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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE MEDICINA

Programa de Pós-graduação em Ciências Médicas

CLARISSA SOUZA GOMES DA FONTOURA

ASSOCIAÇÃO ENTRE AS FISSURAS LABIOPALATAIS E OS GENES ARHGAP29, PBX1, TP63, WNT3 E WNT9B

Niterói 2013


ASSOCIAÇÃO ENTRE AS FISSURAS LABIOPALATAIS E OS GENES ARHGAP29, PBX1, TP63, WNT3 E WNT9B

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre. Área de Concentração: Ciências Médicas.

.

Orientador: Prof. Dr. José Mauro Granjeiro

Co-orientadora: Prof.ª Dr.ª Ariadne Machado Gonçalves Letra

Niterói

2013

O F684

Fontoura, Clarissa Souza Gomes da Associação entre as fissuras labiopalatais e os genes ARHGAP29, PBX1, TP63, WNT3 E WNT9B / Clarissa Souza Gomes da Fontoura. – Niterói : [s.n.], 2013. 104 f. Orientador:José Mauro Granjeiro. Co-Orientador:Ariadne Machado Gonçalves

Letra.

Dissertação(Mestrado em Ciências Médicas) – Universidade Federal Fluminense, Faculdade de Medicina, 2013.

1. Anormalidades craniofaciais. 2. Fissura palatina. 3. Fenda labial. 4. Polimorfismo genético. I. Titulo. CDD 575.1


ASSOCIAÇÃO ENTRE AS FISSURAS LABIOPALATAIS E OS GENES ARHGAP29, PBX1, TP63, WNT3 E WNT9β

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre. Área de Concentração: Ciências Médicas.

Aprovado em 04 de julho de 2013.

BANCA EXAMINADORA

Prof. Dr. Beni Olej

Prof. Dr. Marcelo de Castro Costa

Prof.ª Dr.ª Silvia Paula de Oliveira

Niterói 2013

DEDICATÓRIA

Aos pacientes com fissura labiopalatina e suas famílias, razão do

nosso estudo, que gentilmente colaboraram, confiaram e se prontificaram em participar desta pesquisa. Pacientes que na

inocência de suas vidas nos ensinam o valor do nosso trabalho e depositam em nós suas esperanças em busca de uma melhor

qualidade de vida. Que este estudo, em sua pequena contribuição e buscando reduzir o universo de desconhecimento sobre o assunto,

possa ajudar-nos a oferecer-lhes uma melhor qualidade em suas jornadas diárias.

AGRADECIMENTOS ESPECIAIS Aos meus orientadores ...

Ao Prof. Dr. José Mauro Granjeiro que me recebeu generosamente e

me incentivou ao longo do curso com seu admirável empenho e dedicação à

pesquisa; um exemplo para todos nós, jovens pesquisadores, mostrando que

com determinação e competência é possível contribuir sobremaneira para o

avanço científico.

À Dra. Ariadne Machado Gonçalves Letra, não somente pela sua

imprescindível colaboração e preciosa orientação durante toda a execução

deste trabalho, mas por compartilhar seus conhecimentos, sabedoria,

competência e pela oportunidade bastante enriquecedora que me proporcionou

profissionalmente nestes anos de convívio e, principalmente, por ser essa

amiga especial.

AGRADECIMENTOS

Ao meu pai Luiz Francisco, minha fonte de inspiração, que durante

toda a minha vida construiu e sedimentou exemplos de honestidade, empenho

e perseverança. Obrigada pelo seu amor incondicional e eterno incentivo.

À minha mãe Regina por sua imensa capacidade de zelar e de amar,

por me guiar a realização dos meus sonhos me ajudando a superar todos os

obstáculos, o meu eterno obrigada.

Às minhas irmãs Flávia, Bárbara e Fernanda, que sempre entenderam

os motivos da minha distância e falta de tempo dispensado a elas.

Ao meu marido, Rodrigo Rocha Maia por seu amor e compreensão,

estimulando-me constantemente a seguir em frente e, principalmente, por estar

sempre ao meu lado compartilhando meus sonhos. Muito obrigada por sua

inestimável ajuda, apoio incondicional e estímulo constante.

Ao Programa de Pós-graduação em Ciências Médicas, na pessoa da

atual Coordenadora Professora Solange Artimos de Oliveira, pela

oportunidade, aos professores pelos ensinamentos, às secretárias Orlandina

da Silva e Souza Alvarenga, pelo profissionalismo e cordialidade.

Aos amigos da UFF, pelo apoio, amizade ao longo desses meses de

convivência.

Ao Hospital Nossa Senhora do Loreto por ter permitido acesso aos

pacientes e suas famílias para a realização deste trabalho.

Aos colegas do setor de Cirurgia Plástica do Hospital Nossa Senhora do Loreto, por terem me recebido de forma tão amigável, pela

paciência e ajuda durante os procedimentos com os pacientes. Em especial, ao

Dr. Luiz Sério Zanini, pelo apoio fundamental durante muitos meses de

trabalho intenso.

A todos aqueles que, por um lapso de memória, foram esquecidos,

mas que direta ou indiretamente contribuiriam nesta jornada, fica aqui

registrado o meu muitíssimo obrigado.

A ciência não é, e nunca será, um livro terminado. Todo progresso

importante levanta novas questões. Dificuldades novas e mais profundas

são reveladas posteriormente a cada desenvolvimento.

Albert Einstein

RESUMO

A fissura labial com ou sem fissura palatina (FL/P) é uma anomalia

craniofacial muito comum em humanos e pode ocorrer como característica de

um quadro sindrômico ou isolada quando os indivíduos afetados não

apresentam qualquer anomalia estrutural associada. A etiologia da FL/P é

complexa, com a contribuição de componentes genéticos e ambientais.

Diversos genes/loci candidatos a FL/P foram sugeridos nos últimos anos,

contudo, discrepâncias entres os resultados são comumente encontradas.

Recentemente, os genes WNT3, WNT9B, PBX1, TP63, e ARGHAP29 foram

citados como possíveis genes candidatos à etiologia das FL/P devido à

importante função que exercem durante o desenvolvimento craniofacial. O

objetivo deste trabalho foi avaliar a associação entre polimorfismos nestes

genes com o fenótipo de FL/P em uma população brasileira. Para tanto,

setenta famílias, constituídas por um indivíduo afetado e seus pais não

afetados, foram examinadas clinicamente e amostras de saliva foram coletadas

para estudos moleculares. Um total de 20 polimorfismos distribuídos nos genes

WNT3, WNT9B, PBX1, TP63, e ARGHAP29 foram estudados com relação à

associação com FL/P utilizando-se o método de TaqMan. O teste de

desequilíbrio de transmissão (TDT) foi utilizado para detectar a associação de

alelos em cada marcador nos indivíduos com FL/P, através do programa

Family-Based Association Test (FBAT). O nível de significância foi determinado

em P ≤ 0,05. Houve associação positiva entre FL/P para os genes ARGHAP29

(rs1048854), TP63 (rs4575879) e WNT9B (rs1530364) com FL/P. Não foi

detectada associação entre alelos e genótipos de WNT3 e PBX1 com FL/P.

Estes resultados sugerem que ARGHAP29, TP63 e WNT9B podem estar

envolvidos na etiologia da FL/P na população estudada.

Palavras-chave: anomalias craniofaciais; etiologia; fissura labial/palatina;

polimorfismos genéticos; SNPs.

ABSTRACT

Cleft lip with or without cleft palate (CL/P) is a common craniofacial

anomaly in humans, and may occur as part of a syndrome or isolated, when the

affected individuals do not present any associated structural anomalies. The

etiology of CL/P is complex, with both genetic and environmental factors

involved. Several genes/loci have been suggested in the past years although

discrepancies among results are often found. Previous studies have

demonstrated that WNT3, WNT9B, PBX1, TP63, and ARGHAP29 may be

involved in the etiology of the CL/P due to the important function of these genes

during craniofacial development. The aim of this study was to evaluate the

association between polymorphisms in these genes and CL/P in a Brazilian

population. Seventy families, composed by an affected individual and their

unaffected parents, were examined clinically and saliva samples were collected

for molecular analyses. A total of 20 polymorphisms distributed in WNT3,

WNT9B, PBX1, TP63, and ARGHAP29 were investigated using the TaqMan

method. The Family-Based Association Test (FBAT) and the transmission

disequilibrium test (TDT) were used to verify the association between each

marker allele and CL/P. The level of significance was established at P ≤ 0.05.

Positive associations were detected between CL/P and three markers in

ARGHAP29 (rs1048854), TP63 (rs4575879) and WNT9B (rs1530364) genes.

No association was detected between CL/P and markers in WNT3 and PBX1.

These results suggest that ARGHAP29, WNT9B and TP63 may be involved in

the etiology of CL/P in the studied population.

Keywords: craniofacial anomalies; etiology; cleft lip/palate; genetic

polymorphisms; SNPs.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Diagramas representando a origem embrionária das

estruturas faciais. O terço médio da face é caracterizado pela fusão do

processo frontonasal na parte superior (amarelo) e os processos

maxilares (PMX) bilateralmente na porção mediana da face em

desenvolvimento (verde). A mandíbula é criada pela fusão dos

processos maxilares (azul) em torno de 3,5 semanas de gestação. IMS,

segmento intermaxilar; LNP, proeminência nasal lateral; MNP,

proeminência nasal medial; NP, fossa nasal ............................................

Figura 2: Diagrama das etapas da fusão em um par de proeminências

faciais onde “A” representa a camada epitelial. As proeminências faciais

são ocupadas por células mesenquimais (B) e o crescimento é

impulsionado por sua proliferação (C). O contato inicial ocorre com a

aproximação dos dois epitélios adjacentes (D) e esta adesão é

consolidada através da intercalação de células epiteliais (E). O epitélio

medial é então removido através de uma combinação de apoptose,

migração, e/ou transformação epitélio-mesenquimal (F) resultando na

fusão completa das proeminências da face (G) .......................................

Figura 3: Diagrama mostrando vias de sinalização molecular durante o

desenvolvimento do palato em camundongos. (A) Seção transversal do

palato embrionário. (B) Seções da parede palatina normal (cinza): as

paredes palatinas emanam das proeminências maxilares (E11.5),

crescem e estendem-se verticalmente (E12.5); a língua (T; rosa) desce,

permitindo que as paredes palatinas se elevem (E13,5), se encontrem

(E14.5), fusionando-se na linha media (E15.5). (C) Expressão celular

específica de moléculas de sinalização durante o crescimento e (D)

fusão do palato moléculas expressas no epitélio (amarelo) ou

mesênquima (cinza). As moléculas que mostraram ser essenciais para

o desenvolvimento do palato em camundongos estão circuladas,

sublinhadas quando essenciais em humanos, e em retângulos quando

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essenciais para ambos. As setas que indicam interações gene-gene

(reto) ou ambiente-gene (onduladas) são estabelecidas (preto) ou

hipotéticas (cinza). Ahr, receptor de hidrocarboneto aromático; ALK5,

receptor de ativina como quinase 5; BMP4, proteína óssea

morfogenética 4; BZD's, as benzodiazepinas; MSX1, msh como 1

homeo-box, PTC, patched homólogo 1, Pvrl1 receptor relacionados

poliovírus 1; SATB2, SATB membro da família 2; TBX22, T-box 22;

TgfB3, fator transformador de crescimento β3 (Murray & Schutte, 2004)

Figura 4: Apresentação clínica das Fissuras Labiais. (A) fissura labial

unilateral sem acometimento do alvéolo dentário. (B) fissura labial

bilateral sem comprometimento do alvéolo dentário (Dixon et al., 2011).

Figura 5: Apresentações clínicas das FL/P. (A) fissura labiopalatina

unilateral incompleta; (B) fissura labiopalatina unilateral completa (C) fissura labiopalatina bilateral incompleta; (D) fissura labiopalatina

bilateral completa (Dixon et al., 2011) ......................................................

Figura 6: Apresentação clínica da FP. Fissura palatina completa com

comprometimento dos palatos duro e mole (Dixon et al., 2011) ..............

Figura 7: Esquema da estrutura do gene PBX1. Caixas verdes

representam regiões codificadoras, barras verdes representam íntrons.

As setas coloridas indicam a localização dos polimorfismos estudados

(da esquerda para a direita): rs6426870, rs10442643, rs1618566,

rs10800043, rs7543038 ............................................................................

Figura 8: Esquema da estrutura do gene ARHGAP29. Caixas verdes




rs3789688, rs3814019 ..............................................................................

Figura 9: Esquema da estrutura do gene TP63. Caixas verdes




rs4686529, rs1515490 ..............................................................................

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Figura 10: Esquema da estrutura do gene WNT9B. Caixas verdes



(da esquerda para a direita): rs12602434, rs1530364 .............................

Figura 11: Esquema da estrutura do gene WNT3. Caixas verdes



(da esquerda para a direita): rs199525, rs111769, rs3851781 ................

Figura 12: Distribuição dos tipos de fissuras na população estudada .....

Figura 13: Distribuição étnica da população estudada ............................

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Polimorfismos estudados no gene PBX1 ………………………

Tabela 2: Polimorfismos estudados no gene ARHGAP29 ………………

Tabela 3: Polimorfismos estudados no gene TP63 ……………………… Tabela 4: Polimorfismos estudados no gene WNT9B …………………. Tabela 5: Polimorfismos estudados no gene WNT3 …………………… Tabela 6: Resultados do cálculo de poder estatístico do tamanho da

amostra ……………………….................................................................... Tabela 7: Faixa etária da população estudada ........................................

Tabela 8: Frequência dos alelos encontrados para polimorfismos

estudados no gene PBX1………………………..........................................


estudados no gene TP63 ……………………….........................................


estudados no gene WNT3 ………………………........................................


estudados no gene WNT9B ……………………….....................................


estudados no gene ARHGAP29 ………………………...............................

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ABCA4 Do inglês- ATP-binding cassette, sub-family A (ABC1), member 4

Ahr Do inglês , aryl hydrocarbon receptor

Alk5 Do inglês , receptor tyrosine kinase 5

ARHGAP29 Do inglês , Rho GTPase activating protein 29

Bmp4 Do inglês, bone morphogenetic protein 4

BZD's Benzodiazepinas

DNA Do inglês, Deoxyribonucleic acid

EEC Do inglês, ectrodactyly - ectodermal dysplasia and cleft lip/palate

FBAT Do inglês, Family-Based Association Test

FGF Do inglês, Fibroblast Growth Factor

FL Fissuras labial isolada

FL/P Fissura de lábio e/ou palato

FP Fissuras de palato isolada

GWAS Do inglês, Genome Wide Association Studies

IRF6 Do inglês, Interferon Regulatory Factor 6

LNP Proeminência nasal lateral

MAFB Do inglês, V-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene

homolog B

MNP Proeminência nasal medial

MSI Segmento intermaxilar

MSX1 Do inglês, Muscle segment homeobox 1

ng Nanograma

NP

OMIM

Fossa nasal

Do inglês, Online Mendelian Inheritance in Man

PBX Do inglês, pre-B-cell leukemia homeobox

PCR Do inglês, Polimerase chain reaction

PMX Processos maxilares

PTCH1 Do inglês, Patched 1

Pvrl1 Do inglês, poliovirus receptor-related 1

SATB2 Do inglês SATB membro da família 2

SNPs Do inglês, single nucleotide polymorphism

SOX5 Do ingles, SRY (sex determining region Y)-box 5

SPP Síndrome pterígio poplíteo

TBX22 T-box 22

TDT Teste de desequilíbrio de transmissão

TGFA Do ingles, transforming growth factor, alpha

TGFB Do ingles, transforming growth factor, beta

TgfB3 Do ingles, transforming growth factor, beta 3

TP63 Do inglês, tumor protein p63

VAX Do inglês, homeobox anterior ventral1

VWS Síndrome de Van der Woude

WNT Do inglês, wingless-type MMTV integration site family

WNT3 Do inglês ,wingless-type MMTV integration site family, member 3

WNT9B Do ingles, wingless-type MMTV integration site family, member

9B

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ....................................................................................

2. REVISÃO DA LITERATURA ..............................................................

2.1. PRIMÓRDIOS DO DESENVOLVIMENTO CRANIOFACIAL ...........

2.2. REGULAÇÃO MOLECULAR DO DESENVOLVIMENTO

EMBRIONÁRIO .......................................................................................

2.3. FISSURA LABIAL COM OU SEM FISSURA PALATINA .................

2.4. GENES CANDIDATOS E POLIMORFISMOS GENÉTICOS ...........

2.5. ESTUDOS GENÉTICOS DAS FISSURAS LABIOPALATINAS ......

2.5.1. Estudos de associação …………………………………………….

2.5.2. TP63 .............................................................................................

2.5.3. Via de sinalização WNT ..............................................................

2.5.4. PBX1 .............................................................................................

2.5.5. ARHGAP29 ...................................................................................

3. HIPÓTESE ..........................................................................................

4. OBJETIVOS ........................................................................................

4.1. OBJETIVO GERAL ..........................................................................

4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................

5. MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................

5.1. POPULAÇÃO ESTUDADA ..............................................................

5.2. EXAME CLÍNICO E ANAMNESE ...................................................

5.3. COLETA DE MATERIAL BIOLÓGICO .............................................

5.4. EXTRAÇÃO DO DNA ......................................................................

5.5. QUANTIFICAÇÃO DO DNA .............................................................

5.6. SELEÇÃO DE GENES CANDIDATOS E POLIMORFISMOS DE

UM ÚNICO NUCLEOTÍDEO (SNPs - single nucleotide polimorphisms)

5.7. PBX1.................................................................................................

5.8. ARHGAP29 …………………………………………………………….

5.9. TP63 .................................................................................................

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5.10. WNT9B ...........................................................................................

5.11. WNT3 .............................................................................................

5.12. GENOTIPAGEM ............................................................................

5.13. ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................................................

6. RESULTADOS ...................................................................................

6.1. CARATERIZAÇÃO DA AMOSTRA ..................................................

6.2. ESTUDOS GENÉTICOS DE ASSOCIAÇÃO COM FL/P .................

6.2.1. PBX1..............................................................................................

6.2.2. TP63 ..............................................................................................

6.2.3. WNT3 ............................................................................................

6.2.4. WNT9B .........................................................................................

6.2.5. ARHGAP 29 ..................................................................................

7. DISCUSSÃO .......................................................................................

7.1. DESENHO DO ESTUDO .................................................................

7.2. SELEÇÃO DOS GENES CANDIDATOS E POLIMORFISMOS

ESTUDADOS ..........................................................................................

7.3. ANÁLISE DOS RESULTADOS ........................................................

7.4. MÉTODO DE GENOTIPAGEM .......................................................

7.5. RESULTADOS DE ASSOCIAÇÃO COM A FL/P .............................

7.5.1. PBX1 .............................................................................................

7.5.2. TP63 ..............................................................................................

7.5.3. WNT Genes ..................................................................................

7.5.4. ARHGAP29 ...................................................................................

7.6. LIMITAÇÕES DO ESTUDO .............................................................

7.7. PERSPECTIVAS FUTURAS ............................................................

8. CONCLUSÕES ...................................................................................

REFERÊNCIAS ......................................................................................

APÊNDICE 1: TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO ......................................................................................

APÊNDICE 2: QUESTIONÁRIO ...........................................................

ANEXO 1: APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA ......

ANEXO 2: INSTRUÇÕES DO FABRICANTE – ORAGENE DNA

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PURIFICATION KIT (DNA GENOTEK) ...............................................

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1. INTRODUÇÃO

O desenvolvimento humano é um evento complexo que exige a

integração de vários mecanismos para permitir a formação correta de todas as

estruturas. As fissuras orofaciais ocupam um lugar de destaque entre as

anomalias de desenvolvimento humano, estando entre os defeitos craniofaciais

congênitos mais comuns e apresentando um forte componente genético

(Fraser & Calnan, 1961). Embriologicamente, as fissuras orofaciais podem ser

distinguidas em fissuras labiais (FL), fissuras de palato (FP), e fissuras lábio-

palatinas (FL/P). As fissuras lábio-palatinas, podem incluir as fissuras labiais

associadas ou não à fissura do palato, uma vez que o desenvolvimento e o

mecanismo fisiopatológico de ambas são distintos (Fogh-Andersen, 1942).

Aproximadamente 30% dos casos de FL/P estão associados a síndromes ou

aberrações cromossômicas e cerca de 400 síndromes apresentam FL/P como

parte do fenótipo. Os 70% restantes são considerados casos isolados, onde a

FL/P ocorre em indivíduos que não apresentam qualquer outra anomalia

estrutural (Murray & Schutte, 2004). Estudos familiares sugerem que a FL e

FLP são malformações genéticas distintas da FP (Natsume, 1987). A incidência

relatada para FL e FLP varia de 1:500 a 1:1000 nascimentos dependendo da

população (Dixon et al., 2011). Para FP a incidência relatada é menor, em

torno de 1:1500 nascimentos (Mossey and Little, 2002). A incidência da FL/P

isolada varia de acordo com os diferentes grupos étnicos, ocorrendo em geral

em um caso a cada 1.000 nascimentos em caucasianos. Os índios norte-

americanos são os mais afetados com 1,99 casos para cada 1.000

nascimentos; já nos asiáticos a prevalência é de 1,05 casos para cada 1.000

nascimentos e a menor prevalência é de afro-americanos com um índice de

0,62 em 1000 nascimentos (Croen et al., 1998). Existem variações também

com relação ao tipo de fissura nos diferentes gêneros, onde pacientes do sexo

masculino apresentam maior prevalência de FL/P enquanto pacientes do sexo

feminino apresentam maior prevalência de FP. Outros fatores como localização

geográfica (cidades com altitude elevada), e baixo status socioeconômico

18

também têm sido sugeridos como fatores que podem aumentar a

susceptibilidade à FL/P.

A etiologia da FL/P isolada é complexa com o envolvimento de diversos

genes e fatores ambientais os quais podem interagir e modular o risco de

ocorrência da condição (Vieira, 2008). Desde o primeiro relato da associação

do gene do fator de crescimento transformador alfa (TGFA) com FL/P (Ardinger

et al., 1989), a identificação de genes candidatos para FL/P e vias de

sinalização importantes para o desenvolvimento craniofacial tem sido objeto de

inúmeras pesquisas (Jugessur & Murray, 2005; Lidral & Moreno, 2005).

Diversos estudos utilizando famílias de indivíduos afetados por FL/P, ou

indivíduos não relacionados afetados por FL/P (casos e controles) seguiram e

sugeriram diversos genes e loci como possíveis candidatos a FL/P isolada em

diferentes populações (Dixon et al., 2011).

Os genes da via wingless-type MMTV integration site family (WNT)

foram associados à FL/P em humanos (Chiquet et al., 2008; Menezes et al.,

2010). Dentre estes, os genes WNT3 e WNT9B foram inicialmente escolhidos

baseado em estudos demonstrando a sua importância na formação do palato

de camundongos (Juriloff & Harris, 2006). Desde então, diversos estudos

demonstraram a associação de diferentes genes da via WNT com a FL/P em

diferentes populações (Chiquet et al., 2008; Menezes et al., 2010; Yao et al.,

2011; Mostowska et al., 2012). Os genes da via WNT são considerados

importantes coadjuvantes na etiologia da FL/P uma vez que estes genes

participam de uma complexa cascata de sinalização, que controla diversos

processos durante o desenvolvimento craniofacial (Chiquet et al., 2008;

Menezes et al., 2010).

Assim como os genes da via WNT, o gene PBX1 foi, inicialmente,

escolhido baseado em estudos com modelos animais, uma vez que

camundongos nulos para PBX1 e PBX3 simultaneamente, apresentavam FL/P

(Ferreti et al., 2011). Até o presente momento, não existem estudos

demonstrando associação destes genes em humanos.

O gene TP63 surgiu como candidato ao desenvolvimento de FL/P após

mutações neste gene terem sido identificadas como causadoras da síndrome

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EEC (ectrodactyly - ectodermal dysplasia and cleft lip/palate), caracterizada por

ectrodactilia, displasia ectodérmica e fenda palatina (Online Mendelian

Inheritance in Man, OMIM # 604292) (Ianakiev et al., 2000). Além disso,

estudos com modelos animais mostraram que este gene desempenha um

papel importante no desenvolvimento do palato (Yang et al., 1999; Thomason

et al., 2008). Outros dois estudos de Genome Wide Association Studies

(GWAS) sugeriram uma região no cromossomo 3q em que o TP63 está

localizado como candidata à etiologia da FL/P. O primeiro estudo foi realizado

com uma amostra de famílias chinesas e replicado em seis diferentes

populações (chinesa, filipina, colombiana, indiana, turca e norte americana), e o

cromossomo 3q (3q27-28) foi novamente citado como candidato de risco para

a ocorrência de FL/P (Marazita et al., 2002; Marazita et al., 2009).

O gene ARGHAP29 foi sido sugerido como possível candidato à FL/P

devido à sua importante função durante o desenvolvimento craniofacial (Leslie

et al., 2012). Diversas evidências biológicas (Kaartinen et al., 1995; Juriloff &

Harris, 2006; Moustakas & Heldin, 2008; Kardassis et al., 2009; Schlessinger et

al., 2009) sugerem que os genes envolvidos na via de sinalização do

ARGHAP29 e suas variações podem estar implicados nas anomalias de

desenvolvimento craniofaciais.

A identificação de genes candidatos ao desenvolvimento da FL/P em

uma determinada população proporcionará um melhor entendimento sobre esta

anomalia e apontará novas direções quanto a possíveis métodos de prevenção

e tratamento futuros. Além da tentativa de detectar novos genes/loci

potencialmente envolvidos na etiologia da FL/P, a replicação de estudos

anteriores é uma prática comum na genética humana, para verificar se as

associações sugeridas se repetem em outras populações. Dessa forma, o

presente estudo teve como objetivo verificar a existência da associação entre

polimorfismos nos genes ARGHAP29, PBX1, TP63, WNT3 e WNT9B, em

famílias de indivíduos com FL/P de uma população brasileira. Até a presente

data, não existem relatos de estudos de associação entre os genes

ARGHAP29, PBX1 e FL/P na população brasileira, conferindo ineditismo ao

presente estudo. .

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2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1. PRIMÓRDIOS DO DESENVOLVIMENTO CRANIOFACIAL

O desenvolvimento normal da face humana compreende uma cascata

de eventos complexos e rigidamente controlados durante o desenvolvimento

embrionário, regulados através de genes cujos fatores de transcrição podem

ser traduzidos em proteínas estruturais, regulatórias ou enzimáticas (Kirschner

& LaRossa, 2000).

Na quarta semana de vida embrionária, as estruturas ectodérmicas que

contribuem para a formação craniofacial participam da formação da face,

cavidades nasais e oral (Kirschner & LaRossa, 2000). As células originárias da

crista neural cranial migram sob a forma de células mesenquimais para os

processos embrionários craniofaciais durante o fechamento do tubo neural. Os

segmentos da crista neural, por sua vez, migram para os arcos branquiais em

desenvolvimento para se tornarem precursores de cartilagem, osso, músculo e

tecido conjuntivo do complexo craniofacial (Sender et al., 2003; Jiang et al.,

2006).

O espessamento do ectoderma de superfície em ambos os lados da

proeminência frontal, é a primeira indicação da cavidade nasal, que são

chamadas de placas nasais (Burston & Orth, 1959). Estas placas começam a

invaginar-se por dois métodos: o crescimento anterior dos processos nasais e

pela sua migração resultando nas fossas nasais. Uma fina membrana oronasal

localiza-se entre as fossas e a cavidade oral. Esta membrana se rompe e forma

as coanas primitivas. A diferenciação, crescimento, e eventual fusão destas

proeminências darão origem à região nasal (Sender et al., 2003; Jiang et al.,

2006). No final do segundo mês, a maxila se desenvolve enquanto uma

divisória entre o nariz primitivo e a cavidade oral começa a se formar (Figura 1).

A porção anterior do palato é derivada da área da maxila formada pelos

processos nasais mediais (segmento intermaxilar) que e é chamado palato

21

primário. O desenvolvimento dos outros dois terços posteriores do palato

(palato secundário) inicia-se com a formação de duas projeções verticais na

cavidade oral de ambos os lados da língua, que são provenientes do

crescimento medial dos processos maxilares. Durante a sétima semana, as

paredes palatinas elevam-se e assumem uma orientação horizontal, que irá

posteriormente fundir-se (Arosarena, 2007). O septo nasal cresce inferiormente

e une-se com as duas paredes palatinas para formar duas cavidades distintas:

a cavidade oral e as coanas definitivas (Yoon et al., 2000). O desenvolvimento

do palato se completa em torno da décima segunda semana de gestação e

resulta na formação do palato duro, palato mole e a úvula.

A palatogênese exige remodelação da matriz extracelular e fusão

subsequente das paredes palatinas (Figura 2). Em condições fisiológicas

normais, a remodelação é um processo estritamente controlado e necessário

para o desenvolvimento embrionário (Woessner, 1994). Vários fatores de

crescimento, fatores de transcrição, receptores, sinais de polarização,

peptídeos vasoativos, proteínas de adesão celular, componentes da matriz

extracelular e metaloproteinases estão envolvidas no desenvolvimento das

paredes palatais (Arosarena, 2007).

22

Figura 1: Diagramas representando a origem embrionária das estruturas faciais. O terço médio da face é caracterizado pela fusão do processo frontonasal na parte superior (amarelo) e os processos maxilares (PMX) bilateralmente na porção mediana da face em desenvolvimento (verde). A mandíbula é criada pela fusão dos processos maxilares (azul) em torno de 3,5 semanas de gestação. segmento intermaxilar (ISIM); proeminência nasal lateral (LNP); proeminência nasal medial (MNP); fossa nasal (NP). Fonte: Jugessur et al. (2009).

PMX

PNM

PNL SIM

Olho

Fossa nasal

4.5 Semanas 14 Semanas

23

Figura 2: Diagrama das etapas da fusão em um par de proeminências faciais onde “A” representa a camada epitelial. As proeminências faciais são ocupadas por células mesenquimais (B) e o crescimento é impulsionado por sua proliferação (C). O contato inicial ocorre com a aproximação dos dois epitélios adjacentes (D) e esta adesão é consolidada através da intercalação de células epiteliais (E). O epitélio medial é então removido através de uma combinação de apoptose, migração, e/ou transformação epitélio-mesenquimal (F) resultando na fusão completa das proeminências da face (G). Fonte: adaptado de Jugessur et al. (2009).

2.2. REGULAÇÃO MOLECULAR DO DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO

O desenvolvimento craniofacial é considerado um evento complexo

composto por diversos de tecidos de diferentes origens, os quais têm que se

comunicar entre si para que possam se desenvolver corretamente. Os eventos

mais críticos durante a formação do nariz, lábios e palato apresentam períodos

de desenvolvimento que ocorrem de forma ordenada. Durante este processo,

determinadas alterações celulares, tanto físicas quanto biomecânicas, devem

ocorrer com objetivo de fornecer um correto desenvolvimento desta região.

A sinalização celular faz parte de um complexo sistema de comunicação

que governa e coordena as atividades e funções celulares. Este processo

envolve uma série de eventos celulares e moleculares rigidamente controlados.

Tais processos envolvem, por exemplo: reparação tecidual, moléculas de

adesão celular (caderina-e) e da matriz extracelular (Tudela et al., 2002). Erros

A B C D E F G

24

existentes no processamento de informação celular são responsáveis por

doenças e anomalias de desenvolvimento. A partir do melhor entendimento

sobre os processos de sinalização celular, muitas doenças poderão ser

tratadas de maneira mais eficaz e anomalias de desenvolvimento melhor

entendidas (Figura 3). Estas interações celulares ocorrem devido a sinalização

de alguns genes que agrupam-se em quatro famílias (Wolpert et al. 2002).:

• Fibroblast Growth Factor (FGF): estão associados à angiogênese,

desenvolvimento da mesoderme e condução axonal, entre outros;

• Hedgehog Family: aponta-se como o mais conhecido desta família o

Sonic Hedgehog, que é o responsável pela modelação do tubo

neural em vertebrados e indução da formação de diversos tipos de

neurónios;

• WNT Family: são importantes no estabelecimento da polaridade nos

membros dos vertebrados;

• TGF-B super Family: englobam as famílias TGFB, ativina, BMP e

VG1, entre outras proteínas. As proteínas BMP são capazes de

controlar o ciclo celular de outras células, bem como a sua migração

e diferenciação (Wolpert et al. 2002).

25

0000 Figura 3: Diagrama mostrando vias de sinalização molecular durante o desenvolvimento do palate em camundongos. (A) Seção transversal do palato embrionário. (B) Seções da parede palatina normal (cinza): as paredes palatinas emanam das proeminências maxilares (E11.5), crescem e estendem verticalmente (E12,5); a língua (T; rosa) desce, permitindo que as paredes palatinas se elevem (E13.5), se encontrem (E14.5), fusionando-se na linha media (E15.5). (C) Expressão celular específica de moléculas de sinalização durante o crescimento e (D) fusão do palate: moléculas expressas no epitélio (amarelo) ou mesênquima (cinza). As moléculas que mostraram ser essenciais para o desenvolvimento do palato em camundongos estão circuladas, sublinhadas quando essenciais em humanos, e em retângulos quando essenciais para ambos. As setas que indicam interações gene-gene (reto) ou ambiente-gene (onduladas) são estabelecidas (preto) ou hipotéticas (cinza). Ahr, receptor de hidrocarboneto aromático; Alk5, receptor de ativina como quinase 5; Bmp4, proteína óssea morfogenéticas 4; BZD's, as benzodiazepinas; Msx1, msh como 1 homeo-box, PTC, patched homólogo 1, Pvrl1 (receptor relacionados poliovírus 1); SATB2, SATB membro da família 2; TBX22, T-box 22; TgfB3, fator transformador de crescimento B3 (Murray e Schutte, 2004).

26

2.3. FISSURA LABIAL COM OU SEM FISSURA PALATINA

As fissuras labiopalatinas podem acometer somente o lábio, sendo

chamadas fissuras labiais (FL), podendo ou não envolver o alvéolo dentário ou

ocorrendo somente no palato sendo chamadas fissuras palatinas (FP). Mas na

maioria dos casos as fissuras acometem ambas as estruturas labial e palatina

concomitantemente e são chamadas de fissuras labiopalatinas. Quando estas

estão restritas somente ao palato mole, são caracterizadas como fissuras

incompletas. Além disso, as FL/P podem ser classificadas como unilaterais ou

bilaterais (Murray, 2002).

As FL/P possuem diferentes origens embriológicas, onde se destacam

(Moore, 2005):

1) Fissuras de Lábio Isolado (FL): As fissuras do lábio resultam de um

desenvolvimento imperfeito do palato embrionário primário. A Figura 4 ilustra as apresentações clínicas dos tipos de FL;

Figura 4: Apresentação clínica das Fissuras Labiais. (A) fissura labial unilateral sem acometimento do alvéolo dentário. (B) fissura labial bilateral sem comprometimento do alvéolo dentário (Dixon et al., 2011).

2) Fissuras de Lábio e Palato (FL/P) - Quando as fissuras labiais se

estabelecem, frequentemente, a deformação do desenvolvimento facial

impede o contato das cristas palatinas, quando elas giram para a

posição horizontal, de tal forma que as fissuras do palato primário são

B A

27

frequentemente acompanhadas pelas fissuras do palato secundário

(duro e mole). A Figura 5 ilustra as apresentações clínicas das FL/P;

Figura 5: Apresentações clínicas das FL/P. (A) fissura labiopalatina unilateral incompleta; (B) fissura labiopalatina unilateral complete; (C) fissura labiopalatina bilateral incompleta; (D) fissura labiopalatina bilateral completa (Dixon et al., 2011).

3) Fissuras de Palato Isolado (FP): Resultam do distúrbio de qualquer

um dos estágios da palatogênese: crescimento inadequado dos

processos palatinos, elevação atrasada ou falha na elevação dos

processos palatinos, falhas durante a fusão ou ruptura pós-fusão. A

Figura 6 ilustra a apresentação clínica da FP.

A B

C D

28

Figura 6: Apresentação clínica da FP. Fissura palatina completa com comprometimento dos palatos duro e mole (Dixon et al., 2011). 2.4. GENES CANDIDATOS E POLIMORFISMOS GENÉTICOS

Genes que potencialmente representam um papel na etiologia de uma

alteração em particular são denominados candidatos àquela alteração. A

maioria dos genes candidatos à FL/P foram, originalmente, sugeridos através

de observações durante o processo de embriogênese em modelos animais

(Young et al., 2000). Outras indicações também surgiram de estudos com

aberrações cromossômicas e estudos de ligação com famílias de indivíduos

afetados, apontando determinadas regiões cromossômicas como contendo

possíveis genes candidatos (Murray, 2002).

Polimorfismos de um único nucleotídeo, também conhecidos como

SNPs (single nucleotide polymorphisms), são formas variantes da sequência de

DNA que podem estar presentes nos indivíduos de uma população dentro de

um espectro considerado biologicamente normal (Kornman et al., 1997). A

hipótese de que a forma variante possa estar associada à função alterada de

um gene em particular e consequentemente possa exercer algum papel na

etiologia da FL/P pode ser analisada através da análise das frequências desses

polimorfismos em indivíduos afetados (Prescott et al., 2000).

A

29

2.5. ESTUDOS GENÉTICOS DAS FISSURAS LABIOPALATINAS

Estudos de genes candidatos têm sido o foco das pesquisas de FL/P

desde que Ardinger e colaboradores (Ardinger et al., 1989) sugeriram o papel

para o gene TGFA (fator de crescimento de transformação alfa) e variantes no

risco de FL/P não-sindrômica. A identificação de genes candidatos em

humanos tem utilizado dados de expressão genica e estudos durante o

desenvolvimento craniofacial em animais, principalmente camundongos (Jiang

et al., 2006). Outros genes candidatos também surgiram a partir de estudos

com aberrações cromossômicas e estudos de ligação com famílias de

indivíduos afetados, apontando determinadas regiões cromossômicas como

susceptíveis a conter possíveis genes candidatos (Murray, 2002).

O uso de genes candidatos sugeridos a partir de estudos de FL/P

sindrômica tem se mostrado uma ferramenta auxiliar também para estudos de

FL/P não sindrômica. Por exemplo, o gene IRF6, sugerido como candidato a

FL/P não sindrômica após a sua identificação como fator causal a síndromes

de Van der Woude (VWS; OMIM 119300; Kondo et al., 2002) e da síndrome

pterígio poplíteo (SPP) (OMIM 119500; Kondo et al., 2002), foi primeiramente

associado a FL/P não sindrômica em Zucchero et al. (2004). As associações

com IRF6 foram posteriormente replicadas em diversas populações (Blanton et

al., 2005; Ghassibe et al., 2005; Scapoli et al., 2005; Vieira et al., 2007; Letra et

al., 2012).

2.5.1. Estudos de associação

Nos estudos de associação são comparadas as frequências alélicas de

polimorfismos de um único nucleotídeo, ou SNPs, entre indivíduos afetados e

não afetados, desde que sejam não relacionados. O polimorfismo em estudo

pode ter ação biológica direta no fenótipo da doença, ou o SNP pode estar em

desequilíbrio de ligação com os genes candidatos que determinam

susceptibilidade a essa doença (Aschard et al., 2007).

30

O termo “associação” descreve a coocorrência entre alelos e fenótipos.

Em contraste aos estudos de ligação, que são apropriados para detectar

grandes efeitos de variantes raras, os estudos de associação são adequados

para detectarem efeitos genéticos pequenos ou moderados ligados às

variantes comuns no genoma (Letra et al., 2010).

Os avanços tecnológicos na área da genética e da genômica permitiram

análises simultâneas de centenas de milhares de marcadores por um custo

razoavelmente baixo, promovendo a expansão dos estudos de associação

genômica em larga escala (Genome Wide Associations Studies - GWAS).

Nesse tipo de estudo, buscam-se novos loci contendo genes de

susceptibilidade a diversas doenças complexas, por meio de varreduras do

genoma, utilizando-se plataformas que analisam milhares de SNPs

simultaneamente (Johnson & O’Donnell, 2009).

Como já é evidente para muitas doenças complexas, os estudos de

GWAS recentes têm proporcionado grandes avanços para o melhor

entendimento dos genes e vias de sinalização que desempenham papel

importante na etiologia da FL/P. O primeiro GWAS para FL/P utilizou uma

população de origem caucasiana, confirmando a associação do gene IRF6

(1q32.3-q41), e revelou uma nova região candidata à etiologia da FL/P,

localizada do cromossomo 8q24 (Birnbaum et al., 2009). Mangold et al. (2010)

replicaram esses resultados em seu GWAS em uma população européia,

identificando ainda loci adicionais nos cromossomos 10q25 (VAX1) e 17q22

(NOG). A região 8q24 foi confirmada por um terceiro GWAS em caucasianos

nos EUA (Grant et al., 2009), e em um estudo com trios de famílias nucleares

(pai, mãe e indivíduos afetado) em uma população composta por caucasianos

e asiáticos (Beaty et al., 2010). Curiosamente, o nível de evidência estatística

de marcadores dentro do cromossomo 8q24 era mais significativo entre os trios

de ascendência europeia, enquanto que a evidência de ligação e associação

para marcadores em IRF6 era mais significativa em trios de ascendência

asiática. Além disso, dois novos loci candidatos, contendo os genes MAFB e

ABCA4 foram identificados, mostrando associações significativas nos

indivíduos asiáticos em comparação com europeus (Beaty et al., 2010). A

31

associação de FL/P com o gene ABCA4 (Fontoura et al., 2012) e com a

região 8q24 (Bagordakis et al., 2013) foi posteriormente confirmada em

populações brasileiras enfatizando o possível papel destes genes na etiologia

da FL/P.

Estas observações enfatizam a natureza multifatorial da FL/P e

encorajam a realização de estudos genéticos em diversas populações para

determinar o papel de cada gene candidato em cada população. Abaixo segue

um breve resumo de cada gene candidato proposto neste estudo.

2.5.2. TP63 O gene TP63 está localizado na região cromossômica 3q27, contém 15

éxons e exerce um papel no desenvolvimento epidérmico, sendo detectado em

vários tecidos humanos incluindo a região craniofacial (Van Bokhoven &

Brunner, 2002). Alguns estudos realizados em animais relacionaram a

expressão da proteína p63 com o desenvolvimento de FL/P (Thomason et al.,

2008). Uma pesquisa recente em camundongos demonstrou que IRF6 é um

alvo direto de TP63, que por sua vez está associado com várias síndromes de

malformações que incluem FL/P. Uma das hipóteses é que TP63 está

relacionado com a transcrição do IRF6 e uma mutação neste gene poderia

aumentar a susceptibilidade às fissuras (Ferreti et al., 2011).

Em outro estudo, camundongos com mutação no gene IRF6 exibiram

uma epiderme hiper-proliferativa sem diferenciação terminal levando a

múltiplas aderências epiteliais e resultando em FL/P. Esses resultados

demonstraram que IRF6 tem um papel determinante na proliferação e na

diferenciação de queratinócitos (Ingraham et al., 2006).

Diversos genes têm sido considerados candidatos na etiologia da FL/P

devido à sua possível interação com genes considerados chave na formação

craniofacial. Assim como o IRF6, o BMP4 tem um papel chave na formação do

palato (Zhang et al., 2002). Por este motivo, várias outras alternativas têm sido

descritas nas vias que regulam BMP4 nos últimos anos incluindo o papel do

32

TP63 na formação do palato. Segundo Thomason et al. (2008), no início do

desenvolvimento do palato, o fator de transcrição TP63 regula a expressão de

BMP4 no palato anterior. A perda do gene TP63 pode levar à alteração da

expressão de uma variedade de genes (incluindo BMP4) nos processos

maxilares a partir do momento em que as conchas palatais são formadas. Isto

resulta na expressão alterada dos genes, consequente em defeitos na

formação do longo eixo das conchas palatinas e no desenvolvimento de fenda

palatina (Thomason et al., 2008).

As principais síndromes humanas envolvendo a desregulação na

expressão da proteína p63 incluem EEC, ectrodactilia e Hay-Wells (Rinne et

al., 2007). Celli et al. (1999) realizaram um estudo que mapeou SNPs no gene

TP63 em várias famílias com a síndrome EEC (ectrodactyly, ectodermal

dysplasia and cleft lip/palate, OMIM 604292). A síndrome EEC é caracterizada

por ectrodactilia, displasia ectodérmica e FL/P. De fato, este gene foi

previamente implicado na síndrome dos membros-glândulas mamárias (LMS,

OMIM 603543), caracterizada por diversas anomalias incluindo fissura palatina

e úvula bífida. Ianakiev et al. (2000) evidenciaram mutações no gene TP63 em

famílias com os fenótipos de ectrodactilia e da síndrome EEC. Wessagowit et

a. (2000) relataram sobre os aspectos clínicos e moleculares de uma paciente

com a síndrome EEC. O estudo concluiu que a desordem era consequente de

uma mutação do gene TP63. Por sua vez, a síndrome Hay-Wells é

caracterizada por diversas anomalias incluindo fenda labial e/ou palatal,

displasia ectodérmica congênita. Acredita-se que esta é causada por mutações

missense do gene TP63 e que a sobreposição dos fenótipos, nesta e nas

síndromes supracitadas, ocorrem devido a interações entre os genes na via de

sinalização do TP63 e as proteínas que interagem com o domínio SAM deste

gene (Mcgrath, 2001).

33

2.5.3. Via de sinalização WNT As proteínas Wnt formam uma família de moléculas de sinalização

altamente conservadas que regulam a interação célula-célula durante a

embriogênese. As descobertas sobre os mecanismos de ação dos genes da

família Wnt surgiram a partir de estudos de vários sistemas incluindo estudos

genéticos em Drosophila e Caenorhabditis elegans, estudos bioquímicos em

cultura de células e expressão de genes em embriões de Xenopus. Mutações

nos genes na família Wnt ou nos genes envolvidos nesta via de sinalização

parecem levar a defeitos específicos de desenvolvimento; além disso, várias

doenças humanas, incluindo o câncer, parecem estar relacionadas com uma

sinalização anormal destes genes. Acredita-se que as proteínas expressadas

pelos genes da família Wnt ligam-se a receptores da família frizzled e LRP na

superfície da célula. Através de vários componentes citoplasmáticos o sinal é

traduzido à beta-catenina, esta, então, entra no núcleo para formar um

complexo com TCF e assim ativar a transcrição dos genes alvo de Wnt. A sinalização desta via pode ter pelo menos três alternativas distintas.

Duas alternativas de sinalização são a da polaridade planar da célula e a outra

dependente de cálcio. Uma terceira via, chamada canônica, sinaliza através da

β-catenina. A ativação do receptor Frizzled pela sinalização Wnt tem como

efeito a instabilidade de um complexo proteico (Gskβ), cuja atividade, quando

estável, reduz a quantidade de β-catenina no citoplasma (Kikuchi, 2000). Deste

modo, em células onde a via Wnt está ativa, há acumulação citoplasmática de

β-catenina, pela instabilidade do Gskβ, possibilitando que esta seja translocada

para o núcleo. Uma vez no núcleo, fatores de transcrição são ativados

promovendo a expressão de genes efetores (Kikuchi, 2000).

Dezenove genes da família WNT foram identificados até o presente

momento. Juriloff & Harris (2006) observaram a presença de mutações no gene

WNT9B em uma linhagem de camundongos A/WySn, característica pela

presença de FL/P, e sugeriram que o gene homólogo em humanos (WNT9B)

poderia ser um gene candidato a FL/P isolada. De fato, variações em genes da

família WNT incluindo WNT3, WNT3B, WNT8, WNT9B, e WNT11 foram

34

associadas à FL/P isolada (Chiquet et al., 2008; Menezes et al., 2010). Yao et

al. (2011) relataram a associação de duas SNPs (rs752107 e rs3121310),

localizados no gene WNT3, e FL/P em um estudo caso controle realizado com

população chinesa. Chiquet et al. (2008) observaram a associação de WNT9B

com FL/P em uma amostra constituída por americanos com descendência

europeia e hispânicos, sendo a associação mais significativa observada nas

famílias com descendência europeia. Menezes et al. (2010) observaram

associação significativa entre WNT3 (rs142167) e FL/P em seu estudo caso-

controle em uma população brasileira. Estes achados sugerem que os genes

da família WNT desempenham um papel chave no desenvolvimento do lábio e

palato (Juriloff & Harris, 2006; Chiquet et al., 2008; Menezes et al., 2010; Yao

et al., 2011).

2.5.4. PBX1 O gene PBX1 está localizado na região 1q23 e é constituído por 338 ou

439 aminoácidos associado às proteínas HOX, cuja função é ligar-se às

sequências específicas do DNA (5’ATCAATCAA3’) para regulação do processo

de transcrição. Por muitos anos os genes da família PBX tem demonstrado seu

envolvimento no desenvolvimento de órgãos e do esqueleto. Uma dentre

muitas das suas funções, os genes da família PBX regulam uma cadeia de

moléculas de sinalização no desenvolvimento craniofacial, incluindo WNT,

fatores de crescimento de fibroblastos (FGF), proteína p63 e do fator regulador

de interferon 6 (IRF6). Porém, apenas recentemente, mutações nos genes da

família PBX foram sugeridas como fatores de risco ao desenvolvimento das

FL/P. Ferretti et al. (2011) analisaram o papel dos genes PBX1, PBX2, e PBX3

no desenvolvimento facial e demonstraram que as mutações que afetam os

genes PBX1 e PBX3 concomitantemente resultaram no desenvolvimento de

FL/P em todos os embriões de rato com essas mutações. Além disso, os

embriões de camundongos com mutações nos genes PBX também tinham

reduzido ou anulado a atividade do WNT, que desempenha um papel de

35

destaque no desenvolvimento do ectoderma em embriões. Os autores

concluíram que distúrbios nesta rede podem levar a uma diminuição da morte

celular programada, interferindo assim, com a fusão apropriada de tecidos

faciais e resultando no desenvolvimento de FL/P (Ferreti et al., 2011). Apesar

de todas as evidências, até a presente data não existem relatos de estudos em

humanos associando genes da família PBX e a ocorrência de FL/P.

2.5.5. ARHGAP29 ARHGAP29 está localizado no cromossomo 1p22, um locus que foi

identificado por GWAS de FL/P a 47 kb de ABCA4. Este gene codifica Rho,

uma proteína de ativação de GTPase (GAP) 29 que modula a regulação cíclica

de pequenas proteínas de ligação de GTP tais como RhoA (Saras et al., 1997).

Acredita-se, ainda, que proteína RhoA está envolvida em várias funções

celulares relacionadas com a forma, movimento, interações célula-célula, e

proliferação; todos esses pontos são críticos para o desenvolvimento

craniofacial (Mossey et al., 2009). De fato, Rho é um fator envolvido em ambas

as vias de sinalização TGFB (Kardassis et al., 2009) e WNT (Schlessinger et

al., 2009) as quais têm sido implicadas no desenvolvimento craniofacial

(Kaartinen et al., 1995; Juriloff & Harris, 2006; Moustakas & Heldin, 2008), uma

vez que camundongos knockout para estes genes desenvolveram defeitos

craniofaciais incluindo fendas do lábio, palato ou ambos. Nesta hipótese,

acredita-se que ARHGAP29 poderia ser um mediador da sinalização Rho

implicado no desenvolvimento craniofacial. Em um estudo mais recente foi

demonstrado que a expressão reduzida do gene IRF6 também acarretava na

diminuição da expressão do ARHGAP29 na região craniofacial,

especificamente no epitélio da região palatina. Ainda, a análise por

sequenciamento direto do gene ARHGAP29 revelou oito mutações como

potenciais candidatas na etiologia das FL/P. Este trabalho sugeriu também Rho

como um fator envolvido na via de sinalização entre o gene ARHGAP29 e os

genes da via de sinalização IRF6 (Leslie et al., 2012).

36

3. HIPÓTESE

Polimorfismos nos genes ARGHAP29, PBX1, TP63, WNT3 e WNT9B

estão associados à FL/P em uma população brasileira.

37

4. OBJETIVOS

4.1. OBJETIVO GERAL

Analisar a associação entre variações genéticas (polimorfismos) em

genes expressos no desenvolvimento craniofacial e FL/P.

4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Verificar a existência de associação entre polimorfismos nos genes

ARGHAP29, PBX1, TP63, WNT3 e WNT9B com a FL/P em uma população

brasileira.

38

5. MATERIAL E MÉTODOS

5.1. POPULAÇÃO ESTUDADA

O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da

Secretaria Municipal de Saúde e Defesa Civil, Rio de Janeiro, RJ (Anexo 1).

A amostra foi constituída de 70 famílias, cada uma incluindo um

indivíduo afetado e seus pais não afetados, totalizando 210 indivíduos que se

encontravam em tratamento no setor de cirurgia plástica do Hospital Nossa

Senhora do Loreto, Rio de Janeiro, RJ. Pacientes diagnosticados previamente

como portadores de alguma síndrome não foram incluídos no estudo. Todos os

pacientes e seus responsáveis foram informados sobre os termos do projeto de

pesquisa e foram incluídos neste estudo após aquiescência e assinatura do

Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) (Apêndice 1).

5.2. EXAME CLÍNICO E ANAMNESE

Todos os indivíduos foram analisados clinicamente e através de fichas

clínicas e/ou exames radiográficos para observação dos seguintes parâmetros:

presença de fissura (FL, FL/P ou FP) e lado da fissura (direito, esquerdo,

bilateral, e central). Indivíduos cujo tipo e/ou lado da fissura não puderam ser

determinados através de exame clínico ou através das fichas clínicas foram

considerados como apresentando “tipo/lado de fissura desconhecido”

(Apêndice 2).

Adicionalmente, para cada indivíduo, as seguintes informações

demográficas foram registradas: história positiva de FL/P na família; idade do

paciente; história positiva de diagnóstico de câncer no paciente ou em algum

familiar de primeiro ou segundo grau de parentesco; história de tabagismo e/ou

uso de substâncias alcoólicas (materna) durante a gestação e uso de

39

medicamentos e/ou substâncias teratogênicas durante a gestação (Apêndice

2). Todos os dados foram registrados em uma ficha individual para cada

paciente e então transferidos para uma base de dados.

5.3. COLETA DE MATERIAL BIOLÓGICO

Amostras de saliva foram coletadas de todos os indivíduos como fonte

de DNA genômico utilizando-se os recipientes de coleta Oragene® DNA (DNA

Genotek, Ontario, CA). Após a coleta, as amostras foram mantidas à

temperatura ambiente até o momento de seu processamento.

5.4. EXTRAÇÃO DO DNA

As amostras foram incubadas a 50° C durante 2h antes da extração do

DNA. O DNA foi extraído utilizando-se o tampão de extração prepIt (DNA

Genotek, Ontario, CA) seguindo as instruções do fabricante (Anexo 2).

5.5. QUANTIFICAÇÃO DO DNA

A concentração e a pureza do DNA foram determinadas através da

leitura de densidade óptica em um espectrofotômetro NanoDrop® 8000

(ThermoScientific, Wilmington, DE) através de medições de comprimento de

onda de 260nm. A razão entre os valores obtidos nos comprimentos de onda

260nm e 280nm foi usada para estimar a pureza do DNA genômico. Somente

as amostras de DNA com razão 260/280 acima de 1,7 foram incluídas neste

estudo.

40

5.6. SELEÇÃO DE GENES CANDIDATOS E POLIMORFISMOS DE UM

ÚNICO NUCLEOTÍDEO (SNPs - single nucleotide polimorphisms)

A seleção dos genes candidatos deste estudo (PBX1, ARHGAP29,

TP63, WNT3 e WNT9B) foi previamente descrita na Revisão de Literatura.

Neste estudo foram selecionados os SNPs que se classificassem, de

preferência, como: 1) potencialmente funcionais por alterarem a sequência de

aminoácidos da proteína final, por ocorrerem próximo à região promotora do

gene e potencialmente influenciarem a expressão gênica, ou, ainda, àqueles

que demonstraram alterar a função ou expressão do gene; 2) SNPs em

desequilíbrio de ligação com outros SNPs em regiões de um gene candidato.

Carlson et al. (2004) descreveram uma abordagem para seleção do mínimo de

SNPs representando ao máximo a estrutura de desequilíbrio de ligação de

determinada região.

Vinte SNPs foram selecionados para serem investigados quanto a

associação com FL/P. Detalhes sobre a localização e função dos SNPs

selecionados em cada gene candidato constam nas tabelas e figuras a seguir.

5.7. PBX1

Tabela 1: Polimorfismos estudados no gene PBX1

Cromossomo SNP Posição Alelos Função 1 rs6426870 162790577 CT upstream 1 rs10442643 162830010 AG intron 1 rs1618566 162873970 AG intron 1 rs10800043 162924681 CT intron 1 rs7543038 162990459 GT intron

41

Figura 7: Esquema da estrutura do gene PBX1. Caixas verdes representam regiões codificadoras, barras verdes representam íntrons. As setas coloridas indicam a localização dos polimorfismos estudados (da esquerda para a direita): rs6426870, rs10442643, rs1618566, rs10800043, rs7543038.

5.8. ARHGAP29

Tabela 2: Polimorfismos estudados no gene ARHGAP29 Cromossomo SNP Posição Alelos Função

1 rs1576593 94404339 CT Near-3’ UTR 1 rs1048854 94416119 AG Sinônimo 1 rs1541098 94440558 CT Intron 1 rs3789688 94463828 CT Intron 1 rs3814019 94476984 AG Near-5’UTR

Figura 8: Esquema da estrutura do gene ARHGAP29. Caixas verdes representam regiões codificadoras, barras verdes representam íntrons. As setas coloridas indicam a localização dos polimorfismos estudados (da esquerda para a direita): rs1576593, rs1048854, rs1541098, rs3789688, rs3814019.

42

5.9. TP63

Tabela 3: Polimorfismos estudados no gene TP63 Cromossomo SNP Posição Alelos Função

3 rs9332461 190824484 AG upstream 3 rs4575879 190904013 AG intron 3 rs4607088 190933984 CT intron 3 rs4686529 190980310 AG intron 3 rs1515490 191079549 CT intron

Figura 9: Esquema da estrutura do gene TP63. Caixas verdes representam regiões codificadoras, barras verdes representam íntrons. As setas coloridas indicam a localização dos polimorfismos estudados (da esquerda para a direita): rs9332461, rs4575879, rs4607088, rs4686529, rs1515490. 5.10. WNT9B

Tabela 4: Polimorfismos estudados no gene WNT9B Cromossomo SNP Posição Alelos Função

17 rs12602434 42283052 CG Near-5’UTR 17 rs1530364 42306776 AG intron

Figura 10: Esquema da estrutura do gene WNT9B. Caixas verdes representam regiões codificadoras, barras verdes representam íntrons. As setas coloridas indicam a localização dos polimorfismos estudados (da esquerda para a

43

direita): rs12602434, rs1530364.

5.11. WNT3

Tabela 5: Polimorfismos estudados no gene WNT3 Cromossomo SNP Posição Alelos Função

17 rs199525 42203002 GT intron 17 rs111769 42227151 CT intron 17 rs385178

1 42246300 CT intron

Figura 11: Esquema da estrutura do gene WNT3. Caixas verdes representam regiões codificadoras, barras verdes representam íntrons. As setas coloridas indicam a localização dos polimorfismos estudados (da esquerda para a direita): rs199525, rs111769, rs3851781.

5.12. GENOTIPAGEM

Para genotipagem, as amostras de DNA foram diluídas em agua

deionizada estéril em uma concentração de 2ng/µL e armazenadas a -20o C

para serem utilizadas ao longo do estudo.

As amostras de DNA foram genotipadas utilizando-se o método Taqman

(Ranade et al., 2001). Para cada polimorfismo estudado, as reações foram

realizadas em placas de 384 poços, em um volume total de 3 µL/reação,

contendo 1 µL de DNA, 1,5 µL de Taqman PCR MasterMix (Applied

Biosystems, Foster City, CA, EUA), 0,0375 µL de cada SNP (Applied

Biosystems, Foster City, CA) e 0,425 µL de água deionizada estéril. As reações

foram realizadas em um sequenciador automático ViiA7TM (Applied Biosystems,

Foster City, CA, EUA) utilizando-se as condições de reação estandardizadas

para a técnica de Taqman (95 o C por 10 minutos, 40 ciclos à 95 o C por 15

44

segundos, e 60 o C por 1 minuto).

5.13. ANÁLISE ESTATÍSTICA

Poder do estudo:

O teste proposto por Purcell et al. (2003) foi utilizado para calcular o

poder estatístico do estudo. Os cálculos indicaram que o tamanho da amostra

coletada neste estudo (70 trios totalizando 210 indivíduos) proporcionou um

poder estatístico de ~98% para detectar associação com um valor de P=0,05

uma vez que os marcadores selecionados estavam em desequilíbrio de ligação

com o fenótipo (D’=0,08) e a frequência dos marcadores foi estimada em

~20%.

Tabela 6: Resultados do cálculo de poder estatistico do tamanho da amostra

Alpha Poder Estatístico Número de casos para 80% de poder

0,1 0,9947 24,49 0,05 0,9876 31,09 0,01 0,9482 46,27 0,001 0,8194 67,64 0,05 0,9876 31,09

Análise de Associação:

O teste de desequilíbrio de transmissão (TDT) foi utilizado para verificar

a associação de alelos em cada marcador nos indivíduos com FL/P. Para isto

utilizamos o programa Family Based Association Tests (FBAT) - (Horvath et al.,

2001). O nível de significância foi estabelecido em P < 0,05.

45

6. RESULTADOS 6.1. CARATERIZAÇÃO DA AMOSTRA

Dos indivíduos portadores de FL/P, 43% eram do gênero feminino

enquanto 57% indivíduos eram do gênero masculino. A distribuição dos tipos

de FL/P na população estudada foi de 6% para as fissuras labiais, 20% de

fissuras palatinas, e 74% de fissuras labiopalatinas (Figura 12). Com relação à

distribuição étnica, 36% dos indivíduos afetados eram de descendência afro-

brasileira e os restantes 64% eram caucasianos (Figura 13). Nenhum

paciente/responsável relatou o uso ou exposição a alguma substância

potencialmente teratogênica como pesticidas e herbicidas.

Figura 12: Distribuição dos tipos de fissuras na população estudada

46

Figura 13: Distribuição étnica da população estudada

A idade média dos indivíduos portadores de FL/P foi de 3,1 ± 2,8 anos

(idade mínima dois meses; máxima 13 anos). A idade média materna foi de

23,4 ± 13,2 anos (idade mínima 13 anos; máxima 40 anos) e a idade média

paterna foi de 25 ±17 (idade mínima 18 anos; máxima 56 anos). Estes dados

estão resumidos na Tabela 7.

Tabela 7: Faixa etária da população estudada Indivíduos Idade média ±dade

média padrao Min/Max

Crianças com FL/P 3,1 ±.2,8 65 dias-13 anos Pais 25 ±17 18-56 anos Mães 23,4 ± 13,2 13-40 anos

47

6.2. ESTUDOS GENÉTICOS DE ASSOCIAÇÃO COM FL/P

6.2.1. PBX1 Os resultados para a análise de associação de SNPs no gene PBX1 e

FL/P estão representados na Tabela 8. Não foi detectada associação

significativa entre os SNPs estudados e FL/P (p>0,05).

Tabela 8: Frequência dos alelos encontrados para polimorfismos estudados no gene PBX1

SNP Alelo afreq Base P valor Referência * rs6426870 1 0,202 C 0,0705 C: 34,314% (1540 / 4488) rs6426870 2 0,798 T 0,0705 T: 65,686% (2948 / 4488) rs1044264 1 0,345 A 0,8907 A: 100,000% rs1044264 2 0,655 G 0,8907 C: 0,000% rs1080004 1 0,188 C 0,0863 C: 92,525% (2030 / 2194) rs1080004 2 0,812 T 0,0863 T: 7,475% (164 / 2194) rs7543038 1 0,512 G 0,8787 G: 52,434% (2273 / 4335) rs7543038 2 0,488 T 0,8787 T: 47,566% (2062 / 4335) rs1618566 1 0,301 A 0,8964 A: 24,983% (1115 / 4463) rs1618566 2 0,699 G 0,8964 G: 75,017% (3348 / 4463)

* Frequência dos alelos de referencia em diversas populações (http://genome.ucsc.edu/). 6.2.2. TP63 Os resultados para a análise de associação de SNPs no gene TP63 e

FL/P estão representados na Tabela 9. A análise de transmissão de alelos

entre os indivíduos afetados e os progenitores mostrou diferenças significativas

para as frequências de ambos os alelos no marcador rs4575879 (p=0,02). Não

foi detectada associação significativa entre os SNPs rs9332461, rs4607088,

rs4686529, rs1515490 e FL/P (p > 0,05) (Tabela 9).

48

Tabela 9: Frequência dos alelos encontrados para polimorfismos estudados no gene TP63

SNP Alelo afreq Base P valor Referência * rs9332461 1 0,277 A 0,6682 A: 30,382% (1352 / 4450) rs9332461 2 0,723 G 0,6682 G: 69,618% (3098 / 4450) rs4575879 1 0,559 A 0,0268 A: 52,605% (2080 / 3954) rs4575879 2 0,441 G 0,0268 G: 47,395% (1874 / 3954) rs4607088 1 0,617 C 0,3523 C: 55,063% (2507 / 4553) rs4607088 2 0,383 T 0,3523 T: 44,937% (2046 / 4553) rs4686529 1 0,468 A 0,0754 A: 56,771% (1811 / 3190) rs4686529 2 0,532 G 0,0754 G: 43,229% (1379 / 3190) rs1515490 1 0,312 C 0,6547 C: 25,8% (30,96/120) rs1515490 2 0,688 T 0,6547 C: 74,2% (89,04/120)

*Frequência dos alelos de referencia em diversas populações (http://genome.ucsc.edu/).

6.2.3. WNT3 Os resultados para a análise de associação de SNPs no gene WNT3 e

FL/P estão representados na Tabela 10. Não foi detectada associação

significativa entre os SNPs estudados e FL/P (p >0,05) (Tabela 10).

Tabela 10: Frequência dos alelos encontrados para polimorfismos estudados no gene WNT3

SNP Alelo afreq Base P valor Referência rs199525 1 0,199 G 0,1495 G: 10,994% (241 / 2192); rs199525 2 0,801 T 0,1495 T: 89,006% (1951 / 2192) rs111769 1 0,648 C 0,3096 C: 67,521% (1765 / 2614) rs111769 2 0,352 T 0,3096 T: 32,479% (849 / 2614)

rs3851781 1 0,574 C 0,5078 C: 50,662% (2181 / 4305) rs3851781 2 0,426 T 0,5078 T: 49,338% (2124 / 4305)


49

6.2.4. WNT9B Os resultados para a análise de associação de SNPs no gene WNT9B e

FL/P estão representados na Tabela 11. A análise de transmissão de alelos

entre os indivíduos afetados e os progenitores, mostrou diferenças

significativas para as frequências de ambos os alelos no marcador rs1530364

(p=0,001). Não foi detectada associação significativa entre o SNP rs12602434 e

FL/P (p>0,05) (Tabela 11).

Tabela 11: Frequência dos alelos encontrados para polimorfismos estudados no gene WNT9B

SNP Alelo afreq Base P valor Referência rs12602434 1 0,156 C 0,7236 C: 28,008% (1285 / 4588) rs12602434 2 0,844 G 0,7236 G: 71,992% (3303 / 4588) rs1530364 1 0,315 A 0,001 A: 29,359% (1411 / 4806) rs1530364 2 0,685 G 0,001 G: 70,641% (3395 / 4806)


6.2.5. ARHGAP 29 Os resultados para a análise de associação de SNPs no gene

ARHGAP29 e FL/P estão representados na Tabela 12. A análise de

transmissão de alelos entre os indivíduos afetados e os progenitores mostrou

diferenças significativas para as frequências de ambos os alelos no marcador

rs1048854 (p=0,03). Nenhuma associação foi detectada para os demais SNPs

testados (Tabela 11).

50

Tabela 12: Frequência dos alelos encontrados para polimorfismos estudados no gene ARHGAP29

SNP Alelo afreq Base P valor Referência rs1576593 1 0,387 C 0,3017 C: 49,982% (1406 / 2813)

rs1576593 2 0,613 T 0,3017 T: 49,982% (1406 / 2813)

rs1048854 1 0,185 A 0,0395 A: 82,575% (8651/10477) rs1048854 2 0,815 G 0,0395 G: 17,425% (1825/ 10477) rs1541098 1 0,133 C 0,8526 C: 19,034% (863 / 4534)

rs1541098 2 0,867 T 0,8526 T: 80,966% (3671 / 4534)

rs3789688 1 0,688 C 0,2733 A: 55,905% (2400 / 4293) rs3789688 2 0,312 T 0,2733 G: 44,095% (1893 / 4293) rs3814019 1 0,250 A 0,1657 A: 70,935% (2958 / 4170)

rs3814019 2 0,750 G 0,1657 G: 29,065% (1212 / 4170)

*Frequência de referência dos alelos em diversas populações (http://genome.ucsc.edu/).

51

7. DISCUSSÃO 7.1. DESENHO DO ESTUDO

Os estudos de associação são ferramentas para identificação de

variantes genéticas que predispõem às alterações de desenvolvimento

caracterizadas como complexas. O objetivo deste estudo foi verificar a provável

associação entre um determinado genótipo ou alelo de um gene candidato à

etiologia das FL/P permitindo, assim, a identificação de genes que podem estar

envolvidos com o fenótipo em questão (Letra et al., 2007). Dois tipos de

desenho de estudo são frequentemente utilizados nos estudos de associação e

são classificados como estudos caso-controle e núcleo familiar.

Pode-se definir os estudos caso-controle como uma forma de pesquisa

na qual são comparados dois grupos, onde o primeiro grupo de indivíduos

apresenta uma determinada condição (caso) e o segundo grupo não apresenta

tal condição (controle). Este tipo de estudo é muito utilizado por permitir um

recrutamento de um grande número de indivíduos afetados, sem a

necessidade de incluir seus familiares (Risch, 2000). Por outro lado, os estudos

caso-controle apresentam a desvantagem de se basearem na diferença entre a

frequência dos alelos entre os grupos, que pode ser influenciada pela

heterogeneidade populacional (Letra et al., 2007). De fato, a população

brasileira tem um histórico de grande miscigenação no qual certamente é uma

das preocupações para grupos de pesquisa nacionais que realizam estudos

genéticos. Esta miscigenação conta com aproximadamente 20 gerações de

casamentos entre três grupos ascendentes (nativos, negros e europeus)

tornando a população brasileira uma das mais heterogêneas do mundo (Pena

et al., 2011).

A forma de obtenção dos dados amostrais é uma outra preocupação

neste tipo de delineamento, pois dependendo desta, pode existir um efeito de

confundimento gerado pelo desbalanceamento na constituição genômica dos

indivíduos caso e controle, conduzindo a falsas conclusões resultantes de

52

testes de hipóteses de interesse. Existem na literatura várias propostas para

contornar este tipo de efeito. Batista et al. (2008) e Giolo et al. (2011)

comparam modelos logísticos com e sem covariáveis genéticas e concluíram

que para estudos caso-controle são necessários ajustes visando controlar o

efeito de estratificação populacional. Uma alternativa mais adequada consiste

no uso de delineamentos experimentais mais robustos, tais como a utilização

de amostras de trios.

O desenho deste estudo foi baseado no uso de famílias nucleares (pai,

mãe, e criança afetada) para a investigação de variações genéticas em cinco

genes candidatos associadas à FL/P. A ideia geral deste tipo de delineamento

é coletar uma amostra aleatória de indivíduos afetados juntamente com seus

pais (não afetados), ou seja; a base da análise e o estudo da segregação de

alelos nos trios, com o intuito de selecionar casos e controles de uma mesma

população genética (o núcleo familiar) e avaliar se o gene em estudo está

associado com a etiologia da doença em questão. Para este tipo de estudo de

associação de marcadores moleculares com uma determinada doença, o

genótipo do filho afetado é considerado como um ponto amostral do grupo

“caso” e os dois alelos (um materno e um paterno) que não foram transmitidos

para o filho afetado são considerados um ponto amostral do grupo “controle”.

Desta maneira, têm-se as amostras de casos e de controles de uma mesma

população genética (Purcell et al., 2005). A principal vantagem do estudo de

núcleos familiares é o controle de possíveis efeitos da estratificação

populacional.

No presente estudo foi utilizada uma amostra de conveniência. Este tipo

de amostragem não probabilística é destituído de qualquer rigor estatístico. O

pesquisador seleciona os elementos a que tem acesso, admitindo que estes

possam representar o universo amostral representativo da população em geral.

No entanto, a amostragem por conveniência é adequada e frequentemente

utilizada para geração de ideias em pesquisas exploratórias (Marotti, 2008), tal

qual a utilizada neste estudo, onde a amostra foi composta por 70 famílias/trios

incluindo indivíduos portadores de FL/P isolada, pai e mãe não afetados. Com

relação à distribuição étnica, 36% dos indivíduos afetados eram de

53

descendência afro-brasileira e os 64% restantes eram caucasianos. A

proporção observada para os tipos de FL/P em homens (57%) e mulheres

(43%) corresponde aos dados relatados na literatura. De acordo com Aquino et

al. (2011) foi, também, observada a predominância de FL/P em indivíduos do

gênero masculino na população brasileira.

7.2. SELEÇÃO DOS GENES CANDIDATOS E POLIMORFISMOS

ESTUDADOS

Antes dos avanços alcançados em biotecnologia, os estudos de

associação genética consideravam plataformas ou mapas de marcadores

moleculares compostos de algumas dezenas de nucleotídeos chamados

microssatélites (Pritchard & Feldman, 1996). Com o avanço das técnicas de

sequenciamento, foram identificadas regiões do genoma onde longas

sequências diferem entre os indivíduos em apenas um nucleotídeo. O nome

dado a este tipo de marcador do genoma é SNP, ou polimorfismo de um único

nucleotídeo. Em particular, este tipo de mapa ou plataforma genômica foi

introduzida e disponibilizada pelo International HapMap Project (2003), que é

um consórcio entre grandes centros de pesquisa com a finalidade de descrever

os padrões comuns de variação genética humana. Atualmente, os estudos que

visam a busca por marcadores moleculares associados a uma doença estão

evoluindo sobremaneira. Alguns métodos têm sido propostos em estudos de

associação para a detecção de loci individuais ao longo do genoma e com o

objetivo de pesquisar o mapa de marcadores para encontrar regiões

candidatas, onde pode-se citar as análises de associação entre os loci e a

doença como uma das mais utilizadas. Esta classe de procedimentos foca

diretamente na doença estudada e visa encontrar regiões de marcadores

associados a ela (Aschard et al., 2007).

Muitos genes candidatos a FL/P têm sido sugeridos através de

resultados de estudos biológicos em modelos animais demonstrando a sua

importância durante o desenvolvimento embrionário, resultados de estudos de

54

ligação e de desequilíbrio de ligação, resultados de estudos de associação com

marcadores em todo o genoma (GWAS), aberrações cromossômicas e formas

sindrômicas de FL/P (Murray, 2002). A abordagem deste estudo, com relação à

seleção dos genes estudados, seguiu os modelos acima. Liu et al. (2012)

estudaram características fenotípicas faciais com o objetivo de identificar genes

envolvidos no desenvolvimento craniofacial. Os resultados dos estudos de

GWAS identificaram cinco loci genéticos independentes associados aos

diferentes fenótipos faciais, sugerindo o envolvimento de TP63 como potencial

candidato na determinação das feições faciais humanas. Outros dois estudos

GWAS (Genome Wide Association Studies) sugeriram uma região no

cromossomo 3q em que o TP63 está localizado como candidata à etiologia da

FL/P. O primeiro estudo foi realizado com uma amostra de famílias chinesas e

replicado em seis diferentes populações (chinesa, filipina, colombiana, indiana,

turca e norte americana), e o cromossomo 3q (3q27-28) foi novamente citado

como candidato de risco para a ocorrência de FL/P (Marazita et al., 2002;

Marazita et al., 2009)

Os genes TP63 e PBX1 foram escolhidos baseados em resultados de

estudos biológicos em modelos animais demonstrando a sua importância

durante o desenvolvimento craniofacial e na formação do palato (Thomason et

al., 2008; Ferreti et al., 2011). Entretanto, até a presente data, existem poucos

relatos de estudos de associação com estes genes na ocorrência de FL/P em

humanos. Além da tentativa de detectar novos genes/loci potencialmente

envolvidos na etiologia da FL/P, a replicação de estudos anteriores é uma

prática comum nos estudos genéticos, visando verificar se associações

sugeridas em uma determinada população se repetem em outras populações.

Nesse contexto, associações entre FL/P e os genes, WNT3, WNT9B, and

ARHGAP29, já foram relatadas em outros estudos (Chiquet et al., 2008;

Menezes et al., 2010; Nikopensius et al., 2010; Leslie et al., 2012) e foram

escolhidos no intuito de verificarmos a existência de associação na nossa

população. WNT3 e WNT9B foram localizados na região clf1 e identificados

como contribuidores para o fenótipo de FL/P em camundongos (Juriloff et al.,

2005). Nos seres humanos, as variações em genes WNT foram descritas em

55

casos de FL/P sindrômica (WNT3 e síndrome de Tetra-Amelia) – (Niemann et

al., 2004) e não sindrômica (Chiquet et al., 2008; Menezes et al., 2010). Com

relação ao gene ARHGAP29, que foi inicialmente sugerido como candidato à

FL/P em estudos de associação cobrindo todo o genoma (GWAS) - (Beaty et

al., 2010), um recente estudo mostrou que mutações neste gene podem

contribuir para FL/P (Leslie et al., 2012).

7.3. ANÁLISE DOS RESULTADOS

Os resultados do presente estudo foram analisados estatisticamente

através do teste de desequilíbrio de transmissão utilizando-se o programa

FBAT e o valor indicando significância foi estabelecido em p < 0,05.

Este teste foi descrito inicialmente para a utilização de dados

proveniente de trios (pai, mãe e indivíduo afetado), conforme a amostra deste

estudo, com o objetivo de averiguar a associação entre loci de marcadores

moleculares e genes que influenciam a suscetibilidade à doença baseados na

transmissão alélica entre familiares afetados e não afetados (Spielman et al.,

1993). Entre as vantagens deste teste, destaca-se a habilidade de evitar

variáveis de confundimento (por exemplo: efeitos de estratificação

populacional) que podem induzir a evidências falso-positivas (Ewens &

Spielman, 2003).

Para o TDT, as amostras são consideradas geneticamente homogêneas

por possuírem o mesmo “background” genético, onde os pais são utilizados

como amostra controle e os filhos como casos afetados. Uma desvantagem

deste método é que estudos com análises de associação baseadas em família,

especialmente as que utilizam o TDT, são mais restritivos devido ao fato

desses testes utilizarem apenas uma parcela da amostra considerada

informativa. Assim, é possível que os resultados negativos obtidos no presente

estudo se devam a um erro estatístico do tipo II ocorrido em função do método

de análise utilizado (Ewens & Spielman, 2003).

56

7.4. MÉTODO DE GENOTIPAGEM

A genotipagem do presente estudo foi realizada através do método de

TaqMan, proposto por Ranade et al. (2001), e consiste na utilização de sondas

fluorescentes alelo-específicas, que combinam as etapas de amplificação e

detecção dos alelos em uma única etapa e elimina a necessidade de

procedimentos adicionais para a determinação do genótipo. A fluorescência é

medida durante a reação de PCR e os genótipos inferidos a partir desses

valores. Desta forma, o método TaqMan elimina viés por erro de interpretação,

pois os genótipos são gerados automaticamente sem interferência da análise

humana. Esta é uma técnica dispendiosa devido à necessidade de se usar um

equipamento especial com filtros para detecção de fluorescências em

diferentes comprimentos de onda e do alto custo das sondas fluorescentes

(Letra et al., 2007). Entretanto, a simplicidade da técnica, a alta especificidade

e a confiabilidade dos resultados, fizeram com que o método TaqMan se

tornasse uma importante ferramenta para o estudo de associação em doenças

complexas, como a FL/P (Vieira, 2008).

7.5. RESULTADOS DE ASSOCIAÇÃO COM A FL/P

7.5.1. PBX1 A morfogênese da região craniofacial requer uma coordenação precisa

de programas celulares, incluindo a proliferação, migração, diferenciação e

apoptose (Cox, 2004). Camundongos e humanos apresentam morfologia

craniofacial semelhante durante o desenvolvimento embrionário (Tamarine e

Boyde, 1977; Gritli-Linde, 2008), por essa razão o camundongo oferece um

modelo adequado para estudar esses processos. Tomando como base este

ponto, diversos genes candidatos a anomalias genéticas têm sido relatados a

partir de modelos animais. Um estudo recente demonstrou a importância do

57

papel do gene PBX1 durante a palatogênese em camundongos (Ferreti et al.,

2011). Ferreti et al. (2011) demonstraram em seu estudo que camundongos

nulos para ambos os genes PBX1 e PBX3 desenvolveram FL/P sugerindo que

estes genes podem estar associados ao desenvolvimento de FL/P. Neste

mesmo estudo, a mutação de PBX com ausências de ambas as cópias do

gene e, consequentemente, com ausência de expressão do mesmo, destacou

a importância do papel do PBX1 na morfogênese da face média e seu

envolvimento na expressão dos genes PBX2 e PBX3, membros da mesma

família, uma vez que esta ocorre de forma concomitante a expressão do PBX1.

Notavelmente, nas áreas médias da face, os níveis de PBX1 eram mais

elevados quando comparados com os genes PBX2 e PBX3. Outro fato

importante observado neste estudo com os genes da família PBX foi a

ausência de apoptose em camundongos mutantes para o gene PBX indicando

que as proteínas de PBX podem atuar como indutores de apoptose durante a

morfogênese facial média. Curiosamente, p63 e IRF6, foram citados como

mediadores de apoptose em alguns contextos (Ingraham et al., 2006; Pietsch,

et al., 2008) e também são expressos durante desenvolvimento da face. De

fato, foi demonstrado que a desregulação do gene PBX depende da rede

molecular do complexo WNT-p63-IRF6, interligando vários genes dentro de

uma cascata de acontecimentos responsável pela formação anormal do lábio e

do palato primário em camundongos (Ferreti et al., 2011).

Neste estudo, não foi detectada associação significativa entre os SNPs

estudados no gene PBX1 e FL/P (p > 0,05). Entretanto, dada a complexidade

da etiologia das FL/P, outras investigações em outras populações podem ser

necessárias para confirmar a associação do gene PBX1 com a FL/P.

58

7.5.2. TP63 Evidências que apoiam a participação do gene TP63 como gene

candidato ao desenvolvimento de FL/P incluem estudos genéticos em humanos

(Marazita et al., 2002; Rinne et al., 2007; Marazita et al., 2009) e estudos em

modelos animais mostrando que este gene desempenha papel importante no

desenvolvimento do palato (Yang et al., 1999; Thomason et al., 2008). Em um

estudo com famílias chinesas, Marazita et al. (2002) analisaram marcadores

que pudessem estar associados ao desequilíbrio de ligação em outras regiões

que supostamente poderiam estar envolvidas em FL/P. Como resultado desta

varredura genômica, os autores sugeriram o cromossomo 3q (onde se localiza

o gene TP63) como sendo a região mais significativa, juntamente com o

cromossomo 4q, Posteriormente, Marazita et al. (2009) replicaram o estudo em

chineses em diversas populações incluindo as populações chinesa, filipina,

colombiana, indiana, turca e norte americana. Como resultado, o cromossomo

3q (3q27-28) foi novamente citado como candidato de risco para a FL/P.

Contrariando os estudos anteriores, os resultados de Paranaíba et al. (2013)

não demonstraram associação entre TP63 e FL/P em um estudo caso controle

realizado em uma população brasileira.

Através do mapeamento do gene em várias famílias com a síndrome da

displasia ectodérmica com FL/P, Celli et al. (1999) localizaram o TP63 na

região cromossômica 3q27-29. O TP63 codifica pelo menos seis isoformas

protéicas a depender da sequência promotora iniciadora ou do rearranjo

alternativo após exclusão de introns, fenômeno chamado de splicing. De fato, o

gene TP63 codifica três domínios: um domínio de transativação amino-terminal,

representado pelos aminoácidos 01 a 59; um domínio de ligação ao DNA com

os aminoácidos 142 a 321; e um domínio de oligomerização carboxi-terminal

nos aminoácidos 353 a 397. Ainda em humanos, mutações no gene TP63

foram associadas a diversas anormalidades de desenvolvimento, tais como:

síndrome EEC com FL/P (OMIM 604292), síndrome de Hay-Wells (OMIM

106260) e síndrome de Rapp-Hodgkin (OMIM 129400, Rinne et al., 2007).

Ianakiev et al. (2000) evidenciaram mutações afetando o gene TP63,

59

especificamente no domínio de ligação do DNA, em famílias com os fenótipos

da síndrome EEC, caracterizada por ectrodactilia, displasia ectodérmica e

fenda palatina (OMIM 604292). Além disso, a perda da expressão de p63

resultou em várias anormalidades de desenvolvimento incluindo FL/P em

camundongos (Thomason et al., 2008).

Recentemente, foi relatado que p63 e IRF6 interagem epistaticamente

na palatogênese (Thomason et al., 2010). Tendo como base a hipótese que a

expressão de IRF6 é reduzida no desenvolvimento da face média de

camundongos mutantes para PBX e WNT9B e, ainda, que p63 regula a

expressão de IRF6 (Noszczyk et al., 2001; Rahimov et al., 2008; Thomason et

al., 2010).

Mills et al. (1999) analisaram o papel do gene TP63 na embriogênese de

camundongos usando células-tronco e evidenciaram que esse tem função

importante na diferenciação do ectoderma. Os camundongos nulos para o gene

TP63 apresentaram sérias anormalidades estruturais e craniofaciais; algumas

delas incompatíveis com a sobrevivência. Finalmente, Wessagowit et al. (2000)

relataram a ocorrência e os aspectos clínicos e moleculares de uma paciente

com a síndrome EEC, que é descrita como uma desordem de desenvolvimento

autossômica dominante com alta variabilidade de expressão e penetração

reduzida, cujo substrato molecular é a mutação do gene TP63. Apesar das

evidências biológicas implicando o gene TP63 como possível candidato na

etiologia da FL/P, existem poucos estudos incluindo o gene como candidatos a

FL/P não sindrômica em humanos.

Em nosso estudo os resultados forneceram evidência adicional para a

associação de TP63 (rs4575879 com um p valor = 0,02) com FL/P na nossa

população. Ainda se desconhece se os polimorfismos localizados em introns e,

consequentemente, em regiões não codificadoras ou em sítios de splicing,

podem causar alguma mudança funcional na expressão final da proteína.

Contudo, diversos estudos relataram a presença de que polimorfismos

associados com desordens complexas, como FL/P, que estão localizados em

áreas intrônicas, incluindo a associação do gene IRF6 (Zucchero et al., 2004;

Ghassibe et al., 2005; Vieira et al., 2007; Jia et al., 2009; Jugessur et al., 2009).

60

Portanto, este tipo de SNP não deve ser desconsiderado como potencialmente

prejudicial na etiologia das FL/P. Devido à heterogeneidade genética entre as

populações, é importante investigar a associação de genes previamente

relatados com FL/P em múltiplas populações.

7.5.3. WNT Genes Os genes da via de sinalização WNT são conservados entre as espécies

e são essenciais para o desenvolvimento de vários processos, incluindo a

morfogênese da face (Fossat et al., 2011). Outros estudos relataram que estes

genes são expressos no terço médio da face de camundongos e de galinhas

(Lan et al., 2006; Brugmann et al., 2007; Song et al., 2009; Reid et al., 2011)

concluindo-se que a sinalização de WNT tem um papel importante na

padronização facial de espécies específicas. Foi ainda relatado que a perda de

função de componentes de WNT está associada com malformações na região

média da face e com o desenvolvimento de fissuras orais (Carroll et al., 2005;

Juriloff & Harris, 2006).

Evidências que apoiam a participação dos genes da família WNT como

loci possíveis para o desenvolvimento das FL/P vêm do estudo realizado com

camundongos WySn/A, que apresentaram FL/P na ausência de expressão de

WNT3 (Juriloff et al., 2004). WNT3 e WNT9B foram localizados na região clf1

em camundongos e identificados como possíveis contribuidores para a FL/P

nos mesmos (Juriloff et al., 2005). Em humanos, variações genéticas em genes

WNT foram descritos em casos de FL/P sindrômica (Niemann et al., 2004) e

não sindrômica (Chiquet et al., 2008; Menezes et al., 2010; Mostowska et al.,

2012).

Neste presente estudo, foram investigados SNPs WNT3 e WNT9B como

possíveis candidatos na etiologia das FL/P em famílias brasileiras. Nossos

resultados corroboram os resultados de Chiquet et al. (2008), que relataram a

associação de WNT9B com FL/P em uma amostra constituída por americanos

com descendência europeia e hispânicos, sendo a associação mais forte

61

observada nas famílias com descendência europeia. Entretanto, nesta

pesquisa, observamos associação apenas para o SNP rs1530364 no gene

WNT9B. Menezes et al. (2010) observaram uma associação significativa entre

WNT3 (rs142167) e FL/P no seu estudo caso-controle em uma população

brasileira, embora neste estudo não tenha sido observada associação com

WNT3 e FL/P. Haplótipos em genes WNT3 e WNT9B também foram

associados com o fenótipo de fenda. Em um estudo realizado na população

polonesa por Mostowska et al. (2012), os resultados sugeriram a mutação em

WNT3 (rs3809857) como uma variante de risco para FL/P. Além disso, a

análise de haplótipos revelou que WNT3 está significativamente associado com

FL/P.A associação de FL/P com WNT5A foi encontrada apenas casos de

fissura unilateral esquerda. No presente estudo as amostras não foram

estratificadas em subgrupos de FL/P (unilateral, bilateral, direita ou esquerda)

porque o número de amostras por grupo seria diminuído prejudicando as

análises.

Em um contexto semelhante, considera-se que indivíduos com fissuras

unilaterais, que apresentam agenesias do incisivo lateral sobre o lado não

fissurado, podem apresentar uma fenda bilateral. Já a ausência do incisivo

lateral representaria uma microforma da fissura, ou seja, um insucesso da

fenda bilateral em se desenvolver (Letra et al., 2007). Em estudos com

diferentes abordagens, as vias de sinalizações moleculares da via WNT têm

sido implicadas na regulação do desenvolvimento dentário, onde WNT3 mostra

a expressão específica na formação do esmalte dentário. A importância do

WNT3 durante odontogênese é ainda realçada pela perda progressiva de

ameloblastos dos dentes incisivos pós-natal em ratos transgênicos (Millar et al.,

2003).

Nesta pesquisa, foi observada a associação do SNP rs rs1530364 (p

valor = 0,03). Este polimorfismo está localizado em uma região intrônica na

posição 42306776. De fato, os SNPs mais investigados estão em regiões

intrônicas ou regiões intergênicas e não parecem alterar sítios de fatores de

transcrição de ligação ou ter qualquer outro efeito potencialmente prejudicial.

No estudo realizado por Menezes et al. (2010), a análise in silico revelou que

62

nenhum dos SNPs testados anularam a expressão da proteína, embora exista

a possibilidade de alguns alelos terem um efeito prejudicial no

desenvolvimento. Por exemplo, o SNP rs566926 em WNT5A, associado com

FL/P unilateral esquerda, está localizado num sítio de ligação para o fator de

transcrição intrônico intensificador da função para a qual o alelo “A” cria dois

novos sítios de ligação com SOX5, ambos estes fatores de transcrição

envolvidos na regulação do desenvolvimento embrionário.

Uma série de observações sugerem os genes WNT9B e o WNT3 como

candidatos para FL/P (Menezes et al., 2010; Mostowska et al., 2012). De fato, a

transdução das vias de sinalização WNT depende da fosforilação da proteína

intracitoplasmática Dsh que, uma vez fosforilada, neutraliza o complexo de

degradação da proteína beta-catenina. A presença de moléculas WNT impede

a fosforilação e posterior ubiquitinação da beta-catenina, o que leva ao

acúmulo desta proteína no citoplasma translocando-a para o núcleo das

células, onde interage com fatores de transcrição (Gordon & Nusse, 2006).

Assim, quando em excesso, os sinais de WNT impedem que a beta-catenina

siga sua via natural de degradação por ubiquitinação, o que resulta no acúmulo

desta proteína no núcleo das células e consequentemente, altera a transcrição

de diversos genes, inclusive os que regulam a proliferação, a sobrevivência e a

adesão celular (Seto & Bellen, 2004).

7.5.4. ARHGAP29

Os primeiros estudos de GWAS para FL/P encontraram fortes

evidências para a associação de um marcador (rs987525) na região

cromossômica 8q24 em FL/P (Birnbaum et al., 2009; Mangold et al., 2010).

Esta associação foi validada de forma independente em diversas populações

incluindo uma população brasileira. Recentemente, um outro estudo GWAS

identificou associações em marcadores perto do gene ABCA4 gene, localizado

no cromossomo 1p22.1 em múltiplas populações de FL/P (Beaty et al., 2010).

Em um estudo subsequente, o gene ABCA4 foi associado como um candidato

63

de risco para o desenvolvimento de FL/P em uma população brasileira

(Fontoura et al., 2012). Tradicionalmente, o desequilíbrio de ligação (LD) tem

sido utilizado para ajudar na identificação de variantes etiológicos após GWAS

com base no conceito de que uma variante etiológica pode mostrar uma

associação estatística com um marcador não causal, se os dois estiveram em

LD em uma determinada população (Murray et al., 1987). Por este motivo,

atualmente, o gene ARHGAP29 tem sido considerado como um gene

candidato a etiologia das FL/P.

ARHGAP29 está localizado na região cromossômica 1p22.1 à 47 kb

centroméricas do gene ABCA4 e codifica a proteína ativadora Rho GTPase

(GAP) 29, que por sua vez medeia a regulamentação cíclica de pequenas

proteínas de ligação de GTP como RhoA (Saras et al., 1997). Segundo

Schlessinger et al. (2009), Rho sofre efeito da sinalização da via WNT e que a

sinalização da proteína Rho está envolvida no desenvolvimento craniofacial.

Esta rede de sinalização é mediada, em parte, pela rede de genes IRF6 e de

ARHGAP29. Na verdade, Rho é uma proteína ativadora de GTPase envolvida

na regulação de pequenas proteínas de ligação de GTP e necessária para a

terminação da transcrição de determinados genes (Heasman et al., 2008). O

suporte para este mecanismo foi sustentado por um estudo realizado com

objetivo de analisar o perfil de expressão da cultura de células-tronco da polpa

dentária obtidas de indivíduos com FL/P. Esta caracterização mostrou uma

diminuição da expressão do gene ARHGAP29 em quase três vezes quando

comparado às culturas de pacientes controle não afetados (Bueno et al., 2011).

Neste caso, a perda da proteína GAP manteve Rho em uma forma ativa (GTP-

dependente) aumentando, consequentemente, a sua atividade. Assim sendo,

este efeito poderia afetar negativamente a migração celular durante o

desenvolvimento, representando um mecanismo possível pelo qual

ARHGAP29 pode estar envolvido na etiologia das FL/P. Em tecidos humanos,

ARHGAP29 parece estar presente nos ossos, músculos, coração, placenta,

fígado e pâncreas, com baixa expressão no cérebro, pulmões e rins (Saras et

al., 1997). Um estudo realizado em humanos utilizou cultura de fibroblastos em

meios folato-deficientes e folato-suficiente, apresentando como resultado uma

64

expressão alterada de ARHGAP29 e outros genes (WNT5A) em diversos

mecanismos como a sinalização celular, citoesqueleto e matriz extracelular

(Katula et al., 2007). A deficiência de folato tem sido sugerida como um fator de

risco para FL/P, mas sem evidências suficientes (Dixon et al., 2011).

Recentemente, Kitase e Shuler (2012) mostraram em um estudo

realizado através do tratamento de culturas de células do palato com nocodazol

(medicamento responsável por desestabilizar microtúbulos) que as células

tratadas com este medicamento apresentaram um aumento na atividade de

RhoA. De fato, este resultado mostrou que a regulação da dinâmica dos

microtúbulos e microfilamentos de actina é necessária para a remodelação da

borda medial do epitélio durante palatogênese por isso, como resultado, podem

ter ocasionado a formação de um epitélio medial hipertrofiado e,

consequentemente, uma falha da fusão palatal. Esta hipótese pode representar

um dos mecanismos pelo qual ARHGAP29 poderia estar envolvido na FL/P.

Até o presente momento, o único estudo genético mencionando um possível

envolvimento dos genes de ARHGAP29 na etiologia da FL/P em humanos foi

conduzido a partir de regiões candidatas sugeridas por estudos de associação

por todo o genoma (GWAS), onde revelou oito variantes no gene ARHGAP29

que estão potencialmente associadas a FL/P (Leslie et al., 2012). Este estudo

corrobora os achados de Leslie et al. (2012) que, por sua vez, encontraram

evidências de associação do ARHGAP29 com FL/P. No entanto, os resultados

do presente estudo revelaram a associação do ARHGAP29 com FL/P em

apenas um dos cinco polimorfismos testados (rs1048854 com um p valor =

0,01). Localizado em uma região não codificadora na posição 94416119, este

polimorfismo acarreta em uma mutação sinônima que são caracterizadas por

mudanças na sequência dos nucleotídeos do material genético contudo o

códon codifica para o mesmo aminoácido da sequência original. Embora SNPs

sinônimas não alterem a sequência de proteína, estes SNPs podem estar em

desequilíbrio de ligação com algum outro SNP realmente funcional, o qual

poderia interferir na estrutura da proteína final.

65

7.6. LIMITAÇÕES DO ESTUDO

Este estudo apresentou algumas limitações, dentre elas, o tamanho da

amostra, devido à dificuldade de coleta de material de trios (Indivíduo afetado,

Pai e Mãe), especificamente pela ausência ou desconhecimento do progenitor.

Entretanto, a amostra utilizada (70 trios totalizando 210 indivíduos) resultou em

um poder de estudo estimado em ~98% para detectar associação com um

valor de P=0.05 uma vez que os marcadores selecionados estavam em

desequilíbrio de ligação com o fenótipo (D’=0,08) e a frequência dos

marcadores foi estimada em ~20%. Ainda, se estabelecêssemos um valor de P

mais conservador (ex. P=0.001), nossa amostra resultaria em um poder

estatístico de ~82%.

Um dos grandes problemas em estudos genéticos de doenças

complexas é avaliar a real significância dos resultados obtidos. Os resultados

deste estudo foram avaliados estatisticamente pelo teste de desequilíbrio de

transmissão utilizando-se o programa FBAT e o nível de significância foi

estabelecido em 0,05. Uma desvantagem do TDT consiste na natureza

restritiva da análise, uma vez que utiliza apenas uma parcela da amostra,

considerada informativa. Sendo assim, é possível que algumas associações

positivas tenham sido descartadas em função do método de análise utilizado.

Devido ao pequeno número de SNPs investigados em cada gene, optou-se por

não utilizar correção para testes múltiplos, como por exemplo: o teste de

correção de Bonferroni, por ser um teste extremamente conservador, uma vez

que o objetivo deste estudo era investigar associações entre alguns

marcadores em genes candidatos a FL/P, que pudessem justificar a

necessidade de estudos mais detalhados, como estudos de mapeamento

genético.

66

7.7. PERSPECTIVAS FUTURAS

A identificação de novos genes e loci candidatos à FL/P são de

fundamental importância para o entendimento dessa anomalia. A complexidade

e a diversidade dos aspectos clínicos e mecanismos moleculares envolvidos no

desenvolvimento craniofacial proporcionam inúmeras oportunidades para

investigações futuras da etiologia da FL/P. Os avanços no campo da

engenharia genética poderão proporcionar, num futuro próximo, a identificação

completa dos genes causadores das alterações craniofaciais e

subsequentemente o aconselhamento genético de casais previamente à

concepção (devido à probabilidade de ter genes de alto risco), bem como

propor uma possível terapia gênica em fetos afetados, culminando com a

prevenção da ocorrência da FL/P em humanos.

67

8. CONCLUSÕES

Baseado nos objetivos propostos e nos resultados obtidos no presente

estudo, foi possível concluir que:

• os polimorfismos estudados dos gene ARGHAP29, TP63 e WNT9B

foram associados com FL/P na população estudada;

• o polimorfismo nos genes WNT3 e PBX1 não foram associados com

FL/P na população estudada.

68

REFERÊNCIAS

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APÊNDICE 1: Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

“Estudo da Etiopatogenia das Alterações Craniofaciais e Patologias Dento-Bucais” Pesquisador responsável: Dra. Patricia Nivoloni Tannuri / Dra. Clarissa Souza Gomes da Fontoura. Telefones para contato: (21) 2629-9255 (21) 2498-2195 (21) 8568-5505

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

Nome: _____________________________________________________________ Idade: _____________ anos. R.G. ______________________________________________________ Responsável legal: _________________________________________________________________ O Sr(a) está sendo convidado(a) a participar dos projetos de pesquisa “Estudo da Etiopatogenia das Alterações Craniofaciais e Patologias Dento-Bucais” de responsabilidade do pesquisador Dra. Patricia Nivoloni Tannuri. O presente estudo que apresenta parceria com o Hospital Municipal Nossa Senhora do Loreto (HMNSL), têm como objetivo estabelecer uma base de dados epidemiológico e moleculares para auxiliar em investigações genéticas da formação da fissura labiopalatina. Caso concorde em participar, os procedimentos a serem realizados constam de uma rápida entrevista, coleta de saliva e/ou de tecido descartado em procedimentos cirúrgicos. Estes procedimentos não apresentam desconfortos, riscos ou custos. Este estudo não proporcionara benefícios diretos entretanto os benefícios indiretos serão relevantes para o melhor entendimento das causas das fissuras labiopalatinas. Adicionalmente, a sociedade deve se beneficiar da identificação dos mecanismos moleculares envolvidos com as alterações congênitas. O registro de sua participação nesta pesquisa será mantido de forma confidencial através do uso de códigos numéricos e arquivos fechados. A amostra será armazenada no Banco de Amostras Biológicas da Unidade de Pesquisa Clínica do HUAP/UFF e poderá ser utilizada para estudos futuros. Os resultados desta pesquisa serão publicados em literatura científica especializada. Este é um projeto de pesquisa e não uma forma de tratamento. A sua participação e/ou de seu filho são voluntárias. Nenhuma punição, discriminação ou perda de benefícios ocorrerá se vocês decidirem não participar. Vocês podem desistir da participação em qualquer momento sem punição ou perda de benefícios aos quais vocês têm direito. Se vocês cancelarem a participação, seus dados serão removidos do banco de dados e suas amostras serão destruídas. Eu________________________________________ declaro ter sido informado e concordo em participar, como voluntário, do projeto de pesquisa acima descrito. Data______/_______/________ ____________________________ ___________________________ ____________________________ Assinatura do paciente Responsável Legal Testemunha Eu discuti os pontos acima com o participante e/ou representante legal. É minha opinião que o participante entendeu os riscos, benefícios e obrigações envolvidas na participação neste projeto. _________________________________ ________________________________ _______/________/_______ Dra.. Clarissa Souza Gomes da Fontoura Pesquisador responsável Data Dra. Patricia Nivoloni Tannuri

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APÊNDICE 2: QUESTIONÁRIO Pai Mãe Indivíduo Família

Identificação da Criança: Use: (s) sim ou (n) não No do protocolo:____________data da entrevista:_____/_____/_____ Nome da criança: _____________________________________________________ Idade ____________ anosI__I mesesI__I sexo|__| (f - feminino ; m - masculino) Raça da criança:______________do Pai:_______________da Mãe:________________ Nome do responsável:_________________________________________________ Endereço:____________________________________________________________ Estado: _______________________________________ cep: __________________ Telefone:____________________________________________________________ Escolaridade: Mãe _______________________Pai:_____________________________ Mora ou morou próximo de indústrias |__| Mora ou morou em área rural |__| História ocupacional do pai Tipo de trabalho:__________________________Função:_________________________ Riscos: ______________________Tempo de exposição: ______________________ Tempo de trabalho: |__|__| (em anos) Número de dias de trabalho na semana: |__| Número de horas por dia: |__|__| Já sofreu algum acidente do trabalho com produto químico? |__| Quantas vezes? |__|__| História ocupacional da mãe Tipo de trabalho:____________________Função:_______________________________ Riscos: ______________________Tempo de exposição: ______________________ Tempo de trabalho: |__|__| (em anos) Número de dias de trabalho na semana: |__| Número de horas por dia: |__|__| Já sofreu algum acidente do trabalho com produto químico? |__| Quantas vezes? |__|__| História clínica Use: (s) sim ou (n) não Presença de fenda na família |__| Quem (Lado Materno ou Paterno)?_______________ Tem outros familiares com malformações, anomalias dentárias e/ou síndromes genéticas associadas |__| Quem/Qual? _______________________________________ Câncer|__| Quem (Lado Materno ou Paterno)? ______________________________ tipo do câncer?_______________________________________________________ Idade na época da gestação pai ______ anos / mãe______anos Portadora de alguma patologia durante a gestação? D.S.T. (doença venérea) |__| Hipertensão arterial |__| Epilepsia|__| Diabetes|__| Outra |__| Qual? ______________________________________________________ Uso de medicação durante a gravidez (pré-natal): Suplementos Alimentares: Acido fólico I__I Sulfato ferroso I__IOutras_______________ Período gestacional de uso?_____________________________________________ Anticonvulsivantes |__| Antiinflamatórios |__| Para abortamento |__| Outras |__| Quais?______________________________________________________________ Período gestacional?___________________________________________________ Você faz uso de alguma destas substâncias? Pai: Fumo |__| frequência:_______________Álcool |__| frequência:_________________ Drogas |__| qual / frequência:_______________________________________________ Mãe: Fumo |__| frequência:_____________Álcool |__| frequência:__________________ Drogas |__| qual / frequência:_______________________________________________ Período de uso: antes e/ou durante a gravidez?_________________________________ NÃO PREENCHER Tipo de fissura:_________________________ Lado:___________________________ Odontológico:______________________________________________________

NÃO PREENCHER

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ANEXO 1: APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA

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ANEXO 2: INSTRUÇÕES DO FABRICANTE - ORAGENE DNA PURIFICATION KIT (DNA GENOTEK)

1. 1000 uL das amostra Oragene / saliva mista foram transferidas para um

tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.

2. Para 1000 mL de Oragene / saliva, foi adicionado 40 mL (1/25th

volume) de Oragene purificador (OG-L2P, incluídos) para o tubo de

microcentrífuga e misturado em vortex por alguns segundos.

3. As amostras foram Incubadas em gelo durante 10 minutos.

4. As amostras foram centrifugadas em temperatura ambiente durante

5 minutos a 13.000 rpm (15.000 x g).

5. O sobrenadante foi cuidadosamente transferido com uma pipeta

para um tubo de microcentrífuga novo e as as impurezas descartadas.

6. Um volume de 95 - 100% de etanol igual ao volume do de

sobrenadante foi adicionado e misturado suavemente 10 vezes por

inversão.

7. As amostras foram deixadas em repouso à temperatura ambiente

durante 10 minutos para permitir que o DNA precipite completamente.

8. As amostras foram centrifugadas a temperatura ambiente durante 2

minutos a 13.000 rpm (15.000 x g).

9. O sobrenadante foi removido cuidadosamente com uma pipeta e

descartado, tomando cuidado para não perturbar o sedimento de DNA.

9a. 250 ul de etanol a 70%. foi adicionado e deixado em repouso à

81

temperatura ambiente durante 1 minuto. 9b. O etanol foi completamente

removido.

10. 100 ul de tampão TE foi adicionado para dissolver o sedimento de

DNA e misturado em vortex durante pelo menos 5 segundos. As

amostras foram deixadas temperatura ambiente durante 1-2 dias

associaÇÃo entre as fissuras labiopalatais e os genes … fontoura... · clarissa souza gomes da...

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