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Universidade Federal do Rio Grande do Norte

Centro de Ciências da Saúde

Programa de Pós-Graduação em Desenvolvimento e Inovação Tecnológica em

Medicamentos

MARCELO VÍTOR DE PAIVA AMORIM

APLICAÇÃO DO INFRAVERMELHO PRÓXIMO ALIADA À CALIBRAÇÃO

MULTIVARIADA PARA CONSTRUÇÃO DA TECNOLOGIA ANALÍTICA EM

PROCESSO NA PRODUÇÃO DA OLANZAPINA COMPRIMIDOS

REVESTIDOS

NATAL – RN

2018

MARCELO VÍTOR DE PAIVA AMORIM

APLICAÇÃO DO INFRAVERMELHO PRÓXIMO ALIADA À CALIBRAÇÃO

MULTIVARIADA PARA CONSTRUÇÃO DA TECNOLOGIA ANALÍTICA EM

PROCESSO NA PRODUÇÃO DA OLANZAPINA COMPRIMIDOS REVESTIDOS

Tese de Doutorado apresentada ao Programa

de Pós-Graduação em Desenvolvimento e

Inovação Tecnológica em Medicamentos da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte

(PPgDITM/UFRN), como requisito para a

obtenção do título de Doutor em

Desenvolvimento e Inovação Tecnológica em

Medicamentos

ORIENTADOR: PROF. DR. CICERO FLÁVIO SOARES ARAGÃO (UFRN)

CO-ORIENTADOR: PROF. DR. KÁSSIO MICHEL GOMES DE LIMA (UFRN)

NATAL – RN

2018

AGRADECIMENTOS

Especialmente à Deus, por ter me concedido a graça da vida e a oportunidade de

concretizar mais um objetivo em minha vida.

Aos professores do Programa de Pós-graduação em Desenvolvimento e Inovação

Tecnológica em Medicamentos, de fundamental importância para minha formação,

especialmente ao meu orientador Prof. Dr. Cícero Flávio Soares Aragão e ao meu co-

orientador Prof. Dr. Kássio Michell Gomes de Lima, por toda orientação, apoio e

ensinamentos fundamentais. Vocês contribuíram intensamente para a formação do meu

conhecimento. Muito obrigado!

À Fernanda Saadna pela imensa ajuda e colaboração para a realização desse

trabalho. Você foi extremamente essencial. Meu muito obrigado!

Aos colegas do laboratório de Controle de Qualidade do NUPLAM, Ana Angélica,

Josinalva, Rafael, Rosimeire, Bruno, Raiza, Brunna, Lena, Paula Francinete, Paula Jussara,

Marcos, Isabel pela amizade, ajuda e apoio durante a realização deste trabalho.

Aos colegas de trabalho do NUPLAM, que me apoiaram e me deram palavras de

incentivo. Em especial ao Prof. Carlos Lima, Profa. Lourena Mafra Veríssimo e Andreza

Azevedo pela amizade, incentivo, força e motivação, além de ter cedido às instalações do

laboratório e o apoio para a realização deste trabalho.

Gostaria de agradecer em especial aos meus colegas de laboratório do LCQMed,

Profa. Dra. Ana Paula, Prof. Dr. Fernando Henrique, Prof. Dr. Lilian Solon, Thereza,

Dayanne e Regina pelo apoio, amizade e troca de experiências.

Aos meus amigos Bruno Gazola, Juliana Fernandes, Leonardo de Quadros, Rafaela

Santos, Fabrícia Lima, Jessica Fonseca, Bruno Rafael, Waldemar Alves e Cintia Glasner

pelo amor, apoio, companheirismo, amizade e todas as experiências que ajudaram a

construir esse caminho.

À minha querida família, pessoas maravilhosas que me acompanharam sempre e me

apoiaram. Em especial aos meus pais João Batista e Juliene, meu alicerce e minha vida, e

aos meus irmãos Janaina e Leonardo, que sempre me apoiaram durante toda a minha

caminhada. Obrigado por todo carinho e amor, pelo incentivo para não desistir e seguir

sempre em frente. O otimismo de vocês me deu forças e me motivou a continuar sempre!

Obrigado, amo vocês.

E a todos aqui não citados, que de alguma forma contribuíram com uma parcela

especial para a realização deste trabalho.

PREFÁCIO

Esta tese de doutorado aborda a utilização da técnica do infravermelho próximo

combinado com métodos de calibração multivariada na construção da Tecnologia Analítica

em Processo da produção de Olanzapina comprimidos revestidos. Na introdução são

apresentados os conceitos e justificativas do presente trabalho, logo em seguida, na

fundamentação teórica, estão apresentadas as teorias, as quais constituíram o

embasamento deste estudo, desde os aspectos teóricos sobre o fármaco, métodos

cromatográficos voltados à avaliação da qualidade, processos analíticos tecnológicos e a

aplicação da calibração multivariada em conjunto com o infravermelho próximo. Logo após,

são apresentados os objetivos do presente estudo. A metodologia, juntamente com os

resultados e discussão, apresentam-se divididos em 3 capítulos, de acordo com a

descrição a seguir: O primeiro apresenta a construção do modelo de calibração

multivariado, obtida pela análise dos espectros de infravermelho próximo em formas

farmacêuticas contendo Olanzapina e os excipientes. No segundo foram construídas as

cartas de controle multivariadas para monitoramento da Olanzapina comprimidos revestidos,

como forma de aprimorar o controle em processo – etapa prévia para a construção da

Tecnologia Analítica em Processo. Já no terceiro são apresentados os resultados obtidos a

partir da calibração multivariada, aliada ao infravermelho próximo, para a análise do

conteúdo de água nos comprimidos de Olanzapina revestidos, em comparação ao método

de referência - Karl Fischer. Por fim, são apresentadas as conclusões, as referências, com

toda a bibliografia utilizada neste trabalho, bem como os anexos.

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS

LISTA DE TABELAS

LISTA DE EQUAÇÕES

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

RESUMO

ABSTRACT

1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 19

2. FUNDAMENTOS TEÓRICOS ......................................................................................... 21

2.1. Tecnologia de Processos Analíticos - PAT ............................................................... 21

2.2. Infravermelho próximo (NIR) .................................................................................... 26

2.5. Olanzapina ............................................................................................................... 46

2.5.3. Mecanismo de ação ........................................................................................... 49

2.5.4. Farmacocinética ................................................................................................ 50

2.6. Métodos de Cromatografia Líquida ........................................................................... 51

3. OBJETIVOS .................................................................................................................... 52

3.1 OBJETIVO GERAL .................................................................................................... 52

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................................... 52

Capítulo 1 – DETERMINAÇÃO DO TEOR DE OLANZAPINA EM FORMAS

FARMACÊUTICAS ATRAVÉS DA TÉCNICA DO INFRAVERMELHO PRÓXIMO E

CALIBRAÇÃO MULTIVARIADA ......................................................................................... 55

1. INTRODUÇÃO.............................................................................................................. 55

2. OBJETIVOS ................................................................................................................. 63

3. MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................................ 63

3.1. Materiais .................................................................................................................... 63

3.1.1. Matéria-prima, solventes e outros materiais ........................................................ 63

3.1.2. Equipamentos e materiais de laboratório ............................................................ 64

3.2. Métodos ................................................................................................................... 65

3.2.1. Preparo das amostras e delineamento experimental .......................................... 65

3.2.2. Espectroscopia no Infravermelho Próximo .......................................................... 66

3.2.3. Análise Cromatográfica ....................................................................................... 67

3.2.4. Procedimentos quimiométricos e Software ........................................................ 67

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................... 71

5. CONCLUSÃO DO CAPÍTULO 1 ................................................................................... 77

Capítulo 2 – CONSTRUÇÃO DE CARTAS CONTROLES PARA MONITORAMENTO DA

QUALIDADE DE OLANZAPINA COMPRIMIDOS REVESTIDOS UTILIZANDO COMO

FERRAMENTA ANALÍTICA A ESPECTROSCOPIA NO INFRAVERMELHO PRÓXIMO:

PRIMEIRA ETAPA PARA CONSTRUÇÃO DA TECNOLOGIA ANALÍTICA EM PROCESSO79

1. INTRODUÇÃO.............................................................................................................. 79

2. OBJETIVOS ................................................................................................................. 83

3. MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................................ 83

3.1. Materiais .................................................................................................................... 83

3.1.1. Matéria-prima, solventes e outros materiais ........................................................ 83

3.1.2. Equipamentos e materiais de laboratório ............................................................ 84

3.2. Métodos .................................................................................................................... 85

3.2.1. Preparo das amostras e delineamento experimental .......................................... 85

3.2.2. Espectroscopia no Infravermelho Próximo .......................................................... 87

3.2.3. Análise Cromatográfica ....................................................................................... 87

3.3. Cartas de Controle multivariadas .............................................................................. 87

3.3.1. Sinal Analítico Líquido (NAS) ............................................................................. 87

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................... 91

5. CONCLUSÃO DO CAPÍTULO 2 ................................................................................... 98

Capítulo 3 – DETERMINAÇÃO DO CONTEÚDO DE ÁGUA EM GRANULADOS DE

OLANZAPINA PARA PRODUÇÃO DE COMPRIMIDOS REVESTIDOS .......................... 101

1. INTRODUÇÃO............................................................................................................ 101

2. OBJETIVOS ............................................................................................................... 103

3. MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................................. 104

3.1. Materiais .................................................................................................................. 104

3.1.1. Matéria-prima, solventes e outros materiais ...................................................... 104

3.1.2. Equipamentos e materiais de laboratório .......................................................... 104

3.2. Métodos .................................................................................................................. 104

3.2.1. Preparo das amostras e delineamento experimental ........................................ 104

3.2.2. Espectroscopia no Infravermelho Próximo ........................................................ 105

3.2.3. Análise do conteúdo de água por Karl Fischer .................................................. 105

3.2.4. Construção do modelo de calibração multivariado ............................................ 106

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................. 107

4.1. Relação entre os dados de NIR e KF ...................................................................... 107

5. CONCLUSÃO DO CAPÍTULO 3 ................................................................................. 114

CONCLUSÕES ................................................................................................................. 115

REFERÊNCIAS ................................................................................................................. 118

ANEXOS

Anexo 01 – Artigo publicado

Anexo 02 – Artigo submetido

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Aplicação da PAT com o NIR na indústria alimentícia ........................................... 23

Figura 2. Aplicação da PAT com o NIR na tampa do misturador BIN - Teste de

homogeneidade. .................................................................................................................. 23

Figura 3. Técnicas analíticas empregadas em processos farmacêuticos – PAT. ................. 25

Figura 4. Espectro eletromagnético. NIR (~780 a 2500nm) ................................................. 26

Figura 5. Fluxograma para escolha do método de calibração multivariado .......................... 36

Figura 6. Decomposição da matriz X nas matrizes de escores (T), pesos (P) e resíduos (E).

............................................................................................................................................ 37

Figura 7. Representação geométrica do PLS com uma variável latente modelando os dados

de X (variáveis independentes) e Y (variáveis dependentes). Os dados X formados por três

variáveis e dados de Y por duas variáveis. .......................................................................... 38

Figura 8. Representação da divisão do espectro (r) em quatro diferentes partes: r┴

(NAS+resíduos), NAS (rk*), resíduos (rres) e interferentes (rint) ............................................. 41

Figura 9. Estrutura molecular da Olanzapina ....................................................................... 47

Figura 10. Estrutura molecular da [5-metil-2-((2-nitrofenill)amino)-3-tiofenocarbonitrila

Olanzapina Composto Relacionado A ................................................................................. 47

Figura 11. Estrutura molecular da [2-metil-10H-tieno-[2,3-b][1,5] benzodiazepina-4[5H]-one]

Olanzapina Composto Relacionado B ................................................................................. 48

Figura 12. Estrutura molecular da [(2-metil-4-(4-metilpiperazina-1-il)-10H-benzo[b]tieno[2,3-

e][1,4]diazepina 4’-N-oxido] ................................................................................................. 48

Figura 13. Comparação entre espectros NIR sem tratamento (esquerda) e após Suavização

Savitzky-Golay (direita) ........................................................................................................ 58

Figura 14. Comparação entre espectros NIR sem tratamento (esquerda) e após MSC

(direita) ................................................................................................................................ 59

Figura 15. Comparação entre espectros NIR sem tratamento (esquerda) e após Derivada de

primeira ordem Savitzky-Golay (direita) ............................................................................... 60

Figura 16. Comparação entre espectros NIR sem tratamento (esquerda) e após STD

(direita) ................................................................................................................................ 61

Figura 17. Comparação entre espectros NIR sem tratamento (esquerda) e após SNV

(direita) ................................................................................................................................ 62

Figura 18. Esquema da preparação das amostras comerciais e laboratoriais. ..................... 65

Figura 19. Delineamento experimental para medidas de calibração por NIR de acordo com o

desenho D-Optimal. (a) Olanzapina - Crospovidona - Dióxido de Silício Coildal; (b)

Olanzapina - Poloxamer - Lactose; (c) Olanzapina - Mistura de revestimento - Estearato de

magnésio; (d) Olanzapina – Celulose microcristalina – Lactose; (e) Olanzapina –

Crospovidona – Poloxamer; (f) Olanzapina – Estearato de magnésio – Dióxido de Silício

Coloidal................................................................................................................................ 66

Figura 20. Esquema de construção do modelo de calibração multivariado e análise dos

dados ................................................................................................................................... 71

Figura 21. Comparação dos espectros NIR puros das 27 amostras laboratoriais e 18

amostras comerciais (figura esquerda), com os espectros tratados com suavização SGS

(janela de 7 pontos), MSC e Derivada de primeira ordem Savitsky-Golay (janela de 7 pontos)

(figura direita)....................................................................................................................... 72

Figura 22. Espectros NIR das 27 amostras laboratoriais e 18 comerciais (linhas pretas) e

matéria-prima Olanzapina (linha vermelha) após o pré-tratamento (Suavização, MSC e

Derivada de primeira ordem). .............................................................................................. 72

Figura 23. Relação entre concentração prevista e a de referência para amostras de

calibração e validação, através do modelo de PLS para Olanzapina. (●) grupo de calibração;

(●) grupo de validação. ........................................................................................................ 74

Figura 24. Teste EJCR para o intercepto e a inclinação da regressão da concentração de

Olanzapina prevista versus a de referência utilizando uma validação externa pelo modelo

PLS. ..................................................................................................................................... 75

Figura 25. Representação geométrica da decomposição do sinal analítico. ........................ 81

Figura 26. Representação gráfica de processos sob controle e fora de controle. ................ 82

Figura 27. Esquema da preparação das amostras comerciais e laboratoriais “dentro do

controle”. .............................................................................................................................. 85

Figura 28. Esquema da preparação das amostras comerciais e laboratoriais “fora do

controle”. .............................................................................................................................. 86

Figura 29. Esquema da construção das cartas de controle NAS, Interferentes e resíduos .. 90

Figura 30. Espectros puros de NIR de todas as amostras, n=106. ...................................... 91

Figura 31. Espectros de NIR pré-tratados da Olanzapina (azul), placebo (verde), amostras

laboratoriais (vermelho), amostras de produção (azul claro). ............................................... 92

Figura 32. Espectros pré-tratados de NIR de todas as amostras, n = 106. .......................... 93

Figura 33. Carta controle para Olanzapina - NAS, Interferentes e Resíduos. (●) amostras do

grupo de calibração, (*) previsão e (▼) validação. ............................................................... 94

Figura 34. Cromatograma da solução de Olanzapina da amostra da produção "fora de

controle". ............................................................................................................................. 95

Figura 35. Cromatograma da solução do placebo da Olanzapina. ....................................... 96

Figura 36. Carta controle por PCA – 1 PC. .......................................................................... 97

Figura 37. Carta controle por T² Hotelling's. ......................................................................... 98

Figura 38. Espectros NIR puro das 120 amostras laboratoriais ......................................... 108

Figura 39. Espectros puros de NIR das amostras após seleção das variáveis. ................. 108

Figura 40. Espectros NIR de todas as amostras após o pré-tratamento com a suavização

(SGS) e MSC. .................................................................................................................... 109

Figura 41. Relação entre conteúdo de água prevista (NIR) e a de referência (KF) para

amostras de calibração e previsão, através do modelo de PCR para Olanzapina. (●) grupo

de calibração; (●) grupo de validação. ............................................................................... 110

Figura 42. Teste EJCR para o intercepto e a inclinação da regressão do conteúdo de água

prevista versus a de referência utilizando uma validação externa pelo modelo PCR. ........ 111

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Vantagens e desvantagens da utilização do NIR ................................................. 29

Tabela 2. Avaliação dos pré-tratamentos testados por MLR, PCR e PLS. ........................... 73

Tabela 3. Comparação dos resultados de amostras comerciais por NIR e por HPLC. ......... 75

Tabela 4. Figura de Mérito (FOM) do melhor modelo PLS: Olanzapina em m/m. ................ 76

Tabela 5. Resumo das amostras utilizadas para a construção da carta de controle baseada

no NAS. ............................................................................................................................... 88

Tabela 6. Porcentagem dos produtos de degradação presentes nas amostras da produção

"fora de controle". ................................................................................................................ 96

Tabela 7. Comparação dos resultados do conteúdo de água de amostras laboratoriais e de

produção por NIR e por KF ................................................................................................ 112

Tabela 8. Figura de Mérito (FOM) do melhor modelo PLS: Conteúdo de água em % m/m. 113

LISTA DE EQUAÇÕES

Equação 1. Construção Carta NAS – Passo 1. .................................................................... 42









Equação 10. Construção Carta NAS – Passo 10. ................................................................ 45





Equação 15. Cálculo do tratamento Suavização Savitzky-Golay. ........................................ 57

Equação 16. Cálculo do tratamento de Espalhamento multiplicativo da luz – Passo 1. ....... 58



Equação 19. Cálculo do tratamento da Derivada. ................................................................ 60

Equação 20. Cálculo do tratamento de Variável Normal Padrão. ......................................... 61

Equação 21. Cálculo do RMSECV. ...................................................................................... 68

Equação 22. Cálculo da Sensibilidade. ................................................................................ 69

Equação 23. Cálculo da Seletividade. .................................................................................. 69

Equação 24. Cálculo da Sensibilidade Analítica. ................................................................. 69

Equação 25. Cálculo da Precisão. ....................................................................................... 69

Equação 26. Cálculo da Exatidão. ....................................................................................... 69

Equação 27. Cálculo do LD. ................................................................................................ 70

Equação 28. Cálculo do LQ. ................................................................................................ 70

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

ANN Rede Neural Artificial (Artificial Neural Net)

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária

API Insumo Farmacêutico Ativo (Active Pharmaceutical Ingredient)

CA-MRSA Staphylococcus aureus resistente à meticilina de origem comunitária

CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

CLAE-DAD Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplado ao Detector de

Arranjos de Diodo

CV Coeficiente de Variação

EJCR Elliptical Joint Confidence Region

EMEA Agência Europeia de Medicamentos

FDA Food and Drug Administration

FOM Figuras de Mérito (Figure of Merit)

FT-IR Infravermelho com Transformada de Fourier

HPLC High Performance Líquid Chromatography

ICH International Conference on Harmonization

KF Karl Fischer

LC-ESI-MS/MS Cromatografia Líquida acoplada ao espectrômetro de massas com

ionização por eletrospray

LD Limite de Detecção

LQ Limite de Quantificação

LS SVM Máquina de Vetor de Suporte por Mínimos Quadrados

MALDI-TOF MS Espectrometria de Massa com Ionização por Tempo de Voo

MCUSUM Somatório Cumulativo Multivariado

MEWMA Média Móvel Ponderada Exponencial

MSC Espalhamento Multiplicativa da Luz

MSI Espectrometria de Massas por Imagem

NAS Sinal Analítico Líquido

NIR Infravermelho Próximo

NIRS Espectrofotometria no Infravermelho Próximo

NOC Condição Operacional Normal

NUPLAM Núcleo de Pesquisa em Alimentos e Medicamentos

PAT Tecnologia Analítica em Processo

PCA Análise do Componente Principal

PCR Regressão pelo Componentes Principais

PLS Regressão por Mínimos Quadrados Parciais

PPS Perda por Secagem

PVDF Fluoreto de Polivinilideno

QINV Quimioterapia Induzida por Náusea e Vômito

rc Coeficiente de Correção da calibração

RMSEC Erro Quadrático Médio da Calibração

RMSECV Erro Quadrático Médio da Validação Cruzada

RMSEP Erro Quadrático Médio da Previsão

rp Coeficiente de Correlação da Previsão

SGS Suavização Savitzky-Golay

SNV Variável Normal Padrão

STD Escalonamento de Variáveis

UFRN Universidade Federal do Rio Grande do Norte

USP-NF United States Pharmacopoeia – National Formulary

%m/m Porcentagem massa massa.

RESUMO

A Olanzapina é um benzoadizepínico que provou ter eficácia contra os sintomas positivos e negativos da esquizofrenia, transtorno bipolar e outras psicoses. A indústria farmacêutica e laboratórios analíticos têm focado na qualidade, segurança e eficiência de seus produtos, para isso ferramentas de planejamento e monitoramento são inseridas na escala de produção. O conceito de Tecnologia de Processos Analíticos introduz abordagens inovadoras, como melhorias no controle do processo e na compreensão dos procedimentos realizados para aumentar a eficiência. O presente estudo teve como objetivo aplicar a técnica da espectroscopia no infravermelho próximo para a construção da Tecnologia Analítica em Processo na produção da Olanzapina comprimidos revestidos, uma vez que essa técnica tem ganhado amplo uso, por não necessitar de tratamento nas amostras, ausência da produção de resíduos e as análises são rápidas, quando comparada com as técnicas de referência, por exemplo: as cromatografias. Previamente à implantação da Tecnologia Analítica em Processo são necessárias etapas em bancada para avaliar se a técnica é sensível para o objetivo. Para isso foram desenvolvidos métodos alternativos para comparar com os de referência. No capítulo 1 foi realizado o doseamento do fármaco por cromatografia líquida de alta eficiência e por infravermelho próximo associado a técnicas de calibração multivariada (regressão parcial dos mínimos quadrados – PLS, após pré-tratamento dos espectros). Os resultados encontrados pelo método por infravermelho próximo foram comparados aos obtidos pela cromatografia e como resposta, o doseamento obtido por ambos não mostrou diferença estatisticamente significativa. Já no capitulo 2, a tese foi focada na construção de cartas controles multivariadas, baseadas no Sinal Analítico Líquido (NAS) para monitoramento do doseamento do fármaco em amostras laboratoriais e de produção utilizando a espectroscopia no infravermelho próximo. As cartas de controle (NAS, interferentes e resíduos) foram construídas e mostraram-se promissoras com elevado nível de reconhecimento (95 a 100%) das amostras que estavam realmente dentro ou fora do intervalo especificado. Por fim, no capítulo 3 a determinação do conteúdo de água por infravermelho próximo associado à calibração multivariada, PCR, de granulados da mistura de Olanzapina e excipientes em amostras laboratoriais e de produção foi analisada em comparado ao método de referência (Karl Fischer). Os resultados, quando o NIR e o Karl Fischer foram comparados, não apresentaram diferenças estatisticamente significantes, demonstrando que o NIR associado à calibração multivariada também funciona para a análise do conteúdo de água nos comprimidos de Olanzapina revestidos.Os resultados mostraram que a construção dos modelos de calibração multivariados, associados aos espectros obtidos do infravermelho próximo foram promissores, quando comparado aos dados obtidos pelos métodos de referência. Portanto, a ferramenta analítica alternativa (infravermelho próximo) poderá ser inserida em escala de produção para o monitoramento da qualidade do fármaco na matriz utilizada.

Palavras-chave: Olanzapina; NIR; CLAE; PAT; Carta Controle; Karl Fischer.

ABSTRACT

Olanzapine is a benzodiazepine which proved efficacy in the treatment of positive and negative symptoms of schizophrenia, bipolar disorder and others psychoses. The pharmaceutical industry and analytical laboratories have focused on quality, safety and efficacy of their products, for this planning tools and monitoring are required in the production scale. The concept of Process Analytical Technology introduces innovative approaches, as improvement of process control and comprehension of carried out procedures to improve the efficiency. This study applies the near infrared spectroscopy to build the Process Analytical technology in the production of Olanzapine coated tablets, since this technique has being wide use, because it is not necessary to prepare the samples, the absence of residues produced and the analysis are fast, when compared to the reference techniques, e.g. chromatography. Previously to implementation of Process Analytical Technology some laboratory steps are required to evaluate if the technique are sensitive to the objective. To prove the theory, alternative methods were developed to compare with their references. In the Chapter 1 it was carried out the assay of the drug using high performance liquid chromatography and near infrared associated to multivariate calibration techniques (partial least square – PLS), after the spectra pre-treatment). The results obtained by the near infrared were compared to the chromatography and as response: the assay by both methods did not presented statistically significance difference. In the Chapter 2, the thesis was focused at the construction of multivariate control charts, based on Net Analytical Signal (NAS) to monitor the assay of the drug in laboratory and production samples using near infrared spectroscopy. The control charts (NAS, interferers and residuals) were built and they were promisor with high level of recognition (95 to 100%) of samples that were exactly in or out of the specified range. Lastly, at the Chapter 3 the determination of water content by near infrared associated to multivariate calibration, PCR, of Olanzapine and excipients granulate mixtures in laboratory and production samples was analyzed and compared to the reference method (Karl Fischer). The results, when NIR and Karl Fischer were compared, presented no significant statistically difference, promoting the NIR associated to multivariate calibration also works to analyze the water content into the coated olanzapine tablets. The results showed that the multivariate calibration models constructed, using the spectra obtained by the near infrared, were promisors, when compared to the reference methods. Therefore, the alternative analytical tool (near infrared spectroscopy) can be installed at production scale to monitor the drug quality at this matrix used.

Key-words: Olanzapine; Near Infrared; HPLC; PAT; Control Charts; Karl Fischer.

I N T R O D U Ç Ã O P á g i n a | 19

1. INTRODUÇÃO

Nas últimas décadas, devido às consequências negativas do grande crescimento

industrial e populacional, que provoca graves danos à saúde humana e à natureza, o

aumento da responsabilidade ambiental tem sido visível. Diversos países têm voltado seus

esforços para a busca do desenvolvimento autossustentável, que pode ser definido como o

progresso industrial que atenda às necessidades do presente sem comprometer a

capacidade das futuras gerações de satisfazerem suas próprias necessidades.

Inevitavelmente, essa demanda teve influência decisiva na análise de fármacos e

medicamentos. Para tanto, há a necessidade, cada vez mais, de desenvolver novos

métodos, elaborar novas estratégias, criar novas ferramentas que reduzam ou eliminem

componentes indesejáveis de uma análise, como, produção de resíduos, uso de reagentes

tóxicos, desperdício de energia em processos industriais, etc.

O infravermelho próximo (NIR) possui características úteis para utilização no

controle, pois analisa de forma não destrutiva e rápida, permitindo não só caracterizar as

diferentes formas de uma substância ativa, mas também para determinar a pureza

polimórfica de ambos o produto puro e a preparação final (BLANCO, et al., 2000; FEVOTTE,

et al., 2004).

Além disso, possui vantagens com relação ao menor consumo de produtos químicos.

Dessa forma, a sua aceitação aumentou em vários campos industriais, principalmente na

indústria farmacêutica. NIR tem o potencial de proporcionar uma maior compreensão do

processo e do produto que vai bem com a iniciativa da Tecnologia Analítica de Processo

(PAT) do Food and Drug Administration (FDA). Neste contexto, cartas de controle

multivariadas baseadas no NIR têm sido desenvolvidas para melhorar o processo de

controle de qualidade (ROCHA, et al., 2010).

Nesta tese, o método por cromatografia líquida de alta eficiência (método de

referência), previamente desenvolvido e validado pelo Núcleo de Pesquisa em Alimentos e

Medicamentos da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (NUPLAM/UFRN),

seguindo as recomendações da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), foi

validado parcialmente para as suas aplicações. Em seguida, foram desenvolvidos métodos

espectrofotométricos, na região do Infravermelho Próximo, associados às análises

quimiométricas para construção de modelos de calibração multivariada para doseamento de

misturas de Olanzapina, cartas controles multivariadas para Olanzapina comprimidos

revestidos e construção de modelos de calibração multivariada para determinação do

conteúdo de água em granulados de mistura de Olanzapina e excipientes. Para isso foram

I N T R O D U Ç Ã O P á g i n a | 20

utilizadas ferramentas estatísticas de planejamento de experimentos e softwares para

tratamento de dados e construção dos modelos de calibração multivariados.

F U N D A M E N T O S T E Ó R I C O S P á g i n a | 21

2. FUNDAMENTOS TEÓRICOS

2.1. Tecnologia Analítica em Processos - PAT

O termo “Process Analytical Technology” (PAT) tem sido usado para definir um

sistema para proteger e controlar a fabricação através de medições em tempo útil (ou seja,

durante o processamento) de qualidade crítica e de atributos de desempenho das matérias-

primas e também nos processos com o objetivo de garantir a qualidade do produto final

(GENDRE, et al., 2011).

Normalmente, a garantia de qualidade monitora a segurança e a limpeza das

instalações de uma indústria farmacêutica, mas examina o produto apenas no final,

dificultando a verificação das não conformidades. Assim, quando o produto final da

amostragem analisada indica algo de errado como: contaminação, erro de dosagem, ou

outro problema, o lote é descartado (ou reprocessado) (MOREIRA, 2011).

Muitas medidas em laboratórios analíticos são utilizadas apenas para assegurar a

qualidade do produto, mas não controlar o processo. Neste caso, as amostras são retiradas

de vários pontos da linha de produção e são levadas até um laboratório onde são analisadas

(denominada como análise “off-line”), os resultados são enviados de volta ao solicitante ou

são arquivados para referência futura.

Porém melhorias tecnológicas nos métodos existentes são possíveis. A PAT introduz

abordagens inovadoras, como melhorias no controle do processo e na compreensão dos

procedimentos realizados de forma diferente e aumenta sua eficiência. Com os requisitos de

qualidade implantados no produto desde o início do seu processo, ou seja, com o sistema

de análise instalado na linha de produção a identificação de falhas é muito mais fácil

(MOREIRA, 2011). A PAT pode desempenhar um papel ainda mais importante no projeto e

análise de processos de fabricação, pois é possível desenvolver e implantar tecnologias de

medição (quantitativas e qualitativas) adequadas ao processo, que resulta na eficiência do

uso de energia, tempo e matéria-prima, contribuindo para a sustentabilidade e menor

impacto ambiental.

Moreira (2011) cita que os principais conceitos que diferenciam PAT a partir de

competências industriais farmacêuticas tradicionais são a química de processo analítico e a

fabricação de qualidade. A química de processo analítico geralmente descreve a ciência e a

tecnologia associada com o deslocamento do laboratório de medições baseadas com


sensores e instrumentação posicionados mais próximos do local da operação, pois em

processos industriais o tempo é um dos parâmetros de maior importância, assim como custo

e precisão. No controle de processo são necessárias medições de análises em tempo real,

visto que o tempo gasto para conclusão da análise deve ser pequeno, considerando que os

resultados obtidos podem ser usados imediatamente para controlar ou aperfeiçoar o

processo de fabricação. Portanto, devem-se usar analisadores de processos que podem ser

distribuídos em pontos estratégicos de uma linha de produção. Estes analisadores de

processos são classificados em quatro tipos (FEVOTTE, et al., 2004):

i) “At line”: este sistema aproxima o instrumento analítico a linha de produção.

As vantagens incluem a disposição de um instrumento exclusivo para a

realização da análise, porém demanda tempo e habilidade analítica por parte

de um técnico especialista como consultor. São utilizados em medidas de

especificações técnicas de matéria-prima e controle de qualidade do produto

final.

ii) “on-line”: neste tipo de analisador, um sistema analítico automatizado é

conectado ao processo de fabricação, que extrai, condiciona e encaminha a

amostra para o equipamento, para coletar os dados e processá-los. A

desvantagem deste processo é a preparação da amostra antes da medição.

iii) “in-line”: neste sistema elimina-se a linha de amostragem, introduzindo-se um

sensor analítico dentro da linha do processo (in-situ), em contato direto com o

material a ser analisado. Apesar do aspecto atrativo deste sistema, ele

encontra dificuldades devido a problemas de calibração e com o contato do

sensor com substâncias que podem ocasionar desgastes e obstrução do

sensor.

iv) “non-invasive”: é a classe mais recente de analisadores, o sensor analítico é

posicionado na linha de processo, porém sem contato com a substância,

portanto não ocorrem mudanças na composição da amostra e não gera

contaminação.

Um exemplo de aplicação da PAT na indústria das mais diversas áreas é a utilização

da técnica de espectroscopia NIR no formato “non-invasive”, conforme equipamentos

listados abaixo nas Figuras 1 e 2:


Figura 1. Aplicação da PAT com o NIR na indústria alimentícia

Fonte: http://www.brimrose.com/products/nir_mir_spectrometers/sort_by_spectrometers/7030.html

Figura 2. Aplicação da PAT com o NIR na tampa do misturador BIN - Teste de

homogeneidade.

Fonte: www.pharmaceuticalonline.com/doc/solution-for-real-time-ibc-blend-uniformity-0002

A primeira medição em “tempo-real” em um ambiente de produção foi possível após

modificação em instrumentos laboratoriais. Nas últimas décadas, instrumentos portáteis

automatizados ou multifuncionais foram e estão sendo desenvolvidos para análises

imediatas (em processo) (YAO, et al., 2012).


Em setembro de 2005, o FDA definiu a PAT como uma estrutura para o

desenvolvimento de tecnologia inovadora em ambiente de produção e de garantia da

qualidade, para isso, são necessários quatro etapas para a sua aplicação (YAO, et al.,

2012):

I) Aquisição de dados multivariados e ferramentas de análises;

II) Analisadores de processo;

III) Monitoramento de processo e ferramentas de controle;

IV) Melhoramento contínuo e conhecimento das ferramentas de gerenciamento.

Com base no guia de princípios de “Quality by Design (QbD)”, o FDA recomenda a

indústria farmacêutica a construir sistemas para delinear, analisar e controlar a produção

através de medições durante o processo de atributos críticos como forma de garantir a

qualidade de seus materiais e processos, tais como em matéria-prima ou produto final

(YAO, et al., 2012).

Durante os últimos 20 anos, o número de publicações envolvendo a PAT aumentou

rapidamente, mostrando que a tecnologia dessa ferramenta é bastante promissora e que

atrai a atenção da área industrial e científica. Exemplos desta ferramenta em ambiente

industrial farmacêutico pode ser visto na AstraZeneca, a qual instalou o sistema PAT em

uma de suas fábricas, com a utilização do infravermelho próximo (NIR) na etapa de mistura

do princípio ativo com os excipientes e na instalação de sondas para monitorar o controle de

umidade na produção de medicamentos sólidos. A Sanofi-Aventis aplicou a PAT com

sucesso na produção de medicamentos sólidos para o monitoramento de impurezas e

espessuras de comprimidos. Outros grupos farmacêuticos (Tasly Group e Northeast Group)

vêm implantando a PAT em suas indústrias, em parcerias com universidades ou centros de

pesquisas, como forma de atualizar seu processo produtivo, em geral antigo, que permitam

melhorar seu controle (YAO, et al., 2012).

Em todos os sistemas PAT, instrumentos e métodos espectroscópicos ganham

importância por desempenharem o papel principal, os quais, além disso, apresentam

vantagens, tais como: rapidez, simplicidade, não-destrutividade e portabilidade. Essas

vantagens os tornam mais adequados para realizar analises não-invasivas e “in-line” (YAO,

et al., 2012).

O infravermelho próximo (NIR) e o médio (MIR) são as ferramentas espectroscópicas

mais recomendadas para predizer, por exemplo, a qualidade de misturas de diesel e

biodiesel (nos testes de densidade, conteúdo de enxofre e temperatura de destilação). Outro


exemplo trata-se da análise de embalagens de alumínio-plástico, o qual de acordo com a

Farmacopeia Europeia são necessárias duas horas para o teste, enquanto que com a

aplicação do NIR, apenas dois minutos. Comparando com a técnica de cromatografia líquida

de alta eficiência (CLAE ou HPLC), com a utilização do NIR, ocorre uma economia de tempo

em torno de 98% na análise quantitativa de cefalosporina. Outros usos estão sendo

explorados, como por exemplo, na identificação de materiais a base de plantas (YAO, et al.,

2012), em aplicações para análise de polímeros, indústria petrolífera, análises ambientais,

têxtis e cosmética (PASQUINI, 2003).

Outros métodos, tais como, ultravioleta (UV), ressonância magnética nuclear (RMN),

espectroscopia Raman, espectroscopia de massas (MS), reflectância total atenuada (ATR),

espectroscopia no infravermelho com transformada Fourier (FTIR) também tem sido

utilizadas, conforme relatado na Figura 3.

Fonte: Adaptado de REID, et al., 2012

Figura 3. Técnicas analíticas empregadas em processos farmacêuticos – PAT.

Granulação

Tamanho de Partícula Raman

Turbidez

Reator

Cromatografia NIR MIR

Raman UV pH

Secagem NIR MIR

Raman

Tamanho de Partícula

Mistura NIR MIR

Raman

Compressão NIR

Raman

Matéria-Prima NIR MID

Raman


2.2. Infravermelho próximo (NIR)

A busca crescente por melhoria da qualidade de produtos e racionalização da

produção nas várias áreas da indústria tem levado à substituição gradual de técnicas

analíticas conservadoras demoradas e procedimentos de controle inespecíficos por

ferramentas analíticas específíccas e compatíveis com o ambiente (BURNS e CIURCZAK,

2008).

Nesse sentido, as técnicas espectroscópicas, em geral, tem tido grande destaque

nos últimos anos na indústria farmacêutica, principalmente voltadas ao controle de

qualidade e monitoramento de processos. Os métodos espectroscópicos de análise

baseiam-se na interação da radiação com a matéria, através da medida da quantidade de

radiação produzida ou absorvida pelas moléculas ou espécies atômicas de interesse

(SKOOG e LEARY, 2006). Dentre as existentes, o infravermelho próximo possui

características que a destaca.

A região do infravermelho próximo compreende a faixa do espectro eletromagnético

(~780 a 2500 nm), situada entre o visível e o infravermelho médio, conforme observado na

Figura 4. As absorções na faixa NIR são baseadas em sobretons e combinação de

vibrações da molécula investigada. Devido à sua probabilidade de transição inferior, as

intensidades geralmente diminuem por um fator de 10 a 100, a cada nível a partir da base

para o próximo sobretom (BURNS e CIURCZAK, 2008).

Figura 4. Espectro eletromagnético. NIR (~780 a 2500nm)

Fonte: http://www.processsensors.com/appbl_II/?p=2998


Na região do NIR, as moléculas sofrem transições vibracionais e rotacionais podendo

passar diretamente de um determinado nível energético para dois ou mais níveis de maior

energia. As bandas de absorção mais proeminentes que ocorrem na região do NIR estão

relacionadas a sobretons e combinações de vibrações fundamentais de grupos funcionais –

CH, -NH, -OH e -SH (JAMRÓGIEWICZ, 2012).

O NIR pode ser realizado de três modos: transmitância, reflectância difusa e

transflectância. O segundo mede a reflectância e o terceiro mede a combinação entre a

transmitância e reflectância. Os modos de transmitância e transflectância são em geral

utilizados para amostras líquidas e semissólidas, enquanto que a reflectância difusa é

utilizada para amostras sólidas, na qual a radiação não é capaz de atravessar a amostra e

ser captada por um detector que fique a 180° da fonte de emissão (COSTA, 2014).

Os procedimentos utilizando a região do NIR são menos trabalhosos daqueles os

quais utilizam a região do MIR e são semelhantes aos da região do ultravioleta e visível. A

absorvância de um líquido ou solução pode ser rapidamente mensurada utilizando cubetas

de quartzo ou safira de dimensões variáveis ou utilizando sondas de fibra ótica. Devido a

capacidade de absorver grupos O-H, N-H e C-H fortemente, recomenda-se utilizar solventes

os quais não possuam esses grupamentos ou que sua absorção seja mínima para não

interferir no sinal produzido pela molécula de interesse (PASQUINI, 2003).

A espectroscopia do NIR pode ser utilizada em determinações qualitativas e

quantitativas de espécies moleculares de todos os tipos. Devido a isso ela é amplamente

aceita pela indústria farmacêutica como um método para o controle físico-químico das

amostras, proporcionando medição direta de amostras sólidas com uma análise rápida e

precisa, necessitando de pouca ou nenhuma manipulação da amostra (BLANCO e ALCALÁ,

2006b).

Das técnicas analíticas disponíveis para o desenvolvimento de métodos qualitativos

e quantitativos na indústria farmacêutica, o NIR é provavelmente a mais bem-sucedida. Na

literatura, constam diversos trabalhos voltados para a indústria farmacêutica (COSTA,

2014), tais como: na análise qualitativa e quantitativa de diferentes classes de compostos, e

em diferentes áreas, tais como produtos farmacêuticos (NEVES, et al., 2012), alimentos

(INACIO, DE MOURA e DE LIMA, 2011), ambiental (GELADI, et al., 1999), clínica

(SAKUDO, et al., 2009), entre outros. NIR mede as transições de ligações moleculares de

vibração. Uma ampla gama de moléculas (principalmente compostos orgânicos) absorve no

intervalo de NIR e os seus grupos funcionais, tais como OH, CH, NH e C=O aparecem como

os mais fortes. As amostras geralmente são medidas sem quaisquer pré-tratamentos, o que

torna NIR uma técnica rápida, não invasiva e não destrutiva (MARQUES, et al., 2014).


Outras aplicações do NIR descritas na literatura estão relacionadas com o monitoramento

do processo de revestimento de comprimidos e na determinação de seu ponto final (DE

BEER, et al., 2011; MOLTGEN, et al., 2012).

Segundo Pasquini (2003) a utilização do NIR em métodos análiticos para a

determinação de proteínas em amostras de carne, soja e milho, como forma alternativa ao

método compendial (Kjeldhal) ganhou ênfase e espaço, uma vez que após a construção do

método por NIR, ele é capaz de obter o sinal sem destruir as amostras, gerar o resultado em

menos de um minuto e não produzir resíduos tóxicos ao ambiente.

Além de aplicações na indústria, estudos biológicos também foram descritos, por

exemplo, na aplicação da espectrometria de NIR para análise de microrganismos

Staphylococcus aureus (MAQUELIN, et al., 2003; GRUNERT, et al., 2013), que tem sido

alvo de estudos nos últimos anos. AMIALI e colaboradores (2011) determinaram uma região

espectral FTIR ou a combinação das regiões que refletem uma característica bioquímica

específica de uma cepa de S. aureus meticilina-resistente associado à comunidade (CA-

MRSA).

GRUNERT e colaboradores (2013) estudaram a potencialidade da espectroscopia

FTIR para diagnóstico diferencial dos tipos de S. aureus de polissacarídeo capsular

clinicamente mais relevante. Maquelin e colegas de trabalho (2003) realizaram um primeiro

estudo clínico prospectivo em que os patógenos causadores (Staphylococcus aureus,

Enterococcus feacalis, Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa) de infecções do sangue

foram identificados por espectroscopia FTIR (MARQUES, et al., 2014).

Entretanto, o método de análise por NIR possui desvantagens. Essa tecnologia é e

sempre será fortemente dependente da existência de bons e aceitáveis métodos de

referência, como por exemplo: cromatografia, Karl Fischer, kjeldahl, contagem de placas,

entre outros. Isso ocorre devido à etapa de modelagem ou criação do modelo de calibração,

uma vez que o NIR precisa identificar as características espectrais ou as combinações

destas referentes ao que está sendo pesquisado, portanto pequenas diferenças no sinal do

espectro serão os responsáveis de garantir que tal informação é referente à mudança

existente e detectável pelo método de referência. A diferença entre o sucesso e a falha

nesta técnica está diretamente dependente da qualidade dos valores de referência

associadas às amostras na etapa de modelagem (BLANCO, et al., 1998).

A umidade do ambiente deve ser controlada, uma vez que ele é capaz de detectá-la

e interferir no espectro resultante do produto a ser analisado. Durante sua aplicação em

rotina é necessário inserir novos dados de amostras no modelo de calibração, uma vez que


fenômenos físicos ambientais podem interferir ao longo de sua aplicação e,

consequentemente o modelo de calibração torne-se desqualificado para o objetivo. Além

disso, é necessário que o operador saiba interpretar corretamente os espectros, bem como

realizar com precisão e exatidão os tratamentos quimiométricos, seja de pré-

processamentos ou de construção de modelos de calibração multivariados, dos espectros

para manter respostas adequadas do produto (JAMRÓGIEWICZ, 2012).

De forma resumida, as vantagens e desvantagens estão presentes na Tabela 1

(JAMRÓGIEWICZ, 2012):

Tabela 1. Vantagens e desvantagens da utilização do NIR

Vantagens Desvantagens

Método não destrutivo e não invasivo. Baixa sensitividade do limite do sinal pela determinação de substâncias com concentração abaixo de 0,1% (p/p).

Medidas espectrais rápidas (< 1min). Necessidade de investimento inicial financeiro elevado.

Baixo custo das análises, não necessita de reagente químico, com apenas um operador é capaz de analisar um grande quantitativo de amostras.

Necessita de desenvolvimento de modelos de calibração com analista qualificado.

A possibilidade de scanear o espectro em diversos campos do mesmo objeto permite obter uma composição da amostra de forma mais representativa, consequentemente mais exato será o resultado da análise.

Necessita de calibração exata e robusta com um grande número de amostras ampla variação para ser incorporadas ao modelo.

Não necessita de preparação de amostra ou apenas tratamento mínimo (secagem).

Necessita de manutenção (inserção de novas amostras) contínua do modelo de calibração.

Vários constituintes da mesma amostra podem ser medidos em uma mesma análise.

Dificuldade de transferência de métodos de calibração entre equipamentos de mesmo fabricante ou fabricantes diferentes.

Facilmente aplicável em diferentes ambientes, laboratorial ou industrial.

Necessita de uma análise física e química precisa de amostras de referência.

Análises podem ser feitas em linha e fora de linha

A presenta da sonda de fibra óptica permite ao analista analisar a amostra in situ

A disponibilidade de equipamentos portáteis permite obter espectros de amostras diretamente do local onde a amostra se encontra, não havendo necessidade de realizar amostragem.

Radiação capaz de penetrar na embalagem de vidro das amostras.


2.2.1. Processamento matemático dos sinais

O sinal analítico obtido da espectroscopia no NIR é uma função complexa que

depende da propriedade física e química da molécula. Os valores obtidos também sofrem

influência quando a reflectância difusa é utilizada em amostras sólidas, uma vez que a

reflectância depende do grau de espalhamento da luz incidente, ou seja, quanto mais

espalhada for a luz, menor o grau de penetração na amostra, consequentemente menor

será sua absorção. O espalhamento depende, essencialmente, das propriedades físicas da

amostra (tamanho de partícula, ambiente cristalino ou amorfo) e tem seu efeito multiplicado

na quantidade de luz que é absorvida na amostra, o qual combina com outros efeitos

adicionais, tais como inclinação da linha de base e absorção química (BLANCO, et al.,

1998).

De fato, o espalhamento de luz pode ser responsável pela variabilidade do sinal

entre amostras, o qual conduz para uma alta correlação entre medidas em diferentes

comprimentos de onda. Essas situações requerem um processamento matemático dos

espectros antes de serem analizados para minimizar os efeitos das propriedades físicas das

amostras, ou seja, promovem o melhoramento do sinal pela redução de informações

irrelavantes (BLANCO, et al., 1998)

Segundo Blanco (1998), alguns dos tratamentos matemáticos mais utilizados para

correção do espalhamento de luz do espectro NIR são a normalização ou suavização

(SGS), derivada, correção do espalhamento multiplicativo da luz (MSC) e variação padrão

normal (SNV):

Suavização Savitzky-Golay (Smoothing) – SGS: Filtro utilizado para a remoção de

ruído de alta frequência nas amostras. A suavização SGS assume que as variáveis

que estão próximas umas das outras na matriz de dados contêm informações

semelhantes e por isto, estão relacionadas umas com as outras, de modo que se

pode calcular a média em conjunto para reduzir o ruído, sem perda significativa do

sinal de interesse (WISE, et al., 2006). Aplicações relatadas na literatura: análise em

acerolas (MALEGORI, et al., 2016) e adulterantes em amido (XU, et al., 2015).

Derivada Savitzky-Golay: Pré-tratamento utilizado para a correção de linha de

base, os quais possuem princípio de funcionamento muito semelhante ao do SGS

(NICOLAÏ, et al., 2007). É um método que deve ser utilizado quando as variáveis são

bastante correlacionadas umas com as outras. A forma mais simples de derivação é


a derivada de ordem 1 ou primeira ordem, na qual cada variável é subtraída

imediatamente pela vizinha. Com isso, ocorre a remoção de sinais iguais entre duas

variáveis e mantém apenas a parte do sinal que é diferente entre elas (COSTA,

2014). Este processamento enfatiza (amplifica) os sinais de baixa frequência (WISE,

et al., 2006). Aplicações relatadas na literatura: análise de nimesulida (ROCHA, et

al., 2010), biodísel (OLIVEIRA, ROCHA e POPPI, 2009), resíduos de coco

(RAMBO, et al., 2015), adulterantes em amido (XU, et al., 2015), análise

microbiológica (MARQUES, et al., 2014) e análise microbiológica em frutos

(MARQUES, et al., 2013).

Correção do Espalhamento multiplicativo da luz (MSC): Amplamente utilizado

para a promoção da normalização do espectro, uma vez que existam variações

multiplicativas entre os perfis de resposta das amostras. Normalmente causadas por

diferenças no percurso óptico das amostras ou em consequência de processos de

dispersão de luz, para compensar os efeitos de mudança de base, responsável pela

inclinação do espectro (COSTA, 2014). Aplicações relatadas na literatura: análise de

nimesulida (ROCHA, et al., 2010), análise microbiológica em frutos (MARQUES, et

al., 2013) e monitoramento do processo de revestimento de medicamentos

(MOLTGEN, et al., 2012).

Variável Padrão Normal (Standard Normal Variate – SNV): Tem o princípio de

correlação semelhante ao MSC. O SNV é uma normalização ponderada, o qual

calcula o desvio padrão de todas as variáveis reunidas para uma determinada

amostra e em seguida, normaliza todas elas por este valor. O ajuste multiplicativo é o

desvio padrão de todas as variáveis (WISE, et al., 2006). Aplicações relatadas na

literatura: análise em acerolas (MALEGORI, et al., 2016), resíduos de coco

(RAMBO, et al., 2015) e adulterantes em amido (XU, et al., 2015).

2.2.2. Uso do NIR pelas Farmacopeias

As Farmacopeias Brasileira (BRASIL, 2010) e Americana (USP, 2011) publicaram

métodos gerais sobre NIR, suas aplicações e a necessidade de validação, a qual é

semelhante à requerida para qualquer procedimento analítico. Em geral, os métodos

analíticos farmacopeicos ainda são baseados, na sua grande maioria, em métodos


espectroscópicos de forma univariada, seguindo as normas das diretrizes da ANVISA, no

Brasil (ANVISA, 2003), e ICH (International Conference on Harmonization) (ICH, 1995; ICH,

1997). Dentro das monografias existentes na farmacopeia brasileira, apenas a cola de

fibrina requer que o método para determinação de água no componente 1 e 2 seja feita por

um dos métodos: determinação da água pelo método semimicro ou perda por dessecação

ou espectrofotometria de absorção no infravermelho próximo (BRASIL, 2016).

Para que a tecnologia NIR seja inserida em compêndios oficiais como método de

referência e não mais alternativo, os laboratórios de controle de qualidade oficiais ou

indústrias farmacêuticas necessitam enviar seus métodos de análise validados às agências

reguladoras ou entidades farmacopeicas, para que o método seja analisado, comprovando

assim, que ele se aplica ao produto ao qual foi destinado e, que este método apresente

vantagens em relação ao método de referência. Dessa forma, os métodos poderão ser

adotados na rotina, tornando o NIR uma ferramenta analítica associada à calibração

multivariada essencial na indústria farmacêutica.

De acordo com a farmacopeia brasileira (2010), a validação de uma metodologia

que emprega a espectroscopia NIR é semelhante àquela requerida para qualquer

procedimento analítico e, geralmente, é estabelecida a partir de ferramentas quimiométricas.

Os principais parâmetros a serem avaliados são: especificidade, linearidade, faixa de

trabalho, exatidão, precisão e robustez.

Ainda de acordo com a farmacopeia brasileira (2010), a extensão da especificidade é

dependente do procedimento utilizado. A demonstração da especificade dos métodos NIR

pode ser feita através das seguintes formas:

Os comprimentos de onda utilizados nos modelos de calibração devem

corresponder a bandas do analito de interesse;

Para calibração utilizando PLS (regressão pelos mínimos quadrados parciais)

os coeficientes devem ser plotados e as regiões de maior coeficiente

comparadas com o espectro do analito;

Variações na matriz da amostra não devem afetar de forma significativa a

quantificação da analito;

A validação da linearidade do método NIR envolve a demonstração da resposta

linear da técnica para amostras distribuidas através de uma faixa definida de calibração. O

coeficiente de correlação, r, não é uma ferramente adequada para verificação da

linearidade, mas é a medida da variação dos dados que é adequadamente modelada pela


equação. A melhor maneira de demonstrar a linearidade dos métodos NIR é através da

avaliação estatística dos valores da inclinação e intercepto obtidos para o conjunto de

validação (BRASIL, 2010).

O ajuste é feito pelo método dos mínimos quadrados. A melhor curva é aquela que

apresentar menor resíduo e maior coeficiente angular, entre os valores de Y medidos e os

valores de Y previstos. Uma vez conhecidos os coeficientes de regressão, é possível

predizer a concentração de novas amostras, com vase apenas em seu sinal analítico

(COSTA, 2012).

A faixa de trabalho dos valores de referência do analito do conjunto de validação

define a faixa de trabalho do método NIR. Controles devem ser estabelecidos para garantir

que os resultados fora da faixa de trabalho não sejam aceitos. A validação de um método

NIR deve gerar um valor anômalo quando uma amostra contendo analito fora da faixa de

trabalho for analisada (BRASIL, 2010) (ICH, 1995) (ICH, 1996). Ambas a faixa de trabalho e

linearidade em métodos por NIR dependerão da disponibilidade das amostras e variações

do processo, portanto a faixa fixa recomendada pelos guias (80 a 120% da concentração de

trabalho) pode não ser aplicada, portanto essa faixa pode ser ampliada (BROAD, et al.,

2002).

A exatidão de um método NIR é demonstrada pela correlação dos resultados NIR

com os dados da técnica de referência. Além disso, a exatidão pode ser verificada a partir

da proximidade do erro padrão de predição (SEP) ou através da raiz quadrada do erro

médio quadrático de prevcisão (RMSEP, do inglês, Root Mean Squares Error of Predction)

com o erro do método de referência, o qual deve ser conhecido com base nos valores

históricos (COSTA, 2012). Diferentes métodos estatísticos podem ser utilizados para

verificar diferenças estatísticas entre os resultados obtidos pelo método NIR e o método de

referência (BRASIL, 2010).

A precisão de um método NIR expressa a concordância entre uma série de medidas

obtidas sob condições pré-determinadas. Há dois níveis de precisão que podem ser

considerados: a repetitividade e a precisão intermediária. A precisão de um método NIR é

tipicamente expressa como coeficiente de variação (BRASIL, 2010) (ICH, 1995) (ICH, 1996).

A robustez do método NIR pode ser verificada através de mudanças de parâmetros

do método, como: condições ambientais, temperatura da amostra, características da

amostra e mudanças instrumentais (BRASIL, 2010).

Além dos citados anteriormente, os limites de detecção e quantificação também são

requeridos para o método espectrofotométrico. Os quais são a menor quantidade do analito


presente na amostra que gera sinal e a menor quantidade do analito presente na amostra

que geral sinal com precisão e exatidão, respectivamente (BRASIL, 2010) (BROAD, et al.,

2002). Podem ser estimados a partir da comparação do sinal analítico obtido para uma

amostra que possui baixas concentrações do analito com o sinal da amostra do branco,

estimando assim, a concentração mínima com a qual a espécie de interesse pode ser

determinada de maneira confiável.

2.3. Calibração Multivariada aplicada ao controle de Qualidade de Medicamentos

O termo “quimiometria” foi criado há várias décadas para descrever um novo modo

de analisar dados químicos, em que eram combinados os pensamentos estatísticos e

químicos. Dentre os elementos utilizados na quimiometria, os três mais utilizados nas

aplicações da quimiometria são: modelagem empírica, modelagem multivariada e os dados

químicos (BAKEEV, 2005).

A análise multivariada da quimiometria indica que mais do que uma variável resposta

do instrumento é utilizada para construir os modelos, uma vez que uma única variável não

apresenta seletividade adequada para monitorar uma propriedade especifíca levando em

consideração os interferentes de outras propriedades (BAKEEV, 2005).

Ferramentas quimiométricas podem ser usadas para uma ampla variedade de usos,

incluindo planejamento experimental, análise de dados exploratórios e o desenvolvimento de

modelos preditivos. Na química analítica, a quimiometria tem se mostrado mais eficaz em

duas funções gerais:

i) Especialização Instrumental: modelos de calibração multivariados são

construídos com o objetivo de fornecer seletividade para um instrumental

analítico multivariado;

ii) Extração de informações: ferramentas quimiométricas são usadas para

“destravar” informações intrínsecas já presentes nos dados com o objetivo de

melhorar o entendimento da tecnologia química e analítica.

A calibração multivariada é uma das mais bem sucedidas combinações de métodos

estatísticos com dados químicos. Os dados, em geral, são dispostos em forma de matriz, no

qual as linhas da matriz referem-se às amostras obtidas e as colunas referem-se às

variáveis (absorvâncias de um composto em diferentes comprimentos de onda) (ROCHA,

2007).


A quimiometria é frequentemente aplicada ao Infravermelho próximo, devido ao fato

que a informação do espectro NIR é, em geral, não específica para a maioria das

aplicações. Já para as técnicas de emissão atômica ICP ou espectrometria de massas, as

quais já fornecem seletividade suficiente, não são, frequentemente, alvos da quimiometria

(BAKEEV, 2005).

A combinação da espectroscopia no infravermelho próximo com a calibração

multivariada emergiu na última década como uma alternativa promissora para o controle de

qualidade de insumos farmacêuticos ativos (API) (SARRAGUÇA, SOARES e LOPES, 2011;

FERREIRA, BRAGA e SENA, 2013), fornecendo métodos que são simples, rápidos, não

destrutivos e de baixo custo. Além disso, os métodos baseados em NIR são ambientalmente

amigáveis e livres de solventes, não geram resíduos químicos, as amostras não necessitam

de preparo prévio, e fornecem a precisão e sensibilidade suficiente com menos intervenção

do analista. O desenvolvimento destes métodos requer um desenho de calibração robusta,

que incorpora todas as possíveis fontes de variação (presença de excipientes, impurezas,

produtos de degradação, umidade, formas cristalinas ou amorfas dos pós, entre outros),

melhorando assim o controle da qualidade do produto final (FERREIRA, BRAGA e SENA,

2013).

A calibração é um processo de construção de um modelo matemático para relacionar

a resposta de um instrumento analítico às propriedades da amostra. Qualquer algoritmo de

calibração que possa ser claramente definido em uma expressão matemática exata e

fornece resultados adequados, pode ser utilizado. Todas as amostras devem fornecer

resultados quantitativos dentro do intervalo de precisão como definido pelo método e mesmo

que com a presença de diversos interferentes, o modelo de calibração deverá fornecer uma

quantificação correta. Dentre os modelos de regressões multivariados, podemos citar a

Regressão Linear Múltipla (MLR), Regressão pelo Componente Principal (PCR) e os

Mínimos Quadrados Parciais (PLS) (BRITISH PHARMACOPOEIA, 2010).

O fluxograma abaixo mostra um esquema geral dos métodos de calibração

(FERREIRA, et al., 1999):


Figura 5. Fluxograma para escolha do método de calibração multivariado

Fonte: Adaptado de Ferreira, 1999.

Os métodos tradicionais de calibração CLS (método clássico de mínimos quadrados)

e MLR (regressão linear múltipla), têm suas vantagens e desvantagens quando aplicados a

problemas químicos. Ambos utilizando toda a informação contida na matriz de dados X para

modelar a concentração, isto é, toda a informação espectral, incluindo informações

irrelevantes (FERREIRA, et al., 1999).

O MLR é o melhor método para sistemas bem comportados (respostas lineares, sem

interferentes, sem interações entre analitos, com baixo ruído e nenhuma colinearidade). A

limitação do MLR está no fato de além de incluir todas as informações do espectro (incluindo

as irrelevantes) também ocorre problema na etapa de inversão da matriz (X’X). Se a matriz

contiver menos linhas que colunas (menos amostras que variáveis), ela não poderá ser

invertida e a solução não existirá (SENA, et al., 2000).

Seria interessante, portanto, utilizar um método que, como o CLS, usasse o espectro

por inteiro para análise, e como o MLR, requereria somente a concentração do analito de

interesse no conjunto de calibração (FERREIRA, et al., 1999).

Dois métodos que preenchem estes requisitos são PCR (regressão pelo componente

principal, do inglês, Principal Component Regression) e PLS (mínimos quadrados parciais,

do inglês, Partial Least Squares). Estes dois métodos são consideravelmente mais eficientes

para lidar com ruídos experimentais, colinearidades e não linearidades. Todas as variáveis

relevantes são incluídas nos modelos via PCR ou PLS, o que implica que a calibração pode

ser realizada eficientemente mesmo na presença de interferentes, não havendo

necessidade do conhecimento do número e natureza dos mesmos. Os métodos são

robustos, isto é, seus parâmetros praticamente não se alteram com a inclusão de novas

amostras no conjunto de calibração (FERREIRA, et al., 1999).

SIM

SIM

NÃO

NÃO


Ambos os modelos de regressão PCR e PLS ao invés de utilizar as variáveis

originais, utilizam os scores obtidos em uma PCA, no entanto o PLS difere do PCR pelo fato

de o PLS utilizar a informação das variáveis dependentes Y no cálculo das chamadas

variáveis latentes (SENA, et al., 2000).

O PLS pode ser considerado como o método mais utilizado para a construção de

modelos de calibração multivariada. Esse método realiza uma análise de fatores em que a

matriz de espectros é decomposta em matrizes de variações (pesos) onde os escores

representam a contribuição de cada amostra (ROCHA, 2007).

No PLS, tanto a matriz das variáveis independentes X, como a das variáveis

dependentes Y são decompostas pela Análise de Componentes Prinicipais da mesma

forma, cujo objetivo é transformar dados complexos para que as informações mais

importantes e relevantes se tornem mais fáceis de visualizar. Para isso, a matriz original X,

que é uma tabela onde os dados químicos multivariados é reconstruída para 2 matrizes

menores denominadas matrizes de escores (T) e de pesos (P) e uma matriz de resíduos (E)

que indica a parte não modelada como mostrado na Figura 6 (ROCHA, 2007):

Figura 6. Decomposição da matriz X nas matrizes de escores (T), pesos (P) e resíduos (E).

Fonte: ROCHA, 2007.

Neste caso, X é a matriz original constituída de “m” linhas (objetos amostrais) e “n”

colunas (variáveis); T é a matriz de escores com “m” linhas e “d” colunas (número de

componentes principais); P é a matriz de pesos com dimensões “d” número de linhas e “n”

número de colunas e E é a matriz de resíduos com “m” linhas e “n” colunas (ROCHA, 2007).

Entrentanto, na PCA há um inconveniente, pois a análise é realizada em cada matriz

separadamente, podendo resultar numa relação não muito satisfatória (não linear) entre os

escores (T) dos dois blocos (X e Y). Para isso, utiliza-se o PLS, uma vez que ele é capaz de

realizar uma leve mudança nos valores dos escores, de forma a produzir a melhor relação

possível, ou seja, há uma leve rotação no eixo das componentes principais para obtenção

de uma maior correlação com o vetor de dados y. Então, essas novas componentes

principais passam a se chamar de variáveis latentes (FOULK, 2005). Como pode ser


notado, há um compromisso entre a habilidade dos componentes principais em descrever as

amostras nos espaços individuais (modelagem dos blocos X e Y), e o aumento na correção

entre os escores (ROCHA, 2007). A Figura 7 mostra uma representação geométrica do PLS

com uma variável latente modelando os dados do bloco de variáveis independentes (X) e o

das variáveis dependentes (Y).

Figura 7. Representação geométrica do PLS com uma variável latente modelando os dados

de X (variáveis independentes) e Y (variáveis dependentes). Os dados X formados por três

variáveis e dados de Y por duas variáveis.

Fonte: Adaptado de ROCHA, 2007.

2.4. Cartas de controle multivariadas

O controle de processo estatístico multivariado utilizado para checar o desempenho

de processos no controle de qualidade está se tornando cada vez mais importante, diante

do crescimento do número de variáveis que podem ser medidas (BARTHUS e POPPI, 2002;

NIJHUIS, JONG e VANDEGINSTE, 1997; NIJHUIS, JONG e VANDEGINSTE, 1999;

SKIBSED, et al., 2005). Um dos exemplos da implantação de ferramentas estatísticas

multivariadas ao controle em processo são as cartas de controle, uma vez que elas

permitem detectar possíveis desvios operacionais.

X Y


As cartas de controle não permitem a identificação de quais são as causas especiais

de variação que estão atuando em um processo fora de controle estatístico, mas ela

processa e dispõe informações que podem ser utilizadas na identificação destas causas.

Além disso, é uma ferramenta de grande utilidade, pois incorpora também o conceito de

boas práticas de fabricação, uma vez que permitem a investigação detalhada de todos os

pontos críticos de controle, diagnosticando as possíveis não conformidades em todas as

etapas do processo, e de sinalizar as possíveis fontes de desvios de qualidade

possibilitando correções e interações com o processo (MOREIRA, 2011).

A primeira utilização de cartas de controle foi em 1920 por Walter A. Shewhart. Esta

carta baseia-se no princípio de que a distribuição normal, em cerca de 99,73% das

observações está entre ± 3σ (SANTOS-FERNANDÉZ, 2012). O valor de uma medida

correspondente ao valor desejado mediante a característica de qualidade é chamado o valor

nominal. Estes valores-alvos possuem, em geral, uma faixa de valores suficientemente

próximos a ele, de modo a não influenciar a função ou o desempenho do produto. O maior e

o menor valor permitido para uma característica de qualidade são chamados de limites

superior e inferior de qualidade, respectivamente (COSTA, 2014). No entanto, para alguns

testes há a exigência de apenas o limite inferior de qualidade, como por exemplo, na

dissolução.

As cartas de controle podem ser divididas em univariada e multivariadas, de acordo

com o número de características de qualidade que elas monitoram (TUERHONG e KIM,

2014). As cartas de controle tradicionais são univariada, ou seja, fazem o monitoramento de

variáveis individuais, e são utilizadas para monitorar propriedades importantes da qualidade

do produto final. As mais utilizadas são Shewhart (XIANG, RAN-FENG e ZHI-YONG, 2017),

CUSUM (do inglês, Cumulative Sum) e Gráficos EWMA (do inglês, Exponentially Weighted

Moving-Averag) (APARISI e CARLOS GARCÍA-DÍAZ, 2004).

As cartas de controle EWMA foram introduzidas por Roberts (1959) como uma

alternativa às cartas de controle Shewhart para possibilitar a detecção de pequenas

mudanças no processo. No entanto, as cartas de controle Shewhart levam em conta apenas

as informações presentes no processo e não detectam rapidamente mudanças menores que

de dois desvios-padrão. Ainda tem a limitação de que só podem monitorar uma variável de

cada vez (WANG e ONG, 2008).

Cartas univariada, tais como as cartas de Shewhart, CUSUM e EWMA são indicadas

quando é necessário apenas manter cada variável no seu ponto de operação, mas não

estão em conformidade com processos contínuos multivariados com colinearidades, que é o

que ocorre na maioria dos processos químicos. Neste sentido, o uso de PCA tem uma


grande vantagem, uma vez que ele promove a remoção da colinearidade existente entre as

variáveis (COSTA, 2014), portanto, abrindo margem para as cartas de controle

multivariadas.

Existem na literatura vários tipos de cartas de controle multivariadas, dentre as quais

as que se baseiam em T² Hotelling’s (TUERHONG e KIM, 2014) (VERDIER, 2013) (JULIA,

et al., 2010), MCUSUM (KIM, et al., 2012) (BODNAR e SCHMID, 2011), Shewhart-CUSUM

combinada (RIDWAN, et al., 2017), Shewhart-type multivariada (HUMAN, CHAKRABORTI e

SMIT, 2010), scores de PCA (MARENGO, et al., 2005) (COSTA, et al., 2015) e vetor NAS

(ROCHA e POPPI, 2011) (COSTA, et al., 2015).

De acordo com Tuerhong (2014), a carta de controle multivariada mais amplamente

utilizada é a T² Hotteling’s. Seu monitoramente estatístico é analisado através da distância

entre uma observação e uma média-escalar, estimada através de observações de amostras

que estão dentro de um controle. O limite de controle de cartas de controles T² Hotteling’s é

proporcional ao percentil da distribuição F, assumindo que o dado segue uma distribuição

normal multivariada. A necessidade desse pressuposto de distribuição restringe a

aplicabilidade do conceito das cartas de controle T² Hotteling’s para situações as quais os

dados são distribuição de forma não normal. Dessa forma, diversas outras cartas de

controles foram propostas ao longo das pesquisas.

Dentro da quimiometria, é possivel destacar como uma das ferramentas mais

importantes, o conceito de Sinal Analítico Líquido (NAS). Trata-se de um avanço na teoria

da calibração multivariada, a qual permite a decomposição de um sinal analítico na

informação específica de uma substância e nos seus interferentes, os quais podem estar

presentes na amostra. A partir dai, pode-se ser usados para calcular os valores de figuras

de mérito (FOM) ou parâmetros de validação em aplicações farmacêuticas. Pode, ainda, ser

definido como a parte do sinal analítico exclusivamente relacionado com a substância a

analisar ou a propriedade de interesse, o qual é ortogonal em relação ao espaço das

interferências. Este conceito foi proposto pela primeira vez por LORBER (1986), para os

métodos de calibração multivariada (mínimos quadrados clássicos), mas tem encontrado

poucas aplicações até anos atrás, quando foi melhorado e alargado para métodos de

calibração inversos multivariados, tais como PLS (regressão por mínimos quadrados

parciais) e PCR (regressão de componentes principais) (FERREIRA, BRAGA e SENA,

2013).

Usando cartas de controle com base no sinal de rede do analito, o conteúdo de

analito, as variações de outros compostos, e variações residuais podem ser monitoradas. O

sinal de analito também pode ser usado em análise farmacêutica como um procedimento


em calibração multivariada para seleção de variáveis, para realizar adição de padrão

(ASADPOUR-ZEYNALI e BASTAMI, 2010) e para o cálculo das figuras de mérito (ROCHA,

et al., 2010).

As cartas de controles baseadas no sinal analítico líquido levam em conta a divisão

do espectro em quatro constituintes: (NAS+resíduos), NAS, resíduos e interferentes,

conforme Figura 8.

Figura 8. Representação da divisão do espectro (r) em quatro diferentes partes: r┴

(NAS+resíduos), NAS (rk*), resíduos (rres) e interferentes (rint)

Fonte: ROCHA (2010).

Na Figura 10, o vetor “r” representa o vetor de dados, enquanto que o vetor “r┴”

representa o vetor resultante da decomposição do vetor “r” que é perpendicular ao vetor

interferente “rint”. Realizando a decomposição do vetor “r┴” encontra-se como resultado o

vetor NAS “rk*” e o vetor resíduos “rres”. As linhas pontilhadas em vermelho representam a

projeção do vetor “r” no espaço dos interferentes e o vetor resíduo “rres”. Enquanto que “bk”

representa a direção na qual foi projeto o vetor analito “rk*”.

A figura geométrica que se aproxima de uma elipse mostrada no espaço dos

interferentes indica o limite tolerável nesse espaço para dizer se determinada amostra está

dentro ou fora de controle, enquanto que, os eixos representados dentro dessa figura

representam as duas primeiras componentes principais obtidas pelo PCA.

Após essa divisão, são criadas três cartas de controle (NAS, interferentes e resíduos)

para cada parte da divisão espectral, com o intuito de monitorar se as amostras estão dentro

ou fora de controle. Para isso, são necessárias três fases: construção do modelo, cálculo

dos limites estatísticos e validação do método.

Para se construir as cartas de controle, são necessárias duas etapas. A primeira

refere-se à criação do espaço dos interferentes que descreve todas as variações dos


constituintes da amostra, exceto do analito, enquanto a segunda baseia-se no cálculo do

vetor de regressão NAS (bK). Para isso, dois grupos de informações são necessários:

amostras que contém informação somente do excipiente, denominada placebo, e amostras

que contém a informação do medicamento. Para o cálculo do espaço dos interferentes

utiliza-se a matriz placebo (Rk). Para isso é feito o PCA da matriz placebo com “A”

componentes principais, conforme equação abaixo (COSTA, 2014):

Equação 1. Construção Carta NAS – Passo 1.

Onde:

M: é o espectro centrado na média de um conjunto de amostras dentro das especificações

de qualidade, chamadas de NOC (do inglês, Normal Operating Conditions).

P: matriz “loadings” de dimensão (JxK), onde “J” refere-se ao número de variáveis e “K” ao

número de componentes principais usado pelo PCA.

T: matriz “scores”.

E: matriz resíduos.

Após essa fase, utiliza-se a matriz de “pesos” para definir o espaço dos interferentes

conforme a Equação 2 (COSTA, 2014):


Onde:

rint: vetor interferente de dimensão (jx1), onde “j” refere-se ao número de variáveis.

r: vetor de dados que contém a informação do analito junto com a informação do excipiente

com dimensão (jx1).

P+: é a inversa de Moore-Penrose da matriz dos scores.

A segunda etapa da construção do modelo leva em conta o cálculo do vetor de

regressão NAS de acordo com as equações abaixo (COSTA, 2014):



Onde:

bk: matriz que contém os vetores que são ortogonais ao espaço dos interferentes de

dimensão (jxlmod) em que “lmod” é o número de amostras dentro de controle utilizadas para o

cálculo do vetor de regressão NAS, enquanto que o subscrito “k” refere-se à matriz que

contém a informação do analito de interesse.

Ij: matriz identidade de dimensão (jxj).

Rmod: matriz de dados na qual existem somente amostras dentro de controle e com

dimensão (jxlmod).

Após isso, é calculado a média dos vetores da matriz Bk, com o intuito de achar uma

direção única para os vetores ortogonais ao espado dos interferentes (COSTA, 2014). Esse

novo vetor é denominado vetor de regressão NAS e é calculado da seguinte forma:


Onde:

bk: vetor de regressão NAS com dimensão (jx1)

Agora o vetor NAS (rk*) pode ser computado pela projeção do espectro na direção do

vetor de regressão NAS, conforme mostrado na Figura 9, através da Equação 5 (COSTA,

2014).


É importante notar, na Figura 9, que existe uma pequena diferença entre “r┴” e “rk*”

que é o vetor resíduo (COSTA, 2014). Então, como:


Logo,



Onde:

rres: vetor resíduo

rk*: vetor NAS

rint: vetor interferente

r: vetor de dados

Uma vez decomposto o espectro nas três contribuições, as cartas são

desenvolvidas. O vetor NAS corresponde diretamente à concentração do analito, de modo

que pode ser usado para construir um gráfico de controle que reflete a quantidade de analito

na amostra. Os limites são derivados a partir do desvio padrão da média do vetor NAS (rk*) e

são calculadas usando 95% de confiança, conforme Equação 8, a partir da média e do

desvio padrão do vetor NAS (ROCHA, 2007; COSTA, 2014).


Lim95% = 𝐫k* ± 2S 𝐫k*

A carta dos interferentes é construída pela projeção da matriz NOC no espaço dos

interferentes, segundo a Equação 9 (COSTA, 2014).


𝐑𝒊𝒏𝒕 = 𝐏𝐏 +𝐑𝑵𝑶𝑪

Os espectros das amostras “sob controle” (chamado 𝐑𝐢𝐧𝐭) devem ocupar uma região

restringida do espaço de interferência. As novas amostras, também “sob controle”, que

forem projetadas no espaço interferência deverão ocupar a mesma região. Amostras “fora

de controle” serão projetadas numa região distante. E é justamente essa distância da

projeção de um espectro no espaço de interferência que é usado para construir a carta de

controle dos interferentes. Para o desenvolvimento desta carta, os scores de cada espectro,

correspondente a novas coordenadas no espaço dos interferentes, são calculados segundo

a Equação 10 (COSTA, 2014):



𝐓𝐍𝐎𝐂 = 𝐑T𝐢𝐧𝐭 𝐏(𝐏T𝐏)−1

O d-estatístico para cada espectro é usado para checar se novas amostras tem a

mesma covariância que as amostras dentro do controle, conforme Equação 11 (COSTA,

2014):


𝐝𝐍𝐎𝐂 = (𝐭𝐍𝐎𝐂 − 𝐭 𝐍𝐎𝐂)T 𝐒−1(𝐭𝐍𝐎𝐂𝐢 − 𝐭 𝐍𝐎𝐂)

Onde 𝐭 𝐍𝐎𝐂 é a média do vetor 𝐭𝐍𝐎𝐂 e 𝐒 é a covariância da matriz centrada T𝐍𝐎𝐂.

O d-estatístico, dividido por algumas constantes, segue uma distribuição F com 𝐴 e

(𝐼𝑁𝑂𝐶 − 𝐴) graus de liberdade. Em que 𝐴 é o número de componentes principais usadas no

modelo e 𝐼𝑁𝑂𝐶 o número de amostras dentro do controle. De modo que finalmente o limite da

carta dos interferentes pode ser calculado como descrito na Equação 12 (COSTA, 2014):


𝐷𝑙𝑖𝑚,∝ =𝐴 (I2𝑁𝑂𝐶 −1) 𝐹∝

I𝑁𝑂𝐶(I𝑁𝑂𝐶−𝐴)

O valor de 𝐹∝ é tabelado para uma distribuição F com ∝ níveis de confiança

(MILLER e MILLER, 2005). A carta dos resíduos é calculada pela diferença dos vetores 𝐫k* e

𝐫int de 𝐫𝐍𝐎𝐂, conforme mostrado na Equação 13 (COSTA, 2014):


𝐫𝐫𝐞𝐬 = 𝐫𝐍𝐎𝐂 − 𝐫𝐢𝐧𝐭 – 𝐫k*

Os limites da carta dos resíduos são calculados com base no Q estatístico e são

usados para verificar se o resíduo de novas amostras não é devido somente ao ruído

aleatório, isto porque, para amostras dentro do controle deveriam conter apenas ruído de

distribuição aleatória. Valores de Q estatístico muito elevados podem implicar em presença

de erros sistemáticos, calculados segundo a Equação 14 (COSTA, 2014):


𝑄𝑁𝑂𝐶 = 𝑅T𝑟𝑒𝑠 𝑅𝑟𝑒𝑠 ≈ 𝑔𝑋2ℎ


O Q estatístico segue uma distribuição Q², onde o escalonamento do fator “g” e os

graus de liberdade “ℎ” são chamados os momentos correspondentes da distribuição.

Utilizando o NAS, existem alguns trabalhos, como o de Skibsted et al. (2005) que

utilizaram a espectroscopia NIR para fazer a determinação da homogeneidade de misturas

de princípios ativos, um importante processo de controle de formulações sólidas. Esse

método foi calculado a partir do NAS e mostrou bons resultados, sobretudo pelo fato de ser

rápido, fácil, não destrutivo e providenciar testes estatísticos para o estudo de

homogeneidade. A homogeneidade foi caracterizada por dois métodos e validada com os

dados obtidos por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) (COSTA, 2014).

Novas cartas de controle multivariadas com base no sinal analítico líquido (NAS) têm

sido propostas para realizar o monitoramento da qualidade multivariada de fármacos, como

por exemplo: teste de homogeneidade de excipiente e fármaco (SKIBSTED, et al., 2005), do

polimorfismo do Piroxicam (ROCHA, et al., 2010) e do teor de Isoniazida e Rifampicina

(COSTA, et al., 2015), todas construidas, conforme descrito anteriormente (3 cartas de

controle) e os resultados encontrados foram bem sucedidos, mostrando que o método é

aplicável para o monitoramento de produtos farmacêuticos.

2.5. Olanzapina

2.5.1. Propriedades Fisico-Quimicas

A Olanzapina (Figura 9) é um agente psicotrópico ou antipsicótico pertencente à

classe das tienobenzoadizepinas, obtidas a partir de modificações na estrutura química da

clozapina, trazendo como vantagem a ausência de efeitos hematológicos. Ela mostra alta

afinidade in vitro por receptores de serotonina, dopamina, muscarina e histamina

(MALHOTRA e SHRIVASTAVA, 2013).

Devido a sua forma cristalina com caráter lipofílico, a Olanzapina é um fármaco muito

pouco solúvel em água afetando sua dissolução e consequentemente absorção. Segundo

estudos conduzidos por Rêgo, Moura e Moita (2010), a Olanzapina apresentou boa

solubilidade em metanol, etanol, propanol, isopropanol, butanol e álcool butílico terciário. O

mesmo estudo demonstrou evidência de fotodecomposição desse fármaco. Isto mostra que

uma solução de Olanzapina apresenta sensibilidade à luz, porém quando protegida, pode


ser estocada em temperaturas médias que variam de 4,0 ± 3,0°C (em refrigeração) e 25 ±

5,0°C (ambiente).

Foi relatado que a olanzapina (2-metil-4-(4-metil-1-piperazinil)-10H-tieno-[2,3-b] [1,5]

benzodiazepina) cristaliza em pelo menos 25 formas sólidas, incluindo polimorfos, solvatos e

hidratos (CAPUANO, et al., 2003; REUTZEL-EDENS, et al., 2003; WARZYCKA-

GORCZYCA, et al., 2004; POLLA, et al., 2005; AYALA, et al., 2006).

Dentre os produtos de degradação gerados em processos de instabilidade da

Olanzapina, a farmacopeia americana (USP, 2011) relata e comercializa 3 desses

compostos, os quais estão mostrados nas Figuras 10, 11 e 12. Os demais produtos

encontrados em uma análise cromatográfica são considerados produtos desconhecidos.

Figura 9. Estrutura molecular da Olanzapina

Fonte. Autoria própria, 2017.

Figura 10. Estrutura molecular da [5-metil-2-((2-nitrofenill)amino)-3-tiofenocarbonitrila

Olanzapina Composto Relacionado A



Figura 11. Estrutura molecular da [2-metil-10H-tieno-[2,3-b][1,5] benzodiazepina-4[5H]-one]

Olanzapina Composto Relacionado B


Figura 12. Estrutura molecular da [(2-metil-4-(4-metilpiperazina-1-il)-10H-benzo[b]tieno[2,3-

e][1,4]diazepina 4’-N-oxido]

Olanzapina Composto Relacionado C


2.5.2. Propriedades Farmacológicas

Antipsicóticos convencionais foram introduzidos na década de 1950 e todos tinham

capacidade similar para aliviar os sintomas positivos da esquizofrenia. A maioria desses

antipsicóticos mais antigos "convencionais" diferiam nos efeitos colaterais que eles

produziam. Antipsicóticos típicos são classificados pela sua estrutura química e da potência

com que se ligam à receptores dopamina tipo 2 (D2) (AYALA, et al., 2006).

O primeiro medicamento da família dos neurolépticos atípicos foi a clozapina,

seguido por olanzapina, sendo este último um dos medicamentos mais utilizados desta


família. A olanzapina é um benzoadizepínico relativamente novo que provou ter eficácia

contra os sintomas positivos e negativos da esquizofrenia, transtorno bipolar e outras

psicoses (FULTON e GOA, 1997; CALLAGHAN, et al., 1999; BHANA e PERRY, 2001;

BHANA, et al., 2001; BITTER, et al., 2004; AYALA, et al., 2006). Existe evidência

significativa de suas propriedades estabilizadoras do humor (VIETA e GOIKOLEA, 2005;

AYALA, et al., 2006).

Embora muitos fármacos antipsicóticos atípicos têm sido desenvolvidos e alguns

deles aprovados para o tratamento da esquizofrenia, a olanzapina é ainda inestimável para

a psicose, com maior eficácia clinica (KELLEHER, et al., 2002; CAMPIANI, et al., 2004).

BITTER e colaboradores (2004) demonstraram a eficácia e a segurança da

olanzapina em relação à clozapina em pacientes esquizofrênicos que não responderam

adequadamente à clozapina ou que experimentaram efeitos adversos intoleráveis

associados a ela.

2.5.3. Mecanismo de ação

A olanzapina é um agente antipsicótico atípico da classe dos benzoadizepínicos, foi

aprovado pela FDA para o tratamento das manifestações de perturbações psicóticas em

1996 (FULTON e GOA, 1997; KANDO, et al., 1997). Por ser um fármaco de excelência na

escolha para o tratamento da esquizofrenia, diversas formulações são encontradas no

mercado. Segundo o site da ANVISA existem 37 registros de indústrias farmacêuticas

nacionais e internacionais de formulações disponíveis da Olanzapina, em diversas

apresentações, dentre essas, 19 registros são de medicamentos genéricos.

Seu mecanismo de ação é baseado no bloqueio de múltiplos receptores de

neurotransmissores, incluindo os receptores cerebrais dopaminérgicos D1, D2, D3, D4;

serotonérgicos 5 -HT2A, 5 - HT2C, 5 - HT3, os receptores 5 - HT6, catecolaminas nos

receptores alfa 1 adrenérgicos, nos receptores de acetilcolina muscarínicos e histamina nos

receptores H1 (BYMASTER, et al., 1996).

A olanzapina tem cinco vezes mais afinidade para os receptores 5 - HT2 do que

para os receptores D2 (STEPHENSON e PILOWSKY, 1999) e é usada para tratar a

esquizofrenia e delírio. (KIM, et al., 2001).


A olanzapina pode reduzir as necessidades de opióides em doentes oncológicos com

dor não controlada, déficit cognitivo ou ansiedade (KHOJAINOVA, et al., 2002). O

mecanismo detalhado do efeito da olanzapina na redução da náusea e vômito induzida pela

quimioterapia (QINV) é desconhecido, mas a olanzapina pode bloquear neurotransmissores

dopamina e serotonina, que são mediadores de QINV conhecido (BYMASTER, et al., 1996;

BYMASTER, et al., 2001). Também bloqueia a serotonina, mediador do receptor 5 - HT2C,

um receptor que tem sido mostrado para mediar atividade antiemética em modelos animais

(emese induzida por cisplatina e anorexia induzida por cisplatina no hipotálamo de ratos)

(RUDD, et al., 2006; YAKABI, et al., 2010) bem como a perda de peso em humanos

(HURREN e BERLIE, 2011).

O maior benefício que a Olanzapina apresenta comparado aos outros antipsicóticos

é não ser inibidor do citocromo P450, desta forma possui menos interações medicamentosas

(BYMASTER, et al., 1996). Seu efeito secundário mais comum é a sedação (ALLISON e

CASEY, 2001).

2.5.4. Farmacocinética

A Olanzapina é bem absorvida pelo trato gastrointestinal depois de sua

administração oral, porém sofre considerável efeito de primeira passagem. O pico da

concentração plasmática (Cmáx) é alcançado em cerca de 5 a 8h depois da dose oral

(MARTINDALE, 2007).

A Olanzapina é cerca de 93% ligada as proteínas plasmáticas, extensivamente

metabolizada no fígado, primariamente pela glucoronidação direta e por oxidação mediada

através das enzimas do citocromo P450 isoenzimas CYP1A2, e em menor extensão, pela

CYP2D6. Os dois principais metabólitos 10-N-glucuronide e 4’-N-desmethyl olanzapine

parecem ser inativos. Cerca de 57% de uma dose é excretada na urina, principalmente

como metabólitos, e cerca de 30% aparece nas fezes (MARTINDALE, 2007).

A meia-vida média de eliminação plasmática é frequentemente relatada como sendo

de 30 a 38 horas; a meia-vida tem sido maior em mulheres do que em homens e, é

distribuída no leite materno (MARTINDALE, 2007).

A Olanzapina é uma substância classe II exibindo baixa solubilidade (0,0343 mg/mL)

em água em toda faixa do pH fisiológico. A partir da análise térmica pela Calorimetria

Exploratória Diferencial (DSC) foi possível evidenciar um pico endotérmico intenso e bem


definido a 197,9°C, o qual corresponde à temperatura de fusão do fármaco (FREITAS, et al.,

2012). Possui a capacidade de formar polimorfos, hidratos e diversos solvatos durante seu

processo de fabricação, totalizando 6 formas cristalinas polimórficas (WARZYCKA-

GORCZYCA, et al., 2004). REUTZEL-EDENS e colaboradores (2003) caracterizaram três

diferentes anidridos e três formas di-hidratadas, além de demonstrarem a presença de

diversos solvatos (POLLA, et al., 2005).

Devido a esta capacidade e sabendo que as diversas formas cristalinas ou não

podem apresentar comportamentos físicos distintos e influenciar tanto as propriedades

físicas da formulação, quanto à biodisponibilidade do ativo, é de vital importância à

caracterização de qual forma polimorfo da Olanzapina será utilizada durante o processo de

fabricação.

2.5.5. Ferramentas Analíticas para Avaliação da Qualidade da Olanzapina

Tão importante quanto conhecer as suas características é a determinação de sua

concentração e pureza, quando o fármaco em estudo encontra-se em uma mistura, seja

complexa ou simples. Para isso, devem-se utilizar ferramentas analíticas, as quais usam

processos físico-químicos para separar o analito de estudo dos demais e assim realizar

ensaios qualitativos e quantitativos. Para isso, a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência,

segundo a Farmacopeia Brasileira (BRASIL, 2010), vem sendo realizada como método de

referência, para quase todos os fármacos presentes em compêndios oficiais. Para o fármaco

em estudo nesta tese (Olanzapina), a sua identificação e quantificação, segundo a

Farmacopeia Americana foi feita por CLAE (USP, 2011).

2.6. Métodos de Cromatografia Líquida

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) ou do inglês High Performance

Liquid Chromatography (HPLC) é uma técnica cromatográfica amplamente utilizada que

emprega fenômenos físicos de separação pela utilização de uma fase estacionária capaz de

reter moléculas de interesse e uma fase móvel com fluxo de um líquido controlado

responsável pela eluição das moléculas para uma perfeita separação. Devido a sua

funcionalidade, CLAE tem sido utilizado em amplo campo, mas especificamente em análises

farmacêuticas. A cromatografia em fase reversa é o tipo mais comum de CLAE e é


amplamente utilizada para separar constituintes muito similares. Essa técnica geralmente

emprega colunas apolares, comumente C18 (sílica ligada a 18 átomos de carbono), com

solventes polares constituintes da fase móvel (ZHU e CHEN, 2017).

Quando se fala em análises farmacêuticas, a CLAE tem sido considerada

fundamental, uma vez que auxilia o desenvolvimento e descoberta de novos fármacos, bem

como para controlar sua qualidade (ZHU e CHEN, 2017). As exigências para as análises

farmacêuticas são elevadas, como sinais quantitativos com precisão e exatidão confiáveis,

versatilidade, poder de resolução, robustez, de fácil uso e boa compatibilidade com

detectores UV e de espectrometria de massa (PIETERS, DEJAEGHER e HEYDEN, 2010).

É possível encontrar na literatura diversos métodos cromatográficos aplicados à

análise da Olanzapina, por exemplo, na determinação simultânea de Olanzapina e

Fluoxetina em plasma humano utilizando cromatografia líquida acoplada a espectrometria

de massas (BONDE, et al., 2014) e utilização de cromatografia líquida de interação

hidrofílica (HILIC) para determinação de Olanzapina em comprimidos revestidos de 10 mg

(TUMPA, et al., 2017). Já Hendrickx e colaboradores (2017) desenvolveram método por

cromatografia líquida capilar com detector ultravioleta para detecção e análise simultânea da

Olanzapina, Clorpromazina e seus metabólitos em amostras de microdialisados cerebrais.

Métodos indicativos de estabilidade também são descritos na literatura, por exemplo, na

determinação de Olanzapina em soro por cromatografia líquida de ultra eficiência acoplada

ao detector de massas (ANDREASSEN, FALCH e SPIGSET, 2015).

No entanto, em uma escala industrial, a utilização da CLAE torna-se limitada, uma

vez que é considerado como método analítico destrutivo, ou seja, é necessário transformar

a amostra em uma solução da qual não poderá voltar ao seu formato de origem. Com isso,

as aplicações da CLAE permitem que apenas uma pequena parte de um lote industrial seja

amostrada e o resultado encontrado (doseamento, dissolução ou uniformidade), se torne

verdadeiro para o todo. Contudo, novas tecnologias de controle em processo vêm sendo

estudadas para que outras ferramentas analíticas, não destrutivas, possam auxiliar em um

controle que não seja de apenas uma fração, mas o lote completo.

Além disso, é possível notar que em todas as aplicações anteriormente citadas, o

mesmo padrão de método é criado: análises mais demoradas e de elevado custos, tanto

para realizar a análise (solventes, mão de obra especializada e geração de resíduos), bem

como para manter o equipamento.

Uma das alternativas para que esses problemas sejam, no mínimo, reduzidos vem

do conceito de Tecnologia Analítica em Processo, a qual está se tornando realidade nas

indústrias das mais diversas áreas.

O B J E T I V O S P á g i n a | 52

3. OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

Aplicação do infravermelho próximo para construção da Tecnologia Analítica em

Processo na produção da Olanzapina comprimidos revestidos.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1 Construir modelo de calibração multivariada para análise do teor da Olanzapina, por

Infravermelho Próximo, presente das misturas dos componentes da formulação de

Olanzapina comprimidos revestidos;

2 Construir cartas multivariadas dos comprimidos de Olanzapina, através do

Infravermelho Próximo, para classificar as unidades farmacêuticas que estiverem

dentro e fora dos padrões de qualidade;

3 Construir modelo de calibração multivariada para análise da umidade, por Karl

Fischer e por Infravermelho Próximo, do granulados da mistura de Olanzapina e

excipientes.

C A P Í T U L O 1 P á g i n a | 53

Capítulo 1


Capítulo 1 – DETERMINAÇÃO DO TEOR DE OLANZAPINA EM FORMAS

FARMACÊUTICAS ATRAVÉS DA TÉCNICA DO INFRAVERMELHO PRÓXIMO E

CALIBRAÇÃO MULTIVARIADA

1. INTRODUÇÃO

Antipsicóticos atípicos são um grupo de medicamentos utilizados para o tratamento

psiquiátrico (SEEMAN, 2002). Alguns antipsicóticos atípicos foram aprovados por agências

regulatórias para o tratamento de esquizofrenia, desordem bipolar, autismo e depressão. O

tratamento psiquiátrico de primeira escolha para esquizofrenia e desordem bipolar é a

medicação antipsicótica, o qual inclui a Olanzapina (CITROME, et al., 2011). Olanzapina é

um derivado da tienobenzoadizepina com atividade antipsicótica, antinauseante e

antiemética (NAVARI, 2014).

Diversos métodos analíticos têm sido descritos para a quantificação da Olanzapina

em fluidos biológicos, formulações farmacêuticas e sistemas, utilizando ferramentas tais

como Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) com ultravioleta (BOULTON,

MARKOWITZ e DEVANE, 2001; D'ARRIGO, et al., 2006) ou detecção eletroquímica

(KASPER, et al., 1999), cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa com

ionização eletrospray (LC-ESI-MS/MS) (NIROGI, et al., 2006) e espectrometria de massa

por imagem (MSI) utilizando espectrometria de massa com ionização por tempo de voo

(MALDI-TOF MS) (HAMM, et al., 2012). Embora os métodos analíticos citados indiquem a

eficácia da cromatografia líquida por possuir precisão, exatidão e reprodutibilidade dos

resultados e métodos analíticos sensíveis para a determinação da Olanzapina em vários

estudos, eles requerem elevado gasto de tempo e requerem experiência do analista ao

realizar a análise. Além disso, eles são considerados métodos destrutivos, os quais


necessitam de preparação de amostra. Por todas essas questões, a pesquisa por novas

técnicas analíticas é de fundamental importância, especialmente àquelas as quais possuem

baixo custo e são considerados rápidos.

Por outro lado, a espectroscopia no infravermelho próximo (NIR) tem se destacado

como ferramenta poderosa em aplicações na indústria farmacêutica, devido à técnica ser

rápida e não destrutiva, requer pouca ou nenhuma preparação da amostra e sua elevada

precisão. Além disso, não é necessário utilizar reagentes e nenhum resíduo químico é

gerado, em contraste com os métodos analíticos tradicionais (cromatografia líquida, por

exemplo). Hertrampf e colaboradores (2016) relatam a utilização do NIR acoplado com

modelos multivariados para analisar comprimidos contendo dois princípios ativos (bisoprolol

e hidroclorotiazida) em diferentes apresentações comerciais disponíveis. Dois excipientes

farmacêuticos (lactose monohidratada e celulose microcristalina) e um princípio ativo

(acetominofeno) foram utilizados na análise com NIR e os mínimos quadrados parciais

(PLS) por Sánchez-Paternina et al. (2016). Os alvos principais da utilização do NIR em

indústrias farmacêuticas são na análise de identificação de matérias-primas e produtos

acabados (ALVARENGA, et al., 2008), monitoramento de processos de misturas na

produção (BLANCO, BAÑÓ e BETRAN, 2002), determinação do teor do princípio ativo

(BOYER, et al., 2012), testes de dissolução (NEVES, et al., 2012), dureza (BLANCO e

ALCALÁ, 2006) e polimorfismo (BLANCO, et al., 2005).

O uso apropriado de métodos matemáticos e estatísticos (por exemplo, a

quimiometria) é amplamente responsável pelo avanço da técnica do NIR, incluindo técnicas

de calibrações multivariadas, tais como mínimos quadrados parciais (PLS) (BODSON, et al.,

2007), regressão do componente principal (PCR) (XIE e KALIVAS, 1997), rede neural

artificial (ANM) (MAKINO , et al., 2010) e a máquina de vetor de suporte por mínimos

quadrados (LS SVM) (SHAO, et al., 2012). As principais vantagens da utilização das

técnicas de calibração multivariadas listadas acima são rapidez, baixo custo e medida

analítica não destrutível (tal como o NIR). Além disso, podem ser usadas para estimar

propriedades das amostras (por exemplo, parâmetros físico-químicos de formas

farmacêuticas), as quais podem ser consideradas de elevado custo, requerem considerável

tempo e destrutiva (como o CLAE). Ainda, há a necessidade de que esses procedimentos

sejam validados, incluindo, também, a calibração multivariada para que essa seja

considerada como método de análise oficial, especialmente pela legislação farmacêutica.

No NIR, as bandas espectrais são em geral largas e normalmente sobrepostas. É

raro apresentar bandas espectrais seletivas que permitam uma correlação simples com a

concentração do analito. Por este motivo, técnicas de calibração multivariadas são

necessárias para o desenvolvimento de modelos de calibração, através de um conjunto de

treinamento, para extrair informações do analito (HOLLER, SKOOG e CROUCH, 2009).


Além disso, normalmente se recorre a pré-tratamentos espectrais, com o intuito de diminuir

a interferência de efeitos físicos, relacionados com ruído instrumental, dispersão da luz,

entre outros, os quais podem contribuir na medida do sinal e fornecer resultados enganosos

(COSTA, 2014).

Os pré-tratamentos existentes devem ser feitos antes da construção dos modelos

multivariados, a fim de reduzir ou eliminar sua interferência sobre o espectro. As cartas de

controle, por exemplo, baseiam-se unicamente na informação proveniente dos dados

espectrais, portanto, garantir que variações físicas ou instrumentais não façam parte do sinal

analítico, permitirá a construção das cartas de controle com maior eficiência no

monitoramento de variações de causas especiais (COSTA, 2014).

A seguir serão descritos alguns dos pré-tratamentos mais utilizados nas calibrações

multivariadas:

1.1 Suavização Savitzky-Golay (Smoothing) - SGS

Filtro utilizado para a remoção de ruído de alta frequência nas amostras. A

suavização SGS assume que as variáveis que estão próximas umas das outras na matriz de

dados contêm informações semelhantes e por isto, estão relacionadas umas com as outras,

de modo que se pode calcular a média em conjunto para reduzir o ruído, sem perda

significativa do sinal de interesse (WISE, et al., 2006). O algoritmo ajusta um polinômio de

dados, de intervalos em intervalos, denominados janelas, no qual será feita a suavização.

De acordo com a Equação 15:

Equação 15. Cálculo do tratamento Suavização Savitzky-Golay.

𝐗*𝒊 = 1 Σm

j=m 𝐖𝑗 𝐗𝑖+𝑗

2𝑚+1

Onde X é a matriz que se deseja tratar, X*i a matriz derivada, m o número da janela,

e Wj é um peso calculado por mínimos quadrados.

A Figura 13 corresponde à comparação de um espectro NIR sem pré-tratamento

(esquerda) em comparação com o espectro NIR com pré-tratamento através da Suavização

Savitzky-Golay, com janela de 15 pontos (direita).


Figura 13. Comparação entre espectros NIR sem tratamento (esquerda) e após Suavização

Savitzky-Golay (direita)


Deve-se tomar cuidado na escolha da janela, pois janelas pequenas podem deixar

ruídos remanescentes e janelas muito grandes, podem acarretar em perda de informações

importantes ao modelo. O ajuste adequado desse algoritmo resulta na diminuição dos ruídos

instrumentais aleatórios e o aumento da razão sinal/ruído (COSTA, 2014).

1.2 Espalhamento multiplicativo da luz (MSC)

Amplamente utilizado para a promoção da normalização do espectro, uma vez exista

variações multiplicativas entre os perfis de resposta das amostras. Normalmente causadas

por diferenças no percurso óptico das amostras ou em consequência de processos de

dispersão de luz, para compensar os efeitos de mudança de base, responsável pela

inclinação do espectro (COSTA, 2014).

Nesse pré-tratamento é feito a padronização de cada espectro, por um espectro de

referência, em geral, o espectro de referência utilizado é a média dos espectros, calculado

de acordo a Equação 16:

Equação 16. Cálculo do tratamento de Espalhamento multiplicativo da luz – Passo 1.

𝐱 𝑘 = 1 ΣNi=1 𝐱𝑖𝑘

𝑁

Em seguida são calculados por meio de uma regressão, os parâmetros 𝑎𝑖

(coeficiente linear) e 𝑏𝑖 (coeficiente angular), individualmente para cada espectro, conforme

Equação 17:



𝐱𝑖𝑘 = 𝑎𝑖 + 𝑏𝑖𝐱 𝑘 + 𝑒𝑖𝑘 (𝑖 = 1, … , 𝑁; 𝑘 = 1, … , 𝑘)

Por fim, os espectros são corrigidos, conforme a Equação 18:


𝐱𝐢k,corrigido = (𝐱𝐢k − 𝑎𝑖)⁄𝑏𝑖

Na Figura 14 é mostrado o resultado do MSC, aplicado aos mesmos dados do

espectro bruto apresentado na Figura 14 (direita). Conforme pode ser visto, o deslocamento

ao longo do eixo Y é corrigido após a aplicação do MSC.

Figura 14. Comparação entre espectros NIR sem tratamento (esquerda) e após MSC

(direita)


1.3 Derivada Savitzky-Golay

Pré-tratamento utilizado para a correção de linha de base, os quais possuem

princípio de funcionamento muito semelhante ao do SGS (NICOLAÏ, et al., 2007). É um

método que deve ser utilizado quando as variáveis são bastante correlacionadas umas com

as outras. A forma mais simples de derivação é a derivada de ordem 1 ou primeira ordem,

na qual cada variável é subtraída imediatamente pela vizinha, a qual provoca a remoção de

sinais iguais entre duas variáveis e mantém apenas a parte do sinal que é diferente entre


elas (COSTA, 2014). Este processamento enfatiza os sinais de baixa frequência (WISE, et

al., 2006).

O cálculo das derivadas funciona como uma correção da linha de base, e pode ser

entendido através de um modelo linear do tipo y = ax + b. Com a aplicação da primeira

derivada, o termo b é removido, conforme a equação:

Equação 19. Cálculo do tratamento da Derivada.

d𝑎/d𝐱 = 𝑎

Este processamento enfatiza os sinais de baixa frequência (WISE, et al., 2006).

A derivada de ordem 2 é obtida repetindo esse processo. Além de aumentar os

sinais de baixa frequência, ela também aumenta os de alta frequência, ou seja, haverá uma

tendência de aumento de ruído junto com as informações relevantes, por esse motivo, é

adequado usar este processamento em conjunto com o SGS (COSTA, 2014).

A Figura 15 é um exemplo da aplicação da derivada Savitzky-Golay de ordem 1.

Conforme pode ser observado, este pré-tratamento amplifica o sinal analítico, porém

também aumento os ruídos, o que em geral é prejudicial aos modelos de calibração,

portanto utilizar uma Suavização Savitzky-Golay previamente à derivada pode reduzir a

formação do aumento dos ruídos.

Figura 15. Comparação entre espectros NIR sem tratamento (esquerda) e após Derivada de

primeira ordem Savitzky-Golay (direita)



1.4 Escalonamento de Variáveis (Variance STD Scalling)

Em alguns conjuntos de dados é necessário que se faça o escalonamento das

variáveis, uma vez que em muitas técnicas multivariadas a magnitude do sinal analítico é

proporcional ao nível de ruído nas amostras (WISE, et al., 2006). Para isso, esse pré-

tratamento é utilizado, conforme mostrado na Figura 16, já que ele escalona as variáveis

pelo desvio-padrão, quando o ruído é esperado para ser proporcional ao desvio-padrão das

variáveis, de modo a reduzi-lo e evidenciar mais as variáveis espectrais (COSTA, 2014).

Figura 16. Comparação entre espectros NIR sem tratamento (esquerda) e após STD

(direita)


1.5 Variável Normal Padrão (Standard Normal Variate – SNV)

Tem o princípio de correlação semelhante ao MSC, porém os fatores de correção

são determinados de modo diferente. O SNV é uma normalização ponderada, o qual calcula

o desvio padrão de todas as variáveis reunidas para uma determinada amostra e em

seguida, normaliza todas elas por este valor. O ajuste multiplicativo é o desvio padrão de

todas as variáveis (WISE, et al., 2006).

Após o cálculo do vetor médio, descrito pela Equação 16, é feito o ajuste, conforme

descrito pela Equação 20:

Equação 20. Cálculo do tratamento de Variável Normal Padrão.


Onde, é o deslocamento definido pelo usuário e n o número de variáveis.

O SNV melhora a precisão de previsão, mas não simplifica o modelo e nem reduz as

interferências sistemáticas.

Na Figura 17 é mostrado o resultado obtido após a aplicação do SNV (esquerda) em

comparação ao espectro original (direita). Como pode ser visto o resultado deste pré-

tratamento é bastante similar ao do MSC e após a sua utilização as flutuações no eixo Y

diminuem consideravelmente, quando comparados aos espectros originais.

Figura 17. Comparação entre espectros NIR sem tratamento (esquerda) e após SNV

(direita)


A utilização dessas ferramentas de pré-tratamentos espectrais visam a extração

máxima de informações contidas nos dados espectroscópicos. Possuem um grande

potencial de melhorar o desempenho das cartas de controle, uma vez que auxiliam na

redução de ruídos instrumentais e elucidação das diferenças espectrais.

Validação ocorre via determinação de diversos parâmetros, conhecidos como

Figuras de Mérito (FOM) (THOMPSON, ELLISON e WOOD, 2002). De acordo com a

Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) na RDC n° 166, de 24 de julho de 2017

(ANVISA, 2017), validação de um método analítico farmacêutico é realizado seguindo os

parâmetros de: sensibilidade, seletividade, exatidão, precisão, linearidade, intervalo, limite

de detecção (LD) e quantificação (LQ) e robustez. A Farmacopeia Brasileira (BRASIL, 2010)

e a Agência Europeia Regulatória (EMEA) (EMEA/CHMP/CVMP/QWP, 2009) também

adotam os guias para validação de métodos os quais empregam espectroscopia do NIR,

utilizando ferramentas quimiométricas estabelecidas, avaliando parâmetros, tais como:

especificidade, linearidade, intervalo, exatidão, precisão e robustez.

Nesse trabalho, o objetivo foi de determinar quantitativamente o princípio ativo

Olanzapina em diferentes excipientes utilizando o NIR e calibração multivariada. Todavia, o

doseamento de Olanzapina nunca havia sido calibrada por NIR ou outra técnica rápida.


Além disso, métodos de pré-processamentos foram avaliados para determinar o método

mais adequado para analisar o tipo de dado. Finalmente, os melhores modelos foram

validados empregando-se o cálculo das FOM, tais como: seletividade, sensitividade,

sensitividade analítica, precisão, exatidão, limite de detecção e quantificação.

2. OBJETIVO

O presente capítulo tem como objetivo:

Determinar o teor de Olanzapina em formas farmacêuticas através da técnica do

Infravermelho Próximo e calibração multivariada.

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Materiais

3.1.1. Matéria-prima, solventes e outros materiais

Acetonitrila grau UV/HPLC – J.T. BAKER®

Água ultrapurificada (Milli-Q)

Ácido clorídrico P.A. – VETEC®

Ácido cítrico P.A. – VETEC®

Citrato de sódio di-hidratado P.A. – VETEC®

Metanol grau HPLC – J.T. BAKER®

Foram utilizados padrões de referência Olanzapina da United State Pharmacopeia

(USP-NF), com pureza de 99,60%, lote G0L368.

Olanzapina comprimidos revestidos 2,5 mg;

Olanzapina comprimidos revestidos 5 mg;

Olanzapina comprimidos revestidos 10 mg;

Matéria-prima (Olanzapina polimorfo II);

Excipientes (fornecidos pelo NUPLAM/UFRN e EMS Ltda.):

o Celulose microcristalina 101;


o Estearato de magnésio;


o Dióxido de silício coloidal;

o Poloxamer;

o Crospovidona;

o Lactose;

o Mistura de revestimento.

3.1.2. Equipamentos e materiais de laboratório

Agitador de Tubos – BIOMATIC® 1005;

Balança Semi-micro Analítica – METTLER®;

Banho ultra-som – UNIQUE®;

Balões volumétricos de 10, 100 mL – VIDROLABOR®;

Pipetas automáticas de volume variável EPPENDORF® Research;

Pipetas volumétricas – VIDROLABOR®;

Ponteiras descartáveis EPPENDORF® - amarelas (2-200 µL) e azuis (50 – 100 µL);

Pipetas Pasteur – 3 mL;

Seringas descartáveis (1, 3, 5 e 10 mL) – BD®;

Sistema de filtração a vácuo SARTORIUS GOETTINGEN®;

Sistema de purificação de água ultrapurificada Milli-Q – MILLIPORE®;

Unidade filtrante descartável, 0,45 µm de poro, PTFE – MILLIPORE®;

Vials de tampa rosqueada (1,5 mL de capacidade) – HITACHI®;

Provetas de 500 e 1000 mL – VIDROLABOR®;

Coluna X-Terra RP 18, totalmente porosa, partículas de 5 m com sílicas de alto

grau de pureza ligadas ao grupamento octadecilsilano (C18). Dimensões: 150 mm de

comprimento x 4.6 mm de diâmetro. Fabricante: Waters®;

Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência, modelo PROMINENCE® (Shimadzu, Japão)

constituído pelos seguintes módulos: detector de arranjo de diodos (SPD-M20A),

forno para coluna (CTO-20A), auto injetor (SIL-20A), degaseificador de fase móvel

online (DGU-20A5), sistema controlador (CBM-20A), bomba quaternária (LC-20AT) e

sistema de dados (software) LC-Solution;

Espectrofotômetro no Infravermelho Próximo (FT-NIR), modelo MPA® (Bruker,

Alemanha), equipado com esfera de integração, compartimento de amostras líquidas

e sonda. Software OPUS®.


3.2. Métodos

3.2.1. Preparo das amostras e delineamento experimental

A preparação farmacêutica estudada foi uma mistura de pó contendo Olanzapina e

os 7 excipientes (celulose microcristalina, poloxamer, lactose, estearato de magnésio,

dióxido de silício coloidal, crospovidone e mistura de revestimento).

As amostras laboratoriais e as comerciais (produtos acabados) foram pesadas,

trituradas e colocadas separadamente em vials do NIR, em proporções variáveis para

abranger um intervalo de concentração de 1 a 12,5 mg do conteúdo nominal do princípio

ativo e ± 5,0% da proporção de cada excipiente (massa total média da mistura 210 mg). As

amostras laboratoriais foram feitas pesando individualmente todos os excipientes (incluindo

a mistura de revestimento) e Olanzapina, de acordo com as suas proporções de massas na

fórmula mestre dos comprimidos. Já as amostras comerciais foram, individualmente,

pesadas, trituradas e cada uma foi inserida em vials do NIR. Após inserção foram

homogeneizadas por 5 minutos em agitador de tubos para assegurar a mesma

concentração de princípio ativo por miligrama de pó. A concentração da Olanzapina nas

amostras laboratoriais estava no intervalo de 0,0047 a 0,0595 %m/m e as comerciais de

0,0119 a 0,047 m/m. A Figura 18 representa um esquema de como as amostras foram

preparadas.

Figura 18. Esquema da preparação das amostras comerciais e laboratoriais.



O delineamento experimental foi realizado utilizando o D-Optimal Solution (EL-

HAGRASY, D'AMICO e DRENNEN III, 2006) do software Modde® (MKS Data Analytic

Solutions, Sweden) totalizando 27 experimentos, abrangendo todos os eixos e o ponto

central do espaço das misturas. O delineamento D-Optimal foi empregado para selecionar

os níveis de concentração da Olanzapina e excipientes nas amostras laboratoriais de

calibração e validação externa com o objetivo de construir o modelo multivariado. No ponto

central, todos os constituintes da mistura apresentaram seus valores nominais. A Figura 19

ilustra a razões de misturas da Olanzapina com relação aos excipientes.

Figura 19. Delineamento experimental para medidas de calibração por NIR de acordo com o

desenho D-Optimal. (a) Olanzapina - Crospovidona - Dióxido de Silício Coildal; (b)

Olanzapina - Poloxamer - Lactose; (c) Olanzapina - Mistura de revestimento - Estearato de

magnésio; (d) Olanzapina – Celulose microcristalina – Lactose; (e) Olanzapina –

Crospovidona – Poloxamer; (f) Olanzapina – Estearato de magnésio – Dióxido de Silício

Coloidal.

(a) (b) (c)

(d) (e) (f)


3.2.2. Espectroscopia no Infravermelho Próximo

Os espectros do NIR foram obtidos no modo de reflectância difusa via

espectrofotômetro FT-NIR, modelo MPA® (Bruker, Alemanha), equipado com uma esfera de

integração. Em cada amostra foram obtidos espectros, em triplicata, com uma média de 32

scans, resolução de 16 cm-1 e intervalo de comprimento de onda de 900 a 2500 nm. O


espectro de fundo foi obtido utilizando lâmina revestida de ouro. Os espectros foram obtidos

em ambiente climatizado com temperatura controlada de 22°C e umidade relativa do ar de

60%.

3.2.3. Análise Cromatográfica

3.2.3.1. Condições analíticas

Após as análises no NIR, as amostras foram levadas para o Cromatógrafo Líquido de

Alta Eficiência, modelo PROMINENCE® (Shimadzu, Japão) constituído pelos seguintes

módulos: detector de arranjo de diodos (SPD-M20A), forno para coluna (CTO-20A), auto

injetor (SIL-20A), degaseificador de fase móvel online (DGU-20A5), sistema controlador

(CBM-20A) e bomba quaternária (LC-20AT). As condições cromatográficas não puderam

fazer parte do escopo por ser segredo de indústria.

3.2.4. Procedimentos quimiométricos e Software

Todos os cálculos (modelos e pré-tratamentos) foram realizados usando o software

MATLAB versão 6.5 (The Math-Works, Natick, USA) com o PLS-Toolbox versão 6.01

(Eigenvector Research, Inc., USA). Primeiramente, o espectro NIR calculado foi

transformado em log 1/R, seguido pelo cálculo da média dos espectros (triplicata).

Diferentes pré-tratamentos, por exemplo: Suavização (Smoothing Savitzky-Golay) (SGS)

(com janela de 7 pontos) seguido da Correção de Espalhamento Multiplicativo (MSC) e

Derivada de ordem 1 Savitzky-Golay (com janela de 7 pontos) foram aplicadas nos

espectros, com o objetivo de minimizar características indesejáveis, tais como:

deslocamento espectral, ruído, linha de base e espalhamento (NEVES, et al., 2012;

MARIANI, et al., 2014).

O modelo de regressão (PLS) foi desenvolvido e validado utilizando a ampla

validação cruzada (leave-one-out full cross-validation), também chamada de RMSECV (erro

quadrático médio da validação cruzada), a qual é baseada apenas no conjunto de dados de

calibração. Essa validação é similar ao teste de previsão, uma vez que só testa previsores

em dados que não são usados para calibração, mas para a validação cruzada o

procedimento é realizado apagando sucessivamente amostras do próprio conjunto de

calibração. Primeiro, a amostra inicial é excluída do conjunto de calibração, em seguida, a

calibração é realizada com o restante das amostras. Logo após, a amostra inicial retorna e a


segunda amostra é excluída e a calibração é construída. O processo ocorre sucessivamente

após todo o n do conjunto de calibração (NAES, et al., 2004).

A estimativa de RMSECV é definida por:

Equação 21. Cálculo do RMSECV.

RMSECV =

n

yyn

i

m

j

iji

1 1

2

,ˆˆ

Para evitar sobreposição, o conjunto de dados utilizados para calibração foi

constituído de 75% e 25% dos espectros de amostras laboratoriais e comerciais,

respectivamente. Já para o conjunto de dados utilizados para validação continha 25% e 75%

dos espectros de amostras laboratoriais e comerciais, respectivamente. A escolha dos

espectros foi feito através do algoritmo clássico de Kennard-Stone (KS) (KENNARD e

STONE, 1969). Os seguintes parâmetros de qualidade foram utilizados para avaliar o

modelo de calibração, respectivamente: RMSEC (erro quadrático médio da calibração),

RMSEP (erro quadrático médio da previsão), coeficiente de correção para cada modelo:

calibração (rc) e predição (rp). O teste estatístico (EJCR – Elliptical Joint Confidence Region)

foi calculado para avaliar a inclinação, o intercepto da regressão de referência e para

predizer valores no intervalo de confiança de 95%.

Finalmente, validar um método analítico implica em determinar se é amplamente feito

para o seu propósito. Para isso, algumas figuras de mérito (EURACHEM AND CITAC-

WORK-GROUP, 2002; ICH, 1995; ICH, 1997) foram determinadas, tais como:

Sensibilidade: é definida como razão de sinal responsável pelo acréscimo de uma

unidade de concentração da propriedade de interesse;

Seletividade: é a medida do grau de sobreposição entre o sinal da espécie de

interesse e os interferentes presentes na amostra e indica a parte do sinal que é

perdida por essa sobreposição;

Sensibilidade analítica: é definida como a razão entre a sensibilidade e uma

estimativa do desvio padrão para a flutuação do sinal analítico;

Precisão: grau de aproximação entre uma série de medidas de uma mesma amostra

dentro de determinadas condições;

Teste para o erro sistemático “bias”: é definido como a diferença entre a média

populacional e o seu valor verdadeiro;

Exatidão: expressa o grau de concordância entre o valor estimado ou medido e o

valor tido como verdadeiro ou de referência, geralmente expresso como o RMSEP;


Limite de Detecção (LD): valor mínimo detectável do sinal – ou concentração – o

qual a probabilidade do falso negativo (β) e o falso positivo (α) são 0,05;

Limite de quantificação (LQ): sinal ou concentração do analito que produz

estimativas com desvio padrão relativo dentro do especificado.

As qualidades métricas (BRAGA e POPPI, 2004) utilizadas no estudo para a

avaliação das figuras de mérito podem ser calculadas através das seguintes equações:

Equação 22. Cálculo da Sensibilidade.

Sensibilidade = i

nas

kAnas

jky

xS

,

,

ˆ

Equação 23. Cálculo da Seletividade.

Seletividade = unk

unk

unkx

sanLES

,

,

,

ˆˆ

Equação 24. Cálculo da Sensibilidade Analítica.

Sensibilidade Analítica = x

NES

ˆ

Equação 25. Cálculo da Precisão.

Precisão =

)1(

ˆˆ1 1

2

,

mn

yyn

i

m

j

iji

Equação 26. Cálculo da Exatidão.

Exatidão = RMSEP =

n

yyn

i

ii

1

2ˆ


Equação 27. Cálculo do LD.

LD = NES

xbx k ˆ

133

Equação 28. Cálculo do LQ.

LQ = NES

xbx k ˆ

11010

Onde o vetor de sensibilidade nas

kS deve ser o mesmo para todas as amostras de

calibração, nas

kAX ,ˆ

é o vetor para o sinal analítico puro para o analito k e yi é o valor de

referência da amostra i. unkx , é uma norma Euclidiana do vetor original da resposta

instrumental. x é uma estimativa do ruído, calculado com o desvio padrão de 15 amostras

“branco”. n é o número de amostras e m é o número de replicatas.

Na Figura 20 foi demonstrado como o modelo foi construído para posterior validação

com as Figuras de Mérito, conforme descrito acima.


Figura 20. Esquema de construção do modelo de calibração multivariado e análise dos

dados


4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

O objetivo desse trabalho foi desenvolver uma metodologia para determinar o principio

ativo Olanzapina em uma mistura de sete excipientes (lactose, celulose microcristalina,

poloxamer, crospovidona, dióxido de silício coloidal, estearato de magnésio e mistura de

revestimento) em amostras laboratoriais usando um método simples, rápido e não-

destrutivo. Os espectros de NIR puros (27 amostras laboratoriais e 18 amostras comerciais)

apresentaram o desvio da linha de base e sobreposição de pico como os principais efeitos

de variações. Os espectros das preparações farmacêuticas foram bastante similares aos

espectros os quais continham apenas os excipientes, provando a consistência da baixa

influência da Olanzapina, principalmente devido a sua baixa concentração na formulação.


São apresentados, na Figura 21, os espectros puros de todas as amostras

(esquerda). Nela é possível notar a elevada semelhança entre cada grupo de amostras,

tornando o método com elevado grau de dificuldade para calibração univariada,

necessitando, assim, da realização de um pré-tratamento conforme pode ser verificado na

mesma Figura 21 (direita). Os melhores modelos obtidos durante a etapa de pré-tratamento

foram Suavização (Smoothing Savitzky-Golay – com janela de 7 pontos), MSC e Derivada

de primeira ordem Savitzky-Golay – também com janela de 7 pontos), conforme pode ser

observado na Tabela 2. A Figura 22 compara o grupo de amostras em preto e o espectro

NIR da Olanzapina (de cor vermelho) também tratado, com isso é possível verificar em

qual(ais) região(ões) o principio ativo mais influencia nos espectros das amostras.

Figura 21. Comparação dos espectros NIR puros das 27 amostras laboratoriais e 18 amostras

comerciais (figura esquerda), com os espectros tratados com suavização SGS (janela de 7

pontos), MSC e Derivada de primeira ordem Savitsky-Golay (janela de 7 pontos) (figura direita).


Figura 22. Espectros NIR das 27 amostras laboratoriais e 18 comerciais (linhas pretas) e

matéria-prima Olanzapina (linha vermelha) após o pré-tratamento (Suavização, MSC e

Derivada de primeira ordem).



Para testar o melhor pré-tratamento ou conjunto de pré-tratamentos, foram utilizados

três modelos de regressões: MLR, PCR e PLS. A Tabela 2 apresenta os resultados de

alguns dos valores encontrados para RMSEC, R²Cal, RMSECV, RMSEP e R²Pred.

Tabela 2. Avaliação dos pré-tratamentos testados por MLR, PCR e PLS.

Modelo de Regressão

Pré-tratamentos RMSEC r²cal RMSECV RMSEP r²Pred

MLR

7S-MSC-7D 1,2E-15 1 3,5E-03 8,2E-03 0,75

Baseline-7S-MSC-7D 1,4E-15 1 3,5E-03 7,0E-03 0,84

Baseline-7S-STD 3,8E-16 1 8,1E-03 4,3E-02 0,005

Baseline-MC-7S-7D 2,9E-02 1 2,9E-02 2,6E-02 0,82

PCR

7S-MSC-7D 1,2E-02 0,31 1,4E-02 1,3E-02 0,15

Baseline-7S-MSC-7D 1,1E-02 0,44 1,2E-02 1,3E-02 0,16

Baseline-7S-STD 6,5E-03 0,8 7,3E-03 7,1E-03 0,78

Baseline-MC-7S-7D 3,1E-02 0,56 3,1E-02 3,2E-02 0,23

PLS

7S-MSC-7D 3,2E-03 0,95 4,4E-03 4,1E-03 0,93

Baseline-7S-MSC-7D 3,2E-03 0,95 4,4E-03 4,0E-03 0,93

Baseline-7S-STD 3,3E-03 0,95 6,9E-03 5,9E-03 0,81

Baseline-MC-7S-7D 2,9E-02 0,95 2,9E-02 3,0E-02 0,93

Legenda: 7S – Suavização com janela de 7 pontos; MSC – espalhamento multiplicativo da luz; 7D – derivada de

primeira ordem Savistzky-Golay com janela de 7 pontos; Baseline – correção da linha de base; MC – média

centrada; STD – variável normal padrão.

Dentre os valores obtidos, foi escolhido o modelo de regressão por PLS utilizando

Suavização (Smoothing Savitzky-Golay – com janela de 7 pontos), MSC e Derivada de

primeira ordem Savitzky-Golay – também com janela de 7 pontos). A presença de um

quantitativo maior de variáveis do que amostras desfavoreceu o modelo de regressão por

MLR, favorecendo ao aparecimento da colinearidade. Os valores observados pela regressão

por PCR também não foram satisfatórios, tal fato pode estar ligado à necessidade do

modelo de informar os valores de y para uma melhor correlação. Desse modo, com a

posterior aplicação por PLS, a resposta do método tornou-se mais eficaz, portanto, tornou-

se o método de regressão escolhido para o método.

O modelo de regressão por PLS foi desenvolvido para o princípio ativo, validado

utilizando a ferramenta de ampla validação cruzada “leave-one-out” e o número ideal de

fatores de PLS escolhido como o mínimo no gráfico de variância residual versos o número

de fatores. O mínimo quadrado parcial, em inglês “Partial Least Square - PLS” é um método

matemático que é capaz de descrever a covariância entre dados espectrais NIR

multidimensionais e a variável resposta através do pequeno número de variáveis latentes ou

fatores de PLS. No método, foram necessárias seis variáveis latentes para descrever 99%

da variância no espectro. O modelo de calibração apresentou baixo RMSEC (3,2 x 10-3


%m/m), RMSEP (4,0 x 10-3 %m/m) e elevado coeficiente de regressão para calibração (rc =

0,95) e previsão (rp = 0,93). A Figura 23 apresenta a relação entre os valores previstos e de

referência das amostras laboratoriais no grupo de calibração e de validação, correspondente

a faixa de trabalho da Olanzapina de 1 a 12,5 mg na mistura de pós.

Figura 23. Relação entre concentração prevista e a de referência para amostras de

calibração e validação, através do modelo de PLS para Olanzapina. (●) grupo de calibração;

(●) grupo de validação.


A diagonal preta representa o resultado ideal, ou seja, quanto mais próximo os

pontos estiverem da diagonal, melhor é o ajuste do modelo. É possível verificar que todas as

concentrações calculadas, de ambos os grupos (calibração e validação), foram próximos

aos valores reais.

A fim de obter mais informações acerca da precisão do método, uma análise de

regressão linear versus os valores de concentração encontrados foi realizada. O intercepto

estimado e a inclinação foram comparados com os valores ideais de 0 e 1 utilizando o teste

de EJCR. Os cálculos de EJCR são um meio conveniente para determinar se existem viés

na determinação de ambos os parâmetros quando se utiliza o modelo PLS. Como pode ser

visto na Figura 24, o ponto (a = 0, b = 1) apresentou-se dentro do elipse do EJCR, portanto

pode-se concluir que erros constantes e proporcionais estão ausentes.


Figura 24. Teste EJCR para o intercepto e a inclinação da regressão da concentração de

Olanzapina prevista versus a de referência utilizando uma validação externa pelo modelo

PLS.


Baseado na análise comparativa descrita anteriormente, o modelo PLS com os pré-

tratamentos espectrais suavização, MSC e derivada na primeira ordem foram aplicados para

predizer a Olanzapina em 12 amostras desconhecidas (amostras laboratoriai, n = 1-6;

amostras comerciais, n= 7-12) após aplicação de mesmo pré-tratamento utilizado no grupo

de dados de calibração, as quais podem verificadas na Tabela 3.

Tabela 3. Comparação dos resultados de amostras comerciais por NIR e por HPLC.

Amostras Concentração (%m/m)

Previsão (NIR) Referência (HPLC)

1

Laboratoriais

0,034 0,033

2 0,044 0,047

3 0,036 0,045

4 0,054 0,060

5 0,042 0,043

6 0,013 0,012

7

Comerciais

0,028 0,023

8 0,021 0,023

9 0,023 0,023

10 0,025 0,023

11 0,023 0,024

12 0,022 0,024


Para comparar os métodos, convencional (CLAE) e alternativo (NIR – PLS), o Teste-t

pareado foi aplicado. Nesse teste foi possível verificar que não houve nenhuma diferença

estatística entre os dois métodos, no nível de confiança de 95% (p = 0,08 e t = 1,06). A

repetibilidade do método cromatográfico foi avaliada, como requerido pela ANVISA

(BRASIL, 2003) para assegurar que as análises apresentavam consistência nos resultados.

Foram injetadas no cromatógrafo 6 replicatas de uma amostra de Olanzapina, no nível de

100% da concentração nominal de trabalho. O resultado encontrado mostrou desvio padrão

relativo (DPR) de 0,042% (recomendado é que seja menor do que 2,0%), demonstrando

assim que o método cromatográfico é preciso.

Novos métodos analíticos devem ser validados antes de serem utilizados na indústria

farmacêutica. O método NIR proposto foi validado de acordo com o guia ICH (1997)

avaliando a seletividade, sensibilidade, sensibilidade analítica, precisão, exatidão e limites

de detecção e quantificação. A Tabela 4 apresenta as figuras de mérito (FOM) avaliadas

para o método otimizado. Os valores de exatidão, representados por RMSEC e RMSEP

indicaram que os valores do modelo multivariado estimado exibiram concordância aceitável

ao método de referência. A precisão, em nível de repetibilidade, foi avaliada pela análise de

5 amostras (10 replicatas por amostra), no mesmo dia, obtendo assim o DPR no valor de

4,02%. A veracidade foi estimada pelo parâmetro de erro absoluto, utilizando o valor de

RMSEP de 4,0 x 10-3 %m/m. A veracidade e a precisão corroboraram que o método pode

ser considerado exato. Para a exatidão e os estudos de linearidade, o intervalo de trabalho

analítico foi definido de 1,0 a 12,5% de Olanzapina, para que o método fosse capaz de

analisar as três formulações disponíveis (2,5, 5 e 10 mg). Os parâmetros de sensibilidade e

seletividade avaliados apresentaram resultados aceitáveis, dentro do intervalo analítico do

modelo e os resultados de LD e LQ estimados puderam ser otimistas.

Tabela 4. Figura de Mérito (FOM) do melhor modelo PLS: Olanzapina em m/m.

FOM Conteúdo de Olanzapina (%m/m)

RMSEC 3,2 x 10-3

RMSECV 4,4 x 10-3

RMSEP 4,0 x 10-3

Bias -1,87 x 10-6

cr 0,95

pr 0,93

Inclinação 0,952

Intercepto 0,0014

Precisão 4,02


Sensibilidade 0,1834

Seletividade 1,7988 x 10-4

LD 0,000619

LQ 0,002

RMSEC: erro quadrático médio da calibração; RMSECV: erro quadrático médio da validação

cruzada; RMSEP: erro quadrático médio da previsão; rc: coeficiente de correlação da

calibração; rp: coeficiente de correlação da previsão; LD: Limite de detecção; LQ: Limite de

quantificação

5. CONCLUSÃO DO CAPÍTULO 1

O método por NIR foi desenvolvido, o qual permitiu a determinação com precisão e

exatidão da Olanzapina em amostras laboratoriais e em produtos comerciais com o mínimo

de tratamento na amostra. De acordo com os resultados, a regressão multivariada por PLS

foi um método promissor que pôde ser usado em conjunto com etapas de pré-tratamentos,

os quais foram realizados previamente nos espectros, para assegurar que o modelo

quantitativo seja construído de forma eficaz e com resultados consistentes. O método NIR,

quando comparado ao método convencional (CLAE), não apresentou diferença estatística,

com intervalo de confiança de 95%. Os valores de exatidão, precisão e demais figuras de

méritos exibiram resultados promissores, indicando que o método desenvolvido por NIR

para a Olanzapina pode ser usado como metodologia alternativa para os propósitos

farmacêuticos.


Capítulo 2


Capítulo 2 – CONSTRUÇÃO DE CARTAS CONTROLES PARA MONITORAMENTO DA

QUALIDADE DE OLANZAPINA COMPRIMIDOS REVESTIDOS UTILIZANDO COMO

FERRAMENTA ANALÍTICA A ESPECTROSCOPIA NO INFRAVERMELHO PRÓXIMO:

PRIMEIRA ETAPA PARA CONSTRUÇÃO DA TECNOLOGIA ANALÍTICA EM PROCESSO

1. INTRODUÇÃO

A aprovação e liberação de medicamentos para os usuários requer que o produto

final apresente qualidade dentro de especificações rigorosas, por isso uma vasta quantidade

de testes são realizados para comprovar que a sua qualidade está assegurada. Isso faz com

o processo se torne muito importante, em termos de qualidade, segurança e eficácia

farmacêutica (HETRAMPF, et al., 2015). A espectroscopia no infravermelho próximo é uma

técnica analítica que tem sido cada vez mais empregada para o desenvolvimento de

métodos qualitativos e quantitativos na indústria farmacêutica, além disso, já tem obtido

excelentes resultados em testes tais como: dureza (BLANCO e ALCALÁ, 2006),

homogeneidade (DUONG, et al., 2003), tamanho de partículas (OTUSKA, 2004),

caracterização polimórfica (LI, et al., 2005), testes de dissolução (NEVES, et al., 2012) e

determinação de composição química em comprimidos (TRAFFORD, et al., 1999).

Convencionalmente, medicamentos são produzidos em processos de lote a lote, os quais

são analisados fora da linha de produção com amostras coletadas aleatoriamente para

avaliar a qualidade e eficácia do processo. Estes testes, por exemplo, doseamento, dureza,


desintegração, dissolução são considerados demorados, uma vez que requerem

determinado tempo para preparar a amostra e na realização da análise, e são menos

eficientes. Entretanto, análises em linha de produção agora vêm sendo possíveis de se

realizar, fornecendo um escopo significante de como o lote está sendo processado e

controlado (DE BEER, et al., 2011).

A agência regulatória dos Estados Unidos – Food and Drug Administration (FDA) –

introduziu o conceito de qualidade pelo desenho (Quality by Design – QbD) e o guia de

tecnologia analítica em processo (Process Analytical Technology – PAT) (U.S. FOOD AND

DRUG ADMINISTRATION, 2004) para desenvolver inovações em sistemas de produção

que melhorarão a eficiência e garantia da qualidade (KRISTÓ, et al., 2016). Dentre as

medidas propostas nessa abordagem, destacam-se o processamento contínuo, a medição e

a detecção on-line, o controle de qualidade em tempo real e ferramentas de controle de

processos com os objetivos de reduzir os custos operacionais, melhorar/acelerar a liberação

dos produtos no mercado, reduzir variabilidade e aumentar a flexibilidade, eficiência e

qualidade do produto (IÇTEN, NAGY e REKLAITIS, 2015).

Uma das ferramentas amplamente utilizadas em controle de processos são as cartas

de controles multivariadas (MACGREGOR e KOURTL, 1995). São gráficos estatísticos para

monitorar o que está dentro ou fora (acima ou abaixo) dos limites de controle previamente

determinados com amostras de controle, as quais são conhecidas como amostras de

condições operacionais normais (em inglês, Normal Operating Conditions – NOC)

(CAMBRON, et al., 2016). Diversas cartas de controle multivariadas aplicadas na indústria

farmacêutica têm sido propostas baseadas na Análise do Componente Principal (Principal

Component Analysis – PCA) (CLAVAUD, et al., 2013), Mínimos Quadrados Parciais (Partial

Least Squares – PLS) (KOURTI, NOMIKOS e MACGREGOR, 1995), Somatório Cumulativo

Multivariado (Multivariate Cummulative Sum – MCUSUM) (BODNAR e SCHMID, 2011),

Média Móvel Ponderada Exponencial Multivariada (Multivariate Exponential Weighted

Moving Average – MEWMA) (ZOU, TSUNG e WANG, 2007) e no Sinal Analítico Líquido

(Net Analyte Signal – NAS) (SKIBSED, et al., 2005).

Cartas de controles baseadas no NAS aplicadas em formulações farmacêuticas têm

sido propostas para avaliar o monitoramento da qualidade. Rocha et al. (2010) estudaram

cartas de controle multivariadas baseadas no NAS em associação com o NIR para monitorar

a qualidade de formulações contendo o princípio ativo Nimesulida. Outra aplicação por

Rocha & Poppi (2010) foi a construção de cartas de controles multivariadas baseadas no

NAS, também em associação com NIR para avaliar a caracterização polimórfica de

amostras de Piroxicam. Costa et al. (2015) também estudou cartas de controle multivariadas

baseadas no NAS, em associação com o NIR para monitorar Isoniazida e Rifampicina em

formas farmacêuticas cápsulas. Todos esses estudos provaram que cartas de controle


multivariadas baseadas no NAS foram aplicadas com sucesso na indústria farmacêutica

com muitas aplicações.

Com o uso do NAS é possível calcular um valor escalar livre de interferentes a partir

do vetor sinal analítico, o que torna possível a construção de uma nova forma de calibração,

em que o modelo multivariado pode ser representado em uma forma pseudo-univariada,

conforme Figura 25.

Figura 25. Representação geométrica da decomposição do sinal analítico.

Fonte: ROCHA, 2007.

As cartas são construídas da seguinte forma: uma linha central, um par de limites

de controle, um dos quais se localiza abaixo e outro acima da linha central, e os valores

característicos marcados no gráfico que representam o estado do processo.

Esses valores limites são identificados como: Limite Superior de Controle (LSC),

que é determinado por três desvios padrões acrescido da média; e o Limite Inferior de

Controle (LIC) que é o valor de três desvios padrões decrescido da média. A Figura 26

representa num mesmo gráfico, o mesmo processo em controle e fora de controle.


Figura 26. Representação gráfica de processos sob controle e fora de controle.

Fonte: LIMA, 2006.

Para o entendimento da construção das cartas multivariadas temos:

O NAS: trata-se do fármaco;

Interferentes: referem-se ao placebo, ou seja, medicamento sem o fármaco,

somente com os excipientes presentes;

Resíduo: trata-se de qualquer adulterante contido na amostra, exemplo: adição

proposital de uma substância, degradação das matérias-primas, a presença de

umidade ou de qualquer outro parâmetro.

O monitoramento simultâneo do NAS, interferentes e resíduos, é a grande

vantagem do método. As amostras que possuírem seus valores de NAS, interferentes e

resíduos dentro dos limites estabelecidos pelas amostras em controle são consideradas

dentro de controle. Entretanto, qualquer amostra que possuir pelo menos um valor fora do

limite de qualquer um dos três parâmetros ou apresentarem uma disposição atípica, o

processo é julgado fora de controle (COSTA, 2014).

Portanto, na produção de medicamentos a carta de controle é apresentada como

um auxílio na aplicada do PAT, pois fornece uma linguagem comum para a análise do

desempenho do processo, separando causas especiais de variação comuns. Assim o

processo é ajustado para um tipo de produção previsível, com qualidade e custos

adequados, não deixando que a situação de possibilidade de ocorrência de não

conformidade perdure e acabe com uma possível reprovação do lote final da produção.

Obtendo-se assim, como resultado, medicamentos de melhor qualidade, de menor custo e

aumento da capacidade de produção.


No capítulo 2 dessa tese, foi desenvolvida uma estratégia quimiométrica baseada em

PLS, utilizando a espectroscopia no infravermelho próximo para medir o doseamento de

Olanzapina em formas farmacêuticas (mistura de pós), produzidas pelo NUPLAM/UFRN em

associação com a EMS Ltda., em busca de iniciar um estudo para inclusão do PAT. Como

forma de avanço tecnológico, o uso de ferramentas analíticas multicomponentes baseadas

no NIR pode melhorar, consideravelmente, o controle analítico no processo de produção,

uma vez que o processo garantirá que cada comprimido produzido seja analisado. Com

isso, o novo método destina-se a construir um controle de processo de monitoramento para

melhorar a qualidade das formulações farmacêuticas produzidas pelo NUPLAM/UFRN.

2. OBJETIVO


Construir e validar cartas de controle multivariadas baseadas no NAS para

monitoramento da qualidade, utilizado o NIR, de formas farmacêuticas contendo

Olanzapina, produzidas pelo NUPLAM/UFRN, em parceria com a EMS Ltda.


3.1. Materiais


Acetonitrila grau UV/HPLC – J.T. BAKER®


Ácido clorídrico P.A. – VETEC®

Ácido cítrico P.A. – VETEC®

Citrato de sódio di-hidratado P.A. – VETEC®

Metanol grau HPLC – J.T. BAKER®

Foram utilizados padrões de referência Olanzapina da United State Pharmacopoeia

(USP-NF), com pureza de 99,60%, lote G0L368.

Olanzapina comprimidos revestidos 10 mg (triturados);








o Poloxamer;

o Crospovidona;

o Lactose;

o Mistura de revestimento.


Agitador de Tubos – BIOMATIC® 1005;


Banho ultra-som – UNIQUE®;

Balões volumétricos de 10, 100 mL – VIDROLABOR®;

Pipetas automáticas de volume variável EPPENDORF® Research;

Pipetas volumétricas – VIDROLABOR®;

Ponteiras descartáveis EPPENDORF® - amarelas (2-200 µL) e azuis (50 – 100 µL);

Pipetas Pasteur – 3 mL;

Seringas descartáveis (1, 3, 5 e 10 mL) – BD®;

Sistema de filtração a vácuo SARTORIUS GOETTINGEN®;

Sistema de purificação de água ultrapurificada Milli-Q – MILLIPORE®;

Unidade filtrante descartável, 0,45 µm de poro, PTFE – MILLIPORE®;

Vials de tampa rosqueada (1,5 mL de capacidade) – HITACHI®;

Provetas de 500 e 1000 mL – VIDROLABOR®;

Coluna X-Terra RP 18, totalmente porosa, partículas de 5 m com sílicas de alto

grau de pureza ligadas ao grupamento octadecilsilano (C18). Dimensões: 150 mm de

comprimento x 4.6 mm de diâmetro. Fabricante: Waters®;

Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência, modelo CHROMASTER® (HITACHI, Japão)

constituído pelos seguintes módulos: detector de arranjo de diodos (5430), forno

para coluna (5310), auto injetor (5260), bomba quaternária (5160) e sistema de

dados (software) EzChrom®;



e sonda. Software OPUS®.

Estufa de ar circulante, modelo Q317B42 (Quimis®, Brasil).


3.2. Métodos


As misturas ternárias (Olanzapina, excipiente com maior proporção e mistura dos

demais excipientes) foram selecionadas utilizando o D-Optimal Solution do software

Modde® (MKS Data Analytic Solutions, Sweden) totalizando 75 experimentos, dos quais 35

correspondem a variação de ± 10% m/m do conteúdo nominal do princípio ativo,

abrangendo todos os eixos e o ponto central do espaço das misturas ternárias e, 40

correspondente a variação superior a ± 10% m/m do conteúdo nominal do princípio ativo.

Esses experimentos do delineamento representaram uma ampla combinação possível dos

componentes, e 15 amostras “branco”, contendo apenas o placebo. As amostras

laboratoriais foram pesadas, cada uma contendo uma média de 420 mg de mistura de

componentes, em balança semicroanalítica, com exatidão de 0,0001 g, transferidas para os

vials do NIR (capacidade de 50 mL) e homogeneizadas em agitador de tubo por 3 min. As

amostras de produção (Olanzapina comprimidos revestidos, 10 mg, peso médio de 420 mg)

foram obtidas do NUPLAM/UFRN em parceria com a EMS Ltda. Todas as amostras foram

trituradas, e homogeneizadas como descrito para as amostras laboratoriais e conforme

representado na Figura 27.

Figura 27. Esquema da preparação das amostras comerciais e laboratoriais “dentro do controle”.



O quantitativo de amostras de produção “dentro do controle” totalizaram em 35

unidades (variação de ± 10% m/m do conteúdo nominal do princípio ativo), todas

provenientes de um mesmo lote de produção. Já as amostras da produção “fora de

controle”, totalizaram 40 unidades (variação superior a ± 10% m/m do conteúdo nominal do

princípio ativo e dos demais excipientes, ou seja, se encaixariam fora do intervalo

farmacopeico permitido, 90 a 110% do conteúdo de Olanzapina) também foram obtidas do

mesmo lote, entretanto, as amostras “fora de controle” foram condicionadas, em sua

embalagem primária (blister), em estufa de circulação de ar, durante 1 dia, na temperatura

de 60°C, conforme Figura 28.

Figura 28. Esquema da preparação das amostras comerciais e laboratoriais “fora do

controle”.


Previamente foi realizado o doseamento da matéria-prima Olanzapina, pelo método

de referência (cromatografia líquida) que seria utilizada para a produção das amostras

laboratoriais. O seu conteúdo correspondeu a 96,21% m/m. Dessa forma, todas as amostras


do delineamento (“dentro do controle” e “fora do controle”) foram corrigidas para 100% m/m

para que pudessem permanecer dentro do intervalo especificado.


Os espectros do NIR foram coletados no modo de reflectância difusa via

espectrofotômetro FT-NIR, modelo MPA® (Bruker, Alemanha), equipado com a sonda de

fibra sólida IN 261@2m. Em cada amostra foram obtidos espectros, em triplicata, com uma

média de 32 scans, resolução de 32 cm-1 e intervalo de comprimento de onda de 800 a 2500

nm. O espectro de fundo foi obtido utilizando Spectralon®. Os espectros foram obtidos em

ambiente climatizado com temperatura controlada de 22°C e umidade relativa do ar de 60%.

A sonda foi posicionada na superfície da amostra (com distância menor do que 1 cm e no

ângulo de 90° em relação à superfície) e limpa com papel macio após cada amostra.

3.2.3. Análise Cromatográfica

3.2.3.1. Condições analíticas

Após as análises no NIR, as amostras foram levadas para o Cromatógrafo Líquido de

Alta Eficiência, modelo CHROMASTER® (HITACHI, Japão) constituído pelos seguintes

módulos: detector de arranjo de diodos (5430), forno para coluna (5310), auto injetor (5260)

e bomba quaternária (5160). As condições cromatográficas não puderam fazer parte do

escopo por ser segredo de indústria.

3.3. Cartas de Controle multivariadas

3.3.1. Sinal Analítico Líquido (NAS)

Os dados foram aleatoriamente subdivididos em 3 grupos [Calibração (CAL),

Validação (Val) e Previsão (Pred)]. Os dados de Cal continham 40 espectros NIR, sendo: 20

amostras do delineamento “dentro do controle” e 20 amostras de produção também “dentro

do controle”. Os dados de Pred continham 50 espectros NIR, consistindo de: referente ao

delineamento 5 amostras “dentro do controle” e 20 “fora do controle”, referente as amostras

de produção 5 amostras “dentro do controle” e 15 “fora do controle”, além de 5 amostras do

branco. Os dados de Val apresentaram o mesmo quantitativo de amostras distribuídas para

o grupo Pred. Para o desenvolvimento da carta de controle baseada no NAS, um quarto


grupo de dados foi criado, o NAS, o qual continha 5 amostras do branco, 5 “dentro do

controle” pertencente ao delineamento e 5 “dentro do controle” pertencente às amostras da

produção. Com esse quarto grupo, foi possível definir o espaço dos interferentes e obter o

vetor NAS.

É apresentado, ver Tabela 5, um resumo das amostras que foram utilizadas para

construir e validar as cartas de controle baseadas no NAS.

Tabela 5. Resumo das amostras utilizadas para a construção da carta de controle baseada

no NAS.

Grupo de Amostras

Componentes Descrição (amostra e ordem) Usado para

Cal 40 “dentro do controle” DoE (1-20)

Prod. (21-40) Calibração

Val 10 “dentro do controle” 40 “fora de controle”

DoE “dentro do controle” (1-5)

Prod. “dentro do controle” (6-10)

DoE “fora de controle” (11-30)

Prod. “fora de controle” (31-45)

Branco (46-50)

Validação

Pred 10 “dentro do controle” 40 “fora de controle”

DoE “dentro do controle” (1-5)

Prod. “dentro do controle” (6-10)

DoE “fora de controle” (11-30)

Prod. “fora de controle” (31-45)

Branco (46-50)

Previsão

NAS 10 “dentro do controle” 5 placebo

DoE (1-5)

Prod. (6-10)

15 placebos (11-25)

Construção do espaço de

interferentes e obtenção do vetor NAS

Legenda: Doe = Amostras do delineamento; Prod. = Amostras da produção.

Os espectros foram importados para o MATLAB® versão 8.0 (Math-Works, Natick,

USA), pré-tratados e a carta de controle multivariada foi gerada utilizando rotinas

desenvolvidas no laboratório. Diferentes pré-tratamentos foram utilizados, incluindo:

correção do espalhamento multiplicativo (MSC), escalonamento de variância, derivada na

primeira ordem Savitzky-Golay e Suavização (SGS) (ambas com janelas de 3, 7, 9, 11 e

pontos), com o intuito de minimizar características indesejáveis tais como deslocamento

espectral, ruído, problemas na linha de base e espalhamento de sinal (MARIANI, et al.,

2014).

Após a inserção dos pré-tratamentos, a rotina para a construção das cartas de

controle baseadas no NAS foram inseridas no MATLAB (conforme Figura 29) seguindo o

passo-a-passo:


1. Criação do vetor NAS através do PCA do grupo das amostras de placebo e grupo

NOC (amostras exclusivamente dentro do controle);

2. Construção da carta NAS, com amostras dentro e fora do controle, bem como a

delimitação dos limites inferiores e superiores com ± 2 vezes o desvio padrão do

vetor NAS;

3. Construção da carta dos interferentes com a inserção do limite máximo permitido;

4. Construção da carta dos resíduos com a inserção do limite máximo permitido.


Figura 29. Esquema da construção das cartas de controle NAS, Interferentes e resíduos




As cartas de controles construídas com todo o intervalo de espectro medido (800 a

2500 nm) apresentaram baixo percentual de sucesso para quase todos os pré-tratamentos

utilizados, quando comparado com os resultados obtidos pelo método de referência (CLAE).

Provavelmente, devido ao fato da baixa concentração da Olanzapina na formulação, e que

as absorvâncias dos demais constituintes sobrepõem o sinal do analito. Por esta razão, foi

realizada uma seleção de variáveis para encontrar o intervalo que melhorasse a

classificação. Analisando os espectros da Olanzapina, placebos, amostras laboratoriais e de

produção foi possível observar que existia, entre 1114 a 1410 nm, uma forte influência da

absorvância da Olanzapina, como pode ser visualizado na Figura 30.

Figura 30. Espectros puros de NIR de todas as amostras, n=106.



O espectro é altamente sobreposto e com apenas uma inspeção visual é impossível

identificar o ativo e os excipientes ou para distinguir as características similares entre eles

(“dentro de controle” e “fora de controle”). Dentre os pré-tratamentos utilizados, a derivada

em primeira ordem Savitzky-Golay (com janela de 15 pontos) foi capaz de maximizar as

variações espectrais no intervalo de 1300 a 1370 nm, conforme pode ser observado nas

Figuras 31 e 32.

Figura 31. Espectros de NIR pré-tratados da Olanzapina (azul), placebo (verde), amostras

laboratoriais (vermelho), amostras de produção (azul claro).



Figura 32. Espectros pré-tratados de NIR de todas as amostras, n = 106.


Utilizando o grupo NAS, foi aplicado um PCA com (3 componentes), o qual

apresentou 99,96% de variância, nas amostras que só continham os excipientes (branco ou

placebo) para construir o espaço de interferentes e plotar as amostras NOC dentro desse

espaço. Dessa forma, o vetor de regressão NAS foi obtido e a decomposição de cada

espectro foi realizada. A carta NAS foi construída com a obtenção dos limites de

concentração superior e inferior da Olanzapina, calculado pela média ± o desvio padrão do

grupo de Calibração, os quais possuíam variação de ± 10% da concentração nominal da

Olanzapina. O limite de confiança para a carta dos interferentes foi obtido de acordo com d-

statistics, o qual apresentou o valor de 7.92 e Q-statistics (valor de 2,01 x 10-6) foi utilizada

para a carta dos resíduos, considerando o intervalo de confiança de 95%.

A validação da carta de Olanzapina foi desenvolvida após a construção das três

cartas (NAS, interferentes e resíduos). Para validar a carta NAS foram utilizadas 50

amostras (grupo Pred) obtidas de amostras laboratoriais e da produção (10 “dentro de

controle” e 40 “fora de controle”, respectivamente). Já para validar as cartas dos

interferentes e dos resíduos foram utilizadas 50 amostras (grupo Val) também obtidas de

amostras laboratoriais e da produção (10 “dentro de controle” e 40 “fora de controle”).

A Figura 33 apresenta as cartas de controle desenvolvidas para a Olanzapina após

pré-tratamento com a derivada de primeira ordem Savitzky-Golay (janela de 15 pontos).

Pode ser observado que o grupo Cal foi corretamente classificado com um nível de acerto


de 100%. Além disso, a Figura 33 mostra, também, que as amostras dos grupos de Pred e

Val foram corretamente classificadas de acordo com a carta NAS:

Grupo Pred: nível de acerto de 100% para amostras “dentro de controle” e 97,5%

“fora de controle”;

Grupo Val: nível de acerto de 100% para amostras “dentro de controle” e 95% para

“fora de controle”.

Figura 33. Carta controle para Olanzapina - NAS, Interferentes e Resíduos. (●) amostras do

grupo de calibração, (*) previsão e (▼) validação.


LIMITE MÁXIMO

LIMITE MÍNIMO

LIMITE MÁXIMO

LIMITE MÁXIMO


Existem algumas amostras dos grupos de Pred e Val na carta dos interferentes que

apresentaram valores acima dos limites, os quais podem ser explicados pela hipótese de

que as amostras não estão adequadamente homogêneas ou que as amostras laboratoriais

e de produção tem tamanhos diversos de partículas, como descrito por Costa et al. (2015).

Existem, também, algumas amostras “fora de controle” que estão acima do limite na carta

dos resíduos. Tal fato pode ser explicado pela presença de produtos de degradação, os

quais podem interferir no espectro NIR. O mesmo perfil de resposta não foi encontrado nas

amostras que continham apenas excipientes (46-50).

Na análise de CLAE (Figura 34), foi possível verificar a presença de quatro picos

majoritários de produtos de degradação em amostras da produção “fora de controle” e suas

áreas podem ser visualizadas na Tabela 6. O responsável por esse aumento do sinal na

carta dos resíduos pode ser produzido pelo produto de degradação “Desconhecido 2” ou

mesmo, o somatório de todos os produtos de degradação que foram produzidos pelo

aquecimento na estufa de circulação de ar. Foi avaliada a injeção de uma solução placebo

(Figura 35) para confirmar que os picos dos produtos de degradação encontrados no

cromatograma da solução “fora de controle” eram realmente correlacionados à Olanzapina.

Figura 34. Cromatograma da solução de Olanzapina da amostra da produção "fora de

controle".



Figura 35. Cromatograma da solução do placebo da Olanzapina.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

-1

0

1

2

3

4

Inte

nsi

da

de

, m

AU

Tempo, min

DAD-CH1 - 260 nm


Através dos resultados observados nos cromatogramas, foi possível verificar que na

solução placebo não houve a formação de nenhum pico no tempo de retenção dos picos

existentes na amostra “fora de controle”, confirmando, assim, que os picos são produtos de

degradações existentes nas amostras.

Tabela 6. Porcentagem dos produtos de degradação presentes nas amostras da produção

"fora de controle".

T.R. (min) Pico Área Porcentagem em comparação ao pico da

Olanzapina

3,12 Desconhecida 604 0,0043% 3,49 Desconhecida 54500 0,3896% 4,09 Desconhecida 3568 0,0255% 5,60 Desconhecida 906 0,0064% 8,57 Olanzapina 13988751 -

Apesar dos resultados encontrados nas cartas de resíduos, as porcentagens de

sucesso das cartas foram bastante satisfatórias, como descritas anteriormente. Portanto, as

cartas de controle baseadas no NAS para o controle de processo de Olanzapina

comprimidos revestidos podem ser utilizadas na rotina.

Além da carta controle por NAS, as cartas controle por PCA e por T² Hotelling’s

foram testadas com a finalidade de analisar se com métodos mais simples seria possível

obter o mesmo percentual de sucesso em encontrar valores que estavam “dentro de

controle” e “fora de controle”. Para todas as cartas controle foi utilizado o mesmo pré-


tratamento nos espectros (derivada de primeira ordem Savitzky-Golay com janela de 15

pontos).

Para a carta controle por PCA, foi utilizada 1 componente principal (PC), cuja

acumulava um total de 93,52% de variância, portanto possuía a capacidade de explicar boa

parte da decomposição. Com a obtenção dos dados, a carta foi construída conforme Figura

36:

Figura 36. Carta controle por PCA – 1 PC.


A partir dos dados encontrados é possível verificar que a carta controle por PCA não

foi satisfatória. Apesar das amostras que estavam “dentro de controle” apresentar uma taxa

de sucesso satisfatória (aproximadamente 96%), as que estavam “fora de controle” não

foram bem definidas, o modelo não conseguiu identificar algumas amostras que deveriam

estar fora do intervalo corretamente (limite de confiança de 95%).

Logo em seguida, a carta controle T² Hotelling’s foi criada, também originada com 3

componentes principais. A Figura 37 apresenta os resultados encontrados:


Figura 37. Carta controle por T² Hotelling's.


O mesmo perfil da carta controle por PCA foi observada por T² Hotelling’s. A taxa de

sucesso para as amostras que estavam “dentro de controle” foi elevada (aproximadamente

98%), porém as amostras que estavam “fora de controle” também não foram definidas

corretamente.

Portanto, o modelo da construção da carta de controle multivariada por NAS foi a

mais eficaz, uma vez que as informações do placebo e das amostras “NOC” dentro da carta

controle tornaram-se imprescindíveis para o modelo criar o vetor NAS, ou seja, o sinal

analítico específico da Olanzapina na presença dos inúmeros interferentes presentes, tanto

nas amostras (excipientes) e nas amostras que sofreram degradação forçada - dessecação

(fora de controle).


Esse capítulo apresentou uma aplicação de cartas de controle multivariadas

baseadas no NAS utilizando o NIR para o monitoramento da Olanzapina em formas

farmacêuticas produzidas pelo NUPLAM/UFRN, em parceria com a EMS Ltda. Através do

NAS, foi possível desenvolver três cartas de controle (NAS, interferentes e resíduos), com

seus respectivos níveis de controle. As cartas de controle multivariadas foram validadas e foi


possível identificar amostras, as quais estavam dentro e fora do controle com sucesso. Essa

metodologia forneceu uma ferramenta simples, rápida e eficaz para quantificação

classificação da quantidade de Olanzapina na presença de excipientes em amostras

laboratoriais e comerciais.


Capítulo 3


Capítulo 3 – DETERMINAÇÃO DO CONTEÚDO DE ÁGUA EM GRANULADOS DE

OLANZAPINA PARA PRODUÇÃO DE COMPRIMIDOS REVESTIDOS

1. INTRODUÇÃO

O conteúdo de água de granulados é um atributo de qualidade crítica na produção de

formas farmacêuticas sólidas de via oral. Um controle inadequado pode levar a desvios

durante os processos subsequentes, tais como fluxo dos pós, tendências de baixa

homogeneidade, aumento da friabilidade e propriedades de deterioração dos comprimidos,

bem como mudanças nas propriedades físicas do produto acabado, por exemplo: dureza,

friabilidade e tempo de desintegração (AMIDON e HOUGHTON, 1995; SUN, 2008). Além

disso, mesmo uma umidade residual ligeiramente elevada pode afetar negativamente a

estabilidade de longo prazo do produto final, uma vez que quantidade elevada de água pode

promover a degradação do princípio ativo por hidrólise (WATERMAN e ADAMI, 2005).

Portanto, níveis de umidade adequados são cruciais em processos produtivos de formas

farmacêuticas sólidas (PETERS, et al., 2017).

Uma etapa de produção amplamente utilizada, a qual afeta diretamente e

decisivamente o conteúdo de umidade é a granulação em leito fluidizado. Nela ocorre

mistura, promoção de formação de grânulos através de sprays e, por último, secagem. Após

a mistura dos excipientes, o spray de granulação líquida induz a formação de pontes


líquidas e inicia-se a aglomeração das partículas. Embora diversas pesquisas tenham

estudado esse processo, a variedade de parâmetros controláveis, como por exemplo a taxa

de fluxo de líquido, a temperatura do ar de entrada (SCHAEFER e WORTS, 1978) e

aqueles, os quais são dificilmente controláveis, como a umidade do ar de entrada

(GREENHALGH e WESTRUP, 1997; LIPSANEN, et al., 2007), tornam o processo

complexo. O resultado combinado desses parâmetros é a umidade do grânulo, a qual afeta

criticamente a taxa de crescimento dos grânulos e o seus tamanhos, também é a melhor

propriedade a ser medida para controlar o processo (FRAKE, et al., 1997). Embora seja bem

conhecido, ainda é comum se basear em determinações descontínuas de umidade por

perda por secagem (PPS) e titulação por Karl Fischer (KF) em um conjunto limitado de

amostras em processos e de liberação (GREEN , et al., 2005). No entanto, o método KF é

demorado, destrutivo e requer reagentes bastante tóxicos ao ambiente. Além disso, a

umidade do ambiente pode afetar nos resultados de amostras com baixa umidade, uma vez

que os vials necessitam ser abertos antes das análises.

Em 2004, a agência regulatória de medicamentos e alimentos dos Estados Unidos

(US Food and Drug Administration – FDA) publicou seu guia sobre Tecnologias Analíticas

em Processo (PAT), o qual encoraja as indústrias para obter mais controle sobre seus

processos produtivos, bem como conhecer melhor o seu processo e trocar para análises em

processos durante a produção (U.S. FOOD AND DRUG ADMINISTRATION, 2004). Uma

ferramenta de medição em linha descrita para monitoramento de umidade é a

espectroscopia de infravermelho próximo (NIRS) (FRAKE, et al., 1997; WATANO,

TERASHITA e MIYANAMI, 1991; RANTANEN, et al., 2000).

A espectroscopia no infravermelho próximo (NIRS) tem recebido ampla aceitação

com a indústria farmacêutica, bem como a agrícola para testes em matérias-primas,

produtos acabados e em controle em processo. Uma das grandes vantagens da utilização

do NIR na determinação do conteúdo de água, é que as análises podem ser feitas através

de vials de vidros tampados, ou seja, a umidade do ambiente não interfere na resposta

(ZHENG, et al., 2007).

Estudos prévios mostraram que a água possui forte absorção na região do

infravermelho próximo em torno de 760, 970, 1450 e 1940 nm. As bandas mais fortes de

absorção da água aparecem em 1400 a 1450 nm e 1900 a 1950 nm, os quais são

originadas devido ao primeiro sobretons do estiramento do OH e à combinação da faixa de

estiramento e do dobramento do OH, respectivamente (LUCK, 1974). Variações nas bandas

da água em torno da região de 1400 nm são dependentes do estado da água nas amostras.

Em amotras úmidas, por exemplo, com conteúdo de água em torno de 70 a 90%, a banda


de absorção são similiares aquelas de água pura, em torno de 1400 a 1410 nm. Já em

amostras dessecadas, a banda associada com a água livre parece desaperecer e um novo

traço de absorção aparece em torno de 1430 nm, devido à água intrínseca (BÜNING-

PFAUE, 2006).

Essas duas faixas de comprimento de onda são frequentemente utilizadas para

quantificar o conteúdo de água em várias amostras. A outra banda correspondente à água

na região do NIR é a de 970 a 1190 nm. Essas já não são fortes, por serem geradas devido

ao segundo sobreton do estiramento do OH, bem como a combinação do primeiro sobreton

do estiramento e do dobramento do OH (LUCK, 1974).

A determinação do conteúdo de água por NIRS em ambos os modelos de

trasmitância e reflectância são descritos extensivamente na literatura (REICH, 2005;

BAKEEV, 2004; LIN e HSU, 2002; DZIKI, et al., 2000; BLANCO, et al., 1998; ZHOU, HINES

e BORER, 1998; KAMAT, LODDER e DELUCA, 1989), com diversas aplicações na

agricultura, floretal, téxtil, química e farmacêutica. Os primeiros trabalhos foram pontuados e

discutidos por Blanco et al. (1998), e publicações foram revisadas por Reich (2005).

Granulados farmacêuticos tipicamente contêm em torno de 1 a 3% de água residual, o qual

se caracteriza como um intervalo limitado para a construição de modelos de calibração.

Para ampliá-la, amostras laboratoriais são preparadas por adição de umidade e posterior

secagem (LIN e HSU, 2002; SUKOWSKI, 2003). No entanto, essas amostras não melhoram

significativamente a previsão dos resultados.

Portanto, no capítulo 3 dessa tese foi desenvolvida uma estratégia quimiométrica

baseada em PCR, utilizando a espectroscopia no infravermelho próximo para medir

quantitativamenteo conteúdo de água em granulados contendo Olanzapina, como princípio

ativo, com o objetivo de incluir essa tecnologia em escala de processo produtivo, etapa de

mistura, no NUPLAM/UFRN.

2. OBJETIVO


Determinar quantitativamente o conteúdo de água em granulados contendo

Olanzapina, como princípio ativo, utilizando o NIR e, demonstrar a sua viabilidade

como método não invasivo e não destrutivo, em comparação ao método tradicional,

Karl Fischer.



3.1. Materiais



Metanol seco – Vetec®

Reagente de Karl Fischer- Hydranal R Composite 5K.







o Poloxamer;

o Crospovidona;

o Lactose;



Vials do NIR (50 mL de capacidade) – Bruker®;



e sonda. Software OPUS®;

Titulador automático Karl Fischer (KF), modelo Basic Titrino 794 (Methrom®,

Herisau, Suiça), equipado com unidade de seringa de 10 mL, agitador magnético 703

Ti Stand, com unidade intercambiável;

Estufa de secagem à vácuo, modelo Q819V2 (Quimis®, Brasil), equipado com

bomba à vácuo.

3.2. Métodos


O intervalo da concentração do conteúdo de água dos granulados foi selecionado

utilizando o D-Optimal Solution do software Modde® (MKS Data Analytic Solutions, Sweden)

totalizando 40 experimentos (variação de 0,99 a 5,57% m/m do conteúdo água no


granulado), abrangendo todos os eixos e o ponto central do espaço das misturas ternárias.

As amostras laboratoriais foram pesadas, cada uma contendo uma média de 400 mg de

mistura de componentes, em balança semicroanalítica, com exatidão de 0,0001 g,

transferidas para os vials do NIR (capacidade de 50 mL) e homogeneizadas em agitador de

tubo por 3 min. A produção dos granulados seguiu-se conforme ordem de produção da

formulação do NUPLAM. Por segredo industrial, essa etapa não poderá ser divulgada.

As amostras de produção (40 unidades com conteúdo de água desconhecido, todas

provenientes de um mesmo lote de produção) constituídas de granulados da mistura de

Olanzapina com os excipientes, peso médio de 400 mg, foram obtidas do NUPLAM/UFRN

em parceria com a EMS Ltda. Todas as amostras foram homogeneizadas como descrito

para as amostras laboratoriais.

Todos os vials, sem tampa, contendo amostras foram inseridos em estufa de

secagem à vácuo, programada na temperatura de 60°C e com pressão de 0,05 Mpa. As

amostras foram sendo retiradas da estufa, e tampadas, em cada intervalo de tempo de 30

minutos até 9h de exposição, em seguida cada amostra, foi analisada no infravermelho

próximo e logo em seguida levada para análise no Karl Fischer.


Os espectros do NIR foram coletados no modo de reflectância difusa via

espectrofotômetro FT-NIR, modelo MPA® (Bruker, Alemanha), equipado com a esfera de

integração. Em cada amostra foram obtidos espectros, em triplicata, com uma média de 32

scans, resolução de 32 cm-1 e intervalo de comprimento de onda de 900 a 2500 nm. O

espectro de fundo foi obtido utilizando lâmina revestida de ouro. Os espectros foram obtidos

em ambiente climatizado com temperatura controlada de 22°C e umidade relativa do ar de

60%. Todas as análises no NIR foram realizadas com os vials tampados, para impedir que a

amostra recebesse umidade do ambiente.

3.2.3. Análise do conteúdo de água por Karl Fischer

Após análise no NIR, as amostras foram levadas para um titulador potenciométrico

automático (Karl Fischer), modelo Basic Titrino 794 (Metrhom®, Herisau, Suiça), equipado

com unidade de seringa de 10 mL, agitador magnético 703 Ti Stand, com unidade

intercambiável. Cerca de 0,5 g de cada amostra foi pesada, individualmente, imediatamente

antes de inseri-la no recipiente da análise do KF. Após cada obtenção dos resultados,

sucessivas amostras foram inseridas.


Após obtenção de todos os dados, os resultados encontrados foram tratados para

obtenção do modelo de calibração multivariado.

3.2.4. Construção do modelo de calibração multivariado

Todos os cálculos (modelos e pré-tratamentos) foram realizados usando o software

MATLAB versão 6.5 (The Math-Works, Natick, USA) com o PLS-toolbox versão 6.01

(Eigenvector Research, Inc., USA). Primeiramente, o espectro NIR calculado foi

transformado em log 1/R, seguido pelo cálculo da média dos espectros (triplicata).

Diferentes pré-tratamentos, por exemplo: Suavização (Smoothing Savitzky-Golay) (SGS)

(com janela de 7 pontos), Correção de Espalhamento Multiplicativo (MSC), Derivada de

primeira ordem Savitzky-Golay (com janela de 7 pontos) e Variável Normal Padrão (SNV)

foram aplicadas nos espectros, com o objetivo de minimizar características indesejáveis, tais

como: deslocamento espectral, ruído, linha de base e espalhamento (NEVES, et al., 2012;

MARIANI, et al., 2014).

O modelo de regressão (PCR) foi desenvolvido e validado utilizando a ampla

validação cruzada deixando uma amostra de fora (leave-one-out full cross-validation) -

RMSECV. Para evitar sobreposição, o conjunto de dados utilizados para calibração foi

constituído de 75% e 25% dos espectros de amostras laboratoriais e produção,

respectivamente. Já para o conjunto de dados utilizados para validação continha 25% e 75%

dos espectros de amostras laboratoriais e de produção, respectivamente. A escolha dos

espectros foi feito através do algoritmo clássico de Kennard-Stone (KS) (1969). Os

seguintes parâmetros de qualidade foram utilizados para avaliar o modelo de calibração,

respectivamente: RMSEC, RMSEP, coeficiente de correção para cada modelo: calibração

(rc) e predição (rp). O teste estatístico (EJCR – Elliptical Joint Confidence Region) foi

calculado para avaliar a inclinação, o intercepto da regressão de referência e para predizer

valores no intervalo de confiança de 95%.

Finalmente, validar um método analítico implica em determinar se é amplamente feito

para o seu propósito. Para isso, algumas figuras de mérito (EURACHEM AND CITAC, 2002;

ICH, 1995; ICH, 1997) foram determinadas, tais como: sensibilidade, seletividade,

sensibilidade analítica, precisão, teste para o erro sistemático “bias”, exatidão, LD e LQ.

Seus respectivos conceitos e como calculá-los estão descritos no capítulo 1 dessa tese.

Todo o esquema para a construção do modelo de calibração multivariado, sua

validação e análise dos dados de previsão foram construídos conforme demonstrado

também na Figura 20 do Capítulo 1 desta tese.



4.1. Relação entre os dados de NIR e KF

Os espectros de NIR puros (27 amostras laboratoriais) apresentaram o desvio da

linha de base e sobreposição de pico como os principais efeitos de variações. Os espectros

das preparações farmacêuticas foram bastante similares, provavelmente pela baixa

porcentagem de água existente nas amostras.

São apresentados, na Figura 38, os espectros puros de todas as amostras, sendo

possível notar a elevada semelhança entre cada grupo de amostras, tornando o método

com elevado grau de dificuldade para calibração univariada, necessitando, assim, da

realização de um pré-tratamento conforme pode ser verificado na Figura 39.

Os modelos de calibrações construídos com todo o intervalo de espectro medido (800

a 2500 nm) apresentaram baixo percentual de correlação para quase todos os pré-

tratamentos utilizados, quando comparado com os resultados obtidos pelo método de

referência (KF). Provavelmente, devido ao fato da baixa concentração da água nas

amostras, e que as absorvâncias dos demais constituintes sobrepõe o sinal do analito.

Por esta razão, a escolha dos espectros foi feito através do algoritmo clássico de

Kennard-Stone (KS) (KENNARD e STONE, 1969) para encontrar o intervalo que

melhorasse a classificação. Conforme descrito na literatura, a faixa de comprimento de onda

que a água possui forte absorção foi escolhida (1600 a 2200 nm), como pode ser

visualizado na Figura 40. Os melhores modelos obtidos durante a etapa de pré-tratamento

foram Suavização (Smoothing Savitzky-Golay – com janela de 7 pontos) seguida de MSC.


Figura 38. Espectros NIR puro das 120 amostras laboratoriais


Figura 39. Espectros puros de NIR das amostras após seleção das variáveis.



Figura 40. Espectros NIR de todas as amostras após o pré-tratamento com a suavização

(SGS) e MSC.


Um modelo de regressão por PCR foi desenvolvido para o princípio ativo, validado

utilizando a ferramenta de ampla validação cruzada “leave-one-out” (RMSECV) e o número

ideal de fatores de PCR escolhido como o mínimo no gráfico de variância residual versus o

número de fatores. A regressão pelos componentes principais, em inglês “Principal

Component Regression - PCR” é um método matemático que é capaz de descrever a

covariância entre dados espectrais NIR multidimensionais e a variável resposta através do

pequeno número de variáveis latentes ou fatores de PCR. No método, foram necessárias

três variáveis latentes para descrever 99% da variância no espectro. O modelo de calibração

apresentou RMSEC (0,365%), RMSEP (0,457%), com coeficiente de regressão para

calibração (rc = 0,94) e previsão (rp = 0,94). A Figura 41 apresenta a relação entre os valores

previstos e de referência das amostras laboratoriais no grupo de calibração e de validação.


Figura 41. Relação entre conteúdo de água prevista (NIR) e a de referência (KF) para

amostras de calibração e previsão, através do modelo de PCR para Olanzapina. (●) grupo

de calibração; (●) grupo de validação.


A diagonal preta representa o resultado ideal, ou seja, quanto mais próximo os

pontos estiverem da diagonal, melhor é o ajuste do modelo. É possível verificar que todas as

concentrações calculadas, de ambos os grupos (calibração e validação), foram próximos

aos valores reais.

A fim de obter mais informações a cerca da precisão do método, uma análise de

regressão linear versus os valores de concentração encontrados foi realizada. O intercepto

estimado e a inclinação foram comparados com os valores ideias de 0 e 1 utilizando o teste

de EJCR. Os cálculos de EJCR são um meio conveniente para determinar se existem viés

na determinação de ambos os parâmetros quando se utiliza o modelo PLS. Como pode ser

visto na Figura 42, o ponto (a = 0, b = 1) apresentou-se dentro do elipse do EJCR, portanto

pode-se concluir que erros constantes e proporcionais estão ausentes.


Figura 42. Teste EJCR para o intercepto e a inclinação da regressão do conteúdo de água

prevista versus a de referência utilizando uma validação externa pelo modelo PCR.


Baseado na análise comparativa descrita anteriormente, o modelo PCR com os pré-

tratamentos espectrais SGS, SNC e MSC foram aplicados para predizer o conteúdo de água

presente em 40 amostras desconhecidas (amostras laboratoriais, n = 1-15; amostras da

produção, n= 16-30) após aplicação de mesmo pré-tratamento utilizado no grupo de dados

de calibração, as quais podem verificadas na Tabela 7.


Tabela 7. Comparação dos resultados do conteúdo de água de amostras laboratoriais e de

produção por NIR e por KF

Amostras Concentração (% m/m)

Previsão (NIR) Referência (KF)

1

Laboratoriais

4,69 5,00

2 1,91 2,59

3 2,25 2,09

4 2,05 2,38

5 1,92 2,09

6 1,88 2,28

7 1,86 2,07

8 1,86 1,96

9 1,82 1,77

10 1,87 1,83

11 1,72 2,28

12 1,82 1,86

13 1,81 1,87

14 1,85 2,25

15 1,56 1,77

16 1,56 1,77

17 1,55 1,57

18 1,72 1,76

19 1,59 1,30

20 1,57 1,22

21

Produção

1,26 0,93

22 1,24 0,93

23 1,24 1,03

24 1,19 1,29

25 1,22 0,99

26 1,41 1,16

27 1,54 1,52

28 4,44 4,38

29 4,32 4,47

30 4,07 4,15

31 3,97 3,95

32 3,51 3,4

33 3,63 3,83

34 3,41 3,21

35 3,40 3,21

36 3,10 3,01

37 3,44 3,41

38 3,50 3,33

39 3,15 2,82

40 3,33 3,04


Para comparar os métodos, convencional (KF) e alternativo (NIR-PLS), o Teste-t

pareado foi aplicado. Nesse teste foi possível verificar que não houve nenhuma diferença

estatística entre os dois métodos, no nível de confiança de 95% (p = 0,5 e t = 2,0). A

repetibilidade do método de referência por Karl Fischer foi avaliada, como requerido pela

ANVISA (BRASIL, 2003) para assegurar que as análises apresentavam consistência nos

resultados. Foram analisadas no KF 6 replicatas de uma amostra laboratorial. O resultado

encontrado mostrou desvio padrão residual (DPR) de 0,9% (recomendado é que seja menor

do que 2,0%), demonstrando assim que o método de referência é preciso.

Novos métodos analíticos devem ser validados antes de serem utilizados na indústria

farmacêutica. O método NIR proposto foi validado de acordo com o guia ICH (1997)

avaliando a seletividade, sensibilidade, sensibilidade analítica, precisão, exatidão e limites

de detecção e quantificação. A Tabela 8 apresenta as figuras de mérito (FOM) avaliadas

para o método otimizado. Os valores de exatidão, representados por RMSEC e RMSEP

indicaram que os valores do modelo multivariado estimado exibiram concordância aceitável

ao método de referência. A precisão, em nível de repetibilidade, foi avaliada pela análise de

3 amostras (6 replicatas por amostra), no mesmo dia, obtendo assim o DPR no valor de

2,18%. A veracidade foi estimada pelo parâmetro de erro absoluto, utilizando o valor de

RMSEP de 0,31% m/m. A veracidade e a precisão corroboraram que o método pode ser

considerado exato. Para a exatidão e os estudos de linearidade, o intervalo de trabalho

analítico foi definido de 0,99 a 5,57% m/m de conteúdo de água, para que o método fosse

capaz de analisar dentro dos parâmetros de aceitação (até 3,0% m/m). Os parâmetros de

sensibilidade e seletividade avaliados apresentaram resultados aceitáveis, dentro do

intervalo analítico do modelo e os resultados de LD e LQ estimados foram otimistas.

Tabela 8. Figura de Mérito (FOM) do melhor modelo PLS: Conteúdo de água em % m/m.

FOM Conteúdo de Água / % (m/m)

RMSEC 0,3082

RMSECV 0,3208

RMSEP 0,3184

Bias -2,17 x 10-8

cr 0,94

pr 0,94

Inclinação 0,9467

Intercepto 0,1196

Precisão 2,19

Sensibilidade 1,0253

Seletividade 0,2059


LD 0,2357

LQ 0,9504

RMSEC: erro quadrático médio da calibração; RMSECV: erro quadrático médio da validação

cruzada; RMSEP: erro quadrático médio da previsão; rc: coeficiente de correlação da

calibração; rp: coeficiente de correlação da previsão; LD: Limite de detecção; LQ: Limite de

quantificação


O método por NIR foi desenvolvido, o qual permite a determinação com precisão e

exatidão do conteúdo de água em granulados da mistura de Olanzapina com os excipientes

(lactose, celulose microcristalina, estearato de magnésio, crospovidona, dióxido de silício

coloidal e poloxamer) com o mínimo de tratamento na amostra. De acordo com os

resultados, PCR é um método de regressão promissor que pode ser usado em conjunto com

etapas de pré-tratamentos, os quais devem ser realizados previamente nos espectros, para

assegurar que o modelo de calibração qualitativo/quantitativo seja construído de forma

eficaz e com resultados consistentes. O método NIR, quando comparado ao método de

referência (KF), não apresentou diferença estatística, com intervalo de confiança de 95%.

Os valores de exatidão, precisão e demais figuras de mérito exibiram resultados

promissores, indicando que o método desenvolvido por NIR para a determinação do

conteúdo de água neste tipo de matriz pode ser usado como metodologia alternativa para os

propósitos farmacêuticos.

C O N C L U S Õ E S P á g i n a | 115

Conclusões


Os resultados desse trabalho mostraram que foi possível construir modelos de

calibração multivariados utilizando o NIR como ferramenta analítica alternativa para análises

da Olanzapina em diferentes matrizes, tornando o processo rápido, não destrutivo e de

baixo custo.

No primeiro capítulo, o método de calibração multivariada por NIR foi desenvolvido e

permitiu a determinação com precisão da Olanzapina e exatidão em produtos laboratoriais e

comerciais sem tratamento complexo na amostra. De acordo com os resultados obtidos, a

regressão por PLS mostrou-se promissor, uma vez que com o auxílio de etapas de pré-

tratamentos nos espectros NIR, foi possível assegurar que o modelo de calibração fosse

construído de forma eficaz e com resultados consistentes. O método NIR, quando

comparado ao método de referência (CLAE), não apresentou diferença estatística, com

intervalo de confiança de 95%, confirmando, assim, que o método pode ser reconhecido

como de referência. Os valores de exatidão, precisão e demais figuras de mérito exibiram

resultados promissores, indicando que o método desenvolvido por NIR para a Olanzapina

pode ser usado para os propósitos farmacêuticos.

No segundo capítulo foi apresentada a aplicação das cartas de controle multivariadas

construídas para o monitoramento da Olanzapina em formas farmacêuticas sólidas

produzidas pelo NUPLAM/UFRN, em parceria com a EMS Ltda. As três cartas de controles

(NAS, Interferentes e Resíduos) baseadas no Sinal Analítico Líquido, foram validadas e a

partir delas, foi possível identificar amostras laboratoriais e de produção, as quais estavam

dentro e fora do controle (limite de especificação do teor), com sucesso. Dessa forma, sua

transposição e aplicação na indústria farmacêutica, no setor de controle em processo, torna-

se viável para a aplicação da Tecnologia Analítica em Processo (PAT), uma vez que possui

a capacidade monitoramento com vantagens de ser simples, rápido e não destrutivo,

quando em linha.

Por fim, no capítulo 3, o método para a determinação do conteúdo de água por NIR

foi desenvolvido com precisão e exatidão em granulados da mistura de Olanzapina com os

excipientes (lactose, celulose microcristalina, estearato de magnésio, crospovidona, dióxido

de silício coloidal e poloxamer) com o mínimo de tratamento na amostra. De acordo com os

resultados, o método de regressão por PCR se mostrou promissor, quando utilizado em

conjunto com etapas de pré-tratamentos nos espectros das amostras laboratoriais e de

produção. Quando comparado ao método de referência (Karl Fischer), o método por NIR

não apresentou diferença estatística, com intervalo de confiança de 95%, além de ter sido

comprovada com sucesso as figuras de mérito. Portanto o método por NIR para a

determinação do conteúdo de água na matriz escolhida pode ser utilizada para seus

propósitos farmacêuticos.


Mediante o exposto na tese, os primeiros passos para a aplicação da Tecnologia

Analítica em Processo no setor produtivo do NUPLAM/UFRN para análise online da

Olanzapina em suas etapas produtivas foram realizados com sucesso, mostrando que a

instalação de um infravermelho próximo nos equipamentos do Setor Produtivo do

NUPLAM/UFRN favorecerá ao melhor entendimento do processo, garantirá melhor

qualidade aos medicamentos, reduzirá o tempo de análise, custos com reagentes e resíduos

gerados nas análises. Além disso, será capaz de garantir qualidade ao lote do produto por

inteiro (sem realizar uma amostragem), uma vez que o processo de controle analítico será

realizado em cada comprimido produzido.

Por fim, as perspectivas para a implantação do objetivo da tese direcionam para que

os modelos multivariados de análise quantitativa (calibração) e qualitativa (cartas controles)

do fármaco em estudo, bem como seu controle da umidade, poderão ser incorporados em

uma plataforma, em associação com parcerias com o Instituto Metrópole Digital, Instituto de

Química e NUPLAM/UFRN, para criação de software de análise de leitura imediata das

amostras que estarão em escala produtiva.

R E F E R Ê N C I A S P á g i n a | 118

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Anexos

Anexo I

Artigo publicado

Anexo II

Artigo submetido

aplicaÇÃo do infravermelho prÓximo aliada À … · tecnologia analítica em processo. já no...

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