Maciel Melo, pela orientação, confiança, dedicação,

paciência e pela oportunidade de trabalhar entre pesquisadores tão capazes e pessoas tão

queridas.

Aos colegas de Lembiotech, pessoas mais que maravilhosas as quais eu tive o prazer

e privilégio de poder conviver, Alysson, Samantha, Geórgia, Júlio, Wal, Tallita, Leonardo,

Henrique, Bárbara, Natália, Mirella, Gabrielly, Jonathan, Yara, Raíssa, e os muitos

amigos e colegas de trabalho que contribuíram para esta obra. Em especial ao Santiago e

Samuel, que tanto me ajudaram na execução dos experimentos.

Ao Valdenor, amigo e ocasional filósofo, que imortalizou a frase que norteou os últimos

2 anos de trabalho e serviu de consolo e amparo tanto pra muita gente: “Vai dar certo”.

Ao programa de pós-graduação em ciências marinhas tropicais, ao LABOMAR e seu

colegiado, por suas imensas contribuições para minha formação acadêmica.

À todos que contribuíram direta e indiretamente para a execução deste trabalho.

RESUMO

As áreas de manguezais sofrem com os impactos diretos do seu desmatamento para

atividade de aquicultura e/ou urbanização, bem como com os impactos da poluição. Dentre as

tecnologias de remediação disponíveis, a biorremediação se destaca como a mais adequada para

recuperação de áreas contaminadas de manguezais devido a complexidade desse ecossistema.

A biorremediação consiste em um conjunto de processos nos quais são empregados organismos

vivos, normalmente plantas ou micro-organismos, com intuito de remover ou atenuar poluentes

ambientais. Neste estudo foi avaliado a capacidade de 7 estirpes de bactérias, previamente

isoladas de sedimentos de manguezal contaminados com n-hexadecano, para degradar esse

poluente em microcosmos de sedimentos inoculados com as estirpes de bactérias selecionadas

na forma livre, em suspensão, ou na forma de um consórcio imobilizado em esferas de

quitosana. Também foram avaliados os efeitos da microbiota nativa e a biodegradabilidade das

esferas de quitosana nos tratamentos. O potencial biodegradativo do consórcio de bactérias foi

avaliado pelo monitoramento da atividade desidrogenásica (DHA), estimada por medidas da

concentração de formazan. Dentre as sete estirpes testadas, duas actinobactérias, Gordonia

HEXBA05 e Micrococcus HEXBA06, se destacaram e foram reunidas em um consórcio

CHB56 e testadas em sedimentos esterilizados e não esterilizados, na forma livre e imobilizada

em esferas de quitosana. O consórcio imobilizado na concentração de 106 UFC/g de esfera de

quitosana e inoculado em microcosmos de sedimento de manguezal não esterilizado

contaminado com 10 mg/g de n-hexadecano, mostrou atividade desidrogenásica

significativamente diferente do controle, demonstrando a capacidade do consórcio para

metabolizar o poluente. As esferas de quitosana foram completamente biodegradadas pela

microbiota nativa do sedimento de manguezal em 12 dias. Os resultados desse estudo apontam

que o consórcio CHB56 imobilizado em esferas de quitosana representa uma nova opção de

tecnologia de bioaumentação, podendo ser aplicada em manguezais contaminados com n-

hexadecano, um alcano comumente encontrado em áreas de derramamento de petróleo, com a

vantagem de ser uma tecnologia ecologicamente segura, de fácil manejo e aplicação.

Palavras-Chave: Biorremediação, Microcosmo, n-hexadecano, Imobilização.

ABSTRACT

Mangrove areas suffer from the direct impact of deforestation for aquiculture and/or

urban development, as well as the impacts of pollution. Among the remediation technologies,

bioremediation stands out as one of the most suitable for the recovery of contaminated

mangrove areas, due to the complexity of this ecosystem. Bioremediation consists of a set of

processes in which living organisms are employed, typically plants or microorganisms, aiming

to remove or mitigate the effect of environmental pollutants. This study evaluated the capability

of seven bacterial strains, previously isolated from mangrove sediment contaminated with n-

hexadecane, to degrade the aforementioned pollutant in sediment microcosms inoculated with

those selected bacterial strains in suspension, free form, or as a consortium immobilized in

chitosan beads. Was also evaluated the effects of native micro biota and the biodegradability of

the chitosan beads in treatments. Biodegradation potential of the bacterial consortium was

evaluated by monitoring the desidrogenasic activity (DHA), estimated by measurements of

formazan concentration. Among the seven tested strains, 2 actinobacteria, Gordonia

HEXBA05 and Micrococcus HEXBA06, have excelled and were gathered in a consortium

CHB56 to be tested in sterilized and unsterilized sediment, both in free form and immobilized

in chitosan beads. The consortium, immobilized at a concentration of 106 CFU/g of chitosan

beads and inoculated in unsterilized mangrove sediment microcosms contaminated with 10

mg/g of n-hexadecane showed significantly different desidrogenasic activity from the control,

demonstrating the capacity to metabolize the pollutant of the consortium. The chitosan beads

were completely biodegraded by the native micro biota of mangrove sediment in 12 days. The

results of this study point to the fact that the consortium CHB56 immobilized in chitosan beads

represents a new option of bioremediation technology, and can be applied in mangroves

contaminated with n-hexadecane, an alkane commonly found in oil spill areas, with the

advantages of being an ecologically safe technology of easy application and handling.

Keywords: Bioremediation, Microcosm, n-hexadecane, Immobilization.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Padrão de distribuição das zonas de manguezal no mundo (Fonte: Giri et al., 2010).

............................................................................................................................................ 13

Figura 2 - Representação esquemática da zonação de espécies vegetais no manguezal. ........ 14

Figura 3 - Fauna impactada por derramamento de petróleo. .................................................. 17

Figura 4 – Representação Esquemática das vias de degradação dos alcanos descritas da

literatura. ............................................................................................................................. 22

Figura 5 - Conversão do 2,3 - trifenil cloreto de tetrazólio (TTC) em trifenil formazan (TPF)

catalizada por desidrogenases. .............................................................................................. 24

Figura 6 - Exemplos de diferentes tipos de microcosmos...................................................... 27

Figura 7 - Morfologia colonial das estirpes de bactérias obtidas por enriquecimento com n-

hexadecano a partir de amostras de sedimentos do manguezal da baia de Todos os Santos,

Bahia, contaminados com petróleo. ...................................................................................... 30

Figura 8 – Microcosmos de sedimentos de manguezal utilizados nesse estudo. .................... 32

Figura 9 - Curva padrão preparada a partir de soluções de concentrações conhecidas de

formazan e leitura da absorbância a 485 nm. ........................................................................ 33

Figura 10 - Aspecto do gel e das esferas de quitosana. ......................................................... 34

Figura 11 - Monitoramento da atividade desidrogenásica (DHA) durante a biodegradação de n-

hexadecano em microcosmos de sedimentos de manguezal inoculados com as diferentes

estirpes testadas. .................................................................................................................. 36

Figura 12 – Curvas de crescimento das estirpes HEXBA01, HEXBA04, HEXBA05 e

HEXBA06 em microcosmos de sedimentos de manguezal esterilizados contaminados com 10

mg/g de n-hexadecano. ........................................................................................................ 37

Figura 13 – DHA do consórcio CHB56 e comparação com os resultados das estirpes

individuais. .......................................................................................................................... 39

Figura 14- Aspecto morfológico das colônias das estirpes Gordonia HEXBA05 (colônia rosa e

brilhante) e Micrococccus HEXBA06 (colônia amarela) em meio ATGE. ........................... 40

Figura 15 - Monitoramento da atividade desidrogenásica (DHA) durante a biodegradação de n-

hexadecano em microcosmos de sedimentos de manguezal inoculados com o consórcio CHB56

em diferentes condições. ...................................................................................................... 41

Figura 16 - Resultados de DHA das condições controle dos microcosmos ............................ 44

Figura 17 - Contagem de viáveis das 4 diferentes condições dos microcosmos ..................... 45

Figura 18 - Acompanhamento da degradação das esferas de quitosana ................................. 46

Figura 19 - Aspecto das esferas de quitosana analisadas por Microscopia Eletrônica de

varredura (MEV). ................................................................................................................ 47

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Identificação molecular da estirpe de bactéria, tamanho da sequencia parcial do gene

do RNAr 16S e número de acesso no GenBank. .................................................................. 30

Tabela 2 - Condições empregadas no experimento com o Consórcio HEXBA05+HEXBA06

............................................................................................................................................ 40

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

DHA DeHydrogenase Activity

EPS Exopolissacarídeo

SAC Surface Active Compound

TPF TriPhenyl Formazan

TTC Triphenyl Tetrazolium Chloride

MEV Microscopia Eletrônica de Varredura

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 12

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ...................................................................................... 13

2.1. Ecossistema Manguezal ......................................................................................... 13

2.2. Biorremediação ...................................................................................................... 16

2.3. Biodegradação de n-hexadecano ............................................................................ 20

2.4. Atividade desidrogenásica ..................................................................................... 23

2.5. Imobilização .......................................................................................................... 25

3. OBJETIVOS ................................................................................................................. 29

3.1 OBJETIVO GERAL .............................................................................................. 29

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................. 29

4. METODOLOGIA ......................................................................................................... 30

4.1. Estirpes de bactérias............................................................................................... 30

4.2. Preparação dos microcosmos ................................................................................. 31

4.3. Atividade desidrogenásica ..................................................................................... 32

4.4. Imobilização de micro-organismos em esfera de quitosana .................................... 33

4.5. Análise das esfera de quitosana por microscopia eletrônica de varredura (MEV) ... 34

4.6. Análises Estatísticas ............................................................................................... 34

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................... 35

5.1. Ensaios nos microcosmos ...................................................................................... 35

5.2. Ensaios em microcosmo com o consórcio CHB56 ................................................. 40

5.3. Análise das esferas de quitosana contendo o consórcio HB56 imobilizado ............. 46

6. CONCLUSÕES ............................................................................................................ 48

7. REFERÊNCIAS ........................................................................................................... 49

AQUINO, L. F. Biorremediação de sedimentos de manguezal contaminados ... 12

1. INTRODUÇÃO

O manguezal é um ecossistema de transição entre os ambientes terrestre e marinho, de

ocorrência nas zonas tropical e subtropical, caracterizado pela presença de poucas espécies de

plantas que se desenvolvem em sedimentos lamosos, pouco oxigenados e salinos. Dentre os

diversos papéis ecológicos desempenhados por este ecossistema destacam-se a manutenção e

suporte de variados táxons que utilizam o manguezal em alguma etapa de seu desenvolvimento,

como peixes, aves, répteis, crustáceos, e moluscos; a manutenção da geomorfologia costeira; a

proteção da costa contra tsunamis; a concentração de recursos pesqueiros; além de constituírem

áreas para recreação e turismo.

Apesar de sua reconhecida importância ecológica e social, os manguezais estão entre os

ecossistemas que mais sofrem alterações em consequência de impactos naturais, como aqueles

provocados por tsunamis, por exemplo, e antrópicos, tais como a transformação de áreas de

florestas de mangue em salinas, viveiros de camarão, e/ou em áreas urbanas e industriais. Todas

as atividades humanas desenvolvidas nos manguezais ou em seu entorno causam danos na

diversidade e estrutura do ecossistema, sendo na maioria dos casos, de difícil reparação.

Os micro-organismos desempenham papel essencial no funcionamento de manguezais

pristinos e impactados, ressaltando que essas comunidades podem ser manipuladas para

acelerar a mitigação de impactos naturais e antrópicos. A biorremediação, ou tecnologia que

emprega organismos vivos, normalmente plantas ou micro-organismos, com intuito de remover

ou atenuar impactos ambientais, se destaca dentre as tecnologias disponíveis, por ser

ambientalmente segura, simples e eficiente. Processos de biorremediação têm sido

intensamente pesquisados e recomendados pela comunidade científica para o tratamento de

ambientes contaminados, tais como águas superficiais, águas subterrâneas, sedimentos,

resíduos e efluentes industriais.

Nesse contexto, esse estudo se propôs a testar a hipótese de que sedimentos de

manguezais contaminados com n-hexadecano podem ser recuperados com aplicações de esferas

de quitosana carregadas com um consórcio especial de bactérias, de forma rápida, eficiente e

ecologicamente segura.


2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1. Ecossistema Manguezal

Os manguezais são ecossistemas de transição entre os ambientes terrestre e marinho,

sujeitos aos regimes fluvial e e de marés. Eles se desenvolvem geralmente na zona costeira de

regiões tropicais e subtropicais. Possuem uma vegetação caracteristicamente arbóreo-arbustiva,

altamente especializada para habitar ambientes salinos e pouco oxigenados (MAIA et al., 2006).

A vegetação que compõe o manguezal possui adaptações que a faz estrutural e

funcionalmente única. Um conjunto amplo de características morfológicas e ecofisiológicas

permite que estes organismos suportem as condições peculiares do ambiente em que se

desenvolvem, tais como: raízes escoras e pneumatóforos, dispersão de propágulos pela maré,

xilema e floema densamente distribuídos e eficientes mecanismos de retenção de nutrientes e

de osmorregulação (ALONGI, 2002).

Com base em dados gerados através da interpretação de imagens obtidas por satélites

no ano 2000, a área total de manguezal no globo totalizava 137,760 km² abrangendo 118 países,

com o Brasil ocupando o terceiro lugar na lista dos países com maior área de manguezal do

mundo, superado apenas pela indonésia e Austrália (GIRI et al., 2011). A distribuição dos

manguezais no planeta está ilustrada na figura 1. No Brasil os manguezais estão distribuídos

através de 16 dos 17 estados brasileiros que fazem contato com o oceano Atlântico, sendo a

exceção o Rio Grande do Sul.

Figura 1 - Padrão de distribuição das zonas de manguezal no mundo (Fonte:GIRI et al., 2010).


O manguezal é um ecossistema que devido as suas estritas condições possui baixa

diversidade de gêneros compondo sua vegetação. No Brasil, os principais gêneros de manguezal

verdadeiro são: Rhizophora, Laguncularia, Avicennia e Conocarpus (MAIA et al., 2006)

Uma das marcantes características observáveis da vegetação de manguezal é zonação

das espécies vegetais em função da distância com a água (Figura 2). São sugeridos como fatores

que podem explicar essa zonação a salinidade, o tipo de sedimento e seus nutrientes, predação

e a competição, ou a combinação de vários destes ao longo do espaço e tempo (Bunt, 1996).

Sabe-se, entretanto, que os fatores naturais afetam os componentes do manguezal em diferentes

escalas temporais, levando de minutos a horas para afetar os processos fisiológicos e a

microbiota, em anos para o crescimento e reposição das espécies vegetais, e na ordem de

décadas a séculos para mudanças de natureza regional (ALONGI, 2002; TWILLEY; CHEN;

HARGIS, 1992).

Figura 2 - Representação esquemática da zonação de espécies vegetais no manguezal.

Fonte: Adaptada da internet. Disponível em: <http://sky.scnu.edu.cn/life/class/ecology/image/3/3-25.jpg> Acessado em 22/04/2015

As condições ambientais únicas encontradas nos manguezais, decorrem da combinação

de diversos fatores físicos e químicos. As marés oceânicas e o fluxo do rio são responsáveis

pela complexa corrente formada nos estuários, sendo ponto central dos diversos fenômenos

ecológicos que nele ocorrem, como a dispersão dos organismos, renovação do nutrientes e

oxigênio e remoção dos detritos. Ciclicamente, nas marés baixas e altas, as correntes de águas

oceânicas movem-se a montante e jusante, respectivamente, onde os efeitos da entrada da água

salgada não é restrita apenas as imediações do contato com o mar, sendo detectadas a dezenas


de quilômetros da costa, favorecendo a mistura e arraste de material depositado. A elevada

dinâmica dos processos físicos no manguezal, com presença das correntes e

os fenômenos associados, como as variações de salinidade, temperatura, se refletem em alta

variabilidade nas condições químicas encontradas (MCLEOD; SALM, 2006).

Alguns fatores podem fazer as temperaturas encontradas nos manguezais passíveis de

variação, como a baixa profundidade dos cursos e espelhos d'água, principalmente nas marés

baixas, aumentando a influência da temperatura do ar no ambiente. Ainda, as temperaturas da

água do mar e do rio podem diferir grandemente, fazendo com que a temperatura também seja

influenciada pelo regime de marés. Contudo, as temperaturas médias encontradas nos

manguezais são típicas das regiões tropicais e subtropicais, geralmente superiores a 20 ºC, com

máximas até 40 ºC. (MAIA et al., 2006)

Devido a influência das águas marinhas, a salinidade nos manguezais varia bastante. A

mistura das águas do rio e do mar resulta geralmente em concentrações salinas intermediárias

entre ambos, com valores flutuando também com as marés. Contudo, a presença de uma

topografia amena juntamente com climas muito quentes e secos podem propiciar que a

evaporação exceda a vazão local do rio, elevando a salinidade encontrada em algumas partes

do manguezal além da encontrada em águas marinhas. Em estuários mais profundos, as

diferenças de salinidade e densidade entre as águas do rio e do mar podem gerar um padrão

estratificado, onde a salinidade se apresenta em um gradiente através da coluna

d'água. (MCLEOD; SALM, 2006)

Os manguezais destacam-se entre os ecossistemas mais produtivos do planeta,

exercendo inúmeras funções nos sistemas marinhos e costeiros. Conjuntamente com os

sedimentos e sedimentos associados, estima-se que os manguezais sequestrem até 22,8 milhões

de toneladas de carbono/ano. Apesar da área de cobertura continental dos manguezais ser

apenas cerca 0,1% da área continental total, estas áreas são responsáveis pelo aporte de 10% do

carbono orgânico dissolvido (COD) e 11% do carbono terrestre total exportados aos

oceanos (DITTMAR et al., 2006; JENNERJAHN; ITTEKKOT, 2002).

A localização dos mangues implica que grande parte da matéria orgânica de origem

continental, carreada pelos cursos hídricos em direção aos oceanos, atravesse o ecossistema


durante seu percurso. Deste montante, uma parcela se acumula no ambiente, onde é degradada

ou modificada aeróbica e anaerobicamente por uma enorme diversidade de micro-organismos.

A abundância de matéria orgânica combinada com a granulometria fina dos sedimentos ricos

em silte e argila, promovem o estabelecimento de condições anaeróbias nos sedimentos (ARFI

et al., 2012). A oxidação acelerada da matéria orgânica encontrada depositada nas camadas

superficiais do sedimento, consome prontamente o oxigênio em solução de forma que é

incomum que este seja capaz de penetrar milímetros no sedimento, exceto em microambientes

decorrentes da presença de raízes especializadas ou galerias formadas pela

fauna (THONGTHAM; KRISTENSEN; PUANGPRASAN, 2008).

A preservação e bom funcionamento dos manguezais deve ser levado em conta para a

manutenção equilibrada dos fenômenos de transferência de matéria do continente para o

ambiente marinho, e seus impactos ecológicos, climáticos e socioeconômicos (GIRI et al.,

2011). Tendo a manutenção destes ecossistemas em mente, faz-se imprecindível

desenvolvimento de técnicas de recuperação eficientes e ecologicamente aplicáveis, como os

processos de biorremediação.

2.2. Biorremediação

Existem diversas estratégias disponíveis para remediar ambientes impactados, como a

drenagem, incineração, dentre outras. A biorremediação, um dos grandes alvos da pesquisa

ecológica da comunidade científica atual, consiste em um conjunto de processos no quais são

empregados organismos vivos, normalmente plantas ou micro-organismos, com o intuito de

remover ou atenuar poluentes ambientais. Processos de biorremediação têm sido intensamente

pesquisados e recomendados pela comunidade científica como alternativas viáveis para o

tratamento de ambientes contaminados, tais como águas superficiais, subterrâneas e

sedimentos, resíduos e efluentes industriais (ALEXANDER, 1999).

Dentre os poluentes que impactam os manguezais, as contaminações oriundas de

atividades rotineira da indústria do petróleo e derramamentos acidentais de óleo se destacam

devido a toxicidade, insolubilidade e persistência de algumas frações do petróleo no ambiente.

O desequilíbrio gerado nos ambientes afetados com hidrocarbonetos do petróleo é nocivo tanto

a biodiversidade local como para a saúde humana, fazendo-se necessária a remediação dos

ambientes impactados. O efeito tóxico sobre os animais (Figura 3), a vegetação e as


comunidades microbianas do ambiente traz grande preocupação, principalmente levando em

consideração sua persistência e o efeito de magnificação trófica aos quais os consumidores dos

ecossistemas impactados estão susceptíveis (DU et al., 2014).

Figura 3 - Fauna impactada por derramamento de petróleo.

Fonte: Win Macnamee/Getty images < http://www.gettyimages.ca/detail/news-photo/laughing-gull-coated-in-heavy-oil-wallows-in-the-surf-june-news-photo/101619085> e <http://graphics8.nytimes.com/images/2013/09/30/business/bp2/bp2-articleLarge.jpg> Acessado em 30/04/2015.

Dependendo da natureza química dos contaminantes, pode ocorrer uma diminuição da

concentração destes compostos por fenômenos físicos e químicos, conjuntamente conhecidos

como atenuação natural, tais como a volatilização e a fotoxidação. Na maioria dos casos de

grandes derramamentos de óleo, entretanto, há necessidade do emprego de técnicas de

remediação para acelerar a descontaminação (VIDALI, 2001).

A biorremediação apresenta várias vantagens em relação aos métodos físicos e químicos

tradicionais (e.g: incineração ou neutralização química), dentre elas:

- Ecologicamente seguros: Ao contrário de outros processos, a biodegradação possui a

capacidade de eliminar os contaminantes sem dispensá-los no meio, por exemplo, do sedimento

para a água por solubilização ou para o ar por volatilização. Ainda, a grande diversidade

metabólica, provavelmente complementar pela presença de mais de um organismo envolvido

no processo completo de degradação, permite que o poluente seja metabolizado até suas

menores partes, não restando subprodutos que potencialmente apresentem atividade tóxica

vestigial. Os produtos finais desta degradação são dióxido de carbono, água e a biomassa

microbiana (MAACHI; ABOUSSEOUD; CHAABANE, 2001).


-Baixo custo: Levando em consideração que a remoção é realizada pelo metabolismo

dos organismos, grande parte dos custos está associada à obtenção, preparação e manutenção

das condições de crescimento dos organismos remediadores. Devido a diversidade de técnicas

in situ, elimina-se custos com transporte de material contaminado e os riscos ao ambiente e

saúde humana (FRANZETTI et al., 2009).

-Biocompatibilidade: As tecnologias implementadas para a biorremediação de

sedimentos geralmente utilizam a estimulação da microbiota local pela adição de nutrientes,

alterações em parâmetros físico-químicos que favoreçam o biogênese, a adição de biomassa

proveniente de estirpes nativas ou uma combinação das anteriores. Quando há necessidade de

adição de organismos alóctones, esta é avaliada de forma a detectar e evitar possíveis

desequilíbrios. Estas práticas oferecem mínimos riscos ambientais aos já fragilizados ambientes

impactados por poluentes (VIDALI, 2001).

Contudo, a biorremediação também possui desvantagens e limitações em relação a

métodos físico e químicos, destacando-se:

-Nem todos os poluentes são biodegradáveis. Além disto, alguns dos compostos

passíveis de degradação, durante sua metabolização podem produzir intermediários mais

persistentes e/ou poluentes do que o composto original.

-Especificidade. As condições que favorecem o processo de biorremediação podem ser

difíceis de reproduzir ou manter em larga escala, o que gera dificuldades na extrapolação de

modelos feitos em escalas piloto.

-Tempo. Normalmente o processo de biorremediação requer mais tempo para agir do

que outras opções como a remoção do sedimento ou incineração. . (VIDALI, 2001)

Algumas das técnicas de biorremediação in situ mais utilizadas são:

-Bioventilação: A estratégia consiste no suprimento de ar e nutrientes através da

perfuração de poços em sedimentos contaminados, estimulando a comunidade autóctone. O

fluxo de ar é mínimo, de forma a fornecer apenas o oxigênio necessário para a biodegradação

enquanto o mínimo de vaporização e volatilização dos contaminantes ocorre na atmosfera.


Usado para contaminantes simples e localizados abaixo da superfície do sedimento.

-Bioestímulo: Consiste no suprimento de oxigênio e nutrientes através da adição direta

por meio sólido ou solução aquosa, suplementando as comunidades autóctones. Usado tanto

em sedimento como em águas superficiais. No caso de soluções aquosas, ocorre a percolação

da solução nutritiva, levando oxigênio, carbono ou outros aceptores de elétrons, propiciando

um aumento no metabolismo das comunidades. A distribuição de nutrientes sólidos será

dependente de sua solubilidade e taxa de difusão para que este possa alcançar uma parcela

significativa das comunidades degradadoras.

-Biosparging: Realizada através a injeção de ar pressurizado abaixo da coluna d'água,

distribuindo oxigênio para as comunidades do leito. Adicionalmente promove uma mistura

entre o a zona saturada e o leito, aumentando o contato entre as fases.

-Bioaumentação: Envolve a adição de micro-organismos livre ou imobilizados de

origem endógena ou exógena na área impactada. Os principais fatores limitantes decorrem: i)

os organismos alóctones dificilmente são capazes de competir com as comunidades

microbianas locais, de maneira a perdurar e sustentar um tratamento de longo prazo e ii) grande

parte dos sedimentos que estão em fase crônica de exposição a contaminantes possuem micro-

organismos endógenos com capacidade de metabolização dos poluentes, bastando apenas um

estímulo para que a degradação ocorra de maneira mais eficiente em detrimento da adição de

mais biomassa (VIDALI, 2001).

Dentre as técnicas ex situ de biorremediação, destacam-se:

-Landfarming: uma técnica simples na qual o sedimento contaminado é escavado e

transferido a outro local, onde este possa ser periodicamente revolvido até que os poluentes

sejam degradados, através da estimulação de rotas aeróbicas de degradação das comunidades

autóctones.

-Compostagem: a combinação de camadas de sedimento intercaladas com resíduos

orgânicos inócuos, como lixo orgânico domiciliar, resíduos agrícolas, esterco, de maneira a

bioestimular as comunidades autóctones (VIDALI, 2001).


-Biorreatores: Esta técnica é utilizada no tratamento de material sólido ou semi-sólido

contaminado. O sedimento contaminado é misturado com água, formando uma suspensão com

cerca de 10 a 40% de sólidos, a qual é areada através de movimentos periódicos do reator. A

vantagem associada ao uso de reatores é a vigorosa homogeneização dos contaminantes no

sedimento, minimizando a dificuldade de tratamento in situ decorrente da heterogeneidade da

distribuição dos contaminantes no sedimento. Adicionalmente, o sistema fechado formado no

interior de um biorreator é permissivo a inoculação de micro-organismos degradadores e ainda

à otimização de seus parâmetros culturais, como temperatura e pH, e subsequente aumento no

crescimento microbiano (JACQUES et al., 2007). Limitações severas ligadas a quantidade de

sedimento a ser tratado, necessidade eventual de pré-tratamento para a remoção de compostos

que impeçam o crescimento dos micro-organismos e preparo do sedimento para a redução do

tamanho dos agregados, tornam essa técnica de relativo alto custo, empregada primariamente

quando faz-se necessário a biorremediação de altas concentrações de um determinado poluente

em um curto período de tempo (JACQUES et al., 2007).

O grande fator limitante na capacidade de remediação de sedimentos contaminados com

hidrocarbonetos decorre de sua baixa solubilidade em água, que limita sua assimilação e

degradação. Por esta razão, a capacidade apresentada por alguns micro-organismos de produzir

compostos capazes de aumentar a solubilidade é um forte aliado no processo de biorremediação

(MULLIGAN, 2005).

2.3. Biodegradação de n-hexadecano

O diesel, uma fração do petróleo de ampla utilização comercial, é formado por uma

mistura complexa de hidrocarbonetos, consistindo primariamente de cadeia alifáticas que

variam entre 9 e 23 carbonos e um menor número de componentes aromáticos. Alguns

desses hidrocarbonetos são considerados poluentes ambientais de longa persistência. Por

apresentarem baixa solubilidade em água se tornam mais difíceis de serem biodegradados

(CIRIC; PHILP; WHITELEY, 2010).

O n-hexadecano, componente mais abundante em massa do diesel combustível, é

um alcano de cadeia simples, de formula química C16H34.

A biodegradação dos hidrocarbonetos comumente resulta em metabolitos menos


complexos, ou em CO2 ou metano como produtos finais, dependendo da via metabólica.

Diversos fatores influenciam a taxa de degradação dos hidrocarbonetos pelos micro-

organismos, dentre eles: a complexidade estrutural do hidrocarboneto; a condição de

crescimento da microbiota como temperatura, pH, oxigenação e solubilidade do poluente

(NTOUGIAS et al., 2015).

Micro-organismos ambientais empregam diversas vias para a oxidação dos n-alcanos,

onde diferentes sistemas enzimáticos são responsáveis pela ativação dos alcanos em condições

aeróbias e anaeróbias. Em condições aeróbias, o oxigênio atua como receptor final de elétrons,

enquanto em condições anaeróbias, atuam como receptores o nitrito e o sulfato (JI et al., 2013).

A primeira etapa aeróbica da degradação dos alcanos consiste da introdução de átomos

de oxigênio em alguma porção da cadeia carbônica através de enzimas chamadas hidroxilases,

ou ainda oxigenases. São descritas 4 vias referentes ao sítios de oxidação inicial

das hidroxilases:

-Monoterminal: O alcano é hidroxilado no metil terminal, resultando no seu álcool primário,

sendo oxidado sequencialmente pelas álcool e aldeído desidrogenases, resultando em ácidos

graxos, que são incorporados na β-oxidação (JI et al., 2013; SCHELLER et al., 1998).

-Biterminal: Ocorre após a oxidação de uma das extremidades do alcano até seu ácido graxo

correspondente. O ácido produzido na oxidação monoterminal passa por uma oxidação no

grupo metil na outra extremidade da cadeia (posição ω), resultando em um ω-hidroxi ácido

graxo, que se converte após a ação sequencial das álcool e aldeído desidrogenases, em um

ácido dicarboxílico, que também pode ser incorporado na β-oxidação (JI et al., 2013;

SCHELLER et al., 1998).

-Subterminal: Esse processo ocorre quando a oxidação ocorre na posição adjacente a terminal,

formando o alcool secundário correspondente. Este álcool é convertido nas cetonas e ésteres

correspondentes, sendo então hidroxilado por uma esterase, liberando um álcool e um ácido

graxo, que podem ser incorporados na β-oxidação ou integrar a via biterminal (JI et al., 2013).

-Via de Finnerty: Essa via se inicia com o ataque de dioxigenases levando a formação


do hidroperóxido correspondente, sequencialmente oxidado à peroxi-ácido, aldeído e

finalmente em ácido graxo (JI et al., 2013).

Em condições anaeróbias, são descritos 2 mecanismos principais para a degradação

dos alcanos:

-Adição de fumarato: A adição do grupo fumarato ocorre entre a posição subterminal da cadeia

do alcano e a ligação dupla do fumarato, resultando no alcilsuccinato correspondente. Essa

incorporação permite o rearranjo do esqueleto carbônico e incorporação na β-oxidação

(CALLAGHAN et al., 2009).

- Carboxilação: A conversão do alcano em ácido graxo se dá pela incorporação de um

bicarbonato inorgânico na posição C3 e a liberação dos 2 carbonos da porção terminal,

resultando no ácido graxo com um carbono a menos que o alcano correspondente

(CALLAGHAN et al., 2009).

As vias metabólicas que convertem os alcanos em ácidos graxos, tanto aeróbica

como anaerobicamente, estão representadas a figura 4.

Figura 4 – Representação Esquemática das vias de degradação dos alcanos descritas da literatura.


As vias descritas dividem-se em A) Vias aeróbias. B) vias anaeróbias. Fonte : Adaptado de (JI et al., 2013).

2.4. Atividade desidrogenásica

As desidrogenases desempenham papel fundamental durante a oxidação da matéria

orgânica presente no solo. O conceito de estimar a atividade biológica em sedimentos através

da medição da atividade enzimática das desidrogenases baseia-se no princípio de ser possível

correlacionar o efeito de um amplo grupo de enzimas que atuam na transferência de hidrogênio

e elétrons entre os compostos orgânicos sujeitos a oxidação e seus receptores

finais (BRZEZIŃSKA; STȨPNIEWSKA; STȨPNIEWSKI, 1998). Inicialmente proposto

por Bucksteeg e Thiele (1959), a atividade das desidrogenases é um dos indicativos do

potencial redox em sistemas microbianos em solos e sedimentos. Diversos autores

correlacionam diretamente a atividade desidrogenásica e a capacidade respiratória no

solo (CAMIÑA et al., 1998). Em decorrência disso, o método vem sendo empregado como

estimador da capacidade respiratória e oxidativa em sedimentos, solos agrícolas, estações de

tratamento de água e esgotos (CHANDER; BROOKES, 1991; KLAPWUK; DRENT;

STEENVOORDEN, 1974; MUTER et al., 2012).


O princípio químico da reação catalisada pelas desidrogenases se baseia na redução de

um aceptor de elétron sintético, como os sais de tetrazólio. A transferência de elétrons mediada

pela desidrogenase leva a formação do formazan, um composto insolúvel que pode ser

quantificado espectrofotometricamente. Dentre os diversos sais de tetrazólio descritos, cada um

com suas especificidades e propriedades particulares, o 2,3,5 - trifenil cloreto de tetrazólio ou

TTC é amplamente empregado na avaliação de amostras ambientais. A conversão do TTC

em trifenil formazan (TPF) ocorre pela captação dos carreadores de elétrons competitivamente

com seu aceptores finais, como o oxigênio de acordo com a reação mostrada na figura 5

(CHANDER; BROOKES, 1991). O TTC distingue-se fortemente do TPF, consistindo de um

pó esbranquiçado que produz uma solução levemente amarelada quando dissolvido em água ou

tampão, enquanto o TPF possui uma coloração rubra característica e se precipita em solução

aquosa, podendo ser extraído com diversos solventes orgânicos (GONG, 1997).

Figura 5 - Conversão do 2,3 - trifenil cloreto de tetrazólio (TTC) em trifenil formazan (TPF) catalizada por

desidrogenases.

Fonte: (CHANDER; BROOKES, 1991)

Para a avaliação de amostras ambientais, diversos métodos estão descritos na literatura

para a realização do ensaio, gerando uma grande diversidade de fatores que podem afetar o

resultado da atividade desidrogenásica, tais como as condições de incubação do ensaio, forma


de extração do TPF, tipo de solo ou substrato orgânico testado, influência de substâncias tóxicas

e inibidoras e saturação de oxigênio. Esses fatores devem ser levados em conta de forma a

obter-se resultados compatíveis e comparáveis entre os diferentes tipos de substratos avaliados

(MARGESIN; ZIMMERBAUER; SCHINNER, 2000).

2.5. Imobilização

A aplicação de micro-organismos imobilizados apresenta várias vantagens em

comparação com o uso de células em suspensão. Dentre elas se destacam: facilitação na

recuperação, coleta e isolamento dos produtos; maior taxa de crescimento e maior biomassa

quando empregado em reatores, maior estabilidade catalítica, maior tolerância contra grandes

concentrações de compostos tóxicos, possibilidade de reutilização dos micro-organismos,

menor suscetibilidade à contaminação de micro-organismos indesejáveis, além de maior

estabilidade e tempo útil das células imobilizadas (MATSUMURA et al., 1997).

O processo de imobilização de micro-organismos visa a formação de uma camada

protetora ao redor das células, usualmente sob a forma de esferas, construída de forma tal que

permita o transporte e difusão entre as células e o ambiente. Diversos materiais podem constituir

a matriz na qual as células são recobertas como os polissacarídeos naturais, tais como

o ágar, agarose, carragenanas, alginatos, quitosana, ou ainda materiais sintéticos como resinas

de vinil (KAMPF, 2002).

O termo imobilização compreende um conjunto de técnicas que visam aprisionar células

ou moléculas, tais como enzimas, em suportes sólidos ou semissólidos, geralmente constituídos

à partir de uma matriz polimérica. Cada uma destas técnicas tais como encapsulamento,

floculação, ligação covalente a carreadores, possui características especificas e pode ser melhor

aplicada a critério da natureza do material que será imobilizado e sua aplicação posterior.

Dentre os materiais empregados nos processos de imobilização a quitosana, um

polímero derivado da quitina, se destaca por se tratar de um biopolímero baixo custo,

atoxocidade e biodegradabilidade. A quitina é o principal componente das carapaças crustáceos,

exoesqueleto dos insetos e da parede celular dos fungos, fazendo da quitosana, molécula


oriunda da desacetilação da quitina, profusamente abundante na natureza e de baixo custo,

levando em consideração que pode ser obtida como subproduto dos cultivo e beneficiamento

de crustáceos (HSIEH et al., 2008).

As vantagens no emprego de micro-organismos imobilizados em processos de

biorremediação decorrem da proteção fornecida pela matriz contra estresses ambientais, como

concentrações elevadas de contaminantes, ciclos hídricos, competição interespecífica,

concedendo aos micro-organismos imobilizados melhores condições e tempo de adaptação.

Ainda, a degradação da matriz de imobilização e seu uso como fonte de carbono age como

bioestímulo para o crescimento e proliferação dos micro-organismos (HSIEH et al., 2008;

JACQUES et al., 2007; TONINI; DE REZENDE; GRATIVOL, 2010)

2.6. Microcosmos

Devido as complexas interações biológicas, químicas e físicas que ocorrem no

sedimento, sistemas simplificados em escala laboratorial, chamados microcosmos, tem sido

propostos como forma de possibilitar o estudo dessas interações (BARRA CARACCIOLO;

BOTTONI; GRENNI, 2013; CARBONELL; TARAZONA, 2014).

Microcosmos podem ser definidos como sistemas reprodutíveis e controlados que visam

simular uma porção de ambiente em laboratório, levando em conta os processos e interações

relevantes do ecossistema simulado. A montagem dos microcosmos pode ser feita pelo uso

direto de parcelas intactas de sedimento, por exemplo, preservando a estratificação e a

microbiota autóctone, ou pela composição artificial de organismos em colunas de sedimentos.

Estes sistemas podem ser usados para testar os efeitos da adição de substâncias ao ambiente em

escala controlada, permitindo avaliar a toxicidade de contaminantes e suas

misturas. Decorrentemente, os microcosmos também podem ser empregados para avaliar a

capacidade de bioremediação de contaminantes. Os microcosmos podem incorporar diversas

condições do ambiente alvo, oferecendo uma estimativa mais realística de como será o

desenvolvimento microbiano e a extensão da descontaminação encontradas em campo

(BARRA CARACCIOLO; BOTTONI; GRENNI, 2013; CARBONELL; TARAZONA, 2014;

FERNÁNDEZ et al., 2011; PATHAK et al., 2009). Alguns tipos de microcosmos estão exibidos

na figura 6.


Figura 6 - Exemplos de diferentes formas possíveis de microcosmos.

Fonte: Disponíveis em: http://njwrri.rutgers.edu/images/microcosmexp.jpg; ;

http://ecossa.de/mikrokosmen/boden-mikrokosmen ; http://avecom.be/files/uploads/media/2013/02/83.jpeg ;

https://www.uni-marburg.de/fb17/forschung/fobericht/Foberichtneu/experimentalmicrocosms.jpg. Acessado em

30/04/2015.

Análises da estrutura da comunidade assim como o balanço e distribuição dos

componentes abióticos, apresentam pouca representatividade quando analisados em

microcosmos, tanto pelo esforço analítico frente a tantas possíveis variáveis, quanto pela

dificuldade de extrapolar observações de curto-período para uma escala ambiental maior.

Contudo, quando aplicado em análises funcionais, como o acompanhamento da expressão

enzimática, metabolização de um composto ou mobilização de um determinando nutriente, os

modelos em microcosmos se adequam às escalas dos processos e permitem acesso a essas

informações, de maneira fidedigna às observações em campo, o que pode ser confirmado pela

comparação de estudos em escalas temporais e espaciais crescentes (DELL’ANNO et al., 2012;

MAILA; CLOETE, 2005).

Estudos em escala de bancada envolvendo o isolamento de estirpes microbianas,

caracterização fisiológica, monitoramento, determinação da eficiência de estirpes


degradadoras, dentre outros, são etapas fundamentais e servem de alicerce para experimentos

em campo que envolvam biorremediação. O uso de modelos que simulem as condições dos

sedimentos devem ser conduzidos de forma a aproximar as condições utilizadas na bancada as

condições encontradas no ambiente alvo de estudo. Devido a natureza física dos sedimentos e

dos hidrocarbonetos do petróleo, os contaminantes não se apresentam homogeneamente

dispersos nos sedimentos e sedimentos e sua difusão é dificultada pela fase predominantemente

sólida, o que pode tornar o processo de degradação do poluente em questão diversas ordens de

grandeza inferior aos obtidos em meio líquido, onde o acesso irrestrito dos micro-organismos

ao poluente e as facilidades de transporte advindas com a agitação e homogeneidade

constantes estão presentes (PATHAK et al., 2009).

Existem poucos estudos demonstrando a descontaminação de hidrocarbonetos do

petróleo pela adição de micro-organismos (bioaumentação) em escala ambiental. O pouco

sucesso obtido nestes experimentos pode estar relacionado a forma como as estirpes são

selecionadas, levando primariamente em consideração a competência bioquímica em

detrimento das demais condições físico-químicas e a capacidade de colonizar e competir no

ambiente (PATHAK et al., 2009).


3. OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

O objetivo deste estudo foi avaliar a capacidade de remoção de n-hexadecano por

bactérias selecionadas em suspensão ou imobilizadas em esferas de quitosana, em microcosmos

de sedimentos de manguezal monitorados pela atividade desidrogenásica.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

3.2.1 Avaliar o desempenho de sete estirpes de bactérias selecionadas pelo potencial para

degradar n-hexadecano em sedimentos de manguezais;

3.2.2 Avaliar o desempenho de estirpes de bactérias selecionadas para degradar n-hexadecano

na forma livre e imobilizada em esferas de quitosana;

3.2.3 Avaliar o efeito da comunidade microbiana nativa do sedimento no processo de

biorremediação de n-hexadecano pelo consórcio de bactérias selecionado.

3.2.4 Monitorar a biodegradação da quitosana em sedimentos de manguezal e o seu efeito

sobre a comunidade microbiana.


4. METODOLOGIA

4.1. Estirpes de bactérias

Neste estudo foram utilizadas 7 estirpes de bactérias pertencentes à coleção de micro-

organismos do Laboratório de Ecologia Microbiana e Biotecnologia (LEMBiotech), do

departamento de Biologia na Universidade Federal do Ceará (UFC). Essas estirpes foram

isoladas de amostras de sedimentos de uma área cronicamente contaminada com petróleo do

manguezal da baía de Todos os Santos, Bahia, pela técnica de enriquecimento em meio mineral

contendo n-hexadecano como única fonte. Das 7 estirpes, denominadas HEXBA01 a

HEXBA07 (Figura 7), apenas cinco foram identificadas pela sequência do gene RNA

ribossomal 16S (Tabela 1) (ANGELIM, 2012).

Figura 7 - Morfologia colonial das estirpes de bactérias obtidas por enriquecimento com n-hexadecano a partir

de amostras de sedimentos do manguezal da baia de Todos os Santos, Bahia, contaminados com petróleo.

Fonte: (ANGELIM, 2012)

Tabela 1 - Identificação molecular da estirpe de bactéria, tamanho da sequencia parcial do gene do RNAr 16S e número de acesso no GenBank.

Fonte: Angelim, 2012.

Isolados Bacterianos Identificação Tamanho (pb) N° de acesso no GenBank

HEXBA 1 Sphingomonas sp. 1.232 JQ818204

HEXBA 2 Gordonia sp. 1.302 JQ658422

HEXBA 4 Micrococcus sp. 1.425 JQ658423

HEXBA 5 Gordonia sp. 1.448 JQ658424

HEXBA 6 Micrococcus sp. 1.438 JQ658425


Essa coleção de micro-organismos é mantida à -80 ºC em freezer, em tubos contendo caldo

TGE (triptona, glucose e extrato de levedura) enriquecidos com glicerol 20% v/v como agente

crioprotetor. Para reativação, as culturas estoques são inoculadas em placas de ATGE-salino

(ágar, triptona, glucose, extrato de levedura, 2% m/V NaCl) e as colônias isoladas são utilizadas

para preparação de culturas puras em caldo TGE-salino, incubadas sob agitação em shaker a

150 rpm, 30 ºC por 24h. A partir dessas culturas obtém-se os inóculos ajustando as densidades

óticas para 0,1 de absorbância a λ= 600 nm.

4.2. Preparação dos microcosmos

As amostras de sedimentos de manguezal utilizadas para preparação dos microcosmos

foram coletadas no manguezal do rio Pacoti, na área do Centro de Estudos de Aquicultura

Costeira (CEAC), município de Aquiraz, Ceará. Os sedimentos coletados em diversos pontos

da zona de mangue as margens do rio Pacoti, foram armazenados e transportados para o

laboratório em temperatura ambiente. No laboratório, foram limpos de partículas grosseiras,

homogeneizados e utilizados na montagem dos microcosmos.

Os microcosmos foram montados em tubos Falcon de 50 mL contendo 10 g de

sedimento (Figura 8). Os tubos com sedimentos foram esterilizados em autoclave à 121 ºC por

1 hora, após o que foram submetidos a contagem de unidades formadoras de colônias de

bactérias, pela técnica de diluição em placa de meio ATGE-salino. As placas foram incubadas

a 30 ºC e diariamente observadas até 7 dias.

Aos sedimentos esterilizados foram adicionados 2500 µL de água destilada estéril, 50

µL de cultura e 100 mg de n-hexadecano. As sete estirpes bacterianas foram testadas

separadamente ou em consórcio. Para preparação do inóculo do consórcio 50 µL de cada cultura

selecionada para compor o consórcio foram misturados vigorosamente e dessa cultura mista

foram retirados 50 µL para inocular os microcosmos. Nos tempos 0, 3, 6, 9, 12, 18, e 24 dias

após a inoculação, as triplicatas de cada microcosmo foram sacrificadas para monitoramento

do pH, contagem de bactérias totais e mensuração da atividade desidrogenásica. Foram feitos

2 experimentos independentes.


Figura 8 – Microcosmos de sedimentos de manguezal utilizados nesse estudo.

4.3. Atividade desidrogenásica

Para medir o estado metabólico e a taxa de respiração dos micro-organismos nos

microcosmos foi empregada a atividade desidrogenásica, DHA (do inglês, DeHydrogenase

Activity), pelo método do sal de tetrazólio.

Ao final de cada período de tempo, foram adicionados aos microcosmos 5 mL de uma

solução 2% (m/v) de Cloreto de Trifenil Tetrazólio (TTC) preparada em tampão Tris-HCl 100

mM, pH 7,0. Os microcosmos foram incubados por 24h, protegidos da luz. Após o tempo de

incubação o produto Formazan, possivelmente formado, foi extraído pela adição de 20 mL de

acetona sob agitação em vortex por 5 segundos, seguido de centrifugação a 5000 g por 10

minutos para separação do sedimento e sobrenadante. O sobrenadante contendo o Formazan foi

recolhido e mensurado em espectrofotômetro a 485 nm. A concentração de Formazan foi

determinada a partir de uma curva padrão construída a partir de concentrações conhecidas de

Formazan comercial, sendo a atividade expressa em massa de TPF (trifenilformazan) formada

em função da massa de sedimento ( µg TPF.g-1) (Figura 9).

Fonte: Autor, 2014


Figura 9 - Curva padrão preparada a partir de soluções de concentrações conhecidas de formazan e leitura da

absorbância a 485 nm.

4.4. Imobilização de micro-organismos em esfera de quitosana

As estirpes de bactérias selecionadas foram imobilizadas em esfera de quitosana

seguindo o método descrito por (ANGELIM, 2012). Em 100 mL de uma solução de ácido

acético 1% (v/v) foram solubilizados 3% (m/v) de quitosana ( Galena, 86,5% de desacetilação),

sob agitação lenta por pelo menos 3h e deixada em repouso por 24h de forma a permitir a saída

das bolhas de ar formadas. Concomitantemente, o inóculo foi preparado a partir da biomassa

resultante da centrifugação a 10000 g por 5 min de 100 ml da cultura de bactéria. A biomassa

foi ressuspensa em 1 ml de NaCl 0,9% e essa suspensão foi misturada ao gel de quitosana e a

mistura foi agitada lentamente por 3 h. O gel de quitosana contendo os micro-organismos foi

gotejado utilizando agulhas e seringas em 200 mL de uma solução de Tripolifosfato (TPP) 1%

(m/v) pH 9,0, para a formação das esferas e aprisionamento das células. As esferas

permaneceram em contato com a solução de TPP por 3h permitindo a formação apropriada das

ligações cruzadas entres as cadeias da quitosana, garantindo a integridade das esferas.

Posteriormente, as esferas foram lavadas em uma solução de K2HPO4 0,15M pH 8,0 por 3 vezes

(Figura 10). Para o monitoramento da carga microbiana presente nas esferas, 3 g de esferas

foram pesadas, maceradas, diluídas em 30 mL de salina estéril e plaqueadas em ATGE-salino

para contagem de células viáveis totais expressa como Unidade Formadoras de Colônias (UFC)

y = 0,0584x R² = 0,9952

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

0 10 20 30 40 50

Ab

sorb

ân

cia

a 4

85

nm

[Formazan] em ug/mL Absorbância a 485nm

Curva Padrão - Formazan


por grama.

Figura 10 - Aspecto do gel e das esferas de quitosana.

A) Aspecto do gel de quitosana contendo os micro-organismos antes e depois de ser gotejado na solução de TPP 1% (m/v); B e C) Esferas de quitosana e detalhe do diâmetro da esfera. Fonte: Autor, 2014 .

4.5. Análise das esfera de quitosana por microscopia eletrônica de varredura

(MEV)

Esferas de quitosana foram seccionadas ao meio com auxílio de um bisturi e congeladas

em nitrogênio líquido e liofilizadas. Por tratar-se de um material eletricamente não condutivo,

as esferas liofilizadas foram recobertas por uma camada de 5 nm de ouro antes de serem

analisadas no MEV. As imagens foram feitas usando aumento de 50 à 10.000 x no microscópio

Quanta FEG da Central analítica da UFC.

4.6. Análises Estatísticas

Os ensaios quantitativos foram analisados em pelo menos dois experimentos

independentes e em triplicatas. Os dados foram submetidos à análise de variância pelo método

de ANOVA com o pós-teste de Tukey utilizando intervalo de confiança de 95% (p<0,05). As

análises estatísticas e os gráficos foram feitos utilizado o programa GraphPad Prism 5.0.


5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. Ensaios nos microcosmos

Inicialmente as setes estirpes de bactérias selecionadas para esse estudo foram avaliadas

individualmente quanto a capacidade para degradar n-hexadecano (10 mg/g de sedimento) em

microcosmos de sedimento de manguezal esterilizado. O intuito de esterilizar o sedimento foi

tanto para inativar a microbiota nativa quanto potenciais enzimas presentes e assim, assegurar

que os resultados dos microcosmos fossem atribuídos apenas as estirpes que estavam sendo

testadas. Ressalte-se que devido a natureza argilosa do sedimento, este foi esterilizado a 121C

por 1h e submetido a contagens de bactérias totais, como controle da esterilização. Como não

houve o aparecimento de colônias de bactérias atestou-se que o sedimento estava estéril e então

os microcosmos foram montados e monitorados durante 30 dias. Nesse período foram colhidas

amostras para medida da DHA, determinação do pH e contagem de unidades formadoras de

colônias de bactérias.

Das sete estirpes testadas apenas HEXBA01, HEXBA04, HEXBA05 e HEXBA06

apresentaram DHA, com destaque para a estirpe HEXBA05 que produziu mais de 10 g de

TPF/g no 6o dia, atividade que caiu um pouco no 18o dia e voltou a aumentar no 24o dia.

Ressalte-se que embora HEXBA01 e HEXBA04 também tenham apresentado DHA, essa

atividade foi insignificante, comparada a HEXBA05. HEXBA06 também produziu DHA,

embora com pico apenas no 24o dia. Essas diferenças ficam mais evidentes no gráfico que

compara as atividades DHA produzidas pelas estirpes individualmente (Figura 11).

Diante desses resultados ficou evidente que dentre as sete linhagens selecionadas por

Angelim (2012), através do enriquecimento de sedimentos com n-hexadecano como única

fonte de carbono, apenas quatro estirpes podem ser consideradas consumidoras primárias de n-

hexadecano, ou seja, capazes de metabolizar diretamente esse alcano. Portanto, as demais

estirpes do consórcio original que não cresceram usando n-hexadecano diretamente, como

HEXBA02, HEXBA03 e HEXBA07 devem ter sido isoladas naquele estudo devido a processos

de complementaridade metabólica durante o enriquecimento, onde o produto de um atua como

o substrato para o outro (BACOSA; INOUE, 2015; IZARD; LIMBERGER, 2003; PAIXÃO et

al., 2010).


Figura 11 - Monitoramento da atividade desidrogenásica (DHA) durante a biodegradação de n-hexadecano em

microcosmos de sedimentos de manguezal inoculados com as diferentes estirpes testadas. Atividade

desidrogenásica medida a partir da quantificação de Formazan (TPF) extraído dos microcosmos de sedimento de

manguezal esterilizado, contaminado com n-hexadecano (10 mg/g) e inoculado com cada uma das estirpes de

bactérias isoladamente.

HEXBA01

0 6 12 18 240.0

0.5

1.0

1.5

a

ab

c

bb

Tempo em dias

DH

A e

m µ

gT

PF

.g-¹

.h-¹

HEXBA04

0 6 12 18 240.0

0.5

1.0

1.5

a

a

a

aa

Tempo em dias

DH

A e

m µ

gT

PF

.g-¹

.h-¹

HEXBA05

0 6 12 18 240

10

20

30

a

b

bc

b

c

Tempo em dias

DH

A e

m µ

gT

PF

.g-¹

.h-¹

HEXBA06

0 6 12 18 240

10

20

30

aab

abb

c

Tempo em dias

DH

A e

m µ

gT

PF

.g-¹

.h-¹

0 6 12 18 240

10

20

30H1

H4

H5

H6

Tempo em dias

DH

A e

m µ

gT

PF

.g-¹

.h-¹


Várias enzimas presentes no solo são essenciais para catalisar reações de transformação

da matéria orgânica, sendo úteis para aferir a qualidade do solo. Essas enzimas são

principalmente de origem microbiana e podem agir intra ou extracelular. Apenas um pequena

fração é derivada de plantas e/ ou animais. Dentre as enzimas mais frequentemente encontradas

no solo estão as desidrogenases. A atividade desidrogenásica é uma medida da intensidade do

metabolismo microbiano no solo e assim, da atividade microbiana no solo. Estudos tem

mostrado uma correlação positiva entre o aumento da DHA e a biorremediação de solos

contaminados com hidrocarbonetos do petróleo (BENTO et al., 2003; GONG, 1997; MUTER

et al., 2012)

Portanto, os resultados da DHA nos microcosmos de sedimentos esterilizados podem

ser atribuídos exclusivamente as estipes de bactérias inoculadas.

Como se observa na figura 12 as quatro estirpes de bactérias mantiveram-se viáveis ao

longo de 30 dias de cultivo nos microcosmos. No geral, não foi observado correlação temporal

entre o aumento no número de células viáveis e aumento de DHA. Corroborando com esse

resultado tem-se que HEXBA06 teve um aumento significativo no número de UFC/g no 6o dia

enquanto o aumento da DHA só aconteceu no 24o dia. Da mesma forma, houve redução na

contagem de HEXBA05 no 24o e um pico de DHA. (BENTO et al., 2003) também não

encontraram relação entre o aumento nas contagens de células com a atividade metabólica.

As duas estirpes que se destacaram nesse estudo, Gordonia HEXBA05 e Micrococcus

HEXBA06 pertencem ao filo Actinobacteria. Várias espécies desses gêneros são conhecidas

como degradadoras de hidrocarbonetos (ADETUTU et al., 2013; BRITO et al., 2006; CHEN et

al., 2008; GUO et al., 2010; HUIJIE et al., 2011; LIN et al., 2012; PEDETTA et al., 2013; PEI

et al., 2010; RAMSAY et al., 2000; SAEKI et al., 2009; SHEN et al., 2008; ZHONG et al.,

2010)ou produtoras de exopolissacarídeos (EPS) (FUSCONI et al., 2010) e de biossurfactantes

(BANAT et al., 2010; FRANZETTI et al., 2009), sendo potenciais candidatas para aplicações

na recuperação avançada de óleo (CHOI et al., 2003).


Figura 12 – Curvas de crescimento das estirpes HEXBA01, HEXBA04, HEXBA05 e HEXBA06 em microcosmos

de sedimentos de manguezal esterilizados contaminados com 10 mg/g de n-hexadecano.

Contagem dos isolados

0 6 12 18 24 301.0×105

1.0×106

1.0×107

1.0×108

1.0×109

HEXBA01

HEXBA04

HEXBA06

HEXBA05

Tempo em dias

UF

C/g

de S

ed

imen

to

De forma geral, a DHA de todos as estirpes aumentou entre 6 e 12 dias, seguido de

queda e de um novo aumento no 24o dia, padrão observado em todas as repetições realizadas

nesse estudo. Esse padrão sugere a ocorrência de mudanças no estado metabólico das estirpes

entre esses períodos, em decorrência da metabolização do n-hexadecano ser possível por

diferentes vias de início e da utilização de possíveis subprodutos, como ácidos graxos, formados

na primeira etapa (CALLAGHAN et al., 2009; CHAYABUTRA; JU, 2000; JI et al., 2013;

SCHELLER et al., 1998).

Das linhagens testadas, apresentaram valores de DHA mais elevados as linhagens

HEXBA05 (DHA máx. = 20,14 µgTPF) e HEXBA06 (DHA máx. = 11,46 µgTPF), sendo

assim, essas duas estirpes foram combinadas em um consórcio, denominado CHB56, que foi

testado e cujos resultados estão descritos na figura 13, no primeiro gráfico somente o consórcio

e no segundo gráfico, o consórcio e suas estirpes, para comparação.


Figura 13 – DHA do consórcio CHB56 e comparação com os resultados das estirpes individuais.

CHB56

0 6 12 18 240

10

20

30

a

aa

b

c

Tempo em dias

DH

A e

m µ

gT

PF

.g-¹

.h-¹

0 6 12 18 240

10

20

30

H5

H6

CHB56

DH

A e

m µ

gT

PF

.g-¹

.h-¹

Tempo em dias

Foi observado o mesmo padrão de produção de DHA pelo consórcio, exceto que parece

ter havido uma potencialização da atividade enzimática no sexto dia. Com base nestes

resultados, o consórcio CHB56 foi selecionado para os testes seguintes. É interessante ressaltar

que o aspecto colonial distinto (Figura 14) das estirpes HEXBA05 (Gordonia) e HEXBA06

(Micrococcus) facilitou sobremaneira o monitoramento das populações ao longo do tempo.


Figura 14- Aspecto morfológico das colônias das estirpes Gordonia HEXBA05 (colônia rosa e brilhante) e Micrococccus HEXBA06 (colônia amarela) em meio ATGE.

Fonte: Autor, 2014. .

5.2. Ensaios em microcosmo com o consórcio CHB56

Na etapa seguinte, após a consolidação de um consórcio eficiente, foram testadas duas

condições adicionais nos microcosmos: i) Quanto a presença dos organismos autóctones do

sedimento (sedimento esterilizado ou natural), e ii) Quanto a forma de inoculação dos micro-

organismos, se em meio líquido ou aprisionados em esferas de quitosana (consórcio livre ou

consórcio imobilizado). A combinação destas variáveis gerou as 4 condições usadas no ensaio,

mostradas na tabela 2.

Tabela 2 - Condições empregadas no experimento com o Consórcio CHB56

Nesses ensaios, após inoculação no tempo zero, mediu-se a DHA mais cedo, com 3 dias,

diferentemente dos 6 dias dos ensaios anteriores (Figuras 11 e 13). Os resultados desses ensaios

estão mostrados na figura 15.

Consórcio Imobilizado (CI) Consórcio Livre (CL)

Sedimento Estéril (SE) CISE CLSE

Sedimento Natural (SN) CISN CLSN


Figura 15 - Monitoramento da atividade desidrogenásica (DHA) durante a biodegradação de n-hexadecano em microcosmos de sedimentos de manguezal inoculados com o consórcio CHB56 em

diferentes condições.

CISE

0 3 6 9 12 18 24 300

50

100

150

aa ab

abb

b

Tempo em dias

DH

A e

m µ

gT

PF

.g-¹

CLSE

0 3 6 9 12 18 24 300

50

100

150

ab

ad

b

acdac

cd cd

Tempo em dias

DH

A e

m µ

gT

PF

.g-¹

CISN

0 3 6 9 12 18 24 300

200

400

600

800

1000

aac a

a

b

bcbc

Tempo em dias

DH

A e

m µ

gT

PF

.g-¹

CLSN

0 3 6 9 12 18 24 300

200

400

600

800

1000

aab ab

bc ccc

c

Tempo em dias

DH

A e

m µ

gT

PF

.g-¹

0 3 6 9 12 18 24 300

400

800

1200

CLSE

CISE

CLSN

CISN

Tempo em dias

DH

A e

m µ

gT

PF

.g-¹

CLSE = Consórcio Livre, Sedimento Esterilizado; CISE = Consórcio Imobilizado, Sedimento Esterilizado; CLSN = Consórcio Livre, Sedimento Natural; CISN = Consórcio Imobilizado, Sedimento Natural. Fonte: Autor, 2015.

Analisando os dois microcosmos preparados com sedimentos esterilizados claramente

se observa que a DHA detectada no microcosmo inoculado com o consórcio imobilizado


(CI.SE) foi o dobro da DHA do microcosmo inoculado com o consórcio livre. Essa diferença

pode ser explicada pela proteção fornecida pela matriz de quitosana aos micro-organismos no

seu interior que não ficam expostos a toxicidade direta do contaminante. Ressalte-se que em

ambos os tipos de microcosmos a atividade foi detectada no 3o dia, ou seja, a atividade

metabólica ocorre de fato mais cedo do que havia sido medido no primeiro ensaio (Figura 13).

Depois do pico inicial no 3o. dia, observa-se queda e depois aumento da DHA que se mantém

constante até o final do monitoramento, no 30o dia.

Nos microcosmos preparados com sedimentos não esterilizados, portanto, que simulam

uma situação real de biorremediação in situ, onde existe a influência da microbiota nativa, o

resultado com o consórcio imobilizado se diferenciou ainda mais do consórcio livre, sendo sua

DHA novamente duas vezes maior. Ressalte-se que nesses microcosmos a DHA também foi

significantemente mais alta do que nos microcosmos que usaram sedimento esterilizado,

demonstrando de forma inequívoca a participação da microbiota nativa no processo de

biodegradação do n-hexadecano. Os resultados demonstram claramente a importância da

bioaumentação, ou seja, adição de micro-organismos para acelerar a biodegradação. Além

disso, os resultados também provam o valor de usar essas células imobilizadas, pois além da

proteção contra a toxicidade direta dos poluentes, a matriz também diminui a competição direta

entre o consórcio e a microbiota nativa.

Como mostrado por (ANGELIM, 2012), HEXBA05 e HEXBA06 não são produtoras

de quitosanases, sendo então metabolicamente incapazes de degradar o matriz na qual estão

imobilizadas e utiliza-lo como fonte de carbono. Isto implica que que na condição onde o

sedimento foi esterilizado e havia a presença das esferas de quitosana, o aumento da DHA deve-

se apenas a atividade do consórcio sobre o n-hexadecano. Já na condição de sedimento não

esterilizado, onde existem micro-organismos nativos capazes de degradar a quitosana, a grande

diferença do pico de DHA pode ter contribuição da metabolização e respiração oriunda da

degradação da quitosana.

Em todas as condições, ocorre um pico elevado e característico de respiração após 3

dias do início do experimento. Em ambas condições que utilizaram sedimento esterilizado, foi

percebido uma elevação secundária da atividade respiratória a partir de 9 dias, o que pode

ser atribuído a presença de diferentes etapas de preparação metabólica necessárias à degradação


do n-hexadecano por uma comunidade bacteriana composta por apenas duas espécies. As

condições que utilizaram sedimento não esterilizado não apresentaram elevação significativa

na atividade das desidrogenases nos demais tempos, possivelmente por tratar-se de uma

comunidade metabolicamente mais diversa, incluindo a microbiota autóctone, capaz de realizar

as primeiras etapas da degradação do n-hexadecano e de assimilar os metabólitos secundários

concomitantemente.

Ensaios realizados em microcosmos testando o efeito de consórcios bacterianos

demonstram a prevalência da bioaumentação quando comparada a atenuação natural e o

bioestímulo. Resultados obtidos com outro consórcio demonstraram degradação da fração mais

leve dos componentes do diesel (C12-C23) concentrando-se nos primeiros 14 dias de

experimento e maior aumento da DHA em condições de bioaumentação (CAMARGO;

OKEKE, 2005).

A atividade desidrogenásica durante a degradação de poluentes de petróleo por

consórcios bacterianos parece demonstrar suas taxas mais elevadas nos primeiros dias após a o

contato com o poluente. Ensaios de degradação de óleo diesel adsorvido em turfa revelou que

a DHA apresentou picos dentro dos primeiros 10 dias de contato (MUTER et al., 2012), de

forma análoga a ensaios de degradação resíduos de petróleo em microcosmos, apresentando

valores mais elevados no primeiro mês e decaimento nos demais monitoramentos realizados

dentro do período um ano, com exceção para condições com concentrações de poluentes

extremamente superiores a 5% em massa (DEL PANNO et al., 2005). Em estudo semelhante,

porém visando a degradação resíduos industriais, foi observado crescimento constante da DHA

nos microcosmos com ápice após 8 semanas da aplicação do consórcio e subsequente queda,

revelando que a resposta destas enzimas pode ser influenciada pela natureza química dos

poluentes (APARNA et al., 2010)

Na tentativa de avaliar todas os possíveis interferentes na contribuição na determinação

da DHA total se avaliou essa atividade em: i) Microcosmo de sedimento não esterilizado com

adição de esferas de quitosana sem bactérias – para avaliar a metabolização da quitosana pela

microbiota autóctone (C1); ii) Microcosmos de sedimento não esterilizado enriquecidos apenas

de n-hexadecano (10 mg/g) – visando avaliar a capacidade da microbiota autóctone de

metabolizar o n-hexadecano (C2); iii) Microcosmos de sedimento não esterilizado sem adição


de nenhuma fonte de carbono (SED) – para avaliar a DHA basal do sedimento (Figura 16).

Figura 16 - Resultados de DHA das condições controle dos microcosmos

C1

0 3 6 9 12 18 240

50

100

150

200

250

a

b

cac ac ac ac

Tempo em dias

DH

A e

m µ

gT

PF

.g-¹

C2

0 3 6 9 12 18 240

50

100

150

200

250

a

b

a aa a a

Tempo em dias

DH

A e

m µ

gT

PF

.g-¹

SED

0 3 6 9 12 18 240

50

100

150

200

250

abab ab

abab ab

Tempo em dias

DH

A e

m µ

gT

PF

.g-¹

0 3 6 9 12 18 240

50

100

150

200

250C1

C2

SED

Tempo em dias

DH

A e

m µ

gT

PF

.g-¹

C1 = Sedimento Natural enriquecido com esferas de quitosana estéreis; C2 = Sedimento Natural enriquecido com

hexadecano (10mg/g ) ; SED = Sedimento Natural sem nenhum enriquecimento. Fonte: Autor, 2015.

Os resultados mostram claramente que a atividade basal do sedimento (SED) é muito

baixa e esse resultado foi essencial para corroborar todos os resultados obtidos até aqui com os

consórcios. Depois se observou sim uma atividade enzimática com a adição da quitosana,

provando que a microbiota autóctone é capaz de metabolizar esse polímero e isso é muito

interessante, já que é importante que as esferas sejam biodegradadas no ambiente natural. A

atividade no controle C2 provou que a microbiota nativa tem uma baixa capacidade para

metabolizar o n-hexadecano, provando o valor da bioaumentação com estirpes selecionadas.

O monitoramento das bactérias do consórcio por contagem de células viáveis revelou o

crescimento e permanência das duas populações HEXBA05 e HEXBA06 ao longo dos 30 dias

do experimento, distinguíveis pelas características típicas de suas colônias (Figura 17 A). Com


relação a carga microbiana total, as condições se agruparam primariamente de acordo com o

tratamento do sedimento, se esterilizado ou não esterilizado. Na condição esterilizada, o

consórcio CHB56 cresce livremente, sem os efeitos moduladores da microbiota nativa (Figura

17B – CLSE e CISE). Nas condições de sedimento não esterilizado, o crescimento do consórcio

é modulado pelas interações com a comunidade bacteriana autóctone (Figura 17B – CLSN e

CISN). Em (Angelim et al., 2013), é demonstrado por técnicas moleculares os efeitos do

bioestímulo causado pela adição de quitosana em microcosmos de mangue.

Figura 17 - Contagem de viáveis das 4 diferentes condições dos microcosmos

A) Diversidade microbiana recuperada a partir do microcosmo de sedimento de manguezal não esterilizado inoculado com o consórcio de bactérias CHB56 no 12o dia; B) Contagens de bactérias viáveis totais (UFC/g) nos microcosmo de sedimento inoculados com o consórcio CHB56. CLSE = Consórcio Livre, Sedimento Esterilizado; CISE = Consórcio Imobilizado, Sedimento Esterilizado; CLSN = Consórcio Livre, Sediemento; CISN = Consórcio Imobilizado, Sedimento Natural. Fonte: Autor, 2015.

A degradação das esferas de quitosana foi acompanhada visualmente, comparando-se

as condições em que foi empregado sedimento esterilizado e não esterilizado. Para observação,

os microcosmos foram sacrificados e vertidos em placas e lavados com água destilada para

detecção das esferas ou seus resíduos. Nos microcosmos preparados com sedimento não

esterilizado e inoculado com o consórcio CHB56 percebeu-se um progressivo desgaste das

esferas, com visível diminuição do tamanho e ruptura até o 9o dia. No 12o dia as esferas tinham

sido completamente degradadas. Como mencionado anteriormente, as estirpes de bactérias

aprisionadas nas esferas não produzem quitosanase, portanto, a degradação das esferas nesse

caso pode ser atribuída à microbiota nativa. Nos microcosmos preparados com sedimento

esterilizado e inoculado com o consórcio CHB56 foi notado um pequeno desgaste das esferas


(desgaste mecânico), mas elas permanecem integras e facilmente reconhecidas aos 30 dias de

monitoramento, como mostrado na Figura 18.

Figura 18 - Acompanhamento da degradação das esferas de quitosana

A e C) Aspecto do sedimento esterilizado inoculado com esferas de quitosana contendo o consórcio CHB56 no

12o. dia do experimento; e visualização das esferas integras após lavagem do sedimento esterilizado com água

destilada; B) Sedimento de manguezal não esterilizado após 12 dias da inoculação com as esferas de quitosana

contendo o consórcio CHB56 mostrando que as esferas foram completamente biodegradadas; D) Visualização de

esferas integras de quitosana em sedimento de manguezal esterilizado após 30 dias.

5.3. Análise das esferas de quitosana

A carga de bactérias aprisionadas nas esferas de quitosana foi estimada através de

contagens de células viáveis, tendo sido registrado 106 UFC/g de esfera, para esferas de 1 mm

de diâmetro em média.

A análise das esferas por microscopia eletrônica de varredura (MEV) revelou detalhes

interessantes do interior e da superfície da esfera. Para a análise no MEV as esferas foram

congeladas em nitrogênio e liofilizadas. Esse tratamento preservou a porosidade das esferas, já


que há relatos que métodos lentos de congelamento e secagem podem gerar deformidades,

artefatos, além do colapso dos espaços internos das esferas, trazendo obstáculos aos transportes

de massa. Para análise, as esferas foram cortadas transversalmente o que permitiu visualizar

seu interior poroso, de aspecto esponjoso. A porosidade torna-se evidente na varredura da

superfície da esfera, sendo possível observar a regularidade do tamanho dos poros, que variaram

de 3 à 5 µm (Figura 19). Essa porosidade é essencial para o transporte de massa entre o meio

externo e interno, onde encontra-se a microbiota imobilizada. Infelizmente, não foi possível

capturar nas preparações analisadas uma imagem do consórcio no interior da esfera. A natureza

esponjosa da esfera dificultou essa observação, embora a confirmação das células aprisionadas

tenha sido feita através de contagens de células viáveis.

Figura 19 - Aspecto das esferas de quitosana analisadas por Microscopia Eletrônica de varredura (MEV).

A) Aspecto da superfície esfera íntegra; B) Esfera em corte transversal; C) Detalhe do corte transversal com

aumento de 1500x; D) Detalhe do corte transversal com aumento de 7500x. Fonte: Autor, 2014.


6. CONCLUSÕES

Os resultados desse estudo mostraram que o consórcio CHB56 imobilizado em esferas

de quitosana foi mais eficaz em degradar n-hexadecano em sedimentos de manguezal

contaminado com esse poluente do que o consórcio livre, podendo se transformar numa nova

opção de tecnologia de bioaumentação, com as vantagens de fácil manejo, armazenamento,

transporte e aplicação.


7. REFERÊNCIAS

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