i

Ministério da Saúde

Fundação Oswaldo Cruz

Instituto Oswaldo Cruz

Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária

Avaliação de aspectos da capacidade

vetorial de população de Aedes aegypti

(Linnaeus, 1762) (Diptera: Culicidae)

mantida no laboratório na ausência ou na

presença de piretróide

Camila Dutra e Mello Ribeiro

Orientador: Dr José Bento Pereira Lima

Rio de Janeiro; março de 2008

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

ii

Instituto Oswaldo Cruz

Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária

Avaliação de aspectos da capacidade

vetorial de população de Aedes aegypti

(Linnaeus, 1762) (Diptera: Culicidae)

mantida no laboratório na ausência ou na

presença de piretróide

Camila Dutra e Mello Ribeiro

Dissertação apresentada como requisito à obtenção do título de Mestre

em Ciências

Orientador: Dr José Bento Pereira Lima

Rio de Janeiro; março de 2008

iii

Ribeiro, Camila Dutra e Mello

Avaliação de aspectos da capacidade vetorial de população de Aedes aegypti (Linnaeus, 1762) (Diptera: Culicidae) mantida no laboratório na ausência ou na presença de piretróide

Dissertação de Mestrado em Biologia Parasitária

Instituto Oswaldo Cruz – FIOCRUZ

Rio de Janeiro, 2008

Número de páginas: xi + 104

1. Aedes aegypti, dengue, resistência,capacidade vetorial e piretroide

iv

Avaliação de aspectos da capacidade vetorial de população de Aedes aegypti (Linnaeus, 1762) (Diptera: Culicidae) mantida no laboratório na

ausência ou na presença de piretróide

Tese submetida à coordenação do curso

de Pós-Graduação em Biologia

Parasitária do Instituto Oswaldo Cruz

como parte dos requisitos para obtenção

de grau em Mestre em Ciências.

Banca Examinadora

Dr. Ricardo Lourenço de Oliveira - Revisor e Presidente

FIOCRUZ/ Instituto Oswaldo Cruz

Dr. Alexandre Afrânio Peixoto

FIOCRUZ/ Instituto Oswaldo Cruz

Dr. Carlos Logullo

UENF/ Universidade Estadual do Norte Fluminense

Drª. Cláudia Codeço

FIOCRUZ/ PROCC

Drª. Ima Aparecida Braga

Ministério da Saúde/ Secretaria de Vigilância em Saúde

v

Este trabalho foi realizado no Laboratório de Fisiologia e Controle de

Artrópodes Vetores, Instituto Oswaldo Cruz, sediado no Laboratório de

Entomologia do Centro de Pesquisa General Dr Ismael da Rocha, Instituto de

Biologia do Exército. Foram utilizados recursos da Fundação Oswaldo Cruz, da

Fundação de Amparo à Pesquisa do Rio de Janeiro (Faperj), do Conselho

Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e da Secretaria

de Vigilância em Saúde (SVS-MS).

vi

À minha mãe, Márcia Dutra e Mello e ao meu irmão, Rafael Dutra e Mello Ribeiro, pelo apoio, carinho, amor, caráter, garra e tudo que esta família maravilhosa representa em minha vida. Aos meus avós Guiomar e Melloir por todo apoio, preocupação e conselhos sábios.

vii

Agradecimentos

Em primeiro lugar, gostaria de agradecer à minha mãe, por ser um grande

exemplo de força, garra, amor, admiração e estar sempre presente em todos

os momentos da minha vida. Nela sei que posso contar sempre, meu porto

seguro.

Ao meu irmão Rafael Dutra e Mello Ribeiro, por acima de tudo ser um grande

amigo, irmão, pai, tudo junto e misturado.

Aos meus queridos avós por todo apoio e torcida nestes dois anos e em toda

minha vida.

A todos os meus familiares, tios, tias, primos que de alguma forma participaram

desta etapa, sejam em ligações, encorajando, torcendo, e até oferecendo

ajuda. Vocês foram muito importantes no decorrer deste trabalho.

A todos os amigos do Laboratório de Fisiologia e Controle de Artrópodes

Vetores (LAFICAVE). Como é bom trabalhar em uma equipe realmente unida,

onde todos torcem pelo sucesso dos outros: Denise, Bento, Jutta, Ademir,

Isabella, Patrícia, Gustavo, Márcia, Luana, Thiago, Aline, Natália, Priscila,

Diogo, Luciana, Tânia, Eliane, Gilberto, Diego, Bianca. Mosquiteiros, como a

Denise fala, nosso todo é maior que a soma das partes!!! Muito obrigada!!

Às minhas amigas “não-biólogas” Camila, Carlinha e Lorena. Muito obrigada

pela preocupação, apoio, força e um pouco de diversão que ninguém é de

ferro! Apesar de não terem nenhuma afinidade com mosquitos e biologia,

vocês foram fundamentais para a conclusão deste trabalho.

Aos meus grandes amigos Thiago e Luana. Amigos desde a graduação que

vão continuar por toda a vida. Trabalhamos juntos, nos divertimos juntos,

sorrimos juntos e choramos também juntos. Escrever sobre eles é realmente

viii

difícil, só consigo dizer que é amizade pura, sincera, verdadeira. Muito obrigada

por vocês existirem.

Ao amigo e orientador Ademir Martins Júnior. Digo amigo, pois nos tornamos

muito mais unidos e parceiros no decorrer deste trabalho. Digo orientador pela

paciência, inteligência, conversas, estudos, dicas. Foi de fundamental

importância no planejamento, execução e conclusão deste trabalho. Aprendi

muito com ele nestes dois anos. Muito obrigada!

À querida Natália, amiga de turma do mestrado e também de trabalho. Sempre

pronta para ajudar e te ouvir.

Ao amigo e companheiro de muitos anos Felipe Pereira do Monte. Obrigada

pela preocupação e atenção.

Ao meu mestre Daisaku Ikeda, por direcionar minha vida e minhas ações.

Aos meus amigos do budismo, por todos os incentivos que recebi.

Ao Diogo Bellinato, por sua ajuda em inúmeros momentos nestes dois anos de

intenso trabalho. Foram muitos pedidos de socorro. Ele reclamava bastante,

mas acabava fazendo. Tenho que agradecer também a todas as pessoas que

trabalham na colônia pela enorme paciência, pois minhas gaiolas tomavam

quase todo o espaço do insetário e o povo ficava louco!

À querida Marcinha, pesquisadora do Laboratório de Transmissores de

Hematozoários. Muito obrigada pela ajuda, pelas sugestões e orientação nos

experimentos de infecção.

Ao Dr Ricardo Lourenço de Oliveira, pela revisão desta tese.

À Dra Denise Valle, pela enorme paciência e orientação neste trabalho.

Exemplo de pessoa e profissional.

ix

Ao Dr José Bento Pereira Lima. Meu orientador desde a graduação. Muito

obrigada por todo conselho, sugestão e apoio em todos esses anos de minha

formação.

Ao Instituto de Biologia do Exército (IBEx), onde todos os experimentos foram

realizados.

Ao Instituto Oswaldo Cruz (IOC) pelo apoio financeiro e técnico para a

realização deste trabalho.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (Cnpq)

pela concessão da bolsa de mestrado.

x

ÍNDICE

RESUMO ........................................................................................................... 1

ABSTRACT ....................................................................................................... 2

1) INTRODUÇÃO ............................................................................................... 3

1.1) Dengue - Histórico ............................................................................................. 3

1.2) Agente Etiológico ............................................................................................... 5

1.3) O Vetor ................................................................................................................ 6

1.4) Aedes aegypti ..................................................................................................... 7

1.5) Capacidade Vetorial .......................................................................................... 9

1.6) Controle do Vetor ............................................................................................. 10

1.7) Controle do Vetor no Brasil ............................................................................ 13

1.8) Resistência aos Inseticidas Químicos .......................................................... 14

1.9) O Uso de Piretróides no Brasil ...................................................................... 17

1.9.1) Resistência aos piretróides ..................................................................... 18

1.9.1.1) Resistência metabólica aos piretróides ......................................... 18

1.9.1.2) Resistência aos piretróides por modificação do sítio-alvo ......... 19

1.10) Fatores que Influenciam a Resistência a Inseticidas ............................... 20

1.11) Efeitos Pleiotrópicos Relacionados à Resistência a Inseticidas ............ 21

1.12) Seleção em Laboratório ............................................................................... 23

2) OBJETIVO ................................................................................................... 26

2.1) Objetivo Geral ................................................................................................... 26

2.2) Objetivos Específicos ...................................................................................... 26

3) MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................ 27

3.1) Populações de Ae. aegypti ............................................................................. 27

3.1.1) Manutenção de larvas e adultos de Ae. aegypti ................................. 28

3.2) Perfil de Susceptibilidade a Inseticidas ........................................................ 29

3.2.1) Bioensaios com larvas ............................................................................. 29

3.2.2) Bioensaios com adultos ........................................................................... 30

3.3) Manutenção de Grupos de Ae. aegypti em Laboratório na Presença ou Ausência de Piretróide ............................................................................................ 30

3.3.1) Seleção do grupo “R” ............................................................................... 31

3.4) Avaliação de Diferentes Aspectos da Capacidade Vetorial ...................... 32

3.4.1) Cinética de pupação / desenvolvimento larvar .................................... 32

3.4.2) Proporção de machos e fêmeas ............................................................ 33

3.4.3) Quantidade de sangue ingerido ............................................................. 33

3.4.4) Taxa de fêmeas que realizam postura, número de ovos postos e viabilidade dos ovos ............................................................................................ 33

3.4.5) Longevidade de adultos .......................................................................... 34

3.5) Ensaios com o Vírus DENV-II ........................................................................ 34

3.5.1) Obtenção das amostras de vírus ........................................................... 35

3.5.2) Infecção artificial ....................................................................................... 35

3.5.3) Análise das amostras infectadas ........................................................... 37

3.5.3.1) Extração de RNA viral ...................................................................... 37

3.5.3.2) Detecção do vírus DENV-II por RT-PCR (transcrição reversa e reação em cadeia da polimerase) ................................................................. 38

4) RESULTADOS ............................................................................................ 41

4.1) Resistência a Piretróide X Capacidade Vetorial – Seleção em Laboratório ................................................................................................................ 41

4.1.1) Seleção e manutenção de colônias de Ae. aegypti ............................ 41

xi

4.2) Avaliação de Diferentes Aspectos da Capacidade Vetorial nas Linhagens Selecionadas em Laboratório ................................................................................ 42

4.2.1) Cinética de pupação ................................................................................ 42

4.2.2) Proporção de machos e fêmeas ............................................................ 46

4.2.3) Quantidade de sangue ingerido ............................................................. 48

4.2.4) Taxa de fêmeas que realizam postura, número de ovos postos e viabilidade dos ovos ............................................................................................ 51

4.2.5) Longevidade de adultos .......................................................................... 56

4.2.6) Ensaios de infecção com vírus DENV-II ............................................... 61

4.2.6.1) Infecção artificial ................................................................................ 61

4.2.6.3) Detecção do vírus por RT-PCR ...................................................... 62

4.3) Resistência a Piretróide X Capacidade Vetorial – Populações de Campo .................................................................................................................................... 65

4.3.1) Cinética de pupação / desenvolvimento larvar .................................... 66

4.3.2) Proporção de machos e fêmeas ............................................................ 67

4.3.3) Quantidade de sangue ingerido ............................................................. 68

4.3.4) Taxa de fêmeas que realizam postura, número de ovos postos e viabilidade dos ovos ............................................................................................ 69

4.3.5) Longevidade de adultos .......................................................................... 73

5) DISCUSSÃO ................................................................................................ 76

6) CONCLUSÕES ............................................................................................ 91

7) BIBLIOGRAFIA ........................................................................................... 92

1

RESUMO

Aedes aegypti é considerado o único vetor de dengue nas Américas. A transmissão do vírus se dá a partir da picada da fêmea infectada. No Brasil o combate a este mosquito é feito basicamente pelo emprego de inseticidas químicos e, atualmente, o controle de adultos na maior parte do país ocorre por meio de aplicações espaciais do inseticida piretróide. Este, assim como as demais classes de inseticidas majoritariamente usados em Saúde Pública, atua no sistema nervoso central do inseto. Embora o uso de piretróides contra Ae. aegypti, em âmbito nacional, tenha se iniciado apenas em 1999-2000, já em 2002/2003 foi detectada alteração no status de susceptibilidade de várias populações de Aedes aegypti do país a esta classe de inseticidas. Este rápido aparecimento de resistência em populações do vetor pode estar relacionado à resistência cruzada, pelo uso de inseticidas de outras classes que possuam o mesmo alvo de ação do piretróide, ou que elicitem os mesmos mecanismos de resistência. Insetos resistentes têm sido alvo de estudos e algumas alterações em parâmetros biológicos já foram observadas. Estas alterações apontam para interferência dos inseticidas com a capacidade vetorial de espécies envolvidas na transmissão de patógenos. Com base nestas informações, avaliamos, em uma população de Ae. aegypti oriunda de Natal, RN, resistente a piretróide e selecionada no laboratório com deltametrina (atualmente usado no país), alguns parâmetros biológicos, durante o processo de seleção. Os mesmos parâmetros foram também avaliados em populações de Ae. aegypti provenientes de diferentes regiões do país (Nordeste - Maceió-AL e Henrique Jorge-Fortaleza, CE - e Centro-Oeste - Cuiabá-MT, Aparecida de Goiânia-GO e Uberaba-MG) com diferentes status de susceptibilidade a inseticidas. Além disso, experimentos preliminares foram realizados na tentativa de infectar cepas de Ae. aegypti com o vírus DENV-II com o objetivo de avaliar possíveis diferenças na susceptibilidade ao vírus em cepas resistentes e susceptíveis a inseticida. Porém, análises iniciais não detectaram presença de vírus nos indivíduos analisados. Com relação à população selecionada, observamos, a partir da terceira geração, alterações nos parâmetros testados. De modo geral, a longevidade, o volume de sangue ingerido, a postura e a taxa de eclosão dos ovos foram afetados negativamente no grupo selecionado no laboratório. No entanto, não podemos correlacionar estas alterações à pressão de seleção por deltametrina, visto que a resistência não aumentou significativamente para este inseticida. Entretanto, verificamos um aumento da resistência para o organofosforado temephos em comparação com o grupo não selecionado. Isto sugere que houve alteração na resistência metabólica em conseqüência do processo de seleção em laboratório. Os mesmos parâmetros de viabilidade apareceram alterados, porém em menor intensidade, na população de mosquitos de Henrique Jorge, com alta resistência ao temephos. Estas alterações, observadas em populações de campo, reforçaram a hipótese de que a resistência a inseticida possui um custo evolutivo no inseto. Para entendermos melhor este mecanismo, é necessária maior avaliação, em diferentes populações do Brasil, com diferentes níveis de resistência a inseticidas distintos. Deste modo, poderíamos compreender melhor a biologia de insetos resistentes e fornecer dados que possam ajudar no controle de Ae. aegypti.

2

ABSTRACT

In the Americas, only Aedes aegypti is considered dengue vector. Virus transmission depends on the bite of an infected female. In Brazil, control of this mosquito strongly relies in the use of chemical insecticides. Adult control in almost all country is presently made with spacial applications of pyrethroid insecticides. Similarly to other classes of insecticides major used in Public Health, pyrethroids act in the insect central nervous system. Although the use of pyrethroids against Ae. aegypti in national scale has started only in 1999-2000, susceptibility alteration of several vector populations to this class of insecticides was already detected in 2002-2003. This rapid development of resistance could be related to cross resistance with other classes of insecticides previously used, providing these products share the same target site or activate the same resistance mechanisms. Resistant insects are currently being studied and some differences in biological parameters have already been observed. These differences point to interference of insecticides on vectorial capacity of species involved in pathogen transmission. Based on these informations we evaluated, in an Ae. aegypti population, collected in Natal, RN, pyrethroid resistant and submitted to deltamethrin (presently employed in the country) selection in the laboratory, some biological parameters during the selection process. The same parameters were also evaluated in Aedes aegypti field populations from distinct localities in the country (Northeast Region - Maceió-AL and Henrique Jorge-Fortaleza, CE – and Central Western Region - Cuiabá-MT, Aparecida de Goiânia-GO and Uberaba-MG) and exhibiting different insecticide susceptibility status. Further, preliminary DENV-II virus infection attempts of Aedes aegypti strains were performed in order to evaluate potencial virus susceptibility differences among insecticide resistant and susceptible strains.. However, initial tests did not detect the virus in the specimens analyzed. Regarding the population submitted to selection, we observed, from the 3rd generation on, differences in the tested parameters. In general, longevity, volume of ingested blood, egglaying and egg’s eclosion rate were negatively affected in the group submitted to laboratory selection. However, these differences can not be directly correlated to deltamethrin selection pressure, since resistance against this insecticide did not increase significantly. By contrast, we detected increase of resistance to the organophosphate temephos, comparing to the non selected group. This finding argues in favor of metabolic resistance alteration as a consequence of the selection process in laboratory conditions. The same viability parameters were altered, although to a lesser extent, in the Henrique Jorge mosquito population, bearing high temephos resistance levels. These alterations, observed in field populations, corroborate the hypothesis that insecticide resistance is associated with an evolutive cost in the insect. In order to better understand this mechanism, further evaluation, with different Brazilian mosquito populations, bearing distinct resistance levels, against various products, is necessary. This would enable a better understanding of the biology of resistant insects and provide data that could assist in the control of Ae. aegypti.

3

1) INTRODUÇÃO

1.1) Dengue - Histórico

Existem registros, em uma enciclopédia chinesa, que apontam para

uma enfermidade, ocorrida na China durante o século III. Esta enfermidade foi

chamada pelos chineses de “veneno da água”, pois se acreditava que

houvesse alguma associação com a água (Gubler, 1998). Porém, os primeiros

relatos de epidemias de uma enfermidade clinicamente compatível com dengue

foram descritos na Ásia, África e América do Norte em 1779 e 1780 (Rigau-

Pérez e cols., 1998).

Muitos nomes foram atribuídos a esta doença até seu total

estabelecimento. O primeiro uso do nome “Dengue” ocorreu na Espanha em

1801. Este nome seria um significado para pancada ou golpe causado por um

espírito do mal que provocava dores semelhantes à câimbra (Gubler, 1997).

Apesar dos primeiros relatos de dengue datarem de mais de 200

anos, somente em 1903 Graham sugeriu o envolvimento de mosquitos na

transmissão da doença. Posteriormente Bancroft, em 1906, identificou o

mosquito Aedes (Stegomya) aegypti (Linnaeus, 1762) como seu principal

transmissor (Rosen e cols., 1954).

Ashburn e Craig, em 1907, demonstraram a natureza viral do agente

etiológico após descartarem a participação de bactérias ou protozoários (Rosen

e cols., 1954). Estudos neste sentido foram realizados durante a Segunda

Guerra Mundial, a partir de soros de soldados infectados em Calcutá, Nova

Guiné e Hawaí. Estes estudos resultaram na identificação de dois sorotipos

diferentes dos vírus dengue, denominados DENV-I e DENV-II. Posteriormente

foram isolados outros dois sorotipos diferentes, denominados DENV-III e

DENV-IV, na primeira epidemia conhecida de dengue hemorrágico ocorrida em

Manila, Filipinas (Hammon e cols., 1960; OMS, 1997, 2002). Durante as

décadas de 1950, 1960 e 1970, esta nova forma de dengue ocorreu em

epidemias periódicas em alguns países.

Em 1947, a Organização Pan Americana da Saúde (OPAS)

coordenou um programa de erradicação do Ae. aegypti nas Américas que

4

terminou por volta de 1970. Esta espécie foi considerada erradicada em quase

toda a América. No Brasil, este vetor foi considerado erradicado em 1955

(Benchimol, 2001). Porém, ainda existiam focos do vetor no Suriname, Guiana,

Venezuela, Ilhas do Caribe e Estados Unidos da América (Schatzmayr, 2000).

Em 1980 o vetor já havia reinfestado a maioria dos países tropicais desta

região (Gubler, 1998; Rigau-Pérez e cols., 1998). Nesta mesma época, a

incidência de dengue hemorrágico aumentou dramaticamente, expandindo a

distribuição do vírus para ilhas do Pacífico e para a América. No continente

americano, o sorotipo DENV-IV foi introduzido, em 1981, em São Bartolomeu,

provocando surtos no Caribe, México, países da América Central e do Sul.

Nesta época ocorreu, em Cuba, a primeira epidemia de dengue hemorrágico

das Américas (Kouri e cols., 1986).

Desde então, o dengue é disseminado no mundo; está presente em

mais de 100 países, localizados em regiões tropicais e subtropicais,

predominando em áreas urbanas e semi-urbanas (Figura 1.1). Estima-se que

2,5 a 3 bilhões de pessoas vivam em áreas de transmissão de dengue (OMS,

1997; 2002). Na grande epidemia em 2001 foram notificados 609.000 casos

nas Américas, dos quais 15.000 de dengue hemorrágico, mais que o dobro dos

casos registrados na mesma região em 1995. Estes aumentos têm sido

associados ao crescimento da população, ao aumento de viagens aéreas, à

urbanização descontrolada e à dificuldade de se implantar uma política eficaz

de combate ao mosquito vetor (Gubler, 1998, 2002; Rigau-Pérez e cols., 1998).

Atualmente, o dengue é considerado uma doença endêmica no

Brasil, apresentando surtos epidêmicos recorrentes desde a década de 1980.

Em 2006, foram notificados 345.922 casos autóctones de dengue, com 628

casos confirmados de dengue hemorrágico e 67 óbitos. Ao compararmos com

o ano anterior, observamos um aumento de 39% de casos de dengue no país.

A região Sudeste registrou o maior número de notificações (141.864 casos). O

Rio de Janeiro contribuiu com 30.447 casos durante este ano e foi classificado

como área de média incidência (196 casos por 100.000 habitantes) (SVS,

2006). Em 2007, foram notificados 510.117 casos no país, o que representa um

aumento de 47,46% em relação a 2006 (SVS, 2008).

5

Figura 1.1: Distribuição do e de seu vetor, Aedes aegypti, no mundo. Fonte: disponível no site: http://www.cdc.gov/ncidod/dvbid//map-distribution-2005.htm

1.2) Agente Etiológico

O dengue é uma doença febril, aguda, predominantemente urbana,

benigna na forma clássica e grave na forma hemorrágica. Seu agente

etiológico é um arbovírus do gênero Flavivirus, pertencente à família

Flaviviridae. É possível distinguir quatro sorotipos, que se designam como

DENV-I, DENV-II, DENV-III e DENV-IV (MS, 1994; OMS, 1997, 2002; OPAS,

2000). A infecção por qualquer um dos sorotipos confere proteção duradoura

contra o sorotipo infectante e proteção parcial e temporária, de alguns meses,

contra os demais (Miagostovich e cols., 1997; Gubler, 1998).

Os vírus dengue são descritos morfologicamente como esféricos e

recobertos por uma bicamada lipídica com inserções protéicas circundando o

genoma. Seu genoma é composto de uma molécula de RNA fita simples de

polaridade positiva, de aproximadamente 11kb. O RNA viral é envolto por uma

proteína estrutural denominada proteína do capsídeo, que forma o

nucleocapsídeo. Possui também o precursor da proteína de membrana, a

proteína de envelope e sete proteínas estruturais (Chambers e cols., 1990;

Fonseca e Fonseca, 2002).

6

A partir do repasto de sangue infectado, um mosquito susceptível

está apto a transmitir o vírus após o período de incubação extríneco. Este

período geralmente varia de oito a 14 dias (OMS, 1997), porém há registros de

aparecimento de vírus nas glândulas salivares em menos de uma semana

(Salazar e cols., 2007). O homem é o principal hospedeiro do vírus, embora

alguns autores tenham demonstrado que macacos podem ser infectados,

servindo como reservatório. No homem, o período de incubação varia de três a

15 dias, e após este período há disseminação do vírus por todo corpo, podendo

ser isolado do sangue e tecidos (OMS, 1997, 2002; Gubler, 1998). Após a

infecção com o vírus dengue, o indivíduo pode manifestar a forma aguda da

doença, que pode variar desde sintomas moderados, como estado febril leve,

até formas graves, como a síndrome do dengue hemorrágico e a síndrome do

choque (Monath, 1994). Estas duas formas ocorrem mais freqüentemente (mas

não exclusivamente) em indivíduos anteriormente infectados com um sorotipo,

e, portanto, imunes àquele sorotipo, quando entram em contato com outro

sorotipo (Figueiredo e Fonseca, 1996; Gubler, 1998).

1.3) O Vetor

O dengue tem como vetores mosquitos do gênero Aedes, que

agrupa mais de 500 espécies, sendo Ae. aegypti o vetor primário e Aedes

albopictus (Skuse, 1895) seu vetor secundário. Porém, na América, somente

Ae. aegypti é incriminado como vetor do dengue, apesar de infecção natural de

Ae. albopictus com o vírus dengue já ter sido relatada por pelo menos duas

vezes: durante um surto da doença no México (Ibanez-Bernal e cols., 1997) e,

no Brasil, registro de larva de Ae. albopictus infectada com o vírus dengue na

cidade de Campos Altos, MG (Serufo e cols., 1993). Esta espécie possui

grande importância, pois apresenta maior tolerância ao frio e seu habitat pode

variar do ambiente silvestre ao urbano (Hawley, 1988). No Brasil, a incidência

deste mosquito em áreas suburbanas tem aumentado significativamente

(Gratz, 2004). Com isso, Ae. albopictus pode, eventualmente, atuar como

“ponte” na re-introdução do vírus da febre amarela silvestre e outros patógenos

para o ambiente urbano (Rodhain e Rosen, 1997; Lourenço-de-Oliveira e cols.,

2004; Juliano e Lounibos, 2005). Em contrapartida, Ae. aegypti apresenta

7

comportamento altamente antropofílico, funcionando como a espécie mais

importante na transmissão do dengue ao homem.

1.4) Aedes aegypti

Aedes aegypti (Linnaeus, 1762) é uma espécie do subgênero

Stegomya, subfamília Culicinae. Sua distribuição é mundial, ocorrendo em

regiões tropicais e subtropicais, compreendidas principalmente entre as

latitudes 45° norte e 35° sul (Figura 1.1), embora já tenha sido detectado em

locais fora desses limites, porém sempre dentro das zonas isotermais de 20°C

(Consoli e Lourenço-de-Oliveira, 1994).

Há indícios de que seja originário da África, onde existem populações

selvagens e domésticas, e foi originalmente descrito no Egito, daí seu nome

específico (Ae. aegypti). Este mosquito aparece sempre relacionado ao

homem, acompanhado-o em sua permanente migração pelo mundo (Nelson,

1986; Consoli e Lourenço-de-Oliveira, 1994; MS, 1994; OMS 2002).

Somente populações domésticas são encontradas nas Américas,

provavelmente trazidas pela primeira vez por embarcações em viagens ao

Novo Mundo, em barris de água, durante a colonização européia. É sem dúvida

o mosquito mais associado ao homem, sendo adaptado ao ambiente urbano, e

freqüentemente encontrado no domicílio e no peridomicílio (MS, 1994; OPAS,

2000; OMS 2002).

As larvas desta espécie se desenvolvem em ambiente aquático, e

são facilmente encontradas em tanques de armazenamento de água,

vasilhames dentro e fora das casas, latas, garrafas e vasos de plantas (Nelson,

1986). O corpo do adulto é escuro e possui manchas brancas e um desenho,

composto por escamas claras, em forma de lira, em seu escudo, que facilita a

identificação a olho nu (Figura 1.2). Mede de 6 a 9 mm e vive, em média, 30 a

35 dias. O acasalamento geralmente se dá durante o vôo, mas,

ocasionalmente, pode se dar sobre uma superfície vertical ou horizontal. Uma

única inseminação é suficiente para fecundar todos os ovos que a fêmea venha

a produzir durante sua vida (MS, 1994). A fêmea necessita de sangue para a

produção de seus ovos. A oviposição ocorre acima do nível da água, em

superfície úmida.

8

Aedes aegypti foi reconhecido como transmissor da febre amarela

em 1881 por Carlos J. Finlay (Bisset, 2002). Em 1906, Bancroft publicou as

primeiras evidências de que Ae. aegypti também era vetor de dengue, o que foi

confirmado posteriormente por Agramonte em 1906 e por Simmons em 1931

(Martinez 1990).

No Brasil, Ae. aegypti foi identificado pela primeira vez em 1898 por

Lutz, e em 1899 por Ribas (Franco, 1969). Está presente no país em 26

estados e no Distrito Federal (SVS, 2003) e continua sendo o único vetor

incriminado na transmissão de dengue no Brasil. Estudos recentes confirmam

sua capacidade de se infectar com os vírus do dengue e da febre amarela

(Lourenço-de-Oliveira e cols., 2004). Este mosquito é considerado o vetor

primário global do vírus dengue, apesar de existirem variações genéticas entre

populações do vetor, conferindo-lhes diferentes níveis de competência vetorial

(Gubler e cols., 1979; Tardieux e cols., 1990; Schneider e cols., 2007).

O mecanismo de transmissão é salivar, através da picada da fêmea

infectada. A fêmea, uma vez infectada, necessita de tempo para que o vírus se

replique em seu interior e, posteriormente, localize-se nas glândulas salivares.

Este tempo é denominado período de incubação extrínseco, e varia de oito a

14 dias. A partir daí o mosquito se torna capaz de transmitir o vírus ao

hospedeiro vertebrado (Watts e cols., 1987; Schneider e cols., 2007). Além da

transmissão salivar, pode ocorrer transmissão transovariana ou vertical, em

que o vírus é transmitido da fêmea para seus ovos (Rosen, 1987; Estevas e

Vargas, 2000; Mourya e cols., 2001; Joshi e cols., 2002).

A situação atual é alarmante por variadas razões, das quais as mais

importantes são as falhas no combate efetivo ao vetor. Apesar dos esforços

realizados pelo Programa Nacional de Controle da Dengue (PNCD), e pelos

órgãos de comunicação na tentativa de sensibilização da população, o que se

tem observado é a disseminação do Ae. aegypti, hoje presente na maioria dos

municípios brasileiros.

9

Figura 1.2: Aedes aegypti, vetor primário do Dengue no mundo e único vetor incriminado no Brasil. Fonte: http://saudeonline.wordpress.com/2007/10/28.

1.5) Capacidade Vetorial

O conhecimento sobre a capacidade vetorial é pré-requisito

fundamental para a compreensão da disseminação da doença e para a

definição das medidas de controle (Donalísio e Glasser, 2002). A capacidade

vetorial determina a velocidade com que um patógeno poderá ser disseminado

entre indivíduos sensíveis de uma área à custa de uma população de um vetor

biológico (Lourenço-de-Oliveira, 2005). É estimada através de parâmetros

biológicos, ecológicos e comportamentais do inseto.

Os fatores que determinam a capacidade vetorial do inseto são: a

densidade da espécie vetora numa determinada área, a média diária de

picadas no hospedeiro, a média diária de picadas infectantes, o período de

incubação extrínseco do vírus no vetor (período em que o mosquito deixa de

ser somente infectado e passa a ser infectivo, capaz de transmitir o patógeno

ao hospedeiro definitivo), tempo entre a realização de um repasto sangüíneo, a

oviposição e a procura por um novo repasto (ciclo gonotrófico) e a taxa de

sobrevivência diária do vetor (Lourenço-de-Oliveira, 2005). Dentre estes fatores

destaca-se a competência vetorial do inseto, que é a probabilidade de um vetor

se infectar a partir do repasto sangüíneo infectado. Os fatores que permitem

que um vetor (artrópode) seja susceptível ao agente etiológico e se infecte são

intrínsecos e controlados geneticamente (Hardy e cols., 1983; Bosio e cols.,

1998, 2000; Failloux e cols., 1999). Todos estes parâmetros são necessários

10

para determinar a importância epidemiológica de um inseto, ou seja, sua

eficiência como vetor.

1.6) Controle do Vetor

Práticas para controle de insetos são muito antigas e tem-se registro

de seu uso na China há mais de 2.000 anos. Estas práticas, basicamente de

controle biológico, eram direcionadas às pragas agrícolas (Braga e Valle,

2007a). Antes da Segunda Guerra Mundial, algumas substâncias químicas já

eram utilizadas no combate a insetos, como por exemplo, os compostos

arsênicos. Substâncias orgânicas de origem vegetal também eram usadas no

controle de pragas, como a piretrina, nicotina e rotenona (WHO, 1997).

Com a descoberta, no final do século XIX, de que certas espécies de

insetos e outros artrópodes eram transmissores de algumas importantes

doenças, o controle destas endemias foi basicamente centralizado no combate

ao vetor, visto que vacinas ou medicamentos efetivos ainda não estavam

disponíveis. Esta prática ainda é muito utilizada como parte integrante de

programas de controle de endemias, uma vez que algumas doenças continuam

sem medicamentos ativos contra seus patógenos.

O final da década de 1940 foi chamado de “revolução dos

pesticidas”, pois se utilizou em larga escala o inseticida DDT (dicloro-difenil-

tricloretano) no controle de vetores. Este inseticida foi sintetizado em 1874 por

Zeidler, mas somente em 1939 Paul Muller descobriu sua ação inseticida, o

que lhe rendeu o prêmio Nobel de Medicina em 1948 (D’Amato e cols., 2002).

A partir de então, o DDT passou a ser utilizado no controle de vetores até a

década de 1970, quando seu uso foi proibido em diversos países, por ser

altamente persistente ao meio ambiente e tóxico aos animais (D’Amato e cols.,

2002).

A meta do controle de vetores em Saúde Pública é diminuir a

transmissão de doenças através da eliminação de parte da população de

mosquitos infectados, que freqüentemente está em contato com o homem

(Lima, 2003). Esta eliminação pode ser feita com base no combate a larvas ou

adultos. O controle das larvas pode ser feito pela eliminação de criadouros

(controle físico), com a utilização de organismos naturalmente predadores dos

11

mosquitos (controle biológico) ou com produtos capazes de matar os mosquitos

(controle químico) (Neves e cols., 2001). Esta última é uma das metodologias

mais utilizadas como parte de programas de combate aos vetores. Atualmente,

os principais inseticidas utilizados em Saúde Pública pertencem a quatro

grupos: organoclorados, carbamatos, organofosforados e piretróides. Todos

atuam sobre o sistema nervoso central dos insetos (Beaty e Marquardt, 1996;

Palchick, 1996).

• Organoclorados: São inseticidas que contêm carbono, hidrogênio e

cloro em sua estrutura química (Ware e Whitacre, 2004). São pouco

utilizados atualmente, embora sejam os inseticidas mais persistentes

dentre todas as classes. Seu uso foi descontinuado, chegando a ser

proibido em alguns países, por serem tóxicos aos seres humanos e

outros animais. São também nocivos ao meio ambiente devido a sua

persistência (WHO, 1997; Braga e Valle, 2007a). Seu modo de ação não

é bem esclarecido, mas de algum modo interferem com o balanço de

íons nos axônios dos neurônios, impedindo a transmissão normal do

impulso nervoso. Podem ser divididos em três grupos: DDT e análogos

do DDT, hexaclorohexanos e ciclodienos (WHO, 1997). O DDT, seus

análogos e os hexaclorohexanos agem diretamente no canal de sódio,

impedindo o escoamento de íons. Os ciclodienos atuam no receptor de

ácido gama-aminobutírico (GABA), impedindo a entrada de íons cloreto

nos neurônios (Ware e Whitacre, 2004).

• Carbamatos: Foram desenvolvidos em 1947, na Suíça, e são derivados

do ácido carbâmico (WHO, 1997). Possuem baixa toxicidade aos

mamíferos e amplo espectro de ação nos insetos. O primeiro produto

utilizado foi o carbaril. Posteriormente, o propoxur foi utilizado em

programas de combate à malária em áreas onde a resistência aos

organofosforados havia sido verificada (WHO, 1997). Os carbamatos

atuam inibindo a Acetilcolinesterase, porém esta inibição é reversível

(WHO, 1984). Estes carbamilam a enzima ao invés de acetilá-la, e esta

perde sua forma ativa hidrolítica. A inibição desta enzima resulta em

acúmulo de acetilcolina nas sinapses nervosas e neuro-musculares,

provocando rápidas contrações nos músculos voluntários, levando à

paralisia, seguida de morte (WHO, 1984; IRAC-BR, 2008).

12

• Organofosforados (OPs): São inseticidas que possuem fósforo em sua

composição. São também denominados fosfatos orgânicos ou

inseticidas fosforados. Sua propriedade inseticida foi descoberta na

Alemanha durante a Segunda Guerra Mundial, em estudos com gases

organofosforados (Ware e Whitacre, 2004). Foram primeiramente

utilizados contra pragas agrícolas e passaram a ser usados no controle

de vetores em Saúde Pública após a detecção de resistência aos

organoclorados (WHO, 1997). Os primeiros organofosforados utilizados

como inseticidas apresentavam alta toxicidade aos mamíferos.

Posteriormente, na década de 1950, foi desenvolvido um

organofosforado com grande espectro de ação e baixa toxicidade aos

mamíferos: o malathion. Desde então outros organofosforados foram

desenvolvidos e utilizados em programas de controle de vetores, como o

fenthion, fenitrothion e temephos O sítio de ação dos OPs é o mesmo

dos carbamatos, a Acetilcolinesterase (ACE) a qual inibem. O grupo

fosfato dos OPs ataca o grupo éster das ACEs e as fosforila. Esta

ligação (fósforo-oxigênio) é muito mais forte que a ligação carbono-

oxigênio provocada pelos carbamatos. Desta forma, a desfosforilação

desta enzima é muito mais lenta que a descarbamilação (IRAC-BR,

2008).

• Piretróides: Os piretróides são compostos de origem vegetal, mais

utilizados atualmente como inseticidas. São formulações de ésteres

denominados piretrinas, extraídos de flores pertencentes ao gênero

Chrysanthemum (Ware e Whitacre, 2004). As propriedades inseticidas

das piretrinas são derivadas de ésteres e ácidos piretróicos. Estes

ácidos são altamente lipofílicos e penetram rapidamente em vários

insetos, paralisando seu sistema nervoso (Reigart e Roberts, 1999). As

piretrinas naturais têm sido usadas há séculos como inseticidas e a

composição dos piretróides é conhecida desde 1920. Porém, os

análogos fotoestáveis das piretrinas só foram descritos nos anos 1970.

Após sua introdução, em 1978, os piretróides ganharam enorme apoio

na agricultura devido ao baixo custo, baixas doses utilizadas, grande

espectro de atividade e segurança em seu uso (Watkinson, 1989). Dois

piretróides formulados nesta época foram a permetrina e a cipermetrina

13

(Miller, 1988; WHO, 1997). Estes compostos possuem baixo grau de

toxicidade ao homem e a outros animais devido a dois fatores: absorção

limitada e rápida degradação por enzimas digestivas dos mamíferos.

Insetos sem estas enzimas exibem alta susceptibilidade a estes

produtos (Reigart e Roberts, 1999). São biodegradáveis, não

cumulativos e raramente provocam intoxicações agudas em aves e

mamíferos (Palchick, 1996). Atuam, aparentemente, mantendo abertos

os canais de sódio das membranas dos neurônios. A estrutura de

diferentes piretróides permite a classificação em dois tipos: I e II, de

acordo com a ausência ou presença, respectivamente, de um

grupamento ciano ligado ao radical álcool fenilbenzil. Os piretróides do

tipo II, como é o caso da cipermetrina e deltametrina, têm maior

atividade inseticida e sua toxicidade aumenta com o aumento da

temperatura, ao contrário dos compostos do tipo I (Ware e Whitacre,

2004).

1.7) Controle do Vetor no Brasil

No Brasil, o combate ao Ae. aegypti iniciou-se em São Paulo em

1901, com o controle da febre amarela urbana. Em 1903, Oswaldo Cruz, no Rio

de Janeiro, implantou o programa de controle da febre amarela, cujo objetivo

principal foi a eliminação do vetor. Este programa obteve apoio da Organização

Panamericana de Saúde e culminou com a erradicação do vetor em 1955 (MS,

1968; Braga, 2004).

O uso de inseticidas químicos no controle de Ae. aegypti teve início nos

anos 1940, com a descoberta da ação inseticida do DDT (dicloro-difenil-

tricloretano), um organoclorado. Este inseticida foi utilizado maciçamente até a

erradicação do vetor no Brasil. Contudo, em 1967, com a reintrodução do vetor,

foi detectada resistência ao DDT (Crinnion, 2000). Os organofosforados

passaram a ser utilizados a partir de 1967, seja como larvicidas ou em

aplicações perifocais e espaciais, contra os adultos (MS, 1968; OMS, 1997).

Estes inseticidas são biodegradáveis e possuem poder residual menor que o

DDT, tendo que ser reaplicados com maior periodicidade. Em 1973, Ae. aegypti

foi novamente considerado erradicado no país, sendo reintroduzido em 1976.

14

Desde então, os OPs malathion e fenitrothion passaram a ser utilizados contra

adultos e temephos, contra larvas. O uso de OPs foi intensificado no país a

partir de 1986, quando houve a primeira epidemia recente de dengue no estado

do Rio de Janeiro (Schatzmayr e cols., 1986). O uso intensivo, principalmente

do larvicida temephos, organofosforado recomendado pela Organização

Mundial de Saúde (OMS) para uso em água potável, culminou com a perda de

efetividade desta classe de inseticida em várias regiões do país devido ao

aparecimento de resistência do vetor (Macoris e cols., 1999; Lima e cols., 2003;

Braga e cols., 2004). Em 1999 houve os primeiros registros de resistência ao

temephos e neste mesmo ano o Ministério da Saúde (MS) iniciou a

coordenação de uma Rede para monitorar a resistência de Ae. aegypti a

inseticidas (Rede Nacional de Monitoramento da Resistência de Aedes aegypti

a Inseticidas, MoReNAa). Resultados desta Rede forneceram subsídios para

definição de novas estratégias de controle como, por exemplo, a substituição,

em 2001, do larvicida temephos pelo Bacillus thuringiensis var. israelensis (Bti)

nas localidades onde havia sido detectada resistência ao temephos.

Simultaneamente, OPs foram também substituídos por piretróides no controle

de adultos em todo o país, com exceção do estado de São Paulo que passou a

utilizar organofosforado (Montella e cols., 2007). Este estado já utilizava

piretróides desde 1989, e resistência a este inseticida já havia sido detectada.

1.8) Resistência aos Inseticidas Químicos

A resistência aos inseticidas é definida como a habilidade de uma

população de insetos de sobreviver a uma dose de inseticida que é letal para a

maioria dos indivíduos de uma população susceptível da mesma espécie

(Beaty e Marquardt, 1996; Braga, 2004). A resistência então pode ser pensada

como uma resposta à pressão seletiva, com sobrevivência dos indivíduos que

possuem alelos que lhes conferem resistência. O inseticida não produz

mudança genética, apenas seleciona os indivíduos resistentes (Lima, 2003).

Antes da aplicação de um produto, estima-se que a freqüência de alelos que

conferem resistência é bastante baixa em uma população; porém, com o uso

contínuo do mesmo produto, esta freqüência tende a aumentar até níveis em

15

que a eficácia do produto é comprometida (Roush e Mckenzie, 1987; ffrench-

Constant, 2006).

Embora os inseticidas químicos sejam de fundamental importância

no combate aos vetores, seu uso continuado durante décadas tem resultado na

seleção de resistência em populações de espécies vetoras (OMS, 1995;

FUNASA, 1999). Os casos de resistência registrados se intensificaram por

volta dos anos 1940, com a introdução dos inseticidas sintéticos (IRAC-BR,

2006). Atualmente resistência aos inseticidas já foi detectada para

praticamente todas as classes utilizadas, como os organoclorados,

organofosforados, carbamatos e piretróides. A resistência pode se manifestar

por alteração comportamental, quando o inseto passa a evitar o contato com o

inseticida, através de mudanças em seu comportamento, ou por expressão de

alguma característica do inseto que faça com que o inseticida não o prejudique.

Este último tipo de resistência pode ser dividido em três diferentes

mecanismos:

1) Diminuição da penetração do inseticida: a diminuição da taxa

de penetração do inseticida se dá por alterações na cutícula do inseto. Os

indivíduos com esta alteração ficam com menor quantidade do tóxico em seu

organismo. Com isso, os mecanismos de detoxificação presentes no inseto têm

maior facilidade de metabolizar o inseticida, pois este está em pequena

quantidade no organismo. Não estão elucidados os processos fisiológicos ou

moleculares envolvidos neste tipo de resistência. Sabe-se, porém, que este

mecanismo aparece geralmente em conjunto com outros que conferem

resistência (Raymond e cols., 1989).

2) Resistência metabólica: ocorre quando os mecanismos

enzimáticos de detoxificação (naturais no inseto) têm sua eficiência

aumentada. Este aumento promove a inativação e eliminação do inseticida,

impedindo que este alcance seu sítio de ação, o sistema nervoso central. Três

classes de enzimas, quando alteradas, são responsáveis pela resistência

metabólica: Glutationa-S-Transferases, Oxidases e Esterases (Brogdon e

McAllister, 1998; Hemingway e Ranson, 2000). O estudo das enzimas

relacionadas à resistência metabólica pode ser realizado através de uma série

de ensaios (Hemingway, 1998; Coto e cols., 2000; Rodríguez e cols., 2001,

2002, 2004). Embora cada enzima possua especificidade por um determinado

16

substrato, uma mesma classe de enzimas pode detoxificar mais de um grupo

de inseticidas, conferindo a chamada resistência cruzada.

As Glutationa-S-Transferases (GSTs) são amplamente presentes

entre os seres vivos e têm como função primária a detoxificação de compostos

endógenos e exógenos presentes no organismo. Esta enzima atua conjugando

produtos da hidrólise (por Esterases) ou da oxidação (por Monooxigenases

P450). Promove resistência quando sua atividade é elevada ou quando ocorre

aumento quantitativo de um ou mais tipos de GSTs. Este aumento se dá devido

à amplificação de genes, aumento dos níveis transcricionais ou mudanças

qualitativas nas enzimas (Ranson e Hemingway, 2005).

As Oxidases, ou Monooxigenases P450, como são também

chamadas, estão, assim como as GSTs, envolvidas no metabolismo de

compostos endógenos e exógenos (René, 1999). Estudos em mosquitos

relacionam intensa atividade destas enzimas com resistência a inseticidas

(Bergé e cols., 1998). Em Ae. aegypti, experimento com pressão de seleção

sugeriu que as P450 representam a principal classe enzimática envolvida na

resistência metabólica a piretróides (Kumar e cols., 2002). Estas enzimas

podem estar envolvidas no metabolismo de detoxificação de todas as classes

de inseticidas (Hemingway e Ranson, 2000) e, por isso, são freqüentemente

relacionadas ao fenômeno da resistência cruzada. Estudos em laboratório com

pressão de seleção com temephos (OP) verificaram também aumento de

resistência a deltametrina relacionado a esta classe de enzimas, através de

ensaios com sinergistas (Rodríguez e cols., 2002).

As Esterases estão, em princípio, relacionadas com a detoxificação

de todos os inseticidas químicos. Já é bem relatado na literatura que mosquitos

resistentes a organofosforados geralmente apresentam aumento na atividade

desta enzima. Este aumento pode decorrer, em geral, de amplificação gênica

ou de ativação transcricional. As Esterases agem sobre organofosforados

(OPs) por seqüestro. Esta enzima permanece bastante tempo ligada ao

inseticida. Existe, porém, uma exceção, que é o OP malathion. Já foi relatado

na literatura a existência de uma enzima Esterase que age especificamente

contra este inseticida. Esta enzima, denominada malathion-Esterase, possui

mudança qualitativa que lhe confere maior afinidade por este composto,

hidrolizando-o. Esta enzima não age por seqüestro.

17

Em outras classes de inseticida, como o piretróide, ou outro

composto que possua grupamento éster, as Esterases se ligam e são capazes

de hidrolizar, gerando como produtos, ácido e álcool (Hemingway e cols.,

2004).

3) Modificação do sítio-alvo: Cada inseticida químico apresenta

como alvo diferentes moléculas do sistema nervoso central: a enzima

Acetilcolinesterase (para organofosforados e carbamatos) (Penilla e cols.,

1998), os receptores do ácido γ-amino-butírico (para organoclorados do grupo

dos ciclodienos) (Hemingway e cols., 2004) e canais de sódio (para piretróides

e organoclorados do grupo do DDT) (Soderlund e Kniple, 2003). Indivíduos

resistentes apresentam modificações na molécula-alvo dos inseticidas. Estas

podem ser mutações pontuais que diminuem ou anulam a afinidade entre o

inseticida e seu receptor no organismo do inseto (Beaty e Marquardt, 1996).

1.9) O Uso de Piretróides no Brasil

Como mencionado acima, nos anos 1970 foi desenvolvida uma nova

classe de inseticidas com ação letal mais rápida que os inseticidas utilizados

até então e com um mecanismo da ação igual ao DDT, os piretróides. Os

piretróides sintéticos, atualmente bastante estáveis, são produzidos em

laboratório, baseados em uma substância natural, o piretro, extraído de

crisântemos. No Brasil, os piretróides começaram a ser utilizados no controle

de adultos do vetor do dengue em 1989, em São Paulo. O restante do país

manteve o uso de organofosforados para o controle de larvas e adultos até

1999, quando foi efetivada a troca para piretróide para controle de adultos

(Braga e Valle, 2007b). Atualmente são usados, em aplicações espaciais a

ultra baixo volume, os piretróides deltametrina e cipermetrina (este último em

alguns municípios da Região Norte) ou, no caso do estado de São Paulo, o

organofosforado malathion (SVS, 2006). Ou seja, no Brasil tem sido crescente

a utilização de piretróides para o controle de Ae. aegypti adultos, por meio de

aplicações espaciais (Braga e cols., 2004). No entanto, seu uso nestes últimos

anos tem levado ao rápido aparecimento de resistência em diversas

populações avaliadas (Da-Cunha e cols., 2005; Montella e cols., 2007).

18

1.9.1) Resistência aos piretróides

O rápido aparecimento de resistência a piretróide, em populações de

Ae. aegypti no Brasil, foi diagnosticado através de bioensaios com metodologia

do Centers for Disease Control (CDC, 1998), ligeiramente modificada por nossa

equipe para avaliação de resistência a esta classe de inseticidas (Da-Cunha e

cols., 2005). Esta rápida mudança do status de susceptibilidade das

populações brasileiras do vetor pode estar relacionada ao fato de que vários

mecanismos selecionados por outras classes de inseticidas podem apresentar

resistência cruzada ao piretróide (Curtis e cols., 1998).

Os relatos de resistência a piretróide em Ae. aegypti apontam para

resistência metabólica ou por alteração do alvo no sistema nervoso central

(item 1.8).

1.9.1.1) Resistência metabólica aos piretróides

A resistência metabólica está associada a alterações quantitativas

e/ou qualitativas de enzimas e dos genes que a codificam (Hemingway e cols.,

2004). As alterações quantitativas relacionam-se ao aumento do número de

moléculas de determinadas enzimas, enquanto as alterações qualitativas

relacionam-se à afinidade pelo substrato. Os piretróides, por sua natureza

química, são passíveis de detoxificação por todas as enzimas relacionadas ao

metabolismo de inseticidas: P450, Esterases e GSTs (Hemingway, 2004).

As enzimas P450 (citocromo P450) representam a principal classe

enzimática envolvida na resistência metabólica a piretróides (Kumar e cols.,

2002); na verdade, têm potencial de metabolizar todas as classes de

inseticidas, sendo muito importantes no fenômeno da resistência cruzada

(Hemingway e Ranson, 2000).

As Esterases, que hidrolisam ésteres carboxílicos, estão

principalmente relacionadas à resistência a organofosforados. Porém, estas

enzimas podem detoxificar qualquer outro tipo de composto químico que

possua ligação éster. No caso de piretróides, estas enzimas provavelmente se

ligam ao grupamento éster, provocando hidrólise. Em várias ordens de insetos,

foi detectada maior atividade de Esterases em populações resistentes a

piretróides (Devonshire e Moores, 1982; Karunaratne e cols., 1993; Hernandez

e cols., 2002). Recentemente, nosso grupo encontrou atividade destas enzimas

19

alterada em populações de Ae. aegypti resistentes tanto a temephos quanto a

piretróide (Montella e cols., 2007).

As GSTs (Glutationa-S-Transferases) estão envolvidas na

resistência aos organofosforados (Fournier e cols., 1992), organoclorados

(Grant e Hammock, 1992; Ortelli e cols., 2003) e aos ciclodienos (Reidy e cols.,

1990). Apesar de estudos correlacionando elevados níveis de GST com

resistência a piretróides em diversos insetos (Grant e Matsumura, 1989; Reidy

e cols., 1990; Lagadic e cols., 1993), estas enzimas parecem não estar

diretamente envolvidas na detoxificação deste inseticida (Kostaropoulos e cols.,

2001). Glutationa-S-Transferases estão sendo apontadas como enzimas que

possuem um papel importante na prevenção ou no reparo dos danos oxidativos

induzidos pela exposição a piretróides (Vontas e cols., 2001; Enayati e cols.,

2005).

1.9.1.2) Resistência aos piretróides por modificação do sítio-alvo

Atualmente sabe-se que o sítio-alvo dos piretróides é o sistema

nervoso central (SNC), mais precisamente o canal de sódio regulado por

voltagem (CSRV), o mesmo alvo do DDT. Esta descoberta ocorreu devido a

observações de que insetos susceptíveis ao piretróide morrem de paralisia,

semelhante à morte provocada pelo DDT e chamada de efeito Knockdown.

Após poucos anos de utilização do DDT, foram descritas linhagens

de moscas domésticas resistentes a este inseticida e que não sofriam paralisia

seguida de morte (knockdown), ou apresentavam paralisia temporária, seguida

de total recuperação locomotora após exposição. Este fenótipo ficou conhecido

como fenótipo kdr (“knockdown resistance”, definido por Milani, 1954), e

também foi observado em insetos resistentes aos piretróides, inclusive em Ae.

aegypti, caracterizando resistência cruzada entre DDT e piretróides

(Hemingway, 2000).

A partir destas evidências, estudos têm sido feitos na tentativa de

desvendar os mecanismos moleculares envolvidos no fenótipo kdr (Vais e

cols., 2000; Zhao e cols., 2000; Liu e cols., 2002; Tan e cols., 2002; Saavedra-

Rodriguez e cols., 2007).

Várias mutações no CSRV foram encontradas em diversos insetos e

relacionadas com a resistência a piretróide. A mutação mais freqüente está

20

associada à substituição de uma leucina (Leu) por uma fenilanina (Phe) em

uma região específica do canal de sódio, homóloga entre várias espécies de

insetos (Lüleyap e cols., 2002; Enayati e cols., 2003; Lee e cols., 2003;

Soderlund e Kniple, 2003). Porém, esta mutação ainda não foi descrita em Ae.

aegypti.

Martins (2005), na tentativa de desenvolver uma técnica para

detectar, nas populações de Ae. aegypti do Brasil, alterações no CSRV

relacionadas com a resistência a piretróide, seqüenciou a região que contém a

mutação clássica Leu/Phe (região IIS6) do CSRV em espécimes do vetor

resistentes ao piretróide cipermetrina de várias populações do país. A mutação

kdr clássica não foi encontrada em nenhuma seqüência analisada, mas outra

mutação foi detectada (a substituição de uma Ile por uma Met, três códons

acima da posição da mutação clássica).

Embora muitos estudos venham sendo feitos na tentativa de elucidar

os mecanismos moleculares que conferem resistência aos piretróides, pouco

se sabe sobre as alterações biológicas em insetos vetores provocadas pela

resistência a este inseticida.

1.10) Fatores que Influenciam a Resistência a Inseticidas

Os principais processos que influenciam a dinâmica da resistência

são: mutação, seleção, deriva gênica e migração. Estes processos determinam

a freqüência de alelos resistentes em uma população antes da introdução de

dado inseticida na área. Contudo, seleção e fluxo gênico passam a ser

processos mais importantes quando o inseticida já tem utilização generalizada

na área e estes são os processos sobre os quais há maior possibilidade de

manipulação para influenciar a evolução da resistência (IRAC-BR, 2008).

Georghiou e Taylor, em 1977a,b, classificaram os fatores que

influenciam o processo evolutivo da resistência a inseticida como: fatores

operacionais, fatores genéticos e fatores biológicos.

• Fatores operacionais: são determinados diretamente pela aplicação do

inseticida. São eles: natureza química do inseticida, produtos

anteriormente utilizados, persistência de resíduos, freqüência de

aplicação, estágio de vida exposto, concentração aplicada, modo de

21

aplicação, grau de cobertura e dimensão da área tratada (Georghiou e

Taylor, 1977a).

• Fatores genéticos: determinados pela freqüência inicial de alelos

resistentes, número de alelos envolvidos na resistência, dominância dos

alelos resistentes, vantagem ou desvantagem adaptativa dos indivíduos

resistentes (Georghiou e Taylor, 1977b).

• Fatores biológicos: divididos em fatores bióticos e comportamentais.

Bióticos: número de gerações por ano, progênie produzida a cada

geração, monogamia/poligamia, tamanho da população.

Comportamentais: isolamento, mobilidade e migração,

monofagia/polifagia, sobrevivência e presença de refúgio (Georghiou e

Taylor, 1977b).

Estes fatores, juntos, influenciam a evolução da resistência em uma

população. Os dois últimos fatores são de difícil manipulação no manejo da

resistência, porém são extremamente importantes no aspecto preditivo da

evolução do fenômeno (IRAC-BR, 2008).

A pressão de seleção com inseticida em laboratório nos permite

estudar, de modo controlado, e prever a evolução da resistência e os

mecanismos envolvidos, para, por exemplo, antecipar o efeito de um novo

inseticida introduzido em um programa de controle (Mckenzie e Batterham,

1998).

1.11) Efeitos Pleiotrópicos Relacionados à Resistência a Inseticidas

A resistência a tóxicos é um bom modelo para investigar quando

mudanças adaptativas estão associadas a custos no fitness (Chevillon e cols.,

1997). Existe pouco conhecimento a respeito das bases genéticas de traços

associados à resistência, porém informações neste sentido podem ser

verdadeiros exemplos de efeitos pleiotrópicos, nos quais um gene influencia

mais de um aspecto no fenótipo do organismo (Foster e cols., 2003).

Considera-se que, em geral, genes cuja freqüência aumenta em

resposta à adaptação a um novo ambiente (novo parasita, variações climáticas,

mudanças químicas) devem ter custo no fitness, nos ambientes originais; este

conceito deriva precisamente de sua baixa freqüência em modelos de

22

ambientes anteriores (Fisher, 1958; Holloway, 1990; Carrière e cols., 1994).

Isto é geralmente dito com base na visão de que recursos são re-alocados para

esta adaptação e que processos metabólicos ou de desenvolvimento são

afetados (Davies e cols., 1996).

Existem poucas situações em que são claramente identificados

determinados genes relacionados a adaptações. A resistência a inseticidas é

uma destas situações. Um exemplo disto é a resistência a dieldrin, diazinon e

malathion em Lucilia cuprina (Wiedemann, 1830) (Diptera: Calliphoridae)

(Mckenzie e cols., 1982; Clarke e Mckenzie, 1987; Mckenzie e Clarke 1988;

Mckenzie, 1993; Mckenzie e O‘Farrell, 1993). Para cada um destes inseticidas,

existência de resistência envolve substituição alélica. Foi observada assimetria

(diferenças entre o lado esquerdo e direito de organismos com simetria

bilateral) nos indivíduos resistentes, que foi associada a alelos denominados

Rdl, que codificam os receptores de GABA, alvo dos ciclodienos. Foi observado

também um maior tempo no desenvolvimento em indivíduos resistentes

quando comparados aos susceptíveis. Os fenótipos assimetria de corpo e

tempo de desenvolvimento tiveram correlação significativa e positiva com a

resistência (Mckenzie e Game, 1987).

Postula-se que os insetos resistentes possuem vantagem adaptativa

em comparação com os susceptíveis, uma vez que sobrevivem à aplicação do

inseticida (Roush e Mckenzie, 1987; Chareonviriyaphap e cols., 1997).

Contudo, Mebrahtu e cols. (1997) observaram alterações na taxa de

fecundidade, no tempo entre o repasto sangüíneo e a oviposição e ainda no

tempo gasto na oviposição de espécimes de Ae. aegypti resistentes ao

piretróide permetrina, quando comparados aos susceptíveis. Diminuições na

produção de ovos, na taxa de eclosão e na sobrevivência das larvas de Ae.

aegypti também foram verificadas após seleção com DDT, inseticida da classe

dos organoclorados (Abedi e Brown, 1961). Estas observações apontam para

interferência dos inseticidas com a capacidade vetorial de espécies envolvidas

na transmissão de patógenos.

Estudos relacionados à resistência a inseticidas e alterações no

fitness também foram realizados em Coleoptera (Beeman e Nanis, 1986; Follet

e cols., 1993; Haubruge e Arnaud, 2001). Follet e colaboradores (1993)

23

observaram que o peso das larvas resistentes à permetrina era menor que a

das sensíveis.

Os custos no fitness, ou life history (tabela de vida), são geralmente

investigados através de comparações de parâmetros biológicos como tempo de

desenvolvimento, fecundidade, taxas de crescimento, que são avaliados em

condições ótimas de laboratório (Foster e cols., 2003).

Brewer e Trumble (1991) avaliaram, em Spodoptera exigua (Hubner)

(Lepidoptera: Noctuidae) selecionada em laboratório, por seis gerações, para

resistência a fenvelerato, alguns parâmetros da tabela de vida. Foi observado

aumento no tempo de desenvolvimento (número de dias da oviposição à

pupação) e diminuição na taxa de fecundidade (número de ovos postos) na

população selecionada em comparação com a susceptível e com a proveniente

do campo (resistente, mas não selecionada em laboratório).

1.12) Seleção em Laboratório

Com a finalidade de avaliar a evolução do fenômeno resistência,

muitos estudos de pressão de seleção têm sido feitos em laboratório com

diversos inseticidas.

A partir de registros da ocorrência de larvas de Ae. aegypti

resistentes ao DDT em várias localidades da América Latina e no Vietnã,

estudos foram realizados com seleção em laboratório com DDT, a fim de

predizer se populações de Ae. aegypti, mantidas sob condições controladas,

eram capazes de desenvolver resistência e quando esta atingiria níveis

perceptíveis na população (Abedi e Brown, 1961). Estudos de seleção em

laboratório com DDT foram realizados em cepas de Ae. aegypti da Nigéria

(Surtees, 1958), Malásia (Shidrawi, 1957; Abedi e Brown, 1960) e com

populações da América do Norte (algumas localidades do Caribe e Nova

Orleans) (Abedi e Brown, 1961). A estratégia de pressão de seleção em

laboratório para a resistência a DDT também foi utilizada para vetores da

malária, como Anopheles culicifacies Giles, 1901 (Diptera: Culicidae) e

Anopheles stephensi Liston, 1901 (Diptera: Culicidae) (Curtis e cols., 1978).

Posteriormente, estudos de seleção foram feitos com outros

inseticidas que passaram a ser utilizados. Estes estudos eram feitos não mais

24

para predizer o aparecimento de resistência, como foi feito com o DDT em

algumas localidades, mas para estudar os mecanismos relacionados à

resistência.

Vulule e colaboradores, em 1999, avaliaram a resistência de uma

colônia de Anopheles. Gambiae Giles, 1902 (Diptera: Culicidae) ao piretróide

permetrina sob duas condições: com e sem inibidor de Monooxigenases

(P450). O objetivo foi verificar o papel destas enzimas na resistência ao

piretróide. Foi observada mortalidade significativamente maior para a

população exposta ao inseticida com o inibidor, comparável à mortalidade de

uma população susceptível e não selecionada. A primeira mostrou níveis de

P450 e de Esterases significativamente maiores. Segundo os autores, isto

confirma que Esterases e Oxidases metabolizam permetrina.

Outro estudo de seleção em laboratório e avaliação de mecanismos

de resistência foi realizado com cepas de Ae. aegypti pressionadas com o

organofosforado malathion. Após cinco gerações, bioensaios com outros

inseticidas (organofosforados e piretróides) foram realizados para verificar

resistência cruzada. Surpreendentemente, não foi observado aumento da

resistência ao organofosforado malathion, inseticida usado para a seleção.

Porém foi observada resistência a piretróides, principalmente à deltametrina.

Além disso, ensaios bioquímicos de quantificação da atividade das Esterases,

GSTs e Acetilcolinesterases, realizados para determinar os mecanismos de

resistência possivelmente selecionados, detectaram aumento somente na

atividade de GSTs (Rodríguez e cols., 2003).

Em outros estudos com piretróides, foram selecionados Culex

quinquefasciatus Say, 1823 (Diptera: Culicidae), com permetrina (Xu e cols.,

2005) e Ae. aegypti, com deltametrina (Rodríguez e cols., 2005). O primeiro

mostrou alterações em todas as famílias de enzimas: P450, GSTs e Esterases.

O segundo mostrou alterações nos níveis de GSTs e Esterases; porém

experimentos com sinergistas mostraram que esta elevada atividade de

Esterase não estaria relacionada à resistência a piretróide.

No Brasil, o adulticida piretróide está sendo usado em escala

nacional desde 2000; contudo, já em 2003 foram detectadas populações

resistentes ao inseticida (Da-Cunha e cols. 2005). Por outro lado, estudos

preliminares mostraram que, em laboratório, em poucas gerações algumas

25

populações perdiam a resistência se mantidas na ausência do inseticida (Da-

Cunha e cols., 2005), sugerindo que a resistência poderia estar correlacionada

com menor viabilidade e potencial reprodutivo (fitness).

Racionalizamos que, por meio de pressão de seleção com os

piretróides atualmente utilizados no controle no país, e fixando-se

determinadas variáveis no laboratório, seria possível avaliar de forma

controlada se há alguma relação entre resistência e parâmetros ligados ao

fitness de uma população. Com esta intenção, a partir de uma população de

campo, mantivemos colônias em laboratório em duas condições: com e sem

deltametrina, piretróide utilizado atualmente no país para o controle de adultos.

Avaliamos, em algumas gerações, fatores relacionados à capacidade vetorial.

Os mesmos parâmetros foram também avaliados em algumas populações de

campo com diversos níveis de resistência, sem que tivessem passado pelo

processo de seleção em laboratório. Desta forma, esperamos conhecer melhor

a dinâmica de aquisição de resistência em populações de Ae. aegypti, bem

como investigar potenciais conseqüências deste processo em alguns aspectos

da fisiologia do vetor.

26

2) OBJETIVO

2.1) Objetivo Geral

Verificar, sob condições controladas, se a resistência a inseticidas compromete

aspectos do desenvolvimento, reprodução e viabilidade de populações

brasileiras de Ae. aegypti.

2.2) Objetivos Específicos

2.2.1) Manter uma população natural de Ae. aegypti, já resistente ao piretróide

deltametrina, em condições de laboratório por sucessivas gerações, na

presença e na ausência de pressão de seleção com este mesmo adulticida.

2.2.2) Avaliar, nas colônias acima mencionadas, vários aspectos relacionados

à capacidade vetorial:

a) cinética de desenvolvimento dos estágios imaturos

b) proporção entre machos e fêmeas

c) longevidade dos adultos

d) aceitação do repasto sangüíneo

e) volume de sangue ingerido

f) taxa de paridade das fêmeas

g) número de ovos postos

h) viabilidade dos ovos

2.2.3) Avaliar, em populações de campo de Ae. aegypti com diferentes níveis

de resistência a inseticidas usados no Programa Nacional de Controle da

Dengue, os mesmos parâmetros relacionados à capacidade vetorial acima

descritos.

2.2.4) Avaliar, nas colônias selecionadas em laboratório, potenciais diferenças

na competência vetorial, por meio de infecção experimental com vírus

dengue.

27

3) MATERIAL E MÉTODOS

3.1) Populações de Ae. aegypti

Para a realização deste trabalho, foram utilizados mosquitos Ae.

aegypti da cepa Rockefeller (“Rock”) e de várias populações coletadas no

campo: Natal (RN), Cuiabá (MT), Uberaba (MG), Aparecida de Goiânia (GO),

Maceió (AL) e Henrique Jorge (CE) (Figura 3.1). A linhagem Rockefeller foi

estabelecida em 1959 no Rockefeller Institute (Nova York, NY) e desde então é

utilizada por laboratórios de todo o mundo como cepa de referência para

fecundidade, vigor e susceptibilidade a inseticidas (Hartberg e Craig, 1970).

As populações avaliadas foram originadas de coleta de ovos de

Aedes, por meio de ovitrampas (Braga e cols., 2004), nas cidades de origem,

por solicitação da Secretaria de Vigilância em Saúde, Ministério da Saúde

(SVS-MS) ao Núcleo de Entomologia da Secretaria de Saúde de cada Estado.

As ovitrampas foram preparadas de acordo com Fay e Eliason (1966). O

número de ovitrampas instaladas foi baseado no número de moradias em cada

município amostrado (como medida indireta da densidade populacional):

municípios com até 60.000 moradias recebiam 100 ovitrampas, de 60.000 a

120.000 residências, 150 ovitrampas, de 120.000 a 500.000, recebiam 200

ovitrampas e em localidades acima de 500.000 eram instaladas 300 ovitrampas

(Lima e cols., 2003). Em todos os casos as ovitrampas eram distribuídas de

forma a cobrir o município da forma mais abrangente possível. As ovitrampas

permaneciam no campo de cinco a sete dias. Os ovos, enviados ao laboratório,

foram postos a eclodir e as larvas foram mantidas até a emergência dos

adultos, quando foi feita triagem da espécie de interesse (Ae. aegypti) para

produção maciça de ovos (geração F1).

Estas coletas foram realizadas no âmbito da Rede Nacional de

Monitoramento da Resistência de Aedes aegypti a Inseticidas (MoReNAa), da

qual o LAFICAVE faz parte. A Rede MoReNAa avalia, entre outros, o perfil de

susceptibilidade das populações do vetor aos inseticidas empregados no país,

bem como os potenciais mecanismos envolvidos.

Ovos da geração F1 das populações coletadas em Cuiabá (MT),

Uberaba (MG), Aparecida de Goiânia (GO), Maceió (AL) e Henrique Jorge (CE)

foram postos a eclodir e as larvas e adultos criados de acordo com o item

28

3.1.1. Os adultos foram alimentados em cobaios e a postura obtida foi

denominada geração F2. Com estes ovos foram realizados os experimentos de

avaliação de vários parâmetros da capacidade vetorial (item 3.4).

A população proveniente da cidade de Natal foi destinada à

manutenção de colônias (“grupos”) na presença e na ausência de pressão de

seleção com inseticida (item 3.3).

Figura 3.1: Mapa do Brasil. As localidades avaliadas estão marcadas em vermelho.

3.1.1) Manutenção de larvas e adultos de Ae. aegypti

No LAFICAVE, grupos de 500 larvas de Ae. aegypti são criadas em

bacias plásticas com tampas teladas medindo 27 cm de comprimento, 19 cm

de largura e 7 cm de altura, contendo 1 L de água desclorada e alimentadas

com 0,5 g de ração para gatos triturada a cada três dias (Friskies, Purina,

Camaquã/RS). Para todos os experimentos realizados abaixo, as larvas foram

Cuiabá

Ap. de Goiânia

Uberaba

Henrique Jorge

Natal

Maceió

29

criadas em estufa tipo B.O.D. à temperatura constante de 28°C, segundo

metodologia previamente padronizada no laboratório (Ribeiro, 2006).

As pupas foram transferidas diariamente para gaiolas cilíndricas de

papelão, medindo 16,5 cm de diâmetro por 17,5 cm de altura (denominadas

“gaiolas grandes”), onde os adultos emergem. Aos adultos foi fornecida solução

de açúcar a 10% para a alimentação de machos e fêmeas. A não ser quando

indicado, os adultos foram mantidos em insetário à temperatura de 25 ± 1ºC.

Para obtenção de postura, fêmeas foram alimentadas em cobaios, de

acordo com protocolo aprovado pelo Comitê de Ética para o Uso de Animais,

da Fundação Oswaldo Cruz (CEUA - Fiocruz). Na rotina de criação, três dias

após o repasto sangüíneo, um recipiente com água desclorada contendo papel-

filtro é introduzido na gaiola e, 72 horas depois, as posturas são retiradas. Os

ovos permanecem por um período de pelo menos dois dias em B.O.D. ou no

insetário, até que a água contida no recipiente evapore, deixando-os totalmente

secos.

O procedimento acima descrito foi adotado tanto para a manutenção

da cepa Rockefeller como para as populações de campo. Os ovos utilizados

para os experimentos abaixo ficaram armazenados em estufa B.O.D. à

temperatura de 25°C.

3.2) Perfil de Susceptibilidade a Inseticidas

As populações usadas neste trabalho tiveram seu status de

susceptibilidade avaliado no âmbito do MoReNAa. Bioensaios com temephos

(larvicida utilizado no controle) e deltametrina (adulticida) foram feitos,

respectivamente, com larvas L3 (ver procedimento em Lima e cols., 2003) e

com fêmeas adultas, de 1-2 dias de emergência, em garrafas impregnadas

com inseticida (de acordo com Da-Cunha e cols., 2005).

3.2.1) Bioensaios com larvas

Estes testes foram realizados de acordo com as recomendações da

OMS (1981), utilizando-se várias concentrações de temephos, com o objetivo

de quantificar o status de susceptibilidade das populações ao inseticida. Para

cada teste foram utilizadas nove concentrações do inseticida, com quatro

30

réplicas por concentração, cada réplica contendo 20 larvas em 100 mL de

solução. Desta forma, para cada teste foram utilizados, no total, 40 copos (36

“expostos” e quatro controles), o que corresponde a 800 larvas por teste. Para

cada população, o teste foi repetido quatro vezes.

3.2.2) Bioensaios com adultos

Os bioensaios com adulticida foram realizados de acordo com

método proposto por Brogdon e McAllister (1998), adaptado no laboratório para

piretróides (Da-Cunha e cols., 2005). Para cada teste foram usadas três

garrafas impregnadas com deltametrina e uma com o solvente.

Aproximadamente 15 fêmeas, de um a dois dias pós-emergência, foram então

expostas em cada garrafa. Foram realizados pelo menos três testes para cada

população. A mortalidade foi registrada após 30 e 120 minutos de exposição.

Após este tempo, as fêmeas foram transferidas para gaiolas de papelão de 9,0

cm de diâmetro e 9,5 cm de altura (denominadas “gaiolas pequenas”), para

recuperação, e a mortalidade foi novamente registrada 24 horas depois.

3.3) Manutenção de Grupos de Ae. aegypti em Laboratório na Presença ou

Ausência de Piretróide

A seleção de grupos de Ae. aegypti na presença e na ausência do

piretróide deltametrina foi realizada em parceria com projeto de Doutorado em

curso no nosso laboratório (em estudo que avalia mecanismos bioquímicos e

moleculares envolvidos com a resistência a piretróide), a partir de população de

campo. A população inicial foi originada da coleta de ovos de Aedes, por meio

de ovitrampas (Braga e cols., 2004), na cidade de Natal (RN), por solicitação

ao Núcleo de Entomologia da Secretaria de Saúde do Estado do Rio Grande

do Norte, intermediada pela SVS-MS. Os ovos da geração parental foram

enviados ao laboratório, postos a eclodir e as larvas, mantidas até a

emergência dos adultos, quando foi feita triagem da espécie de interesse (Ae.

aegypti) para produção maciça de ovos.

A eclosão destes ovos e subseqüente criação das larvas geraram

adultos (parentais) que foram separados ao acaso em dois grupos. Um destes,

o grupo “S”, foi separado em três subgrupos (S1, S2 e S3), que foram mantidos

31

em suas respectivas gaiolas, onde se procedeu à produção de ovos para a

próxima geração, sem troca de indivíduos entre os três subgrupos. Os

indivíduos de cada subgrupo foram mantidos separadamente ao longo das

gerações. Para a manutenção destas colônias, a cada geração, uma gaiola de

cada subgrupo era montada com 200 fêmeas de 3-5 dias pós-emergência, às

quais eram oferecidas três sucessivas alimentações sangüíneas, semanais,

seguidas de oviposições. Estas gaiolas foram mantidas em estufa B.O.D. a

25ºC.

Para o outro grupo, “R”, as fêmeas parentais foram submetidas à

seleção com inseticida (item 3.3.1), e as sobreviventes foram divididas ao

acaso em três subgrupos: R1, R2 e R3. Tal qual no grupo “S”, estes subgrupos

foram criados separadamente; nos subgrupos “R” o processo de seleção das

fêmeas foi feito a cada geração.

Excluindo-se a seleção com piretróide, todas as colônias foram

mantidas nas mesmas condições. Os diferentes aspectos da capacidade

vetorial (item 3.4) foram avaliados em três gerações: F1, F3 e F9.

3.3.1) Seleção do grupo “R”

A cada geração, grupos de 30 fêmeas de cada subgrupo (R1, R2 e

R3), 3 a 5 dias após a emergência, foram confinados em garrafas de vidro

impregnadas com uma dose de deltametrina letal para 50-80% da população

(adaptado de Da-Cunha e cols., 2005). As fêmeas permaneceram nestas

garrafas, expostas ao inseticida, por 1 hora e, em seguida, foram transferidas

para gaiolas de papelão pequenas, livres do inseticida. Após 24h, as fêmeas

sobreviventes, consideradas resistentes (Da-Cunha e cols., 2005), foram

transferidas para suas respectivas gaiolas de papelão (grandes) e mantidas,

assim como o grupo “S”, em estufa B.O.D. a 25 ºC. De acordo com os testes

realizados no âmbito do MoReNAa, a dose diagnóstica (menor dose que mata

100% da cepa susceptível Rockefeller) para os testes com deltametrina é 5 µg

por garrafa. Definimos as doses utilizadas de modo que estas matassem cerca

de 50% da população, para obtermos quantidade suficiente de indivíduos para

a próxima geração. A dose inicial utilizada nos testes de seleção foi de 1,5 µg,

A seleção foi repetida de modo que, ao final do teste, obtivéssemos cerca de

200 fêmeas vivas, em cada subgrupo, para a alimentação e obtenção de

32

postura para a próxima geração. A quantidade fixa de fêmeas nas gaiolas a

cada geração descarta o efeito da deriva genética e também evita a diminuição

da variabilidade genética nas seleções.

É importante frisar que nosso insetário, sediado no Laboratório de

Entomologia do Instituto de Biologia do Exército, passou por recente adaptação

às exigências das normas de biossegurança (Adegas e cols., 2005) e está apto

à realização destes ensaios.

3.4) Avaliação de Diferentes Aspectos da Capacidade Vetorial

Os experimentos para avaliação de aspectos da capacidade vetorial

foram realizados nas gerações F1, F3 e F9, separadamente com os subgrupos

de S (S1, S2 e S3) e R (R1, R2 e R3) e com as populações de campo (ver item

3.1). Em todos os casos, foram realizados ensaios em paralelo com a linhagem

Rockefeller, usada como controle de susceptibilidade a inseticidas. Com

exceção dos ensaios de longevidade, todos os testes foram realizados duas

vezes, e em duplicata, para cada subgrupo (S1-3 e R1-3) e para as

populações.

3.4.1) Cinética de pupação / desenvolvimento larvar

Ovos dos grupos, das populações e da cepa Rockefeller foram

estimulados à eclosão em água rica em matéria orgânica. Após a eclosão,

grupos de 200 larvas foram contados e transferidos, com o auxílio de uma

pipeta plástica descartável (Bio-Rad), para bacias plásticas contendo um litro

de água desclorada, como descrito no item 3.1.1, cobertas com tampa telada.

As larvas foram alimentadas, já nas bacias, no primeiro dia após a

eclosão e no quarto dia de desenvolvimento, com 0,5g de ração para gatos

triturada (Friskies, Purina, Camaquã/RS). O alimento foi primeiramente

misturado a um pequeno volume de água e depois despejado na bacia de

criação (Ribeiro, 2006).

A cinética de formação de pupas foi acompanhada diariamente, até o

término do desenvolvimento larvar, por meio de contagem e retirada das pupas

das bacias.

33

3.4.2) Proporção de machos e fêmeas

As pupas retiradas diariamente do experimento anterior (item 3.4.1)

foram transferidas para gaiolas grandes, onde os adultos emergiram. As

gaiolas foram mantidas no insetário. Aos adultos foi fornecida solução de água

açucarada a 10% para a alimentação de machos e fêmeas. Completada a

emergência de todos os adultos, foi realizada a contagem de indivíduos

machos e fêmeas presentes em cada gaiola proveniente de criação de uma

amostragem de 200 larvas.

3.4.3) Quantidade de sangue ingerido

O repasto sangüíneo das fêmeas é um requisito essencial para a

produção de ovos. Para avaliar este parâmetro, larvas dos grupos, das

populações de campo e de Rockefeller, foram criadas de acordo com o item

3.4.1. Os adultos foram mantidos em gaiolas, com fonte de água açucarada, no

insetário. A alimentação sangüínea foi oferecida, no quinto dia pós-emergência,

a fêmeas privadas da solução açucarada por 24 horas (este procedimento

aumenta a eficiência do repasto sangüíneo). A alimentação foi feita por cerca

de 30 minutos em cobaios anestesiados, como descrito no item 3.1.

Para quantificar o volume de sangue ingerido pelas fêmeas, de cada

gaiola foram pesados, antes e após a ingestão de sangue, 3 grupos de 10

fêmeas. Em todos os casos, as fêmeas foram anestesiadas em tubos contendo

acetato de etila durante alguns segundos. O peso destes mosquitos foi aferido

em balança analítica (APX – 200, Denver Instrument).

3.4.4) Taxa de fêmeas que realizam postura, número de ovos postos e

viabilidade dos ovos

Para avaliar a taxa de fêmeas que realizam postura, separamos 30

fêmeas inseminadas de cada subgrupo ou população e de Rockefeller. As

fêmeas foram induzidas a realizar postura individual três dias depois da

alimentação sangüínea, de acordo com procedimento adaptado de Valencia e

cols. (1996), que inclui a transposição dos espécimes para placas de Petri de 6

cm de diâmetro, invertidas, com papéis-filtro no fundo. Cada papel foi

umedecido com 700 µL de água desclorada. As placas contendo as fêmeas

34

grávidas foram colocadas em uma câmara úmida por um período de 24 horas

em uma estufa tipo B.O.D., com temperatura constante de 26ºC. Após a

postura, as fêmeas foram retiradas e as placas postas para secar por mais 24

horas na mesma estufa. Após a secagem do papel-filtro contendo os ovos,

foram quantificados tanto o número de fêmeas que colocaram ovos quanto o

número de ovos por fêmea em cada grupo.

Para avaliar a viabilidade dos ovos, sete dias depois da oviposição,

10 placas de cada subgrupo, das linhagens e da cepa Rockefeller (contendo

posturas individuais do experimento acima) foram escolhidas ao acaso. Os

ovos foram submersos em água rica em matéria orgânica, como estímulo à

eclosão, por um período de 24 horas. O número de larvas que eclodiu nesse

período foi registrado.

3.4.5) Longevidade de adultos

Ovos dos subgrupos e das populações de campo, em paralelo com

Rockefeller, foram postos a eclodir em água rica em matéria orgânica (água de

bacias de criação). As larvas foram criadas em estufa tipo B.O.D. a 28ºC, como

indicado no item 3.1.1. Os adultos recém-emergidos foram distribuídos em

suas respectivas gaiolas grandes (duas gaiolas para cada subgrupo, duas

gaiolas para cada população e duas para a cepa Rockefeller), cada uma delas

contendo 100 casais. Aos adultos foi fornecida solução de sacarose a 10%

como fonte de alimentação contínua. A mortalidade de machos e fêmeas de

cada gaiola foi registrada separadamente, a cada dois dias, por cerca de 90

dias.

Ensaios com gaiolas de diferentes gerações foram realizados em

momentos diferentes e, embora flutuações no insetário possam resultar em

diferenças na longevidade ao longo das gerações, a cepa Rockefeller foi

sempre avaliada em paralelo.

3.5) Ensaios com o Vírus DENV-II

O vírus necessita de um tempo para incubação e disseminação no

corpo do vetor até torná-lo infectivo, ou seja, até estar apto a ser transmitido a

outro hospedeiro. Um parâmetro freqüentemente utilizado para estimar a

35

competência vetorial é a verificação da infectividade do vetor após o tempo

necessário para incubação e disseminação do vírus (Gubler e cols., 1979;

Tardieux e cols., 1990; Lourenço de Oliveira e cols., 2003; Schneider e cols.,

2007). Utilizamos fêmeas dos subgrupos R e S da geração F3 e, como

linhagens controle, Rockefeller e KHW1.

3.5.1) Obtenção das amostras de vírus

As amostras de vírus DENV-II foram isoladas pelo Laboratório de

Flavivirus do Instituto Oswaldo Cruz (IOC) (Schatzmayr, 2000). As amostras

foram cultivadas em cultura de células C6/36, derivadas de mosquitos Aedes

albopictus (Lourenço-de-Oliveira e cols., 2003; Castro e cols., 2004) e tituladas

após sucessivas passagens. As amostras virais foram inoculadas em garrafas

(Cell Culture Flask-Tissue Culture treated – Costar USA, 25 cm²) contendo

monocamada de células C6/36 cultivadas em 10 mL de meio L15 Leibovitz

(Sigma-USA) e 2% de soro bovino fetal (SFB-Gibco-Brl, USA). Depois de 10

dias de incubação em estufa tipo B.O.D. a 28ºC, o material foi recolhido e as

células infectadas em suspensão foram retiradas e diluídas em série. Estas

diluições foram inoculadas em tubos de hemólise sobre uma camada de

células C6/36. A inoculação e as titulações foram feitas no Laboratório de

Flavivirus do IOC, de acordo com os procedimentos definidos por Castro

(2001).

Para os testes a seguir, foram utilizadas as titulações virais de 103,

104, 105, 106, 107, 108 TCID502 por 0,1 mL.

3.5.2) Infecção artificial

Fêmeas de 5 dias de vida adulta foram separadas em gaiolas

grandes de papelão e levadas ao infectório do Laboratório de Transmissores

de Hematozoários, do IOC. Estas fêmeas foram alimentadas com solução

açucarada a 10% até a véspera da infecção.

Para a alimentação sangüínea infectante, foi preparada solução

contendo 1/3 de suspensão viral de DENV-II (nas titulações testadas), 1/3 de

1 Mosquitos de olho branco, cuja mutação foi descrita por Bhalla (1968). Foi utilizado juntamente com Rockefeller para testes com diferentes titulações virais. 2 TCID50 = Tissue culture infective dose of virus; indica o título viral capaz de infectar 50% das celulas de um cultivo em dada diluição (método proposto por Reed e Muench, 1938).

36

eritrócitos de coelho (obtidos a partir de sangue desfibrinado), 1/3 de soro fetal

bovino (SFB); ATP foi usado como fagoestimulante (Castro e cols., 2004;

Lourenço-de-Oliveira e cols., 2004). Este preparado de sangue infectado foi

transferido para aparatos destinados à alimentação artificial (cerca de 3 mL de

sangue por condição experimental) (Rutledge e cols., 1964), que possuem em

seu fundo uma membrana artificial (parafilme) que fica sobre a tela da gaiola

dos mosquitos. Aos aparatos é conectado um banho-maria, com circulação,

que mantém a água a 37ºC ao seu redor (Figura 3.2). A alimentação foi

oferecida durante 30 minutos.

Ao final deste processo, os mosquitos eram anestesiados a frio e

somente as fêmeas que se alimentaram foram aproveitadas. Os mosquitos

foram mantidos em gaiolas pequenas, em estufa B.O.D. a 28°C e umidade

relativa de 70-80%, durante 14 dias (período de incubação extrínseco do vírus)

e alimentados com solução açucarada. No 14°dia após a ingestão de sangue,

as fêmeas sobreviventes foram anestesiadas em banho de gelo e rapidamente

criopreservadas em freezer a -70°C.

Em um primeiro experimento, foi realizada infecção nos grupos R e S

da geração F3, além da cepa Rockefeller, com uma titulação de 108 TCID.

Após 14 dias de incubação, não obtivemos sobreviventes em nenhum caso.

A partir deste resultado, achamos que a titulação utilizada poderia ter

sido a causa da mortalidade dos mosquitos. Partindo deste pressuposto,

decidimos calibrar a titulação viral a ser utilizada, de modo que um maior

número de mosquitos permanecesse vivo até o final do período de incubação.

As diluições do vírus utilizadas e avaliadas ao final de 14 dias foram: 103, 104,

105, 106, 107 e 108 TCID. Para este ensaio, utilizamos fêmeas de Rockefeller e

KHW.

37

Figura 3.2: Exemplo de alimentador artificial utilizado em infecções virais. Retirado de Lima (1999).

3.5.3) Análise das amostras infectadas

As fêmeas alimentadas e congeladas a -70°C provenientes do

experimento com as titulações virais tiveram seus corpos e cabeças separados,

com o auxílio de lâminas de bisturi, transferidos individualmente para tubos tipo

Eppendorf e macerados, respectivamente, em 300 e 150 µL de meio L15,

contendo antibiótico (Sigma-USA). Estes macerados foram centrifugados a

6.000 rpm, a 4°C por 45 minutos em minicentrífuga tipo Eppendorf. Os

sobrenadantes foram transferidos para outros tubos contendo 30% do volume

da amostra de soro fetal bovino (SFB): 90 e 45 µL para os sobrenadantes de

corpos e cabeças, respectivamente. Estes tubos foram devidamente

numerados, datados e congelados a -70°C para a posterior extração do RNA

viral.

3.5.3.1) Extração de RNA viral

Para a extração do RNA viral, foi utilizado QIAmp Viral Mini Kit

(Qiagen, Inc., Valencia, CA, Estados Unidos) de acordo com o protocolo

descrito pelo fabricante. Em tubos de 1,5 mL foram pipetados 560 µL de

tampão AVL (com agentes caotrópicos, para inativação de RNAses). Aos

tubos, foram adicionados 140 µL da amostra; seguiu-se agitação em “vortex”

durante 15 segundos e uma rápida centrifugação (“spin”). Os tubos foram então

deixados sobre a bancada à temperatura ambiente por 10 minutos, após o que

se adicionaram 560 µL de etanol em cada tubo. Depois de agitação e

38

centrifugação rápida, o material foi transferido para as colunas, em tubos de 2

mL, em duas etapas, cada qual com alíquotas de 630 µL. A cada transferência,

as colunas foram centrifugadas a 8.000 rpm por 1 minuto em minicentrífuga

tipo Eppendorf. O eluente presente no tubo de 2 mL foi descartado.

As colunas foram lavadas seqüencialmente com 500 µL de tampão

AW1 (tampão de lavagem), seguidos de centrifugação a 8000 rpm por 1

minuto, adição de 500 µL do tampão AW2 (tampão de lavagem) e

centrifugação a 14.000 rpm por 3 minutos. O eluente presente após as

centrifugações foi descartado.

A coluna foi então transferida para um tubo de 1,5 mL e a ela foram

adicionados 60 µL de tampão AVE (tampão de eluição do RNA contendo água

e azida sódica), permanecendo em incubação por 1 minuto. Em seguida,

centrifugou-se a 8.000 rpm por 1 minuto. De acordo com o protocolo do

fabricante, neste eluente final, que foi estocado a -70°C, deve ser encontrado o

RNA viral.

3.5.3.2) Detecção do vírus DENV-II por RT-PCR (transcrição reversa e

reação em cadeia da polimerase)

A retrotranscrição e a amplificação do cDNA foram feitas

seqüencialmente, no mesmo tubo de reação (processo conhecido como “one-

step”). Para a reação de RT-PCR, 10 µL de RNA extraído foram colocados em

tubos Eppendofs de 200 µL. Estes tubos contendo o RNA foram aquecidos a

75°C por 5 minutos e depois colocados em banho de gelo. Foram pipetados 48

µL do Mix 1 (ver tabela 3.1) e os tubos foram transferidos para o termociclador

(PX2 Thermal Cycler, Thermo Electron Corporation). Este equipamento foi

programado para um ciclo de 42°C/60 minutos, para a transcrição reversa,

seguido por 30 ciclos de desnaturação (94°C/35 segundos), anelamento

(55°C/1 minuto), extensão (72°C/2 minutos) e um ciclo de extensão final

(72°C/10 minutos), correspondentes à amplificação do cDNA (adaptado de

Lanciotti e cols., 1992).

Para incrementar o limite de resolução da amostra amplificada na

RT-PCR, foi realizada uma nova reação de PCR, com primers internos à

seqüência do produto amplificado na reação anterior (processo conhecido

como “Nested PCR”). Para tanto, adicionou-se 47 µL do Mix 2 (quadro 3.1) a 5

39

µl do produto da reação anterior, em um novo tubo de 200 µL. As reações

foram postas no termociclador e submetidas a 18 ciclos de desnaturação

(94°C/35 segundos), anelamento (55°C/1 minuto), extensão (72°C/2 minutos) e

um ciclo de extensão final (72°C/10 minutos). As seqüências dos primers

utilizados se encontram no quadro 3.2.

A visualização dos produtos amplificados foi feita com eletroforese,

em gel de agarose 1,5% em TBE 1X, de10 uL de amostra acrescidos de 2uL

de tampão de amostra (Loading dye 6X). Como marcador de peso molecular,

foi utilizado o DNA Ladder Plus que, entre 200 e 500 pb, tem indicadores a

cada 100 pares de bases (O’Gene Ruler 1 Kb DNA Ladder Plus, da Biolabs).

Ao final da eletroforese, o gel foi corado com brometo de etídio a 1 µg/mL.

A amostra utilizada como controle positivo foi gentilmente cedida pela

pesquisadora do Laboratório de Transmissores de Hematozoários, Márcia G.

Castro, e foi obtida através de quatro inoculações seqüenciais de vírus em

cultura de célula C6/36, para amplificação (Castro, comunicação pessoal). As

células foram então transferidas para garrafas e incubadas por 10-12 dias, para

obtenção de massa viral. Para titulação, a massa viral foi aliqüotada e

submetida à diluição em série, de 10-1 a 10-11. Estas diluições foram usadas

para infectar células C6/36, que permaneceram em estufa durante 10 dias,

apresentando efeito citopático. O título, calculado de acordo com o método de

Reed e Muench (1938), foi 108,23 TCD50.

Para avaliar a faixa de concentração mínima de RNA viral capaz de

ser amplificado e visualizado pela técnica, foi utilizado o controle positivo não

diluído e diluições de 102, 104 e 106 vezes.

40

Quadro 3.1: Volume dos reagentes utilizados nas reações de RT-PCR e “Nested” PCR.

Quadro 3.2: Seqüência dos primers utilizados. Os três primeiros primers foram utilizados para amplificar fragmentos do RNA viral DENV-II e os dois últimos para amplificar fragmentos do gene constitutivo da proteína rp49. *Lanciotti e cols., 1992; **Gentile e cols., 2005.

Reagentes Mix1 (RT-PCR) - µL Mix 2 (Nested PCR) - µL

Água 37 37

Tampão MgCl210X 4 4

Iniciador 1 (100µM) 0,13 0,13

Iniciador 2 (100µM) 0,13 0,5 (Iniciador TS2 100µM)

DTT (100mM) 0,25 ----

dNTPs (10mM) 4 4

AMV - RT (2,5U/µl) 0,1 ----

Taq Polimerase (5U/µl) 0,25 0,25

RNAsin (40U/µl) 0,25 ----

MgCl2 (50mM) 1,5 1,5

Primers Seqüência D1* 5´-TCAATATGCTGAACGCGCGAGAAACCG -3´ D2* 5´-TTGCACCAACAGTCAATGTCTTCAGGTTC-3´ TS2* 5´-CGCCACAAGGGCCATGAACAG-3´

5aeexpRP** 5´-GCTATGACAAGCTTGCCCCCA-3´ 3aeaquaRP1b** 5´-TCATCAGCACCTCCAGCTC-3´

41

4) RESULTADOS

4.1) Resistência a Piretróide X Capacidade Vetorial – Seleção em

Laboratório

4.1.1) Seleção e manutenção de colônias de Ae. aegypti

Experimentos de seleção seguiram-se por nove gerações a partir de

coleta na cidade de Natal-RN, em outubro/2005. Fêmeas adultas (mas não

machos) do grupo R foram pressionadas com deltametrina, como indicado na

seção anterior, a cada geração, para selecionar fêmeas para produção de ovos

da geração seguinte. A dose utilizada na primeira seleção foi 1,5µg de

deltametrina/garrafa, resultando em uma mortalidade média de 48%. Esta dose

foi mantida até a seleção para a terceira geração. Como a mortalidade havia

sido bastante reduzida (entre 20 e 34%), dobrou-se a dose para 3,0 µg de

deltametrina/garrafa para a seleção da geração seguinte (F3�F4). Até a quinta

geração houve uma tendência de queda na mortalidade, que, no entanto,

passou a aumentar a partir de então (a figura 4.1 mostra os resultados de

mortalidade obtidos nos ensaios de seleção a partir da geração F3).

A mortalidade frente à deltametrina foi também avaliada no grupo S

em algumas gerações. Testes com a cepa Rockefeller foram realizados em

paralelo à seleção das oitava e nona gerações. A figura 4.1 representa a

mortalidade apenas nas gerações onde foram computados os grupos R e S. Na

geração F9, não houve diferença significativa na mortalidade entre os grupos R

e S (ANOVA, p>0,05). No entanto, diminuindo-se o tempo de exposição de 60

para 30 minutos, a mortalidade se revelou menor no grupo R (ANOVA, p<0,05).

A cepa Rockefeller foi totalmente susceptível à deltametrina sob estas

condições experimentais. As linhagens S e R foram utilizadas em todos os

ensaios descritos no item 4.2.

42

Mortalidade nas gerações

3 4 5 6 7 8 9

0

20

40

60

80

100

S1 S2 S3 R1 R2 R3ROCK

Gerações

mo

rtal

idad

e (%

)

Figura 4.1: Status de susceptibilidade a deltametrina de população de Ae. aegypti mantida em laboratório na presença (subgrupos “R”) e na ausência (subgrupos “S”) do inseticida - Percentual de mortalidade média das fêmeas de cada subgrupo ao longo das gerações, 24 horas após exposição por 60 minutos ao inseticida (3,0 µg de deltametrina). A dose utilizada até a geração F2 foi de 1,5 µg de deltametrina por garrafa.

4.2) Avaliação de Diferentes Aspectos da Capacidade Vetorial nas

Linhagens Selecionadas em Laboratório

4.2.1) Cinética de pupação

Das três gerações avaliadas (F1, F3 e F9), observamos diferenças

na cinética de desenvolvimento dos subgrupos S e R, em F3 e F9 (Figura 4.2).

Houve atraso na formação de pupas de todos os subgrupos R (R1, R2 e R3) na

geração F3, que se acentuou na F9. Nestas gerações, no quinto e no sexto

dias após a eclosão das larvas, verificou-se diferença significativa (p<0,05) nos

percentuais cumulativos de pupação entre os subgrupos R e S e entre estes e

a cepa Rockefeller (teste de ANOVA com comparação múltipla de Bonferroni).

A mesma análise foi efetuada para a geração F1 (os subgrupos S1 e

R1 e a cepa Rockefeller não foram avaliados); nesta geração (Figura 4.2),

somente R2 apresentou-se diferente dos demais, no quinto dia (p<0,05).

Os subgrupos S apresentaram tendência ao desenvolvimento um

pouco mais lento do que Rockefeller; este fenômeno foi acentuado nos

43

subgrupos R, nos quais se observou atraso de um a dois dias na formação de

pupas na geração F9 (figura 4.2).

Para melhor evidenciar tais tendências, foram realizadas regressões

lineares do percentual cumulativo de pupação no sexto dia (Figura 4.3).

Observou-se regressão negativa e significativa em todos os subgrupos

testados (tabela 4.1).

Tabela 4.1: Efeito da seleção com piretróide sobre o desenvolvimento de Ae. aegypti. Análise de regressão linear das taxas de pupação no sexto dia depois da eclosão, ao longo das gerações. Os valores em negrito indicam regressão significativa.

subgrupo ββββ p Rock -1.565 ± 1.689 0,4519 S1 -5.131 ± 0.5683 0,0008 S2 -2.356 ± 0.6633 0,0238 S3 -1.654 ± 0.3654 0,0106 R1 -7.520 ± 1.233 0,0258 R2 -8.853 ± 1.211 0,0019 R3 -9.523 ± 0.7465 0,0002

β = coeficiente de regressão ou slope ± intervalo de confiança de 95%.

44

F3

4 5 6 7 8 9 10 11

0

20

40

60

80

100

S2-F3S3-F3

R2-F3R3-F3

Rock-F3

S1-F3

R1-F3

dias após eclosão

% P

up

as

F1

4 5 6 7 8 9 10 11

0

20

40

60

80

100

S2-F1

R2-F1S3-F1

R3-F1

dias após eclosão

% P

up

as

F9

4 5 6 7 8 9 10 11

0

20

40

60

80

100 Rock-F9

S1-F9S2-F9S3-F9

R1-F9

R2-F9R3-F9

dias após eclosão

% P

up

as

Figura 4.2: Cinética de pupação dos subgrupos S e R de Ae. aegypti selecionados no laboratório - Os pontos apresentados no gráfico representam a média cumulativa de dois experimentos para cada linhagem, em cada geração. Os resultados para cada geração estão representados em diferentes gráficos (F1, F3 e F9). A cepa Rockefeller foi usada como controle de viabilidade. Em todos os casos as barras verticais indicam o erro padrão.

45

Figura 4.3: Percentual de pupas formadas até o sexto dia após a eclosão nos subgrupos S e R de Ae. aegypti, gerações F1, F3 e F9 - O gráfico mostra os resultados das médias do percentual de pupas de dois experimentos de cada subgrupo. Observou-se regressão significativa em todos os subgrupos.

.

0 3 6 9

0

20

40

60

80

100RockS1S2S3R1R2R3

Gerações

% P

up

as

46

4.2.2) Proporção de machos e fêmeas

Foi avaliada a proporção sexual de uma amostragem da prole dos

subgrupos R e S nas gerações F1, F3 e F9. A Figura 4.4 mostra o percentual

de indivíduos machos e fêmeas em cada linhagem, nas três gerações

analisadas. Em nenhum caso houve diferença significativa entre os números de

machos e fêmeas emergidos (χ2, p>0,05). Ou seja, neste aspecto, os grupos R

e S não diferiram, mantendo a mesma relação observada na linhagem

Rockefeller ao longo das gerações.

47

F1

S1 S2 S3 R1 R2 R3 Rock

010

2030405060

708090

100machofêmea

Po

rcen

tag

em (

%)

* *

Figura 4.4: Proporção entre machos e fêmeas resultantes dos subgrupos S e R de Ae. aegypti - Os gráficos mostram as médias (com os respectivos erros padrão) da taxa de machos e fêmeas adultos nas gerações F1, F3 e F9, como indicado. A cepa Rockefeller foi usada como controle. Em todos os casos estão mostrados os resultados de dois experimentos. (*) testes não realizados.

F3

S1 S2 S3 R1 R2 R3 Rock

010

2030

405060

7080

90100

machofêmea

Po

rcen

tag

em (

%)

F9

S1 S2 S3 R1 R2 R3 Rock

010

20304050

607080

90100

machofêmea

Po

rcen

tag

em (

%)

48

4.2.3) Quantidade de sangue ingerido

A figura 4.5 apresenta a média de dois experimentos, realizados em

duplicata, de quantificação do sangue ingerido por fêmeas dos subgrupos R e

S nas gerações F1, F3 e F9. Observou-se diferença significativa (p<0,05;

f=16,46) entre os subgrupos R e S apenas na geração F9; não foi detectada

diferença entre os subgrupos S e Rockefeller (ANOVA, comparação múltipla de

Bonferroni). Também não houve diferença significativa na comparação do peso

dos mosquitos antes da alimentação sangüínea, o que sugere fortemente que a

variação observada é decorrente de diminuição na quantidade de sangue

ingerido por mosquitos do grupo R. Corrobora esta hipótese o resultado de

análise de regressão linear, que mostra tendência significativa na diminuição

da ingestão de sangue, ao longo das gerações, para o grupo R, mas não para

o S (figura 4.6). Observou-se regressão significativa e negativa nos subgrupos

R2 e R3, e positiva em S2 (tabela 4.2).

Tabela 4.2: Efeito da seleção com piretróide sobre o repasto sangüíneo de Ae. aegypti. Análise de regressão linear da taxa de ingestão de sangue, normalizada por Rockefeller, ao longo das gerações. As médias dos valores dos grupos foram divididos pela média dos valores de Rockefeller. Os valores em negrito indicam regressão significativa.

ββββ p S1 -0.005952 ± 0.009434 0,539 S2 0.0400 ± 0.01170 0,0066 S3 -0.01333 ± 0.008374 0,1353 R1 -0.01267 ± 0.007898 0,1432 R2 -0.03511 ± 0.005739 < 0.0001 R3 -0.01655 ± 0.003389 0,0003

β = coeficiente de regressão ou slope ± intervalo de confiança de 95%.

49

F1

Rock S1 S2 S3 R1 R2 R3

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5a a

a

aa

a

Pes

o D

epoi

s/P

eso

ante

s

F9

Rock S1 S2 S3 R1 R2 R3

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5 aa

a

a

b bbP

eso

Dep

ois

/Pes

o a

nte

s

* Figura 4.5: Taxa de ingestão de sangue por fêmeas dos subgrupos S e R de Ae. aegypti - Os gráficos mostram as médias (com os respectivos erros padrão) da ingestão de sangue nos subgrupos R e S nas gerações F1, F3 e F9, como indicado. A cepa Rockefeller foi usada como controle. As letras diferentes acima de cada coluna indicam diferença significativa (p<0,05) entre os subgrupos. (*) teste não realizado.

F3

Rock S1 S2 S3 R1 R2 R3

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

aa

ba, c

bb, c b, c

Pes

o D

epoi

s/P

eso

ante

s

50

Figura 4.6: Taxa de ingestão de sangue por fêmeas dos subgrupos S e R de Ae. aegypti, ao longo das gerações - Os resultados mostrados correspondem às médias da razão de ingestão de sangue de dois experimentos com duas réplicas, normalizados pela média da cepa Rockefeller. Observou-se regressão significativa e negativa nos subgrupos R2 e R3, e positiva em S2.

1 2 3 4 5 6 7 8 9

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

1.1

1.2S1S2S3R1R2R3

G eração

Raz

ão n

orm

aliz

ada

51

4.2.4) Taxa de fêmeas que realizam postura, número de ovos postos e

viabilidade dos ovos

A possível interferência da resistência a piretróide na reprodução foi

avaliada por meio de parâmetros relativos à realização da postura e ao número

e à viabilidade dos ovos.

Consideramos o número de fêmeas induzidas à postura sob três

condições: 1) aquelas que colocaram mais de 50 ovos dentre as que

realizaram oviposição (Figura 4.7-A), 2) aquelas que colocaram mais de 50

ovos dentre todas as fêmeas induzidas à postura (Figura 4.7-C) e 3) aquelas

que realizaram oviposição (Figura 4.7-E).

Não foi observada diferença significativa entre os grupos R e S e

Rockefeller ao longo das gerações (ANOVA, p>0,05; f=21,73), quando

considerada a primeira condição. A análise de regressão linear (Figura 4.7-B),

apesar de ter mostrado alguma tendência para diminuição em R, do número de

fêmeas que colocaram mais de 50 ovos, dentre as que ovipuseram, não foi

significativa (β=-0,9178 ± 1,130, p= 0,4477).

No entanto, considerando a segunda condição (número de fêmeas

que colocaram mais de 50 ovos dentre todas induzidas à postura), há uma

diminuição altamente significativa em todas as gerações entre Rockefeller e R

(ANOVA, p<0,001; f=18,43) e entre os grupos S e R da nona geração (ANOVA,

p<0,001), figura 4.7-C. A análise de regressão linear para este parâmetro

mostrou uma diminuição significativa (β=-1,894± 0,6511, p=0,0270) dos valores

dos grupos R ao longo das gerações.

Avaliando a terceira condição, na qual todas as fêmeas que

realizaram postura foram consideradas, há uma diminuição altamente

significativa nas gerações F3 e F9 entre Rockefeller e R (ANOVA, p<0,001;

f=16,85) e significativa entre os grupos S e R da nona geração (ANOVA,

p<0,05; f=16,85) (Figura 4.7-E). Embora análise de regressão linear para este

parâmetro não tenha revelado uma diminuição significativa (β=-

2,052 ± 0,9243, p=0,0681) para R ao longo das gerações, tendência a uma

diminuição fica evidente ao se comparar o perfil das retas dos grupos R e S e

Rockefeller (figura 4.7-F).

52

Em relação ao número de ovos por fêmea que realizaram postura, a

Figura 4.8 mostra a média, associada ao seu erro padrão, do número de ovos

por fêmea nos grupos R, S e Rockefeller. Os subgrupos foram reunidos em

seus grupos, uma vez que não houve diferença significativa entre eles. Na

primeira e terceira gerações (painéis A-B) não há diferença significativa na

média de número de ovos por fêmea entre os grupos e Rockefeller (ANOVA,

p>0,05; f=0,07564 – F1; f=2,155 – F3). Por outro lado, na nona geração (painel

C) houve uma diminuição no número de ovos por fêmea no grupo R. Verificou-

se diferença altamente significativa (ANOVA, comparação múltipla de

Bonferroni; f=9,812) entre o grupo R e Rockefeller (p<0,01) e entre os grupos R

e S (p<0,001).

A taxa de eclosão dos ovos foi avaliada para os subgrupos de R e S

nas mesmas gerações, sempre em paralelo a Rockefeller (Figura 4.9). Na

primeira e terceira gerações não houve diferença significativa (ANOVA, p>0,05;

f=1,997 – F1; f= 2,222 – F2) entre a média do número de ovos eclodidos entre

cada subgrupo e Rockefeller. Já na nona geração, a média do número de ovos

eclodidos de todos os subgrupos de R foi menor do que em S (ANOVA,

P<0,05) e Rockefeller (ANOVA, P<0,001; f=13,51). Análise de regressão linear

(Figura 4.10) mostrou regressão significativa em todos os subgrupos, com

exceção de S1 (tabela 4.3).

53

Figura 4.7: Percentual de fêmeas que fazem postura dos subgrupos S e R de Ae. aegypti - foram consideradas somente as que colocam acima de 50 ovos em relação ao total de fêmeas com postura (A-B); somente as que colocam acima de 50 ovos dentre todas as fêmeas avaliadas (C-D);e todas as fêmeas que realizaram postura em relação ao total de fêmeas avaliadas (E-F). Os painéis B, D e F representam curvas de regressão linear para os parâmetros considerados, ao longo das gerações 1, 3 e 9. As letras diferentes acima de cada coluna indicam diferença significativa entre os grupos.

Fêmeas que fazem postura

1 3 9

0

20

40

60

80

100ROCKSR

a a a

a,ca,c

bb

a,cb,c

Gerações

% fê

mea

s co

m p

ostu

ra/to

tal f

êmea

s av

alia

das

Fêmeas que fazem postura

0 3 6 9

0

20

40

60

80

100ROCKSR

Gerações

% f

êmea

s co

m p

ost

ura

/to

tal f

êmea

s av

alia

das

Fêmeas que fazem postura > 50 ovos

0 3 6 9

0

20

40

60

80

100ROCKSR

Gerações% fê

mea

s >5

0 ov

os/fê

mea

s co

m p

ostu

ra

A B

Fêmeas que fazem postura >50 ovos

1 3 9

0

20

40

60

80

100ROCKSR

a a a

a, b, ca, b

b, c, dc, d

c, d d

Gerações% fê

mea

s >5

0 ov

os/to

tal f

êmea

s av

alia

das

C

Fêmeas que fazem postura > 50 ovos

0 3 6 9

0

20

40

60

80

100ROCKSR

Gerações% fê

mea

s >5

0 ov

os/to

tal f

êmea

s av

alia

das

D

Fêmeas que fazem postura >50 ovos

1 3 9

0

20

40

60

80

100ROCKSR

aa a

a aa

a a

a

Gerações% f

êmea

s >

50 o

vos/

fêm

eas

com

po

stu

ra

F E

54

Figura 4.8: Número de ovos por fêmea dos subgrupos S e R de Ae. aegypti - cada painel mostra a média de ovos de dois experimentos, cada qual realizado em duplicata, nas gerações indicadas. Letras iguais sobre as barras indicam que não há diferença significativa entre as médias (ANOVA, p>0,05).

F9

Rock S R

0

25

50

75

100

125

nº o

vos/

fêm

ea

aa

b

F3

Rock S R

0

25

50

75

100

125

nº o

vos/

fêm

ea

a aa

F1

Rock S R

0

25

50

75

100

125

nº o

vos/

fêm

ea

a a a

55

Figura 4.9: Taxa de eclosão dos ovos dos subgrupos S e R de Ae. aegypti - cada painel mostra a média do percentual de eclosão dos ovos de dois experimentos. Diferenças significativas foram observadas na geração F9. Letras iguais sobre as barras indicam que não há diferença significativa entre as médias (ANOVA, p>0,05).

F9

Rock S1F9 S2F9 S3F9 R1F9 R2F9 R3F9

0

20

40

60

80

100a a a a

b bb

% E

clos

ão

F1

Rock S1F1 S3F1 R2F1 R3F1

0

20

40

60

80

100a a a a a

% E

clo

são

F3

Rock S1F3 S2F3 S3F3 R1F3 R2F3 R3F3

0

20

40

60

80

100a a a a a a a

% E

clo

são

56

Figura 4.10: Taxa de eclosão dos ovos dos subgrupos S e R de Ae. aegypti, ao longo das gerações - Regressão linear das gerações F1, F3 e F9. Os resultados apresentados são as médias das taxas de eclosão de ovos. Observou-se regressão significativa e negativa em todos os subgrupos, com exceção de S1.

Tabela 4.3: Efeito da seleção com piretróide sobre a taxa de eclosão de ovos de Ae. aegypti. Análise de regressão linear da taxa de eclosão dos ovos, das gerações 1, 3 e 9. Os valores em negrito indicam regressão significativa.

β p Rock -0.1890 ± 0.1354 0,1736 S1 -0.2766 ± 0.3008 0,3661 S2 -1.113 ± 0.2823 0,001 S3 -0.5461 ± 0.1699 0,0033 R1 -3.724 ± 0.8554 0,0004 R2 -3.374 ± 0.6409 < 0.0001 R3 -4.187 ± 0.6557 < 0.0001

β = coeficiente de regressão ou slope ± intervalo de confiança de 95%.

4.2.5) Longevidade de adultos

Os adultos oriundos de larvas criadas a 28ºC foram separados em

gaiolas de papelão, providas de água açucarada como fonte de alimento, e

mantidas no insetário a 25±1ºC. A mortalidade em cada gaiola foi

acompanhada a cada dois dias, durante 90 dias. Esta análise foi realizada com

a terceira e a nona gerações.

0 3 6 9

60

70

80

90

100ROCKS1S2S3R1R2R3

Gerações

% t

axa

de

eclo

são

57

Uma vez que não houve diferença, os dados de longevidade dos

subgrupos foram reunidos em seus respectivos grupos na Figura 4.11.

Observou-se que os subgrupos de R apresentaram uma tendência de

diminuição de longevidade com o passar das gerações. Isto ocorreu tanto nos

machos como nas fêmeas. Em todos os subgrupos, e mesmo em Rockefeller,

os machos apresentaram longevidade menor que a das fêmeas. Contudo, a

diferença na cinética de mortalidade entre machos e fêmeas tendeu a diminuir

em R ao longo das gerações (figura 4.12).

A comparação do percentual de sobrevivência no 30º dia de

experimento entre os grupos S, R e Rockefeller revelou que não houve

diferença significativa na taxa de sobrevivência dos machos (figura 4.13-A,

ANOVA, p>0,05; f= 5,082). Por outro lado, com relação às fêmeas, foi

observada diferença altamente significativa na taxa de sobrevivência apenas

na geração F9, do grupo R quando comparado a S (ANOVA, p<0,001; f=26,10)

ou a Rockefeller (figura 4.13-B, ANOVA, p<0,001; f=26,10).

Os dados de sobrevivência no 30º dia dos grupos R e S foram

normalizados com Rockefeller e então comparados entre si (figura 4.13-C-D). A

diferença entre as fêmeas dos grupos S e R na geração F9 foi confirmada

(ANOVA, P<0,001; f= 29,44). Este procedimento também revelou diferença

significativa entre os machos S e R, na geração F9 (ANOVA, p<0,05; f=8,811).

58

Figura 4.11: Longevidade de adultos dos subgrupos S e R de Ae. aegypti - Os painéis A-B mostram a cinética de mortalidade de fêmeas, nos grupos R e S respectivamente. Os Painéis C-D mostram resultados equivalentes de mortalidade de machos. As curvas nos gráficos representam regressões não lineares.

FÊMEAS

A B

MACHOS

C D

R F3 X R F9

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

0

20

40

60

80

100R F3RF9Rock

Dias após emergência

% S

ob

revi

ven

tes

S F3 X S F9

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

0

20

40

60

80

100S F3SF9Rock

Dias após emergência

% S

ob

revi

ven

tes

R F3 X R F9

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

0

20

40

60

80

100R F3RF9Rock

Dias após emergência

% S

ob

revi

ven

tes

S F3 X S F9

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

0

20

40

60

80

100S F3SF9Rock

Dias após emergência

% S

ob

revi

ven

tes

59

Figura 4.12: Longevidade de adultos dos subgrupos R e S de Ae. aegypti - Os painéis A-B mostram a cinética de mortalidade de machos e fêmeas, nos grupos R e S respectivamente, da terceira geração. Os Painéis C-D mostram resultados equivalentes, da nona geração. As curvas nos gráficos representam regressões não lineares.

F9

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

0

20

40

60

80

100FêmeasMachos

Grupo R

Dias após emergência

% S

ob

revi

ven

tes

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

0

20

40

60

80

100FêmeasMachos

Grupo S

Dias após emergência

% S

ob

revi

ven

tes

D C

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

0

20

40

60

80

100FêmeasMachos

Grupo R

Dias após emergência

% S

ob

revi

ven

tes

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

0

20

40

60

80

100FêmeasMachos

Grupo S

Dias após emergência

% S

ob

revi

ven

tes

A B

F3

60

C D

A B FÊMEAS

3 9

0

20

40

60

80

100RockSR

a a a a a

b

gerações

% s

obre

vive

ntes

30

0 dia

MACHOS

3 9

0

20

40

60

80

100RockSRa a a

aa

a

gerações

% s

obre

vive

ntes

30

0 dia

NORMALIZADO MACHOS

3 9

0.0

0.5

1.0

1.5

SR

a aa,b

b

gerações

% s

obre

vive

ntes

30

0 dia

Figura 4.13: Percentual de sobreviventes dos subgrupos S e R de Ae. aegypti no 30º dia de experimento - Os painéis A-B mostram o percentual de sobreviventes machos e fêmeas, respectivamente. Nos painéis C-D os resultados foram normalizados por Rockefeller. As letras diferentes acima de cada coluna indicam diferença significativa entre os grupos.

NORMALIZADO FÊMEAS

3 9

0.0

0.5

1.0

1.5

SR

a a a

b

gerações

% s

ob

revi

ven

tes

300 d

ia

61

4.2.6) Ensaios de infecção com vírus DENV-II

Inicialmente idealizou-se investigar possíveis alterações na

capacidade de mosquitos resistentes a piretróide de se infectarem e se

tornarem infectivos com o vírus da dengue. Para tanto, foi realizada tentativa

de infecção artificial com vírus DENV-II. Os resultados abaixo são referentes a

análises preliminares de RT-PCR das cepas alimentadas com solução

contendo de hemácias de coelho e vírus.

4.2.6.1) Infecção artificial

Não houve sobreviventes à infecção com a titulação 108 TCID50 /

0,1mL nos grupos R, S e em Rockefeller, ao final do 14º dia, como informado

na metodologia. Com base nisto, diferentes titulações virais foram testadas,

utilizando-se as cepas Rockefeller e KHW (tabela 4.4). Ao final do 14º dia, não

se observou em Rockefeller nenhuma relação dose-dependente entre a taxa de

sobrevivência dos mosquitos e as titulações virais empregadas. Porém, para

KHW constatou-se um pico de sobrevivência em 104TCID50, decaindo

progressivamente com o aumento do título viral (figura 4.14).

Tabela 4.4: Relação entre o número de fêmeas que se alimentou com sangue infectado e número de fêmeas que sobreviveu após 14 dias de incubação do vírus.

Titulações

(10x)

Nº ♀ ♀ ♀ ♀ que realizaram hematofagia Nº de ♀ ♀ ♀ ♀ vivas após 14 dias Rock KHW Rock KHW

103 32 16 12 9

104 42 5 40 5 105 48 17 17 13 106 55 23 46 5 107 45 11 5 2 108 60 22 42 7

62

Figura 4.14: Infecção com diferentes títulos virais - Fêmeas sobreviventes após 14 dias de infecção com DENV-II.

4.2.6.3) Detecção do vírus por RT-PCR

A fim de determinar se os sobreviventes das diferentes doses

descritas no item anterior estavam de fato infectados e infectivos, procedeu-se

à detecção do vírus em tecidos da cabeça dos sobreviventes através de

amplificação de RNA viral, individualmente, por RT-PCR. Foram aleatoriamente

escolhidas 2 fêmeas, de Rockefeller e de KHW, sobreviventes de cada uma

das titulações 103, 106 e 108 TCID50. Paralelamente, tentativa de amplificação

de RNA viral foi também realizada a partir dos corpos destes mesmos

indivíduos.

Ao final da reação de RT- PCR, esperava-se a amplificação de um

fragmento com cerca de 120pb (Lanciotti e cols., 1992), o que, no entanto, não

ocorreu em nenhuma das amostras (Figura 4.15, parte superior). Amplificação

do controle positivo da reação foi observada somente na segunda reação

(nested PCR), figura 4.15, parte inferior.

Considerando que os mosquitos estivessem de fato infectados, três

hipóteses foram sugeridas para a ausência de amplificação das amostras: 1) a

extração de RNA das amostras não teria sido eficiente ou 2) as amostras não

teriam sido bem conservadas e degradaram ou 3) a concentração de RNA

obtido estaria abaixo do limite de detecção da técnica.

3 4 5 6 7 8

0

20

40

60

80

100RockKHW

Título viral (10x )(TCID50)

% s

obre

vive

nte

s 14

o d

ia

63

Para testar as duas primeiras hipóteses, as mesmas amostras foram

submetidas a um RT-PCR para amplificação de um gene constitutivamente

expresso em Ae. aegypti: o gene da proteína ribossomal rp-49 (Gentile e cols.,

2005). Como a concentração do RNAm deste gene é bem alta nos mosquitos

(Gentile, comunicação pessoal), as amostras foram utilizadas sem diluição e 2

e 10 vezes diluídas. Isto foi feito, uma vez que altas concentrações de

substrato podem inibir a reação. Para todas as amostras testadas houve

amplificação de uma banda do tamanho esperado, com cerca de 190pb (figura

4.16). Este resultado indicou que 1) a extração de RNA das amostras teria sido,

portanto, eficiente e 2) as amostras foram conservadas de forma conveniente.

Além disto, não houve indício de inibição da reação em função da

concentração de substrato usada.

Para avaliar a terceira hipótese, sobre o limite de detecção da

técnica, em relação à faixa de concentração mínima de RNA viral, foi utilizado o

mesmo controle positivo da primeira reação, não diluído e diluído 102, 104 e 106

vezes. Houve amplificação apenas nas amostras não diluídas e 100 vezes

diluídas (figura 4.17), o que corresponde a, no máximo 105 partículas virais.

Os resultados, ainda que preliminares, sugerem que a metodologia

empregada na extração de RNA das amostras e no RT-PCR está de acordo

com o esperado, porém se houver vírus nas amostras utilizadas, a carga viral

pode estar abaixo do limite de detecção do ensaio utilizado.

64

Figura 4.16: Amplificação de controle endógeno (gene rp49) das amostras avaliadas. Eletroforese em gel de agarose 1,5%, corado em brometo de etídio. Legenda (inferior): fonte da amostra de extração de RNA, com a respectiva titulação viral usada para infecção. O RNA substrato foi utilizado em diluições seriadas de 1X; 0,5X e 0,1X (representados em ordem crescente nos poços). Seta inferior: banda correspondente a produto de tamanho esperado (~190pb). Seta superior: banda de amplificação inespecífica. PM: Marcador de peso molecular (100pb).

Figura 4.15: Tentativa de detecção do vírus DENV-II por RT-PCR. Eletroforese em gel de agarose 1,5%, corado em brometo de etídio. Parte superior: produtos da RT-PCR; parte inferior: produtos da nested-PCR. A legenda superior indica as titulações virais utilizadas na infecção dos indivíduos. A legenda inferior indica a fonte do RNA extraído. PM: marcador de 100pb; CP: Controle positivo. A seta branca aponta para amplificação do CP da reação.

65

4.3) Resistência a Piretróide X Capacidade Vetorial – Populações de

Campo

Para compararmos os resultados observados nos grupos submetidos

à seleção no laboratório com os de populações de mosquitos provenientes do

campo, de perfil de resistência conhecido, avaliamos diferentes parâmetros do

desenvolvimento e da viabilidade de populações de Cuiabá (MT), Uberaba

(MG), Aparecida de Goiânia (GO), Maceió (AL) e Henrique Jorge, bairro de

Fortaleza (CE).

Ensaios realizados no laboratório para avaliar o status de

susceptibilidade destas populações aos inseticidas usados no controle de

vetores, o organofosforado temephos (larvicida) e o piretróide deltametrina

(adulticida), foram realizados no âmbito da Rede MoReNAa. Estes resultados

estão na tabela 4.5, que apresenta as cinco populações avaliadas. São

mostrados a razão de resistência (RR95) para temephos, obtida dividindo-se a

CL95 (dose que mata 95% da população) de cada população pela CL95 da

população susceptível (Rockefeller) encontrada para este inseticida, e o

percentual de mortalidade frente à deltametrina, na dose diagnóstica (neste

ensaio, a menor dose que mata 100% da cepa susceptível, Rockefeller), de

5µg por garrafa. Observamos níveis distintos de susceptibilidade nas diferentes

populações. A população de Henrique Jorge foi a que apresentou RR mais alta

Figura 4.17: Limite de detecção de amplificação do controle positivo (RNA viral). Eletroforese em gel de agarose 1,5%, corado em brometo de etídio. Os poços de 1 a 4 e 5 a 8 correspondem aos produtos da RT-PCR, em cujos substratos foram utilizados concentrações de RNA viral diluídos em série: 1X; 0,1X; 0,01X e 0,001X. Foram utilizadas, como substrato da reação de PCR, duas extrações independentes do RNA viral, que na figura estão separadas pelo PM (100pb). Setas brancas apontam para produto amplificado no tamanho esperado (~120pb).

66

para temephos (43,0) e a população de Cuiabá, a mais baixa (4,0). Com

relação à deltametrina, a população que apresentou o menor percentual de

mortalidade foi Uberaba e o maior, Henrique Jorge.

Tabela 4.5: Status de susceptibilidade das populações de Ae. aegypti ao organofosforado temephos e ao piretróide deltametrina.

a RR<3: população susceptível; 3<RR<10: população resistente; e RR>10: população muito resistente (SVS, 2006). b A dose diagnóstica (DD) de deltametrina usada foi de 5 ug/garrafa (metodologia de Da-Cunha e cols. 2005). Neste ensaio, mortalidade abaixo de 80% indica população resistente (Davidson e Zahar 1973). (*) Paixão, 2007

4.3.1) Cinética de pupação / desenvolvimento larvar

Neste experimento avaliamos a cinética de formação de pupas nas

populações de campo provenientes da criação em bacias contendo 200 larvas

a 28ºC. Os resultados apresentados na Figura 4.18 mostram o percentual

cumulativo de formação de pupas ao longo dos dias, em relação ao total de

larvas utilizadas em cada bacia. Cada ponto no gráfico representa a média de

dois experimentos.

Observamos atraso na formação de pupas na população de

Henrique Jorge. Foi realizada comparação estatística entre os percentuais

cumulativos de pupas nos quinto e sexto dias, em que essas diferenças são

mais evidentes. Comparamos a variância entre as populações através de uma

análise paramétrica (ANOVA com comparação múltipla de Bonferroni).

Verificou-se diferença significativa do percentual de formação de pupas no

quinto dia entre a cepa Rockefeller e a população Henrique Jorge (p<0,05; f=

9,011) e entre as populações de Uberaba e Henrique Jorge (p<0,05; f= 9,011).

Estado Localidade/cepa Temephosa RR95

deltametrina % mort DDb

Rockefeller 1,0 100

MT Cuiabá 4,0 89,1

MG Uberaba 9,6 55,3

AL Maceió 10,3 62,9

GO Aparecida de Goiânia 11,2 73,5

CE Henrique Jorge (F1) - 47,0 (*)

CE Henrique Jorge (F3) 43,0 92,5

67

Observou-se também diferença significativa no percentual de pupas no sexto

dia, entre Uberaba e Henrique Jorge (p<0,05; f= 6,252).

Figura 4.18: Cinética de formação de pupas de populações de campo de Ae. aegypti com diferentes perfis de susceptibilidade a inseticidas – Os pontos no gráfico representam a média cumulativa de dois experimentos para cada população.

4.3.2) Proporção de machos e fêmeas

Foi avaliada a proporção sexual de uma amostragem da prole das

populações de campo. A cepa Rockefeller foi utilizada como controle. A Figura

4.19 mostra o percentual de indivíduos machos e fêmeas em cada população.

Não foi observada diferença significativa entre o número de machos e fêmeas

emergidos (χ2, p>0,05) em nenhuma população; todas mantiveram a mesma

relação observada em Rock.

4 5 6 7 8 9 10 11

0

20

40

60

80

100

Ap. Goiânia

Maceió

Rock

Cuiabá

Uberaba

Henrique Jorge

dias após eclosão

% P

up

as

68

Figura 4.19: Proporção de machos e fêmeas de populações de campo de Ae. aegypti com diferentes perfis de susceptibilidade a inseticidas - O gráfico mostra a média (e o erro padrão) da taxa de machos e fêmeas emergidos nas populações, comparados a Rockefeller. Cada barra do gráfico representa a média de dois experimentos.

4.3.3) Quantidade de sangue ingerido

Neste experimento, avaliamos a taxa de ingestão de sangue nas

populações e na cepa Rockefeller. Na figura 4.20, as colunas representam a

razão entre a média de peso de grupos de 10 mosquitos, depois e antes da

alimentação sangüínea. Análise de variância, por meio do teste de Bonferroni

com comparação múltipla, não identificou diferenças significativas entre a taxa

de ingestão de sangue nas populações. Não houve diferença significativa no

peso dos mosquitos, entre todos os grupos, antes da alimentação sangüínea.

RAZÃO MACHO/FÊMEA - campo

Cuiabá

Uberab

a

H. Jorg

e

Mac

eió

Ap. Goiâ

niaRock

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

machofêmea

Po

rcen

tag

em (

%)

69

Figura 4.20: Taxa de ingestão de sangue de populações de campo de Ae. aegypti com diferentes perfis de susceptibilidade a inseticidas - O gráfico mostra as médias (e os erros padrão) da ingestão de sangue nas populações, e comparativamente, Rockefeller. Não foram observadas diferenças significativas, como indicam as letras acima das barras. Em todos os casos são mostrados os resultados de dois experimentos, cada qual em duplicata.

4.3.4) Taxa de fêmeas que realizam postura, número de ovos postos e

viabilidade dos ovos

Foram avaliados a taxa de fêmeas que realizam postura, o número

de ovos postos e a viabilidade destes ovos.

A Figura 4.21, painel A, mostra que, quando se considera apenas as

fêmeas que realizaram postura, a média do número de ovos por fêmea de cada

população, assim como da cepa Rockefeller, é semelhante (p>0,05 em todas

as comparações pareadas; f= 2,619).

A Figura 4.21, painel B, apresenta a média do percentual de fêmeas

que efetivamente realizaram postura, entre todas as fêmeas avaliadas. Neste

caso, diferente do painel anterior, as populações não são equivalentes.

Observou-se diferença significativa entre a cepa Rockefeller e a população de

Maceió (p<0,05) e diferença altamente significativa entre a cepa Rockefeller e

Henrique Jorge (p<0,001). Observou-se ainda diferença significativa entre

Cuiabá e Henrique Jorge (p<0,05) (f=4,657).

Quando o número de ovos é calculado em relação ao total de fêmeas

induzidas à oviposição (Figura 4.21-C), observamos diferença significativa

entre a cepa Rockefeller e a população de Maceió (p<0,05) e altamente

RockCuiabá

Uberaba

Ap. Goiânia

Maceió

Henrique Jorge

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5 aa a a a a

Pes

o D

epo

is/P

eso

an

tes

70

significativa entre Rockefeller e a população de Henrique Jorge (p<0,001).

Observamos também diferença significativa entre a população de Henrique

Jorge e as populações de Cuiabá (p<0,01), Uberaba (p<0,01) e Aparecida de

Goiânia (p<0,05) (f= 6,743).

A Figura 4.22 apresenta outros resultados com este mesmo

experimento. O painel A mostra o percentual de fêmeas que realizam postura

com mais de 50 ovos dentre as fêmeas que realizaram postura. Não

observamos diferença significativa entre as populações quando este parâmetro

foi avaliado (Figura 4.22 A) embora tenhamos observado um menor percentual

de fêmeas que fizeram postura efetiva na população de Henrique Jorge.

O painel B mostra o resultado da avaliação de viabilidade destes

ovos. A taxa de eclosão mostrou-se alta em todas as populações. Não houve

diferença significativa entre o percentual de eclosão nas populações avaliadas.

71

Figura 4.21: Taxa de postura de populações de campo de Ae. aegypti com diferentes perfis de susceptibilidade a inseticidas - O painel A mostra a média do número de ovos por fêmea, de dois experimentos. Os valores foram calculados em relação apenas às fêmeas que realizaram postura. Não foi observada diferença significativa entre as populações. O painel B mostra a média do percentual de fêmeas que realizam postura em cada população. O painel C mostra a média do número de ovos pelo total de fêmeas avaliadas. As letras diferentes acima de cada coluna indicam diferença significativa entre as populações.

RockCuiabá

Uberaba

Ap. Goiânia

Maceió

Henrique Jorge

0

20

40

60

80

100a

a,b a,b a,b b,cc

% f

êmea

s q

ue

real

izam

po

stu

ra

RockCuiabá

Uberaba

Ap. Goiânia

Maceió

Henrique Jorge

0

25

50

75

100

125

nº o

vos/

fêm

ea c

om p

ostu

ra

a aa a a

a

A B

RockCuiabá

Uberaba

Ap. Goiânia

Maceió

Henrique Jorge

0

25

50

75

100

125

nº

ovo

s/ t

ota

l de

fêm

eas a,b

b,c b,c b,cc, d

d

C

72

Figura 4.22: Alguns aspectos da postura de populações de campo de Ae. aegypti com diferentes perfis de susceptibilidade a inseticidas. O painel A mostra o percentual de fêmeas com postura superior a 50 ovos, entre aquelas que realizaram postura. O painel B apresenta a taxa de eclosão dos ovos. Nos dois painéis estão as médias de dois experimentos. Em nenhum caso foi observada diferença significativa entre as populações, como indicam as letras acima das barras.

RockCuiabá

Uberaba

Ap.GoiâniaMaceió

Henrique Jorge

0

20

40

60

80

100 a aa

aa a

% E

clo

são

A B

RockCuiabá

Uberaba

Ap. Goiânia

Maceió

Henrique Jorge

0

20

40

60

80

100 a a a a aa

% F

êmea

s qu

e co

loca

m m

ais

de 5

0 ov

os

73

4.3.5) Longevidade de adultos

Os adultos oriundos de larvas criadas a 28ºC foram separados em

gaiolas de papelão, providas de água açucarada como fonte de alimento, e

mantidas no insetário a 25±1ºC. A mortalidade de cada gaiola foi acompanhada

a cada dois dias.

A Figura 4.23 mostra os percentuais de machos e fêmeas

sobreviventes de cada população ao longo dos dias. Dentre todas as

populações avaliadas, a de Henrique Jorge é a que apresenta a menor

longevidade. Isto ocorre com os dois sexos, embora este efeito seja mais

acentuado nas fêmeas, quando as populações são comparadas. Em todas as

populações testadas, a longevidade dos machos foi menor em comparação

com a das fêmeas.

A Figura 4.24, painéis A, B, mostra o percentual de sobreviventes no

30º dia de experimento, evidenciando diferenças entre machos e fêmeas, e

entre as populações. Esta diferença não é significativa nos machos (Painel A,

p>0,05; f= 2,609). Entretanto, nas fêmeas (Painel B) verificamos diferença

significativa entre a população de Henrique Jorge e todas as outras populações

avaliadas, e a cepa Rockefeller (p<0,05 em todas as comparações; f= 7,814).

A Figura 4.24, painéis C, D mostra o percentual de sobreviventes no 50º

dia de experimento. Observamos diferença significativa nos machos (Painel C)

entre a população de Henrique Jorge e a cepa Rockefeller (p<0,01) e a

população de Aparecida de Goiânia (p<0,05)(f= 9,076). Nas fêmeas (Painel D)

houve diferença significativa entre a população de Henrique Jorge e Cuiabá,

Aparecida de Goiânia e a cepa Rockefeller (p<0,05 em todas as comparações;

f= 3,836).

74

Figura 4.23: Longevidade de adultos de populações de campo de Ae. aegypti com diferentes perfis de susceptibilidade a inseticidas - Os Painéis A e B mostram, respectivamente, os percentuais de sobreviventes machos e fêmeas de cada população ao longo dos dias.

MACHOS

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

0

20

40

60

80

100RockCuiabáUberabaAp. GoiâniaMaceióHenrique Jorge

% S

ob

revi

ven

tes

FÊMEAS

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

0

20

40

60

80

100RockCuiabáUberabaAp. GoiâniaMaceióHenrique Jorge

% S

ob

revi

ven

tes

A B

75

Figura 4.24: Percentual de sobreviventes de populações de campo de Ae. aegypti com diferentes perfis de susceptibilidade a inseticidas - Os Painéis A-B mostram o percentual de sobreviventes machos e fêmeas no 30º dia de experimento. Os painéis C-D mostram o mesmo resultado no 50º dia de experimento. As letras diferentes acima de cada coluna indicam diferença significativa entre as populações.

FÊM EAS

RockCuiabá

Uberaba

Ap. Goiânia

Maceió

Henrique Jorge

0102030405060708090

100 aa a a a

b

% S

obre

vive

nte

s 30

0dia

M ACHOS

RockCuiabá

Uberaba

Ap. Goiânia

Maceió

Henrique Jorge

0

20

40

60

80

100

a a a aa a

% S

obre

vive

nte

s 30

0dia

A B

M ACHOS

RockCuiabá

Uberaba

Ap. Goiânia

Maceió

Henrique Jorge

0102030405060708090

100

aa,b a,b a a,b

b

% S

obre

vive

nte

s 50

0dia

C FÊM EAS

RockCuiabá

Uberaba

Ap. Goiânia

Maceió

Henrique Jorge

0102030405060708090

100

aa

a, ba

a, b

b

% S

obre

vive

nte

s 50

0 dia

D

76

5) DISCUSSÃO

Os inseticidas químicos continuam sendo a ferramenta mais utilizada

no combate aos vetores. Entretanto, vários vetores apresentam atualmente

resistência a todas as principais classes de inseticidas utilizadas nos

programas de controle (Zaim e Guillet, 2002). No Brasil, a resistência ao Aedes

aegypti se encontra disseminada em quase todo o país (Montella e cols.,

2007), o que torna necessário o conhecimento da influência da resistência na

biologia do vetor.

Neste trabalho avaliamos, em populações de Ae. aegypti

provenientes de diferentes regiões do país, e com diferentes status de

susceptibilidade a inseticidas, alguns aspectos do desenvolvimento,

reprodução e viabilidade. Os mesmos parâmetros foram avaliados em uma

população proveniente de Natal (RN), exposta à pressão de seleção em

laboratório com o piretróide deltametrina, ao longo de nove gerações.

Trabalhos de seleção em laboratório já foram realizados com diversos

inseticidas e com diversos vetores, primeiramente para prever a possível

evolução da resistência em cepas susceptíveis (Surtees, 1958; Abedi e Brown,

1960, 1961) e posteriormente para avaliar os mecanismos envolvidos na

resistência (Vulule e cols., 1999; Brengues e cols., 2003; Rodríguez e cols.,

2003, 2005; Hunt e cols., 2005; Qiang Xu e cols., 2005).

Durante campanha coordenada pela OMS em meados do século XX,

da qual diversos países participaram, e que utilizou o organoclorado DDT,

alguns pesquisadores decidiram estudar a possível evolução da resistência a

este inseticida. Isto porque, em algumas regiões, resistência ao DDT já havia

sido detectada em vetores como Anopheles e Ae. aegypti (Surtees, 1958;

Abedi e Brown, 1961). Os primeiros trabalhos envolvendo pressão de seleção

foram realizados com DDT, com o objetivo de avaliar se populações de Ae.

aegypti susceptíveis, ao serem pressionadas com este inseticida, poderiam

desenvolver resistência. Surtees (1958) realizou pressão de seleção com DDT

em população de Ae. aegypti proveniente da Nigéria. Larvas de quarto estádio

foram expostas por 24 horas a uma concentração de inseticida que matou

cerca de 60% da população inicial. A pressão de seleção durou cinco

77

gerações, utilizando-se sempre a mesma dose. O percentual de mortalidade

diminuiu consideravelmente ao longo das gerações, principalmente entre a

terceira e a quarta gerações. Neste trabalho chama atenção a mortalidade na

primeira geração (F1): 20% maior que na população inicial, denotando uma

variação intrínseca no teste. Abedi e Brown (1961) realizaram pressão de

seleção com DDT com uma cepa de Ae. aegypti de Nova Orleans (linhagem

susceptível ao DDT, mantida no laboratório por dez gerações) durante cinco

gerações. A pressão foi exercida sobre larvas de terceiro ou início de quarto

estádio, sempre em concentração que matava cerca de 50% da população

(LC50). Em valores absolutos, esta concentração foi aumentada ao longo das

gerações, principalmente entre as gerações F3 e F4. Maior resistência foi

acompanhada por um aumento inesperado na heterogeneidade da população,

evidenciado por diminuição do coeficiente angular (ou “slope”) dos bioensaios

tipo dose-resposta, indicando que fenótipos susceptíveis ainda persistiram.

Experimentos de seleção com outros vetores também já foram feitos, como

para DDT com An. culicifacies, An. stephensi (Curtis e cols., 1978) e An.

gambiae (Vulule e cols., 1999) e para o piretróide permetrina com Culex

quinquefasciatus (Qiang Xu e cols., 2005).

Qiang Xu e colaboradores (2005) selecionaram duas cepas de Cx.

quinquefasciatus de diferentes localidades do Alabama, alternativamente por

uma ou três gerações. A pressão foi exercida sobre larvas de quarto estádio,

com permetrina em concentração letal para cerca de 60% da população (LC60)

durante 24 horas de exposição. O nível de resistência aumentou

consideravelmente nas duas cepas, quando comparadas a uma cepa

susceptível mantida no laboratório. O slope das curvas dose-resposta também

aumentou, apontando para maior homogeneidade após a seleção.

Outros autores realizaram experimentos com pressão de seleção por

piretróides sobre Ae. aegypti. Mebrahtu e colaboradores (1993) selecionaram

cepa de Ae. aegypti ao longo de 13 gerações com o piretróide permetrina em

larvas de terceiro-quarto estádio com a LC50. Foi observado aumento da

resistência e, além disto, alterações em aspectos biológicos da cepa resistente

em comparação com a susceptível, Rockefeller.

Rodríguez e colaboradores (2005) induziram seleção com

deltametrina em cepa de Ae. aegypti proveniente de Santiago de Cuba, já

78

resistente a este piretróide, e pressionada ao longo de 12 gerações. Foram

utilizadas larvas de quarto estádio expostas a LC90. A cada três gerações foram

feitos testes com outros inseticidas, como os organofosforados malathion,

fenthion e fenitrothion; os piretróides deltametrina, lambda-cialotrina,

cipermetrina e o organoclorado DDT, para avaliar se a seleção estaria

provocando resistência cruzada a outros inseticidas. Após 12 gerações, a

resistência à deltametrina havia aumentado cerca de 22 vezes. Houve um

pequeno aumento na resistência a fenitrothion (2,3 vezes) e um maior aumento

em todos os outros piretróides testados. Não foi observado aumento na

resistência ao organofosforado malathion e ao organoclorado DDT. Contudo,

quando a mesma população de Santiago de Cuba foi submetida à seleção com

os organofosforados temephos (Rodríguez e cols., 2002) e malathion

(Rodríguez e cols., 2003), as cepas resultantes exibiam forte resistência

cruzada com o piretróide deltametrina.

Urmilla e colaboradores (2001) selecionaram cepa de Ae. aegypti de

Mysore, Índia com deltametrina durante 16 gerações. A pressão foi exercida

sobre larvas com a LC50. Foi observado aumento na resistência de 333,83

vezes. Foi observada também resistência aos piretróides permetrina e

fenvalerato, cujos níveis de resistência aumentaram em, respectivamente, 5,19

e 5,92 vezes.

Kumar e colaboradores (2002) realizaram pressão de seleção com

deltametrina em cepa de Ae. aegypti de Cuba. Os testes foram realizados em

larvas e em adultos durante 40 gerações. Foi observada grande diferença na

evolução da resistência quando a seleção foi feita com larvas (aumento de 703

vezes) em comparação com a seleção em adultos (aumento de somente 1,3

vezes).

No presente trabalho, realizamos pressão de seleção com o

piretróide deltametrina ao longo de nove gerações, partindo de uma população

de Natal (RN). Esta população foi dividida em dois grupos (os que não

passaram por seleção e os que passaram por seleção) e estes, divididos em

três subgrupos. Os subgrupos foram mantidos sob as mesmas condições para

que possíveis eventos evolutivos (seleção natural/valor adaptativo, deriva

gênica e efeito fundador) pudessem ser observados e discutidos. No entanto,

79

de um modo geral, não observamos, para os parâmetros avaliados, diferenças

entre os subgrupos de R ou entre os subgrupos de S.

A seleção foi feita em adultos, enquanto que na literatura é comum

que o procedimento seja executado com larvas. Preferimos pressionar adultos,

uma vez que no Brasil os piretróides são utilizados exclusivamente como

adulticidas. A seleção também foi feita apenas com as fêmeas, de três a cinco

dias de idade, e muito provavelmente já inseminadas: estudos no laboratório

comprovaram que bastam três dias de contato com machos, para que todas as

fêmeas estejam copuladas (Belinato, 2007). Se a seleção fosse feita com

ambos, macho e fêmea, teríamos que garantir que os machos que copularam

as fêmeas seriam os resistentes. Assim, cada nova geração seria resultante de

ambos os parentais resistentes. No entanto, para isso, teríamos que separar

machos e fêmeas recém-emergidos para impedir que copulassem antes da

seleção, caso contrário não poderíamos assumir que os machos resistentes

seriam os parentais. Além disto, neste caso seria necessário calibrar o ensaio

para os dois sexos, uma vez que certamente as doses para os machos seriam

diferentes das doses efetivas para as fêmeas. Portanto, de acordo com nossa

estratégia experimental, sabemos que cada geração foi resultante de fêmeas

parentais resistentes, mas não temos certeza da susceptibilidade dos machos

parentais.

Em conformidade com a maioria dos trabalhos citados acima, a

seleção foi feita sempre com a concentração que matava cerca de 50% da

população. Em nosso trabalho, a concentração inicial foi de 1,5 µg de inseticida

em cada garrafa, levando a uma mortalidade média de 48%. Esta dose foi

mantida até a seleção para a terceira geração, quando foi observada

diminuição na taxa de mortalidade (ficando entre 20 e 34%). A partir daí

dobramos a dose e a mantivemos até o final da seleção. Até a quinta geração

houve uma tendência de queda na mortalidade no grupo R que, no entanto,

passou a aumentar na geração seguinte e se manteve até o final da seleção

(Figura 4.1).

A mortalidade do grupo R não seguiu a tendência esperada, que

seria de diminuir ao longo das gerações, como ocorreu nos trabalhos acima

referidos. Os trabalhos que fizeram pressão de seleção com piretróide

mostraram sempre níveis bastante elevados de resistência, na maioria dos

80

casos em larvas. No trabalho de Kumar e colaboradores (2002), que também

utilizaram seleção com deltametrina por 40 gerações, não foram observadas

altas taxas de resistência quando a pressão de seleção foi exercida sobre

adultos, ao contrário da seleção com larvas, quando a resistência atingiu taxas

altíssimas. Mesmo assim, diferente dos resultados aqui apresentados, naquele

trabalho não houve aumento da mortalidade durante a seleção de adultos.

Como observado por Surtees (1958), flutuações nos níveis de

resistência aparentemente podem ocorrer, assim como desvios em relação à

homogeneidade esperada em populações selecionadas (Abedi e Brown, 1961).

Estes dados nos permitem questionar sobre a hipótese de que tenhamos

selecionado o grupo R somente o tempo suficiente para percebermos o início

de uma flutuação, já que pressionamos por apenas nove gerações. Soma-se a

isto o fato de que a seleção foi feita apenas com fêmeas, de modo que

possivelmente alelos susceptíveis vindos dos machos contribuiriam para a

próxima geração. Além disto, se os machos susceptíveis tiverem um maior

valor adaptativo, maior ainda seria sua contribuição para cada geração.

Apesar da metodologia de pressão de seleção empregada neste

trabalho não ter gerado altos níveis de resistência e apesar da mortalidade do

grupo R ter aumentado durante seleção com a mesma concentração de

inseticida a partir da geração F5, na nona geração este grupo apresentou um

menor valor adaptativo comparado ao S, a julgar pelos parâmetros da tabela de

vida observados. Praticamente todas as características fisiológicas avaliadas

foram afetadas em conseqüência da pressão de seleção, único fator diferencial

entre os grupos R e S (em seus respectivos três subgrupos independentes).

Alterações nestas características estariam, em princípio, relacionadas à

resistência.

Uma hipótese elaborada para explicar o aumento de mortalidade no

grupo R seria de que a freqüência dos alelos de resistência estaria de fato

aumentando no grupo R e, conseqüentemente, diminuindo seu valor adaptativo

aos fatores fisiológicos analisados. De acordo com esta hipótese, a mortalidade

em R teria aumentado devido a um acúmulo de genes deletérios recessivos

que estariam em desequilíbrio de ligação com aqueles selecionados para

resistência. Estes genes deletérios permitiriam o desenvolvimento e

reprodução dos indivíduos, porém os tornariam menos adaptados a situações

81

ambientais adversas. Neste caso teríamos aumento na freqüência de dois

fatores: 1) dos genes de resistência conferindo menor susceptibilidade ao

inseticida; e 2) de genes deletérios em condições adversas (ver, abaixo,

discussão sobre capacidade vetorial nas populações de campo).

Em um estudo de análise de polimorfismo (por RFLP) no genoma de

uma linhagem de Ae. aegypti resistente a OP, foi observado que loci próximos

ao gene que confere resistência ao OP apresentaram reduzida variedade

genética, comparados a outras regiões do genoma (Yan e cols., 1998). Este é

um exemplo de que mudança na freqüência de um determinado gene sob ação

da Seleção Natural pode orientar mudança na freqüência de genes próximos

via “efeito carona” (“hitch-hiking effect”), mesmo que estes genes sejam neutros

(Maynard-Smith e Haigh, 1974; Ridley, 2006).

Outro exemplo de “efeito carona” associado à resistência foi

observado por Mebrahtu e colaboradores (1997), em estudo no qual a prole de

uma linhagem de Ae. aegypti resistente ao piretróide permetrina apresentou

maior proporção de machos. Uma vez que em Culicidae a definição sexual é

genética (e não cromossômica), naquela linhagem deve ter sido selecionado

para resistência a OP algum locus ligado ao de definição sexual.

Embora existam poucos genes-alvo associados à resistência

(ffrench-Constant, 1998), está claro que vários caminhos podem levar ao

estabelecimento de uma população resistente. Como citado, diferentes ensaios

de pressão de seleção de uma mesma espécie e com inseticidas da mesma

classe levaram a resultados diversos.

Para avaliar as hipóteses aqui levantadas, precisamos dar

continuidade à seleção. Projeto paralelo em nosso laboratório está avaliando a

freqüência de mutações no canal de sódio (alvo de piretróide) nos grupos R e

S. Os resultados desta análise podem nos ajudar a entender melhor o evento,

bem como a dinâmica de resistência a piretróide.

Em paralelo ao processo de seleção, avaliamos neste trabalho

aspectos do desenvolvimento, reprodução e viabilidade dos grupos R e S, em

comparação com Rockefeller. Muitos trabalhos têm relatado alterações em

diversos parâmetros da biologia de insetos resistentes a diversos inseticidas,

comprometendo-lhes a capacidade vetorial. Investigamos alguns parâmetros

biológicos, como tempo de desenvolvimento larvar (através da cinética de

82

pupação), proporção de machos e fêmeas, quantidade de sangue ingerido,

aspectos de fecundidade e longevidade dos adultos. Estes parâmetros foram

avaliados a cada três gerações, tanto para o grupo S, quanto para o grupo R. A

geração F6 não foi mostrada, pois o percentual de mortalidade do grupo S

frente à deltametrina não foi avaliado nesta geração, para confrontarmos com o

resultado de R.

A variação do tempo médio de desenvolvimento das gerações em

populações de mosquitos é um dado primário e componente fundamental de

medida do fitness em populações em expansão (Charlesworth, 1980). Na

presença de predadores naturais e parasitas, o atraso no desenvolvimento

diminui as taxas de sobrevivência dos estágios larvais e isto provoca uma

diminuição no fitness (Agnew e Koella, 1999). Com relação à cinética de

pupação, houve acompanhamento diário dos grupos avaliados (R e S) nas

gerações indicadas. Estas observações nos permitiram avaliar o tempo de

desenvolvimento dos estágios imaturos. Foi observado atraso na formação de

pupas no grupo R já na terceira geração, acentuado na nona geração,

indicando retardo no desenvolvimento larvar no grupo criado na presença de

piretróide (grupo R). Diminuição no tempo de desenvolvimento não ocorreu no

grupo S.

Alteração no tempo de desenvolvimento foi observada em

Spodoptera exigua (Lepidoptera: Noctuidae) sob pressão de seleção com

fenvelerato, um piretróide (Brewer e Trumble, 1991). Em outro estudo, duas

linhagens de Cydia pomonella (Lepidoptera: Tortricidae), selecionadas em

laboratório com o piretróide deltametrina e o IGR diflubenzuron, apresentaram

desenvolvimento retardado quando comparadas à cepa susceptível (Boivin e

cols., 2001). No entanto, vale mencionar que, em mosquitos de importância

médica, não encontramos na literatura exemplos de estudos avaliando o

envolvimento da resistência a inseticidas com potencial alteração no tempo de

desenvolvimento.

Mebrahtu e cols. (1997) observaram, em uma linhagem de Aedes

aegypti selecionada em laboratório para resistência a permetrina, aumento no

número de machos em relação às fêmeas. Este resultado foi observado na

prole resultante do cruzamento de fêmeas sensíveis com machos resistentes.

Em nosso estudo, a proporção de machos e fêmeas não foi alterada. A razão

83

sexual permaneceu em torno de 1:1 em todos os subgrupos testados, tal qual a

cepa Rockefeller, ao longo das gerações (Figura 4.4).

Avaliamos ainda a quantidade de sangue ingerido em uma única

alimentação sangüínea. Não houve diferença no peso médio dos mosquitos

antes da alimentação entre os grupos testados e a cepa Rockefeller, ao longo

das gerações. Na nona geração, houve diminuição significativa na taxa de

ingestão de sangue do grupo R (pressionado com piretróide) em comparação

com o grupo S (sem pressão de seleção) e com Rockefeller (Figuras 4.5 e 4.6).

Embora não tenha sido encontrado, na literatura, ensaio equivalente,

detectamos registro de efeito de exposição a inseticida (no caso, o piretróide

cipermetrina) sobre a ingestão de sangue no principal vetor da malária, An.

gambiae (Corbel e cols., 2004): indivíduos resistentes e susceptíveis foram

submetidos a diferentes doses sub-letais do inseticida e em seguida foi-lhes

oferecida alimentação sangüínea. A quantidade de sangue ingerido variou de

forma inversamente proporcional à dose de inseticida a que haviam sido

previamente expostos, independente do status de resistência dos indivíduos.

Ou seja, a diminuição da ingestão de sangue pode ser considerada como

indicativo do stress provocado pela exposição ao inseticida, visto que esta

alteração ocorreu em todos os genótipos.

Verificamos que a taxa de fêmeas que realizam postura foi

significativamente alterada nos indivíduos pressionados, na nona geração.

Nesta, somente cerca de 55% de fêmeas do grupo R induzidas à oviposição

colocaram ovos, em contraste com o grupo S e com Rockefeller, cujas taxas

foram de, respectivamente, 83% e 100% (Figura 4.7). Estes resultados

sugerem menor taxa de fecundidade do grupo selecionado com piretróide (as

fêmeas não estariam inseminadas) ou, alternativamente, menor capacidade de

responder ao estímulo de indução da postura. Vale frisar que todas as fêmeas

induzidas à postura estavam ingurgitadas e haviam permanecido em gaiolas

com machos durante cinco dias. Mebrahtu e colaboradores (1997) verificaram,

em cepa proveniente do campo de Ae. aegypti resistente a permetrina, que o

número de fêmeas inseminadas em laboratório foi menor e o tempo de duração

da oviposição foi maior do que na linhagem susceptível.

Experimentos de avaliação de alterações no fitness em An. gambiae

e An. stephensi resistentes a γ-HCH (hexaclorociclohexano) e dieldrin

84

detectaram menor atividade nos machos resistentes. Esta foi a causa sugerida

para as menores taxas de inseminação encontradas nas fêmeas que

acasalaram com estes machos (Rowland, 1991b). A taxa de inseminação

(fecundidade) das fêmeas que copularam com machos homozigotos para

resistência (RR) neste caso foi a metade ou a terça parte da taxa de

fecundidade de fêmeas que copularam com indivíduos sensíveis (SS). Em

outro trabalho deste mesmo autor, foi observado que a atividade das fêmeas

resistentes (RR) foi cerca de 50% menor, quando comparada às fêmeas

sensíveis. Foi observado também que fêmeas resistentes inseminadas tiveram

menores respostas a estímulos de oviposição (Rowland, 1991a) e demoraram

mais para iniciar a postura (Rowland, 1991a; Mebrahtu e cols., 1997). Outros

trabalhos também detectaram diminuição no número de ovos postos por

fêmea, em indivíduos resistentes provenientes de experimentos de seleção: em

Ae. aegypti resistente a DDT (Abedi e Brown, 1961), em Spodoptera exigua

(Lepidoptera: Noctuidae) resistente a fenvalerato (Brewer e Trumble, 1991), e

em Cydia pomonella (Lepidoptera: Tortricidae) resistente a deltametrina e

diflubenzuron (Boivin e cols., 2001).

Com relação à viabilidade dos ovos, verificamos diminuição da taxa

de eclosão em todos os subgrupos de R, na nona geração (Figuras 4.9 e 4.10).

Mebrahtu e colaboradores (1997) também observaram diminuição na taxa de

eclosão de ovos de Ae. aegypti de prole proveniente de cruzamentos entre

indivíduos resistentes a permetrina.

Em nosso trabalho, observamos diminuição da longevidade do grupo

R ao longo das gerações, tanto de machos como de fêmeas, embora nestas a

diminuição tenha sido mais evidente (Figura 4.11). Contudo, a diferença entre

mortalidade de machos e fêmeas tendeu a diminuir na nona geração (Figura

4.12). Ainda assim, a diferença no percentual de fêmeas vivas no 30º dia

depois da emergência dos adultos foi significativa: cerca de 62% para R, em

contraste com 81-82% para S e Rock (Figura 4.13).

Rowland (1991a) não encontrou diferenças significativas na

longevidade de três genótipos avaliados (RR, RS, SS) para resistência a γ-

HCH e dieldrin, seja de An. gambiae ou de An. stephensi. Nestes ensaios,

machos e fêmeas de An. stephensi apresentaram longevidade semelhante,

85

porém fêmeas de An. gambiae tenderam a viver mais que machos desta

espécie.

Os resultados apresentados em nosso trabalho identificaram

diversas alterações em aspectos do desenvolvimento, reprodução e

viabilidade, no grupo selecionado com piretróide. Em princípio, poderíamos

sugerir que a resistência a piretróide estaria afetando estes aspectos. Porém o

fato de, em resposta à exposição à deltametrina a partir da geração F5, o

percentual de mortalidade do grupo R ter aumentado, não nos permite sugerir

tal correlação com segurança. Em função disto, decidimos avaliar os mesmos

aspectos para populações provenientes do campo, com diferentes status de

susceptibilidade a inseticidas. Assim, os resultados obtidos poderiam servir

para nortear a interpretação das alterações identificadas com a linhagem

selecionada no laboratório.

Nas populações avaliadas, testes com o organofosforado temephos

foram feitos em larvas, com diferentes concentrações do inseticida. Este teste,

quantitativo, avalia o grau de resistência de uma determinada cepa, comparado

a uma população susceptível. Testes com o piretróide deltametrina foram feitos

em adultos, com a dose diagnóstica (neste caso, a menor dose que mata 100%

da cepa susceptível). Este ensaio, qualitativo, indica se uma população está ou

não resistente, mas não avalia seu grau de resistência. Com relação a

temephos, as populações avaliadas se distribuíram em três diferentes

categorias: resistência média (Cuiabá, com RR95 de 4,0), alta (três populações

com RR95 em torno de 10,0) e muito alta (uma população, Henrique Jorge, com

RR95 de 43,0). O teste com deltametrina, qualitativo, permitiu identificar duas

categorias de populações, resistentes ou com resistência incipiente. Com

exceção da população de Cuiabá, que apresentou índice de resistência apenas

médio para temephos e resistência incipiente para deltametrina, não houve,

nas populações, relação aparente entre os níveis de resistência para os dois

inseticidas avaliados.

Com relação às avaliações de aspectos do desenvolvimento e

viabilidade, não observamos alterações em nenhuma das populações testadas

nos parâmetros: proporção de machos e fêmeas; quantidade de sangue

ingerido; número de ovos por fêmea que realizou postura e percentual de

eclosão de ovos (Figuras 4.19, 4.20, 4.21 e 4.22).

86

Por outro lado, foram notadas algumas alterações nas populações de

Henrique Jorge e Maceió, ambas do Nordeste. Como mencionado, a população

de Henrique Jorge possui nível de resistência muito alto para temephos

(RR95=43,0); seu percentual de mortalidade para deltametrina, contudo, é

desconhecido para a geração F2 (com a qual foram feitas as análises de

parâmetros biológicos). Porém, os valores de mortalidade frente a este

piretróide para a F1 (47,0%) e F3 (92,5%) indicam alteração rápida da

classificação da população, de resistente para resistência incipiente. A

população de Maceió, que possui resistência alta para temephos (RR95 de

10,3), além de mortalidade abaixo de 80% para deltametrina (indicativo de

resistência), também apresentou alguns parâmetros alterados, porém em

menor grau quando comparado com a população de Henrique Jorge.

Para ambas populações, Maceió e Henrique Jorge, os valores de

dois parâmetros de viabilidade foram menores: o percentual de fêmeas que

realizam postura e o número de ovos postos por total de fêmeas avaliadas

(Figura 4.21). Nos dois casos, estas alterações foram mais evidentes na

população de Henrique Jorge. Vale ressaltar que estas alterações foram

menores nas populações de campo do que no experimento de seleção em

laboratório (geração F9, grupo R). Amin e White (1984) também observaram

menor número de ovos postos em Culex quinquefasciatus resistente a

organofosforado em comparação com cepa susceptível.

Além destas alterações, a população de Henrique Jorge apresentou

atraso no desenvolvimento larvar, avaliado pela cinética de pupação, e

diminuição na longevidade das fêmeas (Figuras 4.18 e 4.23 respectivamente).

Observações neste sentido foram também feitas por Bourguet e colaboradores

(2004) em populações de Culex pipiens provenientes do sudeste da França,

onde utilizou-se organofosforado maciçamente; e por Amin e White (1984) em

Culex quinquefasciatus resistentes a organofosforado.

Vale notar que, em todos os casos nos quais foram observadas

alterações em aspectos da viabilidade das populações de campo, mesmo na

população com resistência muito alta a temephos (Henrique Jorge), as

diferenças encontradas foram mais sutis que aquelas observadas na geração

F9, selecionada com piretróide em laboratório.

87

As alterações em aspectos da biologia identificadas no grupo R

provavelmente não devem ser freqüentemente observadas em populações

naturais: indivíduos portadores destas alterações têm um menor valor

adaptativo e, na ausência do inseticida, perpetuariam menos suas

características. A aplicação de inseticida no campo é intermitente e não atinge

toda a dimensão espacial do habitat do mosquito. Além disto, há possibilidade

de fluxo gênico com populações vizinhas susceptíveis. Portanto,

diferentemente de linhagens confinadas, não é esperado que as populações

naturais, mesmo muito resistentes, apresentem efeitos tão negativos ao fitness.

De maneira geral, efeitos no fitness, tal como observamos, devem estar mais

freqüentemente relacionados à resistência metabólica. A alta produção de

enzimas detoxificantes, deslocando recursos energéticos, ou ainda,

modificações estruturais que alterem suas funções, podem comprometer

aspectos fisiológicos do inseto (Raymond e cols., 2001).

Embora o nível de resistência a OP, na população com a qual a

seleção foi iniciada, não seja conhecido, avaliação preliminar da

susceptibilidade ao OP temephos em larvas da geração F9 dos grupos R e S

revelou que ambos os grupos têm alto índice de resistência ao composto: RR95

de 26,0 e 15,6, respectivamente. Este resultado equivale a um nível de

resistência do grupo R mais de 60% superior ao do grupo S. Não conhecemos

o valor inicial da resistência ao OP na população que deu origem à seleção

(coletada em 2005), porém avaliações da resistência na população de Natal

foram feitas nos anos de 2004 e 2007 (como mostra a tabela 5.1). A população

de 2004, quando temephos ainda era aplicado rotineiramente no município,

apresentou RR95 maior que em 2007. Este dado pode ser atribuído à

substituição de OP por Bti para o controle de larvas, em 2005.

88

Tabela 5.1: Status de susceptibilidade ao organofosforado temephos de populações de Natal coletadas em 2004 e 2007 (fontes: Montella e cols., 2007 [2004] e dados MoReNAa, ainda não publicados [2007]) e dos grupos R (pressionado com deltametrina) e S (sem pressão com deltametrina).

Grupo Geração Temephos

RR95

Natal (2004) F1 18,7

R F9 26,0

S F9 15,6

Natal (2007) F1 10,4

A diferença observada entre as RR95 dos grupos R e S sugere

fortemente que houve seleção de fatores ligados à resistência metabólica pela

pressão por piretróide. Isto porque piretróide e OP possuem alvos diferentes e

é conhecido que o inverso (pressão com OP gerando resistência cruzada a

piretróide) ocorre no Brasil (Montella e cols., 2007).

Um outro aspecto da capacidade vetorial que tentamos avaliar foi a

competência vetorial. Pretendíamos nesta análise identificar possíveis

diferenças na susceptibilidade ao vírus dengue, nos grupos mantidos no

laboratório (S e R) e na cepa Rockefeller. Na tentativa de avaliar a

susceptibilidade de Ae. aegypti ao vírus DENV-II, realizamos experimentos de

infecção por meio de alimentação artificial. Primeiramente, estes experimentos

foram feitos com a terceira geração dos grupos S e R e com a cepa

Rockefeller, utilizando o título viral de 108 TCID50/0,1mL. Ao final de 14 dias

após a alimentação, não obtivemos fêmeas vivas, em nenhum grupo. Para

testar a hipótese de que a mortalidade dos culicídeos era conseqüência de

uma carga de vírus muito alta, resolvemos testar se existia relação entre a

quantidade de vírus no sangue e a taxa de mortalidade, por infecção viral, das

fêmeas ingurgitadas. A partir de amostra de vírus preparada de cultura de

células, realizamos uma série de diluições virais, de forma a obter títulos entre

103 e 108 TCID50/0,1mL. Estudos realizados anteriormente utilizaram títulos

89

nesta faixa (Gubler e Rosen, 1976; 1977; Gubler e cols., 1979; Sunarto e cols.,

1979; Rosen e cols., 1985; Castro e cols., 2004). Outros estudos utilizaram

títulos mais elevados como 108,2 TCID50/0,1mL em Lourenço de Oliveira e

colaboradores (2003) e 109,6 e 109,8 TCID50/0,1mL em Tardieux e

colaboradores (1990). Castro e colaboradores (2004) e Lourenço de Oliveira e

colaboradores (2003) não detectaram diferenças significativas quanto à

mortalidade do grupo infectado e controle. Os outros autores não relataram

sobre este dado.

No experimento com as titulações virais 103, 104, 105, 106, 107 e 108

observamos, ao final de 14 dias, sobrevivência das fêmeas em ambas as

cepas avaliadas: Rockefeller e KHW. Não conseguimos, para Rockefeller,

relacionar título viral e taxa de mortalidade. Na cepa KHW contudo, a partir de

104TCID50, a mortalidade das fêmeas ingurgitadas pareceu inversamente

proporcional ao título viral (Figura 4.14). Resta ainda confirmar se a

mortalidade observada está efetivamente relacionada à titulação viral.

Vale mencionar que, nos experimentos de infecção, as fêmeas

ficaram cerca de 30 minutos em contato com o aparato de alimentação

artificial. Foi observado que o número de fêmeas ingurgitadas após este

período não era grande. Permitimos então que as fêmeas se alimentassem por

mais 30 minutos. Gubler e Rosen (1976), Gubler e colaboradores (1979) e

Rosen e colaboradores (1985) permitiram que as fêmeas ficassem em contato

ao aparato de alimentação por até três horas. Utilizamos ATP como

fagoestimulante, misturado ao sangue infectado, para estimular o interesse dos

mosquitos pela fonte sangüínea (Tran e cols., 1999; Lourenço de Oliveira e

cols., 2003).

As fêmeas infectadas foram mantidas a 28ºC. Esta é a temperatura

em torno da qual o vírus se replica e alcança vários tecidos, inclusive as

glândulas salivares, o que ocorre em torno de 14 dias, como demonstrado por

vários autores (Whitehead e cols., 1971; Gubler e cols., 1979; Rosen e cols.,

1985). Assim como pudemos observar, outros estudos em laboratório

demonstram que a susceptibilidade de Ae. aegypti ao vírus dengue varia entre

diferentes cepas: Freier e Grimstad (1983) obtiveram um percentual de 60% de

infectividade para DENV-I. Com relação a DENV-II, trabalhos avaliando cepas

de diferentes localidades mostram grandes diferenças no percentual de

90

infectividade, que variou entre 5% e 57% (Whitehead e cols., 1971; Gubler e

cols., 1979, Tardieux e cols., 1990, Schneider e cols., 2007). Apesar disto esta

espécie, devido ao seu comportamento antropofílico, continua sendo a mais

importante na transmissão deste vírus aos seres humanos.

Finalmente, é necessário mencionar que, em nosso trabalho, não

conseguimos, em nenhuma titulação analisada por PCR (103, 106 e 108

TCID50), detectar fêmeas infectadas com o vírus DENV-II. Porém, estes

resultados são muito preliminares, visto que avaliamos somente duas fêmeas

de cada cepa, em cada titulação (Figura 4.15). De acordo com os resultados

dos trabalhos citados acima, a taxa de infectividade não é muito alta nesta

espécie. A avaliação de somente poucos espécimes ocorreu por adequações

da metodologia que levaram algum tempo. Fica como perspectiva avançarmos

na metodologia e avaliarmos os espécimes restantes para termos um resultado

conclusivo.

Em nosso trabalho, identificamos, em população de Ae. aegypti

selecionada com inseticida piretróide, alterações em uma série de parâmetros

da tabela de vida. Posteriormente, alterações observadas em populações de

campo, reforçaram a hipótese de que a resistência a inseticida possui um custo

evolutivo no inseto. Para entendermos melhor como este mecanismo evolutivo

ocorre, é necessária maior avaliação, em diferentes populações do Brasil e

com diferentes níveis de resistência a inseticidas para conseguirmos indicar

quais inseticidas, ou se todos interferem em aspectos biológicos do inseto.

Seria interessante continuar avaliando as populações provenientes da região

Nordeste do Brasil, pois foram localidades desta região que apresentaram

alterações: Maceió, Henrique Jorge e Natal (população selecionada).

91

6) CONCLUSÕES

• População de Aedes aegypti proveniente de Natal (RN), selecionada em laboratório com o inseticida piretróide, apresentou diversos parâmetros biológicos alterados, a partir da terceira geração:

- Atraso no desenvolvimento larvar;

- Menor volume de sangue ingerido;

- Menor taxa de fêmeas que realizam postura;

- Postura reduzida;

- Taxa de eclosão dos ovos reduzida;

- Longevidade reduzida.

• A partir da terceira geração a quantidade de inseticida foi dobrada no grupo R, pois houve diminuição da mortalidade. Inesperadamente, a mortalidade aumentou a partir de então.

• Uma vez que a resistência no grupo mantido sob pressão de seleção (R) não aumentou linearmente (conforme o esperado), não foi possível afirmar que as diferenças observadas nos parâmetros de viabilidade estavam relacionadas com a resistência.

• Os mesmos parâmetros foram avaliados em populações provenientes de diferentes regiões do país, e com diferentes status de susceptibilidade a inseticidas. Apenas duas populações, entre aquelas com maiores níveis de resistência, apresentaram comprometimento de viabilidade. Em ambos os casos, as alterações foram mais sutis do que aquelas observadas na população selecionada em laboratório.

• O grupo R, embora mantido sob pressão de seleção com piretróide no laboratório, teve aumento da resistência ao organofosforado temephos. Por outro lado, a população de campo com maior resistência a temephos (Henrique Jorge), foi também a que apresentou maiores alterações em aspectos de viabilidade e reprodução.

• As alterações em aspectos da biologia identificadas no grupo R podem não ser freqüentemente observadas em populações naturais: indivíduos portadores destas alterações têm um menor valor adaptativo e, na ausência do inseticida, perpetuariam menos suas características.

• As alterações, observadas em populações de campo, reforçaram a hipótese de que a resistência a inseticida possui um custo evolutivo no inseto.

92

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