caracelli-zukerman

Ignez CaracelliIgnez Caracelli

BioMat – DF – UNESP/Bauru

Bauru, 08 de outubro de 2007

Aula 8Aula 8Proteínas: da extração à estrutura 3D Proteínas: da extração à estrutura 3D

IntroduçãoIntrodução a a BioquímicaBioquímica: : BiomoléculasBiomoléculas

Julio Julio ZukermanZukerman SchpectorSchpector

LaCrEMMLaCrEMM –– DQ DQ –– UFSCarUFSCar

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proteínaproteína purificadapurificada

PassosPassos necessáriosnecessários parapara estruturaestrutura 3D3D

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extração

proteína purificada

?

ISOLAMENTO•material de partida � extrato bruto•desintegração celular

•extração de enzimas solúveis e de membrana

•meio de extração

Obtenção de proteína purificadaObtenção de proteína purificada

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células ou tecidosPellets com células intactas, organelas, membranas e proteínas de membranas

Sobrenadante comProteína solúvel

células ou tecidoscélulas ou tecidos

misturar, agitar, misturar, agitar, homogeneizar, homogeneizar, sonicarsonicar

IsolamentoIsolamento

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extração

proteína purificada

isolamento

PURIFICAÇÃO•métodos e condições experimentais•estratégia na purificação de enzimas.

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purificaçãopurificação

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SeparaSeparaçção de Proteão de Proteíínas nas

�Fracionamento: solubilidade da proteína depende da temperatura, pH, forca iônica

�Diálise

�Ultrafiltração

�Coluna cromatográfica

�Eletroforese

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Coluna cromatogrColuna cromatográáfica fica

reservatório

proteínas

amostra de proteamostra de proteíínana(fase m(fase móóvel)vel)

matriz smatriz sóólida porosalida porosa(fase (fase estacionestacionáária)ria)

suporte porososuporte poroso

efluenteefluente

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• cromatografia por exclusão de tamanho

• proteínas maiores correm mais rápido

• volume de amostra élimitado

• coluna usualmente longa

Cromatografia filtração em gelCromatografia filtração em gel

leito de polímeroporoso

mistura de proteínas éadicionada à coluna

moléculas de proteínas são separadas por tamanho; as

moléculas maiores aparecem nas 1as frações

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Cromatografia filtração em gelCromatografia filtração em gel

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• Separa proteínas por suas especificidades de ligação

CromatografiaCromatografia de de afinidadeafinidade

mistura de proteínas

proteproteíína de interessena de interesse

liganteligante

mistura de proteínas é adicionada à coluna

contendo polímeros com ligantes específicos para

a proteína de interesse

proteínas não-desejadasdeixam a coluna

proteína de interessedeixa coluna com

a solução de ligantes

solução de ligante

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CromatografiaCromatografia de de afinidadeafinidade

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Purificação de uma enzima hipotéticaPurificação de uma enzima hipotética

150004500036cromatografia de afinidadecromatografia de afinidade

6006000010080cromatografia de gel filtração cromatografia de gel filtração

2008000040090cromatografia de troca iônicacromatografia de troca iônica

32960003000280precipitação com sulfato de amônio precipitação com sulfato de amônio

10100 000100001400extrato celular brutoextrato celular bruto

atividade especifica (unidades/mg)

atividade

(unidades)

proteína total

(mg)

volume (mL)etapaetapa

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A280 02520025852000252000

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20Fraction

#

A280

Fraction #

Peaks

perfil de perfil de eluiçãoeluição

Purificação Purificação

coletor de coletor de frações frações

fração nfração núúmero mero

fração nfração núúmero mero

picos picos

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extraçãoextração

proteína purificadaproteína purificada

isolamento

purificaçãoQUANTIFICAÇÃOMétodos de quantificação de proteína.

CONTROLE DA PUREZAMétodos de controle da pureza.

Eletroforese

ATIVIDADEEnsaios enzimáticos e fatores que

governam a atividade catalítica.

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controle da pureza

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Eletroforese: SDSEletroforese: SDS--PAGEPAGE

• proteínas migram de acordo com tamanho e forma

• a proteina édenaturada, as subunidades se separam

catodocatodo

anodo anodo

popoçço o

diredireçção de ão de migramigraçção ão

Amostra Amostra

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Eletroforese: SDSEletroforese: SDS--PAGEPAGE

Amostra Amostra

diredireçção de ão de migramigraçção ão

mistura de macromoléculas

gel porosogel poroso

eletroforese eletroforese

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CoomassieCoomassie blueblue

Eletroforese: coranteEletroforese: corante

4 4 subunidadessubunidades

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Eletroforese: curva de calibração Eletroforese: curva de calibração

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• para determinar pI da proteína

• utiliza anfolitospara obter um gradiente de pH

• proteínas param de migrar quando pH = pI

Eletroforese: focalizaEletroforese: focalizaçção isoelão isoeléétricatrica

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Eletroforese: focalizaEletroforese: focalizaçção isoelão isoeléétricatrica

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Eletroforese: FocalizaEletroforese: Focalizaçção isoelão isoeléétricatrica

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Eletroforese: FocalizaEletroforese: Focalizaçção isoelão isoeléétricatrica

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Pontos isoelPontos isoeléétricos de algumas tricos de algumas proteinasproteinas

proteínaproteína pIpIpepsinapepsina < 1,0< 1,0

albumina de ovo albumina de ovo 4,64,6

albumina de plasma albumina de plasma sangsangüüííneoneo 4,9 4,9

ureaseurease 5,0 5,0

ββββββββ--lactoglobulinalactoglobulina 5,2 5,2

hemoglobina hemoglobina 6,8 6,8

mioglobina mioglobina 7,0 7,0

quimotripsinogquimotripsinogêênionio 9,5 9,5

citocromocitocromo C C 10,7 10,7

lisozima lisozima 11,0 11,0

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extração

proteína purificada IC

isolamento

purificação

quantificação atividadecontrole da pureza

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M.S.Almeida e E. Kurtenbach, Biotecnologia, Ciência e Desenvolvimento, 24, jan/fev, 2002

protocolosprotocolos e e procedimentosprocedimentos

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poolproteína pura

ativaconcentração ~ 1 mg/mL

no final no final dada purificaçãopurificação

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proteína purificada ativaproteína purificada ativa

IC

concentração ~ 1 mg/mLbaixa quantidade

concentração ~ 10 mg/mL ou maisquantidade ~ 30 mg

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.evaporação sob vácuo (cuidado com o tampão!!!)

.liofilização (cuidado com o tampão!!!!)

.diálise

.filtração

.centrifugação (centricon)

.eletroforese preparativa

.retenção em suportes cromatográficos

Métodos típicos para concentraçãoMétodos típicos para concentração

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Por que a proteína cristaliza?Por que a proteína cristaliza?

• ocorre se o processo for favorável do ponto de vista da termodinâmica

• os precipitantes removem água do meio forçando as moléculas a se associarem

água

Proteína

PEG

sais

açúcares

solventes orgânicos

precipitanteprecipitante

- --

-

++

++

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cristalizacristalizaççãoão precipitaprecipitaççãoão

solubilidadesolubilidade dada macromolmacromolééculacula

diferemdiferem emem suassuas cincinééticasticas

Métodos para cristalizaçãoMétodos para cristalização

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cristalizacristalizaççãoão

diálise (ca. 20%)

precipitaprecipitaççãoão

MÉTODOS BÁSICOS

difusão de vapor (ca. 60%)

difusão em interface livre

batch

Métodos para cristalizaçãoMétodos para cristalização

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DIFUSÃO DE VAPOR

graxa de vácuo

lamínula

gota (10 µl)

(proteína + precipitante)

solução precipitante (1 ml)

“processo de equilíbrio entreduas soluções através dafase de vapor em um meiofechado”

solusoluççãoão inicialinicial menosmenos concentradaconcentrada (GOTA)(GOTA)

�������� perdeperde solventesolvente volvoláátiltil �������� = = potenciaispotenciais ququíímicosmicos

solusoluççãoão inicialinicial maismais concentradaconcentrada ((RESERVATRESERVATóóRIORIO))

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DIFUSÃO DE VAPORDIFUSÃO DE VAPOR

graxa de vácuo

lamínula

gota (10 µl)

(proteína + precipitante)

solução precipitante (1 ml)

Vres >>> Vgota ���� equilíbrio atingido����

pressão de vapor difusão de espécies voláteisgota = reservatório (água ou solvente orgânico)

“processo de equilíbrio entreduas soluções através dafase de vapor em um meiofechado”

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“processo de equilíbrio entre duas soluções através da fase de vapor num meio fechado”

"hanging drop" (gota pendurada)

"sitting drop" (gota sentada)

"sandwich drop" (gota em sanduíche)

DIFUSÃO DE VAPORDIFUSÃO DE VAPOR

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GotaGota tradicionaltradicional: : lisozimalisozima

2µl 2µl

4µl

tampão (precipitantes)30% w/v PEG 50001 M NaCl50 mM AcetatoNa pH 4,5

lisozima (proteína)100 mg/ml50 mM AcetatoNa pH 4,5

lamínula siliconada

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Difusão de vapor: Difusão de vapor: HangingHanging DropDrop

• largamente usado

• gota equaliza com o

reservatório

• volume da gota diminui

lentamente

• concentração da solução de

proteina aumenta

lentamente

A1 A2 A3 A4 A5 A6

B1 B2 B3 B4 B5 B6

C1 C2 C3 C4 C5 C6

D1 D2 D3 D4 D5 D6

[X]

[Y]

reservatório

gotacristaiscristais

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Difusão de vapor: Difusão de vapor: SittingSitting DropDrop

A1 A2 A3 A4 A5 A6

B1 B2 B3 B4 B5 B6

C1 C2 C3 C4 C5 C6

D1 D2 D3 D4 D5 D6

[X]

[Y]

reservatório

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Fases da solução de proteínaFases da solução de proteína

[Proteína]

solu

bili

dad

e

supersaturação supersaturação metaestável

subsaturada

precipitação

cristais

crescimento e nucleação crescimento e nucleação

crescimentocrescimento

barreira de nucleação barreira de nucleação

solução de proteína solução de proteína

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Fatores que afetam o crescimento de cristaisFatores que afetam o crescimento de cristais

• força iônica *

• íons específicos (Ca2+)

• concentração da proteina *

• detergentes

• Inorganic Precipitant

• pH*

• temperatura*

• tempo

• monodispersao*

• vibrações

• pressão

• gravidade

• pureza da proteina*

• Access to water*

• ligantes

• etc....

**mais importantesmais importantes

http://www.hamptonresearch.com/

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INFORMAINFORMAÇÇÕES SOBRE A PROTEÕES SOBRE A PROTEÍÍNANA

PRECIPITANTES

BioquímicaBioquímicaBancos de dadosBancos de dados

Banco de CristalizaçãoBanco de Cristalização

TESTES DE PRECIPITAÇÃO

Experimentos iniciais de cristalização Experimentos iniciais de cristalização

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INFORMAÇÕES SOBRE A PROTEÍNA

PRECIPITANTES

BioquímicaBancos de dados

Banco de Cristalização

TESTES DE PRECIPITAÇÃO

EXPERIMENTOS INICIAIS DE CRISTALIZAÇÃO

Cristalização de Proteínas Cristalização de Proteínas

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MontagemMontagem do do cristalcristal

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ColetaColeta de Dadosde Dados

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Difração de Raio XDifração de Raio X

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reflexões indexadas (h,k,l)

lista de intensidades

simetria

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Função densidade eletrônica Função densidade eletrônica

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Resultado experimental

= o que você vê

o que você vê +

o que você pensa =

o que você obtém

Mapa de densidade eletrônicaMapa de densidade eletrônica

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ResoluçãoResolução

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