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Universidade de São PauloInstituto de Física de São Carlos
Jessica dos Santos
Aspersão dinâmica de drogas neuroativas emcentro gerador de padrões
São Carlos2013
Jessica dos Santos
Aspersão dinâmica de drogas neuroativas emcentro gerador de padrões
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Física do Instituto de Física deSão Carlos da Universidade de São Paulo, para aobtenção do título de Mestre em Ciências.
Área de Concentração: Física AplicadaOpção: Física BiomolecularOrientador: Reynaldo Daniel Pinto
Versão corrigida(versão original disponível na Unidade que aloja o Programa)
São Carlos2013
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTETRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO PARAFINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
Ficha catalográfica elaborada pelo Serviço de Biblioteca e Informação do IFSC, com os dados fornecidos pelo(a) autor(a)
Santos, Jessica dos Aspersão dinâmica de drogas neuroativas em centrogerador de padrões / Jessica dos Santos; orientadorReynaldo Daniel Pinto - versão corrigida -- SãoCarlos, 2013. 91 p.
Dissertação (Mestrado - Programa de Pós-Graduação emFísica Aplicada Biomolecular) -- Instituto de Físicade São Carlos, Universidade de São Paulo, 2013.
1. Sistema nervoso estomatogástrico. 2. Programadynamic clamp. 3. Glutamato. 4. Serotonina. 5.Estímulo químico dinâmico. I. Pinto, Reynaldo Daniel,orient. II. Título.
À minha mãe, Sonia, e avós, Maria e Levino
Agradecimentos
Escrever uma dissertação exige certo isolamento, e o desafio de transformar tantas elu-cubrações em um texto adequado, muitas vezes nos faz questionar se ainda teremos família,namorado e amigos ao final desta etapa. Superados os momentos em que as interrogações pre-valecem, admiramos o resultado da nossa dedicação e enxergamos claramente a participação eo apoio de muitas pessoas. Portanto, quero deixar registrado aqui meus mais sinceros agradeci-mentos:
À minha mãe, Sonia, e meus avós, Maria e Levino. Três pessoas essenciais em minhaformação como pessoa e que nunca mediram esforços para me proporcionar o melhor. Semvocês eu não teria esta profissão da qual tanto me orgulho. Obrigada por acreditarem sempreem meu potencial.
À minha família, principalmente aos meus tios Donizetti e João, por se alegrarem a cadaconquista minha, e compreenderem minha ausência em muitos eventos familiares.
Ao meu namorado, Paulo Eduardo, pelo carinho, incentivo e principalmente paciência.Obrigada por toda a ajuda, em especial com o LATEX e revisão da parte final. Seu apoio foiessencial para que eu conseguisse atingir mais este objetivo. Amo você!
Aos amigos de laboratório do presente: Rafael Tuma e Renata; e aos do passado: RafaelViegas, Carolina e Gisele; pelas conversas, cafés das 16h, apoio no entendimento de teorias eauxílio na execução da pesquisa.
Aos amigos citados acima e tantos outros que me proporcionaram momentos inesquecíveisde descontração, os quais foram essenciais para me esquecer daquilo que pode parecer umsacrifício.
Ao meu orientador, Reynaldo, pela amizade, ensinamentos e orientação desde a iniciaçãocientífica, sempre com paciência, compreensão e competência.
Ao grupo de pesquisa FCIA do IFSC, pelo apoio e por permitir minha integração e desen-volvimento da pesquisa. Em especial: Thiago, Tiago, Ivanilda, Lírio, Marquinhos e Ailton.
Ao pessoal do IFSC, pela ajuda e dedicação. Em especial: Ricardo, Patricia, Silvio, Italo,Sonia e Maria Cristina.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do estado de São Paulo pelo financiamento de nossapesquisa.
A todos aqueles que, de alguma forma, estiveram e estão próximos de mim, fazendo estavida valer cada vez mais a pena.
“The great tragedy of Science - the slaying of a beautiful hypothesis by an ugly fact.”
— THOMAS HENRY HUXLEY
Resumo
SANTOS, J. dos. Aspersão dinâmica de drogas neuroativas em centro gerador de padrões.2013. 91 p. Dissertação (Mestrado em Ciências) - Instituto de Física de São Carlos, Universi-dade de São Paulo, São Carlos, 2013.
O estudo dos efeitos de neurotransmissores e neuromoduladores em circuitos nervosos tradicio-nalmente consiste em observar o comportamento de um sistema, ou parte dele, quando expostoa concentrações constantes da droga, ignorando flutuações ou padrões temporais de liberação.Neste trabalho implementamos um protocolo dinâmico e dependente da atividade do própriosistema nervoso, que permitiu estudar experimentalmente a influência da dinâmica de liberaçãonos efeitos que glutamato (Glu, 1 mM) e serotonina (5-HT, 10 mM) produzem no padrão emer-gente de um centro gerador de padrões (CPG). Os experimentos foram realizados no sistemanervoso estomatogástrico de Callinectes sapidus e Callinectes danae (CPG pilórico) durantesua operação normal in vitro, que pode ser caracterizada por sua frequência de burst, númerode spikes/burst dos neurônios, duty cycle dos neurônios, etc. A partir da atividade de um dosneurônios do CPG, medida extracelularmente, um algoritmo baseado no protocolo dynamicclamp (interação em tempo real entre tecido nervoso vivo e simulação computacional) iden-tifica em tempo real um padrão de atividade pré-escolhido e dispara um injetor de picolitrossemelhante a um picospritzer R©, aspergindo uma pequena quantidade de solução com a droganas vizinhanças dos neurônios e sinapses que compõe o CPG, de onde é retirada por perfusãocontínua de solução fisiológica. Assim, podemos comparar o comportamento emergente doCPG quando este é estimulado de maneira síncrona com sua atividade ou de maneira assín-crona, mas de forma que a mesma quantidade média de droga seja aspergida nos dois casos.Nossos resultados demonstram que um mesmo estímulo “apresentado” de duas maneiras dife-rentes, para um mesmo circuito nervoso, pode produzir respostas diferentes na mesma célula. Oprotocolo se mostrou mais eficiente em mostrar diferenças quando a atividade da droga ocorreem uma escala de tempo menor que aquela do comportamento do CPG. Novos estudos devemser realizados com outros neutrotransmissores e moduladores tanto de ação ionotrópica quantometabotrópica, para se adequar o protocolo aos diferentes tipos de substâncias.
Palavras-chave: Sistema nervoso estomatogástrico. Programa dynamic clamp. Glutamato.Serotonina. Estímulo químico dinâmico.
Abstract
SANTOS, J. dos. Dynamic puff ejection of neuroactive drugs in central pattern genera-tors. 2013. 91 p. Dissertação (Mestrado em Ciências) - Instituto de Física de São Carlos,Universidade de São Paulo, São Carlos, 2013.
Studying the effect of neurotransmitters and neuromodulators usually consists in observing thebehavior of a system, or part of it, when exposed to stationary concentrations of the drugs thatcompletely lack any time dependency. Here we describe a protocol that we developed to studythe changes of the emerging rhythmic pattern of a Central Pattern Generator (CPG) due to theeffects of the aplications dynamics of tiny puffs of glutamate (Glu, 1 mM) or serotonin (5-HT, 10mM) to the neurons and their neuropil. We experimented on the stomatogastric nervous systemof Callinectes sapidus and Callinectes danae (pyloric CPG) during normal operation in vitro,that was characterized using bursting frequency, neuron’s number of spikes/burst, their dutycycle, etc. From the extracelular activity of one of the CPG neurons, a dynamic clamp basedprotocol (real time interaction between living nervous tissue and computer simulation) detectedin real time a given pattern of activity present in a burst and triggered a picospritzer to puff asmall amount of solution with the drug in the neighborhood of the neurons and synapses of theCPG, from where it was washed through constant perfusion of normal saline. Such arrangementallowed us to address what are the differences on the emerging CPG behavior when the stimuliwas activity synchronous or asynchronous, but with the same mean amount of drug deliveredin both cases. In general, our results showed that the same stimulus presented in different waysto the same nervous circuit may generate different responses even in a cell level. Finally, theprotocol proved to be more efficient when the drug activity time scale is smaller than the timescale of the CPG bursting behavior. In the future we should work with other neuromodulatorsand neurotransmiters to improve the protocol.
Keywords: Stomatogastric nervous system. Dynamic clamp program. Glutamate. Serotonin.Dynamic chemical stimulus.
Lista de Figuras
Figura 1.1 - Tipos de comportamentos elétricos que neurônios podem apresentar.(A) Neurônios silenciosos na ausência de estímulos não possuem poten-ciais de ação. (B) Neurônios com comportamento tônico e (C) neurônioscom comportamento em burst (2). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
Figura 2.1 - Esquematização da etapa experimental. (A) Visão dorsal de um siriCallinectes danae. (B) Uma abertura na parte dorsal do exoesqueletopermite a retirada do conjunto (esôfago, estômago, moela gástrica e pi-loro) onde se localiza o sistema nervoso estomatogástrico (STNS). (C)Vista dorsal do conjunto aberto, fixado com pinos de aço inox à placacom cera. Esta posição propicia o isolamento do STNS para posteriorfixação em placa de Petri. (D) Nervos do STNS em placa de Petri pre-enchida com solução fisiológica. O STNS contém dois gânglios comis-surais (CoG) e um gânglio esofágico (OG), responsáveis por fornecerneuromodulação ao gânglio estomatogástrico (STG). Neurônios do STG(central) são responsáveis por controlar os movimentos gástricos e piló-ricos. Note a presença de eletrodos extracelulares isolados por vaselina.(E) STG após retirada da camada de tecido conectivo (disheating) paraexposição dos corpos celulares. (F) Esquema dos nervos e gânglios quecompõem o STNS para o presente estudo. Os registros eletrofisiológicosextracelulares foram feitos no nervo ventricular lateral (lvn). . . . . . . 33
Figura 2.2 - Procedimento experimental de aspersão de drogas ao STG de crustáceosapós dissecação. Eletrodos extracelulares captam os sinais dos nervosmotores, os quais são amplificados e visualizados em um sistema deaquisição de dados. O sinal é transmitido para o Dynamic clamp, oqual procura por um padrão previamente selecionado. Toda vez que opadrão é encontrado, um pulso digital é transmitido para o injetor depicolitros, que liberará solução contendo o neurotransmissor através demicropipetas de vidro. A aspersão manual é feita através de um botão,quando este é pressionado. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
Figura 2.3 - Trecho de uma série temporal real do nervo lvn mostrando bursts iden-tificáveis do neurônio LP. Os potenciais de ação dos neurônios PD e PYse confundem no sinal extracelular. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
Figura 2.4 - Exemplificação do protocolo utilizado. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
Figura 2.5 - Ilustração de potencial de ação. (A) Trecho de uma série temporal realem aquisição extracelular contendo quatro spikes do burst do neurônioLP, encontrado no CPG pilórico. (B) Spike do LP, com duração médiade 6 ms. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
Figura 2.6 - Aspersão real no 4o spike do neurônio LP utilizando o injetor de pico-litros. A duração da aspersão corresponde ao tempo de pulso pressu-rizado. A abertura para a atmosfera corresponde a liberação da pressãorestante do bico injetor. Pode-se observar que o início da aspersão ocorrequando o padrão é detectado, em tempo real. . . . . . . . . . . . . . . . 44
Figura 2.7 - Demonstração do posicionamento da micropipeta. (A) Esquema da placade Petri com o STNS, mostrando o posicionamento da micropipeta, pre-enchida com neuromodulador em solução, próximo ao gânglio STG. Oexcesso de neuromodulador, assim como o excesso de solução fisioló-gica dentro da parede de vaselina, é sugado por uma seringa, compo-nente da perfusão. (B) Imagem de um experimento real, com micropi-peta e seringas de perfusão. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
Figura 2.8 - Circuito pilórico completo indicando as sinapses inibitórias glutamatér-gicas (círculos preenchidos), colinérgicas (círculos sem preenchimento),sinapses elétricas (símbolo de resistor) e elétricas retificadoras (símbolode diodo). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
Figura 2.9 - Neurônio LP em C. borealis com receptores para mais de 10 neurotrans-missores e moduladores (12). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
Figura 3.1 - Trecho de uma série temporal real do nervo lvn mostrando o n-ésimo en-ésimo+1 bursts do neurônio LP. O tempo entre primeiros spikes cor-responde ao período do ciclo de burst (BCP) (5). . . . . . . . . . . . . . 50
Figura 3.2 - Trecho de uma série temporal real do nervo lvn mostrando o n-ésimoburst do neurônio LP. Intervalos interspikes (ISIs) são definidos poreventos consecutivos (spikes) dentro de um burst. . . . . . . . . . . . . 51
Figura 3.3 - Trecho de uma série temporal real do nervo lvn mostrando o n-ésimoburst do neurônio LP. A relação entre ISIs sucessivos é demonstradagraficamente plotando um ISI contra o ISI anterior, ou seja, ISIi+1 × ISIi. 52
Figura 3.4 - Trecho de uma série temporal real do nervo lvn mostrando o n-ésimoe n-ésimo+1 bursts do neurônio LP. O tempo entre o último spike deum burst e o primeiro spike do burst seguinte corresponde ao intervalointerburst (IBI). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
Figura 3.5 - Trecho de uma série temporal real do nervo lvn mostrando o n-ésimoe n-ésimo+1 bursts do neurônio LP. A figura mostra o BCP, calculadoanteriormente, e o tempo de burst, Tb, que compreende o tempo entre oprimeiro e o último spike de um mesmo burst. . . . . . . . . . . . . . . 55
Figura 3.6 - Trecho de uma série temporal real do nervo lvn mostrando o n-ésimo e n-ésimo+1 bursts do neurônio LP. A figura mostra o Tap, que correspondeao tempo necessário para que o neurônio dispare o próximo burst apósuma aspersão. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
Figura 4.1 - BCP calculado para aspersões de Glu 10 mM. (A) BCP para aspersãosíncrona com o 1o spike do neurônio LP. (B) BCP para aspersão síncronacom o 4o spike do neurônio LP. As aspersões síncronas com o LP pos-sibilitaram uma adaptação do circuito pilórico em uma nova frequência.(C) BCP para aspersão assíncrona em 1 segundo, sem adaptação do CPGpilórico. (D) e (E) correspondem ao BCP do controle e pós aspersões,respectivamente. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
Figura 4.2 - Efeitos de aspersões glutamatérgicas no número de spikes por burst pro-duzidos pelo neurônio LP. Aumento da média do número de spikes porburst em aspersões dinâmicas de Glu. Já a aspersão periódica causa umadiminuição desse valor. Barras de erro referentes ao SD representado natabela 4.1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
Figura 4.3 - Histogramas de ISIs em condições de controle, aspersões de Glu mM,e pós aspersões. A distribuição uniforme presente no controle é perdidana presença de neuromoduladores. Note a formação mais acentuada desubpopulações de ISI na aspersão periódica a cada 1 segundo. Retornodo pico principal próximo a 0,02 s e ausência de subpopulações em con-dições de pós aspersão. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
Figura 4.4 - Mapa de primeiro retorno para o LP no experimento com aspersões deGlu. (A) e (B) Representam a assinatura de cometa do neurônio LP,mantidas mesmo com aspersão síncrona no 1o e 4o spikes. (C) Mostraa assinatura com a aspersão assíncrona. (D) e (E) Representam a assi-natura em cometa apresentada em condições de controle e pós aspersão,respectivamente. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
Figura 4.5 - Histograma de densidade para o LP no experimento com aspersões deGlu. (A) e (B) Representam a presença de pontos de acumulação emmenor concentração aspersão síncrona no 1o e 4o spikes. (C) Mostraa ausência de ponto de acumulação com a aspersão assíncrona. (D) e(E) Representam os pontos de acumulação presentes em condições decontrole e pós aspersão, respectivamente. . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
Figura 4.6 - Histogramas de IBIs para aspersões glutamatérgicas. (A) e (B) Histo-gramas de IBIs semelhantes para aspersões dinâmicas no 1o e 4o spikes,respectivamente, com picos na região de 0,6 s. (C) Histograma de IBIsem aspersão periódica, mostrando poucos picos de IBIs, deslocados paraa direita. (D) e (C) Histogramas de IBIs durante condições de controle epós-aspersões, respectivamente, com um aumento e distribuição do IBIsno pós-aspersões. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
Figura 4.7 - Gráficos de duty cycle para o experimento de Glu. (A) e (B) representamas aspersões síncronas com o 1o e 4o spikes, respectivamente, com umvalor de duty cycle que sugere 30% de atividade do neurônio LP. (C)representa aspersão periódica, onde o duty cycle indica atividade menorque 30%. As figuras (D) e (E) representam o controle e pós aspersão,respectivamente, mostrando uma atividade de 60%. . . . . . . . . . . . 69
Figura 4.8 - Tempo de rebote pós-inibitório. Em (A) e (B) observa-se a adaptaçãodo CPG pilórico às aspersões síncronas com o 1o e 4o spikes do LP,respectivamente. (C) O tempo de rebote em aspersões periódicas - apre-senta um decaimento linear durante as ∼20 aspersões iniciais, mas nãodemonstra nenhum adaptação clara do circuito a esse tipo de aspersão.(D) Aspersão periódica com escala de duração do rebote reduzida aosmesmos valores de (A) e (B) para comparação. . . . . . . . . . . . . . 71
Figura 4.9 - BCP calculado para aspersões de 5-HT 10 mM. (A) BCP para aspersãosíncrona com o 2o spike do neurônio LP, com menor regularidade. (B)BCP para aspersão síncrona com o 4o spike do neurônio LP e (C) BCPpara aspersão assíncrona em 1 segundo apresentaram maior regularidadede BCP. (D) e (E) correspondem ao BCP do controle e pós aspersões,respectivamente. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
Figura 4.10 - Efeitos de aspersão serotoninérgicas no número de spike por burst pro-duzidos pelo neurônio LP. Aumento do número de spikes por burst emtodas as aspersões, dinâmicas e periódicas. Barras de erro referentes aoSD representado na tabela 4.3. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
Figura 4.11 - Histogramas de ISIs em condições de controle, aspersões de 5-HT 10mM, e pós aspersões. (A) Histogramas de distribuição de ISIs duranteaspersões serotoninérgicas. Note a formação de subpopulações de ISIsna região entre 0,08 s e 0,1 s, mais acentuada da aspersão síncrona com o4o spike e na periódica a cada 1 s. (B) Histograma de ISIs para condiçõesde controle e pós aspersões. Retorno do pico principal próximo a 0,02 scom aumento da base. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
Figura 4.12 - Mapa de primeiro retorno para o LP. (A), (B) e (C) Mapas mostrando aassinatura de cometa do neurônio LP, mantida mesmo com aspersão sín-crona no 2o e 4o spikes e aspersões assíncronas, respectivamente. For-mação mais intensa de subpopulações na parte superior da diagonal emB e C. (D) e (E) Mapas em condições de controle e pós aspersão, res-pectivamente. Apesar do espalhamento próximo a forma de cometa, nãoexistem subpopulações. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78
Figura 4.13 - Histograma de densidade para o LP. (A), (B) e (C) Histogramas demons-trando a presença de pontos de acumulação em menor concentração du-rante as aspersões serotoninérgicas síncronas com o 2o e 4o spikes eassíncronas, respectivamente. (D) e (E) Histogramas representando ospontos de acumulação presentes em condições de controle e pós asper-são, respectivamente, com um tênue espalhamento. Note o desapareci-mento do espalhamento próximo ao quadrante 0,1s × 0,1s. . . . . . . . 79
Figura 4.14 - Histogramas de IBIs para aspersões serotoninérgicas. (A) Histogramade IBIs para aspersões síncronas com o 2o spike. (B) e (C) Histogramasde IBIs semelhantes para aspersões dinâmicas 4o spikes e periódicas acada 1 segundo, respectivamente. (D) e (E) Histogramas de IBIs durantecondições de controle e pós-aspersões, respectivamente. . . . . . . . . . 80
Figura 4.15 - Gráficos de duty cycle. (A), (B) e (C) Duty cycle durante aspersõessíncronas no 2o spike, 4o spike e assíncronas a cada 1 segundo, respecti-vamente. (D) e (E) Duty cycle do controle e pós aspersão, respectivamente. 82
Figura 4.16 - Mapas de retorno de atividade - rebote. (A) e (B) exibem uma adaptaçãodo CPG pilórico a aspersões síncronas com o 2o e 4o spikes do LP. (C)Na aspersão periódica, um padrão diagonal linear a cada 20 segundo éalcançado, com uma estabilização entre a 60a e 80a aspersões. . . . . . 83
Lista de Tabelas
Tabela 4.1 - Valores médios de spikes em bursts do neurônio LP e desvio padrão docontrole, durante e pós aspersões de Glu 10 mM. . . . . . . . . . . . . 63
Tabela 4.2 - Valores médios de duty cycle do neurônio LP e desvio padrão do con-trole, durante e pós aspersões de Glu 1 mM. . . . . . . . . . . . . . . . 70
Tabela 4.3 - Valores médios de spikes em bursts do neurônio LP e desvio padrão docontrole, durante e pós aspersões de 5-HT 10 mM. . . . . . . . . . . . . 76
Tabela 4.4 - Valores médios de duty cycle do neurônio LP e desvio padrão do con-trole, durante e pós aspersões de 5-HT 10 mM. . . . . . . . . . . . . . 81
Lista de Abreviaturas
5−HT Serotonina
AB Anterior Burster interneuron
aln anterior lateral nerve
BCP Burst Cycle Period
CoG Comissural Ganglion
CPG Central Pattern Generator
dvn dorsal ventricular nerve
Glu Glutamato
IBI Interburst Interval
IC Inferior Cardiac neuron
ion inferior oesophageal nerve
ISI Interspike Intervals
ivn inferior ventricular nerve
LP Lateral Pyloric neuron
lvn lateral ventricular nerve
mvn medial ventricular nerve
PD Pyloric Dilator
pdn pyloric dilator nerve
PY Pyloric neuron
pyn pyloric constrictor nerve
son superior oesophageal nerve
STG Stomatogastric Ganglion
stn stomatogastric nerve
STNS tomatogastric Nervous System
VD ventricular dilator
Sumário
1 Introdução . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 25
1.1 Centros Geradores de Padrão . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 27
1.2 Neurotransmissores e moduladores no CPG pilórico de crustáceos . . . . . . . . p. 28
1.2.1 Glutamato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 29
1.2.2 Serotonina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 30
2 Materiais e métodos experimentais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 31
2.1 Animais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 31
2.2 Dissecação do sistema nervoso estomatogástrico . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 32
2.3 Aparato experimental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 35
2.4 Eletrofisiologia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 36
2.5 Protocolo de estímulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 38
2.5.1 Programa Dynamic clamp . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 40
2.5.2 Microaspersões . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 43
2.5.3 Vantagens e limitações do método . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 46
3 Métodos de análise . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 49
3.1 Período de burst . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 49
3.2 Número de spikes por burst . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 51
3.3 Histograma de ISIs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 51
3.4 Mapa de primeiro retorno (mapa de retorno de ISIs) . . . . . . . . . . . . . . . . p. 52
3.5 Histograma de densidade . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 53
3.6 Histograma de IBIs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 54
3.7 Duty cycle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 55
3.8 Retorno de atividade . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 56
4 Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 59
4.1 Glutamato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 59
4.1.1 Inibição do ritmo pilórico e comportamento distinto quanto adaptação . . . . . p. 60
4.1.2 Influência glutamatérgica no número de spikes por burst . . . . . . . . . . . . p. 61
4.1.3 Neurônio LP mantém assinatura apenas em aspersões dinâmicas . . . . . . . . p. 64
4.1.4 Causas da mudança do ritmo pilórico não se limitam a parte ativa do burst do LP p. 66
4.1.5 Percentual de atividade diminui nas aspersões glutamatérgicas . . . . . . . . . p. 68
4.1.6 Comportamentos divergentes no retorno da atividade - rebote pós inibitório . . p. 70
4.2 Serotonina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 72
4.2.1 Perturbação no período dos bursts . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 73
4.2.2 Influência serotoninérgica no número de spikes por burst . . . . . . . . . . . . p. 74
4.2.3 Assinatura do LP durante aspersões serotoninérgicas . . . . . . . . . . . . . . p. 76
4.2.4 IBIs estão relacionados à mudança do ritmo pilórico . . . . . . . . . . . . . . p. 78
4.2.5 Aspersões serotoninérgicas aumentam o percentual de atividade . . . . . . . . p. 80
4.2.6 Diferença no retorno de atividade em aspersões dinâmicas e periódicas . . . . p. 82
5 Conclusão . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 85
REFERÊNCIAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 87
Apêndice A -- Injeção de picolitros via pressão . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . p. 91
25
1 Introdução
A percepção e interação de um indivíduo com o ambiente, é um comportamento emergente
da comunicação organizada de bilhões de células. Os estímulos externos, e como estes irão
coordenar o comportamento do indivíduo, são eventualmente codificados por células denomi-
nadas neurônios, através de pulsos de voltagem, chamados de potenciais de ação, disparos ou
“spikes”.
Toda essa atividade elétrica individual dos neurônios pode classificá-los em disparadores
endógenos ou silenciosos. Como o próprio nome já diz, os neurônios silenciosos, quando isola-
dos, não disparam potenciais de ação na ausência de estímulos. Já os neurônios ditos disparado-
res endógenos, podem apresentar um comportamento tônico, disparando potenciais de ação em
intervalos aproximadamente regulares; ou um comportamento em rajadas (também chamado
de comportamento em burst), disparando trens de potenciais de ação seguidos por pausas, nas
quais o potencial de membrana hiperpolariza (1), como mostra a figura 1.1.
Os neurônios podem apresentar sensibilidade à substâncias neurotransmissoras e modula-
doras, mudando seus padrões de disparo e até mesmo o padrão apresentado por redes neurais
completas. Os estudos que visam entender o comportamento dos neurônios, em redes ou isola-
damente, são diversos, indo do nível molecular ao comportamental.
Em sistemas nervosos de crustáceos, a técnica mais comum utilizada para entender o efeito
dessas substâncias, é o banho (3–8), que consiste em observar o comportamento de um sistema,
ou parte dele, quando exposto a concentrações constantes da droga, ignorando flutuações ou
padrões temporais de liberação. Porém, esta técnica não está sincronizada com a atividade do
próprio circuito que se estuda.
Durante o funcionamento normal de um sistema nervoso, a maioria dos neurônios não se
encontra submetida a concentrações constantes de neurotransmissores e moduladores. Cada
26
Figura 1.1 – Tipos de comportamentos elétricos que neurônios podem apresentar. (A) Neurônios si-lenciosos na ausência de estímulos não possuem potenciais de ação. (B) Neurônios comcomportamento tônico e (C) neurônios com comportamento em burst (2).
componente do sistema neural recebe pulsos de diferentes estímulos químicos, formado de
pequenas quantidades de substâncias liberadas de maneira descontínua e dependente do fun-
cionamento do próprio circuito. Tendo em vista este comportamento, muitas questões podem
ser levantadas, como por exemplo a relação entre o funcionamento do circuito e a dinâmica de
liberação de substâncias neuroativas como neurotransmissores e moduladores.
Para lidar com questões como esta, existem circuitos nervosos simples que apresentam com-
portamento in vitro muito similar ao in vivo e que permitem a implementação de um protocolo
dinâmico de estímulo químico dependente da atividade em tempo real do próprio circuito.
Nosso estudo teve como objetivo investigar duas questões centrais:
• se o padrão emergente do circuito realmente depende da dinâmica de liberação de subs-
tâncias;
• se diferentes dinâmicas de liberação podem produzir comportamentos distintos em uma
mesma célula.
27
1.1 Centros Geradores de Padrão
Caracterizando grande parte dos movimentos rítmicos de vertebrados e invertebrados, como
locomoção, respiração em mamíferos e até digestão mecânica em crustáceos, os centros gera-
dores de padrão (CPGs) são redes neurais capazes de produzir atividades rítmicas sem receber
informação extrínseca. Tanto em vertebrados quanto em invertebrados, o funcionamento dos
CPGs seguem os mesmos princípios gerais de funcionamento, com um circuito neural apresen-
tando predominância de sinapses inibitórias entre neurônios motores (9–12).
Os CPGs do sistema nervoso estomatogástrico de crustáceos (STNS), vêem sendo inten-
samente estudados por mais de 30 anos. Além de estarem presentes em um circuito de acesso
experimental relativamente fácil, são funcionais mesmo quando isolados, química ou fisica-
mente, do restante do sistema neural (13–15), sendo encontrados no gânglio estomatogástrico
(STG).
Assim como informação sensorial é codificada por neurônios em spikes, o movimento é
a tradução da atividade de um neurônio motor através da contração de células musculares.
O CPG pilórico do STG, responsável pela contração dos músculos que fazem a filtragem e
bombeamento do alimento para o intestino dos animais, possui a capacidade de fornecer in
vitro os mesmos padrões do sistema in vivo. Já o CPG gástrico, que coordena o movimento
dos dentes gástricos para a trituração do alimento na moela gástrica, tem muitas de suas células
silenciadas quando in vitro.
Em média, o STG é composto por 30 células neurais, das quais 14 compõem o CPG pi-
lórico. Esses neurônios são interconectados por sinapses químicas inibitórias glutamatérgicas
(com receptores ionotrópicos inibitórios de glutamato) e colinérgicas (com receptores muscarí-
nicos de acetilcolina) (16).
Os neurônios do CPG pilórico apresentam um comportamento em bursts com atividade em
fase, sendo este comportamento o responsável pelo ritmo trifásico periódico, de aproximada-
mente 1 segundo, apresentado pelo CPG.
28
O neurônio anterior burster (AB) é um interneurônio acoplado aos dois neurônios dilatado-
res pilóricos (PD), formando assim um grupo marcapasso. O regulado ritmo do CPG pilórico
consiste da inibição dos neurônios lateral pilórico (LP) e dos neurônios pilóricos (PY) causada
por este grupo marcapasso, forçando-os a dispararem em alternância com os neurônios dilatado-
res pilóricos (PD). O LP rebate a inibição antes do PY, o qual é novamente inibido. Finalmente,
os neurônios PY conseguem disparar, determinando assim o burst do LP . Já o neurônio car-
díaco inferior (IC), dispara simultaneamente com o burst do neurônio LP, enquanto o neurônio
dilatador ventricular (VD) geralmente dispara com os neurônios PY (12).
O neurônio LP é o único que faz sinapse química com neurônios do grupo marcapasso.
Além disso, o LP também é o único que recebe e faz sinapses de todos os tipos: recebe 9
sinapses inibitórias glutamatérgicas e 3 colinérgicas, faz 3 sinapses inibitórias glutamatérgicas,
além de sinapses elétricas retificadoras com os neurônios PY.
Se o ritmo pilórico depende fortemente das propriedades oscilatórias do neurônio AB, o
padrão de fase depende do momento em que o LP e o PY retornam da inibição (12). Por essas
razões citadas, escolhemos o neurônio LP como foco para nosso estudo, além de ser a célula do
nervo lateral pilórico (lvn) com maior amplitude de spikes em medições extracelulares.
1.2 Neurotransmissores e moduladores no CPG pilórico decrustáceos
O trabalho dos músculos pilóricos depende da atividade de fase entre os neurônios motores
que os controlam, assim como da fração em que as células neurais se encontram em atividade
(17). As células LP, PD e PY, possuem suas fases definidas por sinapses inibitórias mútuas.
Se essas fases forem alteradas de alguma forma, uma mudança na atividade muscular será
observada.
O circuito pilórico apresenta complexidade intrínseca, mesmo com um número reduzido de
neurônios e conexões. Quando conectadas, essas células são responsáveis pelo ritmo periódico
29
da rede, porém, quando isoladas sinapticamente, apresentam comportamento caótico (18). O
padrão rítmico do CPG é gerado através de mecanismos sofisticados de modulação, mudando o
comportamento muscular de acordo com o alimento ingerido, por exemplo. Mais de 100 tipos
de neuromoduladores atuam de forma complexa nesse sistema (19, 20).
A sensibilidade dos neurônios pilóricos quanto a estímulos com substâncias neurotransmis-
soras e moduladoras, pode acarretar em rápidas alterações do padrão de atividade. Quando há
aplicação exógena dessas substâncias nos circuitos do STG, os resultados podem ser mudanças
na frequência, relações de fase e número de spikes por burst em diferentes células, causando
reconfiguração da rede em diferentes padrões (4–6, 8, 17, 21–25).
Todos os neurônios do STG possuem receptores para múltiplos neurotransmissores e mo-
duladores. O neurônio LP possui receptores para mais de 10 dessas substâncias, muitos dos
quais convergem na mesma corrente de cátions (12).
1.2.1 Glutamato
Nos CPGs gástrico e pilórico de crustáceos, o glutamato (Glu) está presente nas sinapses,
possuindo ação inibitória (16). Este neurotransmissor inibe 4 dos seis tipos de neurônios do
circuito pilórico (AB, LP, PY, IC) (24). As sinapses inibitórias glutamatérgicas compõem a
maior parte de sinapses químicas envolvidas no processo de produção de padrões motores no
STG. Porém, apesar de muito dito sobre a ação inibitória do Glu, Krenz et al (7) sugeriram
que este neurotransmissor possui também ação metabotrópica excitatória através de receptores
metabotrópicos de Glu (mGluRs) no circuito gástrico.
A ação de outros neuromoduladores podem ainda influenciar nas sinapses glutamatérgicas.
Johnson e Harris-Warrick (21) descreveram alterações na ação inibitória de Glu causadas por
dopamina, serotonina e octopamina.
30
1.2.2 Serotonina
Conhecida como o hormônio do humor, a 5-hidroxitriptamina (5-HT, serotonina) é uma
monoamina encontrada no sistema nervoso de todos os organismos, influenciando funções fi-
siológicas, comportamentais e cognitivas (1). Em crustáceos, a 5-HT pode estar presente em
projeções serotoninérgicas neurais, e também em vias ascendentes, atuando em neurônios sen-
soriais e modulando o STG como hormônio (12, 26).
Há muito se sabe que a 5-HT influencia nos comportamentos motores produzidos por cir-
cuitos presentes no STG. Segundo Richards et al (27), a 5-HT exibe forte modulação na co-
municação nervo-músculo em lagostas adultas. O efeito de dose dependente da serotonina foi
descrito por Birmingham et al (28), onde em maiores concentrações, a serotonina causa dimi-
nuição da atividade no CPG gástrico.
Para Cruz-Bermúdez e Marder (29) e Flamm e Harris-Warrick (25), o efeito da 5-HT no
ritmo pilórico é relatado por um aumento da frequência do ciclo pilórico. Flamm e Harris-
Warrick (25), ainda completam descrevendo que o efeito da 5-HT é uma combinação de efeito
inibitório e excitatório em células isoladas.
31
2 Materiais e métodos experimentais
Estudos in vitro exigem que o STNS seja isolado de todo e qualquer outro tecido. Uma
boa parte desses estudos, também exige que os neurônios do STG sejam expostos, quer para
registros intracelulares ou aspersões de substâncias, as quais devem interagir com as sinapses
ou os canais presentes nos neurônios. O processo de dissecação, isolamento do tecido nervoso
e exposição dos corpos celulares é denominado preparação.
Apesar de variações interespecíficas, o STNS de crustáceos é funcionalmente invariante até
mesmo entre siris, caranguejos, lagostas e lagostins, apresentando o mesmo circuito essencial de
CPG. Neste estudo, realizamos experimentos onde os registros eletrofisiológicos extracelulares
foram obtidos de axônios dos neurônios do STG de Callinectes sapidus e Callinectes danae.
2.1 Animais
Siris adultos Callinectes sapidus e Callinectes danae, exemplificados na figura 2.1A, com
massa entre 200 e 300 g cada, foram adquiridos em Iguape, SP, e mantidos em água salobra arti-
ficial (sal Red Sea) a uma temperatura de aproximadamente 25◦C até a utilização experimental.
Através de um sistema de aquários desenvolvido especialmente para manter esses animais, re-
moção de proteínas (skimmer), renovação da água e biologia adequadas (bactérias nitrificantes),
conseguimos aumentar a qualidade de vida em cativeiro.
Em todos os procedimentos experimentais envolvendo animais, foram seguidos os princí-
pios éticos sugeridos pela Society for Neuroscience e pelo Comitê de Ética em Experimentação
Animal da Universidade Federal de São Carlos. Os experimentos foram planejados de modo a
usar o menor número de animais possível (n=2), assim como minimizar o estresse e os danos
32
causados ao animal em vida.
2.2 Dissecação do sistema nervoso estomatogástrico
O procedimento para a preparação experimental requer a utilização de um espécime por
vez, o qual é retirado do aquário e imediatamente envolto em gelo por 30 min. Este processo
permite que tanto o metabolismo quanto a atividade do sistema nervoso diminuam com a baixa
temperatura, fazendo com que o animal entre em um estado de “anestesia”. Todo o procedi-
mento de preparação pode ser dividido em duas fases: chamamos de fase grossa a remoção do
cérebro, esôfago, e estômago, composto de moela gástrica e piloro, do restante do animal. Já a
fase fina, corresponde ao isolamento do STNS de outros tecidos.
A dissecação (13) inicia-se com a remoção dos periópodes (patas e quelíceras) do animal
“anestesiado”. Com uma abertura dorso-frontal de aproximadamente 5 cm no exoesqueleto, é
possível retirar cuidadosamente a membrana que envolve o ambiente interno, deixando apenas
uma estreita faixa vertical central, como mostra a figura 2.1B. A artéria oftálmica faz a cir-
culação da hemolinfa do coração ao cérebro, e está fisicamente ligada a esta membrana e ao
STG. As conectivas circun-esofágicas são cortadas e, segurando a extremidade do esôfago, as
conexões com o intestino e hepatopâncreas se quebram normalmente. O conjunto (esôfago,
cérebro, estômago e piloro) é totalmente removido fazendo-se o corte da artéria oftálmica na
parte superior do estômago, antes desta chegar às proximidades do STG. Aqui encerra-se a fase
grossa da preparação.
Com um corte simétrico ântero-posterior e dois cortes laterais na direção dos ossículos,
abre-se o esôfago, estômago e piloro. Os dentículos da moela gástrica são cortados para que
o complexo adquira um formato plano na placa de dissecação. Todo o conjunto é lavado em
solução salina (em mM: 479 NaCl, 13 KCl, 14 CaCl2, 6 MgSO4, 4 Na2SO4, 5 HEPES e 5 TES
- todos adquiridos de Sigma Aldrich; pH 7.4) repetidas vezes para eliminar o suco gástrico. Por
fim, todo o complexo é fixado, usando alfinetes de entomologia, à placa de dissecação (contendo
cera de abelha e preenchida com solução salina), para início da dissecação fina, como mostra
33
Figura 2.1 – Esquematização da etapa experimental. (A) Visão dorsal de um siri Callinectes danae.(B) Uma abertura na parte dorsal do exoesqueleto permite a retirada do conjunto (esôfago,estômago, moela gástrica e piloro) onde se localiza o sistema nervoso estomatogástrico(STNS). (C) Vista dorsal do conjunto aberto, fixado com pinos de aço inox à placa comcera. Esta posição propicia o isolamento do STNS para posterior fixação em placa dePetri. (D) Nervos do STNS em placa de Petri preenchida com solução fisiológica. O STNScontém dois gânglios comissurais (CoG) e um gânglio esofágico (OG), responsáveis porfornecer neuromodulação ao gânglio estomatogástrico (STG). Neurônios do STG (central)são responsáveis por controlar os movimentos gástricos e pilóricos. Note a presença deeletrodos extracelulares isolados por vaselina. (E) STG após retirada da camada de tecidoconectivo (disheating) para exposição dos corpos celulares. (F) Esquema dos nervos egânglios que compõem o STNS para o presente estudo. Os registros eletrofisiológicosextracelulares foram feitos no nervo ventricular lateral (lvn).
34
a figura 2.1C. A preparação contém então a musculatura completa do estômago, os gânglios
supra-esofágicos, o STNS completo, as comissurais circun-esofágicas e o cérebro. A solução
salina é renovada a cada 15 minutos e mantida a uma temperatura de aproximadamente 15oC.
Nas etapas seguintes da dissecação, são utilizados um microscópio estereoscópico (Nikon
SMZ 1000), pinças e tesouras para microcirurgia. Na placa de dissecação, é feita a identificação
dos nervos do STNS e o isolamento dos mesmos. Os nervos estomatogástrico (stn) e ventri-
cular dorsal (dvn) são isolados até o ponto em que entram na artéria oftálmica. Removidos
os músculos, tecidos gordurosos e cortadas as terminações nervosas que não serão utilizadas, o
STNS é transferido para uma placa de Petri revestida por uma camada de elastômero de silicone
transparente (Silgard 184, Dow Corning, MI), e mantida com solução salina, exemplificado na
figura 2.1D. Os nervos então são fixados à placa com pequenos pinos de aço inox na mesma
posição relativa que se encontravam no animal vivo.
Ao final da dissecação fina, permanecem quatro gânglios: o STG e os gânglios anteriores
esofágico (do inglês oesophageal ganglion OG) e comissurais (do inglês comissural ganglion
CoGs), que conferem neuromodulação aos circuitos do STG. Os nervos isolados são os nervos
motores lateral ventricular (lvn), medial ventricular (mvn) e anterior lateral (aln); também são
isolados os nervos stn (que conecta os gânglios superiores aos STG), dvn e os nervos esofágicos
superior e inferior (son e ion), como mostra a figura 2.1F. Em seguida é feita uma limpeza mais
fina dos nervos do STNS, para permitir registros extracelulares da atividade neural, e a artéria
oftálmica é aberta para expor o gânglio STG.
O último passo consiste na remoção de uma fina camada de tecido conectivo que recobre
o gânglio STG, chamada disheating. Esta etapa é extremamente delicada e necessária para ter
acesso aos corpos celulares, facilitando a difusão dos neuromoduladores. A figura 2.1E de-
monstra um STG com os neurônios expostos. Todo o processo de preparação, do início da
dissecação grossa até o disheating, pode durar até 5 horas, dependendo da quantidade de gor-
dura presente e o tamanho do espécime, mas a qualidade da preparação só pode ser observada
após início do registro eletrofisiológico.
35
2.3 Aparato experimental
Para evitar que a preparação sofra qualquer tipo de perturbação mecânica (que poderia
fazer a ponta da pipeta de aspersão tocar nos corpos celulares e danificá-los), utilizamos uma
mesa pneumática, onde encontram-se um microscópio estereoscópico (magnificação 300×),
manipulador de micropipetas (Narishige modelo A20 no 8302, Japão) e bomba peristáltica,
além da placa de Petri contendo a preparação. O aparato experimental consiste também de
amplificadores e interfaces de aquisição, além de dois computadores.
Figura 2.2 – Procedimento experimental de aspersão de drogas ao STG de crustáceos após dissecação.Eletrodos extracelulares captam os sinais dos nervos motores, os quais são amplificados evisualizados em um sistema de aquisição de dados. O sinal é transmitido para o Dynamicclamp, o qual procura por um padrão previamente selecionado. Toda vez que o padrão éencontrado, um pulso digital é transmitido para o injetor de picolitros, que liberará soluçãocontendo o neurotransmissor através de micropipetas de vidro. A aspersão manual é feitaatravés de um botão, quando este é pressionado.
Através de eletrodos extracelulares conectados a amplificadores, o ritmo trifásico do CPG
pilórico é enviado para dois computadores por meio de conversores analógico digitais. Um dos
computadores é dedicado exclusivamente à aquisição dos dados, onde podemos visualizar o
sinal durante o experimento, enquanto o outro é dedicado ao protocolo do tipo Dynamic Clamp
36
(30), capaz de produzir pulsos digitais a partir da atividade neural in vitro em tempo real.
O Dynamic Clamp procura por um padrão pré selecionado (por exemplo, o 3o potencial de
ação de um burst do neurônio LP) e, através de um pulso digital, aciona o injetor de picolitros,
aspergindo assim uma solução contendo neuromodulador ou neurotransmissor. A aspersão se
faz por meio de uma micropipeta de vidro posicionada próxima ao gânglio STG. Esta micropi-
peta, preenchida com solução salina e o neuromodulador cujo efeito se deseja estudar, é ligada
ao injetor de picolitros, montado em nosso laboratório. O sinal de acionamento da válvula
que libera a solução neuromoduladora, é gravado juntamente com os demais sinais adquiridos,
assim, podemos ter uma referência para o real início da exposição do circuito neural ao neuro-
modulador, sem atrasos produzidos por software ou hardware. O injetor também possibilita a
aspersão de maneira manual, quando um botão é pressionado. Esta característica é bastante útil
quando procuramos pela região do gânglio mais sensível ao neuromodulador.
Construímos ao redor do STG uma parede de vaselina para evitar que as substâncias neu-
romoduladoras atinjam demais gânglios e nervos. Durante todo o procedimento experimental,
o gânglio STG é mantido em perfusão contínua de solução salina oxigenada, com um fluxo
de aproximadamente 2 ml/min, para rápida lavagem da droga (o volume de solução dentro do
poço de vaselina que contém o STG é de ∼ 0,2 ml). O procedimento experimental utilizado em
nosso estudo é exemplificado na figura 2.2.
2.4 Eletrofisiologia
Em nosso estudo, os potenciais de ação dos neurônios são registrados extracelularmente de
modo diferencial: cada eletrodo é formado por dois fios finos de aço inoxidável (φ = 0,1 mm),
um deles é posicionado junto aos nervos motores e o outro é posicionado afastado dos nervos,
na solução fisiológica, e usado como referência. A fixação mecânica é obtida pela inserção do
fio dentro da camada de elastômero que reveste a placa de Petri. Após a fixação, o fio posicio-
nado junto ao nervo é isolado do resto da solução com vaselina, como mostrado anteriormente
na figura 2.1D , enquanto a outra extremidade fica em contato com a solução salina, devida-
37
mente aterrada. O sinal obtido é a diferença de potencial elétrico entre essas duas extremidades.
Com amplificação adequada (10000×)(A-M systems 1700 diferencial AC amplifier), os sinais
de saída dos amplificadores são digitalizados por um módulo de aquisição de dados Digidata
1322 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA.) e enviados para um computador, onde podem ser
visualizados e gravados em disco com o programa Axoscope (Molecular Devices, Sunnyvale,
CA) para posterior análise.
As medidas extracelulares foram feitas com eletrodos posicionados no nervo lvn, o qual
enerva os principais músculos pilóricos, a uma distância de aproximadamente 3 cm do gânglio
STG. Neste nervo motor, passam axônios dos neurônios LP, PD e PY. Através das diferenças
em fase e amplitude do potencial de ação de cada célula, as atividades de diferentes neurônios
podem ser identificadas em um mesmo nervo. As células LP, PD e PY possuem atividade rít-
mica e diferenças de fase e de amplitudes bem características. O sinal extracelular do neurônio
LP é o mais fácil de ser identificado, pois possui amplitude tipicamente maior que as outras
células neurais. A figura 2.3 representa um trecho de uma série temporal real, onde é possível
identificar os potenciais de ação do neurônio LP. Entretanto, os neurônios PD e PY disparam
quase em fase e as amplitudes destas duas unidades se confundem no sinal extracelular. Infeliz-
mente, nesta espécie, não é possível dissecar o nervo lvn mais além, até onde bifurcam o pdn ou
o pyn (que contém respectivamente os axônios apenas do PD e do PY) por serem extremamente
finos.
Para a identificação das células PD e PY, são necessárias medições intracelulares, as quais
são inviáveis em nosso protocolo: o rápido fluxo da solução salina envolvendo o STG, devido à
perfusão, e as vibrações produzidas pelos pulsos de solução da micropipeta do injetor de picoli-
tros, podem causar uma movimentação relativa entre os eletrodos intracelulares e os respectivos
corpos celulares empalados, produzindo danos irreversíveis aos neurônios.
Com a leitura do sinal extracelular é possível saber se o circuito pilórico está com o ritmo
adequado e estável, indicando que a preparação foi bem sucedida e que podemos passar para a
próxima fase. É de extrema importância que, para a realização do protocolo proposto a seguir,
a preparação esteja intacta e com ritmo estável, pois somente assim teremos controle de que
38
Figura 2.3 – Trecho de uma série temporal real do nervo lvn mostrando bursts identificáveis do neurônioLP. Os potenciais de ação dos neurônios PD e PY se confundem no sinal extracelular.
as mudanças no ritmo pilórico foram causadas pela aspersão de neuromoduladores e não por
alguma mudança intrínseca, resultado de alguma lesão no STNS.
Quando a preparação pilórica é mantida em condições adequadas, os neurônios podem
manter-se em atividade rítmica por muitas horas. Em nosso estudo, foi importante a utiliza-
ção de preparações com ritmos pilóricos estáveis e com ausência de atividade gástrica, o que
perturbaria a periodicidade do ritmo pilórico. Apesar do protocolo proposto apresentar tempo
reduzido, foram utilizados apenas registros em que o ritmo no pré e pós aspersões se manteve
constante durante aproximadamente 15 minutos. Não é sempre que o ritmo pilórico é observado
em estabilidade por longos períodos de tempo, sendo muitas vezes reconfigurado abruptamente,
mudando a frequência ou contagem de spikes em cada burst. Contudo, é esperado um decai-
mento na qualidade da preparação após seguidas aspersões de neuromoduladores.
2.5 Protocolo de estímulo
A comunicação entre neurônios é feita através de mensagens químicas conduzidas por subs-
tâncias chamadas neurotransmissores e neuromoduladores. Muitos estudos utilizam a técnica
de banho para simular, em primeira aproximação, os efeitos dessas substâncias nos sistemas
39
nervosos e entender seus mecanismos de ação. Para tornar este método mais realista, mime-
tizando o aspecto dinâmico da liberação das drogas que um neurônio recebe de outro in vivo,
propusemos a implementação de um protocolo de estímulo em tempo real que fosse depende
do padrão produzido pelo próprio CPG pilórico.
Baseado no método de Dynamic clamp (30), desenvolvemos uma técnica de eletrofisiologia
que, através da identificação de padrões produzidos por neurônios biológicos, produziria pulsos
digitais em momentos determinados pelo próprio circuito neural. Entretanto, o Dynamic clamp
conseguiria apenas identificar o instante de ocorrência de um evento, mas não a liberação de
substâncias. Nossa proposta foi acoplar este método a um injetor de picolitros, e assim produzir
padrões de aspersão de neuromoduladores dependentes da própria atividade do circuito pilórico.
O sinal captado extracelularmente no nervo motor lvn, é amplificado e digitalizado no com-
putador com o Dynamic clamp, obtendo-se uma série temporal. O Dynamic clamp detecta os
spikes e bursts de um determinado neurônio, presente na série temporal, através de um algo-
ritmo baseado em limiares (de amplitude e de tempo) e derivadas discretas. Simultaneamente,
o programa procura por um evento previamente selecionado (primeiro spike de cada burst do
neurônio LP, por exemplo) e envia um pulso digital ao injetor de picolitros cada vez que o
evento é encontrado, produzindo um padrão de aspersão em tempo real.
Durante a etapa de aspersão síncrona ao padrão do CPG, a frequência de disparos dos
neurônios muda e o sistema se estabiliza em um novo regime de oscilação. Medimos então a
frequência aproximada na qual o sistema se adaptou durante esta fase de aspersão dinâmica.
Com o auxílio de um gerador de funções conectado ao injetor, a nova frequência é utilizada
para gerar estímulos periódicos para o injetor de picolitros, e não mais dependentes do padrão
gerado pelo CPG pilórico. Depois dessa fase de aspersão assíncrona, o STNS passa por um
período de repouso, correspondente ao controle pós aspersões.
Em suma, o protocolo de estímulo proposto consiste em quatro períodos de aquisição de
3 min cada um, separados por 2 min de intervalo de descanso: um período inicial de controle,
seguido de um período com aspersão síncrona com o próprio CPG (aspersões a cada 1o, 2o, 3o
ou 4o spikes do LP), um período com aspersões assíncronas ao padrão (frequência aproximada
40
de uma possível adaptação do STNS na aspersão dinâmica - anterior), e um período de controle
pós estímulos, como mostra a figura 2.4.
Figura 2.4 – Exemplificação do protocolo utilizado.
O período para aspersão deve permitir que o sistema neural se estabilize, seja em uma nova
frequência, ou naquela apresentada antes do início das aspersões. Para garantir que os efeitos
observados sejam exclusivamente de cada aspersão, optamos por um período de descanso de 2
min entre cada fase do protocolo. Através da perfusão, durante o período de descanso, tentamos
remover qualquer molécula de neuromodulador restante do método de aspersão anterior.
2.5.1 Programa Dynamic clamp
Através de simulações computacionais baseadas em sinais eletrofisiológicos medidos em
tempo real, o método de Dynamic clamp (30) permite introduzir artificialmente condutâncias
sinápticas ou de membrana em neurônios biológicos (31, 32). Entretanto, essa técnica de eletro-
fisiologia não se limita apenas a condutâncias. Em nosso caso, foi implementado um algoritmo
que procura por padrões de disparos, em spikes nos sinais extracelulares, e produz um pulso di-
gital quando o padrão é encontrado, acionando um injetor de picolitros semelhante a um picos-
pritzer R©. Assim, ao invés de introduzir condutâncias, implementamos um protocolo dinâmico,
e dependente da atividade, para a aspersão de neuromoduladores em neurônios biológicos.
O programa utilizado do tipo Dynamic clamp (desenvolvido por Fernando Carrón) foi im-
plementado em linguagem C++ em uma plataforma Ubuntu RT-Linux Xenomai. Tal programa
é dividido em duas partes, as quais permitem procurar por padrões de disparo dos neurônios e
acionar, em tempo real, o injetor de picolitros assim que o padrão é encontrado. Através de uma
placa ADC da marca National (PCI 6143), o computador com instalação do Dynamic clamp
recebe o sinal elétrico, presente no nervo lvn, já amplificado e transformado pela placa ADC
41
em uma série temporal de valores de tensão {Vi}, adquiridos sequencialmente a intervalos de
∆t = 100 µs (taxa de aquisição de 10 kHz).
A primeira parte do programa calcula a derivada dos potenciais de ação recebidos para
escolha de um valor de limiar, que seja capaz de isolar os spikes de um dos neurônios presentes
no sinal, e que será utilizado na fase seguinte. O programa calcula a derivada discreta {di} da
série temporal, di = (Vi+1 −Vi)/∆t, assim como a média entre n pontos da série di, sendo n
igual a três o ponto de partida, podendo ser modificado de acordo com o nível de ruído presente
e a eficácia da detecção dos spikes. A taxa de amostragem utilizada na aquisição analógica
( f = 10 kHz), deve ser informada para gerar a janela de observação a partir da aquisição (t = 10,
em segundos). Por exemplo, com t igual a 10, será calculada e armazenada em disco a série
temporal da derivada durante 10 segundos de aquisição de dados, a partir do instante de início
da execução do programa. Os valores dos parâmetros passados para esta primeira parte do
programa foram os mesmos para todos os experimentos, porém, podem ser mudados em cada
aquisição se necessário. O melhor valor de limiar da derivada para a detecção dos spikes é
escolhido através da análise visual do gráfico da derivada obtido a partir dos dados armazenados
usando o software gnuplot (http://www.gnuplot.info/).
A segunda parte do programa implementa o protocolo de aspersão em tempo real e ne-
cessita que seis parâmetros de entrada sejam informados: c, p, k, T , I, f . O parâmetro c é
responsável pela característica do evento a ser procurado (por exemplo, se queremos que o in-
jetor de picolitros seja acionado no 3o spike de cada burst do neurônio LP → c = 3). Cada vez
que o evento escolhido é encontrado, um pulso digital de duração p segundos é mandado para
acionar o injetor de picolitros. O instante de ocorrência de um spike é identificado quando a
média dos últimos k pontos da série temporal da derivada (k = 3) ultrapassa o valor de limiar T
(em V/s), escolhido com o auxílio da primeira parte do programa. Para identificar se os spikes
fazem parte de um mesmo burst ou não, um limite máximo de intervalo de tempo entre spikes
deve ser informado (I). Se esse valor for ultrapassado, o último spike detectado é considerado
como o início de um novo burst. É importante lembrar que a taxa de amostragem (em Hz) a ser
utilizada na aquisição de dados ( f = 10 kHz) também deve ser informada.
42
Figura 2.5 – Ilustração de potencial de ação. (A) Trecho de uma série temporal real em aquisição extra-celular contendo quatro spikes do burst do neurônio LP, encontrado no CPG pilórico. (B)Spike do LP, com duração média de 6 ms.
Para identificar os potenciais de ação do neurônio LP, exemplificados na figura 2.5, escolhe-
mos um valor de limiar que somente a derivada da atividade desta célula consegue ultrapassar.
O momento de liberação da solução contendo neuromodulador, é estabelecido quando a con-
tagem de spikes atinge o número estipulado (c). Por exemplo, com c = 4, um pulso digital é
enviado ao injetor de picolitros toda vez que o 4o spike de cada burst for encontrado. A largura
do pulso digital (em segundos) utilizada neste trabalho foi p = 0,01s, podendo ser ajustada de
acordo com o injetor de picolitros utilizado.
Uma outra opção presente nas duas partes do programa, é a inversão do sinal de entrada
analógica através de um comando i. Colocando apenas a letra “i” na linha de comando, é
possível inverter o sinal de entrada e ter as partes positivas transformadas em negativas e as
negativas transformadas em positivas. A visualização do “novo sinal” seria como uma rotação
de 180o no eixo das ordenadas do sinal original. Esta opção é necessária pois o sinal extracelular
não é simétrico, sendo as vezes mais fácil separar os potenciais de ação de dois neurônios na
parte positiva ou na parte negativa. Vale lembrar que, uma vez utilizada a inversão na primeira
parte, também deve-se, obrigatoriamente, utilizar a inversão na segunda parte do programa.
43
2.5.2 Microaspersões
A técnica de microinjeções pressurizadas é muito utilizada para aplicar pequenas quantida-
des controladas de substâncias dentro das células. O método utiliza um aparelho que permite a
injeção de picolitros de solução de modo reprodutível (33). Através de pequenos pulsos de ar
de mesma largura e com mesma pressão, uma quantidade igual de solução pode ser liberada,
mesmo após um grande número de injeções. Entretanto, esta técnica não se limita a microinje-
ções intracelulares, possibilitando aspersões extracelulares.
O injetor de picolitros utilizado (34), apêndice A, possui 4 parâmetros que podem ser ajusta-
dos de acordo com o tipo de célula e solução utilizada. Em nosso estudo, definimos os mesmos
parâmetros tanto para aspersões glutamatérgicas quanto para aspersão serotoninérgicas.
• Pressão do pulso: 3 bar
• Tempo de duração da aspersão: 20 ms
• Tempo de liberação da pressão restante para atmosfera: 15 ms
• Delay entre aspersão e liberação da pressão restante: 5 ms
Este aparelho controla eletronicamente duas válvulas do tipo solenóide (tempo de abertura
≥ 2 ms), usadas em sistemas de injeção eletrônica de combustíveis em automóveis. Uma das
válvulas conecta momentaneamente uma micropipeta de vidro a uma entrada de ar sob pres-
são (1 bar < P < 2 bar), provocando um pequeno fluxo de solução com neuromodulador, por
exemplo, através da ponta da micropipeta. A segunda válvula abre para a atmosfera, liberando
a pressão remanescente na micropipeta e interrompendo o fluxo. Através do ajuste da duração
da abertura de cada solenóide pode-se controlar a quantidade de solução com substância neu-
romoduladora que é aspergida a cada pulso do injetor de picolitros, de maneira reprodutível e
confiável a partir de quantidades pequenas como alguns picolitros (34). A figura 2.6 demonstra
o pulso para liberação extracelular de solução.
44
Figura 2.6 – Aspersão real no 4o spike do neurônio LP utilizando o injetor de picolitros. A duraçãoda aspersão corresponde ao tempo de pulso pressurizado. A abertura para a atmosferacorresponde a liberação da pressão restante do bico injetor. Pode-se observar que o inícioda aspersão ocorre quando o padrão é detectado, em tempo real.
Micropipetas para aspersão
As micropipetas de vidro para liberação extracelular de substâncias foram produzidas atra-
vés do aquecimento de capilares sem filamento interno (Borosilicate Glass without filament,
O.D.: 1.2 mm, I.D.: 2 mm, 10 cm length) puxadas por um puxador de micropipetas P-97 (Fla-
ming/Brown Micropipette Puller - Sutter Instrument Co. - Programa: P = 500, Heat = 483, Pull
= 0, Vel = 140, Time = 100). A pipeta criada com este equipamento possui uma ponta dema-
siadamente fina (∼ 1 µm), que impede a passagem de solução através da técnica de aspersão
por pressão. Para que a ponta apresentasse diâmetro de aproximadamente 25 µm, permitindo a
aspersão controlada, 1/4 da ponta produzida foi quebrada. O método utilizado para esta quebra
consistiu em posicionar em cruz de duas pipetas e pressionar uma contra a outra até o ponto
de quebra. Para se ter controle do volume de solução aspergido, a micropipeta pode ser cali-
brada fazendo-se marcas de 1mm e observando quantas micro-aspersões eram necessárias para
eliminar 1 mm de solução.
Em nosso estudo, as micropipetas estavam acopladas a um manipulador, o que permitiu a
45
Figura 2.7 – Demonstração do posicionamento da micropipeta. (A) Esquema da placa de Petri com oSTNS, mostrando o posicionamento da micropipeta, preenchida com neuromodulador emsolução, próximo ao gânglio STG. O excesso de neuromodulador, assim como o excessode solução fisiológica dentro da parede de vaselina, é sugado por uma seringa, componenteda perfusão. (B) Imagem de um experimento real, com micropipeta e seringas de perfusão.
procura da melhor região de ação do neuromodulador. A figura 2.7 demonstra o posicionamento
da micropipeta. Ao redor do gânglio STG, foi feita uma parede de vaselina capaz de impedir
a difusão, para outros gânglios, da solução contendo o neuromodulador. O posicionamento da
micropipeta de vidro pode variar de acordo com o posicionamento das células e suas sinapses.
Soluções de neuromoduladores
O Glu está presente nas sinapses inibitórias do CPG pilórico. O interneurônio AB, compo-
nente do grupo marcapasso, inibe todos os neurônios do circuito (com exceção do PD) através
de sinapses glutamatérgicas, como mostra a figura 2.8. Portanto, a aspersão de solução contendo
este neurotransmissor é especialmente interessante.
Para a solução glutamatérgica, utilizamos L-Glutamic acid (Sigma - G1251) diluído em
solução salina. A solução de 10 mM de Glu foi congelada e mantida em refrigeração a -15◦C
até sua utilização.
O neurônio LP possui receptores para mais de 10 neurotransmissores e moduladores, dentre
eles o receptor para a 5-HT, como mostra a figura 2.9. Ainda que a utilização desse neuromodu-
lador usualmente seja feita a fresco, decidimos investigar sua possível ação metabotrópica em
solução já preparada e congelada de Serotonin creatinine monohydrate (Sigma - H7752) diluída
46
Figura 2.8 – Circuito pilórico completo indicando as sinapses inibitórias glutamatérgicas (círculos pre-enchidos), colinérgicas (círculos sem preenchimento), sinapses elétricas (símbolo de resis-tor) e elétricas retificadoras (símbolo de diodo).
em solução salina. A solução de 10 mM de 5-HT era mantida em refrigeração a -15◦C até a
utilização experimental.
Figura 2.9 – Neurônio LP em C. borealis com receptores para mais de 10 neurotransmissores e modu-ladores (12).
2.5.3 Vantagens e limitações do método
A metodologia desenvolvida se mostra útil e conveniente para estudos onde procura-se
chegar o mais próximo possível de situações ocorridas in vivo. Maneiras diferentes de se apre-
sentar um mesmo estímulo podem acarretar respostas bem distintas, como a adaptação a uma
nova frequência, observada apenas em um dos tipos de aspersão (dinâmica), ou conservação da
assinatura característica de cada neurônio do circuito pilórico. As principais vantagens desta
nova metodologia são:
47
• liberação de neuromoduladores dependente do funcionamento do circuito neural,
• possibilita estudo com neurotransmissores e moduladores variados,
• propicia aspersões de diferentes neuromoduladores ao mesmo tempo ou com pequeno
espaço de tempo entre eles.
Uma das grandes vantagens desta nova metodologia, é a liberação de neuromoduladores
de acordo com o funcionamento do sistema neural. A técnica de banho utilizada por muito
pesquisadores (3, 5, 6), limita o estudo a uma exposição estacionária do sistema nervoso a essas
substâncias, muito diferente do que realmente ocorre in vivo.
Contudo, este método ainda apresenta algumas limitações, apesar de todo o cuidado tomado
para torná-lo o mais preciso possível, pois:
• identificação da região/célula onde ocorre a aspersão é dificultada,
• proporciona somente medidas extracelulares.
A obtenção de sinais intracelulares para identificação dos neurônios do STG, necessita de
micropipetas posicionadas no interior de cada corpo celular. Este procedimento é extremamente
delicado e qualquer variação brusca no nível de solução salina ao redor do gânglio, ou até
mesmo a pressão com que o neuromodulador é aspergido, podem ocasionar o rompimento da
membrana celular.
48
49
3 Métodos de análise
Neste capítulo descrevemos os métodos utilizados para a análise, com o objetivo de eviden-
ciar as diferentes respostas do circuito neural de acordo com a forma de aspersão. O software
MATLAB (The Mathworks Inc., Natick, MA) foi utilizado para análise dos dados e construções
gráficas.
3.1 Período de burst
Substâncias neuromoduladoras podem alterar rapidamente o padrão de atividade apresen-
tado pelo circuito. Por exemplo, um CPG que apresenta funcionamento com frequência pró-
xima a 1 Hz, pode ter sua atividade aumentada ou diminuída de acordo com o neuromodulador
liberado próximo ao STG.
Nossa primeira análise investiga mudanças no período do ciclo de burst (BCP, do inglês
burst cycle period) (5). Em nosso estudo, o BCP foi obtido calculando-se o intervalo de tempo
entre os primeiros spikes de cada burst do neurônio LP, como mostra a figura 3.1.
Os instantes de ocorrência de cada spike são detectados,
{ti}= {t1, t2, . . . , tn} (3.1)
onde t1 < t2 < .. .< tn. Em seguida, calcula-se os intervalos interspikes (ISI, do inglês interspike
interval), que correspondem aos eventos consecutivos entre spikes dentro de um burst, figura
3.2.
50
ISIi = ti+1− ti (3.2)
Figura 3.1 – Trecho de uma série temporal real do nervo lvn mostrando o n-ésimo e n-ésimo+1 burstsdo neurônio LP. O tempo entre primeiros spikes corresponde ao período do ciclo de burst(BCP) (5).
Ao calcularmos todos os ISIs, obtemos também o tempo entre o último spike de um burst e o
primeiro spike do burst seguinte, o que chamamos de IBIs (do inglês interburst interval), longos
ISIs entre bursts. Para obtenção dos valores de BCP, precisamos isolar apenas os instantes de
ocorrência de cada primeiro spike de burst, Tp. Consideramos apenas valores que ultrapassem
os IBIs, os quais dependem da atividade que o sistema apresenta em condições de controle.
Uma vez encontrados os instantes de ocorrência {Tp,i}, calculamos o período de cada burst
através da diferença entre e Tp,i+1 e Tp,i.
BCPi = Tp,i+1 −Tp,i (3.3)
Podemos então observar se o sistema neural se adapta ou não à uma nova frequência após
aspersão de neuromodulador, e se essa adaptação é igual para formas diferentes de aspersão, ou
seja, síncronas e assíncronas.
A aspersão de um neuromodulador pode alterar não só o período de burst, mas desencadear
51
Figura 3.2 – Trecho de uma série temporal real do nervo lvn mostrando o n-ésimo burst do neurônio LP.Intervalos interspikes (ISIs) são definidos por eventos consecutivos (spikes) dentro de umburst.
uma série de outras mudanças. Esta adaptação a uma nova frequência pode alterar o número de
spikes presentes em cada burst?
3.2 Número de spikes por burst
A quantidade de spikes presentes em cada burst é um dos fatores que caracterizam o ritmo
pilórico. Quando se estuda a ação de neuromoduladores e são observadas mudanças nos perío-
dos de burst, intuitivamente pensa-se no aumento ou diminuição da quantidade de spikes.
Com os instantes de cada spike já calculados, conseguimos observar se a média de spike
por burst se alterou, e se essa alteração está relacionada com a forma de aspersão.
Se o número de spikes se modifica, alterar-se-iam também os tempos entre eles, ou seja, os
ISIs?
3.3 Histograma de ISIs
Os neurônios motores são capazes de codificar a informação contida na microestrutura dos
padrões de disparo, incluindo uma sutil variação dos tempos de spikes intraburst (32). Esses
52
eventos consecutivos entre spikes dentro de um burst são chamados de ISIs, como descrito
anteriormente. Calculando a diferença entre instantes de disparo consecutivos, obtemos os
valores de ISIs para a realização do histograma.
3.4 Mapa de primeiro retorno (mapa de retorno de ISIs)
A distribuição dos ISIs forma padrões complexos que são típicos de cada neurônio. Os pa-
drões apresentados pelos neurônios pilóricos, são chamados de assinaturas e são muito similares
para um mesmo neurônio entre diferentes preparações, e até para o mesmo tipo de neurônio em
espécies diferentes. Entretanto, essas assinaturas são deveras distintas entre neurônios particu-
lares (5).
O mapa de primeiro retorno consiste na relação entre sucessivos ISIs, ou seja, um ISI contra
o ISI anterior (ISIi+1 × ISIi). Um exemplo seria plotarmos o ISI do segundo e terceiro spike
(ISI2) contra o ISI do primeiro e segundo spike (ISI1). Em seguida, movemos um spike dentro
do burst, repetindo o procedimento para os demais spikes, figura 3.3. Os pontos obtidos corres-
pondem à pares consecutivos de ISIs entre três spikes adjacentes. Graficamente, estes mapas
apontam a dependência dos ISIs e a precisão de padrões de spikes recorrentes (35).
Figura 3.3 – Trecho de uma série temporal real do nervo lvn mostrando o n-ésimo burst do neurônio LP.A relação entre ISIs sucessivos é demonstrada graficamente plotando um ISI contra o ISIanterior, ou seja, ISIi+1 × ISIi.
Quando traçamos uma linha diagonal no mapa de retorno de ISIs e o dividimos em duas
53
metades, observamos que pontos na metade inferior direita representam um ISI curto seguido
de um ISI longo (ISIi+1 > ISIi), já pontos que se encontram na metade superior esquerda,
correspondem a ISI maior seguido de um ISI menor (ISIi+1 < ISIi). A célula LP apresenta um
padrão chamado de “cometa”, onde a maioria dos pontos concentram-se acima da linha (5), ou
seja, a maioria dos ISIs são maiores que seus ISIs anteriores.
Se os valores de ISIs forem modificados, mas a dependência entre eles for mantida, ou
seja ISIi+1 > ISIi, a precisão entre spikes recorrentes será alterada? Essa possível alteração
originará mudanças nos pontos de distribuição da densidade? Ou, obrigatoriamente, a precisão
entre spikes recorrentes também será mantida?
3.5 Histograma de densidade
Uma célula neural do circuito pilórico pode ter alterado os valores de ISIs mas ter mantida
a relação de dependência entre eles. Entretanto, se a precisão de ocorrência dos spikes for
alterada, sua assinatura será perdida.
Para caracterizar a distribuição local de pontos do mapa de retorno, foram calculados os
histogramas de densidade. O cálculo consistiu em uma definição de valor mínimo e máximo,
onde o valor mínimo corresponde ao ponto de menor valor do mapa de retorno e o valor má-
ximo equivale ao maior valor do ponto no mapa de retorno, desde que este seja menor que 0,1
segundos, em x:y. Fixamos a quantidade de bins em 3.000, portanto, cada bin tem aproximada-
mente 0,5 ms × 0,5 ms. Esses histogramas apresentam gradiente de cor do azul, passando pelo
amarelo e depois para o vermelho, onde os pontos de acumulação possuem cores mais próximas
ao vermelho. Separando as zonas de acumulação das áreas de densidade igual a 0 (zero), foi
utilizado um fundo preto.
A relação e distribuição dos ISIs e a quantidade de spikes por burst, são características de
atividade neural. O BCP, visto na seção 3.1, é formado tanto por períodos de atividade quanto
por períodos de inatividade de um neurônio. Uma vez o período de burst alterado, seria a parte
54
ativa a única responsável por esta modificação?
3.6 Histograma de IBIs
O ritmo do neurônio LP é ditado pela inibição glutamatérgica do interneurônio AB. O
período de inibição de um neurônio pilórico, onde este encontra-se inativo, é denominado de
IBI, exemplificado na figura 3.4.
Figura 3.4 – Trecho de uma série temporal real do nervo lvn mostrando o n-ésimo e n-ésimo+1 bursts doneurônio LP. O tempo entre o último spike de um burst e o primeiro spike do burst seguintecorresponde ao intervalo interburst (IBI).
Similar ao cálculo de primeiros spikes, Tp, os instantes de ocorrência dos últimos spikes,
Tu, são encontrados. Os IBIs foram calculados a partir da diferença entre e Tp,i+1 e Tu,i.
IBIi = Tp,i+1 −Tu,i (3.4)
Se mudanças nos ISIs e nos IBIs são observadas, será que a relação entre eles, ou seja, a
porcentagem de cada um dentro do período de burst, continuará a mesma?
55
3.7 Duty cycle
Definido como a fração do ciclo durante a qual um neurônio se encontra ativo, o duty cycle
está intimamente ligado ao trabalho de fases das células de um circuito. Se algum neurônio
dispara de modo diferente, ele pode ter sua ação inibitória aumentada ou diminuída, alterando
o comportamento de fase entre as células do circuito. O duty cycle de neurônios em uma rede
contribui para a geração de comportamentos específicos, como determinar quais músculos irão
contrair, quando e por quanto tempo (17).
Figura 3.5 – Trecho de uma série temporal real do nervo lvn mostrando o n-ésimo e n-ésimo+1 burstsdo neurônio LP. A figura mostra o BCP, calculado anteriormente, e o tempo de burst, Tb,que compreende o tempo entre o primeiro e o último spike de um mesmo burst.
Com base nas variáveis Tp e Tu, podemos calcular o tempo de cada burst, Tb, que corres-
ponde ao intervalo entre primeiro e último spike de um mesmo burst. O duty cycle (D) é a
relação entre Tb e BCP (P), como visto na figura 3.5.
D =Tb
P(3.5)
Até agora, todas as análises foram baseadas no padrão de atividade apresentado pelo neurô-
nio LP, observando possíveis alterações no ritmo pilórico e comportamento da célula. Entre-
tanto, em nenhuma análise houve relação entre o ritmo pilórico e os instantes de aspersão. Será
56
que após uma aspersão de um neuromodulador, o circuito pilórico necessita do mesmo intervalo
de tempo para retornar a atividade quando as aspersões são dinâmicas e periódicas?
3.8 Retorno de atividade
Análises de período de burst, ISIs, IBIs, e duty cycle, são comumente conhecidas por pes-
quisadores que utilizam o STNS como base de estudo. Entretanto, com o desenvolvimento de
uma metodologia, viu-se necessária uma nova forma de análise, onde relacionava-se o compor-
tamento do circuito pilórico e as aspersões.
Figura 3.6 – Trecho de uma série temporal real do nervo lvn mostrando o n-ésimo e n-ésimo+1 burstsdo neurônio LP. A figura mostra o Tap, que corresponde ao tempo necessário para que oneurônio dispare o próximo burst após uma aspersão.
O retorno da atividade, Tap corresponde ao tempo necessário para que o neurônio dispare o
próximo burst após uma aspersão de neuromodulador, seja ela síncrona ou assíncrona com seu
comportamento. Identificado o instante de cada aspersão, Ta, calcula-se a diferença entre uma
aspersão e o próximo primeiro spike, Tp, como mostra a figura 3.6.
O padrão apresentado na análise de Tap, nos mostra não só o efeito do neuromodulador
utilizado para aspersão (inibidor ou excitatório), mas também o tempo de duração do efeito
57
deste e a influência da forma com que esse neuromodulador é apresentado ao circuito pilórico.
58
59
4 Resultados
Neste capítulo apresentamos os resultados obtidos com as análises de BCP, número de spike
por burst, ISIs, IBIs, duty cycle e tempo para o retorno de atividade após uma inibição (rebote
pós-inibitório). Os dados refletem o comportamento do neurônio LP perante dois tipos de as-
persões: dinâmica (dependente do próprio CPG pilórico) e periódica. Inicialmente aplicamos o
protocolo dinâmico e dependente da atividade do circuito e esperamos que um novo ritmo fosse
estabelecido. Então, utilizamos a frequência média de burst desse novo ritmo na aspersão pe-
riódica, para que a quantidade média de droga aspergida no regime estacionário fosse a mesma
nos dois casos. As aspersões glutamatérgicas e serotoninérgicas foram feitas no neuropil do
gânglio STG e realizadas experimentalmente em redes intactas.
4.1 Glutamato
Nesta seção apresentamos a resposta do LP para aspersões de Glu 10 mM em um CPG
pilórico com frequência de burst de 2 Hz antes dos experimentos. Os registros exibidos são
de aspersões dinâmicas no 1o e 4o spikes, e periódicas a cada 1 segundo. O valor da aspersão
periódica foi escolhido por uma aproximação da frequência de adaptação do CPG durante a exe-
cução das aspersões dinâmicas conforme descrito anteriormente. As aspersões síncronas com
o 2o e 3o spikes foram omitidas por apresentarem comportamentos próximos aos das aspersões
no 1o e 4o spikes, respectivamente.
60
4.1.1 Inibição do ritmo pilórico e comportamento distinto quanto adap-tação
Muitas células do CPG pilórico possuem suas fases definidas por sinapses inibitórias mú-
tuas. Se esta fase relativa for alterada de alguma forma, poderá implicar em uma mudança na
atividade de burst do neurônio individual. O efeito inibitório do glutamato é claramente obser-
vado em todas as aspersões, implicando em um aumento do BCP do neurônio LP, entretanto o
ritmo do CPG se comporta de modo distinto em aspersões dinâmicas e periódicas, como mostra
a figura 4.1.
Em condições de controle, o circuito apresentava valor de BCP inicial estável em 0,5 s,
como exibido na figura 4.1D. Um aumento (diminuição) deste valor significa uma redução
(aumento) da frequência pilórica.
Durante os primeiros 20 segundos, nas aspersões dinâmicas no 1o spike (Fig. 4.1A) e no 4o
spike (Fig. 4.1B) do LP, observamos que o BCP apresenta instabilidade. Nestas condições, não
há um valor médio que seja representativo. As aspersões síncronas com o 1o spike, espalham
de modo aparentemente aleatório os valores de BCP em uma faixa entre 0,25 s e 1,5 s. Já nas
aspersões dinâmicas a cada 4o spike, o BCP é inicialmente espalhado em uma faixa mais alta,
de 1s a 2,5 s e vai lentamente tendendo a um valor médio próximo de 1 segundo.
Apesar dos comportamentos instáveis iniciais um pouco diferentes, as aspersões dinâmi-
cas propiciaram uma resposta semelhante e estável após 20-30 s. Com valores de BCP agora
próximos a 1 segundo, as aspersões síncronas com o 1o e 4o spikes induzem uma regularização
do ritmo pilórico à uma nova frequência. Mesmo com os valores de BCP da aspersão a cada
1o spike apresentando menor regularidade do que os valores de BCP para aspersões a cada 4o
spike, podemos caracterizar este comportamento como uma queda de frequência de 2 Hz para
∼1 Hz.
Enquanto aspersões dinâmicas de Glu propiciaram um aumento do BCP e uma adapta-
ção do CPG a uma nova frequência razoavelmente estável, a aspersão periódica produz um
efeito distinto. Com aspersões a cada 1 segundo (Fig. 4.1 C, mesmo ritmo médio de asper-
61
sões e mesma quantidade média de droga), o neurônio LP é fortemente inibido durante os 20
segundos iniciais, impedindo que o circuito apresente um padrão de atividade. Durante os 3
minutos seguintes, a atividade do LP é retomada, entretanto, sem apresentar adaptação a uma
nova frequência característica de burst. Os valores de BCP não apresentam regularidade, com-
preendendo a faixa desde 0,5 s a 2s, aproximadamente, como mostra a figura 4.1C, mesmo com
as aspersões periódicas ocorrendo na mesma frequência (1 Hz) em que o CPG pilórico havia se
adaptado em aspersões dinâmicas.
Durante o controle pós-aspersões, ilustrado na figura 4.1E, o CPG pilórico volta a apresen-
tar seu ritmo característico bem regular com frequência de burst um pouco inferior aos 2 Hz
do controle inicial (Fig. 4.1D). Assim demonstra-se que o efeito das aspersões é reversível e
que o resultado não clusterizado obtido com a aspersão periódica não é decorrente de danos
no sistema, mas sim das perturbações que essas aspersões assíncronas causam na rede. A me-
nor frequência de burst no período de controle pós-aspersões é normal, tendo em vista que a
preparação já se encontrava in vitro por mais de 8 horas.
Nossos resultados corroboram os de Cleland e Selverston (16, 36) e Marder (24) quanto ao
efeito inibitório do Glu. Em ambos os tipos de aspersões, o efeito foi de aumento de BCP, o que
caracteriza uma diminuição, e consequentemente uma inibição, do ritmo pilórico. Por outro
lado, a análise de BCP evidenciou a existência de respostas diferentes para aspersões dinâmicas
e periódicas.
4.1.2 Influência glutamatérgica no número de spikes por burst
Na seção anterior, mostramos que aspersões de Glu causam alterações no ritmo pilórico, di-
minuindo sua frequência de atividade. Entretanto, estaria o alongamento do período relacionado
com a quantidade de spikes produzidos em cada burst? Para abordar esta questão, analisamos o
número de spikes/burst do neurônio LP, ilustrados na figura 4.2.
Observa-se que durante as aspersões dinâmicas, ocorre um aumento do número de spi-
62
A B C
ED
Figura 4.1 – BCP calculado para aspersões de Glu 10 mM. (A) BCP para aspersão síncrona com o 1o
spike do neurônio LP. (B) BCP para aspersão síncrona com o 4o spike do neurônio LP. Asaspersões síncronas com o LP possibilitaram uma adaptação do circuito pilórico em umanova frequência. (C) BCP para aspersão assíncrona em 1 segundo, sem adaptação do CPGpilórico. (D) e (E) correspondem ao BCP do controle e pós aspersões, respectivamente.
kes/burst quando comparado ao controle, ratificando dados de Marder (8), onde aplicação ion-
toforética e banho de glutamato causam despolarização de potenciais, e portanto, aumento dos
mesmos. Os valores da tabela 4.1, nos mostram que a adição foi de quase 2 spikes/burst em
média, o que poderia ocasionar um aumento de BCP e, consequentemente, uma alteração da
frequência pilórica. Este tipo de resposta resume o efeito inibitório do Glu, o qual poderia se
restringir apenas a inibição do ciclo de burst dos neurônios, alterando o ritmo pilórico, e não
inibindo a quantidade de spikes em cada burst.
Entretanto, a aspersão assíncrona causa uma grande diminuição do número de spikes por
burst, o qual foi reduzido quase pela metade quando comparado com a resposta das aspersões
dinâmicas na tabela 4.1. A intensa inibição inicial durante a aspersão periódica, não pode ser
considerada como responsável por esta grande queda da quantidade de spikes. Nossa análise
foi baseada na atividade do neurônio, portanto, o tempo onde o LP estava inicialmente inativo,
foi automaticamente desconsiderado por não apresentar spikes.
63
Figura 4.2 – Efeitos de aspersões glutamatérgicas no número de spikes por burst produzidos pelo neurô-nio LP. Aumento da média do número de spikes por burst em aspersões dinâmicas de Glu.Já a aspersão periódica causa uma diminuição desse valor. Barras de erro referentes ao SDrepresentado na tabela 4.1.
Um fato interessante é que se analisarmos apenas a aspersão periódica, o efeito inibitório
de aspersões glutamatérgicas é observado tanto no BCP quanto no número de spikes por burst.
Contudo, a comparação dos resultados destas duas análises em aspersões dinâmicas, nos mostra
que o efeito inibitório se limitou apenas a tornar o ritmo pilórico mais lento, já que o aumento
do número de spikes/burst é mantido mesmo após cessadas as aspersões, provavelmente um
efeito do ritmo se tornar naturalmente mais lento em uma preparação com mais de 8 horas in
vitro.
Tabela 4.1 – Valores médios de spikes em bursts do neurônio LP e desvio padrão do controle, durante epós aspersões de Glu 10 mM.
Situações Spikes/burst SD
controle 7,9 ±0,7
1o spike 10 ±3
4o spike 10 ±1
1 segundo 5 ±3
pós aspersões 12 ±2
64
4.1.3 Neurônio LP mantém assinatura apenas em aspersões dinâmicas
Baseado em Szücs et al (5), observamos a assinatura do neurônio LP perante as diferentes
formas de aspersão glutamatérgica. Os histogramas de ISIs (Fig. 4.3), mapas de primeiro re-
torno (Fig. 4.4) e histogramas de densidade (Fig. 4.5), nos mostram que a assinatura do LP,
com a forma de um cometa, é mantida durante as aspersões dinâmicas (apesar da “cauda” do
cometa estar mais alinhada com a diagonal quando comparada com as situações de controle),
mas é perdida nas aspersões periódicas. Ou seja, aspersões sincronizadas com o 1o e 4o spikes
do LP não alteram a sequência de ISIs no próximo burst, já aspersões que se distribuem alea-
toriamente ao longo do burst (assíncronas) alteram essa sequência. Uma possível interpretação
é que durante os disparos do LP, o PD se encontra inibido e um pulso de Glu apenas faria com
que o PD atrasasse seu próximo burst. Já um pulso de Glu durante a atividade do PD, que pode
apenas ocorrer na aspersão assíncrona, interromperia a sequência normal com que este inibe o
LP, alterando a informação que o LP expressa em seu próximo burst (32).
Durante o controle, o histograma de ISIs apresenta um pico singular em 0,02 segundos, sem
a presença de subpopulações de ISIs distinguíveis, como mostra a figura 4.3. Nestas condições,
o mapa de primeiro retorno apresentado na figura 4.4D, exibe uma assinatura com formato de
cometa, com ponto de acumulação no quadrante 0,02 s × 0,02 s, revelado pelo histograma de
densidade da figura 4.5D.
Os histogramas de ISIs de aspersões dinâmicas, nos revelam um deslocamento do pico prin-
cipal e alargamento das bases, mostrados na figura 4.3. As aspersões síncronas possuem curvas
bem semelhantes, com um tênue deslocamento do pico de ambas para aproximadamente 0,029
segundos. Estas aspersões, também apresentam uma menor uniformidade dos ISIs, gerando um
alargamento das bases do pico principal, nos histogramas de ISIs, e uma redução dos pontos de
acumulação, mostrados pelos histogramas de densidade nas figuras 4.5A e 4.5B. Entretanto, os
mapas de primeiro retorno nos mostram que, apesar destas alterações reveladas pelos histogra-
mas de ISIs e de densidade, a assinatura como cometa ainda é conservada durante as aspersões
síncronas, mesmo com pontos no quadrante 0,03 s × 0,03 s, como mostram as figuras 4.4A e
65
4.4B.
Figura 4.3 – Histogramas de ISIs em condições de controle, aspersões de Glu mM, e pós aspersões.A distribuição uniforme presente no controle é perdida na presença de neuromoduladores.Note a formação mais acentuada de subpopulações de ISI na aspersão periódica a cada1 segundo. Retorno do pico principal próximo a 0,02 s e ausência de subpopulações emcondições de pós aspersão.
Mudanças na curva do histograma de ISIs da aspersão assíncrona, exibidas na figura 4.3,
são mais proeminentes, apresentando subpopulações de ISIs em sua totalidade. O pico principal
foi totalmente perdido e a região de maior probabilidade de ISIs foi aumentada, compreendendo
entre 0,04 s e 0,06 s. O histograma de densidade desta aspersão, mostra que o ponto de acu-
mulação some completamente, e o mapa de primeiro retorno revela que a assinatura do LP é
perdida quando a aspersão é assíncrona. As figuras 4.4C e 4.5D exibem o mapa de primeiro
retorno e o histograma de densidade, respectivamente, para aspersão assíncrona.
O comportamento do neurônio LP em condições de pós aspersões, revelado também por
resultados das análises de ISIs, é bem próximo ao do controle. A curva referente aos ISIs do
pós aspersões, apresentada na figura 4.3, confirma o retorno do circuito a um ritmo próximo ao
apresentado no controle, onde o pico principal possui valor próximo a 0,02 s e maior unifor-
midade de ISIs. A assinatura em cometa e ponto de acumulação no quadrante 0,02 s × 0,02 s,
66
também são retomadas, como mostrado nas figuras 4.4D e 4.5D, respectivamente.
A B C
D E
Figura 4.4 – Mapa de primeiro retorno para o LP no experimento com aspersões de Glu. (A) e (B)Representam a assinatura de cometa do neurônio LP, mantidas mesmo com aspersão sín-crona no 1o e 4o spikes. (C) Mostra a assinatura com a aspersão assíncrona. (D) e (E)Representam a assinatura em cometa apresentada em condições de controle e pós aspersão,respectivamente.
4.1.4 Causas da mudança do ritmo pilórico não se limitam a parte ativado burst do LP
Já se sabe que os neurônios pilóricos apresentam sensibilidade quanto a estímulos de subs-
tâncias neurotransmissoras e moduladoras, podendo apresentar rapidamente alterações do pa-
drão de atividade (5, 8, 17, 22, 23, 25). Entretanto, estas alterações não estão limitadas apenas
a parte ativa do burst dos neurônios do LP.
Os resultados referentes à fase hiperpolarizada do neurônio LP, apresentaram grande si-
milaridade entre aspersões dinâmicas. As aspersões glutamatérgicas, síncronas com o 1o e 4o
spikes, são mostradas nas figuras 4.6A e 4.6B, respectivamente. Os padrões de IBIs produzidos
67
A B C
D E
Figura 4.5 – Histograma de densidade para o LP no experimento com aspersões de Glu. (A) e (B) Re-presentam a presença de pontos de acumulação em menor concentração aspersão síncronano 1o e 4o spikes. (C) Mostra a ausência de ponto de acumulação com a aspersão assín-crona. (D) e (E) Representam os pontos de acumulação presentes em condições de controlee pós aspersão, respectivamente.
são bem semelhantes, com uma distribuição dos picos próxima a 0,6 s; e poucos registros de
IBIs com valores maiores que 1 segundo.
Durante a aspersão periódica, o padrão apresentado nos mostra uma significante alteração
de comportamento também na fase hiperpolarizada do LP. Exibindo uma maior distribuição dos
IBIs, estes encontram-se dispersos entre a faixa de 0,5 s a 2 s, como mostra a figura 4.6C. A
aspersão periódica também apresentou um único valor de IBI próximo a 17 segundos, referente
aos ∼20 s iniciais de forte inibição do LP. Este valor foi excluído com o intuito de padronização
das escalas de IBIs, melhorando a comparação entre as aspersões. Outro fato que diferencia
a aspersão periódica das dinâmicas, é que uma quantidade bem menor de picos é apresentada,
sugerindo uma distribuição mais larga, sendo estes deslocados para a direita e próximos a 1 s,
evidenciando que as hiperpolarizações são em média mais longas neste caso.
Durante o controle, a fase hiperpolarizada apresentava valores de picos em ∼0,34 segun-
68
dos, com uma distribuição entre 0,25 s e 0,35 s, como mostra a figura 4.6D. Mesmo com o
efeito inibitório causado por aspersões glutamatérgicas, os valores de IBIs retornam abaixo dos
valores apresentados durante as aspersões. No pós aspersões, a distribuição de IBIs ocorre, em
sua grande maioria, entre 0,45 s e 0,65 s, como mostra a figura 4.6E. Como visto na análise
de BCP (subseção 4.1.1), este comportamento é provavelmente um efeito do ritmo se tornar
naturalmente mais lento em uma preparação com mais de 8 horas in vitro.
Figura 4.6 – Histogramas de IBIs para aspersões glutamatérgicas. (A) e (B) Histogramas de IBIs seme-lhantes para aspersões dinâmicas no 1o e 4o spikes, respectivamente, com picos na regiãode 0,6 s. (C) Histograma de IBIs em aspersão periódica, mostrando poucos picos de IBIs,deslocados para a direita. (D) e (C) Histogramas de IBIs durante condições de controle epós-aspersões, respectivamente, com um aumento e distribuição do IBIs no pós-aspersões.
4.1.5 Percentual de atividade diminui nas aspersões glutamatérgicas
É evidente que as alterações observadas nos períodos (subseção 4.1.1), são derivadas das
mudanças do número de spikes por burst (subseção 4.1.2) e do alargamento dos ISIs (subseção
4.1.3) e IBIs (subseção 4.1.4). Entretanto, somente o duty cycle poderia nos mostrar se e quanto
o percentual de atividade do neurônio LP foi alterado.
A tabela 4.2 apresenta os valores médios e desvios do duty cycle. Durante o controle, onde
havia um ritmo periódico bem definido, o duty cycle foi de 0.31. Isto nos revela que os instantes
de atividade neural com spikes (duração da contração do músculo enervado pelo neurônio mo-
69
tor), exibidos na figura 4.7D, representavam ∼30% do período. Durante as aspersões dinâmicas,
o duty cycle apresentou valor de 0.34 em aspersões síncronas com o 1o spike e em aspersões
síncronas com o 4o spike do LP, como ilustrados nas figuras 4.7A e 4.7B, respectivamente. O
comportamento durante estas aspersões, mais uma vez foi semelhante, apresentando percentual
de atividade do neurônio LP de ∼34%. Nas aspersões assíncronas, o sistema não apresentou
regularidade no duty cycle, como pode ser visto na figura 4.7C: o valor médio cai para ∼20%
de atividade, além de apresentar um desvio da mesma ordem de grandeza, o maior desvio entre
todos os resultados.
Novamente observou-se que o efeito é reversível e a porcentagem de atividade volta a ser
estável quando cessadas as aspersões glutamatérgicas, como mostrado na figura 4.7E. No pe-
ríodo de pós aspersão, o valor de duty cycle é de ∼33%, um pouco acima do controle inicial.
Este comportamento pode estar relacionado com o aumento do número de spikes e alargamento
dos ISIs, alterações já discutidas nas subseções anteriores.
A B C
D E
Figura 4.7 – Gráficos de duty cycle para o experimento de Glu. (A) e (B) representam as aspersões sín-cronas com o 1o e 4o spikes, respectivamente, com um valor de duty cycle que sugere 30%de atividade do neurônio LP. (C) representa aspersão periódica, onde o duty cycle indicaatividade menor que 30%. As figuras (D) e (E) representam o controle e pós aspersão,respectivamente, mostrando uma atividade de 60%.
70
Tabela 4.2 – Valores médios de duty cycle do neurônio LP e desvio padrão do controle, durante e pósaspersões de Glu 1 mM.
Situações Duty cycle SD
controle 0,31 ±0,05
1o spike 0,34 ±0,1
4o spike 0,34 ±0,07
1 segundo 0,20 ±0,2
pós aspersões 0,33 ±0,07
4.1.6 Comportamentos divergentes no retorno da atividade - rebote pósinibitório
Os resultados apresentados até o momento, demonstraram uma completa disparidade do
comportamento do neurônio LP entre aspersões dinâmicas e periódicas. Entretanto, eles não
relacionavam a resposta ao estímulo quanto ao tempo necessário para que o neurônio retorne sua
atividade após uma aspersão glutamatérgica. Os resultados desta análise, confirmam que o CPG
pilórico se adapta ao estímulo apenas quando este está sincronizado com o seu comportamento.
As 20 aspersões iniciais, síncronas com o 1o spike do LP, provocaram uma irregularidade
no tempo de retorno do CPG pilórico, como mostra a figura 4.8A. O sistema tenta se adaptar
ao estímulo inibidor, apresentando um tempo de rebote pós inibitório (intervalo entre a inibição
e o próximo spike) entre 0,5 s a 1,5 s. Após este período de adaptação (∼20 aspersões), o
sistema consegue produzir um padrão repetitivo com rebote sempre inferior a 1 segundo. Já nas
aspersões síncronas com o 4o spike do LP, o tempo para a adaptação foi menor, como mostra
a figura 4.8B. Foram necessárias ∼10 aspersões para que o sistema conseguisse se adaptar
ao estímulo e voltar a produzir atividade rítmica. Apesar desta desigualdade no período de
adaptação, o padrão final de rebote do neurônio foi o mesmo da aspersão no 1o spike, ou seja,
pouco menor que 1 segundo.
71
A forte inibição inicial durante a aspersão assíncrona, em que não se espera até o LP apre-
sentar um rebote antes de aplicar novo pulso inibidor, produz um período de inatividade inicial
do neurônio bastante longo, como mostrado na subseção 4.1.1. Na figura 4.8C podemos obser-
var que durante as ∼20 aspersões iniciais, a célula não apresenta spikes. Este comportamento
pode ser confirmado quando analisamos a região de decaimento linear do retorno de atividade.
A figura 4.8D representa um zoom da figura 4.8C, mostrando o comportamento neural perante
aspersão periódica em mesma escala apresentada para as aspersões dinâmicas. Podemos notar
que não houve padrão entre o tempo de aspersão e o retorno da atividade do neurônio LP.
A B
C D
Figura 4.8 – Tempo de rebote pós-inibitório. Em (A) e (B) observa-se a adaptação do CPG pilóricoàs aspersões síncronas com o 1o e 4o spikes do LP, respectivamente. (C) O tempo derebote em aspersões periódicas - apresenta um decaimento linear durante as ∼20 aspersõesiniciais, mas não demonstra nenhum adaptação clara do circuito a esse tipo de aspersão.(D) Aspersão periódica com escala de duração do rebote reduzida aos mesmos valores de(A) e (B) para comparação.
Quando há aplicação exógena de substâncias neuromoduladoras nos circuitos do STG, os
resultados podem ser mudanças na frequência, relações de fase e número de spikes por burst em
diferentes células, causando reconfiguração da rede em diferentes padrões (4–6, 21). Entretanto,
72
as técnicas utilizadas até o momento, nestes trabalhos, não permitiam avaliar o comportamento
de um CPG quando o estímulo é apresentado de acordo com o próprio ritmo pilórico.
O Glu, utilizado em estudos através de aplicações iontoforéticas e banho, altera as condu-
tâncias dos canais de K+ e Cl− (8, 37) e propicia despolarização dos neurônios. Entretanto, os
resultados apresentados são caracterizados como respostas do CPG de determinada espécie, e
nem sempre correspondem ao mesmo comportamento em outra espécie.
Segundo Marder (24), uma explicação para resultados diversos no estudo da ação glutama-
térgica em um STG, se deve à existência de diferentes canais para este modulador em neurônios
de espécies distintas. Entretanto, nossos dados demonstram que um mesmo estímulo “apresen-
tado” de duas maneiras diferentes, em um mesmo espécime, pode produzir respostas diferentes
na mesma célula.
Os resultados apresentados pelo CPG pilórico, refletem os efeitos diferentes das asper-
sões dinâmicas e periódicas, mesmo que ambas acabem produzindo um pulso de Glu a cada
1 segundo. Observamos que as aspersões glutamatérgicas síncronas com a atividade do CPG
pilórico, permitem que o circuito se adapte a uma nova frequência. No entanto, uma forma di-
ferente de aspersão, onde utiliza-se a mesma frequência a qual o circuito se adaptou, mas a fase
do ritmo do CPG não é levada em consideração a cada aspersão, induz outro tipo de resposta.
Ou seja, ao contrário do que ocorre mesmo em osciladores acoplados, o circuito biológico não
é capaz de produzir um regime periódico de oscilação diferente do normal se o estímulo (pulso
de Glu) não estiver em sincronia com a atividade do próprio circuito.
4.2 Serotonina
Nesta seção, apresentamos a resposta do LP para as aspersões de 5-HT 10 mM em um
CPG pilórico, com frequência média de 1 Hz. Os registros exibidos são de aspersões dinâmicas
no 2o e 4o spikes, e periódicas a cada 1 segundo. As aspersões dinâmicas no 1o e 3o spikes
foram omitidas por apresentarem comportamentos próximos aos das aspersões no 2o e 4o spikes,
73
respectivamente.
4.2.1 Perturbação no período dos bursts
Aplicações exógenas de serotonina podem influenciar no padrão motor de células do STG,
perturbando as características do ritmo pilórico normal (8). Com o estudo dos valores de BCP,
foi possível analisarmos o efeito de diferentes tipos de aspersões de 5-HT no ritmo pilórico.
O efeito perturbador da serotonina é claramente observado em todas as aspersões nos ∼40
segundos iniciais, implicando em um aumento do BCP do neurônio LP, entretanto o ritmo do
CPG se comporta de modo distinto durante a aspersão dinâmica com o 2o spike, como exibido
na figura 4.9.
Em condições de controle, os valores de BCP eram estáveis em torno de 1 segundo, como
mostrado na figura 4.9D.
A aspersão dinâmica no 2o spike induziu, nos 40 segundos iniciais, um aumento do período
para ∼1,25 s, como apresentado na figura 4.9A. Após este período inicial o valor médio cai
e a dispersão dos valores aumenta bastante. Durante a aspersão síncrona com o 4o spike do
LP, mostrado na figura 4.9B, observa-se uma dispersão inicial que se reduz rapidamente, dando
lugar a um ritmo bem mais regular e similar ao controle.
O comportamento durante as aspersões assíncronas a cada 1 segundo, exibido na figura
4.9C, é bem próximo ao visto durante as aspersões dinâmicas no 4o spike. Analisando compa-
rativamente o comportamento do CPG pilórico durante todos os protocolos, observa-se que 5-
HT apresenta tanto efeitos metabotrópicos, como uma aceleração do ritmo observada em todos
os protocolos para longos períodos; quanto efeitos mais rápidos, como a dispersão produzida
quando os pulsos foram aplicados no 2o spike do LP.
Os efeitos observados por aspersões serotoninérgicas são reversíveis. As figuras 4.9D e
4.9E correspondem ao controle e pós aspersões, respectivamente. No pós aspersões, podemos
notar que o CPG pilórico volta a apresentar uma maior regularidade no ciclo de burst, com
74
uma frequência bem definida. Entretanto, os valores de BCP, apresentados no pós aspersões,
estão levemente abaixo de 1 segundo, caracterizando um efeito excitatório no ciclo de burst,
corroborando com (4, 11, 23, 29). Observa-se a reversão deste efeito metabotrópico no final do
período de controle pós-aspersões, quando o BCP claramente tende a aumentar e retornar a 1 s.
A B C
D E
Figura 4.9 – BCP calculado para aspersões de 5-HT 10 mM. (A) BCP para aspersão síncrona com o 2o
spike do neurônio LP, com menor regularidade. (B) BCP para aspersão síncrona com o4o spike do neurônio LP e (C) BCP para aspersão assíncrona em 1 segundo apresentarammaior regularidade de BCP. (D) e (E) correspondem ao BCP do controle e pós aspersões,respectivamente.
4.2.2 Influência serotoninérgica no número de spikes por burst
Na seção anterior mostramos que aspersões serotoninérgicas também podem causar pertur-
bações no ritmo pilórico. Aqui analisamos os efeitos de 5-HT no número de spikes por burst
produzidos pelo LP.
O efeito excitatório da 5-HT (4, 11, 23, 29) pode ser estendido para o número de spikes por
burst (figura 4.10). Este comportamento pode ser devido a inibição da liberação do facilitador
75
de sinapses glutamatérgicas (11). Durante todas as aspersões, dinâmicas e periódicas, houve
um aumento do número de spikes por burst quando comparamos com o controle.
Figura 4.10 – Efeitos de aspersão serotoninérgicas no número de spike por burst produzidos pelo neurô-nio LP. Aumento do número de spikes por burst em todas as aspersões, dinâmicas e perió-dicas. Barras de erro referentes ao SD representado na tabela 4.3.
Os valores da tabela 4.3, nos mostram que as aspersões a cada 2o e 4o spikes e periódicas,
induziram a adição de ∼3 spikes por burst, em média. Apesar da aspersão síncrona com o 4o
spike ter apresentado uma maior média de spike por burst, ∼10 spikes, este aumento de 2 spikes
em relação as aspersões dinâmicas com o 2o spike e periódicas a cada 1 segundo, não possiu
relevância pois apresenta um grande desvio padrão. O valor médio de spikes por burst volta a
faixa de ∼7 no pós aspersões, valor próximo ao apresentado pelo controle inicial.
Existem diferenças visíveis nos números de spikes por burst, porém, elas não são mais
separadas por respostas de aspersões dinâmicas e periódicas. Também não podemos afirmar que
o aumento médio de spikes é decorrente de um efeito serotoninérgico de ação metabotrópica,
pois, caso fosse, a aspersão periódica deveria apresentar um número maior de spikes que a
aspersão anterior, síncrona com o 4o spike do LP. Este aumento no número de spikes por burst
poderia ter aumentado os valores de BCP, como ocorreu durante as aspersões glutamatérgicas,
entretanto, este comportamento não foi observado.
O aumento de spikes durante as aspersões demonstra um efeito excitatório de 5-HT, corro-
borando as conclusões de Cruz-Bermúdez e Marder (29), Marder (11) e Funase et al (23).
76
Tabela 4.3 – Valores médios de spikes em bursts do neurônio LP e desvio padrão do controle, durante epós aspersões de 5-HT 10 mM.
Situações Spikes/burst SD
controle 6 ±1
1o spike 9 ±3
4o spike 10 ±4
1 segundo 9 ±2
pós aspersões 7 ±2
4.2.3 Assinatura do LP durante aspersões serotoninérgicas
As análises da assinatura do neurônio LP perante as diferentes formas de aspersão seroto-
ninérgicas, foram baseadas em Szücs et al (5). Os histogramas de ISIs (Fig. 4.11), mapas de
primeiro retorno (Fig. 4.12) e histogramas de densidade (Fig. 4.13), nos mostram que a assina-
tura do LP é parcialmente conservada (Fig. 4.12), mas ocorre a formação de uma subpopulação
que se intensifica ao longo das aspersões, podendo ser associada a um efeito metabotrópico.
Durante o controle inicial, o histograma de ISIs apresenta um pico singular em 0,02 segun-
dos, com predominância de pontos na parte superior da diagonal, com ausência de subpopula-
ções de ISIs distinguíveis, como mostrado na figura 4.11B. Entretanto, seu decaimento se faz de
forma mais suave do que normalmente é apresentado em histogramas de ISIs do neurônio LP,
pois apresenta valores de ISIs de ∼0,02s a ∼0,04 s na base do pico. Nestas condições, o mapa
de primeiro retorno, apresentado na figura 4.12D, exibe uma assinatura com formato de cometa
(Szücs et al, 2003) com um leve espalhamento, e ponto de acumulação no quadrante 0,02 s ×
0,02 s, revelado pelo histograma de densidade na figura 4.13D.
Flamm et al (25) descreveram a ação inibitória em neurônios LP isolados. Este efeito pode
ser estendido para o LP dentro do CPG pilórico quando analisamos o efeito serotoninérgico na
distribuição dos ISIs. Os histogramas de ISIs durante aspersões serotoninérgicas, dinâmicas e
77
A B
Figura 4.11 – Histogramas de ISIs em condições de controle, aspersões de 5-HT 10 mM, e pós asper-sões. (A) Histogramas de distribuição de ISIs durante aspersões serotoninérgicas. Notea formação de subpopulações de ISIs na região entre 0,08 s e 0,1 s, mais acentuada daaspersão síncrona com o 4o spike e na periódica a cada 1 s. (B) Histograma de ISIs paracondições de controle e pós aspersões. Retorno do pico principal próximo a 0,02 s comaumento da base.
periódicas, nos revelam um estreitamento da base do pico principal e formação de uma subpo-
pulação na região de ∼0,7 s a 1 s, mostrados na figura 4.11A. Durante a aspersão síncrona com
o 2o spike, uma maior uniformidade na distribuição de ISIs do neurônio LP é observada em
∼0,015 s, com uma tênue formação de uma subpopulação entre 0,08 s e 0,10 s. Já na aspersão
síncrona com o 4o spike do LP e na aspersão assíncrona a cada 1 segundo, houve uma maior
diminuição do pico principal em 0,02 s e formação de uma subpopulação maior entre 0,08 s e
0,1 s.
Apesar destas alterações reveladas pelos histogramas de ISIs, os mapas de primeiro retorno
nos mostram que a parte da assinatura que corresponde ao cometa é ainda melhor identificada
no decorrer das aspersões dinâmicas no 2o e 4o spikes e periódicas, como mostram as figuras
4.12A, 4.12B e 4.12C, respectivamente.
O comportamento do neurônio LP em condições de pós aspersões, revelado também por
resultados das análises de ISIs, é bem próximo ao do controle. A curva referente aos ISIs do pós
aspersões, apresentada na figura 4.11B, confirma o retorno do circuito a um ritmo semelhante
ao apresentado no controle, onde o pico principal possui valor próximo a 0,02 s e a base entre
78
∼0,02s a ∼0,04 s. A assinatura em cometa retorna, entretanto com espalhamento um pouco
maior, e as subpopulações em 0,1 s × 0,1 s desaparecem, como mostrado na figura 4.12D. Com
o histograma de densidade, observamos que o ponto de acumulação volta a ser no quadrante
0,02 s × 0,02 s, como revelado pela figura 4.13D.
A B C
D E
Figura 4.12 – Mapa de primeiro retorno para o LP. (A), (B) e (C) Mapas mostrando a assinatura decometa do neurônio LP, mantida mesmo com aspersão síncrona no 2o e 4o spikes e as-persões assíncronas, respectivamente. Formação mais intensa de subpopulações na partesuperior da diagonal em B e C. (D) e (E) Mapas em condições de controle e pós asper-são, respectivamente. Apesar do espalhamento próximo a forma de cometa, não existemsubpopulações.
4.2.4 IBIs estão relacionados à mudança do ritmo pilórico
Aplicações exógenas de serotonina podem aumentar a frequência de disparo dos neurô-
nios (11, 23, 29), ativar bursts de neurônios AB isolados (8), e até inibir neurônios LP quando
isolados (25). Entretanto, as observações não se restringem a parte ativa de um ciclo de burst.
Os histogramas de IBIs, mostrados na figura 4.14, nos revelam que mudanças no ritmo piló-
79
A B C
D E
Figura 4.13 – Histograma de densidade para o LP. (A), (B) e (C) Histogramas demonstrando a presençade pontos de acumulação em menor concentração durante as aspersões serotoninérgicassíncronas com o 2o e 4o spikes e assíncronas, respectivamente. (D) e (E) Histogramas re-presentando os pontos de acumulação presentes em condições de controle e pós aspersão,respectivamente, com um tênue espalhamento. Note o desaparecimento do espalhamentopróximo ao quadrante 0,1s × 0,1s.
rico, devido a aspersões serotoninérgicas, não se restringem as alterações apenas na parte ativa
de uma célula, mas também na inibição que outras células exercem neste neurônio, aumentando
assim os valores de IBIs.
Durante as aspersões serotoninérgicas, há uma redução gradual dos IBIs. Os picos princi-
pais são deslocados para a esquerda. Na aspersão síncrona com o 2o spike, ilustrada na figura
4.14A, os picos estão concentrados na faixa entre ∼0,6 s e 0,8 s. Já durante as aspersões sín-
cronas com o 4o spike (Fig. 4.14B), e assíncrona a cada 1 segundo (Fig. 4.14C), os picos se
concentram próximos a 0,5 s. Este comportamento pode ser devido a proximidade de tempo de
ocorrência destas duas aspersões, mais uma vez caracterizando um possível efeito metabotró-
pico da 5-HT.
Quando comparamos o comportamento de IBIs durante o controle e pós aspersões, po-
demos notar um pequeno deslocamento do pico. No tempo de controle, os picos principais
80
compreendiam a faixa entre 0,6 s e 0,8 s, como mostra a figura 4.14D. Essa distribuição é bas-
tante semelhante à distribuição apresentada durante as aspersões dinâmicas a cada 2o spike (Fig.
4.14A).
No controle pós aspersões, os valores de IBIs são reduzidos, deslocando os picos para a
faixa entre 0,5 s e 0,7 s, como mostrado na figura 4.14E. Assim, apesar do valor médio dos IBIs
ter aumentado após cessarem as aspersões serotoninérgicas, ele não retorna ao valor exibido no
controle inicial. Este comportamento caracteriza um possível efeito excitatório metabotrópico
das aspersões serotoninérgicas.
Figura 4.14 – Histogramas de IBIs para aspersões serotoninérgicas. (A) Histograma de IBIs para asper-sões síncronas com o 2o spike. (B) e (C) Histogramas de IBIs semelhantes para aspersõesdinâmicas 4o spikes e periódicas a cada 1 segundo, respectivamente. (D) e (E) Histogra-mas de IBIs durante condições de controle e pós-aspersões, respectivamente.
4.2.5 Aspersões serotoninérgicas aumentam o percentual de atividade
A análise do duty cycle, fração do ciclo durante a qual um neurônio se encontra ativo,
nos permite investigar se e quando o percentual de atividade do neurônio LP é alterado por
aspersões de 5-HT.
Nossos resultados demonstraram um aumento do percentual de atividade durante asper-
sões serotoninérgicas, corroborando aqueles obtidos por Grashow et al (4). Na tabela 4.4 são
81
exibidos os valores médios e desvios do duty cycle.
Em condições de controle (Fig. 4.15D), o valor médio do duty cycle era 0,27 ± 0,09. Com
aspersões serotoninérgicas a cada 2o spike do LP, observa-se um aumento inicial do percentual
de atividade para até 55% que se mantém com baixa dispersão durante os ∼40 segundos iniciais,
como mostra a figura 4.15A. Passado este período inicial, o duty cycle cai para valores menores
e apresenta maior dispersão.
Com relação ao duty cycle, o comportamento do LP é muito semelhante entre as aspersões
síncronas com o 4o spike e assíncronas a cada 1 segundo, como mostram as figuras 4.15B e
4.15C, sendo que este se estabiliza em torno de 56% nos dois casos.
No período pós aspersões, o valor de duty cycle volta a baixar a 36% evidenciando o efeito
metabotrópico excitatório reversível de 5-HT no duty cycle do LP.
Grashow et al (4), descreveram o efeito excitatório da 5-HT quanto ao aumento da atividade
em bursts de neurônios do CPG gástrico. Durante todas as aspersões serotoninérgicas também
houve um aumento do percentual de atividade do LP. Esse efeito excitatório da 5-HT, pode ser
devido a inibição da liberação do facilitador de sinapses glutamatérgicas (11).
Tabela 4.4 – Valores médios de duty cycle do neurônio LP e desvio padrão do controle, durante e pósaspersões de 5-HT 10 mM.
Situações Duty cycle SD
controle 0,27 ±0,09
1o spike 0,4 ±0,1
4o spike 0,6 ±0,1
1 segundo 0,6 ±0,1
pós aspersões 0,4 ±0,1
82
A B C
D E
Figura 4.15 – Gráficos de duty cycle. (A), (B) e (C) Duty cycle durante aspersões síncronas no 2o spike,4o spike e assíncronas a cada 1 segundo, respectivamente. (D) e (E) Duty cycle do controlee pós aspersão, respectivamente.
4.2.6 Diferença no retorno de atividade em aspersões dinâmicas e perió-dicas
Com exceção do maior espalhamento do BCP quando a aspersão ocorre no 2o disparo do
LP, todos os outros resultados obtidos indicam que os efeitos da 5-HT (29) são principalmente
metabotrópicos. Até agora, o comportamento apresentado durante as aspersões síncronas com
o 4o spike e as periódicas a cada 1 segundo, exibiram uma grande similaridade. O mesmo não
acontece quando analisamos o rebote pós-aspersão de 5-HT.
O rebote é similar para as aspersões de 5-HT síncronas ao 2o e 4o spikes do LP, como
mostram as figuras 4.16A e 4.16B, e bastante diferente para aspersões periódicas, mostrado na
figura 4.16C. No protocolo de aspersão periódica, aparentemente ocorre um batimento entre a
frequência de burst e a frequência de aspersão, o que poderia ser explicado com base na ideia de
5-HT não inibir diretamente o LP. Assim, como as frequências não são idênticas, e inicialmente
83
a frequência de burst parece ser um pouco menor que a de aspersão, o pulso assíncrono de 5-
HT ocorre sucessivamente cada vez em uma fase menor do burst do LP. Pouco antes da metade
do protocolo, a frequência de burst torna-se muito próxima da de aspersão e observa-se uma
estabilização, seguida da inversão do comportamento, quando a frequência de burst torna-se um
pouco maior que a de aspersão, adiantando a fase da 5-HT a cada aspersão. Assim, acreditamos
que o parâmetro rebote não é relevante para entender o que ocorre com a aspersão de 5-HT.
A B
C
Figura 4.16 – Mapas de retorno de atividade - rebote. (A) e (B) exibem uma adaptação do CPG pilóricoa aspersões síncronas com o 2o e 4o spikes do LP. (C) Na aspersão periódica, um padrãodiagonal linear a cada 20 segundo é alcançado, com uma estabilização entre a 60a e 80a
aspersões.
A aplicação exógena de serotonina influencia no padrão motor de neurônios do CPG, po-
dendo ativar bursts em neurônios AB isolados (8). Isto influenciaria no comportamento do LP,
uma vez que este é inibido pelo neurônio AB. Entretanto, o efeito excitatório da 5-HT, pode ser
devido a inibição da liberação do facilitador de sinapses glutamatérgicas (11).
Os resultados apresentados pelo CPG pilórico, refletem os efeitos diferentes das aspersões
84
serotoninérgicas, entretanto, não mais distintos entre aspersões dinâmicas e periódicas. A única
exceção foi o maior espalhamento do BCP observado apenas durante o protocolo de aspersões
no 2o spike do LP, que pode ser explicado com base na ideia de que 5-HT inibe a facilitação das
sinapses glutamatérgicas com que o PD inibe o LP (11). Observamos que o comportamento do
CPG durante as aspersões de 5-HT é semelhante para diferentes formas de aspersão. E como
era de se esperar, uma substância que atua com dinâmica temporal essencialmente mais lenta
que a atividade em bursts, não faz com que o circuito biológico produza regimes de oscilação
distintos quando o estímulo (pulso de 5-HT) está ou não sincronizado com a atividade do próprio
circuito.
85
5 Conclusão
Neste trabalho apresentamos um protocolo experimental para estudar o efeito de um neu-
rotransmissor e um neuromodulador em um circuito neural in vitro. Nossa proposta difere
dos métodos usados tradicionalmente, pois ao invés de expor o circuito a uma concentração
constante da substância, utilizamos um injetor de picolitros controlado por um software que,
em tempo real, produz um padrão de estímulo dinâmico e dependente da atividade do próprio
circuito.
Estudamos experimentalmente a influência da dinâmica de liberação de Glu e 5-HT nos
padrões produzidos pelo CPG pilórico de crustáceos, onde estas substâncias são naturalmente
encontradas. Este CPG produz um ritmo periódico trifásico de bursts para a contração de mús-
culos que bombeiam a comida do estômago para os intestinos durante o processo de digestão.
Nosso protocolo permitiu observar o comportamento de um dos neurônios do circuito, medido
extracelularmente, e inferir os efeitos destas substâncias no ritmo do CPG em 3 condições: (a)
controle sem estímulo químico, (b) estímulo químico sincronizado com a atividade do circuito,
(c) estímulo químico não sincronizado com a atividade do circuito mas com mesma quantidade
média de substância que (b).
Nos experimentos usando pulsos de Glu aplicados de modo sincronizado com a atividade
do circuito, observamos que, após um período de transição inicial, o CPG pilórico se adapta ao
estímulo e uma nova frequência de atividade periódica emerge. Quando um trem de pulsos com
a mesma frequência é aplicado de modo assíncrono o CPG não consegue atingir um regime
estacionário de comportamento.
Os resultados com 5-HT não apresentaram esta distinção clara entre estímulos síncronos
e assíncronos, provavelmente por não apresentar ação com a mesma grandeza que o Glu. En-
tretanto, encontramos algumas evidências de que a fase em que o estímulo síncrono é aplicado
86
pode aumentar a dispersão das grandezas que caracterizam a atividade, indicando que o efeito
global de 5-HT não ocorre exclusivamente através de vias lentas.
Nossos resultados evidenciam que o padrão emergente do circuito depende da dinâmica de
liberação de substâncias, podendo produzir respostas diferentes em uma mesma célula princi-
palmente quando a atividade do neurotransmissor ou modulador ocorre em uma escala de tempo
menor que aquela do comportamento do CPG.
Novos estudos devem ser realizados com outros neurotransmissores e moduladores para se
aprimorar o protocolo para diferentes tipos de substâncias.
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APÊNDICE A -- Injeção de picolitros via pressão