apresentação do powerpoint - .: escolas de verão em ... · medicinais com atividade ......

A influência do LASSBio na linha do tempo do Laboratório de Farmaologia e Imunidade -LAFi

Magna Suzana Alexandre Moreira

Laboratório de Farmacologia e Imunidade

Instituto de Ciências Biológicas e da Saúde

Universidade Federal de Alagoas

Rio de Janeiro

Setembro de 2014

Os anos na UFRJ

1997-2004

Doutorado: IMPPG

Pós-Doc: LASSBio

Pós-Doc: IBCCF

Ingresso na UFAL: Junho de 2004

UFAL 2006

Construção dos Laboratórios de Pesquisa do

ICBS/UFAL - FINEP. Edital MCT/FINEP/CT-

INFRA PROINFRA 01/2006.

Início da obra: 2008

Conclusão da obra: 2012

Projetos

2005

Monitoramento de Protótipos de Fármacos (naturais ou sintéticos) Racionalmente Planejados como

Agentes Simbióticos Imunomoduladores e

Antiinflamatórios

FAPEAL

Instituto do Milênio: Inovação e Desenvolvimento em Fármacos e

Medicamentos

IM-CNPQ

2006

PLANEJAMENTO, SÍNTESE E AVALIAÇÃO FARMACOLÓGICA DE

NOVOS CANDIDATOS A FÁRMACOS INIBIDORES DE

ACETILCOLINESTERASE

FAPEMIG

2007

Identificação de novos protótipos de fármacos antiinflamatórios de segunda geração, desenhados

como inibidores seletivos de PGHS-2, a partir de produto

natural brasileiro

FAPEAL

Rede Interinstitucional de Algas Bentônicas (Edital MCT/CNPq/MS-SCTIE-

DECIT/CT-Saúde no. 10/2006 - Algas Marinhas)

Projetos em colaboração

2008

BIOMONITORAMENTO DE PLANTAS MEDICINAIS COM ATIVIDADE

IMUNOMODULADORA/LEISHMANICIDA E ORIENTAÇÃO AO USO

RACIONAL À COMUNIDADE DE ALAGOAS

PPSUS

INCT-INOFAR

1ª. edição

2009

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIPARASITÁRIA (leishmanicida)

DERIVADOS SEMICARBAZÔNICOS E

HIDRAZINO-NACILIDRAZÔNICOS

CT Hidro-RENORBIO

REDE NANOASMABIO: Aplicações de nanobiotecnologia no estudo da asma.

EDITAL 04/CII-2008. REDE NANOBIOTEC-BRASIL

2010 Avaliação da atividade

antiparasitária (eishmanicida) de produtos naturais e

sintéticos

Descrição: Projeto aprovado Cunho Estratégico em Saúide

Uso Racional de plantas medicinais pelos moradores do

Bairro Benedito Bentes em Maceió/Al

Projetos em colaboração

2011 ESTUDO DA ATIVIDADE LEISHMANICIDA

DE DUAS SÉRIES DE DERIVADOS (SEMICARBAZÔNICOS E HIDRAZINO-N-ACILIDRAZÔNICOS): UMA PROPOSTA

PARA NOVAS ESTRATÉGIAS NO TRATAMENTO DA LEISHMANIOSE

FAPEAL

Avaliação da atividade antiparasitária (leishmanicida) de produtos naturais e

sintéticos

UNIVERSAL

2012

INCT-INOFAR

2ª. edição

2013 Desenvolvimento de Novos Protótipos

de Fármacos com Potencial Terapêutico visando Ação

Imunomoduladora e Leishmanicida de Derivados Aminoguanidínicos e Tiofênicos e de seus Respectivos

Complexos Antimoniais FAPEAL

Inovação e desenvolvimento de protótipos de fármacos

leishmanicida

PRONEN-CNPQ-FAPEAL

Seleção, desenvolvimento, triagem pré- clínica e toxicológica in vivo e in vitro de candidatos a fármacos

leishmanicidas

Doenças Negligenciadas -CNPQ

Coordenação de Projetos Institucionais

2013 • Pró-equipamento CAPES: Sistema para análise morfo-funcional de

células in situ e in vitro em tempo real

2014

• Pró-equipamento CAPES: Estruturação de sistema multidisciplinar de criação e manutenção de animais “isogênicos, knockout ou germ-free” e registro eletrofisiológicos in vivo

2014 • *CT-INFRA-CAPES-FINEP: Construção do Biotério Central da UFAL

*Em submissão

Contribuição na UFAL: Produção

20 Alunos de IC 17 Dissertações 2 Teses

Produção Científica com

o LASSBio 1patente 17 artigos

Contribuição na UFAL: Produção em

execução

8 Alunos de IC 1 Dissertações de

Mestrado 3 Teses de Doutorado

Produção Científica com o LASSBio

7 artigos

De que maneira contribuímos para o

INCT-INOFAR

Investigar atividade (in vitro e in vivo) derivados e identificar

protótipos a fármacos leishmanicida

42 derivados

15 derivados da série II

13 derivados da série I

7 derivados da série III

7 derivados da série IV

Amastigota

L. major

Eficácia: 73,8%

Potência: 15,9 µM

LASSBio

1707

Promastigota

L. major

Eficácia: 70,0%

Potência: 3,9 µM

Amastigota

L. braziliensis

Eficácia: 67,1%

Potência: 8,0 µM

LASSBio

1705

Amastigota

L. major

Eficácia: 68,0%

Potência: 8,5 µM

Promastigota

L. major

Eficácia: 75,7%

Potência: 0,5 nM

Amastigota

L. amazonensis

Eficácia: 57,7%

Potência: 84,0 µM

LASSBio

1736

Promastigota

L. braziliensis

Eficácia: 57,2%

Potência: 5,3 µM

Amastigota

L. braziliensis

Eficácia: 70,4%

Potência: 3,6 µM

LASSBio

1706

Promastigota

L. major

Eficácia: 54,5%

Potência: 0,6 µM

Promastigota

L. major

Eficácia: 77,6%

Potência: 0,4 µM

Amastigota

L. amazonensis

Eficácia: 93,2%

Potência: 3,5 µM

LASSBio

1483

Amastigota

L. braziliensis

Eficácia: 65,8%

Potência: 31,7 µM

Amastigota

L. major

Eficácia: 67,7%

Potência: 1,5 µM

Efeito leishmanicida em BALB/c

Figura 2. Efeito in vivo do tratamento com Miltefosina, Glucantime® e LASSBio 1483 na dose de 30 µmol/kg/dia x 28 dias sobre o curso

da lesão de camundongos BALB/c infectados com L. amazonensis. Lesões foram monitoradas semanalmente. Os resultados são

representados pela média ± e.p.m. da espessura da lesão de cinco animais em cada grupo experimental.

Infecção 1 semanas

Tratamento 30 µmol/kg/dia ou 100

µmol/kg/dia, 4 semanas)

Eutanásia: Análise de diluições limitantes (ADL); Dosagem de

enzimas

Medição da espessura das

orelhas infectadas (2 vezes por semana)

Balb/c N=5, 6-8 semanas

Infecção: 1 x 105

L. Amazonensis

Efeito leishmanicida em BALB/c

Figura 1. Efeito in vivo do tratamento com Miltefosina, Glucantime® e LASSBio 1483 na dose de 30 µmol/kg/dia x 28 dias sobre o curso

da lesão de camundongos BALB/c infectados com L. amazonensis. Lesões foram monitoradas semanalmente. Os resultados são

representados pela média ± e.p.m. da espessura da lesão de cinco animais em cada grupo experimental.





enzimas




Infecção: 1 x 105

L. Amazonensis

Figura 2. Efeito in vivo do tratamento com Miltefosina, Glucantime e derivados semicarbazônicos hidrazino-N-

acilidrazônicos sobre a carga parasitária (A) Orelha e (B) Linfonodo de camundongos BALB/C infectados L.

amazonensis na dose de 30 µmol/kg/dia x 28 dias. Os resultados referem-se à média ± erro padrão de

quadruplicatas de um experimento representativo. *p < 0,05, **p < 0,01 x grupo veículo.

Efeito leishmanicida em BALB/c dos derivados sobre a carga parasitária

Orelha Linfonodo

Fotografia da orelha infectada no 28o dia pós-infecção

Controle não-infectado

0,5 cm

Controle infectado

0,5 cm

Miltefosina (v.o.)

0,5 cm

Glucantime (i.p.)

0,5 cm

LASSBio 1483 (v.o.)

0,5 cm

LASSBio 1483 (i.p.)

0,5 cm

LASSBio 1705 (i.p.) LASSBio 1707 (i.p.) LASSBio 1493 (i.p.)

0,5 cm 0,5 cm 0,5 cm

LASSBio 1706 (i.p.) LASSBio 1710 (i.p.) LASSBio 1736 (i.p.)

0,5 cm 0,5 cm 0,5 cm

Análise de letalidade dos animais infectados durante o curso da infecção

Figura 3. Sobrevivência de animais infectados com L. amazonensis durante o tratamento com Miltefosina, Glucantime e

derivados semicarbazônicos Série I (A) e hidrazino-N-acilidrazônicos da Série III (B) e Série IV (C) na dose de 30

µmol/kg/dia x 28 dias. Os resultados referem-se à média ± erro padrão de quadruplicatas de um

experimento representativo. *p < 0,05, **p < 0,01 x grupo veículo.

Glucantime

LASSBio 1705

LASSBio 1706

Figura 4. Efeito do tratamento com Miltefosina, Glucantime,

derivados semicarbazônicos e hidrazino-N-acilidrazônicos sobre os

níveis de ALT (A) e AST (B) no soro de animais infectados com L.

amazonensis na dose de 30 µmol/kg/dia x 28 dias. Os

resultados referem-se à média ± erro padrão da média de 5

animais de um experimento representativo. Os valores foram

considerados significativos quando *p < 0,05 versus o grupo

controle.

Avaliação da toxicidade

Hepática Renal

Figura 5. Efeito do tratamento com Miltefosina, Glucantime,

derivados semicarbazônicos e hidrazino-N-acilidrazônicos sobre

os níveis de creatinina sérica (A) e ureia (B) no soro de animais

infectados com L. amazonensis na dose de 30 µmol/kg/dia x

28 dias. Os resultados referem-se à média ± erro padrão

da média de 5 animais de um experimento representativo.

Os valores foram considerados significativos quando *p <

0,05 versus o grupo controle.

Ativos in vivo

contra

L. amazonensis

Ativos contra amastigotas e

promastigotas de diferentes cepas

de leishmania

Inovação radical

Estabilidade química e

plasmática

SELEÇÃO PARA ENSAIO IN VIVO DE LEISHMANIOSE VISCERAL EM

HAMSTER

LASSBio 1705 LASSBio 1707 LASSBio 1736

Efeito leishmanicida dos derivados sobre a carga parasitária Hamsters

infectados

Figura 6. Efeito in vivo do tratamento com

Glucantime e derivados semicarbazônicos

hidrazino-N-acilidrazônicos sobre a carga

parasitária do baço de Golden Hamsters

infectados com L. chagasi tratados por 15 dias por

via intraperitoneal. Os resultados referem-se à

média ± erro padrão de quadruplicatas de um

experimento representativo. *p < 0,05, **p < 0,01,

***p < 0,001 x grupo veículo

Controle

mols

/kg

Glu

cantime 1

50 m

ols/k

g

Glu

cantime 1

00 m

ols/k

g

Glu

cantime 3

0 m

ols/k

g

LASSBio-1

705 100

mols

/kg

LASSBio-1

705 30

mols

/kg

LASSBio-1

707 100

mols

/kg

LASSBio-1

707 30

mols

/kg

LASSBio-1

736 100 m

ols/k

g

LASSBio-1

736 30

0

2

4

6

******

***

Lo

g d

o n

º d

e p

aras

ito

s

de

L. c

haga

si/g

de

baç

o

Infecção 45 dias


µmol/kg/dia, 15 dias)

Eutanásia: Análise de diluições limitantes (ADL);

Dosagem de enzimas;

Golden Hamster N=5, 6-8 semanas

Infecção: 1 x 107 de

L. chagasi

(MCAN/BR/89/BA262)

Denise, H. et al. Studies on the CPA cysteine peptidase in the Leishmania infantum genome strain JPCM5. BMC Mol Biol, 7:42-48, 2006.

Lima HC, Bleyenberg JA, Titus RG. A simple method for quantifying Leishmania in tissues of infected animals. Parasitol Today 13: 80–82, 1997.

*

*

Figura 7. Efeito in vivo do tratamento com Glucantime e

derivados semicarbazônicos hidrazino-N-acilidrazônicos

sobre os níveis de ALT (A) e AST (B) no soro de Golden

Hamsters infectados com L. chagasi tratados por 15 dias

por via intraperitoneal. Os resultados referem-se à

média ± erro padrão da média de 5 animais de um

experimento representativo. Os valores foram

considerados significativos quando *p < 0,05 versus o

grupo controle

Con

trol

e N

ão-in

fect

ado

Con

trol

e in

fect

ado

mol

s/kg

Glu

cant

ime 15

0 m

ols/kg

Glu

cant

ime 10

0 m

ols/kg

Glu

cant

ime 30

m

ols/kg

LASSBio

-170

5 10

0 m

ols/kg

LASSBio

-170

5 30

m

ols/kg

LASSBio

-170

7 10

0 m

ols/kg

LASSBio

-170

7 30

m

ols/kg

LASSBio

-173

6 10

0 m

ols/kg

LASSBio

-173

6 30

0

5

10

15

20

***

* * ***

AL

T (

Ati

vid

ad

e U

.I./

L)

Con

trol

e N

ão-in

fect

ado

Con

trol

e in

fect

ado

mol

s/kg

Glu

cant

ime 15

0 m

ols/kg

Glu

cant

ime 10

0 m

ols/kg

Glu

cant

ime 30

m

ols/kg

LASSBio

-170

5 10

0 m

ols/kg

LASSBio

-170

5 30

m

ols/kg

LASSBio

-170

7 10

0 m

ols/kg

LASSBio

-170

7 30

m

ols/kg

LASSBio

-173

6 10

0 m

ols/kg

LASSBio

-173

6 30

0

10

20

30

AS

T (

Ati

vid

ad

e U

.I./

L)

Avaliação da toxicidade

Hepatica Renal

Controle N

ão-infectad

o

Controle in

fectad

o

mols/kg

Gluca

ntime 15

0 mols/kg

Gluca

ntime 10

0 mols/kg

Gluca

ntime 30

mols/kg

LASSBio-170

5 10

0 mols/kg

LASSBio-170

5 30

mols/kg

LASSBio-170

7 10

0 mols/kg

LASSBio-170

7 30

mols/kg

LASSBio-173

6 10

0 mols/kg

LASSBio-173

6 30

0

5

10

15

Creatin

ina (

mg

/dL

)

Controle N

ão-infectad

o

Controle in

fectad

o

mols/kg

Gluca

ntime 15

0 mols/kg

Gluca

ntime 10

0 mols/kg

Gluca

ntime 30

mols/kg

LASSBio-170

5 10

0 mols/kg

LASSBio-170

5 30

mols/kg

LASSBio-170

7 10

0 mols/kg

LASSBio-170

7 30

mols/kg

LASSBio-173

6 10

0 mols/kg

LASSBio-173

6 30

0

20

40

60

80

* *

Ureia

(m

g/d

L)

Figura 8. Efeito in vivo do tratamento com

Glucantime e derivados semicarbazônicos hidrazino-

N-acilidrazônicos sobre os níveis de creatinina sérica

(A) e ureia (B) no soro de Golden Hamsters

infectados com L. chagasi tratados por 15 dias por via

intraperitoneal. Os resultados referem-se à média ±

erro padrão da média de 5 animais de um

experimento representativo. Os valores foram

considerados significativos quando *p < 0,05 versus o

Efeito leishmanicida in vivo em BALB/c dos derivados hidrazino-N-acilidrazônicos

Figura 9. Efeito in vivo do tratamento com Glucantime® (100 e 30 µmol/kg/dia x 28 dias), Miltefosina, LASSBio 1736, LASSBio 1705 e LASSBio 1707 (30

µmol/kg/dia x 28 dias) sobre o curso da lesão de camundongos BALB/c infectados com L. amazonensis. Lesões foram monitoradas semanalmente. Os

resultados são representados pela média ± e.p.m. da espessura da lesão de cinco animais em cada grupo experimental.

0 4 8 12 16 20 24 28

0

1

2

3

Controle

Miltefosina (30 mol/kg/ dia, v.o.)

Glucantime (100 mol/kg/ dia, i.p.)

LASSBio 1705 (30 mol/kg/ dia, v.o.)


LASSBio 1707 (30 mol/kg/ dia, i.p.)


Dias após início de tratamento

e

sp

essu

ra d

as o

relh

as (

mm

)

0 4 8 12 16 20 24 28

0

1

2

3

Controle

Miltefosina (30 mol/kg/ dia, v.o.)




LASSBio 1736 (30 mol/kg/ dia, i.p.)

Dias após início de tratamento

e

sp

essu

ra d

as o

relh

as (

mm

)





enzimas




Infecção: 1 x 105

L. Amazonensis

Efeito do tratamento sobre a produção de citocinas no soro de

animais infectados com L amazonensis (INF-g e IL-1b)

0

5

10Controle

Glucatime (100 mols/kg/dia, i.p.)

Miltefosina (30 mols/kg/dia, i.p.)

LASSBio 1483 (30 mols/kg/dia, v.o.)



LASSBio 1707 (30 mols/kg/dia, i.p.)



IFN

- g (

pg

/mL

)

0

5

10

15

20

25

30Controle


Miltefosina (30 mols/kg/dia, v.o.)







IL-1

b (

pg

/mL

)

0

5

10Controle

Glucatime 100 mmols/kg/dia,ip








IL-2

(p

g/m

L)

0

5

10

15

20

25

30

*

Controle









IL-1

0 (

pg

/mL

)Efeito do tratamento sobre a produção de citocinas no soro de

animais infectados com L amazonensis (IL-2 e IL-10)

0

5

10

*

Controle









IL-1

2p

40 (

pg

/mL

)

0

5

10Controle









IL-1

2p

70 (

pg

/mL

)

Efeito do tratamento sobre a produção de citocinas no soro de animais

infectados com L amazonensis (IL-12p40 e IL-12p70)

0

5

10

15Controle









IL-1

7 (

pg

/mL

)

0

5

10

15Controle









TN

F-

(p

g/m

L)

Efeito do tratamento sobre a produção de citocinas no soro de

animais infectados com L amazonensis (IL-17 e TNF-)

Zauli et al.: A dysflagellar mutant of Leishmania (Viannia) braziliensis isolated from a cutaneous leishmaniasis patient. Parasites & Vectors 2012 5:11.

Promastigotas L. chagasi

Adição das substâncias-teste, 48 horas a 28 0C

Preparação da amostra

Análise em Citômetro

MUSE

Anexina V-PE e 7-AAD

Efeito do tratamento com LASSBio 1483 sobre a externalização da fosfatidilserina na

membrana plasmática de promastigotas de L amazonensis

(A) Meio – 48h

(D) Pentamidina 10 μΜ – 48h

(B) DMOS 0,1% – 48h (C) Pentamidina 100 μΜ – 48h

(E) LASSBio1483 100 μΜ – 48h (F) LASSBio1483 10 μΜ – 48h



(A) Meio – 48h









MUSE

Reagente Muse

Mitopotencial

Efeito do tratamento com LASSBio 1483 sobre a alteração no potencial de membrana

mitocondrial de promastigotas de L amazonensis

(A) Meio – 48h




Efeito do tratamento com LASSBio 1705 sobre a alteração no potencial de membrana

mitocondrial de promastigotas de L amazonensis

(A) Meio – 48h




(A) Meio – 48h









MUSE

Reagente Muse

MultiCaspase

Efeito do tratamento com LASSBio 1483 sobre a ativação de metacaspases em

promastigotas de L amazonensis

(A) Meio – 48h



(E)LASSBio1483 100 μΜ – 48h (F)LASSBio1483 10 μΜ – 48h



(A) Meio – 48h




Efeito dos derivados sobre a externalização da fosfatidilserina na membrana plasmática, alteração

no potencial de membrana mitochondrial e ativação de multicaspases em promastigotas de L.

amazonensis



Adição das substâncias-

teste, 48 horas a 28 0C


MEV em Zeiss 900

Fotografia da promastigota de L. chagasi (M.E.V.)

Controle (Meio – 48h)

1.000 X

5.000 X

11.000 X

DMSO– 48h Miltefosina– 48h LASSBio 1705 –

100 μΜ – 48h

LASSBio 1736 –

100 μΜ – 48h

• Perda completa da

morfologia

• Duplo flagelo/

Perda flagelar

• Formas, Arredondadas,

multiseptadas

Debris, perda de

conteúdo

Alvos moleculares

MAecanismo de ação dos

derivados (não altera produção

de citocinas

-Serino-Protease?? Perturba a membrana, apoptose, +

metacaspase

Toposisomerase 2??

Artigos a serem submetidos

In vitro and in vivo leishmanicidal activity of new semicarbazone derivatives against

Leishmania major (Plos One)

In vitro leishmanicidal activity of new hidrazine-N-acylhidrazone derivatives against

Leishmania major (Parasitology Research)

In vitro and in vivo leishmanicidal activity of new hidrazine-N-acylhidrazone

derivatives against Leishmania amazonensis (Antimicrobial Agents And

Chemotherapy)

In vitro and in vivo leishmanicidal activity of new semicarbazone derivatives against

Leishmania amazonensis (Journal of Medicinal Chemistry)

Depósito da patente solicitado em 2013.

CNPqCNPqCAPESCAPES UFALUFAL

Instituto do Instituto do Milênio Milênio INOFARINOFAR--

CNPqCNPq: : 4200115/054200115/05--11 CNPqCNPqCNPqCNPqCAPESCAPESCAPESCAPES UFALUFALUFALUFAL


CNPqCNPq: : 4200115/054200115/05--11 CNPqCNPqCAPESCAPES UFALUFAL


CNPqCNPq: : 4200115/054200115/05--11 CNPqCNPqCNPqCNPqCAPESCAPESCAPESCAPES UFALUFALUFALUFAL


CNPqCNPq: : 4200115/054200115/05--11

APOIO FINANCEIRO

FINEP

Na longa história da humanidade (e também dos animais) aqueles que aprenderam a colaborar e a improvisar de forma eficaz foram os que prevaleceram.

...Esta é a nossa história

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