avaliação da imunidade humoral em crianças com asma ... · a asma é considerada uma das mais...

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Programa de Pós-Graduação em Farmácia

Área de Análises Clínicas

Avaliação da imunidade humoral em crianças com asma

moderada e grave

Fabiana Ghilardi

Dissertação para obtenção do grau de MESTRE

Orientadora: Prafa. Ora. Magda Maria Sales Carneiro-Sampaio

São Paulo 2007

/ 8_81/2

D'EDALUS - Acervo - CQ

11~lr~~ill~IIIIIIIII~III'f~'II!lllllr i .

30100012728

Fichn Catnlográfica Elaborada pela Divisão de Biblioteca e

Documentação do Conjunto das Quím icas da USP

Ghilardi, Fab ia na G4 24a Avaliação da imunidad e hUllloral

moderada e grave / Fabiana G h ila rdi. 75p .

em cr ianças com as m a São Paulo , 200ó.

Dissertação (mestrado) - Fac ul dade de Ciências Farmacê uticas da Univers id ade de São Paulo . Dep artam ento de Aná li ses C líni cas e Toxico lógicas.

Orientador : Carnei ro-Sa mp a io , Magda Maria Sales

I. fmun ocliagnóst ico : Medicin a 2. Imun o log i a 3. Asma I. T. lI. Ca; ne iro-Sampaio, Magda Maria Sales, orientador.

Ó 16.075ó-9 CDD

Fabiana Ghilardi

Avaliação da imunidade humoral em crianças com asma moderada e grave

Comissão Julgadora da

Dissertação para obtenção do grau de Mestre

Profa. Dra. Magda Maria Sales Carneiro-Sampaio orientadora/presidente

Prof. Dr. Dewton de Moraes Vasconcelos 1°. examinador

Prof. Dr. Dirceu Solé 2°. examinador

São Paulo, 10 de abril de 2007.

Trabalho realizado no Laboratório de Imunologia de Mucosas do

Departamento de Imunologia, Instituto de Ciências Biomédicas

da Universidade de São Paulo e Disciplina de Alergia,

Imunologia Clínica e Reumatologia do Departamento de

Pediatria - UNIFESP - EPM.

o suporte financeiro para realização deste estudo foi concedido pela Fundação

Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP

(processo nO 02/05880-4)

((:Nat!a na vida deve ser temiáo, somente

compreenáiáo . .JLgora é /iora de compreender

mais para temer menos ... ".

?darie Curie

fls minlias irmãs, fláriana e CRpsana, caáa

uma ao seu jeito, estão sempre ao meu faáo,

participanáo constantemente áas minlias

vitórias e afegrias.

flos meus pais, Çiino e :Maria lnez que me

áeram a viáa; me ensinaram a vivê-fa com

áigniáaáe, lionestiáaáe e muito amor,

meu eterno o6rigaáa.

jf.os meus avós,

CJ<g,u{ e jf.nna (eternas sautfadés), que com

amor e dédicação foram um e~mpCo

dé vúfa pessoa[

Ji minlia avó ~sa peCo carinfio, e

por estar sempre ao meu Cado.

jf.os meus so6rinfios, qiovanna,

quiDienne, (j3eattiz e Vitória,

aCegria constante em minlia vúfa.

jf.o Pá6io por todo carinfio,

comparti{fiando sempre dé minlias

conquistas.

)Í (profa. c])ra. :M.agáa:M.. S. Carneiro-Sampaio peCa

orientação, deâuação e oportuniáaáe ofereciáa para a

reafização deste tra6aClio.

)Í (j)ra. epatricia epaCmeira, por sua

orientação, eJ(periência profosiona~ áeâuação

e ajuáa nos momentos que mais precisei,

o6rigaáa por tuáo.

}fgraáecimentos

Jl CDra. CBeatriz fl'avares Costa-CarvaClio} peCa e~eriência profissionaC

compartiCliada} constante coCa60ração com ótimas sugestões e por ter

permitido a coCeta de amostras na CDiscipCina de )tCergia} ImunoCogia

CCínica e ~umatoCogia do CDepartamento de <Pediatria - V:J{IPPS<P -

p'<P:M.

)tos professores CDr. Luiz Vicente (jlj6eiro áa SiCva PiClio e CDra. SoCange

CBarros Car60nare peCas sugestões e peCa disponi6iCiáade em participar áo

eJ(ame de quaCificação.

Jl amiga Cliristina )trsCanian 1(u60 peCa grande ajuáa nos testes

e~erimentais e peCa sa6edoria) força} carinlio e amizaáe que tanto me

enriquecem pessoaCmente.

Jl amiga ÇerCânáia :J{eres <Pontes} sempre disposta a ajudar e incentivar

nos momentos que mais precisei} 06rigaáa por tuáo.

Jl amiga CDora Lisa PrieáCander CDeC :J{ero peCa coCa60ração constante}

incentivo e a Ceg ria.

Jl amiga P,Caine Cristina Caráoso peCa ajuáa e companliia nas eternas

lioras que passei no Ca6oratório.

)ts amigas CJ{osana ~zenáe áe OCiveira} Simone Corrêa áa SiCva} :Mariana

)tcenjo 1(miCiausfij.s} Ça6rieCa ComenaCe} SiCvana Luccliin~ CDenise

)tmazonas} )tna Lucia SiCveira Lessa :Marques} 1(ristine PaliC e Leuridan

fl'orres peCo incentivo} aCegria e coCa60ração constante.

)lo CRrof ([)r. )lntônio Conáino 1Veto pera ajuáa e apoio ao {ongo áa

reaCização áeste tra6a{lio.

)los amigos Josias CJ3rito Prazão, Otávio Ca6ra{ :Marques, JuCiana

:Moreira, CRatrícia :Maccliiaverni, CRau{o Vitor Soeiro, Wa{mir Cutrim

)lragão Pi{lio, e aos outros coCegas áa pós-graáuação peCo carinlio e amizaáe.

A enfermeira Socorro ([)amasceno :Monteiro peras co{etas áe sangue e

vacinação áas crianças asmáticas.

)los funcionários áa ([)iscipCina áe )I {e rg ia, Imuno{ogia CCínica e

<R.fumato{ogia áo ([)epartamento áe CReáiatria - V1VIPPSCR - P,CR:M P,{aine

([)amasceno e José P,áuaráo Pernanáes peCo au:{.íCio nas co{etas áe sangue.

As crianças asmáticas e seus responsáveis que prontamente se áispuseram a

participar áesse estuáo.

)I José ([)ermiva{ Vi{anova, pera manutenção áo {a60ratório.

As funcionárias áa Secretária áo ([)epartamento áe )lnáCises C{ínicas e

q'o:(ico{ógicas, jlna :Maria ([)ias ([)antas, P,ána CJ3atista Lima, Sue{i

CRroviáe{o e :Maria )lu:{.iCiaáora áe Lima peCo carinlio, empenlio e

áeáicação.

)los funcionários áa CRós (}raáuação áa Pacu{áaáe áe Ciências

Parmacêuticas Jorge )I {ves áe Lima e P,{aine :Miáori <Ysliico.

)los funcionários áo La60ratório Centrar áa V1VIPP,SCR, )lna P{ávia áe

Camargo áa q'orre PéCi:{. e ([)anie{ Carneiro Carva{lio pera ajuáa na

reaCização áas anáCises.

A CJWsana CRrisco áo Serviço áe P.statística áo ICCJ3 áa VSCR pera era60ração áa

estatística e peCo envo{vimento com meu tra6a(fio.

jIos méâuos e funcionários áo am6uÚltório áa CDiscipfina dê jI{ergia, Imuno{ogia

CCínica e ~umato{ogia áo CDepartamento áe (]!eáiatria - V1VIPP,s(]! -

p,eP?d.

fi ?dônica ~zenáe áo Centro áe Vftra-sonograjia e c.Rfláio{ogia, peCo

carinlio, apoio e au~ífio prestaáo tanto no âm6ito projissiona{ quanto

pessoaL

jI toáos aqueCes que tornaram este tra6a{lio possíveL

Resumo

Resumo

A asma é considerada uma das mais importantes doenças crônicas na infância,

devido a sua alta incidência e ao aumento na morbidade observada nos últimos anos.

Diversas anormalidades imunológicas têm sido descritas em pacientes com asma,

incluindo hipogamaglobulinemia e deficiência de subclasses de IgG. O objetivo deste

trabalho foi avaliar a imunidade humoral representada pelos níveis séricos totais de

imunoglobulinas, subclasses de IgG e níveis salivares de IgA e a imunidade específica

representada pela resposta a antígenos ti mo-dependentes, antígenos timo

independentes tipo 1 e ti mo-independentes tipo 2 em crianças com asma brônquica

moderada e grave. Foram coletadas amostras de sangue pré e pós-imunização com a

vacina Pneumo23® e saliva de 50 crianças, com idades entre 4 e 12 anos. Foram

determinados os níveis séricos de IgG, IgA, IgM, IgE e subclasses de IgG (IgG2, IgG3 e

IgG4) por nefelometria. AlgA secretória determinada nas salivas, os anticorpos IgG

anti-toxóide tetânico, os anticorpos IgG e IgM anti-LPS 0111 e os níveis séricos de

anticorpos IgG pré e pós-vacinais anti-S. pneumoniae foram determinados por ensaio

imunoenzimático. Foram avaliados os níveis séricos de IgE específicos para

Dermatophagoides pteronyssinus, e o teste cutâneo para os alérgenos

Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides farinae e 8/omia tropica/is. Foram

observados níveis elevados de IgG total e das subclasses IgG2 e IgG3. Níveis altos de

IgG4 foram observados em 52% dos pacientes asmáticos, e deficiência de IgG4 em

apenas 8%. Os níveis séricos totais de IgM foram elevados em 24% dos pacientes, e

apenas um paciente apresentou resultado inferior ao valor de normalidade. Foi

detectada deficiência de IgA sérica associada a deficiência de IgA secretória em 1

paciente. Foram detectados elevados níveis totais de IgE sérica e de anticorpos IgE

anti-D. pteronyssinus (classes 4, 5 e 6). Testes cutâneos positivos para

Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides farinae e 8/omia tropica/ís foram

observados em 73% dos pacientes. Foram observados níveis séricos adequados de IgG

anti-toxóide tetânico em 76% das amostras e níveis normais de anticorpos IgG e IgM

anti-LPS 0111, sendo que apenas 6% das crianças apresentaram níveis elevados de

IgM, e 4% de IgG anti-LPS 0111. Apesar da maioria dos pacientes apresentarem boa

resposta de anticorpos anti-pneumococo, foram encontrados 2 pacientes com

deficiência de resposta de anticorpos para polissacarídeos. Em conclusão, foram

identificadas imunodeficiências bem caracterizadas em 3 crianças asmáticas, que

poderiam claramente levar a infecções, o que prioriza a importância da avaliação da

imunidade humoral.

Palavras chave: Asma, Imunodiagnóstico e Imunologia.

Abstract

Abstract

Asthma is considered to be one of the most important chranic diseases in

childhood, with respect to its high incidence, and the increasing morbidity observed in

the last years. Several abnormalities have been described in patients with asthma,

including hipogammaglobulinemia and IgG subclass deficiencies. The aim was to

evaluate the humoral immunity represented by total seric immunoglobulin leveis, IgG

subclasses and salivary IgA leveis and the specific immunity represented by the

response to thymus-dependent, thymus-independent type 1 and thymus-independent

type 2 antigens in children with persistent moderate and severe bronchial asthma.

Blood samples before and after immunization with Pneumo23® and saliva were

collected from 50 asthmatic children (4-12 years old). IgG, IgA, IgM, IgE and IgG

subclasses were analyzed by nephelometry. Secretory IgA, anti-tetanus IgG leveis, anti

LPS 0111 IgG and IgM leveis, and pre and post-immunization anti-pneumococcal IgG

antibodies were measured by immunoenzymatic assay. Anti-Dermatophagoides

pteronyssinus IgE leveis and Prick tests with Dermatophagoides pteronyssinus,

Dermatophagoides farinae, 8/omia tropica/is were also evaluated. Elevated leveis were

observed of total IgG, IgG2 and IgG3 subclasses. High IgG4 leveis were detected in

52% of the asthmatic patients, and IgG4 deficiency in 8%. High seric total IgM leveis

were founded in 24% of the patients, and only one presented IgM . levei bellow normal

age-matched contrais. Seric IgA deficiency associated with secretory IgA deficiency was

founded in one patient. Elevated seric IgE leveis and anti-D. pteronyssinus IgE

antibodies (classes 4, 5 and 6) were detected. Positive prick test to Dermatophagoides

pteronyssinus, Dermatophagoides farinae and 8/omia tropica/is were observed in 73%

of the patients. An adequate anti-tetanus toxoid antibody response was observed in

76% of the samples and normal anti-LPS 0111 IgG and IgM leveis, although 6% of the

children presented high anti-LPS 0111 IgM leveis, and 4% presented high anti-LPS

0111 IgG leveis. Although most of the patients showed a good anti-pneumococcal

response, two patients presented anti-polysaccharide antibody deficiency. In

conclusion, well-characterized immunodeficiencies were identified in three asthmatic

children, which could clearly lead to infections, emphasizing the importance of

evaluating the humoral immunity.

Key words: Asthma, Immunology and Immune Diagnosis.

Sumário

1. INTRODUÇÃO ................................................................................................. 01

2. OBJETIVO ....................................................................................................... 12

3. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................ 13

3.1 casuística ..................................................................................................... 13

3.1.1 Coleta das amostras ................................................................................ 15

3.2 Dosagem dos níveis totais de IgG, IgM, IgA, IgE e de subclassses de IgG 15

3.2.1 Dosagem dos níveis de IgA secretória ....................................................... 16

3.3 Radioallergosorbent test(RAST) ................................................................ 17

3.4 Teste cutâneo de leitura imediata por puntura .... .... ...... ... .......... ... ..... ... .... 18

3.5 Determinação dos níveis séricos de anticorpos IgG anti-toxóide tetânico 18

3.6 Determinação dos níveis séricos de anticorpos IgG e IgM anti .. LPS 0111. 19

3.7 Determinação dos níveis séricos de anticorpos IgG anti-streptococcus pneumoniae ................................................................................................... 21

3.8 Análise estatística ........................................................................................ 23

4. RESULTADOS ............................................................................... óó................. 24

4.1 Determinação de níveis séricos e secretores totais ................................... 24

4.2 Níveis séricos de anticorpos IgE anti-Dermatophagoides ptefõnyssinus . 33

4.3 Teste cutâneo de leiturta imediata por puntura ....................... ,................ 34

4.4 Níveis séricos de anticorpos IgG anti-toxóide tetânico ............................. 34

4.5 Níveis séricos de anticorpos IgG e IgM anti-LPS 0111............................. 35

4.6 Níveis séricos de anticorpos IgG anti-S. pneumoniae ................................ 36

5. DISCUSSÃO. ............... ..... ..... ........ ......... .... ... .................. ... ... .... ........... .... .... ... 39

6. CONCLUSÃO ................................................................................................... 51

7. REFERÊNCIAS ................................................................................................ 52

EL ............... ", .......................................... sa~ua6eaJ sop og5eJedaJd - AI oxauy

69 ............... ", ................................................ epu~JaJaJ ap saJoleA - III oxauy

L9 ............... ", .................................................. sop~lnsaJ ap elaqe.l- 11 oxauy

11-9 ............... ", ................................................................ o!Jl?uo!~sanõ - I oxauy

SOX3NY

Lista de figuras

Figura 1. Porcentagem das diferentes manifestações clínica$ infecciosas observadas nas 50 crianças com asma persistente moderada e grave.

Figura 2. Distribuição dos níveis séricos de IgG (mgjdl) em 50 pacientes com asma persistente moderada e grave.

Figura 3. Distribuição dos níveis séricos de IgM (mgjdl) em 50 pacientes com asma persistente moderada e grave.

Figura 4. Distribuição dos níveis séricos de IgA (mgjdl) em 50 pacientes com asma persistente moderada e grave.

Figura 5. Distribuição dos níveis sé ricos de IgG, IgA e IgM (mgjdl) em 50 pacientes com asma persistente moderada e grav€!o

Figura 6. Distribuição dos níveis séricos de IgE (Uljml) em 50 pacientes com asma persistente moderada e grave.

Figura 7. Distribuição dos níveis séricos de IgG2 (mgjdl) en'l 50 pacientes com asma persistente moderada e grave.



Figura 10. Distribuição dos níveis de IgA secretória (mgjl) avaliados em salivas de 50 pacientes com asma moderada e grâve.

Figura 11. Níveis de IgA sérica e secretória em amostras de sOro e saliva, respectivamente, de 50 pacientes com asma moderada e grave.

Figura 12. Níveis séricos de IgE anti-Dermatophagoides pteronyssinus (KUjl) em 50 pacientes com asma persistente moderada e grave.

Figura 13. Representação das faixas das concentrações de anticorpos IgG e IgM anti-LPS 0111 das 49 amostras de soros de crianças com asma persistente moderada e grave.

Figura 14. Níveis séricos de IgG anti-PS1, PS3, PS5, PS6B, PS9Ve PS14 (mgjl) em 48 pacientes com asma persistente moderada e grave.

25

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Lista de tabelas

Tabela 1. Análise descritiva das concentrações de imunoglobutinas séricas totais (mgjdl), de subclasses de IgG séricas totais (mgjdl) e de IgA secretória (mgjl) em 50 amostras de crianças com asma persistente moderada e grave.

Tabela 2. Análise estatística descritiva dos níveis de anticorpos IgM e IgG anti-LPS 0111, IgG anti-toxóide tetânico e IgE anti~D. pteronyssínus em amostras de soro de 50 crianças COm asma persistente moderada e grave.

25

36

Tabela 3. Níveis de anticorpos IgG (mgjl) pré e pós-vacinais réativos com os 37 sorotipos 1, 3, 5, 6B, 9V, 14 de S. pneumoníae em 48 amostras de soro das crianças com asma persistente moderada ê grave.

Tabela 4. Análise de correlação de Spearman e incremento cOhsiderando as 38 concentrações de anticorpos IgG (mgjl) pré e pós-v~cinais reativos com os sorotipos 1, 3, 5, 6B, 9V e 14 de S. pneumoníaeem 48 amostras de soro das crianças com asma persistent.ê moderada e grave.

Lista de quadro

Quadro 1. Classificação da Gravidade da Asma. 14

IgA IgG IgM IgE IgAD ELISA LPS OPD PBS rpm SIgA IDP IDS CD IFN IL Ps TCD4+ TCDS+ ThO Thl Th2 Th3 TNF BSA TGF TI TD VEF PFE BD Treg Trl ISAAC SHN RAST HIV HTLV 1/11

Lista de abreviaturas

Imunoglobulina A Imunoglobulina G Imunoglobulina M Imunoglobulina E Deficiência da imunoglobulina A Ensaio imunoenzimático em fase sólida Lipopolissacarídeo Orto-fenileno diamina Solução salina tamponada com fosfato Rotações por minuto IgA secretória Imunodeficiência primária Imunodeficiência secundária Cluster af differentiatian Interferon Interleucina Polissacarídeo Linfócito T helper, ou auxiliador Linfócito T supressor Linfócito T helper Linfócito T helper, do sub tipo 1 Linfócito T hei per, do sub tipo 2 Linfócito T helper, do sub tipo 3 Fator de necrose tumoral Albumina sérica bovina Fator transformador de crescimento Antígeno timo independente Antígeno timo dependente Volume expiratório forçado no primeiro segundo Pico de fluxo expiratório Broncodilatador Células T regulatórias Células T regulatórias do tipo 1 Internatianal5tudy af Asthma and Allergies in Childhaad Soro humano normal Radiaallergasarbent test Vírus da imunodeficiência humana Vírus t-linfotrópico humano 1/11

1 1. fritrodução

--------------------- -------

1. INTRODUÇÃO

As imunodeficiências são caracterizadas como um grupo de doenças que

resultam de uma ou mais anormalidades do sistema imune, aumentando a

suscetibilidade aos processos infecciosos. São classificadas em primárias e

secundárias.

As imunodeficiências primárias (IDP) são decorrentes de defeitos

intrínsecos nas células ou fatores do sistema imune e, em sua grande maioria,

são defeitos genéticos, sendo geralmente congênitas ou hereditárias. Estes

defeitos genéticos resultam em uma suscetibilidade aumentada para infecções,

que se manifestam com freqüência, precocemente na primeira ou segunda

infância, mas às vezes são detectadas clinicamente apenas mais tarde. As

imunodeficiências secundárias (IDS) desenvolvem-se como conseqüência de

desnutrição protéico-calórica grave, em decorrência do uso de drogas ou devido

a alterações causadas pelo vírus da imunodeficiência humana entre outras.

Podem apresentar anormalidades transitórias ou permanentes na resposta

imune, onde um ou mais setores podem estar envolvidos, e da mesma forma

como as IDP, a falta da integridade do sistema imunológico resulta em maior

suscetibilidade às infecções.

Didaticamente, as IDP podem ser divididas em deficiência humoral

(deficiente produção de anticorpos devido alteração no desenvolvimento e na

função dos linfócitos B), celular (função anormal das células T auxiliares),

deficiência dos componentes do sistema complemento e alterações na função

das células fagocíticas.

As IDP apresentam quadro clínico caracterizado por infecções

bacterianas recorrentes como otites, sinusites, pneumonias, meningites,

osteomielites, artrites sépticas e sepses.

o diagnóstico de IDP deve ser considerado em qualquer indivíduo que

apresente infecções recorrentes e uma história familiar sugestiva, devendo ser

2 1. Introdução

------------

confirmado através de exame físico e testes laboratoriais apropriados (Chapel

et aI., 2003).

Os seguintes critérios são utilizados na investigação do diagnóstico das

imunodeficiências primárias:

1. Pneumonias: três ou mais episódios em um ano (Rozov, 1999);

2. Otites: três ou mais episódios em seis meses, ou quatro ou mais episódios

em um ano (Bluestone & Stool, 1996);

3. Amidalites: cinco episódios em um ano (Kobinger et aI., 2000);

4. Rinofaringites comuns: 12 ou mais episódios em um ano (Bluestone & Stool,

1996);

5. Sinusites: quatro ou mais episódios em 6 meses, com resposta à terapêutica

medicamentosa (Bluestone & Stool, 1996).

Até o momento são conhecidas mais de 100 IDP. As manifestações

clínicas são altamente variáveis, desde um aumento da suscetibilidade as

infecções até manifestações autoimunes.

Nos pacientes suspeitos de IDP, o quadro de infecções do trato

respiratório é o mais freqüente (Conley & Stiehm, 1996; Chedevergne et aI.,

2000). Aproximadamente 10% das crianças com infecções respiratórias de

repetição encaminhadas para investigação da imunocompetência apresentam

alguma forma de imunodeficiência (Conley & Stiehm, 1996).

A inflamação brônquica é uma característica importante no

desenvolvimento de várias doenças respiratórias (Chedevergne et aI., 2000). Na

infância as infecções respiratórias são a causa mais comum da inflamação

aguda das vias aéreas. Infecções pelo vírus influenza, sincicial e rinovírus ou

processos alérgicos do trato respiratório superior podem iniciar uma crise de

asma, aumentando a suscetibilidade a mais infecções do trato respiratório. Por

outro lado, infecções pulmonares de repetição causadas principalmente por

vírus, durante os primeiros anos de vida, estão associadas a um aumento no

risco de desenvolvimento de asma na infância (Rijt et aI., 2005).

Os processos alérgicos iniciam-se através da resposta exacerbada do

sistema imune a um determinado antígeno ou alérgeno. É provável que

3 L IrJtroduçâ'o ---

múltiplas células e múltiplos mediadores estejam envolvidos em respostas

asmáticas em diferentes pessoas ou mesmo em um único paciente asmático.

Células apresentadoras de antígeno nas vias aéreas, como células

dendríticas e macrófagos alveolares, desempenham um papel crítico no

desencadeamento e na regulação dos eventos inflamatórios.

A cascata inflamatória se inicia com um estímulo (específico ou

inespecífico) que interage com células efetoras das vias aéreas (mastócitos ou

macrófagos). Na maioria dos indivíduos, as doenças alérgicas se caracterizam

pela presença de grande quantidade de anticorpos IgE produzidos pelas células

plasmáticas nos linfonodos. A IgE monomérica se liga ao receptor FCsRI com

alta afinidade na superfície dos mastócitos, e a interação de antígenos

multivalentes com duas ou mais moléculas de IgE, promove a agregação dos

receptores e ativação celular. Isto resulta na degranulação do mastócito e

liberação de vários mediadores inflamatórios, como a histamina,

prostaglandina, leucotrienos e metabólitos do ácido araquidônico (Metzger,

1992), causando efeitos imediatos sobre o tecido alvo das vias aéreas,

promovendo a constrição do músculo liso das vias respiratórias, hiper secreção

de muco e edema da mucosa. Um grande número de células estruturais nas

vias aéreas, como as células epiteliais e células do músculo liso, expressam os

receptores de IgE.

Vários estudos indicam que o linfócito T desempenha um papel crucial na

regulação e expressão da eosinofilia local e produção de IgE, tanto na asma,

quanto na doença alérgica. Existem quatro sub-populações de células T CD4+

(ThO, Th1, Th2, Th3). Os linfócitos ThO são os precursores, e não são

comprometidos funcionalmente, enquanto que as subpopulações Th1, Th2 e

Th3 evoluem para suas formas funcionais definitivas, como conseqüência de

estímulos genéticos e ambientais. Não existem diferenças morfológicas entre

estes linfócitos e sim, funcionais, através de liberação de diferentes citocinas.

A subpopulação Th1 é responsável pela produção de IFN-y e TNF-u,

citocinas responsáveis pela imunidade celular, associada a bactérias

intracelulares, vírus e algumas doenças autoimunes. A subpopulação Th2

4 1. Introdução

produz as citocinas IL-4, IL-5, IL-9 e IL-13, relacionadas à resposta imune

humoral, as quais estão envolvidas na defesa contra infecções por parasitas e

doenças alérgicas.

Avanços têm sido obtidos na definição dos mecanismos que controlam a

inflamação e induzem tolerância imune para antígenos específicos. Subtipos de

células CD4+ conhecidas como células T regulatórias (Treg) apresentam papel

importante neste processo e nas vias de sinalização. Recentemente,

demonstrou-se que as Tregs não funcionam adequadamente nos pacientes com

alergia. Acredita-se que esta disfunção possa explicar a ativação Th2

encontrada em pacientes atópicos ou alérgicos. Teoricamente a célula Treg

pode interferir no desenvolvimento de doenças alérgicas, incluindo a asma, em

diferentes estágios como na sensibilização alérgica, na progressão para

inflamação alérgica, remodelamento brônquico, hiperresponsividade e na

persistência das manifestações clínicas da doença. As Tregs são ainda

subdivididas em Tregs tipo 1 (Trl) e tipo 3 (Th3) que medeiam exclusivamente

supressão via citocinas IL-l0 e TGF-(3, respectivamente. O aumento dos níveis

de IL -10 e TGF-I3, produzidas pela células T reg, potenCialmente suprime a

produção de IgE, enquanto simultaneamente aumenta a produção de IgG4 e

IgA pelos linfócitos B (Van Oosterhout & Bloksma, 2005).

Demonstrou-se que IL-4 e IL-13 estão envolvidas na produção de IgE e

de muco e na ativação de mastócitos, exercendo efeito direto nas células das

vias aéreas. Estudos mostram que altos níveis de IL-13 induzida por

determinado alérgeno, aumentam precocemente a produção sé rica de IgE pelos

linfócitos em crianças entre 2 e 3 anos de idade, aumentando o risco de asma

ou outro processo alérgico (Ly et aI., 2005). Estes autores sugerem uma

associação entre a resposta Th2, a produção de IL-13 e o nível elevado de IgE

em crianças entre 2 e 5 anos. A IL -5 aumenta o número, a migração e ativação

dos eosinófilos no pulmão, desenvolvendo uma hiperreatividade brônquica

(Foster et aI., 1996; Corry et aI., 1996; Mucida et aI., 2003). Outros estudos

demonstraram que asmáticos apresentam uma diminuição na produção de IFN

y associando-se com asma persistente e com a severidade da asma (Smart et

aI., 2002; Rijt et aI., 2005).

5 1, Introdução

----_._-------------------------

A sensibilização precoce, isto é, a ligação da IgE aos mastócitos devido

ao contato com substâncias químicas e protéicas, que são chamadas de

alérgenos em indivíduos predispostos geneticamente (Mucida et ai, 2003),

também é um importante fator de risco para problemas respiratórios

persistentes e hiperreatividade das vias aéreas. Cerca de 70 a 90% dos

indivíduos com asma estabelecida têm sensibilização alérgica e esta proporção

é mais elevada nas crianças.

Evidências epidemiológicas baseadas no aumento das infecções,

prevalência e sensibilização das doenças alérgicas levaram alguns autores a

formularem a hipótese da higiene (Martinez, 2001; Mucida et ai, 2003). Nesta

hipótese discute-se o equilíbrio entre as respostas do tipo Th1 e Th2. A

exposição limitada às bactérias e vírus na infância resulta na estimulação

insuficiente de células Th1, aumentando a expansão das células Th2,

resultando na predisposição à alergia (Yazdanbakhsh et ai, 2002; Mucida et ai,

2003). E, de modo inverso, o estímulo para o padrão de resposta Th1,

ocorrendo precocemente na infância pode levar a uma proteção contra os

alérgenos ambientais (Yazdanbakhsh et ai, 2002).

Embora existam muitos dados na literatura a respeito da prevalência de

asma e de outras doenças alérgicas, a maioria dos estudos foi realizada em

países industrializados, aonde também foi observada uma variabilidade na

prevalência entre as diferentes populações.

A prevalênCia da asma em crianças aumentou em diversos países

desenvolvidos como, Estados Unidos, Noruega, Grécia e Itália nas últimas duas

décadas, apresentando porcentagens que variaram entre 1,5% e 5,5% na

década de setenta para índices de 5,4% a 12,2% na década de noventa

(Nystad et ai, 1997; Sly, 1999; Anthracopoulos et ai, 2001; Ronchetti et ai,

2001).

A única informação publicada há quase duas décadas, na qual foi

estimada a prevalência de asma em crianças da América Latina, demonstrou

grande variação nas diferentes populações. A menor prevalência foi encontrada

no Peru (0,4%) e a maior, no Brasil (4,2%) (Carrasco, 1987). No entanto, os

6 1. Introrjução

---------- ------

estudos realizados há duas décadas diferiam nas metodologias e definições

empregadas, assim as comparações na variabilidade dos sintomas e figuras de

prevalência não eram praticáveis.

Para padronizar a investigação epidemiológica das doenças alérgicas na

infância foi criado em 1991, na Austrália, o International Study of Asthma and

Allergies in Childhood (ISAAC). Este estudo foi elaborado para ser realizado em

três fases, comparando diferentes regiões de 56 países (Asher et aI., 1995) e

apresentou variabilidade de asma ativa de 1,6% a 36,8%, estando o Brasil em

8° lugar com uma prevalência média de 20% (ISAAC, 1998). Existem indícios

de que a prevalência da asma esteja aumentando em todo mundo, inclusive no

Brasil (Fiori & Fristcher, 2001), apesar de ainda termos poucos estudos

epidemiológicos nesta área.

Braga et aI. (1997) observaram crianças em idade escolar, em cinco

cidades do estado de São Paulo entre 1994 e 1995. Foi obtida uma prevalência

de 15,9% de asma. Em Curitiba, a prevalência era de 5% em 1986, já em

1993, houve um aumento para 11,9% (Ferrari et aI., 1995).

A mortalidade por asma vem aumentando no Brasil nos últimos anos. No

estado de São Paulo, essa taxa dobrou entre 1970 e 1996, sendo a cidade de

São Paulo, responsável pela maior parte dos casos (Salto et aI., 2002).

Em um trabalho realizado com populações da América Latina,

empregando o ISAAC, nenhuma relação foi encontrada entre a exposição à

poluição ambiental, exposição precoce aos alérgenos respiratórios e às

infecções gastrintestinais com os dados de prevalência da asma. Estes dados

suscitaram dúvidas sobre a hipótese da higiene na América Latina (Mallol et aI.,

2000).

Os dados epidemiológicos mais recentes do Brasil são do ISAAC,

realizado em 20 cidades brasileiras, representando os valores mais atualizados

sobre a prevalência cumulativa de asma diagnosticada. Na faixa etária de 6 a 7

anos, entre 13.204 crianças entrevistadas, a prevalência de asma diagnosticada

oscilou entre 4,1% e 26,9%. Na faixa etária de 13 a 14 anos, entre os 17.555

adolescentes entrevistados, a prevalência oscilou entre 5,5% e 28,0%.

7 1:Jntrodução __ _

Considerando-se as duas faixas etárias, a prevalência média foi de 13,3%. O

Brasil está entre os países com as taxas mais elevadas nos dois grupos

avaliados (Solé et aI., 2006). Em um recente trabalho, realizado na zona oeste

de São Paulo, foram avaliados 528 escolares, com idades entre 13 e 14 anos,

empregando-se o questionário do ISAAC. Foi observada uma prevalência de

21,9% de asma e uma prevalência de asma com diagnóstico médico de 8,9%

(Pastorino, 2006).

A asma é caracterizada como uma doença crônica intermitente, iniciada

através da exposição a um alérgeno, com resposta de linfócitos Th2 e

subseqüente inflamação eosinofílica das vias aéreas mediadas por IL-5. Essa

resposta resulta em um aumento da reatividade brônquica, hiper

responsividade, aumento da secreção de muco, lesão epitelial, fibrose de

membrana sub-basal, infiltração multicelular e edema, levando a um

remodelamento das vias aéreas (Douwes et aI., 2002; Cohn et aI., 2004).

Clinicamente, a asma resulta em episódios recorrentes dos sintomas,

como chiado, falta de ar, dispnéia e tosse. Em algumas crianças e em alguns

adultos, os sintomas desaparecem durante a vida. No entanto, o lavado

broncoalveolar e biópsia demonstram que mesmo na ausência dos sintomas,

um elevado número de eosinófilos é encontrado, podendo haver recorrência a

qualquer momento (Cohn et aI., 2004).

A asma eosinofílica é definida como uma inflamação sintomática das vias

aéreas, caracterizada pela presença de eosinófilos. Asma não-eosinofílica, deste

modo, representa asma sintomática na ausência de inflamação eosinofílica das

vias aéreas. Douwes et aI. (2002) relatam que em 50% dos casos, a asma é

decorrente de mecanismos alérgicos. Já Cohn et aI. (2004) estimam que a

asma é alérgica em aproximadamente 80% dos asmáticos. A asma não

eosinofílica é associada com respostas neutrofílicas.

A exposição ambiental a endotoxina bacteriana (LPS), poluição do ar

particulada e ozônio, assim como infecções virais, podem ter um importante

papel desencadeador na inflamação aérea neutrofílica da asma (Nightingale et

aI., 1998; Holt et aI., 1999). Embora infecções bacterianas não representem um

8 1. Ir/tradução

fator de risco importante, estas têm sido associadas a complicações secundárias

das infecções virais (Cypcar et a/. , 1992).

A asma ocupacional não alérgica, caracterizada pela exposlçao de

indivíduos adultos a um determinado alérgeno no ambiente de trabalho, é

mediada por uma resposta inflamatória aguda envolvendo as citocinas IL-1,

IL-6, IL-8 e TNF-a e ativação de neutrófilos nas vias aéreas, semelhante à

resposta inflamatória da asma não-eosinofílica (Douwes et a/., 2002).

A principal resposta imune contra os diferentes agentes infecciosos no

trato respiratório é a resposta imune humoral. Para a síntese de anticorpos

contra antígenos protéicos, ou seja, antígenos ti mo-dependentes, é necessária

a presença de linfócitos T CD4+, que produzem uma variedade de citocinas as

quais diferem na capacidade de induzir a troca para os diferentes isotipos de

anticorpos e são importantes na regulação da resposta imune (Coffman et a/.,

1988). Por outro lado, os antígenos não protéicos, como os polissacarídeos e os

lipídeos, induzem a produção de anticorpos sem a necessidade de linfócitos T

auxiliares e são chamados de antígenos ti mo-independentes (TI). O significado

prático dos antígenos TI é que muitos polissacarídeos da parede celular

bacteriana pertencem a esta categoria e a imunidade humoral é o principal

mecanismo de defesa do hospedeiro contra tais infecções. Os antígenos TI

podem ser classificados em 2 sub-grupos, antígenos TI - tipo 1, cujo exemplo é

o lipopolissacáride (LPS ou endotoxina) da parede celular de muitas bactérias

Gram-negativas. Como antígenos TI - tipo 2, temos os polissacarídeos

capsulares, como por exemplo, do pneumococo. Os principais agentes

etiológicos de infecções na infância têm em sua composição antígenos TI - tipo

1 e TI - tipo 2.

Desde as primeiras horas de vida, diversos microrganismos colonizam a

mucosa intestinal do homem passando a fazer parte da sua microbiota. Na

microbiota intestinal estão presentes microrganismos Gram-negativos e Gram

positivos.

As mucosas representam a via natural de contato do organismo com o

meio e em condições fisiológicas, a maioria dos antígenos tem acesso ao

9 1. Introdu~:_--à_o __

sistema imune através destas superfícies. Somente a mucosa intestinal

apresenta uma área 100 vezes maior que a área da pele, e diferentemente da

pele, essa mucosa está recoberta por uma camada de células epiteliais com

características adequadas à absorção (Moore et al, 1981). Além da presença

maciça de elementos linfóides na mucosa, existem várias evidências na

literatura mostrando que a administração de antígenos por via oral ou nasal

pode desencadear não somente eventos locais, como também a produção de

IgA secretória (Neutra et al, 1996).

AlgA secretória é sintetizada pelas células plasmáticas presentes nos

tecidos linfóides de mucosa, prevenindo a invasão das células epiteliais por

bactérias e vírus (Edwards et al, 2004). Difunde-se facilmente do sangue para

o epitélio, age nas superfícies das cavidades corporais como um anticorpo

neutralizante e principalmente, apresenta uma ação não inflamatória.

Existe uma importante associação entre asma e deficiência de IgA

(Cunningham-Rundles, 2001). Em um estudo populacional na cidade de S.

Paulo, foi encontrada uma freqüência de deficiência da IgA 20 vezes mais

elevada entre os asmáticos do que na população geral (Solé et aI., 1985;

carneiro-Sampaio et aI., 1989).

A deficiência seletiva de IgA (IgAD) é a mais comum das

imunodeficiências primárias. Sua freqüência varia de 1 :400 a 1 :3.000 casos

observados em doadores de sangue saudáveis (Edwards et al, 2004). Embora

algA secretória tenha um papel biológico claro, a deficiência de IgA é uma

condição heterogênea, pois muitos indivíduos afetados são clinicamente

saudáveis ou podem apresentar uma variedade de sintomas, tais como doenças

respiratórias ou gastrointestinais recorrentes, atopia, asma, desordens

inflamatórias ou autoimunes como lupus eritematoso sistêmico, artrite

reumatóide, anemia perniciosa, além de processos infecciosos de repetição.

A herança da IgAD se apresenta aparentemente de forma esporádica,

mas pode ocorrer em formas autossômicas recessivas e autossômicas

dominantes (Edwards et al, 2004). Em um estudo realizado com 203 crianças

portadoras de asma brônquica, quatro foram identificadas como deficientes de

10 LJ!7trodu{,-ão

IgA, porém analisando-se inversamente, em estudo com 40 crianças portadoras

de deficiência de IgA, 70% apresentaram manifestações características de

asma brônquica (Carneiro-Sampaio & SOlé, 1999), caracterizando os deficientes

de IgA como um grupo de risco para a asma.

Os anticorpos IgA e IgM secretores agem impedindo microrganismos, e

seus produtos de ligarem-se às células epiteliais da mucosa, fenômeno

denominado neutralização. Portanto, a ausência de IgA nas secreções mucosas

favorece a sensibilização alérgica, em especial dos tratos digestivo e

respiratório (Carneiro-Sampaio & SOlé, 1999; Cunningham-Rundles, 2001).

Clinicamente se define uma deficiência seletiva de IgA quando os níveis

séricos são menores que 7 mg/dl (Sorensen & Moore, 2000). Entretanto, alguns

indivíduos diagnosticados como deficientes podem produzir IgA secretória

suficiente para permanecerem assintomáticos; em outros casos, alguns

pacientes deficientes de IgA possuem números normais no intestino de células

plasmáticas carregando IgA e produzindo níveis de IgA secretória normais

(Cunningham-Rundles, 2001).

Trabalhos na literatura têm demonstrado uma associação entre

deficiência de IgA e deficiência de subclasses de IgG com infecções

respiratórias. Estes pacientes representam um grande número quando

comparados com os casos de deficiência de IgA isolados. As deficiências das

subclasses de IgG tem uma importância clínica quando são associadas com

infecções do trato respiratório e/ou com defeitos na resposta de anticorpos.

Essas deficiências predispõem os pacientes a infecções graves e recorrentes

(De Laat et ai, 1991; Sorensen & Moore, 2000; Meyts et ai, 2006).

Níveis reduzidos de imunoglobulinas ou de subclasses de IgG, mesmo

com níveis séricos de IgG total normais têm associação com um aumento do

risco para infecções (Fadal, 1993; Sorensen & Moore, 2000). Ayres &

Thompson (1997) descreveram a deficiência de imunoglobulinas ou de

subclasses de IgG em pacientes asmáticos, e as manifestações clínicas mais

severas foram relacionadas com deficiência de subclasses de IgG.

11

_0ntrodLlçà'o --------

As subclasses de IgG são produzidas em diferentes quantidades

(distribuição no soro: 58 a 71,5% de IgG1, 19 a 31% de IgG2, 5 a 8,4% de

IgG3 e 0,7 a 5% de IgG4), sendo que cada uma exerce atividades biológicas

distintas. As subclasses IgG1 e IgG3 são dirigidas a antígenos protéicos

incluindo bactérias, vírus e proteínas autólogas. Como a IgG3 compartilha

características funcionais com IgG1, indivíduos totalmente deficientes de IgG3

podem permanecer assintomáticos (Lui et al, 2002). A deficiência de IgG2 está

associada com a falta de anticorpos para polissacarídeos. Dentro das

manifestações clínicas graves ou recorrentes de infecções respiratórias, a

deficiência mais freqüentemente observada é a de IgG2, que leva a um

aumento da suscetibilidade aos patógenos do trato respiratório (Gross et al,

1992).

Estudos demonstram que IgG4 age como um anticorpo anafilático em

alguns casos de alergia a alimentos. A subclasse IgG4 é produzida como

resultado a uma exposição prolongada ao antígeno, não ativa a cascata do

complemento, age como uma molécula monovalente, tem uma capacidade

reduzida de ligação aos receptores da superfície celular, produzindo menos

inflamação que as outras subclasses de IgG (Mori et al, 2001). Alguns estudos

demonstraram aumento de IgG4 em pacientes afetados por infecções

respiratórias recorrentes (Gwynn et al, 1978; Heiner, 1984; Moss et al, 1992).

As alterações da imunidade humoral observadas em pacientes asmáticos

são variáveis, nos quais podemos observar altas concentrações de IgE,

deficiência de IgA e de subclasses de IgG. Diante dessas constatações e da

observação de que a prevalência de doenças alérgicas em geral, principalmente

a asma tem aumentado, achamos relevante realizar uma investigação ampla da

resposta imune humoral, analisando os níveis sé ricos de imunoglobulinas e de

subclasses de IgG, níveis salivares de IgA e a resposta de anticorpos reativos a

polissacarídeos, lipopolissacarídeos e proteínas em pacientes com asma

moderada ou grave, o que poderia auxiliar na compreensão do aumento da

suscetibilidade às infecções nestas crianças.

12 2. Objetivos

2. OBJETIVOS

Avaliar a imunidade humoral representada pelos níveis séricos totais de

imunoglobulinas, subclasses de IgG e níveis salivarés de IgA e a resposta de

anticorpos específica para antígenos ti mo-dependentes, antígenos timo

independentes tipo 1 e ti mo-independentes tipo 2 ém um grupo de crianças

com asma brônquica moderada e grave.

13 3. Materiais e Métodos

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Casuística

Foram selecionadas crianças entre 4 e 12 anos de idade com diagnóstico

de asma persistente moderada e grave, atendidas pela Disciplina de Alergia,

Imunologia e Reumatologia do Departamento de Pediatria - UNIFESP :- EPM. Os

pacientes foram selecionados de acordo com os critérios apresentados no

Quadro 1 (III Consenso Brasileiro no Manejo da Asma, 2002). Estima-se que

60% dos casos de asma sejam intermitentes ou persistentes leves, 25% a 30%

moderados e 5% a 10% graves. Os asmáticos graves são a minoria, mas

representam a maior porcentagem em utilização de recursos. Atualmente, o

número de crianças classificadas como asmáticas na Disciplina de Alergia,

Imunologia e Reumatologia da Universidade Federal de São Paulo, através dos

critérios descritos no Quadro 1, alcança aproximadamente 200. Um dos critérios

para definir a gravidade da asma é o uso contínuo de altas doses de

corticosteróides inalado ou oral em um período maior que 50% do ano. Outros

critérios menores incluem aspectos da função pulmonar, exacerbação,

estabilidade da doença e a quantidade de medicações em uso.

o projeto foi previamente aprovado pela Comissão de Ética e Pesquisa do

Instituto de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo.

Do total de 200 crianças diagnosticadas com asma persistente moderada

e grave, foram selecionadas 50 para este projeto.


Quadro 1: Classificação da Gravidade da Asma

Intermitente Persistente Persistente Persistente

leve moderada grave

Sintomas: <1 ~1 Diários Diários vez/semana vez/semana e

falta de ar, < 1 vez/dia mas não contínuos contínuos aperto no peito, chiado e tosse

Atividades Em geral Limitação para Prejudicadas limitação diária normais grandes

Falta ocasional esforços algumas faltas ao Falta freqüente ao

trabalho ou escola. trabalho e escola. ao

Faltas ocasionais Sintomas com trabalho ou ao trabalho ou exercício Sintomas com

escola escola moderado (subir exercícios leves,

escadas) (andar no plano)

Crises * ocasionais infreqüentes freqüentes tneqüentes/graves (leves)

algumas algumas com ida à necessidade de controladas com requerendo curso emergência, uso corticóide sistêmico,

bd sem ida à de corticóide. de corticóides internação ou com emergência sistêmicos ou risco de vida

internação

Sintomas raros ocasionais comuns quase diários noturnos**

~ 2 vezes/mês > 2 vezes/mês e > lvez/semana > 2 vezes/semana

~ 1 vez/semana

Broncodila- ~1 <2 >2 ~ 2 vezes/ dia tador vezes/ semana

vezes/ semana vezes/semana Para alívio e 2 vezes/ dia

PFE ou VEF1 pré-bel > 80% pré-bel > 80% pré-bel entre pré-bel < 60% previsto ou previsto 600/0 e 800/0 previsto

nas consultas previsto

Fonte: 111 Consenso Brasileiro no Manejo da Asma/ 2002.

* Pacientes com crises infreqüentes, mas que coloquem a vida em risco, devem ser classificados como portadores de asma persistente grave. ** Despertar noturno regular com chiado ou tosse é um sintoma grave. bel - Broncodilatador PFE - Pico de fluxo expiratório VEF1 - Volume expiratório forçado no primeiro segundo.

15 3. Materíais e Métodos

3.1.1 Coleta das amostras

Durante a consulta, feita de rotina, o responsável pelo paciente

respondeu a um questionário (Anexo I). Foi marcada uma data para a coleta de

sangue e saliva (amostras pré-imunização). No dia da coleta, a criança foi

imunizada com a vacina 23-valente não conjugada (Aventis-Pasteur), e após 4

a 6 semanas, houve um retorno para a segunda coleta de sangue, para ser

avaliada a resposta à vacina (amostra pós-imunização).

A coleta das amostras de saliva foi feita antes da aplicação da vacina e

após boa escovação e - enxágüe dos dentes. As salivas obtidas, sem

estimulação, foram depositadas em frascos estéreis e congeladas a -70°C

imediatamente após a coleta. No momento do uso, as mesmas foram

descongeladas, centrifugadas por 10 minutos a 2.500rpm e o sobrenadante

obtido foi utilizado para a dosagem de IgA salivar por ELISA.

As amostras de sangue pré e pós-vacinais foram colhidas em tubos

estéreis contendo gel separador. Após 30 minutos em estufa a 37°C, os soros

foram centrifugados a temperatura ambiente, transferidos para tubos

"eppendorf" e congelados a -70°e.

3.2 Dosagem dos níveis totais de IgG, IgM, IgA, IgE e de subclasses

deIgG

Os níveis séricos de classes de imunoglobulinas (IgG, IgA, IgM e IgE) e

subclasses de IgG (IgG2, IgG3 e IgG4) foram avaliados através do método de

nefelometria, utilizando nefelômetro Behring (BN Prospec) com padrões e

controles apropriados. As dosagens de imunoglobulinas foram efetuadas,

segundo protocolo de ensaio para nefelômetro (Behringer, EUA). As amostras

de soro dos pacientes foram diluídas conforme instruções do fabricante

(Berhinger, EUA).


Os controles, padrões, as soluções tampão e diluentes, assim como os

anticorpos monoclonais utilizados foram obtidos diretamente do fabricante

(Oade Behringer, EUA). Os dados obtidos dos pacientes foram comparados aos

valores normais de referência para a idade (Fujimura, 1990) (Anexo III).

Os nossos resultados obtidos com os valores de IgE sérica total foram

comparados aos valores normais de referência para idade, obtidos de um

estudo realizado na Europa com 448 crianças (Oati & Ringel, 1982).

3.2.1 Dosagem dos níveis de IgA Secretória

A presença de anticorpos IgA secretores nas amostras de saliva foi

determinada através de teste imunoenzimático em fase sólida (ELISA),

conforme descrito por Nagao et aI. (1990). Para tanto, placas de

microtitulação (Costar, NY, USA) foram adsorvidas com 100 f..ll por poço de

soro anti-lgA purificado (Sigma, MO, USA) na concentração de 5 f..lg/ml em

solução tamponada com fosfato (PBS) pH 7,4 e incubadas em câmara úmida

durante 16 horas a 4°C.

Após incubação, as placas foram lavadas 3 vezes com PBS-Tween 20

0,1 %. A seguir, foram incubadas com a curva padrão (IgA de colostro

humano, Sigma, MO, USA), com os controles ("pool de colostro", na diluição

de 1:100.000 a 1:800.000) e com as amostras de salivas (1:500 a 1:4000) por

2 horas a 37°C (100f..ll/poco). O padrão foi utilizado nas concentrações entre

3,9 e 250 ng/ml. Todas as amostras foram testadas em 4 diluições seriadas,

em duplicatas e diluídas em tampão PBS NaCI 0,35M-Tween 20 0,2%.

As placas foram novamente lavadas e incubadas lh30 min a 3rC

(100 f..ll/poço) com o conjugado anti-lgA humano marcado com peroxidase

(Sigma, MO, USA), diluído a 1:5000 no mesmo tampão de diluição.

Após novas lavagens, foi adicionada (100f..llfpoço) a solução de substrato

contendo ortofenilenodiamina (OPO) a 10 mg/ml em tampão citrato-fosfato

O,lM, pH 5,0 e água oxigenada (H202) na concentração 0,01% e deixada reagir


por 30 min no escuro a temperatura ambiente. A reação foi interrompida pela

adição de 50 Ill/poço de ácido sulfúrico (H2S04) a 2,5N. As absorbâncias foram

lidas em leitor de placas em comprimento de onda 492nm (Labsystems,

Finland). A determinação das concentrações foi realizada através do programa

GraphPad Prism (San Diego, CA, USA), as quais foram expressas em mgjl. Os

valores de referência para cada idade estão em anexo (Anexo 111).

3.3 Radioallergosorbent test(RAST)

Os níveis séricos de IgE específicos para Dermatophagoides

pteronyssinus foram avaliados utilizando o ImmunoCAP (Phadia, Uppsala,

Suécia).

O alérgeno foi acoplado covalentemente ao ImmunoCAP, para reagir

com anticorpos IgE específicos das amostras de soro. Após a lavagem dos

anticorpos IgE não específicos, foram adicionados anticorpos anti-IgE marcados

enzimaticamente para a formação de complexos. Após o período de incubação

da enzima, foram feitas novas lavagens, foi adicionado o substrato e a seguir, o

bloqueio da reação. A reação foi mensurada através da fluorescência do eluído.

Os resultados foram expressos em KUjl. Considerou-se positivas as

concentrações maiores ou iguais a 0,35 KUjl.

Os resultados foram agrupados em classes, sendo que: classe O

corresponde a níveis menores que 0,35 (negativo); classe 1 corresponde a

níveis entre 0,35 e 0,70 (fraco); classe 2 corresponde a níveis entre 0,70 e

3,50 (moderado); classe 3 corresponde a níveis entre 3,50 e 17,50 (alto);

classe 4 corresponde a níveis entre 17,50 e 50,0 (muito alto); classe 5

corresponde a níveis entre 50,0 e 100,0 (muito alto) e classe 6 corresponde a

níveis maiores que 100 KUjl (muito alto).


3.4 Teste cutâneo de leitura imediata por puntura

Este teste cutâneo tem por objetivo diagnosticar os alérgenos

causadores das irritações, através da técnica de puntura (prick test). Foram

utilizados extratos comerciais, solução salina como controle negativo e

histamina na concentração de 1 mg/ml como controle positivo.

Os extratos utilizados foram: Dermatophagoides pteronyssinus,

Dermatophagoides farinae e B/omia tropica/is.

Uma gota de cada substância a ser avaliada foi disposta na superfície

volar do antebraço e, com uma agulha, num ângulo de aproximadamente 70°

com a pele, foi realizada a puntura. Após 15 minutos, foi realizada a leitura do

teste. Os resultados foram determinados pela medida da pápula no seu maior

diâmetro. Foi considerado como positivo, um diâmetro médio da pápula maior

ou igual a 3mm (Dreborg et aI., 1989).

Os resultados destes testes foram fornecidos pela Dra. Beatriz Tavares

Costa-Carvalho da Disciplina de Alergia, Imunologia e Reumatologia do

Departamento de Pediatria - UNIFESP - EPM.

3.5 Determinação dos níveis séricos de anticorpos IgG anti-toxóide

tetânico

Os níveis séricos de anticorpos IgG anti-toxóide tetânico foram

determinados através de teste de EUSA, segundo método Melville-Smith

(1990). Foi utilizado como antígeno o toxóide tetânico produzido pelo Instituto

Butantan (Anatoxina tetânica, Lote IB-10/99).

Placas de microtitulação (Costa r, NY, USA) foram adsorvidas com

100 f.!l/poço do toxóide tetânico na concentração de 10 f.!g/ml diluído em

tampão carbonato-bicarbonato de sódio e incubadas em câmara úmida

durante 16 horas a 4° C.


Em seguida, as placas foram lavadas com solução PBS Tween 20 0,1%

por 3 vezes, bloqueadas com 100 J.ll/poço de uma solução contendo leite

desnatado 5% em PBS Tween 20 0,1% e incubadas por 1 hora a 37° C.

Após novas lavagens, a curva padrão (Tetanogamma - Imunoglobulina

Antitetânica, Aventis) na concentração original de 250 UI/ml, o soro controle e

as amostras foram diluídos em leite desnatado 1% em PBS Tween 20 0,1% nas

diluições 1:5000, 1:100 e 1:50, respectivamente, e adicionados às placas no

volume de 100J,Jl/poço. As amostras e o controle foram testados em 4 diluições

seriadas e em duplicatas. As placas foram incubadas por 1 hora a 37°C.

Em seguida, as placas foram lavadas novamente e incubadas por 1 hora

a 37°C com 100 IJI por poço do conjugado anti-IgG humano (Sigma, MO, USA)

marcado com peroxidase, diluído 1: 15000 em leite desnatado 1% em PBS

Tween 20 0,1% .

Após novas lavagens, foi adicionada a solução de substrato contendo

ortofenilenodiamina (OPD) a 10 mg/ml em tampão citrato-fosfato O,lM, pH

5,0 e água oxigenada (H202) 0,01% (1001JI/poço) e deixada reagir por 30 min

no escuro a temperatura ambiente. A reação foi interrompida pela adição de

50 J.ll/poço de ácido sulfúrico (H2S04) a 2,5N. As absorbâncias foram lidas em

leitor de placas em comprimento de onda 492nm (Labsystems, Finland).

A determinação das concentrações foi realizada através do programa

GraphPad Prism (San Diego, CA, USA) e os resultados expressos em UI/ml.

3.6 Determinação dos níveis sé ricos de anticorpos IgG e IgM anti-LPS

0111

Os ensaios de EUSA para determinação dos níveis de anticorpos anti-LPS

0111 foram realizados segundo técnica descrita por Nagao et aI. (2001), com

49 amostras de soro das crianças com asma persistente moderada e grave.

Microplacas (Costa r, USA) foram adsorvidas com l0J.lg/ml de LPS 0111

(Sigma, USA) em PBS pH 7,4. Após incubação de 16h a 4°C, as placas foram


lavadas com PBS Tween 20 0,1% e foi realizado o bloqueio com leite desnatado

a 1% em PBS 7,4, por lh a temperatura ambiente. A seguir, foram adicionadas

a curva padrão, a amostra controle, constituída por um "pool" de soro humano

normal (SHN), utilizado como controle em todos os ensaios, e as amostras de

soro a serem testadas.

o "pool" de soro humano normal foi preparado com 100 amostras de

soro de adultos saudáveis doadores de sangue, provenientes de várias regiões

da Grande São Paulo. Estas amostras foram analisadas no laboratório do Banco

de Sangue do Hospital "Albert Einstein", obedecendo aos critérios da triagem de

doadores: adultos sadios de 18 a 60 anos, de ambos sexos, com reações

sorológicas negativas para HIV, HTLV I/lI, hepatites B e C, doença de Chagas e

sífilis. O "pool" foi formado por 0,5 ml de cada uma das 100 amostras de soro,

foi centrifugado durante 10 minutos a 3.500 rpm e dividido em alíquotas de

lml, que foram estocadas a -70°C até o momento do uso.

Em todas as placas foi adicionada a curva padrão constituída por uma

amostra de soro de adulto saudável com concentrações conhecidas de

anticorpos IgG e IgM anti-LPS 0111, previamente estabelecidas em um

trabalho anterior (Palmeira et aI., 2006). Todas as amostras foram testadas em

4 diluições seriadas em duplicatas e diluídas de 1:50 a 1:400 em PBS NaCl

O,35M Tween 20 0,2% acrescido de 10% de leite desnatado e incubadas em

duplicatas por 24 h a 4° C.

Depois de novas lavagens com PBS Tween 20 0,1%, as placas foram

incubadas com conjugado anti-IgG ou anti-IgM humano marcados com

peroxidase (Sigma, USA) nas diluições de 1:1.500 e 1:1.000, respectivamente,

por 2 h a 37° C. Em seguida às lavagens, foi adicionada solução de substrato

contendo 0,4 mg/ml de ortofenilenodiamina (Sigma, USA) em tampão citrato

fosfato O,lM, pH 5,0 e água oxigenada (H202) 0,01% (1001JI/poço). Após

30 minutos de incubação, a reação enzimática foi interrompida pela adição de

SOJlI de H2S04 2,5N. A absorbância foi lida em leitor para microplacas no

comprimento de onda de 492nm (Labsystems, Finland). Os valores foram

calculados para cada teste com o programa (GraphPad Prism 1.2, USA), e os

resultados expressos em mg/I.


--------------------------------3.7 Determinação dos níveis séricos de anticorpos IgG anti

Streptococcus pneumoniae

A mensuração de anticorpos IgG reativos com polissacarídeos capsulares

dos sorotipos 1 (cód. # 161-X), 3 (cód. # 169-X), 5 (cód. # 177-X), 6B (cód. #

225-X), 9V (cód. #253-X), e 14 (cód. # 197-X) do pneumococo (ATCC, MO,

USA), em 48 amostras de soro pré e pós-vacinais, foi determinada utilizando-se

a técnica de ELISA conforme descrita por Koskela (1987) e adaptada por

Sorensen et alo (1996). A dosagem das amostras de soro pré e pós-vacinais de

cada paciente foi realizada simultaneamente, com o objetivo de evitar

variabilidade inter-ensaio.

No primeiro dia, microplacas (Maxisorp, Nunc, MA, USA) foram

adsorvidas (100~l/poço) com 10 ~g/ml dos pOlissacarídeos capsulares,

sorotipos 1, 3, 5, 6B, 9V e 14, diluídos em tampão PBS 7,4 e incubadas a 37°C

durante 5 horas. Após esse período as placas foram incubadas por 18 horas a

4°C.

No segundo dia, as amostras de soro, o "pool" Helena, utilizado como

controle, formado por um "pool" de soros de adultos saudáveis não imunizados

com a vacina pneumocócica, e o "pool" pneumo, soro de indivíduos adultos

saudáveis, vacinados com a vacina Pneumo-23®(Pasteur-Merriex), foram

diluídos inicialmente (1:11) em tampão BSA (soroalbumina bovina, Sigma, MO,

USA) 1% em PBS Tween 20 0,1 % contendo (50 IJg/ml) do antígeno

polissacarídeo C (Statens Seruminstitut, Denmark, Cód 252130), proveniente da

parede celular do pneumococo, e incubados durante 30 minutos a temperatura

ambiente.

Após esta primeira incubação, as placas foram lavadas por 3 vezes com

PBS Tween 20 0,10/0. A seguir, foram adicionados às placas o soro padrão, o

controle e as amostras em 4 diluições seriadas e em duplicatas, a partir da

diluição inicial de 1:220, 1:110 e 1:55, respectivamente, diluídos com tampão

BSA (Sigma, MO, USA) 1% em PBS Tween 20 0,10/0 e incubados por 2 horas a

temperatura ambiente. Após incubação, as placas foram novamente lavadas e

incubadas com 50 IJI por poço do conjugado constituído por anticorpo

•


monoclonal anti-IgG humano marcado com peroxidase (HP 6043-HRP,

Hybridoma Reagente Laboratory, Baltimore, MD, USA) diluído 1:4.000 em

tampão BSA 10/0 em PBS Tween 20 0,1% por lh30 min a temperatura

ambiente.

Após novas lavagens, foi adicionada a solução de substrato contendo

ortofenilenodiamina (OPD) (Sigma); a 10 mg/ml em tampão citrato-fosfato

O,lM, pH 5,0 e água oxigenada (H202) 0,010/0 (100jJl/poço) e deixada reagir

por 30 min no escuro a temperatura ambiente. A reação foi interrompida pela

adição de 50 ~I/poço de ácido sulfúrico (H2S04) a 2,5N. As absorbâncias foram

lidas em leitor de placàs em comprimento de onda 492nm (Labsystems,

Finland).

Foram considerados válidos os ensaios cujos resultados do soro controle,

analisado em todos os ensaios, estavam dentro do limite de variação

estabelecido previamente (variação inter-ensaio menor do que 20%).

Para a avaliação das concentrações de IgG dessas amostras, foram

utilizados como valores normais de referência os níveis estabelecidos pela

Doutora Patricia Barros Nunes (Tese apresentada à Universidade Federal de

São Paulo - UNIFESP/EPM para obtenção do título de Doutor, 1999), que utiliza

como critério de soroconversão os níveis iguais ou superiores a 1,3 mg/I contra

pelo menos 4 sorotipos ou níveis pós-vacinais pelo menos 4 vezes acima dos

níveis pré-vacinais, determinado por Sorensen et alo (1996).

Nesta tese foi estudado um grupo de 120 crianças saudáveis de várias

faixas etárias, residentes da Favela Paraisópolis - cidade de S. Paulo, coletadas

no Hospital Israelita Albert Einstein. Os critérios de seleção foram: crianças

saudáveis eutróficas com idade entre 6 e 144 meses, com ausência de doença

aguda febril no momento de inclusão no estudo, não portadoras de doenças

crônicas ou em investigação (imunodeficiências, anemias, cardiopatias,

neuropatias, doenças consuntivas).


----------------------------------------------3.8 Análise Estatística

Para análise dos dados, além da análise descritiva, foram empregados

os seguintes testes não paramétricos:

Teste de correlação de Spearman foi empregado para correlacionar as

concentrações de imunoglobulinas séricas totais (IgG, IgM, IgE), subclasses

de IgG (lgG2, IgG3, IgG4), IgA sérica e salivar, dosagens de IgG anti-toxóide

tetânico, níveis de anticorpos IgG e IgM anti-LPS 0111 e as concentrações de

IgG para os sorotipos 1, 3, 5, 68, 9V, 14 (pré e pós-vacinais).

Teste de Mann-Whitney foi empregado para comparação entre as

concentrações séricas de IgE, IgE anti-Do pteronyssinus e os resultados

positivos e negativos obtidos na leitura do teste cutâneo para B/omia

tropica/is, Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides farinae.

Nos testes, fixou-se o alfa em 0,05 ou 5% o nível de rejeição da

hipótese de nulidade.

24 4. Resultados

4. RESULTADOS

4.1 Determinação de níveis séricos e secretores totais

Do total de 50 pacientes incluídos neste estudo, 29 (58°/0) são do sexo

masculino e 21 (42%) são do sexo feminino. Vinte e quatro crianças

apresentaram a primeira manifestação clínica, ou seja, a primeira crise de

chiado, antes dos seis meses de idade; 16 tiveram a primeira manifestação

entre seis meses e um ano de idade, e outras 10 crianças apresentaram os

primeiros sintomas acima de um ano de idade.

Quanto aos diferentes tipos de manifestações clínicas infecciosas, 15 dos

50 pacientes apresentaram menos de dois tipos, 27 apresentaram de 3 a 6

tipos, e 8 pacientes apresentaram mais de 6 tipos. Essas manifestações são

àquelas observadas até o momento do estudo.

A maioria dos pacientes fazia uso de corticosteróides inalatórios orais

e/ou nasais (44 dos 50 pacientes estudados), apenas um paciente fazia uso de

corticosteróides inalatórios orais e tópicos nasais e/ou oculares, e 5 pacientes,

por motivos pessoais, não estavam utilizando corticosteróides no momento da

coleta, apesar da prescrição médica.

As principais manifestações clínicas diagnosticadas em nossos pacientes

estão representadas a seguir, na figura 1.

25 4. Resultados

Outras

Meningite

Infec. Herpes

ftI Estomatite u :5 Õ

ITU

~ Infec. eut. Fúngica

.fi Sinusite J!

Otite '2 ftI ~

Amigdalite

Pneumonia

Diarréia

IVAS ~ O 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

No de crianças (%)

Figura 1. Porcentagem das diferentes manifestações clínicas infecciosas observadas nas 50 crianças com asma persistente moderada e grave. ITU - Infecção do trato urinário; NAS - Infecção das vias aéreas superiores.

A tabela 1 apresenta a análise estatística descritiva com as médias,

medianas, desvio padrão da média, valores mínimo e máximo e limites de

confiança dos níveis de IgG, IgA e IgM, IgE séricos, IgG2, IgG3, e IgG4 séricos

e IgA secretória em 50 amostras de pacientes com asma.

Tabela 1. Análise descritiva das concentrações de imunoglobulinas sencas totais (mg/dl), de subclasses de IgG séricas totais (mg/dl) e de IgA secretória (mg/I) em 50 amostras de crianças com asma persistente moderada e grave.

IgG IgA IgM IgE IgG2 IgG3 IgG4 IgAS* (mg/dl) (mg/dl) (mg/dl) (UI/ml) (mg/dl) (mg/dl) (mg/dl) (mg/I)

Média 1.262,64 147,95 129,0 1.921,65 322,0 205,0 110,35 135,2

Mediana 1.232,0 144,95 117,0 1.145,5 271,2 75,0 71,0 107,95

DP 256,5 61,8 51,3 1.887,0 208,1 34,5 106,4 124,1

Mínimo 851,0 1,0 25,5 38,1 100,5 31,0 2,0 2,2

Máximo 1.966,0 317,4 258,0 10.320,0 1.040,0 205,0 461,0 737,0

IC195% 1.189,75 130,9 114,0 1.385,4 263,7 75,85 80,1 99,9

ICS 95% 1.335,5 165,5 143,0 2.457,9 382,0 95,5 140,6 170,5

IgAS - IgA secretória Iq - Intervalo de confiança inferior DP - Desvio Padrão ICS - Intervalo de confiança superior

26 4. Resultados

Os resultados de todos os testes realizados com as 50 amostras de

crianças asmáticas estão em anexo (Anexo 11).

A maioria das crianças apresentou concentrações séricas totais de IgG

normais, ou seja, dentro dos padrões de normalidade para cada idade (média =

1.262,6 + 256,5 mg/dl) e 9 pacientes (18%) apresentaram valores acima

desses padrões (Figura 2).

2250

2000

1750

- 1500 :E CI

.5. 1250 C) ~

1000

750

500

250

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- - - P3 '-'- P50 ... .. P97

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o 1 2 3 4 5 6 8 10 12 Muitos

Idade (anos)

Figura 2. Distribuição dos níveis séricos de IgG (mgjdl) em 50 pacientes com asma persistente moderada e grave, comparados aos valores de referência normais para a população brasileira, mostrando os percentis 3, 50 e 97 (Adaptado de Fujimura, 1990).

A concentração média de IgM sérica observada nos 50 pacientes

estudados foi de 129,0 + 51,3 mg/dl. Altos níveis dessa imunoglobulina foram

observados em 12 desses pacientes (24%) e apenas uma criança apresentou

concentração (25,5 mg/dl) abaixo do percentil 3 (Figura 3).

4. Resultados

='O

300

250

200

~ 150 :t 9

100

50

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o 1 2 3 4 5 6 8 10 12 Adultos

Idade (anos)

27

Figura 3. Distribuição dos níveis séricos de IgM (mgjdl) em 50 pacientes com asma persistente moderada e grave, comparados aos valores de referência normais para a população brasileira, mostrando os percentis 3, 50 e 97 (Adaptado de Fujimura, 1990).

Foram observadas concentrações normais de IgA sérica (média = 147,95

+ 61,8 mg/dl) na maioria dos pacientes, com exceção de 2 crianças que

apresentaram concentrações acima do percentil 97 e de outras 6 que

apresentaram níveis abaixo do percentil 3. Dessas seis crianças, uma (paciente

nO 30) apresentou concentração de IgA sérica abaixo de 7mg/dl (Figura 4).

4. Resultados

400

350

300

_250 '5

!200 ~

150

100

50

o

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o 2 3 4 5 6 8 10 12 Adultos

Idade (anos)

28

Figura 4. Distribuição dos níveis sé ricos de IgA (mg/dl) em 50 pacientes com asma persistente moderada e grave, comparados aos valores de referência normais para a população brasileira, mostrando os percentis 3, 50 e 97 (Adaptado de Fujimura, 1990).

As concentrações de imunoglobulinas séricas totais (lgA, IgG e IgM)

encontradas nos pacientes estudados foram submetidas à análise estatística

descritiva e representada em gráfico Box-plot (Figura 5).

2200. 1966,0

~17001 $ média E maior valor ';' 1200

~ 75%

F2:J~ 151 ,0

25%

251.0 • menor valor .2 240

~ ~ § 160 E - 80

· O

IgA IgG IgM

Figura 5. Distribuição dos níveis séricos de IgG, IgA e IgM (mg/dl) em 50 pacientes com asma persistente moderada e grave. São mostrados os valores extremos, percentis 25% e 75%, mediana e média. * Pacientes que apresentaram valores de IgA e IgM abaixo da curva de normalidade.

29 4. Resultados

Na figura 6 observamos que 48 pacientes (96%) apresentaram níveis de

IgE sérica total elevados (média = 1.921,65 + 1.887,0 UI/ml).

100000

10000

e 1000 E ::. ::J -w ~ 100

'1 1 •

"- - - - Valores de referência

• Pacientes

• • • •

I • •

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o 1 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Adultos

Idade (anos)

Figura 6. Distribuição dos níveis séricos de IgE (UI/ml) em 50 pacientes com asma persistente moderada e grave. A curva indica os valores de normalidade estimados em população européia (Dati & Ringel, 1982).

Os níveis sé ricos de IgG2 e IgG3 foram elevados, acima do percentil 97,

em 16 (32%) e 12 (24%) pacientes, respectivamente. Nenhum paciente

apresentou níveis dessas duas subclasses abaixo do percentil 3 (Figuras 7 e 8).

No entanto, 4 pacientes (8%) apresentaram baixa concentração de IgG4 e 26

(52%) apresentaram altos níveis desta subclasse (Figura 9).

30 4. Resultados

1200

1000 -_.- P3 • 800

.- . - P50 • • .• . •• P97

600 • • Pacientes • • •

400 • : -:E 400 DI

S 350 N (!) 300 !li

250

200

150

100

50

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Idade (anos)

Figura 7. Distribuição dos níveis séricos de IgG2 (mg/dl) em 50 pacientes com asma persistente moderada e grave, comparados aos valores de referência normais para a população brasileira, mostrando os percentis 3, 50 e 97 (Adaptado de Fujimura, 1990).

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. . .• . . P97

• Pacientes

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o 1 2 3

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Idade (anos)

8 10 12 Adultos


4. Resultados

500

400

300

200

-~ 100 CI

.§. 100 ~ <!) ~ 80

60

40

20

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• Pacientes

• • • •

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o 1 2 3 4 5 6 8 10 12 Adultos

Idade (anos)

31


Os resultados obtidos com as amostras de crianças foram submetidos ao

teste de correlação de Spearman, considerando os níveis de imunoglobulinas

séricas totais e subclasses de IgG. Pudemos observar que não houve correlação

entre os valores das diferentes classes imunoglobulinas. No entanto, coeficientes

estatisticamente significantes, apesar de baixos, foram observados quando

comparamos os níveis de IgG2 com IgG4 (r=O,2975; p = 0,0373), de IgG com

IgG4 (r=0,3408; p = 0,0171) e de IgE com IgG4 (r=0,3432; p = 0,0163).

Quarenta e quatro crianças apresentaram níveis de IgA secretória

compatíveis com os valores de normalidade. Três apresentaram níveis abaixo

do percentil 2,5, sendo que uma (paciente nO 30) apresentou apenas traços

desta imunoglobulina na saliva (2,2 mg/I) e três pacientes apresentaram

valores acima do percentil 97,5 (Figura 10).

4. Resultados

800

1 700

600

E' 300 g S 250 .. :s f 200 u CI) li)

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100

50

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• Pacientes

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O 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Idade (anos)

32

Figura 10. Distribuição dos níveis de IgA secretória (mgjl) avaliados em salivas de 50 pacientes com asma moderada e grave, comparados aos valores de referência normais para a população brasileira, mostrando os percentis 2,5, 50 e 97 (Adaptado de Nagao et al./1990).

A figura 11 apresenta os resultados de IgA sérica total comparados aos

resultados de IgA secretória dosadas nos soros e nas salivas, respectivamente,

dos 50 pacientes com asma persistente moderada e grave. A análise

comparativa entre os níveis de IgA sérica e IgA secretória . demonstrou uma

baixa correlação entre os valores, porém estatisticamente significante (r =

0,3553; P = 0,0129).

300 Â. Â. Â.Â. Â.

200

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Â.Â.

~ 30

20

10

O

Secretória Sérica

Figura 11. Níveis de IgA -sérica e secretória em amostras de soro e saliva, respectivamente, de 50 pacientes com asma moderada e grave. A unidade das concentrações de IgA secretória foi convertida de mgjl para mgjdl para efeito de comparação com algA sérica.

33 4. Resultados

4.2 Níveis sé ricos de anticorpos IgE anti-Dermatophagoides

pteronyssinus

A análise dos níveis de IgE anti-Dermatophagoides pteronyssinus

demonstrou elevados níveis de IgE específico (classes 4, 5 e 6) na maioria das

amostras testadas (76%). Apenas 5 pacientes (10%) apresentaram resultados

negativos destes anticorpos (Figura 12).

101

- 76 c:::: ::l ~ - 51

! c 26 'u; tIJ >- 1 c e 1.00 t d 0.75

I :g c cu 0.50 w 9 0.25

0.00 o 2 3 4 5 6

Classes

Figura 12. Níveis séricos de IgE anti-Dermatophagoides pteronyssinus (KU/I) em 50 pacientes com asma persistente moderada e grave. Classe O corresponde a níveis menores que 0,35 (negativo); classe 1 corresponde a níveis entre 0,35 e 0,70 (fraco); classe 2 corresponde a níveis entre 0,70 e 3,50 (moderado); classe 3 corresponde a níveis entre 3,50 e 17,50 (alto); classe 4 corresponde a níveis entre 17,50 e 50,0 (muito alto); classe 5 corresponde a níveis entre 50,0 e 100,0 (muito alto) e classe 6 corresponde a níveis maiores que 100 KU/I (muito alto).

Os resultados obtidos com as 50 amostras testadas foram submetidos ao

teste de correlação de Spearman, considerando os níveis de anticorpos IgE

reativos com o Dermatophagoides pteronyssinus e também os níveis séricos

totais de IgE. Esta análise demonstrou um alto coeficiente de correlação,

estatisticamente significante, entre os níveis de IgE total e IgE anti

Dermatophagoides pteronyssinus (r = 0,6813; P = O).

34 4. Resultados

4.3 Teste cutâneo de leitura imediata por puntura

Os testes cutâneos para Dermatophagoides pteronyssinus (ácaro),

Dermatophagoides farinae (ácaro da farinha) e Blomia tropicalis ( ácaro) foram

realizados em 41 pacientes (Anexo lI).

Foi observado que 22 crianças apresentaram teste positivo para B.

tropicalis (54%), 26 apresentaram teste positivo para D. farinae (63%), e

outras 26 crianças apresentaram teste positivo para D. pteronyssinus (63%).

No entanto, foi observada uma resposta negativa para os 3 testes em 11

crianças (27%) e outras 16 crianças (39%) apresentaram resposta positiva

para os 3 testes. Um total de 12 crianças (29%) apresentou positividade para

dois testes e 2 pacientes (5%) apresentaram resposta para apenas um dos

testes.

Não foi observada correlação entre os níveis séricos de IgE total e os

resultados do teste cutâneo para os 3 tipos de alérgenos testados. O teste de

Mann-Whitney demonstrou que houve uma correlação significativa entre os níveis

de IgE anti-Dermatophagoides pteronyssinus e o teste cutâneo para B. tropicalis

(p = 0,0053); o mesmo ocorreu para o teste cutâneo com D. farinae (p = 0,0115)

e para o teste cutâneo com D. pteronyssinus (p = 0,0064). Estes resultados

indicam que as amostras que apresentaram alta concentração de IgE sérica anti

D. pteronyssinus, também apresentaram resultados positivos para os 3 alérgenos

utilizados no teste cutâneo.

4.4 Níveis sé ricos de anticorpos IgG anti-toxóide tetânico

Os resultados obtidos de anticorpos IgG anti-toxóide tetânico das 50

amostras de soro das crianças estão representados na tabela 2, com pontos

representando os valores mínimo e máximo, assim como a média e a mediana

e intervalos de confiança. Todas as crianças foram consideradas em conjunto,

sem levar em conta as idades. Doze crianças (24%) apresentaram níveis destes

anticorpos abaixo do considerado protetor (0,5 Ulfml).

35 4. Resultados

4.5 Níveis séricos de anticorpos IgG e IgM anti-LPS 0111

Os níveis de anticorpos IgM e IgG anti-LPS 0111 variaram amplamente

nas 49 amostras testadas. Foram observadas concentrações dentro do valor de

normalidade na maioria dessas amostras. Apenas 5 crianças apresentaram

níveis de anticorpos anti-LPS 0111 acima da normalidade: 3 crianças (6%) para

IgM anti-LPS 0111, e duas (4%) para IgG anti-LPS 0111 (Figura 13).

1000

e-g 100 ..... ..... ..... o ~

10 .J • ~ s:::: 1~ ~

til O e-O u 0.1 ~

~

0.01

122,60

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e

• 1,70

IgM

105,00

0,13

IgG

mediana

média

• maior valor

• 75%

• 25%

• menor valor

Figura 13. Representação das faixas das concentrações de anticorpos IgG e IgM antiLPS 0111 das 49 amostras de soros de crianças com asma persistente moderada e grave. O gráfico apresenta os valores extremos, percentis 25% e 75%, mediana e média.

Os resultados obtidos com as 49 amostras testadas foram submetidos ao

teste de correlação de Spearman, considerando os níveis de anticorpos IgG e

IgM específicos para o LPS 0111 e também os níveis séricos totais de IgM e IgG,

bem como as subclasses de IgG. Não foi observada correlação entre os níveis de

anticorpos IgG e IgM anti-LPS 0111. A análise demonstrou que não houve

correlação entre os níveis de IgG total e de anticorpos IgG anti-LPS 0111. No

entanto, foi verificada uma baixa, mas significante correlação entre os níveis de

IgG4 totais e os níveis de IgG anti-LPS 0111 (r = 0,3001, P = 0,01810).

36 4. Resultados

o mesmo se observou entre os níveis de IgM total e IgM anti-LPS, porém com

um coeficiente de correlação mais alto (r = 0,5446; p<O,OOOl).

A tabela 2 apresenta as médias, limites de confiança, desvio padrão da

média dos valores de anticorpos IgM e IgG anti-LPS 0111, IgG anti-toxóide

tetânico e IgE anti-Do pteronyssínus em amostras de soro de 50 crianças com

asma.

Tabela 2. Análise estatística descritiva dos níveis de anticorpos IgM e IgG anti-LPS 0111, IgG anti-toxóide tetânico e IgE anti-O. pteronyssinusem amostras de soro de 50 crianças com asma persistente moderada e grave

Anticorpos anti- Anticorpos anti- Anticorpos anti-LPS 0111 (mg/I) tetânicos D. pterony"'ssinus

IgM IgG IgG {UI/ml} IgE {KUll}

n 49 49 50 50

Média 23,4 8,0 2,55 61,2

Mediana 17,7 3,8 1,1 79,05

DP 23,8 17,0 3,5 41,8

Mínimo 1,7 0,13 0,22 0,35

Máximo 122,6 105,0 16,0 100,0

leI 95% 16,6 3,1 1,5 49,4

ICS 95% 30,3 12,9 3,5 73,1

DP - Desvio Padrão ICI - Intervalo de confiança inferior ICS - Intervalo de confiança superior n - nO de amostras testadas

4.6 Níveis sé ricos de anticorpos IgG anti-S. pneumoniae

A tabela 3 demonstra a análise estatística descritiva com as médias,

medianas, desvio padrão da média, valores mínimo e máximo e limites de

confiança dos níveis de anticorpos IgG reativos com antígenos pneumocócicos,

dosados antes e após a imunização com a vacina 23-valente não conjugada

(Aventis-Pasteur) em 48 pacientes com asma.

37 4. Resultados

Tabela 3. Níveis de anticorpos IgG (mgjl) pré e pós-vacinais reativos com os sorotipos 1, 3, 5, 66, 9V, 14 de S. pneumoniae em 48 amostras de soro das crianças com asma persistente moderada e grave.

PSl PS3 PSS PS6B PS9V PS14

Pré Pós Pré Pós Pré Pós Pré Pós Pré Pós Pré Pós

Média 1,9 7,4 2,0 2,4 3,2 6,2 2,8 9,7 2,0 7,3 5,9 26,7

Mediana 1,7 4,8 1,5 1,7 2,7 4,0 2,35 4,2 1,6 4,85 2,75 13,55

DP 1,4 8,1 1,8 2,1 2,5 5,6 2,15 18,6 1,6 7,7 8,3 32,8

Mínimo 0,3 0,8 0,3 0,14 0,4 0,5 0,5 0,5 0,2 0,2 0,6 0,6

Máximo 6,1 43,S 9,9 10,2 13,9 22,8 9,4 114,4 7,1 39,7 49,4 164,6

1095% 1,5 5,0 1,45 1,8 2,5 4,55 2,2 4,3 1,5 5,1 3,5 17,2

ICS95% 2,3 9,7 2,5 3,0 3,9 7,8 3,5 15,1 2,4 9,5 8,3 36,2

PS - Polissacarídeo 10 - Intervalo de confiança inferior DP - Desvio Padrão ICS - Intervalo de confiança superior

As médias dos níveis antes da imunização foram maiores que 1,3 mgjl,

para todos os sorotipos analisados. Após a imunização todos os níveis

aumentaram. Dos 48 pacientes analisados, 44 responderam adequadamente à

imunização; 4 não responderam adequadamente à vacina, sendo que 2 desses

pacientes responderam somente a 3 sorotipos, e 2 pacientes apresentaram

resposta pós-vacinal somente a um dos sorotipos. Entre os sorotipos testados,

verificamos que o sorotipo 14 promoveu os maiores níveis de anticorpos

específicos e o sorotipo 3, os menores níveis desses anticorpos (Figura 14).

38 4. Resultados

207.9 -. I - rrédia I 104 •

52

-. 26 1;, g 13 o ! ~5

i :~ ~ I ~ ~ ~ I Y 1 ~ 0.41

0.203

0.1015 Pré PÓS Pré PÓS Pré Pós Pré Pós Pré Pós Pré Pós

PS 1 PS 3 PS 5 PS 6 PS 9 PS 14

Figura 14. Níveis séricos de IgG anti-PS1, PS3, PS5, PS68, PS9Ve PS14 (mgjl) em 48 pacientes com asma persistente moderada e grave. O gráfico apresenta os valores extremos (1= valor máximo e 2= valor mínimo), percentis 25% (3) e 75% (4), mediana (5) e média.

A tabela 4, apresenta os índices de correlação entre os níveis de

anticorpos anti-pneumococos pré e os pós-imunização para cada polissacáride e

o incremento obtido após a imunização.

Tabela 4. Análise de correlação de Spearman e incremento considerando as concentrações de anticorpos IgG (mgjl) pré e pós-vacinais reativos com os sorotipos 1, 3, 5, 68, 9V e 14 de S. pneumoniae em 48 amostras de soro das crianças com asma persistente mod:..:e:..:..,.ra=..;d::..:a=-=.e ...... 9!.:..ra=-v;:..:e:.,:.. ______________ _

r (p) Incremento

PS 1 Pré PS 1 Pós 0,3670 3,9

(p=0,01l9)

PS 3 Pré PS 3 Pós 0,9312 1,2

(p=O)

PS 5 Pré PS 5 Pós 0,7249 1,9

(p=O)

PS 6B Pré PS 6B Pós 0,6358 3,5

(p=O)

PS 9V Pré PS 9V Pós 0,4763 3,7

(p=O,OOll)

PS 14 Pré PS 14 Pós 0,5481 4,5

(~=OLOO022 r - Coeficiente de correlação p - Nível de significância com nível de confiança de 95%.

39 5. Discussão

5. DISCUSSÃO

A asma é considerada uma das mais importantes doenças crônicas na

infância, devido a sua alta incidência, e ao aumento na morbidade e

mortalidade observado nos últimos anos.

No presente trabalho, foi realizada uma ampla avaliação da imunidade

humoral em crianças com asma persistente moderada ou grave, que não

estavam fazendo uso de corticosteróides sistêmicos, caracterizadas por

elevados níveis séricos totais de IgE, altos níveis de anticorpos IgE anti-Do

pteronyssinus e, pela presença, na maioria dos casos, de testes cutâneos

positivos para os alérgenos ambientais Dermatophagoides pteronyssinus,

Dermatophagoides farinae e B/omia tropica/is.

Foi detectada deficiência de IgA sérica e IgA secretória em 1 paciente,

de IgG4 em 4 pacientes e de IgM em uma criança. Por outro lado, foram

observados níveis séricos totais elevados de IgG, IgG2, IgG3, IgG4 e IgM.

A maior parte dos pacientes apresentou resposta significativa de IgG anti

toxóide tetânico e níveis normais de anticorpos IgG e IgM anti-LPS 011!.

Apesar da resposta significativa de anticorpos IgG anti-pneumococo observada

na maioria das crianças, foram encontrados 2 pacientes com deficiência de

resposta de anticorpos para polissacarídeos.

Diversas anormalidades imunológicas têm sido descritas em pacientes

com asma, incluindo hipogamaglobulinemia e deficiência de subclasses de IgG

(Hamilos et aI., 1992). No entanto, muitos estudos são prejudicados pelo

tratamento concomitante com corticorteróides sistêmicos, que podem induzir

estas imunodeficiências (Settipane et aI., 1978; page et aI., 1988; Hoeger et aI.,

1994). Em nosso estudo, nenhuma criança fazia uso de corticosteróides orais.

Deste modo, as concentrações observadas de imunoglobulinas séricas totais

não foram influenciadas pelo uso desse medicamento.

Os mecanismos envolvidos na influência dos esteróides sobre a síntese

de imunoglobulinas ainda não foram descobertos, mas um estudo sugere uma

inibição na captação de antígenos por células apresentadoras de antígenos e

40 5. Discussão

quantidade e função diminuída de células T CD4+, levando a produção

prejudicada de imunoglobulinas.

Pacientes asmáticos graves apresentam diversas condições que os

predispõem a uma suscetibilidade maior a infecções no trato respiratório, que

estão associadas tanto com a fisiopatologia da asma, quanto à influência de

medicações na resposta imunológica.

No estudo realizado por Ludviksson et a!. (2005), foram avaliadas 179

crianças com predisposição genética para atopia e outros processos alérgicos

entre 18 e 23 meses e posteriormente, 161 crianças foram reavaliadas entre

42 e 48 meses. Aos 18/23 meses, 37% destas crianças desenvolveram

manifestações alérgicas definitivas, como asma, eczema atópico e otites. Foi

observada uma prevalência maior em crianças com baixos níveis séricos de IgA

e com altos níveis de IgE. As crianças que apresentaram concentrações

relativamente altas de IgA pareciam estar protegidas contra atopia. Aos

48 meses, a proporção de crianças com manifestações alérgicas foi reduzida

para 31%, porém não houve mais a associação entre asma e baixos níveis de

IgA, e de modo inverso, altos níveis de IgA foram detectados nos asmáticos, o

que pode refletir a persistente estimulação antigênica na mucosa respiratória.

Deste modo, na primeira faixa etária estudada, baixas concentrações de IgA

sérica poderiam facilitar a sensibilização de crianças predispostas, e aos 48

meses, os níveis relativamente elevados de IgA não preveniram ataques

asmáticos nas crianças já sensibilizadas.

Em trabalho anterior, estes mesmos autores indicaram que a freqüência

e severidade das manifestações alérgicas em crianças aos 2 anos de idade

estão mais relacionadas a baixos níveis de IgA sérica, porém dentro da

normalidade, do que com níveis altos de IgE (Ludviksson et a!., 1992). Otites

recorrentes e infecções do trato respiratório também são mais comuns em

crianças com níveis normais baixos de IgA sérica, porém ainda dentro da curva

de normalidade (Ludviksson et a!., 1992; Eiriksson et a!., 1994).

No presente trabalho, a proporção de pacientes com deficiência de IgA

encontrada é semelhante ao trabalho de Carneiro-Sampaio & Solé (1999), no

41 5. Discussào

qual foram estudadas crianças portadoras de quadros moderados e graves de

asma brônquica, e foi encontrada uma proporção de deficiência de IgA de 1:50.

Uma proporção semelhante (18,5%) de pacientes com sinusite

recorrente ou crônica, com idades entre 7 e 15 anos, apresentou valores de IgA

sérica abaixo do percentil 3, sendo que um deles foi diagnosticado como

deficiente de IgA (Costa-Carvalho et aI., 2005).

Ainda no trabalho de Ludviksson et a/. (2005), do grupo de 161 crianças

estudadas, na faixa etária de 42 a 48 meses, 12 (7%) apresentaram

diagnóstico recente de rinite alérgica. Estas crianças demonstraram níveis de

IgA sérica e salivar mais baixos, este resultado foi significativo para IgA salivar.

Foi observada uma fraca, mas significante correlação entre IgA sé rica e salivar.

Este dado pode explicar as freqüentes infecções no trato respiratório

apresentadas por estas crianças, pois algA secretória tem um papel

fundamental na imunologia de mucosas, prevenindo a ligação de bactérias e

toxinas as células epiteliais da mucosa, neutralizando vírus e se ligando a

diversos antígenos alimentares, prevenindo sua entrada na circulação (Loftus et

aI., 1988).

Alguns investigadores relataram a ausência transitória de IgA na saliva

de 18% da população durante o primeiro ano de vida. A partir desta idade,

tanto algA monomérica, quanto algA secretória estão presentes na saliva,

(Cripps et aI., 1989). Isso poderia ser explicado por um transporte de IgA

mediado por um componente secretor imaturo nestas crianças.

o desenvolvimento de alergia tende a estar associado com altos níveis

de IgA total e IgA alérgeno-específica na saliva, porém com baixos níveis de

IgA secretória (Bottcher et aI., 2002). Deste modo, altos níveis de IgAS podem

proteger crianças sensibilizadas de desenvolver sintomas alérgicos acima dos

2 anos de idade, dando suporte a um possível papel protetor da IgAS contra o

desenvolvimento de alergia.

Por outro lado, a falta de sintomas clínicos em pacientes deficientes de

IgA pode ser devido a um aumento de células B com IgM de superfíCie e um

aumento de IgM secretória na mucosa (Brandtzaeg et aI., 1987).

42 S. Discussão

A IL -4 produzida por linfócitos Th2 é importante na regulação da

produção de anticorpos, pois ativa e induz a proliferação de células B, protege

as da apoptose (Brown & Hural, 1997) e pode aumentar a produção de IgA

(Yano et a/., 1992). Uma alta produção de IL-4 em crianças que desenvolverão

alergia posteriormente poderia explicar, não somente uma produção

aumentada de IgE, mas também os altos níveis de IgA salivar encontrados em

indivíduos alérgicos (Bottcher et aI., 2002).

Ambos níveis de IgA e sensibilização alérgica podem ser afetados por

uma resposta deficiente de TGF-~, pois esta citocina não somente estimula a

produção de IgA, mas pode também indiretamente inibir a proliferação das

células Th2 (Lee & Rich, 1993), cujas citocinas têm um papel importante na

patogenia inicial das doenças atópicas (Robinson, 2004).

A associação entre a deficiência de IgA e de subclasses de IgG tem sido

descrita (Oxelius et a/., 1981; Umetsu et a/., 1985). Alterações nas

concentrações séricas de subclasses de IgG têm sido reportadas em infecções

respiratórias crônicas ou recorrentes (Silk & Geiia, 1988; De Baets et a/., 1992;

Gross et a/., 1992; Ribeiro, 1994;) e também em pacientes asmáticos (Loftus et

aI., 1988; Silk & Geiia, 1988). Os baixos níveis de subclasses de IgG durante as

infecções podem ser interpretados por uma produção insuficiente, um aumento

no consumo ou uma meia-vida reduzida (Janeway, 2001).

Em geral, antígenos protéicos promovem principalmente resposta de

IgG1 e IgG3, ao passo que antígenos polissacarídicos induzem resposta de

IgG2. Nos pacientes que . apresentam infecções do trato respiratório superior,

IgG3 é de particular importância, pois é a subclasse responsável pela resposta à

Moraxe//a catarrha/is e à proteína M de Streptococcus pyogenes (Goldblatt et

a/., 1994). Grandes quantidades de IgG3 são induzidas em várias infecções

virais, incluindo a infecção pelo vírus sincicial respiratório (Ferrante et a/.,

1990).

Stanley et a/. (1984) obtiveram altas concentrações de IgG, IgA, IgM,

IgG1 ou IgG2 em 27% dos pacientes com infecções respiratórias crônicas ou

recorrentes.

43 5. Discussão

Gross et aI. (1992) estudaram 267 pacientes com infecções respiratórias

recorrentes e não foram detectadas deficiências totais de imunoglobulinas e

subclasses de IgG em nenhum paciente estudado. No entanto, 27% dos

pacientes apresentaram baixas concentrações de imunoglobulinas, porém

dentro dos valores de normalidade, e 26% dos que apresentaram valores

normais, apresentaram deficiências na resposta de anticorpos.

Esporadicamente, deficiência de IgM tem sido relatada em pacientes

afetados por infecções recorrentes, atopia, asplenia e doenças auto-imunes

(Sorensen & Moore, 2000). Apesar de, no presente trabalho, termos observado

um paciente com baixo nível de IgM sérica, foi encontrado um número muito

maior de pacientes com níveis altos desta imunoglobulina. Ribeiro (1994)

também observou níveis elevados de IgM em asmáticos, independente da

existência prévia de infecções pulmonares.

Segundo trabalho de Lui et aI. (2002), a média dos níveis de IgM nos

pacientes do grupo com infecções respiratórias excedeu os limites superiores

para a idade, ao contrário dos valores normais obtidos com o grupo sem

infecções recorrentes.

Costa-Carvalho et a/. (2005) observaram valores altos de IgM em 63%

dos pacientes com sinusite crônica ou recorrente. Foram encontrados baixos

níveis em duas ou mais subclasses de IgG em 26% das crianças com sinusite

recorrente ou crônica que participaram deste estudo.

Em trabalho realizado com 58 pacientes com doença pulmonar obstrutiva

crônica, 25% apresentaram deficiência em alguma subclasse de IgG, no

entanto estes pacientes estavam fazendo uso de esteróides (O'Keefe et aI.,

1991). Muitos estudos que relataram a deficiência de subclasses de IgG na

asma não foram bem controlados e não atentaram para os efeitos do

tratamento com esteróides · sistêmicos (Page et aI., 1988; Mazer & Gelfand,

1991). As concentrações de todas as imunoglobulinas e subclasses de IgG

começam a decrescer após duas semanas do início do tratamento (Settipane et

aI., 1978). Por outro lado, esteróides inalatórios raramente causam estes efeitos

colaterais (Sheffer, 1991).

44 5 Di5CU5Sâó

Lui et aI. (2002) avaliaram em São Paulo, os níveis de IgA, IgM, IgE, IgG

e subclasses de IgG em 41 crianças de 7 a 15 anos com asma grave,

comparando dois grupos, com (n=12) e sem (n=29) infecções respiratórias

recorrentes. A deficiência de IgA ou de subclasses de IgG foi encontrada em 10

pacientes com infecções e em 16 sem infecções. A deficiência mais comum

encontrada foi de IgG3, em 6 pacientes do grupo sem e 12 do grupo com

infecções. Seis pacientes com infecções (50% do total) e 3 sem infecções (10%

do total), apresentaram deficiência de IgG4 e um paciente de cada grupo

apresentou deficiência de IgG2. Estes autores concluem que deficiências de IgA

e IgG foram encontradas nos dois grupos e portanto, estas não podem ser

indicativas de um futuro desenvolvimento de infecções nestas crianças.

Nossos resultados estão de acordo com os resultados de Heiner (1984),

o qual demonstrou altos níveis de IgG4 em pacientes asmáticos e de Hoeger et

aI. (1994), que observaram concentrações desta subclasse significativamente

mais altas nos asmáticos graves quando comparados aos controles saudáveis.

Moss et aI. (1992) observaram um predomínio de deficiência de IgG4,

detectada em 17,1% das 123 crianças estudadas com infecções respiratórias

recorrentes, contra apenas 7% no grupo controle, constituído por crianças

atópicas sem infecções.

Células B com IgG4 de superfície estão presentes nos sítios de mucosa, e

níveis mais elevados de IgG4 são encontrados nas secreções, quando

comparados ao soro, sugerindo um papel biológico desta subclasse na mucosa

(Keller et aI., 1988; Ogawa et aI., 1989). Esta sugestão torna-se ainda mais

provável ao considerarmos o perfil efetor não-inflamatório da IgG4, que é

semelhante algA (Grill et aI., 1984; Grill et aI., 1985). Provavelmente a

estimulação antigênica crônica, que promove o switch de classes para IgG4, é a

causa deste enriquecimento de IgG4 na mucosa (Ogawa et aI., 1989).

Em nosso trabalho, a correlação encontrada entre os níveis séricos de

IgG4 e os de IgG anti-LPS 0111, poderia ser justificada pela afirmação acima

de que IgG4 pode ter um papel importante na mucosa do trato gastro-

45 5. Discussàó

intestinal, como um anticorpo neutralizante de bactérias enteropatogênicas,

apesar deste estudo não estar descrito na literatura.

Alguns autores acreditam que a IgG4 possa neutralizar antígenos ou

bloquear reações alérgicas (Aalberse et ai, 1993). Outros demonstraram que

esta subclasse age como um anticorpo anafilático em alguns casos de alergia

alimentar (Shakib et ai, 1986).

Os resultados obtidos em nosso trabalho mostram que 96% dos

pacientes alérgicos estudados apresentam concentrações de IgE acima do valor

de normalidade. Estes resultados mostraram correlação com os níveis totais de

IgG4, confirmando os dados da literatura que demonstram a produção destas

imunoglobulinas induzidas por IL-4 secretada por células Th2. Em pacientes

com asma atópica, a produção aumentada de interleucina-4 (IL-4) e produção

diminuída de interferon-y (IFN-y) estão associadas com concentrações séricas

elevadas de IgE, IgG4 e IgG1 (Rousset et ai, 1991; Bergstedt-Lindqvist et aI.,

1988; Lundgren et aI., 1989).

No trabalho de Pereira et aI. (2005), altos níveis de IgG4 foram

detectados no grupo positivo para Blomia tropicalis mostrando uma moderada,

mas significante correlação com IgE específico, indicando que IgG4 pode agir

como anafilático potente e amplificar os níveis de anticorpos mais do que

bloquear. No mesmo trabalho, foi observado um padrão de reconhecimento

antigênico de Blomia tropicalis por IgG4 comparável ao de anticorpos IgE,

analisados por immunoblotting, demonstrando mais uma vez, um mecanismo

comum no switch para estas imunoglobulinas induzido por linfócitos do tipo

Th2.

O alto nível de IgE monomérica, característico de pacientes asmáticos,

ocasiona a ligação desta imunoglobulina ao receptor FCeRI, com alta afinidade,

na superfície dos mastócitos que sofrem degranulação e liberam vários

mediadores inflamatórios pré formados, como a histamina, desencadeando a

reação de hipersensibilidade imediata do tipo I (Metzger, 1992).

46 5. Discussão

o teste cutâneo realizado no presente trabalho revela este fenômeno,

pois avalia a presença de anticorpos IgE específicos nos receptores Fcs

presente na superfície dos mastócitos (Mori et a!., 2001).

Níveis séricos de IgE são elevados em 80% dos pacientes com dermatite

atópica, e alguns autores associam estes níveis com a severidade da doença, já

outros pesquisadores relatam que os níveis de IgE são ainda mais altos quando

a dermatite está associada com asma e/ou rinite (Ogawa et a!., 1971; Jones &

Sampson, 1993).

Nossos resultados mostram que 73% dos pacientes apresentam testes

cutâneos positivos para Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides

farinae e B/omia tropica/is. Corroborando com os nossos resultados, Mori et a!.

(1993) estudaram pacientes com doença respiratória alérgica, e observaram

uma positividade de 80% para estes 3 alérgenos, considerados prevalentes em

nossa população.

B/omia tropica/is é um ácaro que se adapta bem ao ambiente doméstico

e tem sido descrito como parte da fauna da poeira doméstica no Brasil. Estudos

epidemiológicos demonstram a prevalência do Dermatophagoides pteronyssinus

e B. tropica/is (Jorge et a!., 1980). Dermatophagoides pteronyssinus, D. farinae

e B/omia tropica/is são poeiras domésticas predominantes em países tropicais

(Fernandez-Caldas et a!., 1993).

No estudo de Costa-Carvalho et a!. (2005) foi pesquisada a resposta de

IgE específica para estes alérgenos inalantes, para fungos e alérgenos

alimentares através da técnica de RAST. Foi observado que 24 das 27 crianças

com sinusite recorrente ou crônica apresentaram resultado positivo (classe

maior ou igual a lU) de IgE específico para os antígenos inalantes, e nenhuma

criança apresentou resultados positivos para fungos e alérgenos alimentares.

No presente trabalho, no teste de RAST, foram dosados anticorpos IgE

anti-Do pteronyssinus. Altos níveis destes anticorpos foram encontrados,

indicando a prevalência deste alérgeno em nosso ambiente. Quando foram

comparados os resultados do RAST e os resultados positivos do Prick test,

observou-se uma reatividade cruzada entre os anticorpos dirigidos a estes

47 5. Discussão

antígenos, pois foram achados índices de correlação entre anticorpos séricos

IgE anti-Do pteronyssinus e os resultados positivos para os 3 alérgenos

testados. Arruda et aI. (1991) demonstraram 33% de reatividade cruzada entre

B/omia tropica/is e Dermatophagoides pteronyssinus, e 43% de homologia entre

os alérgenos 810 t 5 e Der p 5.

Independente da concentração de imunoglobulinas, se o histórico clínico

da criança indica que uma melhor investigação é necessária, a pesquisa da

capacidade da criança de produzir anticorpos frente a diversos antígenos, é o

próximo passo na avaliação.

Uma falha na resposta a antígenos protéicos indica potencialmente um

problema sério na imunidade humoral. Para tanto, realizou-se, por meio de

ELISA, a detecção de anticorpos anti-toxóide tetânico. A maior parte dos

pacientes, cerca de 76%, apresentou resposta imunológica significativa.

No trabalho de Gross et aI. (1992), apenas 4% dos pacientes com

infecções respiratórias crônicas não responderam ao toxóide tetânico, e todos

eles passaram a responder após um booster da vacina. Em nosso trabalho,

algumas crianças não haviam sido recentemente vacinadas, o que explica a

menor porcentagem de indivíduos que apresentaram níveis protetores para este

antígeno.

Em um trabalho realizado com crianças atópicas e saudáveis (grupo

controle) previamente vacinadas, nenhuma diferença na resposta de anticorpos

IgG reativos com tétano, difteria e coqueluche foi encontrada (Holt et aI.,

2000).

No estudo de Costa-Carvalho et aI. (2005), após a imunização com a

vacina Pneum023R® (Sanofi-Pasteur), foi observado aumento dos níveis de

anticorpos para os sorotipos 1, 3, 5, 68, 9V, 14 em todos os pacientes com

sinusite recorrente/crônica, incluindo os pacientes com baixos níveis de IgA,

IgG2 e IgG3. Foram detectados níveis de anticorpos adequados para 6

sorotipos em 81% dos pacientes analisados e 19% apresentaram resposta para

cinco sorotipos. O sorotipo 14 apresentou os níveis mais elevados. Estes

resultados estão de acordo com os nossos.

48 5. Discussào

Quanto ao nível protetor mínimo de anticorpos para cada sorotipo em

seres humanos, o valor não está bem estabelecido. O critério descrito na

literatura, no qual considera-se resposta adequada à vacinação, a produção de

anticorpos IgG pós-vacinais em concentração > 1,3 mg/I ou um aumento maior

do que 4 vezes dos níveis pré-vacinais, contra pelo menos 4 dos 6 sorotipos

avaliados, é freqüentemente utilizado como indicador de resposta vacinal

(Sorensen, 1998).

Os sorotipos 1, 3, 5, 6B, 9V, 14 foram escolhidos para avaliar a resposta

pós-vacinal porque além de termos o ensaio imunoenzimático já padronizado

em nosso laboratório, esses são os sorotipos que têm sido avaliados em

estudos realizados em nosso meio (Barros-Nunes, 1999; Pedreira, 2002), e por

estarem mais freqüentemente associados com infecções (Brandileone et aI.,

2003; Mantese, 2003). Os sorotipos 1 e 5 continuam sendo os mais detectados

no país, principalmente em crianças com pneumonia (Brandileone, 2003).

Observou-se correlação positiva entre os níveis pré e pós-vacinais de

anticorpos anti-pneumococo. Independente da maioria das crianças já

apresentarem concentrações significativas de anticorpos antes da imunização,

com exceção do sorotipo 3, a concentração de anticorpos pós-vacinais foram

significativamente maiores, revelando a imunogenicidade da vacina contra os

sorotipos 1, 5, 6B, 9V e 14, que despertaram a produção de anticorpos

variando de 1,9 (sorotipo 68) a 4,5 (sorotipo 14) vezes a concentração das

amostras pré-vacinais.

No trabalho de Gross et aI. (1992), 21% dos pacientes com infecções

recorrentes responderam adequadamente à vacina pneumocócica

(Pneumovax), sendo os sorotipos 7 e 14 os menos imunogênicos, e o sorotipo

3, o mais imunogênico. O sorotipo 3 tem sido considerado um bom imunógeno

por alguns autores (Douglas, 1983; Hidalgo, 1996). No entanto, os trabalhos

realizados em nossa população sistematicamente descrevem o sorotipo 14

como mais imunogênico (Pedreira et aI., 2002; Simonsen, 2005; Costa-Carvalho

et aI., 2005). Em adultos e idosos brasileiros saudáveis, os sorotipos 3 e 6B

apresentaram a menor imunogenicidade, os sorotipos 1 e 5 apresentaram

49 5. Discussão

resposta significativa e, o maior aumento de anticorpos foi observado para o

sorotipo 14 (Simonsen, 2005).

Em nosso trabalho foram encontrados 2 pacientes com deficiência de

anticorpos para polissacarídeos. Esta imunodeficiência é considerada freqüente

em pacientes maiores de 2 anos de idade com infecções respiratórias

recorrentes, e existe também a associação com doenças atópicas, como

dermatite e asma (Lane & MacLennan, 1986; Gross et aI., 1992).

No estudo de Ayres & Thompson (1997) foi analisada a resposta de

anticorpos para tétano, difteria, antígenos pneumocócicos e para um extrato

preparado com antígenos do polissacarídeo capsular de 6 linhagens de E co/i

em pacientes com asma severa, pacientes com exacerbação da asma em cada

episódio de infecção do trato respiratório e pacientes com asma leve. Não foi

observada diferença na resposta de anticorpos para os 3 grupos estudados.

Os níveis de anticorpos anti-LPS 0111 observados em nosso trabalho

estão de acordo com os obtidos no trabalho de Zapata-Quintanilla et aI. (2006),

que estudou a resposta de anticorpos para E co/i diarreiogênicas e LPS 0111,

0157 e 055 em adultos brasileiros saudáveis. Neste trabalho, foram

encontrados níveis de anticorpos IgG e IgM anti-LPS 0111 acima do valor de

cut-off em 3 e 7% das amostras, respectivamente. Em nosso trabalho foram

encontrados valores equivalentes, apenas 4% apresentaram níveis elevados de

IgG anti-LPS 0111 e 6% das crianças apresentaram níveis elevados de IgM

anti-LPS 0111.

O nível de cut-off utilizado em nosso trabalho foi determinado

previamente em outro estudo de nosso grupo que avaliou a resposta de

anticorpos anti-LPS 0111, 026 e 0157 de Escherichia co/i enterohemorrágica

(EHEC) em crianças saudáveis de 2 meses a 10 anos de idade de nossa

população (dados não publicados). Não houve diferença significativa entre os

níveis destes anticorpos ao compararmos as crianças asmáticas com as crianças

saudáveis e adultos estudados previamente (Zapata-Quintanilla et aI., 2006).

Estes resultados indicam que, como esperado, as crianças asmáticas têm a

capacidade de responder a antígenos timo-independentes tipo 1, uma vez que

50 5. Discussâ'o

a principal classe de anticorpos produzida é do tipo IgM, o que também pode

explicar a correlação encontrada entre IgM sérica total e anticorpos IgM anti

LPS 0111, no presente trabalho.

Em conclusão, embora existam dados controversos na literatura a

respeito dos níveis de imunoglobulinas e subclasses de IgG em pacientes

asmáticos e/ou atópicos, a detecção de algumas imunodeficiências e a

resposta imune inadequada a diferentes antígenos foram detectadas em

freqüências semelhantes às descritas na literatura. Deste modo, uma ampla

avaliação da resposta imune humoral demonstrou ter relevância para uma

melhor abordagem clínica destes pacientes. ........... B IBL IOT EC A

Faculdade de Ciências Farmacêuticas Universidade de São Paulo

51 6. Conclusões

6. CONCLUSÕES

As principais conclusões da avaliação da imunocompetência humoral do

grupo de crianças com asma moderada e grave, sem uso de corticosteróides

sistêmicos e com atopia comprovada por níveis elevados de IgE total, IgE anti

Dermatophagoides pteronyssinus e testes cutâneos positivos para os principais

alérgenos ambientais foram:

• Concentrações normais e altas de IgG e IgM séricas totais, no

entanto foram observadas deficiência de IgM em um paciente e de

IgA sérica e secretória em outro paciente;

• Concentrações normais e elevadas de IgG2, IgG3 e IgG4, porém 4

pacientes apresentaram deficiência de IgG4;

• Níveis séricos adequados de IgG anti-toxóide tetânico e de

anticorpos IgG e IgM anti-LPS 0111, e para os sorotipos 1, 3, 5,

68, 9V e 14 de S. pneumoniae. Foram encontrados 2 pacientes

com deficiência de resposta de anticorpos para polissacarídeos.

Foram identificadas imunodeficiências bem caracterizadas em 3 crianças

asmáticas, podendo levar claramente a infecções, o que prioriza a importância

da avaliação da imunidade humoral.

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Anexo J "----- - - _._---

ANEXO I

DEPARTAMENTO DE PEDIATRIA - UNIFESP - EPM

DISCIPLINA DE ALERGIA, IMUNOLOGIA CÚNICA E REUMATOLOGIA

PROTOCOLO DE IMUNODEFICIÊNCIAS

64

Data:--.-1 --.-1_

1. N° de identificação: ______ _

2. Nome: ____ ---'-_________ _

3. Rg HSP: ______ _

4. Sexo: (1) Fem (2) Masc

5. Etnia: (1) Branco (2) Negro (3) Mulato (4) Índio (5) Amarelo

6. Data de Nasc. (dd/mm/aaaa):--.-1--1_

7. Endereço: _____________ _

8. Telefone: _____________ _

9. Diagnóstico: ___ _

10. Idade da la manifestação clínica: _____ _

11. Idade do diagnóstico: ______ _

12. Medicações em uso: ___________ _

13. Coleta de sangue: (1) Não (2) Sim - Data:--.-1--1_

14. Histórico de Infecções:

Idade do 1° Freqüência Ag. Etiol Medicações em uso

episódio durante a infecção

IVAS

OMA

Amigdalite

Sinusite

Pneumonia

Infec. Herpes

Infec. Cut Fúngica

Diarréia

!TU

Ane,\D 1 ----- -_ .. _--_._ ._----_._-----------------_.

Meningite

Estomatite

Osteomelite

Outras

15. N.O de internações: __ _

16. UTI: (1) Não (2) Sim

17. História de atopia: (1) Não (2) Sim

18. Consangüinidade: (1) Não (2) Sim

19. Evolução Clínica nos últimos 6 meses (Grupo dos Asmáticos):

19.1 N.O de crises: __ _

19.2 Sintomas intercrises: (1) Não (2) Sim

19.3 Idas ao PS: (1) Não (2) Sim - N.O de vezes: __

19.4 Internações: (1) Não (2) Sim - N.O de vezes: __

65

19.5 Necessidade de corticóide sistêmico: (1) Não (2) Sim - N.O de vezes: __

EXAMES LABORA TORIAIS

(1) Normal (2) t (3) J (4) Não realizado

20.lgG ( ) 21. IgA ( ) 22.lgM ( ) 23.lgE ( )

24. IgG 1 ( ) 25. IgG 2 ( ) 26. IgG 3 ( ) 27. IgG 4 ( )

28. CH 50 ( ) 29. C 2 ( ) 30. C 3 ( ) 31. C4( )

32. Unf. CD3 ( ) 33. Unf. CD4 ( ) 34. Unf. CD8 ( )

HEMOGRAMA: (1) Presente (2) Ausente (3) Não realizado

35. Anemia ( ) 36. Policitemia ( ) 37. Plaquetopenia ( )

38. Plaquetose ( ) 39. Leucopenia ( ) 40. Leucocitose ( )

41. Neutropenia ( ) 42. Neutrofilia ( ) 43. Unfopenia ( )

44. Unfocitose ( ) 45. Eosinofilia ( ) 46. Monocitose ( )

47. Outros:

48. Resposta à vacina pneumocócica:

(1) Resp. O - 2 sorotipos (2) Resp. 3 - 4 sorotipoS (3) Resp. 5 - 6 sorotipoS

c )

99

c ) oue~~.L "ZS

odweJes "OS C) sn/ll./doUJaeH "6t-

opezlleaJ ogN CE) a~uasnv CZ) a~uaSaJd (l)

,'(961) sO:J!?JoJd s6'r1 e S:J'rI ap og5npOJd

IOXéli./(?'

ANEXO II - Resultados de todos os testes realizados com os 50 pacientes com asma persistente moderada e grave

PrickTest LPSOll1 PSl PS3 PSS PS6 PS9 PS14 Id IgA IgG IgM li! E IgG2 IgG3 IgG4 IgAS 1T BT DF DP IgM IgG Pré Pós Pré Pós Pré Pós Pré Pós Pré Pós pré Pós RAST

1 10 170,5 1041,0 100,2 3569,0 219,0 109,0 54,0 136,2 0,3 NT NT NT 33,6 4,8 0,8 31,6 0,8 1,2 1,6 21,7 1,2 12,2 3,2 5,0 49,4 62,6 >100 2 9 249,5 1558,0 108,3 833,1 268,8 118,0 96,6 182,8 1,1 NT NT NT 14,7 0,7 2,7 3,2 1,3 1,2 2,6 2,4 3,9 7,4 3,5 8,0 1,2 1,3 24,00 3 5 87,4 1122,0 104,6 480,1 203,9 83,0 30,3 106,2 0,7 + + + 5,4 4,0 1,7 11,2 1,6 1,7 3,7 6,2 2,9 2,9 3,1 17,8 2,6 3,3 30,70 4 8 106,4 1507,0 211,6 1092,0 178,1 61,0 34,0 77,8 0,5 - 17,7 3,8 0,4 5,3 0,8 0,5 0,7 0,5 1,1 0,6 0,4 1,0 1,0 0,6 52,40 'Si 11.11. 11:63,,1 1I.636,)(j) 18,;9 3333';(j) 285,;01 1'53,;01 11.5,)(i) M(j)/;8 1,,2 + + - 26,,2 5,,3 1';6 1i1j6 '5,,3 16,,'9 3,;5 11.'9,,11. 4,,3 2.(j),,43,;92~,3 8,11. 7(j),,1I. :84r,2(j) 6 6 114,5 1104,0 82,2 516,9 127,0 57,0 34,0 184,0 0,5 - 11,3 1,8 0,8 4,7 0,5 0,3 1,5 2,5 1,0 1,2 1,4 2,6 0,8 1,4 1,18 7 10 317,4 1116,0 106,5 409,2 129,0 48,0 8,0 144,1 0,6 + + 6,0 2,9 1,7 1,8 2,9 3,7 3,2 14,9 2,9 5,5 2,1 4,7 2,7 57,8 62,40 8 10 135,5 1235,0 215,1 896,7 121,0 135,0 2,0 160,8 0,3 + + + 122,6 1,6 1,4 1,8 0,3 0,1 3,4 2,0 2,3 2,4 2,4 2,2 7,7 13,5 0,42 9 12 285,8 1555,0 127,9 1059,0 228,0 153,0 132,0 164,6 0,4 NT NT NT 15,9 4,9 0,9 1,2 0,7 0,6 1,5 1,4 3,3 10,3 0,7 0,8 2,2 25,2 >100 ° 9 116,4 1562,0 123,4 964,7 282,0 87,0 82,0 67,6 1,6 NT NT NT 17,5 1,0 1,8 4,6 1,7 1,3 3,0 3,4 2,3 2,8 1,5 2,0 2,8 6,8 27,80 1 10 186,0 965,4 83,7 1477,0 217,0 35,0 79,0 135,8 0,6 + + + 22,2 1,0 0,7 0,8 0,7 0,6 1,8 7,6 1,2 1,7 0,9 1,4 2,1 15,2 47,10 2 12 121,8 1291,0 169,5 2064,0 317,0 68,0 39,0 112,1 0,6 + + NT 112,6 1,1 4,0 5,0 1,9 2,3 9,0 9,3 6,0 7,2 5,7 7,9 5,9 35,3 >100 3 7 78,4 1260,0 108,3 3453,0 351,0 71,0 204,0 130,7 0,4 + + 83,7 105,0 0,6 3,8 0,5 0,6 1,0 2,8 1,0 1,6 0,4 1,3 0,6 5,3 85,50 4 7 62,6 1364,0 84,8 5241,0 273,6 71,0 193,0 74,4 2,3 + + + 8,0 12,4 2,1 4,9 1,5 1,6 3,7 3,9 3,2 3,7 1,7 2,4 2,4 8,3 >100 5 7 147,8 1297,0 187,8 4114,0 624,0 74,0 245,0 109,0 0,7 + + 21,0 0,1 0,8 3,3 1,4 1,9 2,8 3,9 1,0 2,2 0,7 3,2 1,3 15,6 >100 6 9 165,8 1269,0 200,0 42,5 307,0 97,0 106,0 75,4 0,7 - 29,5 3,8 1,9 15,2 4,1 5,6 2,0 7,1 2,6 5,7 2,1 6,8 4,5 53,9 <0,35 7 12 84,2 865,8 48,3 249,6 282,8 93,0 13,0 71,1 0,4 + + + 3,7 0,5 1,2 4,0 1,5 3,3 2,0 4,4 1,6 10,6 3,9 11,3 1,5 32,5 41,30 8 11 91,8 1263,0 81,1 38,1 402,2 67,0 16,0 173,7 1,4 NT NT NT 11,3 0,5 NT 14,1 NT 7,4 NT 6,9 NT 4,7 NT 7,7 NT 77,7 <0,35 9 9 199,4 1229,0 118,9 744,1 201,0 31,0 310,0 737,0 0,9 + + + 21,6 1,4 1,1 11,0 0,9 0,8 1,5 2,6 1,3 2,0 0,9 12,0 1,6 19,5 97,30

° 7 44,2 1786,0 154,7 2858,0 388,5 135,0 10,0 35,9 1,1 + + + 20,5 60,4 2,5 3,9 2,1 2,6 4,7 4,6 4,0 3,7 2,4 11,9 3,3 164,6 >100 1 4 178,6 1203,0 134,8 166,0 118,0 117,0 9,0 50,1 1,7 - 10,9 10,1 1,0 2,7 1,8 2,2 1,5 4,0 1,2 1,7 0,8 7,2 3,9 4,9 2,81 2 10 192,8 1040,0 76,3 2908,0 286,0 48,0 125,0 43,4 3,5 + + 8,0 13,6 1,9 14,8 1,8 3,9 3,1 6,8 2,3 3,9 1,7 6,6 4,5 50,0 74,40 3 7 105,3 1052,0 114,5 833,1 156,0 83,0 90,0 61,4 2,0 + + + 35,6 4,4 1,0 1,1 1,0 1,3 1,4 1,3 1,3 4,5 5,0 3,8 17,6 78,4 18,20 4 10 77,7 1020,0 25,5 963,3 457,0 99,0 58,0 55,0 0,8 NT NT NT 1,7 2,6 2,9 7,3 5,5 5,4 3,4 6,0 4,3 4,5 4,2 11,7 6,2 13,3 73,80 5 12 218,1 1161,0 103,1 4060,0 301,0 70,0 12,0 121,1 1,4 + + - 13,0 4,0 3,7 9,1 4,4 5,3 6,9 14,4 6,1 11,8 3,2 6,9 6,2 8,5 >100 6 9 258,1 1161,0 118,9 1495,0 238,6 64,0 50,0 57,4 2,5 + + + 13,2 3,0 4,1 7,0 0,7 1,6 1,6 8,1 5,8 6,6 3,4 4,3 0,9 1,3 >100 7 9 112,8 1334,0 67,4 4495,0 383,0 77,0 79,0 94,9 16,0 + + + 11,4 2,6 4,2 4,6 5,7 4,9 3,0 3,6 6,2 6,1 3,0 5,0 11,6 18,7 >100 8 5 116,0 1228,0 135,0 565,1 436,0 50,0 48,0 106,9 0,3 9,1 12,4 2,0 5,0 2,7 2,6 2,1 2,5 3,1 2,7 1,5 7,4 6,0 27,6 <0,35 9 12 142,7 1390,0 105,8 1209,0 334,0 90,0 396,0 193,9 0,3 + + 11,4 6,1 6,1 9,4 9,9 10,2 5,5 5,4 9,4 8,3 2,9 2,7 11,2 10,8 77,50

° 9 1,0 1737,0 124,9 1185,0 155,0 133,0 461,0 2,2 1,7 + + + 16,8 20,2 2,2 5,4 2,3 2,8 4,3 13,8 5,4 18,4 7,1 7,1 27,8 33,5 >100

1 8 219,6 1081,0 204,4 10320,0 154,0 85,0 243,0 223,8 7,3 NT NT NT 11,6 3,5 0,8 6,7 1,1 2,0 1,8 2,6 1,2 1,4 0,8 2,4 1,2 3,9 >100 2 7 211,9 1101,0 217,20 802,1 127,0 59,0 107,0 99,0 3,2 - 27,1 5,1 0,3 9,8 0,9 1,3 0,4 2,4 0,6 7,1 0,3 2,8 1,7 11,8 <0,35

0\ '-J

ANEXO 11 - Resultados de todos os testes realizados com os 50 pacientes com asma persistente moderada e grave

PrickTest LPSOll1 PSl PS3 PSS PS6 PS9 PS14 Id IgA IgG IgM IgE IgG2 IgG3 IgG4 IgAS TT BT DF DP IgM IgG Pré Pós Pré Pós Pré Pós Pré Pós pré Pós Pré Pós RAST

3 9 68,2 1244,0 112,10 491,1 129,0 104,0 59,0 113,4 2,7 + + + 21,0 3,6 0,6 2,8 1,1 1,4 1,2 3,2 1,1 1,5 0,7 2,5 1,0 1,2 44,30 4 12 153,4 951,2 64,50 330,1 280,9 76,0 54,0 617,2 0,7 + + + 15,1 1,6 0,4 2,9 0,8 0,8 0,9 2,2 1,2 114,4 0,8 3,0 4,0 25,0 80,60 5 10 180,3 992,5 154,20 921,0 276,0 72,0 51,0 162,4 0,4 NT NT NT 11,6 5,8 2,1 7,6 1,5 1,7 6,6 14,5 3,0 3,7 3,7 7,2 4,5 8,1 >100 6 6 147,,2 UM/TO 103/4.0l '5n,;8 8&6j.0l '59,.,:0 63j (l) lLil6,,3 m;9 - 18,}6 l "il i(l),,4 3,,2 il.,:o il.73 l,.il il.,.3 !()),'5 1.()),;5 i(l),,4 1,4 1,0 3;8 19,40 7 7 131,1 1256,0 101,50 2522,0 229,6 69,0 62,0 59,9 8,0 NT + + NT NT NT 5,2 NT 2,3 NT 9,1 NT 6,9 NT 3,1 NT 4,8 >100 8 9 250,1 1055,0 160,80 3516,0 170,3 95,0 56,0 229,0 1,6 NT + + 26,7 4,0 3,2 8,0 1,7 1,7 5,0 5,3 3,8 3,7 2,2 2,7 13,6 13,6 >100 9 6 113,5 1548,0 212,20 1106,0 266,5 93,0 133,0 90,4 5,5 - 38,2 5,2 2,0 17,9 3,2 4,7 6,2 11,0 2,6 59,7 2,1 17,0 1,9 36,9 <0,35 O 12 157,0 1966,0 161,60 4531,0 855,0 53,0 188,0 88,5 1,0 NT NT NT 25,8 6,9 5,8 43,5 4,0 8,1 6,7 15,9 8,6 31,0 0,7 13,9 2,4 3,8 >100 1 7 125,4 1810,0 77,80 1344,0 192,8 125,0 352,0 165,7 10,0 - 10,5 3,0 0,7 7,0 1,4 1,1 1,0 1,1 0,8 1,3 0,2 0,2 0,9 0,9 0,56 2 8 162,7 1052,0 163,80 4969,0 260,3 205,0 28,0 95,2 5,6 + + + 42,5 2,6 2,9 3,9 1,1 1,1 5,3 6,1 2,4 7,3 0,2 39,7 1,2 120,0 >100 3 8 106,3 1057,0 210,80 2621,0 100,5 142,0 9,0 60,7 13,6 + + + 19,7 2,3 1,5 4,7 1,6 2,1 13,9 22,8 4,6 34,7 2,9 8,0 15,6 42,7 >100 4 11 184,0 1281,0 72,00 2045,3 588,0 54,0 103,0 129,1 1,1 - + 5,9 4,8 0,5 6,5 1,5 2,1 0,5 1,6 0,6 1,8 0,3 10,8 1,2 23,3 >100 5 11 111,0 851,0 164,00 239,5 557,0 65,0 184,0 153,4 2,6 + + + 44,8 5,2 0,9 1,3 0,6 0,6 1,9 2,7 1,2 6,5 0,4 1,8 1,4 4,7 6,90 6 7 134,0 1407,0 96,00 1670,2 1040,0 36,0 182,0 68,2 1,6 - 18,2 28,0 2,0 3,4 1,4 1,3 3,6 5,2 1,3 1,5 0,7 1,8 7,4 10,3 >100 7 12 164,0 1008,0 120,00 3000,0 599,0 64,0 221,0 54,7 0,4 - + + 11,6 2,1 0,5 2,6 0,6 0,5 1,0 1,2 0,5 0,7 0,7 1,8 2,7 5,8 >100 8 11 160,0 1590,0 178,00 2624,0 707,0 73,0 189,0 145,7 2,5 - 26,2 6,2 3,7 6,0 0,9 0,8 4,5 4,7 6,1 6,2 0,3 0,9 2,8 3,7 2,65 9 10 125,0 1342,0 110,00 501,9 225,0 85,0 27,0 101,6 0,2 - + + 17,8 1,9 2,0 3,4 2,1 2,2 3,3 4,0 3,6 6,9 3,0 28,2 9,9 73,3 4,44 O 6 161,0 978,0 258,00 690,0 248,0 69,0 16,0 79,7 1,1 + - 19,5 1,1 0,7 2,0 1,9 4,5 2,2 2,6 0,7 2,6 0,9 16,3 10,1 49,8 >100

- Idade em anos AS - IgA secretória r - Ensaio não realizado - - B/omia tropica/is : - Dermatophagoides farinae ) - Dermatophagoides pteronyssinus teste cutâneo negativo ; - polissacarídeo \ST - IgE anti-Do pteronyssinus

'" 00

Anexo III

IgG

- - ---- - . __ . -

Anexo III - Valores de referência para diferentes classes e

subclasses de imunoglobulinas

Idade Níveis (mg/dl)

04 a 4,9 anos 564 a 1318

05 a 5,9 anos 564 a 1318

06 a 7,9 anos 665 a 1465

08 a 9,9 anos 672 a 1537

10 a 11,9 anos 739 a 1475

12 a 13,9 anos 680 a 1611

Adulto 739 a 1390

Fujimura, 1990. Tese de Doutorado, Departamento de Pediatria, FMUSP.

IgM


04 a 4,9 anos 58 a 176

05 a 5,9 anos 59 a 166

06 a 7,9 anos 49 a 218

08 a 9,9 anos 67 a 139

10 a 11,9 anos 65 a 134

12 a 13,9 anos 46 a 152

Adulto 81 a 167


69

Anexo Il! ----------

IgA sérica


04 a 4,9 anos 28 a 215

05 a 5,9 anos 50 a 191

06 a 7,9 anos 47 a 267

08 a 9,9 anos 70 a 311

10 a 11,9 anos 113 a 248

12 a 13,9 anos 113 a 254

Adulto 84 a 354

Fujimura/ 1990. Tese de Doutorado/ Departamento de Pediatria/ FMUSP.

IgE

Idade

1 a 5 anos

6 a 9 anos

10 a 15 anos

Adultos

Dati & Ringe/ . C/in Chem 1982; 28:1556.

IgG2

Idade

04 a 4,9 anos

05 a 5,9 anos

06 a 7,9 anos

08 a 9,9 anos

10 a 11,9 anos

12 a 13,9 anos

Adulto

Níveis (UI/ml)

< 60

< 90

< 200

< 100

Níveis (mg/dl)

58 a 247

27 a 242

89 a 261

95 a 331

86 a 368

106 a 368

180 a 372

Fujimura/ 1990. Tese de Doutorado/ Departamento de Pediatria/ FMUSP.

70

71 Anexo 111

--- -----------

IgG3

Idade

04 a 4,9 anos

05 a 5,9 anos

06 a 7,9 anos

08 a 9,9 anos

10 a 11,9 anos

12 a 13,9 anos

Adulto

Níveis (mg/dl)

15 a 118

19 a 140

19 a 110

28 a 105

19 a 104

21 a 82

12 a 92


IgG4


04 a 4,9 anos 3 a 67

05 a 5,9 anos 10 a 30

06 a 7,9 anos 19 a 63

08 a 9,9 anos O a 75

10 a 11,9 anos 16 a 66

12 a 13,9 anos 8 a 84

Adulto 13 a 78


IgA secretória

Percentil Idade

1 a 6 anos (mg/I) > 7 anos (mg/I)

2,5 16,7 54,1

10 22,3 71,1

25 33,8 87,8

50 52,7 119,1

75 71,1 159,9

97,5 122,4 287,0

Nagao, ATet ai, J. Trop. Pediatrics 1995;42:119

72 Anexo [fI ___ o -------------_._ -

IgE Específico (Dl - Dermatophagoides pteronyssinus)

Classes Faixa Interpretação

O < 0,35 KU / L Negativo

1 0,35 - 0,70 KU / L Fraco

2 0,70 - 3,50 KU / L Moderado

3 3,50 - 17,50 KU / L Alto

4 17,50 - 50,00 KU / L Muito Alto

5 50,00 - 100,00 KU / L Muito Alto

6 > 100,00 KU / L Muito Alto

Anexo IV

Anexo IV - PREPARAÇÃO DOS REAGENTES UTILIZADOS

Ácido Sulfúrico, solução 2,5N. Água destilada q.s.p H2S04 (Caal)

PBS NaCI 0,35 M NaCl PBS 7,4 Tween 20

Solução tampão de PBS 7,4 Fosfato bifásico de sódio anidro (Qeel) Cloreto de sódio (Reagen) Água destilada q.s.p Acertar o pH 7,4 com HCI 6N.

Tampão Carbonato -Bicarbonato Carbonato de sódio (Merck 6392) Água destilada q.s.p Bicarbonato de sódio (NaHC03) (Merck 6329) Acertar o pH para 9,0. Guardar em geladeira.

Tampão Citrato-fosfato Ácido cítrico (Merck 21549) Fosfato de sódio bibásico (Qeel) Água destilada Acertar o pH para 5,0.

402 ml 30 ml

20,5 9 1000 ml 2,0 ml

17,91 9 8,8 9 1000 ml

0,923 9 1000 ml 7,662 9

7,4 9 9,9 9 1000 ml

Separar em alíquotas de 100 ml e guardar congelado.

73

Anexo IV

Solução de Substrato com OPD Q-Phenylenediamine Dihydrochloride (Sigma P 8287) 10 mg Tampão citrato fosfato 25 ml Perhydrol 30% (Merck 7209) 10 IJI

Tampão de Lavagem Tween 20 (Sigma P 1379) PBS 7,4

1 ml 1000 ml

74

Anexo IV

RELAÇÃO DE EQUIPAMENTOS UTILIZADOS

Centrífuga refrigerada de mesa, modelo RT6000B, SOrva I Instruments. Centrífuga refrigerada de mesa para tubos tipo "Eppêndorf", modelo 5403. Eppendorf. Equipamento para filtração de água, modelo Milli-Q, Millipore, USA. Estufa, modelo 4101, Nova Ética, São Paulo, Brasil. Freezer -700C, modelo 8425 SB-E, Forma Scientific, Marietta, Ohio, USA. Lavadora de placas de EUSA, modelo Denley, Labsystem, Finlândia. Leitor de EUSA, Labsystem Multiskan MS, Labsystem; Finlândia. Nefelômetro BN100, Dade Behring Marburg Gmbh, USA. pHmetro digital, PHD - 100. Agitador de tubos, phoenix AP 56 Balança semi analítica, marte.

75

Ofício CEP nO 82 /2006

IImo(a). Sr(a). Eabiana GhjJardi. .

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Faculdade de Ciências Farmacêuticas

Comitê de Ética em Pesquisa - CEP

São Paulo, 27 de junho de 2006.

Orientador: Profa. Magda Maria Sales Carneiro Sampaio FBC

Prezado(a) Senhor(a),

o Comitê de Ética em Pesquisa da FCF/USP, em reunião realizada em 26 de

junho de 2006, APROVOU o projeto "Avaliação da imunidade humoral em crianças

portadoras de asma brônquica" (protocolo CEP nO 363) apresentado por Vossa

Senhoria.

Lembramos que após a execução de 50% do cronograma do projeto, deverá

ser apresentado um relatório parcial, de acordo com o Artigo 18 - item C, da Portaria

FCF-111/97.

Atenciosament~,

I 1 ~JJs

' ,I I ./ .. L// '~ ~.

Profa. Ora. Valentina Porta Coordenadora do Comitê de Ética Pesquisa

FCF/USP

Av. Prof. Lineu Prestes, nO 580, Bloco 13 A - Cidade Universitária - CEP 05508-900 - São Paulo - SP Fone 1 Fax: (11) 3091-3677 - e-maU: [email protected]

avaliação da imunidade humoral em crianças com asma ... · a asma é considerada uma das mais...

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