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Fundação Oswaldo Cruz Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães Departamento de Saúde Coletiva

Mestrado em Saúde Pública

Avaliação da técnica Nested-PCRTbU para aplicação no diagnóstico da peste

Recife, 2005

Gerlane Tavares de Souza


Avaliação da técnica Nested-PCRTbU para aplicação no

diagnóstico da peste

Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado em

Saúde Pública do Centro de Pesquisas Aggeu

Magalhães da Fundação Oswaldo Cruz, para

obtenção do Título de Mestre em Saúde Pública,

Área de Controle de Endemias e Métodos de

Diagnóstico de Doenças Infecciosas e Parasitárias.

Orientadora: Profa. Dra. Alzira Maria Paiva de Almeida

Co-Orientadora: Profa. Dra. Nilma Cintra Leal

Recife 2005

Avaliação da técnica Nested-PCRTbU para aplicação no

diagnóstico da peste


Comissão Examinadora

_________________________________________ Dra. Alzira Maria Paiva de Almeida CPqAM/FIOCRUZ (Orientadora)

_________________________________________ Dra. Nilma Cintra Leal

CPqAM/FIOCRUZ (Co-Orientadora)

_________________________________________ Dra. Tereza Cristina Leal Balbino

CPqAM/FIOCRUZ (Membro Interno Titular)

_________________________________________ Dr. Luiz Bezerra de Carvalho Junior

UFPE/LIKA (Membro Externo Titular)

_________________________________________ Dr. Frederico Guilherme Coutinho Abath

CPqAM/FIOCRUZ (Membro Interno Suplente)

_________________________________________ Dra. Marise Sobreira Bezerra da Silva

UPE (Membro Externo Suplente)

Recife, 2005.

Aos meus pais, Clenilson e Cleide, pelo incentivo, compreensão,

orgulho e amor. Agradeço sempre a Deus por tê-los ao meu lado.

Dedico

Agradecimentos

Dra Alzira, obrigada pela confiança e dedicação concedidas a mim desde a Faculdade. Espero

que essa parceria perdure por muito mais tempo. Meus sinceros agradecimentos e admiração.

Dra Nilma, agradeço por toda dedicação e atenção em todos os momentos. Sua ajuda e

orientações foram essenciais na realização deste trabalho.

Agradeço a todos os técnicos e estagiários do Laboratório de Microbiologia pela amizade e

por todos os momentos e experiências compartilhados nesses dois anos.

Isaac Martins, muito obrigada por todo apoio técnico e pela amizade ao longo desses dois

anos.

Agradeço a Dra Tereza Cristina, Dr. Luiz Bezerra de Carvalho, Dra Marise Sobreira e Dr.

Frederico Abath por aceitarem participar desta banca examinadora.

Dr Celso Tavares, muito obrigada pela contribuição na revisão dessa dissertação. “a poesia

deve fazer parte da vida”, “o novo sempre vem...”.

Muito obrigada ao serviço de informática, principalmente a Carlos Augusto e Gilvan Mariano

por toda atenção e ajuda técnica.

Agradeço as amigas Carol e Claudia que não compartilham mais o mesmo laboratório, mas

sempre estão presentes na minha vida.

Agradeço aos amigos do mestrado: Alda, André, Dani, Gisele, Kamila, Luciana, Maristela

Naíde, Rita, Rosy, e Veruska por todos os momentos de dúvidas, angustias, conquistas e

alegrias que passamos juntos. Até mesmo os momentos mais difíceis foram importantes para

nosso longo processo de maturidade científica. Não esqueçam, nosso contrato está assinado!

Marcus Vinícius, muito obrigada pelo amor, carinho, compreensão e amizade nesses nove

anos de convivência. Seu incentivo sempre foi e será muito importante.

Obrigada ao Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães e aos Departamentos de Saúde Coletiva e

Microbiologia pelo suporte técnico e científico.

Agradeço a CAPES, pelo suporte financeiro.

Resumo

O diagnóstico de certeza da peste baseia-se na identificação e isolamento da Y. pestis pelo

cultivo de material de pacientes humanos, de roedores e suas pulgas. No Brasil, os casos

humanos e as epizootias de peste ocorrem em locais distantes dos centros de diagnóstico. A

competição com a flora cadavérica das carcaças de roedores e procedimentos inadequados de

conservação e transporte das amostras aos laboratórios pode resultar na morte do bacilo e

resultados falso-negativos. As técnicas moleculares apresentam-se como alternativas para

estas situações, particularmente técnicas baseadas em PCR. No presente trabalho foi

otimizada para o diagnóstico da peste a técnica N-PCRTbU que se baseia na separação física

dos primers por imobilização dos primers internos na tampa do microtubo, dispensando a

abertura do mesmo entre as duas etapas de amplificação, o que reduz a possibilidade de falso-

positivos pela contaminação cruzada durante a manipulação dos amplicons no Nested-PCR

convencional. Dois pares de primers, dirigidos ao gene estrutural (caf1) do antígeno F1 de Y.

pestis (um par com homologia a uma região mais externa ao alvo e outro com homologia a

uma região mais interna), foram inicialmente testados individualmente por PCR e depois por

N-PCR tendo sido obtidos segmentos de tamanho esperado. Foram estabelecidas as

concentrações de Taq DNA polimerase, dNTPs e MgCl2, bem como a proporção entre os

primers externos e internos para o N-PCRTbU. Nos ensaios para estabelecimento do limiar de

detecção a partir de DNA total e da cultura da cepa Y. pestis P. PB 881 a N-PCRTbU foi

capaz de detectar respectivamente 10 pg de DNA e 20 bactérias viáveis. Baços de

camundongos “Swiss Webster” infectados experimentalmente com a cepa Y. pestis P. PB 881

e amostras de baço, fígado, pulmão e coração conservadas no meio de Cary-Blair por 11

meses foram analisadas em paralelo por cultivo em gelose peptonada e pela técnica N-

PCRTbU. O fragmento de tamanho esperado (460pb) foi amplificado em todas as amostras

mesmo nas que se revelaram multicontaminadas ou negativas pela cultura. Nos ensaios com

DNA de outras espécies do gênero Yersinia: Y. pseudotuberculosis e Y. enterocolitica e com

baços de camundongos não infectados com a Y. pestis não houve amplificação. Além da

especificidade e sensibilidade, como os resultados podem ser obtidos rapidamente, em menos

de 24 horas, a N-PCRTbU poderá ser mais uma opção em situações emergenciais nas quais a

rapidez no diagnóstico é fundamental para adoção de medidas imediatas de controle.

Abstract

Plague diagnosis is based on the identification and isolation of the plague bacilli, Y. pestis, by

culture of human, rodents and flea samples. In Brazil, human cases and plague epizootics

generally occur in areas far from the diagnosis centers. The competition with the cadaveric

flora in carcasses of rodents and inadequate shipment procedures of the samples to the

diagnosis laboratories can result in the death of the bacillus and false-negative results.

Molecular techniques, particularly PCR-based techniques, can circumvent these situations. In

the N-PCRTbU technique the immobilization of the inner primer onto the inside of the

microtubes cap, makes unnecessary opening the tubes between the two steps of amplification.

This procedure reduces the possibility of false-positives by cross-contamination during the

manipulation of the amplicons. In the present work, two pairs of primers, directed to the

structural gene (caf1) of the Y. pestis F1 antigen (a pair with homology to an outer region of

the gene and another one with homology to an inner region), were initially tested by PCR and

later by N-PCR. DNA fragments of the expected sizes were obtained with both primers. Taq

DNA Polymerase, dNTPs and MgCl2 concentrations as well as the ratio between outer and

inner primers for the N-PCRTbU reaction had been established. The detection capacity of N-

PCRTbU was found to be 20 UFC and 10pg of DNA, for N-PCR was six UFC and 1pg DNA.

PCR shown less sensitive and was unable to detect less than 100pg DNA and 200 UFC from

the strain Y. pestis P. PB 881. In the spleens of experimentally infected mice freshly analyzed,

and in samples of spleen, liver, lung and heart from infected mice preserved in Cary-Blair

medium for 11 months, analyzed in parallel by culture and by the N-PCRTbU technique, the

segment of expected size (460bp) was amplified in all the samples, even in the multi-

contaminated ones. In the assays with DNA of other species of Yersiniae: Y. enterocolitica

and Y. pseudotuberculosis, and with spleens from non-infected mice there was no

amplification. Besides its sensitivity and specificity the results of N-PCRTbU can be obtained

quickly, in less 24-hour, so this technique could be a good alternative, mainly in emergency

situations in which the rapidity of the diagnosis is critical for the prompt adoption of control

measures.

Lista de figuras e tabelas

Figura 1 Esquema representativo do N-PCRTbU 22

Figura 2 Produtos da N-PCRTbU com DNA da cepa Y pestis P. PB 881 e diferentes concentrações dos primers dirigidos a uma região da extremidade do gene caf1 (E) e a uma região mais interna (I)

34

Figura 3 Produtos da PCR (primers externos) com diferentes quantidades de DNA da cepa Y. pestis P. PB 881

35

Figura 4 Produtos da N-PCR com diferentes quantidades de DNA da cepa Y. pestis P. PB 881

36

Figura 5 Produtos da N-PCRTbU com diferentes quantidades de DNA da cepa Y. pestis P. PB 881

37

Tabela 1 Número de bactérias viáveis (unidades formadoras de colônias) da cepa Y. pestis P. PB 881 detectadas por PCR, N-PCR e N-PCRTbU

38

Tabela 2 Resultados das análises em vísceras de camundongos infectados com a cepa Y. pestis P. PB 881, após 11 meses de conservação no meio de Cary-Blair

40

Tabela 3 Resultados das análises realizadas a fresco em baços de camundongos infectados com a cepa Y. pestis P. PB 881

41

Lista de abreviaturas BAB Blood Agar Base

BHI Brain Heart Infusion Broth

CPqAM Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães

DNA Ácido Desoxirribonucléico

DNERu Departamento Nacional de Endemias Rurais

dNTP’s Desoxiribonucleotídeos trifosfato

FIOCRUZ Fundação Oswaldo Cruz

FUNASA Fundação Nacional de Saúde

HA Hemaglutinação

ID Imunofluorescência Direta

Kb kilobase

M-PCR Multiplex-PCR

N-PCR Nested-PCR

N-PCRTbU Nested-PCR em tubo único

OMS/WHO Organização Mundial de Saúde/ World Health Organization

OPAS Organização Panamericana de Saúde

pb Pares de bases

PCR Polymerase Chain Reaction (Reação em Cadeia da Polimerase)

RPM Rotações por minuto

SNP Serviço Nacional de Peste

SRP Serviço de Referência em Peste

SUCAM Superintendência de Campanhas de Saúde Pública

SVS Secretaria de Vigilância em Saúde

TBE Tris-borato; ácido bórico; EDTA

UV Ultravioleta

UFC Unidade Formadora de Colônia

Sumário

Dedicatória

Agradecimentos

Resumo

Abstract

Lista de figuras e tabelas

Lista de abreviaturas

Introdução................................................................................................................... 11

Histórico da peste........................................................................................................ 11

Vigilância e controle da peste no Brasil..................................................................... 13

A Yersinia pestis......................................................................................................... 13

Características genéticas............................................................................................ 14

Características clínico-epidemiológicas da peste........................................................ 15

Ciclo epidemiológico.................................................................................................. 15

Formas clínicas e tratamento....................................................................................... 16

Métodos de diagnóstico.............................................................................................. 17

Clínico-epidemiológico............................................................................................... 17

Diagnóstico bacteriológico......................................................................................... 18

Exame direto por coloração pelo azul de metileno..................................................... 18

Imunofluorescência direta........................................................................................... 18

Cultura......................................................................................................................... 18

Teste rápido para pesquisa de F1 (fita reagente)......................................................... 19

Inoculação em camundongos...................................................................................... 19

Diagnóstico sorológico............................................................................................... 19

Diagnóstico molecular............................................................................................... 20

PCR............................................................................................................................. 20

Multiplex-PCR (M-PCR) ........................................................................................... 20

Nested-PCR (N-PCR)................................................................................................. 21

Nested-PCR em tubo único (N-PCRTbU).................................................................. 21

Justificativas................................................................................................................ 23

Pergunta condutora..................................................................................................... 24

Objetivos..................................................................................................................... 25

Geral............................................................................................................................ 25

Específicos.................................................................................................................. 25

Procedimentos metodológicos.................................................................................. 26

Desenho de estudo...................................................................................................... 26

Bactérias e condições de cultivo................................................................................. 26

Teste com bacteriófago............................................................................................... 26

Extração DNA plasmidial........................................................................................... 27

Extração DNA genômico............................................................................................ 27

Avaliação do limiar de detecção do PCR, N-PCR, e N-PCRTbU a partir do DNA total..............................................................................................................................

28

Avaliação do Limiar de detecção do PCR, N-PCR, e N-PCRTbU a partir da cultura..........................................................................................................................

28

Procedimentos com animais........................................................................................ 29

Ensaios a fresco com baços de camundongos............................................................. 29

Ensaios com amostras conservadas em meio de transporte........................................ 29

Primers........................................................................................................................ 30

Avaliação do período de atividade dos primers pré-fixados na tampa do tubo..............................................................................................................................

30

PCR e N-PCR.............................................................................................................. 30

N-PCRTbU.................................................................................................................. 31

Avaliação da especificidade da N-PCRTbU............................................................... 32

Resultados................................................................................................................... 33

Avaliação dos primers por PCR e N-PCR.................................................................. 33

Estabelecimento da proporção entre primers internos e externos no N-PCRTbU.....................................................................................................................

33

Limiar de detecção a partir do DNA total e das suspensões bacterianas...................................................................................................................

33

Teste de especificidade do N-PCRTbU...................................................................... 33

Análise das amostras de vísceras conservadas em Cary-Blair.................................... 39

Análise realizada a fresco em baços de camundongos infectados com a cepa Y. pestis P. PB 881..........................................................................................................

39

Avaliação do período de atividade dos primers pré-fixados na tampa do tubo..............................................................................................................................

39

Discussão.................................................................................................................... 42

Referências bibliográficas........................................................................................... 45

Anexos......................................................................................................................... 51

Artigo.......................................................................................................................... 52

Introdução

Souza, G.T. Avaliação da Técnica Nested-PCR em tubo único para ... 11

Introdução

A peste é uma doença bacteriana de grande magnitude e transcendência na história da

humanidade, cujas características clínicas e epidemiológicas passaram a ser melhor

conhecidas a partir de 1894, durante a pandemia contemporânea. Merecem especial destaque

o isolamento do agente etiológico, Yersinia pestis, por Alexander Yersin em 1894, e a

descoberta do papel da pulga na transmissão da doença por Louis Simond, em 1898

(POLLITZER, 1954), o que possibilitou o desenvolvimento de procedimentos preventivos,

diagnósticos e terapêuticos.

A peste está incluída na classe I do Regulamento Sanitário Internacional (RSI)

vigente, que exige notificação compulsória e vigilância permanente nos focos e nos locais por

onde a infecção possa ser introduzida a partir de países ou continentes com história de peste

(WHO, 1999). O cumprimento do RSI exige que medidas de controle sejam adotadas

imediatamente na vigência de manifestações suspeitas de peste, visando evitar ou minimizar a

repercussão da doença. Para que isto ocorra, a disponibilidade de métodos diagnósticos

rápidos e eficientes é essencial.

Um diagnóstico rápido e preciso é produto de uma série de procedimentos que, em

situações críticas, nem sempre corresponde aos padrões especificados, o que pode repercutir

negativamente no controle da doença. No Brasil, as epizootias e os casos humanos ocorrem

em locais distantes dos centros de diagnóstico e os procedimentos de conservação e transporte

das amostras coletadas para exame podem causar morte dos bacilos da peste e inviabilizar o

diagnóstico pelos métodos tradicionais de cultivo e isolamento da bactéria. O Serviço de

Referência em Peste (SRP) do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães (CPqAM-FIOCRUZ)

vem otimizando e avaliando métodos de diagnósticos moleculares para utilização na rotina de

diagnóstico e, principalmente, em situações emergenciais.

Histórico da peste

Conceitos mais antigos admitiam que a peste teria surgido como doença entre os

primeiros mamíferos placentários no Planalto Central Asiático, considerado o “berço da

peste” (PERRY;FETERSTON, 1997; POLITZER, 1954). Alguns relatos sobre pestilências no

antigo testamento da Bíblia podem ser um indício da ocorrência da peste na era pré-cristã. No

entanto, estudos recentes de Achtman et al.(1999) sugerem que a Y. pestis seria um clone que


divergiu da Y. pseudotuberculosis a cerca de 1.500-20.000 anos, um pouco antes da primeira

pandemia de peste, pela aquisição de fatores de virulência que contribuíram para adaptação da

Y. pestis a novos hospedeiros, formas de transmissão e patogenia diferentes da Y.

pseudotuberculosis.

Na era cristã, em 542 d.C, a peste tomou grandes proporções resultando na primeira

pandemia ou “Peste de Justiniano”, que se iniciou no Egito e se expandiu ao longo de 60 anos

pela Ásia, África e Europa com alta letalidade. A segunda pandemia ou “Peste negra” teve

início no século XIV na Ásia e se prolongou até o século XVI se alastrando por toda a Europa

(levando ao óbito aproximadamente 25 milhões de pessoas), e norte da África. A terceira

pandemia ou pandemia contemporânea teve seu início na China em 1855, atingiu Hong Kong

em 1894 e de lá se irradiou para os Estados Unidos, América do Sul, África do Sul e

Madagascar, através do transporte marítimo (POLLITZER, 1954).

Segundo Mollaret (1989), a terceira pandemia parou de se expandir durante a II guerra

mundial quando os antigos navios foram afundados e substituídos por modernos navios à

prova de ratos. Porém, esta pandemia deixou vários focos endêmicos em muitos países do

mundo.

A bactéria foi introduzida no Brasil em 1899 pelo porto de Santos no Estado de São

Paulo. Inicialmente atingiu várias cidades litorâneas e a partir de 1906 sofreu interiorização

através das rotas comerciais e finalmente se focalizou entre os roedores silvestres, em áreas

rurais, principalmente na região Nordeste: Alagoas, Bahia, Ceará, norte de Minas Gerais,

Paraíba, Piauí, Pernambuco, Rio Grande do Norte, além de um foco na Serra dos Órgãos no

Estado do Rio de Janeiro.

A ocorrência de uma quarta pandemia, a luz dos conhecimentos disponíveis, é

improvável. Entretanto, epidemias de dimensões imprevisíveis podem ocorrer com o uso da Y.

pestis como arma biológica (INGLESBY et al., 2000), o que teria como principal expressão

clínica a forma pneumônica. O uso de bactérias resistentes a antimicrobianos dificultaria o

tratamento e controle da doença.

Atualmente, a peste está incluída pela OMS entre as doenças reemergentes em

decorrência do aumento de incidência mundial de casos humanos e ocorrência de epidemias

em alguns países (HIGGINS, 2004). Em 2002, 13 países notificaram 1 925 casos de peste

com 177 mortes, em 2003, nove países notificaram 2 118 casos dos quais 182 foram fatais. Os

países mais acometidos foram a República Democrática do Congo e Madagascar, ambos na

África (WHO, 2004).


Vigilância e controle da peste no Brasil

No Brasil, a luta contra a Peste esteve a princípio a cargo dos Departamentos de Saúde

dos Estados e em 1936 passou à responsabilidade do Departamento Nacional de Saúde. Em

1941, foi criado o Serviço Nacional de Peste (SNP), estruturado especialmente para o

combate dessa infecção em todo o território, integrado sob comando único técnico e

administrativo. A partir de 1956, o SNP passou a fazer parte do Departamento Nacional de

Endemias Rurais (DNERu), posteriormente SUCAM (Superintendência de Campanhas de

Saúde Pública) e FUNASA (Fundação Nacional de Saúde).

Na década de 70 foi criada uma rede de laboratórios distribuídos estrategicamente nas

áreas de peste, com atribuições em diferentes níveis. Foram divididos em laboratórios de

apoio, que tinham a finalidade de coletar e preparar as amostras para exame, e laboratórios

regionais, encarregados de realizar diagnóstico laboratorial.

Com as reformas no Ministério da Saúde e reorganização do Sistema Nacional de

Vigilância, a vigilância da peste que vinha sendo realizada pela FUNASA, foi

descentralizada, passando à responsabilidade dos próprios municípios atingidos por esta

endemia sob a coordenação da Secretaria de Vigilância em Saúde (SVS). O Serviço de

Referência em Peste do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães (CPqAM), Fundação Oswaldo

Cruz (FIOCRUZ), trabalha integradamente com a SVS e os municípios nesta vigilância.

As atividades de vigilância e controle envolvem a captura sistemática e exames

bacteriológicos dos roedores e seus ectoparasitos para detecção da Y. pestis e a pesquisa de

anticorpos antipestosos através de inquéritos sorológicos entre roedores e carnívoros

domésticos ou silvestres, além do tratamento dos doentes e profilaxia dos comunicantes.

A modernização e desenvolvimento de estratégias de controle e métodos de

diagnóstico rápidos são objetivos primordiais, assim como a sua utilização nas redes de

laboratório de saúde pública, criando-se condições para que o Sistema Único de Saúde (SUS)

dê respostas eficazes às demandas de rotina e mesmo a excepcionalidade de um ataque

terrorista.

A Yersinia pestis

O gênero Yersinia pertence à família Enterobacteriaceae e é constituído de 11 espécies

das quais apenas três são patogênicas para o homem: a Y. pestis, o agente da peste; e as


espécies Y. enterocolitica e Y. pseudotuberculosis que são enteropatógenas. A Y. pestis é um

bacilo curto e ovóide (0,5 a 0,8 µm de diâmetro e de 1 a 3 µm de comprimento), Gram-

negativo, imóvel e não formador de esporos; desenvolve-se em temperaturas de 4ºC a 40ºC

com temperatura ótima de crescimento de 28ºC e pH entre 7.2 – 7.6, porém suporta pH entre

5 a 9,6. Após 48 horas de incubação em meio sólido, suas colônias são pequenas,

esbranquiçadas, convexas, brilhantes e translúcidas (PERRY; FETHERSTON, 1997).

A Y. pestis era considerada uma espécie muito homogênea por possuir apenas um

sorotipo, um fagotipo e um biotipo com três biovar ou variedades geográficas, mas estudos de

ribotipagem em cepas de diversos focos do mundo identificaram mais de 16 ribotipos e

mostraram uma correlação entre os ribotipos e os biovars (GUIYOULE et al., 1994;

GUIYOULE et al., 1997).

Os biovars são definidos de acordo com a capacidade de fermentação do glicerol e

redução do nitrato ao nitrito: variedade Antiqua ou Continental (glicerol +, nitrato+);

Maedievalis (glicerol +, nitrato-) e Orientalis ou Oceânica (glicerol-, nitrato+), cada biovar

seria remanescente da cada uma das três pandemias respectivamente: Peste de Justiniano,

Peste Negra e Peste Contemporânea (PERRY; FETHERSTON, 1997). Zhou et al.(2004)

sugerem a criação de um quarto biovar “microtus” para incluir cepas chinesas não virulentas

para humanos que fermentam o glicerol e não reduzem o nitrato a nitrito, de forma

semelhante ao biovar Maedievalis, mas que não utilizam a arabinose como todas as outras

cepas.

Características genéticas

O genoma de três cepas de Y. pestis (CO-92, KIM e 91001) foi seqüenciado (DENG et

al., 2002; PARKHILL et al., 2001; SONG et al., 2004) e foram encontradas significantes

diferenças entre elas resultantes de rearranjos do DNA.

Cepas típicas de Y. pestis possuem um cromossomo de aproximadamente 4.600 kb e

três plasmídeos: pFra (90-100 kb), pYV (70 kb) e pPst (9,5 kb) (DENG et al., 2002;

PARKHILL et al., 2001; SONG et al., 2004).

O pFra codifica uma proteína capsular ou fração F1 com atividade antifagocítica (DU

et al., 2002) e a toxina murina (Ymt) que parece estar envolvida na transmissão da peste pelas

pulgas (HINNEBUSCH, 2002a). A expressão da F1 depende de vários genes organizados em

um operon (f1), envolvidos na regulação (caf1R), estrutura (caf1), transporte (caf1M) e


montagem (caf1A) da proteína (GALYOV et al., 1990; GALYOV et al., 1991;

KARLYSHEV et al., 1992a ; KARLYSHEV et al., 1992b). A F1 é imunogênica para homens

e animais, sendo amplamente utilizada em testes de diagnóstico de peste (CHU, 2000).

O pPst codifica para a proteína Pla que é precursora do ativador do plasminogênio e da

coagulase (SODEINDE; GOGUEN, 1988) que parecem atuar na disseminação da bactéria no

organismo do hospedeiro a partir do sítio da picada da pulga e no bloqueio do trato digestivo

das pulgas respectivamente (CAVANAUGH, et al., 1971; HINNEBUSCH, 2003).

O plasmídeo pYV é o único encontrado nas três espécies de yersínias patogênicas. É

indispensável à virulência das cepas e confere as bactérias a capacidade de superar as defesas

do organismo hospedeiro através da expressão de proteínas antifagocíticas Yop e de um

complexo sistema de secreção tipo III (CORNELIS, 2002).

O cromossomo possui uma região de 102 kb conhecida como locus pgm que contém

dois segmentos física e funcionalmente distintos: um segmento de aquisição de ferro,

considerado uma ilha de patogenicidade (HPI) que possui genes envolvidos na aquisição do

ferro, e um segmento de pigmentação (locus hms) responsável pela estocagem do ferro

evidenciado pelo fenótipo de pigmentação vermelho das colônias quando cultivadas em meios

ricos em hemina ou corantes análogos. O locus hms parece estar envolvido na colonização do

proventrículo da pulga, contribuindo para transmissão (CARNIEL et al., 2001;

HINNEBUSCH et al., 1996).

A Y. pestis possui cerca de 90% de homologia genética com Y. pseudotuberculosis

(BERCOVIER et al., 1980), porém estas duas espécies produzem quadros clínicos bastante

distintos: enquanto a Y. pseudotuberculosis causa transtornos entéricos raramente fatais e é

transmitida via oral-fecal, a Y. pestis adquiriu a capacidade de ser transmitida por um

artrópode-vetor e pode ser letal. Estas diferenças podem ser justificadas pela presença dos

dois plasmídeos específicos em Y. pestis, pFra e pYV, que teriam sido adquiridos

horizontalmente, além da inativação de alguns genes nessa espécie como o gene da adesina,

importante para colonização do trato intestinal (ACHTMAN et al., 1999).

Características clínico-epidemiológicas da peste

Ciclo epidemiológico


A cadeia epidemiológica da peste é complexa e envolve diferentes populações de

roedores e pulgas, e acidentalmente acomete o homem. Em graus variáveis todos os roedores

são susceptíveis à infecção pestosa. Existe evidência da infecção pela Y. pestis nas ordens

Carnivora, Insectivora, Artiodactyla, Marsupialia, Hyracoidea, e Primata. As aves, répteis e

anfíbios são resistentes a infecção pela Y. pestis, no entanto as aves podem participar na

disseminação da doença pelo transporte de pulgas infectadas (GAGE; KOSOY, 2004).

A transmissão ao homem e roedores é realizada principalmente pela picada da pulga

infectada que pode funcionar como vetor mecânico ou biológico (GAGE; KOSOY, 2004).

Na transmissão biológica, a pulga suga o sangue infectado que, ao chegar nas porções

anteriores do tubo digestivo, sofre coagulação. As bactérias presentes no coágulo se

multiplicam formando uma massa bacilar que bloqueia o estômago da pulga impedindo a

digestão do sangue. Durante as tentativas de se alimentar, a pulga relaxa os músculos

sugadores regurgitando o sangue contaminado no novo hospedeiro propagando a infecção

(HINNEBUSH, 2003).

Na transmissão mecânica, a bactéria é introduzida pelas peças bucais (probóscides)

contaminadas, quando o inseto que foi interrompido em seu repasto sobre um animal doente

passa a picar, em seguida, um animal sadio (GAGE; KOSOY, 2004). Piolhos e carrapatos

podem adquirir a Y. pestis, mas a capacidade vetora desses invertebrados não foi comprovada

experimentalmente (PERRY; FETHERSTON, 1997).

Os animais domésticos, cães e gatos, infectam-se principalmente durante a caça de

roedores infectados e desenvolvem a infecção pestosa na faringe, posteriormente nos pulmões

passando a transmitir a doença através de aerossóis (PERRY; FETHERSTON, 1997).

Formas clínicas e tratamento

A peste no homem se manifesta sob três formas clínicas principais: a bubônica, forma

clínica mais comum, caracterizada pela tumefação inflamatória dos linfonodos que drenam o

local da picada da pulga. Esta pode ser confundida com linfadenites por estreptococos ou

estafilococos, mononucleose infecciosa, filariose linfática, doenças sexualmente

transmissíveis e outras causas de linfadenopatia aguda; a septicêmica, que pode ser primária

ou secundária à forma bubônica. Na forma primária há presença de bacteremia, mas

geralmente não há bubão palpável. A forma secundária ocorre na fase terminal da forma

bubônica não tratada. A bactéria se dissemina por órgãos e tecidos, causando coagulação


intravascular e choque endotóxico e pode ser confundida com outras causas de sepsis; e a

peste pneumônica, que evolui de forma grave e fatal se não tratada adequadamente podendo

ser transmitida por via aerógena sem a necessidade do vetor (PERRY; FETHERSTON, 1997).

Entre 1970 e 1993, 12% dos casos nos Estados Unidos (77 casos) desenvolveram peste

pneumônica secundária a forma bubônica ou septicêmica da doença (PERRY;

FETHERSTON, 1997). Deve-se realizar diagnóstico diferencial da peste pneumônica com

outras doenças como antraz, tularemia e estreptococcias.

A peste pode se apresentar sob formas clínicas mais raras como: peste faringiana,

oftálmica e meningeal. Existem ainda relatos de uma forma benigna ou “pestis minor” com

discreto comprometimento ganglionar e cura espontânea (ALMEIDA et al, 2003; PERRY;

FETHERSTON, 1997).

O tratamento da peste deve ser iniciado o mais precocemente possível e os antibióticos

de escolha são os aminoglicosídeos, as tetraciclinas e as fluoroquinolonas. O cloranfenicol

está indicado principalmente nas meningites e endoftalmites. As penicilinas e macrolídeos

não são eficazes (PERRY; FETHERSTON, 1997).

Uma cepa de Y. pestis multirresistente aos antibióticos de primeira linha utilizados no

tratamento e profilaxia da peste foi isolada em Madagascar. A resistência foi atribuída à

aquisição de um plasmídeo de resistência a antibióticos. Existem várias hipóteses para

explicar a aquisição deste plasmídeo, uma delas é que foi adquirido no organismo dos ratos

(Rattus rattus), animal onívoro, que convive em ambientes contaminados com material fecal

humano com flora resistente a antibióticos (DENNIS; HUGHES, 1997; GALIMAND et al.,

1997). Em outra hipótese, a bactéria teria adquirido o plasmídeo de resistência no sistema

digestivo de pulgas que ingerem sangue contaminado com ambos os microorganismos, o

doador e o receptor do plasmídeo de resistência (HINNEBUSH et al., 2002b).

Métodos de diagnóstico

Clínico-epidemiológico

O diagnóstico clínico-epidemiológico é baseado na correlação de variáveis clínicas e

epidemiológicas de um caso. Este diagnóstico pode ser útil em situações em que não é

possível o isolamento do agente etiológico e em diagnósticos retrospectivos.


Diagnóstico bacteriológico

Exame direto por coloração pelo azul de metileno

Esse teste evidencia a morfologia bipolar da Y. pestis: coloração clara no centro e bem

corada nas extremidades. Pode ser realizado a partir de esfregaços feitos a partir de sangue,

aspirado de bubão, líquido cefalorraquidiano, esputo no homem ou sangue, baço, medula

óssea e fígado dos animais infectados. Um inconveniente da técnica é a dificuldade de

identificação da bactéria em amostras multicontaminadas (ALMEIDA et al., 2003).

Imunofluorescência direta

A imunofluorescência direta (ID) é uma técnica de diagnóstico que se baseia na reação

antígeno-anticorpo empregando anticorpos conjugados com material fluorescente

(isotiocianato de fluoresceínana, FITC) para pesquisa da proteína capsular F1 de Y. pestis em

esfregaços de cultura e material de origem humana ou animal (CHU, 2000). Apesar deste

método ser utilizado na rotina dos programas no Center for Disease Control and Prevention

(CDC) dos Estados Unidos da América (EUA), ainda não foi adotado na rotina de diagnóstico

e vigilância no Brasil, principalmente pelo fato do conjugado não ser produzido

comercialmente.

Cultura

As diversas amostras de material humano, de animais ou de pulgas são cultivadas em

placas de gelose peptonada ou base de agar sangue (Blood Agar Base: BAB) a 28ºC, pH na

faixa de 7,4 a 7,6. O crescimento é lento e após 48hs as colônias são pequenas, translúcidas,

brilhantes e possuem a particularidade de serem deslocadas sem nenhuma alteração

morfológica com a alça de platina.

O cultivo da bactéria em caldo (brain heart infusion broth: BHI) é feito nas mesmas

condições de temperatura e pH utilizadas para a gelose peptonada. O crescimento após 24 a

48 hs apresenta aspecto flocular sem turvação do meio. A repicagem em caldo e posterior


plaqueamento com teste de bacteriófago podem ser realizados para confirmação de colônias

com morfologia característica de Y. pestis crescidas em cultivos multicontaminados (CHU,

2000).

O diagnóstico por cultura pode ser prejudicado pelas condições de transporte e

conservação das amostras que podem estar multicontaminadas ou conter bactérias inviáveis,

acarretando resultado falso negativo.

Teste rápido para pesquisa de F1 (fita reagente)

Chanteau et al. (2003) desenvolveram um teste imunocromatográfico tipo fita reagente

que utiliza anticorpos monoclonais anti-F1 imobilizados junto a uma substância cromógena

em membranas de nitrocelulose. É de fácil e rápida execução dispensando eletricidade,

equipamentos ou refrigeração das amostras. É realizado com a imersão da fita em amostras de

sangue, esputo, aspirado de bubão de pacientes. A leitura do resultado é simples e é revelada

por uma reação cromatrográfica. No entanto, a distribuição deste teste ainda é restrita.

Inoculação em camundongos

A inoculação em camundongos é particularmente útil quando se deseja recuperar a Y.

pestis de amostras multicontaminadas. As amostras são suspensas em salina e inoculadas no

animal que será observado durante duas semanas para verificação dos sintomas ou morte. A

necropsia e posterior cultura de vísceras possibilitam a recuperação da Y. pestis e confirma o

diagnóstico, no entanto é uma alternativa demorada (CHU, 2000).

Diagnóstico sorológico

A técnica de hemaglutinação (HA) utiliza o antígeno F1 imobilizado em hemácias de

carneiro para detectar anticorpos específicos em soros humanos, de roedores e carnívoros

(CHU, 2000). No entanto, esta técnica apresenta inconvenientes como complexidade e

emprego de reagentes perecíveis.


Diversos testes empregando novas matrizes sensibilizadas com a F1 foram

desenvolvidos, porém estas técnicas exigem a utilização de diferentes anticorpos espécie-

específico nos testes com soros humanos, de roedores, cães e gatos (ALMEIDA; FERREIRA,

1992; ARAUJO et al., 1998; BARBOSA, et al., 2000; CARVALHO-JR et al, 1996; LIMA-

BARROS et al., 2002; MONTENEGRO et al., 1993 THULLIER et al., 2003). Uma técnica de

aglutinação em grânulos de látex sensibilizados com a F1 foi desenvolvida no CDC (CHU,

2000); é de fácil execução e de boa reprodutibilidade podendo ser aplicada em soros de

qualquer origem. Rodrigues et al.(1999) desenvolveram um teste de aglutinação de

micropartícula de PVA/GA (Álcool Polivinílico/Glutaraldehido) que são estáveis e de baixo

custo. No entanto, a síntese das partículas de PVA/GA não apresentou reprodutibilidade em

ensaios subseqüentes. A HA continua sendo o teste mais usado no diagnóstico e vigilância da

peste em todo mundo.

Diagnóstico molecular

PCR

A técnica de PCR baseia-se na amplificação “in vitro” de segmentos específicos de

DNA, permitindo um rápido diagnóstico em diversas doenças bacterianas, virais, parasitárias

e hereditárias (ERLICHI et al., 1991). A PCR mostrou-se útil na identificação de patógenos

em amostras conservadas em museus (PERSING et al., 1990) e de Y. pestis em amostras

arqueológicas (DRANCOURT et al., 1998). Diversos protocolos baseados na PCR têm sido

desenvolvidos para diagnóstico da peste em material clínico ou animal (CHU, 2000;

ENGELTHALER et al, 1999; RAHALISON et al, 2000).

Multiplex-PCR (M-PCR)

A M-PCR é uma técnica na qual são utilizados múltiplos pares de primers dirigidos a

diferentes alvos numa mesma reação. Leal e Almeida (1999) desenvolveram um protocolo

para diagnóstico e tipagem de Y. pestis usando primers específicos para os genes caf1, lcrV e

pla localizados respectivamente nos plasmídeos pFra, pYV e pPst e para o gene cromossomal

irp2. Esta técnica mostrou-se útil para estudos retrospectivos da peste (MELO et al., 2003).


Nested-PCR (N-PCR)

A N-PCR é uma variação da PCR adotada para melhorar a sensibilidade e

especificidade da PCR (ERLICHI et al., 1991). O procedimento é realizado em duas etapas de

amplificação: na primeira é utilizado um par de primers com homologia a uma região mais

externa ao alvo e posteriormente, os amplicons gerados na primeira reação servem como

molde para a segunda etapa que utiliza primers dirigidos a uma região mais interna ao

primeiro produto. Leal et al.(1996) adaptaram a técnica para o diagnóstico da peste em baços

de roedores sem a necessidade de extração prévia do DNA da bactéria.

Nested-PCR em tubo único (N-PCRTbU)

A N-PCRTbU é uma variação do N-PCR adaptada para minimizar riscos de

contaminação durante a transferência dos amplicons entre as etapas de amplificação no N-

PCR (ERLICHI et al., 1991). Nesta técnica, os dois pares de primers, internos e externos, são

adicionados ao mesmo tubo sem a necessidade de abertura do tubo entre as fases de

amplificação.

Para evitar a competição entre os dois pares de primers pelo alvo no N-PCRTbU,

foram desenvolvidas algumas estratégias baseadas no uso de diferentes temperaturas de

anelamento para cada par de primers (GOOKIN et al., 2002; HERRMANN et al.,1996) ou na

separação física dos primers (BERG et al., 2001).

Abath et al.(2002) desenvolveram a estratégia de fixar os primers internos na face

interna da tampa do microtubo, por evaporação. Para facilitar a visualização dos primers

fixados, traços do corante azul de bromofenol são adicionados aos primers internos antes da

fixação, dando a eles uma coloração azul. A mistura de reação com os primers externos é

introduzida no interior do tubo e ao final da primeira etapa de amplificação o tubo é invertido

várias vezes de modo que o primer fixado na tampa dissolva-se no produto da primeira reação

(figura 1). Montenegro et al.(2004) adaptaram esta técnica para detecção de Plasmodium, com

adição de primers direcionados para DNA humano como controle para detectar falso

negativos por presença de inibidores.

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Figura 1: Esquema representativo do N-PCRTbU

Primers internos + azul de bromofenol

Primers externos + Mistura de reação

1ª etapa: atuação dos primers externos

2ª etapa: atuação dos primers internos

Diluição dos primers fixados

Justificativas


Justificativas

• A peste está incluída pela OMS entre as doenças reemergentes em decorrência do

aumento de incidência mundial de casos humanos e ocorrência de epidemias em

alguns países (HIGGINS, 2004).

• Embora desde 1997 não tenha sido isolada nenhuma cepa de Y. pestis, os

inquéritos sorológicos vêm detectando anticorpos antipestosos nos animais

sentinelas em vários focos (ARAGÃO et al., 2002) confirmando a manutenção da

circulação da infecção nos focos brasileiros, e em fevereiro de 2005 foi confirmado

sorologicamente um caso humano no município de Pedra Branca no Estado do

Ceará.

• Na vigilância da peste é necessário o emprego de métodos de diagnóstico rápidos e

eficientes para que medidas de controle sejam adotadas rapidamente a fim de

evitar sua propagação entre a população humana.

• O cultivo e isolamento da Y. pestis podem ser prejudicados pela conservação e

transporte inadequados das amostras coletadas para exames. As técnicas baseadas

em PCR podem ser uma alternativa para identificação da Y. pestis em amostras

dessecadas e multicontaminadas.


Pergunta condutora:

Qual o desempenho da técnica Nested-PCRTbU para diagnóstico da peste sob condições

experimentais?

Objetivos


Objetivos

Geral

Avaliar a técnica Nested-PCRTbU para aplicação no diagnóstico da peste.

Específicos

• Otimizar as concentrações dos reagentes utilizados no N-PCRTbU

• Avaliar o limiar de detecção no N-PCRTbU a partir de DNA total e da cultura

bacteriana comparando-o ao da PCR e N-PCR

• Avaliar o desempenho da N-PCRTbU na identificação da Y. pestis em material

de roedores analisado a fresco e após conservação no meio de transporte de

Cary-Blair, comparando-o ao da PCR e N-PCR

Procedimentos metodológicos


Procedimentos metodológicos

Desenho de estudo

Não foi possível o enquadramento desta dissertação em nenhum desenho de pesquisa

epidemiológica, porém a avaliação de testes potencialmente mais eficientes em relação aos

existentes é de grande importância para a epidemiologia.

Bactérias e condições de cultivo

Foi utilizada a cepa Y. pestis P. PB 881 isolada em 1986 da hemocultura de um

paciente humano do Estado da Paraíba (ALMEIDA et al., 1989). A cepa é conservada em

camada alta de gelose em câmara fria (4ºC) na bacterioteca do Departamento de

Microbiologia do CPqAM. Para os trabalhos, a cepa foi reativada por semeio em caldo (Brain

Heart Infusion Broth: BHI, Difco), incubada a 28ºC por 48 horas e em seguida semeada em

gelose peptonada (Blood Agar Base: BAB, Difco). A confirmação da pureza foi realizada pela

sensibilidade ao fago antipestoso. Após a reativação, a cepa foi analisada quanto ao conteúdo

plasmidial para verificar a presença do alvo das reações moleculares (plasmídeo pFra).

Também foi utilizado o DNA total das cepas Y. pestis P. CE 882, Y.

pseudotuberculosis IP 32450e Y. enterocolitica 25C.

Teste com bacteriófago

Após 48 a 72 horas de cultivo em placa, 2 ou 3 colônias com morfologia característica

de Y. pestis foram repicadas individualmente para caldo (BHI) e incubadas a 28ºC por 24

horas. Uma alíquota de cada crescimento em BHI foi plaqueada em BAB e em um local

demarcado da placa foi adicionado o bacteriófago, seguido de incubação a 28ºC. A

sensibilidade ao fago é caracterizada por um halo de lise visualizado após 18-24h no local

onde o fago foi adicionado.


Extração do DNA plasmidial

Para confirmar a presença dos três plasmídeos prototípicos (pFra, pYV e pPst), o DNA

plasmidial da cepa Y. pestis P. PB 881 foi extraído pela técnica de lise alcalina segundo

protocolo de Birnboim e Doly (1979) modificado na Escola Paulista de Medicina.

Um mililitro da cultura em BHI foi centrifugado a 4ºC a 12.000rpm. Ao sedimento foi

adicionado 100µl da solução de lise (Tris-HCL 25mM, EDTA 10mM, glicose 20mM,

lisozima 0,4mg), incubando-se à temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida foi

adicionado 200µl de solução alcalina (SDS 1%, NaOH 0,2N), incubando-se por 10 minutos

em banho de gelo, para completar a lise das células bacterianas. A solução foi neutralizada

com 150µl de acetato de sódio 3M pH 4,8 e incubada por 30 minutos em banho de gelo. Após

10 minutos de centrifugação, o sobrenadante foi transferido para outro tubo e a ele foi

adicionado 400µl de fenol-clorofórmio-álcool isoamilico (25:24:1) para purificação do DNA.

Os tubos foram centrifugados, o sobrenadante recuperado e precipitado com 900µl de álcool

etílico a –70ºC por 30 minutos, seguido por centrifugação por 10 minutos. Após descarte do

sobrenadante, o precipitado foi ressuspenso em 10µl de água deionizada estéril.

O DNA obtido foi submetido à eletroforese em gel de agarose 0,6% em tampão TBE

(Tris-borato 0,089; ácido bórico 0,089M; EDTA 0,002M), a 100V, corado por imersão do gel

em solução de brometo de etídio (15mg/ml) e visualizado sob luz UV. O tamanho dos

plasmídeos foi determinado por comparação com a migração de plasmídeos de tamanhos

conhecidos (147; 63; 35,8 e 6,9kb) da cepa E. coli 39R861.

Extração do DNA genômico

O DNA genômico foi extraído a partir de um mililitro da cultura em BHI que foi

centrifugado a 12.000rpm em centrífuga refrigerada (4ºC). O sobrenadante foi descartado, e o

sedimento suspenso em 500µl de TE, novamente centrifugado, desprezado o sobrenadante e

ao precipitado foi adicionado: 500µl de TE, 10µl de lisozima (10mg/ml) e 10µl de proteinase

K (5mg/ml). Após homogeneização, a suspensão foi incubada a 60ºC por 20 minutos para

início da lise bacteriana, em seguida foi adicionado 100µl de STE (SDS 2,5%, Tris-HCl

10nM pH8,0; EDTA 0,25M). Depois de 15 minutos de incubação a 60ºC, os tubos foram

mantidos por 5 minutos a temperatura ambiente e por 5 minutos em banho de gelo e

neutralizada com 130 µl de acetato de amônio 7,5M, permanecendo no banho de gelo por


mais 15 minutos e centrifugada por 5 minutos. Aproximadamente 700µl de sobrenadante foi

transferido para outro tubo, adicionado o mesmo volume de fenol-clorofórmio-álcool

isoamílico (25:24:1), e centrifugado por 5 minutos. Os sobrenadantes foram novamente

transferidos para outros tubos e o DNA precipitado com aproximadamente 420µl de

isopropanol a -70ºC por 30 minutos ou a -20 por 24 horas. Após centrifugação, o

sobrenadante foi descartado. Os precipitados foram ressuspensos em 10µl de solução de

RNAse (10mg/ml) e conservados a -20ºC.

A qualidade do DNA obtido foi avaliada por eletroforese em gel de agarose a 1% em

tampão TBE, como já descrito. A quantificação do DNA foi realizada em espectofômetro

(Eppendorf).

Avaliação do limiar de detecção do PCR, N-PCR e N-PCRTbU a partir do DNA total

Para o estabelecimento do limiar de detecção das técnicas de PCR (primers internos e

externos), N-PCR e N-PCRTbU, o DNA foi diluído nas concentrações de 0.5ng, 50pg, 5pg,

500fg, 50fg e 5 fg/µl. Foram utilizados 2µl de cada diluição nas reações, correspondendo a

1ng, 100pg, 10pg, 1pg, 100fg e 10fg de DNA.

Avaliação do limiar de detecção do PCR, N-PCR e N-PCRTbU a partir da cultura

Cem microlitros da cultura em BHI da cepa Y. pestis P. PB 881 foram centrifugados

por 5 minutos a 12.000 rpm e o sedimento suspenso em 1000µl de salina estéril. Foram feitas

diluições seriadas (1:10) em salina até 10 -8. 100µl das diluições 10-4 a 10-8 foram plaqueadas

para contagem das Unidades Formadoras de Colônia (UFC) e o restante submetido à fervura

por 10 minutos para lise bacteriana. Dez microlitros das diluições 10-4 a 10-8 fervidas foram

utilizados diretamente nas reações de PCR, N-PCR e N-PCRTbU.


Procedimentos com animais

Sete camundongos albinos “Swiss Webster” obtidos no Biotério Central do CPqAM

foram inoculados por via subcutânea com 0,2 ml de suspensão bacteriana da cepa Y. pestis P.

PB 881 em salina estéril (cerca de 2x105 células bacterianas). Os animais foram mantidos em

sala climatizada com água e ração (Nuvital), supervisionados diariamente, e após a morte,

foram necropsiados para coleta de amostras para as análises. Fragmentos de vísceras (baço,

fígado, pulmão, coração) de um animal foram introduzidos no meio de conservação e

transporte de Cary-Blair (CARY; BLAIR, 1964) e mantidos a temperatura ambiente para

análises posteriores, paralelamente foram submetidos à cultura para confirmação da presença

da Y. pestis. Baços de seis animais foram analisados logo após a coleta (a fresco).

Ensaios a fresco com baços de camundongos

Fragmentos de baços de seis camundongos foram triturados em salina estéril. Uma

alíquota dos sobrenadantes foi semeada em BAB para confirmação da presença da Y. pestis e

o restante submetido a um processo de purificação parcial para neutralização dos inibidores da

reação de PCR segundo protocolo descrito em Leal e Almeida (1999) baseado em Mahbubani

e Bej (1994): 500µl de cada amostra (triturado de vísceras a fresco ou em Cary-Blair) foi

centrifugado, o sedimento lavado em 1000µl de TE (Tris-HCl 10mM; EDTA 1mM) pH 8,0 e

centrifugado. O sedimento foi ressuspenso em 100 µl de tampão K (KCl 50mM; Tris-HCL

20mM pH 8,3; MgCl 2,5mM), a mistura foi incubada a 55ºC por 1 hora, em seguida a 95ºC

por 10 minutos e congelada uma vez. Dez microlitros de cada amostra processada foram

utilizados nas reações de PCR, N-PCR e N-PCRTbU.

Ensaios com amostras conservadas em meio de transporte

Após 11 meses de conservação em Cary-Blair, fragmentos de baço, pulmão, coração e

fígado foram processados para purificação parcial como descrito acima e analisados por PCR,

N-PCR e N-PCRTbU. As amostras foram novamente submetidas à cultura em gelose

peptonada.


Primers

Para amplificação do gene caf1 (GALYOV et al. 1990) foram utilizados dois pares de

primers direcionados a regiões diferentes da seqüência do gene, disponível do Gen Bank (nº

de acesso X61996)

• Primers externos: 5’-CAG TTC CGT TAT CGC CAT TGC 3’ e 5’ TAT TGG TTA

GAT ACG GTT ACG GT-3’ (NORKINA et al., 1994)

• Primers internos: 5’-TTG GAA CTA TTG CAA CTG CTA 3’ e 5’ TTA GAT ACG

GTT ACG GTT A-3’ (LEAL et al., 1996).

Vinte picomoles de cada primer (externos e internos) foram testados individualmente

por PCR utilizando 20ng de DNA da cepa Y. pestis P. PB 881 e posteriormente testados por

N-PCR.

Para as reações de N-PCRTbU, o par de primer interno foi aplicado na face interna dos

microtubos juntamente com traços do corante azul de bromofenol adicionado para facilitar a

visualização da diluição do primer na mistura (figura 1). Os tubos foram mantidos abertos em

cabine de segurança biológica por aproximadamente 40 minutos para fixação dos primers por

evaporação.

Avaliação do período de atividade dos primers pré-fixados na tampa dos tubos

Os tubos com primers fixados foram mantidos sob refrigeração (–20ºC) e usados no

período de três meses para verificar a duração do período de atividade.

PCR e N-PCR

As reações de PCR foram realizadas num volume total de 25µl por tubo, contendo:

2µl das diluições do DNA total ou 10µl das suspensões bacterianas ou 10µl das amostras

processadas; Tris-HCL 10mM pH 8,0; KCl 50mM; MgCl2 1,5 mM; 20 pmoles de primers;

1U da enzima Taq DNA polimerase (Amersham Bioscience); dNTP’s: dATP, dCTP, dGTP e

dTTP 200µM. Em cada ensaio de PCR ou N-PCR, foi incluído um controle negativo (apenas


a mistura de reação, sem adicionar DNA como molde) e um controle positivo (adição de 20

ng de DNA total da cepa Y. pestis P. PB 881).

As amplificações foram realizadas em termociclador (Biometra Trio Thermoblock) e

cada ciclo de amplificação foi composto por 1 minuto a 92ºC para desnaturação, 1 minuto a

55ºC para anelamento dos primers e 1 minuto a 72ºC para extensão num total de 30 ciclos

seguidos de uma etapa final de extensão de 7 minutos a 72ºC.

As reações de Nested-PCR foram realizadas nas mesmas condições de reação já

citadas, com 2 µl do produto das reações de PCR e 20pmol do primer interno.

Os produtos das amplificações foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1%

como já descrito. O tamanho dos segmentos amplificados foi determinado por comparação

com segmentos de tamanhos conhecidos do marcador “100 pb DNA ladder” (Amersham).

N-PCRTbU

Foram realizados ensaios com diferentes quantidades dos primers externos (20; 2; 1;

0,1; 0,01 e 0,001 pmoles) e 20 pmoles dos internos.. A proporção 1:10, correspondendo a

concentração de 2 pmol de primers externos e 20 pmoles de primers internos, foi a que

proporcionou melhor resultado e foi adotada para continuação dos trabalhos. Também foram

realizados ensaios para determinar as concentrações de dNTP, MgCl2 e Taq DNA polimerase.

As reações foram realizadas num volume total de 50µl em tubos com 20 pmoles de

primers internos pré-fixados contendo: 2µl das diluições do DNA total ou 10µl das

suspensões bacterianas ou 10µl das amostras processadas; Tris-HCL 20mM pH 8,0; KCl

100mM; MgCl 3mM; 2 U da enzima Taq DNA polimerase; dNTP’s: dATP, dCTP, dGTP e

dTTP 400µM e 2 pmoles de primer externo.

As amplificações foram realizadas em termociclador (Biometra trio thermoblock). A

primeira etapa consistiu de 15 ciclos compostos de 1 minuto a 90ºC, 1 minuto a 55ºC e 1

minuto a 72ºC. Após a primeira fase de amplificação os tubos foram aquecidos a 90ºC por

aproximadamente dois minutos e em seguida invertidos várias vezes para diluição do primer

fixado na tampa do microtubo, na mistura de reação. Os tubos foram brevemente

centrifugados e submetidos à segunda fase de amplificação composta por 45 ciclos de 1

minuto a 90ºC, 1 minuto a 55ºC e 1 minuto a 72ºC seguidos de uma etapa de extensão final de

7 minutos a 72ºC.


Os produtos da N-PCRTbU foram submetidos a eletroforese como descrito

anteriormente.

Avaliação da especificidade da N-PCRTbU

A especificidade da reação foi avaliada através de ensaios de amplificação com 20ng

do DNA total das cepas Y. pestis P. PB 881 e P. CE 882 e com outras espécies do gênero

Yersinia: Y. pseudotuberculosis IP 32450 e Y. enterocolitica 25C e em triturados de baços de

camundongos normais (não inoculados) cedidos pelo biotério do CPqAM, conduzidos nas

mesmas condições de amplificação empregadas para Y. pestis.

Os produtos das amplificações foram analisados por eletroforese como descrito

anteriormente.

Resultados


Resultados

Avaliação dos primers por PCR e N-PCR

Nas reações de PCR utilizando 20ng de DNA da cepa Y. pestis P. PB 881 e 20 pmoles

de primers externos ou internos houve amplificação dos segmentos de tamanho esperado: 506

e 460 pb respectivamente. No N-PCR realizado a partir do PCR com primers externos, o

fragmento de 460 pb foi amplificado.

Estabelecimento da proporção entre primers internos e externos para N-PCRTbU

Das proporções de primers testadas, a que produziu banda melhor definida foi a de 2

pmol de primer externo para 20 pmol de primer interno (1:10). Esta proporção foi adotada na

continuação dos trabalhos (figura 2, linha 3).

Limiar de detecção a partir de DNA total e das suspensões bacterianas

Nas reações usando como molde o DNA extraído da cepa Y. pestis P. PB 881 nas

quantidades de 1ng, 100pg, 10pg, 1pg, 100fg e 10fg houve amplificação até 100pg para PCR

com primers internos (dados não mostrados) e com primers externos, 1pg para N-PCR e 10 pg

para N-PCRTbU (figuras 3, 4 e 5).

A tabela 1 mostra a quantidade mínima de bactérias viáveis (unidades formadoras de

colônias) da cepa Y. pestis P. PB 881 detectadas por PCR (primer externo), N-PCR e N-

PCRTbU.

Teste de especificidade do N-PCRTbU

Não houve amplificação a partir do DNA total das cepas Y. pseudotuberculosis IP

32450 e Y. enterocolitica Ye25C, nem com as amostras de baços de camundongos normais,

não inoculados. Com o DNA das cepas Y. pestis P. CE 882 e P. PB 881 foi amplificado o

segmento de tamanho esperado (dados não mostrados).


Figura 2. Produtos da N-PCRTbU com DNA da cepa Y. pestis P. PB 881 e diferentesconcentrações dos primers dirigidos a uma região da extremidade do gene caf1 (E) e a umaregião mais interna (I). Linhas 1: 100pb DNA Ladder, 2: 20pmol E x 20 pmol I, 3: 2pmol E x20 pmol I, 4: 1pmol E x 20 pmol I, 5: 0,1 pmol E x 20 pmol I, 6: 0,01 pmol E x 20 pmol I, 7:0,001 pmol E x 20 pmol I, 8: 0pmol E x 20 pmol I, 9: 20pmol E x 0 pmol I, 10: controlenegativo.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

460pb

800pb


1 2 3 4 5 6 7 8 9

800pb

506pb

Figura 3. Produtos da PCR (primers externos) com diferentes quantidades de DNA da cepa Y.pestis P. PB 881. Linhas 1: 100pb DNA ladder, 2: 1ng, 3: 100pg, 4: 10pg, 5: 1pg, 6: 100fg, 7:10fg, 8: controle negativo, 9: controle positivo.


Figura 4. Produtos da N-PCR com diferentes quantidades de DNA da cepa Y. pestis P. PB 881.Linhas 1: 100pb DNA ladder, 2: 1ng, 3: 100pg, 4: 10pg, 5: 1pg, 6: 100fg, 7: 10fg, 8: controlenegativo do PCR, 9: controle positivo do PCR, 10: controle negativo do N-PCR; 11: controlepositivo do N-PCR

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

800pb

460pb


Figura 5. Produtos da N-PCRTbU com diferentes quantidades de DNA da cepa Y. pestis P. PB 881.Linhas 1: 100pb DNA ladder, 2: 1ng, 3: 100pg, 4: 10pg, 5: 1pg, 6: 100fg, 7: PCR primer interno, 8: PCRprimer externo, 9: controle negativo.

1 2 3 4 5 6 7 8 9

800pb

460pb

38

Tabela 1 Número de bactérias viáveis (unidades formadoras de colônias) da cepa Y. pestis P. PB 881 detectadas por PCR, N-PCR e N-

PCRTbU

Diluições UFC/10µl PCR N-PCR N-PCRTbU

10-4 2 x 103 + + +

10-5 2 x 102 - + +

10-6 2 x 101 - + +

10-7 2 x 100 - + -

10-8 0 - - -


Análise de amostras de vísceras conservadas em Cary-Blair

Das quatro amostras (baço, fígado, pulmão, coração) plaqueadas em gelose peptonada

após conservação por 11 meses no meio de Cary-Blair, duas apresentaram crescimento puro

da Y. pestis e duas foram invadidas por crescimento de bactérias e fungos contaminantes. Em

uma das culturas contaminadas havia colônias características de Y. pestis confirmadas pelo

teste com o bacteriófago e na outra o crescimento dos contaminantes foi intenso

inviabilizando o teste com o fago sendo considerada negativa. Houve amplificação dos

segmentos esperados por N-PCR e N-PCRTbU nas quatro amostras independente da presença

de contaminantes nas culturas. Nos ensaios por PCR houve amplificação apenas nas duas

amostras que produziram culturas puras (tabela 2).

Análises realizadas a fresco em baços de camundongos infectados com a cepa Y. pestis P.

PB 881

Das culturas dos baços dos seis animais inoculados com a cepa Y. pestis P. PB 881,

apenas uma revelou crescimento de cultura pura de Y. pestis, nas demais foram obtidas

culturas mistas com crescimento de contaminantes além das colônias características de Y.

pestis confirmadas pelo teste com fago. Em todas houve amplificação do segmento esperado

por N-PCR e N-PCRTbU e em apenas três por PCR. Os resultados dessas análises estão

sumarizados na tabela 3.

Avaliação do Período de atividade dos primers pré-fixados na tampa dos tubos

A atividade dos primers pré-fixados foi mantida durante os três meses de uso.

40

Tabela 2 Resultados das análises em vísceras de camundongos infectados com a cepa Y. pestis P. PB 881, após 11 meses de

conservação no meio de Cary & Blair

Material Cultura Fago PCR N-PCR N-PCRTbU

Baço Multicontaminada + - + +

Fígado Multicontaminada Não realizado - + +

Pulmão Pura Y. pestis + + + +

Coração Pura Y. pestis + + + +

41

Tabela 3 Resultados das análises realizadas a fresco em baços de camundongos infectados com a cepa Y. pestis P. PB 881

Número das amostras Cultura Fago PCR N-PCR N-PCRTbU

1. Multicontaminada + - + +

2. Multicontaminada + + + +

3. Multicontaminada + + + +


5. Pura Y. pestis + + + +


CN Multicontaminada - - - -

CN Sem crescimento NR - - - CN: Controle Negativo (baço de camundongo não inoculados) NR: Não Realizado

Discussão


Discussão

Embora desde 1997 a Y. pestis não tenha sido mais isolada através dos estudos

bacteriológicos realizados em pulgas e roedores, os inquéritos sorológicos têm detectado a

presença de anticorpos antipestosos nos animais sentinela (cães e gatos) em vários focos

(ARAGÃO et. al., 2002) e em fevereiro de 2005 foi detectado sorologicamente um caso

humano no município de Pedra Branca no Estado do Ceará.

No Brasil, a maioria dos casos humanos e as epizootias pestosas ocorrem em áreas

remotas e afetam comunidades com condições sanitárias e de comunicação precárias, longe

dos laboratórios de diagnóstico. Os procedimentos usados na conservação e transporte das

amostras coletadas para exames nos laboratórios podem acarretar o dessecamento e

contaminação das amostras levando a morte da Y. pestis.

O meio de Cary-Blair (1964) foi originalmente desenvolvido para conservação e

transporte de material fecal e foi demonstrado por Cavanaugh (1967) que é capaz de manter a

viabilidade do bacilo da peste por semanas a temperatura ambiente tendo sido adotado na

rotina do Programa de Controle de Peste. Entretanto os resultados mostraram que a

recuperação da Y. pestis nas amostras conservadas no Cary-Blair é inferior do que quando as

amostras são analisadas logo após a coleta (ALMEIDA et al 1988).

Técnicas moleculares apresentam a vantagem de dispensar o cultivo das amostras e

são exeqüíveis mesmo quando as bactérias estão inviáveis. Diversos protocolos baseados na

PCR têm sido desenvolvidos para diagnóstico da peste em material clínico ou animal (CHU,

2000; ENGELTHALER et al, 1999; RAHALISON et al, 2000).

A N-PCR é útil quando se pretende aumentar a sensibilidade da PCR. Um processo

rápido e simples de identificação da Y. pestis por N-PCR diretamente em baços de roedores

foi desenvolvido por Leal et al.(1996).

Um inconveniente da N-PCR é a possibilidade de contaminação cruzada no momento

de transferência dos amplicons da primeira para a segunda etapa de amplificação.

Para minimizar o risco de contaminações na N-PCR têm sido propostas técnicas

realizadas em um único tubo. Nelas, é importante a utilização de estratégias que evitem a

competição entre os dois pares de primers pelo alvo. Para evitar esta competição, algumas

propostas são baseadas na utilização de primers que atuem em temperaturas diferentes

(GOOKIN et al., 2002; HERRMANN, et al., 1996) ou na separação física dos primers no

interior do tubo de reação (ABATH et al., 2002; BERG et al., 2001). A utilização de

temperaturas de anelamento diferentes na N-PCRTbU pode acarretar a amplificação de


segmentos inespecíficos que podem confundir o diagnóstico, além de requererem confecção

de primers especiais. A alternativa de separação física dos primers utilizada por Berg e col

(2001), baseia-se na separação dos mesmos por uma barreira de óleo de silicone no interior do

tubo, porém essa barreira pode ser rompida por trepidações do termociclador ou mesmo da

bancada onde está instalado misturando os primers e possibilitando competição entre eles.

No nosso trabalho, foi otimizada para o diagnóstico da peste, a técnica N-PCRTbU

que se baseia na separação física dos primers pela imobilização dos primers internos na tampa

do microtubo (ABATH et al., 2002)

Outro requisito importante na NPCRTbU é a utilização completa dos primers externos

na primeira fase de amplificação para evitar competição pelo alvo com os primers internos na

segunda fase de amplificação. No presente estudo, a concentração adequada dos primers

externos foi determinada através de ensaios com diferentes concentrações desses primers

tendo sido determinada a proporção de 2 pmol de primer externo e 20 pmol de primer interno.

A estabilidade dos primers internos pré-fixados na face interna dos microtubos

contribui para aumentar a rapidez da técnica. A etapa de fixação requer pelo menos 40

minutos, mas em vista da estabilidade dos primers pré-fixados a temperatura ambiente (Abath

e col 2002) ou pelo menos por três meses a –20ºC como mostrado no presente trabalho os

tubos poderão ser preparados previamente e armazenados para uso quando necessário.

Nos ensaios com as suspensões bacterianas só houve amplificação pela PCR em

suspensões com 2000 UFC, a N-PCRTbU amplificou a partir de 20 UFC e a N-PCR a partir

de duas UFC. Considerando-se que ao morrer um roedor susceptível pode apresentar >106

bactérias/ml de sangue (BUTLER, 1983) o número no material dos roedores é superior ao

mínimo detectado pela N-PCR e N-PCRTbU no presente trabalho.

A partir do DNA total da cepa de peste, o limiar de detecção da N- PCRTbU (10pg)

foi inferior ao do N-PCR (1pg) porém superior ao da PCR (100pg).

Embora não tenha apresentado maior sensibilidade nos ensaios com DNA total ou com

as suspensões bacterianas, nas análises com material de camundongos realizadas a fresco ou

após conservação no meio de Cary-Blair a N-PCRTbU teve desempenho semelhante ao da N-

PCR com a vantagem de que confere maior segurança contra contaminações em relação ao N-

PCR por não ser necessário a abertura do microtubo entre as duas etapas de amplificação.

A eficácia das técnicas N-PCR e N-PCRTbU foi superior a da PCR que só foi capaz

de detectar o bacilo da peste em 50% das amostras quer os ensaios tenham sido realizados a

fresco ou após conservação. Essas técnicas mostraram-se mais eficazes para detecção da Y.

pestis mesmo nas amostras multicontaminadas.


Convém salientar que na rotina das atividades de vigilância da peste o prazo entre a

coleta das amostras dos roedores, transporte para os laboratórios de diagnósticos e análises, é

de cerca de três semanas ou até mais. No caso dos pacientes humanos ou na vigência de

epizootias este período é mais reduzido. No presente trabalho as amostras foram conservadas

no Cary-Blair por 11 meses o que não é usual nos procedimentos de rotina.

Apesar da alta homologia genética da Y. pestis com a Y. pseudotuberculosis (90%) e

com a Y. enterocolitica (48%) (Bercovier et al., 1980) os primers foram desenhados para

amplificar regiões específicas da Y. pestis que não tem homologia com as outras duas

espécies. Não houve amplificação a partir do DNA dessas espécies e também não houve

amplificação nas reações com os baços dos camundongos não infectados comprovando a

especificidade da técnica.

Conclui-se que o N-PCRTbU constitui uma boa ferramenta para as atividades de vigilância

epidemiológica da peste, pois permite o diagnóstico em situações em que os procedimentos

clássicos poderiam ter o desempenho prejudicado, reduzindo-se a possibilidade de resultados

falso-negativos, e por conseguinte, evitando-se os transtornos médico-sociais decorrentes da

detecção tardia de casos de peste.

A imobilização dos primers internos na face interna da tampa do microtubo dispensa a

abertura dos mesmos o que reduz a possibilidade de resultados falso-positivos pela

contaminação durante a manipulação dos amplicons obtidos na primeira reação. Além da

sensibilidade e especificidade a N-PCRTbU confere maior segurança contra contaminações

em relação ao N-PCR por não ser necessário a abertura do microtubo entre as duas etapas de

amplificação e como os resultados podem ser obtidos rapidamente, em menos de 24 horas, a

N-PCRTbU poderá ser mais uma opção em situações emergenciais nas quais a rapidez no

diagnóstico é fundamental para adoção de medidas imediatas de controle.

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Anexos


Anexo

ARTIGO

AVALIAÇÃO DA TÉCNICA NESTED-PCR EM TUBO ÚNICO NO DIAGNÓSTICO

DA PESTE

G. T. de Souza, N. C. Leal, F. G. C. Abath e A. M. P. de Almeida

Departamento de Microbiologia, Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães – FIOCRUZ/MS,

Recife (PE), Brasil

Manuscrito a ser submetido para publicação na revista

Letters in Applied Microbiology


AVALIAÇÃO DA TÉCNICA NESTED-PCR EM TUBO ÚNICO NO DIAGNÓSTICO

DA PESTE

G.T. de Souza, N.C. Leal, F. G. C. Abath e A.M.P. de Almeida

Departamento de Microbiologia, Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães - FIOCRUZ/MS,

Recife, PE, Brasil

___________________________________________________________________

RESUMO

G.T. de Souza, F. G. C. Abath, N.C. Leal e A.M.P. de Almeida

Objetivos: Avaliar a técnica N-PCRTbU para aplicação no diagnóstico da peste.

Métodos e Resultados: Foram realizados ensaios com a cepa Y. pestis P. PB 881 e dois

pares de primers dirigidos ao gene estrutural (caf1) do antígeno F1 da Y. pestis: um par

com homologia a uma região mais externa do gene (primers externos) e outro com

homologia a uma região mais interna (primers internos). Os primers internos foram

imobilizados na face interna da tampa do microtubo e depois da primeira amplificação

foram adicionados ao produto da reação pela simples inversão dos tubos. A N-PCRTbU

foi capaz de detectar 10pg de DNA e 20 bactérias viáveis. Nas análises de vísceras de

camundongos infectados, realizadas a fresco ou após conservação no meio de Cary-Blair,

o segmento de tamanho esperado (460pb) foi amplificado por N-PCRTbU em todas as

amostras mesmo nas que se revelaram multicontaminadas. Não houve amplificação nos

ensaios com DNA de outras espécies do gênero Yersinia e com amostras de baço de

camundongos não infectados.

Conclusão, Significância e Impacto dos Resultados: A N-PCRTbU mostrou-se eficaz

para identificação da Y. pestis em amostras multicontaminadas. A imobilização dos

primers internos na face interna da tampa do microtubo dispensa a abertura dos mesmos o

que reduz a possibilidade de resultados falso-positivos pela contaminação durante a

manipulação dos amplicons obtidos na primeira reação. Além da sensibilidade e

especificidade, como os resultados podem ser obtidos em menos de 24 horas, a N-

PCRTbU poderá ser mais uma opção em situações emergenciais nas quais a rapidez no


___________________________________________________________________

Palavras chave: diagnóstico, N-PCRTbU, peste, Y. pestis


Introdução

A peste (infecção pela Yersinia pestis) é uma zoonose bacteriana primordialmente dos

roedores transmitida pelas pulgas, que pode atingir o homem e outros mamíferos (Gage and

Kosoy, 2004). Nos últimos anos o número de casos humanos vem aumentando mundialmente,

levando a Organização Mundial de Saúde (OMS) a enquadrar a peste entre as doenças

reemergentes (Higgins, 2004). No Brasil, onde nenhum caso humano havia sido confirmado

laboratorialmente desde 1997 (Aragão et al, 2002), um novo caso foi registrado recentemente,

em fevereiro de 2005, no Estado do Ceará. Além disso, os resultados dos inquéritos

sorológicos nos focos têm detectado a presença de anticorpos antipestosos entre os animais

sentinela comprovando a circulação da Y. pestis nessas áreas.

A peste é uma doença de notificação obrigatória internacional e deve permanecer sob

vigilância constante. Isto implica na disponibilidade de métodos rápidos e eficientes de

diagnóstico nos diversos tipos e condições das amostras coletadas para exames. O diagnóstico

de certeza para a peste é o isolamento da Y. pestis por cultivo que pode ser realizado a partir

de amostras de sangue, aspirado de bubão, esputo, medula óssea (peste humana), sangue,

vísceras (baço, fígado, pulmão), ossos de roedores e pulgas. Além de demandar vários dias o

cultivo e isolamento da bactéria podem ser prejudicados pela contaminação das amostras ou

pela morte das bactérias nos procedimentos usados para a conservação e transporte das

amostras dos locais de coleta para os laboratórios de diagnóstico. O Serviço de Referência em

Peste (SRP) do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães (CPqAM) vem desenvolvendo e

avaliando métodos alternativos de diagnóstico para aplicação na metodologia do programa de

vigilância da peste.

Vários métodos moleculares como a PCR e Nested-PCR (N-PCR) têm sido propostos

para o diagnóstico da peste (Campbel et al. 1993; Engelthaler et al. 1999; Leal et al. 1996;

Leal and Almeida 1999). O N-PCR é útil quando se deseja melhorar a sensibilidade da PCR; é

um procedimento realizado em duas etapas de amplificação: na primeira é utilizado um par de

primer com homologia a uma região mais externa ao alvo, posteriormente, os amplicons

gerados na primeira reação servem como molde para a segunda etapa que utiliza primers

dirigidos a uma região mais interna ao primeiro produto. Apesar da N-PCR ser mais sensível

em relação a PCR, existe risco de contaminação durante a transferência dos amplicons da

primeira reação para a segunda etapa de amplificação podendo gerar resultados falso-

positivos. Para minimizar este risco, Abath et al. (2002) desenvolveram uma técnica de N-

PCR em um só tubo (N-PCRTbU), na qual os primers internos são imobilizados na face


interna da tampa do microtubo e depois da primeira amplificação são adicionados ao produto

da reação pela simples inversão dos tubos dispensando a abertura dos mesmos.

No presente trabalho foram realizados ensaios para otimização da N-PCRTbU para

aplicação no diagnóstico da peste.

MATERIAIS E MÉTODOS

Bactérias e condições de cultivo

Foi utilizada a cepa Y. pestis P. PB 881 da bacterioteca do Departamento de Microbiologia do

CPqAM (Almeida et al 1989). Para os trabalhos, a cepa foi reativada por semeio em brain

heart infusion broth (BHI, Difco), incubada a 28ºC por 48 horas e em seguida plaqueada em

blood agar base (BAB, Difco). Após reativação, a cepa foi testada quanto a sensibilidade ao

fago antipestoso (Karimi, 1974) e analisada quanto ao conteúdo plasmidial (Leal et al, 1996).

Também foi utilizado o DNA total das cepas Y. pestis P. CE 882, Y.

pseudotuberculosis IP 32450e Y. enterocolitica 25C.

Extração do DNA genômico

Um mililitro da cultura em BHI foi centrifugado a 12.000rpm a 4ºC, o sobrenadante foi

descartado, o sedimento suspenso em 500µl de TE e novamente centrifugado. O sobrenadante

foi desprezado, o precipitado homogeneizado com 500µl de TE, 10µl de lisozima (10mg/ml)

e 10µl de proteinase K (5mg/ml). A suspensão foi incubada a 60ºC por 20 minutos seguido da

adição de 100µl de STE (SDS 2,5%, Tris-HCl 10nM pH8,0; EDTA 0,25M), 15 minutos de

incubação a 60ºC, 5 minutos a temperatura ambiente e 5 minutos em banho de gelo. A

suspensão foi neutralizada com 130 µl de acetato de amônio 7,5M, mantida no banho de gelo

por mais 15 minutos e depois centrifugada por 5 minutos. Aproximadamente 700µl de

sobrenadante foi transferido para outro tubo, adicionado o mesmo volume de fenol-

clorofórmio-álcool isoamílico (25:24:1) e centrifugado por 5 minutos. O sobrenadante foi

transferido para outro tubo e o DNA precipitado com aproximadamente 420µl de isopropanol

a -70ºC por 30 minutos ou a -20 por 24 horas seguido de centrifugação e descarte do

sobrenadante. O precipitado foi ressuspenso em 10µl de solução de RNAse (10mg/ml) e

conservado a -20ºC.

A qualidade do DNA obtido foi avaliada através de eletroforese em gel de agarose a

0,6% em tampão TBE (Tris-borato 0,089; ácido bórico 0,089M; EDTA 0,002M), a 100V e

visualização sob luz UV após coloração em solução de brometo de etídio (15mg/ml) e a

quantificação foi realizada em espectofotômetro (Eppendorf).


Procedimentos com animais

Sete camundongos albinos “Swiss Webster” obtidos no Biotério Central do CPqAM foram

inoculados por via subcutânea com 0,2 ml de suspensão bacteriana da cepa Y. pestis P. PB

881 em salina estéril (cerca de 2x105 células bacterianas). Os animais foram mantidos em sala

climatizada com água e ração (Nuvital), supervisionados diariamente, e após a morte, foram

necropsiados para coleta de amostras para as análises. Fragmentos de vísceras (baço, fígado,

pulmão, coração) de um animal foram introduzidos no meio de conservação e transporte de

(Cary and Blair, 1964) e mantidos a temperatura ambiente para análises posteriores,

paralelamente foram submetidos à cultura para confirmação da presença da Y. pestis. Baços

de seis animais foram analisados logo após a coleta (a fresco).

Para análises, as amostras foram trituradas e suspensas em salina estéril, centrifugadas

e os sobrenadantes submetidos a um processo de purificação parcial para neutralização dos

inibidores da reação de PCR segundo protocolo descrito em Leal e Almeida (1999) baseado

em Mahbubani e Bej (1994): 500µl de cada amostra (triturado de vísceras a fresco ou em

Cary-Blair) foi centrifugado, o sedimento lavado em 1000µl de TE (Tris-HCl 10mM; EDTA

1mM) pH 8,0 e centrifugado. O sedimento foi ressuspenso em 100 µl de tampão K (KCl

50mM; Tris-HCL 20mM pH 8,3; MgCl 2,5mM), a mistura foi incubada a 55ºC por 1 hora,

em seguida a 95ºC por 10 minutos e congelada uma vez. Dez microlitros de cada amostra

processada foram utilizados nas reações de PCR, N-PCR e N-PCRTbU.

Uma alíquota dos sobrenadantes foi plaqueada em BAB para confirmação da presença

da Y. pestis.

Avaliação do limiar de detecção das técnicas PCR, N-PCR e N-PCRTbU

O DNA da cepa de peste foi diluído em água deionizada estéril nas concentrações de 0.5ng,

50pg, 5pg, 500fg, 50fg e 5 fg/µl e 2µl de cada diluição foram utilizados nas reações,

correspondendo a 1ng, 100pg, 10pg, 1pg, 100fg e 10fg de DNA.

Foram feitas diluições seriadas (1:10) em salina até 10 –8 a partir de uma cultura em

BHI da cepa de peste, 100µl das diluições 10-4 a 10-8 foram plaqueadas para contagem das

Unidades Formadoras de Colônia (UFC) e o restante submetido à fervura por 10 minutos para

lise bacteriana. Dez microlitros das diluições 10-4 a 10-8 fervidas foram utilizados diretamente

nas reações de PCR, N-PCR e N-PCRTbU.


Primers

Para amplificação do gene caf1 (Galyov et al. 1990) foram utilizados dois pares de primers:

Primers externos: 5’-CAG TTC CGT TAT CGC CAT TGC 3’ e 5’ TAT TGG TTA GAT

ACG GTT ACG GT-3’ (Norkina et al. 1994) e Primers internos: 5’-TTG GAA CTA TTG

CAA CTG CTA 3’ e 5’ TTA GAT ACG GTT ACG GTT A-3’ (Leal et al. 1996).

Vinte picomoles de cada primer (externos e internos) foram testados individualmente

por PCR utilizando 20ng de DNA da cepa de peste e posteriormente por N-PCR.

Para as reações de N-PCRTbU, o par de primer interno foi aplicado na face interna dos

microtubos juntamente com traços do corante azul de bromofenol adicionado para facilitar a

visualização após fixação. Os tubos foram mantidos abertos em cabine de segurança biológica

por aproximadamente 40 minutos para fixação dos primers por evaporação do diluente e

depois fechados e guardados a –20ºC até o momento do uso.

PCR e N-PCR

As reações de PCR foram realizadas num volume total de 25µl por tubo, contendo: 2µl das

diluições do DNA total, 10µl das suspensões bacterianas ou 10µl das amostras processadas;

Tris-HCL 10mM pH 8,0; KCl 50mM; MgCl2 1,5 mM; 20 pmoles de primers; 1U da enzima

Taq DNA polimerase (Amersham Bioscience); dNTP’s: dATP, dCTP, dGTP e dTTP 200µM.

Em cada ensaio foi incluído um controle negativo (mistura de reação, sem DNA molde) e um

controle positivo (20 ng de DNA total da cepa Y. pestis P. PB 881).

As amplificações foram realizadas em termociclador (Biometra Trio Thermoblock)

programado para 30 ciclos de 1 minuto a 92ºC, 1 minuto a 55ºC e 1 minuto a 72ºC seguido

por 7 minutos a 72ºC na primeira etapa de amplificação.

A Nested-PCR foi realizada com 2 µl do produto das reações de PCR e 20pmol do

primer interno nas condições descritas.

Os produtos das amplificações foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1%

como descrito. O tamanho dos segmentos amplificados foi determinado por comparação com

o marcador “100 pb DNA ladder” (Amersham).

N-PCRTbU

Foram realizados ensaios para determinar as concentrações de dNTP, MgCl2 e Taq DNA

polimerase e com diferentes proporções entre primers externos e internos. Melhores

resultados foram obtidos com 2 pmoles de primer externo e 20 pmoles de primer interno

(1:10) e foi adotada para continuação dos trabalhos.


As reações foram realizadas num volume total de 50µl contendo: 2µl das diluições do

DNA total, 10µl das suspensões bacterianas ou 10µl das amostras processadas; Tris-HCL

20mM pH 8,0; KCl 100mM; MgCl 3mM; 2 U da enzima Taq DNA polimerase; dNTP’s:

dATP, dCTP, dGTP e dTTP 400µM e 2 pmoles de primer externo.

As amplificações foram realizadas em termociclador (Biometra trio thermoblock). A

primeira etapa de amplificação consistiu de 15 ciclos compostos de 1 minuto a 90ºC, 1 minuto

a 55ºC e 1 minuto a 72ºC. Após a primeira etapa os tubos foram aquecidos a 90ºC por cerca

de dois minutos e em seguida invertidos várias vezes para diluição do primer fixado na tampa

do microtubo, na mistura de reação. Os tubos foram brevemente centrifugados e submetidos à

segunda amplificação composta por 45 ciclos de 1 minuto a 90ºC, 1 minuto a 55ºC e 1 minuto

a 72ºC seguidos de 7 minutos a 72ºC para extensão final.Os produtos das amplificações foram

analisados por eletroforese como descrito.

Ensaios com DNA de uma cepa de Y. pseudotuberculosis (IP 32450) e Y.

enterocolitica (25C) e triturados de baços de camundongos não infectados foram conduzidos

nas mesmas condições empregadas para Y. pestis.

RESULTADOS

Limiar de detecção a partir de DNA total e das diluições bacterianas

Nas reações usando como molde o DNA extraído da cepa de peste houve amplificação até

100pg para PCR, 1pg para N-PCR e 10 pg para N-PCRTbU (tabela 1).

O mínimo de bactérias viáveis detectadas pela N-PCR foram 2 UFC, 20 UFC por N-

PCRTbU e 2000 UFC pela PCR (tabela 1).

Análise de vísceras de camundongos realizadas a fresco ou após conservação no meio de

Cary-Blair

Das quatro amostras (baço, fígado, pulmão, coração) plaqueadas em gelose peptonada após

conservação por 11 meses no meio de Cary-Blair, duas apresentaram crescimento puro da Y.

pestis e duas foram invadidas por crescimento de bactérias e fungos contaminantes. Em uma

das culturas contaminadas havia colônias características de Y. pestis confirmadas pelo teste

com o bacteriófago e na outra o crescimento dos contaminantes foi intenso inviabilizando o

teste com o fago sendo considerada negativa. Houve amplificação dos segmentos esperados

por N-PCR e N-PCRTbU nas quatro amostras independente da presença de contaminantes nas

culturas. Nos ensaios por PCR houve amplificação apenas nas duas amostras que produziram

culturas puras (tabela 2).


Das culturas dos baços dos seis animais inoculados com a cepa Y. pestis P. PB 881,

apenas uma foi positiva por cultura pura, as demais foram positivas, mas foram obtidas

culturas mistas com crescimento de contaminantes. Em todas houve amplificação do

segmento esperado por N-PCR e N-PCRTbU e em apenas três por PCR (tabela 2).

Não houve amplificação com os baços dos camundongos normais, não inoculados

(tabela 2).

Teste de especificidade do N-PCRTbU

Não houve amplificação a partir do DNA total das cepas Y. pseudotuberculosis IP

32450e Y. enterocolitica Ye25C, nem das amostras de baços de camundongos normais (não

inoculados).

DISCUSSÃO

No Brasil a maioria dos casos humanos e as epizootias pestosas ocorrem em áreas

remotas e afetam comunidades com condições sanitárias e de comunicação precárias, longe

dos laboratórios de diagnóstico. Os procedimentos usados na conservação e transporte das

amostras coletadas para exames nos laboratórios podem acarretar a contaminação das

amostras e a morte dos bacilos de peste levando a resultados falso-negativos.

Técnicas moleculares apresentam a vantagem de dispensar o cultivo das amostras e

são exeqüíveis mesmo quando as bactérias estão inviáveis. Diversos protocolos baseados na

PCR têm sido desenvolvidos para diagnóstico da peste em material clínico ou animal (Chu,

2000; Engelthaler et al, 1999; Rahalison et al, 2000; Leal et al 1996; Leal & Almeida (1999).

A N-PCR embora mais sensível que a PCR convencional tem como inconveniente a

possibilidade de contaminação cruzada no momento de transferência dos amplicons da

primeira para a segunda etapa de amplificação. Para minimizar o risco de contaminações na

N-PCR têm sido propostas técnicas realizadas em um único tubo. Nelas, é importante a

utilização de estratégias que evitem a competição entre os dois pares de primers pelo alvo.

Para evitar esta competição, algumas propostas são baseadas na utilização de primers que

atuem em temperaturas diferentes (Gookin et al., 2002; Herrmann, et al., 1996) ou na

separação física dos primers no interior do tubo de reação (Abath et al., 2002; Berg et al.,

2001). A utilização de temperaturas de anelamento diferentes na N-PCRTbU pode acarretar a

amplificação de segmentos inespecíificos que podem confundir o diagnóstico, além de

requererem confecção de primers especiais. A alternativa de separação física dos primers


utilizada por Berg et al (2001), baseia-se na separação dos mesmos por uma barreira de óleo

de silicone no interior do tubo, porém essa barreira pode ser rompida por trepidações do

termociclador ou mesmo da bancada onde está instalado misturando os primers e

possibilitando competição entre eles. Neste trabalho, foi otimizada para o diagnóstico da

peste, a técnica N-PCRTbU que se baseia na separação física dos primers pela imobilização

dos primers internos na tampa do microtubo (Abath et al 2002).

Outro requisito importante na NPCRTbU é a utilização completa dos primers externos

na primeira fase de amplificação para evitar competição pelo alvo com os primers internos na

segunda fase de amplificação. No presente estudo a concentração adequada dos primers

externos foi determinada através de ensaios com diferentes concentrações desses primers

tendo sido determinada a proporção de 2 pmol de primer externo e 20 de primer interno.

A estabilidade dos primers internos pré-fixados na face interna dos microtubos

contribui para aumentar a rapidez da técnica. A etapa de fixação requer pelo menos 40

minutos, mas em vista da estabilidade dos primers pré-fixados a temperatura ambiente (Abath

et al 2002) ou pelo menos por três meses a –20ºC como mostrado no presente trabalho os

tubos poderão ser preparados previamente e armazenados para uso quando necessário.

Nos ensaios com as suspensões bacterianas só houve amplificação pela PCR em

suspensões com mais de 2000 UFC, a N-PCRTbU amplificou a partir de 20 UFC e a N-PCR a

partir de duas UFC. Considerando-se que ao morrer um roedor susceptível pode apresentar

>106 bactérias/ml de sangue o número no material dos roedores é superior ao mínimo

detectado pela N-PCR e N-PCRTbU neste trabalho. A partir do DNA total da cepa de peste, o

limiar de detecção da N- PCRTbU (10pg) foi inferior ao do N-PCR (1pg) porém superior ao

da PCR (100pg).

Embora não tenha apresentado maior sensibilidade nos ensaios com DNA total ou com

as suspensões bacterianas, nas análises com material de camundongos realizadas a fresco ou

após conservação no meio de Cary-Blair a N-PCRTbU teve desempenho semelhante ao da N-

PCR com a vantagem de que confere maior segurança contra contaminações em relação ao N-

PCR por não ser necessário a abertura do microtubo entre as duas etapas de amplificação.

A eficácia das técnicas N-PCR e N-PCRTbU foi superior a da PCR que só foi capaz

de detectar o bacilo da peste em 50% das amostras quer os ensaios tenham sido realizados a

fresco ou após conservação. Essas técnicas mostraram-se eficazes para detecção da Y. pestis

mesmo em amostras multicontaminadas.

Convém salientar que na rotina das atividades de vigilância da peste o prazo entre a

coleta das amostras dos roedores, transporte para os laboratórios de diagnóstico e as análises


duram cerca de três semanas ou até mais. No caso dos pacientes humanos ou na vigência de

epizootias este período é mais reduzido. No presente trabalho as amostras foram conservadas

no Cary-Blair por 11 meses o que não é usual nos procedimentos de rotina.

Apesar da alta homologia genética da Y. pestis com a Y. pseudotuberculosis (90%) e

com a Y. enterocolitica (48%) (Bercovier et al., 1980) os primers foram desenhados para

amplificar regiões específicas da Y. pestis que não tem homologia com as outra duas espécies.

Não houve amplificação a partir do DNA dessas espécies e também não houve amplificação

nas reações com os baços dos camundongos não infectados comprovando a especificidade da

técnica.

Conclui-se que o N-PCRTbU constitui uma boa ferramenta para as atividades de vigilância

epidemiológica da peste, pois permite o diagnóstico em situações em que os procedimentos

clássicos poderiam ter o desempenho prejudicado, reduzindo-se a possibilidade de resultados

falso-negativos, e por conseguinte, evitando-se os transtornos médico-sociais decorrentes da

detecção tardia de casos de peste.

A imobilização dos primers internos na face interna da tampa do microtubo dispensa a

abertura dos mesmos o que reduz a possibilidade de resultados falso-positivos pela

contaminação durante a manipulação dos amplicons obtidos na primeira reação. Além da

sensibilidade e especificidade a N-PCRTbU confere maior segurança contra contaminações

em relação ao N-PCR por não ser necessário a abertura do microtubo entre as duas etapas de

amplificação e como os resultados podem ser obtidos rapidamente, em menos de 24 horas, a

N-PCRTbU poderá ser mais uma opção em situações emergenciais nas quais a rapidez no


AGRADECIMENTOS

Agradecemos a Yara Nakazawa, Silvana Santos, Fabio Melo e a Roberto Werkhauser,

pelo apoio e ajuda técnica no presente trabalho.


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Tabela 1 Comparação do limiar de detecção das técnicas PCR, N-PCR e N-

PCRTbU a partir de DNA total e UFC da cepa Y. pestis P. PB 881.

PCR N-PCR N-PCRTbU

UFC >2 x 102 2 x 101 2 x 102

DNA 100pg 1pg 10pg

UFC: Unidades Formadoras de Colônia pg: picogramas

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Tabela 2 Análises em material de camundongos infectados experimentalmente com a cepa Y. pestis P. PB 881 realizadas a fresco e

após conservação em Cary-Blair

Amostra Cultura Fago PCR N-PCR N-PCRTbU

Baço Multicontaminada + - + +

Fígado Multicontaminada Não realizado - + +

Pulmão Pura + + + +

Amostras conservadas no

meio Cary-Blair

Coração Pura + + + +

Multicontaminada + - + +

Multicontaminada + + + +


Multicontaminada + - + +


Baços analisados a fresco

Pura + - + +

Multicontaminada - - - - Baços de animais não

infectados Sem Crescimento Não realizado - - -

avaliação da técnica nested-pcrtbu para aplicação no ...muito obrigada ao serviço de...

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