aula 08 - engenhariagenetica

7/25/2019 AULA 08 - EngenhariaGenetica

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Prof.: Cynthia Canedo da SilvaAula 8: Micro-organismos e

Engenharia Gentica

Bibliografa: Tortora et al., 2012 - Cap.

9: 247-272Madigan et al., 2012 - Cap. 12


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Aula 8: Micro-organismos eEngenharia Gentica

Ao final desta aula o estudante dever ser capaz:- Reconhecer o papel e a importncia dos micro-organismosna engenharia gentica

- Identificar as principais etapas e elementos necessrios para

a clonagem de genes

- Explicar como as enzimas de restrio e a !"A ligase so

utilizadas para construo de plasm#deos recom$inantes

- !escrever estratgias %ue possi$ilitam a identificao de

$actrias recom$inantes

- Reconhecer pro$lemas associados com a clonagem de genes


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&' Introduo

Engenharia (entica ou

)ecnologia do !"A

Recom$inante *&+,.

/icro-organismos importantes ferramentas


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0roduo de compostos por tempo indefinido


1antagens da utilizao de micro-organismos

2cil cultivo 3 4aixo custo

5$teno de um grande n6mero de clulas

em um curto per#odo de tempo


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7ristais de insulina produzidospela E. coli

E. coliprodutora de insulina

E. coli geneticamentemodificada


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7aracter#sticas do hospedeiro ideal

Aceitar o !"A ex8geno sem provocar

modificao no gene

0ermitir a seleo das clulas %ueapresentarem o !"A ex8geno

4aixo potencial de proliferao no meioam$iente


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Exemplos do micro-organismoshospedeiros

Fon

te:PauloDonatoCastellane

Leveduras: S. cerevisiaeBactrias: E. coli


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7aracter#sticas do vetor ideal

!uplicar o !"A ex8geno

Apresentar marcadores para a seleo

Apresentar propriedades %ue facilitem sua

ligao ao !"A %ue vai ser clonado


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Vetor de clonagem ideal

0lasm#deo1etor de clonagem

Regio em %ue o !"AEx8geno ser

inserido


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7onstruo de uma $actria recom$inante1. Isolamento

do DNA

doador

2. Isolamentodo gene de

interesse

' Isolamento do

!"A do vetor

. !rans"orma#$oda clula

hos%edeira

&. !ratamentocom en'ima de

restri#$o eliga#$o

(. Identi)ca#$oda clula

recom*inante


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0urificaodo !"A

&' Isolamentodo !"A doador

7lula intacta

!"A

9ise celular

9i$erao do !"A



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' Isolamento do gene de interesse

+rodu' ,rias c%ias do gene de

interesse

- Fita molde - DNA ou cDNA- dNTPS (A, G, T, C)

- DNA-olimerase (Taqol)

-Primers-


- 07R: !ea"#o em cadeia da olimerase !elica"#o in vitro

$ue %la&$ueiam a se$u'&cia do e&e de i&teresse


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' Reao de 07R

+/0: 0ea#$o em /adeia da+olimerase -& ciclos em

%assos:0asso &:

!esnaturao

0asso :Anelamento

0asso :Extenso


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CromossomoPlasmdeo

Lise celular

Liberao do

DNA plasmidial e

cromossmico

Cloreto de

csio e

brometo deet!deo

DNA cromossomal

DNA plasmidial

Centri"u#ao em #radiente de CsCl

' Isolamento do !"A plasmidial



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;' Enzimas de restrio 0resentes em %uase todos os micro-organismos

Reconhecem e clivam s#tios espec#ficos na se%u


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Enzima de restrio EcoRI

Clivaem

*+tremidades coesivas

Stio esec%ico

Os fragmentos de

DNA unem um ao

outro por

complementaridad

e!


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Ao dasenzimas de

restrio


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Exemplos >its de $iologia molecular?it de extrao de

!"A gen@mico

?it de extrao de!"A plasmidial

?it de clonagem

de !"A



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)ransformao

!rans"orma#$o com cloreto de clcio

e cho3ue trmico

Mtodo utili'ado %ara inserir os

%lasm4deos nas clulas hos%edeiras

)ransformao por eletroporao


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)ransformao com 7a7le 7ho%ue )rmico

0reparo de clulas competentes


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)ransformao de E. coli

o&s de CaCl&eutrali.amcaras &eativas damem/ra&a e do DNA

lasmidial


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)ransformao por Eletroporao

0reparo de clulas competentes


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Identificao das $actrias recom$inantes

&' so de plasm#deos com genes %ue conferem resist


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0lasm#deorecom$inante

&. /istura de E. colicom osplasm#deos

. Aplicado est#mulo

. 7ultivo em gar nutrientecontendo A/0I7I9I"A

Cromossomo deE. coli

0lasmideorecom$inante

7lulas %ue "C5 rece$erem oplasm#deo morrero em placa

com ampicilina

7lulas transformadasso$revivem em

placa com ampicilina

0la%ueamentodos

transformantes


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!eteco da$actria

recom$inante

Deleo$ranca-azul



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Deleo $ranca-azul

!"A de interesse

inserido no meio do

gene lacZ


Apresentam dois marcadores de seleo


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7ol@nias $ranca - azul

Todas as col0&ias co&t'm o

lasmdeo

Col0&ias a.uislasmdeo Col0&ias /ra&caslasmdeo

recom/i&a&tes



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Bi$ridao de col@nias *mreo de so&da de DNA ara ide&ti%icar col0&ias co&te&do o

e&e de i&teresse

As so&das de DNA s#o comleme&tares ao e&e dese1ado


Tais so&das s#o marcadas or radioatividade ou %luoresc'&cia

Mem*rana

so&da deDNA

marca"#o

DNA dei&teresse


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Bi$ridao decol@nias


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Presena de ntrons

act"ria n#o reconhece as se$u%ncias reguladoras driotos

&orma#o de agregados prot"icos insol'veis

0ro$lemas com a clonagem de genes eucari8ticosem $actrias de col@nias


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Sntese em e(cesso da protena

Destrui#o da nova protena

i)culdades na e(tra#o e puri)ca#o da nova proten

0ro$lemas com a clonagem de genes eucari8ticosem $actrias de col@nias



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D#ntese de c!"ATra&scritase reversa

- Fita molde: m!NA

A %ita de cDNA si&teti.ada elatra&scritase reversa2


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0rodutosfarmac


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0rodutos paraagricultura e pecuria


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3 Anima#5es no 6outu*e:

3 https:**+++.youtue.com*+atch,v-uP/i0123453

https:**+++.youtue.com*+atch,v-6DlO578veC2

https://www.youtube.com/watch?v=GDlOE9TveCIhttps://www.youtube.com/watch?v=GDlOE9TveCI

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