aula prÁtica conduta e atitudes no laboratÓrio de

Aulas Práticas de Microbiologia Prof. Márcia G. Perdoncini

AULA PRÁTICA CONDUTA E ATITUDES NO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA:

1- As normas regulamentadoras de segurança e saúde no trabalho do Ministério do Trabalho e Emprego devem ser seguidas. Estas estão disponíveis no site: <http://www.mte.gov.br/legislacao/normas_regulamentadoras/default.asp>

2- O laboratório deverá ser utilizado, exclusivamente, com atividades para o qual foi designado. 3- É proibido o uso de qualquer aparelho de som e imagem, tais como rádios, televisões, aparelhos

de MP3, reprodutores de CDs e DVDs e telefones celulares, entre outros. 4- É proibido fumar no laboratório. 5- É proibida a ingestão de qualquer alimento ou bebida nas dependências do laboratório. 6- É proibido o uso de medicamentos e a aplicação de cosméticos nas dependências dos

laboratórios. 7- É proibido o manuseio de lentes de contato nas dependências dos laboratórios. 8- Deve-se evitar trabalhar com roupas folgadas, fios, pulseiras ou outro tipo de adornos que

coloquem em risco a segurança. 9- Toda atividade que envolver certo grau de periculosidade exigirá obrigatoriamente a utilização

de EPIs adequados (luvas, óculos, máscaras, jalecos, mangotes etc.). 10- É obrigatório o uso do jaleco até os joelhos, preferencialmente de manga longa, calça comprida

até os pés, calçado completamente fechado e cabelo longo preso dentro das dependências do laboratório.

11- Os Equipamentos de Proteção Individual são de uso restrito às dependências do setor laboratorial e de uso obrigatório para todos no setor.

12- Vestuário, livros e outros objetos de uso pessoal, não necessários ao trabalho prático, deverão ser colocados em locais apropriados, nunca nas áreas de trabalho.

13- Em aulas práticas, os alunos de graduação só deverão ter acesso ao laboratório com a presença do professor responsável, do professor da disciplina usuária ou do técnico responsável, e durante o horário de expediente; o professor ou técnico deverá permanecer com os alunos durante todo o período de desenvolvimento das atividades. Exceções serão admitidas apenas mediante autorização por escrito do professor responsável.

14- Os usuários não deverão deixar o laboratório sem antes se certificar de que os equipamentos, bancadas, ferramentas e utensílios estejam em perfeita ordem, limpando-os e guardando-os em seus devidos lugares, de forma organizada.

15- Utilizar as tomadas elétricas exclusivamente para os fins a que se destinam, verificando se a tensão disponibilizada é compatível com aquela requerida pelos aparelhos que serão conectados.

16- Não levar à boca o material de trabalho (lápis, canetas, etc) e evitar colocar as mãos na boca, nos olhos e no nariz.

17- Lavar cuidadosamente as mãos antes e depois do trabalho prático. 18- Limpar as bancadas de trabalho com álcool 70 antes e depois do trabalho prático. 19- Não pipetar produtos com a boca, usar sempre os dispositivos mecânicos. 20- Não levar o material usado nas aulas práticas para fora do laboratório. 21- Evitar a contaminação das bancadas de trabalho, chão e cestos de papéis. O material

contaminado nunca deve ser esquecido em locais desapropriados, nem colocado inadvertidamente em cima das bancadas de trabalho.

22- Colocar o material contaminado (pipetas, espátulas, lâminas e lamínulas) após a sua utilização em recipientes próprios contendo desinfetante.

23- Materiais para descontaminação (com cultivo microbiano) devem ser colocados antes do descarte em lugar apropriado e previamente identificado.

24- Relatar imediatamente ao docente qualquer acidente que provoque lesão corporal ou que origine derrame dos microrganismos para fora dos respectivos meios de cultura.

25- No final da aula prática, o local de trabalho deve ficar devidamente limpo e arrumado. 26- Verificar se o microscópio fica desligado, limpar as objetivas e colocar a capa protetora. 27- Verificar ainda se o gás ficou desligado. 28- Procedimentos de esterilização de materiais devem ser acompanhados completamente e se

preciso, solicitar ajuda dos técnicos.


29- Equipamentos que usam calor e pressão precisam de cuidados redobrados no uso. Não deixar materiais sob aquecimento sem o seu acompanhamento. Pedir auxílio aos técnicos, se necessário.

30- Colocar vidrarias quentes sobre panos ou flanelas, e não diretamente sobre a bancada ou outras

superfícies mais frias, pois podem trincar ou quebrar.

31- Cuidado ao trabalhar com vidrarias: elas são frágeis, fáceis de quebrar, e o estoque é limitado;

32- Manter um comportamento apropriado e com disciplina. Não correr e não fazer barulho desnessário.

33- Certificar-se da correta utilização dos equipamentos. Pedir explicação de uso aos técnicos, se

necessário.

34- O professor (responsável pelo laboratório ou pela turma que estiver usando o laboratório) tem total autonomia para remover do laboratório o usuário que não estiver seguindo estritamente as normas de utilização (gerais e/ou específicas).

35- Em casos de acidentes (cortes, queimaduras, etc.) com equipamentos, vidrarias, reagentes,

microrganismos procure manter a calma, comunique os técnicos e solicite ajuda. Existe um procedimento de atendimento para estes casos.

A) Materiais mais utilizados no laboratório de microbiologia: 1. Alça de inoculação; 2. Autoclave; 3. Balanças; 4. Balão de fundo chato; 5. Bastão de vidro; 6. Becker; 7. Bico de gás; 8. Cálice; 9. Chapa elétrica; 10. Conta-gotas; 11. Erlenmeyer; 12. Escova para limpeza de vidrarias; 13. Espátulas; 14. Estante para tubos de ensaio; 15. Estufa; 16. Esterilizador; 17. Pisseta ou pissete 18. Funil; 19. Lâminas; 20. Lamínulas; 21. Microscópio; 22. Pera; 23. Pinças;


24. Pipetas; 25. Placa de Petri; 26. Provetas; 27. Tela de amianto; 28. Tripé; 29. Tubos 1 ) ALÇA DE INOCULAÇÃO: – Arame de liga metálica e cabo; – Transfere por toques leves, a amostra infectada para culturas 2) BALANÇA: – Determina a massa de um corpo (“peso’’) – Balança analítica elétrica: cuidar com a conservação – Balança analítica eletrônica: Estágio mais avançado – décimo do grama ao milésimo do miligrama 3) BALÃO DE FUNDO CHATO: – Balão de Florence ou Florença; – Vários usos; – Condicionamento e preparo de meios de cultura; 4) BASTÃO DE VIDRO: – Muito usado; – Agitação de soluções; – Cuidado: não ser danificado nem danificar o recipiente; 5) BECKER: – Copo de Becker, copo de Griffin, copo de Berlim; – Varios usos; – Pesagem e diluição 6) BICO DE GÁS: – Chamas de diferentes intensidades ; – Vários tipos; – Bico de Bunsen, Bico de Tirril, Bico de meker; – Cuidados no acendimento:

1. Segurar o fósforo aceso acima e ao lado do tubo; 2. Abrir cautelosamente a torneira de gás; 3. Chama acesa ( ajustá-la) :

• Amarelada e fumacenta: Falta ar • Desprendendo do bico: Excesso de gás; • Bico queimado por dentro: Mistura de ar e gás não está bem regulada – apagar imediatamente o bico .

Esfriar; Como acender corretamente o bico de gás:

1. Fechar a entrada de gás; 2. Abrir o gás e acender a chama; 3. Abrir o ar até obter uma chama totalmente azulada; 4. Se a chama não estiver azul e estiver totalmente aberto, diminuir o gás.

7) CÁLICE: – Copo de precipitação ou sedimentação – Usado em decantação ou substâncias quando em suspensão 8) CHAPA ELÉTRICA: – Fonte de calor ( resistência elétrica); – Protegida por material refratário ( ex. Amianto); – Uso: Aquecimento de substâncias inflamáveis 9) CONTA – GOTAS: – Colorações 10)ERLENMEYER: – Aquecer substâncias; – Boca estreita: substâncias voláteis ou inflamáveis ( Vantagens sobre o becker) – Agitação / destilação


– Acondicionar meios de cultura 11) ESCOVA PARA LIMPEZA DE VIDRARIAS: – Cuidado: evitar atrito entre sua parte metálica e o material a ser lavado 12) ESPÁTULA: – Pesagem de sólidos e pastosos; – Aço inoxidável, níquel, porcelana, madeira, osso, plástico. 13) ESTANTE PARA TUBOS DE ENSAIO: – Suporta tubos na posição vertical; 14) ESTUFA: – Estufa para cultura bacteriológica e estufa para secagem e esterilização de materiais; – Parede dupla: Interna – chapa de aço com anticorrosivo Externa – aço ou madeira de lei – Isolamento térmica : lã de vidro entre as paredes – Regular a estufa – Vidraria: – Impecavelmente limpa e escorrida; – Boca dos frascos sempre para cima; – Retirar tampas; – Retirar qualquer parte de plástico; – Arrumar de maneira que não caia ou role quando abrir a estufa; – Os tubos de ensaio devem ficar na estante; – Feita a secagem, desligar a estufa e guardar a vidraria. 15) FRASCO LAVADOR, PISSETA OU PISSETE: – Colocar água 16) FUNIL: – Transposição de substâncias – Filtração – Haste: longa – maior rapidez de filtração ; curta: menor rapidez de filtração 17) LÂMINA: – Usada em microscopia – Deve estar limpa e desengordurada para ser utilizada; 18) LAMÍNULA: – Dá cobertura ao material colocado sobre a lâmina; 19) MICROSCÓPIO 20) PERA DE BORRACHA: – Uso: sopro ou sucção – Ex. Pipetar ácidos 21) PINÇAS: – Uso variado – Madeira: tubos de ensaio levados ao fogo; 22) PLACAS DE PETRI: – Par de placas – Acondiciona meios de cultura; 23) PIPETAS: – Graduadas ou volume fixo a) escoamento total b) escoamento parcial – volumétricas ou transferidoras � Micropipetas. 24) PROVETA: – Medir volumes sem grande previsão 25) TELA DE AMIANTO: – Tela de arame com cimento à base de amianto – Amianto: distribui o calor uniformemente; 26) TRIPÉ: – Sustentam recipientes que devem ser aquecidos com o bico de Bunsen


27) TUBOS: – Uso variado – Diâmetro e comprimento variam PROVETAGEM: – Proveta: cilindro graduado / medir volumes – Não é utilizado para volumes com alta precisão – Calibração à 20C – Substância – becker – proveta – Becker – bastão de vidro – proveta ( paredes) – Graduação LEITURA: 1. Analisar a proveta (capacidade, subdivisões, ...) 2. Medida desejada – parte inferior do líquido – menisco – solução transparente; 3. Parte superior do menisco – substância opaca 4. Leitura: menisco à altura dos olhos do observador; Obs. – A proveta deverá estar de repouso, se segurar com as mãos a leitura é incorreta. PIPETAGEM: 1. Mergulhar a pipeta limpa e seca na solução ( a ponta não deve tocar o fundo, nem ficar muito na

superfície) 2. Sucção: até acima do volume desejado 3. Controlando com o dedo indicador ajustar o volume desejado ( menisco) 4. Retirando o dedo o volume escoa rapidamente OBS. – Nunca pipetar líquidos corrosivos ou venenosos com a boca e sempre com a pera; – Ao encher a pipeta deixar sempre a ponta da mesma abaixo da solução; – A ponta da pipeta deve ficar em contato com a parede interna para o volume escoar completamente; – Uma pequena quantidade sempre permanece na ponta da pipeta – previsível – AUTOCLAVE: – Vários modelos: horizontais, verticais, gas, vapor; – Laboratórios de microbiologia: – Caldeira cilíndrica de paredes resistentes; – Tampa com borracha: perfeita vedação – Interior: suporte para cesta metálica; – Fundo: espaça – água (onde fica mergulhada a resistência) – Tampa: orifício de escapamento, válvula de segurança e manômetro ( pressão e temperatura) Obs. Ar residual – forma uma película no material, evitando a penetração do calor - O vapor tem ação esterilizante pois se condensa na superfície fria dos objetos cedendo-lhes seu calor latente.


AULAS PRÁTICAS DE MICROBIOLOGIA

AULA PRÁTICA ASSUNTO: Uso do Microscópio Luminoso A) ROTEIRO TEORIA: Microscópio Luminoso:

• Partes Mecânicas: base ou pé, platina, presilhas, charriot, revólver, canhão, botões macrométrico e micrométrico, botões de controle coaxiais x e y, condensador, diafragma, botões do condensador, botão de abertura do diafragma.

• Lentes oculares • Lentes objetivas • Objetiva de imersão / Óleo de imersão • Poder de resolução do microscópio (comprimento de onda da luz)

Microscópio Eletrônico B) RESUMO TEORIA: Microscopia Luminosa e Eletrônica 1) Microscopia Luminosa (Microscópio Luminoso ou Óptico): - Produz ampliação máxima de cerca de 1000 vezes o tamanho original da amostra - Possui dois tipos de lentes: Objetivas e Oculares - São obtidas ampliações com poder de resolução de até 0,25 mícron (µm). A ampliação do microscópio é limitada pelo seu poder de resolução. 1.1) Poder de Resolução: - Consiste em distinguir dois pontos vizinhos, mostrando-os como detalhes separados e não como borrão ou soma de duas imagens; -Partículas colocadas a uma distância menor que 0,25 µm entre sí são vistas como uma partícula só. 1.2) Aumento Total do Microscópio Óptico: - É determinado pelo fator de ampliação da objetiva e o fator de ampliação da ocular, como mostra a tabela abaixo:

Designação da objetiva

Ampliação da objetiva

Ampliação da ocular Ampliação total

Baixo poder 5 10 50

Médio poder 10 10 100

Alto poder 40 10 400

Imersão 100 10 1000

1.3) Partes do Microscópio Luminoso:

- Base ou pé: apoio para a parte óptica;


- Platina: local onde se põe a lâmina contendo o material para análise; - Espelho ou fonte de luz (lâmpada de halogênio) - Condensador e diafragma: concentram os raios luminosos sobre a lâmina e o material em exame; - Tubo ou canhão: contém as lentes oculares e o revólver; - Revólver: peça giratória na qual se prendem as lentes objetivas; - Objetivas: ampliam a imagem do material observado. Gira-se o revólver da objetiva de menor

aumento para a de maior poder de ampliação. - Objetiva de imersão: é a objetiva de maior aumento, caracterizada por um anel fino em sua extremidade; - Óleo de imersão: colocado entre entre a lâmina e a lente. O uso deste óleo permite que se captem os feixes de raios luminosos que seriam desviados pelas superfícies da lâmina e ar.

- Lentes oculares: amplia a imagem já ampliada pelas objetivas; - Botões macrométrico e micrométrico: aproximam ou afastam a platina com a lâmina da objetiva para

proporcionar um bom foco; - Macrométrico: faz aproximações e afastamentos amplos; - Micrométrico: faz aproximações e afastamentos pequenos;

C) ROTEIRO PRÁTICA: 1. Observar as lâminas em objetivas de 5, 10 e 40 vezes 2. Observar as lâminas em objetiva de imersão


PROCEDIMENTO: Procedimento Geral:

1. Ligar o cabo elétrico na tomada. 2. Ligar a lâmpada. 3. Colocar o preparado no microscópio. 4. Ajustar a distância interpupilar (ver 1.4.2) e a dioptria (ver 1.4.1). 5. Colocar a objetiva de 10x no trajeto de luz. 6. Encostar o condensador na lâmina. 7. Regular a intensidade luminosa com o botão de ajuste correspondente, quando existir este

dispositivo. A intensidade luminosa deve ser ajustada para cada tipo de objetiva. Quanto maior a capacidade de aumento, maior será a necessidade de iluminação.

8. Colocar a lente auxiliar em posição, nos microscópios com este dispositivo. 9. Fixar o preparado microscópico, montado em lâminas perfeitamente limpas, no "charriot" e colocar

na posição desejada por meio dos controles coaxiais (Controles nas coordenadas X e Y). 10. Focalizar com o macrométrico. 11. Realizar a focalização fina com o controle micrométrico. 12. Movimentar o controle micrométrico para evidenciar estruturas existentes em vários níveis do

preparado. 13. Movimentar toda lâmina através dos controles coaxiais de modo regular até encontrar a estrutura

procurada. 14. Se necessitar de maior aumento, colocar as lentes correspondentes em posição e focalizar.

NOTA: A lente frontal do condensador deverá estar na sua posição mais alta para que se possa aproveitar toda a sua capacidade.

Observação com aumento de 10x e 20x:

– Geralmente utilizada para organismos grandes como helmintos e seus ovos e para focalização de lâminas.

Observação com aumento de 40x:

– É possível a observação de alguns organismos maiores ou células neste aumento. – É utilizado para pré-focagem do campo, pois torna mais cômoda a focalização fina com a

objetiva de 100x. – Para observação com este aumento é necessário a utilização de lamínulas. – A espessura da lamínula não deve ultrapassar a 0,17 mm. Esta medida vem gravada na

objetiva de 40x. – A espessura da montagem da peça (corte histológico ou esfregaço mais meio de montagem

e lamínula) deve ser o mais fina possível. – A espessura excessiva interfere na formação da imagem devido à difração da trajetória do

feixe luminoso. Observação com aumento de 100x (em óleo de imersão) É necessário utilizar óleo de imersão para que os raios luminosos não sejam desviados pela camada de ar entre a lente e a lâmina. - Focalizar o preparado com a objetiva de 40x; - Colocar uma gota de óleo de imersão sobre o preparado (o óleo de imersão deve apresentar índice de refração ne = 1,518 e de dispersão de g = 43); - Colocar a objetiva de imersão (100x) em posição; - Encostar a lente frontal da objetiva no óleo por meio da manipulação dos controles coaxiais do "charriot"; - Focalizar através do controle micrométrico.


UTILIZAÇÃO DE LÂMINAS E LAMÍNULAS As lâminas devem ser transparentes, livres de manchas e devem medir um milímetro de espessura. As lamínulas devem medir 0,17 mm de espessura para permitir a formação de uma boa imagem.

• Preparo: - Lavar as lâminas e lamínulas com detergente comum, esfregando uma a uma; - Enxaguar em água destilada duas vezes para retirar os resíduos; - Secar e manter em frascos com álcool etílico comercial até o momento do uso.

• Descarte: - As técnicas de coloração nem sempre são suficientes para inativar o organismo presente na lâmina ou lamínula. - As lâminas e lamínulas devem ser tratadas como as demais vidrarias de laboratório, depositadas em frascos contendo desinfetante após o uso e descartadas por meio de tratamento pelo calor úmido. CUIDADOS COM O MICROSCÓPIO Durante o uso:

• Nunca soprar as lentes para retirar a poeira, pois micropartículas de saliva podem se depositar nas lentes.

• Nunca usar lenços faciais para limpeza de lentes pois estes podem conter filamentos de vidro que riscam a lente. Poderão ser usados tecido de linho ou algodão hidrófilo.

• Seguir rigorosamente as instruções do fabricante do equipamento quanto ao uso de solventes para a limpeza.

• Nunca usar álcool para limpeza de lentes, pois a cola usada na montagem das mesmas é freqüentemente solúvel em álcool.

• Limpar o óleo residual das objetivas ao final de cada uso com algodão hidrófilo, ou uma flanela macia, umedecido em xilol ou em éter-acetona 1:1.

• Nunca deixar os orifícios de conexão das objetivas e oculares abertos. • Mantê-los fechados por plug de proteção adequados ou com as próprias oculares ou objetivas. • Não tocar nas lentes com as mãos. • Somente usar óleo de imersão que atenda a especificação estabelecida pelo fabricante. • Nunca usar óleo de imersão para trabalhos com objetivas que não sejam de imersão. Estes óleos

danificam as substâncias de montagem destas objetivas. • Os microscópios devem ser colocados em superfícies isentas de vibrações e não são recomendadas

mudanças de localização. Limpeza: Corpo:

– Usar álcool ou uma flanela levemente umedecida com água para limpeza do corpo do microscópio.

– Quando usar a flanela úmida, secar imediatamente com uma flanela seca. – Lubrificar as partes móveis com lubrificante derivado do petróleo, como a vaselina, ou

outro lubrificante recomendado pelo fabricante.

Lentes e partes óticas:

– Retirar a poeira usando ar expulso por bulbo de borracha. – Para limpar as lentes, usar tecido especial para limpeza de lentes levemente umedecido em

solução limpadora (ex.: Kodak), específica para lentes de microscópios e equipamentos óticos.

– Resíduos de corantes podem ser retirados com algodão hidrófilo embebido em xilol.


ANOTAÇÕES: MATERIAIS: EQUIPAMENTOS: AMOSTRA: RESULTADOS:


AULA PRÁTICA ASSUNTO: Colorações ROTEIRO TEORIA: - Exame à fresco - Colorações:

• Coloração simples • Coloração composta • Etapas da coloração: preparação do esfregaço, fixação do esfregaço, coloração

RESUMO TEORIA: - Exame à fresco - Coloração:

Qualquer processo de coloração segue basicamente três passos:

1. Preparo do esfregaço: O esfregaço é a colocação dos microrganismos na lâmina de vidro para serem submetidos à coloração. Deve ser oval e delgado.

2. Fixação do esfregaço: serve para fixar os microrganismos do esfregaço na lâmina de vidro, para que posteriormente não sejam removidos durante o processo de coloração.

• Este procedimento faz com que o protoplasma das células dos microrganismos se coagule,aderindo-os desta forma na lâmina.

• A forma mais utilizada de fixação de esfregaço, é passá-lo pela chama umas três vezes. Há também outros processos utilizando produtos químicos.

3. Coloração propriamente dita: são os procedimentos de cada técnica de coloração. PREPARAÇÃO DO ESFREGAÇO

• Para sucesso na observação, é necessário que o esfregaço seja bem feito, apresentando-se em monocamadas, suficientemente concentrado de forma a facilitar a visualização.

• A secagem dos esfregaços deve ocorrer ao ar. Depois de secos, os esfregaços podem ser fixados com calor, passando rapidamente 2 a 3 vezes através da chama de bico de Bunsen.

FIXAÇÃO DO ESFREGAÇO

• Após secar, passar a lâmina com o esfregaço para cima, por três vezes pela chama do bico de Bunsen.

COLORAÇÃO:

• As técnicas de coloração usadas em microbiologia se destinam à observação de estruturas morfológicas como esporos, flagelos e forma das células, diferenciando microrganismos.

• As colorações podem ser: • Simples (quando se utiliza apenas um corante): estudo morfológico básico da célula, como forma e

agrupamentos dos microrganismos. Ex. coloração por azul de metileno • Diferencial ou Composta (quando se utiliza dois ou mais corantes): estudo morfológico e de

algumas ultra estruturas dos microrganismos. • Ex. Coloração de Gram, Coloração de esporos, Coloração de Flagelos, Coloração de

Corpúsculos de inclusão, etc.


COLORAÇÃO DE GRAM

• A coloração de Gram é uma das mais importantes em microbiologia, pois separa asbactérias em dois grandes grupos: Gram positivas e Gram negativas.

– A coloração de Gram utiliza características diferenciais das células bacterianas. Estas características diferenciais se referem à estrutura da parede celular dos microrganismos.

Coloração Simples

Coloração Composta ou Diferencial


– Os microrganismos que contêm altos teores de ácido teicóico (peptideoglicano) em sua parede celular se coram, pela coloração de Gram, em roxo-azulado intenso e são chamados de "Gram positivos".

– Os microrganismos que contém lipopolissacarídeos na membrana externa somente se coram com o contracorante, mostrando-se da cor do mesmo (vermelho), e são denominados "Gram negativos".

Reagentes 1. Cristal Violeta

– Este composto cora toda a célula em roxo-azulado intenso. Preparo Solução A:

– Cristal violeta (90-95% de pureza) - 2 g – Etanol 95% - 20 mL – Filtrar em papel de filtro.

Preparo Solução B: – Oxalato de amônio - 0,2 g – Água destilada - 80 mL

Preparo Solução de Trabalho: – Misturar as soluções colocando-se a solução B sobre a A. Deixar em repouso por 24 horas,

filtrando em seguida. – Estocar em frasco âmbar.

2. Solução de lugol (iodo iodeto de potássio) – O iodeto substitui o cloro do cristal violeta, formando um complexo insolúvel em água.

Preparo da solução de trabalho: – Cristais de iodo (ou ressiblimado) - 1 g – Iodeto de potássio - 2 g – Água destilada. - 300 mL – Misturar e deixar em repouso até dissolução.

Parede Celular de Bactérias Gram Positivas e Gram Negativas


3. Descorante – A solução de etanol 95% - acetona atua como descorante. – A descoloração ocorre apenas nas células de microrganismos Gram negativos. – Alguns autores sugerem que o álcool altera a permeabilidade da membrana externa dos

organismos Gram negativos, devido à sua ação sobre a membrana lipopolissacarídica, permitindo a retirada do complexo cristal violeta-iodeto da célula.

Preparo da solução descorante de etanol - acetona: – Acetona - 10 mL – Etanol 95% - 100 mL

4. Safranina (contracorante) • A safranina atua como contracorante tornando as células Gram negativas coradas e visíveis. • As células de microrganismos Gram positivos provenientes de culturas velhas, lesadas por qualquer

motivo ou mortas, também podem ser coradas pela safranina. Preparo do contracorante - Safranina O - Solução estoque:

– Safranina O - 2,5 mL – Etanol 95% - 100 mL

Solução de trabalho: – Solução estoque de safranina O - 10 mL – Água destilada - 90 mL


COLORAÇÃO DE GRAM INTERPRETAÇÃO: Existem algumas teorias que explicam a coloração de Gram: 1. O mecanismo da coloração de Gram se refere á composição da parede celular, sendo que as Gram

positivas possuem uma espessa camada de peptideoglicano e as Gram negativas, uma fina camada de peptideoglicano, sobre a qual se encontra uma camada composta por lipoproteínas, fosfolipídeos, proteínas e lipopolissacarídeos.

Etapas da Coloração de Gram


• Durante o processo de coloração, o tratamento com álcool (ou álcool - acetona) extrai os lipídeos, resultando então uma porosidade ou permeabilidade aumentada da parede celular das bactérias Gram negativas. Assim o complexo cristal violeta - iodo ( CV-I ) pode ser retirado e as bactérias Gram negativas são descoradas.

• A parede celular das bactérias Gram positivas, em virtude da sua composição diferente, torna- se desidratada durante o tratamento com álcool, a porosidade diminui, a permeabilidade é reduzida e o complexo CV-I não pode ser extraído.

2. Outra explicação baseia- se também em diferenças de permeabilidade entre os dois grupos de bactérias.

Nas bactérias Gram positivas, o complexo CV-I é retido na parede após tratamento pelo álcool- acetona, o que causa provavelmente uma diminuição da do diâmetro dos poros da camada de peptideoglicano da parede celular. A parede das bactérias Gram negativas permanece suficientemente grande, mesmo depois do tratamento com o álcool- acetona, possibilitando a extração do complexo CV-I.

3. Segundo Trabulsi, na etapa diferencial com o álcool -acetona, as bactérias Gram negativas devido a

pequena espessura da camada basal e às descontinuidades existentes nesta camada, em pontos de aderência entre a membrana externa e a membrana celular, tem o complexo corado extraído pelo álcool, que deixa as células descoradas.

ROTEIRO PRÁTICA: EXAME À FRESCO;

1. Flambar rapidamente uma lâmina de microscopia limpa, nos dois lados, “cortando” lentamente a chama do bico de Bunsen;

2. Flambar a alça de repicagem ao rubro e, a seguir, deixá-la esfriar, conservando-a todavia, perto da chama;

3. Tomar o tubo com a suspensão de microrganismos, agitá-lo levemente com a mão esquerda e, com os dedos mínimos e anular da mão direita, remover o tampão de algodão da boca do tubo;

4. Flambar a boca do tubo de cultura; 5. Introduzir a alça de repicagem, presa entre o polegar e o indicador da mão direita, no interior do

tubo, até tocar a suspensão; 6. Flambar novamente a boca do tubo de cultura; Fechar o tuba com o tampão de algodão e colocá-lo

na estante; 7. Tomar uma lâmina (anteriormente preparada) com a mão e depositar em seu centro uma gotícula de

supensão; 8. Pingar uma gota de azul de metileno a pequena distância da suspensão e, sobre a lâmina, colocar uma

lamínula; 9. Observar ao microscópio em objetiva de 40x.

COLORAÇÕES: 1. Preparar o esfregaço: desengordurar e identificar a lâmina e, ao redor da chama do bico de Bunsen: 2. Colocar sobre a lâmina 1 gota da cultura líquida ou, se for cultura sólida, colocar 1 gota de solução

fisilógica e espalhar a cultura sólida sobre esta gota com um alça de inoculação 3. Fazer o esfregaço, espalhando a cultura na lâmina com a alça de inoculação de modo que ele fique de

forma oval, no centro da lâmina e delgado (pouco material). Deixar secar espontaneamente ao ar ao lado da chama do bico de Bunsen.

4. Após secar bem, fixar o esfregaço passando a lâmina por 3 vezes na chama do bico de Bunsen (com o esfregaço voltado para cima)

5. Levar a lâmina para a pia para a realização da coloração de Gram Coloração simples:


1. Colocar sobre o esfregaço o corante azul de metileno ou o corante Fucsina de Ziehl; 2. Enxaguar em água corrente de baixa pressão; 3. Após secar espontaneamente ao ar, observar em objetiva de imersão. 4. Desenhar os microrganismos observados e anotar e os resultados (morfologia celular, arranjos celulares). Coloração de Gram: 1. Preparar o esfregaço (vide acima); 2. Colocar sobre o esfregaço o corante cristal violeta e deixar por 1 min. 3. Colocar lugol sobre o esfregaço e deixar por 1 min. 4. Enxaguar em água corrente de baixa pressão. 5. Descorar o esfregaço com álcool-acetona 1:1 por aproximadamente 10 seg. 6. Enxaguar em água corrente de baixa pressão 7. Colocar o corante Safranina (ou o corante fucsina de Ziehl 10%) sobre o esfregaço e deixar por 30 seg. 8. Enxaguar em água corrente de baixa pressão. 9. Deixar secar espontaneamente ao ar . 5. Observar em objetiva de imersão. 6. Desenhar os microrganismos observados e anotar e os resultados (morfologia celular, arranjos celulares). Exercícios de fixação:

1) Descreva detalhadamente o processo de esfregaço, a partir de uma cultura bacteriana sólida. 2) Qual a diferença entre esfregaço de cultura sólida e o de cultura líquida? 3) Como se faz a fixação de um esfregaço bacteriano? 4) Esquematize as preparações a fresco e as preparações coradas simples observadas. 5) Descreva a técnica da coloração de Gram. 6) Explique porque bactérias Gram-negativas apresentam coloração diferente das bactérias Gram

positivas.

ANOTAÇÕES: MATERIAIS: EQUIPAMENTOS: REAGENTES: AMOSTRA: RESULTADOS:


AULA PRÁTICA Assunto: Averiguação da presença de microrganismos no ambiente e experimento de Price INTRODUÇÃO

O meio aquático foi, provavelmente, o ambiente de origem dos microrganismos que, posteriormente, se especializaram e colonizaram o ambiente terrestre. Hoje, eles são encontrados em toda parte, em suspensão ou assentados com poeira em várias superfícies. Como os microrganismos estão presentes nas partículas de poeira, são passíveis de entrar no organismo do indivíduo cada vez que se respira. O ar deposita-se nos cabelos, nas roupas, na pele e nas mucosas. Do ar passam para o alimento e para a bebida. Felizmente, na sua maioria, os microrganismos são inócuos ou benéficos. São relativamente poucos os que causam prejuízos ao homem. É função do tecnólogo em alimentos estimular e otimizar o desenvolvimento de microrganismos benéficos e inibir aqueles que causam doenças ou deterioram os alimentos e o ambiente.

As mãos, por outro lado, constituem um dos elos mais importantes na cadeia da infecção cruzada. A quantidade de microrganismos constituintes da microbiota normal da pele deve ser reduzida, de modo a eliminar possíveis microrganismos patogênicos aí presentes.

OBJETIVOS

• Reconhecer materiais, equipamentos e normas do laboratório de microbiologia; • Averiguar a presença de microrganismos no ambiente e na pele; • Averiguar o efeito da higienização das mãos.

PROCEDIMENTO A. - Verificação de contaminação ambiental

1. Remover a tampa de uma placa de Petri com ágar nutriente e expô-la em uma determinada condição de sua preferência.

• Ar: deixar a placa com meio de cultura exposta ao ar por 15 minutos; ou colocar a placa sobre o parapeito da janela e remover a poeira ao redor com um pano.

• Pele ou cabelo: passar os dedos em vários pontos da superfície do ágar; ou agitar vigorosamente os cabelos em direção à superfície da placa;

• Respiração: inocular na placa, tossindo ou espirrando, diretamente sobre a superfície do ágar;

2. Utilizar como controles uma placa com meio estéril fechada e outra aberta, por cerca de 60 segundos, próximo ao bico de Bunsen aceso;

3. Abrir um dos tubos de caldo nutriente, deixando-o aberto ao ambiente por alguns minutos; 4. Identificar as placas e os tubos; 5. Fazer a incubação das placas e dos tubos à temperatura ambiente por 7 dias. As placas

devem ser incubadas invertidas, para evitar que o meio se desidrate e que água de condensação caia sobre a superfície do meio;

6. Após o período de incubação, anotar a presença e a diversidade morfológica das colônias microbianas que cresceram sobre a superfície do ágar.

B- Experimento de Price

1. Dividir o fundo da placa de Petri com ágar sangue em três partes, com lápis marcador, e identificar a placa.

2. Retirar um swab (zaragatoa) do tubo com assepsia e umedecê-lo em salina estéril; 3. Esfregar sobre a pele da palma da mão; 4. Semear em um terço da placa de ágar sangue, identificando-o como “mão sem lavar”


5. Lavar as mãos com detergente, vigorosamente, em todas as superfícies, durante 5 minutos;

6. Pegar outro swab esterilizado, umedecê-lo com salina e esfregá-lo nas palmas das mãos lavadas;

7. A seguir, semear o segundo swab em um terço da placa, identificando-o como “mãos lavadas”;

8. Desinfetar as mãos pré-lavadas com álcool iodado (durante 1 minuto) ou álcool a 70% (também durante 1 minuto);

9. Pegar outro swab esterilizado, umedecê-lo com salina e esfregá-lo nas palmas das mãos lavadas e desinfetadas;

10. Semear na terceira parte do meio de cultura e identificá-la como “mãos desinfetadas”; 11. Realizar a incubação a incubação a 37°C, por 48 horas, e fazer a leitura.

EXERCÍCIOS DE FIXAÇÃO

1. Em relação às placas com ágar nutriente (ar, pele, cabelo e respiração), enumere e caracterize as colônias que cresceram na superfície das placas, quanto a tamanho, cor e forma.

Placa Número Cor Forma Tamanho

2. Em relação às placas com ágar sangue, esquematize o resultado obtido com a experiência de Price. Nome do aluno

Mãos sem lavar

Mãos lavadas

Mãos desinfetadas

3. Qual a utilidade do bico de Bunsen no laboratório de microbiologia?

Pele ou cabelo Respiração Ar


4. O que ocorreu com os controles? Justifique os resultados e tire suas conclusões sobre essa aula.

ANOTAÇÕES: MATERIAIS: EQUIPAMENTOS: REAGENTES: AMOSTRA: RESULTADOS:


AULA PRÁTICA ASSUNTO: Preparo de Material de Laboratório para Análises Microbiológicas (Limpeza de Vidrarias: Descontaminação, Lavagem e Secagem) TEORIA /PRÁTICA:

• Todos os materiais (frascos, vidrarias, instrumentos, utensílios, etc) utilizados em uma análise microbiológica passam por diversas etapas até que se encontrem totalmente limpos, estéreis e isentos de resíduos químicos e orgânicos.

• Para isto, são utilizados os agentes físicos e agentes químicos. • Este trabalho envolve as atividades de

descontaminação, descarte dos resíduos contaminados, lavagem, acondicionamento e esterilização.

1. DESCONTAMINAÇÃO E DESCARTE DOS RESÍDUOS:

1.1. Material Novo: Toda a vidraria nova deve passar por um tratamento de limpeza, pois podem estar presentes esporos

resistentes provenientes do material de embalagem; As vidrarias devem ser mergulhadas em água destilada, enxaguadas e submetidas a testes de pH,

antes de serem utilizadas; Um outro método também utilizado é a fervura em da vidraria em solução detergente, causando

assim a lise dos organismos; Proceder o resfriamento e lavagem completa com água destilada.

Tampas de plástico ou borracha, tubos de roscas ou outros frascos, devem passar por um tratamento

para a remoção de resíduos tóxicos: Mergulhar em água destilada, autoclavar a 121oC/15 minutos e enxaguar com água

destilada. Repetir este procedimento mais de uma vez.

1.2. Material Contaminado:

Todo o material contaminado, incluindo os meios de cultura onde foi submetido o crescimento microbiano e demais utensílios que tenham entrado em contato com os microrganismos, principalmente os patógenos, devem ser submetidos à esterilização em autoclave a 121 oC por 30 minutos, observando os seguintes cuidados:

Afrouxar as tampas de todos os frascos com tampa de rosca; Adicionar água ou solução detergente aos estojos de descarte de pipetas, para amolecer os resíduos e

facilitar a posterior remoção; Após passar por este processo de esterilização, os resíduos contidos nas vidrarias ou em outros

materiais podem ser descartados. Obs.:

• Pode-se também proceder a descontaminação dos materiais em estufa à temperatura de 170 – 180 oC por um tempo de 1 - 2 horas.

• Porém deve-se levar em consideração o seguinte critério: Nem todos os tipos de materiais podem ser esterilizados em estufa. Vidrarias volumétricas ao serem submetidas ao calor dilatam e podem sofrer

alterações significativas nas medidas de volume; Materiais de borrachas, plásticos, etc, não podem ser submetidos à temperaturas

muito elevadas por longos períodos. 1.3. Material não contaminado:


Materiais utilizados nas análises microbiológicas que não entram em contato com as culturas de microrganismos passam diretamente para a etapa de lavagem, descartando esta etapa de descontaminação.

2. LAVAGEM:

• Nesta etapa deve-se levar em consideração a escolha do detergente e os métodos de enxágüe, para a remoção dos resíduos.

2.1. Escolha do Detergente:

• Os detergentes mais utilizados são os aniônicos, principalmente aqueles que contém compostos alcalinos como os silicatos carbonatos ou fosfatos.

• O detergente escolhido deverá satisfazer os seguintes critérios: • Ter a capacidade de “amolecer” a água fornecida localmente. Obs.: Água mole é aquela que

carece de íons que formam sais insolúveis com os ácidos graxos de tal forma que o sabão espumará facilmente em tal fluido.

• Ter a capacidade de remover rapidamente o material orgânico à temperatura de 60 oC; • Ser facilmente removido da vidraria após um enxágüe normal, com pH neutro; • Depois de enxaguada a vidraria deverá estar livre de fatores antimicrobianos.

• Eventualmente, pode ser necessária a aplicação de um agente mais forte, principalmente para a limpeza de utensílios que não permitem a introdução de escovas, ou para a remoção de resíduos mais resistentes à ação dos detergentes.

• Nestes casos os agentes mais freqüentemente utilizados são a solução sulfocrômica e a solução de hidróxido de sódio a 1 N.

• O enxágüe dos utensílios deve ser feito de forma a garantir a completa remoção dos resíduos de

detergente, solução sulfocrômica ou outro agente de limpeza utilizado. • Os resíduos destes compostos podem interferir nas análises microbiológicas, tanto por alteração das

características dos meios de cultura, como por inibição do crescimento dos microrganismos.

2.2. Procedimento para a lavagem: a. Remover todo o material contaminado nos frascos e utensílios; b. Mergulhar todo o material em solução detergente e deixar de molho por 2 horas ou mais,

dependendo do grau de aderência do material a ser removido. Deve-se fazer um pré lavagem para retirar o excesso de material orgânico nas bacias

de lavagem; Os tubos de Durhan devem ser colocados de molho em frascos separados, reesistentes

ao calor, e submetidos à ação do vapor fluente por 15 minutos para a remoção dos resíduos de meio de cultura.

c. Com o auxílio de escovas e esponjas , esfregar os frascos e demais utensílios; d. Enxaguar todo o material em água corrente, por dez vezes consecutivas. e. Enxaguar em seguida com água destilada, pelo menos uma vez.

No caso de pipetas recomenda-se o uso de um lavador de pipetas, mantendo cada batelada sob enxágüe contínuo, por pelo menos uma hora.

3. SECAGEM:

• Após a etapa de lavagem, as vidrarias e demais utensílios passam para a etapa de secagem; • Esta etapa é geralmente realizada em estufa ou em forno próprio para a secagem de materiais à

temperatura de 100 oC por aproximadamente 1 a 2 horas.

4. ACONDICIONAMENTO: • Os procedimentos seguintes referem-se aos frascos e utensílios vazios. • Material com meios de cultura, diluentes e reagentes devem ser preparados, acondicionado e

esterilizado seguindo as orientações geralmente contidas nos rótulos de embalagens ou no manual próprio de preparo de reagentes e meios de culturas.


a) Placas de Petri: devem ser acondicionadas em estojos porta placas de alumínio ou aço inoxidável, em grupos de mesma dimensão, ou embrulhadas em papel Kraft em grupos de até dez placas.

b) Pipetas: Preencher o bocal com algodão e acondicionar em estojos porta pipetas de alumínio ou aço inoxidável, em grupos de mesmo volume com as pontas para baixo, na extremidade oposta à tampa do estojo.

Proteger o fundo dos estojos com um chumaço de algodão ou gaze para evitar danos nas pontas das pipetas.

Pode-se também embrulhar as pipetas individualmente em papel Kraft, lembrando-se de identificar a extremidade do embrulho que deve ser aberta no momento da análise, e e anotar externamente o volume da pipeta.

c) Tubos de ensaio vazios: tampar com tampão de algodão ou de gaze, ou ainda com as respectivas tampas no caso dos tubos rosqueáveis.

Acondicionar em grupos de 4 a 6 tubos de mesmo tamanho e volume, embrulhar com papel Kraft e vedar com fita crepe especial.

d) Frascos de homogeneização e outros frascos vazios tampados com tampão de algodão, gaze ou tampa própria: Cobrir a tampa ou o tampão com papel Kraft.

e) Espátulas, pinças, tesouras e demais utensílios: embrulhar individualmente com papel Kraft, lembrando-se de identificar a extremidade do embrulho que deve ser aberta no momento da análise.

5. ESTERILIZAÇÃO:

A destruição de todos os microrganismos presentes em um material, incluindo os esporos, é denominada esterilização.

Todo o material de laboratório vazio (placas, pipetas, tubos de ensaio, frascos, pinças, tesouras, etc) após a etapa de acondicionamento devem ser esterilizados em autoclave (calor úmido) ou estufa (calor seco).

• A esterilização pode ocorrer por agentes físicos (calor, radiações, filtrações) ou químicos (óxido de

etileno, beta propiolactona, glutaraldeido, formaldeido) • Esterilização pelo calor:

– A temperatura elevada é um dos métodos de maior eficiência e um dos mais utilizados na destruição de microrganismo.

– O calor pode ser aplicado tanto em condições úmidas (vapor ou água) quanto secas. – O método que utiliza temperaturas extremas para matar os microrganismos é o da

incineração

5.1. Esterilização pelo calor seco: • Calor seco ou ar quente em temperaturas suficientemente altas, levam os microrganismos a morte. • Entretanto esta técnica não é tão efetiva quanto o calor úmido e, portanto, são necessárias

temperaturas muito altas e tempos de exposição maior. • Por exemplo: a esterilização de vidrarias de laboratórios (como placas de petri, pipetas) requer um

tempo de 2 horas de exposição a 160 – 180 oC, enquanto que a esterilização dos mesmos materiais em autoclave requer somente 15 minutos a 121 oC.

• Há situações entretanto em que um material não poderá ser exposto à umidade, e o método pelo calor seco é preferido.

5.1.1. Flambagem:

– Consiste em passar o material sobre a chama de um bico de Bunsen ou lamparina. – Utilizado para bocas de tubos de ensaio, lâminas de vidro e, eventualmente para espátulas,

sondas, etc. – Para tubos de ensaio, a flambagem tem finalidade de evitar possíveis contaminações na

transferência ou inoculação de culturas. – No caso de lâminas, espátulas e sondas a flambagem é efetuada após imersão em álcool,

não implicando necessariamente em esterilização.

5.1.2. Aquecimento ao rubro em chama:


– Utilizado para esterilização de alças e agulhas de inoculação.

5.1.3. Ar quente (Estufa ou forno de Pasteur):

– Pipetas e placas de Petri são esterilizadas a uma temperatura de 170 – 180 oC por um período de 1 a 2 horas em equipamento denominado Forno de Pasteur ou mais conhecido como estufa de esterilização.

– O papel que protege o material deve adquirir cor parda, porém não deve escurecer muito ou se tornar quebradiço.

– Após o término da esterilização, deve-se esperar a o resfriamento total da estufa antes de se abrir a porta da mesma. Isto deve ser feito para se evitar mudança brusca de temperatura nas vidrarias o que levaria à quebra das mesmas.

5.2. Esterilização por Calor Úmido:

• O calor úmido é muito mais eficiente que o calor seco para destruir os microrganismos. • Isto porque o calor úmido causa desnaturação e coagulação das proteínas vitais como as enzimas,

enquanto o calor seco causa oxidação dos constituintes orgânicos da célula (isto é, ele “queima” lentamente as células).

• A desnaturação de proteínas celulares ocorre com temperaturas e tempos de exposição menores do que aqueles requeridos para a oxidação.

• Por exemplo: os esporos de Bacillus anthracis são destruídos entre 2 e 15 minutos pelo calor úmido

a 100 oC, mas com o calor seco leva mais de 180 min a 140 oC para conseguir o mesmo resultado. • Endósporos bacterianos são as formas mais resistentes de vida. • Por outro lado as formas vegetativas das bactérias são muito mais sensíveis ao calor e usualmente

são mortas dentro de 5 a 10 minutos pelo calor úmido a 60 – 70 oC.

•Uma alça de inoculação pode ser esterilizada colocando-se na chama do bico de Bunsen por alguns segundos.

•Quando a alça de inoculação é colocada na chama, gotículas podem ser formadas, resultando em propagação de organismos vivos.

•Para prevenir, deve-se colocar a alça primeiramente na porção mais fria da chama e só depois colocá-la na parte mais quente.

Parte mais fria

Parte mais quente x


• Células vegetativas de leveduras e outros fungos são geralmente destruídas entre 5 e 10 minutos pelo calor úmido a 50 – 60 oC.

• Para matar os esporos dos fungos no mesmo período de tempo são necessárias temperaturas de 70 – 80 oC.

• A susceptibilidade dos protozoários e de muitos vírus ao calor é similar àquela da maioria das células vegetativas.

• O calor úmido utilizado para matar os microrganismos pode ser na forma de vapor, água fervente ou água aquecida a temperaturas abaixo do seu ponto de ebulição.

5.2.1. Vapor d’ água sob pressão:

• O uso do vapor d’água sob pressão é o método mais prático e seguro de aplicação do calor úmido. • Em um sistema fechado de volume constante, um aumento de pressão permitirá um aumento na

temperatura. • Vapor d’água sob pressão fornece temperaturas maiores do que aqueles possíveis com vapor sem

pressão ou água fervente. • Há a vantagem também de um aquecimento rápido e maior penetração do calor. • O aparelho destinado a esterilizar com vapor de água sob pressão é a autoclave.

AUTOCLAVE: • Desenvolvida no século XIX, a autoclave é um equipamento essencial em todo o laboratório de

microbiologia. • Muitos meios de culturas, soluções e materiais contaminados são esterilizados rotineiramente com

este aparelho. • A autoclave parece uma panela de pressão no sentido em que ambas utilizam vapor sob pressão,

porém a temperatura e a a pressão interna na autoclave podem ser bem mais controladas. • Â câmara de parede dupla da autoclave é primeiramente lavada com vapor fluente, para remover

todo o ar. • É então preenchida com vapor puro e mantida a uma determinada temperatura e pressão por um

período especifico de tempo. • É essencial que todo o ar residual inicialmente presente na câmara seja completamente substituído

por vapor d’água. • Se o ar estiver presente, reduzirá a temperatura interna da autoclave. • É a temperatura e não a pressão no interior da câmara, que mata os microrganismos • Uma autoclave é usualmente operada a uma pressão de 15 lb/pol2, na qual a temperatura do vapor é

121oC. • O tempo necessário para esterilizar nesta temperatura depende do material que está sendo tratado. • Leva mais tempo para o calor penetrar em um material viscoso ou sólido do que em material fluido. • O tempo necessário também depende do volume do material que está sedo esterilizado. • Por exemplo, 1.000 tubos contendo 10 ml cada de um meio líquido podem ser esterilizados em 10 a

15 minutos a 121 oC, enquanto o mesmo volume de meio (10 litros) em um único frasco necessitará de uma hora ou mais, pois mais tempo será requerido para o calor penetrar no centro do material volumoso.

Vapor sob Pressão (autoclave):

– É o método mais eficiente para esterilizar meios de cultura e soluções diluentes. – Deve ser utilizado para todo meio que resiste a altas temperaturas sem se alterar. – Também é utilizado para vidrarias e para esterilização de cultivos e material contaminado

antes da lavagem. – A esterilização na autoclave geralmente é atingida a uma temperatura de 121 oC por 15 – 20

minutos a uma pressão de 15 lbs.

• Obs. – Ao usar a autoclave é importante que todo o ar seja removido antes que a pressão seja

aumentada, pois uma mistura de ar e vapor resulta numa temperatura menor a uma dada pressão.


• Por exemplo: se 1/3 do ar permanece na autoclave, a temperatura atingida será de apenas 115 oC .

Corte longitudinal de uma autoclave ilustrando as partes e a via do fluxo de vapor. 5.2.2. Vapor Fluente:

– Consiste em tratar térmica,mente um material à temperatura de 100 oC, em autoclave, sem utilizar a pressão de vapor.

– É utilizados para certos meios de cultura que sofrem alterações quando submetidos a tratamentos térmicos acima de 100 oC.

• O tratamento pode ser:

– Por aquecimento a 100 oC por no mínimo 60 minutos por máximo de 90 minutos; – – Calor intermitente (tindalização): por aquecimento a 100 oC por 30 minutos, repetindo este

tratamento por três dias consecutivos, sendo o meio incubado nas condições que será usado entre um aquecimento e outro.

• O aquecimento do primeiro dia mata as formas microbianas vegetativas presentes no meio;

• Durante a incubação entre um aquecimento e outro, possíveis formas esporuladas germinam e então são destruídas nos aquecimentos subseqüentes.

5.3. Esterilização por Filtração:

• Os filtros são utilizados para esterilizar materiais que não podem ser submetidos aos outros processos de esterilização.

• São utilizados filtros ou membranas filtrantes capazes de reter os microrganismos.


• Estas membranas filtrantes são discos de ésteres de celulose finos (150 µm), com poros pequenos, que retém os microrganismos.

• Um sistema de filtração por pressão positiva muito utilizado para pequenos volumes (até 100 ml) é o

Swinnex filter-holderr (Millipore Filter Corporations) que é facilmente adaptados a seringas hipodérmicas.

• Para evitar a contaminação do analista por partículas aerossóis que são emitidas durante a manipulação de materiais biológicos, foram desenvolvidas cabines de segurança biológica que empregam sistema de filtração.

– O ar é aspirado para dentro do equipamento e filtrado através de filtros de acetato de celulose aderido a uma folha de alumínio, com a finalidade de reter 99 % de partículas presentes no ar.

5.4. Esterilização por radiações:

• Radiação ultra violeta (256 – 280 nm) agem sobre o DNA da célula do microrganismo tornando-o inativo.

• As fontes são: lâmpadas de vapor de mercúrio a baixa pressão.

6. SECAGEM DE MATERIAIS: • Esta etapa pode ou não ser realizada. • É utilizada quando a etapa de esterilização é por calor úmido (autoclave). • Geralmente após este tipo de esterilização, os materiais ficam úmidos, podendo facilitar uma

contaminação. • A secagem pode ser realizada em estufa de Pasteur a temperaturas de no máximo 100 oC. • A armazenagem dos materiais deve ocorrer apenas após os mesmo estarem totalmente secos.

AULA PRÁTICA ROTEIRO:

• Preparar os materiais e vidrarias para serem utilizados em análises microbiológicas, seguindo a seguinte ordem:

1. Descontaminação em autoclave (121 oC por 30 minutos) 2. Descarte dos resíduos; 3. Lavagem e enxágüe; 4. Secagem; 5. Acondicionamento em papel Kraft; 6. Esterilização em autoclave; 7. Armazenamento

Obs. • Identificar os pacotes de vidrarias acondicionados com o nome da equipe, a data da esterilização e

volume da vidraria quando pertinente; • Usar luvas de borracha para a lavagem das vidrarias; • Usar avental especial para a lavagem das vidrarias; • Não esquecer do último enxágüe em água destilada; • Não esquecer de retirar o ar residual da autoclave.

Exercícios de fixação:

1) O que indica a mudança de cor da ampola com Bacillus stearothermophilus? 2) Descreva o procedimento necessário para esterilização de materiais em autoclave (placas de Petri,

pipetas e bonecas). 3) Porque se deve sempre esperar que a autoclave escoe todo o vapor (posição zero do manômetro)

antes de se proceder à abertura da tampa?


4) Como é o processo de funcionamento de uma autoclave? ANOTAÇÕES: MATERIAIS: EQUIPAMENTOS:


AULA PRÁTICA ASSUNTO: Preparo de Meios de Cultura: Preparo de meio sólido MEIOS DE CULTURA:

• Os meios de cultura são usados para o cultivo artificial dos microrganismos; • Eles fornecem os nutrientes necessários para o crescimento dos microrganismos; • Os nutrientes indispensáveis para os microrganismos são:

– Fonte de Carbono (energia); – Fonte de Nitrogênio; – Sais Minerais.

• Alguns microrganismos também precisam de fatores de crescimento, que são substâncias que eles não podem sintetizar, tais como vitaminas, aminoácidos, etc.

• O desenvolvimento dos microrganismos nos meios de cultura estão relacionados com fatores extrínsecos e intrínsecos:

– Disponibilidade de nutrientes; – Aeração; – Umidade; – pH; – Temperatura; – Umidade; – Esterilidade (o meio de cultura deve estar isento de qualquer tipo de contaminação); – Assepsia;Pressão osmótica.

• Quando uma população de microrganismos está em crescimento ativo em um meio nutritivo , ocorre a formação de uma cultura;

• Em meios naturais os microrganismos raramente se encontram isolados, pois as espécies estão em

geral misturadas e se desenvolvem conjuntamente se as condições são favoráveis; • Quando uma única espécie de microrganismo se desenvolve em um meio de cultura esta cultura é

chamada de cultura pura.

Todos os trabalhos em laboratórios são baseados em culturas puras, pois são as únicas que permitem estudos precisos de morfologia e fisiologia microbiana.

Classificação dos Meios de Cultura: 1. Classificação quanto à natureza:

A. Animado: Constituído por células vivas. Ex. Animais de laboratório, tecidos vivos, etc. B. Naturais, inanimados e semi-sintéticos: Não possuem células vivas, mais possuem componentes da

natureza, e são preparados por diversas misturas de nutrientes. • Exemplos de substâncias naturais: Extratos de carne (proteínas solúveis, carboidratos, sais),

Peptonas, Extratos de levedura, sangue, soro, leite, extrato de solo, fluido de rumem bovino, etc.

C. Sintético ou Artificiais: também são meios inanimados que são formados por substâncias químicas preparadas em laboratório.

• Ex. MAS (ágar Mac conkey sorbitol 5-bromo 4-cloro 3indoxil β-D-glucoronídio) é um meio de cultura seletivo diferencial para plaqueamento diferencial de E. coli O157:H7.

Algumas Definições:


Extratos:

• São concentrados aquosos desidratados, obtidos a partir de carnes (sem tendões e graxas), de leveduras ou de malte.

• Os extratos de carne e levedura geralmente são isentos de carboidratos fermentáveis, ao contrário do extrato de malte, o qual possui um elevado teor, principalmente de maltose, indicado particularmente para o cultivo de leveduras e bolores.

• O valor nutritivo dos extratos é devido à substâncias solúveis obtidas a partir da matéria prima tais como: carboidratos, compostos orgânicos, vitaminas hidrossolúveis e sais.

Peptonas:

• São substâncias de origem protéica; • Obtidas a partir de proteínas nativas que foram transformadas em fragmentos hidrossolúveis. • O termo “peptonas” é usado quando são obtidos por via enzimática, e o termo “hidrolisado”

quando obtida por via inorgânica. • As peptonas constituem uma mistura de peptídeos, e os hidrolisados uma mistura mais ou menos

irregular de diversos peptídeos e aminoácidos livres. • As peptonas e os hidrolisados representam as substâncias basais mais importantes para a preparação

dos meios de cultura para os microrganismos. • As peptonas e os hidrolisados disponibilizam nitrogênio para o meio de cultura.

2. Classificação quanto à consistência:

A. Meios Líquidos B. Meios Fluidos C. Meios Semi-sólidos D. Meios Solidificados E. Meios Sólidos

A presença ou ausência de consistência no meio de cultura ocorre pela presença ou

ausência do ágar-ágar (ou simplesmente ágar) A consistência do meio de cultura está relacionada com o estado físico, considerando-se o teor de ágar-ágar adicionado ao meio de cultura. Ágar-ágar:

• É um polissacarídeo ácido obtido a partir de algas marinhas (Rhodophyceae), que pro hidrólise fornece D-galactose e pequena quantidade de D-galactose e ácido sulfúrico.

• É utilizado como agente solidificante de meios de cultura • Não são considerados como fonte nutritiva para os microrganismos (pois não são hidrofilizados

pelos microrganismos) Propriedades do ágar-ágar:

• Em soluções aquosa na concentração de 1,2% se dissolve e se liquefaz somente a temperatura de 95oC e permanece líquido até 45-48 oC.

• Nesta temperatura de o meio de cultura pode ser semeado sem risco de inativar os microrganismos, ou ainda poderá ser enriquecido pela adição de proteínas coaguláveis (sangue, soro), vitaminas ou atores termolábeis.

• Depois de solidificado, adquire consistência firme e pode ser incubado a 35-37 oC sem perder a consistência.

• Resistem a autoclavação (121 oC, exceto em pH menor que 4,0 e maior que 9,0); • É destituído de toxicidade para os microrganismos; • Praticamente não é atacado (hidrolisado) pelos microrganismos; • Na concentração de 1,5% - 2% confere um certo grau de umidade à superfície do meio de cultivo,

permitindo no entanto, a obtenção de colônias isoladas. • A estrutura do gel quando na concentração de 1,2% impede a mobilidade bacteriana, porém favorece

a difusão dos nutrientes.


3. Classificação dos meios quanto a Composição:

A. Meios Simples: são destinados ao cultivo de microrganismos pouco exigentes ou servem de base para outros meios de cultura. Ex. água peptonada, ágar simples.

B. Meios de Enriquecimento: Meios de composição simples adicionados de substâncias que melhoram seu valor nutritivo. Ex.caldo BHI (infusão de cérebro e coração), ágar chocolate, etc.

C. Meios Complexos: São aqueles que não se conhece a composição exata dos seus ingredientes. Ex. ágar sangue, ágar extrato de levedura, etc

4. Classificação dos meios quanto às finalidades:

A. Conservadores e/ou de transporte: São meios utilizados no caso de não ser possível realizar a cultura logo após a coleta de um determinado material biológico. Possui a finalidade de manter estável a população microbiana presente no material. Ex. solução salina glicerinada.

B. Enriquecimento: è aquele que permite o crescimento de microrganismos exigentes que necessitam, de fatores de crescimento, mais não inibem o crescimento de outros. Ex. caldo selenito, caldo tetrationato

C. Seletivos: São aqueles que contém substâncias que inibem o crescimento de certos microrganismos, porém permitem o crescimento de outros.

• A intensidade desta seletividade pode ser variável, como ocorre com alguns meios empregados para o isolamento de enterobactérias.

• Podem ser de: – Baixa impediência, Ex. ágar EMB (eosina azul de metileno); – Média impediência, Ex. ágar Salmonella-Shigella; – Alta impediência, Ex. ágar Sulfito de Bismuto

D. Diferenciais: Possuem substancias que evidenciam uma característica que permite separar ou

diferenciar um grupo ou uma espécie de microrganismo. Ex ágar EMB., ágar baird parker, etc. E. Seletivo-diferenciais: São aqueles que combinam seletividade e diferenciação. Ex. ágar Manitol

Salgado, seletivo para estafilococos devido ao alto teor de sal, diferenciando o S. aureus (colônia amarela) do S. epidermidis (colônia branca) através da fermentação do manitol.

F. Dosagem: Meios de composição definida (sintéticos) empregados para a dosagem de vitaminas, aminoácidos e antibióticos. Há também meios especiais para a avaliação de desinfetantes. Ex. Antibiotic Agar.

G. Contagem: são aqueles meios específicos apara a contagem de colônias, cuja composição deve obedecer a recomendações padronizadas. Ex. Plate Count Agar (ágar padrão para contagem).

H. Identificação: Existe uma grande variedade de meios rotineiramente utilizado em microbiologia para a identificação bioquímica de microorganismos. Ex. prova da Urease, Citrato, Indol, Fermentação da Glicose, etc.

I. Estoque: A manutenção adequada da viabilidade e das características fisiológicas de uma cultura pode exigir um meio diferente daquele que é recomendado para o seu crescimento ótimo, pois o crescimento rápido pode estar associado a uma rápida morte celular devido à eliminação de substâncias tóxicas como produto do metabolismo dos microrganismos. Ex. caldo nutriente, agar Nutriente semi-sólido, etc.

Observações: • Ao se preparar meios de cultura deve-se ter em mente alguns fatores que podem interferir com um

resultado satisfatório do crescimento bacteriana. Como exemplo o pH que geralmente é do meio final, pronto para a inoculação e determinado a temperatura ambiente.

– Se o meio contiver fosfatos ou outros tampões ativos, devemos ajustar as quantidades dos sais do tampão para obter o pH apropriado.

• Outro fator de influencia é a temperatura, pois ao preparar um meio de cultura não podemos deixá-lo por mais de uma hora á temperatura ambiente, pois pode ocorrer uma evaporação de água, alterando sua composição final. Além disso o risco de contaminação do meio é maior

Armazenagem dos meios de cultura:


• Após seu preparo, os meios devem ser esfriados a temperatura ambiente. • Podem ser armazenados e conservados em geladeira. • Dependendo da composição do meio, pode ser armazenados por uma semana ou mais. Recomendações: • Manter registro escrito onde conste data de recepção, prazo de validade e outras anotações que

considere necessárias, como, por exemplo, controle de estoque. • Meios de cultura desidratados devem permanecer bem fechados em recipientes âmbar e ao abrigo da

luz, e em alguns casos, sob refrigeração. • Meios em forma de pós se conservam durante um ano; • Meios granulados se conservam por três anos. Teste de esterilidade: • Após a autoclavação (esterilização do meio a 121oC por 15 minutos) os meios devem ser deixados na

estufa até o dia seguinte para controle de sua esterilidade.

Meios de cultura desidratados: • Apresentam-se no mercado sob a forma de pós ou granulados; • São higroscópicos, por isso os frascos são hermeticamente fechados com tampas de rosca e somente

devem ser abertos em ambientes secos. • Devem ser armazenados em ambientes isentos de luz, pois muitas vezes a luz altera as substâncias

componentes dos meios de cultura. • Prazo de validade: geralmente de 2 a três anos (antes do preparo). • Vantagens dos meios desidratados:

• Estabilidade elevada; • Utilização simples; • Rápido preparo; • Podem ser preparados pouco tempo antes de sua utilização; • Exigem pouco espaço para armazenagem.

• Certos meios podem ser utilizados sem que seja necessário sua esterilização na autoclave, mesmo porque alguns não suportam a autoclavagem (perde alguns nutrientes, como por exemplo a desnaturação de proteínas, perda de vitaminas, hidrólise de carboidratos, etc)

Controle de Qualidade: • Embora muitos meios tenham sido submetidos a controle de qualidade pelo fabricante, em muitos

casos deve-se repetir a avaliação no laboratório antes de sua utilização. • Deve-se em cada novo lote de meios, inocular microrganismos reservas, isto é, microrganismo que

pertencem a coleção do laboratório (bacterioteca), pois as reações destes nos meios já são conhecidas.

• Por exemplo: Estreptococos grupo A em agar sangue devem apresentar bom crescimento e beta hemólise.

Técnica básica de Preparo e Cuidados Necessários: • Para análise de rotina de alimentos devem ser utilizados meios formulados na forma desidratada

adquiridos comercialmente. • Os frascos contendo estes meios trazem rótulos que descrevem a composição, a indicação de uso,

condições de estocagem, o preparo e esterilização do meio. • Seguir sempre as recomendações do rótulo. A validade e estocagem dos meios também contribuem significativamente na qualidade da análise, portanto deve-se respeitar os seguintes princípios:

– O primeiro que entra é o primeiro que sai; – Monitorar a chegada do produto e a primeira vez que o meio foi aberto; – Observar as datas de validade; – Uma vez aberta a embalagem, fechar hermeticamente;


– Estocar a temperaturas inferiores a 25oC, para evitar estragos. – Como os meios são higroscópicos, a pesagem deve ser feita rapidamente e em local de pouca

umidade. – Durante a pesagem e rehidratação, evitar contaminação com substâncias químicas, utilizando-se

vidrarias e espátulas adequadamente lavadas e enxaguadas, bem como água destilada ou deionizada de alta qualidade.

– Ler atentamente os rótulos dos meios. – Pesar cuidadosamente a quantidade exata do meio desidratado ou as proporções corretas dos

ingredientes, em balança cuja exatidão seja verificada freqüentemente. • Adicionar ao meio de cultura a metade da água necessária e homogeneizar bem, até obter uma

suspensão homogênea. • Adicionar o restante da água e homogeneizar, lavando várias vezes o recipiente aonde se pesou o

meio. • Meios contendo agar devem ser deixados em repouso por 10 a 15 minutos antes do aquecimento,

para que o agar seja “embebido” com água assegurando total dissolução; • Determine o pH do meio em potenciômetro previamente ajustado com tampões. • Um meio preparado adequadamente manterá o pH indicado no rótulo de sua embalagem. Esterilização: • Distribuir em recipiente adequado, quantidade correspondente a 2/3 da capacidade do frasco; • Esterilizar a 121oC por 15 minutos (o aumento da temperatura ou do tempo poderá causar alterações

no meio). • Obs. Alguns meios, principalmente os enriquecidos com proteínas, aminoácidos, vitaminas ou outros

nutrientes podem apresentar sensibilidades a altas temperaturas, podendo ocorrer perdas de alguns destes componentes. A indicação sempre constará no rótulo do produto, devendo apenas ser aquecidos em temperaturas de aproximadamente 60 oC (banho-maria), até 100 oC (vapor fluente).

• Desvio de cor: alteração de pH, superaquecimento, resíduos nas vidrarias; • Crescimento pobre: presença de resíduos como detergentes nas vidrarias, resíduos tóxicos na água,

pH alterado, superaquecimento, uso do meio quente; • Colônias alteradas: umidade excessiva na superfície do meio, distribuição de substancias inibidoras

no preparo; • Crescimento atípico: meio vencido, armazenamento inadequado, resíduos de substancias nas

vidrarias ou na água, superpopulação. Defeitos e causas de erro no preparo e manipulação de meios de cultura: • Solidificação do meio em pó: conservação sob umidade, frascos abertos por muito tempo ou

fechamento errado; • pH alterado: má qualidade da água, erro na vedação do frasco, superaquecimento no preparo, meio

de cultura vencido; • Turbidez e/ou precipitação: uso de água não destilada, presença de resíduos nas vidrarias,

superaquecimento e evaporação do meio; • Solidificação insuficiente: erros de pesagens e/ou de diluição, superaquecimento, problemas nos

componentes, má distribuição nas placas, meio vencido;


ROTEIRO PRÁTICA:

PROCEDIMENTO PARA O PREPARO DE MEIOS DE CULTURA SOLIDIFICADOS:

1. Pesar a quantidade do meio de cultura desidratado indicado no rótulo do frasco; 2. Medir a quantidade de água destilada indicada no rótulo, em uma proveta; 3. Em um balão volumétrico, dissolver o pó nos 100 ml de água destilada; 4. Deixar descansar por 10 min., para que ocorra a hidratação do pó, facilitando a dissolução; 5. Aquecer o meio, numa chapa aquecedora, até que ocorra a total dissolução do ágar, ou seja, quando o

ágar “chorar” (as partículas de ágar escorrem pela parede do balão) ; o aquecimento deverá ser associado com agitação constante;

6. Esterilizar em autoclave o meio de cultura; 7. Fazer o plaqueamento do meio de cultura: Verter uma pequena quantidade do meio de cultura em placas

de Petri esterilizadas , ao redor do bico de bunsen; deixar que ocorra a solidificação do meio; 8. Efetuar o controle de qualidade dos meios de cultura: colocar as placas de Petri com o meio de cultura em

uma estufa à 37 °C. Após 24hs observar se houve o crescimento de alguma colônia. Se houve é porque ocorreu contaminação desse meio e o mesmo não está esterilizado não podendo ser utilizado – deve-se descartá-lo. Se não houve o crescimento de nenhuma colônia é porque o meio está realmente esterilizado, podendo ser utilizado.

9. Os meios que passaram no teste de esterilização deve ser armazenados na geladeira para posterior uso.

ANOTAÇÕES: MATERIAIS: EQUIPAMENTOS:


AULA PRÁTICA ASSUNTO: Preparo de meios de cultura: Preparo de meios de cultura líquido Liquefação e envazamento de meios sólidos PROCEDIMENTO PARA O PREPARO DE MEIOS DE CULTURA LÍQUIDOS (CALDOS):

10. Pesar a quantidade do meio de cultura desidratado indicado no rótulo do frasco; 11. Medir a quantidade de água destilada indicada no rótulo, em uma proveta; 12. Em um balão volumétrico, dissolver o pó nos 100 ml de água destilada; 13. Agitar para dissolução do pó; 14. Pipetar quantidade necessária em tubos de ensaios, enlenmeyers ou balões; 15. Esterilizar em autoclaves. 16. Efetuar o controle de qualidade dos meios de cultura colocando-os em uma estufa à 37 °C. Após 24hs

observar se houve o crescimento de colônias ou turvação do meio. Se houve é porque ocorreu contaminação desse meio e o mesmo não está esterilizado não podendo ser utilizado – deve-se descartá-lo. Se não houve, é porque o meio está realmente esterilizado, podendo ser utilizado.

17. Os meios que passaram no teste de esterilização deve ser armazenados na geladeira para posterior uso. Exercícios de fixação:

1. Porque os microrganismos utilizam meios quimicamente definidos? 2. Porque o Agar é o agente solidificante ideal para uso em microbiologia? 3. Qual é a constituição do Agar? Qual é a finalidade de sua incorporação no meio de cultura? 4. Quando um microbiologista utiliza um meio de enriquecimento para o cultivo de microrganismos? 5. Como são preparados os meios de cultura? Descreva o procedimento.



AULA PRÁTICA ASSUNTO: Técnicas de Semeadura: Placas de Petri (Contagem e Isolamento) TEORIA:

• Em laboratório os microrganismos são cultivados ou desenvolvidos em material nutriente denominado meio de cultura.

• Alguns laboratórios preparam seus próprios meios a partir de pós desidratados, enquanto outros compram meios preparados (“prontos para uso”) em placas de Petri ou tubos de ensaio.

• Existe à disposição uma extensa lista de meios comerciais, e o tipo utilizado depende de muitos fatores.

• Esses fatores incluem considerações sobre a origem do material a ser analisado, a espécie que se imagina estar presente nesta amostra e as necessidades nutricionais dos microrganismos.

• Numa análise microbiológica, a amostra de alimento deve ser preparada e depois inoculada ao meio de cultura;

• O material colocado no meio de cultura é chamado de inóculo. • Esta inoculação pode ser por diferentes técnicas de acordo com o que se pretende (contagem de

colônias ou isolamento de um microrganismo) • Após a inoculação, o meio é incubado, para que ocorra o desenvolvimento dos microrganismos. • Durante a incubação do meio inoculado, as células individuais de cada microrganismo inoculado,

multiplicam-se e produzem um grande número de células, que juntas formam uma colônia • Visível a olho nu, cada colônia é uma cultura pura com um ancestral único. • Morfologicamente, as colônias não são iguais para todos as espécies.

• P. ex. algumas espécies de microrganismos podem formar uma colônia aderente (pegajosa), elevada, enquanto outras formam colônias lisas e secas.

Semeaduras: • Os microrganismos necessitam de um meio de cultura adequado para o seu crescimento in vitro. Mas,

além dos componentes presentes no meio, outros fatores interferem no seu desenvolvimento: são fatres ambientais como temperatura (psicrófilos, mesófilos, termófilos) e tensão de oxigênio (aeróbias, anaeróbias facultativas, microaerófilas).

• Inoculando um microrganismo em um meio de cultura que possua todos esses requisitos nutritivos e fatores ambientais favorecidos, o microrganismo inicia o seu desenvolvimento neste meio, passando pelas fases da curva de crescimento, desde a fase de latência, logaritmica, estacionária até a fase de morte.

• A fase logaritmica (exponencial) é caracterizada por divisões sucessivas (cissiparidade, originando a formação de um grupamento de bactériasda mesma espécie, que é denominado de colônia (massa de célula). Essa évisualizada sem o auxílio do microscópio, sendo então considerada como característica macroscópica das bactérias.

• Como cada espécie possui um tipo morfológico colonial diferente, estas devem ser analizadas, quanto à elevação, forma, tamanho, bordas e pigmentação. Em um meio de cultura, um único tipo de colônia observado é denominado cultura pura; vários tipos de colônia, cultura mista. Em microbiologia, há várias técnicas de inoculação de microrganismos; algumas são utilizadas para exames qualitativos e outras para estudos quantitativos (contagem de bactérias).

• Dentre as técnicas empregadas, encontramos: o Estrias em superfície (esgotamento):

� Estrias contínuas: em tubos e placas � Estrias descontínuas: em placas


o Diluição: � Pour plate: com ágar liquefeito (placas) � Superfície (placas) � Em meio líquido: profundidade (tubos)

Normas Utilizadas: a) O fio da alça de platina devem sempre ser flambados antes e depois de qualquer inoculação, ou seja,

devem ser aquecidos ao rubro no cone interno da chama do bico de Bunsen. Para a coleta de material, devem ser esfriados na parte interna do recipiente com o enio de cultura.

b) Os recipientes (tubos de ensaio, placas de Petri, etc) com meio de cultura, devem sempre ser abertos próxmo à chama do bico de Bunsen.

c) A boca dos tubos de ensaio deve ser aquecida após a retirada da tampa e antes da colocação da tampa. A tampa nunca deve ser colocada sobre a bancada, sendo retirada e mantida segura pelo dedo mínimo da mão direita durante a ioculação.

Método:

1) Estrias Cotínuas: a) Tubos: Podemos usar meios sólidos com bisel curto ou longo e sem bisel. O bisel curto é semeado

com agulha de níquel cromo, inserindo-a no meio até quase o fundo do mesmo e em seguida, estriando-se a superfície do bisel. Esta forma é utilizada em meios de identificação de bactérias. O bisel longo é utilizado principalmente para a conservação de cepasde bactérias e fungos, onde semeia-se com a alça ou agulha, estriando a superfície do bisel. No sem bisel a inoculação deverá ter a profundidade de 2/3 do meio e nãodeverá ter mais do que uma única picada. Semeia-se com agulha; é mais utilizado para se verificar a motilidade das bactérias.

Interpretação dos Resultados: Para avaliar a leitura dos resultados desta técnica deve-se observar os seguintes ítens: - Quantidade: pode ser escassa, moderada ou abumdadnte. - Margens ou bordos do crescimento: pode ser descrita como uniforme ou nítida, ou mostrando várias irregularidades. - Consistência da massa de crescimento: pode ser butírica ou de consistência semelhante à de manteiga, facilmente removivel com a alça de platina, viscosa ou mucóide, seca ou quebradiça. - Cromogênese ou pigmentação: pode ser opaca,translúcida ou com pigmentos. Em tubos sem bisel a interpretação dos resultados se baseia em: - Resultado positivo: crescimento por todo o meio, semelhante a um pinheiro invertido (microrganismo com motilidade). - resultado negativo: o crescimento ocorre somenteno local da inoculação.

b) Placas: O estriamento contínuo é feito com alça de níquel cromo, semeando em zigue-zague sobre toda a superfície da placa.

Interpretação dos resultados: - Tamanho das colônias; - Bordos: a perfiferia das colônias bacterianas formam muitos desenhos diferentes dependendo das espécies. Podem ser inteiros, lobulados, ondulados, denticulados ou franjados. - Elevação: Achatadas, espraiadas, convexas, umbilicadas, centro saliente. Cromogênese ou pigmentação: pode ser poca, translúcida ou com pigmentos. Forma: ascolônias podem ser circulares, irregulares ou rizóides. - Consistência da massa de crescimento: butírica (como manteiga), facilmente removível com a alça de platina, viscosa ou mucóide, seca ou quebradiça.

2) Estrias Descontínuas: a) Placas: A semeadura por esgotamento descontínuo é mais apropriada para o isolamento de colônias

de bactérias. Esta semeadura deve ser feita espalhando-se a amostra com uma alça de platina em um terço da placa, logo em seguida flabar a alça e a partir desse inóculo fazer o espalhamento. Deve-se


passar a alça sobre o inóculo e a semeadura em forma de zigue-zague não tocando mais o inóculo inicial.

Obs. O sucesso da semeadura está em : - Grande número de estrias - Não perfurar o meio - Não voltar a lça sobre a estria - Pegar pequena quantiade do material para estriar. 3) Diluição: a) Pour Plate: liquefazer o meio de cultura. Colocar em uma placa de Petri, com uma pipeta

previamente esterilizada, 1 ml do inóculo e verter 15 – 20 ml do meio de cultura liquefeito (e resfriado à 45 – 42 oC). Homogeneizar com movimentos circulares em 8 (10 x) e esperar solidificar. A te´cnica pour plate pode ser realizada com o onjetivo de se obter colônias isoladas (estudo qualitativo) ou para realizar a contagem de colônias em placas (estudo quantitativo).

Interpretação dos resultados: Para o resultado quantitativo realizar a contagem das colônias escolhendo a placa que contenha de 25 – 250 colônias. Em seguida realizar o cálculo. b) Superfície (Spread Plate): Nesta técnica o meio já deve estar solidificado na placa. Com um pipeta

previamente esterilizada, colocar sobre o meio 0,1 ml do inóculo e espalhar com alça de Drigalski. c) Meios líquidos: A introdução do inóculo e meio líquido pode ser feita com uma alça de níquel

cromo ou com uma pipeta. Com a alça, introduzi-la no meio e agitá-la levemente. Com a pipeta, depositar o inóculo no fundo do tubo e aspirar algumas vezes com a pipeta para homogeneizar.

Interpretação dos resultados: O resultado de crescimento no meio líquido é observado por: - Quantidade de crescimento, que pode ser escassa, moderada ou abundante; - Distribuição de crescimento: pode ser crescimento uniformemente distribuído (nitidamente turvo), crescimento confinado à superfície do meio como uma espuma ou filme (película); ou crescimento acumulado como sedimento que pode ser granuloso ou viscoso; e ainda verificar o odor, que pode ser pútirdo, aromático ou desprezível. CONDIÇÕES DE INCUBAÇÃO: Após a inoculação, as bactérias deverão ser icubadas em ambiente com tensão de oxigênio e temperatura ideais para o seu desenvolvimento. O tempo de incubação depende de cada espécie de microrganismo variando entre 24 – 48 horas ou mais para atingirem a fase logarítmica de crescimento, sendo vsíveis macroscopicamente. ROTEIRO DA PRÁTICA: Realizar todos os métodos de inoculção em placas de Petri descritos acima. Incubar os tubos em atmosfera e temperatura ideais. Fazer a leitura e interpretar os resultados.


Semeadura por estrias

Semeadura por estrias: esgotamento

Semeadura Pour plate: Contagem


ANOTAÇÕES:

MATERIAIS:

EQUIPAMENTOS: AMOSTRA: RESULTADOS:


AULA PRÁTICA ASSUNTO: Técnicas de Semeadura: Semeadura em tubos com meio sólido Semeadura em meios líquidos ROTERIO DA PRÁTICA: Realizar todos os métodos de semeadura em tubos, descritos anteriormente. Incubar os tubos em atmosfera e temperatura ideais. Fazer a leitura e interpretar os resultados. EXERCÍCIOS DE FIXAÇÃO: 1. Quais são as formas de crescimento bacteriano em meio líquido? Explique-as. 2. O que se entende por “colônia” de microrganismos? 3. Como pode ser obtida uma cultura pura de bactéria? 4. Explique a diferença entre as técnicas de semeadura em Pour Plate e por diluição (Spread Plate). 5. Como se calcula o número de UFC/ml de microrganismos inoculados na técnica de semeadura em Pour

Plate? 6. Como se calcula o número de UFC/ml de microrganismos inoculados na técnica de semeadura em

Spread Plate? ANOTAÇÕES:

MATERIAIS:

EQUIPAMENTOS: AMOSTRA: RESULTADOS:


AULA PRÁTICA ASSUNTO: Preparo e Diluições de amostras TEORIA: 1. DILUIÇÕES:

• Diluição é o procedimento de adição de uma substância a outra para reduzir a concentração de uma das substâncias.

• O uso mais comum da palavra diluição ocorre no sentido de que "tantas partes de um material estão sendo diluídas em um número total de partes do produto final (diluente + material)".

• "Uma diluição é uma expressão de concentração ou proporção, não de volume". • "Diluição indica a quantidade relativa de substâncias em uma solução". • Em "frases de diluição", o menor número sempre se refere ao número de partes da substância que

está sendo diluída, enquanto que o maior número sempre se refere ao número de partes que constitui a solução final.

Exemplo: Frase de Diluição: "Fazer uma diluição 1 para 10 de leite em solução salina peptonada". Esta frase poderia ser escrita de outras formas, com o mesmo significado:

• "Fazer uma diluição 1 em 10, de leite em solução salina peptonada". • "Fazer uma diluição 1 para 10, de leite com solução salina peptonada". • "Fazer uma diluição 1/10, de leite com solução salina peptonada". • "Fazer uma diluição 1:10, de leite usando solução salina peptonada". • "Fazer uma diluição de 1 parte de leite e 9 partes de solução salina peptonada".

1.1 Diluições decimais – Diluições decimais são diluições em que a quantidade de substância a ser diluída

corresponde à unidade, ou múltiplos da unidade e o volume final da solução diluída é igual a 10 ou múltiplo de 10 (diluições de base 10).

1.2 Diluições decimais seriadas – São diluições decimais preparadas em série e que possuem um fator de diluição único e

igual a 10. Exemplo: Preparar diluições decimais de uma cultura bacteriana em fase estacionária até 10-3: a) Preparar uma diluição 1:10 da cultura em fase estacionária em solução salina peptonada, isto é, misturar 1 mL da cultura em fase estacionária com 9 mL de solução salina peptonada (10-1). b) A partir da diluição 1:10 preparada conforme item 1 deste exemplo, após homogeneização em agitador de tubos, tomar 1 mL e misturar com 9 mL de solução salina peptonada, de forma a obter a diluição 1:100 da cultura em fase estacionária (10-2). c) A partir da diluição 1:100 preparada conforme item 2 deste exemplo, após homogeneização em agitador de tubos, tomar 1 mL e misturar com 9 mL de solução salina peptonada, de forma a obter a diluição 1:1000 da cultura em fase estacionária (10-3).


1.3 Cálculos de Diluições: 1.3.1 Cálculo envolvendo uma diluição:

– Para preparar uma diluição 1:100 de carne em solução salina peptonada, devemos misturar uma parte de carne em um volume final de 100 partes, isto é, 1 + 99.

1.3.2 Várias diluições relacionadas: Vários métodos laboratoriais indicam o uso de uma série de diluições, o que nada mais é que um número de soluções obtidas pela diluição de uma substância em um diluente, e fazendo diluições seqüenciais a partir das soluções resultantes. 1.4 Diluições de alimentos para realização de análises microbiológicas

– O processo de diluição da amostra, bem como o procedimento técnico utilizado durante esse processo, constituem fatores importantes de interferência nos resultados finais da análise microbiológica.

– Em microbiologia de alimentos, comumente são utilizadas diluições decimais da amostra, adotando-se rotineiramente dois critérios: massa por unidade de volume (m/v) e volume por unidade de volume (v/v).

– Para a obtenção de uma diluição de base 10, homogeneizam-se porções da amostra com

volume de diluente necessário para completar o volume correspondente a 10 vezes o volume (ou peso) da amostra.

Assim, a diluição 1:10 de uma amostra de leite pasteurizado pode ser obtida homogeneizando: – 1 mL de leite + 9 mL de diluente, ou – 10 mL de leite + 90 mL de diluente, ou – 20 mL de leite + 180 mL de diluente, ou – 25 mL de leite + 225 mL de diluente, e assim por diante.

Diluições Seriadas:

Diluição 10-1

ou 1/10 ou 0,10

Diluição 10-3

ou 1/1000 ou 0,0010

Diluição 10-4

ou 1/10000 ou 0,00010

Diluição 10-2

ou 1/100 ou 0,010

1 ml 1 ml 1 ml

9 ml diluente

9 ml diluente

Amostra ou Cultura bacteriana

1 ml

9 ml diluente

9 ml diluente


– Em todos os exemplos acima, a amostra resulta diluída à 1:10 (10-1) e, conseqüentemente, em cada mL da diluição teremos uma quantidade de amostra correspondente a um décimo de mL (0,1 mL) e 0,9 mL de diluente.

– Sempre que necessário inocular amostras líquidas sem diluir em meios de cultura, considera-se que a amostra se encontra na diluição 100.

– Para produtos sólidos há a necessidade de pesar a amostra. Normalmente utilizam-se alíquotas de 10 ou 25 gramas de alimentos sólidos. Dez ou vinte e cinco gramas de alimento não correspondem necessariamente a 10 ou 25 mL de alimento. O volume vai variar com a densidade e temperatura do alimento em análise.

– Alimentos sólidos, em pó ou pastosos sempre terão que sofrer diluição antes do início da análise, usando-se o critério massa por unidade de volume (m/v).

– Normalmente a diluição inicial de amostras sólidas, em pó ou pastosas, utilizada para análises microbiológicas é 1:10. Outras diluições como 1:2, 1:5, ou outras podem ser usadas em casos especiais.

• Antes do início do procedimento de diluição é fundamental que a amostra seja bem

homogeneizada (produtos líquidos em pó e pastosos) ou que a alíquota para análise, obtida de produtos sólidos, seja tomada de vários pontos de forma a representar realmente a amostra.

Diluições Seriadas:

• As diluições seriadas devem ser realizadas para a partir delas se fazer a inoculação nos meios de cultura;

• É feita pelo menos uma inoculação de cada diluição

• Com o alimento diluído, fica mais fácil encontrar uma placa ideal para se fazer a contagem de microrganismos

25 g AMOSTRA DE ALIMENTO

225 ML DE DILUENTE (ÁGUA PEPTONADA) Diluição

10-1

ou 1/10 ou 0,10

Diluição 10-3

ou 1/1000 ou 0,0010

Diluição 10-4

ou 1/10000 ou 0,00010

Diluição 10-2

ou 1/100 ou 0,010

1 ml 1 ml 1 ml

9 ml diluente

9 ml diluente

Homo- geneizar

+


1.5 Pontos críticos do processo de diluição de amostras de alimentos 1.5.1 Homogeneização da amostra e suas diluições: A homogeneização inadequada da diluição inicial, e das subseqüentes, poderá acarretar diferenças muito grandes na contagem das colônias e resultados incoerentes quando do uso de duas ou mais diluições sucessivas

– Para a obtenção de resultados corretos de contagem de microrganismos em amostras de alimentos, a homogeneização de todas as diluições é ponto fundamental.

– A homogeneização da diluição inicial (amostra/diluente) deverá ser realizada em

"stomacher" ou homogeneizador entre 30 segundos a 2 minutos, dependendo do tipo de amostra.

– A homogeneização das diluições subseqüentes deverá ser realizada com o auxílio de

agitador de tubos, por um período de tempo não superior a 1 minuto.

– Evitar a homogeneização manual das diluições, pois o processo manual resulta a cada vez

em diferentes graus de homogeneidade.

25 g ou ml do Alimento

225 ml diluente

(25 = 1 parte)

(225 = 9 partes)

+

250 ml totais (225 ml de diluente+25 ml de alimento)

1 parte do alimento + 9 partes de diluente = 10 partes totais onde, 1 parte do alimento está está contida em 10 partes totais da mistura, por isto o alimento está diluído 10 vezes ou então está 10 vezes menos concentrado do que quando puro. Diluição 1/10 ou 0,10 ou 10--11

Preparo da primeira diluição: 10-1 ou 0,10 ou 1/10

(10 partes totais)


1.5.2 Diluições a utilizar x Intervalo de precisão e repetibilidade

– Considerando que o intervalo de precisão e repetibilidade poderá variar de 15 a 150, de 20 a 200, de

25 a 250 e ainda de 30 a 300, dependendo da metodologia analítica empregada, caberá ao analista estabelecer diluições que possibilitem a contagem de colônias nesses intervalos de precisão.

• Dessa forma, para alimentos com expectativa de crescimento bacteriano baixo, devido ao seu

processo de fabricação e de conservação, as inoculações deverão ser efetuadas a partir da diluição inicial 100 para líquidos ou 10-1 para sólidos ou pastosos, com no mínimo, duas diluições sucessivas.

• Por outro lado, para alimentos que se desconhece o número aproximado de microrganismos existentes, as diluições a serem preparadas deverão garantir condições de realização das contagens. Usualmente, nesses casos, utilizam-se as diluições 10-1 a 10-6.

Tempo desde a primeira diluição até a inoculação em meios de cultura

– O tempo gasto para a execução das diluições de uma amostra de alimentos até sua inoculação em

meios de cultura deverá ser de, no máximo, 20 minutos, de forma a não permitir a multiplicação dos microrganismos contidos nas diferentes diluições, o que acarretaria a obtenção de resultados falsos para a contagem de microrganismos.

Possíveis contaminações acidentais

– Ao retirar as pipetas dos cartuchos ou ao desenrolar o papel que envolve individualmente cada uma delas, tomar o máximo de cuidado para não tocar com a pipeta a superfície externa do cartucho, as mãos, as bordas externas dos tubos ou dos recipientes.

– Esses mesmos cuidados deverão ser tomados quando se estiver efetuando as inoculações nas placas ou nos tubos de ensaio. Caso tal situação ocorra, despreze a pipeta e reinicie o procedimento corretamente.

Aderência do líquido às paredes da pipeta

– Não inserir a ponta da pipeta mais do que 2,5 cm abaixo da superfície do líquido dentro dos tubos ou

dos recipientes contendo as diluições das amostras, diminuindo assim, a superfície de contato da pipeta com a amostra diluída.

– Dispensar lentamente o inóculo, permitindo a drenagem total até a marca final da pipeta por um período de 4 a 6 segundos, nos casos em que o mesmo corresponda ao volume total da pipeta. Preferentemente, usar pipetas que não sejam de esgotamento total.

– Quando da dispensa de parte do conteúdo de uma pipeta, deixar que o líquido escorra lentamente. O procedimento de expulsão rápida do líquido contido na pipeta acarreta a retenção de um maior volume de líquido aderido às paredes.

Tipo e capacidade das pipetas

– Sempre utilizar pipetas com marcação nítida de volume e, preferencialmente, que permitam a

pipetagem do volume desejado sem que seja necessária a expulsão da última porção da pipeta. – Quando esse tipo de pipeta não estiver disponível no laboratório, para a pipetagem de 1 mL, é

recomendável a utilização de pipetas com capacidade de 2 mL, com graduação de 1/10 ou 1/100, aspirando o inóculo até o volume total da mesma e dispensando a primeira porção (1 mL) no interior da placa ou do tubo.

– As pipetas utilizadas não deverão ter capacidade superior a 10 vezes o volume a ser medido, para assegurar que o inóculo dispensado seja o requerido.

– Por exemplo, se o inóculo for de 0,1 mL, utilizar uma pipeta de 1 mL com graduação de no mínimo 1/10, aspirando o inóculo até o volume total da mesma e dispensando a primeira divisão no interior da placa ou do tubo.


1.5.7 Precisão dos volumes dos inóculos – Manter a pipeta sempre na posição vertical e inclinar o tubo até posição que forme

um ângulo de 45º em relação à pipeta, facilitando, desta forma, a leitura na pipeta do "menisco" do volume a ser dispensado

1.5.8 Uso de pipetas • Sempre utilizar uma pipeta para cada diluição. • Não tocar com a pipeta de uma determinada diluição no diluente da diluição seguinte. • NUNCA enxaguar a pipeta com o diluente da diluição subseqüente. • A mesma pipeta poderá ser utilizada para a semeadura de diluições de amostras, desde que se parta

da maior diluição (amostra mais diluída) para a menor diluição (amostra menos diluída).

ROTEIRO DA PRÁTICA:

a) Preparar as amostras como descrito abaixo; b) Inocular pela técnica pour plate, cada diluição em meio de cultura apropriado; c) Incubar por 24 – 48 horas; d) Realizar a contagem das colônias e cálculo dos resultados.

PREPARO DE AMOSTRAS SÓLIDAS: 1) Fazer a recepção da amostra 1.1) Fazer a inspeção visual da amostra 1.2) Anotar tudo o que for necessário 2) Preparo: 2.1) Desinfetar a área externa da embalagem com álcool à 70 %; 2.2) Pesar 25 g da amostra para um frasco estéril previamente tarado com 225 ml de diluente; ( cortar pedaços pequenos de diversos pontos da amostra) 2.3) Homogeneizar a amostra ( 8000 – 15000 rpm por 1 à 2 min. ) 2.4) Preparar as diluições seriadas: a partir da diluição 1/10 ( retirar 1 ml da diluição 1/10 e passar para um tubo com 9 ml de diluente e assim sucessivamente até a última diluição ) 3) Pré – relatório : 3.1) Anotar todos os cuidados na hora da recepção da amostra, retirada da unidade analítica, preparo das diluições 3.2) Anotar todos os cuidados assépticos 3.3) Anotar as dificuldades e erros durante a prática PREPARO DE AMOSTRAS EM PÓ: 1) Fazer a recepção da amostra 1.1) Fazer a inspeção visual da amostra 1.2)Anotar tudo o que for necessário 2) Preparo: 2.1) Homogeneizar a amostra no frasco ( revolver a amostra com uma espátula estéril ); 2.2) Desinfetar a área externa da embalagem com álcool à 70 %;


2.3) Pesar 25 g da amostra para um frasco estéril previamente tarado com 225 ml de diluente; ( cortar pedaços pequenos de diversos pontos da amostra) 2.4) Homogeneizar a amostra ( 8000 – 15000 rpm por 1 à 2 min. ) 2.5) Preparar as diluições seriadas: a partir da diluição 1/10 ( retirar 1 ml da diluição 1/10 e passar para um tubo com 9 ml de diluente e assim sucessivamente até a última diluição ) 3) Pré – relatório : 3.1) Anotar todos os cuidados na hora da recepção da amostra, retirada da unidade analítica, preparo das diluições 3.2) Anotar todos os cuidados assépticos 3.3) Anotar as dificuldades e erros durante a prática PREPARO DE AMOSTRAS PASTOSAS: 1) Fazer a recepção da amostra 1.1) Fazer a inspeção visual da amostra 1.2) Anotar tudo o que for necessário 2) Preparo: 2.1) Homogeneizar a amostra no frasco ( revolver a amostra com uma espátula estéril ) – o intervalo entre a mistura e a retirada analítica não deve exceder 15 min. ; 2.2) Desinfetar a área externa da embalagem com álcool à 70 %; 2.3) Pesar 25 g da amostra para um frasco estéril previamente tarado com 225 ml de diluente; ( cortar pedaços pequenos de diversos pontos da amostra) 2.4) Homogeneizar a amostra ( 8000 – 15000 rpm por 1 à 2 min. ) 2.5) Preparar as diluições seriadas: a partir da diluição 1/10 ( retirar 1 ml da diluição 1/10 e passar para um tubo com 9 ml de diluente e assim sucessivamente até a última diluição ) 3) Pré – relatório : 3.1) Anotar todos os cuidados na hora da recepção da amostra, retirada da unidade analítica, preparo das diluições 3.2) Anotar todos os cuidados assépticos 3.3) Anotar as dificuldades e erros durante a prática PREPARO DE AMOSTRAS DE OVOS: 1) Fazer a recepção da amostra: 1.1) Fazer a inspeção visual da amostra; 1.2) Anotar tudo o que for necessário; 2) Preparo: 2.1) Retirar os ovos da geladeira e passar para uma estufa à 20 C, por um certo período de tempo; 2.2) Em seguida, passar para 25 C, por um certo período de tempo; 2.3) Transferir para temperatura ambiente, para equilibrar a temperatura; 2.4) Lavar os ovos com água e detergente ( a água deve estar 11C acima da temperatura dos ovos, portanto não inferior à 32 C )


2.5) Drenar o excesso de líquido e mergulhar os ovos em álcool à 70 % por 10 min. 2.6) Lavando e desinfetando bem as mãos, segurar os ovos , quebrar a casca e verter o conteúdo interno em um frasco estéril ( até dar os 25 ml ); 2.7) Submeter o conteúdo a um período inicial de 1 à 2 min. de homogeneização, antes da adição do diluente e homogeneização definitiva da diluição 1/10; 2.8) Preparar as diluições seriadas: A partir da diluição 1/10 ( retirar 1 ml desta diluição e passar para um tubo com 9ml de diluente e assim sucessivamente até a última diluição ). 3) Pré relatório: 3.1) Anotar todos os cuidadosna hora da recepção da amostra, retirada da unidade analítica, preparo das diluições; 3.2) Anotar todos os cuidados assépticos; 3.3) Anotar as dificuldades e erros durante a prática. PREPARO DE AMOSTRAS GORDUROSAS: 1) Fazer a recepção da amostra 1.1) Fazer a inspeção visual da amostra 1.2) Anotar tudo o que for necessário 2) Preparo: 2.1) Desinfetar a área externa da embalagem com álcool à 70 %; 2.2) Pesar 25 g da amostra em um frasco com 225 ml de diluente suplementado com tween 80 à 1% ( peso/volume) 2.3) Homogeneizar a amostra à 8000 rpm por 1 à 2 min. 2.4) Preparar as diluições seriadas: a partir da diluição 1/10 ( retirar 1 ml da diluição 1/10 e passar para um tubo com 9 ml de diluente e assim sucessivamente até a última diluição ) 3) Pré – relatório : 3.1) Anotar todos os cuidados na hora da recepção da amostra, retirada da unidade analítica, preparo das diluições 3.2) Anotar todos os cuidados assépticos 3.3) Anotar as dificuldades e erros durante a prática PREPARO DE AMOSTRAS GORDUROSAS: 4) Fazer a recepção da amostra 1.1) Fazer a inspeção visual da amostra 1.2) Anotar tudo o que for necessário 5) Preparo: 2.1) Desinfetar a área externa da embalagem com álcool à 70 %; 2.2) Pesar 25 g da amostra em um frasco com 225 ml de diluente suplementado com tween 80 à 1% ( peso/volume) 2.3) Homogeneizar a amostra à 8000 rpm por 1 à 2 min. 2.4) Preparar as diluições seriadas: a partir da diluição 1/10 ( retirar 1 ml da diluição 1/10 e passar para um tubo com 9 ml de diluente e assim sucessivamente até a última diluição )


6) Pré – relatório : 3.1) Anotar todos os cuidados na hora da recepção da amostra, retirada da unidade analítica, preparo das diluições 3.2) Anotar todos os cuidados assépticos 3.3) Anotar as dificuldades e erros durante a prática PREPARO DE AMOSTRAS PARA A TÉCNICA DA LAVAGEM SUPERFICIAL: 1) Fazer a recepção da amostra 1.1) Fazer a inspeção visual da amostra 1.2) Anotar tudo o que for necessário 2) Preparo: 2.1) Desinfetar a área externa da embalagem com álcool à 70 %; 2.2) Transferir 50 g da amostra para um frasco estéril e previamente tarado; 2.3) Adicionar o diluente na proporção 1/1 ( 1 ml de diluente para 1 g da amostra) 2.4) Lavar a amostra agitando vigorosamente o frasco, manualmente por 50 vezes; 2.5) Preparar as diluições seriadas: pegar 1 ml do preparado e adicionar em 9 ml de diluente ( Diluição 1/10) e assim sucessivamente até a última diluição. 3) Pré – relatório : 3.1) Anotar todos os cuidados na hora da recepção da amostra, retirada da unidade analítica, preparo das diluições 3.2) Anotar todos os cuidados assépticos 3.3) Anotar as dificuldades e erros durante a prática PREPARO DE AMOSTRAS LÍQUIDAS: 1) Fazer a recepção da amostra 1.1) Fazer a inspeção visual da amostra 1.3) Anotar tudo o que for necessário 2) Preparo: 2.1) Desinfetar a área externa da embalagem com álcool à 70 %; 2.2) Medir 25 ml da amostra para um frasco estéril previamente tarado com 225 ml de diluente; ( cortar pedaços pequenos de diversos pontos da amostra) 2.3) Homogeneizar a amostra ( 8000 – 15000 rpm por 1 à 2 min. ) 2.4) Preparar as diluições seriadas: a partir da diluição 1/10 ( retirar 1 ml da diluição 1/10 e passar para um tubo com 9 ml de diluente e assim sucessivamente até a última diluição ) 3) Pré – relatório : 3.1) Anotar todos os cuidados na hora da recepção da amostra, retirada da unidade analítica, preparo das diluições 3.2) Anotar todos os cuidados assépticos 3.3) Anotar as dificuldades e erros durante a prática


ANOTAÇÕES: MATERIAIS: EQUIPAMENTOS: AMOSTRAS: RESULTADOS:


AULA PRÁTICA ASSUNTO: Contagem de Colônias TEORIA: – A aplicação de procedimentos de controle durante o processo analítico visa à garantia da confiabilidade

do resultado final, assegurando a sua repetibilidade, precisão e exatidão. – A precisão e a exatidão do método também dependerão da correta observação e aplicação dos

procedimentos padronizados estabelecidos para a área analítica. – A garantia da validade dos resultados da contagem estará assegurada quando os resultados dos controles

indicarem não haver qualquer falha em nenhuma etapa do processo analítico. RECOMENDAÇÕES GERAIS 1. Sempre utilizar mais de uma placa, seja uma duplicata da mesma diluição, seja duas ou mais diluições

diferentes. 2. As contagens deverão ser realizadas imediatamente após o período de incubação das placas. 3. Na impossibilidade de realizar a contagem imediatamente após o período de incubação, manter as placas

sob refrigeração em temperatura de 4ºC a 7ºC por um período não superior a 24 horas. 4. Esse procedimento não deve tornar-se uma prática rotineira. 5. Para a contagem, selecionar placas que contenham um número de colônias que se encontre dentro do

intervalo de precisão e repetibilidade estabelecido pelo método em uso (por exemplo, 20 a 200 colônias, 25 a 250 colônias, etc).

6. As colônias deverão ser contadas com o auxílio de contador de colônias equipado com placa de vidro ou acrílico, com diâmetro compatível com o das placas utilizadas, dividido milimetricamente em quadrantes com 1 cm2 de área e com iluminação artificial uniforme.

7. O contador de colônias deverá ter capacidade para aumento de 1 a 2 vezes, com dispositivo de regulagem de altura para melhor ajuste do foco, podendo ainda dispor de sistema eletrônico ou manual de registro das contagens

8. O contador de colônias deverá estar localizado em local onde não haja incidência direta de luz sobre a plataforma de apoio da placa, para evitar possíveis enganos na identificação das colônias.

9. Utilizar o estereoscópio para observação de características morfológicas das colônias, para diferenciar microrganismos de partículas da amostra ou do meio e para seleção e isolamento de colônias.

10. Verificar sempre a proporcionalidade dos resultados obtidos nas diluições sucessivas. REGRAS GERAIS PARA CÁLCULO E REGISTROS 1. Expressão de resultados de contagem

• No cálculo das contagens, o resultado final será expresso em UFC/g ou mL, levando-se em conta a diluição empregada, da seguinte maneira:

• R = a x 10b UFC/g ou mL � R = resultado � a = os dois primeiros algarismos significativos, números de 0 a 9 � b = expoente (0 a 10) � UFC = unidade formadora de colônias � g = grama e mL= mililitro


Exemplos: • Diluição 10 -2 (1:100)

– Média das contagens: 25 UFC – Resultado: 25 x 100 = 2.500 = 2,5 x 103 UFC/g ou mL

• Diluição 10 -3 (1:1.000) – Média das contagens: 38 UFC – Resultado: 38 x 1.000 = 38.000 = 3,8 x 104 UFC/g ou mL

� O resultado final será expresso considerando-se os dois primeiros algarismos representativos, separados por vírgula. Os algarismos subseqüentes, quando existirem, deverão ser arredondados e transformados em potência de 10.

2. Arredondamento de resultados Quando se fizer necessário, e visando não criar uma falsa idéia de precisão, aplicar a seguinte regra para a aproximação dos resultados: 2.1 Arredondar para cima o segundo algarismo ou o subseqüente quando o algarismo imediatamente após for superior a 5. Exemplo:

– Diluição 10-2 – Média das contagens: 186 UFC – Arredondando-se o terceiro algarismo para cima tem-se como resultado: – 190 x 100 = 19.000 = 1,9 x 104 UFC/g ou mL

2.2 Arredondar para baixo o segundo algarismo ou o subseqüente quando o algarismo imediatamente após for inferior a 5. Exemplo:

– Diluição 10–2

– Média das contagens: 184 UFC – Arredondando o terceiro algarismo para baixo tem-se como resultado: – 180 x 100 = 18.000 = 1,8 x 104 UFC/g ou mL

2.3 Nos casos em que o terceiro algarismo ou o subseqüente for igual a cinco, arredondar para baixo quando o segundo ou o subseqüente for menor ou igual a 5 e para cima quando for maior que 5. Exemplos: Diluição 10-2 Média das contagens: 185 UFC Arredondando o terceiro algarismo para cima tem-se como resultado: 190 x 100 = 19.000 = 1,9 x 104 UFC/g ou Ml Média das contagens: 145 UFC Arredondando o terceiro algarismo para baixo tem-se como resultado: 140 x 100 = 14.000 = 1,4 x 104 UFC/g ou mL Média das contagens: 155 UFC Arredondando o terceiro algarismo para baixo tem-se como resultado: 150 x 100 = 15.000 = 1,5 x 104 UFC/g ou mL


Normas de Trabalho durante as aulas práticas no Laboratório de Microbiologia:

• No início de cada aula, traçar um plano de trabalho considerando o tempo necessário para a realização da prática;

• Trabalhar sempre de maneira ordenada, tranqüila, constante e metódica, evitando movimentos desnecessários, bem como corrente de ar no laboratório;

• Limpar e desinfetar as superfícies das mesas, balcões e etc, no começo e no final de cada aula prática;

• Efetuar anotações sobre a aula prática, como os materiais, equipamentos e amostras utilizadas; estas anotações serão necessárias para se fazer os relatórios de cada aula prática;

• Identificar as amostras com o nome da equipe, bem como o material a ser utilizado, antes de iniciar a prática. As amostras em geral não devem ser descartadas até obter-se os resultados;

• Tocar o material a analisar apenas com materiais estéreis (nunca com as mãos); • No caso de derramamento de material contaminado, proceder imediatamente a desinfecção e

esterilização; • Todo o material utilizado na análise, tais como lâminas, pipetas, etc., devem ser colocados em

recipientes contendo solução desinfetante para descarte; • O material utilizado deve receber a seguinte seqüência de tratamento (*)

– Esterilização – Lavagem – Secagem – Embalagem e esterilização – Armazenamento

(*) Porém, os alunos deverão deixar lavados apenas os materiais utilizados durante a aula, que não estão contaminados. Os materiais contaminados serão esterilizados pela equipe de apoio dos laboratórios.

• Os cultivos após leitura devem ser esterilizados; • Observar a temperatura das estufas e banhos termostatizados, quando forem utilizá-los; • Ler com atenção o rótulo do produto a ser utilizado; • Manipular todos os reagentes e solventes com o máximo de cuidado; • Não cheirar reagentes e meios de cultura; • Se não for possível trabalhar em fluxo laminar utilzar o bico de Bunsen, entre o material a ser

analisado e o analista; • Deve-se utilizar luvas cirúrgicas descartáveis quando da manipulação de micorganismos altamente

infecciosos; • Se não for utilizar pipetador automático, todas as pipetas deverão ter algodão na extremidade de

sucção, para evitar contaminação do analista; • Seguir as nornas de uso dos aparelhos; • Flambar alças, agulhas e pinças, antes e após o uso; • Deixar o laboratório limpo e organizado ao final de cada aula prática.


Normas de higiene e ordem pessoais

• Usar avental ou guarda-pó (jaleco) e, se possível, touca e máscara; • Manter no laboratório exclusivamente os materiais necessários aos trabalhos de análises; • Se for portador de algum ferimento nas mãos, não deve participar dos trabalhos de análise. No caso

de necessidade extrema, fazer uma boa sanificação das mãos, especialmente do ferimento, e utilizar luvas, procedendo também a sanificação das mesmas.

• Lavar e utilizar sanificante nas mãos ao entrar, sempre que for necessário e ao sair do laboratório; • Não fumar, comer ou ingerir líquidos no laboratório; • Evitar tocar o corpo e especialmente os olhos, boca, nariz com as mãos durante os trabalhos no

laboratório. Em caso de necessidade de fazê-lo proceda a lavagem e sanificação das mãos antes e após o ato;

• Não umedecer etiquetas ou outro material do laboratório com a língua; • Não utilizar lenços de uso pessoal ou avental para limpar objetos ou instrumentos de trabalho no

laboratório; • Em casos de acidentes com ferimentos e cortes, proceder imediatamente a lavagem e a desinfecção; • Comunicar imediatamente qualquer suspeita de haver contraído uma enfermidade no laboratório.

aula prÁtica conduta e atitudes no laboratÓrio de

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