Ministrio da SadeFundao Oswaldo CruzInstituto Ren Rachou

ASPECTOS IMUNOLGICOS CELULARES E HUMORAIS NA

FASE CRNICA DA DOENA DE CHAGAS

Ps-graduao em Cincias da Sade

Biologia Celular e Molecular

TESE DE DOUTORADO

Danielle Marquete Vitelli Avelar

Laboratrio de Biomarcadores de Diagnstico e Monitorao - IRR/FIOCRUZ

Belo Horizonte

Maro de 2008

Orientador: Dr. Olindo Assis Martins Filho

Co-orientadora: Dra. Silvana Maria Eli Santos

DANIELLE MARQUETE VITELLI AVELAR

ASPECTOS IMUNOLGICOS CELULARES E HUMORAIS NA

FASE CRNICA DA DOENA DE CHAGAS

Orientador: Dr. Olindo Assis Martins Filho

Co-orientadora: Dra. Silvana Maria Eli Santos

Belo Horizonte, 26 de Maro de 2008.

Ps-graduao em Cincias da Sade

Biologia Celular e Molecular

EXAMINADORES

Dr. Paulo Renato Zuquim Antas IOC/FIOCRUZ

Dra. Walderez Ornelas Dutra ICB/UFMG

Dra. Juliana de Assis Silva Gomes Estanislau IRR/FIOCRUZ

Dr. Marco Antnio da Silva Campos IRR/FIOCRUZ

Dra. Cristiana Toscano Fonseca IRR/FIOCRUZ (suplente)

Ministrio da SadeFundao Oswaldo CruzInstituto Ren Rachou

Catalogao-na-fonte Rede de Bibliotecas da FIOCRUZ Biblioteca do CPqRR Segemar Oliveira Magalhes CRB/6 1975 V841a 2008

Vitelli-Avelar, Danielle Marquete. Aspectos imunolgicos celulares e humorais na fase

crnica da doena de Chagas, ou, Humoral and Cellular immunological aspects of chronic Chagas disease / Danielle Marquete Vitelli-Avelar. Belo Horizonte, 2008. xiv, 145 f: il.; 210 x 297mm. Bibliografia: f. 130 - 140 Tese (doutorado) Tese para obteno do ttulo de

Doutora em Cincias pelo Programa de Ps-Graduao em Cincias da Sade do Centro de Pesquisas Ren Rachou. rea de concentrao: Biologia Celular e Molecular. 1. Doena de Chagas/imunologia 2. Citometria de

Fluxo/mtodos 3. Citocinas/imunologia I. Ttulo. II. Martins-Filho, Olindo Assis (Orientao). III. Eli-Santos, Silvana Maria (Co-orientao)

CDD 22. ed. 616.936 3

LOCAL DE DESENVOLVIMENTO DA TESE

Laboratrio de Biomarcadores de Diagnstico e Monitorao do Instituto Ren

Rachou/FIOCRUZ.

COLABORADORES

LABORATRIO DE TRIATOMNEOS IRR/ FIOCRUZ

Dr. Joo Carlos Pinto Dias

LABORATRIO DE BIOMARCADORES DE DIAGNSTICO E MONITORAO IRR/

FIOCRUZ

Renato Sathler Avelar, Andra Teixeira de Carvalho, Ana Paula Barbosa Wendling e Paula

Souza Lage

POSTO AVANADO DE PESQUISAS EMANUEL DIAS BAMBU

Dr. Joo Soares Moreira Magalhes e Paulo Lamunier

UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRINGULO MINEIRO UBERABA/MG

Prof. Aluzio Prata

UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO Ouro Preto/MG

Profa. Marta de Lana

RGOS FINANCIADORES

CPqRR/FIOCRUZ, CNPq (no: 4758058-2003 e 481097-2004) e UNICEF/UNDP/World

Bank/WHO Special Program for Research and Training in Tropical Disease (TDR) (no: A30451).

DDDDedico este trabalho aos meus maiores

incentivadores: meus pais, minha irm e ao

meu marido Renato. Muito obrigada por

tanta dedicao, compreenso e acima de

tudo pelo amor.

AGRADECIMENTOS

A Deus, sempre, por ter iluminado as minhas escolhas e ter colocado pessoas especiais no meu

caminho.

Ao Dr. Olindo Assis Martins Filho pelo apoio incondicional desde a iniciao cientfica, por sua

incansvel atuao - crticas, correes de contedo e forma, sugestes, suporte tcnico e

literatura cientfica, capacitando-me a desenvolver reflexes crticas para responder aos desafios

e exigncias de um futuro acadmico. Obrigada por incentivar-me a fazer o melhor, sempre.

Dra. Silvana Maria Eli Santos pela colaborao na interpretao dos resultados, correo

desta tese e pelas constantes palavras de apoio e incentivo.

Ao Dr. Joo Carlos Pinto Dias pelo empenho na seleo de pacientes, no envio das amostras de

sangue e por compartilhar seus valiosos conhecimentos sobre a doena de Chagas.

Ao Paulo Lamunier pela coleta do sangue dos pacientes.

Aos doadores de sangue cuja participao foi imprescindvel para a realizao deste trabalho.

s estudantes e amigas Andra Teixeira, Roberta Dias, Vanessa Pascoal e Ariane Massine pelos

ensinamentos cientficos, principalmente de citometria de fluxo e pela torcida. Admiro o trabalho

de vocs.

Aos amigos do Laboratrio de Biomarcadores de Diagnstico e Monitorao e do Laboratrio de

Imunologia Celular e Molecular pela rica convivncia.

Paula Souza Lage pelo auxlio nas anlises dos dados de citometria, pelo empenho e dedicao

em aprender e pelo convvio.

Natlia velin Martins que em seu primeiro contato com a cincia demonstrou astcia e

entusiasmo me enchendo de orgulho.

Lisiane, Fabiana, Cntia, Eliandra e Bia pelo apoio tcnico de qualidade e amizade.

Roberta Flix e Clari Gandra pela eficincia e amizade.

Ao Paulo, Neide, Andra e Cris da Secretaria da Ps-graduao.

Anna Carolina da estatstica pelo esforo em me ajudar na escolha dos melhores testes.

Ao Segemar pela presteza.

E em especial a Cristiano Lara Massara que tornou realidade o meu sonho - sem ele nada disso

teria sido possvel.

Aos professores da Ps-graduao do Centro de Pesquisas Ren Rachou pelos ensinamentos.

Aos doutores lvaro Jos Romanha e Rodrigo Corra Oliveira, diretores do Centro de Pesquisa

Ren Rachou.

Aos funcionrios do Centro de Pesquisas Ren Rachou.

Jane e John por acreditarem e investirem nos potenciais meu e do Renato.

So muitas as pessoas e instituies que merecem os meus agradecimentos e eu, mesmo que

fizesse a mais longa lista, correria o risco de cometer injustias.

Finalmente, minha famlia e amigos, por estarem presentes nos momentos de alegria, de

desespero e lgrimas, sempre torcendo pelo meu sucesso.

"Todo o interesse na doena e na morte apenas

uma outra forma de interesse pela vida

Thomas Mann (1875-1955)

RESUMO

Diversos estudos que avaliam os mecanismos imunolgicos associados manifestao de

diferentes formas clnicas da doena de Chagas tm sugerido eventos multifatoriais. Com esse

estudo, nosso objetivo foi adicionar novos elementos complexa rede imunolgica que envolve a

interao parasita-hospedeiro e as distintas manifestaes clnicas da doena de Chagas crnica,

indeterminada (IND), cardaca (CARD) e digestiva (DIG). Para esse objetivo, realizamos uma

anlise detalhada de caractersticas fenotpicas da resposta imune com nfase na anlise

imunofenotpica de clulas mononucleares do sangue perifrico, no perfil de citocinas

intracitoplasmticas de leuccitos circulantes bem como na magnitude da resposta de IgG anti-

Trypanosoma cruzi. Nossos principais achados demonstraram elevadas freqncias de clulas

reguladoras CD4+CD25high e NKT, associadas com nveis aumentados de clulas NK citotxicas

circulantes em IND, enquanto percentuais aumentados de linfcitos T CD8+HLA-DR+ foram

observados em CARD e DIG. Adicionalmente, nossos dados demonstraram valores aumentados

de clulas pr-NK, alm de elevados valores de moncitos pr-inflamatrios e linfcitos B

ativados, contrastando com a ativao diminuda de clulas T e diminuio da freqncia de

clulas T reguladoras CD4+CD25high marcos do estgio recente (E-IND) da doena de Chagas

crnica. Anlise comparativa transversal entre E-IND, IND e CARD ainda sugeriu que uma

mudana em direo a altos valores de macrfagos-like e nveis basais de moncitos pr-

inflamatrios alm de elevados valores de clulas NK maduras, NKT e CD4+CD25high podem

resultar na forma clnica IND. Por outro lado, altos nveis de clulas CD8+HLA-DR+ paralelo a

nveis basais de clulas NK maduras, NKT e CD4+CD25high podem levar a doena cardaca. Alm

disso, freqncia aumentada de linfcitos totais alto-produtores de IL-4, IL-10 e IL-13 e um

perfil misto de citocinas derivadas de NK e neutrfilos foram marcos do grupo IND, enquanto

freqncias aumentadas de moncitos alto-produtores de TNF- e baixas freqncias de

linfcitos T CD8+IL-10+ foram as principais caractersticas de CARD. A avaliao do perfil de

citocinas de leuccitos circulantes aplicando a estratgia de viso panormica demonstrou que

enquanto a maioria dos IND apresentam um perfil de citocinas reguladoras, a maioria dos CARD

apresentam um micro-ambiente de citocinas inflamatrias. Apesar dos nossos achados

corroborarem com relatos prvios de perfis distintos de anticorpos IgG anti-T. cruzi entre IND e

CARD, eles indicaram que marcadores da resposta imune humoral so, sem dvida, mais

aplicveis para diagnstico sorolgico e monitorao de critrio de cura. Em suma, nossos dados

demonstram que, mais que uma mudana em direo a um padro polarizado, um fino balano

relevante para direcionar os mecanismos imuno-mediados essenciais para a definio da doena

de Chagas.

ABSTRACT

Studies on immunological mechanisms associated with different clinical forms of Chagas disease

have suggested multifactorial events for the disease development. Herein, we intended to add

new elements to the complex immunological network underlying the parasite-host relationship

and the distinct clinical outcome of chronic Chagas disease, referred as indeterminate (IND),

cardiac (CARD) and digestive (DIG) clinical forms. For this purpose, we have performed a

detailed analysis of phenotypic features of the immune response emphasizing the ex vivo

immunophenotype of peripheral blood mononuclear cells, the intracitoplasmatic cytokine profile

of circulating leukocyte subsets as well as the magnitude of anti-Trypanosoma cruzi IgG immune

response. Our major findings demonstrated that higher frequency of both CD4+CD25high and

NKT regulatory cells, associated with increased levels of circulating cytotoxic NK cells was

observed in IND whereas increased percentage of CD8+HLA-DR+ T-lymphocytes subset was

exclusively associated with CARD and DIG. Additionally, our data demonstrated that increased

values of pre-NK-cells besides higher values of proinflammatory monocytes and activated B

lymphocytes contrasting with the impaired T- lymphocytes activation and decreased frequency of

CD4+CD25high regulatory T lymphocytes was the hallmark of early stage (E-IND) of chronic

Chagas disease. Comparative cross-sectional analysis among E-IND, IND and CARD further

suggested that a shift toward high values of macrophage-like cells and basal levels of

proinflammatory monocytes besides high values of mature NK cells, NKT and regulatory T cells

may account for IND clinical form outcome. On the other hand, the upsurge of high levels of

CD8+HLA-DR+ cells parallel with basal levels of mature NK cells, NKT and CD4+CD25high cells

might lead to cardiac disease. Moreover, enhanced frequency of total lymphocytes high

producers of IL-4, IL-10 and IL-13 besides a mixed pattern of NK and neutrophil-derived

cytokines was the hallmark of IND, whereas enhanced frequency of TNF- producing monocytes

and lower frequency of IL-10 producing CD8+ T-cells was the major features of CARD. The

assessment of the cytokine profile of circulating leukocytes applying the panoramic overview

strategy demonstrated that while most IND presented a regulatory cytokine profile, the majority

of CARD displayed a particular inflammatory cytokine milieu. Despite our findings corroborate

previous reports of distinct profiles of anti-T. cruzi IgG between IND and CARD, they indicated

that the humoral immune response biomarkers are indeed more applicable to the serological

diagnosis and cure criteria monitoring. Altogether, our data demonstrated that more than shift

toward a polarized pattern, a fine balance is relevant to drive the resultant immune-mediated

mechanisms underlying the chronic Chagas disease outcome.

SUMRIO

LISTA DE TABELA................................................................................................................ i

LISTA DE FIGURAS.............................................................................................................. ii

LISTA DE ABREVIATURAS................................................................................................ iii

1. INTRODUO.................................................................................................................... 1

2. OBJETIVOS......................................................................................................................... 17

2.1. Objetivo Geral................................................................................................................... 18

2.2. Objetivos Especficos......................................................................................................... 18

2.3. Tpicos de Investigao.................................................................................................... 19

3. MATERIAL E MTODOS................................................................................................. 20

3.1. Populao de estudo.......................................................................................................... 21

3.2. Anlise do fentipo celular dos leuccitos do sangue perifrico................................... 26

3.2.1. Protocolo de imunofenotipagem celular por citometria de fluxo............................ 26

3.2.2. Estratgias para anlises imunofenotpicas de leuccitos circulantes................... 28

3.2.2.1. Anlise convencional.................................................................................. 28

3.2.2.2. Anlise de clulas T reguladoras................................................................ 29

3.2.2.3. Anlise do marcador CD56 em subpopulaes de clulas CD3-CD16+..... 30

3.2.2.4. Anlise de subpopulaes de clulas CD3-CD56+..................................... 31

3.2.2.5. Anlise de clulas NKT.............................................................................. 33

3.2.2.6. Anlise combinada gated........................................................................ 34

3.2.2.7. Anlise de moncitos pr-inflamatrios..................................................... 35

3.3. Avaliao do padro de produo de citocinas citoplasmticas em leuccitos

circulantes..................................................................................................................................

36

3.3.1. Obteno do antgeno solvel de formas tripomastigotas do T. cruzi.................... 36

3.3.1.1. Cultivo de formas tripomastigotas do T. cruzi........................................... 36

3.3.1.2. Preparo do antgeno solvel de formas tripomastigotas do T. cruzi........... 37

3.3.2. Protocolo de cultura de curta durao in vitro empregando amostras de sangue

total.................................................................................................................................... 38

3.3.3. Protocolo de marcao de citocinas intracitoplasmticas em leuccitos do

sangue perifrico aps cultura de curta durao in vitro.................................................

39

3.3.4. Aquisio de dados para avaliao do perfil de expresso de citocinas

intracelulares.....................................................................................................................

41

3.3.5. Estratgias de anlises de citocinas intracitoplasmticas em subpopulaes de

leuccitos circulantes........................................................................................................

42

3.3.5.1. Anlise de citocinas intracitoplasmticas em moncitos............................ 42

3.3.5.2. Anlise de citocinas intracitoplasmticas em neutrfilos........................... 43

3.3.5.3. Anlise de citocinas intracitoplasmticas em clulas NK.......................... 44

3.3.5.4. Anlise de citocinas intracitoplasmticas em linfcitos totais................... 45

3.3.5.5. Anlise de citocinas intracitoplasmticas em subpopulaes de linfcitos

T e por linfcitos B..................................................................................................

45

3.3.5.6. Anlise de citocinas intracitoplasmticas em clulas B1........................... 46

3.3.6. Modelo panormico de anlise imunofenotpica por citometria de fluxo............... 47

3.4. Estudo da reatividade de IgG total anti-EPI (FC-AFEA) e IgG1 anti-TRIPO (FC-

ALTA) por citometria de fluxo................................................................................................

48

3.4.1. Obteno de preparaes antignicas do T. cruzi.................................................. 48

3.4.1.2. Cultivo de formas epimastigotas do T. cruzi.............................................. 48

3.4.1.3. Cultivo de formas tripomastigotas do T. cruzi........................................... 48

3.3.2. Protocolo de imunofluorescncia indireta por citometria de fluxo............... 49

3.3.3. Estratgias de anlises dos resultados.......................................................... 50

3.5. Anlise estatstica............................................................................................................... 52

4. ARTIGOS.............................................................................................................................. 55

4.1- Artigo 1: Chagasic patients with indeterminate clinical form of the disease have

high frequencies of circulating CD3+CD16-CD56+ natural killer T cells and

CD4+CD25High regulatory T lymphocytes..............................................................................

56

4.2- Artigo 2: Are increased frequency of macrophage-like and natural killer (NK)

cells, together with high levels of NKT and CD4+CD25high T cells balancing activated

CD8+ T cells, the key to control Chagas' disease morbidity?...............................................

68

4.3- Artigo 3: New strategy to assess the overall cytokine profile of circulating

leukocytes and decode distinct clinical status of human Chagas disease............................

leukocytes and decode distinct clinical status of human Chagas disease............................ 81

4.4- Artigo 4: Non-conventional flow cytometry approaches to detect anti-Trypanosoma

cruzi immunoglobulin G in the clinical laboratory...............................................................

109

CONSIDERAES FINAIS................................................................................................... 121

REFERNCIA BIBLIOGRFICA........................................................................................ 130

ANEXO...................................................................................................................................... 141

i

LISTA DE TABELA

Tabela 1: Populao de estudo.................................................................................................. 25

Tabela 2: Anticorpos monoclonais marcados com fluorocromos utilizados para anlise de

populaes, subpopulaes celulares e molculas de superfcie................................................

27

Tabela 3: Anticorpos monoclonais marcados com fluorocromos utilizados para anlise de

populaes e subpopulaes de leuccitos do sangue perifrico...............................................

41

Tabela 4: Anticorpos monoclonais utilizados para identificao de citocinas intracelulares

em leuccitos do sangue perifrico.............................................................................................

41

ii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Seqncia de procedimentos utilizados para as anlises dos percentuais de

populaes celulares por citometria de fluxo.............................................................................

29

Figura 2: Seqncia de procedimentos utilizados para as anlises dos percentuais de clulas

T reguladoras (CD4+CD25HIGH) por citometria de fluxo............................................................

30

Figura 3: Seqncia de procedimentos utilizados para as anlises dos percentuais das

subpopulaes de clulas NK: pr-NK (CD3-CD16+CD56-) e NK madura (CD3-

CD16+CD56+) por citometria de fluxo.......................................................................................

31

Figura 4: Seqncia de procedimentos utilizados para as anlises dos percentuais das

subpopulaes CD3-CD56DIMCD16-/+ e CD3-CD56BRIGHTCD16-/+ por citometria de fluxo.....

32

Figura 5: Sequncia de procediementos utilizados para as anlises dos percentuais das

subpopulaes NKT1 (CD3+CD16+CD56-), NKT2 (CD3+CD16-CD56+) e NKT3

(CD3+CD16+CD56+) por citometria de fluxo.............................................................................

34

Figura 6: Seqncia de passos utilizados para as anlises de subpopulaes de clulas T

CD4+ ou CD8+ ativadas (HLA-DR+) por citometria de fluxo....................................................

35

Figura 7: Seqncia de procedimentos utilizados para as anlises dos percentuais de

moncitos pr-inflamatrios (CD14+CD16+HLA-DR++) por citometria de fluxo.....................

36

Figura 8: Anlise da produo de citocinas citoplasmticas por moncitos do sangue

perifrico por citometria de fluxo...............................................................................................

43

Figura 9: Anlise da produo de citocinas citoplasmticas por neutrfilos do sangue

perifrico por citometria de fluxo...............................................................................................

43

Figura 10: Anlise da produo de citocinas citoplasmticas por clulas NK do sangue

perifrico por citometria de fluxo...............................................................................................

44

Figura 11: Anlise da produo de citocinas citoplasmticas por linfcitos totais do sangue

perifrico por citometria de fluxo ..............................................................................................

45

Figura 12: Anlise da produo de citocinas citoplasmticas por clulas T-CD4+ do sangue

perifrico por citometria de fluxo...............................................................................................

46

Figura 13: Anlise da produo de citocinas citoplasmticas por clulas B1 do sangue

perifrico por citometria de fluxo...............................................................................................

46

Figura 14: Seqncia de passos utilizados para as anlises da reatividade de IgG anti-EPI e

IgG1 anti-TRIPO do T. cruzi por citometria de fluxo................................................................

51

iii

LISTA DE ABREVIATURAS

ADCC Citotoxicidade celular dependente de anticorpos

AL Anticorpos lticos

APCs Clulas apresentadoras de antgenos (antigen presenting cells)

ASC Anticorpos da sorologia convencional

B1 Linfcitos B CD5+

BSA Albumina srica bovina

CARD Indivduos portadores da forma clnica cardaca

CD14 Molcula expressa na superfcie de moncitos

CD16 Molcula expressa em clulas Natural Killer e moncitos

CD19 Molcula expressa em linfcitos B

CD25 Cadeia do receptor para a citocina IL-2

CD3 Molcula expressa em linfcitos T

CD4 Molcula expressa em linfcitos T auxiliares

CD5 Molcula expressa em linfcitos B1

CD8 Molcula expressa em linfcitos T citotxicos

CD56 Molcula de adeso presente em clulas Natural Killer

DIG Indivduos portadores da forma clnica digestiva

ECG Eletrocardiograma

EDTA Etilenodiaminotetractico

EPI Formas epimastigotas do Trypanosoma cruzi

FITC Isotiocianato de fluorescena

FL Fluorescncia

FSC Tamanho (forward scatter)

HAI Reao de hemaglutinao indireta

HLA Antgeno Leucocitrio Humano

Id Anticorpo anti-idiotipo

IFI Imunofluorescncia indireta

IFN- Interferon gama

Ig Imunoglobulina

iv

IgG Imunoglobulina G

IL Interleucina

IMF Intensidade Mdia de Fluorescncia

IND Indivduos portadores da forma clnica indeterminada

LIT Meio de cultivo para formas epimastigotas do Trypanosoma cruzi (Liver Infusion

Tryptose)

MFF Soluo Fixadora

MHC Complexo principal de histocompatibilidade

NI Grupo no infectado

NK Clulas Natural Killer

NKT Subpopulao de clulas T que expressa em sua superfcie receptores de clulas NK

NO xido Ntrico

PBS Tampo Fosfato Salnico

PBS-P PBS-W a 0,5% de saponina

PBS-W PBS a 0,5% de albumina srica bovina

PE Ficoeritrina

PPFP Percentual de Parasitos Fluorescentes Positivos

RPMI Meio de cultura (Rosweel Park Memorial Institute)

SBF Soro bovino fetal

SES Secretaria de Estado de Sade de Minas Gerais

SSC Granulosidade (side scatter)

TCR Receptor de clula T

TGF- Fator de Crescimento Transformante beta

TNF- Fator de Necrose Tumoral alfa

WHO Organizao Mundial da Sade (World Health Organization)

1. INTRODUO

Introduo

_________________________________________________________________________________________________________________________________

2

Carlos Chagas, mdico brasileiro, descobriu a doena de Chagas a aproximadamente

um sculo atrs e publicou sua primeira descrio em 1909. A descoberta dessa doena

consistiu em uma das mais importantes conquistas mdicas do Brasil. Carlos Chagas

descreveu tanto aspectos da biologia do agente etiolgico, o Trypanosoma cruzi, como da

clnica, epidemiologia e patogenia da doena (CHAGAS, 1909). Entretanto, apesar do avano

nos estudos da doena de Chagas nas ltimas dcadas, questionamentos ainda permanecem

relativos interao parasito-hospedeiro, progresso clnica da infeco e mecanismos

indutores de proteo e patologia.

Como parte das comemoraes do centenrio da descoberta da doena de Chagas, a

FIOCRUZ criou o Programa Integrado de Doena de Chagas-PIDC que tem como pilares (1)

estimular a cooperao intra-FIOCRUZ visando dar retorno sociedade quanto aos desafios

atuais da doena de Chagas; (2) assegurar contribuio efetiva da FIOCRUZ para o controle

da doena de Chagas no sculo XXI, estabelecendo metas de pesquisa e desenvolvimento

tecnolgico para 2009; (3) possibilitar a retomada de liderana da FIOCRUZ no campo da

pesquisa e interveno em doena de Chagas no seu segundo centenrio, fortalecendo as

interaes extramuros da FIOCRUZ; (4) articular projetos visando o estabelecimento de

compromissos de gerao de inovao na pesquisa em doena de Chagas e a captao de

financiamentos. Esse estudo, alm de outros desenvolvidos no Instituto Ren Rachou, vem

contribuir com os ideais do PIDC, uma vez que investiga mecanismos imunolgicos

envolvidos no estabelecimento/manuteno de diferentes formas clnicas da doena de

Chagas.

A doena de Chagas ocorre em reas rurais e peri-urbanas do Mxico, Amrica

Central e Amrica do Sul. Dados da Organizao Mundial da Sade mostram a ocorrncia de

vinte e uma mil mortes e a incidncia de duzentos mil novos casos ao ano na Amrica Latina

Introduo

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3

(WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2002), com 12 a 14 milhes de pessoas infectadas na

Amrica Latina (DIAS, 2007).

No Brasil, a doena de Chagas a quarta causa de morte entre as doenas infecto-

parasitrias, ocorrendo em uma rea de trs milhes de quilmetros quadrados. So cerca de

2.450 municpios, envolvendo uma populao de mais de 28 milhes de pessoas expostas ao

risco de contaminao e uma populao de aproximadamente cinco milhes de indivduos

infectados (DIAS et al., 1997). Nos ltimos 5 anos foram notificados mais de 470 casos de

infeco aguda, quase 90% deles ocorreram na Amaznia Legal, sendo 75% no Par

(BRASIL, s.d.).

Em regies onde os programas de controle do triatomneo, inseto vetor da doena, so

ineficazes, a infeco se d principalmente pelo contato da pele ou mucosa do hospedeiro

vertebrado com fezes e/ou urina do triatomneo contaminado pelo protozorio T. cruzi. Os

vetores se infectam quando formas tripomastigotas sangneas so ingeridas durante a suco

do sangue do hospedeiro vertebrado infectado. Uma vez no intestino posterior do inseto, as

formas tripomastigotas se transformam em formas epimastigotas, que se multiplicam por

diviso binria e, posteriormente, passam por alteraes morfolgicas e fisiolgicas

transformando-se em tripomastigotas metacclicos no reto do inseto, estando, ento aptas a

penetrar em clulas do hospedeiro mamfero. Essas formas, aps o repasto sangneo, so

eliminadas juntamente com as fezes do vetor, penetrando na pele lesada pela picada ou em

mucosas ntegras. Na regio de penetrao do parasito, ocorre a infeco de clulas

principalmente do sistema fagoctico - mononuclear e/ou do prprio tegumento. Aps ciclo

focal de poucos dias, o parasito se difunde por via hematognica e linftica, com

multiplicao em vrios rgos e tecidos, ocorrendo como caracterstica fundamental uma

intensa parasitemia, detectvel por exames parasitolgicos diretos. No interior de clulas, as

formas tripomastigotas se transformam em amastigotas, que conseguem escapar do vacolo

Introduo

_________________________________________________________________________________________________________________________________

4

parasitfago para o citoplasma, onde se inicia um processo de diviso binria. Aps a

multiplicao, as formas amastigotas transformam-se em tripomastigotas que rompem a clula

e, uma vez na circulao sangnea, podem infectar novas clulas ou serem ingeridas por

outro inseto vetor, dando continuidade ao ciclo biolgico do parasito (BRENER et al., 1973;

GARCIA et al., 1991; DIAS, 2000).

Quando se estudam os mecanismos de transmisso, observa-se que, alm da

transmisso vetorial, casos de transmisso alternativos, como a via transfusional (YOUNG et

al., 2007), congnita (DORN et al., 2007; GRTLER et al., 2003), por transplantes de rgos

(CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION, 2006) e acidentes

laboratoriais podem ser identificados. A via transfusional considerada a segunda via mais

freqente de infeco, tendo especial importncia epidemiolgica, uma vez que pode levar a

doena para reas sem transmisso natural (WENDEL, 1997; SCHOFIELD & DIAS 1999;

VINHAES & DIAS, 2000). Alm disso, em regies como na Amaznia, existem mecanismos

excepcionais de transmisso (vetorial domiciliar sem colonizao, vetorial extradomiciliar) e

a ocorrncia de surtos episdicos de transmisso oral (BRASIL, 2005a, COURA, 2006).

Recentemente, ocorreram surtos de doena de Chagas com forma aguda e morte por ingesto

de formas tripomastigotas dissolvidas em bebidas, como suco de cana e aa, em que os

insetos vetores silvestres, provavelmente, foram triturados durante o preparo ou suas fezes

contaminaram o alimento, conforme divulgado amplamente na mdia e no Guia de Vigilncia

Epidemiolgica do Ministrio da Sade (BRASIL, 2005b).

A anlise clnica e laboratorial de pacientes portadores da doena de Chagas permite

classificar a infeco em duas fases: aguda e crnica. A fase aguda caracteriza-se por

alteraes teciduais degenerativas e inflamatrias focais, devido a uma intensa multiplicao

local do parasito. Manifestaes sistmicas, como febre, mal estar, astenia, edema subcutneo,

linfadenomegalia, esplenomegalia e hepatomegalia, podem tambm ser observadas

Introduo

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5

(LARANJA, 1953; REZENDE & RASSI, 1994; BRASIL, 2004). Entretanto, em geral, esses

sinais so atenuados e a fase inicial da doena passa desapercebida, confundindo-se com uma

"gripe" ou "mal estar" passageiro.

A evoluo da fase aguda para a fase crnica, que pode durar de poucas semanas a

meses, acompanhada pelo gradativo desaparecimento das manifestaes clnicas,

diminuio da parasitemia e elevao de anticorpos especficos da classe IgG. Os indivduos

portadores da infeco crnica podem ser classificados do ponto de vista clnico, como

pertencentes s formas indeterminada (IND), cardaca (CARD), digestiva (DIG) e

cardiodigestiva. A imensa maioria dos pacientes evolui para uma forma crnica

indeterminada, caracterizada pela sorologia positiva, ausncia de sinais, sintomas da doena e

eletrocardiograma-ECG e raio-X (corao, esfago e clon) normais. Os pacientes

apresentam de forma geral, bom estado de sade, desconhecendo, muitas vezes, a presena da

infeco. Estima-se que cerca de 50-60% dos indivduos infectados apresentam essa forma

clnica. Embora reconhecendo que o prognstico favorvel, sabe-se que, anualmente, cerca

de 2 a 5% desses indivduos evoluem para formas sintomticas da doena. Aps 20-30 anos

de infeco, cerca de 20-30% dos indivduos portadores da forma clnica IND desenvolvem a

forma CARD, resultante de danos progressivos do miocrdio, secundrios miocardite

fibrosante (DIAS, 1989; PRATA, 2001). A infeco chagsica pode levar ainda a dilataes

do esfago e clon, principais manifestaes da forma clnica DIG. Essa forma clnica ocorre

em menos de 10% dos indivduos portadores da doena, sendo resultado, principalmente, da

formao de fibrose e da destruio dos neurnios do sistema nervoso autnomo do trato

gastrointestinal (KOEBERLE & NADOR, 1955; DIAS, 1989; DA SILVEIRA et al.,

2007a,b). Pessoas infectadas pelo T. cruzi com o sistema imune debilitado (AIDS,

quimioterapia, terapias imunossupressoras) podem reativar a doena de Chagas com

abundante parasitemia sangunea e tecidual. Devido longa durao da forma assintomtica

Introduo

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da infeco, a doena de Chagas considerada uma doena matadora silenciosa

(MAGUIRE, 2006), esse constitui um dos vrios motivos pelos quais a doena no atrai a

ateno da mdia (TARLETON et al., 2007).

O benzonidazol o composto disponvel para o tratamento da doena de Chagas no

Brasil. Esse composto apresenta srios efeitos colaterais, requer administrao por longos

perodos de tempo sob superviso mdica e h grande variao na susceptibilidade de isolados

do parasito ao dessa droga, sendo recomendado o tratamento de pacientes agudos e

crnicos recentes, nos quais se observam resultados positivos, principalmente em crianas

menores de 15 anos (URBINA & DOCAMPO, 2003). Apesar da maioria dos estudos

revelarem uma baixa eficincia desse frmaco durante a terapia de pacientes crnicos,

avaliaes recentes tm sugerido o tratamento de modo a retardar, ou mesmo evitar, a

evoluo da doena crnica (ANDRADE et al., 2004; DE CASTRO et al., 2006; VIOTTI et

al., 2006).

Uma questo chave que envolve a doena de Chagas o diagnstico. Sem um

diagnstico correto, indivduos infectados no podem ser identificados, conseqentemente,

tratados e a eficincia do tratamento no pode ser corretamente avaliada. O efeito de

campanhas de controle no pode ser avaliado sem ferramentas de diagnstico competentes.

Na fase crnica, os nveis de parasitemia encontram-se baixos e assim o diagnstico se baseia

na deteco da resposta sorolgica do hospedeiro. A maioria dos testes sorolgicos

disponveis emprega preparaes de antgeno bruto de formas epimastigotas do T. cruzi, nica

forma do ciclo de vida do parasito que no encontrada no hospedeiro vertebrado, podendo

ser responsvel pelos resultados falso-positivos. A especificidade desses ensaios tem sido

questionada devido freqncia de infeces com outros tripanosomatdeos que circulam na

mesma rea geogrfica do T. cruzi (Leishmania spp e Trypanosoma rangeli) e so

responsveis pela antigenicidade cruzada e resultados falso-positivos. A ausncia de um teste

Introduo

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padro-ouro torna difcil a avaliao da sensibilidade de testes sorolgicos que podem ser

teis na avaliao rpida da eficcia do tratamento, do diagnstico de infeco congnita ou

para determinar o impacto de mtodos de controle de transmisso, compondo base para o

avano de todos os campos de pesquisa na doena de Chagas (TARLETON et al., 2007).

Os mecanismos especficos envolvidos com o estabelecimento/manuteno das

diferentes formas clnicas da doena de Chagas so complexos. No se sabe explicar como

alguns indivduos infectados desenvolvem formas graves da doena e nem o fato das

manifestaes clnicas serem to heterogneas. Acredita-se que as manifestaes patolgicas

tanto na fase aguda, quanto na fase crnica da doena de Chagas sejam conseqncia de

mecanismos multifatoriais relacionados tanto ao parasito quanto ao hospedeiro vertebrado.

Dentre os fatores relacionados ao parasito, anlises em camundongos revelaram que a

variabilidade das cepas, o tropismo, a antigenicidade e o tamanho do inculo so aspectos

relevantes (VAGO, 2000). Quanto ao hospedeiro, importante ressaltar o estado nutricional,

a faixa etria, o sexo e, especialmente, as caractersticas genticas e imunolgicas (DIAS,

2000; ARANTES et al.; 2007; CAMPBELL et al., 2004).

A resposta imune durante a infeco humana inicial pelo T. cruzi (aguda recente,

aguda tardia e crnica recente) no completamente entendida, apesar da sua funo crucial

no direcionamento das diferentes formas clnicas da infeco crnica. Estudos demonstram

que o T. cruzi induz uma forte ativao do sistema imune durante a infeco aguda e que os

diferentes mecanismos imunes induzidos durante estgios iniciais da fase crnica

indeterminada da infeco representam componentes essenciais da atividade imune presente

na fase crnica tardia (ANDRADE, 1991; BRENER & GAZZINELLI, 1997; MARINHO et

al., 1999; SATHLER-AVELAR et al., 2003; GOLGHER & GAZZINELLI, 2004). Na busca

de identificar diferenas na resposta imune relacionadas com o estabelecimento/manuteno

das distintas formas clnicas da fase crnica tardia da doena de Chagas, de suma

Introduo

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importncia caracterizar subpopulaes leucocitrias majoritrias e minoritrias do sangue

perifrico de indivduos durante os eventos iniciais da infeco, assim como comparar com as

alteraes observadas em indivduos na fase crnica tardia da doena. Estudo fenotpico

realizado durante a infeco recente pelo T. cruzi, aps classificao com base na sorologia,

descreveu no grupo agudo recente uma supresso da atividade de linfcitos T, ativao de

linfcitos B e o favorecimento da migrao de moncitos para o foco inflamatrio. Na fase

aguda tardia, foi observada a ativao de clulas NK independente de clulas T e na fase

crnica recente foi encontrado um aumento na populao de linfcitos B ao lado de um

aumento na populao dos moncitos pr-inflamatrios sugerindo uma natureza independente

de linfcitos T (SATHLER-AVELAR et al., 2003). Esses autores acreditam que a imunidade

mediada por clulas T durante a forma clnica indeterminada recente da doena de Chagas

pode representar um fenmeno restrito aos focos inflamatrios, considerando relatos prvios

da presena de clulas T, principalmente linfcitos T CD8+, no infiltrado inflamatrio do

tecido cardaco de indivduos infectados pelo T. cruzi (FUENMAYOUR et al., 2005). Estudo

realizado em modelo experimental murino para a infeco pelo T. cruzi demonstrou que o

aparecimento no corao de clulas T produtoras de citocinas est correlacionado com o

aumento local da expresso de molculas de adeso celular, o que seria consistente com a

migrao de linfcitos T para o foco inflamatrio (FUENMAYOUR et al., 2005). Nesse

estudo, os autores propem que a inflamao crnica no corao chagsico altamente ativa e

est relacionada com um padro imunolgico estvel que se estende desde a fase aguda

recente at estgios tardios da fase crnica.

HIGUCHI et al. (1993a) utilizando tcnicas de imunohistoqumica estabeleceram uma

associao entre a presena de antgenos do T. cruzi e a formao de infiltrados inflamatrios

no tecido cardaco de pacientes com miocardite chagsica. Esse mesmo grupo avaliou o

fentipo das clulas do infiltrado inflamatrio, encontrando um predomnio de clulas T CD8+

Introduo

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(HIGUCHI et al., 1993a,b). Estudos desenvolvidos por REIS et al. (1993) mostram ainda que

estas clulas CD8+ expressavam granzima A, um marcador para linfcitos T citolticos. Esses

autores atribuem clula T CD8+ e a seus produtos, a fibrose e a citlise observadas no tecido

cardaco nos pacientes portadores de miocardite chagsica.

No contexto da forma clnica DIG, os estudos que avaliam os elementos envolvidos

nos mecanismos imunopatolgicos no tubo digestivo so ainda escassos. LEMOS et al.,

(1998), em estudo pioneiro, demonstraram um predomnio de linfcitos CD4+ no infiltrado

inflamatrio do esfago e do clon de pacientes chagsicos portadores de mega decorrentes

da forma DIG. DA SILVEIRA et al. (2007a,b) demonstram ainda que o desenvolvimento de

megaclon aps a infeco aguda pelo T. cruzi est associado com a manuteno da invaso

de gnglios entricos por linfcitos T citotxicos e perda da inervao de msculos.

Devido a limitaes ticas de se estudar o perfil fenotpico do infiltrado inflamatrio e

leses teciduais decorrentes da infeco crnica da doena de Chagas, vrios pesquisadores

tm utilizado o sangue perifrico como estratgia para avaliar a resposta imunolgica

desencadeada durante a fase crnica da doena. O estudo do sangue perifrico de pacientes na

fase crnica da doena de Chagas demonstra grande nmero de linfcitos T ativados e B

circulantes, alm de diminuio significativa no percentual de linfcitos T CD3+. Linfcitos B

CD5+ esto presentes em alto percentual na circulao destes pacientes (DUTRA et al., 1994).

Aps estimulao in vitro por antgenos do T. cruzi ou por anticorpos humanos anti-

epimastigotas, atravs de estimulao idiotpica, observa-se proliferao diferenciada das

populaes celulares. Dessa forma, a estimulao por antgenos de T. cruzi leva expanso

preferencial de linfcitos T ativados, enquanto a estimulao idiotpica estimula

preferencialmente linfcitos B CD5+ e linfcitos T CD8+ (DUTRA et al., 2000). Na forma

clnica DIG, inverso da razo CD4/CD8 foi descrita contrastando com resultados em CARD

nos quais a razo normal. Ainda em pacientes da forma DIG reduo do percentual de

Introduo

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clulas CD4+CD28+ e um aumento na expresso de linfcitos T ativados (HLA-DR+) foram

observados (LEMOS et al., 1998).

Considerando a complexidade das interaes imunolgicas desencadeadas durante a

infeco pelo T. cruzi, ainda so necessrios esclarecimentos mais detalhados a respeito das

populaes e subpopulaes celulares diretamente envolvidas nos mecanismos de resistncia

e morbidade da doena. A deteco de molculas expressas na superfcie de clulas, atravs

da citometria de fluxo, empregando sistemas de anlises mais elaborados e protocolos

experimentais atuais, que permitem a anlise simultnea de um maior nmero de molculas

por superfcie celular, trouxe a possibilidade de identificar e/ou caracterizar novas sub-

populaes, trazendo assim, informaes adicionais que podem enriquecer os conhecimentos

acerca das diferentes formas clnicas da doena de Chagas.

Ao analisar macrfagos, seja em humanos seja em camundongos, observam-se duas

populaes fenotipicamente distintas: CD14++CD16- e CD14+CD16+. Em indivduos

saudveis, as clulas CD14+CD16+ correspondem aproximadamente a 10% da populao de

moncitos. Entretanto, em indivduos com infeces graves, o nmero de moncitos

CD14+CD16+ encontra-se consideravelmente aumentado (NOCKHER et al., 1998;

SKRZECZYSKA et al., 2002). Tais moncitos expressam altos nveis da molcula HLA-

DR em sua superfcie, sintetizam elevados nveis de TNF- e quantidades basais de citocinas

reguladoras como IL-10, sendo denominados moncitos pr-inflamatrios (BELGE et al.,

2002). Os altos nveis de TNF- provavelmente decorrem da elevada expresso de receptores

dirigidos a componentes estruturais dos agentes infecciosos, como exemplo temos o LPS

atuando sobre os receptores Toll-like 4 (TLR-4) em clulas dendrticas ativadas (THOMA-

USZYNSKI et al., 2000). CAMPOS et al. (2001) demonstraram que glicoprotenas (GPIs) e

glicolipdios (GIPLs) derivados de T. cruzi podem se ligar ao receptor Toll-like 2 de

moncitos e induzir a sntese de IL-12, TNF- e xido ntrico (NO). OLIVEIRA et al. (2004),

Introduo

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estudando a funo de TLR-4 na doena de Chagas, constataram que camundongos

deficientes para este receptor so altamente susceptveis infeco pelo T. cruzi, com elevada

parasitemia e taxa de mortalidade. Isso se deve falha na interao de GIPLs do parasita com

os receptores TLR-4 presentes em moncitos, indicando sua importncia na ativao da

resposta imune protetora. Atualmente, ateno especial tem sido dada aos TLR devido ao seu

papel na ativao de clulas NK durante infeces bacterianas e por protozorios. LAUZON

et al. (2003) demonstraram que antgenos derivados de Leishmania sp. ao se ligarem aos

receptores TLR-2 aumentam a produo das citocinas IFN- e TNF- e a translocao nuclear

de NF-B pelas clulas NK. Esse mesmo grupo, recentemente, verificou que as clulas NK

possuem diversos TLRs, que esto diretamente relacionados com o aumento da produo de

citocinas e citotoxicidade celular (LAUZON et al., 2006). No contexto da doena de Chagas,

pouco se sabe sobre a interao de antgenos do T. cruzi e os TLRs presentes em NK, mas

pertinente sugerir que a interao desses antgenos com esses receptores pode ser importante

na ativao de clulas NK na fase aguda e crnica da doena de Chagas.

bem aceito que a ausncia de patologia em indivduos infectados pelo T. cruzi est

associada com a capacidade do indivduo em regular a resposta anti-T. cruzi, responsvel pelo

controle da parasitemia persistente e do dano inflamatrio tecidual, caractersticos da doena

de Chagas (BRENER et al., 1997). Certamente, o dano tecidual frente inflamao deve ser

mais grave na ausncia de mecanismos reguladores que envolvem tanto a resposta imune

inata eficaz quanto a adaptativa. Estudos tm demonstrado que existem vrios tipos de clulas

com funo reguladora, algumas induzidas em resposta a um estmulo infeccioso e outras

consideradas reguladoras naturais (BLUESTONE & ABBAS, 2003; PICCIRILLO &

SHEVACH, 2004; BELKAID & ROUSE, 2005). As clulas T reguladoras foram descritas

como uma populao nica CD4+CD25+ que regulam respostas imunes inata e adaptativa e

que possuem a capacidade de controlar respostas imunes efetoras excessivas ou mal

Introduo

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direcionadas, incluindo respostas contra patgenos ou antgenos prprios (MALOY &

POWRIE, 2001; GAVIN et al., 2001; SHEVACH, 2002; TRZONKOWSKI et al., 2004).

Vrios mecanismos pelos quais as clulas T reguladoras realizam suas atividades

moduladoras tm sido propostos, incluindo a inibio da atividade citotxica pela regulao

negativa de IL-12 e CD25 em linfcitos T CD8+ ou atravs de contato direto com essas

clulas efetoras (PICCIRILLO & SHEVAC, 2001; GROSSMAN et al., 2004; OGARRA &

VIEIRA, 2004; TRZONKOWSKI et al., 2004; CASSIS et al., 2005,). Embora em modelos

experimentais murinos, as clulas T CD4+ reguladoras sejam caracterizadas por apresentarem

o fentipo CD4+CD25+, sendo todas possuidoras de potencial papel regulador, caracterizado

por uma diminuio de produo de citocinas e habilidade de inibir proliferao celular in

vitro, em humanos, apenas as CD4+CD25HIGH apresentam esta habilidade. No contexto da

doena de Chagas, ARAJO e colabores (2007) demonstraram freqncia aumentada de

clulas CD4+CD25HIGHFOXP3+ em pacientes da forma IND quando comparados com

pacientes portadores da forma clnica cardaca, indicando que estas clulas teriam funo

importante na manuteno da forma clnica indeterminada da doena de Chagas.

Semelhantemente s clulas T reguladoras, as clulas NKT tm sido descritas como

uma subpopulao relevante tanto na funo inata (GODFREY et al., 2000; KRONENBERG

& GAPIN, 2002), quanto na atividade anti-tumoral (GODFREY & KRONENBERG, 2004;

VAN DER VLIET et al., 2004) e reguladora (HAMMOND & KRONENBERG, 2003;

MATSUDA et al., 2003), apresentando atividades sob o controle de clulas acessrias e

fatores solveis do micro-ambiente local (LEITE-DE-MORAES et al., 1997; GODFREY &

KRONENBERG, 2004). Estudos fenotpicos demonstraram que clulas NKT compreendem

uma subpopulao de clulas T, distinta das clulas T convencionais, por expressarem

receptores de clulas NK como o CD16, CD56 e/ou CD161, sendo o CD56 o melhor

marcador para definir os subgrupos de clulas NKT (ORTALDO et al., 1991; GODFREY et

Introduo

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al., 2000). As funes reguladoras das clulas NKT previnem doenas auto-imunes e

cooperam com respostas protetoras contra patgenos (GODFREY et al., 2000; GODFREY &

KRONENBERG, 2004). Clulas NKT inibem vrias doenas auto-imunes, incluindo diabetes

tipo 1, lupus eritromatoso sistmico e artrite reumatide. A populao de clulas NKT est

diminuda nessas doenas, impedindo sua ao de prevenir respostas imunes autodestrutivas

(KOJO et al., 2003; GODFREY & KRONENBERG, 2004; VAN DER VLIET et al., 2004).

Durante infeces, clulas NKT secretam citocinas pr-inflamatrias que estimulam respostas

inata e adaptativa que eliminam o patgeno (EMOTO et al., 2003). Por outro lado, clulas

NKT secretam citocinas antiinflamatrias que limitam infeces induzidas por patgenos

(TANIGUCHI et al., 2003; VAN KAER, 2004). Ainda obscuro como as clulas NKT

exacerbam respostas inflamatrias para controlar patgenos durante infeces, enquanto

favorecem uma resposta antiinflamatria em outras infeces, prevenindo dano tecidual

induzido pela infeco. Recentemente, foi demonstrado em modelo experimental murino de

infeco pelo T. cruzi, que as clulas NKT apresentam funo importante em ambas as

respostas, pr-inflamatria e antiinflamatria (DUTHIE et al., 2005). Esses autores sugerem

que clulas NKT invariantes limitam respostas inflamatrias, enquanto clulas NKT variantes

aumentam respostas inflamatrias que contribuem para a morbidade e mortalidade. Assim,

subpopulaes de clulas com funes distintas podem preferencialmente direcionar eventos

imunomoduladores, enquanto outras direcionam para respostas imunes inflamatrias. Essas

observaes sugerem que o sucesso no controle da infeco pelo T. cruzi e da doena de

Chagas envolve o desenvolvimento de uma resposta imune modulada suficiente para controlar

a infeco na ausncia de extensa destruio tecidual.

Ainda no contexto da imunomodulao, a rede de citocinas um importante circuito

que determina a morbidade da doena de Chagas. Estudos demonstram uma correlao entre a

secreo de IFN- e o desenvolvimento de doena cardaca grave e o papel de IL-10

Introduo

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14

controlando a imunopatologia (BAHIA-OLIVEIRA et al., 2000; GOMES et al., 2003).

Entretanto, o fato de uma grande proporo de indivduos indeterminados tambm

produzirem nveis elevados de IFN-, em adio a outras citocinas inflamatrias levantou a

hiptese de que mais do que uma mudana para um perfil de citocinas polarizadas, um fino

balano de citocinas inflamatrias e reguladoras derivadas de diferentes fontes possa

contribuir para os mecanismos imuno-mediados relacionados s diferentes formas clnicas da

doena. De fato, tem sido demonstrado que enquanto moncitos de pacientes das formas

clnicas IND e CARD so capazes de produzir IL-10, e alguns IND produzem altos nveis de

IFN- por linfcitos T, moncitos de IND produzem nveis mais altos de IL-10, quando

comparados com moncitos de pacientes da forma clnica cardaca (CORRA-OLIVEIRA et

al., 1999; GOMES et al., 2003; SOUZA et al., 2004). Esses achados enfatizam que o balano

de citocinas representa um elemento chave no estabelecimento/manuteno das diferentes

formas clnicas. Assim, avaliar a produo de diferentes citocinas com caractersticas

inflamatrias e reguladoras produzidas por subpopulaes de leuccitos da imunidade inata e

adaptativa representa estratgia adequada para caracterizao do perfil de indivduos

portadores das diferentes formas clnicas da doena de Chagas.

A induo e/ou modulao da resposta do hospedeiro a antgenos derivados do

parasito no deve ser avaliada de forma limitada, restrita a funes imunolgicas celulares.

Existem evidncias do envolvimento da resposta humoral nos eventos que acompanham a

evoluo da doena de Chagas. Anticorpos anti-T. cruzi so amplamente detectados em

portadores da doena de Chagas (BRENER, 1980). Os estudos da imunidade humoral foram

revolucionados por KRETTLI & BRENER (1982), quando foi demonstrada a existncia de

duas categorias de anticorpos, funcionalmente distintos, no soro de hospedeiros infectados

pelo T. cruzi, os quais foram denominados anticorpos da sorologia convencional (ASC) e

anticorpos lticos (AL). Os ASC, tambm denominados no protetores, so encontrados no

Introduo

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15

soro de hospedeiros infectados pelo T. cruzi mesmo aps quimioterapia eficaz. Esses

anticorpos so identificados in vitro por tcnicas sorolgicas de rotina. Por outro lado,

anticorpos da categoria AL, tambm conhecidos como anticorpos protetores, so encontrados

apenas no soro de hospedeiros com infeco ativa, desaparecendo aps a cura por interveno

teraputica especfica para a doena de Chagas. Esses anticorpos so especficos para epitopos

presentes na superfcie de formas tripomastigotas vivas do T. cruzi, sendo identificados in

vitro atravs das tcnicas de lise mediada pelo complemento (GALVO et al., 1993) e, mais

recentemente, pela citometria de fluxo (MARTINS-FILHO et al., 1995). Por serem capazes

de induzir a lise mediada pelo complemento de formas tripomastigotas sangneas, os

anticorpos da categoria AL tm sido considerados importantes no controle da parasitemia na

fase crnica da infeco pelo T. cruzi, e assim, a sua presena, indireta ou diretamente,

poderia estar associada ao estabelecimento da forma clnica IND. Entretanto, esse mecanismo

hipottico necessita ainda de investigaes complementares. Considerando que os estudos

sorolgicos baseados na citometria de fluxo constituem um campo com grandes

possibilidades de crescimento, devido ao aumento da sensibilidade de deteco, em relao a

outros mtodos (MARTINS-FILHO et al., 1995), a avaliao da resposta humoral por meio

da reatividade de anticorpos que se ligam a formas epimastigotas e tripomastigotas do T. cruzi

por citometria de fluxo (FC-AFEA e FC-ALTA) permitir ampliar o conhecimento desses

eventos imunolgicos. importante salientar que esse sistema isento de variabilidades

metodolgicas inerentes ao analista e com sensibilidade e especificidade muito superiores aos

diferentes protocolos de deteco e revelao convencionais, podendo assim trazer novas

perspectivas para os estudos sorolgicos aplicados ao diagnstico, prognstico, e critrio de

cura da doena de Chagas (MARTINS-FILHO et al., 2002).

Em suma, considerando o exposto, podemos observar que diversos mecanismos da

resposta imune tm sido propostos e apresentados como elos no estabelecimento/manuteno

Introduo

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16

das diferentes formas clnicas na fase crnica da doena de Chagas. Entretanto, o grande

avano em tcnicas imunolgicas tem permitido a elaborao de perguntas ainda mais

refinadas e o estabelecimento de novas hipteses que podem estar associadas ao complexo

conjunto de interaes que envolvem a doena de Chagas humana. Nesse sentido,

acreditamos que o estudo de caractersticas fenotpicas adicionais de populaes e

subpopulaes leucocitrias do sangue perifrico, atravs do uso de novas estratgias de

anlises, bem como a investigao do panorama de citocinas intracitoplasmticas de

leuccitos circulantes, em paralelo ao estudo da reatividade de anticorpos IgG anti-T. cruzi,

apresenta-se como uma estratgia atual e relevante para subsidiar o entendimento do

fenmeno da cronificao diferenciada na doena de Chagas.

2. OBJETIVOS

Objetivo

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2.1. Objetivo Geral

Investigar aspectos imunolgicos celulares e humorais na fase crnica da doena de Chagas

com nfase no perfil fenotpico e panorama de citocinas intracitoplasmticas de leuccitos

circulantes e na reatividade de anticorpos IgG anti-Trypanosoma cruzi.

2.2. Objetivos Especficos

1. Caracterizar aspectos fenotpicos de leuccitos circulantes a fim de estabelecer

biomarcadores capazes de decodificar diferentes formas clnicas da infeco crnica pelo T.

cruzi.

2. Instituir um novo modelo para a anlise do perfil panormico de citocinas

intracitoplasmticas de leuccitos do sangue perifrico em portadores das formas clnicas

indeterminada e cardaca.

3. Explorar as aplicabilidades de tcnicas no convencionais para o estudo da reatividade

sorolgica anti-T. cruzi aplicada em estudos clnicos da doena de Chagas.

Tpicos de Investigao

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19

2.3. Tpicos de Investigao

Estudar de forma descritivo-analtica o perfil fenotpico de leuccitos do sangue

perifrico de indivduos portadores das formas clnicas indeterminada, cardaca e

digestiva, com nfase na anlise de clulas T CD4+ e CD8

+ ativadas, subpopulaes de

clulas NK e NKT e na freqncia de clulas T reguladoras (Artigo 1);

Caracterizar o perfil fenotpico de leuccitos do sangue perifrico de indivduos

portadores da fase crnica recente, focalizando em subpopulaes de clulas T e B,

marcadores de ativao e de adeso celular, subpopulaes de moncitos, clulas NK

e NKT e na freqncia de clulas T reguladoras (Artigo 2);

Correlacionar os principais achados imunofenotpicos de leuccitos do sangue

perifrico observados em portadores das formas clnicas indeterminada e cardaca

(Artigo 2);

Estabelecer uma nova estratgia para anlise panormica do perfil de citocinas

intracitoplasmticas de leuccitos circulantes associados imunidade inata e

adaptativa (Artigo 3).;

Caracterizar o impacto da estimulao in vitro com antgenos de formas

tripomastigotas do T. cruzi no panorama de citocinas intracitoplasmticas de

leuccitos circulantes associados imunidade inata e adaptativa (Artigo 3).

Avaliar a aplicabilidade da pesquisa de anticorpos IgG anti-formas epimastigotas

fixadas do T. cruzi (FC-AFEA) no diagnstico sorolgico da Doena de Chagas

(Artigo 4);

Caracterizar o potencial da pesquisa de anticorpos IgG1 anti-formas tripomastigotas

vivas do T. cruzi (FC-ALTA) e da FC-AFEA para fins prognsticos na monitorao

clnica da infeco crnica pelo T. cruzi (Artigo 4);

Avaliar o desempenho da FC-AFEA como tcnica complementar na monitorao de

cura ps-teraputica etiolgica da Doena de Chagas (Artigo 4).

3. MATERIAL E MTODOS

Material e Mtodos

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21

3.1. Populao de estudo

Os dados que compem as publicaes 1 Chagasic patients with indeterminate

clinical form of the disease have high frequencies of circulating CD3+CD16

-CD56

+ natural

killer T cells and CD4+CD25

High regulatory T lymphocytes e 2 Are increased frequency of

macrophage-like and natural killer (NK) cells, together with high levels of NKT and

CD4+CD25

high T cells balancing activated CD8

+ T cells, the key to control Chagas' disease

morbidity? correspondem ao objetivo especfico 1.

Para cumprir o proposto no objetivo especfico 1, foram selecionados 54 indivduos,

sendo 13 crianas e 41 adultos. Todos os participantes foram submetidos a testes de sorologia

convencional especficos para o diagnstico da doena de Chagas. Os indivduos pertencentes

ao grupo de pacientes chagsicos apresentaram resultados concomitantemente positivos nas

reaes de hemaglutinao indireta (HAI) e imunofluorescncia indireta (IFI) para o T. cruzi.

Considerando que esse estudo teve como objetivo realizar uma anlise de diferentes

parmetros imunolgicos associados morbidade da infeco pelo T. cruzi, todos pacientes

foram submetidos a exames clnicos, radiolgicos e eletrocardiogrficos que permitiram

agrup-los como pacientes portadores da forma clnica indeterminada recente (Early

INDeterminate chronic phase E-IND), indeterminada crnica (IND), cardaca crnica

(CARD) e digestiva crnica (DIG). Indivduos dos grupos E-IND e IND foram selecionados a

partir da comprovao da infeco chagsica na ausncia de manifestaes clnicas,

eletrocardiogrficas ou radiolgicas de acometimento cardaco ou digestivo. A segregao

entre os indivduos crnicos recentes (E-IND) e tardios (IND) foi feita de acordo com o

Consenso Brasileiro em Doena de Chagas (2005) que considera como recente o perodo de

cinco a doze anos aps a infeco inicial. Os portadores da forma clnica CARD foram

caracterizados pela presena de sintomas, sinais fsicos e alteraes em exames laboratoriais

(eletrocardiograma /ECG e radiografia de trax). O grupo DIG foi definido a partir do

Material e Mtodos

_________________________________________________________________________________________________________________________________

22

diagnstico radiolgico de megaesfago e megaclon, caracterstica desta forma clnica,

baseando-se essencialmente no exame clnico e radiolgico - raio X de trax em posies PA

e PE, raio X contrastado de esfago em OAD (oblqua anterior direita), pela tcnica de

HADDAD E GODOY (1963) e enema opaco (REZENDE & MOREIRA, 2000).

Sete crianas da mesma rea, assintomticas e sem sinais de outra enfermidade, foram

submetidas a testes sorolgicos que confirmaram a ausncia de infeco pelo T. cruzi,

constituindo assim o grupo no infectado pelo T. cruzi (NI-1) usado como parmetro de

comparao para avaliao de alteraes imunofenotpicas observadas no grupo E-IND. J

como parmetro de comparao para as anlises realizadas no grupo IND foram selecionados

adultos saudveis com resultados negativos para os testes de sorologia convencional

supracitados, constituindo o grupo NI-2.

Todos os indivduos foram voluntrios, sendo provenientes das cidades Bambu,

Berilo e Jos Gonalves de Minas do estado de Minas Gerais. O consentimento escrito foi

obtido de todos os participantes. No caso das crianas, os pais ou responsveis foram

esclarecidos quanto ao estudo e, aqueles que concordaram em participar, assinaram o Termo

de Consentimento Livre e Esclarecido para Pacientes Voluntrios. A conduta clnico-

laboratorial adotada nesse estudo foi previamente aprovada pelo Comit de tica do

IRR/FIOCRUZ (Protocolo CEPSH/CPqRR #09/2003 e #11/2004). Todos os procedimentos,

incluindo os estudos eletrocardiogrficos, radiolgicos e a assistncia mdico-laboratorial

dada aos pacientes, bem como o acompanhamento ambulatorial e a coleta de sangue esteve

sob a responsabilidade do Dr. Joo Carlos Pinto Dias, do Dr. Joo Soares Moreira Magalhes

e da Dra. Marta de Lana. A Tabela 1 sumariza as informaes referentes aos grupos de

pacientes estudados.

Material e Mtodos

_________________________________________________________________________________________________________________________________

23

Os dados que compem a terceira publicao New strategy to assess the overall

cytokine profile of circulating leukocytes and decode distinct clinical status of human

chagas disease correspondem ao objetivo especfico 2.

O grupo de pacientes portadores da doena Chagas crnica foi o mesmo empregado

para o primeiro e segundo artigo excluindo-se o grupo de indivduos com comprometimento

digestivo. Para a anlise pontual do efeito do tratamento foram selecionados 18 indivduos,

sendo 5 indivduos do grupo IND selecionados a partir da comprovao da infeco chagsica

na ausncia de manifestaes clnicas, eletrocardiogrficas ou radiolgicas de acometimento

cardaco ou digestivo e 13 indivduos portadores da forma clnica CARD, caracterizados pela

presena de sintomas, sinais fsicos e alteraes em exames laboratoriais (eletrocardiograma e

radiografia de trax). Os indivduos foram voluntrios provenientes do Ambulatrio de

Doena de Chagas do Hospital das Clnicas de UFMG. O consentimento escrito foi obtido de

todos os participantes. A conduta clnico-laboratorial adotada nesse estudo foi previamente

aprovada pelo Comit de tica do IRR/FIOCRUZ (IRR/FIOCRUZ-Minas protocolos

#09/2003) e da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG-COEP protocolo #ETIC

070/00). Todos os procedimentos, incluindo os estudos eletrocardiogrficos, radiolgicos e a

assistncia mdico-laboratorial dada aos pacientes, bem como o tratamento dos indivduos

infectados com benzonidazol (5mg/kg/peso por dia, durante 60 dias consecutivos) estiveram

sob a responsabilidade da Dra. Silvana Maria Eli Santos e da Dra. Eliane Dias Gontijo. Para

o estudo longitudinal, foram feitas duas coletas (antes e aps um ano do trmino do

tratamento) de amostras de sangue perifrico coletadas em tubos Vacutainer, contendo

EDTA ou heparina sdica como anticoagulantes. A Tabela 1 sumariza as informaes

concernentes aos grupos de pacientes estudados.

Material e Mtodos

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24

Os dados que compem a quarta publicao Non-conventional flow cytometry

approaches to detect anti-Trypanosoma cruzi immunoglobulin G in the clinical

laboratory. correspondem ao objetivo especfico 3.

Para esse estudo foram empregadas 4 coortes de amostras de soro: (1) de pacientes

portadores da doena de Chagas crnica tardia, de leishmaniose visceral (VL), leishmaniose

tegumentar (LCL), toxoplasmose (TX), malria (MA) e esquistossomose (SCH). As amostras

de soros de pacientes portadores da doena de Chagas crnica tardia e os controles no

infectados foram os mesmos dos objetivos especficos 1 e 2. J as amostras de soros de

indivduos portadores de outras infeces foram obtidas a partir de sorotecas previamente

montadas e consistiram de indivduos adultos que por deciso do comit de tica em

pesquisas no foram identificados; (2) de pacientes portadores da doena de Chagas crnica

tardia segregados nas diferentes formas clnicas (IND, CARD e DIG) e controles no

infectados, sendo os mesmos empregados nos objetivos especficos 1 e 2; (3) de pacientes

portadores da doena de Chagas crnica tardia segregados nas diferentes formas clnicas. A

coleta desses soros foi realizada no Centro de treinamento e Referncia de doenas

Infecciosas e Parasitrias (CTRDIP) do Hospital das Clnicas da Faculdade de Medicina da

Universidade Federal de Minas Gerais, sob a superviso do Dr. Manoel Otvio da Costa

Rocha. As amostras de soros dos pacientes DIG foram enviadas para Belo Horizonte pela Dra.

Sheila Jorge Adad do Departamento de Patologia Cirrgica da Faculdade de Medicina do

Tringulo Mineiro (FMTM). A distribuio etria dessa coorte iniciou uma disperso etria na

faixa de 24-77 anos de idade; (4) de pacientes chagsicos no tratados (NT), tratados no

curados (TNC) e tratados curados (TC). Essa coorte contm 60 indivduos com idades de 6

meses a 68 anos, acompanhados pelo Dr. Anis Rassi da Faculdade de Medicina da

Universidade Federal de Gois. Estes pacientes tiveram exames sorolgicos (IFA e HA) e

parasitolgico (hemocultura) avaliados em um estudo retrospectivo, que variou de trs a 26

Material e Mtodos

_________________________________________________________________________________________________________________________________

25

anos aps tratamento etiolgico, e foram classificados em trs diferentes categorias como

descrito por MARTINS-FILHO et al. (2002). O tratamento foi realizado durante a fase aguda,

sub-aguda, ou crnica da infeco. O critrio de cura utilizado para a classificao dos grupos

baseou-se na negativao conjunta dos testes sorolgicos convencionais IFI, HAI e ELISA e

do xenodiagnstico. Indivduos NT e TNC persistiram com resultados positivos tanto nos

testes parasitolgicos como sorolgicos. Pacientes foram considerados TC somente quando

ambos exames foram consistentemente negativos pelo menos em 8 ensaios de coleta serial de

amostras de sangue. Nesse estudo no foi dada nfase aos diferentes esquemas de tratamento

uma vez que no foi nosso objetivo. A Tabela 1 sumariza as informaes concernentes aos

grupos de pacientes estudados.

Material e Mtodos

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26

Tabela 1: Populao de estudo

Grupo No de indivduos Idade Sexo (M/F)

Artigo 1 No infectado* NI 12 20-53 3/9 Indeterminado* IND 08 44-67 3/5 Cardaco* CARD 13 50-70 5/8 Digestivo* DIG 08 45-65 5/3

Artigo 2 Crianas no infectadas NI-1 07 9-14 6/1 Adultos no infectados* NI-2 12 20-59 3/9 Indeterminado recente E-IND 06 9-14 4/2 Indeterminado* IND 08 44-67 3/5 Cardaco* CARD 13 50-70 5/8

Artigo 3 Coorte 1 No infectado* NI 11 20-53 3/8 Indeterminado* IND 06 44-67 3/3 Cardaco* CARD 08 50-70 2/6

Coorte 2 Indeterminado IND 05 35-46 1/4 Cardaco CARD 13 29-58 7/6

Artigo 4 Coorte 1 No infectado* NI 12 20-53 3/8 Doena de Chagas* CH 28 44-70 13/15 Leishmaniose visceral VL 26 - - Leishmaniose tegumentar LCL 20 - - Toxoplasmose TX 20 - - Malria MA 20 - - Esquistossomose SCH 20 - -

Coorte 2 No infectado* NI 12 20-53 3/9 Indeterminado* IND 06 44-67 3/3 Cardaco* CARD 13 50-70 5/8 Digestivo* DIG 07 45-65 4/3

Coorte 3 Indeterminado IND 10 24-59 8/12 Cardaco CARD 10 26-71 15/12 Digestivo DIG 10 30-77 19/10

Coorte 4 No tratados NT 19 34-68 10/9 Tratados no curados TNC 17 12-66 9/8 Tratados curados TC 24 6 meses-54 6/18

M= masculino; F= feminino. * Representam a mesma populao

Material e Mtodos

_________________________________________________________________________________________________________________________________

27

3.2. Anlise do fentipo celular dos leuccitos do sangue perifrico

3.2.1. Protocolo de imunofenotipagem celular por citometria de fluxo

Os ensaios de imunofenotipagem dos leuccitos do sangue perifrico foram feitos

segundo protocolo proposto pelo fabricante, modificado conforme descrito a seguir.

Em tubos de poliestireno 12x75mm, foram adicionados 5L do anticorpo monoclonal

especfico para o marcador de superfcie celular de interesse marcado com fluorocromo

(Tabela 2). Combinaes especficas de anticorpos monoclonais marcados com fluorocromos

distintos foram utilizadas para a anlise simultnea de marcadores de superfcie celular

necessrios para a caracterizao de subpopulaes celulares de interesse. Para cada

combinao de anticorpos monoclonais, foram adicionadas alquotas de 100L de sangue

perifrico total coletado em EDTA. Aps homogeneizao em vrtex, as preparaes foram

incubadas por 30 minutos, temperatura ambiente e ao abrigo da luz. Aps o perodo de

incubao, as amostras foram submetidas lise dos eritrcitos, utilizando 2ml de soluo de

lise comercial (FACS Lysing Solution Becton Dickinson) diluda 10 vezes em gua

destilada. Aps nova homogeneizao em vrtex, as preparaes foram incubadas por 10

minutos a temperatura ambiente e ento submetidas centrifugao (400g, 10 minutos a

18C). O sobrenadante foi descartado e os leuccitos lavados com 2mL de PBS (0,015M pH

7,4), empregando-se as mesmas condies de centrifugao anteriormente citadas. Numa

etapa final, os leuccitos foram fixados com 200L de soluo fixadora (10g/L de

paraformaldedo, 1 % de cacodilato de sdio, 6,65g/L de cloreto de sdio, pH 7,2). Aps um

perodo de pelo menos 15 minutos a 4C, os parmetros fenotpicos e morfomtricos das

clulas presentes em cada tubo foram determinados no citmetro de fluxo (FACScalibur

Becton Dickinson). O programa CELLQuest foi utilizado para a aquisio de dados e para a

anlise dos resultados empregando diferentes estratgias.

Material e Mtodos

_________________________________________________________________________________________________________________________________

28

Tabela 2: Anticorpos monoclonais marcados com fluorocromos utilizados para anlise de populaes, subpopulaes celulares e molculas de superfcie.

Anticorpo Fluorocromo Clone Fentipo alvo no estudo

Anti-CD3 FITC, PE UCHT1 Linfcitos T, NKT

Anti-CD4 FITC, PE 13B8.2 ou RPA-

T4 Linfcitos T auxiliares

Anti-CD5 FITC L17F12 Linfcitos B1

Anti-CD8 FITC, TC B9.11 ou M-L233 Linfcitos T citotxicos

Anti-CD14 TC TK4 Moncitos

Anti-CD16 FITC, TC 3G8 Clulas NK, NKT, Macrfago-like

Anti-CD18 FITC YF118.3 Linfcito T ativado

Anti-CD19 FITC, PE, TC HID19 ou 4G7, Linfcitos B

Anti-CD23 PE M-L233 Subpopulaes de Linfcito B

Anti-CD25 PE 3G10 Clula T reguladora

Anti-CD28 PE 15E8 Linfcito T ativado

Anti-CD38 PE AT13/5 Linfcito T ativado

Anti-CD54 FITC 15.2 Linfcito T ativado

Anti-CD56 PE B159 Clulas NK, NKT

Anti-CD62L FITC DREG-56 Linfcito T ativado

Anti-HLA-DR PE T36 Linfcito T ativado,

Monc. pr-inflamatrios

FITC = isotiocianato de fluorescena; PE = ficoeritrina; TC = tricolo 3.2.2. Estratgias para anlises imunofenotpicas de leuccitos circulantes

Os dados referentes imunofenotipagem dos leuccitos do sangue perifrico foram

analisados atravs de diversas estratgias, dependendo do fentipo celular rastreado. Assim,

empregando os recursos mltiplos do programa CELLQuest, foram adotadas diferentes

estratgias para anlise fenotpica denominadas: anlise convencional (SATHLER-AVELAR

et al., 2003); anlise de clulas T reguladoras (BAECHER-ALLAN et al., 2001); anlise do

marcador CD56 em subpopulaes de clulas CD3-CD16+ (GADDY et al., 1997), anlise de

subpopulaes de clulas CD3-CD56+ (COOPER et al., 2001); anlise de clulas NKT

(DOHERTY, et al., 1999); anlise combinada gated (SATHLER-AVELAR et al., 2003) e

anlise de moncitos pr-inflamatrios (BELGE et al., 2002).

Material e Mtodos

_________________________________________________________________________________________________________________________________

29

3.2.2.1. Anlise convencional

A anlise convencional foi realizada segundo proposto por SATHLER-AVELAR et

al. (2003). A Figura 1 ilustra a seqncia de passos para a anlise convencional. Esse tipo de

anlise consistiu na seleo da populao celular de interesse baseada em aspectos

morfomtricos, realizada atravs de grficos de distribuio puntual de tamanho (FSC) versus

granulosidade (SSC) (Figura 1A). Aps a seleo da regio de interesse (R1), o percentual de

subpopulaes celulares fluorescentes, dentro da populao selecionada, foi obtido em

grficos bidimensionais de distribuio puntual de fluorescncia, incluindo as modalidades

FL1 versus FL2, FL2 versus FL3 ou FL1 versus FL3 (Figura 1B).

FL3/CD19

FL2/CD5

A B

Tamanho

Granulosidade

R1

82.38% 0.37%

2.57%14.69%

Figura 1: Seqncia de procedimentos utilizados para as anlises dos percentuais de populaes celulares por citometria de fluxo. (A) Grfico de distribuio puntual FSC versus SSC utilizado para a seleo da populao de interesse, nesse caso linfcitos pequenos R1. (B) Grfico de distribuio puntual FL1 versus FL2 utilizado para quantificar o percentual das populaes ou subpopulaes celulares especficas, confinadas em R1.

3.2.2.2. Anlise de clulas T reguladoras

A anlise de clulas T reguladoras foi realizada segundo proposto por BAECHER-

ALLAN et al. (2001). A Figura 2 ilustra a seqncia de procedimentos para a anlise de

Material e Mtodos

_________________________________________________________________________________________________________________________________

30

clulas T reguladoras com fentipo CD4+CD25HIGH. Aps a seleo da regio de interesse

(R1), baseada em aspectos morfomtricos, realizada atravs de grficos de distribuio

puntual de tamanho (FSC) versus granulosidade (SSC) (Figura 2A), grficos de FL1/CD4

versus FL2/CD25 foram construdos, permitindo identificar a segregao da populao CD4+

em 3 subpopulaes: CD4+CD25- (R2), CD4+CD25LOW (R3) e CD4+CD25HIGH (R4). A frao

celular confinada em R4, representa o valor percentual de clulas T reguladoras na populao

de linfcitos totais (Figura 2B).

FL1/CD4

FL2/CD25

A B

Tamanho

Granulosidade

R1

1.98%

25.74%

23.37%

R2

R3

R4

Figura 2: Seqncia de procedimentos utilizados para as anlises dos percentuais de clulas T reguladoras (CD4+CD25HIGH) por citometria de fluxo. (A) Grfico de distribuio puntual FSC versus SSC utilizado para a seleo da populao de interesse, nesse caso linfcitos pequenos R1. (B) Grfico de distribuio puntual FL1/CD4 versus FL2/CD25 utilizado para quantificar o percentual de clulas T reguladoras (CD4+CD25HIGH), confinadas em R4.

3.2.2.3. Anlise do marcador CD56 em subpopulaes de clulas CD3-CD16+

A anlise de subpopulaes de clulas CD3-CD16+ foi realizada segundo proposto por

GADDY et al. (1997). A Figura 3 ilustra a seqncia de procedimentos para a anlise das

subpopulaes de clulas pr-NK (CD3-CD16+CD56-) e clulas NK maduras (CD3-

CD16+CD56+). Aps a seleo da regio de interesse (R1), baseada em aspectos

morfomtricos, realizada atravs de grficos de distribuio puntual de tamanho (FSC) versus

granulosidade (SSC) (Figura 3A), foram construdos grficos de FL1/CD3 versus FL3/CD16,

onde uma nova regio R2 foi construda, confinando a populao CD3-CD16+ (Figura 3B).

Material e Mtodos

_________________________________________________________________________________________________________________________________

31

Posteriormente, grficos de FL1/CD3 versus FL2/CD56 foram empregados, onde uma nova

regio (R3) foi construda, confinando a populao CD3-CD56+. Em seguida, aps a

combinao das regies R1, R2 e R3 atravs das frmulas G2=R2+R3 e G3=R1 and G2

onde + representa o somatrio de clulas confinadas nas regies R1 e R2 e and designa a

interceco dos eventos presentes simultaneamente em G2 e R1. Em seguida grficos de

FL3/CD16 versus FL2/CD56, contendo as clulas confinadas em G3, foram utilizados para

quantificar os percentuais das subpopulaes CD3-CD16+CD56- e CD3-CD16+CD56+.

FL1/CD3

FL3/CD16

A B

Tamanho

Granulosidade

R1

FL3/CD16

FL2/CD56

D

FL1/CD3

FL2/CD56

C

7.29% 84.21%

5.67%2.83%

CD3-CD16+CD56+

CD3-CD16+CD56-

Figura 3: Seqncia de procedimentos utilizados para as anlises dos percentuais das subpopulaes de clulas NK: pr-NK (CD3-CD16+CD56-) e NK madura (CD3-

CD16+CD56+) por citometria de fluxo. (A) Grfico de distribuio puntual FSC versus SSC utilizado para a seleo da populao de interesse, nesse caso linfcitos pequenos R1. (B) Grfico de distribuio puntual FL1/CD3 versus FL3/CD16 utilizado para selecionar a populao celular CD3-CD16+ (R2). (C) Grfico de distribuio puntual FL1/CD3 versus FL2/CD56 utilizado para selecionar a populao celular CD3-CD56+ (R3). (D) Aps a combinao das regies R1, R2 e R3 atravs das frmulas G2=R2 + R3 e G3=R1 and G2 um grfico de FL3/CD16 versus FL2/CD56 contendo as clulas confinadas em G3 foi utilizado para quantificar os percentuais das subpopulaes de clulas NK.

Material e Mtodos

_________________________________________________________________________________________________________________________________

32

3.2.2.4. Anlise de subpopulaes de clulas CD3-CD56+

A anlise de clulas CD3-CD56+ foi realizada segundo proposto por COOPER et al.

(2001). A Figura 4 ilustra a seqncia de procedimentos para a anlise de clulas CD3-

CD56DIMCD16-/+ e CD3-CD56BRIGHTCD16-/+. Aps a seleo da regio de interesse (R1),

baseada em aspectos morfomtricos, realizada atravs de grficos de distribuio puntual de

tamanho (FSC) versus granulosidade (SSC) (Figura 4A), foram construdos grficos de

FL1/CD3 versus FL2/CD56, onde uma regio (R2) foi construda selecionando a populao

CD3-CD56+ (Figura 4B). O prximo passo consistiu na combinao das regies R1 e R2

atravs da frmula G2=R1 and R2, onde and designa a interseo dos eventos presentes

simultaneamente em R1 e R2. Em seguida, grficos de FL3/CD16 versus FL2/CD56,

contendo as clulas confinadas em G2, foram utilizados para quantificar os percentuais das

subpopulaes CD3-CD56DIMCD16-/+ e CD3-CD56BRIGHTCD16-/+ (Figura 4C).

FL1/CD3

FL2/CD56

A B

Tamanho

R1

Granulosidade

Material e Mtodos

_________________________________________________________________________________________________________________________________

33

FL3/CD16

FL2/CD56

C

3.23% 3.88%

85.56%7.33%

CD3- CD56BRIGHT CD16+

CD3-CD56DIMCD16+CD3-CD56DIM

CD16-

CD3-CD56BRIGHT

CD16-

Figura 4: Seqncia de procedimentos utilizados para as anlises dos percentuais das subpopulaes CD3-CD56DIMCD16-/+ e CD3-CD56BRIGHTCD16-/+ por citometria de fluxo. (A) Grfico de distribuio puntual FSC versus SSC utilizado para a seleo da populao de interesse, nesse caso linfcitos pequenos R1. (B) Grfico de distribuio puntual FL1/CD3 versus FL2/CD56 (R2) utilizado para selecionar a populao celular CD3-CD56+ - R2. (C) Aps a combinao das regies R1 e R2, atravs da frmula G2=R1 and R2, um grfico de FL3/CD16 versus FL2/CD56, contendo as clulas confinadas em G2, foi empregado para quantificar o percentual das subpopulaes CD3-CD56DIMCD16-/+ e CD3-CD56BRIGHTCD16-/+.

3.2.2.5. Anlise de clulas NKT

A anlise de clulas NKT foi realizada segundo proposto por DOHERTY el al. (1999)

e modificado por MARTINS-FILHO (2000). A Figura 5 ilustra a sequncia de procedimentos

para a anlise de clulas NKT (CD3+CD16-/+CD56-/+). Aps a seleo da regio de interesse

(R1), baseada em aspectos morfomtricos, realizada atravs de grficos de distribuio

puntual de tamanho (FSC) versus granulosidade (SSC) (Figura 5A), foram construdos

grficos de FL1/CD3 versus FL3/CD16, onde uma regio (R2) foi construda selecionando a

populao CD3+CD16-/+ (Figura 5B). O prximo passo consistiu na combinao das regies

R1 e R2 atravs da frmula G2=R1andR2, onde and designa a interseo dos eventos

presentes simultaneamente em R1 e R2. Em seguida, grficos de FL3/CD16 versus

FL2/CD56, contendo as clulas confinadas em G2, foram utilizados para quantificar os

percentuais das seguintes subpopulaes, por ns definidas: NKT1 (CD3+CD16+CD56-),

NKT2 (CD3+CD16-CD56+) e NKT3 (CD3+CD16+CD56+) (Figura 5C).

Material e Mtodos

_________________________________________________________________________________________________________________________________

34

A

Tamanho

R1

Granulosidade

A

FL1/CD3

B

R2

FL3/CD16

FL3/CD16

C

NKT1

(CD3+CD16+CD56-)

NKT3

(CD3+CD16+CD56+)NKT2

7.27% 0,29%

2,46%89,98%

FL2/CD56

Figura 5: Seqncia de procedimentos utilizados para as anlises dos percentuais das subpopulaes NKT1 (CD3+CD16+CD56-), NKT2 (CD3+CD16-CD56+) e NKT3 (CD3+CD16+CD56+) por cito