biologia molecular na genÉtica forense ou apesar do dna, as probabilidades de sempre

BIOLOGIA MOLECULARBIOLOGIA MOLECULAR

NA GENÉTICA FORENSENA GENÉTICA FORENSE

ouou

Apesar do DNA, as Apesar do DNA, as Probabilidades de Probabilidades de

Sempre...Sempre...

MAIO 2004 O DNA e a LEI 2

REPETIÇÃO REPETIÇÃO IN TANDENIN TANDEN

3’-CGTAAATCTAGGTGTCGTCTACTAAAG-5’3’-CGTAAATCTAGGTGTCGTCTACTAAAG-5’ 5’-GCATTTAGATCCA5’-GCATTTAGATCCACAGCAGCAGCAGATGATTTC-3’ATGATTTC-3’

5’-GCATTTAGATCCA5’-GCATTTAGATCCACAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGATGTTTC-3’ATGTTTC-3’3’-CGTAAATCTAGGTGTCGTCGTCGTCGTCTACAAAG-53’-CGTAAATCTAGGTGTCGTCGTCGTCGTCTACAAAG-5’’


5' 3'

DNA dupla fita

Região alvo

primers DNTPs Taq DNA pol.

A TÉCNICA DE PCR - CICLO IA TÉCNICA DE PCR - CICLO I

•Desnaturação das fitas de

DNA

• Pareamento dos primers

•Alongamento das novas fitas


5' 3'

Região alvo

•Desnaturação das fitas de

DNA

• Pareamento dos primers

•Alongamento das novas fitas

A TÉCNICA DE PCR - CICLO IIA TÉCNICA DE PCR - CICLO II


22CAGATACCGCTCGCGCTCAGATACCGCTCGCGCTCGACGACGACGACACAGCCATCACAGCCAT44CAGATACCGCTCGCGCTCAGATACCGCTCGCGCTCGACGACGACGACGACGACGACGACACAGCCATCACAGCCAT55CAGATACCGCTCGCGCTCAGATACCGCTCGCGCTCGACGACGACGACGACGACGACGACGACGACACAGCCATCACAGCCAT66CAGATACCGCTCGCGCTCAGATACCGCTCGCGCTCGACGACGACGACGACGACGACGACGACGACGACGACACAGCCATCACAGCCAT

2/6 5/6 4/6 2/4

STRS = SHORT TANDEM REPEATS


ELEMENTOSELEMENTOSBÁSICOSBÁSICOS

MICRO-SATÉLITES

(STRs)



MICRO-SATÉLITES

(STRs)


Nova aparênciaNova aparência


inclusão exclusãoinclusão exclusão


1/23/4

2/3

1/24/5

2/3

LOCUSGENE

ALELOAlelo paterno

obrigatório


PVPVPROBABILIDADE DOPROBABILIDADE DO

TRIO SER VERDADEIROTRIO SER VERDADEIRO

PVPV = = P(M 1/2) • P(P 3/4) • P(F 2/3P(M 1/2) • P(P 3/4) • P(F 2/3||M 1/2, P 3/4)M 1/2, P 3/4)

PVPV = = PP((MM) • ) • PP((PP) • ) • PP((F | M,PF | M,P))

1/23/4

2/3

probabilidade de se encontrar um trio com os fenótipos observados e que o suposto pai é o pai biológico


PFPFPROBABILIDADE DO TRIO SER PROBABILIDADE DO TRIO SER

FALSOFALSO

PFPF == P(M 1/2) • P(P 3/4) • P(F 2/3|M 1/2, P P(M 1/2) • P(P 3/4) • P(F 2/3|M 1/2, P ))

PFPF = = PP((MM) • ) • PP((PP) • ) • PP((F | MF | M))

probabilidade de se encontrar um trio compatível, com os fenótipos observados e que o suposto pai não é o pai biológico.

1/23/4

2/3


IPIPÍNDICE DE ÍNDICE DE

PATERNIDADEPATERNIDADE

PVIP = PF

IP = P(M) • P(P) • P(F | M,P)

P(M) • P(P) • P(F | M)

Simplificando, IP se baseia em Simplificando, IP se baseia em apenas duas probabilidades:apenas duas probabilidades: (a) de que o casal M e P (a) de que o casal M e P

produza o filhoproduza o filho (b) de que a M tenha o filho(b) de que a M tenha o filho

= P(F | M,P)

P(F | M)


CÁLCULO CÁLCULO DO IPDO IP

PP((F | MF | M) = 0,5 p) = 0,5 p33

• PP((F | M,PF | M,P) = 0,25) = 0,251/2 3/4

1/4 2/31/3 2/4

1/2

2/

1/

Neste caso:

IP = 0,25 / 0,5 p3

IP = 0,5 / p3


CÁLCULO DO ÍNDICECÁLCULO DO ÍNDICEREGRA SIMPLESREGRA SIMPLES

Mãe Mãe FilhoFilho APOAPO 1/11/1 1/#1/# #/##/# ∆∆

1/11/1 1/11/1 11 11 ½ ½ ØØ pp11

1/#1/# ## ØØ ½½ 11 pp11

1/21/2 1/1 1/1 11 11 ½½ ØØ ½ p½ p11

1/21/2 1,21,2

1/# 1/# ou ou 2/#2/#

##


Freqüência alélicaFreqüência alélicaee

valores do índicevalores do índice

0,1 0,1

0,1

0,4

0,8

5

1,25

0,625

freqüência índice

Quanto mais raroo alelo, maior o

índice de paternidade


LAUDOLAUDOEXCLUSÃOEXCLUSÃO

LOCUS MÃE FIL PAI ÍNDICE CD4 2/6 6/8 2/2 (*) CSF1PO 5/5 4/5 6/6 (*) D16S539 1/1 0/1 1/5 (*) D5S818 2/3 2/5 2/5 2.995 D7S820 2/3 3/3 0/1 (*) FXIIIA 5/10 5/5 3/13 (*) FXIIIB 1/4 1/4 5/5 (*) FES/FPS 1/2 1/2 1/3 0.782 PLA2A1 4/5 3/5 2/2 (*) THO1 2/2 2/2 4/4 (*) HUMTPOX 3/7 1/3 4/6 (*) VWA 6/8 0/6 4/8 (*) DXS8084 7/8 2/7 5/5 (*)


LAUDOLAUDOINCLUSÃOINCLUSÃO

LOCUS MÃE FIL PAI INDICE CD4 1/2 2/8 8/11 17.67 CSF1PO 3/5 3/5 4/5 0.95 D16S539 1/3 1/2 2/3 5.21 D5S818 5/6 3/5 3/5 1.52 D7S820 3/4 4/4 3/4 1.98 FXIIIA 3/5 4/5 4/4 4.29 FXIIIB 1/5 1/5 1/5 2.10 FES/FPS 0/2 0/3 2/3 1.91 PLA2A1 2/4 2/6 5/6 2.91 THO1 3/5 3/4 2/4 2.67 TPOX 3/6 3/6 4/6 0.64 VWA 7/7 7/8 5/8 3.17 ÍNDICE TOTAL 3364457.63 PROBABILIDADE TOTAL 99.999971%


100100 10001000 10.00010.000 100.000100.000 1.000.0001.000.000 10.000.00010.000.000

0,990,99 0,9990,999

0,99990,9999 0,999990,99999

0,9999990,999999 0,99999990,9999999

ÍNDICE e PROBABILIDADEÍNDICE e PROBABILIDADE

99 %99 % 99,9 %99,9 % 99,99 %99,99 % 99,999 %99,999 % 99,9999 %99,9999 % 9999999 %9999999 %

ÍNDICE PROB

IP

IP+1PP =


CRITÉRIOS PARA CRITÉRIOS PARA INCLUSÃOINCLUSÃO

Probabilidade mínima 99,99%

IP > 10.000

Descontar o maior IP

Não há número mínimo de exames

Loci geneticamente não ligados


1/80001/8000

1/30001/3000

1/24 000 0001/24 000 000

ÍNDICES PARA EVIDÊNCIASÍNDICES PARA EVIDÊNCIAS NÃO GENÉTICAS NÃO GENÉTICAS

VASECTOMIAVASECTOMIA

OUTRAS EVIDÊNCIASOUTRAS EVIDÊNCIAS

TOTALTOTAL


1000010000

1/240000001/24000000

1/24001/2400

2400000024000000

1000010000

ÍNDICEÍNDICECOMPOSTOCOMPOSTO

Observe-se que a ordem dos fatores não altera o produto !

EXAMES LABORATÓRIO 1EXAMES LABORATÓRIO 1


ÍNDICE COMPOSTO 1ÍNDICE COMPOSTO 1

EXAMES LABORATÓRIO 2EXAMES LABORATÓRIO 2

ÍNDICE FINALÍNDICE FINAL


CONCLUSÕES.1CONCLUSÕES.1

Qualquer Qualquer evidência não evidência não

genéticagenética

Índice finalÍndice final

Limite Limite mínimomínimo::

•quantificada na forma de índice. Produto dos índices individuais.

Probabilidade de 99,99%

Índice: 10.000

•para qualquer índice das evidências não genéticas,sempre haverá um conjunto de exames de dna tal que seu índice neutralizará qualquer índice atribuído às outras evidências.


CONCLUSÕES.2CONCLUSÕES.2

Se se aceita a idéia de que todas as Se se aceita a idéia de que todas as

evidências não genéticas sejam evidências não genéticas sejam quantificáveis quantificáveis numericamente, e numericamente, e

acreditamos que sejam, para qualquer acreditamos que sejam, para qualquer investigação de paternidade pode ser investigação de paternidade pode ser

obtida obtida resposta definitiva exclusivamente resposta definitiva exclusivamente

pelo DNApelo DNA..

IMPLICAÇÕESIMPLICAÇÕESEE

COMENTÁRIOS COMENTÁRIOS


1/80001/8000

1/30001/3000

1/24 000 0001/24 000 000

ÍNDICES PARA EVIDÊNCIASÍNDICES PARA EVIDÊNCIAS NÃO GENÉTICAS NÃO GENÉTICAS

VASECTOMIAVASECTOMIA


TOTALTOTAL


DESAFIOS ÉTICOSDESAFIOS ÉTICOS

Denúncia maternaDenúncia maternaoitiva de testemunhasoitiva de testemunhas

material hospitalarmaterial hospitalar(sobras de necrópsia, (sobras de necrópsia,

exames, etc)exames, etc)Amostras de exames anterioresAmostras de exames anteriores

A recusa de se submeter aos A recusa de se submeter aos examesexames

Suficiente?Suficiente? Desnecessária?!Desnecessária?! pertencem à família?pertencem à família?

O Juiz pode O Juiz pode determinar seu uso? determinar seu uso? Podem ser usadas à Podem ser usadas à revelia da família?revelia da família?

Prova de ‘culpa’ do Prova de ‘culpa’ do acusado.acusado.


FONTES DE DNA FONTES DE DNA e alguns e alguns

problemasproblemas

Sangue periférico

Esfregaço celulas

mucosa oral

Líquido Seminal

Ossos

Fios de cabelo

GRANDE PROBLEMA:Troca de amostras

Transfusão NÃO afeta exame

ESTOCAGEM:Glicerol ou em Papel assinado

ÉTICA:Autorizações Materna e Paterna


PERÍCIA INDIRETA - INFERÊNCIA DE UM PERÍCIA INDIRETA - INFERÊNCIA DE UM GENÓTIPO PELO EXAME DE GENÓTIPO PELO EXAME DE

FAMILIARESFAMILIARES

1 / 2

2 / 3

1 / 2 2 / 4

1/21/42/22/4

Se 3 no lugar de 4 e p(3)=0,1

IP = 0,5 x 0,5 / 0,1 = 2.5


QUESTÕES FREQÜENTESQUESTÕES FREQÜENTES

Exumação Exumação vsvs Exame dos familiares Exame dos familiares Exumação:Exumação:

Material degradado (fragmentos muito pequenos);Material degradado (fragmentos muito pequenos); Pequena quantidade;Pequena quantidade; Contaminação por DNA estranho (principalmente de Contaminação por DNA estranho (principalmente de

fungos, bactérias e larvas de insetos, mas também dos fungos, bactérias e larvas de insetos, mas também dos colhedores das amostras).colhedores das amostras).

Exame dos Familiares:Exame dos Familiares: Número de locos + número de familiares – Quanto mais, Número de locos + número de familiares – Quanto mais,

melhor.melhor.

Identificação Humana – O DNA Identificação Humana – O DNA mitocondrialmitocondrial


OUTRAS QUESTÕES OUTRAS QUESTÕES FREQÜENTESFREQÜENTES

Freqüências alélicas brasileiras Freqüências alélicas brasileiras EXISTEMEXISTEM Os exames clássicos:Os exames clássicos:

O que não exclui, O que não exclui, incluiinclui ! ! Eram razoavelmente poderososEram razoavelmente poderosos Nem todos devem ser revistos – só baixas Nem todos devem ser revistos – só baixas

probabilidades probabilidades de exclusãode exclusão

Probabilidade Probabilidade a priori – a priori – 50%50% A Probabilidade de Paternidade A Probabilidade de Paternidade nãonão é uma é uma

probabilidade...probabilidade...


TIPOS DE EXAMETIPOS DE EXAMELABORATORIALLABORATORIAL

Sondas Multilocais

unilocais

STRs por PCR

Alto custo. Grande quantidade deDNA. Treinamento; falta de repetiblidade. Não permitemcálculo preciso. Subjetiva !

Alto custo. Grande Quantidade de DNA. Excesso de alelos impede classificação precisa.

Procedimento de escolha.


MICROSSATÉLITESMICROSSATÉLITESDETECTADOSDETECTADOS

POR PCRPOR PCRTAXA DE

MUTAÇÃO

SUPRESSÃO ALÉLICA

REFERENCIAL NOMENCLATURA

Soluções:TRÊS EXCLUSÕES

EXCLUSÕES DIRETAS

AMOSTRAS CLONADAS e SEQÜENCIADAS

NOMENCLATURA - falso problema

biologia molecular na genÉtica forense ou apesar do dna, as probabilidades de sempre

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