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PRISCILA LAIZ ZIMATH

AVALIAÇÃO DO EFEITO ANTIDEPRESSIVO DO

EXTRATO HIDROALCÓOLICO DAS CASCAS DE

Rapanea ferruginea E COMPOSTOS ISOLADOS EM

ANIMAIS NORMO E HIPERGLICEMICOS

Itajaí

2017

UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS

FARMACÊUTICAS

ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E

SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS

PRISCILA LAIZ ZIMATH





Dissertação submetida à Universidade do

Vale do Itajaí como parte dos requisitos

para a obtenção do grau de Mestre em

Ciências Farmacêuticas.

Orientadora: Profa. Dra. Márcia Maria de

Souza

Co-orientadora: Profa. Dra. Angela

Malheiros

Itajaí (SC)

Agosto de 2017

Ficha Catalográfica

Bibliotecária Eugenia Berlim Buzzi – CRB- 14/963

Z65a

Zimath, Priscila Laiz, 1993-

Avaliação do efeito antidepressivo do extrato hidroalcóolico

das cascas de Rapanea ferruginea e compostos isolados em

animais normo e hiperglicemicos [manuscrito] / Priscila Laiz

Zimath. -

Itajaí, SC. 2017.

172 f. ; il. ; tab. ; graf. ; fig.

Bibliografias f. 121-166

Cópia de computador (Printout(s)).

Dissertação submetida à Universidade do Vale do Itajaí como

parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciências

Farmacêuticas.

“ Orientador: Prof. Dra. Márcia Maria de Souza. ”

“ Coorientador: Prof. Dra. Angela Malheiros. ”

1. Transtorno depressivo. 2.Teoria monoaminérgica. 3. Diabetes

mellitus. I. Universidade do Vale do Itajaí. II. Título

.

CDU: 616.89-008.454

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais, Deise e Junior, pelo carinho, apoio, compreensão, paciência

e confiança depositados em mim. Obrigada por sempre apoiarem minhas

escolhas!

À minha orientadora Márcia Maria de Souza e coorientadora Angela

Malheiros, que contribuiram imensamente para meu crescimento

profissional e pessoal. Muito obrigada pelos ensinamentos e pela confiança

depositada em mim;

Aos professores Ruth Meri Lucinda da Silva, Luísa Mota da Silva e José

Roberto Santin pela colaboração, correções e ajuda na realização de alguns

experimentos;

Às minhas amigas Ariela, Caroline, Elaine, Letícia, Pamella e Maria

Augusta pela paciência, companheirismo e amizade;

À minha amiga Adrielli, por toda a paciência e ajuda durante os últimos 4

anos, obrigada!

Às minhas parceiras de laboratório, Ana Elisa e Ana Paula, que se tornaram

minhas amigas e confidentes. Muito obrigada por toda a ajuda!

Às alunas de iniciação científica Thaís e Camila C., pela ajuda em

experimentos;

Às técnicas dos laboratórios Samantha Santos e Viviane Steimbach;

Aos membros da banca, pelas correções e orientações para conclusão deste

trabalho;

À todos os professores e funcionários do PPGCF;

À UNIVALI, em especial ao Programa de Pós-Graduação em Ciências

Farmacêuticas, pelo apoio financeiro para a realização da pesquisa e à

CAPES pela bolsa de mestrado.

“Alguns homens vêem as coisas como são, e dizem ‘Por quê?’

Eu sonho com as coisas que nunca foram e digo ‘Por que não?'”

Geroge Bernard Shaw





Priscila Laiz Zimath

Agosto/2017

Orientadora: Márcia Maria de Souza, Doutora.

Coorientadora: Angela Malheiros, Doutora.

Área de Concentração: Produtos naturais e substâncias sintéticas bioativas.

Número de Páginas: 164.

O transtorno depressivo maior (TDM) é um dos distúrbios mentais mais prevalentes

nos dias atuais e acomete aproximadamente 322 milhões de indivíduos no mundo. Os

mecanismos fisiopatológicos do TDM ainda não estão totalmente estabelecidos, mas

a hipótese mais aceita para justificar a neuropatologia da doença é a do desequilíbrio

das monoaminas. O TDM é uma comorbidade bastante comum em pacientes com

diabetes mellitus (DM) e um possível mecanismo fisiopatológico que correlacionam

as duas doenças é o aumento do estresse oxidativo devido a hiperglicemia. O objetivo

deste trabalho foi avaliar o efeito tipo-antidepressiva do extrato hidroalcóolico das

cascas de Rapanea ferruginea (EHCRF) e compostos isolados ácido mirsinóico A

(AMA) e B (AMB), em camundongos e o envolvimento do sistema monoaminérgico

no mecanismo de ação desta atividade, bem como investigar o efeito do tratamento

prolongado dos mesmos sobre respostas comportamentais relacionadas com a

depressão e sobre parâmetros do dano oxidativo avaliados no córtex e hipocampo de

animais hiperglicêmicos. Para tanto, EHCRF (50, 100, 150 e 300 mg/kg, v.o.), AMA

(5, 15 e 30 mg/kg, v.o.) ou AMB (3, 15, 30 e 60 mg/kg, v.o.) foram administrados em

camundongos submetidos a testes preditivos de depressão, como o teste do nado

forçado (TNF) e teste da suspensão pela cauda (TSC), splash test (ST) e teste do

campo aberto (TCA). Para o estudo do mecanismo de ação da atividade tipo-

antidepressiva de EHCRF (150 mg/kg), foi utilizado TSC para investigação dos

sistemas monoaminérgicos, dente eles o serotonérgico, noradrenérgico e

dopaminérgico. Também foi avaliado o tempo de ação da propriedade tipo-

antidepressiva do EHCRF, AMA e AMB. Para avaliação da ação de EHCRF (150

mg/kg), AMA (5mg/kg) ou AMB (3 mg/kg) sobre o comportamento depressivo de

ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina (STZ, 75 mg/kg, i.p.), os animais

foram tratados durante 28 dias após a injeção de STZ, e submetidos ao TNF e TCA.

Para análise da ação sobre parâmetros de estresse oxidativo, foram mensurados os

níveis de produto de peroxidação lipídica (LOOH), a redução dos níveis de glutationa

reduzida (GSH) e atividades das enzimas catalase (CAT) e superóxido dismutase

(SOD) no hipocampo e córtex dos animais normo e hiperglicêmicos tratados ou não

com EHCRF, AMA ou AMB. O efeito tipo-antidepressivo de EHCRF foi observado

no tratamento agudo no TSC e TNF tendo essa atividade duração de até 3 horas. AMA

e AMB também apresentaram atividade tipo-antidepressiva em TSC, com duração de

ação de 4 e 6 horas, respectivamente. Quando investigado os sistemas

neurotransmissores e/ou receptores farmacológicos envolvidos no efeito tipo-

antidepressivo do EHCRF, verificou-se que seu efeito foi revertido com o pré-

tratamento com reserpina (4 mg/kg, um inibidor do transportador vesicular das

monoaminas), NAN-190 (0,5 mg/kg, antagonista dos receptores serotonérgicos 5-

HT1A), quetanserina (5 mg/kg, antagonista dos receptores serotonérgicos 5-HT2A),

ondansetrona (0,5 mg/kg, antagonista dos receptores serotonérgicos 5-HT3), prazosin

(1 mg/kg, antagonista α1-adrenérgico), haloperidol (0,2 mg/kg, antagonista

dopaminérgico não seletivo), pimozide (0,2 mg/kg, antagonista dopaminérgico D2),

SCH23390 (0,05 mg/kg, antagonista dopaminérgico D1). Com relação ao

comportamento depressivo de ratos diabéticos induzido por STZ e submetidos ao

TNF, EHCRF (150 mg/kg) e AMA (5 mg/kg) não apresentaram alteraçoes no

comportamento, mas AMB reduziu o tempo de imobilidade quando comparado aos

diabéticos tratados com veículo, apesar de todos os três tratamentos não prevenirem

o aumento os níveis plasmáticos de glicose nem a perda de peso causada pela DM. O

tratamento com EHCRF, AMA e AMB foram capazes de reduzir a atividade

aumentada de CAT e SOD devido a hiperglicemia, assim como foram capazes de

diminuir os níveis de LOOH no hipocampo e córtex. AMB também foi capaz de

impedir a redução dos níveis de GSH no hipocampo. Os resultados apontam que AMB

é um composto com potencial atividade antidepressiva que também age combatendo

danos oxidativos.

Palavras-chave: Transtorno depressivo maior. Teoria monoaminérgica. Diabetes

mellitus. Estresse oxidativo. Rapanea ferruginea.

EVALUATION OF THE ANTIDEPRESSANT EFFECT

OF THE HYDROALCOLIC EXTRACT OF Rapanea

ferrugnea BARKS AND ISOLATED COMPOUNDS IN

NORMOGLICEMIC AND HYPERGLICEMIC

ANIMALS

Priscila Laiz Zimath

August/2017

Advisor: Márcia Maria de Souza, PhD.

Co-advisor: Angela Malheiros, PhD.

Area of Concentration: Natural products and synthetic bioactive substances.

Number of Pages: 164.

Major depressive disorder (MDD) is one of the most prevalent mental disorders today

and affects approximately 322 million people worldwide. The pathophysiological

mechanisms of MDD have not yet been fully established, but the first and most widely

accepted hypothesis to explain the neuropathology of the disease is that of monoamine

imbalance. MDD a fairly common comorbidity in patients with diabetes mellitus

(DM), and a possible pathophysiological mechanism that correlates the two diseases

is the increase of oxidative stress due to hyperglycemia. The objectives of this study

were to evaluate the antidepressive properties of the hydroalcoholic extract of the bark

of Rapanea ferruginea (EHCRF) and the isolated compounds mirsinoic acid A

(AMA) and B (AMB) in mice, and the involvement of the monoaminergic system in

the mechanism of action of this Activity, and to investigate the effect of their

prolonged treatment on behavioral responses related to depression and on oxidative

damage parameters evaluated in the cortex and hippocampus of normoglycemic and

diabetic animals. To that end, EHCRF (50, 100, 150 and 300 mg / kg, p.o.), AMA (5,

15 and 30 mg/kg, p.o.) or AMB (3, 15, 30 and 60 mg/kg, in mice submitted to

predictive tests of depression, such as forced swimming test (FST) and tail suspension

test (TST), the splash test (ST) and the open field test (OFT). For the study of the

mechanism of action of the antidepressive activity of EHCRF (150 mg/kg), TSC was

used to investigate monoaminergic systems, such as the serotonergic, noradrenergic

and dopaminergic systems. The time of action of the antidepressant-type property of

EHCRF, AMA and AMB was also evaluated. To evaluate the action of EHCRF (150

mg/kg), AMA (5 mg/kg) or AMB (3 mg/kg) on the depressive behavior of

streptozotocin-induced diabetic rats (STZ, 75 mg/kg, i.p.), animals treated for 28 days

after STZ injection, and were submitted to TNF and TCA. The levels of lipid

peroxidation (LOOH), reduced levels of reduced glutathione (GSH) and activities of

the catalase (CAT) and superoxide dismutase (SOD) enzymes in the hippocampus

were measured for analysis of the action on oxidative stress parameters. The cortex of

normal and hyperglycemic animals treated, or not treated, with EHCRF, AMA or

AMB. The antidepressant-type effect of EHCRF was observed in the acute treatment

in the TST and FST, with this activity lasting for up to 4 hours. AMA and AMB also

presented antidepressant activity in SSC, with duration of action of 4 and 6 hours,

respectively. Investigating the neurotransmitter systems and/or pharmacological

receptors involved in the antidepressant-type effect of EHCRF, their effect was found

to be reversed with pretreatment with reserpine (4 mg/kg, an inhibitor of the vesicular

monoamine transporter), NAN (0.5 mg/kg, 5-HT1A serotonergic receptor antagonist),

quetanserin (5 mg/kg, 5-HT2A serotonergic receptor antagonist), ondansetron (0,5

mg/kg, 5-HT3 serotonergic receptor antagonist), prazosin (1 mg/kg, α1-adrenergic

antagonist), haloperidol (0,2 mg/kg, non-selective dopaminergic antagonist),

pimozide (0,2 mg/kg, D2 dopaminergic antagonist), and SCH23390 (0,05 mg/kg,

dopaminergic D1 antagonist). In relation to the depressive behavior of STZ-induced

diabetic rats submitted to TNF, EHCRF (150 mg/kg) and AMA (5 mg/kg) showed no

changes in behavior, but AMB reduced immobility time when compared to vehicle-

treated diabetic rats, although none of the three treatments prevented the increase in

plasma glucose levels or weight loss caused by DM. Treatment with EHCRF, AMA

and AMB were able to reduce the increased activity of CAT and SOD due to

hyperglycemia, and were also able to decrease the levels of LOOH in the hippocampus

and cortex. AMB was also able to prevent the reduction of GSH levels in the

hippocampus. The results indicate that AMB is a compound with potential

antidepressant activity that also acts to combat oxidative damage.

Keywords: Major depressive disorder. Monoaminergic theory. Diabetes mellitus.

Oxidative stress. Rapanea ferruginea.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Alvos de ação dos antidepressivos .......................................... 36

Figura 2 - Diagrama simplificado mostrando mecanismos que se acredita

estarem envolvidos na fisiopatologia da depressão. .................................. 40

Figura 3 - Esquema correlacionando hiperglicemia e depressão maior, .. 44

Figura 4 - Mecanismo diabetogênico de STZ. ......................................... 47

Figura 5 - Antioxidantes no combate do ânion superóxido ...................... 48

Figura 6 - Foto da espécie R. ferruginea: a) planta inteira, b) frutos verdes

e folhas, c) cascas do caule. ...................................................................... 53

Figura 7 - Estrutura química do ácido mirsinóico A (1) e B (2). ............. 54

Figura 8 - Estrutura química do ácido mirsinóico A (1) e B (2). ............. 58

Figura 9 - Protocolo experimental............................................................ 62

Figura 10 - Efeito tipo-antidepressivo da administração do EHCRF em

camundongos, no TSC, TNF e ST. ........................................................... 75

Figura 11 - Influência da reserpina no efeito tipo-antidepressivo de EHCRF

.................................................................................................................. 76

Figura 12 - Influência de PCPA no efeito tipo-antidepressivo da

administração de EHCRF .......................................................................... 78

Figura 13 - Influência do NAN-190 no efeito tipo-antidepressivo da

administração de EHCRF. ......................................................................... 79

Figura 14 - Influência da quetanserina no efeito tipo-antidepressivo da

administração EHCRF .............................................................................. 79

Figura 15 - Influência da ondansetrona no efeito tipo-antidepressivo da


Figura 16 - Influência de prazosin no efeito tipo-antidepressivo da


Figura 17 - Influência de ioimbina no efeito tipo-antidepressivo da


Figura 18 - Influência de haloperidol no efeito tipo-antidepressivo da


Figura 19 - Influência de SCH23390 no efeito tipo-antidepressivo da


Figura 20 - Influência de pimozide no efeito tipo-antidepressivo da


Figura 21 - Efeito tipo-antidepressivo da administração de AMA em

camundongos ............................................................................................ 86

Figura 22 - Efeito tipo-antidepressivo da administração de AMB em

camundongos ............................................................................................ 87

Figura 23 - Tempo de duração da atividade tipo-antidepressiva do EHCRF

(150 mg/kg) em animais submetidos ao TSC ........................................... 88

Figura 24 - Tempo de duração da atividade tipo-antidepressiva do AMA (5

mg/kg) em animais submetidos ao TSC .................................................... 89

Figura 25 - Tempo de duração da atividade tipo-antidepressiva do AMB (3

mg/kg) em animais submetidos ao TSC .................................................... 89

Figura 26 - Efeito da administração de INS, IMI, EHCRF, AMA e AMB

na latência e tempo de imobilidade no TNF e número de cruzamentos e

levantadas no TCA em animais normo e hiperglicêmicos ........................ 92

Figura 27 - Efeito da administração prolongada de INS, IMI, EHCRF,

AMA e AMB nos níveis de GSH no hipocampo e córtex de ratos diabéticos

induzido por estreptozotocina ................................................................... 93


no teor de LOOH no hipocampo e córtex de ratos diabéticos induzido por

estreptozotocina ....................................................................................... 94


na atividade de SOD no hipocampo e córtex de ratos diabéticos induzido

por estreptozotocina...................................................................................95


na atividade de CAT no hipocampo e córtex de ratos diabéticos induzido

por estreptozotocina...................................................................................96

Figura 31 - Esquema representativo dos materiais e métodos

utilizados..................................................................................................115

6

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

5-HT - serotonina

ADT - antidepressivos tricíclicos

AGE - produtos finais de glicação glicação avançadas

AMA - ácido mirsinóico A

AMB - ácido mirsinóico B

AMPA - ácido α-amino-3-hidroxi-metil-5-4-isoxazolpropiônico

ANOVA - análise de variância

ATC - ácido tricloroacético

BDNF - fator neurotrófico derivado do cérebro

BHT - butil hidróxi tolueno

CAT - catalase

CDNB - 1-cloro-2,4 dinitrobenzeno

CoQH2 - citocromo C redutase

CPF - córtex pré-frontal

DA - dopamina

DM - diabetes mellitus

DM1 - diabetes mellitus tipo 1

DM2 - diabetes mellitus tipo 2

DSM-V - Manual Estatístico e Diagnóstico de Transtornos Mentais

DTNB - 5,5’-ditiobis 2-ácido nitrobenzóico

EHCRF-1 - extrato hidroalcóolico das cascas de Rapanea ferruginea 1

EHCRF-2 - extrato hidroalcóolico das cascas de Rapanea ferruginea 2

EPM - erro padrão médio

EROs - espécies reativas de oxigênio

FNT-β - fator de necrose tumoral β

GLU - glutamato

GPx - glutationa peroxidase

GSH - glutationa reduzida

GSSG - glutationa oxidada

HbA1 - hemoglobina glicada

HPA - eixo hipotálamo-hipofise-adrenal

IFN-g interferon g

IL-1β - interleucina 1β

i.p. - intraperitoneal

IMAO - antidepressivos inibidores da monoaminooxidase

IMI - imipramina

INS - insulina NPH

ISRN - antidepressivos inibidores seletivos da recaptação da noradrenalina

ISRS - antidepressivos inibidores seletivos da recaptação de serotonina

LPO - peroxidação lipídica

mGluR5 - receptor metabotrópico de GLU tipo 5

NA - noradrenalina

NMDA - N-metil-d-aspartato

NOR - grupo normoglicêmico

PCPA - paraclorofenilalanina

SNC - sistema nervoso central

SOD - enzimas superóxido dismutase

ST - splash test

STZ - estreptozotocina

TCA - teste do campo aberto

TDM - transtorno depressivo maior

TNF - teste do nado forçado

TRIS - hidroximetilaminometano

TSC - teste de suspensão pela cauda

v.o. - via oral

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ...................................................................................... 25

2 OBJETIVOS ........................................................................................... 29

2.1 Objetivo Geral: .................................................................................... 29

2.2 Objetivos Específicos: ......................................................................... 29

3 REVISÃO DA LITERATURA ............................................................. 31

3.1 Transtorno depressivo maior: aspectos gerais ................................. 31

3.1.1 Neurobiologia da depressão ............................................................ 33

3.2 Depressão e diabetes ........................................................................... 41

3.2.1 Estresse oxidativo ............................................................................. 47

3.3 Considerações sobre a família Primulaceae e o gênero Myrsine ..... 51

3.4 Rapanea ferruginea Mez ..................................................................... 52

3.4.1 Aspectos Químico-farmacológicos .................................................. 54

4 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................... 57

4.1 Material Vegetal: ................................................................................. 57

4.1.1 Preparação do extrato hidroalcóolico de Rapanea ferruginea ...... 57

4.1.2 Isolamento e identificação dos compostos AMA e AMB............... 57

4.2 Substâncias utilizadas e vias de administração ................................ 59

4.3 Métodos ................................................................................................ 59

4.3.1 Avaliação farmacológica in vivo ...................................................... 59

4.3.1.1 Animais ........................................................................................... 59

4.3.2 Grupos experimentais ...................................................................... 60

4.3.2.1 Grupos experimentais utilizando camundongos ........................... 60

4.3.2.2 Grupos experimentais utilizando ratos .......................................... 61

4.4 Avaliação da atividade tipo-antidepressiva de EHCRF em

camundongos ............................................................................................. 63

4.4.1 Avaliação do efeito do EHCRF sobre o sistema motor e depressor

através do teste do campo aberto (TCA) ................................................. 63

4.4.2 Avaliação do efeito EHCRF sobre a depressão através do teste de

suspensão pela cauda (TSC) ..................................................................... 63

4.4.3 Avaliação do efeito EHCRF sobre a depressão através do teste do

nado forçado (TNF) .................................................................................. 64

4.4.4 Avaliação do efeito EHCRF sobre a anedonia dos animais através

do Splash test (ST) ..................................................................................... 64

4.5 Análise do mecanismo de ação da atividade tipo-antidepressiva .... 65

4.5.1 Avaliação da influência do sistema monoaminérgico sobre a

atividade tipo-antidepressiva do EHCRF ............................................... 65

4.5.2 Avaliação da influência do sistema serotonérgico sobre a atividade

tipo-antidepressiva do EHCRF ................................................................ 65

4.5.3 Avaliação da influência do sistema noradrenérgico sobre a

atividade tipo-antidepressiva do EHCRF ............................................... 66

4.5.4 Avaliação da influência do sistema dopaminérgico sobre a atividade


4.6 Avaliação da atividade tipo-antidepressiva dos compostos isolados de

Rapanea ferruginea, AMA e AMB ........................................................... 67

4.6.1 Avaliação do tempo de duração da atividade tipo-antidepressiva do

EHCRF, AMA e AMB .............................................................................. 67

4.7 Avaliação do comportamento tipo-depressivo e dos parâmetros de

estresse oxidativo em ratos diabéticos induzido pro estreptozotocina .. 67

4.7.1 Indução de Diabetes ......................................................................... 67

4.7.1.1 Hemoglobina glicada ..................................................................... 68

4.7.2 Teste do campo aberto (TCA) ......................................................... 68

4.7.3 Teste do nado forçado (TNF) .......................................................... 69

4.7.4 Avaliação de parâmetros oxidativos ............................................... 69

4.7.4.1 Preparação das amostras ............................................................... 69

4.7.4.2 Mensuração da concentração de proteínas ................................... 70

4.7.4.3 Quantificação dos níveis de GSH .................................................. 70

4.7.4.4 Determinação da atividade enzimática da superóxido dismutase

(SOD) .......................................................................................................... 70

4.7.4.5 Quantificação da atividade da enzima catalase (CAT) ................. 71

4.7.4.6 Determinação do teor de hidroperóxidos lipídicos (LOOH) ......... 71

4.8 Análise estatística ................................................................................ 71

5 RESULTADOS ...................................................................................... 73

5.1 Análise por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) ......... 73

5.2 Efeito tipo-antidepressivo do EHCRF em camundongos ................ 73

5.3 Determinação do mecanismo de ação monoaminérgico da atividade


5.3.1 Avaliação do sistema monoaminérgico sobre a atividade tipo-

antidepressiva do EHCRF ........................................................................ 76

5.3.2 Avaliação do sistema serotonérgico ................................................ 77

5.3.3 Avaliação do sistema noradrenérgico ............................................. 80

5.3.4 Avaliação do sistema dopaminérgico .............................................. 82

5.4 Efeito tipo-antidepressivo dos compostos isolados ácido mirsinóico A

e B em camundongos ................................................................................. 85

5.5 Avaliação do tempo de duração da atividade tipo-antidepressiva do

EHCRF, AMA e AMB .............................................................................. 87

5.6 Avaliação do comportamento tipo-depressivo e medidas dos

parâmetros de estresse oxidativo em ratos diabéticos induzido pro

estreptozotocina ......................................................................................... 89

5.6.1 Quantificação dos níveis de GSH .................................................... 92

5.6.2 Quantificação nos níveis de LOOH ................................................ 93

5.6.3 Quantificação da atividade da enzima SOD .................................. 94

5.6.4 Quantificação da atividade da enzima CAT .................................. 95

6 DISCUSSÃO ........................................................................................... 97

7 CONSIDERAÇÕES FINAIS .............................................................. 116

REFERÊNCIAS ...................................................................................... 117

ANEXO A ................................................................................................ 162

ANEXO B ................................................................................................ 163

25

1 INTRODUÇÃO

O transtorno de depressão maior (TDM) é uma doença mental

debilitante com significativa morbidade e mortalidade, a qual envolve a

presença de sintomas cognitivos, afetivos e físicos incluindo fadiga,

anedonia, alterações do apetite e do peso e distúrbios do sono (BECK;

BREDEMEIER, 2016). A depressão quando moderada e grave está associada

a efeitos significativos na qualidade de vida, com impacto em vários

domínios, particularmente social e no trabalho.

O modo de ação de antidepressivos já existentes, num geral, são

principalmente baseados na hipótese monoaminérgica, a qual sugere que a

depressão é causada por uma diminuição da disponibilidade de

neurotransmissores monoaminérgicos, como a serotonina (5-HT),

noradrenalina (NA) e dopamina (DA) no sistema nervoso central (SNC)

(TRAN et al., 2003, ROSENBLAT et al., 2015). Esses medicamentos

incluem inibidores seletivos da recaptação de 5-HT (ISRSs), Inibidores da

receptação de 5-HT e NA (IRSNs), antidepressivos tricíclicos (ADTS) e

inibidores da degradação desses neurotransmissores, como inibidores de

monoamina oxidase (IMAOs) (BRUNELLO et al., 2002; HILLHOUSE,

PORTER, 2015). No entanto, uma parte da população de pacientes

deprimidos (20% a 30%) não responde a esses medicamentos, além dos

diversos efeitos adversos apresentados, havendo a necessidade da busca de

novos alvos com potencial terapêutico.

O Diabetes Mellitus (DM) é uma sindrome metabólica crônica que

compartilha o fenótipo de hiperglicemia. É um problema de saúde pública em

ascendência, a qual promove complicações de curto e longo prazo como

neuropatia, nefropatia, retinopatia, doença arterial coronariana, dentre outras.

Também foi estabelecido que o DM em longo prazo pode estar associado a

desordens psiquiátricas, como depressão, distimia e transtorno de ansiedade.

Quando se trata de associação entre diabetes e depressão, uma relação

bidirecional é observada. Está bem documentado na literatura que a

prevalência de depressão é maior em pacientes com DM em comparação com

aqueles sem diabetes (NOUWEN et al., 2010; BUCHBERGER et al., 2016).

Pesquisas tem evidenciado o envolvimento do estresse oxidativo com

quadros depressivos, podendo o mesmo ser desencadeado por diversas

patologias, dentre elas, o diabetes (TRENTO et al., 2012; MAURYA et al.,

26

2016). Estes danos devido ao estresse oxidativo podem estar relacionados a

um desiquilibrio homeostático, por meio de formação de espécies reativas de

oxigênio (EROs) ou de nitrogênio (ERNs) e também pela formação de

produtos avançados de glicação (AGEs), causados pela hiperglicemia. Dentre

os danos oxidativos apresentados por pacientes depressivos e diabéticos,

destacam-se: deficiência dos níveis sanguíneos de enzimas antioxidantes,

como a superoxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa peroxidase

(GPx), e altos níveis de produtos de peroxidação lipídica, quando comparados

com controles saudáveis (OZCAN et al., 2004), sugerindo que ambas as

doenças causam alterações no equilibro pró- e antioxidante do organismo

(MORETTI et al., 2012).

Desde a introdução do Hipericum perforatum na terapêutica da

depressão, as plantas medicinais tem sido consideradas como alvos potenciais

das quais pode-se obter substanciâs com propriedades antidepressivas. Desse

modo, é importante ressaltar que compostos provenientes de plantas e

produtos naturais têm contribuído substancialmente para a descoberta de

novos fármacos.

A espécie escolhida para estudo, Rapanea ferruginea (Sin. Myrsine

coriacea, Myrsine floculosa Mar. e Gaballeria ferruginea Ruiz & Pav),

pertence a família Primulaceae e é popularmente conhecida como

‘Capororoca’ (LORENZI, 2008). O chá das folhas ou decocção de cascas da

planta é usado popularmente como diurético, utilizado no combate às

afecções urinárias e também constitui um bom depurativo. Também é dito

que a planta diminui coceiras, erupções, urticárias, eczemas, reumatismo e

afecções do fígado (BOTREL, 2006). A espécie R. ferruginea e seus

compostos isolados ácido mirsinóico A (AMA) e B (AMB) tem sido

estudados pelo Núcleo de Investigações Químico-farmacêuticas (NIQFAR,

UNIVALI). O AMA e AMB apresentam importante atividade anti-

inflamatória (DONG et al., 1999), antinociceptiva (HESS et al., 2010;

ANTONIALLI et al., 2012), anticolinesterásica (COSTA et al., 2011),

nootrópica (COSTA et al., 2011), antibacteriana com ação especifica contra

Staphylococcus aureus e Bacillus subtilis (BELLA-CRUZ et al., 2013) e

leishmanicida (CECHINEL-FILHO, et al., 2013) já descritas. O extrato bruto

das folhas da planta também apresentou efeito hipoglicêmico em animais

com diabetes induzida por haloxano (GALVAN , 2007).

27

Considerando que espécie R. ferruginea já mostrou apresentar

atividade no Sistema Nervoso Central (SNC) e atividade tipo-antidepressiva

em testes preliminares, o presente estudo teve como principal objetivo avaliar

o efeito tipo-antidepressivo do extrato hidroalcóolico das cascas de Rapanea

ferruginea (EHCRF) e dos compostos ácido mirsinóico A (AMA) e B

(AMB), em camundongos e verificar o envolvimento do sistema

monoaminérgico no mecanismo de ação desta atividade, bem como

investigar o efeito do tratamento prolongado dos mesmos sobre respostas

comportamentais relacionadas com a depressão e sobre parâmetros do

estresse oxidativo avaliados no córtex e hipocampo de animais normo

hiperglicêmicos.

29

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral:

Avaliar o efeito tipo-antidepressivo do EHCRF e dos compostos

AMA e AMB em camundongos e verificar o envolvimento do sistema

monoaminérgico no mecanismo de ação desta atividade, bem como

investigar o efeito do tratamento prolongado dos mesmos sobre respostas

comportamentais relacionadas com a depressão e sobre parâmetros do

estresse oxidativo avaliados no córtex e hipocampo de animais diabéticos.

2.2 Objetivos Específicos:

✓ Verificar o efeito tipo-antidepressivo da administração aguda por via oral

(v.o.) do EHCRF no teste do nado forçado (TNF) e no teste de suspensão

pela cauda (TSC) em camundongos, assim como o efeito do tratamento

sob a atividade locomotora e exploratória no teste do campo aberto

(TCA) e efeito sobre a anedonia através do Splash test (ST);

✓ Investigar se o efeito tipo-antidepressivo do EHCRF está relacionado aos

dois compostos isolados majoritários do extrato da planta, a ácido

mirsinóico A (AMA) e B (AMB), através do TSC, TCA e ST;

✓ Determinar o tempo de ação do efeito tipo-antidepressivo do EHCRF,

AMA e AMB;

✓ Investigar o envolvimento do sistema monoaminérgico no modo de ação

do efeito tipo-antidepressivo do EHCRF por meio do TSC;

✓ Avaliar o comportamento depressivo de ratos diabéticos submetidos ao

TNF, tratados ou não com o EHCRF, AMA ou AMB.

✓ Avaliar parâmetros de estresse oxidativo em ratos diabéticos tratados ou

não com o EHCRF, AMA ou AMB, através de parâmetros de estresse

oxidaitovo no córtex e hipocampo.

31

3 REVISÃO DA LITERATURA

3.1 Transtorno depressivo maior: aspectos gerais

O TDM, também denominado depressão crônica ou depressão

unipolar, segundo o Manual Diagnóstico e Estatístico de Transtornos

Mentais, na sua quinta edição (Diagnostic and Statistical Manual of Mental

Disorders V – DSM-V), é uma desordem mental complexa, multifatorial,

heterogênea e frequentemente crônica. Esta doença é caracterizada por

sintomas como: humor deprimido, acentuada diminuição do interesse ou

prazer, perda ou ganho de peso corporal, insônia ou hipersonia, agitação ou

retardo psicomotor, fadiga ou perda de energia, sentimento de inutilidade ou

culpa excessiva, redução da capacidade de pensar ou concentrar,

pensamentos recorrentes de morte, ideia suicida ou tentativa de suicídio. Para

o diagnóstico é necessária a presença de no mínimo cinco destes sintomas,

sendo pelo menos um deles o humor deprimido ou a perda do interesse ou

prazer (DSM-V, 2013). De acordo com os sintomas descritos pelo DSM-V

(2013), a TDM pode ser especificada de acordo com sua gravidade:

- Leve: presença de dois sintomas. A intensidade dos sintomas causa

sofrimento, mas é manejável, e os sintomas resultam em pouco prejuízo no

funcionamento social ou profissional;

- Moderado: presença de três sintomas. A rotina diária começa a ser

afetada, torna-se uma pessoa emocionalmente instável;

- Moderado a grave: presença de quatro ou cinco sintomas. Nesta

classificação é comum o paciente apresentar comportamento suicida;

- Grave: presença de quatro ou cinco sintomas com agitação motora.

Sua intensidade causa grave sofrimento e não é manejável, e os sintomas

interferem acentuadamente no funcionamento social e profissional;

- Com características psicóticas: além dos sintomas necessáriso para

do diagnóstico de TDM, estão presentes delírios e/ou alucinações.

Além disso, de acordo com o curso da doença, o TDM também pode

ser classificado como:

- Em remissão parcial: presença de sintomas do episódio de TDM,

mas não são satisfeitos todos os critérios ou existe um período de menos de

32

dois meses sem sintomas significativos de um episódio depressivo maior após

o término desse episódio;

- Em remissão completa: durante os últimos dois meses, nenhum

sinal ou sintoma significativo da perturbação esteve presente;

- Não especificado.

Dados recentes reportados na literatura estimam que cerca de 4,4%

da população mundial, aproximadamente 322 milhões de pessoas, vivem com

TDM; sendo mais prevalente em mulheres (5,1%) do que em homens (3,6%)

(WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2017). Mundialmente, o Brasil está

na 5ª posição no ranking de países com maiores taxas de prevalência de

transtornos depressivos, totalizando 5,7% da população. Além disso, a taxa

de prevalência também varia segundo a idade, ocorrendo principalmente na

idade adulta, sendo aproximadamente 7,5% entre as mulheres entre 55-74

anos, e 5,5% entre os homens também com esta idade (ROEPKE;

SELIGMAN, 2016).

Os transtornos depressivos em adultos começam a aumentar em

prevalência nas idades de 20 a 30, mas ocorre em crianças e adolescentes com

idade inferior a 15 anos, porém com taxa de prevalência muito menor quando

comparado à adultos (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2017). A

prevalência de sintomas depressivos não varia significativamente em

diferentes raças ou grupos étnicos. Estima-se também que 8-20% da

população irá apresentar a doença ao longo da vida (KESSLER; BROMET,

2013; ROEPKE, SELIGMAN, 2016).

A etiologia do TDM não é bem estabelecida, mas acredita-se que é

causada principalmente por fatores ambientais, entre eles o estresse durante

a vida, estresse emocional, danos teciduais (por exemplo, acidente vascular

cerebral). Porém, possui uma importante carga hereditária, cerca de 40-50%

dos casos são causados por um componente genético (BERTON; NESTLER,

2006; WILLNER; SCHEEL-KRUGUER; BELZUNG, 2013).

Além disso, não há um consenso que determina a neuropatologia da

doença, mas esse distúrbio tem sido associado a uma série de anormalidades

no SNC (DURISKO; MULDSNT; ANDREWS, 2015). Caracteriza-se, em

geral, como um mau funcionamento ou ruptura das neurotransmissões

cerebrais responsáveis pela regulação do humor, prazer e recompensa

(KRISHNAN; NESTLER, 2008, 2010; PALAZIDOU, 2012; DEAN;

KESHAVAN, 2017).

33

Existem inúmeras razões que tentam explicar as limitações na

pesquisa da fisiopatologia da depressão, as quais também dificultam a busca

de novos tratamentos. Dentre estas, a relativa inacessibilidade ao cérebro, o

qual permite estudos apenas pós-morte ou por meio de técnicas de

neuroimagens; o fato de que a maioria dos casos de depressão ser por causa

idiopática; a limitação do diagnóstico da doença, e, a sobreposição de

sintomas com outros diagnósticos psiquiátricos e até neurodegenerativos

(KRISHNAN; NESTLER, 2008).

Evidencias comprovam que apenas 30% dos pacientes com TDM

responde ao tratamento de forma efetiva com antidepressivos, além de

necessitar de uma terapia contínua (semanas até meses) para início da

melhora dos sintomas (LITTLE, 2009), o que muitas vezes leva ao abandono

do tratamento (WILLNER et al., 2013). Supõem-se que essa demora na

melhoria do quadro de humor dos pacientes, ocorre devido ao tempo

necessário para que fatores tróficos como o fator neurotrófico derivado do

cérebro (BDNF) e a proteína anti-apoptótica (Bcl-2) sejam expressos

(WILLNER et al., 2013). Também são necessárias adaptações de sinalização

e regulação de genes-alvo, que por sua vez, regulam diversos processos

fisiológicos, os quais incluem neuroplasticidade, neuroproteção e

neurogênese, justificando a demora das ações terapêuticas dos

antidepressivos (KRISHNAN; NESTLER, 2008).

Os fármacos antidepressivos representam o tratamento padrão para

a depressão (BRANCHI et al., 2013), tem seus efeitos baseados em

mecanismos monoaminérgicos e, possuem várias limitações (WHISKEY;

TAYLOR, 2013; CRAWFORD et al., 2014), dentre elas, os efeitos adversos.

A insônia, cefaleia, ansiedade e disfunção sexual, e o aumento de peso são os

que possuem maior destaque. Por isso, estudos nessa área estão crescendo

cada vez mais, em busca de novas opções terapêuticas para os sintomas e

danos causados por essa doença.

3.1.1 Neurobiologia da depressão

Apesar da alta prevalência e do grande impacto da TDM, os

mecanismos fisiopatológicos da depressão ainda não estão totalmente

estabelecidos. A primeira hipótese e a mais aceita para justificar a

34

neuropatologia da doença é a do desequilíbrio das monoaminas, 5-HT, NA e

DA proposta por Schildkraut (1965). Esta hipótese enfatiza o distúrbio de

neurotransmissores disponíveis na fenda sináptica, havendo uma diminuição

das monoaminas nas fendas sinápticas, ou ainda, ocorre uma ineficiência e/ou

disfunção dos receptores específicos de 5-HT, NA e/ou DA (DEAN;

KESHAVAN , 2017).

Esta hipótese é reforçada pelo conhecimento do mecanismo de ação

dos fármacos antidepressivos, que de forma aguda se baseia no aumento da

disponibilidade desses neurotransmissores na fenda sináptica (ELHWUEGI,

2004; PRINS; OLIVER; KORTE, 2011), por meio da inibição da recaptação

de 5-HT, NA ou DA e/ou ainda age inibindo a enzima monoamina oxidase,

enzima que biotransforma as monoaminas (NEMEROFF, 2007).

Os ISRSs constituem a classe de antidepressivos mais amplamente

prescrita para a depressão maior e distúrbios relacionados. O primeiro ISRS

introduzido foi a fluoxetina, que continua sendo um dos antidepressivos mais

largamente prescrito. Outros ISRSs incluem o citalopram, a fluvoxamina, a

paroxetina e a sertralina (HILLHOUSE; PORTER, 2015). Há várias classes

de antidepressivos disponíveis além dos ISRSs, dentre eles os ADTs (como

a imipramina, desipramina, amitriptilina), IMAOs (moclobemida), inibidores

seletivos da recaptação da NA conhecidos como ISRNs (duloxetina), os de

dupla recaptação de 5-HT/NA, ditos IRSNs (venlafaxina). Ainda há os

antidepressivos atípicos, sem mecanismo farmacológico totalmente

conhecido (minaprina, bupropiona) (SHIROMA et al., 2010; HILLHOUSE;

PORTER, 2015). A figura 1 ilustra os principais mecanismos desses

medicamentos antidepressivos.

Segundo a teoria monoaminérgica no cérebro normal, os

neurotransmissores 5-HT, NA ou DA são liberados e ativam receptores pós-

sinápticos. A neurotransmissão é terminada pela recaptação do

neurotransmissor no neurônio pré-sináptico. Na depressão, a concentração de

monoaminas na fenda sináptica está diminuída, acarretando o transtorno de

humor. O bloqueio dos sítios de recaptação, poderia representar o efeito do

uso de antidepressivos aumentando a disponibilidade dos neurotransmissores

monoaminérgicos para ativarem seus receptores pós-sinápticos, com

reestabelecimento do humor (CASTRÉN, 2010; DONATO, 2013).

Estudos neurobiológicos e neuroanatômicos também confirmam a

hipótese monoaminérgica e indicam que importantes alterações nos sistemas

35

serotoninérgico e noradrenérgico estão relacionadas com o sucesso do

tratamento antidepressivo (ELHUEGI, 2004).

O sistema serotoninérgico participa na maturação dos sistemas

cerebrais envolvidos na regulação emocional no adulto, sendo que alterações

serotoninérgicas numa fase precoce do desenvolvimento predispõem para o

desenvolvimento de depressão. Além disso, também é responsável pelas

alterações comportamentais, dentre elas a ansiedade, impulsividade e

agressividade (KIM et al, 2010). Os receptores serotonérgicos envolvidos na

fisiopatologia da depressão são o 5-HT1A, 5-HT2A/2C e 5-HT3 (CRYAN et al.,

2005), e antidepressivos que atuam nessa via causam alterações de densidade

e sensibilidade em receptores 5-HT1 e 5-HT2, por meio do tratamento

crônico (PANDEY et al., 2008).

O sistema noradrenérgico envolve a NA e seus receptores, uma

família composta por duas subfamílias: os receptores α – adrenérgicos (α1A,

α1B, α1D, α2A, α2b, α2C) e β- adrenérgicos (β1, β2 e β3). Há estudos que

postulam que os receptores do sistema noradrenérgico estão envolvidos em

alguns sintomas da depressão, como no caso da excitação e medo (TAYLOR

et al., 2005; PYTKA et al., 2016). Além disso, há uma diferença na densidade

de alguns receptores noradrenérgicos entre pacientes depressivos e não

depressivos (PYTKA et al., 2016). Evidências demonstram a participação de

receptores α-adrenérgicos e β-adrenérgicos na ação de fármacos

antidepressivos, ressaltando a importância do sistema noradrenérgico na

depressão (TAYLOR et al., 2005). Enquanto o bloqueio de receptores α1-

adrenérgicos está associado a estados depressivos, o tratamento crônico com

antidepressivos aumenta a atividade destes, e causa também aumento na

densidade destes receptores no córtex frontal (CF) e no hipocampo (HIP)

(PYTKA et al., 2016).

36

Figura 1 – Alvos de ação dos antidepressivos

Fonte: Rang & Dale (2016).

NE = noradrenalina; NET = transportador de noradrenalina; Li+ = lítio; ADTs =

antidepressivos tricíclicos; IRSNs = inibidores da recaptação de serotonina e

noradrenalina; ISRS = inibidores seletivos da recaptação de serotonina; IMAO =

inibidores da monoaminoxidase; MAO = monoaminoxidase; 5-HT = serotonina;

37

O sistema dopaminérgico também é um importante alvo envolvido

nos transtornos de humor, e a função dopaminérgica reduzida também está

implicada na fisiopatologia da depressão (DAILLY et al., 2004).

No estriado de pacientes depressivos foi observada uma diminuição

na expressão dos transportadores dopaminérgicos (LAASONEN-BALK et

al., 1999), o que pode ser o fator primário que determina uma menor

disponibilidade de DA na fenda sináptica (DAILLY et al., 2004). Além disso,

Pytka (2016) sugere diferenças nas densidades de receptores dopaminérgicos

em cérebros de pacientes depressivos, quando comparados a pacientes não

depressivos, ressaltando o importante envolvimento da via na patogênese da

doença e no tratamento (PYTKA et al., 2016). Também é considerado que a

hipofunção da via dopaminérgica mesolímbica, relacionada com o controle

das emoções e recompensa (EGERTON et al., 2009), pode estar envolvida

com a anedonia, considerado um dos principais sintomas da depressão, e que

o efeito de antidepressivos sobre a transmissão dopaminérgica parece ser um

importante fator que contribui para a eficácia da terapia antidepressiva

(SHANKMAN et al., 2010; SHIMAMOTO et al., 2015). O antidepressivo

bupropiona, inibidor da recaptação da DA/NA, atua na área mesolímbica e é

opção de tratamento para a depressão com características anedônicas

elevadas (PATEL et al., 2016).

Apesar de bem estabelecida, a hipótese monoaminérgica possui

falhas, entre elas:

1) Não explica o fato de que os efeitos clínicos dos antidepressivos,

principalmente a melhora do humor, são observados apenas após 3 a 4

semanas do início da terapia, sendo que estes medicamentos aumentam os

níveis sinápticos de monoaminas de forma aguda (ELHWUEGI, 2004);

2) O fato de que a depressão está fortemente associada à fatores genéticos

(HYDE et al., 2008) e à exposição a agentes estressores (TOUMA, 2011), e

que apesar das inúmeras tentativas de associação entre variabilidade em

genes relacionados a funções monoaminérgicas e situações de estresse em

transtornos afetivos, uma relação consistente ainda não está bem estabelecida

(HARRO; ORELAND, 2001);

3) Compostos que aumentam níveis sinápticos de monoaminas, como por

exemplo a anfetamina, não tem ação antidepressiva (BALDESSARINI,

1996).

38

Neste sentido, acredita-se que outros sistemas neurais e mecanismos

bioquímicos estejam envolvidos na etiologia e tratamento da depressão

(MORETTI, 2013). Além disso, sabe-se também que o aumento agudo da

disponibilidade sináptica de monoaminas produz uma rede de alterações

neuroplásticas secundárias que ocorre a longo prazo e envolve alterações

transcricionais e traducionais que regulam a plasticidade molecular e celular

(hipótese neurotrófica da depressão) (PITTENGER; DUMAN, 2008;

CASTRÉN; RANTAMÄKI, 2010; DUMAN, 2014).

Apenas a teoria monoaminérgica não explica o espectro de

alterações estruturais macroscópicas e microscópicas documentados em

pacientes depressivos, as alterações em numerosos outros sistemas

neurotransmissores, como visualizado na Figura 2, a desregulação do eixo

hipotálamo-hipofise-adrenal (HPA), e potenciais mecanismos inflamatórios

que contribuem para a fisiopatologia (ROSENBLAT et al., 2014). Outra

teoria bastante estudada recentemente enfatiza a importância da

neuroplasticidade, crucial para neurogênese do hipocampo e também dos

fatores neurotróficos, tais como o BDNF, na fisiopatologia da doença

(NUMAKAWA et al., 2014; MILLER; HEN, 2015).

A teoria neurotrófica da depressão (DUMAN et al., 1997), de forma

resumida, postula que o estresse leva à redução da expressão de BDNF, que

por sua vez leva à atrofia do hipocampo e córtex pré-frontal. Confirmando

esta teoria, sabe-se que os níveis diminuídos de BDNF sérico em pacientes

com depressão é normalizado, após remissão da doença induzida por

antidepressivos (MOLENDJIK et al., 2014).

O sistema glutamatérgico emergiu como um potencial alvo para

melhorar a eficácia clínica do tratamento de depressão maior e também

diminuir os riscos de remissão (HOLLY; LACROSSE; HILLHOUSE, 2014).

Pesquisas pós-morte fornecem evidências de que há relevante disfunção

glutamatérgica em pacientes diagnosticados com TDM (FRYE et al., 2007;

HASHIMOTO; SAWA; IYO, 2007; BLOCK et al., 2009;

KUÇUKIBRAHIMOGLU et al., 2009; GARAKANI et al., 2013). Além

disso, agentes farmacológicos que atuam antagonizando os receptores

NMDA (N-metil D-Aspartato) demonstram atividade tipo-antidepressiva

tanto em estudos pré-clínicos (WOLAK et al., 2015) como em estudos

clínicos (OHGI; FUTAMURA; HASHIMOTO, 2015). O sistema

GABAérgico atua na modulação de neurônios dopaminérgicos,

39

noradrenérgicos e serotonérgicos (PEHRSON et al., 2015), sendo

responsável pelo controle de humor e das funções cognitivas (MCDONALD

et al., 2004), por tanto, também está diretamente ligado ao desenvolvimento

da depressão maior. Estudos demonstraram que os receptores GABAérgicos

apresentam níveis diminuídos em regiões cerebrais (BHAGWAGAR et al.,

2008; PRICE et al., 2009; LUSCHER et al., 2011; PEHRSON et al., 2015)

de pacientes depressivos, comparados a pacientes saudáveis. Corrobrando

com estes resultados, sabe-se que fármacos moduladores dos receptores

GABA-A, quando utilizados concomitantemente com ISRS, causam

potencialização nos efeitos antidepressivos dos mesmos (MOHLER, 2012),

e antagonistas de receptores GABA-B já apresentaram atividade

antidepressiva em modelos animais (PYTKA et al., 2016).

O aumento da co-prevalência de comorbidades inflamatórias,

incluindo doenças auto-imunes, cardiovasculares, diabetes, obesidade e

síndrome metabólica, asma e alergias com TDM levou a uma investigação

mais profunda sobre o possível envolvimento do sistema inflamatório na

fisiopatologia da depressão (WALKER et al., 2011). Os níveis elevados de

citocinas inflamatórias, incluindo fator de necrose tumoral α (TNF-α),

interleucina 1β (IL-1β) e interferon-gama (IFN-g),diminuem a produção de

5-HT e aumento da produção de catabólitos de triptofano, mostrando induzir

sintomas de humor deprimido (CAPURON et al., 2003). Portanto, a

inflamação tem um efeito direto sobre os níveis centrais de 5-HT, fornecendo

ligação direta aos sintomas de humor e produção aumentada de citocinas.

Também está bem estabelecida a associação entre TDM e a

disfunção/hiperativação do eixo HPA (KELLER et al., 2016), através da

desregulação de receptores mineralocorticoides e/ou receptores

glicocorticóides dentro do sistema HPA (CARPENTER et al., 2009;

STETLER; MILLER, 2011). Aproximadamente 50% dos pacientes com

TDM apresentam hipercortisolemia ou outros distúrbios do sistema HPA

(HENNINGS et al., 2009; KELLER et al., 2016) e que estas disfunções

aumentam o risco de depressão em indivíduos saudáveis (LLOYD;

NEMEROFF, 2011).

40

Figura 2 - Diagrama simplificado mostrando mecanismos que se acredita estarem envolvidos na fisiopatologia da depressão.

Fonte: Rang; Dale, 2016.

As principais vias envolvidas no desenvolvimento de transtornos depressivos envolvem 1) o eixo HPA, que é ativado através de

situações de estresse emocional, que por sua vez, potencializa a ação excitatória de glutamato, e altera a expressão genica que promove

apoptose; 2) Envolvimento nas monoaminas (NE = noradrenalina; 5-HT = serotonina) e do BDNF. ACHT = hormônio

adrenocorticotrófico; CRF = fator liberador de corticotrofina.

41

3.2 Depressão e diabetes

Diabetes mellitus (DM) é uma doença complexa e crônica, a qual

compreende uma junção de distúrbios metabólicos de etiologia múltipla. É

caracterizada principalmente pela hiperglicemia crônica resultante de

defeitos na ação e/ou secreção de insulina, um hormônio secretado pelas

células β pancreáticas, com distúrbios no metabolismo de carboidratos,

gorduras e proteínas (AMERICAN DIABETES ASSOCIATION, 2010;

AMERICAN DIABETES ASSOCIATION, 2017). A doença causa vários

danos e falhas em sistemas do organismo, especialmente olhos, rins, sistema

nervoso, coração e vasos sanguíneos (AMERICAN DIABETES

ASSOCIATION, 2009).

Segundo a Sociedade Brasileira de Diabetes (SBD) (2015), são 415

milhões de pessoas com diabetes no mundo e a estimativa para 2040 é de 642

milhões de pessoas. A doença acomete com maior frequência os homens

(cerca de 215,2 milhões), enquanto 199,5 milhões são mulheres. Mais de 16

milhões de brasileiros adultos (8,1%) sofrem de diabetes e a doença mata 72

mil pessoas por ano no Brasil, revela um relatório OMS. O número de

brasileiros diagnosticados com diabetes cresceu 61,8% nos últimos 10 anos,

passando de 5,5% da população em 2006 para 8,9% em 2016 (SBD, 2015).

A DM é classificada de acordo com sua etiologia, em quatro tipos: tipo 1

(DM1; doença auto-imune que causa destruição progressiva das células β

pancreáticas, geralmente levando a deficiência absoluta de insulina); tipo 2

(DM2; devido a deficiência progressiva de secreção de insulina ou devido a

resistência a insulina); DM gestacional (diagnosticado no segundo ou terceiro

trimestre gestacional); e tipos específicos de DM por outras causas, dentre

elas: síndrome de diabetes monogênicas, como diabetes neonatal e diabetes

de início de maturidade dos jovens, doenças do pâncreas exócrino (fibrose

cística) ou então induzida por fármacos ou por substâncias químicas

(AMERICAN DIABETES ASSOCIATION, 2017).

Para diagnostico da doença, são necessários a presença dos três

principais sintomas característicos de pacientes com diabetes: poliúria

(aumento do volume urinário), polidipsia (aumento de sede) e perda ponderal

de peso (Tabela 1). Além da sintomatologia clínica, também são considerados

critérios de valores de glicemia (superior ou igual a 200 mg/dL a qualquer

horário do dia), em jejum de 8 horas (superior ou igual a 126 mg/dL) ou após

42

duas horas da administração oral de 75 g de glicose (teste de tolerância à

glicose oral, níveis glicêmicos superior ou igual a 200 mg/dL) (AMERICAN

DIABETES ASSOCIATION, 2017). Também é diagnosticada por meio da

dosagem dos níveis de hemoglobina glicada (a cima de 6,5% estão associados

a um risco maior de complicações crônicas), o qual avalia o grau de

hiperglicemia crônica entre os pacientes diabéticos (CAVAGNOLLI, 2011).

A evolução clínica de portadores de diabetes inclui uma série de

complicações secundárias a hiperglicemia. A exposição crônica do SNC a

elevadas taxas de glicose é responsável pelo desenvolvimento da

encefalopatia diabética, que incluem isquemia, alterações cognitivas e

depressão (BIESSELS et al., 2002; DHALIWAL; WEINSTOCK, 2014;

D'AMATO et al., 2016), sendo este transtorno de humor o principal foco de

interesse do presente trabalho.

O diagnóstico de depressão em pacientes diabéticos mostra

relevante interatividade, podendo tanto o diabetes agravar os sintomas de

depressão como a depressão aumentar risco de complicações relacionadas ao

diabetes (MOUSSAVI et al., 2007). Pacientes diabéticos são duas vezes mais

propensos a ter depressão, sendo esta a desordem psiquiátrica mais comum

encontrada nesse grupo (TRENTO et al., 2012; de MORAIS et al., 2014),

com incidência de cerca de 39% quando comparado com a população não

diabética (LUSTMAN al., 2005; MORISHITA, 2009). Porém, estas

estatísticas possivelmente são maiores, uma vez que a depressão muitas vezes

não é diagnosticada nem tratada em pacientes diabéticos (LUSTMAN et al.,

2005), agravando ainda mais o estado diabético.

As consequências da hiperglicemia causam lesões celulares, os

quais são responsáveis pelas principais complicações do DM. Por exemplo,

uma forma de hiperglicemia causar lesão celular é promovendo produtos

finais avançados de glicação (AGEs). Estes são conhecidos por contribuir

para o complicações do diabetes ao aumentar o estresse oxidativo intracelular

(BROWNLEE, 2001). Estudos epidemiológicos sugerem que a elevação de

AGEs podem ser um fator de risco significativo para DM1 (BEYAN et al.,

2012), lesão de células β (SANDU et al., 2005; ZHAO et al., 2009),para

resistência a insulina periférica (CAI et al., 2007) e depressão maior (CHEN

et al., 2012).

43

Quadro 1 – Elementos clínicos que levantam a suspeita de DM

Sinais e sintomas clássicos

Poliúria

Polidipsia

Perda inexplicada de peso (principalmente DM1)

Polifagia

Sintomas menos específicos

Fadiga, fraqueza e letargia

Visão turva (ou melhora temporária da visão para perto)

Prurido vulvar ou cutâneo, balanopostite

Complicações crônicas/doenças intercorrentes

Neuropatia diabética: câimbras, parestesias e/ou dor nos membros inferiores,

mononeuropatia de nervo craniano

Retinopatia diabética

Catarata

Doença arteriosclerótica: infarto agudo do miocárdio, acidente vascular

encefálico, doença vascular periférica

Infecções de repetição

Encefalopatia diabética: isquemia, alterações cognitivas, depressão

Adaptado de: Duncan et al., 2013.

Além disso, DM e depressão são classificados como principais

causas de incapacidade no mundo moderno, sendo que no Brasil, são

respectivamente a 6ª e 7ª doenças que causam redução de anos na vida,

refletindo alta prevalência e incapacitação de ambas as doenças

(ANDERSON et al., 2001; TRENTO et al., 2012).

Em modelos animais de DM, assim como em humanos, há diversas

alterações cerebrais, dentre elas, distúrbios de neurotransmissão, plasticidade

44

sináptica prejudicada, redução da neurogênese no giro denteado e aumento

do estresse oxidativo em áreas do cérebro relacionadas com a depressão

(hipocampo e córtex pré-frontal) (de MORAIS et al., 2014; GUPTA;

RADHAKRISHNAN; KURHE, 2014; PRABHKAR et al., 2015).

Figura 3 - Esquema correlacionando hiperglicemia e depressão maior,

Fonte: Adaptado de Kaur; Pandhi; Dutta, 2011.

EROS = espécies reativas de oxigênio.

Desde sua descoberta em 1959, a estreptozotocina (STZ) vem sendo

amplamente utilizada para a indução de diabetes em animais experimentais.

Contém uma molécula de glicose (na forma desoxi) que está ligada a uma

porção de metilnitrosourea altamente reativa, que possivelmente exerce

efeito citotóxico, enquanto que a fração de glicose dirige o produto químico

45

às células β pancreáticas (JOHANSSON; TJALVE, 1978; WU; YAN, 2015).

Por ser análogo de glicose, a STZ reconhece o transportador GLUT2 que é

abundante em membranas plasmáticas de células β pancreáticas (LENZEN,

2008), tornando estas células alvo específico da STZ. Dentro das células β

pancreáticas, o STZ forma o diazometano (DAM), agente de alquilação, o

qual causa metilação do DNA e provoca ação diabetogênica (LENZEN,

2008). Além da metilação do DNA, STZ também induz diabetes por

múltiplos mecanismos, como o aumento dos níveis de NADPH por auto-

oxidação de glicose ou diacilglicerol (DAG) e aumento de O2, gerando

radicais livres, ativação da cascata de proteína quinase C, acúmulo de

produtos finais de glicação avançada e aumento da secreção de citocinas

(GONZALES et al., 2000; GIACCO; BROWNLEE, 2010) (Figura 4). Outro

aspecto relevante para a toxicidade de STZ é o envolvimento do estresse

nitrosativo e oxidativo, entre vários mecanismos propostos que delineam a

atividade diabética da STZ (GOYAL et al., 2016).

Por tanto, a STZ é uma substância que induz diabetes em animais,

devido a inibição da secreção de insulina por meio de necrose das células β

pancreáticas, resultando em animais com DM1 (LENZEN, 2008; GUPTA et

al., 2014). Como a GLUT2 também é expressa no fígado e rim em menos

extensão, doses elevadas de STZ também podem prejudicar as funções

hepáticas e renais (BOUWENS; ROOMAN, 2005). Além disso, a

hiperglicemia diabética causada pela STZ causa complicações em outros

orgãos como cérebro, coração e músculos (WEI et al., 2003).

A STZ é amplamente utilizada para a indução de diabetes

experimental em roedores (LENZEN, 2008) e sua propriedade diabetogênica

é estudada desde 1963 (RAKIETEN; RAKIETEN; NADKARNI, 1963).

Pode ser utilizada sozinha ou em combinação com outros produtos químicos

ou com manipulações dietéticas para indução de DM1 e DM2, dependendo a

posologia e forma de administração (GHASEMI; KHALIFI; JEDI, 2014),

sendo a DM1 induzida com uma única injeção (YIN et al., 2006).

Estudos reportam que diabetes em ratos induzido por STZ resultam

em severo comportamento tipo-depressivo (GOMEZ; BARROS, 2000;

WAYHS et al., 2010; CALETTI et al., 2012; HO et al., 2012), aumentando

principalmente o tempo de duração da imobilidade dos animais em testes

comportamentais utilizados para depressão, como o teste do nado forçado

46

(TNF) e teste de suspensão pela cauda (TSC) (HIRANO; MIYATA; KAMEI,

2003; MIYATA et al., 2004; HO et al., 2012).

Quando relacionada a diabetes, a administração de STZ mimetiza

quadros patológicos observados em pacientes diabéticos como poliúria,

polifagia e hiperglicemia (GOYARY; SHARMA, 2010). Porém, os

mecanismos da relação DM/depressão ainda não foram completamente

elucidados (de MORAIS, 2013).

47

Figura 4 - Mecanismo diabetogênico de STZ.

Fonte: Adaptado de Goyal et al. (2016).

Alquilação de DNA, geração de espécies reativas de oxigênio (EROs) e espécies de

nitrogênio reativo (ERNs), estresse oxidativo, dano do DNA e sobrecarca de glicose

levam à morte de células β pancreáticas, causando hiperglicemia juntamente com a

diminuição da biossíntese e liberação de insulina (GOYAL et al., 2016).

3.2.1 Estresse oxidativo

O estresse oxidativo é uma condição biológica que ocorre quando há

um desequilíbrio entre compostos oxidantes espécies reativas de oxigênio

(EROs) e de nitrogênio (ERNs) e antioxidantes, gerando excesso de radicais

livres ou diminuição da velocidade de remoção desses. EROs e ERNs

desempenham um papel importante em muitos processos biológicos, como a

apoptose vias de sinalização celular (HALLIWELL, 2011), porém, quando

presentes em quantidades excessivas, conduzem à oxidação de biomoléculas

(principalmente lipídios, proteínas e o DNA), com consequente dano às suas

48

funções biológicas e/ou desequilíbrio homeostático (DALLE-DONNE et al.,

2006; MILLER; SADEH, 2014).

Existem antioxidantes endógenos ou absorvidos através da dieta que

combatem ou limitam os níveis intracelulares das EROs/ERNs e controlam a

ocorrência de danos ocasionados por elas. Para isso, o organismo dispõe de

um elaborado sistema de defesa antioxidante não enzimático e enzimático.

Dentre os não enzimáticos, estão a glutationa (GSH), peptídeos de histidina,

proteínas ligadas ao ferro (transferrina e ferritina), ácido diidrolipóico e o

citocromo C redutase (CoQH2). Já os enzimáticos são representados pelas

enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa

peroxidase (GPx) (MAYNE, 2003; URSO; CLARKSON, 2003) (figura 5).

Dentre os antioxidantes adquiridos na dieta, pode-se destacar o ácido

ascórbico, a-tocoferol (vitamina-E) e β-caroteno (pró-vitamina-A) (SMAGA

et al., 2015).

Figura 5 - Antioxidantes no combate do ânion superóxido

Fonte: Adaptado de Delbrin; Antunes; Zanesco, 2009.

O2- = ânion superóxido; H2O2 = peróxido de hidrogênio; SOD = enzima antioxidante

superóxido dismutase; CAT = enzima antioxidante catalase; GPx = glutationa

peroxidase; GSH = glutationa reduzida; GSSG = glutationa oxidada; Grd = glutationa

redutase.

Responsável pela defesa antioxidante enzimática do organismo, a

SOD catalisa a dismutação do ânion superóxido em oxigênio e peróxido de

49

hidrogênio por processo sucessivo de oxidação e redução, tornando o produto

menos reativo que o anterior, sendo fundamental para a prevenção da

toxicidade induzida pelas EROs/ERNs (STOCKER; KEANEY, 2004). Como

consequência, causa a proteção das células expostas as reações do superóxido

e evita o envelhecimento precoce causado pelas EROs/ERNs. Estudos

clínicos apontam que há diminuição da atividade da SOD em pacientes

deprimidos, causando aumento dos níveis do ânion superóxido (RYBKA et

al., 2013; LOPRESTI et al., 2014).

A enzima CAT tem como função a decomposição dos produtos da

SOD, ou seja, inibe a formação das EROs ou promove a remoção dessas

espécies, por meio da decomposição do peróxido de hidrogênio em água e

oxigênio, tornando-o inofensivo ao organismo (GALECKI et al., 2009). Em

pacientes com depressão a atividade da CAT foi encontrada em níveis mais

elevados (SZEBENI et al., 2014).

A GPx também é uma enzima antioxidante endógena com função de

proteção, responsável pela remoção de pró-oxidantes hidroperóxidos,

hidroxila e lipídeos peroxidados. Estudos in vivo e pós-morte relataram a

diminuição da atividade e dos níveis de GPx no plasma e no córtex pré-frontal

de pacientes com depressão, sugerindo que a diminuição da GPx aumenta os

níveis de EROs no interior da célula, ocasionando a morte celular (MAES et

al., 2011; STEFANESCU; CIOBICA, 2012).

A glutationa (L-γ-glutamil-L-cistenilglicina) participa defesa

antioxidante não enzimática e é sintetizada principalmente pelo fígado e está

presente no organismo em duas formas: reduzida (GSH) ou oxidada (GSSG),

sendo a GSH o antioxidante hidrossolúvel não proteico mais importante nos

seres vivos. A GSH possui diversas funções e participa de diversos processos

celulares, tais como a síntese de DNA, proteínas e também da modulação da

função proteica (STOCKER; KEANEY, 2004; DRINGEN; PAWLOWSKI;

HIRRLINGER, 2005), pode servir de substrato para a ação da GPx agindo

na detoxificação de peróxidos orgânicos e de hidrogênio, auxiliando no

combate das EROs/ERNs (FRIDOVICH, 1997; STOCKER; KEANEY,

2004; MAHER, 2005). A diminuição da atividade da GSH e consequente

aumento de EROs/ERNs disponíveis parece estar relacionada com a

fisiopatologia de doenças psiquiátricas, dentre elas se destacam a ansiedade,

esquizofrenia e depressão (MORRIS et al., 2014; SMAGA et al, 2015).

50

A ação central dos radicais livres leva à destruição oxidativa dos

neurônios e à neurodegeneração que, por sua vez, está associada a transtornos

psiquiátricos (VALKO et al., 2007), dentre elas o TDM (BLACK et al., 2015;

ZHANG et al., 2016), ansiedade (CHANANA; KUMAR, 2016),

esquizofrenia (RUIZ-LITAGO et al., 2012), autismo (KHAN et al., 2016) e

epilepsia (RAHMAN, 2015). Aumentos na balanço de pró-oxidantes e

antioxidantes, e aumento de EROs e ERNs podem estar associados também

ao TDM recorrente (TALAROWSKA et al., 2015). Além dessas, a ação dos

EROs e ERNs parece estar envolvido em processos neurodegenerativos de

doenças como Parkinson e Alzheimer (LI; REICHMANN, 2016).

Estudos relacionando o balanço oxidativo em pacientes deprimidos

e saudáveis descrevem alterações nas enzimas antioxidantes SOD, CAT e

GPx, maior peroxidação lipídica em pacientes com depressão (OZCAN et al.,

2004; TALAROWSKA et al., 2012; ANDERSON; MAES, 2014), além de

elevados níveis de EROs no plasma e no soro (YUMRU et al., 2009). O

tratamento com ISRSs, em estudos pré-clínicos e clínicos, demonstraram que

os mesmos possuem efeito antioxidante, revertendo o desequilíbrio oxidativo

encontrado no estado depressivo (BILICI et al., 2001; EREN; NAZIROGLU;

DEMIRDAS, 2007; HERKEN et al., 2007). Tal fato indica que os efeitos dos

medicamentos ultrapassam os mecanismos bioquímicos relacionados ao

aumento de monoaminas no SNC.

Estudos in vivo demonstram que modelos animais de depressão

baseados na indução de estresse crônico aumentam as EROs e modificam as

defesas antioxidantes no encéfalo de ratos (MADRIGAL et al., 2001;

FONTELLA et al., 2005; LUCCA et al., 2009), e o estresse oxidativo

ocasionado nesses modelos é diminuído com administração de

antidepressivos (ABDEL-WAHAB; SALAMA, 2011; LEE et al., 2011).

O aumento do estresse oxidativo com quadros depressivos, pode ser

desencadeado por diversas patologias, dentre elas, o diabetes. Tanto em

pacientes depressivos quanto diabéticos, são encontrados perfis de estresse

oxidativo com deficiência dos níveis sanguíneos de enzimas antioxidantes,

entre elas a superoxido SOD, CAT e GPx, e altos níveis de produtos de

peroxidação lipídica, quando comparados com controles saudáveis (OZCAN

et al., 2004), sugerindo que a depressão e a DM são acompanhadas por

distúrbios no balanço entre processos pró e antioxidante (MORETTI et al.,

2012).

51

De forma geral, o estresse oxidativo é caracterizado pelo

desequilíbrio entre a produção de radicais livres e a capacidade antioxidante

do organismo, e estudos clínicos indicam que esse desequilíbrio pode

contribuir para o agravamento de ambas as doenças (BABURAO; ANAND,

2012).

Segundo a OMS, estima-se que cerca de 80% das pessoas em todo

o mundo confiam e utilizam medicamentos à base de plantas nos cuidados de

saúde primário. E plantas medicinais e fitoterápicos são usados comumente

em muitas partes do mundo para tratar DM, bem como complicações

neurológicas associadas a esta doença, como a depressão maior (CRAGG;

NEWMAN, 2013; WANG et al., 2014).

3.3 Considerações sobre a família Primulaceae e o gênero Myrsine

A família Primulacea apresenta 9 gêneros, com cerca de 900

espécies, dentre eles, espécies do gênero Myrsine. O gênero Myrsine,

anteriormente pertencente a família Mysinaceae, destaca-se pelo elevado

número de espécies, aproximadamente 305, e cerca de 34 ocorrem no Brasil

(FREITAS; KINOSHITA, 2015). O gênero Também está distribuído na

Bolívia, México, Argentina, Paraguai e Uruguai (LORENZI, 2002). São

árvores de porte pequeno a médio, que possuem folhas simples com margens

inteiras em disposição alternas no caule. As plantas do gênero são conhecidas

popularmente como Canela-azeitona, Capororoca, Copororoca, Azeitonado-

mato, Camará, Capororocaçu, Capororoca vermelha, Pororoca, e ainda,

Capororoca-mirim (LORENZI, 2008), devido o formato dos frutos que são

consumidos por várias espécies de pássaros, tornando seu plantio útil em

áreas degradadas de preservação permanente.

As espécies de Myrsine são plantas geralmente encontradas na

Amazônia, Caatinga, Cerrado e na Mata Atlântica, habitando encostas

rochosas e bordas de mata, e muito utilizadas na recuperação de encostas,

porém exige solos profundos (LOPES; GONÇALVES, 2006). Existem

poucos estudos na literatura sobre composição fitoquímica de espéciês do

gêreno Myrsine, seus principais metabólitos secundários são: alquil- e

alquenil-resorcinóis, 2,5- dihidroxi-3-alquil-benzoquinonas, triterpenos

pentacíclicos dos esqueletos oleanano e ursano, triterpenos tetracíclicos dos

52

esqueletos damarano e cicloartano, saponinas triterpênicas, flavonóides

glicosilados e derivados de ácido benzóico (FOUBERT et al., 2008).

Com relação a estudos farmacológicos com representantes da

família primulaceae, destaca-se a atividade hipoglicemiante de Embelia ribes

(DURG et al., 2017) e seu componente majoritário a embelina bem como da

Primula denticulata (SINGH et al., 2014).

Dentre os estudos farmacológicos reportados com espécies do

genero, se destacam as espécies M. africana, que possui atividade citotóxica

(LI; MCLAUGHLIN, 1989); M. africana com atividade anti-helmíntica

(GITHIORI et al., 2002); M. australis com atividade de inibição da enzima

fosfolipase D (HEGDE et al., 1995); M. melanophloes com atividade

antifúngica e moluscicida (OHTANI; MAW; HOSTETTMANN, 1993); M.

seguinii com atividade anti-inflamatória, inibitória da enzima metioninase e

inibitória da enzima DNA polimerase (MIZUSHINA et al., 2000; MAKABE

et al., 2003; ITO; NARISE; SHIMURA, 2008).

3.4 Rapanea ferruginea Mez

A espécie estudada possui três sinonímias na literatura botânica:

Myrsine coriacea, Myrsine floculosa Mar. e Gaballeria ferruginea Ruiz &

Pav. Porém, o nome latino válido é Rapanea ferruginea Mez. (LORENZI,

2008). A planta destaca-se das demais espécies de Myrsine, pois ocorre em

todo o país, em quase todas as formações vegetais, sendo particularmente

frequente na floresta pluvial da encosta atlântica, em estados como: Bahia,

Espírito Santo, Rio de Janeiro, Minas Gerais, São Paulo, Paraná, Rio Grande

do Sul e Santa Catarina (FREITAS; KINOSHITA, 2015; LORENZI, 2002).

É uma arvoreta com altura que varia de 6-12 m, com tronco de 30-40 cm de

diâmetro. Floresce duas vezes ao ano, podendo a mesma espécie estar com

flores e frutos maduros na mesma árvore. Os frutos são pequenos (3-5 mm

diâmetro), globosos e de coloração negro-arroxeada quando maduros

(LORENZI, 1992; PASCOTTO, 2007).

A R. ferruginea é utilizada como tintoriais, e os frutos são alimentos

para várias espécies de pássaros (PINESCHI, 1990) e também de humanos

(os frutos são usados como condimentos em vinagre). Além disso, também é

utilizada para produção de carvão, na construção civil, como lenha,

53

paisagismo e reflorestamento para recuperação ambiental (LORENZI, 2002;

PASCOTTO, 2007).

O chá das folhas ou decocção de cascas da planta é indicado

popularmente por ter efeito diurético, utilizado no combate às afecções

urinárias e também constitui um bom depurativo. Diminui coceiras, erupções,

urticárias, eczemas, reumatismo e afecções do fígado (BOTREL, 2006;

LORENZI, 1992).

Figura 6 - Foto da espécie R. ferruginea: a) planta inteira, b) frutos verdes e folhas,

c) cascas do caule.

Fonte: Zermiani, 2015.

54

3.4.1 Aspectos Químico-farmacológicos

Como reportado anteriormente, do ponto de vista químico, várias

substâncias já foram isoladas de espécies de Myrsine, algumas com atividade

biológica já conhecida, enquanto outras estão sendo estudadas. Os principais

representantes do metabolismo neste gênero são os derivados de ácidos

benzóicos prenilados, os quais possuem estrutura química e atividade

biológica diferentes. Também são encontrados benzoquinonas e

triterpenóides em espécies como: R. myricoides, R. umbellata, R. lancifolia,

R. guyanensis e Myrsine seguinii (BLUNT; CHEN; WIEMER, 1998;

MAKABE et al., 2003). Além disso, são encontrados triterpenos

pentacíclicos dos esqueletos leanano e ursano, triterpenos tetracíclicos dos

esqueletos damarano e cicloartano, saponinas triterpênicas e flavonoides

glicosilados (JANUÁRIO et al., 1991; FOUBERT, 2008).

Já foram isolados e identificados os compostos ácido mirsinóico A,

B, C, D, E e F em espécies de Rapanea sp., dentre elas R. ferruginea

(ZERMIANI et al., 2016), e demonstraram importante atividade anti-

inflamatória (DONG et al., 1999; HIROTA et al., 2002; MAKABE et al.,

2003; ITO; NARISE; SHIMURA, 2008). Das espécies brasileiras R.

umbellata, R. lancifolia, R. guyanensis, R. ferruginea foram isolados os

compostos ácido mirsinóico A (1) e B (2) (BACCARIN et al., 2011;

JANUÁRIO, et al., 1991; HIROTA et al, 2002).

Figura 7 - Estrutura química do ácido mirsinóico A (1) e B (2).

Fonte: Adaptado de Gazoni (2009).

55

Quanto aos aspectos farmacológicos do gênero, os extratos são

utilizados como anti-inflamatório, analgésico, antioxidante, antiparasitário,

no tratamento da tuberculose, de infecções ginecológicas, hiperplasia lobular,

histeromiomas, cistos de ovário, reumatismo e artrite reumática

(MANGURO; MIDIWO; KRAUS, 1996; LALL; MEYER, 1999;

MIZUSHIMA et al., 1999; MAKABE, 2003; CORDERO et al., 2004;

GATHUMAA et al., 2004; MOMTAZ; LALL; BASSON, 2008).

Com relação aos seus componentes majoritários o AMB demostrou

ter efeito inibitório sobre a enzima metioninase a partir de bactérias

periodontais, como Fusobacterium nucleantum, Porphyromonas gingivalis e

Treponema denticola, apresentando efeito inibidor superior ao do cloreto de

zinco, que é tido como um inibidor da metioninase (ITO; NARISE;

SHIMURA, 2008).

Em estudo preliminar, foi verificado o potencial efeito

hipoglicêmico de extrato bruto de Rapanea sp. sobre a liberação de insulina

de animais normoglicêmicos e observou que nas doses de 200 e 350 mg/kg

de extratos houve um perfil glicêmico semelhante a glibenclamida

(STIEVEN, 2005). Monteiro (2009) verificou os efeitos do tratamento

crônico com o AMB em animais diabéticos induzido por estreptozotocina.

Após 15 dias de tratamento com AMB na concentração de 10 mg/kg os

animais apresentaram uma redução de 38-23% na glicemia quando

comparado ao grupo hiperglicêmico, e após 30 dias de tratamento a redução

foi de 49,01%.

Antonialli (2012) evidenciou que o AMB, além da propriedade

antinociceptiva evidenciada em estudos anteriores utilizando testes de

nocicepção aguda, apresenta também efeito anti-hipernociceptivo marcante

quando avaliado em modelos animais de dor persistente de origem

inflamatória e neuropática em camundongos. O estudo demonstrou ainda que

AMB, quando administrado principalmente por via sistêmica (oral e

endovenosa) é capaz de reduzir de modo significativo a resposta

hipernociceptiva induzida pela carragenina em camundongos, apresentando

um excelente potencial para tratar a dor persistente em seres humanos, sem

quaisquer efeitos secundários significativos.

O AMB também produz antinocicepção sistêmica, quando avaliada

em modelos químicos de nocicepção em ratos, em doses que revelam

nenhuma interferência na atividade locomotora. Os resultados sugerem que o

56

AMB pode ter potencial valor terapêutico para o desenvolvimento de novos

fármacos analgésicos (HESS et al., 2010). Além disso, o AMB também

apresentou atividade antinociceptiva no modelo das contorções abdominais

induzidas por ácido acético, demonstrando inibição máxima de 44%, sendo

mais ativo que o medicamento referência (aspirina) (TESTONI, 2004).

Em estudo realizado por Galvan (2007) foi testado o efeito do

extrato bruto clorofórmico das cascas de R. ferruginea e do AMB isolado,

comparados com a morfina, utilizando modelo de dor neuropática diabética.

Os tratamentos com extrato bruto e AMB impedir am completamente o efeito

hiperalgésico nos dois modelos testados, produzindo efeitos antinociceptivo

semelhantes ao da morfina.

Quanto à atividade antitumoral, o AMB testado por via oral e

intraperitoneal, apresentou uma redução satisfatória no número de células

tumorais e no volume do Tumor Ascítico de Ehrlich (TESTONI, 2004).

AMB apresentou atividade leishmanicida contra os protozoários

Leishmania amazonensis e Leishmania brasiliensis, sugerindo sua

importância como uma possível fonte de agentes antiparasitários

(CECHINEL-FILHO et al., 2013).

Também foi avaliada a atividade anticolinesterásica do AMA e

AMB in vitro. AMA apresentou atividade superior ao AMB em todos os

tecidos cerebrais testados (GAZONI, 2009; FILLIPIN, 2010). Além disso,

AMA facilitou a ação sobre as fases de memória (aquisição, consolidação e

evocação) em camundongos normais e também com doença de Alzheimer

induzida por estreptozotocina (COSTA, 2011). AMA e AMB apresentaram

atividade antibacteriana significativa contra Staphylococcus aureus e

Bacillus subtilis. Além disso, também apresentaram potencial tóxico

moderado no bioensaio com ovos de Artemia salina e não apresentaram

efeitos mutagênicos contra Saccharomyces cerevisiae (BELLA-CRUZ et al.,

2013).

57

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Material Vegetal:

4.1.1 Preparação do extrato hidroalcóolico de Rapanea ferruginea

As cascas do caule de Rapanea ferruginea foram coletadas na rua

Belo Horizonte, município de Blumenau, estado de Santa Catarina, Brasil,

em outubro de 2015.

O material vegetal já foi anteriormente identificado pelo Prof. Oscar

Benigno Iza (UNIVALI) e uma amostra foi depositada no Herbário Barbosa

Rodrigues (Itajaí/SC), sendo catalogada pelo código HBR52715.

As cascas do caule foram processadas em um moinho de facas,

sendo triturados para preparo da solução extrativa. Conforme padronizado

por Baccarin (2011), o extrato foi preparado usando maceração dinâmica,

etanol 90 % v/v, proporção 1:10, velocidade de 400 rpm por 2 horas. A

solução foi filtrada e concentrada até a obtenção do extrato mole. O extrato

mole foi diluído em propilenoglicol na concentração de 10%, denominado

extrato hidroalcóolico das cascas de Rapanea ferruginea, EHCRF-1 (figura

8).

O mesmo procedimento foi repetido mais uma vez, a fim de se obter

maior quantidade de extrato, sendo denominado EHCRF-2.

Ambos os extratos foram utilizados para avaliação biológica, sendo

o EHCRF-1 utilizado para os ensaios com camundongos (ítem 4.4 - 4.6) e o

EHCRF-2 com ratos (ítem 4.7).

4.1.2 Isolamento e identificação dos compostos AMA e AMB

O isolamento dos compostos foi realizado sob orientação da

professora Dra. Angela Malheiros no laboratório de Fitoquímica da Univali.

O EHCRF-2 foi submetido a coluna cromatográfica (CC) utilizando

como fase estacionária sílica gel 60 e como fase móvel mistura de solventes

orgânicos com gradiente de polaridade utilizando hexano, acetato de etila e

etanol. O gradiente de eluição foi definido baseado na observação do

comportamento das frações por cromatografia de camada delgada (CCD).

58

Por meio de coluna cromatográfica foram obtidos os compostos

AMA e AMB. Ambos os compostos foram analisados através de

Cromatografia Líquida de Alta Eficiencia (CLAE), a fim de comprovar sua

identificação e também avaliar a pureza dos mesmos (figura 8).

Para análise por CLAE dos compostos (AMA e AMB) e extratos de

R. ferruginea EHCRF-1. E EHCRF-2), as amostras foram diluídas em

metanol na concentração de 2 mg/mL para o extrato e 100 μL/mL para os

compostos. Foram filtradas com membrana de PTFE modificada de 0,45 µm.

Foi utilizada como fase fixa, coluna Kinetex C18 2,6 µm 150 x4.60 mm.

Como fase móvel foram eluídas misturas com gradiente de polaridade de

acetonitrila, metanol e água acidificada com tampão fosfórico de pH 2,6, com

fluxo de 0.9 mL/min a 40°C.

A detecção foi realizada por espectro de varredura na faixa de

cumprimento de onda em 190 nm até 400 nm. O software LC Solution® foi

utilizado para registar os cromatogramas e medias as áreas dos picos.

Figura 8 - Estrutura química do ácido mirsinóico A (1) e B (2).

EHCRF = extrato hidroalcóolico das cascas de Rapanea ferruginea; AMA = ácido

mirsinóico A; AMB = ácido mirsinóico B; CC = colula cromatográfica; RT = tempo

de retenção.

59

4.2 Substâncias utilizadas e vias de administração

Para os ensaios farmacológicos in vivo foram utilizadas as seguintes

substâncias: imipramina, reserpina, paraclorofenilalanina (PCPA), 1-(2-

Methoxyphenyl)-4-[4-(2-phthalimido)butyl]piperazine hydrobromide)

(NAN-190), ketanserina, ondansetrona, prazosin, ioimbina, haloperidol, 7-

chloro-3-methyl-1-phenyl-1,2,4,5-tetrahydro-3-benzazepin-8-ol

(SCH23390) e estreptozotocina (obtidos de Sigma-Aldrich, Missouri, EUA).

Para a realização dos testes in vitro foram utilizados os seguintes

reagentes: reagente de Bradford, ácido tricloroacético (ATC),

hidroximetilaminometano (TRIS), 5,5’-ditiobis 2-ácido nitrobenzóico

(DTNB), metanol, água destilada, butil hidróxi tolueno (BHT), ácido

sulfúrico, xilenol, ferro, tampão Tris/EDTA, peróxido de hidrogênio, água

milli-q, pirogallol, ácido clorídrico, 1-cloro-2,4 dinitrobenzeno (CDNB),

glutationa reduzida (GSH), azida sódica, β-NADPH, glutationa redutase de

levedura, tampão fosfato de sódio, 5-HT, butil acetato, vanádio,

sulfonilamida, etilenodiamina, nitrato de sódio, sulfato de zinco e ácido

ascórbico.

4.3 Métodos

4.3.1 Avaliação farmacológica in vivo

4.3.1.1 Animais

Para a primeira parte experimental (4.4 a 4.6) foram utilizados

camundongos Swiss fêmeas (25 a 30 g), oriundos do Biotério Central da

Univali. As metodologias propostas no presente estudo são consagradas na

literatura científica e para alguns testes ou modelos farmacológicos,

principalmente no que tange a parâmetros comportamentais utilizados em

modelos animais de patologias, atualmente não existem métodos alternativos

para a avaliação das atividades aqui propostas que não utilizem animais.

Além disso, foram utilizadas fêmeas devido a depressão maior ser mais

prevalente em mulheres (WHO, 2017).

Os animais foram mantidos no biotério setorial em caixas com

maravalha, com no máximo 20 animais/caixa com ciclo claro/escuro de 12

60

horas, aclimatados a temperatura de 22 2 C e tratados com água e ração ad

libitum, exceto durante os experimentos. As caixas foram trocadas em dias

alternados por técnico responsável conforme rotina interna do biotério. Os

animais permaneceram no biotério por no máximo 3 dias, exceto nos casos

de tratamento crônico. Durante os experimentos, os mesmos foram

conduzidos para a sala experimental e permaneceram em ambientação por

um período mínimo de uma hora. Após os experimentos os animais foram

eutanaziados por equipe responsável, com CO2/O2 (conforme Conselho

Nacional de Controle de Experimentação Animal, CONCEA) prática local

da instituição) e as carcaças foram descartadas em sacos de lixo hospitalar,

para processo de incineração, também conforme pratica local.

Já para os procedimentos experimentais (4.7. Avaliação do

comportamento tipo-depressivo e dos parâmetros de estresse oxidativo em

ratos diabéticos induzido pro estreptozotocina) foram utilizados ratas da

linhagem Wistar, com 2 a 3 meses de idade, pesando entre 150 e 200 g,

provenientes da Universidade do Vale do Itajaí (UNIVALI). Optou-se por

estes modelos animais devido ao fato de que os mesmos possuem sua

fisiologia semelhante à do homem, tendo seus aspectos intrínsecos

praticamente descritos em sua totalidade pela literatura.

Os procedimentos experimentais apresentados nesta dissertação

foram aprovados pelo Comissão de Ética no Uso de Animais –

CEUA/UNIVALI, sob pareceres números: 039/15 e 002/17 (ANEXO A e B).

4.3.2 Grupos experimentais

4.3.2.1 Grupos experimentais utilizando camundongos

Para a investigação farmacológica da atividade tipo-antidepressiva

em camundongos, os animais foram divididos em treze grupos experimentais

(n = 10), sendo eles:

61

Quadro 2 - Grupos de tratamento em camundongos

Grupo Tratamento, via de administração

Controle negativo Salina (NaCl 0,9%), v.o.*

Controle positivo Imipramina 20 mg/kg, v.o.

EHCRF 50 EHCRF 50 mg/kg, v.o.




AMA 5 AMA 5 mg/kg, v.o.



AMB 3 AMB 3 mg/kg, v.o.




*Administrações v.o. foram realizadas 60 min antes do experimento.

As doses foram definidas conforme trabalhos anteriores realizados

pelo Núcleo de Investigações Químico-Farmacêuticas (NIQFAR) da

Universidade do Vale do Itajaí, UNIVALI (GAZONI, 2009; FILLIPIN,

2010; COSTA, 2011).

As soluções foram administradas obedecendo um volume de 0.10

mL/peso corporal foi administrado nos animais.

4.3.2.2 Grupos experimentais utilizando ratos

Para a investigação farmacológica no comportamento tipo-

antidepressiva em ratos, os animais foram divididos em sete grupos

experimentais (n = 6-9), todos tratados durante 28 dias, sendo eles:

62

Quadro 3 - Grupos de tratamanto em ratas

Grupo Glicemia Tratamento, via de

administração

NOR Normoglicêmico Salina (NaCl 0,9%), i.p.

VEI Hiperglicêmico Imipramina 20 mg/kg, v.o.

INS Hiperglicêmico Insulina NPH 6UI, s.c.

IMI Hiperglicêmico Imipramina 20 mg/kg, i.p.

EHCRF Hiperglicêmico EHCRF 150 mg/kg, i.p.

AMA Hiperglicêmico AMA 5 mg/kg, i.p.

AMB Hiperglicêmico AMB 3 mg/kg, i.p.

O protocolo adotado foi baseado nos trabalhos de de Morais (2013),

com algumas modificações. O protocolo experimental está representado na

figura a seguir, e mais detalhes serão descritos ao longo da metodologia deste

estudo:

Figura 9 - Protocolo experimental

PE: pesagem; GLI: aferição da glicose; TCA: teste do campo aberto; TNF: teste do

nado forçado.

63

4.4 Avaliação da atividade tipo-antidepressiva de EHCRF em

camundongos

Avaliou-se a atividade tipo-antidepressiva de EHCRF (50, 100, 150

e 300 mg/kg, v.o.) utilizando os testes de nado forçado (TNF) e suspensão

pela cauda (TST), a ação sobre o sistema motor e depressor por meio do teste

do campo aberto (TCA) e sobre a anedonia de camundongos utilizando o

Splash test (ST).

4.4.1 Avaliação do efeito do EHCRF sobre o sistema motor e depressor

através do teste do campo aberto (TCA)

O TCA foi realizado com o intuito de verificar se o tratamento

utilizado não interferiria na mobilização do animal e, consequentemente, nos

resultados referentes a atividade tipo-antidepressiva, uma vez que os testes

da suspensão pela cauda e nado forçado exigem o processo de movimentação

do animal, tendo o sistema motor influência na resposta emitida.

O aparato utilizado para os experimentos com camundongos é

confeccionado em madeira (30 x 30 x 15 cm) com a frente de vidro para

melhor visualizar os animais. O interior do aparato é subdividido em nove

quadrantes. As dimensões podem variar conforme o tamanho do animal

estudado. O teste avalia efeitos inespecíficos de substâncias sobre o SNC bem

como o efeito de substâncias sobre o sistema motor dos animais. 60 minutos

após os tratamentos com EHCRF (50, 100, 150 e 300 mg/kg, v.o.), foram

observados os seguintes parâmetros: número de cruzamentos dos quadrantes

(Crossing) e número de tentativas de levantar o corpo sobre as patas traseiras

(Rearing), durante 6 minutos (OLIVEIRA et al., 2006).

4.4.2 Avaliação do efeito EHCRF sobre a depressão através do teste de

suspensão pela cauda (TSC)

A metodologia do TSC foi descrita por Steru et al (1985), com

modificações (Holzmann et al., 2014), para avaliar os possíveis efeitos

antidepressivos de substâncias. Nesse teste a parte terminal da cauda dos

camundongos foi fixada com fita adesiva, a uma altura de 50 cm do chão, em

64

um aparato de madeira com capacidade para 4 animais, os quais ficaram

isolados visível e acusticamente. O EHCRF (50, 100, 150 e 300 mg/kg, v.o.)

foi administrado 60 minutos antes do experimento. O tempo de observação

dos animais suspensos foi de 6 minutos, e foi analisado o tempo de

imobilidade dos animais. Substâncias com atividade tipo-antidepressiva

tendem a diminuir o tempo de imobilidade, aumentando o período de agitação

dos animais.

4.4.3 Avaliação do efeito EHCRF sobre a depressão através do teste do

nado forçado (TNF)

O TNF foi realizado conforme descrito por Rodrigues et al. (2002)

e padronizado por Holzmann (2014) em nossos laboratórios. Como controle

positivo foi utilizado imipramina (20 mg/kg, i.p.). O EHCRF (50, 100, 150 e

300 mg/kg, v.o.) foi administrado 60 minutos antes do experimento. Após o

tempo de administração dos tratamentos os animais foram colocados

individualmente num tanque de vidro (25 cm de altura e 10 cm de diâmetro),

cheio com água a uma temperatura de 24 a 25°C, durante 6 minutos. O tempo

de imobilidade dos animais foi utilizado como parâmetro, comportamento

este, que indica o estado de desesperança do animal após perceber que a fuga

do recipiente não será possível. Os animais foram considerados imóveis

quando realizaram movimentos necessários apenas para manter a cabeça em

cima da água (PORSOLT; BERTIN; JALFRE, 1977).

4.4.4 Avaliação do efeito EHCRF sobre a anedonia dos animais através

do Splash test (ST)

O ST, descrito anteriormente por Isingrini e colaboradores (2010),

consiste na vaporização de uma solução de sacarose a 10% sobre os animais

colocados de forma individual em um aparato de acrílico (9 x 7 x 11 cm). O

EHCRF (50, 100, 150 e 300 mg/kg, v.o.) foi administrado 60 minutos antes

do experimento. É um teste comportamental que avalia a anedonia dos

animais, desta forma, após a vaporização da solução de sacarose, são

cronometrados o tempo de latência e o tempo total de autolimpeza

(grooming) por um período de 5 minutos. Este teste é utilizado para avaliar o

65

comportamento motivacional e o autocuidado dos animais (WILLNER;

HALE; ARGYROPOULOS, 2005; YALCIN; AKSU; BELZUNG., 2005).

4.5 Análise do mecanismo de ação da atividade tipo-antidepressiva

Após constatar que o EHCRF (150 mg/kg, v.o.) apresentou efeito

tipo-antidepressivo no TSC, em um novo ciclo de experimentos, foi

investigado o mecanismo de ação da propriedade antidepressiva deste

extrato, por meio do mesmo teste. Após o TSC, foi realizado o TCA com os

mesmos animais, para investigar possível atuação no sistema motor dos

animais. Na avaliação do mecanismo de ação, foi investigado o sistema

monoaminérgico, serotonérgico, noradrenérgico e dopaminérgico. Os

camundongos foram divididos em quatro grupos distintos (n=10): controle

negativo (veículo), grupo tratado com EHCRF, antagonistas dos sistemas

avaliados e antagonista/EHCRF.

4.5.1 Avaliação da influência do sistema monoaminérgico sobre a

atividade tipo-antidepressiva do EHCRF

A fim de verificar o possível envolvimento do sistema

monoaminérgico no mecanismo de ação do EHCRF, os animais foram pré-

tratados com reserpina (2 mg/kg, i.p.), agente que causa depleção de

catecolaminas das vesículas sinápticas. Decorrido 18 horas após o tratamento

com reserpina, os animais receberam o EHCRF (150 mg/kg, v.o.) e/ou

veículo e foram submetidos ao TSC 60 minutos após o tratamento e logo

após, ao TCA (RABIEI; GHOLAMIN; RAFIEIAN-KOPAEI, 2016).

4.5.2 Avaliação da influência do sistema serotonérgico sobre a atividade

tipo-antidepressiva do EHCRF

A fim de verificar o possível envolvimento do sistema serotonérgico

no mecanismo de ação tipo-antidepressivo do EHCRF, os animais foram pré-

tratados durante 4 dias consecutivos com para-cloro-fenilalanina (PCPA -

100 mg/kg, i.p.), que inibe a enzima triptofano-hidroxilase, responsável pela

síntese de 5-HT, com isso, dos estoques de 5-HT no SNC são depletados.

66

Decorridas 24 horas após a última injeção de PCPA e/ou veículo, os animais

receberam EHCRF (150 mg/kg, v.o.) e foram submetidos ao TSC 60 minutos

após os tratamentos, seguido do TCA. A participação dos subtipos de

receptores serotonérgicos (5-HT1A e 5-HT2A) também foi investigada no

efeito tipo-antidepressivo do EHCRF. Para tanto, os animais foram pré-

tratados com NAN-190 (0,5 mg/kg, i.p., antagonista 5-HT1A), quetanserina

(5 mg/kg, i.p., antagonista 5-HT2A) e/ou veículo. Passados 30 minutos do

tratamento com os antagonistas, os animais receberam EHCRF (150 mg/kg,

v.o.) e decorridos 60 min foram avaliados no TSC, seguido do TCA. Para

verificar a influência do receptor serotonérgico subtipo 5-HT3, os

camundongos foram pré-tratados com ondasentrona (0,5 mg/kg, i.p.,

antagonista seletivo 5-HT3). Decorridos 30 min da administração, os animais

receberam EHCRF (150 mg/kg, v.o.) e, 60 min depois foram submetidos ao

TSC e TCA.

4.5.3 Avaliação da influência do sistema noradrenérgico sobre a

atividade tipo-antidepressiva do EHCRF

A fim de investigar o possível envolvimento do sistema

noradrenérgico no mecanismo de ação da propriedade tipo-antidepressiva do

EHCRF, os camundongos foram pré-tratados com prazosin (1 mg/kg, i.p.,

antagonista α1), ioimbina (1 mg/kg, i.p., antagonista α2), e/ou veículo, e após

30 minutos, receberam EHCRF (150 mg/kg, v.o.) 60 minutos após a

administração, os animais foram avaliados no TSC e TCA.

4.5.4 Avaliação da influência do sistema dopaminérgico sobre a atividade


A fim de investigar o possível envolvimento do sistema

dopaminérgico no mecanismo de ação da propriedade tipo-antidepressiva, os

animais foram pré-tratados com haloperidol (0,2 mg/kg, i.p.), antagonista não

seletivo dos receptores de dopamina, e/ou veículo. Decorridos 30 minutos do

tratamento, o animais receberam EHCRF (150 mg/kg, v.o.) e após mais 60

minutos, foram analisados no TSC e TCA. Na investigação da via

dopaminérgica, também foi avaliada a participação dos receptores seletivos

67

de dopamina, utilizando os antagonistas SCH23390 (0,05 mg/Kg, i.p.,

antagonista D1) e o pimozide (0,2 mg/kg, i.p., antagonista D2) e/ou veículo,

30 minutos antes do tratamento com EHCRF (150 mg/kg, v.o.). Decorridos

60 minutos da administração dos antagonistas, os animais foram avaliados no

TSC e TCA.

4.6 Avaliação da atividade tipo-antidepressiva dos compostos isolados de

Rapanea ferruginea, AMA e AMB

Foi relevante avaliar se os dois compostos majoritários da planta, o

AMA e AMB, seriam os responsáveis pelo efeito tipo-antidepressivo do

EHCRF. Para a realização dos testes, os animais foram pré-tratados com

AMA (5, 15 e 30 mg/kg, v.o.) e AMB (3, 10, 30 e 60 mg/kg, v.o.), imipramina

e veículo. Após 60 minutos das administrações, os animais foram submetidos

ao TSC (item 4.3.2) seguido do TCA (item 4.3.1) e ST (item 4.3.4).

4.6.1 Avaliação do tempo de duração da atividade tipo-antidepressiva do

EHCRF, AMA e AMB

Com o intuito de avaliar o tempo de duração do efeito tipo-

antidepressivo do EHCRF, AMA e AMB, foi realizada uma análise temporal.

Nesse experimento, sete grupos diferentes de animais receberam o EHCRF

(150 mg/kg, v.o), AMA (5 mg/kg, v.o.) ou AMB (3 mg/kg, v.o.), e um grupo

o veículo. Passados 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 8 horas da administração do EHCRF,

AMA, AMB e/ou veículo, os animais foram submetidos ao TSC seguido do

TCA.

4.7 Avaliação do comportamento tipo-depressivo e dos parâmetros de

estresse oxidativo em ratos diabéticos induzido pro estreptozotocina

4.7.1 Indução de Diabetes

A indução de diabetes foi realizada conforme descrito por de Morais

(2013) e da Silva (2014). Após jejum por 8 horas (apenas de comida), o

diabetes foi induzido com uma única injeção STZ na dose de 75 mg/kg i.p.,

68

dissolvida em tampão citrato (10 mM, pH 4,5). A hiperglicemia em jejum nos

animais foi confirmada 72 horas após a administração de STZ, através de tiras

de refletância com amostra de uma gota de sangue retirada da cauda. A

glicemia dos animais foi aferida novamente ao final dos testes

comportamentais. Animais com a glicemia em jejum ≥250 mg/dL foram

considerados hiperglicêmicos e mantidos no estudo. Todos os animais foram

observados diariamente e pesados a cada 7 dias ( totalizando 4 pesagens)

durante o período de experimento.

4.7.1.1 Hemoglobina glicada

A hemoglobina glicada (HbA1) foi determinada por resina de

permuta-iónica de acordo com as instruções do fabricante (Trinity biotech,

Brasil). As amostras de sangue foram misturadas com reagente de lise para

preparar um hemolizado. A preparação hemolizada é então misturada durante

5 minutos com resina catiônica que se liga a hemoglobina (HbAO). Após

centrifugação, a HbA1 é determinada no sobrenadante. A absorvência foi

determinada a 405 nm e o resultado foi expresso em percentagem de HbA1.

4.7.2 Teste do campo aberto (TCA)

Após o 28º dia do tratamento crônico, foi realizado o TCA, de

acordo com Santiago e colaboradores (2010). Os animais serão colocados

individualmente em um aparato de campo aberto retangular (40 cm x 50 cm

x 63 cm) com o chão dividido em 6 retângulos. A atividade exploratória

(rearings) e o número de cruzamentos de linhas com as quatro patas

(crossings) foram contados durante 5 minutos. Esse teste foi realizado

principalmente para observar se o procedimento de indução de diabetes ou os

tratamentos com INS, IMI, EHCRF, AMA e AMB interferem na atividade

locomotora dos animais, evitando resultados falso-negativos ou falso-

positivos.

69

4.7.3 Teste do nado forçado (TNF)

O TNF foi realizado logo após o TCA, segundo a metodologia de

Porsolt et al. (1978) com algumas modificações. O teste foi conduzido por

duas sessões. A primeira sessão foi o pré-teste, a qual os ratos foram

colocados individualmente para nadar em um tanque com água (30 cm x 40

cm de altura, contendo 25 cm de água a 24 ± 1 °C), durante 5 minutos. 24

horas após, os animais foram submetidos novamente para nadar no tanque de

água (sessão teste). Durante a sessão teste foi cronometrado o tempo total de

imobilidade (exceto leves movimentos leves necessários para flutuar) e o

tempo de latência para o primeiro episódio de imobilidade (WAYHS et al.,

2010). Depois de cada sessão (pré-teste e teste), os animais foram removidos

e colocados em uma caixa separada para secagem, e depois serão colocados

novamente em suas caixas habituais.

4.7.4 Avaliação de parâmetros oxidativos

4.7.4.1 Preparação das amostras

Os animais foram tratados durante 28 dias conforme os tratamentos

já descritos no item 4.3.2.2; sendo que 24 horas após a última administração,

os mesmos foram eutanasiados pelo método da guilhotina, para que não

houvesse interferência nos resultados bioquímicos. Rapidamente, o córtex

pré-frontal (CPF) e o hipocampo (HIP) dos animais de todos grupos

experimentais foram dissecados, sendo homogeneizados separadamente em

200 mM de tampão fosfato de sódio (pH 6,5) a 4°C. O sangue total também

foi coletado em tubo previamente heparinizado e levando à centrifugação a

1000 rpm, durante 5 minutos, com o propósito de separação do plasma.

Os homogenatos foram utilizados para determinação da glutationa

redutase (GSH) e níveis de peroxidação lipídica (LOOH) e depois

centrifugado a 9000 rpm por 20 minutos. O sobrenadante foi utilizado para

determinação da atividade da superoxido dismutase (SOD) e catalase (CAT).

70

4.7.4.2 Mensuração da concentração de proteínas

A concentração de proteínas foi mensurada em espectrofotômetro a

590 nm utilizando o reagente de Bradford (Amresco®) e albumina bovina

(0,012 – 0,100 mg/ml) foi utilizada como curva padrão.

4.7.4.3 Quantificação dos níveis de GSH

Para quantificar os níveis de GSH foi utilizado o método de Sedlak

e Lindsay (1968), com algumas modificações. Nos microtubos de

polipropileno foi adicionado 50 µL dos homogenatos ou plasma, preparados

como descrito anteriormente, e 40 µL de ácido tricloroacético (ATC) 12,5%,

e foi centrifugado por 15 minutos (4000 rpm, 4ºC). Posteriormente foi

adicionado uma alíquota de 20 μL do sobrenadante, seguido de 270 μL de

TRIS 0,4 M (pH 8,9) e 10 μL de 5,5’-ditiobis 2-ácido nitrobenzóico (DTNB)

1 mM em uma placa de 96 poços. Para a realização do branco foi utilizado

300 µL de TRIS 0,4 M (pH 8,9). Em seguida foi realizada a leitura em

espectrofotômetro (415 nm). Os valores individuais foram interpolados em

uma curva padrão de GSH (1,23–9,9 μg/mL), com os valores expressos em

μg de GSH/g de tecido.

4.7.4.4 Determinação da atividade enzimática da superóxido dismutase

(SOD)

A atividade enzimática da SOD foi determinada através da

capacidade desta enzima em inibir a auto-oxidação do pirogallol

(MARKLUND; MARKLUND, 1974). Em um microtubos de polipropileno

foi adicionado 442,5 μL de tampão Tris/EDTA (pH= 8,5) e 40 µL do

sobrenadante da amostra. A mistura reacional acrescida da amostra foi

homogeneizada e acrescentado 25 µL de pirogallol. Posteriormente o meio

reacional foi armazenado em temperatura ambiente por 20 minutos. Ao

término do período de incubação, foi adicionado 12,5 µL de HCl 1M, com o

objetivo de parar a reação. Os microtubos de polipropileno foram

centrifugados por 4 minutos (14000 rpm, 4ºC). Em uma placa de 96 poços

foram adicionados 300 µL do sobrenadante. A absorbância foi quantificada

no espectrofotômetro (405-440 nm). Os resultados foram comparados com o

71

controle (tampão Tris-EDTA com pirogallol sem incubação + média sem

amostra sem incubação), sendo este valor igual a 100%. A quantidade de

proteína que inibe a reação em 50% (IC50) equivale a 1 unidade (U) de SOD.

Os resultados foram expressos em U de SOD/mg de proteína.

4.7.4.5 Quantificação da atividade da enzima catalase (CAT)

A metodologia a ser utilizada foi descrita por Aebi (1984) com

algumas modificações. Para isso, os homogenatos foram centrifugados por

20 minutos a 9000 RPM a uma temperatura de 4ºC. Posteriormente, 20 µL

do sobrenadante foi transferido para uma cubeta de quartzo com 1960 µL de

solução de reação (Tampão Tris/ EDTA 5mM, pH 8,0; peróxido de

hidrogênio 30%; água ultrapura). O decréscimo da absorbância foi medido

em comprimento de onda de 240 nm por 1 minuto. Os resultados foram

expressos em μmol de H2O2 consumidos/min/g de tecido.

4.7.4.6 Determinação do teor de hidroperóxidos lipídicos (LOOH)

Para avaliar o dano no tecido cerebral produzido pelo estresse

oxidativo ocasionado pela peroxidação lipídica, foi utilizado o método de

Jiang; Hunt, Wolff, (1992). Primeiramente, em 100 μL de homogenato foi

adicionado 10 μL de metanol, homogeneizados e levados a centrifuga por 20

minutos (9000 rpm, 4ºC). Posteriormente, em uma placa de 96 poços foi

adicionado 30 μL do sobrenadante e 140 μL do meio reacional (4 mM

hidroxitolueno butilado, 250 mM FeSO4, 25 mM H2SO4 e 100 mM xilenol

laranja). A placa permaneceu por 30 min ao abrigo da luz, e após esse período

foi realizada leitura em espectrofotômetro (560 nm) e a concentração de

LOOH foi ajustada a 1 mg de tecido. Os resultados foram expressos em

mmol/mg de tecido, utilizando o coeficiente de extinção de 43.6/M/cm de

H2O2.

4.8 Análise estatística

Foi utilizado o software GraphPad ® versão 6.0 e Microsoft Excel

® 2013 para tratamento dos dados. Os resultados obtidos foram avaliados

estatisticamente através da análise de variância de uma ou duas vias

72

(ANOVA), quando aplicável, seguido do Teste de Tukey. Os dados foram

apresentados como médias seguido do erro padrão médio (EPM). Foram

considerados significativos os resultados com P<0,05.

73

5 RESULTADOS

5.1 Análise por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)

Os compostos isolados dos extratos de R. ferrugínea foram

submetidos a técnicas de CCD e, posteriormente, foram submetidos da

técnica de CLAE, afim de comprovar sua identificação e também pureza.

As análises foram comparadas com padrão disponível no laboratório

e também com a literatura (ZERMIANI, 2015; 2016). O composto

identificado como AMB apresentou RT de 15,58 min e 98,77% de pureza,

enquanto o AMA apresentou tempo de rentenção (RT) de 16,05 min e

91,85% de pureza, ambos os RTs condizentes com a literatura para a

metodologia utilizada (ZERMIANI, 2015; 2016).

Afim de avaliar a quantidades dos compostos isolados presentes nos

extratos das cascas de R. ferrugínea (EHCRF-1 e EHCRF-2), ambos foram

analisados através de CLAE. Tanto em EHCRF-1 quanto em EHCRF-2), foi

possível identificar a presença dos compostos isolados neste estudo, AMA e

AMB, entretanto, ocorreram diferenças importantes em relação as

concentrações destes componentes.

No EHCRF-1, foi identificado menor concentração de AMA

(245,11 µg/mL), e maior concentração de AMB (360,16 µg/mL), enquanto

que no EHCRF-2 os resultados foram invertidos, foram evidenciados, 239,69

µg/mL de AMA e 650,38 µg/mL de EMB. Essa diferença pode ser observada

devido a diferença na época de maceração do extrato. Sabe-se que o maior

tempo de armazenamento (EHCRF-2), diminui a humidade presente e

também pode favorecer algumas reações bioquímicas como oxidações, oxi-

reduções, entre outras, dependedo da espécie vegetal, temperatura, humidade

e tempo em que ficaram armazenadas (AKINYELE et al., 2017).

É importante ressaltar que a diferença entre as concentrações destes

compostos poderá resultar em diferentes resultados de atividade biológica,

principalmente se um deles for o composto responsável por tal ação.

5.2 Efeito tipo-antidepressivo do EHCRF em camundongos

O efeito do tratamento de EHCRF sobre o parâmetro

comportamental tempo de imobilidade observado no TSC e TNF é mostrado

na Figura 9A e 9B, respectivamente. O EHCRF nas doses de 100, 150 e 300

74

mg/kg diminuiu tempo de imobilidade no TSC [F(5, 44) = 35,22, P<0,0001]

e, nas doses de 150 e 300 no TNF [F(5, 41) = 16,88, p<0,0001].

No comportamento de autolimpeza no ST, todas as doses testadas

aumentaram o tempo de autocuidado de forma significativa, semelhante ao

resultado apresentado pela imipramina [F(5, 42) = 17,12, P<0,0001] (figura

9). No TCA (figura 5E) o EHCRF não promoveu nenhuma alteração na

atividade locomotora dos camundongos, quando comparado ao grupo

controle [F(4, 30) = 0,4441, P= 0,7757].

Considerando que o EHCRF na dose de 150 mg/kg, v.o. foi tão

eficaz quanto a dose de 300 mg/kg na redução do tempo de imobilidade no

TSC, esta dose foi escolhida para todos os experimentos subsequentes na

investigação dos mecanismos envolvidos no efeito tipo-antidepressivo. Além

disso, o TSC apresentou maior sensibilidade frente ao TNF na redução da

imobilidade dos animais, e por isso foi o teste de escolha para a realização

dos demais experimentos.

75

Figura 10 - Efeito tipo-antidepressivo da administração do EHCRF em camundongos,

no TSC, TNF e ST.

V e íc u lo 2 0 5 0 1 0 0 1 5 0 3 0 0

0

5 0

1 0 0

1 5 0

2 0 0

E C (m g /k g , v .o .)

Te

mp

o d

e i

mo

bil

ida

de

(s

)

* * * *

Im ip ra m in a (m g /k g , i .p .)

* * * *

* * * *

A

*

+ + + +

+

+ +

T S C

# # # #

# # # #

# # # #

Te

mp

o d

e i

mo

bil

ida

de

(s

)

V e íc u lo 2 0 5 0 1 0 0 1 5 0 3 0 0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

B

*

* * * *

* * * *

# # # #

## #

T N F

V e íc u lo 2 0 5 0 1 0 0 1 5 0 3 0 0

0

2 0

4 0

6 0

La

tên

cia

pa

ra a

uto

lim

pe

za

(s

) C

*

* * * *

# #

S T

# # # #

V e íc u lo 2 0 5 0 1 0 0 1 5 0 3 0 0

0

5 0

1 0 0

1 5 0

Te

mp

o d

e a

uto

lim

pe

za

(s

)

* * * ** * * *

* * * *

D

* * * *

* *

S T

#

Cro

ss

ing

(Nº d

e c

ruz

am

en

tos

) (

s)

V e íc u lo 2 0 5 0 1 0 0 1 5 0 3 0 0

0

5 0

1 0 0

1 5 0

ET C A

Efeito da administração de EGCRF (50, 100, 150 e 300 mg/kg, v.o.) e imipramina (20

mg/kg, v.o.) no tempo de imobilidade no TSC (A), TNF (B), latência para a

autolimpeza (C) e tempo total de autolimpeza (D) no ST, e número de cruzamentos

no TCA (E). EHCRF foi administrado 60 minutos antes dos testes. Os valores foram

expressos como média ± EPM (n=8-10). *P<0,05 e ****P<0,0001 quando comparado

com o grupo controle tratado com salina; +P<0,05, ++P<0,01 e ++++P<0,0001

quando o grupo tratado é comparado com o próximo grupo tratado com dose maior;

#P<0,05, ##P<0,01 e ####P<0,0001 quando comparado com o grupo controle tratado

com imipramina (ANOVA de uma via seguida do teste de Tukey).

76

5.3 Determinação do mecanismo de ação monoaminérgico da atividade


Após observar melhor atividade tipo-antidepressiva de EHCRF

sobre TSC, foi avaliado o possível mecanismo de ação do extrato sobre o

sistema monoaminérgico de camundongos, principal sistema responsável

pelo mecanismo de ação de fármacos antidepressivos.

5.3.1 Avaliação do sistema monoaminérgico sobre a atividade tipo-

antidepressiva do EHCRF

O pré-tratamento dos animais com reserpina (2 mg/kg, i.p.), 18 horas

antes da administração do EHCRF, foi capaz de impedir o efeito tipo-

antidepressivo no TSC (figura 10) (Pré-tratamento com reserpina [F(1, 29) =

13,74, P=0,0009], tratamento com EHCRF [F(1, 29) = 193,9, P<0,0001],

interação reserpina × EHCRF [F(1, 29) = 36,81, P<0,0001]. A administração

de reserpina sozinha ou associada com EHCRF (figura 10A) alterou a

atividade locomotora no TCA (figura 10B). Pré-tratamento com reserpina

[F(1, 33) = 3,253, P=0,0804], tratamento com EHCRF [F(1, 33) = 2120,

P<0,0001], interação reserpina × EHCRF [F(1, 33) = 4,444, P=0,0427].

Figura 11 - Influência da reserpina no efeito tipo-antidepressivo de EHCRF

Te

mp

o d

e i

mo

bil

ida

de

(s

)

C o n tro le E C

0

1 0 0

2 0 0

3 0 0

S a lin a

R e s e rp in a (2 m g /k g )

A * * * * # # # #

* * * *

Nú

me

ro d

e C

ruz

am

en

tos

C o n tro le E C

0

5 0

1 0 0

1 5 0

# # # #

B

* * * *

Efeito do pré-tratamento dos camundongos com reserpina (2 mg/kg, i.p.), 18 horas

antes da administração do EHCRF no efeito anti-imobilidade no TSC (figura A) e no

número de cruzamentos no TCA (figura B). Os valores foram expressos como média

± EPM (n=8-10). ****P<0,0001 quando comparados com o grupo controle tratado

77

com salina; #### P<0,0001 comparado com o mesmo grupo pré-tratado com salina

(ANOVA de duas vias seguida do teste de Tukey).

5.3.2 Avaliação do sistema serotonérgico

Para a avaliação da influência do sistema serotonérgico na atividade

tipo-antidepressiva do EHCRF, foram utilizados: PCPA (p-clorofenilalanina,

inibidor da enzima triptofano hidroxilase); NAN-190, (antagonista seletivo

de receptores serotonérgicos 5-HT1A); quetanserina (antagonista do receptor

serotonérgico 5-HT2A); e ondansetrona (antagonista do receptor

serotonérgico 5-HT3).

O pré-tratamento dos camundongos com o PCPA (100 mg/kg, i.p.),

foi capaz de impedir o efeito tipo-antidepressivo do EHCRF (Figura 11).

ANOVA de duas vias revelou diferenças significativas entre o pré-tratamento

com PCPA [F(1, 24) = 3,138, P=0,0892], tratamento com EHCRF [F(1, 24)

= 133,8, P<0,0001], interação PCPA × EHCRF [F(1, 24) = 78,81, P<0,0001].

O tratamento com PCPA isolado não foi capaz de alterar a atividade

locomotora no TCA, porém, quando combinado PCPA com o EHCRF

(Figura 11B), a atividade locomotora no TCA foi diminuída. Pré-tratamento

com PCPA [F(1, 33) = 44,98, P<0,0001], tratamento com EHCRF [F(1, 33)

= 9,551, P=,0040], interação PCPA × EHCRF [F(1, 33) = 4,173, P=0,0491].

Para a continuar a avaliação do sistema serotonérgico, foi

administrado NAN-190. Este foi capaz de impedir o efeito tipo-

antidepressivo do EHCRF (Pré-tratamento com NAN-190 [F(1, 24) = 0,9026,

P=0,3515], tratamento com EHCRF [F(1, 24) = 97,68, P<0,0001], interação

NAN-190 × EHCRF [F(1, 24) = 49,04, P<0,0001] (figura 12A). A

administração de NAN-190 isolado ou em combinação com o EHCRF (figura

12B) não alterou a atividade locomotora dos animais no TCA. Pré-tratamento

com NAN-190 [F(1, 26) = 14,21, P=0,0009], tratamento com EHCRF [F(1,

26) = 12,68, P=0,0015], interação NAN-190 × EHCRF [F(1, 26) = 0,250,

P=0,6206].

78

Figura 12 - Influência de PCPA no efeito tipo-antidepressivo da administração de

EHCRF T

em

po

de

im

ob

ilid

ad

e (

s)

C o n tro le E C

0

5 0

1 0 0

1 5 0

2 0 0

S a lin a

P C P A (1 0 0 m g /k g )

A * * * *

# # # #

* * * *

Nú

me

ro d

e C

ruz

am

en

tos

C o n tro le E C

0

5 0

1 0 0

1 5 0 B

# # # #* *

Efeito do pré-tratamento dos camundongos com PCPA (100 mg/kg, i.p.), durante 4

dias consecutivos anteriores à administração do EHCRF no efeito de anti-imobilidade

no TSC (figura 6A) e no número de cruzamentos no TCA (figura 6B). Os valores

foram expressos como média ± EPM (n=8-10). ****P<0,0001 quando comparados

com o grupo controle tratado com salina; ####P<0,0001 comparado com o mesmo

grupo pré-tratado com salina (ANOVA de duas vias seguida do teste de Tukey).

Para a avaliação da influência do subtipo de receptor serotonérgico

5-HT2A, foi utilizada a quetanserina (5 mg/kg, i.p.) como antagonista. Os

resultados demonstram que o bloqueio deste receptor, foi capaz de impedir o

efeito tipo-antidepressivo do EHCRF (figura 13A) (Pré-tratamento com

quetanserina [F(1, 24) = 32,80, P<0,0001], tratamento com EHCRF [F(1, 24)

= 268,1, P<0,0001], interação quetanserina X EHCRF [F(1, 24) = 99,26,

P<0,0001]. O tratamento dos camundongos com quetanserina isolada ou

combinada com o EHCRF (figura 13B) causou uma diminuição da atividade

locomotora no TCA. Pré-tratamento com quetanserina [F(1, 33) = 3,241,

P=0,0810], tratamento com EHCRF [F(1, 33) = 18,01 P=0,0002],

interação quetanserina X EHCRF [F (1, 33) = 0,04596, P=0,8316].

79

Figura 13 - Influência do NAN-190 no efeito tipo-antidepressivo da administração

de EHCRF

Te

mp

o d

e i

mo

bil

ida

de

(s

)

C o n tro le E C

0

5 0

1 0 0

1 5 0

2 0 0

2 5 0

S a lin a

N A N -1 9 0 (0 ,5 m g /k g )A

* * * *

# # # #

Nú

me

ro d

e C

ruz

am

en

tos

C o n tro le E C

0

5 0

1 0 0

1 5 0 B

*

Efeito do pré-tratamento dos camundongos com NAN-190 (0,5 mg/kg, i.p.), 30 min



± EPM (n=8-10). ****P<0,0001 quando comparados com o grupo controle tratado

com salina; #### P<0,0001 comparado com o mesmo grupo pré-tratado com salina


Figura 14 - Influência da quetanserina no efeito tipo-antidepressivo da administração

EHCRF

Te

mp

o d

e i

mo

bil

ida

de

(s

)

C o n tro le E C

0

5 0

1 0 0

1 5 0

2 0 0

2 5 0

S a lin a

Q u e ta n s e r in a (5 m g /k g )

A

* * * *# # # #

* * *

Nú

me

ro d

e C

ruz

am

en

tos

C o n tro le E C

0

5 0

1 0 0

1 5 0

* #

B

Efeito do pré-tratamento dos camundongos com quetanserina (5 mg/kg, i.p.), 30 min



± EPM (n=8-10). *P<0,05 e ****P<0,0001 quando comparados com o grupo controle

tratado com salina; #P<0,05 e ####P<0,0001 quando comparados com o mesmo

grupo pré-tratado com salina (ANOVA de duas vias seguida do teste de Tukey).

Também foi avaliada a influência do subtipo de receptor

serotonérgico 5-HT3, ondasentrona (0,5 mg/kg, i.p.) como antagonista. Os

80

resultados demonstram que o pré-tratamento dos animais com ondasentrona

reverteu o efeito tipo-antidepressivo do EHCRF (figura 14A): pré-tratamento

com ondasentrona [F(1, 23) = 64,17,P<0,0001], tratamento com EHCRF

[F(1, 23) = 67,79, P<0,0001], interação ondasentrona X EHCRF [F(1, 23) =

255,1, P<0,0001]. O tratamento dos camundongos com ondasentrona isolada

ou combinada com o EHCRF (figura 14B) não alterou a atividade locomotora

no TCA. Pré-tratamento com ondasentrona [F(1, 25) = 16,56, P=0,0004],

tratamento com EHCRF [F(1, 25) = 3,188, P = 0,0863], interação

ondasentrona X EHCRF [F(1, 25) = 0,2100, P=0,6507].

Figura 15 - Influência da ondansetrona no efeito tipo-antidepressivo da administração

EHCRF

Te

mp

o d

e i

mo

bil

ida

de

(s

)

C o n tro le E C

0

5 0

1 0 0

1 5 0

2 0 0

S a lin a

O n d a n s e tro n a (0 ,5 m g /k g )

A

* * * * # # # #

* * *

Nú

me

ro d

e C

ruz

am

en

tos

C o n tro le E C

0

5 0

1 0 0

1 5 0B

*

Efeito do pré-tratamento dos camundongos com ondansetrona (0,5 mg/kg, i.p.), 30

min antes da administração do EHCRF no efeito anti-imobilidade no TSC (figura A)

e no número de cruzamentos no TCA (figura B). Os valores foram expressos como

média ± EPM (n=8-10). ****P<0,0001 quando comparado com o grupo controle

tratado com salina; ####P<0,0001 quando comparados com o mesmo grupo pré-

tratado com salina (ANOVA de duas vias seguida do teste de Tukey).

5.3.3 Avaliação do sistema noradrenérgico

Para a avaliação da influência do sistema noradrenérgico na

atividade tipo-antidepressiva do EHCRF, foram utilizados prazosin

(antagonista α1 adrenérgico) e ioimbina (antagonista α2 adrenérgico).

O pré-tratamento dos camundongos com prazosin (1 mg/kg, i.p.) foi

capaz de impedir o efeito tipo-antidepressivo do EHCRF (figura 15A). Pré-

tratamento com prazosin [F(1, 27) = 95,84, P<0,0001], tratamento com

81

EHCRF [F(1, 27) = 128,8, P<0,0001], interação prazosin X EHCRF [F(1, 27)

= 163,8, P<0,0001]. A administração de prazosin isolado ou combinado com

o EHCRF (figura 15B) alterou a atividade locomotora dos camundongos no

TCA, diminuindo a mesma. Pré-tratamento com prazosin [F(1, 31) = 0,6520,

P=0,4256], tratamento com EHCRF [F(1, 31) = 136,4, P<0,0001], interação

prazosin X EHCRF [F(1, 31) = 0,2857, P=0,5968].

Figura 16 - Influência de prazosin no efeito tipo-antidepressivo da administração

EHCRF

Te

mp

o d

e i

mo

bil

ida

de

(s

)

C o n tro le E C

0

5 0

1 0 0

1 5 0

S a lin a

P ra z o s in (1 m g /k g )

A* * * *

# # # #

Nú

me

ro d

e C

ruz

am

en

tos

C o n tro le E C

0

5 0

1 0 0

1 5 0

# # # #* * * *

Efeito do pré-tratamento dos camundongos com prazosin (1 mg/kg, i.p.), 30 min antes

da administração do EHCRF no efeito anti-imobilidade no TSC (figura A) e no


± EPM (n=8-10). ****P<0,0001 quando comparado com o grupo controle tratado

com salina; ####P<0,0001 quando comparados com o mesmo grupo pré-tratado com

salina (ANOVA de duas vias seguida do teste de Tukey).

O pré-tratamento dos camundongos com ioimbina (1 mg/kg, i.p.) foi

capaz de impedir o efeito tipo-antidepressivo do EHCRF (figura 16A). Pré-

tratamento com ioimbina [F(1, 26) = 296,4, P<0,0001], tratamento com

EHCRF [F(1, 26) = 6,743, P=0,0153], interação ioimbina X EHCRF [F(1,

26) = 296,4, P<0,0001]. A administração de ioimbina isolado ou

combinado com o EHCRF (figura 16B) não causou alteração da atividade

locomotora dos camundongos no TCA. Pré-tratamento com ioimbina [F(1,

30) = 0,5347, P=0,4703], tratamento com EHCRF [F(1, 30) = 1,439,

P=0,2397], interação ioimbina X EHCRF [F(1, 30) = 0,9139, P=0,3467].

82

Figura 17 - Influência de ioimbina no efeito tipo-antidepressivo da administração

EHCRF T

em

po

de

im

ob

ilid

ad

e (

s)

C o n tro le E C

0

5 0

1 0 0

1 5 0

2 0 0

S a lin a

Io im b in a (1 m g /k g )

A * * * * # # # #

* * *

Nú

me

ro d

e C

ruz

am

en

tos

C o n tro le E H C R F

0

5 0

1 0 0

1 5 0 B

Efeito do pré-tratamento dos camundongos com ioimbina (1 mg/kg, i.p.), 30 min antes

da administração do EHCRF no efeito anti-imobilidade no TSC (figura A) e no





5.3.4 Avaliação do sistema dopaminérgico

Para a avaliação da influência do sistema dopaminérgico na

atividade tipo-antidepressiva do EHCRF, foram utilizados haloperidol (0,2

mg/kg, i.p., antagonista dopaminérgico não seletivo), SCH23390 (0,05

mg/kg, i.p.; antagonista dopaminérgico D1) e pimozide (0,2 mg/kg, i.p.;

antagonista dopaminérgico D2).

O pré-tratamento dos camundongos com haloperidol (0,2 mg/kg,

i.p.) foi capaz de impedir o efeito tipo-antidepressivo do EHCRF (figura

17A). Pré-tratamento com haloperidol [F(1, 23) = 395,0, P<0,0001],

tratamento com EHCRF [F(1, 23) = 4,694, P=0,0409], interação haloperidol

X EHCRF [F(1, 23) = 66,84, P<0,0001]. A administração de haloperidol

isolado ou combinado com o EHCRF (figura 17B) não causou alteração da

atividade locomotora dos camundongos no TCA. Pré-tratamento com

haloperidol [F(1, 29) = 12,73, P=0,0013], tratamento com EHCRF [F(1, 29)

= 0,03972, P=0,8434], interação haloperidol X EHCRF [F(1, 29) = 0,03660,

P=0,8496].

83

Figura 18 - Influência de haloperidol no efeito tipo-antidepressivo da administração

EHCRF T

em

po

de

im

ob

ilid

ad

e (

s)


0

1 0 0

2 0 0

3 0 0

4 0 0

S a lin a

H a lo p e r id o l (0 ,2 m g /k g )

A

* * * *# # # #

* * * *

Nú

me

ro d

e C

ruz

am

en

tos


0

5 0

1 0 0

1 5 0 B

Efeito do pré-tratamento dos camundongos com haloperidol (0,2 mg/kg, i.p.), 30 min






O pré-tratamento dos camundongos com SCH23390 (0,05 mg/kg,

i.p.) foi capaz de impedir o efeito tipo-antidepressivo do EHCRF (figura

18A). Pré-tratamento com SCH23390 [F(1, 26) = 117,1, P<0,0001],

tratamento com EHCRF [F(1, 26) = 5,455, P=0,0275], interação SCH23390

X EHCRF [F(1, 26) = 18,33, P=0,0002]. A administração de SCH23390

isolado ou combinado com o EHCRF (figura 18B) não causou alteração da

atividade locomotora dos camundongos no TCA. Pré-tratamento com

SCH23390 [F(1, 28) = 10,36, P=0,0033], tratamento com EHCRF [F(1, 28)

= 17,70, P=0,0002], interação SCH23390 X EHCRF [F(1, 28) = 0,5172,

P=0,4780].

O pré-tratamento dos camundongos com pimozide (0,2 mg/kg, i.p.)

foi capaz de impedir o efeito tipo-antidepressivo do EHCRF (figura 19A).

Pré-tratamento com pimozide [F(1, 25) = 1,973, P=0,1724], tratamento com

EHCRF [F(1, 25) = 17,20, P=0,0003], interação pimozide X EHCRF [F(1,

25) = 77,37, P<0,0001]. A administração de pimozide isolado ou combinado

com o EHCRF (figura 19B) alterou a atividade locomotora dos camundongos

no TCA, diminuindo a mesma. Pré-tratamento com pimozide [F 1, 28) =

43,36, P<0,0001], tratamento com EHCRF [F(1, 28) = 9,848, P=0,0040],

interação prazosin X EHCRF [F(1, 28) = 4,814,P=0,0367].

84

Figura 19 - Influência de SCH23390 no efeito tipo-antidepressivo da administração

EHCRF T

em

po

de

im

ob

ilid

ad

e (

s)


0

5 0

1 0 0

1 5 0

2 0 0

S a lin a

S C H 2 3 3 9 0 (0 ,0 5 m g /k g )

A * * * # # # #

* * *

Nú

me

ro d

e C

ruz

am

en

tos


0

5 0

1 0 0

1 5 0

* * *

Efeito do pré-tratamento dos camundongos com SCH23390 (0,05 mg/kg, i.p.), 30 min



± EPM (n=8-10). ***P<0,001 quando comparado com o grupo controle tratado com

salina; ####P<0,0001 quando comparados com o mesmo grupo pré-tratado com salina


Figura 20 - Influência de pimozide no efeito tipo-antidepressivo da administração

EHCRF

Te

mp

o d

e i

mo

bil

ida

de

(s

)

C o n tro le E C

0

5 0

1 0 0

1 5 0

2 0 0

S a lin a

P im o z id e (0 ,2 m g /k g )

A

* * *

# # # #* * * *

Nú

me

ro d

e C

ruz

am

en

tos

C o n tro le E C

0

5 0

1 0 0

1 5 0

# # # #*

Efeito do pré-tratamento dos camundongos com pimozide (0,2 mg/kg, i.p.), 30 min



± EPM (n=8-10). ****P<0,001 quando comparado com o grupo controle tratado com

salina; ####P<0,0001 quando comparados com o mesmo grupo pré-tratado com salina


85

5.4 Efeito tipo-antidepressivo dos compostos isolados ácido mirsinóico A

e B em camundongos

Na figura 16 estão representados resultados da avaliação do efeito

tipo- antidepressivo de dois dos compostos majoritários presentes no

EHCRF, o AMA (5, 15 e 30 mg/kg, v.o.) e AMB (3, 10, 30 e 60 mg/kg, v.o.).

O AMA 5 mg/kg foi a menor dose capaz de promover diminuição no tempo

de imobilidade dos camundongos no TSC [F(4,32) = 72,29, P<0,0001]

(figura 20A), sem alterar a atividade locomotora, quando comparado ao

grupo controle [F(5,30) = 0,41, P=0,74] (figura 20B). No comportamento de

autolimpeza no ST, as doses de 5 e 15 mg/kg aumentaram o tempo de

autocuidado de forma significativa, semelhante ao resultado apresentado pela

imipramina (F (4, 35) = 11,90, P<0,0001) (figura 20C e 20D). A imipramina

(20 mg/kg, v.o.) usada como controle positivo, reduziu o tempo de

imobilidade no TSC e aumentou o tempo de autolimpeza no ST [F(5,35)=

105,1, P<0,0001] (figura 20A e 20D).

A dose de 3 mg/kg foi a menor dose do AMB capaz de promover

diminuição no tempo de imobilidade dos camundongos no TSC [F(5,35) =

77,86, P<0,0001] (figura 21A), sem alterar a atividade locomotora, quando

comparado ao grupo controle [F(5,35) = -1,85, P=0,98] (figura 21B). No

comportamento de autolimpeza no ST, a dose de 3 mg/kg aumentou o tempo

de autocuidado de forma significativa, semelhante ao resultado apresentado

pela imipramina [F(5, 43) = 28,41, P<0,0001) (figura 21D). A imipramina

(20 mg/kg, v.o.) usada como controle positivo, reduziu o tempo de

imobilidade no TSC [F(5,35) = 105,1, P<0,0001] e aumentou o tempo total

de autolimpeza (figura 21A e 21C).

86

Figura 21 - Efeito tipo-antidepressivo da administração de AMA em camundongos

V e íc u lo 2 0 5 1 5 3 0

0

5 0

1 0 0

1 5 0

A M A (m g /k g , v .o .)

Te

mp

o d

e i

mo

bil

ida

de

(s

)

* * * *

A

Im ip ra m in a (m g /k g , v .o .)

* * * *

* * * ** * * *

# # ## ##

T S C

Cro

ss

ing

(Nº d

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ruz

am

en

tos

) (

s)

V e íc u lo 2 0 5 1 5 3 0

0

5 0

1 0 0

1 5 0 BT C A

La

tên

cia

pa

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uto

lim

pe

za

(s

)

V e íc u lo 2 0 5 1 5 3 0

0

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0 C

*

#

* * * *

# # # #S T

Te

mp

o d

e a

uto

lim

pe

za

(s

)

V e íc u lo 2 0 5 1 5 3 0

0

5 0

1 0 0

1 5 0 D

* * * *

* * ** * *

#

S T

Efeito da administração de AMA (5, 15 e 30 mg/kg, v.o.) e imipramina (20 mg/kg,

i.p.) no tempo de imobilidade no TSC (A), no número de cruzamentos no TCA (B),

no tempo de latência (C) e tempo total de autolimpeza (D) no SP. Os valores foram

expressos como média ± EPM (n=8-10). *0,05, ***P<0,001 e ****P<0,0001 quando

comparado com o grupo controle tratado com salina; ++P<0,01, +++P<0,001 e

++++P<0,0001 quando comparado com o grupo imipramina (ANOVA de uma via

seguida do teste de Tukey).

87

Figura 22 - Efeito tipo-antidepressivo da administração de AMB em camundongos

V e íc u lo 2 0 3 1 0 3 0 6 0

0

5 0

1 0 0

1 5 0

A M B (m g /k g , v .o .)

Te

mp

o d

e i

mo

bil

ida

de

(s

)

* * * *

* *

A

Im ip ra m in a (m g /k g , v .o .)

* * * *

* * ** * * *

#

# # # #

# # # #

# # # #

T S C

Cro

ss

ing

(Nº d

e c

ruz

am

en

tos

) (

s)

V e íc u lo 2 0 3 1 0 3 0 6 0

0

5 0

1 0 0

1 5 0 BT C A

La

tên

cia

pa

ra a

uto

lim

pe

za

(s

)

V e íc u lo 2 0 3 1 0 3 0 6 0

0

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0 C

**

# # #

# # # #

ST

Te

mp

o d

e a

uto

lim

pe

za

(s

)

V e íc u lo 2 0 3 1 0 3 0 6 0

0

5 0

1 0 0

1 5 0 D

* * * *

* * * *

*

# #

# # # # # # #

ST

Efeito da administração de AMB (3, 10, 30 e 60 mg/kg, v.o.) e imipramina (20 mg/kg,

i.p.) no tempo de imobilidade no TSC (A) , no número de cruzamentos no TCA (B),

no tempo de latência (C) e tempo total de autolimpeza (D) no SP. Os valores foram

expressos como média ± EPM (n=8-10). *0,05, **P<0,01, ***P<0,001 e

****P<0,0001 quando comparado com o grupo controle tratado com salina (ANOVA

de uma via seguida do teste de Tukey).

5.5 Avaliação do tempo de duração da atividade tipo-antidepressiva do

EHCRF, AMA e AMB

Na figura 22 estão representados os resultados sobre o tempo de ação

da atividade tipo-antidepressiva do EHCRF. O tratamento com EHCRF (150

mg/kg, v.o) produziu um efeito significativo ao reduzir o tempo de

imobilidade dos animais, após 1 h [F(7,57) = 64,56, P<0,0001], 2 h [F(7,57)

= 38,84, p<0,0001] e 3 h [F(7,57) = 21,11, P<0,001] da sua administração,

quando comparado com o grupo controle tratado com veiculo (figura 22A).

O tratamento com EHCRF não produziu qualquer alteração no número de

cruzamentos durante as 4 horas após a administração, indicando que não

ocorre perturbação locomotora [F(7,70) = 1,99, P=0,0676] (figura 22B). O

88

efeito tipo-antidepressivo permaneceu significativo até 3 horas, no entanto

este efeito foi abolido em 4 horas. Considerando estes dados, todos os

experimentos foram realizados usando 1 hora como intervalo de tempo para

investigar o efeito do EHCRF e seu mecanismo de ação.

O tratamento com AMA (5 mg/kg, v.o) produziu um efeito

significativo ao reduzir o tempo de imobilidade dos animais, após 1 h

[F(9,70) = 88,21, P<0,0001], 2 h [F(9,70) = 62,40, P<0,0001], 3 h [F(9,70) =

57,15, P<0,001] e 4 h [F(9,70) = 51,77, P<0,001] da sua administração,

quando comparado com o grupo controle tratado com véiculo (figura 23A),

sem causar nenhuma alteração na atividade locomotora dos camundongos

[F(11,106) = 1,496, P=0,1437] (figura 19B). O pico do efeito tipo-

antidepressivo foi observado 1 h após a administração do AMA.

O tratamento com AMB (3 mg/kg, v.o) produziu um efeito

significativo ao reduzir o tempo de imobilidade dos animais, após 1 h

[F(11,93) = 101,9, p<0,0001], 2 h [F(11,93) = 72,90, P<0,0001], 3 h

[F(70,28) = 21,11, P<0,001], 4 h [F(11,93) = 61,65, P<0,001] e 6 h [F(11,93)

= 55,01, P<0,001] da sua administração, quando comparado com o grupo

controle tratado com véiculo (figura 24A), sem causar nenhuma alteração na

atividade locomotora dos camundongos [F(11,106) = 1,496, P=0,1437]

(figura 24B). O pico do efeito tipo-antidepressivo foi observado 1 h após a

administração do AMB.

Figura 23 - Tempo de duração da atividade tipo-antidepressiva do EHCRF (150

mg/kg) em animais submetidos ao TSC

Te

mp

o d

e i

mo

bil

dia

de

(s

)

0

5 0

1 0 0

1 5 0E H C R F (1 5 0 m g /k g )

V e íc u lo

1 h 2 h

A

* * * *

* * * *

3 h 4 h

* * *

Nú

me

ro

de

Cru

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me

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s

0

5 0

1 0 0

1 5 0B

1 h 2 h 3 h 4 h

O EHCRF (150 mg/kg) foi administrado 1, 2, 3 e 4 horas antes do teste. Os resultados

foram expressos como média ± EPM (N=8-10). ***P<0,001 e ***P<0,0001 denotam

significâncias estatísticas quando comparado com o grupo controle tratado com

veículo (ANOVA de uma via seguida do teste de Tukey).

89

Figura 24 - Tempo de duração da atividade tipo-antidepressiva do AMA (5 mg/kg)

em animais submetidos ao TSC T

em

po

de

im

ob

ild

iad

e (

s)

0

5 0

1 0 0

1 5 0A M A (5 m g /k g )

V e íc u lo

1 h 2 h

A

* * * *

* * * *

3 h 4 h

* * * * * * * *

6 h

Nú

me

ro d

e C

ruz

am

en

tos

0

5 0

1 0 0

1 5 0B

1 h 2 h 3 h 4 h

O AMA (5 mg/kg) foi administrado 1, 2, 3 e 4 horas antes do teste. Os resultados

foram expressos como média, seguido dos EPMs (N=8-10). ***P<0,001 e

****P<0,0001 denotam significâncias estatísticas quando comparado com o grupo

controle tratado com veículo (ANOVA de uma via seguida do teste de Tukey).

Figura 25 - Tempo de duração da atividade tipo-antidepressiva do AMB (3 mg/kg)

em animais submetidos ao TSC

Te

mp

o d

e i

mo

bil

dia

de

(s

)

0

5 0

1 0 0

1 5 0A M B (3 m g /k g )

V e íc u lo

1 h 2 h

A

* * * ** * * *

3 h 4 h

* * * ** * * *

6 h

* * * *

8 h

Nú

me

ro d

e C

ruz

am

en

tos

0

5 0

1 0 0

1 5 0B

1 h 2 h 3 h 4 h 8 h6 h

O AMB (3 mg/kg) foi administrado 1, 2, 3, 4, 6 e 8 horas antes do teste. Os resultados

foram expressos como média ± EPM (N=8-10). ***P<0,001 e ****P<0,0001

denotam significâncias estatísticas quando comparado com o grupo controle tratado

com veículo (ANOVA de uma via seguida do teste de Tukey).

5.6 Avaliação do comportamento tipo-depressivo e medidas dos

parâmetros de estresse oxidativo em ratos diabéticos induzido pro

estreptozotocina

90

Por meio da monitorização clínica dos animais diabéticos, pode-se

observar que eles apresentaram glicosúria, polidipsia e poliúria. O pelo

tornou-se menos brilhoso e mais amarelo. O peso corpóreo de animais

diabéticos tratados por via oral, uma vez ao dia, com veículo, imipramina

(IMI) (20 mg/kg, v.o.), EHCRF (150 mg/kg, v.o.), AMA (5 mg/kg, v.o.) ou

AMB (3 mg/kg, v.o.) foi 27,7%, 29,19%, 28,61%, 28,71% e 25,06% menor,

respectivamente, quando comparado ao peso corpóreo de animais

normoglicêmicos tratados com veículo (202,71 g ± 14,83). Como esperado,

animais diabéticos tratados diariamente com insulina (INS) (6 UI /dia, s.c.)

não apresentaram perda significativa de peso (7,44%) quando comparados

aos animais normoglicêmicos tratados com veículo. Também foi aferida a

glicemia em jejum (6 horas) e hemoglobina glicada. Os valores são

encontrados na tabela 1.

Como pode ser visto na figura 25A, ANOVA de uma via mostrou

diferença significativa [F(6,45) = 11,55; P<0,0001] no tempo de imobilidade

dos animais. O teste de Tukey demonstrou que os animais diabéticos

apresentaram um aumento do tempo de imobilidade quando comparados com

os animais normoglicêmicos (P<0,05). O tratamento com INS, IMI ou

EHCRF diminuiram o tempo de imobilidade em quando comparados ao

grupo de animais hiperglicêmicos tratados com veículo (P<0,01, P<0,01 e

P<0,05, respectivamente). O tratamento com AMB foi capaz de diminuir o

tempo de imobilidade de forma bastante significativa (P<0,0001).

Do mesmo modo, análises pós-hoc demonstraram que os ratos

hiperglicêmicos apresentaram menor latência de primeira imobilidade

quando comparados com NOR (P<0,05) (figura 25B). O tratamento IMI e

INS alteraram o tempo de latência para a primeira imobilidade de animais

hiperglicêmicos [F(6,42) = 4,603, P<0,001]. Os tratamentos com EHCRF,

AMA e AMB também foram capazes de aumentar o tempo de latência para

a primeira imobilidade em animais hiperglicêmicos P<0,01, P<0,05 e P<0,01,

respectivamente.

91

Tabela 1 - Efeito da administração prolongada com INS, IMI, EHCRF, AMA ou

AMB no peso corporal, glicemia em jejum e hemoglobina glicada em ratas diabéticas

Grupo Peso (g) Glicemia

(mg/dL)

Hemoglobina

glicada (%)

Normoglicêmico 202,71 ±

14,83

118 ± 7,91 4,1 ± 0,13

Diabético + VEI 146,54 ±

18,63**

473 ±

39,35****

9,0 ± 0,22****

Diabético + INS 187,61 ±

8,50

92 ± 15,07 5,4 ± 0,30**** ####

Diabético + IMI 143,53 ±

9,44**

519 ±

32,70****

8,4 ± 0,12**** #

Diabético +

EHCRF

144,70 ±

26,40**

544 ±

31,18****

9,0 ± 0,27****

Diabético + AMA 144,51 ±

16,00**

541,5 ±

53,79****

9,2 ± 0,21****

Diabético + AMB 151,90 ±

24,05***

545 ±

59,59****

9,2 ± 0,11****

Efeito do tratamento prolongado (28 dias) com veículo, INS (6 UI/dia, s.c.), IMI (20

mg/kg, v.o.), EHCRF (150 mg/kg, v.o.), AMA (5 mg/kg, v.o.) ou AMB (3 mg/kg,

v.o.) no peso (g), glicemia (mg/dL) e porcentagem de hemoglobina glicada em

animais normoglicêmicos e diabéticos. Os valores foram expressos como média ±

EPM (n=5). ****P<0,0001 quando comparado com o grupo normoglicêmico;

#P<0,05 e ####P<0,0001 quando comparado o grupo hiperglicêmico tratado com

veículo com demais grupos hiperglicêmicos (ANOVA de uma via seguida do teste de

Tukey).

Em relação ao número de cruzamentos (figura 25C) e levantadas

avaliados (figura 25D) no TCA, os animais diabéticos apresentaram uma

diminuição em ambos os parâmetros quando comparados com os animais

normoglicêmicos ([F (6,41) = 6,373, P<0,0001] e [F (6,44) = 6,479,

P<0,0001], respectivamente) assim como animais tratados com IMI (P<0,05

e P<0,001, respectivamente). Os tratamentos com INS e AMB foram capazes

de impedir a diminuição do número de cruzamentos em ratos diabéticos

(P<0,01 e P<0,0001, respectivamente).

92

Figura 26 - Efeito da administração de INS, IMI, EHCRF, AMA e AMB na latência

e tempo de imobilidade no TNF e número de cruzamentos e levantadas no TCA em

animais normo e hiperglicêmicos

N O R V E I IN S IM I E H C R F A M A A M B

0

5 0

1 0 0

1 5 0

2 0 0

2 5 0

Te

mp

o d

e i

mo

bil

ida

de

(s

)

A

S T Z (7 5 m g /k g , v .o .)

* *

* *

* * * *

#

*

# #

+

TNF

La

tên

cia

pa

ra i

mo

bil

ida

de

(s

)


0

2 0

4 0

6 0B

S T Z (7 5 m g /k g , v .o .)

* *

* ** *

* *

TNF

Cro

ss

ing

(Nº d

e c

ruz

am

en

tos

)


0

2 0

4 0

6 0

8 0C

S T Z (7 5 m g /k g , v .o .)

#

#

** *

+

T C AR

ea

rin

g

(Nº

de

le

va

nta

da

s)


0

1 0

2 0

3 0

S T Z (7 5 m g /k g , v .o .)

# #

# # #

*

D

T C A



v.o.) na latência para imobilidade (A), tempo total de imobilidade (s) (B), crossing

(C) e rearing (D) em animais normoglicêmicos e diabéticos. Os valores foram

expressos como média ± EPM (n=6-9). #P<0,05, ##P<0,01 ###P<0,001 quando

comparado o grupo normoglicêmico com demais grupos diabéticos; *P<0,05,

**P<0,01 e ****P<0,0001 quando comparado com o grupo diabético tratado com

veículo; +P<0,05 quando comparado com o grupo diabético tratado com imipramina

(ANOVA de uma via seguida do teste de Tukey).

5.6.1 Quantificação dos níveis de GSH

O efeito da administração prolongada de INS, IMI, EHCRF, AMA

e AMB nos níveis de GSH no hipocampo e córtex é demonstrado na figura

26 (A e B, respectivamente). A ANOVA de uma via revelou um efeito

significativo do fator de tratamento [hipocampo: F(6,40) = 11,17, P<0,0001;

córtex: F(6,40) = 0,2661, P=0,9495]. O teste post-hoc de Tukey mostrou que

93

os animais diabéticos exibiram uma redução dos níveis de GSH no

hipocampo mas não no córtex, quando comparados com animais NOR

(P<0,0001). O tratamento com INS impediu a redução dos níveis de GSH no

hipocampo de animais diabéticos (P<0,0001), assim como o tratamento

prolongado com IMI (P<0,05). Dentre os tratamentos com EHCRF, AMA e

AMB, apenas AMB foi capaz de impedir a redução dos níveis de GSH no

hipocampo (P<0,05), quando comparados à animais diabéticos tratados com

veículo.

Figura 27 - Efeito da administração prolongada de INS, IMI, EHCRF, AMA e AMB

nos níveis de GSH no hipocampo e córtex de ratos diabéticos induzido por

estreptozotocina

H ip o c a m p o

GS

H (

g/m

g d

e t

ec

ido

)

N O R V E I IN IM I E H C R F A M A A M B

0

2 0

4 0

6 0

8 0

# # #

* *

* * * *

A

S T Z (7 5 m g /k g , v .o .)

C ó rte x

GS

H (

g/m

g d

e t

ec

ido

)

N O R V E I IN IM I E H C R F A M A A M B

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

B

S T Z (7 5 m g /k g , v .o .)



v.o.) nos níveis de GSH (μg/mg de tecido) no hipocampo (A) e córtex (B) de animais

normoglicêmicos e diabéticos. Os valores foram expressos como média ± EPM (n=6-

9). ###P<0,001 quando comparado o grupo normoglicêmico com demais grupos

diabéticos; *P<0,05 e ****P<0,0001 quando comparado com o grupo diabético

tratado com veículo (ANOVA de uma via seguida do teste de Tukey).

5.6.2 Quantificação nos níveis de LOOH


e AMB no teor de LOOH no hipocampo e córtex é demonstrado na figura 29

(A e B, respectivamente). A ANOVA de uma via revelou um efeito

significativo do fator de tratamento [hipocampo: F(6,37) = 13,0 P<0,0001;

córtex: F(6,36) = 7,915; P<0,0001]. O teste post-hoc de Tukey mostrou que

os animais diabéticos exibiram aumento dos níveis de LOOH tanto no

94

hipocampo quanto no córtex, quando comparados com animais NOR

(P<0,0001 e P<0,05, respectivamente). O tratamento com INS diminuiu os

níveis de LOOH no hipocampo e córtex de animais diabéticos (P<0,001),

assim como o tratamento prolongado com IMI (P<0,01 e P<0,001,

respectivamente). O tratamento com EHCRF, AMA e AMB também foram

capazes de diminuir os níveis de LOOH no hipocampo e córtex de forma

similar (P<0,01, P<0,05 e P<0,0001 respectivamente).

Figura 28 - Efeito da administração de INS, IMI, EHCRF, AMA e AMB no teor de

LOOH no hipocampo e córtex de ratos diabéticos induzido por estreptozotocina

LO

OH

(

mo

l/m

g d

e t

ec

ido

)


0

1

2

3

4H ip o c a m p o

# # # #

* *

* * * ** ** *

S T Z (7 5 m g /k g , v .o .)

* *

A

C ó rte x

LO

OH

(

mo

l/m

g d

e t

ec

ido

)


0

1

2

3

4

5

S T Z (7 5 m g /k g , v .o .)

# #

* * * * ** * *

**

B



v.o.) nos níveis de LOOH (mmol/mg de tecido) no hipocampo (A) e córtex (B) de


EPM (n=6-9). ; #P<0,05, ###P<0,001 quando comparado o grupo normoglicêmico

com demais grupos diabéticos; *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 e ****P<0,0001

quando comparado com o grupo diabético tratado com veículo (ANOVA de uma via

seguida do teste de Tukey).

5.6.3 Quantificação da atividade da enzima SOD


e AMB na quantificação da atividade da enzima SOD no hipocampo e córtex

é demonstrado na figura 27 (A e B, respectivamente). A ANOVA uma via

revelou um efeito significativo do fator de tratamento [hipocampo: F(6,29) =

5,126, P<0,001; córtex: F(6,29) = 6,667, P<0,001]. O teste post-hoc de Tukey

mostrou que os animais diabéticos exibiram um aumento da atividade da

enzima SOD tanto no hipocampo quanto no córtex, quando comparados com

95

animais NOR (P<0,01). O tratamento com INS diminuiu a atividade de SOD

no hipocampo de animais diabéticos (P<0,001), assim como o tratamento

prolongado com IMI (P<0,001). Todos os demais tratamentos (EHCRF,

AMA e AMB) também foram capazes de diminuir a atividade de SOD no

hipocampo de forma similar (P<0,05).

Figura 29 - Efeito da administração de INS, IMI, EHCRF, AMA e AMB na atividade

de SOD no hipocampo e córtex de ratos diabéticos induzido por estreptozotocina

H ip o c a m p o

U S

OD

/mg

pro

teín

a


0 .0 0 0

0 .0 0 1

0 .0 0 2

0 .0 0 3# #

* ** * * * *

A

S T Z (7 5 m g /k g , v .o .)

C ó rte x

U S

OD

/mg

pro

teín

a


0 .0 0 0

0 .0 0 1

0 .0 0 2

0 .0 0 3

# #

B

S T Z (7 5 m g /k g , v .o .)



v.o.) na atividade de SOD (U/mg de proteína) no hipocampo (A) e córtex (B) de


EPM (n=6-9). ##P<0,01 quando comparado o grupo normoglicêmico com demais

grupos diabéticos; *P<0,05 e **P<0,01 quando comparado com o grupo diabético

tratado com veículo (ANOVA de uma via seguida do teste de Tukey).

5.6.4 Quantificação da atividade da enzima CAT


e AMB na quantificação da atividade da enzima SOD no hipocampo e córtex

é demonstrado na figura 28 (A e B, respectivamente). A ANOVA uma via

revelou um efeito significativo do fator de tratamento [hipocampo: F(6,24) =

7,319, P<0,0001; córtex: F(6,26) = 19,13, P<0,0001]. O teste post-hoc de

Tukey mostrou que os animais diabéticos exibiram um aumento da atividade

da enzima CAT tanto no hipocampo quanto no córtex, quando comparados

com animais NOR (P<0,01 e P<0,0001, respectivamente). O tratamento com

INS diminuiu a atividade de CAT no hipocampo e córtex de animais

diabéticos (P<0,01 e P<0,0001, respectivamente), assim como o tratamento

prolongado com IMI (P<0,01 e P<0,0001, respectivamente). EHCRF e AMB

96

foram capazes de diminuir a atividade de CAT no hipocampo e córtex de

forma similar (P<0,001 e P<0,0001, respectivamente). AMA foi capaz de

diminuir a atividade de CAT apenas no córtex (P<0,01).

Figura 30 - Efeito da administração de INS, IMI, EHCRF, AMA e AMB na atividade

de CAT no hipocampo e córtex de ratos diabéticos induzido por estreptozotocina

H ip o c a m p o

m

ol/

min

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de

pro

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a


0

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0

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B

S T Z (7 5 m g /k g , v .o .)

* * * ** * * *

* * * *

* *

* * * *



v.o.) na atividade de CAT (U/mg de proteína) no hipocampo (A) e córtex (B) de


EPM (n=6-9). ##P<0,01 e ####P<0,0001 quando comparado o grupo normoglicêmico

com demais grupos diabéticos; **P<0,01, ***P<0,001 e ****P<0,0001 quando

comparado com o grupo diabético tratado com veículo (ANOVA de uma via seguida

do teste de Tukey).

97

6 DISCUSSÃO

A humanidade utiliza as plantas medicinais desde a Antiguidade,

sendo estas empregadas por diversas etnias em todo o mundo. Desta forma,

é de consenso universal que as plantas sempre desempenharam um papel

importante na vida do homem de diversas maneiras: como gênero

alimentício, no fornecimento de matéria prima para fabricação de objetos de

uso doméstico, como remédios na terapêutica de várias patologias e, também

em práticas religiosas durante as quais são utilizados seus efeitos psicodélicos

(GURIB-FAKIM, 2006). No mundo ocidental, principalmente nas últimas

décadas, observa-se o aumento no interesse pelo uso das plantas na

terapêutica de diversas patologias (CUNHA, 2005), inclusive do SNC,

principalmente para a depressão (SULAKHIYA et al., 2015; BHANGALE;

ACHARYA, 2016; PAHWA; GOEL, 2016).

Há uma grande diversidade de tratamentos farmacológicos

disponíveis para a depressão, mas o grau de sucesso de tratamento não é mais

do que 50-60% (KISS, 2008) e a maior parte deles apresentam diversos

efeitos adversos (GUADARRAMA-CRUZ et al., 2008), os quais levam ao

abandono do tratamento. Além disso, grande parte dos pacientes não

conseguem a remissão da depressão crônica (KATO; CHANG, 2013).

Portanto, existe uma necessidade de pesquisa e desenvolvimento de terapias

antidepressivas mais eficazes, principalmente provenientes de produtos

naturais (CHEN et al., 2016; GALDINO, et al., 2015).

A utilização de modelos e testes animais de depressão são

indispensável para a compreensão de mecanismos de ação da doença, assim

como para o desenvolvimento de novas alternativas terapêuticas. Neste

contexto, são utilizados testes com validade preditiva, como o TNF para ratos

e camundongos, e o TSC apenas para camundongos (PORSOLT et al., 1977;

STERU et al., 1985; NESTLER et al., 2002; MCARTHUR; BORSINI,

2006), ambos os testes são sensíveis a administração aguda de fármacos

antidepressivos (CRYAN; VALENTINO; LUCKI, 2005). Estes testes

baseiam-se na observação do animal em estado de desespero

comportamental, o qual se movimenta para tentar fugir desta situação

inescapável. Após os primeiros minutos, desenvolve uma postura imóvel, e a

diminuição deste tempo de imobilidade é indicativo do efeito tipo-

antidepressivo (PORSOLT et al., 1977; STERU et al., 1985; BOURIN et al.,

98

2005; CRYAN; MOMBEREAU; VASSOUT, 2005). Estes dois testes são

amplamente utilizados na busca por compostos com possível ação

antidepressiva por serem de fácil uso e de boa reprodutibilidade (CRYAN et

al., 2002; BOURIN et al., 2005).

No presente estudo, animais tratados com EHCRF foram

submetidos aos dois testes preditivos para substâncias antidepressivas, TSC

e TNF. No TSC, o tratamento com EHCRF (DE50 = 120,96 mg/kg) promoveu

diminuição no tempo de imobilidade dos animais de forma dose dependente,

sugerindo um efeito tipo-antidepressivo no teste já em dose aguda no TSC.

Para confirmação do efeito tipo-antidepressivo do EHCRF, os animais foram

tratados com as mesmas doses e submetidos ao TNF. Nas doses de 150 e 300

mg/kg o EHCRF diminuiu o tempo de imobilidade dos animais no TNF,

confirmando o efeito tipo-antidepressivo nos testes preditivos para depressão.

O efeito tipo-antidepressivo observado no TSC e TNF poderia ser

interpretado de forma errônea caso o EHCRF apresentasse algum efeito sobre

o sistema motor do animal, gerando um resultado falso positivo. Para

descartar essa possibilidade foi realizado o TCA, teste utilizado na

investigação de possíveis efeitos sobre a atividade motora, sendo que e o

parâmetro utilizado foi o número de cruzamentos (crossings) realizado pelos

animais (TATEM et al., 2014). A atividade locomotora avaliada no TCA não

foi alterada nos camundongos, quando comparado ao grupo controle. Assim,

pode-se afirmar que o efeito tipo-antidepressivo apresentado pela

administração de EHCRF no TSC e TNF é válido, e que não é devido a um

efeito motor do mesmo.

Além disso, é notável que o efeito tipo-antidepressivo produzido

pelo EHCRF (150 e 300 mg/kg) foi semelhante ao efeito produzido pelo

antidepressivo clássico imipramina (20 mg/kg, utilizado como controle

positivo), pois também reduziu significativamente o tempo de imobilidade

dos camundongos no TSC e TNF. Este dado reforça a afirmação que ambos

os testes que são amplamente utilizado como teste preditivo da atividade

antidepressiva, são também sensíveis à administração aguda de fármacos

antidepressivos (STERU et al., 1985).

Considerando que o TSC apresentou maior sensibilidade frente ao

TNF na redução da imobilidade dos animais, o TSC foi escolhido para a

investigação do tempo de ação farmacológica e também mecanismo de ação

tipo-antidepressivo do EHCRF.

99

Apesar da dificuldade de analisar em roedores os sintomas como

anedonia, sentimento de culpa, ideação suicida, a confirmação da condição

depressiva pode ser realizada com diferentes testes, os quais verificam

comportamentos associados à depressão (ZUEGER et al., 2005). Anedonia é

definida pela perda de interesse ou prazer em atividades que costumavam ser

prazerosas, este sintoma é passível de ser verificado no ST. Neste estudo, a

anedonia foi analisada pelo aumento da latência do animal em adquirir o

comportamento de auto-limpeza (grooming) e pela redução do tempo total de

permanência neste comportamento, em relação ao grupo controle no Splash

teste (WILLNER, 2005; YALCIN et al., 2005). Todas as doses de EHCRF

testadas (50, 100, 150 e 300 mg/kg) aumentaram o tempo total de grooming

dos camundongos, apresentando resultados similares aos dos animais

tratados com imipramina.

Após verificar o efeito tipo-antidepressivo, foi avaliado o possível

mecanismo farmacodinâmico do EHCRF, com ênfase no sistema

monoaminérgico. A hipótese monoaminérgica (SCHILDKRAUT, 1965), foi

selecionada para o estudo por ainda ser a mais aceita e também por abranger

os principais mecanismos de ação dos fármacos antidepressivos usuais, os

quais aumentam a concentração de neurotransmissões serotonérgicas,

noradrenérgicas e/ou dopaminérgica (MEYER, 2012; ISHOLA et al., 2014;

WILSON et al., 2014). Entretanto, ainda há dúvidas se o déficit de 5-HT, NA

e DA no SNC são consequência ou o próprio fator desencadeante da

depressão (MULINARI, 2012).

Diante disto, para avaliar se o EHCRF possui interferência no

sistema monoaminérgico, foi realizada a administração da reserpina (2

mg/kg) 18 horas antes da administração do EHCRF, com intuito de produzir

a depleção das monoaminas no SNC dos animais. A reserpina é um anti-

hipertensivo que depleta as reservas de monoaminas e está associado a

sintomas depressivos (GARDNER; BOLES, 2011). Ela interfere na ligação

intraneural das monoaminas, com isso as monoaminas ficam suceptíveis à

degradação pela monoaminoxidase mitocondrial (SCHILDKRAUT, 1965).

Verifica-se que com a administração de reserpina, o efeito tipo-

antidepressivo do EHCRF no TSC é revertido, ou seja, o extrato necessita

dessa via para o seu efeito. Porém, como esperado, foi observado que a

administração de reserpina afeta o sistema motor do animal

(NEISEWANDER et al., 1994; BUSANELLO et al., 2011), pois há

100

diminuição do número de cruzadas de linhas no TCA, e esse comportamento

não é revertido com a administração de EHCRF. Por tanto, pode se tratar de

um resultado falso negativo, pela reserpina ser um fármaco psicodepressor.

Desde o surgimento da teoria monoaminérgica, o sistema

serotonérgico é considerado um dos principais alvos para o tratamento da

depressão (DUMAN et al., 2014), sendo este o mecanismo de ação de

aproximadamente 80% dos antidepressivos disponíveis (ELHWUEGI, 2004;

DALE; BANG-ANDERSEN; SÁNCHEZ, 2015). Este sistema inclui a 5-HT

e ácido 5-hidroxiindoleacético (5-HIAA), que influenciam fortemente as

emoções humanas (ANDREWS et al., 2015). O aumento da

neurotransmissão serotonérgica pode neutralizar a alteração cognitiva,

incluindo a memória e o aprendizado, considerados características centrais da

depressão (BAUNE et al., 2010). Desta maneira, hipotetizamos que o efeito

tipo-antidepressivo do EHCRF poderia ser mediado, pelo menos em parte,

por uma ativação do sistema serotoninérgico, sendo essa hipótese investigada

pelo pré-tratamento com PCPA, NAN-190, quetanserina e ondansetrona.

Primeiramente os animais foram tratados durante 4 dias

consecutivos com PCPA (100 mg/kg), um inibidor da enzima triptofano

hidroxilase, responsável pela biossíntese de 5-HT (TAYLOR et al., 2005),

para verificar a possível atuação do EHCRF neste sistema. O tratamento com

PCPA causa diminuição de cerca de 93% dos níveis corticais disponíveis de

5-HT (BINEY et al., 2016), sem produzir alterações nos níveis de DA e NA

(RODRIGUES et al., 2002, GOLÇAVES et al., 2012). Os resultados obtidos

sugerem que o efeito tipo-antidepressivo do EHCRF é dependente da

neurotransmissão serotonérgica, isto é, a reversão do efeito anti-imobilidade

do EHCRF pelo PCPA pode ser decorrente da indisponibilidade e/ou

insuficiência sináptica de 5-HT. Estes dados estão em concordância com

estudos que relatam que o PCPA tem a capacidade de impedir a ação de

antidepressivos como os ISRS (AN et al., 2008; DUARTE et al., 2008;

MACHADO et al., 2009). PCPA sozinho ou coadministrado com EHCRF

não alterou a atividade exploratória dos animais no TCA, excluindo um

possível resultado falso-positivo.

Possíveis distúrbios nos receptores serotonérgicos também estão

relacionados com os processos depressivos (LIN et al., 2016), por tanto, no

presente estudo, a influência dos receptores 5-HT no mecanismo de ação tipo-

101

antidepressivo do EHCRF foi investigada pela administração de antagonistas

seletivos 5-HT1A (NAN-190), 5-HT2A (quetanserina) e 5-HT3 (ondansetrona).

Observou-se que NAN-190, um antagonista do receptor 5- HT1A

reverteu o efeito anti-imobilidade do EHCRF no TSC. Vários autores

estudam o envolvimento de 5-HT1A no efeito antidepressivo, utilizando o

bloqueio desse receptor por NAN-190 como ferramenta farmacológica

(FAJEMIROYE et al., 2014a; FAJEMIROYE et al., 2014b; CARDOSO et

al., 2015; YINGCONG et al., 2015). Além disso, sabe-se que alterações

anormais do sistema serotonérgico em pacientes depressivos são observadas,

incluindo a diminuição de metabólitos de 5-HT e diminuição dos receptores

5-HT1A (JANS et al., 2007). Os antidepressivos da classe ISRS são

conhecidos não só por inibir a recaptação da 5-HT como também atuam como

agonistas indiretos dos receptores pós-sináptico 5-HT1A (DAVID;

GARDIER, 2016). No TCA esses tratamentos não produziram alterações

comportamentais que os permitissem diferenciar do controle, descartando a

possibilidade da reversão de efeito ser devido a um comprometimento motor.

Para a avaliação da participação de receptores 5-HT2A no

mecanismo de ação do EHCRF, animais foram tratados com quetanserina,

um antagonista deste receptor. Observou-se que a quetanserina foi capaz de

impedir o efeito anti-imobilidade do EHCRF no TSC, sugerindo a

participação desse receptor no mecanismo de ação do extrato. O tratamento

com quetanserina e quetanserina/EHCRF alterou de forma pouco

significativa o sistema motor dos animais, porém não apresentou influência

sobre a mobilidade dos animais no TSC. Receptores 5-HT2A desempenham

um papel importante no sistema límbico, sendo relevantes para o tratamento

da depressão, sendo que alguns antidepressivos, tais como a trazodona,

nefazodona e mirtazapina, são antagonistas do receptor 5-HT2A

(DESMYTER et al., 2011; ARTIGAS, 2013; AZNAR; KLEIN, 2013).

Quetanserina é reportada para a prevenção do efeito tipo-antidepressivo de

compostos antidepressivos no TSC (BINFARÉ et al., 2009). Ela possui maior

afinidade pelo receptor do subtipo 5-HT2A do que 5-HT2C (GLENNON et al.,

2002). Por tanto, sugere-se que o efeito tipo-antidepressivo do EHCRF no

TSC também é mediado pela interação com o receptor 5-HT2A, embora a

participação do 5-HT2C não seja excluída.

Finalizando o estudo do envolvimento da via serotoninérgica,

animais foram tratados com ondansetrona, um antagonista dos receptores 5-

102

HT3. O pré-tratamento com o ondansetrona foi capaz de impedir o efeito tipo-

antidepressivo do EHCRF, sugerindo a participação desse receptor no

mecanismo de ação, sem provocar alterações na atividade motora dos animais

submetidos ao TCA. Estudos relacionando a depressão com receptores 5-HT3

são escassos, mas sabe-se que o antagonismo destes receptores aumenta a

liberação de monoaminas, o qual é um mecanismo importante para o

tratamento da depressão (KURHE; MAHESH, 2015). Além disso,

antagonistas 5-HT3 (vortioxetina, por exemplo) (KOHLER et al., 2016)

associados com ISRS, melhoram o quadro depressivo de pacientes que

utilizavam ISRS isolados e não apresentavam melhora (SUMAYA;

BAILEY; CATLETT, 2016).

Autores têm revelado a participação dos receptores serotonérgicos

no mecanismo de ação dos fármacos antidepressivos, sobretudo dos

tricíclicos e dos ISRSs (JESSE; WILHELM; NOGUEIRA, 2010;

SUGIMOTO et al., 2010; ULAK et al., 2010). No presente estudo, o efeito

anti-imobilidade do EHCRF foi revertido quando os camundongos foram

pré-tratados com PCPA (p-clorofenilalanina, inibidor da enzima triptofano

hidroxilase), NAN-190, (antagonista seletivo de receptores serotonérgicos 5-

HT1A), quetanserina (antagonista do receptor serotonérgico 5-HT2A) e

ondansetrona (antagonista do receptor serotonérgico 5-HT3), confirmando o

possível envolvimento do sistema serotoninérgico no efeito tipo-

antidepressivo.

Estudos revelam que a estimulação de receptores serotonérgicos

ativa a função do sistema noradrenérgico, e vice-versa, confirmando a relação

entre serotonina e noradrenalina na depressão (KRISHNAN; NESTLER,

2008). Diversos estudos experimentais e clínicos também demonstram o

papel fundamental do sistema noradrenérgico na etiologia da depressão

(ELHWUEGI, 2004; HAMON; BLIER, 2013). Alguns antidepressivos,

dentre eles mazindol, reboxetina e mirtazapina, atuam aumentando da

disponibilidade sináptica de NA (NIKIFORUK; GOLEMBIOWSKA;

POPIK, 2010), reforçando o envolvimento do sistema noradrenérgico na

fisiopatologia da doença.

Por tanto, também foi avaliado o envolvimento do sistema

noradrenérgico no modo de ação de ECHRF. O papel dos receptores α1 e α2-

adrenérgicos na ação de compostos antidepressivos já está estabelecido

(CAPRA et al., 2010). Os receptores cerebrais α1-adrenoceptores vem sendo

103

relacionados a um fator chave que influencia positivamente a atividade

comportamental (STONE et al., 2004). O efeito tipo-antidepressivo do

EHCRF foi revertido pelo pré-tratamento com prazosin no TSC, sem causar

qualquer alteração na locomoção dos animais no TCA.

Os receptores α2-adrenérgico também são de grande importância

para o cérebro. Acredita-se que os heterorreceptores adrenérgicos α2

inibitórios controlam a liberação de 5-HT a partir de terminações nervosas

serotonérgica, enquanto que os autorreceptores adrenérgicos α2 controlam a

liberação de noradrenalina na terminação nervosa (ELHWUEGI, 2004).

Vários estudos fornecem evidências do envolvimento dos receptores α2

adrenérgicos no transtorno depressivo maior e em casos de suicídio. Estes

receptores α2 adrenérgicos se encontram aumentados no cérebro e nas

plaquetas de indivíduos deprimidos ou em condições de estresse crônico

(PANDEY; DWIVEDI, 2007), e constituem um importante alvo para os

efeitos antidepressivos de fármacos (BALDESSARINI, 2012). O efeito tipo-

antidepressivo do EHCRF foi revertido pelo pré-tratamento com ioimbina no

TSC, sugerindo que o receptor α2-adrenérgico pós-sináptico está envolvido

com a ação do EHCRF.

O estudo sugere que o efeito tipo-antidepressivo do EHCRF

depende, pelo menos parcialmente, da ativação de receptores α1 e α2

adrenérgicos, uma vez que o pré-tratamento dos camundongos com

antagonistas de ambos receptores reverteu de forma significativa o efeito

tipo-antidepressivo promovido pelo EHCRF. Sabe-se que antidepressivos

que alteram a transmissão noradrenérgica, tais como ISRN ou iMAO, são

largamente usados na terapêutica dos distúrbios de humor por aumentarem

os níveis de noradrenalina extracelular (PÁEZ-PEREDA, 2005).

Assim como a 5-HT e a NA, a DA exibe um papel fisiológico muito

importante também na fisiopatologia da depressão. Estudos em pacientes

depressivos, incluindo pós-morte, demonstraram redução da concentração de

metabólitos de DA no fluido cerebroespinal e em regiões cerebrais que

mediam o humor e motivação. Esses estudos sustentam a hipótese que a

depressão está também associada a redução da neurotransmissão de DA,

possivelmente por uma compensação regulatória de receptor D2 (DUNLOP;

NEMEROFF, 2007). Além disso, distúrbios na neurotransmissão da DA

parecem estar relacionados com processos depressivos (GRACE, 2016). Por

tanto, o sistema dopaminérgico também é um alvo importante implicado na

104

regulação da depressão (KLIMEK et al., 2002). Também é notado o

envolvimento do sistema dopaminérgico em pacientes depressivos, incluindo

a tirosina hidroxilase (TH), receptor D2 de dopamina e transportador de

dopamina (DAT) (CHEN et al., 2015; IKEMOTO; YANG; TAN, 2015),

além disso, a neurotransmissão dopaminérgica na região mesolímbica pode

viabilizar o aparecimento dos sintomas da depressão e de outros transtornos,

como aqueles relacionados com o abuso de substâncias ilícitas

(SALAMONE; CORREA, 2012). Os sintomas depressivos mais

relacionados com a DA são a anedonia e a perda de motivação, os quais

envolvem a redução da sinalização dopaminérgica, principalmente na via

dopaminérgica mesolímbica (PANDIT et al., 2016).

Diante da importância do sistema dopaminérgico na depressão, este

também foi investigado no presente estudo. Os resultados obtidos revelaram

que o haloperidol (antagonista dopaminérgico não seletivo) foi capaz de

impedir o efeito tipo-antidepressivo do EHCRF no TSC. Da mesma forma, o

SCH23390 (antagonista seletivo de receptores dopaminérgicos D1) e também

o pré-tratamento com pimozide (antagonista de receptores dopaminérgicos

D2), não foram capazes de impedir o efeito anti-imobilidade do EHCRF no

TSC. Em todos os animais tratados e submetidos ao TCA não foram

observadas alterações na movimentação espontânea dos animais, descartando

a possibilidade dessas reversões de efeito serem acompanhadas de

comprometimento motor.

O SCH23390 foi capaz de impedir o efeito antidepressivo em

camundongos de diversos compostos, dentre eles antidepressivos como os

iMAO, ADT e ISRS (RENARD et al., 2001; BINFARE et al., 2010; MELO,

2011; CUNHA et al., 2012).

Esses resultados indicam que o sistema dopaminérgico pode

modular o efeito tipo-antidepressivo do EHCRF no TSC. O antidepressivo da

classe ADT, imipramina, também tem envolvimento de receptores

dopaminérgicos D1 e D2 no mecanismo de ação no TSC (HIRANO et al.,

2007).

Os resultados apresentados no presente estudo sugerem que o efeito

tipo-antidepressivo do EHCRF no TSC envolve a participação dos sistemas

serotonérgico, noradrenérgico e dopaminérgico. Este efeito apresentado pelo

EHCRF é semelhante ao da venlafaxina, a qual é supostamente de ação mais

rápida em comparação aos outros antidepressivos e de melhor eficácia em

105

pacientes resistentes ao tratamento, sendo ainda segura em superdosagem.

Outro exemplo é a mirtazapina, cuja ação antidepressiva se dá pelo bloqueio

de receptores α2-adrenérgicos, aumentando a liberação tanto de NA quanto

de 5-HT (O´DONNELL; SHELTON, 2011).

Os dados apresentados no estudo também são consistentes com a

hipótese de que os sistemas serotonérgico, noradrenérgico e dopaminérgico

contribuem para a eficácia da terapia antidepressiva (HAMON; BLIER,

2013). Uma estratégia bastante promissora no desenvolvimento de novos

fármacos antidepressivos é a utilização de inibidores triplos de recaptação de

monoaminas, ou seja, substancias que inibem a recaptação de 5-HT, NA e

DA. Um estudo sugere que estas terapias são mais eficazes e que necessitam

de menos tempo de tratamento para produzir efeito terapêutico e a melhora

do humor, quando comparados aos antidepressivos inibidores seletivos ou de

recaptação de apenas duas monoaminas (LIANG et al., 2008). Neste sentido,

o EHCRF pode ser considerado como um agente promissor para atividade

antidepressiva, principalmente devido ao grande interesse na busca por uma

resposta mais rápida ao tratamento, remissão dos sintomas e melhora da

qualidade de vida dos pacientes depressivos, uma vez que parece exercer

efeito tipo-antidepressivo dependente da modulação dos sistemas

serotonérgico, noradrenérgico e dopaminérgico.

É importante ressaltar que o efeito apresentado pelo EHCRF pode

estar relacionado com a presença de outros compostos presentes, além de

AMA e AMB. Akinyele e colaboradores (2017) confirmam que o efeito

sinérgico entre os compostos presentes na complexa composição de extratos

pode ser fundamental para a atividade do mesmo, ou ainda, mehorar esta

atividade quando comparada aos compostos isolados.

Com relação a princípios ativos responsáveis pelo efeito tipo-

antidepressivo do EHCRF, foram isolados e identificados os compostos

majoritários AMA e AMB (DONG et al., 1999; HIROTA et al., 2002; ITO;

NARISE; SHIMURA, 2008; MAKABE et al., 2003), ambos foram testados

no TSC, em doses já utilizadas em testes anteriores (COSTA, 2011). Ambos

os compostos foram administrados em camundongos submetidos ao TSC. O

AMA promoveu diminuição no tempo de imobilidade dos animais em todas

as doses testadas (5, 15 e 30 mg/kg), sugerindo apresentar um efeito tipo-

antidepressivo bastante significativo. Destaca-se a dose de 5 mg/kg como a

menor dose efetiva. Com relação a anedonia observada no ST, as doses de 5

106

e 15 mg/kg aumentaram o tempo total de autolimpeza. O AMB também

promoveu diminuição no tempo de imobilidade dos animais em todas as

doses testadas (3, 10, 30 e 60 mg/kg), sendo 3 mg/kg a dose de menor

concentração efetiva. Entre animais tratados e submetidos ao ST, o grupo que

recebeu a dose de 3mg/kg apresentou tempo de autolimpeza superior ao

grupo tratado com imipramina, resultado bastante promissor, pois sabe-se

que a anedonia é o principal sintoma apresentado por pacientes depressivos.

Em todos os animais tratados e submetidos ao TCA não foram observadas

qualquer alterações na movimentação espontânea dos animais, descartando a

possibilidade do efeito anti-imobilidade ser devido comprometimento motor.

Estes resultados obtidos com administração dos compostos AMA e

AMB são bastante promissores, pois são exclusivos na literatura. Não

existem estudos de atividade antidepressiva com a espécie R. ferruginea tão

pouco com seus compostos majoritários. Estudos com AMA e AMB no que

tange patologias do SNC são bastante escassos. Antonialli (2012) evidenciou

que o AMB possui propriedade antinociceptiva em testes de nocicepção

aguda, efeito anti-hipernociceptivo marcante em modelos animais de dor

persistente de origem inflamatória e neuropática em camundongos,

antinociceptivo em modelo de dor neuropática diabética (GALVAN, 2007),

além de resposta hipernociceptiva induzida pela carragenina em

camundongos, apresentando um excelente potencial para tratar a dor

persistente em seres humanos, sem quaisquer efeitos secundários

significativos (TESTONI, 2004; HESS et al., 2010). Ainda no que tange o

SNC, AMA e AMB apresentaram atividade anticolinesterásica in vitro

(FILLIPIN, 2010; GAZONI, 2009). Além disso, AMA facilitou a ação sobre

as fases de memória (aquisição, consolidação e evocação) em camundongos

normais e também com doença de Alzheimer induzida por estreptozotocina

(COSTA, 2011).

Outro parâmetro importante na investigação de uma substância com

atividade farmacológica, é determinar seu tempo de ação. Para tanto, foi

determinado o tempo de duração da ação farmacológica do EHCRF, AMA e

AMB. É amplamente utilizado para determinação do tempo em que a

substância atinge o seu melhor desempenho, além de observar a duração em

horas do seu efeito. Observa-se que o EHCRF atinge seu melhor desempenho

de atividade tipo-antidepressiva após 1 hora da administração, e exerce efeito

por até 3 horas. Já o AMA e AMB, 5 e 3 mg/kg, respectivamente, também

107

apresentaram melhor desempenho da atividade tipo-antidepressiva após 1

hora de administração, e AMA apresentou tempo de duração de 4 horas,

enquanto AMB teve duração de 6 horas. Porém, esses dados apresentados em

camundongos não podem ser estrapolados para humanos por se tratar de

organismos e metabolismos diferentes. A investigação do tempo de duração

de ação de substâncias em animais é essencial para determinar as

administrações diárias do fármaco, mas esses valores devem ser confirmados

através de outras metodologias. Quanto maior o tempo de duração de ação do

fármaco, menor a probabilidade de várias administrações diárias, e maior a

adesão ao tratamento pelo paciente. O fitoterápico com extrato de Hipericum

perforatum, por exemplo, apresenta um tempo de duração de ação

farmacológica de 8 horas, por tanto, tem indicação clínica de 3

administrações diárias (SARRIS et al., 2012).

Após verificar que o EHCRF e seus compostos majoritários AMA e

AMB apresentam atividade tipo-antidepressiva bastante significativa, fez-se

necessário aprofundar a investigação desta atividade utilizando um modelo

que de fato causasse o comportamento depressivo nos animais. Por meio de

modelos animais, e não apenas testes preditivos, é possível verificar se o

EHCRF, AMA e AMB são ativos para a doença.

Já está bem estabelecida a relação entre TDM e DM, uma vez que a

prevalência da depressão em pacientes diabéticos é muito maior que a

população em geral (BOUWMAN et al. 2010), e é evidente que tanto DM1

quanto DM2 causam danos ao SNC (ARTOLA, 2008). Modelos

experimentais de diabetes, assim como o modelo de diabetes induzida por

STZ, seguido do teste comportamental de depressão (TNF/TSC), podem ser

úteis em estudos que corelacionam a fisiopatologia da DM com a TDM e suas

complicações (WAYHS et al., 2013).

O modelo de diabetes induzido por STZ causa toxicidade nas células

β-pancreáticas e o aparecimento dos sinais da doença se dá 2 a 4 dias após a

administração i.p. de STZ (SATHISHSEKAR; SUBRAMANIAN, 2005;

HAIDER et al., 2013). Estes sinais da doença são verificados a partir do

aumento dos níveis de glicose plasmática, redução do ganho de peso corporal

e aumento do percentual de hemoglobina glicada (HbA1). Além disso, os

níveis os insulina diminuem rapidamente após indução de DM com STZ,

favorecendo o acumulo de glicose no espaço extracelular. Essas alterações

tem um impacto direto sobre o SNC, causando alterações

108

neurocomportamentais, disfunções autonômicas, alterações neuroendócrinas

e alterações neurotransmissoras (BARBER et al., 2003).

A dose de STZ utilizada para a indução de DM1 no presente estudo

foi de 75 mg/kg, pois o uso de altas doses de STZ (por exemplo, 100 mg/kg

para ratos) pode promover a uma destruição completa das células β

pancreáticas, o que muitas vezes está associado ao óbito dos animais.

Enquanto doses mais baixas não causam a toxicidade das células β

pancreáticas nos animais (RODRIGUES et al., 1999).

O TNF é baseado na observação dos ratos, quando forçados a nadar

em um espaço restrito por um determinado tempo, os quais eventualmente

deixam de lutar para fugir da situação. Essa condição de desespero

comportamental é considerada um efeito depressivo, e é utilizado como teste

preditivo para descoberta de novos fármacos antidepressivos (PORSOLT et

al., 1978). Ratos e camundongos reagem de forma diferente ao TNF de

Porsolt e por isso seus protocolos também devem ter diferenças (BORSINI,

1995). O teste de Porsolt em camundongos não requer o pré-teste de 15

minutos (DAVID et al, 2003) e o tempo de duração do teste é de 6 minutos,

o que justifica a diferença entre as duas metodologias.

Estudos observaram um efeito significativo no comportamento

relacionado à depressão no 28º dia após a indução do diabetes por STZ

(GOMEZ; BARROS, 2000; CALETTI et al., 2012), por tanto, os

experimentos para avaliação do comportamento depressivo dos animais

foram validados 28 dias após a administração de STZ. No presente estudo,

animais diabéticos tratados com veículo apresentaram comportamento

depressivo evidente quando comparado com os animais normoglicêmicos,

dado que corrobora com os resultados já descritos na literatura (GOMEZ;

BARROS, 2000; WAYHS et al., 2010; CALETTI et al., 2012).

A latência para a início da imobilidade é o tempo decorrido entre a

introdução do animal na água até que fique completamente imóvel pela

primeira vez (CONTRERAS; MARTÍNEZ-MOTA; SAAVEDRA, 1998). Os

resultados mostram que o grupo hiperglicêmico apresenta menor tempo de

latência para imobilidade quando comparado com o grupo normoglicêmico.

Este comportamento, em junção com o tempo total de imobilidade, comprova

o comportamento depressivo dos animais diabéticos.

Estudos reportam alterações comportamentais em pacientes

diabéticos e também em animais submetidos a modelos de diabetes,

109

principalmente relacionado a estado de ansiedade e depressão (BRANDS et

al., 2005), o que pode justificar a diminuição da atividade locomotora no TCA

dos animais hiperglicêmicos quando comparado a ratos normoglicêmicos.

A fim de investigar se o pronunciamento do comportamento

depressivo pode estar relacionado ao estado hiperglicêmico dos animais, foi

investigado o efeito do tratamento prolongado com INS sobre o

comportamento depressivo e oxidativo em ratos hiperglicêmicos. Como

esperado, quando comparado ao grupo VEI, o grupo diabético tratado com

INS apresentou redução dos níveis de glicose no sangue e na percentagem de

HbA1. Além disso, a menor perda de peso, quando comparado ao grupo

NOR, foi o grupo INS, sugerindo uma melhora da saúde geral dos animais.

O tratamento com INS também preveniu o comportamento depressivo

pronunciado dos animais hiperglicêmicos. Estes resultados confirmam que o

tratamento com INS reverte a imobilidade prolongada (HILAKIVI-CLARKE

et al., 1990) e previne o dano neuronal no córtex de ratos diabéticos induzidos

por STZ (GUYOT et al., 2001). Ho e colaboradores (2012) comprovaram que

o tratamento com INS é capaz de induzir um efeito semelhante à

antidepressivos em camundongos diabéticos submetidos ao TSC e a DM1

induzida por STZ pode ser revertida pelo tratamento com INS. Grossman et

al (2010) relataram que o controle glicêmico através da administração de INS

em ratos diabéticos induzido por STZ pode promover a regeneração de

células β no pâncreas diabético. A extensão da restauração da função e da

massa das células β depende do período de tratamento e do controle do nível

glicêmico, (GROSSMAN et al., 2010) uma vez que este estado

hiperglicêmico é revertido pelo tratamento com INS, melhorando os sintomas

depressivos dos animais. Além disso, estudos mostraram que ratos diabéticos

apresentaram maior comportamento depressivo quando submetidos ao TNF

(GOMEZ; BARROS, 2000; da SILVA HAESER et al., 2007; CERETTA et

al., 2012; de MORAIS et al., 2014), e o tratamento com insulina foi capaz de

impedir esta mudança comportamental (HILAKIVI-CLARKE et al., 1990;

de MORAIS et al., 2014; WAYHS et al., 2010).

É importante destacar que os níveis de glicose e HbA1 são

complementares para avaliar o controle de DM. A HbA1 total refere-se a um

conjunto de substâncias formada pelas reações entre a hemoglobina A e

alguns açúcares. A elevação de 1% na hemoglobina glicada total corresponde

a, aproximadamente, um aumento médio de 25 a 35 mg/dL na glicemia. As

110

dosagens de glicose e hemoglobina glicada são distintas e complementares

para avaliação do controle do DM, pois os resultados de hemoglobina glicada

total refletem a glicemia média no intervalo de dois a três meses antecedentes

a coleta; sendo que os valores de HbA1 entre 4% e 6% são considerados

normais e níveis acima de 7% estão associados a um risco maior de

complicações crônicas (CAVAGNOLLI, 2011), já resultados de glicemia

refletem a avaliação da glicose no momento da coleta sanguínea (SAUDEK

et al., 2006).

Testou-se o efeito do tratamento prolongado com o antidepressivo

IMI. Corroborando com resultados de Morais e colaboradores (2013), o

tratamento com IMI induziu um comportamento tipo-antidepressivo, embora

não tenha melhorado os níveis elevados de glicose no sangue, HbA1 ou o

ganho de peso reduzido observado nos ratos diabéticos. O tratamento com

IMI diminuiu o número de cruzamentos no TCA, sugerindo uma diminuição

da atividade locomotora, porém, não afetou o desenvolvimento dos animais

no TNF.

Também foi investigado o efeito do tratamento crônico do EHCRF,

AMA ou AMB sobre o comportamento depressivo, já que ambos

apresentaram atividade tipo-antidepressiva promissora no TSC e TNF em

camundongos. Observou-se que o tratamento com AMB foi capaz de impedir

o comportamento depressivo de ratos diabéticos, tanto quando o tratamento

com IMI. Além disso, AMB não alterou o sistema locomotor dos animais no

TCA. A ausência do efeito tipo-antidepressivo do EHCRF (150 mg/kg, v.o.)

e AMA (5 mg/kg, v.o.) em animais hiperglicêmicos pode ser devido à

duração do tratamento ou a dose utilizada, que foi a menor dose efetiva a qual

apresentou efeito tipo-antidepressivo em camundongos. Os tratamentos com

EHCRF, AMA e AMB não alteraram a condição hiperglicêmica dos animais

diabéticos, o percentual de HbA1 e também não evitaram o ganho de peso

reduzido (tabela 1). Por tanto, observa-se que mesmo não revertendo o quadro

diabético causado pela administração de STZ, AMB foi capaz de impedir o

comportamento depressivo causado pela hiperglicemia em ratos.

A disfunção de células β pancreáticas na DM1 induzida por STZ

pode ser aliviada com a utilização produtos naturais, principalmente obtidos

de plantas. As plantas medicinais são a base para o rastreio de fármacos

antihiperglicemiantes utilizando modelos de animais diabéticos induzido por

STZ (WU; YAN, 2015). Além da toxicidade das células β pancreáticas

111

causada pela administração de STZ, danos oxidativos causado por

EROs/ERNs também estão implicados na destruição destas células

(LENZEN, 2008). Portanto, numerosos estudos demonstraram que os

extratos e compostos de plantas com propriedades antioxidantes podem

melhorar a disfunção da célula β pancreáticas na DM1 induzida por STZ, tais

como, proantocianidinas de semente de uva (DING et al, 2013), curcumina

(CHANPOO et al., 2010), resveratrol (KU et al., 2012) e picnogenol

(PARVEEN et al., 2013). Os mecanismos subjacentes dessas substâncias

fitoquímicas são, além da ação antioxidante, provavelmente devido às suas

habilidades para atenuar a toxicidade hiperglicêmica, diminuindo os níveis

de glicose no sangue e/ou facilitando a combustão da glicose (MARCHAND;

ARANY; HILL, 2010).

Em geral, muitas complicações do DM são causadas por exposição

a elevados níveis de glicose e os mecanismos responsáveis pela lesão tissular

induzida por hiperglicemia tem em comum uma única via, o aumento do

estresse oxidativo (VALKO et al., 2007; GIACCO; BROWNLEE, 2010;

NAUDI et al., 2012), uma vez que a hiperglicemia gera elevação de radicais

livres por auto-oxidação de glicose (BONNEFONT-ROUSSELOT et al.,

2004), além do aumento da atividade da enzima aldose redutase e a formação

dos AGEs.

Os AGEs são moléculas formadas a partir de reações

aminocarbonilo não-enzimáticas que ocorrem de forma mais acelerada no

estado hiperglicêmico do diabetes (DA SILVA, 2014). Uma vez que esses

compostos tem a capacidade de modificar irreversivelmente propriedades

químicas e funcionais de estruturas biológicas, os AGEs influenciam nas

complicações orgânicas desencadeadas pelo diabetes, tais como a retinopatia

(STITT; CURTIS, 2005), a neuropatia (JACK; WRIGHT, 2012),

complicações cardiovasculares (PIARULLI et al., 2013) e depressão maior

(CHEN et al., 2012). Sendo assim, além do estresse oxidativo, os AGEs

também são um fator primordial nos danos teciduais causados pelo diabetes

(SINGH, 2001; DA SILVA, 2014).

Como resultado da hiperglicemia também há diminuição da

eficiência das defesas antioxidantes (SADI et al., 2008), o que, por sua vez,

pode causar outras condições patológicas (YOUNG; WOODSIDE, 2001),

como a TDM. Estudos encontraram evidências de aumento do estresse

oxidativo em pacientes com TDM, sugerindo que este seja um contribuinte

112

importante para fisiopatologia da depressão (MELLON et al., 2016;

LINDQVIST et al., 2017). Tanto em pacientes depressivos quanto diabéticos,

são encontrados perfis de estresse oxidativo, com deficiência dos níveis

sanguíneos de enzimas antioxidantes e altos níveis de produtos de

peroxidação lipídica, quando comparados com controles saudáveis (OZCAN

et al., 2004; SARANDOL et al., 2007). Para tanto, foi investigado o efeito do

tratamento crônico do EHCRF e dos compostos AMA e AMB sobre os danos

oxidativos no hipocampo e córtex, não apenas para confirmar esta hipótese,

mas também para verificar se a atividade apresentada no comportamento

depressivo dos animais diabéticos está relacionada com uma melhora no

sistema antioxidante dos mesmos.

As enzimas antioxidantes CAT e SOD também apresentam suas

atividades de forma anormal em pacientes com TDM (GAŁECKI et al., 2009;

KOTAN et al., 2011; SZEBENI et al., 2014). Estas enzimas fazem parte do

sistema de defesa antioxidante enzimático e possuem papel bastante

importante. SOD é a primeira linha de defesa contra EROs e ERNs e é

responsável pela dismutação do ânion superóxido (O2•-), que é altamente

reativo e tóxico, para H2O2 (peróxido de hidrogênio), que é menos reativo e

tóxico (DELBRIN; ANTUNES; ZANESCO, 2009). A CAT catalisa reações

químicas que convertem H2O2 em água e molécula de oxigênio (figura 5).

Nesse contexto, os dados mostram que animais diabéticos apresentaram um

aumento do estresse oxidativo no hipocampo e córtex, evidenciado pelo

aumento na atividade de SOD (figura 27) e CAT (figura 28), sugerindo que

os mecanismos de defesa do organismo são ativados para minimizar o

aumento do estresse oxidativo, assim como pelo aumento dos níveis de

peroxidação lipídica (figura 29).

Além disso, observou-se uma significativa dimimuição do teor de

GSH (figura 26) no hipocampo. Os neurônios do hipocampo são

particularmente suscetíveis ao dano oxidativo devido ao alto consumo de

oxigênio, grande conteúdo facilmente oxidável de ácidos graxos

poliinsaturados e níveis antioxidantes relativamente baixos (WANG;

MICHAELIS, 2010). O estresse oxidativo no hipocampo provoca redução da

neurogênese e maior morte neuronal (MATTSON, 2000; HUANG; ZOU;

CORNIOLA, 2012). Sabe-se que o hipocampo é uma das estruturas límbicas

implicadas na depressão (WANG; MICHAELIS, 2010). Além disso, o

hipocampo tem conexões com o córtex pré-frontal, região mais diretamente

113

envolvida na emoção e cognição e, assim, contribui para outros principais

sintomas do TDM (DUMAN; MONTEGGIA, 2006; HALL et al., 2010).

O GSSG e GSH estão entre os marcadores de estresse oxidativo mais

estudados no TDM (LAPIDUS et al,. 2014; MORRIS et al., 2014). A

peroxidação lipídica leva a um funcionamento celular prejudicado, perda da

elasticidade e fluidez da membrana e morte celular (MONTUSCHI;

BARNES; ROBERTIS, 2004). O GSH, um antioxidante não-enzimático, é

oxidado por EROs/ERNs e formar GSSG (SCHULZ et al., 2000). Por tanto,

os níveis elevados de GSH são considerados como uma indicação de

capacidade antioxidante, enquanto a elevação de GSSG é um indicador de

estresse oxidativo.

A melhora no comportamento depressivo de ratos diabéticos

tratados com INS foi acompanhado de prevenção de todos os parâmetros de

estresse oxidativo testadosbo hipocampo e córtex. Esses resultados sugerem

que além de seu efeito significativo sobre o controle glicêmico, esse

tratamento também tem um papel importante no combate a atenuação do

estresse oxidativo (MOREIRA et al., 2006). Em nosso estudo, o efeito

neuroprotetor do tratamento com INS foi evidenciado pelo aumento dos

níveis de GSH e redução da atividade de SOD e CAT no hipocampo dos

animais, o que corrobora com estudos que afirmam que a INS pode exercer

papéis importantes no desenvolvimento neural e plasticidade sináptica

(BENARROCH, 2012; HUANG; LEE; HSU, 2010).

Zafir e colaboradores (2009) relatam que a utilização de fármacos

antidepressivos, como imipramina, venlafaxina e fluoxetina, há restauração

simultânea e sincronizada de antioxidantes endógenos, como nas atividades

de SOD, CAT, GST, GR e níveis de GSH, em amostras de cérebro de ratos

Swiss albinos estressados. Além disso, outro estudo mostrou que a

venlafaxina antagonizou o estresse induzido em camundongos,

demonstrando uma diminuição considerável dos níveis de GSH e na atividade

de GST no hipocampo dos animais testados, em doses que apresentaram

atividade tipo antidepressiva no TNF e TSC (ABDEL-WAHAB et al., 2011).

Esses resultados indicam a ligação entre a resposta antioxidante ao efeito

tipo-antidepressivo de fármacos (ABDEL-WAHAB et al., 2011), com isso,

intervenções clínicas com fármacos antidepressivos que possuem efeito

antioxidante podem ser consideradas eficazes, não só por aliviar os sintomas

depressivos, mas também por ser um meio de modulação do estresse

114

oxidativo (DONATO, 2013). Os resultados do presente estudo corroboram

com estas informações, pois o grupo de animais diabéticos tratado com IMI

apresentaram melhora no comportamento depressivo e nos parâmetros de

estresse oxidativo testados. IMI foi capaz de previnir a redução dos níveis de

GHS no hipocampo causados pela hiperglicemia, assim como previnir o

aumento da peroxidação lipídica no hipocampo e córtex. Em relação as

enzimas antioxidantes SOD e CAT, o tratamento prolongado com IMI

também foi capaz de previnir o aumento da atividade das duas enzimas.

O efeito na redução do comportamento depressivo induzido pelo

tratamento prolongado com EHCRF, AMA ou AMB podem ser associado a

uma redução significativa nos parâmetros de estresse oxidativo no

hipocampo e córtex. O tratamento com AMB, assim como IMI, foi capaz de

prevenir a diminuição dos níveis de GSH no hipocampo. Quanto à atividade

de SOD, os tratamentos com EHCRF, AMA e AMB foram capazes de

prevenir o aumento da atividade enzimática no hipocampo de ratos

diabéticos. Em relação à atividade da CAT, somente o tratamento com o

EHCRF e AMB foram capazes de prevenir sua atividade aumentada no

hipocampo, de forma mais significativa que INS e IMI. Já no córtex, todos

os tratamentos foram capazes de prevenir a atividade aumentada de CAT. O

tratamento prolongado com EHCRF, AMA ou AMB também foram capazes

de reduzir a peroxidação lipídica de ratos diabéticos.

Por tanto, EHCRF apresentou atividade tipo-antidepressiva em

camundongos e os sistemas serotonérgico, noradrenérgico e dopaminérgico

estão envolvidos no moco de ação do extrato. AMA e AMB, compostos

isolados de EHCRF também apresentaram atividade tipo-antidepressiva no

TSC e ST. Além disso, quando administrados separadamente em ratas

diabéticas induzido por STZ, AMB destacou-se devido a influência sobre o

comportamento depressivo destes animais. Esta atividade pode estar

relacionada ao potencial de redução de dano oxidativo no hipocampo e córtex

de animais hiperglicêmicos (Figura 31).

115

Figura 31 - Esquema representativo dos materiais e métodos utilizados

EHCRF = extrato hidroalcóolico das cascas de Rapanea ferruginea; AMA = ácido mirsinóico A; AMB = ácido mirsinóico B; CC=

coluna cromatográfica; TSC = teste de suspensão pela cauda; TNF = teste do nado forçado; TCA = teste do campo aberto; ST = splash

test; GSH = glutationa redutaze; LOOH = lipoperoxidação; CAT = catalase; SOD = superórido dismutase.

116

7 CONSIDERAÇÕES FINAIS

Este trabalho demonstrou o efeito tipo-antidepressivo da

administração aguda do EHCRF (50, 100, 150 e 300 mg/kg, v.o.) no TNF e

TSC em camundongos e efeito sobre a anedonia, observado no ST. O EHCRF

não apresentou qualquer efeito sob a atividade locomotora e exploratória no

TCA. Com relação ao tempo de duração da atividade tipo-antidepressiva no

TSC, o EHCRF apresentou-se ativo durante 3 horas. Verificou-se o

envolvimento do sistema monoaminérgico para a ação tipo-antidepressiva do

EHCRF, dentre eles sistemas serotonérgico, noradrenérgico e dopaminérgico

Foi verificado se o efeito tipo-antidepressivo do EHCRF está

relacionado aos dois compostos isolados majoritários do extrato da planta,

AMA (5, 15 e 30 mg/kg, v.o.) e AMB (3, 10, 30 e 60 mg/kg, v.o.) através do

TSC, TCA e ST. Ambos os compostos apresentaram atividade tipo-

antidepressiva nos testes preditivos, destacando a dose de 5 e 3 mg/kg para

AMA e AMB, respectivamente. Também não hove interferência no sistema

motor dos animais no TCA. AMA apresentou tempo de duração de atividade

tipo-antidepressiva no TSC de 4 horas, e o AMB de 6 horas.

Com relação ao comportamento depressivo de ratos diabéticos

induzido por STZ e submetidos ao TNF, AMB apresentou excelente

resultado, revertendo o efeito de imobilidade dos animais hiperglicêmicos,

este efeito pode ser devido à sua capacidade de melhorar os parâmetros de

estresse oxidativo no hipocampo e córtex.

Como o tratamento prolongado com EHCRF e AMA não induziram

reversão completa do estado depressivo de animais diabéticos, conclui-se que

estresse oxidativo pode não ser o único fator envolvido na fisiopatologia que

relaciona TDM com DM.

117

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ANEXO A

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ANEXO B

avaliaÇÃo do efeito antidepressivo do extrato ...siaibib01.univali.br/pdf/priscila laiz...

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