Cascavel, 2010

MICROBIOLOGIA

ALEXANDRE CARVALHO DE MOURA

(AULAS PRÁTICAS PARA O CURSO DE FARMÁCIA)

Faculdade Assis Gurgacz

AULA PRÁTICA : 01

1- Equipamentos e materiais utilizados na prática microbiológica

Equipamentos

Os equipamentos utilizados no trabalho microbiológico variam de conformidade com a complexidade das atividades desenvolvidas no laboratório. Serão apresentados , nesta relação, aqueles equipamentos que são indispensáveis ao trabalho microbiológico. Os equipamentos assinalados com o sinal * são necessários mas não indispensáveis.

A) Autoclave de Chamberland : utilizada para esterilização de meios de cultura, esterilização de materiais contaminados e esterilização de vidrarias .B) Balança semi- analítica (10 mg -1200 g) e analítica* ( 100 g e 210 g) : pesagem de corantes e reagente para preparo de meios de cultura e soluções.C) Banho-Maria (37ºC) : utilizado para incubação de culturas, de microrganismos, em meios líquidos.D) Banho - Maria (45-50ºC)* : utilizado para preparo de meios de cultura e para a incubação de culturas, de microrganismos, em meios líquidos.E) Bico de Bunsen: manipulação asséptica de microrganismos; flambagem de alças, pinças, tesouras, etc..F) Câmara asséptica (fluxo laminar) : manipulação de microrganismos.G) Centrífuga (3000 rpm) :utilizada para sedimentar partículas sólidas de meio líquido.H) Contador de colônias*: utilizada para contar a colônias que crescem em meios sólidos contidos em placas de Petri.I) Destilador de água : fornecer água mais pura para o preparo de meios de cultura, corantes e reagentes.J) Estufa bacteriológica (35-37ºC) : incubação de culturas de microrganismos o que favorece o seu crescimento. Existem microrganismos que requerem temperaturas diferentes, como: 4, 25, 42 e 45ºC.L) Estufa de secagem (80-100ºC) :secagem de vidrarias.M) Estufa de esterilização (100 a 300 ºC)*: é conhecido como Forno Pasteur e é utilizado para esterilizar , à seco, materiais como vidrarias, pinças, tesouras, glicerina,etc..N) Freezer (-20 ou -70ºC) : utilizado para guardar culturas de microrganismos, antibióticos, reagentes,etc..O) Potenciômetro ou pHmetro : medir pH de meios de cultura e de reagentes.P) Microscópico estereoscópico (lupa) : estudo da morfologia de colônias microbianas.Q) Microscópio ótico comum de campo claro: observação de preparações em lâminas coradas ou a fresco.R) Placa aquecedora com agitação magnética * : dissolução de meios de cultura ou soluções.S) Forno de microndas : usado para aquecimento e dissolução de meios de culturas.T) Refrigerador ( 4ºC a 8ºC ) : armazenamento de meios de cultivo e de cultura de microrganismos.

Materiais

a) Meios de cultura desidratados ou prontos para uso: cultivo de microrganismos.b) Corantes em pó ou preparados : usados para coloração de lâminas contendo microrganismos ou materiais biológicos.c) Sais e açúcares : preparo de meios de cultura e soluções reagentes.d) Alça de agulhas de níquel cromo (alça de platina) : usada para isolamento e semeadura de microrganismos. Para uso em rotina, as alças e agulhas devem ser de fio nº24 (Brown & Sharp 24 ou BS 24) e o comprimentodeve ser de 45-50 mm. As alças devem ter um diâmetro interno de 3 mm.e) Algodão hidrófilo ou hidrófobo : usado para confecção de buchas para tubos de ensaio e para proteção do bocal de pipetas.f) Barbante : usado para acondicionamento de materiais.g) Estante : suporte para tubos de ensaio.h) Tesoura : acondicionamento de materiais.

Vidraria

a) Balão de fundo chato e Erlenmeyer de 250, 500 e 1000 ml : preparo de meio de cultura e soluções reagentes.b) Béquer 100, 250 ml : uso diversoc) Frasco conta - gotas de 250 ml : coloração de lâminas.d) Frascos de cor âmbar com rolha esmerilhada: estoque de soluções corantes.e) Lâmina escavada ( lâmina de Koch) : usada para reações de aglutinação e para observação de microrganismos pela técnica da gota pendente .f) Lâminas ( 26 X 76 mm) e lamínulas ( 20 X 20) : preparações coradas e à fresco.g) Provetas de 100, 250, 500 e 1000 ml : serve para medida de líquidos que serão usados para preparo de meios de cultura, reagentes e soluções corantes.h) Tubos de ensaio : são apresentados nos tamanhos 13 X 100 mm, 16 X 150 mm, 18 X 180 mm que servirão para distribuição de volumes de 3, 5 e 10 ml respectivamente. Os tubos podem possuir tampa de rosca ou não.i) Pipetas de Mohr : medida e transferência de líquidos.j) Placas de Petri : acondicionamento de meios de cultivo. As mais usadas são as de tamanho 10 X 100 mm e 10 X 80 mm.

2) Normas preconizadas em laboratório de microbiologia

* É obrigatório o uso de avental, sendo que este nunca deve ser intercambiado com os colegas depois de ser usado. Este avental somente deverá ser usado no interior do laboratório e em corredores de áreas técnicas comuns, devendo ser retirado quando sair do ambiente.* Deixar em local apropriado casacos, bolsas, livros e outros pertences ( colocá-los em local indicado pelo professor).* Não colocar objetos de uso pessoal sobre as bancadas.* Lavar as mãos ao entrar e antes de sair do laboratório ( lavagem higiênica) com sabão líquidos e após friccionar com álcool 70%. Secar ao ar.* Não fumar, comer ou ingerir líquidos dentro do laboratório.* Não tocar nos olhos, boca ou nariz com as mãos.* Não umidecer etiquetas com a língua.* Não fazer uso de lenços ou avental para limpar objetos ou instrumentos de trabalho.

* Manter nas proximidades do local de trabalho um desinfetante (álcool 70%).* Cuidado ao acender o bico de gás. Verifique se não existe substância inflamável por perto.* Utilizar somente calçados fechados e de solado que dê aderência ao solo. Não é permitido o uso de sandálias dentro da área laboratorial.* Não utilizar jóias e bijuterias que dificultem o trabalho e favoreçam a ocorrência de acidentes e contaminação.* Usar luvas quando as atividades a serem desenvolvidas exigirem contato com fluidos corpóreos.* Usar máscara sempre que manipular substâncias químicas com alto teor de evaporação , e em área de alta contaminação com produtos biológicos.* Usar protetor facial, como óculos de segurança, principalmente quando houver possibilidade de espirros de fluidos.* É proibido o manuseio de maçanetas, telefones, puxadores de armários , ou outros objetos de uso comum por pessoas usando luvas durante a execução de atividades em que, agentes patogênicos ou material correlato ( químico e/ou biológico) esteja sendo manipulado.* Não é permitida a presença de animais e plantas que não estejam relacionados com as atividades do laboratório.* O acesso ao laboratório é limitado ou restrito ao pessoal técnico e alunos. Não é permitida a circulação de pessoas estranhas .* Minimizar a formação de aerosóis durante as manipulações laboratoriais.* Não levar luvas para áreas externas do laboratório.* Comunicar ao professor se possuir algum ferimento nas mãos.* Em caso de acidente, comunicar imediatamente o professor e\ou o técnico responsável.* Tratar os cortes, perfurações ou abrasões imediatamente, limpando com solução antisséptica e cobrindo com curativo.* Comunicar imediatamente qualquer suspeita de haver contraído uma enfermidade, como consequência de uma infecção no laboratório.

03 - NORMAS DE TRABALHO MICROBIOLÓGICO

* Cada aluno é responsável pelo material que receber.* No início de cada análise traçar um plano de trabalho, considerando o tempo necessário para uma análise e a sua leitura.* Trabalhar sempre de maneira ordenada, tranqüila, constante e metódica, evitando movimentos desnecessários como trocas de lugar , assento, etc..* Limpar e desinfetar a superfície de mesas e balcões antes e depois do trabalho de cada dia, com álcool 70%.* Efetuar o registro de análise, anotando o tipo de produto, procedência, dia e hora de entrada no laboratório e qualquer outra observação prévia à análise. Na análise propriamente dita anotar: data, método, meio de cultura empregado e os resultados obtidos.* Identificar as amostras antes de iniciar a análise e, em geral, não descartar até obter os resultados.* O material a ser analisado deve ser tocado exclusivamente com instrumentos estéreis e nunca com as mãos.

* Flambar alças, agulhas e pinças antes e após o uso ( limpar a alça de semeadura, com exceção da alça calibrada , em areia e álcool antes de flambá-la) .* Nunca colocar pipetas contaminadas na bancada de trabalho.* Colocar todo material usado, tais como lâminas, pipetas, lamínulas, etc. em recipientes adequados com solução desinfetante.* Os cultivos, antes de terminada a análise, devem ser conservados na geladeira de material contaminado.* Os cultivos, após terminada a análise, devem ser descartados no cemitério de materiais contaminados.* Nunca desprezar o material contaminado no cesto de lixo.* Nunca desprezar líquidos contaminados na pia do laboratório.* Colocar todo o material contaminado em recipiente apropriado e autoclavar a 121ºC durante 15 a 20 minutos para posterior lavagem.* O material utilizado em microbiologia deve receber a seguinte seqüência de tratamento: esterilização, lavagem, secagem, acondicionamento, esterilização, armazenamento.* Não retirar qualquer cultivo do laboratório.* Evitar salpicar mesas e pisos com água ou soluções corantes.* No caso de derramar material infectado em bancadas ou pisos cobrir com fenol 5 a 10%, recobrir com papel toalha e embeber novamente com fenol. Não esqueça de comunicar ao professor ou técnico.* Seguir as normas de uso de aparelhos.* Ao final dos trabalhos práticos fazer a desinfecção da bancada com álcool 70%. * Ao final dos trabalhos práticos fazer antissepsia das mãos com álcool 70% e a seguir lavar as mãos e secar com papel toalha. Este procedimento poderá ser alterado para: lavar as mãos com água e sabão, enxaguar, friccionar com álcool 70% ou solução de álcool-iodado.

04) Atividade prática

a) Trabalho demonstrativo em grupo :

1- Apresentação do laboratório de microbiologia (instalação e pessoal)2- Equipamentos, materiais e vidraria utilizados na prática microbiológica e suas respectivas funções.3- Leitura e discussão das normas adotadas no laboratório de microbiologia.4- Preparo artesanal de alças e agulhas de níquel-cromo .

b) Trabalho individual:

1- Identificação da bancada de trabalho.2- Fazer a desinfecção da bancada de trabalho, conforme demonstração do instrutor. Usar álcool 70%.3- Lavagem das mãos: Molhar a mão com água, gotejar sabão líquido, esfregar as palmas das mãos, dorso da mão , inter dedos, polegar e pulso. Enxaguar com água. Friccionar por 15 segundos com álcool 70% adicionado de 2% de glicerina. Secar ao ar.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

01-BIER,O.- Microbiologia e Imunologia. 24ª ed.,São Paulo, Melhoramentos, p. 919-998, 1985.

02-CARDOSO, C.L.-Microbiologia: aulas práticas para o curso de odontologia. Maringá: UEM,1996.03-CETESB.- Normalização Técnica L5.009. Segurança e Higiene do Trabalho em

Laboratório de Microbiologia. 1ª ed., São Paulo, Companhia de Saneamento Ambiental,11p., 1975.

04-SALLE,A.J.- Laboratory Manual on Fundamental Principles of Bacteriology. 6th ed.,New York, McGraw-Hill Book Company, p. 2-7,1967.04-CETESB.- Normalização Técnica L5.009. Segurança e Higiene do Trabalho em

Laboratório de Microbiologia. 1ª ed., São Paulo, Companhia de Saneamento Ambiental,11p., 1975.

05-LARPENT,J.P. & LARPENT-GOURGAUD, M.- Microbiologia Prática. São Paulo.Ed.Edgard Blücher Ltda. Tradução: M.C.de M.Amorozc e E.Kirchner p.1-

15, 1975.

Objetivos da aula prática nº 01

Espera-se que o aluno seja capaz de :

1) Citar a principal função dos seguintes equipamentos e materiais usados na rotina de um laboratório de microbiologia:a) autoclave; b) Bico de Bunsen; c)estufa bacteriológica; d) microscópio ótico de campo claro; e) Fluxo Laminar; f) alças e agulhas bacteriológica; algodão hidrófilo ou hidrófobo; g) Placas de Petri; h) Lâminas e lamínulas de vidro; i) tubos de ensaio 13 X 100 mm.

2) Por que as normas de trabalho microbiológico e higiene são necessárias de serem adotadas em um laboratório de microbiologia?

3) Justificar o uso de 10 normas adotadas no laboratório de microbiologia, descritas na apostila de aula prática?

4) Quando são usadas as alças calibradas e quais os seus volumes?

AULA PRÁTICA : 02

01-TÉCNICAS DE LAVAGEM E ACONDICIONAMENTO DE MATERIAL

A lavagem e esterilização de materiais são atividades de apoio aos vários processos de análises de laboratório , sendo definida como a eliminação de resíduos orgânicos de proteínas e de seus produtos de metabolização dos componentes do meio de cultura, após o seu costume.

É de fundamental importância a escolha dos detergentes, equipamentos e métodos empregados. Com a lavagem inadequada de vidrarias poderão ficar restos de meios de cultura e metabólitos que irão interferir nos constituintes das soluções e meios de cultura, e conseqüentemente, nos resultados dos exames. Com o enxague inadequado poderá permanecer resíduos de detergentes nas vidrarias o que poderá influenciar no crescimento dos microrganismos.

LAVAGEM MANUAL DE VIDRARIAS

a) Tubos de Ensaio

* Colocar os tubos, com as tampas de rosca afrouxadas, em caixa de aço inoxidável e autoclavar a 121ºC durante 20 a 30 minutos para a descontaminação. Esta descontaminação prévia é uma regra de segurança que deve ser realizada em todo laboratório de microbiologia . Este procedimento independe se o material está ou não contaminado com microrganismos patogênicos. * Descartar os conteúdos dos tubos.Os meios de cultura contendo ágar-ágar devem ser retirados ainda quentes (liquefeitos) da autoclave, desprezando-se em recipientes apropriados e nunca na pia de laboratório para evitar o entupimento dos canos devido a solidificação do meio de cultivo após o resfriamento a temperatura ambiente.* Se necessário ferver os tubos com solução de detergente a 0,5% para eliminar os resíduos do meios de cultivo.* Caso persistam resíduos, após a fervura, escovar a parte interna de cada tubo com o auxílio de um gaspilhão ( escovinha).* Enxague 10 vezes em água corrente enchendo e esvaziando totalmente os tubos.* Enxague uma vez em água destilada e deionizada

b) Placas de Petri

* Após a descontaminação , por autoclavagem, lavar individualmente cada uma das partes da placa (tampa e fundo, com o auxílio de uma esponja, para retirar marcas de lápis dermatográfico e resíduos do meio de cultura. No caso de uso de canetas de reprografia, usar álcool para retirar as marcas.* Enxaguar 10 vezes em água corrente, esfregando com as mãos, as superfícies internas e externas de cada uma das partes das placas. Verificar se todos os resíduos foram eliminados.* Enxaguar uma vez cada uma das partes da placa em água destilada ou deionizada.

c) Pipetas

* Após a descontaminação , por autoclavagem, tomando cuidado para não quebrar o bocal, retirar o tampão de algodão (bucha) de cada pipeta através de vácuo ou estilete de ponta fina ( palitos, agulha).

* Colocar as pipetas em caixas contendo solução de detergente a 0,5% e ferver para eliminar os resíduos da parede.* Enxaguar 10 vezes em água corrente enchendo e esvaziando totalmente as pipetas.* Enxaguar uma vez em água destilada ou deionizada.

d) Lâminas e lamínulas

* Colocar o material em recipiente adequado e cobrir com solução de detergente 0,5-1,0%.* Aquecer até a ebulição e manter a fervura por 5-10 minutos.* Enxaguar em água corrente até a retirada do detergente.* Enxaguar com água destilada.* Secar com o auxílio de um pano limpo e macio (gaze).* Desprezar as lâminas e lamínulas que estiverem muito riscadas ou foscas.

e) Lavagem de vidraria nova

- Técnica geral : colocar a vidraria ( tubos de ensaio, placas de Petri e frascos) em um recipiente adequado e cobrir com solução detergente a 05-1,0%. Aquecer até a ebulição. Retirar a vidraria da solução detergente, enxaguar por 5 a 10 vezes com água corrente ( se possível morna) e por último com água destilada. Escorrer o excesso de água e secar o material na estufa a 80-100ºC.

- Ténicas especiais :pipetas : colocar as pipetas em cubas rasas, cobrir com solução de detergente a 0,5-

1,0% e aquecer até a ebulição. Retirar as pipetas da solução detergente; enxaguar por 5 a 10 vezes em água corrente e por último em água destilada. Escorrer o excesso e colocar para secar em estufa a 80-100ºC.

lâminas e lamínulas : colocar as lâminas em álcool etílico a 95% contendo 3% de ácido clorídrico.Deixar de molho durante algumas horas.Retirar as lâminas da mistura álcool-ácido, enxaguar por 5 a 10 vezes em água corrente e por último em água destilada.Secar as lâminas com pano limpo e macio. Segurar as lâminas pelas bordas para evitar a impregnação das mesmas com gordura das mãos. Guardá-las em recipiente fechado.

f) Lavagem com "solução"sulfo-crômica

Esta lavagem se faz necessária quando a vidraria apresenta resíduos que resistiram à lavagem com detergente.O procedimento a seguir é: * Após a descontaminação esvaziar os conteúdos de cada frasco ( tubos, pipetas, placas, etc.).* Adicionar 50 mL de "solução"sulfo-crômica no frasco a ser lavado.* Agitar, com os devidos cuidados, de cinco a seis vezes.* com o auxílio de um funil transferir a "solução"sulfo-crômica usada apara o próximo frasco a ser lavado.* Este procedimento poderá ser repetido, sem descarte da "solução", para a lavagem de, no máximo, 10 frascos.* Enxaguar 10 vezes em água corrente, enchendo e esvaziando totalmente os frascos.

* Enxaguar uma vez em água destilada ou deionizada, realizando medidas de pH da água destilada ou deionizada antes e depois do enxague (de preferência deixar o frasco em teste com água destilada durante a noite e logo após realizar a medida de pH em potenciômetro (pHmetro).

SECAGEM

Deixar escorrer toda a água e colocar a vidraria na posição emborcada na estufa de secagem a 100 ºC por 1 hora.

ACONDICIONAMENTO

Todo material utilizado no trabalho microbiológico deve ser perfeitamente limpo e também estéril.

Para ser esterilizado , o material deve ser acondicionado.As técnicas de acondicionamento consistem em envolver com papel, total ou

parcialmente, o material a ser esterilizado com finalidade de preservar sua esterilidade. O papel usado deve ser de boa qualidade, permeável ao ar, resistente ao calor, permitir a passagem de vapor, resistir à umidade e tração, não conter resíduos tóxicos e ser impermeável para os micorganismos. O material utilizado deve ser compatível com o material a ser esterilizado e ao processo a ser usado.

Na prática é usado papel ( Kraft) , algodão hidrófobo ( cardado) ou hidrófilo ( absorvente) e barbante.

A vidraria, após cuidadosa lavagem e secagem, é acondicionada com papel (Kraft, Tigre, Jornal , Lista telefônica, etc.) e esterilizada em autoclave a 121ºC por 15 - 20) minutos ou em Forno de Pasteur a 170 - 180 ºC por 2 horas.

Os materiais devem ser acondicionados utilizando-se os métodos:

* A boca de toda a vidraria como tubos, garrafas, balões e erlenmeyer é fechada com tampões de algodão (buchas), que não devem ser folgados ou demasiadamente apertados.* Nas garrafas, erlenmeyer, balões de fundo chato, etc.a bucha de algodão deve ser recoberta com gaze (boneca). Levam, também, um envólucro de papel, o qual é amarrado com barbante.* Os tubos de ensaio, depois de fechados com as buchas de algodão, são empacotados. O número de tubos depende da necessidade de uso do laboratório.* As placas de Petri são embrulhadas individualmente ou em número de 2, 5, 10, etc, conforme a demanda de uso. os pacotes são fixados com barbante ou fita crepe.* Pipetas são embuchadas na extremidade destinada a aspiração, com pequena bucha de algodão colocada com o auxílio de uma agulha ou estilete, sendo então, totalmente envolta em papel de embrulho.Elas também podem ser acondicionadas em pacotes de papel ( conjunto de 5, 10, 20) ou em cilindros de aço inoxidável especialmente fabricado para este propósito. A bucha não permite a penetração de germes que podem contaminar os líquidos e protegem o operador contra a ingestão de líquidos contaminados.* Os swabs ( cotonetes ou zaragatoa ) devem ser recobertos com papel alumínio e embaladas em pacotes de papel( com marcas que identifiquem o local onde está o cabo do swab) ou colocados em frascos autoclaváveis que devem ser embuchados e envolvidos parcialmente em papel.

MOVIMENTAÇÃO DA VIDRARIA NO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA

LAVAGEM

SECAGEM ACONDICIONAM

ENTO

DESCONTAMI NAÇÃO

USO ESTERILIZAÇÃO

02- ATIVIDADE PRÁTICA

Trabalho individual : - Fazer a desinfecção da bancada com álcool 70%.- Lavar as mãos conforme instrução da aula anterior.- Embuchar, conforme a orientação do professor, 3 tubos de ensaio 13 x100 mm e 3

tubos 16x150 mm.- Acondicionar 4 pipetas sorológicas ( 1, 2, 5 e 10 ml) utilizando o seguinte

procedimento: Com o auxílio de um estilete ( clips para papel), colocar uma pequena bucha de algodão no bocal da pipeta. Verificar, assoprando suavemente na pipeta, se a bucha está adequada. Não deve estar frouxa, nem muito apertada o que dificultaria a passagem de ar. Acondicionar individualmente cada pipeta utilizando papel kraft 50x10 cm. Amarrar com barbante ou fita crepe; anotar o volume da pipeta.

- Produzir 05 zaragatoa ( swabs) utilizando palito para churrasco , algodão e papel alumínio.

Trabalho em grupo : - Deverá ser feita por grupo composto por dois alunos:- Acondicionar os tubos embuchados em pacotes , utilizando papel kraft e barbante

ou fita crepe. Identifique o material, coloque a data.- Montar feixes de pipetas, com mesmo volume, conforme orientação do professor.- Acondicionar 1 erlenmeyer de 250 ml, conforme instrução do professor.- Acondicionar 07 placas de Petri, utilizando papel kraft e fita crepe. Um pacote

deve conter 02 placas e o outro 05 placas. - Acondicionar as zaragatoas utilizando papel kraft e barbante.- Acondicionar 5 tubos em latas para serem autoclavados.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

01-BIER,O.- Microbiologia e Imunologia. 24ª ed.,São Paulo, Melhoramentos, p. 919-998, 1985.

02-CARDOSO, C.L.-Microbiologia: aulas práticas para o curso de odontologia. Maringá: UEM,1996.03-SALLE,A.J.- Laboratory Manual on Fundamental Principles of Bacteriology. 6th ed.,New York, McGraw-Hill Book Company, p. 2-7,1967.04-CETESB.- Normalização Técnica L5.009. Segurança e Higiene do Trabalho em

Laboratório de Microbiologia. 1ª ed., São Paulo, Companhia de Saneamento Ambiental,11p., 1975.

05-ZANON,U.-Esterilização, p. 831-858 In: U. Zanon & J.Neves (ed.). Infecções Hospitalares, Prevenção, Diagnóstico e Tratamento. 1ª ed..Rio de Janeiro, MEDSI, 1987.

Objetivos da aula prática nº 02

Espera-se que o aluno seja capaz de :

1) Conceituar e indicar a importância da lavagem do material a ser utilizado emm microbiologia.Descrever a técnica de lavagem de vidraria em uso ( técnica geral, pipetas, lamínulas e lâminas.

2) Qual a indicação da lavagem de vidraria com solução sulfo-crômica?

3) Qual a finalidade do acondicionamento do material no laboratório de microbiologia?

4) Qual a finalidade da colocação de algodão no bocal de pipetas?

5) Citar 5 propriedades que deve apresentar o papel utilizado no acondicionamento do material na prática microbiológica.

AULA PRÁTICA : 03

1- ESTERILIZAÇÃO PELO CALOR ÚMIDO

A esterilização é definida como sendo o processo de destruição de todos os microrganismos presentes em um determinado material. Ela é obtida pela utilização de agentes físicos, agentes químicos e , no caso de líquidos termolábeis, pelo processo da filtração.

Um objeto é considerado esterilizado quando a probabilidade de se detectar um microrganismo vivo, após a esterilização deste material, é infinitamente pequena, ou seja, menor do que um para um milhão. O calor úmido sob a forma de vapor de água saturado sob pressão, é o mais prático e eficiente agente de esterilização. O equipamento que produz estas condições é chamado de autoclave. O funcionamento da autoclave é baseado no princípio da marmita de Papin, em que a água aquecida em recipiente fechado onde o vapor fica retido sobre pressão, pode atingir temperaturas superiores a 100ºC sem ferver. A autoclave de Chamberland consiste essencialmente em uma caldeira cilíndrica de paredes resistentes, fechada na parte superior por uma tampa, que veda perfeitamente, dotada de uma guarnição de borracha e parafusos (manipuladores) de fixação. No interior da caldeira existe um suporte (cruzeta) sobre a qual se coloca uma cesta metálica de superfície perfurada, contendo o material ser esterilizado. Entre a cruzeta e o fundo da autoclave existe um espaço onde estão localizadas resistências elétricas protegidas por material isolantes. Neste espaço é colocado a água que será aquecida. A tampa da autoclave possui um orifício de escapamento, uma válvula de segurança e um manômetro que indica a pressão e a temperatura correspondente.

Técnica de esterilização na autoclave

- Abrir a tampa da autoclave e colocar água na caldeira até quase atingir a cruzeta( um dedo abaixo);- Introduzir o cesto metálico contendo o material a ser esterilizado;- Fechar a tampa, apertando por igual os manipuladores;- Ligar a chave elétrica no máximo da intensidade;- Abrir o registro do orifício do escapamento. A princípio, há expulsão do ar contido na caldeira. Quando a água começa a ferver, sai um jato intermitente de ar misturado com vapor de água. Quando todo o ar residual é expulso do aparelho, começa a sair um jato contínuo de vapor de água. Fechar o registro do orifício de escapamento. O manômetro começa a acusar o aumento de pressão:- Ao atingir a temperatura de 121ºC ( 1 atmosfera de pressão), diminuir a intensidade de calor girando a chave elétrica para a posição média ou mínima, de forma que a pressão permaneça estável;- Marcar o tempo de esterilização de 15 minutos;- Desligar a chave elétrica girando-a para a posição desligado;- Aguardar que a pressão retorne a zero atmosfera;- Abrir o registro do orifício de escapamento para equalizar a pressão da autoclave com a do ambiente;- Com auxílio de luvas de amianto, de cano longo, afrouxar os manipuladores;- Abrir a tampa da autoclave com cuidado. Proteger o rosto contra a projeção de vapor;- Retirar o cesto com o material esterilizado.Obs: Para regular a válvula de segurança, deslocar o contra-peso para frente ou para trás, de maneira a estabilizar a pressão desejada, observando-se o limite de até 1,5 atmosferas. A água da caldeira após a esterilização de material contaminado deve ser drenado através da válvula de drenagem.

Controle do processo de esterilização

Pode ser feito por:

1) Fita indicadora (Indicador químico) : Fixar, sob a superfície dos objetos a serem esterilizados, um pedaço de aproximadamente 3 a 5 cm da fita indicadora. Observar que a fita possui cor creme uniforme. Após a esterilização verificar se a fita apresenta faixas pretas paralelas, indicando que a temperatura do processo de esterilização atingiu 121ºC. 2) Anidrido succínico( indicador químico) : colocar em um béquer de 100 ml um tubo de ensaio 13x100 mm, com tampa de algodão, acondicionado em envólucro de papel , contendo 1 g de anidrido succínico. Esta substância tem ponto de fusão de 119,6ºC e se apresenta à temperatura ambiente no estado sólido. Após a esterilização, observar se o anidrido está fundido ( líquido) indicando que a temperatura do processo de esterilização ficou próximo de 120ºC.3) Indicador biológico (Sterikon, Esterilitest): este bioindicador consiste em uma ampola que contém caldo nutriente, açúcar, um indicador de pH e esporos de uma bactéria Bacillus stearothermophilus (ATCC 7953). A resistência térmica destes esporos é tal que o microrganismo não sobrevive após autoclavação a 121ºC durante 15 minutos ( D121= 3 1 minuto). Em temperatura ou tempos de exposição menores, os esporos sobrevivem . As ampolas são colocadas junto com o material a ser esterilizado. Após a autoclavação, a eficácia do processo de esterilização, é verificada pela incubação das ampolas para evidenciação da germinação dos esporos. A ausência de crescimento indica esterilização adequada. Neste caso, o bioindicador apresenta coloração violeta clara. Se a esterilização for inadequada, os esporos do B. Stearothermophilus sobrevivem ao tratamento térmico e germinam. O conteúdo da ampola apresentará coloração amarela dentro de 24 horas, devido ã formação de ácidos decorrentes da fermentação do açúcar e também apresenta turbidez devido ao crescimento bacteriano.Técnica de realização do controle biológico: colocar em um béquer de 100 ml de capacidade uma ampola de Sterikon ou Esterilitest ( teste - ampola 1) juntamente com o material a ser esterilizado na autoclave. Em paralelo, deixar outra ampola do bioindicador à temperatura ambiente ( controle positivo- ampola 2) . Após a esterilização, retirar a ampola teste da autoclave e incubá-la, juntamente com ao controle positivo, em Banho-Maria a 56-60ºC durante 24-48 horas. Os resultados podem ser analisados observando a Tabela 01.

Tabela 01- Interpretação do controle de esterilização da autoclave de Chamberland pelo emprego de bioindicadores ( B. stearothermophilus).

Ampola 1 (teste)

Ampola 2 ( Controle positivo)

Processo de esterilização

Turbidez e coloração amarela

turbidez e coloração amarela

Inadequado

Límpido e coloração violeta

turbidez e coloração amarela+

Adequado

Límpido e coloração violeta

límpido e coloração violeta

Bioindicador inativo, substituí-lo

2- ESTERILIZAÇÃO PELO CALOR SECO

A esterilização pelo calor seco é realizada em estufas especiais denominadas de Forno Pasteur. Basicamente, o forno de Pasteur consiste de uma câmara dotada de um elemento aquecedor elétrico ( resistência) que aquece a câmara e seu conteúdo; além disso,

existe um termostato que regula a temperatura desejada e um orifício na parte superior que permite a colocação de termômetro. Devido o calor seco apresentar menor poder de penetração do que o calor úmido, a esterilização pelo calor seco requer temperaturas mais elevadas ( 140-180ºC) e tempo de exposição mais prolongado ( 1- 3 horas). Seu uso é indicado para esterilização de vidraria, instrumentos de corte ou de pontas passíveis de serem oxidadas pelo vapor, pós e produtos impermeáveis como ceras, pomadas e óleos. Os materiais são efetivamente esterilizados quando tratados por uma das várias combinações de temperatura-tempo de eficácia comprovada.

Tabela 02- Combinações de tempo e temperatura para esterilização em Forno Pasteur.

Temperatura ( ºC ) Tempo ( horas)121 12

160 * 02 *170 01

* Mais utilizado Outras formas de esterilização pelo calor seco utilizadas no laboratório de

microbiologia incluem a incineração de materiais descartáveis e flambagem. A flambagem é o método empregado para a esterilização de alças e agulhas de níquel-cromo que são aquecidas ao rubro, diretamente na chama do bico de Bunsen.

Técnica de esterilização no Forno Pasteur

- Ligar o forno e ajustar a temperatura para 160ºC com auxílio do botão do termostato e do termômetro graduado;

- Após o forno atingir a temperatura de 160ºC, utilizando luvas de amianto, abrir a porta do forno e colocar o material limpo , seco e devidamente acondicionado no interior do forno, de forma adequada para permitir a circulação do ar quente no interior da câmara. Alguns tipos de forno são dotados de ventilador interno para uniformizar a circulação do ar;

- Fechar a porta do forno e aguardar a temperatura subir e estabilizar em 160ºC;- A partir desse momento, marcar o tempo de esterilização de 2 horas. Nunca abrir a

porta do forno durante o ciclo de esterilização;- Desligar o forno e deixar esfriar naturalmente, com a porta fechada;- Com auxílio de luvas de amianto de cano longo, abrir a porta do forno para a

retirada do material quando o termômetro acusar temperatura de 60-80ºC.

3- ESTERILIZAÇÃO POR FILTRAÇÃO

A esterilização de líquidos e gases pode ser efetuada por meio de filtração através de materiais capazes de reter microrganismos. Atualmente, dois tipos de filtros são amplamente utilizados em laboratórios de microbiologia : discos filtrantes (Seitz) e membranas filtrantes (Millipore, Sartorius). Os discos Seitz são discos de amianto, extremamente absorventes, que retém os microrganismos principalmente por diferenças de cargas elétricas. As membranas filtrantes são constituídas de ésteres de celulose e contém milhões de poros microscópicos com diâmetros uniformes variando de 0,01 a 14 m. Essas membranas retém, em sua superfície, todas as partículas que excedem ao tamanho dos seus poros. Na prática bacteriológica,

geralmente são utilizadas membranas com poros de 0,45 a 0,22 m. Os discos e membranas filtrantes são muito utilizados no laboratório de microbiologia para a esterilização de soluções termolábeis, como por exemplo: soro, plasma, açucares, antibióticos, vitaminas que são adicionadas assepticamente em meios de cultivo.

Técnica de esterilização por filtração:

Para a filtração de soluções , em discos ou membranas, é necessário forçar o líquido através do filtro, aplicando uma pressão negativa ao frasco de filtração, por meio de uma bomba de vácuo ou de uma trompa de água, ou impondo uma pressão positiva acima do líquido de filtração. Normalmente , o disco Seitz é acoplado a um suporte que por sua vez é adaptado a um frasco de kitasato, sendo que este conjunto acondicionado é esterilizado em autoclave.As membranas filtrantes podem ser montadas em suportes de diferentes tamanhos , que variam de acordo com o diâmetro da membrana. Para a filtração de um pequeno volume de líquido, o suporte previamente esterilizado e com membrana é adaptado a uma seringa,sendo que o líquido filtrado é coletado em frasco estéril. Para grandes volumes são mais usados os filtros Seitz.

O controle de esterilidade da solução filtrada é feito através de semeadura em meios de cultura na forma líquida. A ausência de turvação do meio de cultivo, após incubação a 37ºC por 24 - 48 horas, comprova a eficácia do processo de esterilização.

4- ATIVIDADE PRÁTICA

Trabalho individual :

- Fazer a desinfecção da bancada de trabalho com álcool 70%;- Lavar as mãos com água e sabão ( lavagem higiênica).

Trabalho em grupo :

- Verificar o funcionamento de uma autoclave conforme orientação do professor;- Proceder a autoclavagem do material fornecido pelo professor.- Proceder o controle do processo de autoclavagem através da fita indicadora e

indicador biológico.- Proceder a flambagem de agulhas e alças de semeadura bacteriológica.- Fazer a desinfecção da bancada de trabalho com álcool 70%;- Lavar as mãos com água e sabão ( lavagem higiênica).

Objetivos da aula prática nº 06

Espera-se que o aluno seja capaz de :

1) Descrever a técnica geral de esterilização no Forno Pasteur e na autoclave de Chamberland.

2) Quais materiais hospitalares devem ser esterilizados através da autoclave?

3) Quais materiais hospitalares podem ser esterilizados pelo Forno Pasteur?

4) Como é realizado e interpretado o controle do processo de esterilização na autoclave utilizando o indicador biológico?

5) Quantos frascos ,e em que posições ,de indicadores biológicos devem ser colocados em autoclaves pequenas , média e grandes?

6) Qual a periodicidade de se fazer o controle do processo de esterilização em um hospital?

AULA PRÁTICA : 04

CONTEÚDO :1- Segurança e Higiene no trabalho microbiológico ( Manipulação asséptica)2- Atividade prática : Técnicas de manipulação asséptica

1- SEGURANÇA E HIGIENE NO TRABALHO MICROBIOLÓGICO

Cada laboratorista é responsável pela sua segurança e a de seus companheiros de trabalho. O acidente mais comum no laboratório de microbiologia é a infecção por microrganismo patogênico, estando sujeito a este tipo de acidente todo pessoal que trabalha ou circula pelo laboratório. A via mais importante de infecção é a respiratória, por inalação do ar contaminado de trabalho. Além desta, outras vias de infecção devem ser consideradas, como por exemplo:- Pele ( escoriações, acidentes com materiais pérfuro-cortantes, mordida de animais inoculados; - Mucosa bucal e vias digestivas: ingestão de líquidos contaminados, insuficiente anti-sepsia das mãos antes de comer e fumar, maquilagem durante o trabalho;- Olhos e ouvidos : projeção de cultura microbiana, mãos contaminadas.

Com o objetivo de evitar qualquer tipo de infecção acidental durante a jornada de trabalho no laboratório de microbiologia, observar as seguintes normas:- Não correr riscos desnecessários;- Usar equipamentos de segurança apropriados;- Estar preparado para agir rapidamente em casos de acidentes;- Proibido fumar e comer no laboratório.

Cada laboratório trabalha em condições diferentes e os riscos de infecções a que está exposto o pessoal varia de segundo a organização da instituição, sua equipe, métodos de trabalho, assim como as operações que ali se realizam.

As pessoas que trabalham em laboratório de microbiologia devem possuir boa capacidade mental e habilidade manual. Devem ter conhecimentos básicos em higiene, epidemiologia e desinfecção. Cada indivíduo deve ser conscientizado dos riscos que tem seu trabalho e ser de forma sistemática informado dos métodos, procedimentos e

comportamento pessoal para prevenir qualquer infecção ou a eventual propagação de uma epidemia fora do laboratório.

Área contaminada

Esta denominação é dada ao local onde se manipulam materiais que contenham ou possam conter microrganismos patogênicos ou potencialmente patogênicos. Como o risco principal nesta área é a inalação de aerossóis, cuidados especiais devem ser observados nas seguintes manipulações microbiológicas:

- Ao abrir os recipientes com amostras, sobretudo quando em meios líquidos;- Ao preparar esfregaços;- Ao pipetar suspensões microbianas, o que deve ser feito com bulbo de borracha e

nunca com a boca;- Ao homogeneizar suspensões microbianas manualmente, com auxílio de pipetas ou

em agitador de tubo tipo “mixer “;- Ao desprezar líquidos sobrenadantes após centrifugação;- Ao abrir tubos ou frascos após centrifugar;- Ao flambar alça ou agulha de semeadura bacteriológica.O trabalho nesta área deve ser realizado levando-se em conta as seguintes

recomendações:- Evitar a entrada e o trânsito de pessoas estranhas;- Trabalhar sempre com o avental de proteção;- Evitar entrada e saída contínua das pessoas que estejam trabalhando nesta área;- Manter sempre à mão um frasco com desinfetante ( Álcool 70% ou fenol 5%).

Equipamentos de segurança :

São instrumentos que tem por finalidade evitar ou amenizar um acidente. Os equipamentos de segurança que se pode dispor na maioria dos laboratórios são limitados devido ao alto custo., Poucos contam com câmaras ou cabines assépticas dotadas de filtros esterilizantes, sistema de exaustão e de luz ultravioleta. Em laboratórios que possuem câmara asséptica alguns cuidados devem ser tomados:

- Usar lâmpada de ultravioleta com emissão de raios de comprimento de onda em torno de 250-260 nm;

- Não operar com luz ultravioleta ligada, os raios ultravioleta causam sérios danos aos olhos e pele;

- Antes de iniciar o trabalho, fazer a desinfecção da câmara asséptica e ligar a luz ultravioleta pelo período de 1 a 2 horas;

- Limpar os bulbos das lâmpadas, a cada duas semanas, com álcool etílico para remover o pó.

Existem , no entanto, equipamentos de segurança simples e de baixo custo, de uso indispensável na prática microbiológica, como por exemplo:

- Recipiente metálico ( ou de vidro) para receber líquidos contaminados;- Frasco contendo areia e álcool para limpar agulha e alça bacteriológica antes de

flambá-la, para evitar a produção de aerossóis;- Estantes de arame estáveis;- Recipiente metálico, com tampa, para receber o material a ser autoclavado

( cemitério);- Pipetadores com bulbos de borracha para aspirar e vazar líquidos com pipetas;- Pipetas contendo buchas de algodão, para proteger a parte destinada a aspiração;

- Recipiente para depositar pipetas contaminadas;- Equipamentos de proteção individual- avental, luvas, máscaras, óculos, gorros,

botas.

Higiene Pessoal:

É indispensável no laboratório de microbiologia uma rigorosa limpeza. Cada aluno é responsável pela sua bancada de trabalho e pelos instrumentos que utilizar. As seguintes normas de limpeza devem ser observadas durante o trabalho;

- Antes de iniciar o trabalho o aluno deverá colocar o avental, de uso exclusivo, lavar as mãos com água e sabão e efetuar a desinfecção da bancada de trabalho;

- Após cada contato com material infeccioso, fazer a anti-sepsia com álcool 70%, a seguir lavá-las com água e sabão;

- Para qualquer trabalho que apresente risco maior de contaminação, utilizar instrumentos e equipamentos de proteção individual. Usar máscara quando da manipulação de microrganismos transmissíveis pelo ar;

- Não fumar, comer ou beber no laboratório;- Não roer unhas, esfregar os olhos ou ouvido durante as manipulações;- Usar somente panos estéreis para limpeza;- Não colocar cadernos ou livros no setor contaminado;- Ao término do trabalho na área contaminada, proceder a desinfecção da bancada,

fazer a anti-sepsia e a lavagem das mãos com água e sabão.

Em caso de acidentes

Um dos acidentes mais freqüentes é a queda e a quebra de tubos, pipetas, frascos ou recipientes contendo microrganismos patogênicos ou potencialmente patogênicos. Nestes casos proceder da seguinte forma;

- Despejar sobre o material quebrado e seus arredores, solução de fenol a 5% ou outro desinfetante apropriado;

- Cobrir a área com papel toalha ou jornal para demarcá-la e recobrir novamente com fenol a 5%. Após 30 minutos, usando luvas e com auxílio de pinça, recolher os cacos de vidro e o papel toalha e colocá-los no cemitério. Se o material cair no piso, os alunos devem deixar o ambiente por 30 minutos e após proceder como no ítem anterior.

Causas de acidentes de trabalho:

As causas de acidentes de trabalho podem ocorrer devido aos atos inseguros ou condições inseguras. O ato inseguro é a maneira pela qual as pessoas se expõem a riscos de acidentes, freqüentemente representados pelas seguintes situações:

- Desconhecimento dos riscos de acidentes;- Treinamento inadequado;- Falta de interesse ou de aptidão para o trabalho;- Excesso de confiança;- Atitudes impróprias tais como revolta, violência, mau humor, etc.;- Incapacidade física para o trabalho;- fadiga.As condições inseguras do local de trabalho são aquelas que põem em risco a

integridade física ou a saúde dos trabalhadores ou a própria segurança das instalações.

4- ATIVIDADE PRÁTICA

Trabalho individual :

- Fazer a desinfecção da bancada de trabalho com álcool 70%;- Lavar as mãos com água e sabão ( lavagem higiênica).- Manipulação da Placa de Petri : Treinar repetidas vezes a técnica de abrir e

fechar placas de Petri 100X15. Utilizar apenas uma das mãos, conforme demonstração do instrutor.

Manipulação asséptica :

Teste de manipulação asséptica:

- Lavar as mãos com água e sabão e fazer a desinfecção da bancada de trabalho;- Identificar 3 tubos de ensaio 13X100, previamente esterilizados, com números

de 1 a 3;- A partir de um tubo de 20 ml de capacidade contendo 10 ml de TSB (caldo

tripticaseina de soja) previamente esterilizado, transferir assepticamente 5,0 ml para um tubo de ensaio de13X100, com auxílio de pipeta de 2,0 ml (tubo 1).

- A partir do tubo 1, transferir assepticamente 3ml, para o tubo 2, com auxílio de uma pipeta de 1 ou 2 ml

- A partir do tubo 2, transferir assepticamente 1ml, para o tubo 3, com auxílio de uma pipeta de 1 ou 2 ml.

- Incubar os 4 tubos em estufa 35-37ºC/24hs- Fazer a leitura de turbidez e preencher o relatório- Fazer a desinfecção da bancada de trabalho com álcool 70%;- Lavar as mãos com água e sabão ( lavagem higiênica).

Quadro 1- Resultados do teste de manipulação asséptica

TUBOS LÍMPIDO TURVOA123

Quadro 2-Interpretar os resultados obtidos no teste de manipulação asséptica

Objetivos da aula prática nº 07

Espera-se que o aluno seja capaz de :

1) Qual a via mais importante de infecção acidental no laboratório de microbiologia? Que procedimentos técnicos devem ser utilizados para evitar o risco destas infecções?

2) Explicar por que a manipulação asséptica no laboratório de microbiologia deve, obrigatoriamente, ser feita atrás da chama do bico de Bunsen ?

3) Qual o resultado que você obteve no experimento de manipulação asséptica realizado na aula prática ? Justifique a resposta.

ANOTAÇÕES

AULA PRÁTICA : 5

1) CULTURA PURA DE MICRORGANISMOS

A) Introdução

Um pré-requisito para a caracterização de uma espécie microbiana no laboratório de microbiologia é que ela esteja disponível para estudo como uma cultura pura. O termo cultura pura quer dizer que todas as células da cultura tem uma origem comum, isto é, são descendentes da mesma célula. É possível obter uma cultura pura através da transferência de uma célula para um meio de cultura adequado, através do uso de

micromanipulador acoplado a um microscópio. Entretanto, na prática microbiológica são empregados métodos indiretos para a obtenção de culturas puras, baseados em técnicas de isolamento de colônias, como por exemplo: (1) Técnicas de esgotamento por estrias contínuas ou descontínuas, na superfície do agar nutriente; (2) Diluição e semeadura por técnica de “pour plate” ou de semeadura em superfície de agar nutriente.Em termos práticos, considera-se que a população microbiana de uma colônia é proveniente de uma única célula e portanto representa uma cultura pura. Na realidade, neste caso, o termo cultura axênica pode ser mais apropriado do que cultura pura porque cultura axênica significa o crescimento de um microrganismo em um ambiente livre de outros organismos. Essencialmente, o termo cultura pura implica em pureza genética enquanto que cultura axênica não.

b) Formação e crescimento de colônias

Quando uma célula bacteriana isolada se reproduz dentro de um meio solidificado ou na sua superfície, sua progênie vai se acumulando na forma de uma massa de células conhecida como colônia. Inicialmente o crescimento da colônia é exponencial em relação ao tempo. Após algumas divisões, entretanto, a ordem de crescimento se torna mais complexa devido à grande proximidade das células acumuladas. Esta proximidade cria uma situação, que pode ser chamada de aglomeração fisiológica, na qual as células individuais competem entre si pelos nutrientes disponíveis e afetam-se mutuamente pelo acúmulo localizado de produtos residuais. Como os nutrientes precisam se difundir do meio circundante para as células, enquanto os produtos residuais do metabolismo devem se difundir das células para o ambiente, os membros individuais das colônias ficam sujeitos a uma variedade de condições ambiente, segundo sua localização da colônia. O crescimento de colônias bacterianas é afetado , não só pelas interações de colônias vizinhas. Se as colônias estiverem muito próximas, elas interferem com o crescimento uma das outras pela depleção de nutrientes do meio ou pela excreção de produtos residuais tóxicos. O fenômeno é comumente observado em placas semeadas por estrias em agar nutriente, para isolamento de bactérias. Nestas placas, as colônias que estão juntas são pequenas, enquanto aquelas que se encontram bem isoladas atingem tamanhos maiores.

c) Estoque de culturas puras

É essencial que o método de conservação e manutenção preserve todas as características da espécie, tais como foram evidenciadas no momento de seu isolamento.No laboratório, são utilizadas as seguintes técnicas com esta finalidade:(1) transferência periódica para meios de cultura recém preparados:(2) conservação das culturas em agar inclinado, sob camada de óleo mineral;(3) conservação das culturas pela dessecação rápida em estado congelado (liofilização);(4) estocagem em temperaturas muito baixas, como por exemplo: freezer –70ºC;

nitrogênio líquido a – 196ºC.Existem organizações cuja principal função é manter em estoque de culturas puras autênticas de bactérias, fungos, algas, protozoários e de células animais. Como exemplos destas instituições, podemos citar:(1) American Type Culture Collection ( ATCC) , localizada em Rockville, Maryland,

USA;(2) Instituto Pasteur de Paris, em Paris, França;(3) National Collection of Type Culture (NCTC) em Londres , Inglaterra;

(4) Japanese Type Culture Collection em Nagao, Tóquio, Japão.Estas culturas puras de amostras padrões são utilizadas em trabalhos de pesquisa e no controle de qualidade da rotina microbiológica. Geralmente estas amostras são enviadas em ampolas ( liofilizadas) , mediante a compra ou doação.

2)TÉCNICA DE SEMEADURA EM TUBOS E PLACAS

Trabalho individual:

a) Identificar 2 placas contendo meio de cultura , com o nome do aluno ;b) A partir de um cultivo de 24 horas em meio líquido efetuar o isolamento de colônias,

através da técnica de esgotamento por estrias contínuas, em uma das placas.c) A partir de um cultivo de 24 horas em meio líquido efetuar o isolamento de colônias,

através da técnica de esgotamento por estrias descontínuas, na placa restante.d) Identificar 3 tubos de ensaio com os números 1, 2 e 3.e) Transferir, de um cultivo de 24 horas em meio líquido, com uma agulha bacteriológica

um inóculo para os tubos :(1) em picada(2) em picada e estria(3) em estria

f) Incubar a 35-37ºC / 24 horasg) Fazer a leitura das placas verificando as características de crescimento e o isolamento

das colônias.

Avaliação do crescimento bacteriano

Crescimento em meio sólido

Crescimento em agar inclinado

Crescimento em meio líquido

Forte: mais de 10 colônias na estria final (4ª estria)

Forte: estria com crescimento abundante

Forte: acentuada turvação , película superficial

Moderado: 0 a 5 colônias na estria final (4ª estria)

Moderado: estria com contorno definido

Moderado: turvação regular

Escasso: 0 a 5 colônias na 2ª estria

Escasso: estria com falhas podendo Ter colônias isoladas

Escasso: leve turvação

Muito escasso: 1 a 5 colônias na 1ª estria

Nulo: ausência de crescimento

Muito escasso: turvação quase imperceptível

Obs: técnica de esgotamento por estria descontínua

Obs: Técnica de semeadura por estria superficial

Obs: Técnica de semeadura por dispersão

Objetivos da aula 08:

O aluno deverá ser capaz de :

1) Definir cultura pura de microrganismos e indicar sua importância na prática microbiológica. Quais técnicas utilizadas para a obtenção de culturas puras?

2) Quais os métodos de conservação de culturas puras no laboratório de microbiologia?

3) Como é feita a avaliação macroscópica do crescimento bacteriano em:

(a) Placa semeada por técnica de esgotamento por estrias descontínuas(b) Tubos contendo agar simples inclinado(c) Meios de cultura líquidos

4) Fazer o esquema da semeadura por esgotamento por : (a) estrias contínuas(b) estrias descontínuas

AULA PRÁTICA : 6

PREPARAÇÕES MICROSCÓPICAS CORADAS

As preparações coradas são os exames microscópicos mais comumente empregados em microbiologia pois proporcionam uma melhor visualização dos microrganismos, permitindo diferenciar vários tipos morfológicos, assim como, o estudo de suas estruturas, quando da utilização de técnicas específicas de colorações.

COLORAÇÃO DE GRAM

O método de Gram se baseia no fato de que o complexo formado entre o iodo (lugol) e a violeta de genciana (“complexo iodo-pararosa-anilina”) permanece retido dentro da célula de algumas bactérias mesmo após o tratamento subseqüente com o álcool (“agente descorante”). Estas bactérias são denominadas Gram positivas ou que tomam o Gram. Outras bactérias chamadas Gram negativas ou que não tomam o Gram descoram facilmente pelo álcool. Entretanto, se após a ação do álcool se efetuar uma coloração de fundo utilizando-se a fucsina básica, as bactérias Gram negativas aparecerão coradas em vermelho, ao passo que as Gram positivas se apresentarão roxas, isto é, conservarão a cor violeta do complexo iodo-violeta de genciana.

O mecanismo da coloração de Gram não está ainda bem definido porém, se relaciona indubitavelmente ás diferenças de permeabilidade da parede celular. Nas bactérias Gram positivas a parede é constituída essencialmente por um componente mucopeptídico e o tratamento com álcool resulta uma desidratação e conseqüente diminuição da permeabilidade,o que impede ou dificulta a eluição do complexo iodo-corante. O mesmo não acontece nas bactérias Gram negativas, nas quais o solvente orgânico atua em sentido contrário determinando aumento de permeabilidae celular. A coloração de Gram é de elevada importância para a sistemática em bacteriologia pois divide as bactérias em dois grandes grupos: GRAM POSITIVAS e GRAM NEGATIVAS, que reagem diferentemente frente a muitos agentes físicos e químicos.

PREPARO DOS CORANTES DA COLORAÇÃO DE GRAM

1.- CRISTAL VIOLETA FENICADO (seg. Nicolle):

1.1 - Fórmula:

Cristal violeta 1,0 gÁlcool a 95GL 10,0 mlFenol fundido 2,0 gÁgua destilada 100 ml

1.2 - Fenol fundido: para manter o fenol fundido dissolver em Banho-Maria a 50-60C e adicionar 10% de água destilada.

1.3 -. Preparo: triturar o cristal violeta em um gral. Adicionar o álcool, homogeneizar. Juntar o fenol fundido. Acrescentar aproximadamente 50 ml de água destilada, misturar e transferir para um frasco âmbar de rolha eesmerilhada. Lavar o gral 2 a 3 vezes com o restante de água destilada. Deixar em repouso durante 24 horas. Filtrar em papel ou algodão para outro frasco âmbar de rolha esmerilhada. Estocar.

NOTA: Quando da transferência do corante em estoque para frascos conta-gotas filtrar novamente com papel de filtro ou algodão.

2 - MORDENTE (sol. de lugol)

2.1 -Fórmula:

Iodo 1,0 GIodeto de potássio 2,0 GÁgua destilada 300 Ml

2.2 - Preparo: triturar o iodo com iodeto de potássio em um gral. Adicionar aos poucos a água destilada. Misturar bem. Filtrar e estocar em frasco âmbar de rolha esmerilhada.

2.3 - AGENTE DESCORANTE (álcool)

Usar apenas solventes P.A. podendo-se empregar o álcool etílico 95 à mistura de álcool-cetona (1:1); ou a de éter-cetona na proporção de (1:3).

2.4 - CORANTE DE FUNDO (FUCSINA BÁSICA)

a. Preparo: diluir a fucsina de Ziehl (ver método de coloração de Ziehl) 1:10 em água destilada. Filtrar em papel ou algodão e estocar em frasco âmbar de rolha esmerilhada.

Atividade prática

- Fazer a desinfecção da bancada de trabalho com álcool 70%;- Lavar as mãos com água e sabão ( lavagem higiênica).- Em uma lâmina desengordurada e seca faça um esfregaço utilizando uma

suspensão bacteriana ( não esquecer de passar a alça bacteriológica no álcool areia antes de flambá-la).

- Fixar o esfregaço passando-o três vezes pela chama - Cobrir o esfregaço por 1 minuto com cristal violeta.- Escorrer o corante, cobrir 1 minuto com lugol.- Lavar em água corrente de baixa pressão.- Descorar com álcool-cetona (tempo delicado 5-10 segundos).- Lavar em água corrente de baixa pressão.- Corar com fucsina de Ziehl 1:10 durante 30 segundos.- Lavar em água corrente de baixa pressão.

- Deixar secar espontaneamente ao ar.- Leitura ao microscópio com objetiva de imersão.- Fazer o desenho das observações ao microscópio- Classificar as bactérias observadas em relação à morfologia e coloração- Fazer a desinfecção da bancada de trabalho com álcool 70%;- Lavar as mãos com água e sabão ( lavagem higiênica

AULA PRÁTICA: 7

ANTIBIOGRAMA: TÉCNICA DE DIFUSÃO EM ÁGAR.

INTRODUÇÃO

A sensibilidade dos microrganismos a drogas pode ser investigada em rotina pelos métodos de diluição (técnicas de microdiluição em caldo, técnica de diluição em ágar), de difusão em ágar e de diluição do disco em caldo (bactérias anaeróbias). Nos métodos de diluição, concentrações previamente determinadas da droga são incorporadas ao meio de cultura, o microrganismo é semeado e o sistema incubado em temperatura e atmosféra adequadas. Depois de um período de tempo definido, verifica-se a menor concentração da droga que foi capaz de impedir o crescimento do microrganismo. O meio pode ser líquido ou sólido. Nos métodos de difusão, deixa-se a droga difundir no meio de cultura sólido a partir de um reservatório, que pode ser um orifício no meio de cultura, uma tira ou um disco de papel de filtro ou mesmo uma pastilha. Depois que o microrganismo é uniformemente semeado, coloca-se a droga no meio de cultura, incuba-se o sistema e verifica-se depois de 18-24 horas, se o crescimento do microrganismo foi inibido. O significado da inibição é interpretado de acordo com a técnica usada. Considerando-se que na prática bacteriológica a técnica mais utilizada é a de difusão em ágar pelo sistema de discos proposta por Kirby-Bauer, descrevemos abaixo os principais aspéctos técnicos deste procedimento com base nas recomendações de especialistas nacionais e internacionais.

MEIO DE CULTURA

Entre os vários meios de cultura disponíveis, o ágar de Mueller-Hinton é considerado o melhor para a realização dos testes de susceptibilidade de rotina, devido os seguintes fatores:

1) Boa reprodutibilidade em diferentes partidas do meio;2) Apresenta baixa concentração de inibidores para sufonamidas, trimetropim e

tetraciclinas;3) Proporciona crescimento satisfatório da maioria dos patógenos;4) Devido a tradição de uso encontra-se diponível, na literatura para estudos

comparativos, uma grande quantidade de resultados do antibiograna obtidos com este meio de cultura.O meio de Mueller-Hinton deve ser de sangue de carneiro ou coelho quando as necessidades do microrganismo o exigirem. Para as espécies do gênero Haemophilus o meio deve ser preparado sob a forma de ágar chocolate.

Preparo do Meio de Mueller-Hinton - Preparar o ágar de Mueller-Hinton desidratado (fórmula: Infuso de carne 2g; hidrolisado ácido de caseína 17,5g; amido 1,5g; ágar-ágar 17g; água destilada 1000ml) conforme as instruções do fabricante. Imediatamente após a autoclavação, resfriar o meio em Banho-Maria 45-50oC. Distribuir o meio para placas de Petri de forma a obter uma camada de aproximadamente 4 mm de espessura. Isto corresponde a 60-70ml de meio para placas de 140mm de diâmetro interno e 25-30ml para placas com 90mm de diâmetro interno, podendo ser utilizadas placas de vidro ou de plástico. Deixar o meio solidificar a temperatura ambiente. A não ser que as placas sejam usadas no mesmo dia, estocá-las em refrierador (2 a 8oC). Utilizar as placas até sete dias após o preparo. Fazer o controle de esterilidade de algumas placas do total de placas preparadas. Incubar estas placas na estufa a 30-37oC durante 24-48 horas. Descartar as placas usadas como controle.

Estocagem dos Discos - Os cartuchos ou frascos contendo os discos de papel de filtro impregnados com os agentes antimicrobianos geralmente são fornecidos em recipientes individualizados apropiados. Os métodos de acondicionamnto devem assegurar as condições anidras adequadas. Para estocagem dos discos por longo período de tempo, é necesário obter os seguintes cuidados: 1) Manter os discos refrigerados (< 8oC ) ou congelados a -14 oC, dependendo da

droga; 2) Para preservar a potência, congelar os discos centendo drogas da família dos -

lactâmicos. Estes discos, quando refrigerados (2-8 oC), aprentam validade de uma semana;

3) Retirar os frascos de dicos do refrigerador ou freezer uma ou duas horas antes do uso. Antes de abrí-los, mantê-los fechados até ocorrer o equilíbrio com a temperatura ambiente. Este procedimento reduz ao mínimo a formação de água de condensação devido ao choque térmico;

4) No caso do uso de dispositivo mecânico para aplicação dos discos, ele deve estar acondicionado em recipiente fechado e rígido, contendo um agente desecante. Antes de abrí-lo, observar os cuidados descritos anteriormente para evitar o choque térmico;

5) Evitar excesso de umidade nos recipientes que contém os discos, subsituir o agente dessecante quando o indicador mudar de cor;

6) Quando fora do uso, manter o dispositivo para aplicação de discos em refrigerador (2-8oC);

7) Utilizar os discos contendo agentes antimicrobianos dentro do prazo de validade.

Suspensão Padrão de Sulfato de Bário - É usada para padronizar a densidade do inóculo em aproximadamente 1,5 x 108 UFC/ml, que corresponde a uma tubidez equivalente ao tubo 1/2 da escalade McFarland. Técnica de Preparo: 1) Adicionar 0,5ml de uma solução 0,048M de cloreto de Bário (11,7g de BaCl2 2H2O para

1000ml de água destilada), à 99,5ml de uma solução 0,36N (1% v/v ) de Ácido sulfúrico (1ml de H2SO4 para 99ml de água destilada);

2) Verificara a densidade da turbidez desta suspensão padrão em espectofotômetro a 625 nm. A absorbância encontrada deve estar entre 0,08 a 0,1;

3) Distriibuir volumes de 4-6 ml para tubos de ensaio com tampa de rosca de tamanho identico aqueles usados para o preparo do inóculo;

4) Apertar bem as tampas de rosca dos tubos. Selar com parafina. Estocar os tubos a temperatura ambiente, ao abrigo da luz

5) Antes do uso, agitar vigorosamente a suspensão padrão de Sulfato de Bário em agitador de tubos;

6) Após três meses do preparo, substituir a supensão ou verificar sua densidade em espectofotômetro

Preparo de Inóculo - 1) Método padrão: a) A partir de um cultivo em placa de ágar nutriente, selecionar 4 a 5 colônias b) Assepticamente, com auxilio de alça bactriológica, tocar a parte superior do centro de

cada colônia e transferí-las para um tubo de ensaio contendo 4-5ml de caldo tripticaseína soja;

c) Incubar na estufa em aerobiose a 35-37 oC até obter ou exceder a turbidez da suspensão padrão de Sulfatode Bário;

d) Ajustar aturbidez da cultura em crescimento ativo em caldo com solução salina esterilizada (NaCl 0,85%) ou caldo nutriente até obter uma turbidez visualmente comparável com aquela da suspensão padrão. Para executar esta etapa de forma apropriada usar iluminação adequada, observar os tubos (teste padrão) contra um fundo branco com linhas pretas contrastantes, ou sobre um texto de jornal.

2) Procedimento Alternativo Padronizado: Para os testes de susceptibilidade de rotina o preparo do inóculo pode ser feito diretamente a partir de um cultivo bacteriano de 18-24 horas em placa de ágar nutriente não seletivo, comoo ágar sangue. Assepticamente, com auxílio de alça bacteriológica, transferir várias colônias (mais de 5 ) identicas para um tubo de ensaio contendo um pequeno volume de solução salina e preparar uma suspensão bacteriana fortemente turva. Imediatamente, diluir com solução salina e ajustar a turbidez desta suspensão com aquela suspensão padrão de Sulfato de Bário. Este é o procedimento de escolha para testar espécies de bactérias que não crescem bem em caldo nutriente.

Semeadura em Placa - Dentro de 15 min. da padronização da turbidez da suspensão do inóculo, assepticamente, introduzir um cotonete e homogenizar. Ao retirar o cotonete precionar firmemente contra a parede do tubo, para remover o excsso da suspensão. A seguir semear a superfície do ágar de Mueller-Hinton de maneira uniforme. Efetuar a semeadura três vezes, sem recarregar o cotonete, inoculando por estrias nos planos paralelo, perpenicular e diagonal ao diâmetro da placa. Deixar a placa secar a temperatura ambiente por 3-5 min.

Apliação do Disco - Os discos podem ser aplicados com dispoitivos mecânicos múltiplos ou individuais, ou manualmente com auxílio de uma pinça. Os discos devem ser precionados levemente contra a superfície do meio. Devem ser colocados pelo menos 20mm da borda da placa e devem distar um do outro de pelo menos 30mm. Considerando-se que algumas drogas se difundem quase que instantaneamente, o disco não pode ser movido de posição após o contato com a superfície do ágar de Mueller-Hinton. Colocar no centro da placa os discos dos antibióticos que se difunde com menos intensidade, EX: polimixina, bacitracina e vancomicina.

Incubação das Placas - Inverter as placas e colocá-las na estufa, em aerobiose, a 35oC dentro de 15min. após aplicação dos discos. Quando testar Hamophilus spp ou N.

gonorrhoeae, as placas devem ser incubadas em atmosfera de microaerofilia, utilizando 5 a 7% de CO2.

Leitura das Placas - Após 16 a 18 horas de incubação examinar cada placa e medir, com auxilio de uma régua, o diâmetro da zona de completa inibição incluindo o diâmetro do disco. O halo de inibição do ágar Mueller-Hinton é medido macroscopicamente, em milímitros, pelo lado externo do fundo da placa, utilizando-se luz refletida sobre um fundo escuro. No caso do Mueller-Hinton ser adicionado de sangue, medir as zonas de inibição na superfície do meio de cultura, com a tampa da placa removida.

Interpretação - A categoria que a bactéria é colocada, isto é, resistente, intermediária ou sensível, é obtida pelo tamanho do halo de inibição

Controle de Qualidade - Com finalidade de avaliar a precisão e a exatidão dos testes, utilizam-se amostras padrões de Staphylococcus aureus (ATCC 25923), E.coli (ATCC25922) e Pseudomonas aeroginosa (ATCC 27853), que devem ser testadas quando do preparo ou aquisição de cada lote de discos contendo os agentes antimicrobianos. Para testar as culturas das amostras padrões de controle, elas devem ser ativadas pela semeadura em TSB, incubadas em a 35-37oC por 18-24 horas para a obtenção de colônias isoladas. Preparar o inóculo e fazer o antibiograma descrito anteriormente.

AMOSTRA:

Agente antimicrobiano

Concentração Diâmetro Interpretação

AULA PRÁTICA : 8IDENTIFICAÇÃO DE BACILOS DA FAMÍLIA Enterobacteriaceae

INTRODUÇÃO

Os bacilos Gram negativos pertencentes à família Enterobacteriaceae são microrganismos freqüentemente isolados de amostras clínicas enviadas aos laboratórios de Microbiologia. Antes do advento dos antibióticos, quimioterápicos e imunosupressores, as doenças infecciosas causadas pelas enterobactérias estavam essencialmente limitadas aos tratos gastrointestinal, pulmonar e urinário. Atualmente estas podem ser isoladas de infecções de praticamente todos os sítios anatômicos e o microbiologista deve estar preparado para isolar estes microrganismos a partir de qualquer material biológico enviado ao laboratório.

Embora seja possível uma identificação preliminar das enterobactérias baseada nas características das colônias e nas reações bioquímicas em meios de isolamento primário, a identificação dos diferentes gêneros e espécies exige muitas vezes uma série de testes bioquímicos.

Atualmente dispomos de vários esquemas para a identificação das enterobactérias podendo estes serem fonecidos aos laboratórios clínicos em kits comerciais. Isto vem facilitar a identificação adequada das enterobactérias, já que, muitos laboratórios têm dificuldade em preparar e manter os diversos meios necessárioos à realização da identificação definitiva convencional.

Anteriormente a identificação das espécies de Enterobacteriaceae era realizada utilizando-se fluxogramas. Atualmente, estes não estão sendo utilizados com freqüência em vista do uso bastante difundido de sistemas compactos numéricos de perfis e dados de referência computadorizados.

O emprego dos sistemas de identificação tornou possível definir “biotipos” ou “impressões digitais” bioquímicos mediante os quais muitas espécies bacterianas conhecidas podem ser sub-agrupadas. Foram desenvolvidas fórmulas matemáticas pelas quais os resultados das provas bioquímicas são convertidos em números de biotipos, possibilitando o uso de computadores para auxiliar na identificação definitiva das enterobactérias. Alguns fabricantes dispõem de guias ou registros de perfis que fornecem uma lista dos números de biotipos das várias espécies bacterianas. Os números de biotipos estão baseados em dados obtidos a partir da análise de milhares de reações bioquímicas.

A biotipificação é uma valiosa ajuda para reconhecer grupos bacterianos. Isto é necessário durante uma investigação epidemiológica ou quando se estuda a fonte de infecções cruzadas nos hospitais. A análise dos biotipos de algumas espécies bacterianas pode levar a uma melhor interpretação a cerca de como a variação das características de identificação pode estar relacionada com diferenças conhecidas quanto a virulência de diferentes cepas.

No comércio brasileiro existem sistemas computadorizados de identificação baseados em combinações de provas bioquímicas organizadas em kits compactos de utilização direta de substrato (BAC-TRAY, API-20, ENTEROTUBE), como também, kits que empregam meios de cultura (LABORCLIN, BIOPROV, PROBAC, NEWPROV). Em ambos os casos os parâmetros usados são muito semelhantes. Assim sendo, a escolha de um deles é uma questão de preferência pessoal.

É importante lembrar que um bom diagnóstico microbiológico não depende somente de uma série de carcterísticas diferenciais e que o sistema de identificação não é um

dispositivo infalível. O microbiologista deve integrar os dados bioquímicos às características coloniais (cor, tamanho, textura, odor, reações hemolíticas), à coloração de Gram, aos caracteres morfológicos e, se disponíveis, às reações sorológicas, para então efetuar uma identificação final de forma confiável.

O microbiologista deve conhecer os princípios das provas bioquímicas empregadas no laboratório a fim de que qualquer inconsistência bioquímica, problemas com culturas mistas ou técnicas errôneas possam ser rapidamente conhecidas e corrigidas.

Nesta unidade estão apresentadas as provas bioquímicas básicas do sistema R/b (não disponível no comércio brasileiro para a identificação de bacilos Gram negativos pertencentes à família Enterobacteriaceae. O mecanismo bioquímico aqui apresentado será sempre o mesmo, independente do sistema utilizado.

TRIPLICE AÇUCAR FERRO (TSI)

1.Finalidade:Determinar a habilidade de um microrganismo em utilizar, incorporados a um meio basal, glicose e ou lactose e sacarose com ou sem a produção de gás; evidenciar ainda a produção de gás sulfídrico (H2S). O meio de TSI é empregado comumente em bacteriologia para a identificação preliminar (triagem) das enterobactérias.

2. Fórmula: Extrato de carne 3,0 gExtrato de levedura 3,0 gPeptona 20,0 gLactose 10,0 gSacarose 10,0 gGlicose 1,0 gSulfato ferroso 0,2 gTiossulfato de sódio 0,3 gCloreto de sódio 5,0 gVermelho de fenol 0,024 gAgar-agar 12,0 gÁgua destilada 1000 ml

3. Mecanismo:A utilização dos açúcares presentes no meio de TSI pode ocorrer aerobicamente na superfície ou anaerobicamente em profundidade, ou simultaneamente, dependendo do potencial enzimático do microrganismo em questão. Basicamente encontramos no meio de TSI os 3 modelos de fermentação abaixo apresentados:

* (1) Apenas a fermentação da glicose (K/A). A superfície alcalina (vermelha) indica a ocorrência da degradação oxidativa da glicose. Após aproximadamente 18 horas de incubação, a glicose é totalmente consumida devido a sua baixa concentração (0,1%) e o microrganismo começa então a utilizar as peptonas, presentes no meio, para o seu crescimento. O catabolismo das peptonas resulta na liberação da amônia (NH3) responsável pela alcalinização da superfície do meio de cultura. A profundidade do meio permanece

amarela devido a prévia fermentação da glicose com produção de ácidos relativamente estáveis. Portanto, o pH da base se torna mais ácido que o da superfície do meio onde ocorreu a oxidação do açúcar.

* (2) Fermentação da lactose, sacarose e glicose (A/A). Alguns microrganismos tem a capacidade de usar todos os açúcares presentes, resultando na acidificação da superfície e da base. Tanto a lactose como a sacarose estão presentes em concentrações 10 vezes maiores do que a glicose; portanto, após 18 horas de incubação a glicose é consumida mas existe ainda grandes quantidades dos outros dois açúcares. Dependendo do tempo de incubação, a superfície pode se apresentar alcalina devido a depleção da lactose e sacarose com conseqüente utilização das peptonas presentes no meio.

* (3) Não fermentação da lactose, sacarose ou glicose (k/K) ou (K/NC). Certas bactérias, principalmente bacilos Gram negativos não entéricos, são incapazes de fermentar os açúcares presentes no TSI. O desenvolvimento destes microrganismos ocorre devido a degradação das peptonas. A reação K/K é resultado da degradação tanto aeróbica quanto anaeróbica das peptonas, enquanto que o modelo K/NC é devido ao catabolismo somente aeróbico destas substâncias.

Os gases produzidos no meio de TSI são CO2 e H2 e as bactérias produtoras são chamadas aerogênicas. No caso da não formação de gases são ditas anaerogênicas.

O meio de TSI evidencia ainda a presença de bactérias produtoras de gás sulfrídrico (H2S), resultante da reação em duas etapas:

- A bactéria num ambiente ácido degrada o tiossulfato de sódio (substrato) com a produção de gás sulfídrico que é um gás incolor e invisível.

- Numa segunda etapa, o H2S reage com o sulfato ferroso existente no meio (revelador) formando o sulfeto ferroso que é um composto insolúvel, responsável pela coloração negra que aparece no meio de TSI. Observar que a produção de H2S implica na produção de ácido mesmo que a coloração amarela não possa ser observada.

4. Técnica de semeadura: “picada profunda e estria superficial”

5. Técnica de preparo:Meio encontrado comercialmente desidratado. Portanto, para o preparo do meio seguir as instruções do fabricante.

6. Leitura e Interpretação:

Reação na superfície ou ápice / reação na profundidade ou base:

K: alcalino

A: ácido

AG: ácido e gás

H2S: gás sulfídrico

INDOL

1. Finalidade: Determinar a habilidade de um determinado microrganismo em produzir indol a partir da molécula de triptofano.

2. Mecanismo:

O triptofano é um aminoácido que quando degradado por certas bactérias levam à formação principalmente dos seguintes produtos metabólicos intermediários: indol, escatol (metil indol) e ácido indol-acético. As várias enzimas intracelulares envolvidas neste processo fisiológico são coletivamente denominadas de “triptofanases”. Os produtos intermediários formados em maior quantidade na degradação do triptofano são o ácido indol pirúvico, que produz indol por desaminação-deaminação, e o escatol formado pela descarboxilação do ácido indol-acético. A presença do indol no meio de cultivo é revelada pela adição do reativo de Kovacs, ocorrendo então a seguinte reação química:

O p-dimetil-amino-benzaldeído se liga à molécula do indol produzindo um composto quinoidal de coloração vermelha, evidenciado pela formação de um anel na camada alcoólica superficial do meio. A reação de cor é na realidade devido a reação dos grupos CH2 do anel pirrólico da molécula do indol com o aldeído, que num meio “ácido” forma uma “quinona”.

4. Técnica de preparo:A prova do indol pode ser realizada utilizando-se um meio específico para esta prova. Entretanto, nos laboratórios de rotina de microbiologia clínica, geralmente, empregam-se meios que fornecem leitura de outras provas bioquímicas além do indol, como por exemplo o MIO (motilidade, indol e ornitina). Os meios são encontrados comercialmente desidratados. Portanto, para o preparo seguir as instruções do fabricante.

5. Leitura e Interpretação:Adicionar 5 gotas de Reativo de Kovacs na superfície do meio inoculado:- Positivo: desenvolvimento de anel vermelho na superfície do meio de cultivo.- Negativo: sem desenvolvimento de cor na camada alcoólica.

Obs. Pode ocorrer o desenvolvimento de uma coloração laranja na superfície do meio devido a presença de escatol, que pode ser um dos precursores para a formação do indol.

CITRATO DE SIMMONS

1. Finalidade:Determinar se um microrganismo é capaz de utilizar o citrato como única fonte de carbono para o seu crescimento com conseqüente alcalinização.

2. Mecanismo:Normalmente, o metabolismo do citrato envolve a condensação de uma molécula acetil com a coenzima A mais o oxalacetato para iniciar o ciclo de Krebs. A grande maioria das bactérias utilizam o citrato pelo ciclo dos ácidos tri-carboxílicos ou através da via fermentativa. A clivagem do citrato envolve a participação da “citratase”. O citrato é transformado em acetato e oxalacetato sendo este último transformado em piruvato e CO2. O meio de cultivo utilizado para a fermentação do citrato também contém um sal inorgânico de amônia. O microrganismo que usa o citrato como única fonte de carbono também utiliza o sal de amônia como única fonte de nitrogênio. A degradação destes sais produz amônia (NH3) com a conseqüente alcalinização.

4. Técnica de semeadura: “estria superficial (risco)”. Utilizar um inóculo pequeno.

5. Técnica de preparo:Meio encontrado comercialmente desidratado. Portanto, para o preparo do meio seguir as instruções do fabricante.

6. Leitura e Interpretação:- Positivo: crescimento bacteriano com ou sem alteração da cor do meio para azul.- Negativo: ausência de crescimento bacteriano. Não ocorre alteração da cor do meio.

MOTILIDADE (agar semi-sólido pH 7,2)

1. Finalidade:Determinar se um microrganismo é móvel ou imóvel., ou seja se tem ou não flagelo.

2. Técnica de preparo:A prova da motilidade pode ser realizada utilizando-se um meio específico para esta prova. Entretanto, nos laboratórios de rotina de microbiologia clínica, geralmente, empregam-se meios que fornecem leitura de outras provas bioquímicas além do indol, como por exemplo o MIO (motilidade, indol e ornitina). Os meios são encontrados comercialmente desidratados. Portanto, para o preparo seguir as instruções do fabricante.

4. Técnica de semeadura: “por picada profunda”.

5. Leitura e Interpretação:

- Positivo: o microrganismo móvel se difunde ao redor da linha da picada, apresentando o aspecto de uma nuvem difusa.- Negativo: o microrganismo imóvel cresce apenas ao longo da linha de semedura.

LISINA DESCARBOXILASE

1. Finalidade:Determinar a habilidade enzimática de um determinado microrganismo em descarboxilar o aminoácido lisina com a conseqüente alcalinização do meio de cultivo pela formação da amina correspondente.

2. Mecanismo:A descarboxilação é um processo no qual as bactérias que possuem enzimas “descarboxilases” específicas, são capazes de atuar nos grupos carboxila-terminal (-COOH) dos aminoácidos produzindo uma amina ou diamina e dióxido de carbono. As enzimas descaboxilases são numerosas, porém específicas para um determinado substrato (aminoácido). Estas enzimas são adaptativas porque são formadas pelos microrganismos somente quando estes são cultivados em ambiente ácido, na presença do substrato específico. Os produtos de descarboxilação por sua vez, determinam uma alcalinidade no pH do meio de cultura. A descarboxilação é restrita àqueles aminoácidos que possuem pelo menos um grupo quimicamente ativo além da amina (-NH2) ou do grupo carboxílico (-COOH) e a quebra do aminoácido ocorre anaerobicamente. A descarboxilação é um processo irreversível não oxidativo e requer uma coenzima comum. o piridoxal fosfato. O aminoácido lisina, sob a ação da lisina descarboxilase forma uma diamina (cadaverina) e dióxido de carbono.

NH2-CH2-(CH2)3-CH-NH2-COOH(L-lisina)

lisina descarboxilase - CO2

NH2-CH2-(CH2)3-CH2-NH2 + CO2

(cadaverina)

4. Técnica de semeadura: por “dispersão”.

5. Leitura e Interpretação:- Positivo: desenvolvimento de uma coloração púrpura.- Negativo: desenvolvimento de uma coloração amarela.

OBSERVAÇÃO

O princípio bioquímico da descarboxilação da ORNITINA E ARGININA é semelhante ao descrito acima, mudando na fórmula simplesmente o aminácido a ser descarboxilado como também a diamina formada pela ação do microrganismo no substrato (ornitina e arginina), originando a putrescina.

NH2-CH2-(CH2)3-CH-NH2-COOH(L-ornitina)

ornitina descarboxilase +

CO2

NH2-CH2-(CH2)3-CH2-NH2 + CO2

(putrescina)

NH=CNH2-NH-(CH2)3-CH-NH2-COOH(L-arginina)

arginina descarboxilase + CO2

NH2-CH2-(CH2)3-CH2-NH2 + CO2

(putrescina)

FERMENTAÇÃO DE CARBOIDRATOS

1. Finalidade:Determinar a habilidade de um microrganismo em fermentar um carbohidrato específico incorporado num meio basal com a produção de ácido ou ácido e gás.

Obs. Uma única base pode ser empregada para a observação da capacidade do microrganismo de fermentar diferentes açúcares. O carbohidrato deverá ser incorporado ao meio base na hora do uso. Nos laboratórios de rotina de microbiologia clínica são utilizados meios que fornecem leitura de outras provas bioquímicas além da fermentação de açúcares (glicose, lactose, sacarose), como por exemplo o TSI, Rugai, KIA, etc...

2. Mecanismo:A fermentação é um processo metabólico anaeróbico de óxido-redução no qual um substrato orgânico serve como aceptor final de hidrogênio. Na fermentação de substratos orgânicos como os carbohidratos ocorre a formação de produtos oxidados e reduzidos, que dependem de alguns fatores tais como:(1) o tipo de microrganismo(2) a natureza do substrato a ser fermentado(3) as condições ambientais de cultivo com temperatura, acidez, etc...

Os produtos de fermentação dos carbohidratos e álcoois, genericamente denominados de “açúcares”, são poucos: dois gases (H2 e CO2), poucos ácidos e álcoois e uma cetona.

4. Técnica de semeadura: por “dispersão”.

5. Leitura e Interpretação:- Fermentação do açúcar: meio ácido - coloração amarela.- Não fermentação do açúcar: meio alcalino - coloração vermelha.

FENILALANINA DESAMINASE

1. Finalidade:Determinar a habilidade de um microrganismo em desaminar a fenilalanina com a conseqüente modificação de meio de cultivo pela formação de ácido fenilpirúvico.

2. Mecanismo: O aminoácido aromático fenilalanina sofre desaminação oxidativa, catalizada por uma flavoproteína, para produzir o ácido fenilpirúvico. A desaminação oxidativa resulta na liberação de um grupo amina (NH2) do aminoácido para formar um alfa cetoácido de ligação dupla e amônia (NH3). Este processo ocorre em duas etapas: inicialmente o hidrogênio é retirado do aminoácido formando um iminoácido. Este hidrogênio livre se combina com o oxigênio para formar água e consequentemente o iminoácido é hidrolizado em um cetoácido. A fenilalanina é desaminada em ácido fenilpirúvico e este durante a incubação é reduzido a ácido fenilacético. O ácido fenilacético pode ser convertido em fenilalanina, com isso, iniciando novamente o ciclo. Uma pequena quantidade de ácido fenilpirúvico é susceptível a ser descarboxilado a ácido fenil acético, o qual também pode se reconvertido em fenilalanina. A evidenciação da desaminação da fenilalanina no meio de cultivo é revelada pela adição do reativo cloreto férrico, ocorrendo a seguinte reação química: o cloreto férrico é um agente oxidante e os íons férrico (Fe+++) em solução ácida com hidrazina formará como produto final nitrogênio e amoníaco. O cloreto férrico atua como agente quelante fazendo com que o ácido fenilpirúvico desenvolva uma coloração verde.

3. Técnica de semeadura: estria superficial

4. Leitura e interpretação:Após 18 24 horas de incubação adicionar 4 a 5 gotas da solução de cloreto férrico diretamente no tubo inoculado. - Positivo: desenvolvimento de uma coloração verde escura.

- Negativo: sem desenvolvimento de cor.

PROVA DA OXIDASE

1. Finalidade:Determinar a presença da enzima oxidase (citocromo oxidase).

2. Mecanismo:Os citocromos são hemeproteínas que atuam com aceptores intermediários de elétrons no processo de respiração aeróbia, envolvendo no estágio final desta cadeia a participação da enzima oxidase (citocromo oxidase). O sistema citocromo ocorre em organismos aeróbios ou anaeróbios facultativos, podendo estar associado nestes casos à enzima oxidase. A prova da oxidase é empregada para investigar aqueles microrganismos que apresentam ou não esta enzima ou que são anaeróbios obrigatórios. O teste utiliza certos reagentes (corantes) tais como o dicloridrato de tetrametil-fenilenodiamino, que substituindo o oxigênio atua como

aceptor artificial de elétrons. O corante no estado reduzido é incolor, contudo na presença da citocromo oxidase e do oxigênio atmosférico é oxidado tomando uma coloração escura.

3. Execução do teste:Atritar em um pedaço de papel de filtro uma porção da colônia bacteriana a ser testada. Adicionar uma gota do reativo sobre o inóculo.

4. Leitura e Interpretação:- Positivo: desenvolvimento de uma coloração púrpura imediatamente após a adição de reativo- Negativo: sem o desenvolvimento de cor.

OBS: Existem no mercado brasileiro fitas ou discos impregnados com o reativo.

PROVA DO KCN

1. Finalidade:Determinar a capacidade de um microrganismo em reproduzir-se em um meio que contenha cianeto de potássio.

2. Mecanismo:A respiração aeróbia é um processo de óxido-redução que produz energia. A maioria dos organismo aeróbicos possuem a enzima citocromo-oxidase que as tornam capazes de utilizar o oxigênio como aceptor de hidrogênio. O Cianeto é um inibidor não competitivo do sistema citocromo-oxidase. No entanto, alguns microrganismos aeróbicos não são sensíveis ao cianeto. Esta resistência se deve provavelmente, a um sistema de respiração flavoproteica.

3. Técnica de semeadura:Semear por dispersão inóculo pouco denso.

4. Leitura e interpretação:Após 24 - 48 horas de incubação a 35º C, alguns podem precisar até 4 dias de incubação, observar a presença ou ausência de crescimento bacteriano.- Positivo Crescimento (meio turvo)- Negativo Ausência de crescimento (meio inalterado).

OBS: O cianeto é extremamente tóxico e deve ser destruído pela adição de sulfato ferroso e 0,1 ml de KOH a 40 % para inativação do cianeto. Após autoclavar os tubos.

AULA PRÁTICA: 9

VISUALIZAÇÃO DE FUNGOS

INTRODUÇÃO

Os fungos possuem dois tipos morfológicos: as leveduras, que são inicelulares, e os bolores ou fungos filamentosos, que são multicelulares.

Os fungos filamentosos possuem como elemento constituinte a hifa; o conjunto de hifas é denominado como micélio.

Quanto à função, o micélio classifica-se em vegetativo e reprodutor.Para se observar a morfologia microcópica dos bolores, deve-se analisar os micélios

vegetativo e reprodutor.No micélio vegetativo, deve-se analisar a hifa, varificando-se o seu diâmetro, a

presença ou ausência de septos e pigmento. Deve-se também observar a existência de estruturas diferenciadas na hifa, como por exemplo: rizóides (estruturas semelhantes à raiz), gavinhas ( hifas enroladas), esporos formados por mutiplicação vegetativa ( clamidoconídio e artroconídio).

No micélio reprodutor, deve-se analisar se os esporos são endógenos formados em esporangióforos, ou se são exógenos (conídios) formados em conidióforo. Deve-se ainda analisar a forma, tamanho, e cor desses esporos.

Com relação às leveduras, deve-se observar as características da célula vegetativa, verificando a forma, o tamanho (2-5 a 15-50 m), presença ou ausência de cápsula e pseudo hifas. E, também, as características de reprodução vagetativa: formação, brotamento (blastoconídio), clamidoconídio e artroconídio.

MÉTODO

Observar a morfologia microscópica de bolores e laveduras coradas com lacrofenol azul-algodão, tintura da china (cápsula), ou sem coloração ( prova de filamentação). As lâminas preparadas são realizadas com esfregaços fixados (coloração de Gram) montagem úmida, semelhante a um exame a fresco ou com cultivo em lâmina.

RUSULTADO E INTERPRETAÇÃO

Esquematizar a estrutura e morfologia dos fungos

Lâmina 1 - Lâmina 2

OBS: Apesar dos fungos serem todos Gam-positivos, esta coloração não é utilizada para bolores, pois a montagem através de esfregaços fixados destruiria a estrutura de continuidade que existe entre o micélio vegetativo e o reprodutor e também impediria, pela cor da violeta-genciana, a visualização dos septos.

A coloração de Gram para visualizar a morfologia das leveduras pode ser utilizada, pois esta é um fungo unicelular, e quando há necessidade de visualizar outras estruturas utilizam-se os métodos como a coloração com tintura-da-china para cápsula e a prova da filamentação, que é um cultivo em lâmina para visualizar a pseudo-hifa e os esporos formados por multiplicação vegetativa .

OBJETIVOS:

- visualizar estruturas vegetativas de fungos filamentosos.- visualizar estruturas de reprodução dos fungos filamentosos.- visualizar a formadas leveduras.- visualizar os esporos formados por multiplicação vegetativa das leveduras e

bolores.- visualizar cápsulas das leveduras.- Citar algumas colorações utilizadas para exame microscópico de fungos.

AULA PRÁTICA : 10

CONTROLE DA MICROBIOTA DAS MÃOS

INTRODUÇÃO:

As mãos constituem um dos elos mais importantes na cadeia da infecção cruzada. A quantidade de microrganismos constituintes da microbiota normal da pele do cirurgião deve ser reduzida, assim como possíveis microrganismos patogênicos presentes devem ser eliminados.

OBJETIVOS

- verificar o grande número de microrganismos que existe na pele.- Observar a eficácia da lavagem das mãos e do uso de um antisséptico na redução

dos microrganismos da pele.

MATERIAL NECESSÁRIO:

- Uma placa de agar sangue;- Alça de platina;- Três swabs esterilizados; - Um tubo contendo 10 ml de solução salina esterilizada;- Frasco contendo detergente;- Frasco contendo álcool 70%

PROCEDIMENTO

- Dividir o fundo da placa de Petri contendo ágar-sangue em três partes. Identificar a placa.

- Retirar um swabs do tubo, com assepsia, umidecê-lo em salina estéril e esfregar sobre a pele da palma da mão. A seguir semear 1/3 da placa de ágar-sangue com swabs, identificando “mãos sem lavar”.

- Lavar as mãos com detergente (sabão),vigorosamente, em todas as superfícies, durante 5 min. (deve-se utilizar escovas). A seguir pegar outro swabs esterilizado, umidecer em salina esterilizada e esfregar na pele das mãos lavadas. A seguir semear o segundo 1/3 da placa. Identificar: mãos lavadas.

- Desinfetar as mãos pré-lavadas ( 5 min. Com sabão) com álcool 70% (durante1 min.). A seguir utilizando-se outro swabs estéril, umidecido em salina também esterilizada, esfregar nas palmas das mãos lavadas e desinfetadas e semear na terceira parte do meio de cultura. Identificar: mãos desinfetadas.

- Seguir o esquema da figura 1

FIGURA 1

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--

SEGUNDA FASE :

MATERIAL NECESSÁRIO

- Placa de ágar-sangue;- Lâminas de microscopia;- Bateria de coloração de Gram;- Alça de platina- Microscópio.

INTERPRETAÇÃO

"SWAB"

Salina estéril

Mãos sem lavar (I)

Mãos lavadas 5'com sabão (II)

Mãos lavadas + álcool 70% (III)

- Observar o crescimento de colônias nas três partes da placa. - Fazer esfregaço de 3 a 4 colônias diferentes, corar pelo Gram e observar em

imersão.

LAVAGEM DAS MÃOS

- Remover todas as jóias e adornos;- Molhar completamente as mãos e antebraços, ensaboando-os em seguida, com

sabão líquido;- Escovar, em toda sua extenção mãos, unhas e antebraços, com uma escova

adequada acionada em movimentos rotatórios durante 3 minutos; escovar tanto a face palmar como dorsal de cada mão, bem como todas as quatro superfícies de cada um dos dedos, nas áreas interdigitais, os pulsos e e antebraços;

- Lavar profundamente em água;- Repetir o ensaboamento e a lavagem por mais duas vezes, sem usar escova;- Enxugar com toalha de papel branca, primeiro as mãos e depois os antebraçosCom as mãos lavadas e enxutas, não tocar em mais nada que não seja esterilizado.

Calçar luvas estéreis. OBS: sempre que houver suspeita de contaminação das luvas durante o atendimento, lavar as mãos calçadas com álcool iodado a 2%.

RESULTADOS

Relatar os resultados obtidos .

1º terço da placa :

2º terço da placa :

3º terço da placa :

Resultado da coloração de Gram

Justificar estes achados

AULA PRÁTICA : 11

IDENTIFICAÇÃO DE COCOS GRAM POSITIVOS

PROVA DA CATALASE

Teste rápido em lâmina a temperatura ambiente

PRINCÍPIO:Verificar a presença da enzima catalase.

BIOQUÍMICA ENVOLVIDA: A enzima catalase está presente na grande maioria das bactérias aeróbias ou anaeróbias facultativas, que contém o complexo citocromo. Usualmente, os microrganismos que não contém citocromos também não possuem catalase . Grande parte das bactérias anaeróbias possuem peroxidases em vez de catalase. Na decomposição da molécula de água oxigenada “in vitro”, uma molécula atua como substrato reduzido e a outra como um doador. O substrato reduzido pelos átomos de hidrogênio cedidos pelo doador dá como resultado um substrato reduzido (H20) e um doador oxidado (gás).

H2O2 + H2O2 2 H2O2 + O2

REATIVO EMPREGADO:Peróxido de hidrogênio 30% (Superoxol)Conservar em congelador a 4ºC.

TÉCNICA:Com a alça ou agulha de semeadura bacteriológica depositar uma porção de um cultivo bacteriano puro no centro de uma lâmina limpa e desengordurada. Adicionar uma gota de água oxigenada a 30%. “Não inverter a ordem e não agitar”.

LEITURA:POSITIVO : Formação imediata de bolhas de gás.NEGATIVO : Ausência de bolhas de gás.

NOTA: Não utilizar cultivos provenientes de agar sangue

CRESCIMENTO EM CHAPMAN (7,5% DE NaCl)

PRINCIPIO:Verificar se a bactéria é capaz de crescer em meio contendo alta concentração de NaCl (7,5 %).O gênero Staphylococcus cresce neste meio, enquanto os gêneros Micrococcus, Planococcus e Stomatococcus não o fazem.

TÉCNICA DE SEMEADURA:Fazer semeadura por estrias superficiais com auxiílio de uma agulha de semeadura bacteriológica. Incubar 35ºC por 24 horas.

LEITURA:POSITIVO: Presença de crescimento.NEGATIVO: Ausência de crescimento.

DNase

PRINCÍPIO:Determinar a atividade de um microrganismo em produzir a enzima desoxirribonuclease.

TÉCNICA DE SEMEADURA:Semear fazendo um “risco” com auxilio de uma agulha de semeadura bacteriológica o meio contida em placa. Iincubar a 35ºC por 24 horas.

BIOQUÍMICA ENVOLVIDA:Com a produção da enzima Dnase pelo microrganismo, esta é difundida no meio de cultivo, e agindo sobre o DNA quebrará sua dupla hélice. Ao se fazer a revelação com HCl 1N ocorrerá precipitação do DNA íntegro, tornando desta forma o meio com aparencia turva. Onde não houve precipitação do DNA, por não estar íntegro, ruptura esta causada pela ação da enzima DNase, não ocorrerá turvação do meio de cultura,aparecendo desta forma um halo transparente ao redor da semeadura do microrganismo produtor da enzima.

LEITURA:Cobrir toda a superfície do meio de cultura na placa com äcido clorídrico 1N. Aguardar alguns minutos para fazer a leitura.

POSITIVO: aparecimento de um halo transparente ao redor da semeadura.

COAGULASE

PRINCÍPIO:Determinar a capacidade de um microrganismo em coagular o plasma pela ação da enzima coagulase.

REATIVOS:Recomenda-se, de preferência, utilizar plasma humano ou de coelho, podendo ser substituido por plasma de cavalo, carneiro ou bovino.Coletar assépticamente o sangue em um recipiente previamente esterilizado, contendo uma quantidade estabelecida de anticoagulante. Deixar as hemácias sedimentarem ou centifugar a 1500 - 2000 rpm durante 10 minutos.Assépticamente retirar o plasma e colocar em recipiente esterilizado.

TÉCNICA DE SEMEADURA:Colocar em um tubo de ensaio (13 x 100 mm) esterilizado, 0,5 ml de plasma humano ou de coelho não diluído. Adicionar 0,5 ml de um cultivo em caldo simples (cultura pura) de 18 - 24 horas juntamente com o plasma. Girar o tubo suavemente para homogeinizar a suspensão de microrganismos (Não agitar). Incubar a 37ºC em Banho Maria por 4 horas. Observar a cada 30 minutos se há formação de coágulo. Se após 4 horas não houver coágulo visível, incubar em estufa a 37ºC por 18 - 24 horas.

CoagulasePlasma coágulo de fibrina

bacteriana

Alguns autores sugerem que a coagulase é uma substância semelhante a protrombina que reage com os fatores plasmáticos normais para formar uma substância semelhante a trombina que por sua vez ativa o fibrinogênio para formar a fibrina.

LEITURA:POSITIVO: Forma um coágulo ou filamentos de fibrina definidos.

-Completa: o coágulo abrange todo o tubo.-Parcial: o coágulo não se estende por todo o meio.Qualquer grau de coagulação se considera positivo.

NEGATIVO: Não há formação de coágulo. A suspensão se mantém homogênea.

MANITOL AERÓBIO E ANAERÓBIO

PRINCÍPIO: Determinar a habilidade de um microrganismo em degradar o manitol

TÉCNICA DE SEMEADURA:Semear por picada profunda com auxílio de uma agulha de semeadura bacteriológica dois tubos contendo o meio. Após adicionar de 10 - 15 gotas de vaselina líquida estéril em um dos tubos. Incubar a 35ºC, por 48 - 72 horas.

LEITURA:POSITIVO: Desenvolvimento de cor amarela no meio de cultivo.NEGATIVO:Não auteração da cor do meio.

MALTOSE

PRINCÍPIO:Determinar a habilidade de um microrganismo em utilizar a maltose.

TÉCNICA DE SEMEADURA:Semear por estrias superficiais com auxílio de uma alça bacteriológica.Incubar a 35ºC por 24 -72 horas.

LEITURA:POSITIVO: Desenvolvimento de halo de coloração amarela ao redor do crescimento bacteriano.VARIÁVEL: Não visualização de halo de coloração amarela na parte supeerior do,agar mas ocorre o aparecimento de halo amarelo na parte inferior do agar.NEGATIVO: Sem desenvolvimento de halo de coloração amarela ao redor do crescimento bacteriano

(Catalase +)

|Chapman

||

| |(+) (-)

Staphylococcus sp Micrococcus sp | Planococcus sp | Stomatococcus sp DNase Coagulase || |

(+) (-)| | S. aureus S intermedius S. hycus Estafilococos coagulase negativoManitol aeróbio (+) (+) (-) Manitol anaeróbio (+) (-) (-) Maltose (+) (+)/(-) (-)