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SUBSECRETARÍA DE ECONOMÍA: INFORME FINAL: “ANÁLISIS DE TOXINAS LIPOFÍLICAS MEDIANTE LC-MS/MS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIÓN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp. EN MAGALLANES” INFORME FINAL “Análisis de toxinas lipofílicas mediante LC-MS/MS en muestras de fitoplancton y moluscos recolectadas durante la floración estival 2013 de Dinophysis spp. en Magallanes” SUBSECRETARÍA DE ECONOMIA Y EMT / Abril 2014

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Page 1: “Análisis de toxinas lipofílicas mediante LC-MS/MS en ...metadatos.mma.gob.cl/sinia/Informe_final_Analisis_toxinas_lipofilicas_656-055.pdfSUBSECRETARÍA DE ECONOMÍA: INFORME FINAL:

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo

INFORME FINAL

ldquoAnaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas mediante LC-MSMS en muestras de fitoplancton y moluscos recolectadas durante la

floracioacuten estival 2013 de Dinophysis spp en Magallanesrdquo

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIA Y EMT Abril 2014

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I N S T I T U T O D E F O M E N T O P E S Q U E R O

INFORME FINAL

ldquoAnaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas mediante LC-MSMS en muestras de fitoplancton y moluscos recolectadas durante la

la floracioacuten estival 2013 de Dinophysis spp en Magallanesrdquo

SUBSCRETARIacuteA DE ECONOMIA Y EMT Abril 2014

REQUIRENTE

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIA Y EMPRESAS DE

MENOR TAMANtildeO

Subsecretaria de Economiacutea y Empresas de Menor Tamantildeo Katia Trusich Ortiz

EJECUTOR

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO IFOP

Director Ejecutivo (I)

Jorge Castillo Pizarro

Jefe Divisioacuten Investigacioacuten en Acuicultura Leonardo Guzmaacuten Meacutendez

JEFE DEL PROYECTO

Gemita Pizarro Nova

AUTORA

Gemita Pizarro Nova

COLABORADORES

Claudia Zamora Amstein

Jorge Toro Mancilla Roberto Raimapo Raimapo

Ceacutesar Alarcoacuten Zapata Hernaacuten Pacheco Valles

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo

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RESUMEN EJECUTIVO Este informe final incluye los resultados de los anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas en muestras de agua (fitoplancton y microalgas) y moluscos recolectados entre enero y febrero de 2013 en la regioacuten de Magallanes cuando ocurrioacute una floracioacuten de dinoflagelados entre los que destacaron Dinophysis acuminata y Protoceratium reticulatum Ambas especies eran sospechosas de producir toxinas lipofiacutelicas DTX1 y PTXs en el primer caso y YTXs en el segundo Tal floracioacuten se mantuvo intensa entre diciembre 2012 y febrero 2013 Las muestras de moluscos fitoplancton (agua) y microalgas aisladas por micromanipulacioacuten fueron recolectados en diferentes sectores de Magallanes durante el monitoreo regular de marea roja VII etapa 2013-14 que se realiza anualmente Los anaacutelisis de toxinas en las muestras fueron realizados por LC-MSMS en un laboratorio extranjero por tratarse de una teacutecnica auacuten no implementada en Chile para la deteccioacuten de toxinas marinas lipofiacutelicas certificada a nivel comercial ni tampoco para investigacioacuten baacutesica rutinaria Los resultados indican que en los moluscos se encontraban presentes pectenotoxina-2 (PTX2) yesotoxinas (YTXs) 45-hidroxi-yesotoxina (45OHYTX) dinofisistoxina-1 (DTX1) y espiroacutelidos (SPXs) La mayor concentracioacuten la presentoacute el grupo de las YTXs (40-294 microg kg-1) en muestras de choritos provenientes del sector de Seno Otway Igualmente la PTX2 se presentoacute en mayor concentracioacuten (3-45 microg kg-1) en este mismo sector y en los mismos transvectores Para el caso de contenido gaacutestrico de ostiones procedentes del aacuterea norte de Magallanes (estero Peel) se detectoacute tanto PTX2 como YTXs mientras que en cuerpo entero de chorito de la misma estacioacuten se detectoacute PTX2 y SPX1 El DTX1 fue detectado en choritos (1-18 microg kg-1 considerando DTX1 libre y total) procedentes del aacuterea centro de Magallanes (sector Seno Otway y sectores adyacentes a Punta Arenas) El AO no fue detectado en ninguna las aacutereas monitoreadas de la regioacuten Los SPXs fueron principalmente detectados en choritos de las aacutereas centro y sur de Magallanes y en una estacioacuten del aacuterea norte de la regioacuten (estero Peel) De las cinco toxinas detectadas en los moluscos solo DTX1 mostroacute estar localizada en el aacuterea centro de Magallanes mientras que las restantes fueron detectadas en las tres aacutereas de monitoreo Norte centro y sur de Magallanes No se encontroacute pectenotoxina-1 (PTX1) dinofisistoxina-2 (DTX2) ni azaspiraacutecidos (AZPs) en las muestras de moluscos

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Los resultados muestran que de los cuatro grupos de toxinas PTXs YTXs DTXs y SPXs tres de ellas estuvieron presentes simultaacuteneamente en los moluscos vale decir PTX2 YTXs y DTX1 o bien PTXs YTXs y SPXs La presencia de PTX2 y DTX1 en moluscos fue coincidente con la mayor abundancia relativa de Dinophysis acuminata en el ambiente y no con D acuta que estuvo ausente Las YTXs fueron detectadas en los mismos transvectores y coincidioacute con una alta abundancia relativa de Protoceratium reticulatum En este uacuteltimo caso fue posible confirmar la produccioacuten de YTXs por P reticulatum en microalgas aisladas por micromanipulacioacuten y en cultivos establecidos a partir de aislamientos de esta especie desde muestras de agua procedentes del aacuterea norte y centro de Magallanes

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IacuteNDICE GENERAL

Paacutegina

RESUMEN EJECUTIVO -------------------------------------------------------------------------------------------- i IacuteNDICE GENERAL --------------------------------------------------------------------------------------------------- iii IacuteNDICE DE FIGURA -------------------------------------------------------------------------------------------------- iv IacuteNDICE DE TABLAS ------------------------------------------------------------------------------------------------- iv IacuteNDICE DE ANEXOS ------------------------------------------------------------------------------------------------ v

1 ANTECEDENTES -------------------------------------------------------------------------------------------- 1

2 OBJETIVOS --------------------------------------------------------------------------------------------------- 2 21 Objetivo general ----------------------------------------------------------------------------------------- 3 22 Objetivo especiacutefico ------------------------------------------------------------------------------------- 3

3 METODOLOGIacuteA --------------------------------------------------------------------------------------------- 3 31 Obtencioacuten del extracto --------------------------------------------------------------------------------- 3 32 Laboratorio de anaacutelisis dotado con LC-MSMShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 3 33 Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por LC-MSMShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 4 34 Extraccioacuten de toxinashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 6

4 RESULTADOS ------------------------------------------------------------------------------------------------ 9 41 Toxinas en moluscoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 9 42 Toxinas en microalgashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 9

5 ANAacuteLISIS Y DISCUSIOacuteN DE LOS RESULTADOS helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 11 51 Toxinas en moluscoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 11 52 Toxinas en microalgashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 12

6 CONCLUSIONES --------------------------------------------------------------------------------------------- 13

7 REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS -------------------------------------------------------------------- 14

FIGURA

TABLAS

ANEXOS Anexo 1 Certificacioacuten laboratorio INTECMAR Anexo 2 Lista de anaacutelisis que realiza INTECMAR y sus costos (en euros) 2013 Anexo 3 Resultados de anaacutelisis en muestras de microalgas anteriormente enviadas procedentes de

Magallanes por el equipo de espectrometriacutea de masas utilizado por INTECMAR Trabajo presentado a las XXXII Congreso de Ciencias del Mar realizado en Punta Arenas 22-25 octubre de 2012

Anexo 4 Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten Anexo 5 Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de Magallanes Anexo 6 Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para

cierre de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

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IacuteNDICE DE FIGURA

Figura 1 Estaciones y sectores muestreados (ciacuterculo rojo) y sector Fortuna donde fue recolectado el caracol piquilhue (ciacuterculo amarillo)

IacuteNDICE TABLAS

Tabla 1 Condiciones cromatograacuteficas para el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas usando una columna

de UPLC C18 en fase reversa y medio baacutesico Tabla 2 Paraacutemetros de la fuente de ionizacioacuten para el Xevo TQMS (Waters) en la determinacioacuten

de toxinas lipofiacutelicas Tabla 3 Resumen de las condiciones de espectrometriacutea de masas empleadas con el Xevo

TQMS (Waters) en el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas Tabla 4 TRR y valores de tolerancia para las toxinas analizadas Tabla 5 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de moluscos Tabla 6 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de microalgas Tabla 7 Niveles actualmente permitidos por la legislacioacuten europea (bioensayo) y los niveles

propuestos por la autoridad europea para la seguridad alimentaria (EFSA) (Gerssen et al 2010) European Food Safety Authority

Tabla 8 Abundancia relativa ambiental de las microalgas al momento de recolectar las muestras

de moluscos En rojo se indica la deteccioacuten de toxina positiva en los moluscos PTXs (D acuminata) YTXs (P reticulatum) SPXs (A ostenfeldii) DTX1 (A acuta) (Tabla modificada de Guzmaacuten et al 2014)

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IacuteNDICE ANEXOS

Anexo 1 Certificacioacuten laboratorio INTECMAR Anexo 2 Lista de anaacutelisis que realiza INTECMAR y sus costos (en euros) 2013 Anexo 3 Resultados de anaacutelisis en muestras de microalgas anteriormente enviadas

procedentes de Magallanes por el equipo de espectrometriacutea de masas utilizado por INTECMAR Trabajo presentado a las XXXII Congreso de Ciencias del Mar realizado en Punta Arenas 22-25 octubre de 2012

Anexo 4 Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten Anexo 5 Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de

Magallanes Anexo 6 Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para

cierre de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

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1 ANTECEDENTES En Chile auacuten existen escasos antecedentes acerca de las toxinas lipofiacutelicas presentes en nuestros moluscos asiacute como la fuente microalgal asociada a su produccioacuten y la variabilidad espacio-temporal de las mismas Tal situacioacuten es tambieacuten un problema en el sur austral de Chile y particularmente en Magallanes donde el historial de este tipo de toxinas ha sido opacado por la fuerte incidencia de toxina paralizante asociada a la presencia de Alexandrium catenella No obstante en los dos uacuteltimos antildeos los niveles de toxicidad por toxinas lipofiacutelicas en la regioacuten se han constituido en un problema para la autoridad de Salud pues han determinado el cierre de grandes extensiones de aacutereas a la extraccioacuten de moluscos hecho no acontecido anteriormente salvo muy local y esporaacutedicamente (eg Uribe et al 2001) ademaacutes del efecto econoacutemico y social

Dentro de las toxinas lipofiacutelicas las maacutes conocidas y frecuentes a nivel mundial por sus efectos diarreicos (veneno diarreico de los mariscos VDM) en humanos son el aacutecido okadaico y sus derivados las dinofisistoxinas (AO y DTXs) (eg Yasumoto et al 1978) tambieacuten conocidas como okadaatos Por lo mismo poseen un mayor historial de citas en la literatura cientiacutefica Los okadaatos son fuertes inhibidores de las proteiacutenas fosfatasas 1 y 2A y potenciales promotores de tumores (Yasumoto et al 1989 Fujiki et al 1989) con efectos croacutenicos desconocidos por lo que su efecto es maacutes lento Por esta razoacuten representan un riesgo para la salud puacuteblica y dan lugar a prolongadas vedas de extraccioacuten de bivalvos tanto de bancos naturales como centros de cultivo con las consiguientes peacuterdidas econoacutemicas para el sector pesquero y acuicultor en otras partes del mundo

Actualmente en Chile las toxinas lipofiacutelicas son detectadas por el bioensayo del ratoacuten una metodologiacutea semicuantitativa e inespeciacutefica Por lo mismo suelen ocurrir falsos positivos debido a la interferencia de otras toxinas lipofiacutelicas diferentes al VDM inocuas o no para el hombre pero que pueden estar presentes en las muestras inyectadas pues son co-extraiacutedas con los okadaatos

Gracias al uso de tecnologiacuteas de alta sensibilidad uacuteltimamente ha sido posible detectar junto a los okadaatos otras toxinas lipofiacutelicas de diverso efecto toacutexico tales como las yesotoxinas pectenotoxinas azaspiraacutecidos espiroacutelidos y gimnodimina (Zhao et al 1993 Yasumoto amp Takizawa 1997 Uribe et al 2001 Garciacutea et al 2005 Blanco et al 2007 Krock et al 2009 Aacutelvarez et al 2010 2011 Loacutepez et al 2010 Pizarro et al 2011 Fux et al 2011 Trefault et al 2011)

En Magallanes ha sido reportada la presencia de okadaatos (AO y DTXs) asociadas a la presencia de Dinophysis acuminata (Uribe et al 2001) Tambieacuten se ha reportado la presencia de yesotoxinas (YTXs) en moluscos Esta uacuteltima se sospecha estar asociada a la presencia de la especie Protoceratium reticulatum comprobada fuente primaria en Ayseacuten (Pizarro et al 2012) norte de Chile (Aacutelvarez et al 2011) y ampliamente conocida como tal a nivel mundial

Durante el periodo estival de 2013 en la regioacuten de Magallanes ocurrioacute una floracioacuten de dinoflagelados entre los que destacaron Dinophysis acuminata y Protoceratium reticulatum Tal floracioacuten se mantuvo intensa entre diciembre 2012 y febrero 2013 lo que permitioacute recolectar muestras de transvectores y microalgas para establecer yo confirmar los perfiles de toxinas lipofiacutelicas respectivas mediante LC-MSMS particularmente en una regioacuten con muy poca informacioacuten al respecto

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2 OBJETIVOS 21 General del proyecto

Establecer mediante LC-MSMS los perfiles de toxinas lipofiacutelicas en muestras de moluscos y de plancton recolectadas durante la floracioacuten de dinoflagelados ocurrida durante el verano 2013 en la regioacuten de Magallanes

22 Objetivo especiacutefico

Establecer los perfiles de toxinas lipofiacutelicas en transvectores centinelas fitoplancton y microalgas aisladas por micromanipulacioacuten recolectados en diferentes sectores de Magallanes durante el monitoreo regular realizados durante una floracioacuten de Dinophysis spp y Protoceratium reticulatum

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3 METODOLOGIacuteA En esta seccioacuten se describen las metodologiacuteas asociadas a las actividades realizadas para el logro de los objetivos asiacute como tambieacuten los conceptos e ideas que la fundamentan

31 Obtencioacuten del extracto - Carne de mariscos Dependiendo de la cantidad de material se procesoacute soacutelo el hepatopaacutencreas

o carne total Se maceroacute y pesoacute el material Se realizoacute extraccioacuten con metanol en una de 11 pv Los extractos fueron centrifugados y el sobrenadante filtrado por filtros de nylon de 045 microm y vaciado a un vial

- Extracto en metanol de muestras de fitoplancton (ie el ensamble total de microalgas sin separar

especies) Aliacutecuotas de agua previamente filtradas por malla de 250 microm para eliminar el zooplancton de tamantildeo mayor fueron filtradas en filtros de fibra de vidrio muflados de 13 mm de diaacutemetro (tamantildeo de poro nominal de 07 microm) Los filtros fueron puestos por separado seguacuten sitio de recolecta y fecha en ependorfs de 15 ml y congelados hasta ser extraiacutedos con 1 mL de metanol centrifugados El sobrenadante fue filtrado por filtros de nylon de 045 microm y vaciado a un vial

- Extracto en metanol de D acuminata y P reticulatum La microalgas aisladas por

micromanipulacioacuten bajo un microscopio invertido (siempre y cuando el nuacutemero de D acuminata y de P reticulatum fuera suficiente como para lograr reunir un nuacutemero cercano a las 30 ceacutelulas por cada especie) fueron puestas en un ependorf de 15 ml con 1 ml de metanol Para obtener el extracto de toxina las muestras fueron mezcladas en vortex y filtradas por filtros de nylon de 045 microm El extracto filtrado fue puesto en un vial Solo en una ocasioacuten fue posible acumular un nuacutemero suficiente de ceacutelulas de D acuta por ello fue posible obtener solo una muestra para esta especie

- Todos los extractos fueron secados con nitroacutegeno gas a 38ordmC Este proceso evita los problemas

de traslado de extractos en solventes orgaacutenicos y yo evitar eventuales peacuterdidas de liacutequidos en las muestras durante el trayecto

32 Laboratorio de anaacutelisis dotado de LC-MSMS La metodologiacutea para el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas se realizoacute mediante espectrometriacutea de masas acoplada a un cromatoacutegrafo liacutequido (LC-MSMS) Por tratarse de una teacutecnica auacuten no implementada en Chile en aspectos de determinacioacuten de toxinas marinas a nivel comercial y certificada ni tampoco para realizar investigacioacuten baacutesica de rutina fue necesario enviar las muestras a un laboratorio extranjero certificado Tal laboratorio pertenece al Instituto Tecnoloacutegico del Mar (INTECMAR) Galicia Espantildea

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El contacto se realizoacute a traveacutes de grupos de investigacioacuten extranjeros de vasta y reconocida experiencia en el tema para prospectar la factibilidad de donde realizar los anaacutelisis Los mismos aconsejaron al laboratorio perteneciente a INTECMAR INTECMAR es una entidad de investigacioacuten estatal encargada de realizar los monitoreos semanales en Galicia donde tambieacuten se encuentra fiacutesicamente su sede Actualmente estaacute certificada para la deteccioacuten de toxinas lipofiacutelicas en moluscos entre otros anaacutelisis que realiza (Anexo 1 y 2) El Anexo 2 contiene el costo del anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas (equivalente a cotizacioacuten) El laboratorio seleccionado posee un cromatoacutegrafo UPLC Acquity Waters acoplado a un triple cuadrupolo Waters Xevo TQ con la suficiente sensibilidad en la deteccioacuten de toxinas en microalgas aisladas por micromanipulacioacuten sensibilidad que fuera confirmada anteriormente al establecer cuantitativamente el perfil de toxinas lipofiacutelicas en muestras de microalgas aisladas desde muestras de sedimentos de Magallanes (ver Anexo 3) Previo al enviacuteo de extractos de moluscos y contrato de ensayo de anaacutelisis exigido por INTECMAR se realizoacute la consulta acerca de nuestro intereacutes tambieacuten por analizar toxinas en microalgas aun cuando no estuviesen certificados en esta matriz en particular La solicitud de anaacutelisis fue aceptada por parte de INTECMAR Una vez aceptado el contrato de ensayo por parte de INTECMAR (Anexo 4) se procedioacute entonces a enviar las muestras de 29 extractos de microalgas y 29 extractos de moluscos mientras INTECMAR facturoacute por costos de anaacutelisis solicitados por IFOP en el contrato de ensayo (Anexo 5) Si bien el nuacutemero de extractos obtenidos fue cercano a las 140 muestras el nuacutemero de muestras enviadas se ajustoacute al presupuesto otorgado para este proyecto al mismo tiempo que la informacioacuten obtenida fuera suficiente como para tener una visioacuten regional de los perfiles de toxinas que estuvieron presentes durante la floracioacuten estival de 2013 33 Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por LC-MSMS

Las toxinas lipofiacutelicas a determinar en las muestras fueron aacutecido okadaico (AO) dinofisistoxina-2 (DTX2) dinofisistoxina-1 (DTX1) pectenotoxinas (PTX1 PTX2) azaspiraacutecidos (AZA1 AZA2 AZA3) yesotoxinas (YTX homoYTX 45OHYTX 45OHhomoYTX) y espiroacutelidos (SPX1) El anaacutelisis se realizoacute con los siguientes elementos

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Equipos

Sistema cromatograacutefico Acquity Ultra Performance (Coacutedigo B191C)

Espectroacutemetro de masas equipado con interfase ESI y taacutendem MSMS Xevo TQMS (Coacutedigo B192C)

Software del programa TargetLynx (Coacutedigo 196)

Columna cromatograacutefica de fase reversa C18 17 microm 21 x 100 mm Acquity UPLC BEH

Reactivos y disolventes

Metanol grado HPLC gradiente

H2O Milli-Q Ellix

Acetonitrilo grado HPLC o Hipergrado para LC-MS

Acido foacutermico 98-100

Hidroacutexido amoacutenico 25

MeOHAgua 50

AcetonitriloAgua 90

Aacutecido clorhiacutedrico 37

Disolucioacuten de aacutecido clorhiacutedrico 25 M Hidroacutexido Soacutedico (le 99 pureza)

Disolucioacuten de hidroacutexido soacutedico 25 M

Disolventes cromatograacuteficos

Disolucioacuten tampoacuten hidroacutexido amoacutenico al 0125

Fase moacutevil A Agua conteniendo 67 mM de NH4OH

Fase moacutevil B Acetonitrilo conteniendo 67 mM de NH4OH

Cada fase moacutevil se filtra a vaciacuteo a traveacutes de filtros de membrana de nylon de 022 microm

Toxinas de Referencia

Disolucioacuten certificada de aacutecido ocadaico en metanol (NRC CRM-OA-c) Cod PB015

Disolucioacuten certificada de Yessotoxina Yessotoxin di-sodium salt en metanol (CRM-00-YTX) Cod PB018

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Disolucioacuten certificada de Homo-yessotoxina 1aHomoyessotoxin di-sodium salt en metanol (CRM-00-hYTX) Cod PB019

Disolucioacuten certificada de calibracioacuten de Azaspiraacutecido 1 en metanol (NRC CRM-AZA1) Cod PB020

Disolucioacuten certificada de calibracioacuten de Azaspiraacutecido 2 en metanol (NRC CRM-AZA2) Cod PB021

Disolucioacuten certificada de calibracioacuten de Azaspiraacutecido 3 en metanol (NRC CRM-AZA3) Cod PB022

Disolucioacuten de calibracioacuten de Dinofisistoxina 2 en metanol (00-DTX2) Cod PB026

Disolucioacuten de calibracioacuten de Dinofisistoxina 1 en metanol (CRM-00-DTX1) Cod PB032

Disolucioacuten de calibracioacuten de Pectenotoxina 2 en metanol (00-PTX2) Cod PB031

Material de Referencia Certificado (Mussel Tissue Reference Material for DSP Toxins NRC CRM-DSP-Mus-b) con AO y DTX1 101 plusmn 08 microgg y 13 plusmn 02 microgg respectivamente Homogeneizado de mejilloacuten (Mytilus edulis) Cod PB014

Material de Referencia Certificado (Mussel Tissue Reference Material for AZA Toxins NRC CRM-AZA-Mus) con AZA1 116 plusmn 010 microgg AZA2 0273 plusmn 0023 microgg y AZA3 0211 plusmn 0022 microgg Homogeneizado de mejilloacuten (Mytilus edulis) Cod PB030

Disolucioacuten certificada de calibracioacuten de 13-dismetil espiroacutelido C en metanol (NRC CRM-SPX1) Cod PB027

La Tabla 1 muestra las condiciones cromatograacuteficas usando una columna de UPLC C18 en fase reversa y medio baacutesico mientras que los paraacutemetros de la fuente de ionizacioacuten para el Xevo TQMS (Waters) se muestran en la Tabla 2

34 Extraccioacuten de toxinas

A los extractos metanoacutelicos en seco de las 29 muestras de moluscos y 29 muestras de microalgas se le adicionaron hasta un total de 25 mL de metanol dispensadas en pequentildeas aliacutecuotas agitando el vial con un vortex durante 30 segundos Anaacutelisis de las formas libres del AO DTX1 y DTX2 y de las toxinas de los grupos PTXs AZAs y YTXs Para la determinacioacuten de las formas libres del AO DTX1 y DTX2 y de las toxinas de los grupos PTXs AZAs y YTXs se filtroacute un volumen de aproximadamente 12 ml del extracto metanoacutelico a traveacutes de filtros

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de jeringa de 045 microm para su posterior hidroacutelisis (seccioacuten siguiente) Otra aliacutecuota del mismo extracto filtrada a traveacutes de filtro de jeringa compatible con el disolvente de 022 microm se diluyoacute a la mitad con MeOH 100 y se inyectoacute 5 microl en el sistema LC-MSMS Hidroacutelisis y cuantificacioacuten del contenido total de AO DTX1 y DTX2 Para detectar y cuantificar el contenido total de AO DTX1 y DTX2 se requiere una hidroacutelisis baacutesica previa a la inyeccioacuten de los extractos en el sistema de LC-MSMS Procedimiento En un vial que contiene 1 ml de extracto metanoacutelico previamente filtrado por filtros de jeringa de 045 microm se antildeaden 125 microl de NaOH 25 M se agita manualmente 10 segundos y la mezcla fue sometida a 76 plusmn 4 ordmC durante 40 minutos en un bantildeo Se enfrioacute a temperatura ambiente se pesoacute y luego neutralizoacute con 125 microl de HCl 25 M Finalmente se homogenizoacute nuevamente con el vortex durante 30 segundos Una aliacutecuota del extracto resultante se filtroacute con filtros de jeringa de 022 microm y diluyoacute 58 con MeOH 100 Una aliacutecuota de 5 microl fue inyectada en el sistema de LC-MSMS Durante el proceso de hidroacutelisis el vial debe estar bien cerrado para evitar peacuterdidas por evaporacioacuten (la temperatura de ebullicioacuten del MeOH es 65 ordmC) Las peacuterdidas se pueden detectar mediante pesada del vial antes y despueacutes de la hidroacutelisis en caso de confirmarse se completaraacute el peso con metanol La deteccioacuten con el espectroacutemetro de masas se realizoacute usando dos transiciones por toxina la de mayor intensidad se utilizoacute para cuantificar y la de menor intensidad para confirmar (Tabla 3) Identificacioacuten y Confirmacioacuten La identificacioacuten de la presencia de toxinas se realizaraacute por comparacioacuten del tiempo de retencioacuten de cada una de las toxinas en la muestra con el tiempo de retencioacuten obtenido en las disoluciones de calibrado estaacutendar inyectadas en un mismo diacutea de anaacutelisis Se permite una desviacioacuten maacutexima entre ambos tiempos del 25 Para las toxinas que se cuantifican con la recta de calibrado del anaacutelogo correspondiente se establece un TRR con una tolerancia seguacuten se indica en la Tabla 4 Para una correcta identificacioacuten se exige una separacioacuten entre picos calculada mediante aplicacioacuten de la expresioacuten

2 x (RT2-RT1) RS = ----------------------

(W1+W2)

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En donde RT1 y RT2 y W1 y W2 son respectivamente los tiempos de retencioacuten y las anchuras en la liacutenea base de dos picos adyacentes RT2gtRT1 La resolucioacuten seraacute aceptable cuando Rs gt10 y la resolucioacuten a liacutenea base se consideraraacute completa cuando Rs gt15 La confirmacioacuten de la presencia de toxina seguacuten el criterio de la Decisioacuten de la Comisioacuten 2002657EC se basa en la relacioacuten entre las dos transiciones empleadas para la determinacioacuten (cuantificacioacuten y confirmacioacuten)

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4 RESULTADOS

41 Toxinas en moluscos

Las toxinas detectadas en moluscos fueron PTX2 YTX 45OHYTX DTX1 y SPX1 (Tabla 5) La mayor concentracioacuten la presentoacute el grupo de las YTXs (40-294 microg kg-1) en muestras de choritos provenientes del sector de Seno Otway (Fig 1) En este mismo sector las PTXs tambieacuten presentaron las mayores concentraciones (3-45 microg kg-1) en estos transvectores En el caso del ostioacuten tanto el PTX2 como las YTXs fueron detectadas en el contenido gaacutestrico El DTX1 fue detectado en choritos (1-18 microg kg-1 considerando DTX1 libre y total) procedentes del sector Seno Otway y sectores adyacentes a Punta Arenas El AO no fue detectado en ninguna aacuterea de la Regioacuten Los SPXs fueron principalmente detectados en choritos de las aacutereas centro y sur de Magallanes y en una estacioacuten del estero Peel (M13) en el aacuterea norte de la regioacuten No obstante que los niveles son muy bajos (01- 25 microg kg-1) incluso del nivel letal 50 en ratones inyectados intraperitonealmente 40 microg kg-1 (Richard et al 2000) los valores encontrados son iguales o mayor al encontrado en el caracol piquilhue recolectado en julio de 2012 y que en ese entonces produjo la muerte de ratones provocando el cierre de aacutereas de extraccioacuten por la autoridad de salud regional (Anexo 6) De las cinco toxinas detectadas en los moluscos solo DTX1 mostroacute estar localizada en el aacuterea centro de Magallanes mientras que las restantes fueron detectadas en las tres aacutereas de monitoreo Norte centro y sur de Magallanes No se encontraron PTX1 DTX2 ni AZPs en las muestras de moluscos Los resultados muestran que de los cuatro grupos de toxinas PTX YTXs DTXs y SPXs tres de ellas pueden estar presentes simultaacuteneamente en los moluscos vale decir PTXs YTXs y DTX1 o bien SPXs en vez de DTX1 42 Toxinas en microalgas

En las microalgas se detectaron PTXs y YTXs (Tabla 6) Las PTXs fueron detectadas aunque a nivel de trazas en ceacutelulas de D acuminata seleccionadas por micromanipulacioacuten desde muestras de agua procedentes de estero Silva Palma (M25) estero Wickham (M26) y Cutter Cove (M29) (Fig1) Tambieacuten fue detectada en filtrados de agua (fitoplancton) de Pto Fontaine (M21) e I Engelfield (M29N1) Las YTXs fueron detectadas en ceacutelulas de P reticulatum seleccionadas por micromanipulacioacuten y en cultivos de esta microalga que se logroacute establecer a partir de muestras de agua provenientes de C Adalberto (M04) Cutter Cove (M29) e I Engelfield (M29N1) Solo en los cultivos se detectoacute

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homoYTX y en uno de ellos tambieacuten se detectoacute aunque miacutenimamente 45OHYTX un derivado de la YTX que normalmente se encuentra en los moluscos como producto de bio-transformacioacuten La presencia de 45OHYTX en el cultivo pudo deberse a la presencia de ceacutelulas ya en fase de declinacioacuten de la curva de crecimiento

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5 ANAacuteLISIS Y DISCUSIOacuteN DE LOS DATOS

51 Toxinas en moluscos De las toxinas lipofiacutelicas se sabe que AO DTXs y AZAs causan trastornos gastrointestinales en los seres humanos (Gerssen et al 2010) Para las toxinas restantes (YTXs PTXs y SPXs) auacuten cuando no se han reportado casos de intoxicacioacuten en los seres humanos eacutestas son letales o altamente toacutexicas cuando los ratones son inyectados por viacutea intraperitoneal (Paz et al 2008 Richard et al 2000 Miles et al 2004) Es el caso de los SPXs la toxicidad en ratones inyectados por viacutea intraperitoneal supera a la del resto de las toxinas pues su dosis letal 50 es de 40 microg kg-1 (Richard et al 2000) Tal es asiacute que como referencia (Tabla 5) el transvector caracol piquilhue recolectadas en Julio de 2012 y cuyos niveles de toxicidad provocaron la muerte de los ratones solo presentoacute 01 microg kg-1 deteccioacuten que fue realizada durante este estudio en muestras de carne almacenadas durante no maacutes de 1 antildeo a -20 ordmC Sin embargo no se puede descartar una peacuterdida de la actividad por transformacioacuten durante el periodo de conservacioacuten A excepcioacuten de los SPXs el resto de las toxinas mencionadas estaacuten reguladas por la legislacioacuten europea tanto para consumo interno como importacioacuten de moluscos y tunicados para garantizar la salud de las personas Asiacute tambieacuten estaacuten reguladas por la legislacioacuten chilena a traveacutes del Instituto de Salud Puacuteblica (ISP) estableciendo los mismos niveles de referencia europeo en base al bioensayo ratoacuten Aun cuando los niveles de toxinas detectadas en los moluscos durante este estudio estaacuten por debajo de lo exigido por las regulaciones e incluso de los niveles propuestos por el EFSA (Tabla 7) la presencia de dos y tres tipos de toxinas en los moluscos representa una complejidad en la determinacioacuten de los niveles de toxicidad especialmente si se encuentran presentes toxinas altamente toacutexicas para ratones inyectados intraperitonealmente como son los SPXs Aunque se sospechaba la concurrencia de diferentes tipos de toxinas tal hecho no habiacutea sido confirmado anteriormente Sin embargo los SPXs siguen siendo una incoacutegnita pues se desconoce la fuente de estas toxinas A ostenfeldii la especie que podriacutea ser candidata a confirmar estuvo ausente (Tabla 8 modificado de Guzmaacuten et al 2014) durante el periodo en que se detectoacute en los moluscos Los escasos antecedentes toxigeacutenicos de esta especie en Chile la han confirmado como productora de toxinas paralizantes en Ayseacuten (Pizarro et al 2012) pero no de SPXs No obstante la produccioacuten de SPXs por esta especie en la regioacuten de Magallanes auacuten no se puede descartar Las YTXs fueron las toxinas maacutes abundantes en los moluscos analizados condicioacuten que se corresponde con la alta abundancia relativa de esta especie en el ambiente (Tabla 8) en la mayoriacutea de los casos (Tabla 5)

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Los resultados sugieren que los falsos positivos por bioensayo ratoacuten pudieran ser maacutes frecuentes de lo que se piensa actualmente para la regioacuten de Magallanes 52 Toxinas en microalgas Los resultados indican que P reticulatum encontrado en Magallanes producen YTXs al igual que las especies reportadas en la regioacuten de Antofagasta y Ayseacuten (Aacutelvarez et al 2011 Pizarro et al 2012) Tal resultado hace altamente probable que esta especie es la fuente de YTXs detectadas en los moluscos durante el periodo de estudio De acuerdo a las toxinas detectadas en las muestras de D acuminata aisladas asiacute como en el fitoplancton con gran abundancia de esta especie (Tabla 8) sugiere que esta microalga podriacutea ser una fuente primaria de PTXs tal como ocurre en el norte y sur del paiacutes (Blanco et al 2007 Fux et al 2011) Aunque la especie tambieacuten ha sido asociada a la presencia de DTX1 en moluscos en un evento toacutexico ocurrido en 1998 en Magallanes (Uribe et al 2001) el DTX1 no fue detectado en las muestras de D acuminata durante este estudio El no hallazgo de DTX1 en estas muestras pudo deberse a una fuente microalgal distinta como D acuta yo P lima D acuta ha sido asociada a DTX1 en moluscos de la regioacuten de Ayseacuten (Lembeye et al 1993 y Zhao et al 1993) mientras que P lima es productora solo de DTX1 en la regioacuten de Magallanes (Salgado et al 2012) Sin embargo cuando se detectoacute DTX1 en las muestras de moluscos durante este estudio D acuta estuvo ausente en las muestras de agua mientras que D acuminata presentoacute una abundancia relativa alta Por otro lado el volumen de resuspensioacuten de los extractos pudo ser elevado al seguir el mismo procedimiento protocolar que se aplica a las muestras de moluscos de acuerdo a la normativa europea actual Por tal razoacuten el LC-MSMS no logroacute detectar PTXs ni DTX1 en las muestras de microalgas En estos casos un protocolo para el anaacutelisis de las microalgas debiera incluir un volumen menor de resuspensioacuten de los extractos secos en referencia al utilizado para los moluscos o bien seleccionar por micromanipulacioacuten un nuacutemero mayor de microalgas (gt 130 ceacutelulas) Sin embargo esto uacuteltimo es maacutes difiacutecil de lograr en latitudes australes debido a la baja densidad de ceacutelulas en las que se presenta normalmente esta especie en condiciones naturales Por tal motivo se recomienda realizar pruebas con un volumen de resuspensioacuten menor a 1 mL aun cuando se trate de un LC-MSMS triple cuadrupolo

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6 CONCLUSIONES

a Los moluscos de la regioacuten de Magallanes pueden presentar PTX2 YTX 45OHYTX DTX1 y SPX1

b El hecho que los moluscos puedan presentar dos o maacutes tipos de toxinas lipofiacutelicas dificulta establecer el nivel de toxicidad total

c P reticulatum en Magallanes produce YTXs al igual que la especie del norte y sur del paiacutes

d La abundancia relativa ambiental de P reticulatum durante el periodo de estudio coincidioacute con la presencia de YTXs en los moluscos

e Los SPXs encontrados anteriormente en caracoles piquilhue tambieacuten fue posible detectarlos en choritos durante este estudio

f Auacuten queda por confirmar el tipo de SPXs presentes y su eventual fuente primaria La presencia de SPXs en los moluscos no siempre coincidioacute con la presencia de A ostenfeldii en el ambiente y su abundancia relativa maacutexima fue solo de nivel 1 (raro) durante el periodo de estudio

g La PTX2 detectada en los moluscos coincidioacute con una alta abundancia relativa ambiental de D acuminata No obstante auacuten queda por confirmar si esta especie es la fuente primaria Para ello se hace necesario ajustar (disminuir) el volumen de dilucioacuten de los extractos secos de microalgas aisladas por micromanipulacioacuten aun cuando se trata de un espectroacutemetro de masas como un triple cuadrupolo

h La deteccioacuten de DTX1 en los moluscos coincidioacute con la ausencia de D acuta en el ambiente La toxina tampoco fue detectada en los moluscos cuando esta microalga estuvo a niveles de 2 y 3 (escaso y regular) Queda por confirmar la produccioacuten de DTX1 por esta especie en Magallanes

i No se encontraron PTX1 DTX2 ni AZPs en las muestras de moluscos durante el periodo de estudio

j Los resultados demuestran la presencia de toxinas en los moluscos que se hace necesario identificar y cuantificar utilizando teacutecnicas distintas al bioensayo

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southeastern Pacific Ocean reveal a diverse but patchy distribution of phycotoxins Toxicon 58(5) 389ndash397

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F I G U R A

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Figura 1 Estaciones y sectores muestreados (ciacuterculo rojo) y sector Fortuna donde fue recolectado el

caracol piquilhue (ciacuterculo amarillo)

T A B L A S

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Tabla 1 Condiciones cromatograacuteficas para el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas usando

una columna de UPLC C18 en fase reversa y medio baacutesico

Columna Acquity UPLC BEH C18 17 microm 21x100 mm

Temperatura columna 45 ordmC

Flujo 04 mlmin

Volumen inyeccioacuten 5 microl

Temperatura muestras 10 plusmn 5 ordmC

Gradiente

Tiempo (min) Fase A () Fase B ()

0 75 25

066 75 25

330 5 95

528 5 95

726 75 25

900 75 25

Tabla 2 Paraacutemetros de la fuente de ionizacioacuten para el Xevo TQMS (Waters) en la determinacioacuten de toxinas lipofiacutelicas

PARAacuteMETROS DE LA FUENTE

ESI- ESI+

AO DTX2 DTX1 YTX homoYTX 45OH YTX y 45OH

homoYTX

AZA1 AZA2 AZA3 PTX2 PTX1 y SPX1

Voltaje de capilar (V) 100 200

Temperatura de solvatacioacuten (ordmC) 450 450

Flujo gas de solvatacioacuten (lh) 850 850

Flujo gas cono (lh) 50 50

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Tabla 3

Resumen de las condiciones de espectrometriacutea de masas empleadas con el Xevo TQMS (Waters) en el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas

Compuesto tR (min)

ESI

Ioacuten Precursor

(mz)

Ioacuten Producto

(mz)

Dwell time (s)

Energiacutea colisioacuten

(eV)

Voltaje cono (V)

AO 189 NEG 8035 2552 0010 46 86

113 0010 56 86

DTX2 210 NEG 8035 2552 0010 46 86

113 0010 56 86

DTX1 214 NEG 8175 5634 0010 43 86

2552 0010 48 86

YTX 202 NEG 5704 4674 0010 30 45

3963 0010 35 45

45OH-YTX 182 NEG 5784 4674 0010 30 45

3964 0010 30 45

HomoYTX 203 NEG 5775 4744 0010 30 48

4034 0010 30 48

45OH-homoYTX 182 NEG 5855 4034 0010 30 45

4744 0010 30 45

PTX1 306 POS 8925 8395 0015 25 36

8215 0015 25 36

PTX2 362 POS 8765 8415 0015 20 36

8235 0015 25 36

AZA1 263 POS 8425 6545 0015 55 50

3622 0015 50 50

AZA2 270 POS 8565 6725 0015 45 27

6545 0015 45 27

AZA3 236 POS 8285 6404 0015 55 47

3622 0015 55 47

SPX1 368 POS 6925 6744 0015 27 60

1643 0015 42 60 Transicioacuten cuantificadora

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Tabla 4 TRR y valores de tolerancia para las toxinas analizadas

TOXINA TRR TOLERANCIA

Toxinas del grupo de AO

AO 1000 0990-1010

DTX2 1040 1014-1066

DTX1 1140 1111-1168

Toxinas del grupo de PTX

PTX2 1000 0990-1010

PTX1 0850 0829-0871

Toxinas del grupo de YTX

YTX 1000 0990-1010

45OH-YTX 0894 0871-0916

Homo YTX 1000 0990-1010

45OH-homoYTX 0899 0876-0921

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Tabla 5 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de moluscos

Nordm estMes

recolectaLocalidad Molusco

cuerpo

enterohepat

gramos

carne

toxicidad

VDM ratoacuten

PTX2

(ugKg)

YTX

(ugKg)

45OHYTX

(ugKg)

DTX1

libre

(ugKg)

DTX1

total

(ugkg)

SPX 1

(ugKg)

M13 ene-13 E Peel chorito x 5086 + 01 02

M13 ene-13 E Peel ostioacuten x 5155 No real izado 16 21

M33 ene-13 B Bell chorito x 5253 + 04

M37 ene-13 B Agua Fresca chorito x 5039 + 05 01

M35 ene-13 C San Isidro chorito x 5289 + 000 01

M42 ene-13 V Holanda chorito x 5231 + 06 13

M43 ene-13 B Yendegaia chorito x 5193 + 04 25

M45 ene-13 Pto Williams chorito x 5161 - 28 07

M08 feb-13 E Falcon cholga x 5027 - 14

M09 feb-13 E Penguumlin cholga x 5103 + 14

M22 feb-13 E de las Montantildeas cholga x 5052 - 26

M23 feb-13 I Ballesteros cholga x 5204 - 87

M24 feb-13 B Fanny chorito x 2016 - 38 1071 479 12

M25 feb-13 E Silva Palma chorito x 1447 - 59 1077 898 09

M26 feb-13 E Wickham chorito x 1093 - 194 2940 2232 66 66

M27 feb-13 E Sullivan chorito x 1137 - 450 1944 1478

M28 feb-13 E Nuntildeez chorito x 1179 + 33 721 407

M29 feb-13 Cutter Cove chorito x 1003 - 65 501 309

M29N1 feb-13 I Engelfield chorito x 1116 - 297 2007 1483

M31 feb-13 B Nash chorito x 2231 +

M33 feb-13 B Bell chorito x 1181 - 93

M34 feb-13 S Pedro chorito x 0726 -

M35 feb-13 C San Isidro chorito x 1178 + 110

M36 feb-13 B Buena chorito x 1367 +

M37 feb-13 B Agua Fresca chorito x 0850 + 45 100 80

M39 feb-13 Pto Zenteno chorito x 3241 + 28

M39N2 feb-13 Pta San Valentin chorito x 1712 - 11

M39N3 feb-13 Pto Yartou chorito x 2035 - 11

sector

Fortunajul-12 B Inuacutetil

caracol

piquilhuex 107000 + 01

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo TABLAS

Tabla 6 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de microalgas

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo TABLAS

Tabla 7 Niveles actualmente permitidos por la legislacioacuten europea (bioensayo) y los niveles propuestos por la

autoridad europea para la seguridad alimentaria (EFSA) (Gerssen et al 2010)

Toxin Legislacioacuten (μg kg-

1) Proposicioacuten

EFSA (μg kg-1)

Validacioacuten LC-MSMS

(μg kg-1)

OA and DTXs 160 45

PTXs 120

YTXs 1000 3750

AZAs 160 32

SPXs 400 (Gerssen et al2010)

European Food Safety Authority Decisioacuten 2002657 de la Unioacuten Europea EC Incluye PTXs

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo TABLAS

Tabla 8 Abundancia relativa ambiental de las microalgas al momento de recolectar las muestras de moluscos En rojo se indica la deteccioacuten de toxina positiva en los moluscos asociada a la supuesta microalga fuente PTXs (D

acuminata) YTXs (P reticulatum) SPXs (A ostenfeldii) DTX1 (A acuta)

(Tabla modificada de Guzmaacuten et al 2014)

A N E X O S

ANEXO 1

Certificacioacuten laboratorio INTECMAR

ANEXO 2

Lista de anaacutelisis que realiza INTECMAR y sus costos (en euros) 2013

scv 1 de 7

GUIA PARA LA AUTOLIQUIDACIOacuteN DE TASAS A FAVOR DE LA COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA 2013 Los aspectos financieros de los servicios prestados por Intecmar en el marco de su actividad e vienen regulados en la Ley 62003 de 9 de diciembre de tasas precios y exenciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia (DOG nuacutem 240 de 11122003) y fueron actualizados posteriormente en la Ley 142010 de 27 de diciembre de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2011 (DOG nuacutem 250 de 30122010) y en la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013 (DOG nuacutem 42 de 28022013) Existen dos maneras de liquidar las tasas correspondientes a los servicios prestados por Intecmar

1 De forma manual cubriendo el modelo A de autoliquidacioacuten que se descarga en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda y que adjunto en pdf y se lleva al banco para su pago httpwwwconselleriadefacendaeswebportalconfeccion-impresos

2 De forma telemaacutetica en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda viacutenculo httpshostcixtecesXEITObinlionwebXeitodllxmit a traveacutes del modelo 730

Ambos modelos de liquidacioacuten de tasas adjuntamos ejemplo al final de este documento deben ser remitidos por mail a Intecmar con el sello del banco fiacutesico o virtual como paso previo a la emisioacuten del certificado Los coacutedigos generales necesarios son

minus Consejeriacutea de Medio Rural y de Mar Coacutedigo 09 minus Delegacioacuten de Pontevedra Coacutedigo 40 minus Servicio de Intecmar Coacutedigo 24

Los coacutedigos y descripcioacuten de las tasas son los regulados en la legislacioacuten vigente y los hemos resumido en los anexos siguientes Vilaxoaacuten 4 de marzo de 2013

scv 2 de 7

TARIFAS DE TASAS VIGENTES PARA 2013 - Ley 22013 d e 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013

(DOG nuacutem 42 de 28022013)

Estas tarifas son consecuencia de la actualizacioacuten de las tarifas contenidas en los anexos 1 2 3 4 y 5 de la Ley 62003 del 9 de diciembre de tasas precios y exacciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia por la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 Seraacuten aplicables desde el diacutea de la entrada en vigor de la Ley de

presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 TASA POR SERVICIOS ADMINISTRATIVOS

No sujecioacuten No se exigiraacute la tasa por servicios administrativos cuando se trate de compulsas o cotejos de documentos que deban acompantildear a solicitudes escritos o comunicaciones presentadas por el ciudadano y realizadas en el aacutembito de actuacioacuten de los registros seguacuten lo dispuesto en el artiacuteculo 385 de la Ley 301992 del 26 de noviembre de reacutegimen juriacutedico de las administraciones puacuteblicas y del procedimiento administrativo comuacuten

Excepciones Estaraacuten exentos de la presente tasa

1- La expedicioacuten de certificados de retribuciones satisfechas por la Xunta de Galicia con el objeto de justificacioacuten en relacioacuten con el impuesto sobre la renta de las personas fiacutesicas

2- La expedicioacuten de certificados y compulsa que el personal de la Administracioacuten solicite respecto a las necesidades propias del puesto de trabajo o relacioacuten de servicios

3- Los alumnos por cualquier actuacioacuten en materia de ensentildeanzas no universitarias

scv 3 de 7

4- Las compulsas realizadas en las oficinas de empleo para los desempleados en la tramitacioacuten de expedientes que sean competencia de dichas oficinas

5 La inscripcioacuten en las convocatorias para a seleccioacuten de personal de la comunidad autoacutenoma despueacutes de justificacioacuten documental solicitada por

- Personas con discapacidad igual o superior al 33 - Personas que sean miembros de familias numerosas clasificadas en la

categoriacutea especial Se aplicaraacute una bonificacioacuten del 50 a la inscripcioacuten solicitada por - Personas que sean miembros de familias numerosas de categoriacutea

general - Personas que figurasen como demandantes de empleo desde por lo

menos seis meses antes a la fecha de la convocatoria de pruebas selectivas de personal en las que soliciten su participacioacuten y no esteacuten percibiendo prestacioacuten o subsidio por desempleo

6- La expedicioacuten de certificados relativos a la situacioacuten fiscal 7- El Estado y los demaacutes entes puacuteblicos territoriales o institucionales

siempre que los servicios o actividades de que sean beneficiarios se presten o se realicen en el marco del principio de colaboracioacuten entre administraciones

8- Las viacutectimas de actos terroristas asiacute como sus coacutenyuges y sus hijos por cualquier actuacioacuten en materia educativa realizada en centros oficiales de estudios en todos los niveles de ensentildeanza

9- Los miembros de los organismos consultivos de la Administracioacuten puacuteblica gallega respecto de los certificados emitidos por dichos organismos

COacuteDIGO TASAS

DESCRIPCIOacuteN IMPORTE euro

314400 Prestacioacuten de servicios en el Instituto Tecnoloacutegico para el Control del Medio Marino de Galicia

314401 Anaacutelisis de biotoxinas marinas en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de Yasumoto 1978 4752

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en rato segundo o meacutetodo de Yasumoto 1984 5432

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS)

9520 -Anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten

seguacuten el meacutetodo de la AOAC 4752

scv 4 de 7

-Anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo da AOAC 4752

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1978 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10186

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1984 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10865

-Anaacutelisis combinada en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS) anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo AOAC y anaacutelisis de toxicidad de tipo ASP por cromatografiacutea liquida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo de la AOAC 15000

314402 Anaacutelisis de muestras en agua de mar -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton marino mediante

microscopiacutea oacuteptica 15133 -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton toacutexico marino

mediante microscopiacutea oacuteptica 13333 - Anaacutelisis de carbono orgaacutenico disuelto 5093 -Anaacutelisis de nutrientes inorgaacutenicos disueltos 3500 -Anaacutelisis de pigmentos fotosinteacuteticos (clorofila ldquoardquo) por

espectrofluorimetria 1698 314403 Anaacutelisis microbioloacutegicos en moluscos y otros organismos

procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Cuantificacioacuten de E Coli 10186 - Deteccioacuten de Salmonella spp 16975 -Enumeracioacuten de Escherichia coli en moluscos bivalvos

vivos por la teacutecnica de medida directa de impedancia con el sistema BacTrac 4300 6800

314404 Anaacutelisis de contaminantes de origen quiacutemica en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Determinacioacuten de metales pesados (Pb Cd Cu Zn As Hg Ni Cr Ag) mediante espectrofotometriacutea de absorcioacuten atoacutemica por metal

6790

-Determinacioacuten de compuestos bifenilos policlorados (PCB) mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

scv 5 de 7

-Determinacioacuten de pesticidas organoclorados mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

-Determinacioacuten de hidrocarburos aromaacuteticos policiacuteclicos (HAPs) mediante cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de fluorescencia

28200

314405 Anaacutelisis histopatoloacutegica de moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Estudio hispatoloacutegico Determinacioacuten de Bonamia Marteillia Perkinsus y otras alteraciones patoloacutegicas

101852

314406 Emisioacuten de certificaciones e informes teacutecnicos y otras actuaciones a peticioacuten del interesado

Emisioacuten de certificados a peticioacuten de los interesados sobre las actuaciones llevadas a cabo por el Instituto

1000

Emisioacuten de informes teacutecnicos a peticioacuten del interesado (euros por hora o fraccioacuten)

4000

scv 6 de 7

scv 7 de 7

ANEXO 3

Resultados de anaacutelisis en muestras de microalgas anteriormente enviadas procedentes de Magallanes por el equipo de espectrometriacutea de masas utilizado por INTECMAR Trabajo presentado a las XXXII

Congreso de Ciencias del Mar realizado en Punta Arenas 22-25 octubre de 2012

PERFIL DE TOXINAS DE PROROCENTRUM LIMA (DINOPHYCEAE) AISLADO DESDE LA COSTA DE MAGALLANES SUR DE CHILE P Salgado1 G Pizarro1 JM Franco2 P Rioboacute2 e I Bravo3

1Instituto de Fomento Pesquero (IFOP) Punta Arenas Chile gemitapizarroifopcl 2Instituto de Investigaciones Marinas (CSIC) Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea 3Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea

Prorocentrum lima (Ehrenberg) es un dinoflagelado marino bentoacutenico que se encuentra adherido generalmente

sobre macroalgas sedimentos y detrito flotante y menos comuacutenmente en el plancton (Bravo et al 2001) Es una especie neriacutetica y estuarina y su rango de distribucioacuten geograacutefica variacutea desde aguas costeras tropicales a templadas (Faust 1991) La importancia de P lima se debe a que son productoras de toxinas diarreogeacutenicas en las personas (veneno diarreico de los mariscos VDM) al igual que algunas especies de Dinophysis aunque raramente se le han asociado con episodios toacutexicos por VDM por su caraacutecter epiacutefito y bentoacutenico El complejo VDM producido por P lima incluye moleacuteculas conocidas como el aacutecido okadaico (AO) y derivados dinofisistoxinas (DTX-1 DTX-2) (Bravo et al 2001 Vale et al 2009) No obstante existen casos citados para USA donde se detectoacute toxicidad por VDM en bivalvos de cultivos asociadas a P lima aunque en bajos niveles (Maranda et al 2007a) En Canadaacute tambieacuten se llevoacute a cabo un estudio en moluscos de cultivo cuya finalidad fue determinar el origen del VDM en la que P lima fue la principal especie sospechosa tras la ocurrencia de un evento toacutexico humano por VDM ocurrido en 1998 (Levasseur et al 2003) y en antildeos anteriores (Quilliam et al 1993) Aunque Levasseur et al (2003) no logroacute probar la toxicidad de los mariscos en cultivo a causa de P lima cabe hacer notar que lo que buscaron fue OA y DTX1 no DTX 3 este uacuteltimo principal derivado de las anteriores tras su transformacioacuten en los moluscos (eg Suzuki et al 1999 Vale amp Sampayo 2002)

En consecuencia el rol de P lima en eventos toacutexicos por VDM auacuten no puede descartarse por cuanto podriacutean llegar a ser importantes en ambientes turbulentos debido a la eventual remocioacuten de microalgas adheridas en sustratos por efecto de vientos (Levasseur et al 2003) factor de importancia si se trata de sedimentos o contrariamente en zonas someras y estables de cultivos de moluscos que al mismo tiempo favorecen microambientes para sustratos en los que prolifera la epiacutefita P lima (Lawrence et al 2000) quedando expuestas a re-suspensiones temporales que favorecen la filtracioacuten de estas microalgas por los bivalvos en cultivo (Maranda et al 2007a)

Chile posee escaso conocimiento sobre esta especie en su medio natural incluido su perfil de toxinas y potencial rol en la toxificacioacuten de moluscos por VDM Por tal razoacuten resultoacute interesante aportar al conocimiento de estos aspectos en muestras de sedimentos recolectadas en el estrecho de Magallanes en las que esta especie se encontroacute inhabitualmente abundante

Las ceacutelulas utilizadas en este estudio fueron aisladas desde sedimentos superficiales (0-3 cm) recolectados en el invierno de 2010 en la localidad de cabo San Isidro durante el muestreo regular del programa de monitoreo de marea roja en la regioacuten de Magallanes En esa oportunidad se logroacute cuantificar hasta 1002 quistes tecadoscm3 de Prorocentrum lima la mayor concentracioacuten respecto a otros sitios de recolecta (Fig 1) Los sedimentos de esta localidad presentaron una coloracioacuten oscura y un fuerte olor a sulfuro de hidroacutegeno (H2S) producto de anoxia local

Se aislaron entre 27 y 87 quistes tecados (Fig 1 a) directamente desde los sedimentos mientras otras 60 ceacutelulas vegetativas (Fig 1 b) fueron aisladas luego de promover la actividad y divisioacuten de los quistes en condiciones de 15 ordmC y un ciclo de luzoscuridad de 1212 horas (Tabla 1) Para este fin se aislaron quistes tecados y trasvasijaron a placas Petri de 5 cm de diaacutemetro conteniendo 5 mL de medio de cultivo L1 Para el anaacutelisis de toxinas las ceacutelulas aisladas fueron trasvasijadas a un tubo Eppendorf de 15 mL y congelados a -80 ordmC Una aliacutecuota de sedimento huacutemedo (100 microL aproximados) tambieacuten fue vaciada en un tubo Eppendorf y congelado Para extraer la toxina se antildeadioacute 500 microL de metanol 100 a cada tubo se mezcloacute por 1 min y filtroacute por 045 microm trasvasijando a un vial El extracto fue secado bajo nitroacutegeno gas a 40 ordmC y conservado a 4 ordmC hasta su anaacutelisis Previo al anaacutelisis de toxinas los extractos fueron resuspendidos en 150 microl de metanol

La presencia de la toxina dinofisistoxina 1 (DTX-1) en las muestras (Fig2) fue confirmada en modo negativo a traveacutes de su ioacuten precursor [M-H]- mz 8175 y sus iones productos mz 5634 y 2552 mediante un cromatoacutegrafo UPLC Acquity Waters acoplado a un triple cuadrupolo Waters Xevo TQ (LC-MS) La columna utilizada fue una Acquity UPLC BEH C18 17microm 21 x 100 mm a 45 ordmC La fase moacutevil consistioacute en (A) hidroacutexido amoacutenico a pH 11 y (B) hidroacutexido amoacutenico en acetonitrilo (67 mM) con una tasa de flujo de 4 mLmin El gradiente de elucioacuten utilizado fue el siguiente mantencioacuten al 75 de A entre 0 y 066 min cambio a 5 de A entre 066 y 330 min mantener 5

de A entre 330 y 528 min recuperacioacuten del 75 de A entre 528 y 726 min mantencioacuten al 75 de A hasta 9 min Se pinchoacute 5microL de muestra en el LC-MS El contenido de DTX-1 en las muestras fue cuantificado en base al ion precursor

Los tres tipos de muestras fueron positivas a la presencia de DTX-1 pero las ceacutelulas vegetativas fueron las que presentaron un mayor contenido de DTX-1 por ceacutelula La deteccioacuten de DTX-1 en los sedimentos (Tabla 2) reflejoacute la presencia de los quistes tecados en eacutestos

Figura 1 Concentraciones de quistes tecados de Prorocentrum lima (quistescm3 de sedimento huacutemedo) en estaciones de muestreo en el Estrecho de Magallanes (M26 Estero Wickham M29N1 Isla Engenfield M31 Bahiacutea Nash M35 Cabo San Isidro M39C1 Bahiacutea Gente Grande M39C2 Bahiacutea Inuacutetil M39C3 Canal Gabriel) y Canal Beagle (M41 Ventisquero Espantildea M42 Ventisquero Holanda) (a) Quistes tecados (b) ceacutelulas vegetativas obtenidas de germinacioacuten de quistes tecados bajo condiciones de laboratorio Barra de escala 20 microm

Tabla 1 Sedimento y ceacutelulas de Prorocentrum lima aisladas para anaacutelisis de toxinas

Extracto metanoacutelico Nordm de ceacutelulas TR ngmL pg DTX-1 ceacutel

G1 quistes tecados 27 213 lt2 -

G2 quistes tecados 67 214 05 11

G3 quistes tecados 87 215 12 21

G4 ceacutelulas vegetativas 60 215 34 87

G6 sedimentos aliacutecuota 213 13 19 pg microL sed

TR tiempo de retencioacuten

Figura 2 Cromatogramas de extractos metanoacutelicos de Prorocentrum lima quistes tecados (a) ceacutelulas vegetativas (b) y sedimentos (c)

Tabla 2 Caracteriacutesticas del sedimento con quistes tecados de Prorocentrum lima

Tipo Tamantildeo (mm)

Grava 2 35

Arena media 025 - 05 32

Arena muy fina 0063 - 0125 2

Limo-arcilla lt 0063 1

Estos resultados constituyen otra eventual posibilidad de toxicidad en los moluscos por VDM no soacutelo de aquellos con modalidad de vida bentoacutenica superficial sino de aquellos que tambieacuten viven enterrados en la arena (eg almeja huepo) Maacutes auacuten si se conoce que P lima posee la capacidad de desarrollar poblaciones naturales en aguas templadas en nuacutemeros que podriacutean justificar una toxicidad por VDM en los mariscos (eg Maranda et al 2007a b)

Referencias

Bravo I ML Fernaacutendez I Ramilo amp A Martinez 2001 Toxin composition of the toxic dinofagellate Prorocentrum lima isolated from different locations along the Galician coast (NW Spain) Toxicon 39 1537ndash1545

Faust MA 1991 Morphology of ciguatera-causing Prorocentrum lima (Pyrrophyta) from widely differing sites J Phycol 27 642-648

Lawrence J E Grant J Quilliam M A Bauder A G amp Cembella A D 2000 Colonizaition and growth of the toxic dinoflagellate Prorocentrum lima and associated fouling macroalgae on mussels in suspended culture Mar Ecol Prog Ser 201 147-154

Levasseur M Couture J Y Weise A M Michaud S Elbrachter M Sauveacute G amp Bonneau E 2003 Pelagic and epiphytic summer distributions of Prorocentrum lima and P mexicanum at two mussel farms in the Gulf of St Lawrence Aquat Microbiol Ecol 30283-293

Maranda L Corwin S Dover S amp Morton S L 2007a Prorocentrum lima (Dinophyceae) in northeastern USA coastal waters II Toxin load in the epibiota and in shellfish Harmful Algae 6 632-641

Maranda L Corwin S Hargraves P E 2007b Prorocentrum lima (Dinophyceae) in 19 northeastern USA coastal waters I Abundance and distribution Harmful Algae 6 623ndash631

Quilliam MA Gilgan MW amp Pleasance S 1993 Confirmation of an incident of diarrhetic shellfish poisoning in eastern Canada In Smayda TJ Shimizu Y (Eds) Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea Elsevier New York pp 547ndash552

Suzuki T Ota H amp Yamasaki M 1999 Direct evidence of transformation of dinophysistoxin-1 to 7-O-acyl-dinophysistoxin-1 (Dinophysis-3) in the scallop Patinopecten yessoensis Toxicon 37 187-198

Vale P amp Sampayo M A 2002 First confirmation of human diarrhoeic poisonings by okadaic acid esters after ingestion of razor clams (Solen marginatus) and green crabs (Carcinus maenas) in Aveiro lagoon Portugal and detection of okadaic acid esters in phytoplankton Toxicon 40989-996

Vale P Veloso V amp Amorim A 2009 Toxin composition of a Prorocentrum lima strain isolated from the Portuguese coast Toxicon 54145ndash152

Agradecimientos Intecmar de la Xunta de Galicia Espantildea donde se realizaron los anaacutelisis de toxinas proyecto

SUBPESCA ldquoManejo y Monitoreo de Mareas Rojas en las regiones de Los Lagos Ayseacuten y Magallanes IV etapa 2010rdquo

ANEXO 4

Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten

ANEXO 5

Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de Magallanes

TASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

O

EJE

MP

LA

R P

AR

A E

L IN

TE

RE

SA

DO

LIQ

UID

AC

IOacuteN

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

EN

TID

AD

BA

NC

AR

IATASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

0 9

4 0

2 4INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

AD

MIN

IST

RA

CIOacute

NTASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

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IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

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OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

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DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

9520 euros

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CONSELLERIA DE FACENDA

ANEXO 6

Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para cierre

de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

Seccioacuten Ediciones y Produccioacuten Almte Manuel Blanco Encalada 839

Fono 56-32-2151500 Valparaiacuteso Chile

wwwifopcl

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Srdquo

I N S T I T U T O D E F O M E N T O P E S Q U E R O

INFORME FINAL

ldquoAnaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas mediante LC-MSMS en muestras de fitoplancton y moluscos recolectadas durante la

la floracioacuten estival 2013 de Dinophysis spp en Magallanesrdquo

SUBSCRETARIacuteA DE ECONOMIA Y EMT Abril 2014

REQUIRENTE

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIA Y EMPRESAS DE

MENOR TAMANtildeO

Subsecretaria de Economiacutea y Empresas de Menor Tamantildeo Katia Trusich Ortiz

EJECUTOR

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO IFOP

Director Ejecutivo (I)

Jorge Castillo Pizarro

Jefe Divisioacuten Investigacioacuten en Acuicultura Leonardo Guzmaacuten Meacutendez

JEFE DEL PROYECTO

Gemita Pizarro Nova

AUTORA

Gemita Pizarro Nova

COLABORADORES

Claudia Zamora Amstein

Jorge Toro Mancilla Roberto Raimapo Raimapo

Ceacutesar Alarcoacuten Zapata Hernaacuten Pacheco Valles

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SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo

i

RESUMEN EJECUTIVO Este informe final incluye los resultados de los anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas en muestras de agua (fitoplancton y microalgas) y moluscos recolectados entre enero y febrero de 2013 en la regioacuten de Magallanes cuando ocurrioacute una floracioacuten de dinoflagelados entre los que destacaron Dinophysis acuminata y Protoceratium reticulatum Ambas especies eran sospechosas de producir toxinas lipofiacutelicas DTX1 y PTXs en el primer caso y YTXs en el segundo Tal floracioacuten se mantuvo intensa entre diciembre 2012 y febrero 2013 Las muestras de moluscos fitoplancton (agua) y microalgas aisladas por micromanipulacioacuten fueron recolectados en diferentes sectores de Magallanes durante el monitoreo regular de marea roja VII etapa 2013-14 que se realiza anualmente Los anaacutelisis de toxinas en las muestras fueron realizados por LC-MSMS en un laboratorio extranjero por tratarse de una teacutecnica auacuten no implementada en Chile para la deteccioacuten de toxinas marinas lipofiacutelicas certificada a nivel comercial ni tampoco para investigacioacuten baacutesica rutinaria Los resultados indican que en los moluscos se encontraban presentes pectenotoxina-2 (PTX2) yesotoxinas (YTXs) 45-hidroxi-yesotoxina (45OHYTX) dinofisistoxina-1 (DTX1) y espiroacutelidos (SPXs) La mayor concentracioacuten la presentoacute el grupo de las YTXs (40-294 microg kg-1) en muestras de choritos provenientes del sector de Seno Otway Igualmente la PTX2 se presentoacute en mayor concentracioacuten (3-45 microg kg-1) en este mismo sector y en los mismos transvectores Para el caso de contenido gaacutestrico de ostiones procedentes del aacuterea norte de Magallanes (estero Peel) se detectoacute tanto PTX2 como YTXs mientras que en cuerpo entero de chorito de la misma estacioacuten se detectoacute PTX2 y SPX1 El DTX1 fue detectado en choritos (1-18 microg kg-1 considerando DTX1 libre y total) procedentes del aacuterea centro de Magallanes (sector Seno Otway y sectores adyacentes a Punta Arenas) El AO no fue detectado en ninguna las aacutereas monitoreadas de la regioacuten Los SPXs fueron principalmente detectados en choritos de las aacutereas centro y sur de Magallanes y en una estacioacuten del aacuterea norte de la regioacuten (estero Peel) De las cinco toxinas detectadas en los moluscos solo DTX1 mostroacute estar localizada en el aacuterea centro de Magallanes mientras que las restantes fueron detectadas en las tres aacutereas de monitoreo Norte centro y sur de Magallanes No se encontroacute pectenotoxina-1 (PTX1) dinofisistoxina-2 (DTX2) ni azaspiraacutecidos (AZPs) en las muestras de moluscos

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ii

Los resultados muestran que de los cuatro grupos de toxinas PTXs YTXs DTXs y SPXs tres de ellas estuvieron presentes simultaacuteneamente en los moluscos vale decir PTX2 YTXs y DTX1 o bien PTXs YTXs y SPXs La presencia de PTX2 y DTX1 en moluscos fue coincidente con la mayor abundancia relativa de Dinophysis acuminata en el ambiente y no con D acuta que estuvo ausente Las YTXs fueron detectadas en los mismos transvectores y coincidioacute con una alta abundancia relativa de Protoceratium reticulatum En este uacuteltimo caso fue posible confirmar la produccioacuten de YTXs por P reticulatum en microalgas aisladas por micromanipulacioacuten y en cultivos establecidos a partir de aislamientos de esta especie desde muestras de agua procedentes del aacuterea norte y centro de Magallanes

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iii

IacuteNDICE GENERAL

Paacutegina

RESUMEN EJECUTIVO -------------------------------------------------------------------------------------------- i IacuteNDICE GENERAL --------------------------------------------------------------------------------------------------- iii IacuteNDICE DE FIGURA -------------------------------------------------------------------------------------------------- iv IacuteNDICE DE TABLAS ------------------------------------------------------------------------------------------------- iv IacuteNDICE DE ANEXOS ------------------------------------------------------------------------------------------------ v

1 ANTECEDENTES -------------------------------------------------------------------------------------------- 1

2 OBJETIVOS --------------------------------------------------------------------------------------------------- 2 21 Objetivo general ----------------------------------------------------------------------------------------- 3 22 Objetivo especiacutefico ------------------------------------------------------------------------------------- 3

3 METODOLOGIacuteA --------------------------------------------------------------------------------------------- 3 31 Obtencioacuten del extracto --------------------------------------------------------------------------------- 3 32 Laboratorio de anaacutelisis dotado con LC-MSMShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 3 33 Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por LC-MSMShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 4 34 Extraccioacuten de toxinashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 6

4 RESULTADOS ------------------------------------------------------------------------------------------------ 9 41 Toxinas en moluscoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 9 42 Toxinas en microalgashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 9

5 ANAacuteLISIS Y DISCUSIOacuteN DE LOS RESULTADOS helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 11 51 Toxinas en moluscoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 11 52 Toxinas en microalgashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 12

6 CONCLUSIONES --------------------------------------------------------------------------------------------- 13

7 REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS -------------------------------------------------------------------- 14

FIGURA

TABLAS

ANEXOS Anexo 1 Certificacioacuten laboratorio INTECMAR Anexo 2 Lista de anaacutelisis que realiza INTECMAR y sus costos (en euros) 2013 Anexo 3 Resultados de anaacutelisis en muestras de microalgas anteriormente enviadas procedentes de

Magallanes por el equipo de espectrometriacutea de masas utilizado por INTECMAR Trabajo presentado a las XXXII Congreso de Ciencias del Mar realizado en Punta Arenas 22-25 octubre de 2012

Anexo 4 Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten Anexo 5 Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de Magallanes Anexo 6 Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para

cierre de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

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iv

IacuteNDICE DE FIGURA

Figura 1 Estaciones y sectores muestreados (ciacuterculo rojo) y sector Fortuna donde fue recolectado el caracol piquilhue (ciacuterculo amarillo)

IacuteNDICE TABLAS

Tabla 1 Condiciones cromatograacuteficas para el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas usando una columna

de UPLC C18 en fase reversa y medio baacutesico Tabla 2 Paraacutemetros de la fuente de ionizacioacuten para el Xevo TQMS (Waters) en la determinacioacuten

de toxinas lipofiacutelicas Tabla 3 Resumen de las condiciones de espectrometriacutea de masas empleadas con el Xevo

TQMS (Waters) en el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas Tabla 4 TRR y valores de tolerancia para las toxinas analizadas Tabla 5 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de moluscos Tabla 6 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de microalgas Tabla 7 Niveles actualmente permitidos por la legislacioacuten europea (bioensayo) y los niveles

propuestos por la autoridad europea para la seguridad alimentaria (EFSA) (Gerssen et al 2010) European Food Safety Authority

Tabla 8 Abundancia relativa ambiental de las microalgas al momento de recolectar las muestras

de moluscos En rojo se indica la deteccioacuten de toxina positiva en los moluscos PTXs (D acuminata) YTXs (P reticulatum) SPXs (A ostenfeldii) DTX1 (A acuta) (Tabla modificada de Guzmaacuten et al 2014)

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v

IacuteNDICE ANEXOS

Anexo 1 Certificacioacuten laboratorio INTECMAR Anexo 2 Lista de anaacutelisis que realiza INTECMAR y sus costos (en euros) 2013 Anexo 3 Resultados de anaacutelisis en muestras de microalgas anteriormente enviadas

procedentes de Magallanes por el equipo de espectrometriacutea de masas utilizado por INTECMAR Trabajo presentado a las XXXII Congreso de Ciencias del Mar realizado en Punta Arenas 22-25 octubre de 2012

Anexo 4 Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten Anexo 5 Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de

Magallanes Anexo 6 Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para

cierre de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

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1

1 ANTECEDENTES En Chile auacuten existen escasos antecedentes acerca de las toxinas lipofiacutelicas presentes en nuestros moluscos asiacute como la fuente microalgal asociada a su produccioacuten y la variabilidad espacio-temporal de las mismas Tal situacioacuten es tambieacuten un problema en el sur austral de Chile y particularmente en Magallanes donde el historial de este tipo de toxinas ha sido opacado por la fuerte incidencia de toxina paralizante asociada a la presencia de Alexandrium catenella No obstante en los dos uacuteltimos antildeos los niveles de toxicidad por toxinas lipofiacutelicas en la regioacuten se han constituido en un problema para la autoridad de Salud pues han determinado el cierre de grandes extensiones de aacutereas a la extraccioacuten de moluscos hecho no acontecido anteriormente salvo muy local y esporaacutedicamente (eg Uribe et al 2001) ademaacutes del efecto econoacutemico y social

Dentro de las toxinas lipofiacutelicas las maacutes conocidas y frecuentes a nivel mundial por sus efectos diarreicos (veneno diarreico de los mariscos VDM) en humanos son el aacutecido okadaico y sus derivados las dinofisistoxinas (AO y DTXs) (eg Yasumoto et al 1978) tambieacuten conocidas como okadaatos Por lo mismo poseen un mayor historial de citas en la literatura cientiacutefica Los okadaatos son fuertes inhibidores de las proteiacutenas fosfatasas 1 y 2A y potenciales promotores de tumores (Yasumoto et al 1989 Fujiki et al 1989) con efectos croacutenicos desconocidos por lo que su efecto es maacutes lento Por esta razoacuten representan un riesgo para la salud puacuteblica y dan lugar a prolongadas vedas de extraccioacuten de bivalvos tanto de bancos naturales como centros de cultivo con las consiguientes peacuterdidas econoacutemicas para el sector pesquero y acuicultor en otras partes del mundo

Actualmente en Chile las toxinas lipofiacutelicas son detectadas por el bioensayo del ratoacuten una metodologiacutea semicuantitativa e inespeciacutefica Por lo mismo suelen ocurrir falsos positivos debido a la interferencia de otras toxinas lipofiacutelicas diferentes al VDM inocuas o no para el hombre pero que pueden estar presentes en las muestras inyectadas pues son co-extraiacutedas con los okadaatos

Gracias al uso de tecnologiacuteas de alta sensibilidad uacuteltimamente ha sido posible detectar junto a los okadaatos otras toxinas lipofiacutelicas de diverso efecto toacutexico tales como las yesotoxinas pectenotoxinas azaspiraacutecidos espiroacutelidos y gimnodimina (Zhao et al 1993 Yasumoto amp Takizawa 1997 Uribe et al 2001 Garciacutea et al 2005 Blanco et al 2007 Krock et al 2009 Aacutelvarez et al 2010 2011 Loacutepez et al 2010 Pizarro et al 2011 Fux et al 2011 Trefault et al 2011)

En Magallanes ha sido reportada la presencia de okadaatos (AO y DTXs) asociadas a la presencia de Dinophysis acuminata (Uribe et al 2001) Tambieacuten se ha reportado la presencia de yesotoxinas (YTXs) en moluscos Esta uacuteltima se sospecha estar asociada a la presencia de la especie Protoceratium reticulatum comprobada fuente primaria en Ayseacuten (Pizarro et al 2012) norte de Chile (Aacutelvarez et al 2011) y ampliamente conocida como tal a nivel mundial

Durante el periodo estival de 2013 en la regioacuten de Magallanes ocurrioacute una floracioacuten de dinoflagelados entre los que destacaron Dinophysis acuminata y Protoceratium reticulatum Tal floracioacuten se mantuvo intensa entre diciembre 2012 y febrero 2013 lo que permitioacute recolectar muestras de transvectores y microalgas para establecer yo confirmar los perfiles de toxinas lipofiacutelicas respectivas mediante LC-MSMS particularmente en una regioacuten con muy poca informacioacuten al respecto

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2

2 OBJETIVOS 21 General del proyecto

Establecer mediante LC-MSMS los perfiles de toxinas lipofiacutelicas en muestras de moluscos y de plancton recolectadas durante la floracioacuten de dinoflagelados ocurrida durante el verano 2013 en la regioacuten de Magallanes

22 Objetivo especiacutefico

Establecer los perfiles de toxinas lipofiacutelicas en transvectores centinelas fitoplancton y microalgas aisladas por micromanipulacioacuten recolectados en diferentes sectores de Magallanes durante el monitoreo regular realizados durante una floracioacuten de Dinophysis spp y Protoceratium reticulatum

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3

3 METODOLOGIacuteA En esta seccioacuten se describen las metodologiacuteas asociadas a las actividades realizadas para el logro de los objetivos asiacute como tambieacuten los conceptos e ideas que la fundamentan

31 Obtencioacuten del extracto - Carne de mariscos Dependiendo de la cantidad de material se procesoacute soacutelo el hepatopaacutencreas

o carne total Se maceroacute y pesoacute el material Se realizoacute extraccioacuten con metanol en una de 11 pv Los extractos fueron centrifugados y el sobrenadante filtrado por filtros de nylon de 045 microm y vaciado a un vial

- Extracto en metanol de muestras de fitoplancton (ie el ensamble total de microalgas sin separar

especies) Aliacutecuotas de agua previamente filtradas por malla de 250 microm para eliminar el zooplancton de tamantildeo mayor fueron filtradas en filtros de fibra de vidrio muflados de 13 mm de diaacutemetro (tamantildeo de poro nominal de 07 microm) Los filtros fueron puestos por separado seguacuten sitio de recolecta y fecha en ependorfs de 15 ml y congelados hasta ser extraiacutedos con 1 mL de metanol centrifugados El sobrenadante fue filtrado por filtros de nylon de 045 microm y vaciado a un vial

- Extracto en metanol de D acuminata y P reticulatum La microalgas aisladas por

micromanipulacioacuten bajo un microscopio invertido (siempre y cuando el nuacutemero de D acuminata y de P reticulatum fuera suficiente como para lograr reunir un nuacutemero cercano a las 30 ceacutelulas por cada especie) fueron puestas en un ependorf de 15 ml con 1 ml de metanol Para obtener el extracto de toxina las muestras fueron mezcladas en vortex y filtradas por filtros de nylon de 045 microm El extracto filtrado fue puesto en un vial Solo en una ocasioacuten fue posible acumular un nuacutemero suficiente de ceacutelulas de D acuta por ello fue posible obtener solo una muestra para esta especie

- Todos los extractos fueron secados con nitroacutegeno gas a 38ordmC Este proceso evita los problemas

de traslado de extractos en solventes orgaacutenicos y yo evitar eventuales peacuterdidas de liacutequidos en las muestras durante el trayecto

32 Laboratorio de anaacutelisis dotado de LC-MSMS La metodologiacutea para el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas se realizoacute mediante espectrometriacutea de masas acoplada a un cromatoacutegrafo liacutequido (LC-MSMS) Por tratarse de una teacutecnica auacuten no implementada en Chile en aspectos de determinacioacuten de toxinas marinas a nivel comercial y certificada ni tampoco para realizar investigacioacuten baacutesica de rutina fue necesario enviar las muestras a un laboratorio extranjero certificado Tal laboratorio pertenece al Instituto Tecnoloacutegico del Mar (INTECMAR) Galicia Espantildea

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4

El contacto se realizoacute a traveacutes de grupos de investigacioacuten extranjeros de vasta y reconocida experiencia en el tema para prospectar la factibilidad de donde realizar los anaacutelisis Los mismos aconsejaron al laboratorio perteneciente a INTECMAR INTECMAR es una entidad de investigacioacuten estatal encargada de realizar los monitoreos semanales en Galicia donde tambieacuten se encuentra fiacutesicamente su sede Actualmente estaacute certificada para la deteccioacuten de toxinas lipofiacutelicas en moluscos entre otros anaacutelisis que realiza (Anexo 1 y 2) El Anexo 2 contiene el costo del anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas (equivalente a cotizacioacuten) El laboratorio seleccionado posee un cromatoacutegrafo UPLC Acquity Waters acoplado a un triple cuadrupolo Waters Xevo TQ con la suficiente sensibilidad en la deteccioacuten de toxinas en microalgas aisladas por micromanipulacioacuten sensibilidad que fuera confirmada anteriormente al establecer cuantitativamente el perfil de toxinas lipofiacutelicas en muestras de microalgas aisladas desde muestras de sedimentos de Magallanes (ver Anexo 3) Previo al enviacuteo de extractos de moluscos y contrato de ensayo de anaacutelisis exigido por INTECMAR se realizoacute la consulta acerca de nuestro intereacutes tambieacuten por analizar toxinas en microalgas aun cuando no estuviesen certificados en esta matriz en particular La solicitud de anaacutelisis fue aceptada por parte de INTECMAR Una vez aceptado el contrato de ensayo por parte de INTECMAR (Anexo 4) se procedioacute entonces a enviar las muestras de 29 extractos de microalgas y 29 extractos de moluscos mientras INTECMAR facturoacute por costos de anaacutelisis solicitados por IFOP en el contrato de ensayo (Anexo 5) Si bien el nuacutemero de extractos obtenidos fue cercano a las 140 muestras el nuacutemero de muestras enviadas se ajustoacute al presupuesto otorgado para este proyecto al mismo tiempo que la informacioacuten obtenida fuera suficiente como para tener una visioacuten regional de los perfiles de toxinas que estuvieron presentes durante la floracioacuten estival de 2013 33 Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por LC-MSMS

Las toxinas lipofiacutelicas a determinar en las muestras fueron aacutecido okadaico (AO) dinofisistoxina-2 (DTX2) dinofisistoxina-1 (DTX1) pectenotoxinas (PTX1 PTX2) azaspiraacutecidos (AZA1 AZA2 AZA3) yesotoxinas (YTX homoYTX 45OHYTX 45OHhomoYTX) y espiroacutelidos (SPX1) El anaacutelisis se realizoacute con los siguientes elementos

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5

Equipos

Sistema cromatograacutefico Acquity Ultra Performance (Coacutedigo B191C)

Espectroacutemetro de masas equipado con interfase ESI y taacutendem MSMS Xevo TQMS (Coacutedigo B192C)

Software del programa TargetLynx (Coacutedigo 196)

Columna cromatograacutefica de fase reversa C18 17 microm 21 x 100 mm Acquity UPLC BEH

Reactivos y disolventes

Metanol grado HPLC gradiente

H2O Milli-Q Ellix

Acetonitrilo grado HPLC o Hipergrado para LC-MS

Acido foacutermico 98-100

Hidroacutexido amoacutenico 25

MeOHAgua 50

AcetonitriloAgua 90

Aacutecido clorhiacutedrico 37

Disolucioacuten de aacutecido clorhiacutedrico 25 M Hidroacutexido Soacutedico (le 99 pureza)

Disolucioacuten de hidroacutexido soacutedico 25 M

Disolventes cromatograacuteficos

Disolucioacuten tampoacuten hidroacutexido amoacutenico al 0125

Fase moacutevil A Agua conteniendo 67 mM de NH4OH

Fase moacutevil B Acetonitrilo conteniendo 67 mM de NH4OH

Cada fase moacutevil se filtra a vaciacuteo a traveacutes de filtros de membrana de nylon de 022 microm

Toxinas de Referencia

Disolucioacuten certificada de aacutecido ocadaico en metanol (NRC CRM-OA-c) Cod PB015

Disolucioacuten certificada de Yessotoxina Yessotoxin di-sodium salt en metanol (CRM-00-YTX) Cod PB018

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6

Disolucioacuten certificada de Homo-yessotoxina 1aHomoyessotoxin di-sodium salt en metanol (CRM-00-hYTX) Cod PB019

Disolucioacuten certificada de calibracioacuten de Azaspiraacutecido 1 en metanol (NRC CRM-AZA1) Cod PB020

Disolucioacuten certificada de calibracioacuten de Azaspiraacutecido 2 en metanol (NRC CRM-AZA2) Cod PB021

Disolucioacuten certificada de calibracioacuten de Azaspiraacutecido 3 en metanol (NRC CRM-AZA3) Cod PB022

Disolucioacuten de calibracioacuten de Dinofisistoxina 2 en metanol (00-DTX2) Cod PB026

Disolucioacuten de calibracioacuten de Dinofisistoxina 1 en metanol (CRM-00-DTX1) Cod PB032

Disolucioacuten de calibracioacuten de Pectenotoxina 2 en metanol (00-PTX2) Cod PB031

Material de Referencia Certificado (Mussel Tissue Reference Material for DSP Toxins NRC CRM-DSP-Mus-b) con AO y DTX1 101 plusmn 08 microgg y 13 plusmn 02 microgg respectivamente Homogeneizado de mejilloacuten (Mytilus edulis) Cod PB014

Material de Referencia Certificado (Mussel Tissue Reference Material for AZA Toxins NRC CRM-AZA-Mus) con AZA1 116 plusmn 010 microgg AZA2 0273 plusmn 0023 microgg y AZA3 0211 plusmn 0022 microgg Homogeneizado de mejilloacuten (Mytilus edulis) Cod PB030

Disolucioacuten certificada de calibracioacuten de 13-dismetil espiroacutelido C en metanol (NRC CRM-SPX1) Cod PB027

La Tabla 1 muestra las condiciones cromatograacuteficas usando una columna de UPLC C18 en fase reversa y medio baacutesico mientras que los paraacutemetros de la fuente de ionizacioacuten para el Xevo TQMS (Waters) se muestran en la Tabla 2

34 Extraccioacuten de toxinas

A los extractos metanoacutelicos en seco de las 29 muestras de moluscos y 29 muestras de microalgas se le adicionaron hasta un total de 25 mL de metanol dispensadas en pequentildeas aliacutecuotas agitando el vial con un vortex durante 30 segundos Anaacutelisis de las formas libres del AO DTX1 y DTX2 y de las toxinas de los grupos PTXs AZAs y YTXs Para la determinacioacuten de las formas libres del AO DTX1 y DTX2 y de las toxinas de los grupos PTXs AZAs y YTXs se filtroacute un volumen de aproximadamente 12 ml del extracto metanoacutelico a traveacutes de filtros

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de jeringa de 045 microm para su posterior hidroacutelisis (seccioacuten siguiente) Otra aliacutecuota del mismo extracto filtrada a traveacutes de filtro de jeringa compatible con el disolvente de 022 microm se diluyoacute a la mitad con MeOH 100 y se inyectoacute 5 microl en el sistema LC-MSMS Hidroacutelisis y cuantificacioacuten del contenido total de AO DTX1 y DTX2 Para detectar y cuantificar el contenido total de AO DTX1 y DTX2 se requiere una hidroacutelisis baacutesica previa a la inyeccioacuten de los extractos en el sistema de LC-MSMS Procedimiento En un vial que contiene 1 ml de extracto metanoacutelico previamente filtrado por filtros de jeringa de 045 microm se antildeaden 125 microl de NaOH 25 M se agita manualmente 10 segundos y la mezcla fue sometida a 76 plusmn 4 ordmC durante 40 minutos en un bantildeo Se enfrioacute a temperatura ambiente se pesoacute y luego neutralizoacute con 125 microl de HCl 25 M Finalmente se homogenizoacute nuevamente con el vortex durante 30 segundos Una aliacutecuota del extracto resultante se filtroacute con filtros de jeringa de 022 microm y diluyoacute 58 con MeOH 100 Una aliacutecuota de 5 microl fue inyectada en el sistema de LC-MSMS Durante el proceso de hidroacutelisis el vial debe estar bien cerrado para evitar peacuterdidas por evaporacioacuten (la temperatura de ebullicioacuten del MeOH es 65 ordmC) Las peacuterdidas se pueden detectar mediante pesada del vial antes y despueacutes de la hidroacutelisis en caso de confirmarse se completaraacute el peso con metanol La deteccioacuten con el espectroacutemetro de masas se realizoacute usando dos transiciones por toxina la de mayor intensidad se utilizoacute para cuantificar y la de menor intensidad para confirmar (Tabla 3) Identificacioacuten y Confirmacioacuten La identificacioacuten de la presencia de toxinas se realizaraacute por comparacioacuten del tiempo de retencioacuten de cada una de las toxinas en la muestra con el tiempo de retencioacuten obtenido en las disoluciones de calibrado estaacutendar inyectadas en un mismo diacutea de anaacutelisis Se permite una desviacioacuten maacutexima entre ambos tiempos del 25 Para las toxinas que se cuantifican con la recta de calibrado del anaacutelogo correspondiente se establece un TRR con una tolerancia seguacuten se indica en la Tabla 4 Para una correcta identificacioacuten se exige una separacioacuten entre picos calculada mediante aplicacioacuten de la expresioacuten

2 x (RT2-RT1) RS = ----------------------

(W1+W2)

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En donde RT1 y RT2 y W1 y W2 son respectivamente los tiempos de retencioacuten y las anchuras en la liacutenea base de dos picos adyacentes RT2gtRT1 La resolucioacuten seraacute aceptable cuando Rs gt10 y la resolucioacuten a liacutenea base se consideraraacute completa cuando Rs gt15 La confirmacioacuten de la presencia de toxina seguacuten el criterio de la Decisioacuten de la Comisioacuten 2002657EC se basa en la relacioacuten entre las dos transiciones empleadas para la determinacioacuten (cuantificacioacuten y confirmacioacuten)

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4 RESULTADOS

41 Toxinas en moluscos

Las toxinas detectadas en moluscos fueron PTX2 YTX 45OHYTX DTX1 y SPX1 (Tabla 5) La mayor concentracioacuten la presentoacute el grupo de las YTXs (40-294 microg kg-1) en muestras de choritos provenientes del sector de Seno Otway (Fig 1) En este mismo sector las PTXs tambieacuten presentaron las mayores concentraciones (3-45 microg kg-1) en estos transvectores En el caso del ostioacuten tanto el PTX2 como las YTXs fueron detectadas en el contenido gaacutestrico El DTX1 fue detectado en choritos (1-18 microg kg-1 considerando DTX1 libre y total) procedentes del sector Seno Otway y sectores adyacentes a Punta Arenas El AO no fue detectado en ninguna aacuterea de la Regioacuten Los SPXs fueron principalmente detectados en choritos de las aacutereas centro y sur de Magallanes y en una estacioacuten del estero Peel (M13) en el aacuterea norte de la regioacuten No obstante que los niveles son muy bajos (01- 25 microg kg-1) incluso del nivel letal 50 en ratones inyectados intraperitonealmente 40 microg kg-1 (Richard et al 2000) los valores encontrados son iguales o mayor al encontrado en el caracol piquilhue recolectado en julio de 2012 y que en ese entonces produjo la muerte de ratones provocando el cierre de aacutereas de extraccioacuten por la autoridad de salud regional (Anexo 6) De las cinco toxinas detectadas en los moluscos solo DTX1 mostroacute estar localizada en el aacuterea centro de Magallanes mientras que las restantes fueron detectadas en las tres aacutereas de monitoreo Norte centro y sur de Magallanes No se encontraron PTX1 DTX2 ni AZPs en las muestras de moluscos Los resultados muestran que de los cuatro grupos de toxinas PTX YTXs DTXs y SPXs tres de ellas pueden estar presentes simultaacuteneamente en los moluscos vale decir PTXs YTXs y DTX1 o bien SPXs en vez de DTX1 42 Toxinas en microalgas

En las microalgas se detectaron PTXs y YTXs (Tabla 6) Las PTXs fueron detectadas aunque a nivel de trazas en ceacutelulas de D acuminata seleccionadas por micromanipulacioacuten desde muestras de agua procedentes de estero Silva Palma (M25) estero Wickham (M26) y Cutter Cove (M29) (Fig1) Tambieacuten fue detectada en filtrados de agua (fitoplancton) de Pto Fontaine (M21) e I Engelfield (M29N1) Las YTXs fueron detectadas en ceacutelulas de P reticulatum seleccionadas por micromanipulacioacuten y en cultivos de esta microalga que se logroacute establecer a partir de muestras de agua provenientes de C Adalberto (M04) Cutter Cove (M29) e I Engelfield (M29N1) Solo en los cultivos se detectoacute

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homoYTX y en uno de ellos tambieacuten se detectoacute aunque miacutenimamente 45OHYTX un derivado de la YTX que normalmente se encuentra en los moluscos como producto de bio-transformacioacuten La presencia de 45OHYTX en el cultivo pudo deberse a la presencia de ceacutelulas ya en fase de declinacioacuten de la curva de crecimiento

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5 ANAacuteLISIS Y DISCUSIOacuteN DE LOS DATOS

51 Toxinas en moluscos De las toxinas lipofiacutelicas se sabe que AO DTXs y AZAs causan trastornos gastrointestinales en los seres humanos (Gerssen et al 2010) Para las toxinas restantes (YTXs PTXs y SPXs) auacuten cuando no se han reportado casos de intoxicacioacuten en los seres humanos eacutestas son letales o altamente toacutexicas cuando los ratones son inyectados por viacutea intraperitoneal (Paz et al 2008 Richard et al 2000 Miles et al 2004) Es el caso de los SPXs la toxicidad en ratones inyectados por viacutea intraperitoneal supera a la del resto de las toxinas pues su dosis letal 50 es de 40 microg kg-1 (Richard et al 2000) Tal es asiacute que como referencia (Tabla 5) el transvector caracol piquilhue recolectadas en Julio de 2012 y cuyos niveles de toxicidad provocaron la muerte de los ratones solo presentoacute 01 microg kg-1 deteccioacuten que fue realizada durante este estudio en muestras de carne almacenadas durante no maacutes de 1 antildeo a -20 ordmC Sin embargo no se puede descartar una peacuterdida de la actividad por transformacioacuten durante el periodo de conservacioacuten A excepcioacuten de los SPXs el resto de las toxinas mencionadas estaacuten reguladas por la legislacioacuten europea tanto para consumo interno como importacioacuten de moluscos y tunicados para garantizar la salud de las personas Asiacute tambieacuten estaacuten reguladas por la legislacioacuten chilena a traveacutes del Instituto de Salud Puacuteblica (ISP) estableciendo los mismos niveles de referencia europeo en base al bioensayo ratoacuten Aun cuando los niveles de toxinas detectadas en los moluscos durante este estudio estaacuten por debajo de lo exigido por las regulaciones e incluso de los niveles propuestos por el EFSA (Tabla 7) la presencia de dos y tres tipos de toxinas en los moluscos representa una complejidad en la determinacioacuten de los niveles de toxicidad especialmente si se encuentran presentes toxinas altamente toacutexicas para ratones inyectados intraperitonealmente como son los SPXs Aunque se sospechaba la concurrencia de diferentes tipos de toxinas tal hecho no habiacutea sido confirmado anteriormente Sin embargo los SPXs siguen siendo una incoacutegnita pues se desconoce la fuente de estas toxinas A ostenfeldii la especie que podriacutea ser candidata a confirmar estuvo ausente (Tabla 8 modificado de Guzmaacuten et al 2014) durante el periodo en que se detectoacute en los moluscos Los escasos antecedentes toxigeacutenicos de esta especie en Chile la han confirmado como productora de toxinas paralizantes en Ayseacuten (Pizarro et al 2012) pero no de SPXs No obstante la produccioacuten de SPXs por esta especie en la regioacuten de Magallanes auacuten no se puede descartar Las YTXs fueron las toxinas maacutes abundantes en los moluscos analizados condicioacuten que se corresponde con la alta abundancia relativa de esta especie en el ambiente (Tabla 8) en la mayoriacutea de los casos (Tabla 5)

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Los resultados sugieren que los falsos positivos por bioensayo ratoacuten pudieran ser maacutes frecuentes de lo que se piensa actualmente para la regioacuten de Magallanes 52 Toxinas en microalgas Los resultados indican que P reticulatum encontrado en Magallanes producen YTXs al igual que las especies reportadas en la regioacuten de Antofagasta y Ayseacuten (Aacutelvarez et al 2011 Pizarro et al 2012) Tal resultado hace altamente probable que esta especie es la fuente de YTXs detectadas en los moluscos durante el periodo de estudio De acuerdo a las toxinas detectadas en las muestras de D acuminata aisladas asiacute como en el fitoplancton con gran abundancia de esta especie (Tabla 8) sugiere que esta microalga podriacutea ser una fuente primaria de PTXs tal como ocurre en el norte y sur del paiacutes (Blanco et al 2007 Fux et al 2011) Aunque la especie tambieacuten ha sido asociada a la presencia de DTX1 en moluscos en un evento toacutexico ocurrido en 1998 en Magallanes (Uribe et al 2001) el DTX1 no fue detectado en las muestras de D acuminata durante este estudio El no hallazgo de DTX1 en estas muestras pudo deberse a una fuente microalgal distinta como D acuta yo P lima D acuta ha sido asociada a DTX1 en moluscos de la regioacuten de Ayseacuten (Lembeye et al 1993 y Zhao et al 1993) mientras que P lima es productora solo de DTX1 en la regioacuten de Magallanes (Salgado et al 2012) Sin embargo cuando se detectoacute DTX1 en las muestras de moluscos durante este estudio D acuta estuvo ausente en las muestras de agua mientras que D acuminata presentoacute una abundancia relativa alta Por otro lado el volumen de resuspensioacuten de los extractos pudo ser elevado al seguir el mismo procedimiento protocolar que se aplica a las muestras de moluscos de acuerdo a la normativa europea actual Por tal razoacuten el LC-MSMS no logroacute detectar PTXs ni DTX1 en las muestras de microalgas En estos casos un protocolo para el anaacutelisis de las microalgas debiera incluir un volumen menor de resuspensioacuten de los extractos secos en referencia al utilizado para los moluscos o bien seleccionar por micromanipulacioacuten un nuacutemero mayor de microalgas (gt 130 ceacutelulas) Sin embargo esto uacuteltimo es maacutes difiacutecil de lograr en latitudes australes debido a la baja densidad de ceacutelulas en las que se presenta normalmente esta especie en condiciones naturales Por tal motivo se recomienda realizar pruebas con un volumen de resuspensioacuten menor a 1 mL aun cuando se trate de un LC-MSMS triple cuadrupolo

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6 CONCLUSIONES

a Los moluscos de la regioacuten de Magallanes pueden presentar PTX2 YTX 45OHYTX DTX1 y SPX1

b El hecho que los moluscos puedan presentar dos o maacutes tipos de toxinas lipofiacutelicas dificulta establecer el nivel de toxicidad total

c P reticulatum en Magallanes produce YTXs al igual que la especie del norte y sur del paiacutes

d La abundancia relativa ambiental de P reticulatum durante el periodo de estudio coincidioacute con la presencia de YTXs en los moluscos

e Los SPXs encontrados anteriormente en caracoles piquilhue tambieacuten fue posible detectarlos en choritos durante este estudio

f Auacuten queda por confirmar el tipo de SPXs presentes y su eventual fuente primaria La presencia de SPXs en los moluscos no siempre coincidioacute con la presencia de A ostenfeldii en el ambiente y su abundancia relativa maacutexima fue solo de nivel 1 (raro) durante el periodo de estudio

g La PTX2 detectada en los moluscos coincidioacute con una alta abundancia relativa ambiental de D acuminata No obstante auacuten queda por confirmar si esta especie es la fuente primaria Para ello se hace necesario ajustar (disminuir) el volumen de dilucioacuten de los extractos secos de microalgas aisladas por micromanipulacioacuten aun cuando se trata de un espectroacutemetro de masas como un triple cuadrupolo

h La deteccioacuten de DTX1 en los moluscos coincidioacute con la ausencia de D acuta en el ambiente La toxina tampoco fue detectada en los moluscos cuando esta microalga estuvo a niveles de 2 y 3 (escaso y regular) Queda por confirmar la produccioacuten de DTX1 por esta especie en Magallanes

i No se encontraron PTX1 DTX2 ni AZPs en las muestras de moluscos durante el periodo de estudio

j Los resultados demuestran la presencia de toxinas en los moluscos que se hace necesario identificar y cuantificar utilizando teacutecnicas distintas al bioensayo

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F I G U R A

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Figura 1 Estaciones y sectores muestreados (ciacuterculo rojo) y sector Fortuna donde fue recolectado el

caracol piquilhue (ciacuterculo amarillo)

T A B L A S

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Tabla 1 Condiciones cromatograacuteficas para el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas usando

una columna de UPLC C18 en fase reversa y medio baacutesico

Columna Acquity UPLC BEH C18 17 microm 21x100 mm

Temperatura columna 45 ordmC

Flujo 04 mlmin

Volumen inyeccioacuten 5 microl

Temperatura muestras 10 plusmn 5 ordmC

Gradiente

Tiempo (min) Fase A () Fase B ()

0 75 25

066 75 25

330 5 95

528 5 95

726 75 25

900 75 25

Tabla 2 Paraacutemetros de la fuente de ionizacioacuten para el Xevo TQMS (Waters) en la determinacioacuten de toxinas lipofiacutelicas

PARAacuteMETROS DE LA FUENTE

ESI- ESI+

AO DTX2 DTX1 YTX homoYTX 45OH YTX y 45OH

homoYTX

AZA1 AZA2 AZA3 PTX2 PTX1 y SPX1

Voltaje de capilar (V) 100 200

Temperatura de solvatacioacuten (ordmC) 450 450

Flujo gas de solvatacioacuten (lh) 850 850

Flujo gas cono (lh) 50 50

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Tabla 3

Resumen de las condiciones de espectrometriacutea de masas empleadas con el Xevo TQMS (Waters) en el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas

Compuesto tR (min)

ESI

Ioacuten Precursor

(mz)

Ioacuten Producto

(mz)

Dwell time (s)

Energiacutea colisioacuten

(eV)

Voltaje cono (V)

AO 189 NEG 8035 2552 0010 46 86

113 0010 56 86

DTX2 210 NEG 8035 2552 0010 46 86

113 0010 56 86

DTX1 214 NEG 8175 5634 0010 43 86

2552 0010 48 86

YTX 202 NEG 5704 4674 0010 30 45

3963 0010 35 45

45OH-YTX 182 NEG 5784 4674 0010 30 45

3964 0010 30 45

HomoYTX 203 NEG 5775 4744 0010 30 48

4034 0010 30 48

45OH-homoYTX 182 NEG 5855 4034 0010 30 45

4744 0010 30 45

PTX1 306 POS 8925 8395 0015 25 36

8215 0015 25 36

PTX2 362 POS 8765 8415 0015 20 36

8235 0015 25 36

AZA1 263 POS 8425 6545 0015 55 50

3622 0015 50 50

AZA2 270 POS 8565 6725 0015 45 27

6545 0015 45 27

AZA3 236 POS 8285 6404 0015 55 47

3622 0015 55 47

SPX1 368 POS 6925 6744 0015 27 60

1643 0015 42 60 Transicioacuten cuantificadora

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SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo TABLAS

Tabla 4 TRR y valores de tolerancia para las toxinas analizadas

TOXINA TRR TOLERANCIA

Toxinas del grupo de AO

AO 1000 0990-1010

DTX2 1040 1014-1066

DTX1 1140 1111-1168

Toxinas del grupo de PTX

PTX2 1000 0990-1010

PTX1 0850 0829-0871

Toxinas del grupo de YTX

YTX 1000 0990-1010

45OH-YTX 0894 0871-0916

Homo YTX 1000 0990-1010

45OH-homoYTX 0899 0876-0921

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Tabla 5 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de moluscos

Nordm estMes

recolectaLocalidad Molusco

cuerpo

enterohepat

gramos

carne

toxicidad

VDM ratoacuten

PTX2

(ugKg)

YTX

(ugKg)

45OHYTX

(ugKg)

DTX1

libre

(ugKg)

DTX1

total

(ugkg)

SPX 1

(ugKg)

M13 ene-13 E Peel chorito x 5086 + 01 02

M13 ene-13 E Peel ostioacuten x 5155 No real izado 16 21

M33 ene-13 B Bell chorito x 5253 + 04

M37 ene-13 B Agua Fresca chorito x 5039 + 05 01

M35 ene-13 C San Isidro chorito x 5289 + 000 01

M42 ene-13 V Holanda chorito x 5231 + 06 13

M43 ene-13 B Yendegaia chorito x 5193 + 04 25

M45 ene-13 Pto Williams chorito x 5161 - 28 07

M08 feb-13 E Falcon cholga x 5027 - 14

M09 feb-13 E Penguumlin cholga x 5103 + 14

M22 feb-13 E de las Montantildeas cholga x 5052 - 26

M23 feb-13 I Ballesteros cholga x 5204 - 87

M24 feb-13 B Fanny chorito x 2016 - 38 1071 479 12

M25 feb-13 E Silva Palma chorito x 1447 - 59 1077 898 09

M26 feb-13 E Wickham chorito x 1093 - 194 2940 2232 66 66

M27 feb-13 E Sullivan chorito x 1137 - 450 1944 1478

M28 feb-13 E Nuntildeez chorito x 1179 + 33 721 407

M29 feb-13 Cutter Cove chorito x 1003 - 65 501 309

M29N1 feb-13 I Engelfield chorito x 1116 - 297 2007 1483

M31 feb-13 B Nash chorito x 2231 +

M33 feb-13 B Bell chorito x 1181 - 93

M34 feb-13 S Pedro chorito x 0726 -

M35 feb-13 C San Isidro chorito x 1178 + 110

M36 feb-13 B Buena chorito x 1367 +

M37 feb-13 B Agua Fresca chorito x 0850 + 45 100 80

M39 feb-13 Pto Zenteno chorito x 3241 + 28

M39N2 feb-13 Pta San Valentin chorito x 1712 - 11

M39N3 feb-13 Pto Yartou chorito x 2035 - 11

sector

Fortunajul-12 B Inuacutetil

caracol

piquilhuex 107000 + 01

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Tabla 6 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de microalgas

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Tabla 7 Niveles actualmente permitidos por la legislacioacuten europea (bioensayo) y los niveles propuestos por la

autoridad europea para la seguridad alimentaria (EFSA) (Gerssen et al 2010)

Toxin Legislacioacuten (μg kg-

1) Proposicioacuten

EFSA (μg kg-1)

Validacioacuten LC-MSMS

(μg kg-1)

OA and DTXs 160 45

PTXs 120

YTXs 1000 3750

AZAs 160 32

SPXs 400 (Gerssen et al2010)

European Food Safety Authority Decisioacuten 2002657 de la Unioacuten Europea EC Incluye PTXs

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Tabla 8 Abundancia relativa ambiental de las microalgas al momento de recolectar las muestras de moluscos En rojo se indica la deteccioacuten de toxina positiva en los moluscos asociada a la supuesta microalga fuente PTXs (D

acuminata) YTXs (P reticulatum) SPXs (A ostenfeldii) DTX1 (A acuta)

(Tabla modificada de Guzmaacuten et al 2014)

A N E X O S

ANEXO 1

Certificacioacuten laboratorio INTECMAR

ANEXO 2

Lista de anaacutelisis que realiza INTECMAR y sus costos (en euros) 2013

scv 1 de 7

GUIA PARA LA AUTOLIQUIDACIOacuteN DE TASAS A FAVOR DE LA COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA 2013 Los aspectos financieros de los servicios prestados por Intecmar en el marco de su actividad e vienen regulados en la Ley 62003 de 9 de diciembre de tasas precios y exenciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia (DOG nuacutem 240 de 11122003) y fueron actualizados posteriormente en la Ley 142010 de 27 de diciembre de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2011 (DOG nuacutem 250 de 30122010) y en la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013 (DOG nuacutem 42 de 28022013) Existen dos maneras de liquidar las tasas correspondientes a los servicios prestados por Intecmar

1 De forma manual cubriendo el modelo A de autoliquidacioacuten que se descarga en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda y que adjunto en pdf y se lleva al banco para su pago httpwwwconselleriadefacendaeswebportalconfeccion-impresos

2 De forma telemaacutetica en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda viacutenculo httpshostcixtecesXEITObinlionwebXeitodllxmit a traveacutes del modelo 730

Ambos modelos de liquidacioacuten de tasas adjuntamos ejemplo al final de este documento deben ser remitidos por mail a Intecmar con el sello del banco fiacutesico o virtual como paso previo a la emisioacuten del certificado Los coacutedigos generales necesarios son

minus Consejeriacutea de Medio Rural y de Mar Coacutedigo 09 minus Delegacioacuten de Pontevedra Coacutedigo 40 minus Servicio de Intecmar Coacutedigo 24

Los coacutedigos y descripcioacuten de las tasas son los regulados en la legislacioacuten vigente y los hemos resumido en los anexos siguientes Vilaxoaacuten 4 de marzo de 2013

scv 2 de 7

TARIFAS DE TASAS VIGENTES PARA 2013 - Ley 22013 d e 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013

(DOG nuacutem 42 de 28022013)

Estas tarifas son consecuencia de la actualizacioacuten de las tarifas contenidas en los anexos 1 2 3 4 y 5 de la Ley 62003 del 9 de diciembre de tasas precios y exacciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia por la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 Seraacuten aplicables desde el diacutea de la entrada en vigor de la Ley de

presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 TASA POR SERVICIOS ADMINISTRATIVOS

No sujecioacuten No se exigiraacute la tasa por servicios administrativos cuando se trate de compulsas o cotejos de documentos que deban acompantildear a solicitudes escritos o comunicaciones presentadas por el ciudadano y realizadas en el aacutembito de actuacioacuten de los registros seguacuten lo dispuesto en el artiacuteculo 385 de la Ley 301992 del 26 de noviembre de reacutegimen juriacutedico de las administraciones puacuteblicas y del procedimiento administrativo comuacuten

Excepciones Estaraacuten exentos de la presente tasa

1- La expedicioacuten de certificados de retribuciones satisfechas por la Xunta de Galicia con el objeto de justificacioacuten en relacioacuten con el impuesto sobre la renta de las personas fiacutesicas

2- La expedicioacuten de certificados y compulsa que el personal de la Administracioacuten solicite respecto a las necesidades propias del puesto de trabajo o relacioacuten de servicios

3- Los alumnos por cualquier actuacioacuten en materia de ensentildeanzas no universitarias

scv 3 de 7

4- Las compulsas realizadas en las oficinas de empleo para los desempleados en la tramitacioacuten de expedientes que sean competencia de dichas oficinas

5 La inscripcioacuten en las convocatorias para a seleccioacuten de personal de la comunidad autoacutenoma despueacutes de justificacioacuten documental solicitada por

- Personas con discapacidad igual o superior al 33 - Personas que sean miembros de familias numerosas clasificadas en la

categoriacutea especial Se aplicaraacute una bonificacioacuten del 50 a la inscripcioacuten solicitada por - Personas que sean miembros de familias numerosas de categoriacutea

general - Personas que figurasen como demandantes de empleo desde por lo

menos seis meses antes a la fecha de la convocatoria de pruebas selectivas de personal en las que soliciten su participacioacuten y no esteacuten percibiendo prestacioacuten o subsidio por desempleo

6- La expedicioacuten de certificados relativos a la situacioacuten fiscal 7- El Estado y los demaacutes entes puacuteblicos territoriales o institucionales

siempre que los servicios o actividades de que sean beneficiarios se presten o se realicen en el marco del principio de colaboracioacuten entre administraciones

8- Las viacutectimas de actos terroristas asiacute como sus coacutenyuges y sus hijos por cualquier actuacioacuten en materia educativa realizada en centros oficiales de estudios en todos los niveles de ensentildeanza

9- Los miembros de los organismos consultivos de la Administracioacuten puacuteblica gallega respecto de los certificados emitidos por dichos organismos

COacuteDIGO TASAS

DESCRIPCIOacuteN IMPORTE euro

314400 Prestacioacuten de servicios en el Instituto Tecnoloacutegico para el Control del Medio Marino de Galicia

314401 Anaacutelisis de biotoxinas marinas en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de Yasumoto 1978 4752

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en rato segundo o meacutetodo de Yasumoto 1984 5432

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS)

9520 -Anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten

seguacuten el meacutetodo de la AOAC 4752

scv 4 de 7

-Anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo da AOAC 4752

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1978 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10186

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1984 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10865

-Anaacutelisis combinada en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS) anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo AOAC y anaacutelisis de toxicidad de tipo ASP por cromatografiacutea liquida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo de la AOAC 15000

314402 Anaacutelisis de muestras en agua de mar -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton marino mediante

microscopiacutea oacuteptica 15133 -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton toacutexico marino

mediante microscopiacutea oacuteptica 13333 - Anaacutelisis de carbono orgaacutenico disuelto 5093 -Anaacutelisis de nutrientes inorgaacutenicos disueltos 3500 -Anaacutelisis de pigmentos fotosinteacuteticos (clorofila ldquoardquo) por

espectrofluorimetria 1698 314403 Anaacutelisis microbioloacutegicos en moluscos y otros organismos

procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Cuantificacioacuten de E Coli 10186 - Deteccioacuten de Salmonella spp 16975 -Enumeracioacuten de Escherichia coli en moluscos bivalvos

vivos por la teacutecnica de medida directa de impedancia con el sistema BacTrac 4300 6800

314404 Anaacutelisis de contaminantes de origen quiacutemica en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Determinacioacuten de metales pesados (Pb Cd Cu Zn As Hg Ni Cr Ag) mediante espectrofotometriacutea de absorcioacuten atoacutemica por metal

6790

-Determinacioacuten de compuestos bifenilos policlorados (PCB) mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

scv 5 de 7

-Determinacioacuten de pesticidas organoclorados mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

-Determinacioacuten de hidrocarburos aromaacuteticos policiacuteclicos (HAPs) mediante cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de fluorescencia

28200

314405 Anaacutelisis histopatoloacutegica de moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Estudio hispatoloacutegico Determinacioacuten de Bonamia Marteillia Perkinsus y otras alteraciones patoloacutegicas

101852

314406 Emisioacuten de certificaciones e informes teacutecnicos y otras actuaciones a peticioacuten del interesado

Emisioacuten de certificados a peticioacuten de los interesados sobre las actuaciones llevadas a cabo por el Instituto

1000

Emisioacuten de informes teacutecnicos a peticioacuten del interesado (euros por hora o fraccioacuten)

4000

scv 6 de 7

scv 7 de 7

ANEXO 3

Resultados de anaacutelisis en muestras de microalgas anteriormente enviadas procedentes de Magallanes por el equipo de espectrometriacutea de masas utilizado por INTECMAR Trabajo presentado a las XXXII

Congreso de Ciencias del Mar realizado en Punta Arenas 22-25 octubre de 2012

PERFIL DE TOXINAS DE PROROCENTRUM LIMA (DINOPHYCEAE) AISLADO DESDE LA COSTA DE MAGALLANES SUR DE CHILE P Salgado1 G Pizarro1 JM Franco2 P Rioboacute2 e I Bravo3

1Instituto de Fomento Pesquero (IFOP) Punta Arenas Chile gemitapizarroifopcl 2Instituto de Investigaciones Marinas (CSIC) Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea 3Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea

Prorocentrum lima (Ehrenberg) es un dinoflagelado marino bentoacutenico que se encuentra adherido generalmente

sobre macroalgas sedimentos y detrito flotante y menos comuacutenmente en el plancton (Bravo et al 2001) Es una especie neriacutetica y estuarina y su rango de distribucioacuten geograacutefica variacutea desde aguas costeras tropicales a templadas (Faust 1991) La importancia de P lima se debe a que son productoras de toxinas diarreogeacutenicas en las personas (veneno diarreico de los mariscos VDM) al igual que algunas especies de Dinophysis aunque raramente se le han asociado con episodios toacutexicos por VDM por su caraacutecter epiacutefito y bentoacutenico El complejo VDM producido por P lima incluye moleacuteculas conocidas como el aacutecido okadaico (AO) y derivados dinofisistoxinas (DTX-1 DTX-2) (Bravo et al 2001 Vale et al 2009) No obstante existen casos citados para USA donde se detectoacute toxicidad por VDM en bivalvos de cultivos asociadas a P lima aunque en bajos niveles (Maranda et al 2007a) En Canadaacute tambieacuten se llevoacute a cabo un estudio en moluscos de cultivo cuya finalidad fue determinar el origen del VDM en la que P lima fue la principal especie sospechosa tras la ocurrencia de un evento toacutexico humano por VDM ocurrido en 1998 (Levasseur et al 2003) y en antildeos anteriores (Quilliam et al 1993) Aunque Levasseur et al (2003) no logroacute probar la toxicidad de los mariscos en cultivo a causa de P lima cabe hacer notar que lo que buscaron fue OA y DTX1 no DTX 3 este uacuteltimo principal derivado de las anteriores tras su transformacioacuten en los moluscos (eg Suzuki et al 1999 Vale amp Sampayo 2002)

En consecuencia el rol de P lima en eventos toacutexicos por VDM auacuten no puede descartarse por cuanto podriacutean llegar a ser importantes en ambientes turbulentos debido a la eventual remocioacuten de microalgas adheridas en sustratos por efecto de vientos (Levasseur et al 2003) factor de importancia si se trata de sedimentos o contrariamente en zonas someras y estables de cultivos de moluscos que al mismo tiempo favorecen microambientes para sustratos en los que prolifera la epiacutefita P lima (Lawrence et al 2000) quedando expuestas a re-suspensiones temporales que favorecen la filtracioacuten de estas microalgas por los bivalvos en cultivo (Maranda et al 2007a)

Chile posee escaso conocimiento sobre esta especie en su medio natural incluido su perfil de toxinas y potencial rol en la toxificacioacuten de moluscos por VDM Por tal razoacuten resultoacute interesante aportar al conocimiento de estos aspectos en muestras de sedimentos recolectadas en el estrecho de Magallanes en las que esta especie se encontroacute inhabitualmente abundante

Las ceacutelulas utilizadas en este estudio fueron aisladas desde sedimentos superficiales (0-3 cm) recolectados en el invierno de 2010 en la localidad de cabo San Isidro durante el muestreo regular del programa de monitoreo de marea roja en la regioacuten de Magallanes En esa oportunidad se logroacute cuantificar hasta 1002 quistes tecadoscm3 de Prorocentrum lima la mayor concentracioacuten respecto a otros sitios de recolecta (Fig 1) Los sedimentos de esta localidad presentaron una coloracioacuten oscura y un fuerte olor a sulfuro de hidroacutegeno (H2S) producto de anoxia local

Se aislaron entre 27 y 87 quistes tecados (Fig 1 a) directamente desde los sedimentos mientras otras 60 ceacutelulas vegetativas (Fig 1 b) fueron aisladas luego de promover la actividad y divisioacuten de los quistes en condiciones de 15 ordmC y un ciclo de luzoscuridad de 1212 horas (Tabla 1) Para este fin se aislaron quistes tecados y trasvasijaron a placas Petri de 5 cm de diaacutemetro conteniendo 5 mL de medio de cultivo L1 Para el anaacutelisis de toxinas las ceacutelulas aisladas fueron trasvasijadas a un tubo Eppendorf de 15 mL y congelados a -80 ordmC Una aliacutecuota de sedimento huacutemedo (100 microL aproximados) tambieacuten fue vaciada en un tubo Eppendorf y congelado Para extraer la toxina se antildeadioacute 500 microL de metanol 100 a cada tubo se mezcloacute por 1 min y filtroacute por 045 microm trasvasijando a un vial El extracto fue secado bajo nitroacutegeno gas a 40 ordmC y conservado a 4 ordmC hasta su anaacutelisis Previo al anaacutelisis de toxinas los extractos fueron resuspendidos en 150 microl de metanol

La presencia de la toxina dinofisistoxina 1 (DTX-1) en las muestras (Fig2) fue confirmada en modo negativo a traveacutes de su ioacuten precursor [M-H]- mz 8175 y sus iones productos mz 5634 y 2552 mediante un cromatoacutegrafo UPLC Acquity Waters acoplado a un triple cuadrupolo Waters Xevo TQ (LC-MS) La columna utilizada fue una Acquity UPLC BEH C18 17microm 21 x 100 mm a 45 ordmC La fase moacutevil consistioacute en (A) hidroacutexido amoacutenico a pH 11 y (B) hidroacutexido amoacutenico en acetonitrilo (67 mM) con una tasa de flujo de 4 mLmin El gradiente de elucioacuten utilizado fue el siguiente mantencioacuten al 75 de A entre 0 y 066 min cambio a 5 de A entre 066 y 330 min mantener 5

de A entre 330 y 528 min recuperacioacuten del 75 de A entre 528 y 726 min mantencioacuten al 75 de A hasta 9 min Se pinchoacute 5microL de muestra en el LC-MS El contenido de DTX-1 en las muestras fue cuantificado en base al ion precursor

Los tres tipos de muestras fueron positivas a la presencia de DTX-1 pero las ceacutelulas vegetativas fueron las que presentaron un mayor contenido de DTX-1 por ceacutelula La deteccioacuten de DTX-1 en los sedimentos (Tabla 2) reflejoacute la presencia de los quistes tecados en eacutestos

Figura 1 Concentraciones de quistes tecados de Prorocentrum lima (quistescm3 de sedimento huacutemedo) en estaciones de muestreo en el Estrecho de Magallanes (M26 Estero Wickham M29N1 Isla Engenfield M31 Bahiacutea Nash M35 Cabo San Isidro M39C1 Bahiacutea Gente Grande M39C2 Bahiacutea Inuacutetil M39C3 Canal Gabriel) y Canal Beagle (M41 Ventisquero Espantildea M42 Ventisquero Holanda) (a) Quistes tecados (b) ceacutelulas vegetativas obtenidas de germinacioacuten de quistes tecados bajo condiciones de laboratorio Barra de escala 20 microm

Tabla 1 Sedimento y ceacutelulas de Prorocentrum lima aisladas para anaacutelisis de toxinas

Extracto metanoacutelico Nordm de ceacutelulas TR ngmL pg DTX-1 ceacutel

G1 quistes tecados 27 213 lt2 -

G2 quistes tecados 67 214 05 11

G3 quistes tecados 87 215 12 21

G4 ceacutelulas vegetativas 60 215 34 87

G6 sedimentos aliacutecuota 213 13 19 pg microL sed

TR tiempo de retencioacuten

Figura 2 Cromatogramas de extractos metanoacutelicos de Prorocentrum lima quistes tecados (a) ceacutelulas vegetativas (b) y sedimentos (c)

Tabla 2 Caracteriacutesticas del sedimento con quistes tecados de Prorocentrum lima

Tipo Tamantildeo (mm)

Grava 2 35

Arena media 025 - 05 32

Arena muy fina 0063 - 0125 2

Limo-arcilla lt 0063 1

Estos resultados constituyen otra eventual posibilidad de toxicidad en los moluscos por VDM no soacutelo de aquellos con modalidad de vida bentoacutenica superficial sino de aquellos que tambieacuten viven enterrados en la arena (eg almeja huepo) Maacutes auacuten si se conoce que P lima posee la capacidad de desarrollar poblaciones naturales en aguas templadas en nuacutemeros que podriacutean justificar una toxicidad por VDM en los mariscos (eg Maranda et al 2007a b)

Referencias

Bravo I ML Fernaacutendez I Ramilo amp A Martinez 2001 Toxin composition of the toxic dinofagellate Prorocentrum lima isolated from different locations along the Galician coast (NW Spain) Toxicon 39 1537ndash1545

Faust MA 1991 Morphology of ciguatera-causing Prorocentrum lima (Pyrrophyta) from widely differing sites J Phycol 27 642-648

Lawrence J E Grant J Quilliam M A Bauder A G amp Cembella A D 2000 Colonizaition and growth of the toxic dinoflagellate Prorocentrum lima and associated fouling macroalgae on mussels in suspended culture Mar Ecol Prog Ser 201 147-154

Levasseur M Couture J Y Weise A M Michaud S Elbrachter M Sauveacute G amp Bonneau E 2003 Pelagic and epiphytic summer distributions of Prorocentrum lima and P mexicanum at two mussel farms in the Gulf of St Lawrence Aquat Microbiol Ecol 30283-293

Maranda L Corwin S Dover S amp Morton S L 2007a Prorocentrum lima (Dinophyceae) in northeastern USA coastal waters II Toxin load in the epibiota and in shellfish Harmful Algae 6 632-641

Maranda L Corwin S Hargraves P E 2007b Prorocentrum lima (Dinophyceae) in 19 northeastern USA coastal waters I Abundance and distribution Harmful Algae 6 623ndash631

Quilliam MA Gilgan MW amp Pleasance S 1993 Confirmation of an incident of diarrhetic shellfish poisoning in eastern Canada In Smayda TJ Shimizu Y (Eds) Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea Elsevier New York pp 547ndash552

Suzuki T Ota H amp Yamasaki M 1999 Direct evidence of transformation of dinophysistoxin-1 to 7-O-acyl-dinophysistoxin-1 (Dinophysis-3) in the scallop Patinopecten yessoensis Toxicon 37 187-198

Vale P amp Sampayo M A 2002 First confirmation of human diarrhoeic poisonings by okadaic acid esters after ingestion of razor clams (Solen marginatus) and green crabs (Carcinus maenas) in Aveiro lagoon Portugal and detection of okadaic acid esters in phytoplankton Toxicon 40989-996

Vale P Veloso V amp Amorim A 2009 Toxin composition of a Prorocentrum lima strain isolated from the Portuguese coast Toxicon 54145ndash152

Agradecimientos Intecmar de la Xunta de Galicia Espantildea donde se realizaron los anaacutelisis de toxinas proyecto

SUBPESCA ldquoManejo y Monitoreo de Mareas Rojas en las regiones de Los Lagos Ayseacuten y Magallanes IV etapa 2010rdquo

ANEXO 4

Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten

ANEXO 5

Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de Magallanes

TASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

O

EJE

MP

LA

R P

AR

A E

L IN

TE

RE

SA

DO

LIQ

UID

AC

IOacuteN

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

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DIG

OS

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DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

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3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

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LA

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AR

IATASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

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IQU

IDA

CIOacute

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BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

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Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

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2 4INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS3 1 4 4 0 1

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BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

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AIEUROS

Conselleriacutea de

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PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

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3 1 4 4 0 1

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

9520 euros

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ANEXO 6

Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para cierre

de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

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Seccioacuten Ediciones y Produccioacuten Almte Manuel Blanco Encalada 839

Fono 56-32-2151500 Valparaiacuteso Chile

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SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo

i

RESUMEN EJECUTIVO Este informe final incluye los resultados de los anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas en muestras de agua (fitoplancton y microalgas) y moluscos recolectados entre enero y febrero de 2013 en la regioacuten de Magallanes cuando ocurrioacute una floracioacuten de dinoflagelados entre los que destacaron Dinophysis acuminata y Protoceratium reticulatum Ambas especies eran sospechosas de producir toxinas lipofiacutelicas DTX1 y PTXs en el primer caso y YTXs en el segundo Tal floracioacuten se mantuvo intensa entre diciembre 2012 y febrero 2013 Las muestras de moluscos fitoplancton (agua) y microalgas aisladas por micromanipulacioacuten fueron recolectados en diferentes sectores de Magallanes durante el monitoreo regular de marea roja VII etapa 2013-14 que se realiza anualmente Los anaacutelisis de toxinas en las muestras fueron realizados por LC-MSMS en un laboratorio extranjero por tratarse de una teacutecnica auacuten no implementada en Chile para la deteccioacuten de toxinas marinas lipofiacutelicas certificada a nivel comercial ni tampoco para investigacioacuten baacutesica rutinaria Los resultados indican que en los moluscos se encontraban presentes pectenotoxina-2 (PTX2) yesotoxinas (YTXs) 45-hidroxi-yesotoxina (45OHYTX) dinofisistoxina-1 (DTX1) y espiroacutelidos (SPXs) La mayor concentracioacuten la presentoacute el grupo de las YTXs (40-294 microg kg-1) en muestras de choritos provenientes del sector de Seno Otway Igualmente la PTX2 se presentoacute en mayor concentracioacuten (3-45 microg kg-1) en este mismo sector y en los mismos transvectores Para el caso de contenido gaacutestrico de ostiones procedentes del aacuterea norte de Magallanes (estero Peel) se detectoacute tanto PTX2 como YTXs mientras que en cuerpo entero de chorito de la misma estacioacuten se detectoacute PTX2 y SPX1 El DTX1 fue detectado en choritos (1-18 microg kg-1 considerando DTX1 libre y total) procedentes del aacuterea centro de Magallanes (sector Seno Otway y sectores adyacentes a Punta Arenas) El AO no fue detectado en ninguna las aacutereas monitoreadas de la regioacuten Los SPXs fueron principalmente detectados en choritos de las aacutereas centro y sur de Magallanes y en una estacioacuten del aacuterea norte de la regioacuten (estero Peel) De las cinco toxinas detectadas en los moluscos solo DTX1 mostroacute estar localizada en el aacuterea centro de Magallanes mientras que las restantes fueron detectadas en las tres aacutereas de monitoreo Norte centro y sur de Magallanes No se encontroacute pectenotoxina-1 (PTX1) dinofisistoxina-2 (DTX2) ni azaspiraacutecidos (AZPs) en las muestras de moluscos

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ii

Los resultados muestran que de los cuatro grupos de toxinas PTXs YTXs DTXs y SPXs tres de ellas estuvieron presentes simultaacuteneamente en los moluscos vale decir PTX2 YTXs y DTX1 o bien PTXs YTXs y SPXs La presencia de PTX2 y DTX1 en moluscos fue coincidente con la mayor abundancia relativa de Dinophysis acuminata en el ambiente y no con D acuta que estuvo ausente Las YTXs fueron detectadas en los mismos transvectores y coincidioacute con una alta abundancia relativa de Protoceratium reticulatum En este uacuteltimo caso fue posible confirmar la produccioacuten de YTXs por P reticulatum en microalgas aisladas por micromanipulacioacuten y en cultivos establecidos a partir de aislamientos de esta especie desde muestras de agua procedentes del aacuterea norte y centro de Magallanes

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iii

IacuteNDICE GENERAL

Paacutegina

RESUMEN EJECUTIVO -------------------------------------------------------------------------------------------- i IacuteNDICE GENERAL --------------------------------------------------------------------------------------------------- iii IacuteNDICE DE FIGURA -------------------------------------------------------------------------------------------------- iv IacuteNDICE DE TABLAS ------------------------------------------------------------------------------------------------- iv IacuteNDICE DE ANEXOS ------------------------------------------------------------------------------------------------ v

1 ANTECEDENTES -------------------------------------------------------------------------------------------- 1

2 OBJETIVOS --------------------------------------------------------------------------------------------------- 2 21 Objetivo general ----------------------------------------------------------------------------------------- 3 22 Objetivo especiacutefico ------------------------------------------------------------------------------------- 3

3 METODOLOGIacuteA --------------------------------------------------------------------------------------------- 3 31 Obtencioacuten del extracto --------------------------------------------------------------------------------- 3 32 Laboratorio de anaacutelisis dotado con LC-MSMShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 3 33 Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por LC-MSMShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 4 34 Extraccioacuten de toxinashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 6

4 RESULTADOS ------------------------------------------------------------------------------------------------ 9 41 Toxinas en moluscoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 9 42 Toxinas en microalgashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 9

5 ANAacuteLISIS Y DISCUSIOacuteN DE LOS RESULTADOS helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 11 51 Toxinas en moluscoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 11 52 Toxinas en microalgashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 12

6 CONCLUSIONES --------------------------------------------------------------------------------------------- 13

7 REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS -------------------------------------------------------------------- 14

FIGURA

TABLAS

ANEXOS Anexo 1 Certificacioacuten laboratorio INTECMAR Anexo 2 Lista de anaacutelisis que realiza INTECMAR y sus costos (en euros) 2013 Anexo 3 Resultados de anaacutelisis en muestras de microalgas anteriormente enviadas procedentes de

Magallanes por el equipo de espectrometriacutea de masas utilizado por INTECMAR Trabajo presentado a las XXXII Congreso de Ciencias del Mar realizado en Punta Arenas 22-25 octubre de 2012

Anexo 4 Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten Anexo 5 Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de Magallanes Anexo 6 Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para

cierre de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

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iv

IacuteNDICE DE FIGURA

Figura 1 Estaciones y sectores muestreados (ciacuterculo rojo) y sector Fortuna donde fue recolectado el caracol piquilhue (ciacuterculo amarillo)

IacuteNDICE TABLAS

Tabla 1 Condiciones cromatograacuteficas para el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas usando una columna

de UPLC C18 en fase reversa y medio baacutesico Tabla 2 Paraacutemetros de la fuente de ionizacioacuten para el Xevo TQMS (Waters) en la determinacioacuten

de toxinas lipofiacutelicas Tabla 3 Resumen de las condiciones de espectrometriacutea de masas empleadas con el Xevo

TQMS (Waters) en el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas Tabla 4 TRR y valores de tolerancia para las toxinas analizadas Tabla 5 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de moluscos Tabla 6 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de microalgas Tabla 7 Niveles actualmente permitidos por la legislacioacuten europea (bioensayo) y los niveles

propuestos por la autoridad europea para la seguridad alimentaria (EFSA) (Gerssen et al 2010) European Food Safety Authority

Tabla 8 Abundancia relativa ambiental de las microalgas al momento de recolectar las muestras

de moluscos En rojo se indica la deteccioacuten de toxina positiva en los moluscos PTXs (D acuminata) YTXs (P reticulatum) SPXs (A ostenfeldii) DTX1 (A acuta) (Tabla modificada de Guzmaacuten et al 2014)

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v

IacuteNDICE ANEXOS

Anexo 1 Certificacioacuten laboratorio INTECMAR Anexo 2 Lista de anaacutelisis que realiza INTECMAR y sus costos (en euros) 2013 Anexo 3 Resultados de anaacutelisis en muestras de microalgas anteriormente enviadas

procedentes de Magallanes por el equipo de espectrometriacutea de masas utilizado por INTECMAR Trabajo presentado a las XXXII Congreso de Ciencias del Mar realizado en Punta Arenas 22-25 octubre de 2012

Anexo 4 Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten Anexo 5 Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de

Magallanes Anexo 6 Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para

cierre de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

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1

1 ANTECEDENTES En Chile auacuten existen escasos antecedentes acerca de las toxinas lipofiacutelicas presentes en nuestros moluscos asiacute como la fuente microalgal asociada a su produccioacuten y la variabilidad espacio-temporal de las mismas Tal situacioacuten es tambieacuten un problema en el sur austral de Chile y particularmente en Magallanes donde el historial de este tipo de toxinas ha sido opacado por la fuerte incidencia de toxina paralizante asociada a la presencia de Alexandrium catenella No obstante en los dos uacuteltimos antildeos los niveles de toxicidad por toxinas lipofiacutelicas en la regioacuten se han constituido en un problema para la autoridad de Salud pues han determinado el cierre de grandes extensiones de aacutereas a la extraccioacuten de moluscos hecho no acontecido anteriormente salvo muy local y esporaacutedicamente (eg Uribe et al 2001) ademaacutes del efecto econoacutemico y social

Dentro de las toxinas lipofiacutelicas las maacutes conocidas y frecuentes a nivel mundial por sus efectos diarreicos (veneno diarreico de los mariscos VDM) en humanos son el aacutecido okadaico y sus derivados las dinofisistoxinas (AO y DTXs) (eg Yasumoto et al 1978) tambieacuten conocidas como okadaatos Por lo mismo poseen un mayor historial de citas en la literatura cientiacutefica Los okadaatos son fuertes inhibidores de las proteiacutenas fosfatasas 1 y 2A y potenciales promotores de tumores (Yasumoto et al 1989 Fujiki et al 1989) con efectos croacutenicos desconocidos por lo que su efecto es maacutes lento Por esta razoacuten representan un riesgo para la salud puacuteblica y dan lugar a prolongadas vedas de extraccioacuten de bivalvos tanto de bancos naturales como centros de cultivo con las consiguientes peacuterdidas econoacutemicas para el sector pesquero y acuicultor en otras partes del mundo

Actualmente en Chile las toxinas lipofiacutelicas son detectadas por el bioensayo del ratoacuten una metodologiacutea semicuantitativa e inespeciacutefica Por lo mismo suelen ocurrir falsos positivos debido a la interferencia de otras toxinas lipofiacutelicas diferentes al VDM inocuas o no para el hombre pero que pueden estar presentes en las muestras inyectadas pues son co-extraiacutedas con los okadaatos

Gracias al uso de tecnologiacuteas de alta sensibilidad uacuteltimamente ha sido posible detectar junto a los okadaatos otras toxinas lipofiacutelicas de diverso efecto toacutexico tales como las yesotoxinas pectenotoxinas azaspiraacutecidos espiroacutelidos y gimnodimina (Zhao et al 1993 Yasumoto amp Takizawa 1997 Uribe et al 2001 Garciacutea et al 2005 Blanco et al 2007 Krock et al 2009 Aacutelvarez et al 2010 2011 Loacutepez et al 2010 Pizarro et al 2011 Fux et al 2011 Trefault et al 2011)

En Magallanes ha sido reportada la presencia de okadaatos (AO y DTXs) asociadas a la presencia de Dinophysis acuminata (Uribe et al 2001) Tambieacuten se ha reportado la presencia de yesotoxinas (YTXs) en moluscos Esta uacuteltima se sospecha estar asociada a la presencia de la especie Protoceratium reticulatum comprobada fuente primaria en Ayseacuten (Pizarro et al 2012) norte de Chile (Aacutelvarez et al 2011) y ampliamente conocida como tal a nivel mundial

Durante el periodo estival de 2013 en la regioacuten de Magallanes ocurrioacute una floracioacuten de dinoflagelados entre los que destacaron Dinophysis acuminata y Protoceratium reticulatum Tal floracioacuten se mantuvo intensa entre diciembre 2012 y febrero 2013 lo que permitioacute recolectar muestras de transvectores y microalgas para establecer yo confirmar los perfiles de toxinas lipofiacutelicas respectivas mediante LC-MSMS particularmente en una regioacuten con muy poca informacioacuten al respecto

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2

2 OBJETIVOS 21 General del proyecto

Establecer mediante LC-MSMS los perfiles de toxinas lipofiacutelicas en muestras de moluscos y de plancton recolectadas durante la floracioacuten de dinoflagelados ocurrida durante el verano 2013 en la regioacuten de Magallanes

22 Objetivo especiacutefico

Establecer los perfiles de toxinas lipofiacutelicas en transvectores centinelas fitoplancton y microalgas aisladas por micromanipulacioacuten recolectados en diferentes sectores de Magallanes durante el monitoreo regular realizados durante una floracioacuten de Dinophysis spp y Protoceratium reticulatum

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3

3 METODOLOGIacuteA En esta seccioacuten se describen las metodologiacuteas asociadas a las actividades realizadas para el logro de los objetivos asiacute como tambieacuten los conceptos e ideas que la fundamentan

31 Obtencioacuten del extracto - Carne de mariscos Dependiendo de la cantidad de material se procesoacute soacutelo el hepatopaacutencreas

o carne total Se maceroacute y pesoacute el material Se realizoacute extraccioacuten con metanol en una de 11 pv Los extractos fueron centrifugados y el sobrenadante filtrado por filtros de nylon de 045 microm y vaciado a un vial

- Extracto en metanol de muestras de fitoplancton (ie el ensamble total de microalgas sin separar

especies) Aliacutecuotas de agua previamente filtradas por malla de 250 microm para eliminar el zooplancton de tamantildeo mayor fueron filtradas en filtros de fibra de vidrio muflados de 13 mm de diaacutemetro (tamantildeo de poro nominal de 07 microm) Los filtros fueron puestos por separado seguacuten sitio de recolecta y fecha en ependorfs de 15 ml y congelados hasta ser extraiacutedos con 1 mL de metanol centrifugados El sobrenadante fue filtrado por filtros de nylon de 045 microm y vaciado a un vial

- Extracto en metanol de D acuminata y P reticulatum La microalgas aisladas por

micromanipulacioacuten bajo un microscopio invertido (siempre y cuando el nuacutemero de D acuminata y de P reticulatum fuera suficiente como para lograr reunir un nuacutemero cercano a las 30 ceacutelulas por cada especie) fueron puestas en un ependorf de 15 ml con 1 ml de metanol Para obtener el extracto de toxina las muestras fueron mezcladas en vortex y filtradas por filtros de nylon de 045 microm El extracto filtrado fue puesto en un vial Solo en una ocasioacuten fue posible acumular un nuacutemero suficiente de ceacutelulas de D acuta por ello fue posible obtener solo una muestra para esta especie

- Todos los extractos fueron secados con nitroacutegeno gas a 38ordmC Este proceso evita los problemas

de traslado de extractos en solventes orgaacutenicos y yo evitar eventuales peacuterdidas de liacutequidos en las muestras durante el trayecto

32 Laboratorio de anaacutelisis dotado de LC-MSMS La metodologiacutea para el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas se realizoacute mediante espectrometriacutea de masas acoplada a un cromatoacutegrafo liacutequido (LC-MSMS) Por tratarse de una teacutecnica auacuten no implementada en Chile en aspectos de determinacioacuten de toxinas marinas a nivel comercial y certificada ni tampoco para realizar investigacioacuten baacutesica de rutina fue necesario enviar las muestras a un laboratorio extranjero certificado Tal laboratorio pertenece al Instituto Tecnoloacutegico del Mar (INTECMAR) Galicia Espantildea

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4

El contacto se realizoacute a traveacutes de grupos de investigacioacuten extranjeros de vasta y reconocida experiencia en el tema para prospectar la factibilidad de donde realizar los anaacutelisis Los mismos aconsejaron al laboratorio perteneciente a INTECMAR INTECMAR es una entidad de investigacioacuten estatal encargada de realizar los monitoreos semanales en Galicia donde tambieacuten se encuentra fiacutesicamente su sede Actualmente estaacute certificada para la deteccioacuten de toxinas lipofiacutelicas en moluscos entre otros anaacutelisis que realiza (Anexo 1 y 2) El Anexo 2 contiene el costo del anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas (equivalente a cotizacioacuten) El laboratorio seleccionado posee un cromatoacutegrafo UPLC Acquity Waters acoplado a un triple cuadrupolo Waters Xevo TQ con la suficiente sensibilidad en la deteccioacuten de toxinas en microalgas aisladas por micromanipulacioacuten sensibilidad que fuera confirmada anteriormente al establecer cuantitativamente el perfil de toxinas lipofiacutelicas en muestras de microalgas aisladas desde muestras de sedimentos de Magallanes (ver Anexo 3) Previo al enviacuteo de extractos de moluscos y contrato de ensayo de anaacutelisis exigido por INTECMAR se realizoacute la consulta acerca de nuestro intereacutes tambieacuten por analizar toxinas en microalgas aun cuando no estuviesen certificados en esta matriz en particular La solicitud de anaacutelisis fue aceptada por parte de INTECMAR Una vez aceptado el contrato de ensayo por parte de INTECMAR (Anexo 4) se procedioacute entonces a enviar las muestras de 29 extractos de microalgas y 29 extractos de moluscos mientras INTECMAR facturoacute por costos de anaacutelisis solicitados por IFOP en el contrato de ensayo (Anexo 5) Si bien el nuacutemero de extractos obtenidos fue cercano a las 140 muestras el nuacutemero de muestras enviadas se ajustoacute al presupuesto otorgado para este proyecto al mismo tiempo que la informacioacuten obtenida fuera suficiente como para tener una visioacuten regional de los perfiles de toxinas que estuvieron presentes durante la floracioacuten estival de 2013 33 Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por LC-MSMS

Las toxinas lipofiacutelicas a determinar en las muestras fueron aacutecido okadaico (AO) dinofisistoxina-2 (DTX2) dinofisistoxina-1 (DTX1) pectenotoxinas (PTX1 PTX2) azaspiraacutecidos (AZA1 AZA2 AZA3) yesotoxinas (YTX homoYTX 45OHYTX 45OHhomoYTX) y espiroacutelidos (SPX1) El anaacutelisis se realizoacute con los siguientes elementos

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5

Equipos

Sistema cromatograacutefico Acquity Ultra Performance (Coacutedigo B191C)

Espectroacutemetro de masas equipado con interfase ESI y taacutendem MSMS Xevo TQMS (Coacutedigo B192C)

Software del programa TargetLynx (Coacutedigo 196)

Columna cromatograacutefica de fase reversa C18 17 microm 21 x 100 mm Acquity UPLC BEH

Reactivos y disolventes

Metanol grado HPLC gradiente

H2O Milli-Q Ellix

Acetonitrilo grado HPLC o Hipergrado para LC-MS

Acido foacutermico 98-100

Hidroacutexido amoacutenico 25

MeOHAgua 50

AcetonitriloAgua 90

Aacutecido clorhiacutedrico 37

Disolucioacuten de aacutecido clorhiacutedrico 25 M Hidroacutexido Soacutedico (le 99 pureza)

Disolucioacuten de hidroacutexido soacutedico 25 M

Disolventes cromatograacuteficos

Disolucioacuten tampoacuten hidroacutexido amoacutenico al 0125

Fase moacutevil A Agua conteniendo 67 mM de NH4OH

Fase moacutevil B Acetonitrilo conteniendo 67 mM de NH4OH

Cada fase moacutevil se filtra a vaciacuteo a traveacutes de filtros de membrana de nylon de 022 microm

Toxinas de Referencia

Disolucioacuten certificada de aacutecido ocadaico en metanol (NRC CRM-OA-c) Cod PB015

Disolucioacuten certificada de Yessotoxina Yessotoxin di-sodium salt en metanol (CRM-00-YTX) Cod PB018

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6

Disolucioacuten certificada de Homo-yessotoxina 1aHomoyessotoxin di-sodium salt en metanol (CRM-00-hYTX) Cod PB019

Disolucioacuten certificada de calibracioacuten de Azaspiraacutecido 1 en metanol (NRC CRM-AZA1) Cod PB020

Disolucioacuten certificada de calibracioacuten de Azaspiraacutecido 2 en metanol (NRC CRM-AZA2) Cod PB021

Disolucioacuten certificada de calibracioacuten de Azaspiraacutecido 3 en metanol (NRC CRM-AZA3) Cod PB022

Disolucioacuten de calibracioacuten de Dinofisistoxina 2 en metanol (00-DTX2) Cod PB026

Disolucioacuten de calibracioacuten de Dinofisistoxina 1 en metanol (CRM-00-DTX1) Cod PB032

Disolucioacuten de calibracioacuten de Pectenotoxina 2 en metanol (00-PTX2) Cod PB031

Material de Referencia Certificado (Mussel Tissue Reference Material for DSP Toxins NRC CRM-DSP-Mus-b) con AO y DTX1 101 plusmn 08 microgg y 13 plusmn 02 microgg respectivamente Homogeneizado de mejilloacuten (Mytilus edulis) Cod PB014

Material de Referencia Certificado (Mussel Tissue Reference Material for AZA Toxins NRC CRM-AZA-Mus) con AZA1 116 plusmn 010 microgg AZA2 0273 plusmn 0023 microgg y AZA3 0211 plusmn 0022 microgg Homogeneizado de mejilloacuten (Mytilus edulis) Cod PB030

Disolucioacuten certificada de calibracioacuten de 13-dismetil espiroacutelido C en metanol (NRC CRM-SPX1) Cod PB027

La Tabla 1 muestra las condiciones cromatograacuteficas usando una columna de UPLC C18 en fase reversa y medio baacutesico mientras que los paraacutemetros de la fuente de ionizacioacuten para el Xevo TQMS (Waters) se muestran en la Tabla 2

34 Extraccioacuten de toxinas

A los extractos metanoacutelicos en seco de las 29 muestras de moluscos y 29 muestras de microalgas se le adicionaron hasta un total de 25 mL de metanol dispensadas en pequentildeas aliacutecuotas agitando el vial con un vortex durante 30 segundos Anaacutelisis de las formas libres del AO DTX1 y DTX2 y de las toxinas de los grupos PTXs AZAs y YTXs Para la determinacioacuten de las formas libres del AO DTX1 y DTX2 y de las toxinas de los grupos PTXs AZAs y YTXs se filtroacute un volumen de aproximadamente 12 ml del extracto metanoacutelico a traveacutes de filtros

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de jeringa de 045 microm para su posterior hidroacutelisis (seccioacuten siguiente) Otra aliacutecuota del mismo extracto filtrada a traveacutes de filtro de jeringa compatible con el disolvente de 022 microm se diluyoacute a la mitad con MeOH 100 y se inyectoacute 5 microl en el sistema LC-MSMS Hidroacutelisis y cuantificacioacuten del contenido total de AO DTX1 y DTX2 Para detectar y cuantificar el contenido total de AO DTX1 y DTX2 se requiere una hidroacutelisis baacutesica previa a la inyeccioacuten de los extractos en el sistema de LC-MSMS Procedimiento En un vial que contiene 1 ml de extracto metanoacutelico previamente filtrado por filtros de jeringa de 045 microm se antildeaden 125 microl de NaOH 25 M se agita manualmente 10 segundos y la mezcla fue sometida a 76 plusmn 4 ordmC durante 40 minutos en un bantildeo Se enfrioacute a temperatura ambiente se pesoacute y luego neutralizoacute con 125 microl de HCl 25 M Finalmente se homogenizoacute nuevamente con el vortex durante 30 segundos Una aliacutecuota del extracto resultante se filtroacute con filtros de jeringa de 022 microm y diluyoacute 58 con MeOH 100 Una aliacutecuota de 5 microl fue inyectada en el sistema de LC-MSMS Durante el proceso de hidroacutelisis el vial debe estar bien cerrado para evitar peacuterdidas por evaporacioacuten (la temperatura de ebullicioacuten del MeOH es 65 ordmC) Las peacuterdidas se pueden detectar mediante pesada del vial antes y despueacutes de la hidroacutelisis en caso de confirmarse se completaraacute el peso con metanol La deteccioacuten con el espectroacutemetro de masas se realizoacute usando dos transiciones por toxina la de mayor intensidad se utilizoacute para cuantificar y la de menor intensidad para confirmar (Tabla 3) Identificacioacuten y Confirmacioacuten La identificacioacuten de la presencia de toxinas se realizaraacute por comparacioacuten del tiempo de retencioacuten de cada una de las toxinas en la muestra con el tiempo de retencioacuten obtenido en las disoluciones de calibrado estaacutendar inyectadas en un mismo diacutea de anaacutelisis Se permite una desviacioacuten maacutexima entre ambos tiempos del 25 Para las toxinas que se cuantifican con la recta de calibrado del anaacutelogo correspondiente se establece un TRR con una tolerancia seguacuten se indica en la Tabla 4 Para una correcta identificacioacuten se exige una separacioacuten entre picos calculada mediante aplicacioacuten de la expresioacuten

2 x (RT2-RT1) RS = ----------------------

(W1+W2)

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En donde RT1 y RT2 y W1 y W2 son respectivamente los tiempos de retencioacuten y las anchuras en la liacutenea base de dos picos adyacentes RT2gtRT1 La resolucioacuten seraacute aceptable cuando Rs gt10 y la resolucioacuten a liacutenea base se consideraraacute completa cuando Rs gt15 La confirmacioacuten de la presencia de toxina seguacuten el criterio de la Decisioacuten de la Comisioacuten 2002657EC se basa en la relacioacuten entre las dos transiciones empleadas para la determinacioacuten (cuantificacioacuten y confirmacioacuten)

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4 RESULTADOS

41 Toxinas en moluscos

Las toxinas detectadas en moluscos fueron PTX2 YTX 45OHYTX DTX1 y SPX1 (Tabla 5) La mayor concentracioacuten la presentoacute el grupo de las YTXs (40-294 microg kg-1) en muestras de choritos provenientes del sector de Seno Otway (Fig 1) En este mismo sector las PTXs tambieacuten presentaron las mayores concentraciones (3-45 microg kg-1) en estos transvectores En el caso del ostioacuten tanto el PTX2 como las YTXs fueron detectadas en el contenido gaacutestrico El DTX1 fue detectado en choritos (1-18 microg kg-1 considerando DTX1 libre y total) procedentes del sector Seno Otway y sectores adyacentes a Punta Arenas El AO no fue detectado en ninguna aacuterea de la Regioacuten Los SPXs fueron principalmente detectados en choritos de las aacutereas centro y sur de Magallanes y en una estacioacuten del estero Peel (M13) en el aacuterea norte de la regioacuten No obstante que los niveles son muy bajos (01- 25 microg kg-1) incluso del nivel letal 50 en ratones inyectados intraperitonealmente 40 microg kg-1 (Richard et al 2000) los valores encontrados son iguales o mayor al encontrado en el caracol piquilhue recolectado en julio de 2012 y que en ese entonces produjo la muerte de ratones provocando el cierre de aacutereas de extraccioacuten por la autoridad de salud regional (Anexo 6) De las cinco toxinas detectadas en los moluscos solo DTX1 mostroacute estar localizada en el aacuterea centro de Magallanes mientras que las restantes fueron detectadas en las tres aacutereas de monitoreo Norte centro y sur de Magallanes No se encontraron PTX1 DTX2 ni AZPs en las muestras de moluscos Los resultados muestran que de los cuatro grupos de toxinas PTX YTXs DTXs y SPXs tres de ellas pueden estar presentes simultaacuteneamente en los moluscos vale decir PTXs YTXs y DTX1 o bien SPXs en vez de DTX1 42 Toxinas en microalgas

En las microalgas se detectaron PTXs y YTXs (Tabla 6) Las PTXs fueron detectadas aunque a nivel de trazas en ceacutelulas de D acuminata seleccionadas por micromanipulacioacuten desde muestras de agua procedentes de estero Silva Palma (M25) estero Wickham (M26) y Cutter Cove (M29) (Fig1) Tambieacuten fue detectada en filtrados de agua (fitoplancton) de Pto Fontaine (M21) e I Engelfield (M29N1) Las YTXs fueron detectadas en ceacutelulas de P reticulatum seleccionadas por micromanipulacioacuten y en cultivos de esta microalga que se logroacute establecer a partir de muestras de agua provenientes de C Adalberto (M04) Cutter Cove (M29) e I Engelfield (M29N1) Solo en los cultivos se detectoacute

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homoYTX y en uno de ellos tambieacuten se detectoacute aunque miacutenimamente 45OHYTX un derivado de la YTX que normalmente se encuentra en los moluscos como producto de bio-transformacioacuten La presencia de 45OHYTX en el cultivo pudo deberse a la presencia de ceacutelulas ya en fase de declinacioacuten de la curva de crecimiento

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5 ANAacuteLISIS Y DISCUSIOacuteN DE LOS DATOS

51 Toxinas en moluscos De las toxinas lipofiacutelicas se sabe que AO DTXs y AZAs causan trastornos gastrointestinales en los seres humanos (Gerssen et al 2010) Para las toxinas restantes (YTXs PTXs y SPXs) auacuten cuando no se han reportado casos de intoxicacioacuten en los seres humanos eacutestas son letales o altamente toacutexicas cuando los ratones son inyectados por viacutea intraperitoneal (Paz et al 2008 Richard et al 2000 Miles et al 2004) Es el caso de los SPXs la toxicidad en ratones inyectados por viacutea intraperitoneal supera a la del resto de las toxinas pues su dosis letal 50 es de 40 microg kg-1 (Richard et al 2000) Tal es asiacute que como referencia (Tabla 5) el transvector caracol piquilhue recolectadas en Julio de 2012 y cuyos niveles de toxicidad provocaron la muerte de los ratones solo presentoacute 01 microg kg-1 deteccioacuten que fue realizada durante este estudio en muestras de carne almacenadas durante no maacutes de 1 antildeo a -20 ordmC Sin embargo no se puede descartar una peacuterdida de la actividad por transformacioacuten durante el periodo de conservacioacuten A excepcioacuten de los SPXs el resto de las toxinas mencionadas estaacuten reguladas por la legislacioacuten europea tanto para consumo interno como importacioacuten de moluscos y tunicados para garantizar la salud de las personas Asiacute tambieacuten estaacuten reguladas por la legislacioacuten chilena a traveacutes del Instituto de Salud Puacuteblica (ISP) estableciendo los mismos niveles de referencia europeo en base al bioensayo ratoacuten Aun cuando los niveles de toxinas detectadas en los moluscos durante este estudio estaacuten por debajo de lo exigido por las regulaciones e incluso de los niveles propuestos por el EFSA (Tabla 7) la presencia de dos y tres tipos de toxinas en los moluscos representa una complejidad en la determinacioacuten de los niveles de toxicidad especialmente si se encuentran presentes toxinas altamente toacutexicas para ratones inyectados intraperitonealmente como son los SPXs Aunque se sospechaba la concurrencia de diferentes tipos de toxinas tal hecho no habiacutea sido confirmado anteriormente Sin embargo los SPXs siguen siendo una incoacutegnita pues se desconoce la fuente de estas toxinas A ostenfeldii la especie que podriacutea ser candidata a confirmar estuvo ausente (Tabla 8 modificado de Guzmaacuten et al 2014) durante el periodo en que se detectoacute en los moluscos Los escasos antecedentes toxigeacutenicos de esta especie en Chile la han confirmado como productora de toxinas paralizantes en Ayseacuten (Pizarro et al 2012) pero no de SPXs No obstante la produccioacuten de SPXs por esta especie en la regioacuten de Magallanes auacuten no se puede descartar Las YTXs fueron las toxinas maacutes abundantes en los moluscos analizados condicioacuten que se corresponde con la alta abundancia relativa de esta especie en el ambiente (Tabla 8) en la mayoriacutea de los casos (Tabla 5)

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Los resultados sugieren que los falsos positivos por bioensayo ratoacuten pudieran ser maacutes frecuentes de lo que se piensa actualmente para la regioacuten de Magallanes 52 Toxinas en microalgas Los resultados indican que P reticulatum encontrado en Magallanes producen YTXs al igual que las especies reportadas en la regioacuten de Antofagasta y Ayseacuten (Aacutelvarez et al 2011 Pizarro et al 2012) Tal resultado hace altamente probable que esta especie es la fuente de YTXs detectadas en los moluscos durante el periodo de estudio De acuerdo a las toxinas detectadas en las muestras de D acuminata aisladas asiacute como en el fitoplancton con gran abundancia de esta especie (Tabla 8) sugiere que esta microalga podriacutea ser una fuente primaria de PTXs tal como ocurre en el norte y sur del paiacutes (Blanco et al 2007 Fux et al 2011) Aunque la especie tambieacuten ha sido asociada a la presencia de DTX1 en moluscos en un evento toacutexico ocurrido en 1998 en Magallanes (Uribe et al 2001) el DTX1 no fue detectado en las muestras de D acuminata durante este estudio El no hallazgo de DTX1 en estas muestras pudo deberse a una fuente microalgal distinta como D acuta yo P lima D acuta ha sido asociada a DTX1 en moluscos de la regioacuten de Ayseacuten (Lembeye et al 1993 y Zhao et al 1993) mientras que P lima es productora solo de DTX1 en la regioacuten de Magallanes (Salgado et al 2012) Sin embargo cuando se detectoacute DTX1 en las muestras de moluscos durante este estudio D acuta estuvo ausente en las muestras de agua mientras que D acuminata presentoacute una abundancia relativa alta Por otro lado el volumen de resuspensioacuten de los extractos pudo ser elevado al seguir el mismo procedimiento protocolar que se aplica a las muestras de moluscos de acuerdo a la normativa europea actual Por tal razoacuten el LC-MSMS no logroacute detectar PTXs ni DTX1 en las muestras de microalgas En estos casos un protocolo para el anaacutelisis de las microalgas debiera incluir un volumen menor de resuspensioacuten de los extractos secos en referencia al utilizado para los moluscos o bien seleccionar por micromanipulacioacuten un nuacutemero mayor de microalgas (gt 130 ceacutelulas) Sin embargo esto uacuteltimo es maacutes difiacutecil de lograr en latitudes australes debido a la baja densidad de ceacutelulas en las que se presenta normalmente esta especie en condiciones naturales Por tal motivo se recomienda realizar pruebas con un volumen de resuspensioacuten menor a 1 mL aun cuando se trate de un LC-MSMS triple cuadrupolo

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6 CONCLUSIONES

a Los moluscos de la regioacuten de Magallanes pueden presentar PTX2 YTX 45OHYTX DTX1 y SPX1

b El hecho que los moluscos puedan presentar dos o maacutes tipos de toxinas lipofiacutelicas dificulta establecer el nivel de toxicidad total

c P reticulatum en Magallanes produce YTXs al igual que la especie del norte y sur del paiacutes

d La abundancia relativa ambiental de P reticulatum durante el periodo de estudio coincidioacute con la presencia de YTXs en los moluscos

e Los SPXs encontrados anteriormente en caracoles piquilhue tambieacuten fue posible detectarlos en choritos durante este estudio

f Auacuten queda por confirmar el tipo de SPXs presentes y su eventual fuente primaria La presencia de SPXs en los moluscos no siempre coincidioacute con la presencia de A ostenfeldii en el ambiente y su abundancia relativa maacutexima fue solo de nivel 1 (raro) durante el periodo de estudio

g La PTX2 detectada en los moluscos coincidioacute con una alta abundancia relativa ambiental de D acuminata No obstante auacuten queda por confirmar si esta especie es la fuente primaria Para ello se hace necesario ajustar (disminuir) el volumen de dilucioacuten de los extractos secos de microalgas aisladas por micromanipulacioacuten aun cuando se trata de un espectroacutemetro de masas como un triple cuadrupolo

h La deteccioacuten de DTX1 en los moluscos coincidioacute con la ausencia de D acuta en el ambiente La toxina tampoco fue detectada en los moluscos cuando esta microalga estuvo a niveles de 2 y 3 (escaso y regular) Queda por confirmar la produccioacuten de DTX1 por esta especie en Magallanes

i No se encontraron PTX1 DTX2 ni AZPs en las muestras de moluscos durante el periodo de estudio

j Los resultados demuestran la presencia de toxinas en los moluscos que se hace necesario identificar y cuantificar utilizando teacutecnicas distintas al bioensayo

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F I G U R A

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Figura 1 Estaciones y sectores muestreados (ciacuterculo rojo) y sector Fortuna donde fue recolectado el

caracol piquilhue (ciacuterculo amarillo)

T A B L A S

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Tabla 1 Condiciones cromatograacuteficas para el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas usando

una columna de UPLC C18 en fase reversa y medio baacutesico

Columna Acquity UPLC BEH C18 17 microm 21x100 mm

Temperatura columna 45 ordmC

Flujo 04 mlmin

Volumen inyeccioacuten 5 microl

Temperatura muestras 10 plusmn 5 ordmC

Gradiente

Tiempo (min) Fase A () Fase B ()

0 75 25

066 75 25

330 5 95

528 5 95

726 75 25

900 75 25

Tabla 2 Paraacutemetros de la fuente de ionizacioacuten para el Xevo TQMS (Waters) en la determinacioacuten de toxinas lipofiacutelicas

PARAacuteMETROS DE LA FUENTE

ESI- ESI+

AO DTX2 DTX1 YTX homoYTX 45OH YTX y 45OH

homoYTX

AZA1 AZA2 AZA3 PTX2 PTX1 y SPX1

Voltaje de capilar (V) 100 200

Temperatura de solvatacioacuten (ordmC) 450 450

Flujo gas de solvatacioacuten (lh) 850 850

Flujo gas cono (lh) 50 50

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Tabla 3

Resumen de las condiciones de espectrometriacutea de masas empleadas con el Xevo TQMS (Waters) en el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas

Compuesto tR (min)

ESI

Ioacuten Precursor

(mz)

Ioacuten Producto

(mz)

Dwell time (s)

Energiacutea colisioacuten

(eV)

Voltaje cono (V)

AO 189 NEG 8035 2552 0010 46 86

113 0010 56 86

DTX2 210 NEG 8035 2552 0010 46 86

113 0010 56 86

DTX1 214 NEG 8175 5634 0010 43 86

2552 0010 48 86

YTX 202 NEG 5704 4674 0010 30 45

3963 0010 35 45

45OH-YTX 182 NEG 5784 4674 0010 30 45

3964 0010 30 45

HomoYTX 203 NEG 5775 4744 0010 30 48

4034 0010 30 48

45OH-homoYTX 182 NEG 5855 4034 0010 30 45

4744 0010 30 45

PTX1 306 POS 8925 8395 0015 25 36

8215 0015 25 36

PTX2 362 POS 8765 8415 0015 20 36

8235 0015 25 36

AZA1 263 POS 8425 6545 0015 55 50

3622 0015 50 50

AZA2 270 POS 8565 6725 0015 45 27

6545 0015 45 27

AZA3 236 POS 8285 6404 0015 55 47

3622 0015 55 47

SPX1 368 POS 6925 6744 0015 27 60

1643 0015 42 60 Transicioacuten cuantificadora

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Tabla 4 TRR y valores de tolerancia para las toxinas analizadas

TOXINA TRR TOLERANCIA

Toxinas del grupo de AO

AO 1000 0990-1010

DTX2 1040 1014-1066

DTX1 1140 1111-1168

Toxinas del grupo de PTX

PTX2 1000 0990-1010

PTX1 0850 0829-0871

Toxinas del grupo de YTX

YTX 1000 0990-1010

45OH-YTX 0894 0871-0916

Homo YTX 1000 0990-1010

45OH-homoYTX 0899 0876-0921

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Tabla 5 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de moluscos

Nordm estMes

recolectaLocalidad Molusco

cuerpo

enterohepat

gramos

carne

toxicidad

VDM ratoacuten

PTX2

(ugKg)

YTX

(ugKg)

45OHYTX

(ugKg)

DTX1

libre

(ugKg)

DTX1

total

(ugkg)

SPX 1

(ugKg)

M13 ene-13 E Peel chorito x 5086 + 01 02

M13 ene-13 E Peel ostioacuten x 5155 No real izado 16 21

M33 ene-13 B Bell chorito x 5253 + 04

M37 ene-13 B Agua Fresca chorito x 5039 + 05 01

M35 ene-13 C San Isidro chorito x 5289 + 000 01

M42 ene-13 V Holanda chorito x 5231 + 06 13

M43 ene-13 B Yendegaia chorito x 5193 + 04 25

M45 ene-13 Pto Williams chorito x 5161 - 28 07

M08 feb-13 E Falcon cholga x 5027 - 14

M09 feb-13 E Penguumlin cholga x 5103 + 14

M22 feb-13 E de las Montantildeas cholga x 5052 - 26

M23 feb-13 I Ballesteros cholga x 5204 - 87

M24 feb-13 B Fanny chorito x 2016 - 38 1071 479 12

M25 feb-13 E Silva Palma chorito x 1447 - 59 1077 898 09

M26 feb-13 E Wickham chorito x 1093 - 194 2940 2232 66 66

M27 feb-13 E Sullivan chorito x 1137 - 450 1944 1478

M28 feb-13 E Nuntildeez chorito x 1179 + 33 721 407

M29 feb-13 Cutter Cove chorito x 1003 - 65 501 309

M29N1 feb-13 I Engelfield chorito x 1116 - 297 2007 1483

M31 feb-13 B Nash chorito x 2231 +

M33 feb-13 B Bell chorito x 1181 - 93

M34 feb-13 S Pedro chorito x 0726 -

M35 feb-13 C San Isidro chorito x 1178 + 110

M36 feb-13 B Buena chorito x 1367 +

M37 feb-13 B Agua Fresca chorito x 0850 + 45 100 80

M39 feb-13 Pto Zenteno chorito x 3241 + 28

M39N2 feb-13 Pta San Valentin chorito x 1712 - 11

M39N3 feb-13 Pto Yartou chorito x 2035 - 11

sector

Fortunajul-12 B Inuacutetil

caracol

piquilhuex 107000 + 01

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Tabla 6 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de microalgas

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Tabla 7 Niveles actualmente permitidos por la legislacioacuten europea (bioensayo) y los niveles propuestos por la

autoridad europea para la seguridad alimentaria (EFSA) (Gerssen et al 2010)

Toxin Legislacioacuten (μg kg-

1) Proposicioacuten

EFSA (μg kg-1)

Validacioacuten LC-MSMS

(μg kg-1)

OA and DTXs 160 45

PTXs 120

YTXs 1000 3750

AZAs 160 32

SPXs 400 (Gerssen et al2010)

European Food Safety Authority Decisioacuten 2002657 de la Unioacuten Europea EC Incluye PTXs

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Tabla 8 Abundancia relativa ambiental de las microalgas al momento de recolectar las muestras de moluscos En rojo se indica la deteccioacuten de toxina positiva en los moluscos asociada a la supuesta microalga fuente PTXs (D

acuminata) YTXs (P reticulatum) SPXs (A ostenfeldii) DTX1 (A acuta)

(Tabla modificada de Guzmaacuten et al 2014)

A N E X O S

ANEXO 1

Certificacioacuten laboratorio INTECMAR

ANEXO 2

Lista de anaacutelisis que realiza INTECMAR y sus costos (en euros) 2013

scv 1 de 7

GUIA PARA LA AUTOLIQUIDACIOacuteN DE TASAS A FAVOR DE LA COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA 2013 Los aspectos financieros de los servicios prestados por Intecmar en el marco de su actividad e vienen regulados en la Ley 62003 de 9 de diciembre de tasas precios y exenciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia (DOG nuacutem 240 de 11122003) y fueron actualizados posteriormente en la Ley 142010 de 27 de diciembre de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2011 (DOG nuacutem 250 de 30122010) y en la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013 (DOG nuacutem 42 de 28022013) Existen dos maneras de liquidar las tasas correspondientes a los servicios prestados por Intecmar

1 De forma manual cubriendo el modelo A de autoliquidacioacuten que se descarga en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda y que adjunto en pdf y se lleva al banco para su pago httpwwwconselleriadefacendaeswebportalconfeccion-impresos

2 De forma telemaacutetica en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda viacutenculo httpshostcixtecesXEITObinlionwebXeitodllxmit a traveacutes del modelo 730

Ambos modelos de liquidacioacuten de tasas adjuntamos ejemplo al final de este documento deben ser remitidos por mail a Intecmar con el sello del banco fiacutesico o virtual como paso previo a la emisioacuten del certificado Los coacutedigos generales necesarios son

minus Consejeriacutea de Medio Rural y de Mar Coacutedigo 09 minus Delegacioacuten de Pontevedra Coacutedigo 40 minus Servicio de Intecmar Coacutedigo 24

Los coacutedigos y descripcioacuten de las tasas son los regulados en la legislacioacuten vigente y los hemos resumido en los anexos siguientes Vilaxoaacuten 4 de marzo de 2013

scv 2 de 7

TARIFAS DE TASAS VIGENTES PARA 2013 - Ley 22013 d e 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013

(DOG nuacutem 42 de 28022013)

Estas tarifas son consecuencia de la actualizacioacuten de las tarifas contenidas en los anexos 1 2 3 4 y 5 de la Ley 62003 del 9 de diciembre de tasas precios y exacciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia por la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 Seraacuten aplicables desde el diacutea de la entrada en vigor de la Ley de

presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 TASA POR SERVICIOS ADMINISTRATIVOS

No sujecioacuten No se exigiraacute la tasa por servicios administrativos cuando se trate de compulsas o cotejos de documentos que deban acompantildear a solicitudes escritos o comunicaciones presentadas por el ciudadano y realizadas en el aacutembito de actuacioacuten de los registros seguacuten lo dispuesto en el artiacuteculo 385 de la Ley 301992 del 26 de noviembre de reacutegimen juriacutedico de las administraciones puacuteblicas y del procedimiento administrativo comuacuten

Excepciones Estaraacuten exentos de la presente tasa

1- La expedicioacuten de certificados de retribuciones satisfechas por la Xunta de Galicia con el objeto de justificacioacuten en relacioacuten con el impuesto sobre la renta de las personas fiacutesicas

2- La expedicioacuten de certificados y compulsa que el personal de la Administracioacuten solicite respecto a las necesidades propias del puesto de trabajo o relacioacuten de servicios

3- Los alumnos por cualquier actuacioacuten en materia de ensentildeanzas no universitarias

scv 3 de 7

4- Las compulsas realizadas en las oficinas de empleo para los desempleados en la tramitacioacuten de expedientes que sean competencia de dichas oficinas

5 La inscripcioacuten en las convocatorias para a seleccioacuten de personal de la comunidad autoacutenoma despueacutes de justificacioacuten documental solicitada por

- Personas con discapacidad igual o superior al 33 - Personas que sean miembros de familias numerosas clasificadas en la

categoriacutea especial Se aplicaraacute una bonificacioacuten del 50 a la inscripcioacuten solicitada por - Personas que sean miembros de familias numerosas de categoriacutea

general - Personas que figurasen como demandantes de empleo desde por lo

menos seis meses antes a la fecha de la convocatoria de pruebas selectivas de personal en las que soliciten su participacioacuten y no esteacuten percibiendo prestacioacuten o subsidio por desempleo

6- La expedicioacuten de certificados relativos a la situacioacuten fiscal 7- El Estado y los demaacutes entes puacuteblicos territoriales o institucionales

siempre que los servicios o actividades de que sean beneficiarios se presten o se realicen en el marco del principio de colaboracioacuten entre administraciones

8- Las viacutectimas de actos terroristas asiacute como sus coacutenyuges y sus hijos por cualquier actuacioacuten en materia educativa realizada en centros oficiales de estudios en todos los niveles de ensentildeanza

9- Los miembros de los organismos consultivos de la Administracioacuten puacuteblica gallega respecto de los certificados emitidos por dichos organismos

COacuteDIGO TASAS

DESCRIPCIOacuteN IMPORTE euro

314400 Prestacioacuten de servicios en el Instituto Tecnoloacutegico para el Control del Medio Marino de Galicia

314401 Anaacutelisis de biotoxinas marinas en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de Yasumoto 1978 4752

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en rato segundo o meacutetodo de Yasumoto 1984 5432

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS)

9520 -Anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten

seguacuten el meacutetodo de la AOAC 4752

scv 4 de 7

-Anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo da AOAC 4752

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1978 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10186

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1984 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10865

-Anaacutelisis combinada en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS) anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo AOAC y anaacutelisis de toxicidad de tipo ASP por cromatografiacutea liquida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo de la AOAC 15000

314402 Anaacutelisis de muestras en agua de mar -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton marino mediante

microscopiacutea oacuteptica 15133 -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton toacutexico marino

mediante microscopiacutea oacuteptica 13333 - Anaacutelisis de carbono orgaacutenico disuelto 5093 -Anaacutelisis de nutrientes inorgaacutenicos disueltos 3500 -Anaacutelisis de pigmentos fotosinteacuteticos (clorofila ldquoardquo) por

espectrofluorimetria 1698 314403 Anaacutelisis microbioloacutegicos en moluscos y otros organismos

procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Cuantificacioacuten de E Coli 10186 - Deteccioacuten de Salmonella spp 16975 -Enumeracioacuten de Escherichia coli en moluscos bivalvos

vivos por la teacutecnica de medida directa de impedancia con el sistema BacTrac 4300 6800

314404 Anaacutelisis de contaminantes de origen quiacutemica en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Determinacioacuten de metales pesados (Pb Cd Cu Zn As Hg Ni Cr Ag) mediante espectrofotometriacutea de absorcioacuten atoacutemica por metal

6790

-Determinacioacuten de compuestos bifenilos policlorados (PCB) mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

scv 5 de 7

-Determinacioacuten de pesticidas organoclorados mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

-Determinacioacuten de hidrocarburos aromaacuteticos policiacuteclicos (HAPs) mediante cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de fluorescencia

28200

314405 Anaacutelisis histopatoloacutegica de moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Estudio hispatoloacutegico Determinacioacuten de Bonamia Marteillia Perkinsus y otras alteraciones patoloacutegicas

101852

314406 Emisioacuten de certificaciones e informes teacutecnicos y otras actuaciones a peticioacuten del interesado

Emisioacuten de certificados a peticioacuten de los interesados sobre las actuaciones llevadas a cabo por el Instituto

1000

Emisioacuten de informes teacutecnicos a peticioacuten del interesado (euros por hora o fraccioacuten)

4000

scv 6 de 7

scv 7 de 7

ANEXO 3

Resultados de anaacutelisis en muestras de microalgas anteriormente enviadas procedentes de Magallanes por el equipo de espectrometriacutea de masas utilizado por INTECMAR Trabajo presentado a las XXXII

Congreso de Ciencias del Mar realizado en Punta Arenas 22-25 octubre de 2012

PERFIL DE TOXINAS DE PROROCENTRUM LIMA (DINOPHYCEAE) AISLADO DESDE LA COSTA DE MAGALLANES SUR DE CHILE P Salgado1 G Pizarro1 JM Franco2 P Rioboacute2 e I Bravo3

1Instituto de Fomento Pesquero (IFOP) Punta Arenas Chile gemitapizarroifopcl 2Instituto de Investigaciones Marinas (CSIC) Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea 3Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea

Prorocentrum lima (Ehrenberg) es un dinoflagelado marino bentoacutenico que se encuentra adherido generalmente

sobre macroalgas sedimentos y detrito flotante y menos comuacutenmente en el plancton (Bravo et al 2001) Es una especie neriacutetica y estuarina y su rango de distribucioacuten geograacutefica variacutea desde aguas costeras tropicales a templadas (Faust 1991) La importancia de P lima se debe a que son productoras de toxinas diarreogeacutenicas en las personas (veneno diarreico de los mariscos VDM) al igual que algunas especies de Dinophysis aunque raramente se le han asociado con episodios toacutexicos por VDM por su caraacutecter epiacutefito y bentoacutenico El complejo VDM producido por P lima incluye moleacuteculas conocidas como el aacutecido okadaico (AO) y derivados dinofisistoxinas (DTX-1 DTX-2) (Bravo et al 2001 Vale et al 2009) No obstante existen casos citados para USA donde se detectoacute toxicidad por VDM en bivalvos de cultivos asociadas a P lima aunque en bajos niveles (Maranda et al 2007a) En Canadaacute tambieacuten se llevoacute a cabo un estudio en moluscos de cultivo cuya finalidad fue determinar el origen del VDM en la que P lima fue la principal especie sospechosa tras la ocurrencia de un evento toacutexico humano por VDM ocurrido en 1998 (Levasseur et al 2003) y en antildeos anteriores (Quilliam et al 1993) Aunque Levasseur et al (2003) no logroacute probar la toxicidad de los mariscos en cultivo a causa de P lima cabe hacer notar que lo que buscaron fue OA y DTX1 no DTX 3 este uacuteltimo principal derivado de las anteriores tras su transformacioacuten en los moluscos (eg Suzuki et al 1999 Vale amp Sampayo 2002)

En consecuencia el rol de P lima en eventos toacutexicos por VDM auacuten no puede descartarse por cuanto podriacutean llegar a ser importantes en ambientes turbulentos debido a la eventual remocioacuten de microalgas adheridas en sustratos por efecto de vientos (Levasseur et al 2003) factor de importancia si se trata de sedimentos o contrariamente en zonas someras y estables de cultivos de moluscos que al mismo tiempo favorecen microambientes para sustratos en los que prolifera la epiacutefita P lima (Lawrence et al 2000) quedando expuestas a re-suspensiones temporales que favorecen la filtracioacuten de estas microalgas por los bivalvos en cultivo (Maranda et al 2007a)

Chile posee escaso conocimiento sobre esta especie en su medio natural incluido su perfil de toxinas y potencial rol en la toxificacioacuten de moluscos por VDM Por tal razoacuten resultoacute interesante aportar al conocimiento de estos aspectos en muestras de sedimentos recolectadas en el estrecho de Magallanes en las que esta especie se encontroacute inhabitualmente abundante

Las ceacutelulas utilizadas en este estudio fueron aisladas desde sedimentos superficiales (0-3 cm) recolectados en el invierno de 2010 en la localidad de cabo San Isidro durante el muestreo regular del programa de monitoreo de marea roja en la regioacuten de Magallanes En esa oportunidad se logroacute cuantificar hasta 1002 quistes tecadoscm3 de Prorocentrum lima la mayor concentracioacuten respecto a otros sitios de recolecta (Fig 1) Los sedimentos de esta localidad presentaron una coloracioacuten oscura y un fuerte olor a sulfuro de hidroacutegeno (H2S) producto de anoxia local

Se aislaron entre 27 y 87 quistes tecados (Fig 1 a) directamente desde los sedimentos mientras otras 60 ceacutelulas vegetativas (Fig 1 b) fueron aisladas luego de promover la actividad y divisioacuten de los quistes en condiciones de 15 ordmC y un ciclo de luzoscuridad de 1212 horas (Tabla 1) Para este fin se aislaron quistes tecados y trasvasijaron a placas Petri de 5 cm de diaacutemetro conteniendo 5 mL de medio de cultivo L1 Para el anaacutelisis de toxinas las ceacutelulas aisladas fueron trasvasijadas a un tubo Eppendorf de 15 mL y congelados a -80 ordmC Una aliacutecuota de sedimento huacutemedo (100 microL aproximados) tambieacuten fue vaciada en un tubo Eppendorf y congelado Para extraer la toxina se antildeadioacute 500 microL de metanol 100 a cada tubo se mezcloacute por 1 min y filtroacute por 045 microm trasvasijando a un vial El extracto fue secado bajo nitroacutegeno gas a 40 ordmC y conservado a 4 ordmC hasta su anaacutelisis Previo al anaacutelisis de toxinas los extractos fueron resuspendidos en 150 microl de metanol

La presencia de la toxina dinofisistoxina 1 (DTX-1) en las muestras (Fig2) fue confirmada en modo negativo a traveacutes de su ioacuten precursor [M-H]- mz 8175 y sus iones productos mz 5634 y 2552 mediante un cromatoacutegrafo UPLC Acquity Waters acoplado a un triple cuadrupolo Waters Xevo TQ (LC-MS) La columna utilizada fue una Acquity UPLC BEH C18 17microm 21 x 100 mm a 45 ordmC La fase moacutevil consistioacute en (A) hidroacutexido amoacutenico a pH 11 y (B) hidroacutexido amoacutenico en acetonitrilo (67 mM) con una tasa de flujo de 4 mLmin El gradiente de elucioacuten utilizado fue el siguiente mantencioacuten al 75 de A entre 0 y 066 min cambio a 5 de A entre 066 y 330 min mantener 5

de A entre 330 y 528 min recuperacioacuten del 75 de A entre 528 y 726 min mantencioacuten al 75 de A hasta 9 min Se pinchoacute 5microL de muestra en el LC-MS El contenido de DTX-1 en las muestras fue cuantificado en base al ion precursor

Los tres tipos de muestras fueron positivas a la presencia de DTX-1 pero las ceacutelulas vegetativas fueron las que presentaron un mayor contenido de DTX-1 por ceacutelula La deteccioacuten de DTX-1 en los sedimentos (Tabla 2) reflejoacute la presencia de los quistes tecados en eacutestos

Figura 1 Concentraciones de quistes tecados de Prorocentrum lima (quistescm3 de sedimento huacutemedo) en estaciones de muestreo en el Estrecho de Magallanes (M26 Estero Wickham M29N1 Isla Engenfield M31 Bahiacutea Nash M35 Cabo San Isidro M39C1 Bahiacutea Gente Grande M39C2 Bahiacutea Inuacutetil M39C3 Canal Gabriel) y Canal Beagle (M41 Ventisquero Espantildea M42 Ventisquero Holanda) (a) Quistes tecados (b) ceacutelulas vegetativas obtenidas de germinacioacuten de quistes tecados bajo condiciones de laboratorio Barra de escala 20 microm

Tabla 1 Sedimento y ceacutelulas de Prorocentrum lima aisladas para anaacutelisis de toxinas

Extracto metanoacutelico Nordm de ceacutelulas TR ngmL pg DTX-1 ceacutel

G1 quistes tecados 27 213 lt2 -

G2 quistes tecados 67 214 05 11

G3 quistes tecados 87 215 12 21

G4 ceacutelulas vegetativas 60 215 34 87

G6 sedimentos aliacutecuota 213 13 19 pg microL sed

TR tiempo de retencioacuten

Figura 2 Cromatogramas de extractos metanoacutelicos de Prorocentrum lima quistes tecados (a) ceacutelulas vegetativas (b) y sedimentos (c)

Tabla 2 Caracteriacutesticas del sedimento con quistes tecados de Prorocentrum lima

Tipo Tamantildeo (mm)

Grava 2 35

Arena media 025 - 05 32

Arena muy fina 0063 - 0125 2

Limo-arcilla lt 0063 1

Estos resultados constituyen otra eventual posibilidad de toxicidad en los moluscos por VDM no soacutelo de aquellos con modalidad de vida bentoacutenica superficial sino de aquellos que tambieacuten viven enterrados en la arena (eg almeja huepo) Maacutes auacuten si se conoce que P lima posee la capacidad de desarrollar poblaciones naturales en aguas templadas en nuacutemeros que podriacutean justificar una toxicidad por VDM en los mariscos (eg Maranda et al 2007a b)

Referencias

Bravo I ML Fernaacutendez I Ramilo amp A Martinez 2001 Toxin composition of the toxic dinofagellate Prorocentrum lima isolated from different locations along the Galician coast (NW Spain) Toxicon 39 1537ndash1545

Faust MA 1991 Morphology of ciguatera-causing Prorocentrum lima (Pyrrophyta) from widely differing sites J Phycol 27 642-648

Lawrence J E Grant J Quilliam M A Bauder A G amp Cembella A D 2000 Colonizaition and growth of the toxic dinoflagellate Prorocentrum lima and associated fouling macroalgae on mussels in suspended culture Mar Ecol Prog Ser 201 147-154

Levasseur M Couture J Y Weise A M Michaud S Elbrachter M Sauveacute G amp Bonneau E 2003 Pelagic and epiphytic summer distributions of Prorocentrum lima and P mexicanum at two mussel farms in the Gulf of St Lawrence Aquat Microbiol Ecol 30283-293

Maranda L Corwin S Dover S amp Morton S L 2007a Prorocentrum lima (Dinophyceae) in northeastern USA coastal waters II Toxin load in the epibiota and in shellfish Harmful Algae 6 632-641

Maranda L Corwin S Hargraves P E 2007b Prorocentrum lima (Dinophyceae) in 19 northeastern USA coastal waters I Abundance and distribution Harmful Algae 6 623ndash631

Quilliam MA Gilgan MW amp Pleasance S 1993 Confirmation of an incident of diarrhetic shellfish poisoning in eastern Canada In Smayda TJ Shimizu Y (Eds) Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea Elsevier New York pp 547ndash552

Suzuki T Ota H amp Yamasaki M 1999 Direct evidence of transformation of dinophysistoxin-1 to 7-O-acyl-dinophysistoxin-1 (Dinophysis-3) in the scallop Patinopecten yessoensis Toxicon 37 187-198

Vale P amp Sampayo M A 2002 First confirmation of human diarrhoeic poisonings by okadaic acid esters after ingestion of razor clams (Solen marginatus) and green crabs (Carcinus maenas) in Aveiro lagoon Portugal and detection of okadaic acid esters in phytoplankton Toxicon 40989-996

Vale P Veloso V amp Amorim A 2009 Toxin composition of a Prorocentrum lima strain isolated from the Portuguese coast Toxicon 54145ndash152

Agradecimientos Intecmar de la Xunta de Galicia Espantildea donde se realizaron los anaacutelisis de toxinas proyecto

SUBPESCA ldquoManejo y Monitoreo de Mareas Rojas en las regiones de Los Lagos Ayseacuten y Magallanes IV etapa 2010rdquo

ANEXO 4

Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten

ANEXO 5

Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de Magallanes

TASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

O

EJE

MP

LA

R P

AR

A E

L IN

TE

RE

SA

DO

LIQ

UID

AC

IOacuteN

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

EN

TID

AD

BA

NC

AR

IATASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

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Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

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NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

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9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

0 9

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2 4INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS3 1 4 4 0 1

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NTASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

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Firma del declarante o representante legal

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BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

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PONTEVEDRA

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ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

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2 4

3 1 4 4 0 1

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

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ANEXO 6

Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para cierre

de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

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Seccioacuten Ediciones y Produccioacuten Almte Manuel Blanco Encalada 839

Fono 56-32-2151500 Valparaiacuteso Chile

wwwifopcl

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ii

Los resultados muestran que de los cuatro grupos de toxinas PTXs YTXs DTXs y SPXs tres de ellas estuvieron presentes simultaacuteneamente en los moluscos vale decir PTX2 YTXs y DTX1 o bien PTXs YTXs y SPXs La presencia de PTX2 y DTX1 en moluscos fue coincidente con la mayor abundancia relativa de Dinophysis acuminata en el ambiente y no con D acuta que estuvo ausente Las YTXs fueron detectadas en los mismos transvectores y coincidioacute con una alta abundancia relativa de Protoceratium reticulatum En este uacuteltimo caso fue posible confirmar la produccioacuten de YTXs por P reticulatum en microalgas aisladas por micromanipulacioacuten y en cultivos establecidos a partir de aislamientos de esta especie desde muestras de agua procedentes del aacuterea norte y centro de Magallanes

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iii

IacuteNDICE GENERAL

Paacutegina

RESUMEN EJECUTIVO -------------------------------------------------------------------------------------------- i IacuteNDICE GENERAL --------------------------------------------------------------------------------------------------- iii IacuteNDICE DE FIGURA -------------------------------------------------------------------------------------------------- iv IacuteNDICE DE TABLAS ------------------------------------------------------------------------------------------------- iv IacuteNDICE DE ANEXOS ------------------------------------------------------------------------------------------------ v

1 ANTECEDENTES -------------------------------------------------------------------------------------------- 1

2 OBJETIVOS --------------------------------------------------------------------------------------------------- 2 21 Objetivo general ----------------------------------------------------------------------------------------- 3 22 Objetivo especiacutefico ------------------------------------------------------------------------------------- 3

3 METODOLOGIacuteA --------------------------------------------------------------------------------------------- 3 31 Obtencioacuten del extracto --------------------------------------------------------------------------------- 3 32 Laboratorio de anaacutelisis dotado con LC-MSMShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 3 33 Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por LC-MSMShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 4 34 Extraccioacuten de toxinashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 6

4 RESULTADOS ------------------------------------------------------------------------------------------------ 9 41 Toxinas en moluscoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 9 42 Toxinas en microalgashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 9

5 ANAacuteLISIS Y DISCUSIOacuteN DE LOS RESULTADOS helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 11 51 Toxinas en moluscoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 11 52 Toxinas en microalgashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 12

6 CONCLUSIONES --------------------------------------------------------------------------------------------- 13

7 REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS -------------------------------------------------------------------- 14

FIGURA

TABLAS

ANEXOS Anexo 1 Certificacioacuten laboratorio INTECMAR Anexo 2 Lista de anaacutelisis que realiza INTECMAR y sus costos (en euros) 2013 Anexo 3 Resultados de anaacutelisis en muestras de microalgas anteriormente enviadas procedentes de

Magallanes por el equipo de espectrometriacutea de masas utilizado por INTECMAR Trabajo presentado a las XXXII Congreso de Ciencias del Mar realizado en Punta Arenas 22-25 octubre de 2012

Anexo 4 Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten Anexo 5 Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de Magallanes Anexo 6 Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para

cierre de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

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iv

IacuteNDICE DE FIGURA

Figura 1 Estaciones y sectores muestreados (ciacuterculo rojo) y sector Fortuna donde fue recolectado el caracol piquilhue (ciacuterculo amarillo)

IacuteNDICE TABLAS

Tabla 1 Condiciones cromatograacuteficas para el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas usando una columna

de UPLC C18 en fase reversa y medio baacutesico Tabla 2 Paraacutemetros de la fuente de ionizacioacuten para el Xevo TQMS (Waters) en la determinacioacuten

de toxinas lipofiacutelicas Tabla 3 Resumen de las condiciones de espectrometriacutea de masas empleadas con el Xevo

TQMS (Waters) en el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas Tabla 4 TRR y valores de tolerancia para las toxinas analizadas Tabla 5 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de moluscos Tabla 6 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de microalgas Tabla 7 Niveles actualmente permitidos por la legislacioacuten europea (bioensayo) y los niveles

propuestos por la autoridad europea para la seguridad alimentaria (EFSA) (Gerssen et al 2010) European Food Safety Authority

Tabla 8 Abundancia relativa ambiental de las microalgas al momento de recolectar las muestras

de moluscos En rojo se indica la deteccioacuten de toxina positiva en los moluscos PTXs (D acuminata) YTXs (P reticulatum) SPXs (A ostenfeldii) DTX1 (A acuta) (Tabla modificada de Guzmaacuten et al 2014)

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v

IacuteNDICE ANEXOS

Anexo 1 Certificacioacuten laboratorio INTECMAR Anexo 2 Lista de anaacutelisis que realiza INTECMAR y sus costos (en euros) 2013 Anexo 3 Resultados de anaacutelisis en muestras de microalgas anteriormente enviadas

procedentes de Magallanes por el equipo de espectrometriacutea de masas utilizado por INTECMAR Trabajo presentado a las XXXII Congreso de Ciencias del Mar realizado en Punta Arenas 22-25 octubre de 2012

Anexo 4 Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten Anexo 5 Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de

Magallanes Anexo 6 Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para

cierre de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

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1

1 ANTECEDENTES En Chile auacuten existen escasos antecedentes acerca de las toxinas lipofiacutelicas presentes en nuestros moluscos asiacute como la fuente microalgal asociada a su produccioacuten y la variabilidad espacio-temporal de las mismas Tal situacioacuten es tambieacuten un problema en el sur austral de Chile y particularmente en Magallanes donde el historial de este tipo de toxinas ha sido opacado por la fuerte incidencia de toxina paralizante asociada a la presencia de Alexandrium catenella No obstante en los dos uacuteltimos antildeos los niveles de toxicidad por toxinas lipofiacutelicas en la regioacuten se han constituido en un problema para la autoridad de Salud pues han determinado el cierre de grandes extensiones de aacutereas a la extraccioacuten de moluscos hecho no acontecido anteriormente salvo muy local y esporaacutedicamente (eg Uribe et al 2001) ademaacutes del efecto econoacutemico y social

Dentro de las toxinas lipofiacutelicas las maacutes conocidas y frecuentes a nivel mundial por sus efectos diarreicos (veneno diarreico de los mariscos VDM) en humanos son el aacutecido okadaico y sus derivados las dinofisistoxinas (AO y DTXs) (eg Yasumoto et al 1978) tambieacuten conocidas como okadaatos Por lo mismo poseen un mayor historial de citas en la literatura cientiacutefica Los okadaatos son fuertes inhibidores de las proteiacutenas fosfatasas 1 y 2A y potenciales promotores de tumores (Yasumoto et al 1989 Fujiki et al 1989) con efectos croacutenicos desconocidos por lo que su efecto es maacutes lento Por esta razoacuten representan un riesgo para la salud puacuteblica y dan lugar a prolongadas vedas de extraccioacuten de bivalvos tanto de bancos naturales como centros de cultivo con las consiguientes peacuterdidas econoacutemicas para el sector pesquero y acuicultor en otras partes del mundo

Actualmente en Chile las toxinas lipofiacutelicas son detectadas por el bioensayo del ratoacuten una metodologiacutea semicuantitativa e inespeciacutefica Por lo mismo suelen ocurrir falsos positivos debido a la interferencia de otras toxinas lipofiacutelicas diferentes al VDM inocuas o no para el hombre pero que pueden estar presentes en las muestras inyectadas pues son co-extraiacutedas con los okadaatos

Gracias al uso de tecnologiacuteas de alta sensibilidad uacuteltimamente ha sido posible detectar junto a los okadaatos otras toxinas lipofiacutelicas de diverso efecto toacutexico tales como las yesotoxinas pectenotoxinas azaspiraacutecidos espiroacutelidos y gimnodimina (Zhao et al 1993 Yasumoto amp Takizawa 1997 Uribe et al 2001 Garciacutea et al 2005 Blanco et al 2007 Krock et al 2009 Aacutelvarez et al 2010 2011 Loacutepez et al 2010 Pizarro et al 2011 Fux et al 2011 Trefault et al 2011)

En Magallanes ha sido reportada la presencia de okadaatos (AO y DTXs) asociadas a la presencia de Dinophysis acuminata (Uribe et al 2001) Tambieacuten se ha reportado la presencia de yesotoxinas (YTXs) en moluscos Esta uacuteltima se sospecha estar asociada a la presencia de la especie Protoceratium reticulatum comprobada fuente primaria en Ayseacuten (Pizarro et al 2012) norte de Chile (Aacutelvarez et al 2011) y ampliamente conocida como tal a nivel mundial

Durante el periodo estival de 2013 en la regioacuten de Magallanes ocurrioacute una floracioacuten de dinoflagelados entre los que destacaron Dinophysis acuminata y Protoceratium reticulatum Tal floracioacuten se mantuvo intensa entre diciembre 2012 y febrero 2013 lo que permitioacute recolectar muestras de transvectores y microalgas para establecer yo confirmar los perfiles de toxinas lipofiacutelicas respectivas mediante LC-MSMS particularmente en una regioacuten con muy poca informacioacuten al respecto

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2

2 OBJETIVOS 21 General del proyecto

Establecer mediante LC-MSMS los perfiles de toxinas lipofiacutelicas en muestras de moluscos y de plancton recolectadas durante la floracioacuten de dinoflagelados ocurrida durante el verano 2013 en la regioacuten de Magallanes

22 Objetivo especiacutefico

Establecer los perfiles de toxinas lipofiacutelicas en transvectores centinelas fitoplancton y microalgas aisladas por micromanipulacioacuten recolectados en diferentes sectores de Magallanes durante el monitoreo regular realizados durante una floracioacuten de Dinophysis spp y Protoceratium reticulatum

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3

3 METODOLOGIacuteA En esta seccioacuten se describen las metodologiacuteas asociadas a las actividades realizadas para el logro de los objetivos asiacute como tambieacuten los conceptos e ideas que la fundamentan

31 Obtencioacuten del extracto - Carne de mariscos Dependiendo de la cantidad de material se procesoacute soacutelo el hepatopaacutencreas

o carne total Se maceroacute y pesoacute el material Se realizoacute extraccioacuten con metanol en una de 11 pv Los extractos fueron centrifugados y el sobrenadante filtrado por filtros de nylon de 045 microm y vaciado a un vial

- Extracto en metanol de muestras de fitoplancton (ie el ensamble total de microalgas sin separar

especies) Aliacutecuotas de agua previamente filtradas por malla de 250 microm para eliminar el zooplancton de tamantildeo mayor fueron filtradas en filtros de fibra de vidrio muflados de 13 mm de diaacutemetro (tamantildeo de poro nominal de 07 microm) Los filtros fueron puestos por separado seguacuten sitio de recolecta y fecha en ependorfs de 15 ml y congelados hasta ser extraiacutedos con 1 mL de metanol centrifugados El sobrenadante fue filtrado por filtros de nylon de 045 microm y vaciado a un vial

- Extracto en metanol de D acuminata y P reticulatum La microalgas aisladas por

micromanipulacioacuten bajo un microscopio invertido (siempre y cuando el nuacutemero de D acuminata y de P reticulatum fuera suficiente como para lograr reunir un nuacutemero cercano a las 30 ceacutelulas por cada especie) fueron puestas en un ependorf de 15 ml con 1 ml de metanol Para obtener el extracto de toxina las muestras fueron mezcladas en vortex y filtradas por filtros de nylon de 045 microm El extracto filtrado fue puesto en un vial Solo en una ocasioacuten fue posible acumular un nuacutemero suficiente de ceacutelulas de D acuta por ello fue posible obtener solo una muestra para esta especie

- Todos los extractos fueron secados con nitroacutegeno gas a 38ordmC Este proceso evita los problemas

de traslado de extractos en solventes orgaacutenicos y yo evitar eventuales peacuterdidas de liacutequidos en las muestras durante el trayecto

32 Laboratorio de anaacutelisis dotado de LC-MSMS La metodologiacutea para el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas se realizoacute mediante espectrometriacutea de masas acoplada a un cromatoacutegrafo liacutequido (LC-MSMS) Por tratarse de una teacutecnica auacuten no implementada en Chile en aspectos de determinacioacuten de toxinas marinas a nivel comercial y certificada ni tampoco para realizar investigacioacuten baacutesica de rutina fue necesario enviar las muestras a un laboratorio extranjero certificado Tal laboratorio pertenece al Instituto Tecnoloacutegico del Mar (INTECMAR) Galicia Espantildea

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4

El contacto se realizoacute a traveacutes de grupos de investigacioacuten extranjeros de vasta y reconocida experiencia en el tema para prospectar la factibilidad de donde realizar los anaacutelisis Los mismos aconsejaron al laboratorio perteneciente a INTECMAR INTECMAR es una entidad de investigacioacuten estatal encargada de realizar los monitoreos semanales en Galicia donde tambieacuten se encuentra fiacutesicamente su sede Actualmente estaacute certificada para la deteccioacuten de toxinas lipofiacutelicas en moluscos entre otros anaacutelisis que realiza (Anexo 1 y 2) El Anexo 2 contiene el costo del anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas (equivalente a cotizacioacuten) El laboratorio seleccionado posee un cromatoacutegrafo UPLC Acquity Waters acoplado a un triple cuadrupolo Waters Xevo TQ con la suficiente sensibilidad en la deteccioacuten de toxinas en microalgas aisladas por micromanipulacioacuten sensibilidad que fuera confirmada anteriormente al establecer cuantitativamente el perfil de toxinas lipofiacutelicas en muestras de microalgas aisladas desde muestras de sedimentos de Magallanes (ver Anexo 3) Previo al enviacuteo de extractos de moluscos y contrato de ensayo de anaacutelisis exigido por INTECMAR se realizoacute la consulta acerca de nuestro intereacutes tambieacuten por analizar toxinas en microalgas aun cuando no estuviesen certificados en esta matriz en particular La solicitud de anaacutelisis fue aceptada por parte de INTECMAR Una vez aceptado el contrato de ensayo por parte de INTECMAR (Anexo 4) se procedioacute entonces a enviar las muestras de 29 extractos de microalgas y 29 extractos de moluscos mientras INTECMAR facturoacute por costos de anaacutelisis solicitados por IFOP en el contrato de ensayo (Anexo 5) Si bien el nuacutemero de extractos obtenidos fue cercano a las 140 muestras el nuacutemero de muestras enviadas se ajustoacute al presupuesto otorgado para este proyecto al mismo tiempo que la informacioacuten obtenida fuera suficiente como para tener una visioacuten regional de los perfiles de toxinas que estuvieron presentes durante la floracioacuten estival de 2013 33 Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por LC-MSMS

Las toxinas lipofiacutelicas a determinar en las muestras fueron aacutecido okadaico (AO) dinofisistoxina-2 (DTX2) dinofisistoxina-1 (DTX1) pectenotoxinas (PTX1 PTX2) azaspiraacutecidos (AZA1 AZA2 AZA3) yesotoxinas (YTX homoYTX 45OHYTX 45OHhomoYTX) y espiroacutelidos (SPX1) El anaacutelisis se realizoacute con los siguientes elementos

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5

Equipos

Sistema cromatograacutefico Acquity Ultra Performance (Coacutedigo B191C)

Espectroacutemetro de masas equipado con interfase ESI y taacutendem MSMS Xevo TQMS (Coacutedigo B192C)

Software del programa TargetLynx (Coacutedigo 196)

Columna cromatograacutefica de fase reversa C18 17 microm 21 x 100 mm Acquity UPLC BEH

Reactivos y disolventes

Metanol grado HPLC gradiente

H2O Milli-Q Ellix

Acetonitrilo grado HPLC o Hipergrado para LC-MS

Acido foacutermico 98-100

Hidroacutexido amoacutenico 25

MeOHAgua 50

AcetonitriloAgua 90

Aacutecido clorhiacutedrico 37

Disolucioacuten de aacutecido clorhiacutedrico 25 M Hidroacutexido Soacutedico (le 99 pureza)

Disolucioacuten de hidroacutexido soacutedico 25 M

Disolventes cromatograacuteficos

Disolucioacuten tampoacuten hidroacutexido amoacutenico al 0125

Fase moacutevil A Agua conteniendo 67 mM de NH4OH

Fase moacutevil B Acetonitrilo conteniendo 67 mM de NH4OH

Cada fase moacutevil se filtra a vaciacuteo a traveacutes de filtros de membrana de nylon de 022 microm

Toxinas de Referencia

Disolucioacuten certificada de aacutecido ocadaico en metanol (NRC CRM-OA-c) Cod PB015

Disolucioacuten certificada de Yessotoxina Yessotoxin di-sodium salt en metanol (CRM-00-YTX) Cod PB018

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6

Disolucioacuten certificada de Homo-yessotoxina 1aHomoyessotoxin di-sodium salt en metanol (CRM-00-hYTX) Cod PB019

Disolucioacuten certificada de calibracioacuten de Azaspiraacutecido 1 en metanol (NRC CRM-AZA1) Cod PB020

Disolucioacuten certificada de calibracioacuten de Azaspiraacutecido 2 en metanol (NRC CRM-AZA2) Cod PB021

Disolucioacuten certificada de calibracioacuten de Azaspiraacutecido 3 en metanol (NRC CRM-AZA3) Cod PB022

Disolucioacuten de calibracioacuten de Dinofisistoxina 2 en metanol (00-DTX2) Cod PB026

Disolucioacuten de calibracioacuten de Dinofisistoxina 1 en metanol (CRM-00-DTX1) Cod PB032

Disolucioacuten de calibracioacuten de Pectenotoxina 2 en metanol (00-PTX2) Cod PB031

Material de Referencia Certificado (Mussel Tissue Reference Material for DSP Toxins NRC CRM-DSP-Mus-b) con AO y DTX1 101 plusmn 08 microgg y 13 plusmn 02 microgg respectivamente Homogeneizado de mejilloacuten (Mytilus edulis) Cod PB014

Material de Referencia Certificado (Mussel Tissue Reference Material for AZA Toxins NRC CRM-AZA-Mus) con AZA1 116 plusmn 010 microgg AZA2 0273 plusmn 0023 microgg y AZA3 0211 plusmn 0022 microgg Homogeneizado de mejilloacuten (Mytilus edulis) Cod PB030

Disolucioacuten certificada de calibracioacuten de 13-dismetil espiroacutelido C en metanol (NRC CRM-SPX1) Cod PB027

La Tabla 1 muestra las condiciones cromatograacuteficas usando una columna de UPLC C18 en fase reversa y medio baacutesico mientras que los paraacutemetros de la fuente de ionizacioacuten para el Xevo TQMS (Waters) se muestran en la Tabla 2

34 Extraccioacuten de toxinas

A los extractos metanoacutelicos en seco de las 29 muestras de moluscos y 29 muestras de microalgas se le adicionaron hasta un total de 25 mL de metanol dispensadas en pequentildeas aliacutecuotas agitando el vial con un vortex durante 30 segundos Anaacutelisis de las formas libres del AO DTX1 y DTX2 y de las toxinas de los grupos PTXs AZAs y YTXs Para la determinacioacuten de las formas libres del AO DTX1 y DTX2 y de las toxinas de los grupos PTXs AZAs y YTXs se filtroacute un volumen de aproximadamente 12 ml del extracto metanoacutelico a traveacutes de filtros

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de jeringa de 045 microm para su posterior hidroacutelisis (seccioacuten siguiente) Otra aliacutecuota del mismo extracto filtrada a traveacutes de filtro de jeringa compatible con el disolvente de 022 microm se diluyoacute a la mitad con MeOH 100 y se inyectoacute 5 microl en el sistema LC-MSMS Hidroacutelisis y cuantificacioacuten del contenido total de AO DTX1 y DTX2 Para detectar y cuantificar el contenido total de AO DTX1 y DTX2 se requiere una hidroacutelisis baacutesica previa a la inyeccioacuten de los extractos en el sistema de LC-MSMS Procedimiento En un vial que contiene 1 ml de extracto metanoacutelico previamente filtrado por filtros de jeringa de 045 microm se antildeaden 125 microl de NaOH 25 M se agita manualmente 10 segundos y la mezcla fue sometida a 76 plusmn 4 ordmC durante 40 minutos en un bantildeo Se enfrioacute a temperatura ambiente se pesoacute y luego neutralizoacute con 125 microl de HCl 25 M Finalmente se homogenizoacute nuevamente con el vortex durante 30 segundos Una aliacutecuota del extracto resultante se filtroacute con filtros de jeringa de 022 microm y diluyoacute 58 con MeOH 100 Una aliacutecuota de 5 microl fue inyectada en el sistema de LC-MSMS Durante el proceso de hidroacutelisis el vial debe estar bien cerrado para evitar peacuterdidas por evaporacioacuten (la temperatura de ebullicioacuten del MeOH es 65 ordmC) Las peacuterdidas se pueden detectar mediante pesada del vial antes y despueacutes de la hidroacutelisis en caso de confirmarse se completaraacute el peso con metanol La deteccioacuten con el espectroacutemetro de masas se realizoacute usando dos transiciones por toxina la de mayor intensidad se utilizoacute para cuantificar y la de menor intensidad para confirmar (Tabla 3) Identificacioacuten y Confirmacioacuten La identificacioacuten de la presencia de toxinas se realizaraacute por comparacioacuten del tiempo de retencioacuten de cada una de las toxinas en la muestra con el tiempo de retencioacuten obtenido en las disoluciones de calibrado estaacutendar inyectadas en un mismo diacutea de anaacutelisis Se permite una desviacioacuten maacutexima entre ambos tiempos del 25 Para las toxinas que se cuantifican con la recta de calibrado del anaacutelogo correspondiente se establece un TRR con una tolerancia seguacuten se indica en la Tabla 4 Para una correcta identificacioacuten se exige una separacioacuten entre picos calculada mediante aplicacioacuten de la expresioacuten

2 x (RT2-RT1) RS = ----------------------

(W1+W2)

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En donde RT1 y RT2 y W1 y W2 son respectivamente los tiempos de retencioacuten y las anchuras en la liacutenea base de dos picos adyacentes RT2gtRT1 La resolucioacuten seraacute aceptable cuando Rs gt10 y la resolucioacuten a liacutenea base se consideraraacute completa cuando Rs gt15 La confirmacioacuten de la presencia de toxina seguacuten el criterio de la Decisioacuten de la Comisioacuten 2002657EC se basa en la relacioacuten entre las dos transiciones empleadas para la determinacioacuten (cuantificacioacuten y confirmacioacuten)

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4 RESULTADOS

41 Toxinas en moluscos

Las toxinas detectadas en moluscos fueron PTX2 YTX 45OHYTX DTX1 y SPX1 (Tabla 5) La mayor concentracioacuten la presentoacute el grupo de las YTXs (40-294 microg kg-1) en muestras de choritos provenientes del sector de Seno Otway (Fig 1) En este mismo sector las PTXs tambieacuten presentaron las mayores concentraciones (3-45 microg kg-1) en estos transvectores En el caso del ostioacuten tanto el PTX2 como las YTXs fueron detectadas en el contenido gaacutestrico El DTX1 fue detectado en choritos (1-18 microg kg-1 considerando DTX1 libre y total) procedentes del sector Seno Otway y sectores adyacentes a Punta Arenas El AO no fue detectado en ninguna aacuterea de la Regioacuten Los SPXs fueron principalmente detectados en choritos de las aacutereas centro y sur de Magallanes y en una estacioacuten del estero Peel (M13) en el aacuterea norte de la regioacuten No obstante que los niveles son muy bajos (01- 25 microg kg-1) incluso del nivel letal 50 en ratones inyectados intraperitonealmente 40 microg kg-1 (Richard et al 2000) los valores encontrados son iguales o mayor al encontrado en el caracol piquilhue recolectado en julio de 2012 y que en ese entonces produjo la muerte de ratones provocando el cierre de aacutereas de extraccioacuten por la autoridad de salud regional (Anexo 6) De las cinco toxinas detectadas en los moluscos solo DTX1 mostroacute estar localizada en el aacuterea centro de Magallanes mientras que las restantes fueron detectadas en las tres aacutereas de monitoreo Norte centro y sur de Magallanes No se encontraron PTX1 DTX2 ni AZPs en las muestras de moluscos Los resultados muestran que de los cuatro grupos de toxinas PTX YTXs DTXs y SPXs tres de ellas pueden estar presentes simultaacuteneamente en los moluscos vale decir PTXs YTXs y DTX1 o bien SPXs en vez de DTX1 42 Toxinas en microalgas

En las microalgas se detectaron PTXs y YTXs (Tabla 6) Las PTXs fueron detectadas aunque a nivel de trazas en ceacutelulas de D acuminata seleccionadas por micromanipulacioacuten desde muestras de agua procedentes de estero Silva Palma (M25) estero Wickham (M26) y Cutter Cove (M29) (Fig1) Tambieacuten fue detectada en filtrados de agua (fitoplancton) de Pto Fontaine (M21) e I Engelfield (M29N1) Las YTXs fueron detectadas en ceacutelulas de P reticulatum seleccionadas por micromanipulacioacuten y en cultivos de esta microalga que se logroacute establecer a partir de muestras de agua provenientes de C Adalberto (M04) Cutter Cove (M29) e I Engelfield (M29N1) Solo en los cultivos se detectoacute

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homoYTX y en uno de ellos tambieacuten se detectoacute aunque miacutenimamente 45OHYTX un derivado de la YTX que normalmente se encuentra en los moluscos como producto de bio-transformacioacuten La presencia de 45OHYTX en el cultivo pudo deberse a la presencia de ceacutelulas ya en fase de declinacioacuten de la curva de crecimiento

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5 ANAacuteLISIS Y DISCUSIOacuteN DE LOS DATOS

51 Toxinas en moluscos De las toxinas lipofiacutelicas se sabe que AO DTXs y AZAs causan trastornos gastrointestinales en los seres humanos (Gerssen et al 2010) Para las toxinas restantes (YTXs PTXs y SPXs) auacuten cuando no se han reportado casos de intoxicacioacuten en los seres humanos eacutestas son letales o altamente toacutexicas cuando los ratones son inyectados por viacutea intraperitoneal (Paz et al 2008 Richard et al 2000 Miles et al 2004) Es el caso de los SPXs la toxicidad en ratones inyectados por viacutea intraperitoneal supera a la del resto de las toxinas pues su dosis letal 50 es de 40 microg kg-1 (Richard et al 2000) Tal es asiacute que como referencia (Tabla 5) el transvector caracol piquilhue recolectadas en Julio de 2012 y cuyos niveles de toxicidad provocaron la muerte de los ratones solo presentoacute 01 microg kg-1 deteccioacuten que fue realizada durante este estudio en muestras de carne almacenadas durante no maacutes de 1 antildeo a -20 ordmC Sin embargo no se puede descartar una peacuterdida de la actividad por transformacioacuten durante el periodo de conservacioacuten A excepcioacuten de los SPXs el resto de las toxinas mencionadas estaacuten reguladas por la legislacioacuten europea tanto para consumo interno como importacioacuten de moluscos y tunicados para garantizar la salud de las personas Asiacute tambieacuten estaacuten reguladas por la legislacioacuten chilena a traveacutes del Instituto de Salud Puacuteblica (ISP) estableciendo los mismos niveles de referencia europeo en base al bioensayo ratoacuten Aun cuando los niveles de toxinas detectadas en los moluscos durante este estudio estaacuten por debajo de lo exigido por las regulaciones e incluso de los niveles propuestos por el EFSA (Tabla 7) la presencia de dos y tres tipos de toxinas en los moluscos representa una complejidad en la determinacioacuten de los niveles de toxicidad especialmente si se encuentran presentes toxinas altamente toacutexicas para ratones inyectados intraperitonealmente como son los SPXs Aunque se sospechaba la concurrencia de diferentes tipos de toxinas tal hecho no habiacutea sido confirmado anteriormente Sin embargo los SPXs siguen siendo una incoacutegnita pues se desconoce la fuente de estas toxinas A ostenfeldii la especie que podriacutea ser candidata a confirmar estuvo ausente (Tabla 8 modificado de Guzmaacuten et al 2014) durante el periodo en que se detectoacute en los moluscos Los escasos antecedentes toxigeacutenicos de esta especie en Chile la han confirmado como productora de toxinas paralizantes en Ayseacuten (Pizarro et al 2012) pero no de SPXs No obstante la produccioacuten de SPXs por esta especie en la regioacuten de Magallanes auacuten no se puede descartar Las YTXs fueron las toxinas maacutes abundantes en los moluscos analizados condicioacuten que se corresponde con la alta abundancia relativa de esta especie en el ambiente (Tabla 8) en la mayoriacutea de los casos (Tabla 5)

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Los resultados sugieren que los falsos positivos por bioensayo ratoacuten pudieran ser maacutes frecuentes de lo que se piensa actualmente para la regioacuten de Magallanes 52 Toxinas en microalgas Los resultados indican que P reticulatum encontrado en Magallanes producen YTXs al igual que las especies reportadas en la regioacuten de Antofagasta y Ayseacuten (Aacutelvarez et al 2011 Pizarro et al 2012) Tal resultado hace altamente probable que esta especie es la fuente de YTXs detectadas en los moluscos durante el periodo de estudio De acuerdo a las toxinas detectadas en las muestras de D acuminata aisladas asiacute como en el fitoplancton con gran abundancia de esta especie (Tabla 8) sugiere que esta microalga podriacutea ser una fuente primaria de PTXs tal como ocurre en el norte y sur del paiacutes (Blanco et al 2007 Fux et al 2011) Aunque la especie tambieacuten ha sido asociada a la presencia de DTX1 en moluscos en un evento toacutexico ocurrido en 1998 en Magallanes (Uribe et al 2001) el DTX1 no fue detectado en las muestras de D acuminata durante este estudio El no hallazgo de DTX1 en estas muestras pudo deberse a una fuente microalgal distinta como D acuta yo P lima D acuta ha sido asociada a DTX1 en moluscos de la regioacuten de Ayseacuten (Lembeye et al 1993 y Zhao et al 1993) mientras que P lima es productora solo de DTX1 en la regioacuten de Magallanes (Salgado et al 2012) Sin embargo cuando se detectoacute DTX1 en las muestras de moluscos durante este estudio D acuta estuvo ausente en las muestras de agua mientras que D acuminata presentoacute una abundancia relativa alta Por otro lado el volumen de resuspensioacuten de los extractos pudo ser elevado al seguir el mismo procedimiento protocolar que se aplica a las muestras de moluscos de acuerdo a la normativa europea actual Por tal razoacuten el LC-MSMS no logroacute detectar PTXs ni DTX1 en las muestras de microalgas En estos casos un protocolo para el anaacutelisis de las microalgas debiera incluir un volumen menor de resuspensioacuten de los extractos secos en referencia al utilizado para los moluscos o bien seleccionar por micromanipulacioacuten un nuacutemero mayor de microalgas (gt 130 ceacutelulas) Sin embargo esto uacuteltimo es maacutes difiacutecil de lograr en latitudes australes debido a la baja densidad de ceacutelulas en las que se presenta normalmente esta especie en condiciones naturales Por tal motivo se recomienda realizar pruebas con un volumen de resuspensioacuten menor a 1 mL aun cuando se trate de un LC-MSMS triple cuadrupolo

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6 CONCLUSIONES

a Los moluscos de la regioacuten de Magallanes pueden presentar PTX2 YTX 45OHYTX DTX1 y SPX1

b El hecho que los moluscos puedan presentar dos o maacutes tipos de toxinas lipofiacutelicas dificulta establecer el nivel de toxicidad total

c P reticulatum en Magallanes produce YTXs al igual que la especie del norte y sur del paiacutes

d La abundancia relativa ambiental de P reticulatum durante el periodo de estudio coincidioacute con la presencia de YTXs en los moluscos

e Los SPXs encontrados anteriormente en caracoles piquilhue tambieacuten fue posible detectarlos en choritos durante este estudio

f Auacuten queda por confirmar el tipo de SPXs presentes y su eventual fuente primaria La presencia de SPXs en los moluscos no siempre coincidioacute con la presencia de A ostenfeldii en el ambiente y su abundancia relativa maacutexima fue solo de nivel 1 (raro) durante el periodo de estudio

g La PTX2 detectada en los moluscos coincidioacute con una alta abundancia relativa ambiental de D acuminata No obstante auacuten queda por confirmar si esta especie es la fuente primaria Para ello se hace necesario ajustar (disminuir) el volumen de dilucioacuten de los extractos secos de microalgas aisladas por micromanipulacioacuten aun cuando se trata de un espectroacutemetro de masas como un triple cuadrupolo

h La deteccioacuten de DTX1 en los moluscos coincidioacute con la ausencia de D acuta en el ambiente La toxina tampoco fue detectada en los moluscos cuando esta microalga estuvo a niveles de 2 y 3 (escaso y regular) Queda por confirmar la produccioacuten de DTX1 por esta especie en Magallanes

i No se encontraron PTX1 DTX2 ni AZPs en las muestras de moluscos durante el periodo de estudio

j Los resultados demuestran la presencia de toxinas en los moluscos que se hace necesario identificar y cuantificar utilizando teacutecnicas distintas al bioensayo

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southeastern Pacific Ocean reveal a diverse but patchy distribution of phycotoxins Toxicon 58(5) 389ndash397

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F I G U R A

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Figura 1 Estaciones y sectores muestreados (ciacuterculo rojo) y sector Fortuna donde fue recolectado el

caracol piquilhue (ciacuterculo amarillo)

T A B L A S

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Tabla 1 Condiciones cromatograacuteficas para el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas usando

una columna de UPLC C18 en fase reversa y medio baacutesico

Columna Acquity UPLC BEH C18 17 microm 21x100 mm

Temperatura columna 45 ordmC

Flujo 04 mlmin

Volumen inyeccioacuten 5 microl

Temperatura muestras 10 plusmn 5 ordmC

Gradiente

Tiempo (min) Fase A () Fase B ()

0 75 25

066 75 25

330 5 95

528 5 95

726 75 25

900 75 25

Tabla 2 Paraacutemetros de la fuente de ionizacioacuten para el Xevo TQMS (Waters) en la determinacioacuten de toxinas lipofiacutelicas

PARAacuteMETROS DE LA FUENTE

ESI- ESI+

AO DTX2 DTX1 YTX homoYTX 45OH YTX y 45OH

homoYTX

AZA1 AZA2 AZA3 PTX2 PTX1 y SPX1

Voltaje de capilar (V) 100 200

Temperatura de solvatacioacuten (ordmC) 450 450

Flujo gas de solvatacioacuten (lh) 850 850

Flujo gas cono (lh) 50 50

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Tabla 3

Resumen de las condiciones de espectrometriacutea de masas empleadas con el Xevo TQMS (Waters) en el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas

Compuesto tR (min)

ESI

Ioacuten Precursor

(mz)

Ioacuten Producto

(mz)

Dwell time (s)

Energiacutea colisioacuten

(eV)

Voltaje cono (V)

AO 189 NEG 8035 2552 0010 46 86

113 0010 56 86

DTX2 210 NEG 8035 2552 0010 46 86

113 0010 56 86

DTX1 214 NEG 8175 5634 0010 43 86

2552 0010 48 86

YTX 202 NEG 5704 4674 0010 30 45

3963 0010 35 45

45OH-YTX 182 NEG 5784 4674 0010 30 45

3964 0010 30 45

HomoYTX 203 NEG 5775 4744 0010 30 48

4034 0010 30 48

45OH-homoYTX 182 NEG 5855 4034 0010 30 45

4744 0010 30 45

PTX1 306 POS 8925 8395 0015 25 36

8215 0015 25 36

PTX2 362 POS 8765 8415 0015 20 36

8235 0015 25 36

AZA1 263 POS 8425 6545 0015 55 50

3622 0015 50 50

AZA2 270 POS 8565 6725 0015 45 27

6545 0015 45 27

AZA3 236 POS 8285 6404 0015 55 47

3622 0015 55 47

SPX1 368 POS 6925 6744 0015 27 60

1643 0015 42 60 Transicioacuten cuantificadora

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Tabla 4 TRR y valores de tolerancia para las toxinas analizadas

TOXINA TRR TOLERANCIA

Toxinas del grupo de AO

AO 1000 0990-1010

DTX2 1040 1014-1066

DTX1 1140 1111-1168

Toxinas del grupo de PTX

PTX2 1000 0990-1010

PTX1 0850 0829-0871

Toxinas del grupo de YTX

YTX 1000 0990-1010

45OH-YTX 0894 0871-0916

Homo YTX 1000 0990-1010

45OH-homoYTX 0899 0876-0921

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Tabla 5 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de moluscos

Nordm estMes

recolectaLocalidad Molusco

cuerpo

enterohepat

gramos

carne

toxicidad

VDM ratoacuten

PTX2

(ugKg)

YTX

(ugKg)

45OHYTX

(ugKg)

DTX1

libre

(ugKg)

DTX1

total

(ugkg)

SPX 1

(ugKg)

M13 ene-13 E Peel chorito x 5086 + 01 02

M13 ene-13 E Peel ostioacuten x 5155 No real izado 16 21

M33 ene-13 B Bell chorito x 5253 + 04

M37 ene-13 B Agua Fresca chorito x 5039 + 05 01

M35 ene-13 C San Isidro chorito x 5289 + 000 01

M42 ene-13 V Holanda chorito x 5231 + 06 13

M43 ene-13 B Yendegaia chorito x 5193 + 04 25

M45 ene-13 Pto Williams chorito x 5161 - 28 07

M08 feb-13 E Falcon cholga x 5027 - 14

M09 feb-13 E Penguumlin cholga x 5103 + 14

M22 feb-13 E de las Montantildeas cholga x 5052 - 26

M23 feb-13 I Ballesteros cholga x 5204 - 87

M24 feb-13 B Fanny chorito x 2016 - 38 1071 479 12

M25 feb-13 E Silva Palma chorito x 1447 - 59 1077 898 09

M26 feb-13 E Wickham chorito x 1093 - 194 2940 2232 66 66

M27 feb-13 E Sullivan chorito x 1137 - 450 1944 1478

M28 feb-13 E Nuntildeez chorito x 1179 + 33 721 407

M29 feb-13 Cutter Cove chorito x 1003 - 65 501 309

M29N1 feb-13 I Engelfield chorito x 1116 - 297 2007 1483

M31 feb-13 B Nash chorito x 2231 +

M33 feb-13 B Bell chorito x 1181 - 93

M34 feb-13 S Pedro chorito x 0726 -

M35 feb-13 C San Isidro chorito x 1178 + 110

M36 feb-13 B Buena chorito x 1367 +

M37 feb-13 B Agua Fresca chorito x 0850 + 45 100 80

M39 feb-13 Pto Zenteno chorito x 3241 + 28

M39N2 feb-13 Pta San Valentin chorito x 1712 - 11

M39N3 feb-13 Pto Yartou chorito x 2035 - 11

sector

Fortunajul-12 B Inuacutetil

caracol

piquilhuex 107000 + 01

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo TABLAS

Tabla 6 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de microalgas

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo TABLAS

Tabla 7 Niveles actualmente permitidos por la legislacioacuten europea (bioensayo) y los niveles propuestos por la

autoridad europea para la seguridad alimentaria (EFSA) (Gerssen et al 2010)

Toxin Legislacioacuten (μg kg-

1) Proposicioacuten

EFSA (μg kg-1)

Validacioacuten LC-MSMS

(μg kg-1)

OA and DTXs 160 45

PTXs 120

YTXs 1000 3750

AZAs 160 32

SPXs 400 (Gerssen et al2010)

European Food Safety Authority Decisioacuten 2002657 de la Unioacuten Europea EC Incluye PTXs

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo TABLAS

Tabla 8 Abundancia relativa ambiental de las microalgas al momento de recolectar las muestras de moluscos En rojo se indica la deteccioacuten de toxina positiva en los moluscos asociada a la supuesta microalga fuente PTXs (D

acuminata) YTXs (P reticulatum) SPXs (A ostenfeldii) DTX1 (A acuta)

(Tabla modificada de Guzmaacuten et al 2014)

A N E X O S

ANEXO 1

Certificacioacuten laboratorio INTECMAR

ANEXO 2

Lista de anaacutelisis que realiza INTECMAR y sus costos (en euros) 2013

scv 1 de 7

GUIA PARA LA AUTOLIQUIDACIOacuteN DE TASAS A FAVOR DE LA COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA 2013 Los aspectos financieros de los servicios prestados por Intecmar en el marco de su actividad e vienen regulados en la Ley 62003 de 9 de diciembre de tasas precios y exenciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia (DOG nuacutem 240 de 11122003) y fueron actualizados posteriormente en la Ley 142010 de 27 de diciembre de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2011 (DOG nuacutem 250 de 30122010) y en la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013 (DOG nuacutem 42 de 28022013) Existen dos maneras de liquidar las tasas correspondientes a los servicios prestados por Intecmar

1 De forma manual cubriendo el modelo A de autoliquidacioacuten que se descarga en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda y que adjunto en pdf y se lleva al banco para su pago httpwwwconselleriadefacendaeswebportalconfeccion-impresos

2 De forma telemaacutetica en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda viacutenculo httpshostcixtecesXEITObinlionwebXeitodllxmit a traveacutes del modelo 730

Ambos modelos de liquidacioacuten de tasas adjuntamos ejemplo al final de este documento deben ser remitidos por mail a Intecmar con el sello del banco fiacutesico o virtual como paso previo a la emisioacuten del certificado Los coacutedigos generales necesarios son

minus Consejeriacutea de Medio Rural y de Mar Coacutedigo 09 minus Delegacioacuten de Pontevedra Coacutedigo 40 minus Servicio de Intecmar Coacutedigo 24

Los coacutedigos y descripcioacuten de las tasas son los regulados en la legislacioacuten vigente y los hemos resumido en los anexos siguientes Vilaxoaacuten 4 de marzo de 2013

scv 2 de 7

TARIFAS DE TASAS VIGENTES PARA 2013 - Ley 22013 d e 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013

(DOG nuacutem 42 de 28022013)

Estas tarifas son consecuencia de la actualizacioacuten de las tarifas contenidas en los anexos 1 2 3 4 y 5 de la Ley 62003 del 9 de diciembre de tasas precios y exacciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia por la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 Seraacuten aplicables desde el diacutea de la entrada en vigor de la Ley de

presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 TASA POR SERVICIOS ADMINISTRATIVOS

No sujecioacuten No se exigiraacute la tasa por servicios administrativos cuando se trate de compulsas o cotejos de documentos que deban acompantildear a solicitudes escritos o comunicaciones presentadas por el ciudadano y realizadas en el aacutembito de actuacioacuten de los registros seguacuten lo dispuesto en el artiacuteculo 385 de la Ley 301992 del 26 de noviembre de reacutegimen juriacutedico de las administraciones puacuteblicas y del procedimiento administrativo comuacuten

Excepciones Estaraacuten exentos de la presente tasa

1- La expedicioacuten de certificados de retribuciones satisfechas por la Xunta de Galicia con el objeto de justificacioacuten en relacioacuten con el impuesto sobre la renta de las personas fiacutesicas

2- La expedicioacuten de certificados y compulsa que el personal de la Administracioacuten solicite respecto a las necesidades propias del puesto de trabajo o relacioacuten de servicios

3- Los alumnos por cualquier actuacioacuten en materia de ensentildeanzas no universitarias

scv 3 de 7

4- Las compulsas realizadas en las oficinas de empleo para los desempleados en la tramitacioacuten de expedientes que sean competencia de dichas oficinas

5 La inscripcioacuten en las convocatorias para a seleccioacuten de personal de la comunidad autoacutenoma despueacutes de justificacioacuten documental solicitada por

- Personas con discapacidad igual o superior al 33 - Personas que sean miembros de familias numerosas clasificadas en la

categoriacutea especial Se aplicaraacute una bonificacioacuten del 50 a la inscripcioacuten solicitada por - Personas que sean miembros de familias numerosas de categoriacutea

general - Personas que figurasen como demandantes de empleo desde por lo

menos seis meses antes a la fecha de la convocatoria de pruebas selectivas de personal en las que soliciten su participacioacuten y no esteacuten percibiendo prestacioacuten o subsidio por desempleo

6- La expedicioacuten de certificados relativos a la situacioacuten fiscal 7- El Estado y los demaacutes entes puacuteblicos territoriales o institucionales

siempre que los servicios o actividades de que sean beneficiarios se presten o se realicen en el marco del principio de colaboracioacuten entre administraciones

8- Las viacutectimas de actos terroristas asiacute como sus coacutenyuges y sus hijos por cualquier actuacioacuten en materia educativa realizada en centros oficiales de estudios en todos los niveles de ensentildeanza

9- Los miembros de los organismos consultivos de la Administracioacuten puacuteblica gallega respecto de los certificados emitidos por dichos organismos

COacuteDIGO TASAS

DESCRIPCIOacuteN IMPORTE euro

314400 Prestacioacuten de servicios en el Instituto Tecnoloacutegico para el Control del Medio Marino de Galicia

314401 Anaacutelisis de biotoxinas marinas en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de Yasumoto 1978 4752

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en rato segundo o meacutetodo de Yasumoto 1984 5432

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS)

9520 -Anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten

seguacuten el meacutetodo de la AOAC 4752

scv 4 de 7

-Anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo da AOAC 4752

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1978 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10186

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1984 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10865

-Anaacutelisis combinada en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS) anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo AOAC y anaacutelisis de toxicidad de tipo ASP por cromatografiacutea liquida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo de la AOAC 15000

314402 Anaacutelisis de muestras en agua de mar -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton marino mediante

microscopiacutea oacuteptica 15133 -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton toacutexico marino

mediante microscopiacutea oacuteptica 13333 - Anaacutelisis de carbono orgaacutenico disuelto 5093 -Anaacutelisis de nutrientes inorgaacutenicos disueltos 3500 -Anaacutelisis de pigmentos fotosinteacuteticos (clorofila ldquoardquo) por

espectrofluorimetria 1698 314403 Anaacutelisis microbioloacutegicos en moluscos y otros organismos

procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Cuantificacioacuten de E Coli 10186 - Deteccioacuten de Salmonella spp 16975 -Enumeracioacuten de Escherichia coli en moluscos bivalvos

vivos por la teacutecnica de medida directa de impedancia con el sistema BacTrac 4300 6800

314404 Anaacutelisis de contaminantes de origen quiacutemica en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Determinacioacuten de metales pesados (Pb Cd Cu Zn As Hg Ni Cr Ag) mediante espectrofotometriacutea de absorcioacuten atoacutemica por metal

6790

-Determinacioacuten de compuestos bifenilos policlorados (PCB) mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

scv 5 de 7

-Determinacioacuten de pesticidas organoclorados mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

-Determinacioacuten de hidrocarburos aromaacuteticos policiacuteclicos (HAPs) mediante cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de fluorescencia

28200

314405 Anaacutelisis histopatoloacutegica de moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Estudio hispatoloacutegico Determinacioacuten de Bonamia Marteillia Perkinsus y otras alteraciones patoloacutegicas

101852

314406 Emisioacuten de certificaciones e informes teacutecnicos y otras actuaciones a peticioacuten del interesado

Emisioacuten de certificados a peticioacuten de los interesados sobre las actuaciones llevadas a cabo por el Instituto

1000

Emisioacuten de informes teacutecnicos a peticioacuten del interesado (euros por hora o fraccioacuten)

4000

scv 6 de 7

scv 7 de 7

ANEXO 3

Resultados de anaacutelisis en muestras de microalgas anteriormente enviadas procedentes de Magallanes por el equipo de espectrometriacutea de masas utilizado por INTECMAR Trabajo presentado a las XXXII

Congreso de Ciencias del Mar realizado en Punta Arenas 22-25 octubre de 2012

PERFIL DE TOXINAS DE PROROCENTRUM LIMA (DINOPHYCEAE) AISLADO DESDE LA COSTA DE MAGALLANES SUR DE CHILE P Salgado1 G Pizarro1 JM Franco2 P Rioboacute2 e I Bravo3

1Instituto de Fomento Pesquero (IFOP) Punta Arenas Chile gemitapizarroifopcl 2Instituto de Investigaciones Marinas (CSIC) Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea 3Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea

Prorocentrum lima (Ehrenberg) es un dinoflagelado marino bentoacutenico que se encuentra adherido generalmente

sobre macroalgas sedimentos y detrito flotante y menos comuacutenmente en el plancton (Bravo et al 2001) Es una especie neriacutetica y estuarina y su rango de distribucioacuten geograacutefica variacutea desde aguas costeras tropicales a templadas (Faust 1991) La importancia de P lima se debe a que son productoras de toxinas diarreogeacutenicas en las personas (veneno diarreico de los mariscos VDM) al igual que algunas especies de Dinophysis aunque raramente se le han asociado con episodios toacutexicos por VDM por su caraacutecter epiacutefito y bentoacutenico El complejo VDM producido por P lima incluye moleacuteculas conocidas como el aacutecido okadaico (AO) y derivados dinofisistoxinas (DTX-1 DTX-2) (Bravo et al 2001 Vale et al 2009) No obstante existen casos citados para USA donde se detectoacute toxicidad por VDM en bivalvos de cultivos asociadas a P lima aunque en bajos niveles (Maranda et al 2007a) En Canadaacute tambieacuten se llevoacute a cabo un estudio en moluscos de cultivo cuya finalidad fue determinar el origen del VDM en la que P lima fue la principal especie sospechosa tras la ocurrencia de un evento toacutexico humano por VDM ocurrido en 1998 (Levasseur et al 2003) y en antildeos anteriores (Quilliam et al 1993) Aunque Levasseur et al (2003) no logroacute probar la toxicidad de los mariscos en cultivo a causa de P lima cabe hacer notar que lo que buscaron fue OA y DTX1 no DTX 3 este uacuteltimo principal derivado de las anteriores tras su transformacioacuten en los moluscos (eg Suzuki et al 1999 Vale amp Sampayo 2002)

En consecuencia el rol de P lima en eventos toacutexicos por VDM auacuten no puede descartarse por cuanto podriacutean llegar a ser importantes en ambientes turbulentos debido a la eventual remocioacuten de microalgas adheridas en sustratos por efecto de vientos (Levasseur et al 2003) factor de importancia si se trata de sedimentos o contrariamente en zonas someras y estables de cultivos de moluscos que al mismo tiempo favorecen microambientes para sustratos en los que prolifera la epiacutefita P lima (Lawrence et al 2000) quedando expuestas a re-suspensiones temporales que favorecen la filtracioacuten de estas microalgas por los bivalvos en cultivo (Maranda et al 2007a)

Chile posee escaso conocimiento sobre esta especie en su medio natural incluido su perfil de toxinas y potencial rol en la toxificacioacuten de moluscos por VDM Por tal razoacuten resultoacute interesante aportar al conocimiento de estos aspectos en muestras de sedimentos recolectadas en el estrecho de Magallanes en las que esta especie se encontroacute inhabitualmente abundante

Las ceacutelulas utilizadas en este estudio fueron aisladas desde sedimentos superficiales (0-3 cm) recolectados en el invierno de 2010 en la localidad de cabo San Isidro durante el muestreo regular del programa de monitoreo de marea roja en la regioacuten de Magallanes En esa oportunidad se logroacute cuantificar hasta 1002 quistes tecadoscm3 de Prorocentrum lima la mayor concentracioacuten respecto a otros sitios de recolecta (Fig 1) Los sedimentos de esta localidad presentaron una coloracioacuten oscura y un fuerte olor a sulfuro de hidroacutegeno (H2S) producto de anoxia local

Se aislaron entre 27 y 87 quistes tecados (Fig 1 a) directamente desde los sedimentos mientras otras 60 ceacutelulas vegetativas (Fig 1 b) fueron aisladas luego de promover la actividad y divisioacuten de los quistes en condiciones de 15 ordmC y un ciclo de luzoscuridad de 1212 horas (Tabla 1) Para este fin se aislaron quistes tecados y trasvasijaron a placas Petri de 5 cm de diaacutemetro conteniendo 5 mL de medio de cultivo L1 Para el anaacutelisis de toxinas las ceacutelulas aisladas fueron trasvasijadas a un tubo Eppendorf de 15 mL y congelados a -80 ordmC Una aliacutecuota de sedimento huacutemedo (100 microL aproximados) tambieacuten fue vaciada en un tubo Eppendorf y congelado Para extraer la toxina se antildeadioacute 500 microL de metanol 100 a cada tubo se mezcloacute por 1 min y filtroacute por 045 microm trasvasijando a un vial El extracto fue secado bajo nitroacutegeno gas a 40 ordmC y conservado a 4 ordmC hasta su anaacutelisis Previo al anaacutelisis de toxinas los extractos fueron resuspendidos en 150 microl de metanol

La presencia de la toxina dinofisistoxina 1 (DTX-1) en las muestras (Fig2) fue confirmada en modo negativo a traveacutes de su ioacuten precursor [M-H]- mz 8175 y sus iones productos mz 5634 y 2552 mediante un cromatoacutegrafo UPLC Acquity Waters acoplado a un triple cuadrupolo Waters Xevo TQ (LC-MS) La columna utilizada fue una Acquity UPLC BEH C18 17microm 21 x 100 mm a 45 ordmC La fase moacutevil consistioacute en (A) hidroacutexido amoacutenico a pH 11 y (B) hidroacutexido amoacutenico en acetonitrilo (67 mM) con una tasa de flujo de 4 mLmin El gradiente de elucioacuten utilizado fue el siguiente mantencioacuten al 75 de A entre 0 y 066 min cambio a 5 de A entre 066 y 330 min mantener 5

de A entre 330 y 528 min recuperacioacuten del 75 de A entre 528 y 726 min mantencioacuten al 75 de A hasta 9 min Se pinchoacute 5microL de muestra en el LC-MS El contenido de DTX-1 en las muestras fue cuantificado en base al ion precursor

Los tres tipos de muestras fueron positivas a la presencia de DTX-1 pero las ceacutelulas vegetativas fueron las que presentaron un mayor contenido de DTX-1 por ceacutelula La deteccioacuten de DTX-1 en los sedimentos (Tabla 2) reflejoacute la presencia de los quistes tecados en eacutestos

Figura 1 Concentraciones de quistes tecados de Prorocentrum lima (quistescm3 de sedimento huacutemedo) en estaciones de muestreo en el Estrecho de Magallanes (M26 Estero Wickham M29N1 Isla Engenfield M31 Bahiacutea Nash M35 Cabo San Isidro M39C1 Bahiacutea Gente Grande M39C2 Bahiacutea Inuacutetil M39C3 Canal Gabriel) y Canal Beagle (M41 Ventisquero Espantildea M42 Ventisquero Holanda) (a) Quistes tecados (b) ceacutelulas vegetativas obtenidas de germinacioacuten de quistes tecados bajo condiciones de laboratorio Barra de escala 20 microm

Tabla 1 Sedimento y ceacutelulas de Prorocentrum lima aisladas para anaacutelisis de toxinas

Extracto metanoacutelico Nordm de ceacutelulas TR ngmL pg DTX-1 ceacutel

G1 quistes tecados 27 213 lt2 -

G2 quistes tecados 67 214 05 11

G3 quistes tecados 87 215 12 21

G4 ceacutelulas vegetativas 60 215 34 87

G6 sedimentos aliacutecuota 213 13 19 pg microL sed

TR tiempo de retencioacuten

Figura 2 Cromatogramas de extractos metanoacutelicos de Prorocentrum lima quistes tecados (a) ceacutelulas vegetativas (b) y sedimentos (c)

Tabla 2 Caracteriacutesticas del sedimento con quistes tecados de Prorocentrum lima

Tipo Tamantildeo (mm)

Grava 2 35

Arena media 025 - 05 32

Arena muy fina 0063 - 0125 2

Limo-arcilla lt 0063 1

Estos resultados constituyen otra eventual posibilidad de toxicidad en los moluscos por VDM no soacutelo de aquellos con modalidad de vida bentoacutenica superficial sino de aquellos que tambieacuten viven enterrados en la arena (eg almeja huepo) Maacutes auacuten si se conoce que P lima posee la capacidad de desarrollar poblaciones naturales en aguas templadas en nuacutemeros que podriacutean justificar una toxicidad por VDM en los mariscos (eg Maranda et al 2007a b)

Referencias

Bravo I ML Fernaacutendez I Ramilo amp A Martinez 2001 Toxin composition of the toxic dinofagellate Prorocentrum lima isolated from different locations along the Galician coast (NW Spain) Toxicon 39 1537ndash1545

Faust MA 1991 Morphology of ciguatera-causing Prorocentrum lima (Pyrrophyta) from widely differing sites J Phycol 27 642-648

Lawrence J E Grant J Quilliam M A Bauder A G amp Cembella A D 2000 Colonizaition and growth of the toxic dinoflagellate Prorocentrum lima and associated fouling macroalgae on mussels in suspended culture Mar Ecol Prog Ser 201 147-154

Levasseur M Couture J Y Weise A M Michaud S Elbrachter M Sauveacute G amp Bonneau E 2003 Pelagic and epiphytic summer distributions of Prorocentrum lima and P mexicanum at two mussel farms in the Gulf of St Lawrence Aquat Microbiol Ecol 30283-293

Maranda L Corwin S Dover S amp Morton S L 2007a Prorocentrum lima (Dinophyceae) in northeastern USA coastal waters II Toxin load in the epibiota and in shellfish Harmful Algae 6 632-641

Maranda L Corwin S Hargraves P E 2007b Prorocentrum lima (Dinophyceae) in 19 northeastern USA coastal waters I Abundance and distribution Harmful Algae 6 623ndash631

Quilliam MA Gilgan MW amp Pleasance S 1993 Confirmation of an incident of diarrhetic shellfish poisoning in eastern Canada In Smayda TJ Shimizu Y (Eds) Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea Elsevier New York pp 547ndash552

Suzuki T Ota H amp Yamasaki M 1999 Direct evidence of transformation of dinophysistoxin-1 to 7-O-acyl-dinophysistoxin-1 (Dinophysis-3) in the scallop Patinopecten yessoensis Toxicon 37 187-198

Vale P amp Sampayo M A 2002 First confirmation of human diarrhoeic poisonings by okadaic acid esters after ingestion of razor clams (Solen marginatus) and green crabs (Carcinus maenas) in Aveiro lagoon Portugal and detection of okadaic acid esters in phytoplankton Toxicon 40989-996

Vale P Veloso V amp Amorim A 2009 Toxin composition of a Prorocentrum lima strain isolated from the Portuguese coast Toxicon 54145ndash152

Agradecimientos Intecmar de la Xunta de Galicia Espantildea donde se realizaron los anaacutelisis de toxinas proyecto

SUBPESCA ldquoManejo y Monitoreo de Mareas Rojas en las regiones de Los Lagos Ayseacuten y Magallanes IV etapa 2010rdquo

ANEXO 4

Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten

ANEXO 5

Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de Magallanes

TASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

O

EJE

MP

LA

R P

AR

A E

L IN

TE

RE

SA

DO

LIQ

UID

AC

IOacuteN

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

EN

TID

AD

BA

NC

AR

IATASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

0 9

4 0

2 4INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

AD

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IST

RA

CIOacute

NTASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

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BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

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NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

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AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

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2 4

3 1 4 4 0 1

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

9520 euros

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ANEXO 6

Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para cierre

de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

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Fono 56-32-2151500 Valparaiacuteso Chile

wwwifopcl

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SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo

iii

IacuteNDICE GENERAL

Paacutegina

RESUMEN EJECUTIVO -------------------------------------------------------------------------------------------- i IacuteNDICE GENERAL --------------------------------------------------------------------------------------------------- iii IacuteNDICE DE FIGURA -------------------------------------------------------------------------------------------------- iv IacuteNDICE DE TABLAS ------------------------------------------------------------------------------------------------- iv IacuteNDICE DE ANEXOS ------------------------------------------------------------------------------------------------ v

1 ANTECEDENTES -------------------------------------------------------------------------------------------- 1

2 OBJETIVOS --------------------------------------------------------------------------------------------------- 2 21 Objetivo general ----------------------------------------------------------------------------------------- 3 22 Objetivo especiacutefico ------------------------------------------------------------------------------------- 3

3 METODOLOGIacuteA --------------------------------------------------------------------------------------------- 3 31 Obtencioacuten del extracto --------------------------------------------------------------------------------- 3 32 Laboratorio de anaacutelisis dotado con LC-MSMShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 3 33 Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por LC-MSMShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 4 34 Extraccioacuten de toxinashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 6

4 RESULTADOS ------------------------------------------------------------------------------------------------ 9 41 Toxinas en moluscoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 9 42 Toxinas en microalgashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 9

5 ANAacuteLISIS Y DISCUSIOacuteN DE LOS RESULTADOS helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 11 51 Toxinas en moluscoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 11 52 Toxinas en microalgashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 12

6 CONCLUSIONES --------------------------------------------------------------------------------------------- 13

7 REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS -------------------------------------------------------------------- 14

FIGURA

TABLAS

ANEXOS Anexo 1 Certificacioacuten laboratorio INTECMAR Anexo 2 Lista de anaacutelisis que realiza INTECMAR y sus costos (en euros) 2013 Anexo 3 Resultados de anaacutelisis en muestras de microalgas anteriormente enviadas procedentes de

Magallanes por el equipo de espectrometriacutea de masas utilizado por INTECMAR Trabajo presentado a las XXXII Congreso de Ciencias del Mar realizado en Punta Arenas 22-25 octubre de 2012

Anexo 4 Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten Anexo 5 Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de Magallanes Anexo 6 Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para

cierre de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

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iv

IacuteNDICE DE FIGURA

Figura 1 Estaciones y sectores muestreados (ciacuterculo rojo) y sector Fortuna donde fue recolectado el caracol piquilhue (ciacuterculo amarillo)

IacuteNDICE TABLAS

Tabla 1 Condiciones cromatograacuteficas para el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas usando una columna

de UPLC C18 en fase reversa y medio baacutesico Tabla 2 Paraacutemetros de la fuente de ionizacioacuten para el Xevo TQMS (Waters) en la determinacioacuten

de toxinas lipofiacutelicas Tabla 3 Resumen de las condiciones de espectrometriacutea de masas empleadas con el Xevo

TQMS (Waters) en el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas Tabla 4 TRR y valores de tolerancia para las toxinas analizadas Tabla 5 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de moluscos Tabla 6 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de microalgas Tabla 7 Niveles actualmente permitidos por la legislacioacuten europea (bioensayo) y los niveles

propuestos por la autoridad europea para la seguridad alimentaria (EFSA) (Gerssen et al 2010) European Food Safety Authority

Tabla 8 Abundancia relativa ambiental de las microalgas al momento de recolectar las muestras

de moluscos En rojo se indica la deteccioacuten de toxina positiva en los moluscos PTXs (D acuminata) YTXs (P reticulatum) SPXs (A ostenfeldii) DTX1 (A acuta) (Tabla modificada de Guzmaacuten et al 2014)

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v

IacuteNDICE ANEXOS

Anexo 1 Certificacioacuten laboratorio INTECMAR Anexo 2 Lista de anaacutelisis que realiza INTECMAR y sus costos (en euros) 2013 Anexo 3 Resultados de anaacutelisis en muestras de microalgas anteriormente enviadas

procedentes de Magallanes por el equipo de espectrometriacutea de masas utilizado por INTECMAR Trabajo presentado a las XXXII Congreso de Ciencias del Mar realizado en Punta Arenas 22-25 octubre de 2012

Anexo 4 Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten Anexo 5 Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de

Magallanes Anexo 6 Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para

cierre de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

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1

1 ANTECEDENTES En Chile auacuten existen escasos antecedentes acerca de las toxinas lipofiacutelicas presentes en nuestros moluscos asiacute como la fuente microalgal asociada a su produccioacuten y la variabilidad espacio-temporal de las mismas Tal situacioacuten es tambieacuten un problema en el sur austral de Chile y particularmente en Magallanes donde el historial de este tipo de toxinas ha sido opacado por la fuerte incidencia de toxina paralizante asociada a la presencia de Alexandrium catenella No obstante en los dos uacuteltimos antildeos los niveles de toxicidad por toxinas lipofiacutelicas en la regioacuten se han constituido en un problema para la autoridad de Salud pues han determinado el cierre de grandes extensiones de aacutereas a la extraccioacuten de moluscos hecho no acontecido anteriormente salvo muy local y esporaacutedicamente (eg Uribe et al 2001) ademaacutes del efecto econoacutemico y social

Dentro de las toxinas lipofiacutelicas las maacutes conocidas y frecuentes a nivel mundial por sus efectos diarreicos (veneno diarreico de los mariscos VDM) en humanos son el aacutecido okadaico y sus derivados las dinofisistoxinas (AO y DTXs) (eg Yasumoto et al 1978) tambieacuten conocidas como okadaatos Por lo mismo poseen un mayor historial de citas en la literatura cientiacutefica Los okadaatos son fuertes inhibidores de las proteiacutenas fosfatasas 1 y 2A y potenciales promotores de tumores (Yasumoto et al 1989 Fujiki et al 1989) con efectos croacutenicos desconocidos por lo que su efecto es maacutes lento Por esta razoacuten representan un riesgo para la salud puacuteblica y dan lugar a prolongadas vedas de extraccioacuten de bivalvos tanto de bancos naturales como centros de cultivo con las consiguientes peacuterdidas econoacutemicas para el sector pesquero y acuicultor en otras partes del mundo

Actualmente en Chile las toxinas lipofiacutelicas son detectadas por el bioensayo del ratoacuten una metodologiacutea semicuantitativa e inespeciacutefica Por lo mismo suelen ocurrir falsos positivos debido a la interferencia de otras toxinas lipofiacutelicas diferentes al VDM inocuas o no para el hombre pero que pueden estar presentes en las muestras inyectadas pues son co-extraiacutedas con los okadaatos

Gracias al uso de tecnologiacuteas de alta sensibilidad uacuteltimamente ha sido posible detectar junto a los okadaatos otras toxinas lipofiacutelicas de diverso efecto toacutexico tales como las yesotoxinas pectenotoxinas azaspiraacutecidos espiroacutelidos y gimnodimina (Zhao et al 1993 Yasumoto amp Takizawa 1997 Uribe et al 2001 Garciacutea et al 2005 Blanco et al 2007 Krock et al 2009 Aacutelvarez et al 2010 2011 Loacutepez et al 2010 Pizarro et al 2011 Fux et al 2011 Trefault et al 2011)

En Magallanes ha sido reportada la presencia de okadaatos (AO y DTXs) asociadas a la presencia de Dinophysis acuminata (Uribe et al 2001) Tambieacuten se ha reportado la presencia de yesotoxinas (YTXs) en moluscos Esta uacuteltima se sospecha estar asociada a la presencia de la especie Protoceratium reticulatum comprobada fuente primaria en Ayseacuten (Pizarro et al 2012) norte de Chile (Aacutelvarez et al 2011) y ampliamente conocida como tal a nivel mundial

Durante el periodo estival de 2013 en la regioacuten de Magallanes ocurrioacute una floracioacuten de dinoflagelados entre los que destacaron Dinophysis acuminata y Protoceratium reticulatum Tal floracioacuten se mantuvo intensa entre diciembre 2012 y febrero 2013 lo que permitioacute recolectar muestras de transvectores y microalgas para establecer yo confirmar los perfiles de toxinas lipofiacutelicas respectivas mediante LC-MSMS particularmente en una regioacuten con muy poca informacioacuten al respecto

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2

2 OBJETIVOS 21 General del proyecto

Establecer mediante LC-MSMS los perfiles de toxinas lipofiacutelicas en muestras de moluscos y de plancton recolectadas durante la floracioacuten de dinoflagelados ocurrida durante el verano 2013 en la regioacuten de Magallanes

22 Objetivo especiacutefico

Establecer los perfiles de toxinas lipofiacutelicas en transvectores centinelas fitoplancton y microalgas aisladas por micromanipulacioacuten recolectados en diferentes sectores de Magallanes durante el monitoreo regular realizados durante una floracioacuten de Dinophysis spp y Protoceratium reticulatum

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3

3 METODOLOGIacuteA En esta seccioacuten se describen las metodologiacuteas asociadas a las actividades realizadas para el logro de los objetivos asiacute como tambieacuten los conceptos e ideas que la fundamentan

31 Obtencioacuten del extracto - Carne de mariscos Dependiendo de la cantidad de material se procesoacute soacutelo el hepatopaacutencreas

o carne total Se maceroacute y pesoacute el material Se realizoacute extraccioacuten con metanol en una de 11 pv Los extractos fueron centrifugados y el sobrenadante filtrado por filtros de nylon de 045 microm y vaciado a un vial

- Extracto en metanol de muestras de fitoplancton (ie el ensamble total de microalgas sin separar

especies) Aliacutecuotas de agua previamente filtradas por malla de 250 microm para eliminar el zooplancton de tamantildeo mayor fueron filtradas en filtros de fibra de vidrio muflados de 13 mm de diaacutemetro (tamantildeo de poro nominal de 07 microm) Los filtros fueron puestos por separado seguacuten sitio de recolecta y fecha en ependorfs de 15 ml y congelados hasta ser extraiacutedos con 1 mL de metanol centrifugados El sobrenadante fue filtrado por filtros de nylon de 045 microm y vaciado a un vial

- Extracto en metanol de D acuminata y P reticulatum La microalgas aisladas por

micromanipulacioacuten bajo un microscopio invertido (siempre y cuando el nuacutemero de D acuminata y de P reticulatum fuera suficiente como para lograr reunir un nuacutemero cercano a las 30 ceacutelulas por cada especie) fueron puestas en un ependorf de 15 ml con 1 ml de metanol Para obtener el extracto de toxina las muestras fueron mezcladas en vortex y filtradas por filtros de nylon de 045 microm El extracto filtrado fue puesto en un vial Solo en una ocasioacuten fue posible acumular un nuacutemero suficiente de ceacutelulas de D acuta por ello fue posible obtener solo una muestra para esta especie

- Todos los extractos fueron secados con nitroacutegeno gas a 38ordmC Este proceso evita los problemas

de traslado de extractos en solventes orgaacutenicos y yo evitar eventuales peacuterdidas de liacutequidos en las muestras durante el trayecto

32 Laboratorio de anaacutelisis dotado de LC-MSMS La metodologiacutea para el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas se realizoacute mediante espectrometriacutea de masas acoplada a un cromatoacutegrafo liacutequido (LC-MSMS) Por tratarse de una teacutecnica auacuten no implementada en Chile en aspectos de determinacioacuten de toxinas marinas a nivel comercial y certificada ni tampoco para realizar investigacioacuten baacutesica de rutina fue necesario enviar las muestras a un laboratorio extranjero certificado Tal laboratorio pertenece al Instituto Tecnoloacutegico del Mar (INTECMAR) Galicia Espantildea

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4

El contacto se realizoacute a traveacutes de grupos de investigacioacuten extranjeros de vasta y reconocida experiencia en el tema para prospectar la factibilidad de donde realizar los anaacutelisis Los mismos aconsejaron al laboratorio perteneciente a INTECMAR INTECMAR es una entidad de investigacioacuten estatal encargada de realizar los monitoreos semanales en Galicia donde tambieacuten se encuentra fiacutesicamente su sede Actualmente estaacute certificada para la deteccioacuten de toxinas lipofiacutelicas en moluscos entre otros anaacutelisis que realiza (Anexo 1 y 2) El Anexo 2 contiene el costo del anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas (equivalente a cotizacioacuten) El laboratorio seleccionado posee un cromatoacutegrafo UPLC Acquity Waters acoplado a un triple cuadrupolo Waters Xevo TQ con la suficiente sensibilidad en la deteccioacuten de toxinas en microalgas aisladas por micromanipulacioacuten sensibilidad que fuera confirmada anteriormente al establecer cuantitativamente el perfil de toxinas lipofiacutelicas en muestras de microalgas aisladas desde muestras de sedimentos de Magallanes (ver Anexo 3) Previo al enviacuteo de extractos de moluscos y contrato de ensayo de anaacutelisis exigido por INTECMAR se realizoacute la consulta acerca de nuestro intereacutes tambieacuten por analizar toxinas en microalgas aun cuando no estuviesen certificados en esta matriz en particular La solicitud de anaacutelisis fue aceptada por parte de INTECMAR Una vez aceptado el contrato de ensayo por parte de INTECMAR (Anexo 4) se procedioacute entonces a enviar las muestras de 29 extractos de microalgas y 29 extractos de moluscos mientras INTECMAR facturoacute por costos de anaacutelisis solicitados por IFOP en el contrato de ensayo (Anexo 5) Si bien el nuacutemero de extractos obtenidos fue cercano a las 140 muestras el nuacutemero de muestras enviadas se ajustoacute al presupuesto otorgado para este proyecto al mismo tiempo que la informacioacuten obtenida fuera suficiente como para tener una visioacuten regional de los perfiles de toxinas que estuvieron presentes durante la floracioacuten estival de 2013 33 Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por LC-MSMS

Las toxinas lipofiacutelicas a determinar en las muestras fueron aacutecido okadaico (AO) dinofisistoxina-2 (DTX2) dinofisistoxina-1 (DTX1) pectenotoxinas (PTX1 PTX2) azaspiraacutecidos (AZA1 AZA2 AZA3) yesotoxinas (YTX homoYTX 45OHYTX 45OHhomoYTX) y espiroacutelidos (SPX1) El anaacutelisis se realizoacute con los siguientes elementos

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5

Equipos

Sistema cromatograacutefico Acquity Ultra Performance (Coacutedigo B191C)

Espectroacutemetro de masas equipado con interfase ESI y taacutendem MSMS Xevo TQMS (Coacutedigo B192C)

Software del programa TargetLynx (Coacutedigo 196)

Columna cromatograacutefica de fase reversa C18 17 microm 21 x 100 mm Acquity UPLC BEH

Reactivos y disolventes

Metanol grado HPLC gradiente

H2O Milli-Q Ellix

Acetonitrilo grado HPLC o Hipergrado para LC-MS

Acido foacutermico 98-100

Hidroacutexido amoacutenico 25

MeOHAgua 50

AcetonitriloAgua 90

Aacutecido clorhiacutedrico 37

Disolucioacuten de aacutecido clorhiacutedrico 25 M Hidroacutexido Soacutedico (le 99 pureza)

Disolucioacuten de hidroacutexido soacutedico 25 M

Disolventes cromatograacuteficos

Disolucioacuten tampoacuten hidroacutexido amoacutenico al 0125

Fase moacutevil A Agua conteniendo 67 mM de NH4OH

Fase moacutevil B Acetonitrilo conteniendo 67 mM de NH4OH

Cada fase moacutevil se filtra a vaciacuteo a traveacutes de filtros de membrana de nylon de 022 microm

Toxinas de Referencia

Disolucioacuten certificada de aacutecido ocadaico en metanol (NRC CRM-OA-c) Cod PB015

Disolucioacuten certificada de Yessotoxina Yessotoxin di-sodium salt en metanol (CRM-00-YTX) Cod PB018

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6

Disolucioacuten certificada de Homo-yessotoxina 1aHomoyessotoxin di-sodium salt en metanol (CRM-00-hYTX) Cod PB019

Disolucioacuten certificada de calibracioacuten de Azaspiraacutecido 1 en metanol (NRC CRM-AZA1) Cod PB020

Disolucioacuten certificada de calibracioacuten de Azaspiraacutecido 2 en metanol (NRC CRM-AZA2) Cod PB021

Disolucioacuten certificada de calibracioacuten de Azaspiraacutecido 3 en metanol (NRC CRM-AZA3) Cod PB022

Disolucioacuten de calibracioacuten de Dinofisistoxina 2 en metanol (00-DTX2) Cod PB026

Disolucioacuten de calibracioacuten de Dinofisistoxina 1 en metanol (CRM-00-DTX1) Cod PB032

Disolucioacuten de calibracioacuten de Pectenotoxina 2 en metanol (00-PTX2) Cod PB031

Material de Referencia Certificado (Mussel Tissue Reference Material for DSP Toxins NRC CRM-DSP-Mus-b) con AO y DTX1 101 plusmn 08 microgg y 13 plusmn 02 microgg respectivamente Homogeneizado de mejilloacuten (Mytilus edulis) Cod PB014

Material de Referencia Certificado (Mussel Tissue Reference Material for AZA Toxins NRC CRM-AZA-Mus) con AZA1 116 plusmn 010 microgg AZA2 0273 plusmn 0023 microgg y AZA3 0211 plusmn 0022 microgg Homogeneizado de mejilloacuten (Mytilus edulis) Cod PB030

Disolucioacuten certificada de calibracioacuten de 13-dismetil espiroacutelido C en metanol (NRC CRM-SPX1) Cod PB027

La Tabla 1 muestra las condiciones cromatograacuteficas usando una columna de UPLC C18 en fase reversa y medio baacutesico mientras que los paraacutemetros de la fuente de ionizacioacuten para el Xevo TQMS (Waters) se muestran en la Tabla 2

34 Extraccioacuten de toxinas

A los extractos metanoacutelicos en seco de las 29 muestras de moluscos y 29 muestras de microalgas se le adicionaron hasta un total de 25 mL de metanol dispensadas en pequentildeas aliacutecuotas agitando el vial con un vortex durante 30 segundos Anaacutelisis de las formas libres del AO DTX1 y DTX2 y de las toxinas de los grupos PTXs AZAs y YTXs Para la determinacioacuten de las formas libres del AO DTX1 y DTX2 y de las toxinas de los grupos PTXs AZAs y YTXs se filtroacute un volumen de aproximadamente 12 ml del extracto metanoacutelico a traveacutes de filtros

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7

de jeringa de 045 microm para su posterior hidroacutelisis (seccioacuten siguiente) Otra aliacutecuota del mismo extracto filtrada a traveacutes de filtro de jeringa compatible con el disolvente de 022 microm se diluyoacute a la mitad con MeOH 100 y se inyectoacute 5 microl en el sistema LC-MSMS Hidroacutelisis y cuantificacioacuten del contenido total de AO DTX1 y DTX2 Para detectar y cuantificar el contenido total de AO DTX1 y DTX2 se requiere una hidroacutelisis baacutesica previa a la inyeccioacuten de los extractos en el sistema de LC-MSMS Procedimiento En un vial que contiene 1 ml de extracto metanoacutelico previamente filtrado por filtros de jeringa de 045 microm se antildeaden 125 microl de NaOH 25 M se agita manualmente 10 segundos y la mezcla fue sometida a 76 plusmn 4 ordmC durante 40 minutos en un bantildeo Se enfrioacute a temperatura ambiente se pesoacute y luego neutralizoacute con 125 microl de HCl 25 M Finalmente se homogenizoacute nuevamente con el vortex durante 30 segundos Una aliacutecuota del extracto resultante se filtroacute con filtros de jeringa de 022 microm y diluyoacute 58 con MeOH 100 Una aliacutecuota de 5 microl fue inyectada en el sistema de LC-MSMS Durante el proceso de hidroacutelisis el vial debe estar bien cerrado para evitar peacuterdidas por evaporacioacuten (la temperatura de ebullicioacuten del MeOH es 65 ordmC) Las peacuterdidas se pueden detectar mediante pesada del vial antes y despueacutes de la hidroacutelisis en caso de confirmarse se completaraacute el peso con metanol La deteccioacuten con el espectroacutemetro de masas se realizoacute usando dos transiciones por toxina la de mayor intensidad se utilizoacute para cuantificar y la de menor intensidad para confirmar (Tabla 3) Identificacioacuten y Confirmacioacuten La identificacioacuten de la presencia de toxinas se realizaraacute por comparacioacuten del tiempo de retencioacuten de cada una de las toxinas en la muestra con el tiempo de retencioacuten obtenido en las disoluciones de calibrado estaacutendar inyectadas en un mismo diacutea de anaacutelisis Se permite una desviacioacuten maacutexima entre ambos tiempos del 25 Para las toxinas que se cuantifican con la recta de calibrado del anaacutelogo correspondiente se establece un TRR con una tolerancia seguacuten se indica en la Tabla 4 Para una correcta identificacioacuten se exige una separacioacuten entre picos calculada mediante aplicacioacuten de la expresioacuten

2 x (RT2-RT1) RS = ----------------------

(W1+W2)

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8

En donde RT1 y RT2 y W1 y W2 son respectivamente los tiempos de retencioacuten y las anchuras en la liacutenea base de dos picos adyacentes RT2gtRT1 La resolucioacuten seraacute aceptable cuando Rs gt10 y la resolucioacuten a liacutenea base se consideraraacute completa cuando Rs gt15 La confirmacioacuten de la presencia de toxina seguacuten el criterio de la Decisioacuten de la Comisioacuten 2002657EC se basa en la relacioacuten entre las dos transiciones empleadas para la determinacioacuten (cuantificacioacuten y confirmacioacuten)

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9

4 RESULTADOS

41 Toxinas en moluscos

Las toxinas detectadas en moluscos fueron PTX2 YTX 45OHYTX DTX1 y SPX1 (Tabla 5) La mayor concentracioacuten la presentoacute el grupo de las YTXs (40-294 microg kg-1) en muestras de choritos provenientes del sector de Seno Otway (Fig 1) En este mismo sector las PTXs tambieacuten presentaron las mayores concentraciones (3-45 microg kg-1) en estos transvectores En el caso del ostioacuten tanto el PTX2 como las YTXs fueron detectadas en el contenido gaacutestrico El DTX1 fue detectado en choritos (1-18 microg kg-1 considerando DTX1 libre y total) procedentes del sector Seno Otway y sectores adyacentes a Punta Arenas El AO no fue detectado en ninguna aacuterea de la Regioacuten Los SPXs fueron principalmente detectados en choritos de las aacutereas centro y sur de Magallanes y en una estacioacuten del estero Peel (M13) en el aacuterea norte de la regioacuten No obstante que los niveles son muy bajos (01- 25 microg kg-1) incluso del nivel letal 50 en ratones inyectados intraperitonealmente 40 microg kg-1 (Richard et al 2000) los valores encontrados son iguales o mayor al encontrado en el caracol piquilhue recolectado en julio de 2012 y que en ese entonces produjo la muerte de ratones provocando el cierre de aacutereas de extraccioacuten por la autoridad de salud regional (Anexo 6) De las cinco toxinas detectadas en los moluscos solo DTX1 mostroacute estar localizada en el aacuterea centro de Magallanes mientras que las restantes fueron detectadas en las tres aacutereas de monitoreo Norte centro y sur de Magallanes No se encontraron PTX1 DTX2 ni AZPs en las muestras de moluscos Los resultados muestran que de los cuatro grupos de toxinas PTX YTXs DTXs y SPXs tres de ellas pueden estar presentes simultaacuteneamente en los moluscos vale decir PTXs YTXs y DTX1 o bien SPXs en vez de DTX1 42 Toxinas en microalgas

En las microalgas se detectaron PTXs y YTXs (Tabla 6) Las PTXs fueron detectadas aunque a nivel de trazas en ceacutelulas de D acuminata seleccionadas por micromanipulacioacuten desde muestras de agua procedentes de estero Silva Palma (M25) estero Wickham (M26) y Cutter Cove (M29) (Fig1) Tambieacuten fue detectada en filtrados de agua (fitoplancton) de Pto Fontaine (M21) e I Engelfield (M29N1) Las YTXs fueron detectadas en ceacutelulas de P reticulatum seleccionadas por micromanipulacioacuten y en cultivos de esta microalga que se logroacute establecer a partir de muestras de agua provenientes de C Adalberto (M04) Cutter Cove (M29) e I Engelfield (M29N1) Solo en los cultivos se detectoacute

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homoYTX y en uno de ellos tambieacuten se detectoacute aunque miacutenimamente 45OHYTX un derivado de la YTX que normalmente se encuentra en los moluscos como producto de bio-transformacioacuten La presencia de 45OHYTX en el cultivo pudo deberse a la presencia de ceacutelulas ya en fase de declinacioacuten de la curva de crecimiento

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5 ANAacuteLISIS Y DISCUSIOacuteN DE LOS DATOS

51 Toxinas en moluscos De las toxinas lipofiacutelicas se sabe que AO DTXs y AZAs causan trastornos gastrointestinales en los seres humanos (Gerssen et al 2010) Para las toxinas restantes (YTXs PTXs y SPXs) auacuten cuando no se han reportado casos de intoxicacioacuten en los seres humanos eacutestas son letales o altamente toacutexicas cuando los ratones son inyectados por viacutea intraperitoneal (Paz et al 2008 Richard et al 2000 Miles et al 2004) Es el caso de los SPXs la toxicidad en ratones inyectados por viacutea intraperitoneal supera a la del resto de las toxinas pues su dosis letal 50 es de 40 microg kg-1 (Richard et al 2000) Tal es asiacute que como referencia (Tabla 5) el transvector caracol piquilhue recolectadas en Julio de 2012 y cuyos niveles de toxicidad provocaron la muerte de los ratones solo presentoacute 01 microg kg-1 deteccioacuten que fue realizada durante este estudio en muestras de carne almacenadas durante no maacutes de 1 antildeo a -20 ordmC Sin embargo no se puede descartar una peacuterdida de la actividad por transformacioacuten durante el periodo de conservacioacuten A excepcioacuten de los SPXs el resto de las toxinas mencionadas estaacuten reguladas por la legislacioacuten europea tanto para consumo interno como importacioacuten de moluscos y tunicados para garantizar la salud de las personas Asiacute tambieacuten estaacuten reguladas por la legislacioacuten chilena a traveacutes del Instituto de Salud Puacuteblica (ISP) estableciendo los mismos niveles de referencia europeo en base al bioensayo ratoacuten Aun cuando los niveles de toxinas detectadas en los moluscos durante este estudio estaacuten por debajo de lo exigido por las regulaciones e incluso de los niveles propuestos por el EFSA (Tabla 7) la presencia de dos y tres tipos de toxinas en los moluscos representa una complejidad en la determinacioacuten de los niveles de toxicidad especialmente si se encuentran presentes toxinas altamente toacutexicas para ratones inyectados intraperitonealmente como son los SPXs Aunque se sospechaba la concurrencia de diferentes tipos de toxinas tal hecho no habiacutea sido confirmado anteriormente Sin embargo los SPXs siguen siendo una incoacutegnita pues se desconoce la fuente de estas toxinas A ostenfeldii la especie que podriacutea ser candidata a confirmar estuvo ausente (Tabla 8 modificado de Guzmaacuten et al 2014) durante el periodo en que se detectoacute en los moluscos Los escasos antecedentes toxigeacutenicos de esta especie en Chile la han confirmado como productora de toxinas paralizantes en Ayseacuten (Pizarro et al 2012) pero no de SPXs No obstante la produccioacuten de SPXs por esta especie en la regioacuten de Magallanes auacuten no se puede descartar Las YTXs fueron las toxinas maacutes abundantes en los moluscos analizados condicioacuten que se corresponde con la alta abundancia relativa de esta especie en el ambiente (Tabla 8) en la mayoriacutea de los casos (Tabla 5)

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Los resultados sugieren que los falsos positivos por bioensayo ratoacuten pudieran ser maacutes frecuentes de lo que se piensa actualmente para la regioacuten de Magallanes 52 Toxinas en microalgas Los resultados indican que P reticulatum encontrado en Magallanes producen YTXs al igual que las especies reportadas en la regioacuten de Antofagasta y Ayseacuten (Aacutelvarez et al 2011 Pizarro et al 2012) Tal resultado hace altamente probable que esta especie es la fuente de YTXs detectadas en los moluscos durante el periodo de estudio De acuerdo a las toxinas detectadas en las muestras de D acuminata aisladas asiacute como en el fitoplancton con gran abundancia de esta especie (Tabla 8) sugiere que esta microalga podriacutea ser una fuente primaria de PTXs tal como ocurre en el norte y sur del paiacutes (Blanco et al 2007 Fux et al 2011) Aunque la especie tambieacuten ha sido asociada a la presencia de DTX1 en moluscos en un evento toacutexico ocurrido en 1998 en Magallanes (Uribe et al 2001) el DTX1 no fue detectado en las muestras de D acuminata durante este estudio El no hallazgo de DTX1 en estas muestras pudo deberse a una fuente microalgal distinta como D acuta yo P lima D acuta ha sido asociada a DTX1 en moluscos de la regioacuten de Ayseacuten (Lembeye et al 1993 y Zhao et al 1993) mientras que P lima es productora solo de DTX1 en la regioacuten de Magallanes (Salgado et al 2012) Sin embargo cuando se detectoacute DTX1 en las muestras de moluscos durante este estudio D acuta estuvo ausente en las muestras de agua mientras que D acuminata presentoacute una abundancia relativa alta Por otro lado el volumen de resuspensioacuten de los extractos pudo ser elevado al seguir el mismo procedimiento protocolar que se aplica a las muestras de moluscos de acuerdo a la normativa europea actual Por tal razoacuten el LC-MSMS no logroacute detectar PTXs ni DTX1 en las muestras de microalgas En estos casos un protocolo para el anaacutelisis de las microalgas debiera incluir un volumen menor de resuspensioacuten de los extractos secos en referencia al utilizado para los moluscos o bien seleccionar por micromanipulacioacuten un nuacutemero mayor de microalgas (gt 130 ceacutelulas) Sin embargo esto uacuteltimo es maacutes difiacutecil de lograr en latitudes australes debido a la baja densidad de ceacutelulas en las que se presenta normalmente esta especie en condiciones naturales Por tal motivo se recomienda realizar pruebas con un volumen de resuspensioacuten menor a 1 mL aun cuando se trate de un LC-MSMS triple cuadrupolo

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6 CONCLUSIONES

a Los moluscos de la regioacuten de Magallanes pueden presentar PTX2 YTX 45OHYTX DTX1 y SPX1

b El hecho que los moluscos puedan presentar dos o maacutes tipos de toxinas lipofiacutelicas dificulta establecer el nivel de toxicidad total

c P reticulatum en Magallanes produce YTXs al igual que la especie del norte y sur del paiacutes

d La abundancia relativa ambiental de P reticulatum durante el periodo de estudio coincidioacute con la presencia de YTXs en los moluscos

e Los SPXs encontrados anteriormente en caracoles piquilhue tambieacuten fue posible detectarlos en choritos durante este estudio

f Auacuten queda por confirmar el tipo de SPXs presentes y su eventual fuente primaria La presencia de SPXs en los moluscos no siempre coincidioacute con la presencia de A ostenfeldii en el ambiente y su abundancia relativa maacutexima fue solo de nivel 1 (raro) durante el periodo de estudio

g La PTX2 detectada en los moluscos coincidioacute con una alta abundancia relativa ambiental de D acuminata No obstante auacuten queda por confirmar si esta especie es la fuente primaria Para ello se hace necesario ajustar (disminuir) el volumen de dilucioacuten de los extractos secos de microalgas aisladas por micromanipulacioacuten aun cuando se trata de un espectroacutemetro de masas como un triple cuadrupolo

h La deteccioacuten de DTX1 en los moluscos coincidioacute con la ausencia de D acuta en el ambiente La toxina tampoco fue detectada en los moluscos cuando esta microalga estuvo a niveles de 2 y 3 (escaso y regular) Queda por confirmar la produccioacuten de DTX1 por esta especie en Magallanes

i No se encontraron PTX1 DTX2 ni AZPs en las muestras de moluscos durante el periodo de estudio

j Los resultados demuestran la presencia de toxinas en los moluscos que se hace necesario identificar y cuantificar utilizando teacutecnicas distintas al bioensayo

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(Dinophyceae) aislado desde la costa de Magallanes sur de Chile In Proceedings of Libro de resuacutemenes del XXXII Congreso de Ciencias del Mar Punta Arenas Chile 22-26 de Octubre 2012 p 228

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southeastern Pacific Ocean reveal a diverse but patchy distribution of phycotoxins Toxicon 58(5) 389ndash397

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F I G U R A

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Figura 1 Estaciones y sectores muestreados (ciacuterculo rojo) y sector Fortuna donde fue recolectado el

caracol piquilhue (ciacuterculo amarillo)

T A B L A S

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Tabla 1 Condiciones cromatograacuteficas para el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas usando

una columna de UPLC C18 en fase reversa y medio baacutesico

Columna Acquity UPLC BEH C18 17 microm 21x100 mm

Temperatura columna 45 ordmC

Flujo 04 mlmin

Volumen inyeccioacuten 5 microl

Temperatura muestras 10 plusmn 5 ordmC

Gradiente

Tiempo (min) Fase A () Fase B ()

0 75 25

066 75 25

330 5 95

528 5 95

726 75 25

900 75 25

Tabla 2 Paraacutemetros de la fuente de ionizacioacuten para el Xevo TQMS (Waters) en la determinacioacuten de toxinas lipofiacutelicas

PARAacuteMETROS DE LA FUENTE

ESI- ESI+

AO DTX2 DTX1 YTX homoYTX 45OH YTX y 45OH

homoYTX

AZA1 AZA2 AZA3 PTX2 PTX1 y SPX1

Voltaje de capilar (V) 100 200

Temperatura de solvatacioacuten (ordmC) 450 450

Flujo gas de solvatacioacuten (lh) 850 850

Flujo gas cono (lh) 50 50

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Tabla 3

Resumen de las condiciones de espectrometriacutea de masas empleadas con el Xevo TQMS (Waters) en el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas

Compuesto tR (min)

ESI

Ioacuten Precursor

(mz)

Ioacuten Producto

(mz)

Dwell time (s)

Energiacutea colisioacuten

(eV)

Voltaje cono (V)

AO 189 NEG 8035 2552 0010 46 86

113 0010 56 86

DTX2 210 NEG 8035 2552 0010 46 86

113 0010 56 86

DTX1 214 NEG 8175 5634 0010 43 86

2552 0010 48 86

YTX 202 NEG 5704 4674 0010 30 45

3963 0010 35 45

45OH-YTX 182 NEG 5784 4674 0010 30 45

3964 0010 30 45

HomoYTX 203 NEG 5775 4744 0010 30 48

4034 0010 30 48

45OH-homoYTX 182 NEG 5855 4034 0010 30 45

4744 0010 30 45

PTX1 306 POS 8925 8395 0015 25 36

8215 0015 25 36

PTX2 362 POS 8765 8415 0015 20 36

8235 0015 25 36

AZA1 263 POS 8425 6545 0015 55 50

3622 0015 50 50

AZA2 270 POS 8565 6725 0015 45 27

6545 0015 45 27

AZA3 236 POS 8285 6404 0015 55 47

3622 0015 55 47

SPX1 368 POS 6925 6744 0015 27 60

1643 0015 42 60 Transicioacuten cuantificadora

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Tabla 4 TRR y valores de tolerancia para las toxinas analizadas

TOXINA TRR TOLERANCIA

Toxinas del grupo de AO

AO 1000 0990-1010

DTX2 1040 1014-1066

DTX1 1140 1111-1168

Toxinas del grupo de PTX

PTX2 1000 0990-1010

PTX1 0850 0829-0871

Toxinas del grupo de YTX

YTX 1000 0990-1010

45OH-YTX 0894 0871-0916

Homo YTX 1000 0990-1010

45OH-homoYTX 0899 0876-0921

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Tabla 5 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de moluscos

Nordm estMes

recolectaLocalidad Molusco

cuerpo

enterohepat

gramos

carne

toxicidad

VDM ratoacuten

PTX2

(ugKg)

YTX

(ugKg)

45OHYTX

(ugKg)

DTX1

libre

(ugKg)

DTX1

total

(ugkg)

SPX 1

(ugKg)

M13 ene-13 E Peel chorito x 5086 + 01 02

M13 ene-13 E Peel ostioacuten x 5155 No real izado 16 21

M33 ene-13 B Bell chorito x 5253 + 04

M37 ene-13 B Agua Fresca chorito x 5039 + 05 01

M35 ene-13 C San Isidro chorito x 5289 + 000 01

M42 ene-13 V Holanda chorito x 5231 + 06 13

M43 ene-13 B Yendegaia chorito x 5193 + 04 25

M45 ene-13 Pto Williams chorito x 5161 - 28 07

M08 feb-13 E Falcon cholga x 5027 - 14

M09 feb-13 E Penguumlin cholga x 5103 + 14

M22 feb-13 E de las Montantildeas cholga x 5052 - 26

M23 feb-13 I Ballesteros cholga x 5204 - 87

M24 feb-13 B Fanny chorito x 2016 - 38 1071 479 12

M25 feb-13 E Silva Palma chorito x 1447 - 59 1077 898 09

M26 feb-13 E Wickham chorito x 1093 - 194 2940 2232 66 66

M27 feb-13 E Sullivan chorito x 1137 - 450 1944 1478

M28 feb-13 E Nuntildeez chorito x 1179 + 33 721 407

M29 feb-13 Cutter Cove chorito x 1003 - 65 501 309

M29N1 feb-13 I Engelfield chorito x 1116 - 297 2007 1483

M31 feb-13 B Nash chorito x 2231 +

M33 feb-13 B Bell chorito x 1181 - 93

M34 feb-13 S Pedro chorito x 0726 -

M35 feb-13 C San Isidro chorito x 1178 + 110

M36 feb-13 B Buena chorito x 1367 +

M37 feb-13 B Agua Fresca chorito x 0850 + 45 100 80

M39 feb-13 Pto Zenteno chorito x 3241 + 28

M39N2 feb-13 Pta San Valentin chorito x 1712 - 11

M39N3 feb-13 Pto Yartou chorito x 2035 - 11

sector

Fortunajul-12 B Inuacutetil

caracol

piquilhuex 107000 + 01

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Tabla 6 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de microalgas

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SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo TABLAS

Tabla 7 Niveles actualmente permitidos por la legislacioacuten europea (bioensayo) y los niveles propuestos por la

autoridad europea para la seguridad alimentaria (EFSA) (Gerssen et al 2010)

Toxin Legislacioacuten (μg kg-

1) Proposicioacuten

EFSA (μg kg-1)

Validacioacuten LC-MSMS

(μg kg-1)

OA and DTXs 160 45

PTXs 120

YTXs 1000 3750

AZAs 160 32

SPXs 400 (Gerssen et al2010)

European Food Safety Authority Decisioacuten 2002657 de la Unioacuten Europea EC Incluye PTXs

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo TABLAS

Tabla 8 Abundancia relativa ambiental de las microalgas al momento de recolectar las muestras de moluscos En rojo se indica la deteccioacuten de toxina positiva en los moluscos asociada a la supuesta microalga fuente PTXs (D

acuminata) YTXs (P reticulatum) SPXs (A ostenfeldii) DTX1 (A acuta)

(Tabla modificada de Guzmaacuten et al 2014)

A N E X O S

ANEXO 1

Certificacioacuten laboratorio INTECMAR

ANEXO 2

Lista de anaacutelisis que realiza INTECMAR y sus costos (en euros) 2013

scv 1 de 7

GUIA PARA LA AUTOLIQUIDACIOacuteN DE TASAS A FAVOR DE LA COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA 2013 Los aspectos financieros de los servicios prestados por Intecmar en el marco de su actividad e vienen regulados en la Ley 62003 de 9 de diciembre de tasas precios y exenciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia (DOG nuacutem 240 de 11122003) y fueron actualizados posteriormente en la Ley 142010 de 27 de diciembre de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2011 (DOG nuacutem 250 de 30122010) y en la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013 (DOG nuacutem 42 de 28022013) Existen dos maneras de liquidar las tasas correspondientes a los servicios prestados por Intecmar

1 De forma manual cubriendo el modelo A de autoliquidacioacuten que se descarga en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda y que adjunto en pdf y se lleva al banco para su pago httpwwwconselleriadefacendaeswebportalconfeccion-impresos

2 De forma telemaacutetica en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda viacutenculo httpshostcixtecesXEITObinlionwebXeitodllxmit a traveacutes del modelo 730

Ambos modelos de liquidacioacuten de tasas adjuntamos ejemplo al final de este documento deben ser remitidos por mail a Intecmar con el sello del banco fiacutesico o virtual como paso previo a la emisioacuten del certificado Los coacutedigos generales necesarios son

minus Consejeriacutea de Medio Rural y de Mar Coacutedigo 09 minus Delegacioacuten de Pontevedra Coacutedigo 40 minus Servicio de Intecmar Coacutedigo 24

Los coacutedigos y descripcioacuten de las tasas son los regulados en la legislacioacuten vigente y los hemos resumido en los anexos siguientes Vilaxoaacuten 4 de marzo de 2013

scv 2 de 7

TARIFAS DE TASAS VIGENTES PARA 2013 - Ley 22013 d e 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013

(DOG nuacutem 42 de 28022013)

Estas tarifas son consecuencia de la actualizacioacuten de las tarifas contenidas en los anexos 1 2 3 4 y 5 de la Ley 62003 del 9 de diciembre de tasas precios y exacciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia por la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 Seraacuten aplicables desde el diacutea de la entrada en vigor de la Ley de

presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 TASA POR SERVICIOS ADMINISTRATIVOS

No sujecioacuten No se exigiraacute la tasa por servicios administrativos cuando se trate de compulsas o cotejos de documentos que deban acompantildear a solicitudes escritos o comunicaciones presentadas por el ciudadano y realizadas en el aacutembito de actuacioacuten de los registros seguacuten lo dispuesto en el artiacuteculo 385 de la Ley 301992 del 26 de noviembre de reacutegimen juriacutedico de las administraciones puacuteblicas y del procedimiento administrativo comuacuten

Excepciones Estaraacuten exentos de la presente tasa

1- La expedicioacuten de certificados de retribuciones satisfechas por la Xunta de Galicia con el objeto de justificacioacuten en relacioacuten con el impuesto sobre la renta de las personas fiacutesicas

2- La expedicioacuten de certificados y compulsa que el personal de la Administracioacuten solicite respecto a las necesidades propias del puesto de trabajo o relacioacuten de servicios

3- Los alumnos por cualquier actuacioacuten en materia de ensentildeanzas no universitarias

scv 3 de 7

4- Las compulsas realizadas en las oficinas de empleo para los desempleados en la tramitacioacuten de expedientes que sean competencia de dichas oficinas

5 La inscripcioacuten en las convocatorias para a seleccioacuten de personal de la comunidad autoacutenoma despueacutes de justificacioacuten documental solicitada por

- Personas con discapacidad igual o superior al 33 - Personas que sean miembros de familias numerosas clasificadas en la

categoriacutea especial Se aplicaraacute una bonificacioacuten del 50 a la inscripcioacuten solicitada por - Personas que sean miembros de familias numerosas de categoriacutea

general - Personas que figurasen como demandantes de empleo desde por lo

menos seis meses antes a la fecha de la convocatoria de pruebas selectivas de personal en las que soliciten su participacioacuten y no esteacuten percibiendo prestacioacuten o subsidio por desempleo

6- La expedicioacuten de certificados relativos a la situacioacuten fiscal 7- El Estado y los demaacutes entes puacuteblicos territoriales o institucionales

siempre que los servicios o actividades de que sean beneficiarios se presten o se realicen en el marco del principio de colaboracioacuten entre administraciones

8- Las viacutectimas de actos terroristas asiacute como sus coacutenyuges y sus hijos por cualquier actuacioacuten en materia educativa realizada en centros oficiales de estudios en todos los niveles de ensentildeanza

9- Los miembros de los organismos consultivos de la Administracioacuten puacuteblica gallega respecto de los certificados emitidos por dichos organismos

COacuteDIGO TASAS

DESCRIPCIOacuteN IMPORTE euro

314400 Prestacioacuten de servicios en el Instituto Tecnoloacutegico para el Control del Medio Marino de Galicia

314401 Anaacutelisis de biotoxinas marinas en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de Yasumoto 1978 4752

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en rato segundo o meacutetodo de Yasumoto 1984 5432

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS)

9520 -Anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten

seguacuten el meacutetodo de la AOAC 4752

scv 4 de 7

-Anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo da AOAC 4752

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1978 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10186

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1984 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10865

-Anaacutelisis combinada en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS) anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo AOAC y anaacutelisis de toxicidad de tipo ASP por cromatografiacutea liquida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo de la AOAC 15000

314402 Anaacutelisis de muestras en agua de mar -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton marino mediante

microscopiacutea oacuteptica 15133 -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton toacutexico marino

mediante microscopiacutea oacuteptica 13333 - Anaacutelisis de carbono orgaacutenico disuelto 5093 -Anaacutelisis de nutrientes inorgaacutenicos disueltos 3500 -Anaacutelisis de pigmentos fotosinteacuteticos (clorofila ldquoardquo) por

espectrofluorimetria 1698 314403 Anaacutelisis microbioloacutegicos en moluscos y otros organismos

procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Cuantificacioacuten de E Coli 10186 - Deteccioacuten de Salmonella spp 16975 -Enumeracioacuten de Escherichia coli en moluscos bivalvos

vivos por la teacutecnica de medida directa de impedancia con el sistema BacTrac 4300 6800

314404 Anaacutelisis de contaminantes de origen quiacutemica en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Determinacioacuten de metales pesados (Pb Cd Cu Zn As Hg Ni Cr Ag) mediante espectrofotometriacutea de absorcioacuten atoacutemica por metal

6790

-Determinacioacuten de compuestos bifenilos policlorados (PCB) mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

scv 5 de 7

-Determinacioacuten de pesticidas organoclorados mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

-Determinacioacuten de hidrocarburos aromaacuteticos policiacuteclicos (HAPs) mediante cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de fluorescencia

28200

314405 Anaacutelisis histopatoloacutegica de moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Estudio hispatoloacutegico Determinacioacuten de Bonamia Marteillia Perkinsus y otras alteraciones patoloacutegicas

101852

314406 Emisioacuten de certificaciones e informes teacutecnicos y otras actuaciones a peticioacuten del interesado

Emisioacuten de certificados a peticioacuten de los interesados sobre las actuaciones llevadas a cabo por el Instituto

1000

Emisioacuten de informes teacutecnicos a peticioacuten del interesado (euros por hora o fraccioacuten)

4000

scv 6 de 7

scv 7 de 7

ANEXO 3

Resultados de anaacutelisis en muestras de microalgas anteriormente enviadas procedentes de Magallanes por el equipo de espectrometriacutea de masas utilizado por INTECMAR Trabajo presentado a las XXXII

Congreso de Ciencias del Mar realizado en Punta Arenas 22-25 octubre de 2012

PERFIL DE TOXINAS DE PROROCENTRUM LIMA (DINOPHYCEAE) AISLADO DESDE LA COSTA DE MAGALLANES SUR DE CHILE P Salgado1 G Pizarro1 JM Franco2 P Rioboacute2 e I Bravo3

1Instituto de Fomento Pesquero (IFOP) Punta Arenas Chile gemitapizarroifopcl 2Instituto de Investigaciones Marinas (CSIC) Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea 3Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea

Prorocentrum lima (Ehrenberg) es un dinoflagelado marino bentoacutenico que se encuentra adherido generalmente

sobre macroalgas sedimentos y detrito flotante y menos comuacutenmente en el plancton (Bravo et al 2001) Es una especie neriacutetica y estuarina y su rango de distribucioacuten geograacutefica variacutea desde aguas costeras tropicales a templadas (Faust 1991) La importancia de P lima se debe a que son productoras de toxinas diarreogeacutenicas en las personas (veneno diarreico de los mariscos VDM) al igual que algunas especies de Dinophysis aunque raramente se le han asociado con episodios toacutexicos por VDM por su caraacutecter epiacutefito y bentoacutenico El complejo VDM producido por P lima incluye moleacuteculas conocidas como el aacutecido okadaico (AO) y derivados dinofisistoxinas (DTX-1 DTX-2) (Bravo et al 2001 Vale et al 2009) No obstante existen casos citados para USA donde se detectoacute toxicidad por VDM en bivalvos de cultivos asociadas a P lima aunque en bajos niveles (Maranda et al 2007a) En Canadaacute tambieacuten se llevoacute a cabo un estudio en moluscos de cultivo cuya finalidad fue determinar el origen del VDM en la que P lima fue la principal especie sospechosa tras la ocurrencia de un evento toacutexico humano por VDM ocurrido en 1998 (Levasseur et al 2003) y en antildeos anteriores (Quilliam et al 1993) Aunque Levasseur et al (2003) no logroacute probar la toxicidad de los mariscos en cultivo a causa de P lima cabe hacer notar que lo que buscaron fue OA y DTX1 no DTX 3 este uacuteltimo principal derivado de las anteriores tras su transformacioacuten en los moluscos (eg Suzuki et al 1999 Vale amp Sampayo 2002)

En consecuencia el rol de P lima en eventos toacutexicos por VDM auacuten no puede descartarse por cuanto podriacutean llegar a ser importantes en ambientes turbulentos debido a la eventual remocioacuten de microalgas adheridas en sustratos por efecto de vientos (Levasseur et al 2003) factor de importancia si se trata de sedimentos o contrariamente en zonas someras y estables de cultivos de moluscos que al mismo tiempo favorecen microambientes para sustratos en los que prolifera la epiacutefita P lima (Lawrence et al 2000) quedando expuestas a re-suspensiones temporales que favorecen la filtracioacuten de estas microalgas por los bivalvos en cultivo (Maranda et al 2007a)

Chile posee escaso conocimiento sobre esta especie en su medio natural incluido su perfil de toxinas y potencial rol en la toxificacioacuten de moluscos por VDM Por tal razoacuten resultoacute interesante aportar al conocimiento de estos aspectos en muestras de sedimentos recolectadas en el estrecho de Magallanes en las que esta especie se encontroacute inhabitualmente abundante

Las ceacutelulas utilizadas en este estudio fueron aisladas desde sedimentos superficiales (0-3 cm) recolectados en el invierno de 2010 en la localidad de cabo San Isidro durante el muestreo regular del programa de monitoreo de marea roja en la regioacuten de Magallanes En esa oportunidad se logroacute cuantificar hasta 1002 quistes tecadoscm3 de Prorocentrum lima la mayor concentracioacuten respecto a otros sitios de recolecta (Fig 1) Los sedimentos de esta localidad presentaron una coloracioacuten oscura y un fuerte olor a sulfuro de hidroacutegeno (H2S) producto de anoxia local

Se aislaron entre 27 y 87 quistes tecados (Fig 1 a) directamente desde los sedimentos mientras otras 60 ceacutelulas vegetativas (Fig 1 b) fueron aisladas luego de promover la actividad y divisioacuten de los quistes en condiciones de 15 ordmC y un ciclo de luzoscuridad de 1212 horas (Tabla 1) Para este fin se aislaron quistes tecados y trasvasijaron a placas Petri de 5 cm de diaacutemetro conteniendo 5 mL de medio de cultivo L1 Para el anaacutelisis de toxinas las ceacutelulas aisladas fueron trasvasijadas a un tubo Eppendorf de 15 mL y congelados a -80 ordmC Una aliacutecuota de sedimento huacutemedo (100 microL aproximados) tambieacuten fue vaciada en un tubo Eppendorf y congelado Para extraer la toxina se antildeadioacute 500 microL de metanol 100 a cada tubo se mezcloacute por 1 min y filtroacute por 045 microm trasvasijando a un vial El extracto fue secado bajo nitroacutegeno gas a 40 ordmC y conservado a 4 ordmC hasta su anaacutelisis Previo al anaacutelisis de toxinas los extractos fueron resuspendidos en 150 microl de metanol

La presencia de la toxina dinofisistoxina 1 (DTX-1) en las muestras (Fig2) fue confirmada en modo negativo a traveacutes de su ioacuten precursor [M-H]- mz 8175 y sus iones productos mz 5634 y 2552 mediante un cromatoacutegrafo UPLC Acquity Waters acoplado a un triple cuadrupolo Waters Xevo TQ (LC-MS) La columna utilizada fue una Acquity UPLC BEH C18 17microm 21 x 100 mm a 45 ordmC La fase moacutevil consistioacute en (A) hidroacutexido amoacutenico a pH 11 y (B) hidroacutexido amoacutenico en acetonitrilo (67 mM) con una tasa de flujo de 4 mLmin El gradiente de elucioacuten utilizado fue el siguiente mantencioacuten al 75 de A entre 0 y 066 min cambio a 5 de A entre 066 y 330 min mantener 5

de A entre 330 y 528 min recuperacioacuten del 75 de A entre 528 y 726 min mantencioacuten al 75 de A hasta 9 min Se pinchoacute 5microL de muestra en el LC-MS El contenido de DTX-1 en las muestras fue cuantificado en base al ion precursor

Los tres tipos de muestras fueron positivas a la presencia de DTX-1 pero las ceacutelulas vegetativas fueron las que presentaron un mayor contenido de DTX-1 por ceacutelula La deteccioacuten de DTX-1 en los sedimentos (Tabla 2) reflejoacute la presencia de los quistes tecados en eacutestos

Figura 1 Concentraciones de quistes tecados de Prorocentrum lima (quistescm3 de sedimento huacutemedo) en estaciones de muestreo en el Estrecho de Magallanes (M26 Estero Wickham M29N1 Isla Engenfield M31 Bahiacutea Nash M35 Cabo San Isidro M39C1 Bahiacutea Gente Grande M39C2 Bahiacutea Inuacutetil M39C3 Canal Gabriel) y Canal Beagle (M41 Ventisquero Espantildea M42 Ventisquero Holanda) (a) Quistes tecados (b) ceacutelulas vegetativas obtenidas de germinacioacuten de quistes tecados bajo condiciones de laboratorio Barra de escala 20 microm

Tabla 1 Sedimento y ceacutelulas de Prorocentrum lima aisladas para anaacutelisis de toxinas

Extracto metanoacutelico Nordm de ceacutelulas TR ngmL pg DTX-1 ceacutel

G1 quistes tecados 27 213 lt2 -

G2 quistes tecados 67 214 05 11

G3 quistes tecados 87 215 12 21

G4 ceacutelulas vegetativas 60 215 34 87

G6 sedimentos aliacutecuota 213 13 19 pg microL sed

TR tiempo de retencioacuten

Figura 2 Cromatogramas de extractos metanoacutelicos de Prorocentrum lima quistes tecados (a) ceacutelulas vegetativas (b) y sedimentos (c)

Tabla 2 Caracteriacutesticas del sedimento con quistes tecados de Prorocentrum lima

Tipo Tamantildeo (mm)

Grava 2 35

Arena media 025 - 05 32

Arena muy fina 0063 - 0125 2

Limo-arcilla lt 0063 1

Estos resultados constituyen otra eventual posibilidad de toxicidad en los moluscos por VDM no soacutelo de aquellos con modalidad de vida bentoacutenica superficial sino de aquellos que tambieacuten viven enterrados en la arena (eg almeja huepo) Maacutes auacuten si se conoce que P lima posee la capacidad de desarrollar poblaciones naturales en aguas templadas en nuacutemeros que podriacutean justificar una toxicidad por VDM en los mariscos (eg Maranda et al 2007a b)

Referencias

Bravo I ML Fernaacutendez I Ramilo amp A Martinez 2001 Toxin composition of the toxic dinofagellate Prorocentrum lima isolated from different locations along the Galician coast (NW Spain) Toxicon 39 1537ndash1545

Faust MA 1991 Morphology of ciguatera-causing Prorocentrum lima (Pyrrophyta) from widely differing sites J Phycol 27 642-648

Lawrence J E Grant J Quilliam M A Bauder A G amp Cembella A D 2000 Colonizaition and growth of the toxic dinoflagellate Prorocentrum lima and associated fouling macroalgae on mussels in suspended culture Mar Ecol Prog Ser 201 147-154

Levasseur M Couture J Y Weise A M Michaud S Elbrachter M Sauveacute G amp Bonneau E 2003 Pelagic and epiphytic summer distributions of Prorocentrum lima and P mexicanum at two mussel farms in the Gulf of St Lawrence Aquat Microbiol Ecol 30283-293

Maranda L Corwin S Dover S amp Morton S L 2007a Prorocentrum lima (Dinophyceae) in northeastern USA coastal waters II Toxin load in the epibiota and in shellfish Harmful Algae 6 632-641

Maranda L Corwin S Hargraves P E 2007b Prorocentrum lima (Dinophyceae) in 19 northeastern USA coastal waters I Abundance and distribution Harmful Algae 6 623ndash631

Quilliam MA Gilgan MW amp Pleasance S 1993 Confirmation of an incident of diarrhetic shellfish poisoning in eastern Canada In Smayda TJ Shimizu Y (Eds) Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea Elsevier New York pp 547ndash552

Suzuki T Ota H amp Yamasaki M 1999 Direct evidence of transformation of dinophysistoxin-1 to 7-O-acyl-dinophysistoxin-1 (Dinophysis-3) in the scallop Patinopecten yessoensis Toxicon 37 187-198

Vale P amp Sampayo M A 2002 First confirmation of human diarrhoeic poisonings by okadaic acid esters after ingestion of razor clams (Solen marginatus) and green crabs (Carcinus maenas) in Aveiro lagoon Portugal and detection of okadaic acid esters in phytoplankton Toxicon 40989-996

Vale P Veloso V amp Amorim A 2009 Toxin composition of a Prorocentrum lima strain isolated from the Portuguese coast Toxicon 54145ndash152

Agradecimientos Intecmar de la Xunta de Galicia Espantildea donde se realizaron los anaacutelisis de toxinas proyecto

SUBPESCA ldquoManejo y Monitoreo de Mareas Rojas en las regiones de Los Lagos Ayseacuten y Magallanes IV etapa 2010rdquo

ANEXO 4

Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten

ANEXO 5

Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de Magallanes

TASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

O

EJE

MP

LA

R P

AR

A E

L IN

TE

RE

SA

DO

LIQ

UID

AC

IOacuteN

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

EN

TID

AD

BA

NC

AR

IATASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

0 9

4 0

2 4INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

AD

MIN

IST

RA

CIOacute

NTASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

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IQU

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N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

9520 euros

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

CONSELLERIA DE FACENDA

ANEXO 6

Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para cierre

de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

Seccioacuten Ediciones y Produccioacuten Almte Manuel Blanco Encalada 839

Fono 56-32-2151500 Valparaiacuteso Chile

wwwifopcl

Page 6: “Análisis de toxinas lipofílicas mediante LC-MS/MS en ...metadatos.mma.gob.cl/sinia/Informe_final_Analisis_toxinas_lipofilicas_656-055.pdfSUBSECRETARÍA DE ECONOMÍA: INFORME FINAL:

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SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo

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IacuteNDICE DE FIGURA

Figura 1 Estaciones y sectores muestreados (ciacuterculo rojo) y sector Fortuna donde fue recolectado el caracol piquilhue (ciacuterculo amarillo)

IacuteNDICE TABLAS

Tabla 1 Condiciones cromatograacuteficas para el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas usando una columna

de UPLC C18 en fase reversa y medio baacutesico Tabla 2 Paraacutemetros de la fuente de ionizacioacuten para el Xevo TQMS (Waters) en la determinacioacuten

de toxinas lipofiacutelicas Tabla 3 Resumen de las condiciones de espectrometriacutea de masas empleadas con el Xevo

TQMS (Waters) en el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas Tabla 4 TRR y valores de tolerancia para las toxinas analizadas Tabla 5 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de moluscos Tabla 6 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de microalgas Tabla 7 Niveles actualmente permitidos por la legislacioacuten europea (bioensayo) y los niveles

propuestos por la autoridad europea para la seguridad alimentaria (EFSA) (Gerssen et al 2010) European Food Safety Authority

Tabla 8 Abundancia relativa ambiental de las microalgas al momento de recolectar las muestras

de moluscos En rojo se indica la deteccioacuten de toxina positiva en los moluscos PTXs (D acuminata) YTXs (P reticulatum) SPXs (A ostenfeldii) DTX1 (A acuta) (Tabla modificada de Guzmaacuten et al 2014)

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IacuteNDICE ANEXOS

Anexo 1 Certificacioacuten laboratorio INTECMAR Anexo 2 Lista de anaacutelisis que realiza INTECMAR y sus costos (en euros) 2013 Anexo 3 Resultados de anaacutelisis en muestras de microalgas anteriormente enviadas

procedentes de Magallanes por el equipo de espectrometriacutea de masas utilizado por INTECMAR Trabajo presentado a las XXXII Congreso de Ciencias del Mar realizado en Punta Arenas 22-25 octubre de 2012

Anexo 4 Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten Anexo 5 Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de

Magallanes Anexo 6 Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para

cierre de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

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1 ANTECEDENTES En Chile auacuten existen escasos antecedentes acerca de las toxinas lipofiacutelicas presentes en nuestros moluscos asiacute como la fuente microalgal asociada a su produccioacuten y la variabilidad espacio-temporal de las mismas Tal situacioacuten es tambieacuten un problema en el sur austral de Chile y particularmente en Magallanes donde el historial de este tipo de toxinas ha sido opacado por la fuerte incidencia de toxina paralizante asociada a la presencia de Alexandrium catenella No obstante en los dos uacuteltimos antildeos los niveles de toxicidad por toxinas lipofiacutelicas en la regioacuten se han constituido en un problema para la autoridad de Salud pues han determinado el cierre de grandes extensiones de aacutereas a la extraccioacuten de moluscos hecho no acontecido anteriormente salvo muy local y esporaacutedicamente (eg Uribe et al 2001) ademaacutes del efecto econoacutemico y social

Dentro de las toxinas lipofiacutelicas las maacutes conocidas y frecuentes a nivel mundial por sus efectos diarreicos (veneno diarreico de los mariscos VDM) en humanos son el aacutecido okadaico y sus derivados las dinofisistoxinas (AO y DTXs) (eg Yasumoto et al 1978) tambieacuten conocidas como okadaatos Por lo mismo poseen un mayor historial de citas en la literatura cientiacutefica Los okadaatos son fuertes inhibidores de las proteiacutenas fosfatasas 1 y 2A y potenciales promotores de tumores (Yasumoto et al 1989 Fujiki et al 1989) con efectos croacutenicos desconocidos por lo que su efecto es maacutes lento Por esta razoacuten representan un riesgo para la salud puacuteblica y dan lugar a prolongadas vedas de extraccioacuten de bivalvos tanto de bancos naturales como centros de cultivo con las consiguientes peacuterdidas econoacutemicas para el sector pesquero y acuicultor en otras partes del mundo

Actualmente en Chile las toxinas lipofiacutelicas son detectadas por el bioensayo del ratoacuten una metodologiacutea semicuantitativa e inespeciacutefica Por lo mismo suelen ocurrir falsos positivos debido a la interferencia de otras toxinas lipofiacutelicas diferentes al VDM inocuas o no para el hombre pero que pueden estar presentes en las muestras inyectadas pues son co-extraiacutedas con los okadaatos

Gracias al uso de tecnologiacuteas de alta sensibilidad uacuteltimamente ha sido posible detectar junto a los okadaatos otras toxinas lipofiacutelicas de diverso efecto toacutexico tales como las yesotoxinas pectenotoxinas azaspiraacutecidos espiroacutelidos y gimnodimina (Zhao et al 1993 Yasumoto amp Takizawa 1997 Uribe et al 2001 Garciacutea et al 2005 Blanco et al 2007 Krock et al 2009 Aacutelvarez et al 2010 2011 Loacutepez et al 2010 Pizarro et al 2011 Fux et al 2011 Trefault et al 2011)

En Magallanes ha sido reportada la presencia de okadaatos (AO y DTXs) asociadas a la presencia de Dinophysis acuminata (Uribe et al 2001) Tambieacuten se ha reportado la presencia de yesotoxinas (YTXs) en moluscos Esta uacuteltima se sospecha estar asociada a la presencia de la especie Protoceratium reticulatum comprobada fuente primaria en Ayseacuten (Pizarro et al 2012) norte de Chile (Aacutelvarez et al 2011) y ampliamente conocida como tal a nivel mundial

Durante el periodo estival de 2013 en la regioacuten de Magallanes ocurrioacute una floracioacuten de dinoflagelados entre los que destacaron Dinophysis acuminata y Protoceratium reticulatum Tal floracioacuten se mantuvo intensa entre diciembre 2012 y febrero 2013 lo que permitioacute recolectar muestras de transvectores y microalgas para establecer yo confirmar los perfiles de toxinas lipofiacutelicas respectivas mediante LC-MSMS particularmente en una regioacuten con muy poca informacioacuten al respecto

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2 OBJETIVOS 21 General del proyecto

Establecer mediante LC-MSMS los perfiles de toxinas lipofiacutelicas en muestras de moluscos y de plancton recolectadas durante la floracioacuten de dinoflagelados ocurrida durante el verano 2013 en la regioacuten de Magallanes

22 Objetivo especiacutefico

Establecer los perfiles de toxinas lipofiacutelicas en transvectores centinelas fitoplancton y microalgas aisladas por micromanipulacioacuten recolectados en diferentes sectores de Magallanes durante el monitoreo regular realizados durante una floracioacuten de Dinophysis spp y Protoceratium reticulatum

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3 METODOLOGIacuteA En esta seccioacuten se describen las metodologiacuteas asociadas a las actividades realizadas para el logro de los objetivos asiacute como tambieacuten los conceptos e ideas que la fundamentan

31 Obtencioacuten del extracto - Carne de mariscos Dependiendo de la cantidad de material se procesoacute soacutelo el hepatopaacutencreas

o carne total Se maceroacute y pesoacute el material Se realizoacute extraccioacuten con metanol en una de 11 pv Los extractos fueron centrifugados y el sobrenadante filtrado por filtros de nylon de 045 microm y vaciado a un vial

- Extracto en metanol de muestras de fitoplancton (ie el ensamble total de microalgas sin separar

especies) Aliacutecuotas de agua previamente filtradas por malla de 250 microm para eliminar el zooplancton de tamantildeo mayor fueron filtradas en filtros de fibra de vidrio muflados de 13 mm de diaacutemetro (tamantildeo de poro nominal de 07 microm) Los filtros fueron puestos por separado seguacuten sitio de recolecta y fecha en ependorfs de 15 ml y congelados hasta ser extraiacutedos con 1 mL de metanol centrifugados El sobrenadante fue filtrado por filtros de nylon de 045 microm y vaciado a un vial

- Extracto en metanol de D acuminata y P reticulatum La microalgas aisladas por

micromanipulacioacuten bajo un microscopio invertido (siempre y cuando el nuacutemero de D acuminata y de P reticulatum fuera suficiente como para lograr reunir un nuacutemero cercano a las 30 ceacutelulas por cada especie) fueron puestas en un ependorf de 15 ml con 1 ml de metanol Para obtener el extracto de toxina las muestras fueron mezcladas en vortex y filtradas por filtros de nylon de 045 microm El extracto filtrado fue puesto en un vial Solo en una ocasioacuten fue posible acumular un nuacutemero suficiente de ceacutelulas de D acuta por ello fue posible obtener solo una muestra para esta especie

- Todos los extractos fueron secados con nitroacutegeno gas a 38ordmC Este proceso evita los problemas

de traslado de extractos en solventes orgaacutenicos y yo evitar eventuales peacuterdidas de liacutequidos en las muestras durante el trayecto

32 Laboratorio de anaacutelisis dotado de LC-MSMS La metodologiacutea para el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas se realizoacute mediante espectrometriacutea de masas acoplada a un cromatoacutegrafo liacutequido (LC-MSMS) Por tratarse de una teacutecnica auacuten no implementada en Chile en aspectos de determinacioacuten de toxinas marinas a nivel comercial y certificada ni tampoco para realizar investigacioacuten baacutesica de rutina fue necesario enviar las muestras a un laboratorio extranjero certificado Tal laboratorio pertenece al Instituto Tecnoloacutegico del Mar (INTECMAR) Galicia Espantildea

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El contacto se realizoacute a traveacutes de grupos de investigacioacuten extranjeros de vasta y reconocida experiencia en el tema para prospectar la factibilidad de donde realizar los anaacutelisis Los mismos aconsejaron al laboratorio perteneciente a INTECMAR INTECMAR es una entidad de investigacioacuten estatal encargada de realizar los monitoreos semanales en Galicia donde tambieacuten se encuentra fiacutesicamente su sede Actualmente estaacute certificada para la deteccioacuten de toxinas lipofiacutelicas en moluscos entre otros anaacutelisis que realiza (Anexo 1 y 2) El Anexo 2 contiene el costo del anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas (equivalente a cotizacioacuten) El laboratorio seleccionado posee un cromatoacutegrafo UPLC Acquity Waters acoplado a un triple cuadrupolo Waters Xevo TQ con la suficiente sensibilidad en la deteccioacuten de toxinas en microalgas aisladas por micromanipulacioacuten sensibilidad que fuera confirmada anteriormente al establecer cuantitativamente el perfil de toxinas lipofiacutelicas en muestras de microalgas aisladas desde muestras de sedimentos de Magallanes (ver Anexo 3) Previo al enviacuteo de extractos de moluscos y contrato de ensayo de anaacutelisis exigido por INTECMAR se realizoacute la consulta acerca de nuestro intereacutes tambieacuten por analizar toxinas en microalgas aun cuando no estuviesen certificados en esta matriz en particular La solicitud de anaacutelisis fue aceptada por parte de INTECMAR Una vez aceptado el contrato de ensayo por parte de INTECMAR (Anexo 4) se procedioacute entonces a enviar las muestras de 29 extractos de microalgas y 29 extractos de moluscos mientras INTECMAR facturoacute por costos de anaacutelisis solicitados por IFOP en el contrato de ensayo (Anexo 5) Si bien el nuacutemero de extractos obtenidos fue cercano a las 140 muestras el nuacutemero de muestras enviadas se ajustoacute al presupuesto otorgado para este proyecto al mismo tiempo que la informacioacuten obtenida fuera suficiente como para tener una visioacuten regional de los perfiles de toxinas que estuvieron presentes durante la floracioacuten estival de 2013 33 Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por LC-MSMS

Las toxinas lipofiacutelicas a determinar en las muestras fueron aacutecido okadaico (AO) dinofisistoxina-2 (DTX2) dinofisistoxina-1 (DTX1) pectenotoxinas (PTX1 PTX2) azaspiraacutecidos (AZA1 AZA2 AZA3) yesotoxinas (YTX homoYTX 45OHYTX 45OHhomoYTX) y espiroacutelidos (SPX1) El anaacutelisis se realizoacute con los siguientes elementos

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Equipos

Sistema cromatograacutefico Acquity Ultra Performance (Coacutedigo B191C)

Espectroacutemetro de masas equipado con interfase ESI y taacutendem MSMS Xevo TQMS (Coacutedigo B192C)

Software del programa TargetLynx (Coacutedigo 196)

Columna cromatograacutefica de fase reversa C18 17 microm 21 x 100 mm Acquity UPLC BEH

Reactivos y disolventes

Metanol grado HPLC gradiente

H2O Milli-Q Ellix

Acetonitrilo grado HPLC o Hipergrado para LC-MS

Acido foacutermico 98-100

Hidroacutexido amoacutenico 25

MeOHAgua 50

AcetonitriloAgua 90

Aacutecido clorhiacutedrico 37

Disolucioacuten de aacutecido clorhiacutedrico 25 M Hidroacutexido Soacutedico (le 99 pureza)

Disolucioacuten de hidroacutexido soacutedico 25 M

Disolventes cromatograacuteficos

Disolucioacuten tampoacuten hidroacutexido amoacutenico al 0125

Fase moacutevil A Agua conteniendo 67 mM de NH4OH

Fase moacutevil B Acetonitrilo conteniendo 67 mM de NH4OH

Cada fase moacutevil se filtra a vaciacuteo a traveacutes de filtros de membrana de nylon de 022 microm

Toxinas de Referencia

Disolucioacuten certificada de aacutecido ocadaico en metanol (NRC CRM-OA-c) Cod PB015

Disolucioacuten certificada de Yessotoxina Yessotoxin di-sodium salt en metanol (CRM-00-YTX) Cod PB018

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Disolucioacuten certificada de Homo-yessotoxina 1aHomoyessotoxin di-sodium salt en metanol (CRM-00-hYTX) Cod PB019

Disolucioacuten certificada de calibracioacuten de Azaspiraacutecido 1 en metanol (NRC CRM-AZA1) Cod PB020

Disolucioacuten certificada de calibracioacuten de Azaspiraacutecido 2 en metanol (NRC CRM-AZA2) Cod PB021

Disolucioacuten certificada de calibracioacuten de Azaspiraacutecido 3 en metanol (NRC CRM-AZA3) Cod PB022

Disolucioacuten de calibracioacuten de Dinofisistoxina 2 en metanol (00-DTX2) Cod PB026

Disolucioacuten de calibracioacuten de Dinofisistoxina 1 en metanol (CRM-00-DTX1) Cod PB032

Disolucioacuten de calibracioacuten de Pectenotoxina 2 en metanol (00-PTX2) Cod PB031

Material de Referencia Certificado (Mussel Tissue Reference Material for DSP Toxins NRC CRM-DSP-Mus-b) con AO y DTX1 101 plusmn 08 microgg y 13 plusmn 02 microgg respectivamente Homogeneizado de mejilloacuten (Mytilus edulis) Cod PB014

Material de Referencia Certificado (Mussel Tissue Reference Material for AZA Toxins NRC CRM-AZA-Mus) con AZA1 116 plusmn 010 microgg AZA2 0273 plusmn 0023 microgg y AZA3 0211 plusmn 0022 microgg Homogeneizado de mejilloacuten (Mytilus edulis) Cod PB030

Disolucioacuten certificada de calibracioacuten de 13-dismetil espiroacutelido C en metanol (NRC CRM-SPX1) Cod PB027

La Tabla 1 muestra las condiciones cromatograacuteficas usando una columna de UPLC C18 en fase reversa y medio baacutesico mientras que los paraacutemetros de la fuente de ionizacioacuten para el Xevo TQMS (Waters) se muestran en la Tabla 2

34 Extraccioacuten de toxinas

A los extractos metanoacutelicos en seco de las 29 muestras de moluscos y 29 muestras de microalgas se le adicionaron hasta un total de 25 mL de metanol dispensadas en pequentildeas aliacutecuotas agitando el vial con un vortex durante 30 segundos Anaacutelisis de las formas libres del AO DTX1 y DTX2 y de las toxinas de los grupos PTXs AZAs y YTXs Para la determinacioacuten de las formas libres del AO DTX1 y DTX2 y de las toxinas de los grupos PTXs AZAs y YTXs se filtroacute un volumen de aproximadamente 12 ml del extracto metanoacutelico a traveacutes de filtros

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de jeringa de 045 microm para su posterior hidroacutelisis (seccioacuten siguiente) Otra aliacutecuota del mismo extracto filtrada a traveacutes de filtro de jeringa compatible con el disolvente de 022 microm se diluyoacute a la mitad con MeOH 100 y se inyectoacute 5 microl en el sistema LC-MSMS Hidroacutelisis y cuantificacioacuten del contenido total de AO DTX1 y DTX2 Para detectar y cuantificar el contenido total de AO DTX1 y DTX2 se requiere una hidroacutelisis baacutesica previa a la inyeccioacuten de los extractos en el sistema de LC-MSMS Procedimiento En un vial que contiene 1 ml de extracto metanoacutelico previamente filtrado por filtros de jeringa de 045 microm se antildeaden 125 microl de NaOH 25 M se agita manualmente 10 segundos y la mezcla fue sometida a 76 plusmn 4 ordmC durante 40 minutos en un bantildeo Se enfrioacute a temperatura ambiente se pesoacute y luego neutralizoacute con 125 microl de HCl 25 M Finalmente se homogenizoacute nuevamente con el vortex durante 30 segundos Una aliacutecuota del extracto resultante se filtroacute con filtros de jeringa de 022 microm y diluyoacute 58 con MeOH 100 Una aliacutecuota de 5 microl fue inyectada en el sistema de LC-MSMS Durante el proceso de hidroacutelisis el vial debe estar bien cerrado para evitar peacuterdidas por evaporacioacuten (la temperatura de ebullicioacuten del MeOH es 65 ordmC) Las peacuterdidas se pueden detectar mediante pesada del vial antes y despueacutes de la hidroacutelisis en caso de confirmarse se completaraacute el peso con metanol La deteccioacuten con el espectroacutemetro de masas se realizoacute usando dos transiciones por toxina la de mayor intensidad se utilizoacute para cuantificar y la de menor intensidad para confirmar (Tabla 3) Identificacioacuten y Confirmacioacuten La identificacioacuten de la presencia de toxinas se realizaraacute por comparacioacuten del tiempo de retencioacuten de cada una de las toxinas en la muestra con el tiempo de retencioacuten obtenido en las disoluciones de calibrado estaacutendar inyectadas en un mismo diacutea de anaacutelisis Se permite una desviacioacuten maacutexima entre ambos tiempos del 25 Para las toxinas que se cuantifican con la recta de calibrado del anaacutelogo correspondiente se establece un TRR con una tolerancia seguacuten se indica en la Tabla 4 Para una correcta identificacioacuten se exige una separacioacuten entre picos calculada mediante aplicacioacuten de la expresioacuten

2 x (RT2-RT1) RS = ----------------------

(W1+W2)

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En donde RT1 y RT2 y W1 y W2 son respectivamente los tiempos de retencioacuten y las anchuras en la liacutenea base de dos picos adyacentes RT2gtRT1 La resolucioacuten seraacute aceptable cuando Rs gt10 y la resolucioacuten a liacutenea base se consideraraacute completa cuando Rs gt15 La confirmacioacuten de la presencia de toxina seguacuten el criterio de la Decisioacuten de la Comisioacuten 2002657EC se basa en la relacioacuten entre las dos transiciones empleadas para la determinacioacuten (cuantificacioacuten y confirmacioacuten)

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4 RESULTADOS

41 Toxinas en moluscos

Las toxinas detectadas en moluscos fueron PTX2 YTX 45OHYTX DTX1 y SPX1 (Tabla 5) La mayor concentracioacuten la presentoacute el grupo de las YTXs (40-294 microg kg-1) en muestras de choritos provenientes del sector de Seno Otway (Fig 1) En este mismo sector las PTXs tambieacuten presentaron las mayores concentraciones (3-45 microg kg-1) en estos transvectores En el caso del ostioacuten tanto el PTX2 como las YTXs fueron detectadas en el contenido gaacutestrico El DTX1 fue detectado en choritos (1-18 microg kg-1 considerando DTX1 libre y total) procedentes del sector Seno Otway y sectores adyacentes a Punta Arenas El AO no fue detectado en ninguna aacuterea de la Regioacuten Los SPXs fueron principalmente detectados en choritos de las aacutereas centro y sur de Magallanes y en una estacioacuten del estero Peel (M13) en el aacuterea norte de la regioacuten No obstante que los niveles son muy bajos (01- 25 microg kg-1) incluso del nivel letal 50 en ratones inyectados intraperitonealmente 40 microg kg-1 (Richard et al 2000) los valores encontrados son iguales o mayor al encontrado en el caracol piquilhue recolectado en julio de 2012 y que en ese entonces produjo la muerte de ratones provocando el cierre de aacutereas de extraccioacuten por la autoridad de salud regional (Anexo 6) De las cinco toxinas detectadas en los moluscos solo DTX1 mostroacute estar localizada en el aacuterea centro de Magallanes mientras que las restantes fueron detectadas en las tres aacutereas de monitoreo Norte centro y sur de Magallanes No se encontraron PTX1 DTX2 ni AZPs en las muestras de moluscos Los resultados muestran que de los cuatro grupos de toxinas PTX YTXs DTXs y SPXs tres de ellas pueden estar presentes simultaacuteneamente en los moluscos vale decir PTXs YTXs y DTX1 o bien SPXs en vez de DTX1 42 Toxinas en microalgas

En las microalgas se detectaron PTXs y YTXs (Tabla 6) Las PTXs fueron detectadas aunque a nivel de trazas en ceacutelulas de D acuminata seleccionadas por micromanipulacioacuten desde muestras de agua procedentes de estero Silva Palma (M25) estero Wickham (M26) y Cutter Cove (M29) (Fig1) Tambieacuten fue detectada en filtrados de agua (fitoplancton) de Pto Fontaine (M21) e I Engelfield (M29N1) Las YTXs fueron detectadas en ceacutelulas de P reticulatum seleccionadas por micromanipulacioacuten y en cultivos de esta microalga que se logroacute establecer a partir de muestras de agua provenientes de C Adalberto (M04) Cutter Cove (M29) e I Engelfield (M29N1) Solo en los cultivos se detectoacute

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homoYTX y en uno de ellos tambieacuten se detectoacute aunque miacutenimamente 45OHYTX un derivado de la YTX que normalmente se encuentra en los moluscos como producto de bio-transformacioacuten La presencia de 45OHYTX en el cultivo pudo deberse a la presencia de ceacutelulas ya en fase de declinacioacuten de la curva de crecimiento

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5 ANAacuteLISIS Y DISCUSIOacuteN DE LOS DATOS

51 Toxinas en moluscos De las toxinas lipofiacutelicas se sabe que AO DTXs y AZAs causan trastornos gastrointestinales en los seres humanos (Gerssen et al 2010) Para las toxinas restantes (YTXs PTXs y SPXs) auacuten cuando no se han reportado casos de intoxicacioacuten en los seres humanos eacutestas son letales o altamente toacutexicas cuando los ratones son inyectados por viacutea intraperitoneal (Paz et al 2008 Richard et al 2000 Miles et al 2004) Es el caso de los SPXs la toxicidad en ratones inyectados por viacutea intraperitoneal supera a la del resto de las toxinas pues su dosis letal 50 es de 40 microg kg-1 (Richard et al 2000) Tal es asiacute que como referencia (Tabla 5) el transvector caracol piquilhue recolectadas en Julio de 2012 y cuyos niveles de toxicidad provocaron la muerte de los ratones solo presentoacute 01 microg kg-1 deteccioacuten que fue realizada durante este estudio en muestras de carne almacenadas durante no maacutes de 1 antildeo a -20 ordmC Sin embargo no se puede descartar una peacuterdida de la actividad por transformacioacuten durante el periodo de conservacioacuten A excepcioacuten de los SPXs el resto de las toxinas mencionadas estaacuten reguladas por la legislacioacuten europea tanto para consumo interno como importacioacuten de moluscos y tunicados para garantizar la salud de las personas Asiacute tambieacuten estaacuten reguladas por la legislacioacuten chilena a traveacutes del Instituto de Salud Puacuteblica (ISP) estableciendo los mismos niveles de referencia europeo en base al bioensayo ratoacuten Aun cuando los niveles de toxinas detectadas en los moluscos durante este estudio estaacuten por debajo de lo exigido por las regulaciones e incluso de los niveles propuestos por el EFSA (Tabla 7) la presencia de dos y tres tipos de toxinas en los moluscos representa una complejidad en la determinacioacuten de los niveles de toxicidad especialmente si se encuentran presentes toxinas altamente toacutexicas para ratones inyectados intraperitonealmente como son los SPXs Aunque se sospechaba la concurrencia de diferentes tipos de toxinas tal hecho no habiacutea sido confirmado anteriormente Sin embargo los SPXs siguen siendo una incoacutegnita pues se desconoce la fuente de estas toxinas A ostenfeldii la especie que podriacutea ser candidata a confirmar estuvo ausente (Tabla 8 modificado de Guzmaacuten et al 2014) durante el periodo en que se detectoacute en los moluscos Los escasos antecedentes toxigeacutenicos de esta especie en Chile la han confirmado como productora de toxinas paralizantes en Ayseacuten (Pizarro et al 2012) pero no de SPXs No obstante la produccioacuten de SPXs por esta especie en la regioacuten de Magallanes auacuten no se puede descartar Las YTXs fueron las toxinas maacutes abundantes en los moluscos analizados condicioacuten que se corresponde con la alta abundancia relativa de esta especie en el ambiente (Tabla 8) en la mayoriacutea de los casos (Tabla 5)

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Los resultados sugieren que los falsos positivos por bioensayo ratoacuten pudieran ser maacutes frecuentes de lo que se piensa actualmente para la regioacuten de Magallanes 52 Toxinas en microalgas Los resultados indican que P reticulatum encontrado en Magallanes producen YTXs al igual que las especies reportadas en la regioacuten de Antofagasta y Ayseacuten (Aacutelvarez et al 2011 Pizarro et al 2012) Tal resultado hace altamente probable que esta especie es la fuente de YTXs detectadas en los moluscos durante el periodo de estudio De acuerdo a las toxinas detectadas en las muestras de D acuminata aisladas asiacute como en el fitoplancton con gran abundancia de esta especie (Tabla 8) sugiere que esta microalga podriacutea ser una fuente primaria de PTXs tal como ocurre en el norte y sur del paiacutes (Blanco et al 2007 Fux et al 2011) Aunque la especie tambieacuten ha sido asociada a la presencia de DTX1 en moluscos en un evento toacutexico ocurrido en 1998 en Magallanes (Uribe et al 2001) el DTX1 no fue detectado en las muestras de D acuminata durante este estudio El no hallazgo de DTX1 en estas muestras pudo deberse a una fuente microalgal distinta como D acuta yo P lima D acuta ha sido asociada a DTX1 en moluscos de la regioacuten de Ayseacuten (Lembeye et al 1993 y Zhao et al 1993) mientras que P lima es productora solo de DTX1 en la regioacuten de Magallanes (Salgado et al 2012) Sin embargo cuando se detectoacute DTX1 en las muestras de moluscos durante este estudio D acuta estuvo ausente en las muestras de agua mientras que D acuminata presentoacute una abundancia relativa alta Por otro lado el volumen de resuspensioacuten de los extractos pudo ser elevado al seguir el mismo procedimiento protocolar que se aplica a las muestras de moluscos de acuerdo a la normativa europea actual Por tal razoacuten el LC-MSMS no logroacute detectar PTXs ni DTX1 en las muestras de microalgas En estos casos un protocolo para el anaacutelisis de las microalgas debiera incluir un volumen menor de resuspensioacuten de los extractos secos en referencia al utilizado para los moluscos o bien seleccionar por micromanipulacioacuten un nuacutemero mayor de microalgas (gt 130 ceacutelulas) Sin embargo esto uacuteltimo es maacutes difiacutecil de lograr en latitudes australes debido a la baja densidad de ceacutelulas en las que se presenta normalmente esta especie en condiciones naturales Por tal motivo se recomienda realizar pruebas con un volumen de resuspensioacuten menor a 1 mL aun cuando se trate de un LC-MSMS triple cuadrupolo

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13

6 CONCLUSIONES

a Los moluscos de la regioacuten de Magallanes pueden presentar PTX2 YTX 45OHYTX DTX1 y SPX1

b El hecho que los moluscos puedan presentar dos o maacutes tipos de toxinas lipofiacutelicas dificulta establecer el nivel de toxicidad total

c P reticulatum en Magallanes produce YTXs al igual que la especie del norte y sur del paiacutes

d La abundancia relativa ambiental de P reticulatum durante el periodo de estudio coincidioacute con la presencia de YTXs en los moluscos

e Los SPXs encontrados anteriormente en caracoles piquilhue tambieacuten fue posible detectarlos en choritos durante este estudio

f Auacuten queda por confirmar el tipo de SPXs presentes y su eventual fuente primaria La presencia de SPXs en los moluscos no siempre coincidioacute con la presencia de A ostenfeldii en el ambiente y su abundancia relativa maacutexima fue solo de nivel 1 (raro) durante el periodo de estudio

g La PTX2 detectada en los moluscos coincidioacute con una alta abundancia relativa ambiental de D acuminata No obstante auacuten queda por confirmar si esta especie es la fuente primaria Para ello se hace necesario ajustar (disminuir) el volumen de dilucioacuten de los extractos secos de microalgas aisladas por micromanipulacioacuten aun cuando se trata de un espectroacutemetro de masas como un triple cuadrupolo

h La deteccioacuten de DTX1 en los moluscos coincidioacute con la ausencia de D acuta en el ambiente La toxina tampoco fue detectada en los moluscos cuando esta microalga estuvo a niveles de 2 y 3 (escaso y regular) Queda por confirmar la produccioacuten de DTX1 por esta especie en Magallanes

i No se encontraron PTX1 DTX2 ni AZPs en las muestras de moluscos durante el periodo de estudio

j Los resultados demuestran la presencia de toxinas en los moluscos que se hace necesario identificar y cuantificar utilizando teacutecnicas distintas al bioensayo

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F I G U R A

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Figura 1 Estaciones y sectores muestreados (ciacuterculo rojo) y sector Fortuna donde fue recolectado el

caracol piquilhue (ciacuterculo amarillo)

T A B L A S

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Tabla 1 Condiciones cromatograacuteficas para el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas usando

una columna de UPLC C18 en fase reversa y medio baacutesico

Columna Acquity UPLC BEH C18 17 microm 21x100 mm

Temperatura columna 45 ordmC

Flujo 04 mlmin

Volumen inyeccioacuten 5 microl

Temperatura muestras 10 plusmn 5 ordmC

Gradiente

Tiempo (min) Fase A () Fase B ()

0 75 25

066 75 25

330 5 95

528 5 95

726 75 25

900 75 25

Tabla 2 Paraacutemetros de la fuente de ionizacioacuten para el Xevo TQMS (Waters) en la determinacioacuten de toxinas lipofiacutelicas

PARAacuteMETROS DE LA FUENTE

ESI- ESI+

AO DTX2 DTX1 YTX homoYTX 45OH YTX y 45OH

homoYTX

AZA1 AZA2 AZA3 PTX2 PTX1 y SPX1

Voltaje de capilar (V) 100 200

Temperatura de solvatacioacuten (ordmC) 450 450

Flujo gas de solvatacioacuten (lh) 850 850

Flujo gas cono (lh) 50 50

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Tabla 3

Resumen de las condiciones de espectrometriacutea de masas empleadas con el Xevo TQMS (Waters) en el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas

Compuesto tR (min)

ESI

Ioacuten Precursor

(mz)

Ioacuten Producto

(mz)

Dwell time (s)

Energiacutea colisioacuten

(eV)

Voltaje cono (V)

AO 189 NEG 8035 2552 0010 46 86

113 0010 56 86

DTX2 210 NEG 8035 2552 0010 46 86

113 0010 56 86

DTX1 214 NEG 8175 5634 0010 43 86

2552 0010 48 86

YTX 202 NEG 5704 4674 0010 30 45

3963 0010 35 45

45OH-YTX 182 NEG 5784 4674 0010 30 45

3964 0010 30 45

HomoYTX 203 NEG 5775 4744 0010 30 48

4034 0010 30 48

45OH-homoYTX 182 NEG 5855 4034 0010 30 45

4744 0010 30 45

PTX1 306 POS 8925 8395 0015 25 36

8215 0015 25 36

PTX2 362 POS 8765 8415 0015 20 36

8235 0015 25 36

AZA1 263 POS 8425 6545 0015 55 50

3622 0015 50 50

AZA2 270 POS 8565 6725 0015 45 27

6545 0015 45 27

AZA3 236 POS 8285 6404 0015 55 47

3622 0015 55 47

SPX1 368 POS 6925 6744 0015 27 60

1643 0015 42 60 Transicioacuten cuantificadora

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Tabla 4 TRR y valores de tolerancia para las toxinas analizadas

TOXINA TRR TOLERANCIA

Toxinas del grupo de AO

AO 1000 0990-1010

DTX2 1040 1014-1066

DTX1 1140 1111-1168

Toxinas del grupo de PTX

PTX2 1000 0990-1010

PTX1 0850 0829-0871

Toxinas del grupo de YTX

YTX 1000 0990-1010

45OH-YTX 0894 0871-0916

Homo YTX 1000 0990-1010

45OH-homoYTX 0899 0876-0921

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Tabla 5 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de moluscos

Nordm estMes

recolectaLocalidad Molusco

cuerpo

enterohepat

gramos

carne

toxicidad

VDM ratoacuten

PTX2

(ugKg)

YTX

(ugKg)

45OHYTX

(ugKg)

DTX1

libre

(ugKg)

DTX1

total

(ugkg)

SPX 1

(ugKg)

M13 ene-13 E Peel chorito x 5086 + 01 02

M13 ene-13 E Peel ostioacuten x 5155 No real izado 16 21

M33 ene-13 B Bell chorito x 5253 + 04

M37 ene-13 B Agua Fresca chorito x 5039 + 05 01

M35 ene-13 C San Isidro chorito x 5289 + 000 01

M42 ene-13 V Holanda chorito x 5231 + 06 13

M43 ene-13 B Yendegaia chorito x 5193 + 04 25

M45 ene-13 Pto Williams chorito x 5161 - 28 07

M08 feb-13 E Falcon cholga x 5027 - 14

M09 feb-13 E Penguumlin cholga x 5103 + 14

M22 feb-13 E de las Montantildeas cholga x 5052 - 26

M23 feb-13 I Ballesteros cholga x 5204 - 87

M24 feb-13 B Fanny chorito x 2016 - 38 1071 479 12

M25 feb-13 E Silva Palma chorito x 1447 - 59 1077 898 09

M26 feb-13 E Wickham chorito x 1093 - 194 2940 2232 66 66

M27 feb-13 E Sullivan chorito x 1137 - 450 1944 1478

M28 feb-13 E Nuntildeez chorito x 1179 + 33 721 407

M29 feb-13 Cutter Cove chorito x 1003 - 65 501 309

M29N1 feb-13 I Engelfield chorito x 1116 - 297 2007 1483

M31 feb-13 B Nash chorito x 2231 +

M33 feb-13 B Bell chorito x 1181 - 93

M34 feb-13 S Pedro chorito x 0726 -

M35 feb-13 C San Isidro chorito x 1178 + 110

M36 feb-13 B Buena chorito x 1367 +

M37 feb-13 B Agua Fresca chorito x 0850 + 45 100 80

M39 feb-13 Pto Zenteno chorito x 3241 + 28

M39N2 feb-13 Pta San Valentin chorito x 1712 - 11

M39N3 feb-13 Pto Yartou chorito x 2035 - 11

sector

Fortunajul-12 B Inuacutetil

caracol

piquilhuex 107000 + 01

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Tabla 6 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de microalgas

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Tabla 7 Niveles actualmente permitidos por la legislacioacuten europea (bioensayo) y los niveles propuestos por la

autoridad europea para la seguridad alimentaria (EFSA) (Gerssen et al 2010)

Toxin Legislacioacuten (μg kg-

1) Proposicioacuten

EFSA (μg kg-1)

Validacioacuten LC-MSMS

(μg kg-1)

OA and DTXs 160 45

PTXs 120

YTXs 1000 3750

AZAs 160 32

SPXs 400 (Gerssen et al2010)

European Food Safety Authority Decisioacuten 2002657 de la Unioacuten Europea EC Incluye PTXs

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Tabla 8 Abundancia relativa ambiental de las microalgas al momento de recolectar las muestras de moluscos En rojo se indica la deteccioacuten de toxina positiva en los moluscos asociada a la supuesta microalga fuente PTXs (D

acuminata) YTXs (P reticulatum) SPXs (A ostenfeldii) DTX1 (A acuta)

(Tabla modificada de Guzmaacuten et al 2014)

A N E X O S

ANEXO 1

Certificacioacuten laboratorio INTECMAR

ANEXO 2

Lista de anaacutelisis que realiza INTECMAR y sus costos (en euros) 2013

scv 1 de 7

GUIA PARA LA AUTOLIQUIDACIOacuteN DE TASAS A FAVOR DE LA COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA 2013 Los aspectos financieros de los servicios prestados por Intecmar en el marco de su actividad e vienen regulados en la Ley 62003 de 9 de diciembre de tasas precios y exenciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia (DOG nuacutem 240 de 11122003) y fueron actualizados posteriormente en la Ley 142010 de 27 de diciembre de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2011 (DOG nuacutem 250 de 30122010) y en la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013 (DOG nuacutem 42 de 28022013) Existen dos maneras de liquidar las tasas correspondientes a los servicios prestados por Intecmar

1 De forma manual cubriendo el modelo A de autoliquidacioacuten que se descarga en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda y que adjunto en pdf y se lleva al banco para su pago httpwwwconselleriadefacendaeswebportalconfeccion-impresos

2 De forma telemaacutetica en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda viacutenculo httpshostcixtecesXEITObinlionwebXeitodllxmit a traveacutes del modelo 730

Ambos modelos de liquidacioacuten de tasas adjuntamos ejemplo al final de este documento deben ser remitidos por mail a Intecmar con el sello del banco fiacutesico o virtual como paso previo a la emisioacuten del certificado Los coacutedigos generales necesarios son

minus Consejeriacutea de Medio Rural y de Mar Coacutedigo 09 minus Delegacioacuten de Pontevedra Coacutedigo 40 minus Servicio de Intecmar Coacutedigo 24

Los coacutedigos y descripcioacuten de las tasas son los regulados en la legislacioacuten vigente y los hemos resumido en los anexos siguientes Vilaxoaacuten 4 de marzo de 2013

scv 2 de 7

TARIFAS DE TASAS VIGENTES PARA 2013 - Ley 22013 d e 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013

(DOG nuacutem 42 de 28022013)

Estas tarifas son consecuencia de la actualizacioacuten de las tarifas contenidas en los anexos 1 2 3 4 y 5 de la Ley 62003 del 9 de diciembre de tasas precios y exacciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia por la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 Seraacuten aplicables desde el diacutea de la entrada en vigor de la Ley de

presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 TASA POR SERVICIOS ADMINISTRATIVOS

No sujecioacuten No se exigiraacute la tasa por servicios administrativos cuando se trate de compulsas o cotejos de documentos que deban acompantildear a solicitudes escritos o comunicaciones presentadas por el ciudadano y realizadas en el aacutembito de actuacioacuten de los registros seguacuten lo dispuesto en el artiacuteculo 385 de la Ley 301992 del 26 de noviembre de reacutegimen juriacutedico de las administraciones puacuteblicas y del procedimiento administrativo comuacuten

Excepciones Estaraacuten exentos de la presente tasa

1- La expedicioacuten de certificados de retribuciones satisfechas por la Xunta de Galicia con el objeto de justificacioacuten en relacioacuten con el impuesto sobre la renta de las personas fiacutesicas

2- La expedicioacuten de certificados y compulsa que el personal de la Administracioacuten solicite respecto a las necesidades propias del puesto de trabajo o relacioacuten de servicios

3- Los alumnos por cualquier actuacioacuten en materia de ensentildeanzas no universitarias

scv 3 de 7

4- Las compulsas realizadas en las oficinas de empleo para los desempleados en la tramitacioacuten de expedientes que sean competencia de dichas oficinas

5 La inscripcioacuten en las convocatorias para a seleccioacuten de personal de la comunidad autoacutenoma despueacutes de justificacioacuten documental solicitada por

- Personas con discapacidad igual o superior al 33 - Personas que sean miembros de familias numerosas clasificadas en la

categoriacutea especial Se aplicaraacute una bonificacioacuten del 50 a la inscripcioacuten solicitada por - Personas que sean miembros de familias numerosas de categoriacutea

general - Personas que figurasen como demandantes de empleo desde por lo

menos seis meses antes a la fecha de la convocatoria de pruebas selectivas de personal en las que soliciten su participacioacuten y no esteacuten percibiendo prestacioacuten o subsidio por desempleo

6- La expedicioacuten de certificados relativos a la situacioacuten fiscal 7- El Estado y los demaacutes entes puacuteblicos territoriales o institucionales

siempre que los servicios o actividades de que sean beneficiarios se presten o se realicen en el marco del principio de colaboracioacuten entre administraciones

8- Las viacutectimas de actos terroristas asiacute como sus coacutenyuges y sus hijos por cualquier actuacioacuten en materia educativa realizada en centros oficiales de estudios en todos los niveles de ensentildeanza

9- Los miembros de los organismos consultivos de la Administracioacuten puacuteblica gallega respecto de los certificados emitidos por dichos organismos

COacuteDIGO TASAS

DESCRIPCIOacuteN IMPORTE euro

314400 Prestacioacuten de servicios en el Instituto Tecnoloacutegico para el Control del Medio Marino de Galicia

314401 Anaacutelisis de biotoxinas marinas en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de Yasumoto 1978 4752

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en rato segundo o meacutetodo de Yasumoto 1984 5432

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS)

9520 -Anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten

seguacuten el meacutetodo de la AOAC 4752

scv 4 de 7

-Anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo da AOAC 4752

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1978 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10186

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1984 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10865

-Anaacutelisis combinada en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS) anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo AOAC y anaacutelisis de toxicidad de tipo ASP por cromatografiacutea liquida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo de la AOAC 15000

314402 Anaacutelisis de muestras en agua de mar -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton marino mediante

microscopiacutea oacuteptica 15133 -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton toacutexico marino

mediante microscopiacutea oacuteptica 13333 - Anaacutelisis de carbono orgaacutenico disuelto 5093 -Anaacutelisis de nutrientes inorgaacutenicos disueltos 3500 -Anaacutelisis de pigmentos fotosinteacuteticos (clorofila ldquoardquo) por

espectrofluorimetria 1698 314403 Anaacutelisis microbioloacutegicos en moluscos y otros organismos

procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Cuantificacioacuten de E Coli 10186 - Deteccioacuten de Salmonella spp 16975 -Enumeracioacuten de Escherichia coli en moluscos bivalvos

vivos por la teacutecnica de medida directa de impedancia con el sistema BacTrac 4300 6800

314404 Anaacutelisis de contaminantes de origen quiacutemica en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Determinacioacuten de metales pesados (Pb Cd Cu Zn As Hg Ni Cr Ag) mediante espectrofotometriacutea de absorcioacuten atoacutemica por metal

6790

-Determinacioacuten de compuestos bifenilos policlorados (PCB) mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

scv 5 de 7

-Determinacioacuten de pesticidas organoclorados mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

-Determinacioacuten de hidrocarburos aromaacuteticos policiacuteclicos (HAPs) mediante cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de fluorescencia

28200

314405 Anaacutelisis histopatoloacutegica de moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Estudio hispatoloacutegico Determinacioacuten de Bonamia Marteillia Perkinsus y otras alteraciones patoloacutegicas

101852

314406 Emisioacuten de certificaciones e informes teacutecnicos y otras actuaciones a peticioacuten del interesado

Emisioacuten de certificados a peticioacuten de los interesados sobre las actuaciones llevadas a cabo por el Instituto

1000

Emisioacuten de informes teacutecnicos a peticioacuten del interesado (euros por hora o fraccioacuten)

4000

scv 6 de 7

scv 7 de 7

ANEXO 3

Resultados de anaacutelisis en muestras de microalgas anteriormente enviadas procedentes de Magallanes por el equipo de espectrometriacutea de masas utilizado por INTECMAR Trabajo presentado a las XXXII

Congreso de Ciencias del Mar realizado en Punta Arenas 22-25 octubre de 2012

PERFIL DE TOXINAS DE PROROCENTRUM LIMA (DINOPHYCEAE) AISLADO DESDE LA COSTA DE MAGALLANES SUR DE CHILE P Salgado1 G Pizarro1 JM Franco2 P Rioboacute2 e I Bravo3

1Instituto de Fomento Pesquero (IFOP) Punta Arenas Chile gemitapizarroifopcl 2Instituto de Investigaciones Marinas (CSIC) Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea 3Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea

Prorocentrum lima (Ehrenberg) es un dinoflagelado marino bentoacutenico que se encuentra adherido generalmente

sobre macroalgas sedimentos y detrito flotante y menos comuacutenmente en el plancton (Bravo et al 2001) Es una especie neriacutetica y estuarina y su rango de distribucioacuten geograacutefica variacutea desde aguas costeras tropicales a templadas (Faust 1991) La importancia de P lima se debe a que son productoras de toxinas diarreogeacutenicas en las personas (veneno diarreico de los mariscos VDM) al igual que algunas especies de Dinophysis aunque raramente se le han asociado con episodios toacutexicos por VDM por su caraacutecter epiacutefito y bentoacutenico El complejo VDM producido por P lima incluye moleacuteculas conocidas como el aacutecido okadaico (AO) y derivados dinofisistoxinas (DTX-1 DTX-2) (Bravo et al 2001 Vale et al 2009) No obstante existen casos citados para USA donde se detectoacute toxicidad por VDM en bivalvos de cultivos asociadas a P lima aunque en bajos niveles (Maranda et al 2007a) En Canadaacute tambieacuten se llevoacute a cabo un estudio en moluscos de cultivo cuya finalidad fue determinar el origen del VDM en la que P lima fue la principal especie sospechosa tras la ocurrencia de un evento toacutexico humano por VDM ocurrido en 1998 (Levasseur et al 2003) y en antildeos anteriores (Quilliam et al 1993) Aunque Levasseur et al (2003) no logroacute probar la toxicidad de los mariscos en cultivo a causa de P lima cabe hacer notar que lo que buscaron fue OA y DTX1 no DTX 3 este uacuteltimo principal derivado de las anteriores tras su transformacioacuten en los moluscos (eg Suzuki et al 1999 Vale amp Sampayo 2002)

En consecuencia el rol de P lima en eventos toacutexicos por VDM auacuten no puede descartarse por cuanto podriacutean llegar a ser importantes en ambientes turbulentos debido a la eventual remocioacuten de microalgas adheridas en sustratos por efecto de vientos (Levasseur et al 2003) factor de importancia si se trata de sedimentos o contrariamente en zonas someras y estables de cultivos de moluscos que al mismo tiempo favorecen microambientes para sustratos en los que prolifera la epiacutefita P lima (Lawrence et al 2000) quedando expuestas a re-suspensiones temporales que favorecen la filtracioacuten de estas microalgas por los bivalvos en cultivo (Maranda et al 2007a)

Chile posee escaso conocimiento sobre esta especie en su medio natural incluido su perfil de toxinas y potencial rol en la toxificacioacuten de moluscos por VDM Por tal razoacuten resultoacute interesante aportar al conocimiento de estos aspectos en muestras de sedimentos recolectadas en el estrecho de Magallanes en las que esta especie se encontroacute inhabitualmente abundante

Las ceacutelulas utilizadas en este estudio fueron aisladas desde sedimentos superficiales (0-3 cm) recolectados en el invierno de 2010 en la localidad de cabo San Isidro durante el muestreo regular del programa de monitoreo de marea roja en la regioacuten de Magallanes En esa oportunidad se logroacute cuantificar hasta 1002 quistes tecadoscm3 de Prorocentrum lima la mayor concentracioacuten respecto a otros sitios de recolecta (Fig 1) Los sedimentos de esta localidad presentaron una coloracioacuten oscura y un fuerte olor a sulfuro de hidroacutegeno (H2S) producto de anoxia local

Se aislaron entre 27 y 87 quistes tecados (Fig 1 a) directamente desde los sedimentos mientras otras 60 ceacutelulas vegetativas (Fig 1 b) fueron aisladas luego de promover la actividad y divisioacuten de los quistes en condiciones de 15 ordmC y un ciclo de luzoscuridad de 1212 horas (Tabla 1) Para este fin se aislaron quistes tecados y trasvasijaron a placas Petri de 5 cm de diaacutemetro conteniendo 5 mL de medio de cultivo L1 Para el anaacutelisis de toxinas las ceacutelulas aisladas fueron trasvasijadas a un tubo Eppendorf de 15 mL y congelados a -80 ordmC Una aliacutecuota de sedimento huacutemedo (100 microL aproximados) tambieacuten fue vaciada en un tubo Eppendorf y congelado Para extraer la toxina se antildeadioacute 500 microL de metanol 100 a cada tubo se mezcloacute por 1 min y filtroacute por 045 microm trasvasijando a un vial El extracto fue secado bajo nitroacutegeno gas a 40 ordmC y conservado a 4 ordmC hasta su anaacutelisis Previo al anaacutelisis de toxinas los extractos fueron resuspendidos en 150 microl de metanol

La presencia de la toxina dinofisistoxina 1 (DTX-1) en las muestras (Fig2) fue confirmada en modo negativo a traveacutes de su ioacuten precursor [M-H]- mz 8175 y sus iones productos mz 5634 y 2552 mediante un cromatoacutegrafo UPLC Acquity Waters acoplado a un triple cuadrupolo Waters Xevo TQ (LC-MS) La columna utilizada fue una Acquity UPLC BEH C18 17microm 21 x 100 mm a 45 ordmC La fase moacutevil consistioacute en (A) hidroacutexido amoacutenico a pH 11 y (B) hidroacutexido amoacutenico en acetonitrilo (67 mM) con una tasa de flujo de 4 mLmin El gradiente de elucioacuten utilizado fue el siguiente mantencioacuten al 75 de A entre 0 y 066 min cambio a 5 de A entre 066 y 330 min mantener 5

de A entre 330 y 528 min recuperacioacuten del 75 de A entre 528 y 726 min mantencioacuten al 75 de A hasta 9 min Se pinchoacute 5microL de muestra en el LC-MS El contenido de DTX-1 en las muestras fue cuantificado en base al ion precursor

Los tres tipos de muestras fueron positivas a la presencia de DTX-1 pero las ceacutelulas vegetativas fueron las que presentaron un mayor contenido de DTX-1 por ceacutelula La deteccioacuten de DTX-1 en los sedimentos (Tabla 2) reflejoacute la presencia de los quistes tecados en eacutestos

Figura 1 Concentraciones de quistes tecados de Prorocentrum lima (quistescm3 de sedimento huacutemedo) en estaciones de muestreo en el Estrecho de Magallanes (M26 Estero Wickham M29N1 Isla Engenfield M31 Bahiacutea Nash M35 Cabo San Isidro M39C1 Bahiacutea Gente Grande M39C2 Bahiacutea Inuacutetil M39C3 Canal Gabriel) y Canal Beagle (M41 Ventisquero Espantildea M42 Ventisquero Holanda) (a) Quistes tecados (b) ceacutelulas vegetativas obtenidas de germinacioacuten de quistes tecados bajo condiciones de laboratorio Barra de escala 20 microm

Tabla 1 Sedimento y ceacutelulas de Prorocentrum lima aisladas para anaacutelisis de toxinas

Extracto metanoacutelico Nordm de ceacutelulas TR ngmL pg DTX-1 ceacutel

G1 quistes tecados 27 213 lt2 -

G2 quistes tecados 67 214 05 11

G3 quistes tecados 87 215 12 21

G4 ceacutelulas vegetativas 60 215 34 87

G6 sedimentos aliacutecuota 213 13 19 pg microL sed

TR tiempo de retencioacuten

Figura 2 Cromatogramas de extractos metanoacutelicos de Prorocentrum lima quistes tecados (a) ceacutelulas vegetativas (b) y sedimentos (c)

Tabla 2 Caracteriacutesticas del sedimento con quistes tecados de Prorocentrum lima

Tipo Tamantildeo (mm)

Grava 2 35

Arena media 025 - 05 32

Arena muy fina 0063 - 0125 2

Limo-arcilla lt 0063 1

Estos resultados constituyen otra eventual posibilidad de toxicidad en los moluscos por VDM no soacutelo de aquellos con modalidad de vida bentoacutenica superficial sino de aquellos que tambieacuten viven enterrados en la arena (eg almeja huepo) Maacutes auacuten si se conoce que P lima posee la capacidad de desarrollar poblaciones naturales en aguas templadas en nuacutemeros que podriacutean justificar una toxicidad por VDM en los mariscos (eg Maranda et al 2007a b)

Referencias

Bravo I ML Fernaacutendez I Ramilo amp A Martinez 2001 Toxin composition of the toxic dinofagellate Prorocentrum lima isolated from different locations along the Galician coast (NW Spain) Toxicon 39 1537ndash1545

Faust MA 1991 Morphology of ciguatera-causing Prorocentrum lima (Pyrrophyta) from widely differing sites J Phycol 27 642-648

Lawrence J E Grant J Quilliam M A Bauder A G amp Cembella A D 2000 Colonizaition and growth of the toxic dinoflagellate Prorocentrum lima and associated fouling macroalgae on mussels in suspended culture Mar Ecol Prog Ser 201 147-154

Levasseur M Couture J Y Weise A M Michaud S Elbrachter M Sauveacute G amp Bonneau E 2003 Pelagic and epiphytic summer distributions of Prorocentrum lima and P mexicanum at two mussel farms in the Gulf of St Lawrence Aquat Microbiol Ecol 30283-293

Maranda L Corwin S Dover S amp Morton S L 2007a Prorocentrum lima (Dinophyceae) in northeastern USA coastal waters II Toxin load in the epibiota and in shellfish Harmful Algae 6 632-641

Maranda L Corwin S Hargraves P E 2007b Prorocentrum lima (Dinophyceae) in 19 northeastern USA coastal waters I Abundance and distribution Harmful Algae 6 623ndash631

Quilliam MA Gilgan MW amp Pleasance S 1993 Confirmation of an incident of diarrhetic shellfish poisoning in eastern Canada In Smayda TJ Shimizu Y (Eds) Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea Elsevier New York pp 547ndash552

Suzuki T Ota H amp Yamasaki M 1999 Direct evidence of transformation of dinophysistoxin-1 to 7-O-acyl-dinophysistoxin-1 (Dinophysis-3) in the scallop Patinopecten yessoensis Toxicon 37 187-198

Vale P amp Sampayo M A 2002 First confirmation of human diarrhoeic poisonings by okadaic acid esters after ingestion of razor clams (Solen marginatus) and green crabs (Carcinus maenas) in Aveiro lagoon Portugal and detection of okadaic acid esters in phytoplankton Toxicon 40989-996

Vale P Veloso V amp Amorim A 2009 Toxin composition of a Prorocentrum lima strain isolated from the Portuguese coast Toxicon 54145ndash152

Agradecimientos Intecmar de la Xunta de Galicia Espantildea donde se realizaron los anaacutelisis de toxinas proyecto

SUBPESCA ldquoManejo y Monitoreo de Mareas Rojas en las regiones de Los Lagos Ayseacuten y Magallanes IV etapa 2010rdquo

ANEXO 4

Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten

ANEXO 5

Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de Magallanes

TASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

O

EJE

MP

LA

R P

AR

A E

L IN

TE

RE

SA

DO

LIQ

UID

AC

IOacuteN

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

EN

TID

AD

BA

NC

AR

IATASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

0 9

4 0

2 4INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

AD

MIN

IST

RA

CIOacute

NTASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

9520 euros

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

CONSELLERIA DE FACENDA

ANEXO 6

Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para cierre

de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

Seccioacuten Ediciones y Produccioacuten Almte Manuel Blanco Encalada 839

Fono 56-32-2151500 Valparaiacuteso Chile

wwwifopcl

Page 7: “Análisis de toxinas lipofílicas mediante LC-MS/MS en ...metadatos.mma.gob.cl/sinia/Informe_final_Analisis_toxinas_lipofilicas_656-055.pdfSUBSECRETARÍA DE ECONOMÍA: INFORME FINAL:

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo

v

IacuteNDICE ANEXOS

Anexo 1 Certificacioacuten laboratorio INTECMAR Anexo 2 Lista de anaacutelisis que realiza INTECMAR y sus costos (en euros) 2013 Anexo 3 Resultados de anaacutelisis en muestras de microalgas anteriormente enviadas

procedentes de Magallanes por el equipo de espectrometriacutea de masas utilizado por INTECMAR Trabajo presentado a las XXXII Congreso de Ciencias del Mar realizado en Punta Arenas 22-25 octubre de 2012

Anexo 4 Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten Anexo 5 Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de

Magallanes Anexo 6 Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para

cierre de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo

1

1 ANTECEDENTES En Chile auacuten existen escasos antecedentes acerca de las toxinas lipofiacutelicas presentes en nuestros moluscos asiacute como la fuente microalgal asociada a su produccioacuten y la variabilidad espacio-temporal de las mismas Tal situacioacuten es tambieacuten un problema en el sur austral de Chile y particularmente en Magallanes donde el historial de este tipo de toxinas ha sido opacado por la fuerte incidencia de toxina paralizante asociada a la presencia de Alexandrium catenella No obstante en los dos uacuteltimos antildeos los niveles de toxicidad por toxinas lipofiacutelicas en la regioacuten se han constituido en un problema para la autoridad de Salud pues han determinado el cierre de grandes extensiones de aacutereas a la extraccioacuten de moluscos hecho no acontecido anteriormente salvo muy local y esporaacutedicamente (eg Uribe et al 2001) ademaacutes del efecto econoacutemico y social

Dentro de las toxinas lipofiacutelicas las maacutes conocidas y frecuentes a nivel mundial por sus efectos diarreicos (veneno diarreico de los mariscos VDM) en humanos son el aacutecido okadaico y sus derivados las dinofisistoxinas (AO y DTXs) (eg Yasumoto et al 1978) tambieacuten conocidas como okadaatos Por lo mismo poseen un mayor historial de citas en la literatura cientiacutefica Los okadaatos son fuertes inhibidores de las proteiacutenas fosfatasas 1 y 2A y potenciales promotores de tumores (Yasumoto et al 1989 Fujiki et al 1989) con efectos croacutenicos desconocidos por lo que su efecto es maacutes lento Por esta razoacuten representan un riesgo para la salud puacuteblica y dan lugar a prolongadas vedas de extraccioacuten de bivalvos tanto de bancos naturales como centros de cultivo con las consiguientes peacuterdidas econoacutemicas para el sector pesquero y acuicultor en otras partes del mundo

Actualmente en Chile las toxinas lipofiacutelicas son detectadas por el bioensayo del ratoacuten una metodologiacutea semicuantitativa e inespeciacutefica Por lo mismo suelen ocurrir falsos positivos debido a la interferencia de otras toxinas lipofiacutelicas diferentes al VDM inocuas o no para el hombre pero que pueden estar presentes en las muestras inyectadas pues son co-extraiacutedas con los okadaatos

Gracias al uso de tecnologiacuteas de alta sensibilidad uacuteltimamente ha sido posible detectar junto a los okadaatos otras toxinas lipofiacutelicas de diverso efecto toacutexico tales como las yesotoxinas pectenotoxinas azaspiraacutecidos espiroacutelidos y gimnodimina (Zhao et al 1993 Yasumoto amp Takizawa 1997 Uribe et al 2001 Garciacutea et al 2005 Blanco et al 2007 Krock et al 2009 Aacutelvarez et al 2010 2011 Loacutepez et al 2010 Pizarro et al 2011 Fux et al 2011 Trefault et al 2011)

En Magallanes ha sido reportada la presencia de okadaatos (AO y DTXs) asociadas a la presencia de Dinophysis acuminata (Uribe et al 2001) Tambieacuten se ha reportado la presencia de yesotoxinas (YTXs) en moluscos Esta uacuteltima se sospecha estar asociada a la presencia de la especie Protoceratium reticulatum comprobada fuente primaria en Ayseacuten (Pizarro et al 2012) norte de Chile (Aacutelvarez et al 2011) y ampliamente conocida como tal a nivel mundial

Durante el periodo estival de 2013 en la regioacuten de Magallanes ocurrioacute una floracioacuten de dinoflagelados entre los que destacaron Dinophysis acuminata y Protoceratium reticulatum Tal floracioacuten se mantuvo intensa entre diciembre 2012 y febrero 2013 lo que permitioacute recolectar muestras de transvectores y microalgas para establecer yo confirmar los perfiles de toxinas lipofiacutelicas respectivas mediante LC-MSMS particularmente en una regioacuten con muy poca informacioacuten al respecto

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2 OBJETIVOS 21 General del proyecto

Establecer mediante LC-MSMS los perfiles de toxinas lipofiacutelicas en muestras de moluscos y de plancton recolectadas durante la floracioacuten de dinoflagelados ocurrida durante el verano 2013 en la regioacuten de Magallanes

22 Objetivo especiacutefico

Establecer los perfiles de toxinas lipofiacutelicas en transvectores centinelas fitoplancton y microalgas aisladas por micromanipulacioacuten recolectados en diferentes sectores de Magallanes durante el monitoreo regular realizados durante una floracioacuten de Dinophysis spp y Protoceratium reticulatum

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3 METODOLOGIacuteA En esta seccioacuten se describen las metodologiacuteas asociadas a las actividades realizadas para el logro de los objetivos asiacute como tambieacuten los conceptos e ideas que la fundamentan

31 Obtencioacuten del extracto - Carne de mariscos Dependiendo de la cantidad de material se procesoacute soacutelo el hepatopaacutencreas

o carne total Se maceroacute y pesoacute el material Se realizoacute extraccioacuten con metanol en una de 11 pv Los extractos fueron centrifugados y el sobrenadante filtrado por filtros de nylon de 045 microm y vaciado a un vial

- Extracto en metanol de muestras de fitoplancton (ie el ensamble total de microalgas sin separar

especies) Aliacutecuotas de agua previamente filtradas por malla de 250 microm para eliminar el zooplancton de tamantildeo mayor fueron filtradas en filtros de fibra de vidrio muflados de 13 mm de diaacutemetro (tamantildeo de poro nominal de 07 microm) Los filtros fueron puestos por separado seguacuten sitio de recolecta y fecha en ependorfs de 15 ml y congelados hasta ser extraiacutedos con 1 mL de metanol centrifugados El sobrenadante fue filtrado por filtros de nylon de 045 microm y vaciado a un vial

- Extracto en metanol de D acuminata y P reticulatum La microalgas aisladas por

micromanipulacioacuten bajo un microscopio invertido (siempre y cuando el nuacutemero de D acuminata y de P reticulatum fuera suficiente como para lograr reunir un nuacutemero cercano a las 30 ceacutelulas por cada especie) fueron puestas en un ependorf de 15 ml con 1 ml de metanol Para obtener el extracto de toxina las muestras fueron mezcladas en vortex y filtradas por filtros de nylon de 045 microm El extracto filtrado fue puesto en un vial Solo en una ocasioacuten fue posible acumular un nuacutemero suficiente de ceacutelulas de D acuta por ello fue posible obtener solo una muestra para esta especie

- Todos los extractos fueron secados con nitroacutegeno gas a 38ordmC Este proceso evita los problemas

de traslado de extractos en solventes orgaacutenicos y yo evitar eventuales peacuterdidas de liacutequidos en las muestras durante el trayecto

32 Laboratorio de anaacutelisis dotado de LC-MSMS La metodologiacutea para el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas se realizoacute mediante espectrometriacutea de masas acoplada a un cromatoacutegrafo liacutequido (LC-MSMS) Por tratarse de una teacutecnica auacuten no implementada en Chile en aspectos de determinacioacuten de toxinas marinas a nivel comercial y certificada ni tampoco para realizar investigacioacuten baacutesica de rutina fue necesario enviar las muestras a un laboratorio extranjero certificado Tal laboratorio pertenece al Instituto Tecnoloacutegico del Mar (INTECMAR) Galicia Espantildea

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El contacto se realizoacute a traveacutes de grupos de investigacioacuten extranjeros de vasta y reconocida experiencia en el tema para prospectar la factibilidad de donde realizar los anaacutelisis Los mismos aconsejaron al laboratorio perteneciente a INTECMAR INTECMAR es una entidad de investigacioacuten estatal encargada de realizar los monitoreos semanales en Galicia donde tambieacuten se encuentra fiacutesicamente su sede Actualmente estaacute certificada para la deteccioacuten de toxinas lipofiacutelicas en moluscos entre otros anaacutelisis que realiza (Anexo 1 y 2) El Anexo 2 contiene el costo del anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas (equivalente a cotizacioacuten) El laboratorio seleccionado posee un cromatoacutegrafo UPLC Acquity Waters acoplado a un triple cuadrupolo Waters Xevo TQ con la suficiente sensibilidad en la deteccioacuten de toxinas en microalgas aisladas por micromanipulacioacuten sensibilidad que fuera confirmada anteriormente al establecer cuantitativamente el perfil de toxinas lipofiacutelicas en muestras de microalgas aisladas desde muestras de sedimentos de Magallanes (ver Anexo 3) Previo al enviacuteo de extractos de moluscos y contrato de ensayo de anaacutelisis exigido por INTECMAR se realizoacute la consulta acerca de nuestro intereacutes tambieacuten por analizar toxinas en microalgas aun cuando no estuviesen certificados en esta matriz en particular La solicitud de anaacutelisis fue aceptada por parte de INTECMAR Una vez aceptado el contrato de ensayo por parte de INTECMAR (Anexo 4) se procedioacute entonces a enviar las muestras de 29 extractos de microalgas y 29 extractos de moluscos mientras INTECMAR facturoacute por costos de anaacutelisis solicitados por IFOP en el contrato de ensayo (Anexo 5) Si bien el nuacutemero de extractos obtenidos fue cercano a las 140 muestras el nuacutemero de muestras enviadas se ajustoacute al presupuesto otorgado para este proyecto al mismo tiempo que la informacioacuten obtenida fuera suficiente como para tener una visioacuten regional de los perfiles de toxinas que estuvieron presentes durante la floracioacuten estival de 2013 33 Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por LC-MSMS

Las toxinas lipofiacutelicas a determinar en las muestras fueron aacutecido okadaico (AO) dinofisistoxina-2 (DTX2) dinofisistoxina-1 (DTX1) pectenotoxinas (PTX1 PTX2) azaspiraacutecidos (AZA1 AZA2 AZA3) yesotoxinas (YTX homoYTX 45OHYTX 45OHhomoYTX) y espiroacutelidos (SPX1) El anaacutelisis se realizoacute con los siguientes elementos

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Equipos

Sistema cromatograacutefico Acquity Ultra Performance (Coacutedigo B191C)

Espectroacutemetro de masas equipado con interfase ESI y taacutendem MSMS Xevo TQMS (Coacutedigo B192C)

Software del programa TargetLynx (Coacutedigo 196)

Columna cromatograacutefica de fase reversa C18 17 microm 21 x 100 mm Acquity UPLC BEH

Reactivos y disolventes

Metanol grado HPLC gradiente

H2O Milli-Q Ellix

Acetonitrilo grado HPLC o Hipergrado para LC-MS

Acido foacutermico 98-100

Hidroacutexido amoacutenico 25

MeOHAgua 50

AcetonitriloAgua 90

Aacutecido clorhiacutedrico 37

Disolucioacuten de aacutecido clorhiacutedrico 25 M Hidroacutexido Soacutedico (le 99 pureza)

Disolucioacuten de hidroacutexido soacutedico 25 M

Disolventes cromatograacuteficos

Disolucioacuten tampoacuten hidroacutexido amoacutenico al 0125

Fase moacutevil A Agua conteniendo 67 mM de NH4OH

Fase moacutevil B Acetonitrilo conteniendo 67 mM de NH4OH

Cada fase moacutevil se filtra a vaciacuteo a traveacutes de filtros de membrana de nylon de 022 microm

Toxinas de Referencia

Disolucioacuten certificada de aacutecido ocadaico en metanol (NRC CRM-OA-c) Cod PB015

Disolucioacuten certificada de Yessotoxina Yessotoxin di-sodium salt en metanol (CRM-00-YTX) Cod PB018

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Disolucioacuten certificada de Homo-yessotoxina 1aHomoyessotoxin di-sodium salt en metanol (CRM-00-hYTX) Cod PB019

Disolucioacuten certificada de calibracioacuten de Azaspiraacutecido 1 en metanol (NRC CRM-AZA1) Cod PB020

Disolucioacuten certificada de calibracioacuten de Azaspiraacutecido 2 en metanol (NRC CRM-AZA2) Cod PB021

Disolucioacuten certificada de calibracioacuten de Azaspiraacutecido 3 en metanol (NRC CRM-AZA3) Cod PB022

Disolucioacuten de calibracioacuten de Dinofisistoxina 2 en metanol (00-DTX2) Cod PB026

Disolucioacuten de calibracioacuten de Dinofisistoxina 1 en metanol (CRM-00-DTX1) Cod PB032

Disolucioacuten de calibracioacuten de Pectenotoxina 2 en metanol (00-PTX2) Cod PB031

Material de Referencia Certificado (Mussel Tissue Reference Material for DSP Toxins NRC CRM-DSP-Mus-b) con AO y DTX1 101 plusmn 08 microgg y 13 plusmn 02 microgg respectivamente Homogeneizado de mejilloacuten (Mytilus edulis) Cod PB014

Material de Referencia Certificado (Mussel Tissue Reference Material for AZA Toxins NRC CRM-AZA-Mus) con AZA1 116 plusmn 010 microgg AZA2 0273 plusmn 0023 microgg y AZA3 0211 plusmn 0022 microgg Homogeneizado de mejilloacuten (Mytilus edulis) Cod PB030

Disolucioacuten certificada de calibracioacuten de 13-dismetil espiroacutelido C en metanol (NRC CRM-SPX1) Cod PB027

La Tabla 1 muestra las condiciones cromatograacuteficas usando una columna de UPLC C18 en fase reversa y medio baacutesico mientras que los paraacutemetros de la fuente de ionizacioacuten para el Xevo TQMS (Waters) se muestran en la Tabla 2

34 Extraccioacuten de toxinas

A los extractos metanoacutelicos en seco de las 29 muestras de moluscos y 29 muestras de microalgas se le adicionaron hasta un total de 25 mL de metanol dispensadas en pequentildeas aliacutecuotas agitando el vial con un vortex durante 30 segundos Anaacutelisis de las formas libres del AO DTX1 y DTX2 y de las toxinas de los grupos PTXs AZAs y YTXs Para la determinacioacuten de las formas libres del AO DTX1 y DTX2 y de las toxinas de los grupos PTXs AZAs y YTXs se filtroacute un volumen de aproximadamente 12 ml del extracto metanoacutelico a traveacutes de filtros

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de jeringa de 045 microm para su posterior hidroacutelisis (seccioacuten siguiente) Otra aliacutecuota del mismo extracto filtrada a traveacutes de filtro de jeringa compatible con el disolvente de 022 microm se diluyoacute a la mitad con MeOH 100 y se inyectoacute 5 microl en el sistema LC-MSMS Hidroacutelisis y cuantificacioacuten del contenido total de AO DTX1 y DTX2 Para detectar y cuantificar el contenido total de AO DTX1 y DTX2 se requiere una hidroacutelisis baacutesica previa a la inyeccioacuten de los extractos en el sistema de LC-MSMS Procedimiento En un vial que contiene 1 ml de extracto metanoacutelico previamente filtrado por filtros de jeringa de 045 microm se antildeaden 125 microl de NaOH 25 M se agita manualmente 10 segundos y la mezcla fue sometida a 76 plusmn 4 ordmC durante 40 minutos en un bantildeo Se enfrioacute a temperatura ambiente se pesoacute y luego neutralizoacute con 125 microl de HCl 25 M Finalmente se homogenizoacute nuevamente con el vortex durante 30 segundos Una aliacutecuota del extracto resultante se filtroacute con filtros de jeringa de 022 microm y diluyoacute 58 con MeOH 100 Una aliacutecuota de 5 microl fue inyectada en el sistema de LC-MSMS Durante el proceso de hidroacutelisis el vial debe estar bien cerrado para evitar peacuterdidas por evaporacioacuten (la temperatura de ebullicioacuten del MeOH es 65 ordmC) Las peacuterdidas se pueden detectar mediante pesada del vial antes y despueacutes de la hidroacutelisis en caso de confirmarse se completaraacute el peso con metanol La deteccioacuten con el espectroacutemetro de masas se realizoacute usando dos transiciones por toxina la de mayor intensidad se utilizoacute para cuantificar y la de menor intensidad para confirmar (Tabla 3) Identificacioacuten y Confirmacioacuten La identificacioacuten de la presencia de toxinas se realizaraacute por comparacioacuten del tiempo de retencioacuten de cada una de las toxinas en la muestra con el tiempo de retencioacuten obtenido en las disoluciones de calibrado estaacutendar inyectadas en un mismo diacutea de anaacutelisis Se permite una desviacioacuten maacutexima entre ambos tiempos del 25 Para las toxinas que se cuantifican con la recta de calibrado del anaacutelogo correspondiente se establece un TRR con una tolerancia seguacuten se indica en la Tabla 4 Para una correcta identificacioacuten se exige una separacioacuten entre picos calculada mediante aplicacioacuten de la expresioacuten

2 x (RT2-RT1) RS = ----------------------

(W1+W2)

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En donde RT1 y RT2 y W1 y W2 son respectivamente los tiempos de retencioacuten y las anchuras en la liacutenea base de dos picos adyacentes RT2gtRT1 La resolucioacuten seraacute aceptable cuando Rs gt10 y la resolucioacuten a liacutenea base se consideraraacute completa cuando Rs gt15 La confirmacioacuten de la presencia de toxina seguacuten el criterio de la Decisioacuten de la Comisioacuten 2002657EC se basa en la relacioacuten entre las dos transiciones empleadas para la determinacioacuten (cuantificacioacuten y confirmacioacuten)

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4 RESULTADOS

41 Toxinas en moluscos

Las toxinas detectadas en moluscos fueron PTX2 YTX 45OHYTX DTX1 y SPX1 (Tabla 5) La mayor concentracioacuten la presentoacute el grupo de las YTXs (40-294 microg kg-1) en muestras de choritos provenientes del sector de Seno Otway (Fig 1) En este mismo sector las PTXs tambieacuten presentaron las mayores concentraciones (3-45 microg kg-1) en estos transvectores En el caso del ostioacuten tanto el PTX2 como las YTXs fueron detectadas en el contenido gaacutestrico El DTX1 fue detectado en choritos (1-18 microg kg-1 considerando DTX1 libre y total) procedentes del sector Seno Otway y sectores adyacentes a Punta Arenas El AO no fue detectado en ninguna aacuterea de la Regioacuten Los SPXs fueron principalmente detectados en choritos de las aacutereas centro y sur de Magallanes y en una estacioacuten del estero Peel (M13) en el aacuterea norte de la regioacuten No obstante que los niveles son muy bajos (01- 25 microg kg-1) incluso del nivel letal 50 en ratones inyectados intraperitonealmente 40 microg kg-1 (Richard et al 2000) los valores encontrados son iguales o mayor al encontrado en el caracol piquilhue recolectado en julio de 2012 y que en ese entonces produjo la muerte de ratones provocando el cierre de aacutereas de extraccioacuten por la autoridad de salud regional (Anexo 6) De las cinco toxinas detectadas en los moluscos solo DTX1 mostroacute estar localizada en el aacuterea centro de Magallanes mientras que las restantes fueron detectadas en las tres aacutereas de monitoreo Norte centro y sur de Magallanes No se encontraron PTX1 DTX2 ni AZPs en las muestras de moluscos Los resultados muestran que de los cuatro grupos de toxinas PTX YTXs DTXs y SPXs tres de ellas pueden estar presentes simultaacuteneamente en los moluscos vale decir PTXs YTXs y DTX1 o bien SPXs en vez de DTX1 42 Toxinas en microalgas

En las microalgas se detectaron PTXs y YTXs (Tabla 6) Las PTXs fueron detectadas aunque a nivel de trazas en ceacutelulas de D acuminata seleccionadas por micromanipulacioacuten desde muestras de agua procedentes de estero Silva Palma (M25) estero Wickham (M26) y Cutter Cove (M29) (Fig1) Tambieacuten fue detectada en filtrados de agua (fitoplancton) de Pto Fontaine (M21) e I Engelfield (M29N1) Las YTXs fueron detectadas en ceacutelulas de P reticulatum seleccionadas por micromanipulacioacuten y en cultivos de esta microalga que se logroacute establecer a partir de muestras de agua provenientes de C Adalberto (M04) Cutter Cove (M29) e I Engelfield (M29N1) Solo en los cultivos se detectoacute

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homoYTX y en uno de ellos tambieacuten se detectoacute aunque miacutenimamente 45OHYTX un derivado de la YTX que normalmente se encuentra en los moluscos como producto de bio-transformacioacuten La presencia de 45OHYTX en el cultivo pudo deberse a la presencia de ceacutelulas ya en fase de declinacioacuten de la curva de crecimiento

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5 ANAacuteLISIS Y DISCUSIOacuteN DE LOS DATOS

51 Toxinas en moluscos De las toxinas lipofiacutelicas se sabe que AO DTXs y AZAs causan trastornos gastrointestinales en los seres humanos (Gerssen et al 2010) Para las toxinas restantes (YTXs PTXs y SPXs) auacuten cuando no se han reportado casos de intoxicacioacuten en los seres humanos eacutestas son letales o altamente toacutexicas cuando los ratones son inyectados por viacutea intraperitoneal (Paz et al 2008 Richard et al 2000 Miles et al 2004) Es el caso de los SPXs la toxicidad en ratones inyectados por viacutea intraperitoneal supera a la del resto de las toxinas pues su dosis letal 50 es de 40 microg kg-1 (Richard et al 2000) Tal es asiacute que como referencia (Tabla 5) el transvector caracol piquilhue recolectadas en Julio de 2012 y cuyos niveles de toxicidad provocaron la muerte de los ratones solo presentoacute 01 microg kg-1 deteccioacuten que fue realizada durante este estudio en muestras de carne almacenadas durante no maacutes de 1 antildeo a -20 ordmC Sin embargo no se puede descartar una peacuterdida de la actividad por transformacioacuten durante el periodo de conservacioacuten A excepcioacuten de los SPXs el resto de las toxinas mencionadas estaacuten reguladas por la legislacioacuten europea tanto para consumo interno como importacioacuten de moluscos y tunicados para garantizar la salud de las personas Asiacute tambieacuten estaacuten reguladas por la legislacioacuten chilena a traveacutes del Instituto de Salud Puacuteblica (ISP) estableciendo los mismos niveles de referencia europeo en base al bioensayo ratoacuten Aun cuando los niveles de toxinas detectadas en los moluscos durante este estudio estaacuten por debajo de lo exigido por las regulaciones e incluso de los niveles propuestos por el EFSA (Tabla 7) la presencia de dos y tres tipos de toxinas en los moluscos representa una complejidad en la determinacioacuten de los niveles de toxicidad especialmente si se encuentran presentes toxinas altamente toacutexicas para ratones inyectados intraperitonealmente como son los SPXs Aunque se sospechaba la concurrencia de diferentes tipos de toxinas tal hecho no habiacutea sido confirmado anteriormente Sin embargo los SPXs siguen siendo una incoacutegnita pues se desconoce la fuente de estas toxinas A ostenfeldii la especie que podriacutea ser candidata a confirmar estuvo ausente (Tabla 8 modificado de Guzmaacuten et al 2014) durante el periodo en que se detectoacute en los moluscos Los escasos antecedentes toxigeacutenicos de esta especie en Chile la han confirmado como productora de toxinas paralizantes en Ayseacuten (Pizarro et al 2012) pero no de SPXs No obstante la produccioacuten de SPXs por esta especie en la regioacuten de Magallanes auacuten no se puede descartar Las YTXs fueron las toxinas maacutes abundantes en los moluscos analizados condicioacuten que se corresponde con la alta abundancia relativa de esta especie en el ambiente (Tabla 8) en la mayoriacutea de los casos (Tabla 5)

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Los resultados sugieren que los falsos positivos por bioensayo ratoacuten pudieran ser maacutes frecuentes de lo que se piensa actualmente para la regioacuten de Magallanes 52 Toxinas en microalgas Los resultados indican que P reticulatum encontrado en Magallanes producen YTXs al igual que las especies reportadas en la regioacuten de Antofagasta y Ayseacuten (Aacutelvarez et al 2011 Pizarro et al 2012) Tal resultado hace altamente probable que esta especie es la fuente de YTXs detectadas en los moluscos durante el periodo de estudio De acuerdo a las toxinas detectadas en las muestras de D acuminata aisladas asiacute como en el fitoplancton con gran abundancia de esta especie (Tabla 8) sugiere que esta microalga podriacutea ser una fuente primaria de PTXs tal como ocurre en el norte y sur del paiacutes (Blanco et al 2007 Fux et al 2011) Aunque la especie tambieacuten ha sido asociada a la presencia de DTX1 en moluscos en un evento toacutexico ocurrido en 1998 en Magallanes (Uribe et al 2001) el DTX1 no fue detectado en las muestras de D acuminata durante este estudio El no hallazgo de DTX1 en estas muestras pudo deberse a una fuente microalgal distinta como D acuta yo P lima D acuta ha sido asociada a DTX1 en moluscos de la regioacuten de Ayseacuten (Lembeye et al 1993 y Zhao et al 1993) mientras que P lima es productora solo de DTX1 en la regioacuten de Magallanes (Salgado et al 2012) Sin embargo cuando se detectoacute DTX1 en las muestras de moluscos durante este estudio D acuta estuvo ausente en las muestras de agua mientras que D acuminata presentoacute una abundancia relativa alta Por otro lado el volumen de resuspensioacuten de los extractos pudo ser elevado al seguir el mismo procedimiento protocolar que se aplica a las muestras de moluscos de acuerdo a la normativa europea actual Por tal razoacuten el LC-MSMS no logroacute detectar PTXs ni DTX1 en las muestras de microalgas En estos casos un protocolo para el anaacutelisis de las microalgas debiera incluir un volumen menor de resuspensioacuten de los extractos secos en referencia al utilizado para los moluscos o bien seleccionar por micromanipulacioacuten un nuacutemero mayor de microalgas (gt 130 ceacutelulas) Sin embargo esto uacuteltimo es maacutes difiacutecil de lograr en latitudes australes debido a la baja densidad de ceacutelulas en las que se presenta normalmente esta especie en condiciones naturales Por tal motivo se recomienda realizar pruebas con un volumen de resuspensioacuten menor a 1 mL aun cuando se trate de un LC-MSMS triple cuadrupolo

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6 CONCLUSIONES

a Los moluscos de la regioacuten de Magallanes pueden presentar PTX2 YTX 45OHYTX DTX1 y SPX1

b El hecho que los moluscos puedan presentar dos o maacutes tipos de toxinas lipofiacutelicas dificulta establecer el nivel de toxicidad total

c P reticulatum en Magallanes produce YTXs al igual que la especie del norte y sur del paiacutes

d La abundancia relativa ambiental de P reticulatum durante el periodo de estudio coincidioacute con la presencia de YTXs en los moluscos

e Los SPXs encontrados anteriormente en caracoles piquilhue tambieacuten fue posible detectarlos en choritos durante este estudio

f Auacuten queda por confirmar el tipo de SPXs presentes y su eventual fuente primaria La presencia de SPXs en los moluscos no siempre coincidioacute con la presencia de A ostenfeldii en el ambiente y su abundancia relativa maacutexima fue solo de nivel 1 (raro) durante el periodo de estudio

g La PTX2 detectada en los moluscos coincidioacute con una alta abundancia relativa ambiental de D acuminata No obstante auacuten queda por confirmar si esta especie es la fuente primaria Para ello se hace necesario ajustar (disminuir) el volumen de dilucioacuten de los extractos secos de microalgas aisladas por micromanipulacioacuten aun cuando se trata de un espectroacutemetro de masas como un triple cuadrupolo

h La deteccioacuten de DTX1 en los moluscos coincidioacute con la ausencia de D acuta en el ambiente La toxina tampoco fue detectada en los moluscos cuando esta microalga estuvo a niveles de 2 y 3 (escaso y regular) Queda por confirmar la produccioacuten de DTX1 por esta especie en Magallanes

i No se encontraron PTX1 DTX2 ni AZPs en las muestras de moluscos durante el periodo de estudio

j Los resultados demuestran la presencia de toxinas en los moluscos que se hace necesario identificar y cuantificar utilizando teacutecnicas distintas al bioensayo

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14

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F I G U R A

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Figura 1 Estaciones y sectores muestreados (ciacuterculo rojo) y sector Fortuna donde fue recolectado el

caracol piquilhue (ciacuterculo amarillo)

T A B L A S

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Tabla 1 Condiciones cromatograacuteficas para el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas usando

una columna de UPLC C18 en fase reversa y medio baacutesico

Columna Acquity UPLC BEH C18 17 microm 21x100 mm

Temperatura columna 45 ordmC

Flujo 04 mlmin

Volumen inyeccioacuten 5 microl

Temperatura muestras 10 plusmn 5 ordmC

Gradiente

Tiempo (min) Fase A () Fase B ()

0 75 25

066 75 25

330 5 95

528 5 95

726 75 25

900 75 25

Tabla 2 Paraacutemetros de la fuente de ionizacioacuten para el Xevo TQMS (Waters) en la determinacioacuten de toxinas lipofiacutelicas

PARAacuteMETROS DE LA FUENTE

ESI- ESI+

AO DTX2 DTX1 YTX homoYTX 45OH YTX y 45OH

homoYTX

AZA1 AZA2 AZA3 PTX2 PTX1 y SPX1

Voltaje de capilar (V) 100 200

Temperatura de solvatacioacuten (ordmC) 450 450

Flujo gas de solvatacioacuten (lh) 850 850

Flujo gas cono (lh) 50 50

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Tabla 3

Resumen de las condiciones de espectrometriacutea de masas empleadas con el Xevo TQMS (Waters) en el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas

Compuesto tR (min)

ESI

Ioacuten Precursor

(mz)

Ioacuten Producto

(mz)

Dwell time (s)

Energiacutea colisioacuten

(eV)

Voltaje cono (V)

AO 189 NEG 8035 2552 0010 46 86

113 0010 56 86

DTX2 210 NEG 8035 2552 0010 46 86

113 0010 56 86

DTX1 214 NEG 8175 5634 0010 43 86

2552 0010 48 86

YTX 202 NEG 5704 4674 0010 30 45

3963 0010 35 45

45OH-YTX 182 NEG 5784 4674 0010 30 45

3964 0010 30 45

HomoYTX 203 NEG 5775 4744 0010 30 48

4034 0010 30 48

45OH-homoYTX 182 NEG 5855 4034 0010 30 45

4744 0010 30 45

PTX1 306 POS 8925 8395 0015 25 36

8215 0015 25 36

PTX2 362 POS 8765 8415 0015 20 36

8235 0015 25 36

AZA1 263 POS 8425 6545 0015 55 50

3622 0015 50 50

AZA2 270 POS 8565 6725 0015 45 27

6545 0015 45 27

AZA3 236 POS 8285 6404 0015 55 47

3622 0015 55 47

SPX1 368 POS 6925 6744 0015 27 60

1643 0015 42 60 Transicioacuten cuantificadora

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Tabla 4 TRR y valores de tolerancia para las toxinas analizadas

TOXINA TRR TOLERANCIA

Toxinas del grupo de AO

AO 1000 0990-1010

DTX2 1040 1014-1066

DTX1 1140 1111-1168

Toxinas del grupo de PTX

PTX2 1000 0990-1010

PTX1 0850 0829-0871

Toxinas del grupo de YTX

YTX 1000 0990-1010

45OH-YTX 0894 0871-0916

Homo YTX 1000 0990-1010

45OH-homoYTX 0899 0876-0921

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Tabla 5 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de moluscos

Nordm estMes

recolectaLocalidad Molusco

cuerpo

enterohepat

gramos

carne

toxicidad

VDM ratoacuten

PTX2

(ugKg)

YTX

(ugKg)

45OHYTX

(ugKg)

DTX1

libre

(ugKg)

DTX1

total

(ugkg)

SPX 1

(ugKg)

M13 ene-13 E Peel chorito x 5086 + 01 02

M13 ene-13 E Peel ostioacuten x 5155 No real izado 16 21

M33 ene-13 B Bell chorito x 5253 + 04

M37 ene-13 B Agua Fresca chorito x 5039 + 05 01

M35 ene-13 C San Isidro chorito x 5289 + 000 01

M42 ene-13 V Holanda chorito x 5231 + 06 13

M43 ene-13 B Yendegaia chorito x 5193 + 04 25

M45 ene-13 Pto Williams chorito x 5161 - 28 07

M08 feb-13 E Falcon cholga x 5027 - 14

M09 feb-13 E Penguumlin cholga x 5103 + 14

M22 feb-13 E de las Montantildeas cholga x 5052 - 26

M23 feb-13 I Ballesteros cholga x 5204 - 87

M24 feb-13 B Fanny chorito x 2016 - 38 1071 479 12

M25 feb-13 E Silva Palma chorito x 1447 - 59 1077 898 09

M26 feb-13 E Wickham chorito x 1093 - 194 2940 2232 66 66

M27 feb-13 E Sullivan chorito x 1137 - 450 1944 1478

M28 feb-13 E Nuntildeez chorito x 1179 + 33 721 407

M29 feb-13 Cutter Cove chorito x 1003 - 65 501 309

M29N1 feb-13 I Engelfield chorito x 1116 - 297 2007 1483

M31 feb-13 B Nash chorito x 2231 +

M33 feb-13 B Bell chorito x 1181 - 93

M34 feb-13 S Pedro chorito x 0726 -

M35 feb-13 C San Isidro chorito x 1178 + 110

M36 feb-13 B Buena chorito x 1367 +

M37 feb-13 B Agua Fresca chorito x 0850 + 45 100 80

M39 feb-13 Pto Zenteno chorito x 3241 + 28

M39N2 feb-13 Pta San Valentin chorito x 1712 - 11

M39N3 feb-13 Pto Yartou chorito x 2035 - 11

sector

Fortunajul-12 B Inuacutetil

caracol

piquilhuex 107000 + 01

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Tabla 6 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de microalgas

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Tabla 7 Niveles actualmente permitidos por la legislacioacuten europea (bioensayo) y los niveles propuestos por la

autoridad europea para la seguridad alimentaria (EFSA) (Gerssen et al 2010)

Toxin Legislacioacuten (μg kg-

1) Proposicioacuten

EFSA (μg kg-1)

Validacioacuten LC-MSMS

(μg kg-1)

OA and DTXs 160 45

PTXs 120

YTXs 1000 3750

AZAs 160 32

SPXs 400 (Gerssen et al2010)

European Food Safety Authority Decisioacuten 2002657 de la Unioacuten Europea EC Incluye PTXs

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Tabla 8 Abundancia relativa ambiental de las microalgas al momento de recolectar las muestras de moluscos En rojo se indica la deteccioacuten de toxina positiva en los moluscos asociada a la supuesta microalga fuente PTXs (D

acuminata) YTXs (P reticulatum) SPXs (A ostenfeldii) DTX1 (A acuta)

(Tabla modificada de Guzmaacuten et al 2014)

A N E X O S

ANEXO 1

Certificacioacuten laboratorio INTECMAR

ANEXO 2

Lista de anaacutelisis que realiza INTECMAR y sus costos (en euros) 2013

scv 1 de 7

GUIA PARA LA AUTOLIQUIDACIOacuteN DE TASAS A FAVOR DE LA COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA 2013 Los aspectos financieros de los servicios prestados por Intecmar en el marco de su actividad e vienen regulados en la Ley 62003 de 9 de diciembre de tasas precios y exenciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia (DOG nuacutem 240 de 11122003) y fueron actualizados posteriormente en la Ley 142010 de 27 de diciembre de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2011 (DOG nuacutem 250 de 30122010) y en la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013 (DOG nuacutem 42 de 28022013) Existen dos maneras de liquidar las tasas correspondientes a los servicios prestados por Intecmar

1 De forma manual cubriendo el modelo A de autoliquidacioacuten que se descarga en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda y que adjunto en pdf y se lleva al banco para su pago httpwwwconselleriadefacendaeswebportalconfeccion-impresos

2 De forma telemaacutetica en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda viacutenculo httpshostcixtecesXEITObinlionwebXeitodllxmit a traveacutes del modelo 730

Ambos modelos de liquidacioacuten de tasas adjuntamos ejemplo al final de este documento deben ser remitidos por mail a Intecmar con el sello del banco fiacutesico o virtual como paso previo a la emisioacuten del certificado Los coacutedigos generales necesarios son

minus Consejeriacutea de Medio Rural y de Mar Coacutedigo 09 minus Delegacioacuten de Pontevedra Coacutedigo 40 minus Servicio de Intecmar Coacutedigo 24

Los coacutedigos y descripcioacuten de las tasas son los regulados en la legislacioacuten vigente y los hemos resumido en los anexos siguientes Vilaxoaacuten 4 de marzo de 2013

scv 2 de 7

TARIFAS DE TASAS VIGENTES PARA 2013 - Ley 22013 d e 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013

(DOG nuacutem 42 de 28022013)

Estas tarifas son consecuencia de la actualizacioacuten de las tarifas contenidas en los anexos 1 2 3 4 y 5 de la Ley 62003 del 9 de diciembre de tasas precios y exacciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia por la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 Seraacuten aplicables desde el diacutea de la entrada en vigor de la Ley de

presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 TASA POR SERVICIOS ADMINISTRATIVOS

No sujecioacuten No se exigiraacute la tasa por servicios administrativos cuando se trate de compulsas o cotejos de documentos que deban acompantildear a solicitudes escritos o comunicaciones presentadas por el ciudadano y realizadas en el aacutembito de actuacioacuten de los registros seguacuten lo dispuesto en el artiacuteculo 385 de la Ley 301992 del 26 de noviembre de reacutegimen juriacutedico de las administraciones puacuteblicas y del procedimiento administrativo comuacuten

Excepciones Estaraacuten exentos de la presente tasa

1- La expedicioacuten de certificados de retribuciones satisfechas por la Xunta de Galicia con el objeto de justificacioacuten en relacioacuten con el impuesto sobre la renta de las personas fiacutesicas

2- La expedicioacuten de certificados y compulsa que el personal de la Administracioacuten solicite respecto a las necesidades propias del puesto de trabajo o relacioacuten de servicios

3- Los alumnos por cualquier actuacioacuten en materia de ensentildeanzas no universitarias

scv 3 de 7

4- Las compulsas realizadas en las oficinas de empleo para los desempleados en la tramitacioacuten de expedientes que sean competencia de dichas oficinas

5 La inscripcioacuten en las convocatorias para a seleccioacuten de personal de la comunidad autoacutenoma despueacutes de justificacioacuten documental solicitada por

- Personas con discapacidad igual o superior al 33 - Personas que sean miembros de familias numerosas clasificadas en la

categoriacutea especial Se aplicaraacute una bonificacioacuten del 50 a la inscripcioacuten solicitada por - Personas que sean miembros de familias numerosas de categoriacutea

general - Personas que figurasen como demandantes de empleo desde por lo

menos seis meses antes a la fecha de la convocatoria de pruebas selectivas de personal en las que soliciten su participacioacuten y no esteacuten percibiendo prestacioacuten o subsidio por desempleo

6- La expedicioacuten de certificados relativos a la situacioacuten fiscal 7- El Estado y los demaacutes entes puacuteblicos territoriales o institucionales

siempre que los servicios o actividades de que sean beneficiarios se presten o se realicen en el marco del principio de colaboracioacuten entre administraciones

8- Las viacutectimas de actos terroristas asiacute como sus coacutenyuges y sus hijos por cualquier actuacioacuten en materia educativa realizada en centros oficiales de estudios en todos los niveles de ensentildeanza

9- Los miembros de los organismos consultivos de la Administracioacuten puacuteblica gallega respecto de los certificados emitidos por dichos organismos

COacuteDIGO TASAS

DESCRIPCIOacuteN IMPORTE euro

314400 Prestacioacuten de servicios en el Instituto Tecnoloacutegico para el Control del Medio Marino de Galicia

314401 Anaacutelisis de biotoxinas marinas en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de Yasumoto 1978 4752

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en rato segundo o meacutetodo de Yasumoto 1984 5432

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS)

9520 -Anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten

seguacuten el meacutetodo de la AOAC 4752

scv 4 de 7

-Anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo da AOAC 4752

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1978 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10186

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1984 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10865

-Anaacutelisis combinada en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS) anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo AOAC y anaacutelisis de toxicidad de tipo ASP por cromatografiacutea liquida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo de la AOAC 15000

314402 Anaacutelisis de muestras en agua de mar -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton marino mediante

microscopiacutea oacuteptica 15133 -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton toacutexico marino

mediante microscopiacutea oacuteptica 13333 - Anaacutelisis de carbono orgaacutenico disuelto 5093 -Anaacutelisis de nutrientes inorgaacutenicos disueltos 3500 -Anaacutelisis de pigmentos fotosinteacuteticos (clorofila ldquoardquo) por

espectrofluorimetria 1698 314403 Anaacutelisis microbioloacutegicos en moluscos y otros organismos

procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Cuantificacioacuten de E Coli 10186 - Deteccioacuten de Salmonella spp 16975 -Enumeracioacuten de Escherichia coli en moluscos bivalvos

vivos por la teacutecnica de medida directa de impedancia con el sistema BacTrac 4300 6800

314404 Anaacutelisis de contaminantes de origen quiacutemica en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Determinacioacuten de metales pesados (Pb Cd Cu Zn As Hg Ni Cr Ag) mediante espectrofotometriacutea de absorcioacuten atoacutemica por metal

6790

-Determinacioacuten de compuestos bifenilos policlorados (PCB) mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

scv 5 de 7

-Determinacioacuten de pesticidas organoclorados mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

-Determinacioacuten de hidrocarburos aromaacuteticos policiacuteclicos (HAPs) mediante cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de fluorescencia

28200

314405 Anaacutelisis histopatoloacutegica de moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Estudio hispatoloacutegico Determinacioacuten de Bonamia Marteillia Perkinsus y otras alteraciones patoloacutegicas

101852

314406 Emisioacuten de certificaciones e informes teacutecnicos y otras actuaciones a peticioacuten del interesado

Emisioacuten de certificados a peticioacuten de los interesados sobre las actuaciones llevadas a cabo por el Instituto

1000

Emisioacuten de informes teacutecnicos a peticioacuten del interesado (euros por hora o fraccioacuten)

4000

scv 6 de 7

scv 7 de 7

ANEXO 3

Resultados de anaacutelisis en muestras de microalgas anteriormente enviadas procedentes de Magallanes por el equipo de espectrometriacutea de masas utilizado por INTECMAR Trabajo presentado a las XXXII

Congreso de Ciencias del Mar realizado en Punta Arenas 22-25 octubre de 2012

PERFIL DE TOXINAS DE PROROCENTRUM LIMA (DINOPHYCEAE) AISLADO DESDE LA COSTA DE MAGALLANES SUR DE CHILE P Salgado1 G Pizarro1 JM Franco2 P Rioboacute2 e I Bravo3

1Instituto de Fomento Pesquero (IFOP) Punta Arenas Chile gemitapizarroifopcl 2Instituto de Investigaciones Marinas (CSIC) Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea 3Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea

Prorocentrum lima (Ehrenberg) es un dinoflagelado marino bentoacutenico que se encuentra adherido generalmente

sobre macroalgas sedimentos y detrito flotante y menos comuacutenmente en el plancton (Bravo et al 2001) Es una especie neriacutetica y estuarina y su rango de distribucioacuten geograacutefica variacutea desde aguas costeras tropicales a templadas (Faust 1991) La importancia de P lima se debe a que son productoras de toxinas diarreogeacutenicas en las personas (veneno diarreico de los mariscos VDM) al igual que algunas especies de Dinophysis aunque raramente se le han asociado con episodios toacutexicos por VDM por su caraacutecter epiacutefito y bentoacutenico El complejo VDM producido por P lima incluye moleacuteculas conocidas como el aacutecido okadaico (AO) y derivados dinofisistoxinas (DTX-1 DTX-2) (Bravo et al 2001 Vale et al 2009) No obstante existen casos citados para USA donde se detectoacute toxicidad por VDM en bivalvos de cultivos asociadas a P lima aunque en bajos niveles (Maranda et al 2007a) En Canadaacute tambieacuten se llevoacute a cabo un estudio en moluscos de cultivo cuya finalidad fue determinar el origen del VDM en la que P lima fue la principal especie sospechosa tras la ocurrencia de un evento toacutexico humano por VDM ocurrido en 1998 (Levasseur et al 2003) y en antildeos anteriores (Quilliam et al 1993) Aunque Levasseur et al (2003) no logroacute probar la toxicidad de los mariscos en cultivo a causa de P lima cabe hacer notar que lo que buscaron fue OA y DTX1 no DTX 3 este uacuteltimo principal derivado de las anteriores tras su transformacioacuten en los moluscos (eg Suzuki et al 1999 Vale amp Sampayo 2002)

En consecuencia el rol de P lima en eventos toacutexicos por VDM auacuten no puede descartarse por cuanto podriacutean llegar a ser importantes en ambientes turbulentos debido a la eventual remocioacuten de microalgas adheridas en sustratos por efecto de vientos (Levasseur et al 2003) factor de importancia si se trata de sedimentos o contrariamente en zonas someras y estables de cultivos de moluscos que al mismo tiempo favorecen microambientes para sustratos en los que prolifera la epiacutefita P lima (Lawrence et al 2000) quedando expuestas a re-suspensiones temporales que favorecen la filtracioacuten de estas microalgas por los bivalvos en cultivo (Maranda et al 2007a)

Chile posee escaso conocimiento sobre esta especie en su medio natural incluido su perfil de toxinas y potencial rol en la toxificacioacuten de moluscos por VDM Por tal razoacuten resultoacute interesante aportar al conocimiento de estos aspectos en muestras de sedimentos recolectadas en el estrecho de Magallanes en las que esta especie se encontroacute inhabitualmente abundante

Las ceacutelulas utilizadas en este estudio fueron aisladas desde sedimentos superficiales (0-3 cm) recolectados en el invierno de 2010 en la localidad de cabo San Isidro durante el muestreo regular del programa de monitoreo de marea roja en la regioacuten de Magallanes En esa oportunidad se logroacute cuantificar hasta 1002 quistes tecadoscm3 de Prorocentrum lima la mayor concentracioacuten respecto a otros sitios de recolecta (Fig 1) Los sedimentos de esta localidad presentaron una coloracioacuten oscura y un fuerte olor a sulfuro de hidroacutegeno (H2S) producto de anoxia local

Se aislaron entre 27 y 87 quistes tecados (Fig 1 a) directamente desde los sedimentos mientras otras 60 ceacutelulas vegetativas (Fig 1 b) fueron aisladas luego de promover la actividad y divisioacuten de los quistes en condiciones de 15 ordmC y un ciclo de luzoscuridad de 1212 horas (Tabla 1) Para este fin se aislaron quistes tecados y trasvasijaron a placas Petri de 5 cm de diaacutemetro conteniendo 5 mL de medio de cultivo L1 Para el anaacutelisis de toxinas las ceacutelulas aisladas fueron trasvasijadas a un tubo Eppendorf de 15 mL y congelados a -80 ordmC Una aliacutecuota de sedimento huacutemedo (100 microL aproximados) tambieacuten fue vaciada en un tubo Eppendorf y congelado Para extraer la toxina se antildeadioacute 500 microL de metanol 100 a cada tubo se mezcloacute por 1 min y filtroacute por 045 microm trasvasijando a un vial El extracto fue secado bajo nitroacutegeno gas a 40 ordmC y conservado a 4 ordmC hasta su anaacutelisis Previo al anaacutelisis de toxinas los extractos fueron resuspendidos en 150 microl de metanol

La presencia de la toxina dinofisistoxina 1 (DTX-1) en las muestras (Fig2) fue confirmada en modo negativo a traveacutes de su ioacuten precursor [M-H]- mz 8175 y sus iones productos mz 5634 y 2552 mediante un cromatoacutegrafo UPLC Acquity Waters acoplado a un triple cuadrupolo Waters Xevo TQ (LC-MS) La columna utilizada fue una Acquity UPLC BEH C18 17microm 21 x 100 mm a 45 ordmC La fase moacutevil consistioacute en (A) hidroacutexido amoacutenico a pH 11 y (B) hidroacutexido amoacutenico en acetonitrilo (67 mM) con una tasa de flujo de 4 mLmin El gradiente de elucioacuten utilizado fue el siguiente mantencioacuten al 75 de A entre 0 y 066 min cambio a 5 de A entre 066 y 330 min mantener 5

de A entre 330 y 528 min recuperacioacuten del 75 de A entre 528 y 726 min mantencioacuten al 75 de A hasta 9 min Se pinchoacute 5microL de muestra en el LC-MS El contenido de DTX-1 en las muestras fue cuantificado en base al ion precursor

Los tres tipos de muestras fueron positivas a la presencia de DTX-1 pero las ceacutelulas vegetativas fueron las que presentaron un mayor contenido de DTX-1 por ceacutelula La deteccioacuten de DTX-1 en los sedimentos (Tabla 2) reflejoacute la presencia de los quistes tecados en eacutestos

Figura 1 Concentraciones de quistes tecados de Prorocentrum lima (quistescm3 de sedimento huacutemedo) en estaciones de muestreo en el Estrecho de Magallanes (M26 Estero Wickham M29N1 Isla Engenfield M31 Bahiacutea Nash M35 Cabo San Isidro M39C1 Bahiacutea Gente Grande M39C2 Bahiacutea Inuacutetil M39C3 Canal Gabriel) y Canal Beagle (M41 Ventisquero Espantildea M42 Ventisquero Holanda) (a) Quistes tecados (b) ceacutelulas vegetativas obtenidas de germinacioacuten de quistes tecados bajo condiciones de laboratorio Barra de escala 20 microm

Tabla 1 Sedimento y ceacutelulas de Prorocentrum lima aisladas para anaacutelisis de toxinas

Extracto metanoacutelico Nordm de ceacutelulas TR ngmL pg DTX-1 ceacutel

G1 quistes tecados 27 213 lt2 -

G2 quistes tecados 67 214 05 11

G3 quistes tecados 87 215 12 21

G4 ceacutelulas vegetativas 60 215 34 87

G6 sedimentos aliacutecuota 213 13 19 pg microL sed

TR tiempo de retencioacuten

Figura 2 Cromatogramas de extractos metanoacutelicos de Prorocentrum lima quistes tecados (a) ceacutelulas vegetativas (b) y sedimentos (c)

Tabla 2 Caracteriacutesticas del sedimento con quistes tecados de Prorocentrum lima

Tipo Tamantildeo (mm)

Grava 2 35

Arena media 025 - 05 32

Arena muy fina 0063 - 0125 2

Limo-arcilla lt 0063 1

Estos resultados constituyen otra eventual posibilidad de toxicidad en los moluscos por VDM no soacutelo de aquellos con modalidad de vida bentoacutenica superficial sino de aquellos que tambieacuten viven enterrados en la arena (eg almeja huepo) Maacutes auacuten si se conoce que P lima posee la capacidad de desarrollar poblaciones naturales en aguas templadas en nuacutemeros que podriacutean justificar una toxicidad por VDM en los mariscos (eg Maranda et al 2007a b)

Referencias

Bravo I ML Fernaacutendez I Ramilo amp A Martinez 2001 Toxin composition of the toxic dinofagellate Prorocentrum lima isolated from different locations along the Galician coast (NW Spain) Toxicon 39 1537ndash1545

Faust MA 1991 Morphology of ciguatera-causing Prorocentrum lima (Pyrrophyta) from widely differing sites J Phycol 27 642-648

Lawrence J E Grant J Quilliam M A Bauder A G amp Cembella A D 2000 Colonizaition and growth of the toxic dinoflagellate Prorocentrum lima and associated fouling macroalgae on mussels in suspended culture Mar Ecol Prog Ser 201 147-154

Levasseur M Couture J Y Weise A M Michaud S Elbrachter M Sauveacute G amp Bonneau E 2003 Pelagic and epiphytic summer distributions of Prorocentrum lima and P mexicanum at two mussel farms in the Gulf of St Lawrence Aquat Microbiol Ecol 30283-293

Maranda L Corwin S Dover S amp Morton S L 2007a Prorocentrum lima (Dinophyceae) in northeastern USA coastal waters II Toxin load in the epibiota and in shellfish Harmful Algae 6 632-641

Maranda L Corwin S Hargraves P E 2007b Prorocentrum lima (Dinophyceae) in 19 northeastern USA coastal waters I Abundance and distribution Harmful Algae 6 623ndash631

Quilliam MA Gilgan MW amp Pleasance S 1993 Confirmation of an incident of diarrhetic shellfish poisoning in eastern Canada In Smayda TJ Shimizu Y (Eds) Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea Elsevier New York pp 547ndash552

Suzuki T Ota H amp Yamasaki M 1999 Direct evidence of transformation of dinophysistoxin-1 to 7-O-acyl-dinophysistoxin-1 (Dinophysis-3) in the scallop Patinopecten yessoensis Toxicon 37 187-198

Vale P amp Sampayo M A 2002 First confirmation of human diarrhoeic poisonings by okadaic acid esters after ingestion of razor clams (Solen marginatus) and green crabs (Carcinus maenas) in Aveiro lagoon Portugal and detection of okadaic acid esters in phytoplankton Toxicon 40989-996

Vale P Veloso V amp Amorim A 2009 Toxin composition of a Prorocentrum lima strain isolated from the Portuguese coast Toxicon 54145ndash152

Agradecimientos Intecmar de la Xunta de Galicia Espantildea donde se realizaron los anaacutelisis de toxinas proyecto

SUBPESCA ldquoManejo y Monitoreo de Mareas Rojas en las regiones de Los Lagos Ayseacuten y Magallanes IV etapa 2010rdquo

ANEXO 4

Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten

ANEXO 5

Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de Magallanes

TASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

O

EJE

MP

LA

R P

AR

A E

L IN

TE

RE

SA

DO

LIQ

UID

AC

IOacuteN

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

EN

TID

AD

BA

NC

AR

IATASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

0 9

4 0

2 4INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

AD

MIN

IST

RA

CIOacute

NTASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

9520 euros

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

CONSELLERIA DE FACENDA

ANEXO 6

Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para cierre

de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

Seccioacuten Ediciones y Produccioacuten Almte Manuel Blanco Encalada 839

Fono 56-32-2151500 Valparaiacuteso Chile

wwwifopcl

Page 8: “Análisis de toxinas lipofílicas mediante LC-MS/MS en ...metadatos.mma.gob.cl/sinia/Informe_final_Analisis_toxinas_lipofilicas_656-055.pdfSUBSECRETARÍA DE ECONOMÍA: INFORME FINAL:

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo

1

1 ANTECEDENTES En Chile auacuten existen escasos antecedentes acerca de las toxinas lipofiacutelicas presentes en nuestros moluscos asiacute como la fuente microalgal asociada a su produccioacuten y la variabilidad espacio-temporal de las mismas Tal situacioacuten es tambieacuten un problema en el sur austral de Chile y particularmente en Magallanes donde el historial de este tipo de toxinas ha sido opacado por la fuerte incidencia de toxina paralizante asociada a la presencia de Alexandrium catenella No obstante en los dos uacuteltimos antildeos los niveles de toxicidad por toxinas lipofiacutelicas en la regioacuten se han constituido en un problema para la autoridad de Salud pues han determinado el cierre de grandes extensiones de aacutereas a la extraccioacuten de moluscos hecho no acontecido anteriormente salvo muy local y esporaacutedicamente (eg Uribe et al 2001) ademaacutes del efecto econoacutemico y social

Dentro de las toxinas lipofiacutelicas las maacutes conocidas y frecuentes a nivel mundial por sus efectos diarreicos (veneno diarreico de los mariscos VDM) en humanos son el aacutecido okadaico y sus derivados las dinofisistoxinas (AO y DTXs) (eg Yasumoto et al 1978) tambieacuten conocidas como okadaatos Por lo mismo poseen un mayor historial de citas en la literatura cientiacutefica Los okadaatos son fuertes inhibidores de las proteiacutenas fosfatasas 1 y 2A y potenciales promotores de tumores (Yasumoto et al 1989 Fujiki et al 1989) con efectos croacutenicos desconocidos por lo que su efecto es maacutes lento Por esta razoacuten representan un riesgo para la salud puacuteblica y dan lugar a prolongadas vedas de extraccioacuten de bivalvos tanto de bancos naturales como centros de cultivo con las consiguientes peacuterdidas econoacutemicas para el sector pesquero y acuicultor en otras partes del mundo

Actualmente en Chile las toxinas lipofiacutelicas son detectadas por el bioensayo del ratoacuten una metodologiacutea semicuantitativa e inespeciacutefica Por lo mismo suelen ocurrir falsos positivos debido a la interferencia de otras toxinas lipofiacutelicas diferentes al VDM inocuas o no para el hombre pero que pueden estar presentes en las muestras inyectadas pues son co-extraiacutedas con los okadaatos

Gracias al uso de tecnologiacuteas de alta sensibilidad uacuteltimamente ha sido posible detectar junto a los okadaatos otras toxinas lipofiacutelicas de diverso efecto toacutexico tales como las yesotoxinas pectenotoxinas azaspiraacutecidos espiroacutelidos y gimnodimina (Zhao et al 1993 Yasumoto amp Takizawa 1997 Uribe et al 2001 Garciacutea et al 2005 Blanco et al 2007 Krock et al 2009 Aacutelvarez et al 2010 2011 Loacutepez et al 2010 Pizarro et al 2011 Fux et al 2011 Trefault et al 2011)

En Magallanes ha sido reportada la presencia de okadaatos (AO y DTXs) asociadas a la presencia de Dinophysis acuminata (Uribe et al 2001) Tambieacuten se ha reportado la presencia de yesotoxinas (YTXs) en moluscos Esta uacuteltima se sospecha estar asociada a la presencia de la especie Protoceratium reticulatum comprobada fuente primaria en Ayseacuten (Pizarro et al 2012) norte de Chile (Aacutelvarez et al 2011) y ampliamente conocida como tal a nivel mundial

Durante el periodo estival de 2013 en la regioacuten de Magallanes ocurrioacute una floracioacuten de dinoflagelados entre los que destacaron Dinophysis acuminata y Protoceratium reticulatum Tal floracioacuten se mantuvo intensa entre diciembre 2012 y febrero 2013 lo que permitioacute recolectar muestras de transvectores y microalgas para establecer yo confirmar los perfiles de toxinas lipofiacutelicas respectivas mediante LC-MSMS particularmente en una regioacuten con muy poca informacioacuten al respecto

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo

2

2 OBJETIVOS 21 General del proyecto

Establecer mediante LC-MSMS los perfiles de toxinas lipofiacutelicas en muestras de moluscos y de plancton recolectadas durante la floracioacuten de dinoflagelados ocurrida durante el verano 2013 en la regioacuten de Magallanes

22 Objetivo especiacutefico

Establecer los perfiles de toxinas lipofiacutelicas en transvectores centinelas fitoplancton y microalgas aisladas por micromanipulacioacuten recolectados en diferentes sectores de Magallanes durante el monitoreo regular realizados durante una floracioacuten de Dinophysis spp y Protoceratium reticulatum

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo

3

3 METODOLOGIacuteA En esta seccioacuten se describen las metodologiacuteas asociadas a las actividades realizadas para el logro de los objetivos asiacute como tambieacuten los conceptos e ideas que la fundamentan

31 Obtencioacuten del extracto - Carne de mariscos Dependiendo de la cantidad de material se procesoacute soacutelo el hepatopaacutencreas

o carne total Se maceroacute y pesoacute el material Se realizoacute extraccioacuten con metanol en una de 11 pv Los extractos fueron centrifugados y el sobrenadante filtrado por filtros de nylon de 045 microm y vaciado a un vial

- Extracto en metanol de muestras de fitoplancton (ie el ensamble total de microalgas sin separar

especies) Aliacutecuotas de agua previamente filtradas por malla de 250 microm para eliminar el zooplancton de tamantildeo mayor fueron filtradas en filtros de fibra de vidrio muflados de 13 mm de diaacutemetro (tamantildeo de poro nominal de 07 microm) Los filtros fueron puestos por separado seguacuten sitio de recolecta y fecha en ependorfs de 15 ml y congelados hasta ser extraiacutedos con 1 mL de metanol centrifugados El sobrenadante fue filtrado por filtros de nylon de 045 microm y vaciado a un vial

- Extracto en metanol de D acuminata y P reticulatum La microalgas aisladas por

micromanipulacioacuten bajo un microscopio invertido (siempre y cuando el nuacutemero de D acuminata y de P reticulatum fuera suficiente como para lograr reunir un nuacutemero cercano a las 30 ceacutelulas por cada especie) fueron puestas en un ependorf de 15 ml con 1 ml de metanol Para obtener el extracto de toxina las muestras fueron mezcladas en vortex y filtradas por filtros de nylon de 045 microm El extracto filtrado fue puesto en un vial Solo en una ocasioacuten fue posible acumular un nuacutemero suficiente de ceacutelulas de D acuta por ello fue posible obtener solo una muestra para esta especie

- Todos los extractos fueron secados con nitroacutegeno gas a 38ordmC Este proceso evita los problemas

de traslado de extractos en solventes orgaacutenicos y yo evitar eventuales peacuterdidas de liacutequidos en las muestras durante el trayecto

32 Laboratorio de anaacutelisis dotado de LC-MSMS La metodologiacutea para el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas se realizoacute mediante espectrometriacutea de masas acoplada a un cromatoacutegrafo liacutequido (LC-MSMS) Por tratarse de una teacutecnica auacuten no implementada en Chile en aspectos de determinacioacuten de toxinas marinas a nivel comercial y certificada ni tampoco para realizar investigacioacuten baacutesica de rutina fue necesario enviar las muestras a un laboratorio extranjero certificado Tal laboratorio pertenece al Instituto Tecnoloacutegico del Mar (INTECMAR) Galicia Espantildea

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SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo

4

El contacto se realizoacute a traveacutes de grupos de investigacioacuten extranjeros de vasta y reconocida experiencia en el tema para prospectar la factibilidad de donde realizar los anaacutelisis Los mismos aconsejaron al laboratorio perteneciente a INTECMAR INTECMAR es una entidad de investigacioacuten estatal encargada de realizar los monitoreos semanales en Galicia donde tambieacuten se encuentra fiacutesicamente su sede Actualmente estaacute certificada para la deteccioacuten de toxinas lipofiacutelicas en moluscos entre otros anaacutelisis que realiza (Anexo 1 y 2) El Anexo 2 contiene el costo del anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas (equivalente a cotizacioacuten) El laboratorio seleccionado posee un cromatoacutegrafo UPLC Acquity Waters acoplado a un triple cuadrupolo Waters Xevo TQ con la suficiente sensibilidad en la deteccioacuten de toxinas en microalgas aisladas por micromanipulacioacuten sensibilidad que fuera confirmada anteriormente al establecer cuantitativamente el perfil de toxinas lipofiacutelicas en muestras de microalgas aisladas desde muestras de sedimentos de Magallanes (ver Anexo 3) Previo al enviacuteo de extractos de moluscos y contrato de ensayo de anaacutelisis exigido por INTECMAR se realizoacute la consulta acerca de nuestro intereacutes tambieacuten por analizar toxinas en microalgas aun cuando no estuviesen certificados en esta matriz en particular La solicitud de anaacutelisis fue aceptada por parte de INTECMAR Una vez aceptado el contrato de ensayo por parte de INTECMAR (Anexo 4) se procedioacute entonces a enviar las muestras de 29 extractos de microalgas y 29 extractos de moluscos mientras INTECMAR facturoacute por costos de anaacutelisis solicitados por IFOP en el contrato de ensayo (Anexo 5) Si bien el nuacutemero de extractos obtenidos fue cercano a las 140 muestras el nuacutemero de muestras enviadas se ajustoacute al presupuesto otorgado para este proyecto al mismo tiempo que la informacioacuten obtenida fuera suficiente como para tener una visioacuten regional de los perfiles de toxinas que estuvieron presentes durante la floracioacuten estival de 2013 33 Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por LC-MSMS

Las toxinas lipofiacutelicas a determinar en las muestras fueron aacutecido okadaico (AO) dinofisistoxina-2 (DTX2) dinofisistoxina-1 (DTX1) pectenotoxinas (PTX1 PTX2) azaspiraacutecidos (AZA1 AZA2 AZA3) yesotoxinas (YTX homoYTX 45OHYTX 45OHhomoYTX) y espiroacutelidos (SPX1) El anaacutelisis se realizoacute con los siguientes elementos

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SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo

5

Equipos

Sistema cromatograacutefico Acquity Ultra Performance (Coacutedigo B191C)

Espectroacutemetro de masas equipado con interfase ESI y taacutendem MSMS Xevo TQMS (Coacutedigo B192C)

Software del programa TargetLynx (Coacutedigo 196)

Columna cromatograacutefica de fase reversa C18 17 microm 21 x 100 mm Acquity UPLC BEH

Reactivos y disolventes

Metanol grado HPLC gradiente

H2O Milli-Q Ellix

Acetonitrilo grado HPLC o Hipergrado para LC-MS

Acido foacutermico 98-100

Hidroacutexido amoacutenico 25

MeOHAgua 50

AcetonitriloAgua 90

Aacutecido clorhiacutedrico 37

Disolucioacuten de aacutecido clorhiacutedrico 25 M Hidroacutexido Soacutedico (le 99 pureza)

Disolucioacuten de hidroacutexido soacutedico 25 M

Disolventes cromatograacuteficos

Disolucioacuten tampoacuten hidroacutexido amoacutenico al 0125

Fase moacutevil A Agua conteniendo 67 mM de NH4OH

Fase moacutevil B Acetonitrilo conteniendo 67 mM de NH4OH

Cada fase moacutevil se filtra a vaciacuteo a traveacutes de filtros de membrana de nylon de 022 microm

Toxinas de Referencia

Disolucioacuten certificada de aacutecido ocadaico en metanol (NRC CRM-OA-c) Cod PB015

Disolucioacuten certificada de Yessotoxina Yessotoxin di-sodium salt en metanol (CRM-00-YTX) Cod PB018

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Disolucioacuten certificada de Homo-yessotoxina 1aHomoyessotoxin di-sodium salt en metanol (CRM-00-hYTX) Cod PB019

Disolucioacuten certificada de calibracioacuten de Azaspiraacutecido 1 en metanol (NRC CRM-AZA1) Cod PB020

Disolucioacuten certificada de calibracioacuten de Azaspiraacutecido 2 en metanol (NRC CRM-AZA2) Cod PB021

Disolucioacuten certificada de calibracioacuten de Azaspiraacutecido 3 en metanol (NRC CRM-AZA3) Cod PB022

Disolucioacuten de calibracioacuten de Dinofisistoxina 2 en metanol (00-DTX2) Cod PB026

Disolucioacuten de calibracioacuten de Dinofisistoxina 1 en metanol (CRM-00-DTX1) Cod PB032

Disolucioacuten de calibracioacuten de Pectenotoxina 2 en metanol (00-PTX2) Cod PB031

Material de Referencia Certificado (Mussel Tissue Reference Material for DSP Toxins NRC CRM-DSP-Mus-b) con AO y DTX1 101 plusmn 08 microgg y 13 plusmn 02 microgg respectivamente Homogeneizado de mejilloacuten (Mytilus edulis) Cod PB014

Material de Referencia Certificado (Mussel Tissue Reference Material for AZA Toxins NRC CRM-AZA-Mus) con AZA1 116 plusmn 010 microgg AZA2 0273 plusmn 0023 microgg y AZA3 0211 plusmn 0022 microgg Homogeneizado de mejilloacuten (Mytilus edulis) Cod PB030

Disolucioacuten certificada de calibracioacuten de 13-dismetil espiroacutelido C en metanol (NRC CRM-SPX1) Cod PB027

La Tabla 1 muestra las condiciones cromatograacuteficas usando una columna de UPLC C18 en fase reversa y medio baacutesico mientras que los paraacutemetros de la fuente de ionizacioacuten para el Xevo TQMS (Waters) se muestran en la Tabla 2

34 Extraccioacuten de toxinas

A los extractos metanoacutelicos en seco de las 29 muestras de moluscos y 29 muestras de microalgas se le adicionaron hasta un total de 25 mL de metanol dispensadas en pequentildeas aliacutecuotas agitando el vial con un vortex durante 30 segundos Anaacutelisis de las formas libres del AO DTX1 y DTX2 y de las toxinas de los grupos PTXs AZAs y YTXs Para la determinacioacuten de las formas libres del AO DTX1 y DTX2 y de las toxinas de los grupos PTXs AZAs y YTXs se filtroacute un volumen de aproximadamente 12 ml del extracto metanoacutelico a traveacutes de filtros

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de jeringa de 045 microm para su posterior hidroacutelisis (seccioacuten siguiente) Otra aliacutecuota del mismo extracto filtrada a traveacutes de filtro de jeringa compatible con el disolvente de 022 microm se diluyoacute a la mitad con MeOH 100 y se inyectoacute 5 microl en el sistema LC-MSMS Hidroacutelisis y cuantificacioacuten del contenido total de AO DTX1 y DTX2 Para detectar y cuantificar el contenido total de AO DTX1 y DTX2 se requiere una hidroacutelisis baacutesica previa a la inyeccioacuten de los extractos en el sistema de LC-MSMS Procedimiento En un vial que contiene 1 ml de extracto metanoacutelico previamente filtrado por filtros de jeringa de 045 microm se antildeaden 125 microl de NaOH 25 M se agita manualmente 10 segundos y la mezcla fue sometida a 76 plusmn 4 ordmC durante 40 minutos en un bantildeo Se enfrioacute a temperatura ambiente se pesoacute y luego neutralizoacute con 125 microl de HCl 25 M Finalmente se homogenizoacute nuevamente con el vortex durante 30 segundos Una aliacutecuota del extracto resultante se filtroacute con filtros de jeringa de 022 microm y diluyoacute 58 con MeOH 100 Una aliacutecuota de 5 microl fue inyectada en el sistema de LC-MSMS Durante el proceso de hidroacutelisis el vial debe estar bien cerrado para evitar peacuterdidas por evaporacioacuten (la temperatura de ebullicioacuten del MeOH es 65 ordmC) Las peacuterdidas se pueden detectar mediante pesada del vial antes y despueacutes de la hidroacutelisis en caso de confirmarse se completaraacute el peso con metanol La deteccioacuten con el espectroacutemetro de masas se realizoacute usando dos transiciones por toxina la de mayor intensidad se utilizoacute para cuantificar y la de menor intensidad para confirmar (Tabla 3) Identificacioacuten y Confirmacioacuten La identificacioacuten de la presencia de toxinas se realizaraacute por comparacioacuten del tiempo de retencioacuten de cada una de las toxinas en la muestra con el tiempo de retencioacuten obtenido en las disoluciones de calibrado estaacutendar inyectadas en un mismo diacutea de anaacutelisis Se permite una desviacioacuten maacutexima entre ambos tiempos del 25 Para las toxinas que se cuantifican con la recta de calibrado del anaacutelogo correspondiente se establece un TRR con una tolerancia seguacuten se indica en la Tabla 4 Para una correcta identificacioacuten se exige una separacioacuten entre picos calculada mediante aplicacioacuten de la expresioacuten

2 x (RT2-RT1) RS = ----------------------

(W1+W2)

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En donde RT1 y RT2 y W1 y W2 son respectivamente los tiempos de retencioacuten y las anchuras en la liacutenea base de dos picos adyacentes RT2gtRT1 La resolucioacuten seraacute aceptable cuando Rs gt10 y la resolucioacuten a liacutenea base se consideraraacute completa cuando Rs gt15 La confirmacioacuten de la presencia de toxina seguacuten el criterio de la Decisioacuten de la Comisioacuten 2002657EC se basa en la relacioacuten entre las dos transiciones empleadas para la determinacioacuten (cuantificacioacuten y confirmacioacuten)

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4 RESULTADOS

41 Toxinas en moluscos

Las toxinas detectadas en moluscos fueron PTX2 YTX 45OHYTX DTX1 y SPX1 (Tabla 5) La mayor concentracioacuten la presentoacute el grupo de las YTXs (40-294 microg kg-1) en muestras de choritos provenientes del sector de Seno Otway (Fig 1) En este mismo sector las PTXs tambieacuten presentaron las mayores concentraciones (3-45 microg kg-1) en estos transvectores En el caso del ostioacuten tanto el PTX2 como las YTXs fueron detectadas en el contenido gaacutestrico El DTX1 fue detectado en choritos (1-18 microg kg-1 considerando DTX1 libre y total) procedentes del sector Seno Otway y sectores adyacentes a Punta Arenas El AO no fue detectado en ninguna aacuterea de la Regioacuten Los SPXs fueron principalmente detectados en choritos de las aacutereas centro y sur de Magallanes y en una estacioacuten del estero Peel (M13) en el aacuterea norte de la regioacuten No obstante que los niveles son muy bajos (01- 25 microg kg-1) incluso del nivel letal 50 en ratones inyectados intraperitonealmente 40 microg kg-1 (Richard et al 2000) los valores encontrados son iguales o mayor al encontrado en el caracol piquilhue recolectado en julio de 2012 y que en ese entonces produjo la muerte de ratones provocando el cierre de aacutereas de extraccioacuten por la autoridad de salud regional (Anexo 6) De las cinco toxinas detectadas en los moluscos solo DTX1 mostroacute estar localizada en el aacuterea centro de Magallanes mientras que las restantes fueron detectadas en las tres aacutereas de monitoreo Norte centro y sur de Magallanes No se encontraron PTX1 DTX2 ni AZPs en las muestras de moluscos Los resultados muestran que de los cuatro grupos de toxinas PTX YTXs DTXs y SPXs tres de ellas pueden estar presentes simultaacuteneamente en los moluscos vale decir PTXs YTXs y DTX1 o bien SPXs en vez de DTX1 42 Toxinas en microalgas

En las microalgas se detectaron PTXs y YTXs (Tabla 6) Las PTXs fueron detectadas aunque a nivel de trazas en ceacutelulas de D acuminata seleccionadas por micromanipulacioacuten desde muestras de agua procedentes de estero Silva Palma (M25) estero Wickham (M26) y Cutter Cove (M29) (Fig1) Tambieacuten fue detectada en filtrados de agua (fitoplancton) de Pto Fontaine (M21) e I Engelfield (M29N1) Las YTXs fueron detectadas en ceacutelulas de P reticulatum seleccionadas por micromanipulacioacuten y en cultivos de esta microalga que se logroacute establecer a partir de muestras de agua provenientes de C Adalberto (M04) Cutter Cove (M29) e I Engelfield (M29N1) Solo en los cultivos se detectoacute

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homoYTX y en uno de ellos tambieacuten se detectoacute aunque miacutenimamente 45OHYTX un derivado de la YTX que normalmente se encuentra en los moluscos como producto de bio-transformacioacuten La presencia de 45OHYTX en el cultivo pudo deberse a la presencia de ceacutelulas ya en fase de declinacioacuten de la curva de crecimiento

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5 ANAacuteLISIS Y DISCUSIOacuteN DE LOS DATOS

51 Toxinas en moluscos De las toxinas lipofiacutelicas se sabe que AO DTXs y AZAs causan trastornos gastrointestinales en los seres humanos (Gerssen et al 2010) Para las toxinas restantes (YTXs PTXs y SPXs) auacuten cuando no se han reportado casos de intoxicacioacuten en los seres humanos eacutestas son letales o altamente toacutexicas cuando los ratones son inyectados por viacutea intraperitoneal (Paz et al 2008 Richard et al 2000 Miles et al 2004) Es el caso de los SPXs la toxicidad en ratones inyectados por viacutea intraperitoneal supera a la del resto de las toxinas pues su dosis letal 50 es de 40 microg kg-1 (Richard et al 2000) Tal es asiacute que como referencia (Tabla 5) el transvector caracol piquilhue recolectadas en Julio de 2012 y cuyos niveles de toxicidad provocaron la muerte de los ratones solo presentoacute 01 microg kg-1 deteccioacuten que fue realizada durante este estudio en muestras de carne almacenadas durante no maacutes de 1 antildeo a -20 ordmC Sin embargo no se puede descartar una peacuterdida de la actividad por transformacioacuten durante el periodo de conservacioacuten A excepcioacuten de los SPXs el resto de las toxinas mencionadas estaacuten reguladas por la legislacioacuten europea tanto para consumo interno como importacioacuten de moluscos y tunicados para garantizar la salud de las personas Asiacute tambieacuten estaacuten reguladas por la legislacioacuten chilena a traveacutes del Instituto de Salud Puacuteblica (ISP) estableciendo los mismos niveles de referencia europeo en base al bioensayo ratoacuten Aun cuando los niveles de toxinas detectadas en los moluscos durante este estudio estaacuten por debajo de lo exigido por las regulaciones e incluso de los niveles propuestos por el EFSA (Tabla 7) la presencia de dos y tres tipos de toxinas en los moluscos representa una complejidad en la determinacioacuten de los niveles de toxicidad especialmente si se encuentran presentes toxinas altamente toacutexicas para ratones inyectados intraperitonealmente como son los SPXs Aunque se sospechaba la concurrencia de diferentes tipos de toxinas tal hecho no habiacutea sido confirmado anteriormente Sin embargo los SPXs siguen siendo una incoacutegnita pues se desconoce la fuente de estas toxinas A ostenfeldii la especie que podriacutea ser candidata a confirmar estuvo ausente (Tabla 8 modificado de Guzmaacuten et al 2014) durante el periodo en que se detectoacute en los moluscos Los escasos antecedentes toxigeacutenicos de esta especie en Chile la han confirmado como productora de toxinas paralizantes en Ayseacuten (Pizarro et al 2012) pero no de SPXs No obstante la produccioacuten de SPXs por esta especie en la regioacuten de Magallanes auacuten no se puede descartar Las YTXs fueron las toxinas maacutes abundantes en los moluscos analizados condicioacuten que se corresponde con la alta abundancia relativa de esta especie en el ambiente (Tabla 8) en la mayoriacutea de los casos (Tabla 5)

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Los resultados sugieren que los falsos positivos por bioensayo ratoacuten pudieran ser maacutes frecuentes de lo que se piensa actualmente para la regioacuten de Magallanes 52 Toxinas en microalgas Los resultados indican que P reticulatum encontrado en Magallanes producen YTXs al igual que las especies reportadas en la regioacuten de Antofagasta y Ayseacuten (Aacutelvarez et al 2011 Pizarro et al 2012) Tal resultado hace altamente probable que esta especie es la fuente de YTXs detectadas en los moluscos durante el periodo de estudio De acuerdo a las toxinas detectadas en las muestras de D acuminata aisladas asiacute como en el fitoplancton con gran abundancia de esta especie (Tabla 8) sugiere que esta microalga podriacutea ser una fuente primaria de PTXs tal como ocurre en el norte y sur del paiacutes (Blanco et al 2007 Fux et al 2011) Aunque la especie tambieacuten ha sido asociada a la presencia de DTX1 en moluscos en un evento toacutexico ocurrido en 1998 en Magallanes (Uribe et al 2001) el DTX1 no fue detectado en las muestras de D acuminata durante este estudio El no hallazgo de DTX1 en estas muestras pudo deberse a una fuente microalgal distinta como D acuta yo P lima D acuta ha sido asociada a DTX1 en moluscos de la regioacuten de Ayseacuten (Lembeye et al 1993 y Zhao et al 1993) mientras que P lima es productora solo de DTX1 en la regioacuten de Magallanes (Salgado et al 2012) Sin embargo cuando se detectoacute DTX1 en las muestras de moluscos durante este estudio D acuta estuvo ausente en las muestras de agua mientras que D acuminata presentoacute una abundancia relativa alta Por otro lado el volumen de resuspensioacuten de los extractos pudo ser elevado al seguir el mismo procedimiento protocolar que se aplica a las muestras de moluscos de acuerdo a la normativa europea actual Por tal razoacuten el LC-MSMS no logroacute detectar PTXs ni DTX1 en las muestras de microalgas En estos casos un protocolo para el anaacutelisis de las microalgas debiera incluir un volumen menor de resuspensioacuten de los extractos secos en referencia al utilizado para los moluscos o bien seleccionar por micromanipulacioacuten un nuacutemero mayor de microalgas (gt 130 ceacutelulas) Sin embargo esto uacuteltimo es maacutes difiacutecil de lograr en latitudes australes debido a la baja densidad de ceacutelulas en las que se presenta normalmente esta especie en condiciones naturales Por tal motivo se recomienda realizar pruebas con un volumen de resuspensioacuten menor a 1 mL aun cuando se trate de un LC-MSMS triple cuadrupolo

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6 CONCLUSIONES

a Los moluscos de la regioacuten de Magallanes pueden presentar PTX2 YTX 45OHYTX DTX1 y SPX1

b El hecho que los moluscos puedan presentar dos o maacutes tipos de toxinas lipofiacutelicas dificulta establecer el nivel de toxicidad total

c P reticulatum en Magallanes produce YTXs al igual que la especie del norte y sur del paiacutes

d La abundancia relativa ambiental de P reticulatum durante el periodo de estudio coincidioacute con la presencia de YTXs en los moluscos

e Los SPXs encontrados anteriormente en caracoles piquilhue tambieacuten fue posible detectarlos en choritos durante este estudio

f Auacuten queda por confirmar el tipo de SPXs presentes y su eventual fuente primaria La presencia de SPXs en los moluscos no siempre coincidioacute con la presencia de A ostenfeldii en el ambiente y su abundancia relativa maacutexima fue solo de nivel 1 (raro) durante el periodo de estudio

g La PTX2 detectada en los moluscos coincidioacute con una alta abundancia relativa ambiental de D acuminata No obstante auacuten queda por confirmar si esta especie es la fuente primaria Para ello se hace necesario ajustar (disminuir) el volumen de dilucioacuten de los extractos secos de microalgas aisladas por micromanipulacioacuten aun cuando se trata de un espectroacutemetro de masas como un triple cuadrupolo

h La deteccioacuten de DTX1 en los moluscos coincidioacute con la ausencia de D acuta en el ambiente La toxina tampoco fue detectada en los moluscos cuando esta microalga estuvo a niveles de 2 y 3 (escaso y regular) Queda por confirmar la produccioacuten de DTX1 por esta especie en Magallanes

i No se encontraron PTX1 DTX2 ni AZPs en las muestras de moluscos durante el periodo de estudio

j Los resultados demuestran la presencia de toxinas en los moluscos que se hace necesario identificar y cuantificar utilizando teacutecnicas distintas al bioensayo

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F I G U R A

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Figura 1 Estaciones y sectores muestreados (ciacuterculo rojo) y sector Fortuna donde fue recolectado el

caracol piquilhue (ciacuterculo amarillo)

T A B L A S

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Tabla 1 Condiciones cromatograacuteficas para el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas usando

una columna de UPLC C18 en fase reversa y medio baacutesico

Columna Acquity UPLC BEH C18 17 microm 21x100 mm

Temperatura columna 45 ordmC

Flujo 04 mlmin

Volumen inyeccioacuten 5 microl

Temperatura muestras 10 plusmn 5 ordmC

Gradiente

Tiempo (min) Fase A () Fase B ()

0 75 25

066 75 25

330 5 95

528 5 95

726 75 25

900 75 25

Tabla 2 Paraacutemetros de la fuente de ionizacioacuten para el Xevo TQMS (Waters) en la determinacioacuten de toxinas lipofiacutelicas

PARAacuteMETROS DE LA FUENTE

ESI- ESI+

AO DTX2 DTX1 YTX homoYTX 45OH YTX y 45OH

homoYTX

AZA1 AZA2 AZA3 PTX2 PTX1 y SPX1

Voltaje de capilar (V) 100 200

Temperatura de solvatacioacuten (ordmC) 450 450

Flujo gas de solvatacioacuten (lh) 850 850

Flujo gas cono (lh) 50 50

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Tabla 3

Resumen de las condiciones de espectrometriacutea de masas empleadas con el Xevo TQMS (Waters) en el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas

Compuesto tR (min)

ESI

Ioacuten Precursor

(mz)

Ioacuten Producto

(mz)

Dwell time (s)

Energiacutea colisioacuten

(eV)

Voltaje cono (V)

AO 189 NEG 8035 2552 0010 46 86

113 0010 56 86

DTX2 210 NEG 8035 2552 0010 46 86

113 0010 56 86

DTX1 214 NEG 8175 5634 0010 43 86

2552 0010 48 86

YTX 202 NEG 5704 4674 0010 30 45

3963 0010 35 45

45OH-YTX 182 NEG 5784 4674 0010 30 45

3964 0010 30 45

HomoYTX 203 NEG 5775 4744 0010 30 48

4034 0010 30 48

45OH-homoYTX 182 NEG 5855 4034 0010 30 45

4744 0010 30 45

PTX1 306 POS 8925 8395 0015 25 36

8215 0015 25 36

PTX2 362 POS 8765 8415 0015 20 36

8235 0015 25 36

AZA1 263 POS 8425 6545 0015 55 50

3622 0015 50 50

AZA2 270 POS 8565 6725 0015 45 27

6545 0015 45 27

AZA3 236 POS 8285 6404 0015 55 47

3622 0015 55 47

SPX1 368 POS 6925 6744 0015 27 60

1643 0015 42 60 Transicioacuten cuantificadora

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Tabla 4 TRR y valores de tolerancia para las toxinas analizadas

TOXINA TRR TOLERANCIA

Toxinas del grupo de AO

AO 1000 0990-1010

DTX2 1040 1014-1066

DTX1 1140 1111-1168

Toxinas del grupo de PTX

PTX2 1000 0990-1010

PTX1 0850 0829-0871

Toxinas del grupo de YTX

YTX 1000 0990-1010

45OH-YTX 0894 0871-0916

Homo YTX 1000 0990-1010

45OH-homoYTX 0899 0876-0921

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Tabla 5 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de moluscos

Nordm estMes

recolectaLocalidad Molusco

cuerpo

enterohepat

gramos

carne

toxicidad

VDM ratoacuten

PTX2

(ugKg)

YTX

(ugKg)

45OHYTX

(ugKg)

DTX1

libre

(ugKg)

DTX1

total

(ugkg)

SPX 1

(ugKg)

M13 ene-13 E Peel chorito x 5086 + 01 02

M13 ene-13 E Peel ostioacuten x 5155 No real izado 16 21

M33 ene-13 B Bell chorito x 5253 + 04

M37 ene-13 B Agua Fresca chorito x 5039 + 05 01

M35 ene-13 C San Isidro chorito x 5289 + 000 01

M42 ene-13 V Holanda chorito x 5231 + 06 13

M43 ene-13 B Yendegaia chorito x 5193 + 04 25

M45 ene-13 Pto Williams chorito x 5161 - 28 07

M08 feb-13 E Falcon cholga x 5027 - 14

M09 feb-13 E Penguumlin cholga x 5103 + 14

M22 feb-13 E de las Montantildeas cholga x 5052 - 26

M23 feb-13 I Ballesteros cholga x 5204 - 87

M24 feb-13 B Fanny chorito x 2016 - 38 1071 479 12

M25 feb-13 E Silva Palma chorito x 1447 - 59 1077 898 09

M26 feb-13 E Wickham chorito x 1093 - 194 2940 2232 66 66

M27 feb-13 E Sullivan chorito x 1137 - 450 1944 1478

M28 feb-13 E Nuntildeez chorito x 1179 + 33 721 407

M29 feb-13 Cutter Cove chorito x 1003 - 65 501 309

M29N1 feb-13 I Engelfield chorito x 1116 - 297 2007 1483

M31 feb-13 B Nash chorito x 2231 +

M33 feb-13 B Bell chorito x 1181 - 93

M34 feb-13 S Pedro chorito x 0726 -

M35 feb-13 C San Isidro chorito x 1178 + 110

M36 feb-13 B Buena chorito x 1367 +

M37 feb-13 B Agua Fresca chorito x 0850 + 45 100 80

M39 feb-13 Pto Zenteno chorito x 3241 + 28

M39N2 feb-13 Pta San Valentin chorito x 1712 - 11

M39N3 feb-13 Pto Yartou chorito x 2035 - 11

sector

Fortunajul-12 B Inuacutetil

caracol

piquilhuex 107000 + 01

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Tabla 6 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de microalgas

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Tabla 7 Niveles actualmente permitidos por la legislacioacuten europea (bioensayo) y los niveles propuestos por la

autoridad europea para la seguridad alimentaria (EFSA) (Gerssen et al 2010)

Toxin Legislacioacuten (μg kg-

1) Proposicioacuten

EFSA (μg kg-1)

Validacioacuten LC-MSMS

(μg kg-1)

OA and DTXs 160 45

PTXs 120

YTXs 1000 3750

AZAs 160 32

SPXs 400 (Gerssen et al2010)

European Food Safety Authority Decisioacuten 2002657 de la Unioacuten Europea EC Incluye PTXs

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Tabla 8 Abundancia relativa ambiental de las microalgas al momento de recolectar las muestras de moluscos En rojo se indica la deteccioacuten de toxina positiva en los moluscos asociada a la supuesta microalga fuente PTXs (D

acuminata) YTXs (P reticulatum) SPXs (A ostenfeldii) DTX1 (A acuta)

(Tabla modificada de Guzmaacuten et al 2014)

A N E X O S

ANEXO 1

Certificacioacuten laboratorio INTECMAR

ANEXO 2

Lista de anaacutelisis que realiza INTECMAR y sus costos (en euros) 2013

scv 1 de 7

GUIA PARA LA AUTOLIQUIDACIOacuteN DE TASAS A FAVOR DE LA COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA 2013 Los aspectos financieros de los servicios prestados por Intecmar en el marco de su actividad e vienen regulados en la Ley 62003 de 9 de diciembre de tasas precios y exenciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia (DOG nuacutem 240 de 11122003) y fueron actualizados posteriormente en la Ley 142010 de 27 de diciembre de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2011 (DOG nuacutem 250 de 30122010) y en la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013 (DOG nuacutem 42 de 28022013) Existen dos maneras de liquidar las tasas correspondientes a los servicios prestados por Intecmar

1 De forma manual cubriendo el modelo A de autoliquidacioacuten que se descarga en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda y que adjunto en pdf y se lleva al banco para su pago httpwwwconselleriadefacendaeswebportalconfeccion-impresos

2 De forma telemaacutetica en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda viacutenculo httpshostcixtecesXEITObinlionwebXeitodllxmit a traveacutes del modelo 730

Ambos modelos de liquidacioacuten de tasas adjuntamos ejemplo al final de este documento deben ser remitidos por mail a Intecmar con el sello del banco fiacutesico o virtual como paso previo a la emisioacuten del certificado Los coacutedigos generales necesarios son

minus Consejeriacutea de Medio Rural y de Mar Coacutedigo 09 minus Delegacioacuten de Pontevedra Coacutedigo 40 minus Servicio de Intecmar Coacutedigo 24

Los coacutedigos y descripcioacuten de las tasas son los regulados en la legislacioacuten vigente y los hemos resumido en los anexos siguientes Vilaxoaacuten 4 de marzo de 2013

scv 2 de 7

TARIFAS DE TASAS VIGENTES PARA 2013 - Ley 22013 d e 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013

(DOG nuacutem 42 de 28022013)

Estas tarifas son consecuencia de la actualizacioacuten de las tarifas contenidas en los anexos 1 2 3 4 y 5 de la Ley 62003 del 9 de diciembre de tasas precios y exacciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia por la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 Seraacuten aplicables desde el diacutea de la entrada en vigor de la Ley de

presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 TASA POR SERVICIOS ADMINISTRATIVOS

No sujecioacuten No se exigiraacute la tasa por servicios administrativos cuando se trate de compulsas o cotejos de documentos que deban acompantildear a solicitudes escritos o comunicaciones presentadas por el ciudadano y realizadas en el aacutembito de actuacioacuten de los registros seguacuten lo dispuesto en el artiacuteculo 385 de la Ley 301992 del 26 de noviembre de reacutegimen juriacutedico de las administraciones puacuteblicas y del procedimiento administrativo comuacuten

Excepciones Estaraacuten exentos de la presente tasa

1- La expedicioacuten de certificados de retribuciones satisfechas por la Xunta de Galicia con el objeto de justificacioacuten en relacioacuten con el impuesto sobre la renta de las personas fiacutesicas

2- La expedicioacuten de certificados y compulsa que el personal de la Administracioacuten solicite respecto a las necesidades propias del puesto de trabajo o relacioacuten de servicios

3- Los alumnos por cualquier actuacioacuten en materia de ensentildeanzas no universitarias

scv 3 de 7

4- Las compulsas realizadas en las oficinas de empleo para los desempleados en la tramitacioacuten de expedientes que sean competencia de dichas oficinas

5 La inscripcioacuten en las convocatorias para a seleccioacuten de personal de la comunidad autoacutenoma despueacutes de justificacioacuten documental solicitada por

- Personas con discapacidad igual o superior al 33 - Personas que sean miembros de familias numerosas clasificadas en la

categoriacutea especial Se aplicaraacute una bonificacioacuten del 50 a la inscripcioacuten solicitada por - Personas que sean miembros de familias numerosas de categoriacutea

general - Personas que figurasen como demandantes de empleo desde por lo

menos seis meses antes a la fecha de la convocatoria de pruebas selectivas de personal en las que soliciten su participacioacuten y no esteacuten percibiendo prestacioacuten o subsidio por desempleo

6- La expedicioacuten de certificados relativos a la situacioacuten fiscal 7- El Estado y los demaacutes entes puacuteblicos territoriales o institucionales

siempre que los servicios o actividades de que sean beneficiarios se presten o se realicen en el marco del principio de colaboracioacuten entre administraciones

8- Las viacutectimas de actos terroristas asiacute como sus coacutenyuges y sus hijos por cualquier actuacioacuten en materia educativa realizada en centros oficiales de estudios en todos los niveles de ensentildeanza

9- Los miembros de los organismos consultivos de la Administracioacuten puacuteblica gallega respecto de los certificados emitidos por dichos organismos

COacuteDIGO TASAS

DESCRIPCIOacuteN IMPORTE euro

314400 Prestacioacuten de servicios en el Instituto Tecnoloacutegico para el Control del Medio Marino de Galicia

314401 Anaacutelisis de biotoxinas marinas en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de Yasumoto 1978 4752

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en rato segundo o meacutetodo de Yasumoto 1984 5432

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS)

9520 -Anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten

seguacuten el meacutetodo de la AOAC 4752

scv 4 de 7

-Anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo da AOAC 4752

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1978 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10186

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1984 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10865

-Anaacutelisis combinada en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS) anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo AOAC y anaacutelisis de toxicidad de tipo ASP por cromatografiacutea liquida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo de la AOAC 15000

314402 Anaacutelisis de muestras en agua de mar -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton marino mediante

microscopiacutea oacuteptica 15133 -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton toacutexico marino

mediante microscopiacutea oacuteptica 13333 - Anaacutelisis de carbono orgaacutenico disuelto 5093 -Anaacutelisis de nutrientes inorgaacutenicos disueltos 3500 -Anaacutelisis de pigmentos fotosinteacuteticos (clorofila ldquoardquo) por

espectrofluorimetria 1698 314403 Anaacutelisis microbioloacutegicos en moluscos y otros organismos

procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Cuantificacioacuten de E Coli 10186 - Deteccioacuten de Salmonella spp 16975 -Enumeracioacuten de Escherichia coli en moluscos bivalvos

vivos por la teacutecnica de medida directa de impedancia con el sistema BacTrac 4300 6800

314404 Anaacutelisis de contaminantes de origen quiacutemica en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Determinacioacuten de metales pesados (Pb Cd Cu Zn As Hg Ni Cr Ag) mediante espectrofotometriacutea de absorcioacuten atoacutemica por metal

6790

-Determinacioacuten de compuestos bifenilos policlorados (PCB) mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

scv 5 de 7

-Determinacioacuten de pesticidas organoclorados mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

-Determinacioacuten de hidrocarburos aromaacuteticos policiacuteclicos (HAPs) mediante cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de fluorescencia

28200

314405 Anaacutelisis histopatoloacutegica de moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Estudio hispatoloacutegico Determinacioacuten de Bonamia Marteillia Perkinsus y otras alteraciones patoloacutegicas

101852

314406 Emisioacuten de certificaciones e informes teacutecnicos y otras actuaciones a peticioacuten del interesado

Emisioacuten de certificados a peticioacuten de los interesados sobre las actuaciones llevadas a cabo por el Instituto

1000

Emisioacuten de informes teacutecnicos a peticioacuten del interesado (euros por hora o fraccioacuten)

4000

scv 6 de 7

scv 7 de 7

ANEXO 3

Resultados de anaacutelisis en muestras de microalgas anteriormente enviadas procedentes de Magallanes por el equipo de espectrometriacutea de masas utilizado por INTECMAR Trabajo presentado a las XXXII

Congreso de Ciencias del Mar realizado en Punta Arenas 22-25 octubre de 2012

PERFIL DE TOXINAS DE PROROCENTRUM LIMA (DINOPHYCEAE) AISLADO DESDE LA COSTA DE MAGALLANES SUR DE CHILE P Salgado1 G Pizarro1 JM Franco2 P Rioboacute2 e I Bravo3

1Instituto de Fomento Pesquero (IFOP) Punta Arenas Chile gemitapizarroifopcl 2Instituto de Investigaciones Marinas (CSIC) Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea 3Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea

Prorocentrum lima (Ehrenberg) es un dinoflagelado marino bentoacutenico que se encuentra adherido generalmente

sobre macroalgas sedimentos y detrito flotante y menos comuacutenmente en el plancton (Bravo et al 2001) Es una especie neriacutetica y estuarina y su rango de distribucioacuten geograacutefica variacutea desde aguas costeras tropicales a templadas (Faust 1991) La importancia de P lima se debe a que son productoras de toxinas diarreogeacutenicas en las personas (veneno diarreico de los mariscos VDM) al igual que algunas especies de Dinophysis aunque raramente se le han asociado con episodios toacutexicos por VDM por su caraacutecter epiacutefito y bentoacutenico El complejo VDM producido por P lima incluye moleacuteculas conocidas como el aacutecido okadaico (AO) y derivados dinofisistoxinas (DTX-1 DTX-2) (Bravo et al 2001 Vale et al 2009) No obstante existen casos citados para USA donde se detectoacute toxicidad por VDM en bivalvos de cultivos asociadas a P lima aunque en bajos niveles (Maranda et al 2007a) En Canadaacute tambieacuten se llevoacute a cabo un estudio en moluscos de cultivo cuya finalidad fue determinar el origen del VDM en la que P lima fue la principal especie sospechosa tras la ocurrencia de un evento toacutexico humano por VDM ocurrido en 1998 (Levasseur et al 2003) y en antildeos anteriores (Quilliam et al 1993) Aunque Levasseur et al (2003) no logroacute probar la toxicidad de los mariscos en cultivo a causa de P lima cabe hacer notar que lo que buscaron fue OA y DTX1 no DTX 3 este uacuteltimo principal derivado de las anteriores tras su transformacioacuten en los moluscos (eg Suzuki et al 1999 Vale amp Sampayo 2002)

En consecuencia el rol de P lima en eventos toacutexicos por VDM auacuten no puede descartarse por cuanto podriacutean llegar a ser importantes en ambientes turbulentos debido a la eventual remocioacuten de microalgas adheridas en sustratos por efecto de vientos (Levasseur et al 2003) factor de importancia si se trata de sedimentos o contrariamente en zonas someras y estables de cultivos de moluscos que al mismo tiempo favorecen microambientes para sustratos en los que prolifera la epiacutefita P lima (Lawrence et al 2000) quedando expuestas a re-suspensiones temporales que favorecen la filtracioacuten de estas microalgas por los bivalvos en cultivo (Maranda et al 2007a)

Chile posee escaso conocimiento sobre esta especie en su medio natural incluido su perfil de toxinas y potencial rol en la toxificacioacuten de moluscos por VDM Por tal razoacuten resultoacute interesante aportar al conocimiento de estos aspectos en muestras de sedimentos recolectadas en el estrecho de Magallanes en las que esta especie se encontroacute inhabitualmente abundante

Las ceacutelulas utilizadas en este estudio fueron aisladas desde sedimentos superficiales (0-3 cm) recolectados en el invierno de 2010 en la localidad de cabo San Isidro durante el muestreo regular del programa de monitoreo de marea roja en la regioacuten de Magallanes En esa oportunidad se logroacute cuantificar hasta 1002 quistes tecadoscm3 de Prorocentrum lima la mayor concentracioacuten respecto a otros sitios de recolecta (Fig 1) Los sedimentos de esta localidad presentaron una coloracioacuten oscura y un fuerte olor a sulfuro de hidroacutegeno (H2S) producto de anoxia local

Se aislaron entre 27 y 87 quistes tecados (Fig 1 a) directamente desde los sedimentos mientras otras 60 ceacutelulas vegetativas (Fig 1 b) fueron aisladas luego de promover la actividad y divisioacuten de los quistes en condiciones de 15 ordmC y un ciclo de luzoscuridad de 1212 horas (Tabla 1) Para este fin se aislaron quistes tecados y trasvasijaron a placas Petri de 5 cm de diaacutemetro conteniendo 5 mL de medio de cultivo L1 Para el anaacutelisis de toxinas las ceacutelulas aisladas fueron trasvasijadas a un tubo Eppendorf de 15 mL y congelados a -80 ordmC Una aliacutecuota de sedimento huacutemedo (100 microL aproximados) tambieacuten fue vaciada en un tubo Eppendorf y congelado Para extraer la toxina se antildeadioacute 500 microL de metanol 100 a cada tubo se mezcloacute por 1 min y filtroacute por 045 microm trasvasijando a un vial El extracto fue secado bajo nitroacutegeno gas a 40 ordmC y conservado a 4 ordmC hasta su anaacutelisis Previo al anaacutelisis de toxinas los extractos fueron resuspendidos en 150 microl de metanol

La presencia de la toxina dinofisistoxina 1 (DTX-1) en las muestras (Fig2) fue confirmada en modo negativo a traveacutes de su ioacuten precursor [M-H]- mz 8175 y sus iones productos mz 5634 y 2552 mediante un cromatoacutegrafo UPLC Acquity Waters acoplado a un triple cuadrupolo Waters Xevo TQ (LC-MS) La columna utilizada fue una Acquity UPLC BEH C18 17microm 21 x 100 mm a 45 ordmC La fase moacutevil consistioacute en (A) hidroacutexido amoacutenico a pH 11 y (B) hidroacutexido amoacutenico en acetonitrilo (67 mM) con una tasa de flujo de 4 mLmin El gradiente de elucioacuten utilizado fue el siguiente mantencioacuten al 75 de A entre 0 y 066 min cambio a 5 de A entre 066 y 330 min mantener 5

de A entre 330 y 528 min recuperacioacuten del 75 de A entre 528 y 726 min mantencioacuten al 75 de A hasta 9 min Se pinchoacute 5microL de muestra en el LC-MS El contenido de DTX-1 en las muestras fue cuantificado en base al ion precursor

Los tres tipos de muestras fueron positivas a la presencia de DTX-1 pero las ceacutelulas vegetativas fueron las que presentaron un mayor contenido de DTX-1 por ceacutelula La deteccioacuten de DTX-1 en los sedimentos (Tabla 2) reflejoacute la presencia de los quistes tecados en eacutestos

Figura 1 Concentraciones de quistes tecados de Prorocentrum lima (quistescm3 de sedimento huacutemedo) en estaciones de muestreo en el Estrecho de Magallanes (M26 Estero Wickham M29N1 Isla Engenfield M31 Bahiacutea Nash M35 Cabo San Isidro M39C1 Bahiacutea Gente Grande M39C2 Bahiacutea Inuacutetil M39C3 Canal Gabriel) y Canal Beagle (M41 Ventisquero Espantildea M42 Ventisquero Holanda) (a) Quistes tecados (b) ceacutelulas vegetativas obtenidas de germinacioacuten de quistes tecados bajo condiciones de laboratorio Barra de escala 20 microm

Tabla 1 Sedimento y ceacutelulas de Prorocentrum lima aisladas para anaacutelisis de toxinas

Extracto metanoacutelico Nordm de ceacutelulas TR ngmL pg DTX-1 ceacutel

G1 quistes tecados 27 213 lt2 -

G2 quistes tecados 67 214 05 11

G3 quistes tecados 87 215 12 21

G4 ceacutelulas vegetativas 60 215 34 87

G6 sedimentos aliacutecuota 213 13 19 pg microL sed

TR tiempo de retencioacuten

Figura 2 Cromatogramas de extractos metanoacutelicos de Prorocentrum lima quistes tecados (a) ceacutelulas vegetativas (b) y sedimentos (c)

Tabla 2 Caracteriacutesticas del sedimento con quistes tecados de Prorocentrum lima

Tipo Tamantildeo (mm)

Grava 2 35

Arena media 025 - 05 32

Arena muy fina 0063 - 0125 2

Limo-arcilla lt 0063 1

Estos resultados constituyen otra eventual posibilidad de toxicidad en los moluscos por VDM no soacutelo de aquellos con modalidad de vida bentoacutenica superficial sino de aquellos que tambieacuten viven enterrados en la arena (eg almeja huepo) Maacutes auacuten si se conoce que P lima posee la capacidad de desarrollar poblaciones naturales en aguas templadas en nuacutemeros que podriacutean justificar una toxicidad por VDM en los mariscos (eg Maranda et al 2007a b)

Referencias

Bravo I ML Fernaacutendez I Ramilo amp A Martinez 2001 Toxin composition of the toxic dinofagellate Prorocentrum lima isolated from different locations along the Galician coast (NW Spain) Toxicon 39 1537ndash1545

Faust MA 1991 Morphology of ciguatera-causing Prorocentrum lima (Pyrrophyta) from widely differing sites J Phycol 27 642-648

Lawrence J E Grant J Quilliam M A Bauder A G amp Cembella A D 2000 Colonizaition and growth of the toxic dinoflagellate Prorocentrum lima and associated fouling macroalgae on mussels in suspended culture Mar Ecol Prog Ser 201 147-154

Levasseur M Couture J Y Weise A M Michaud S Elbrachter M Sauveacute G amp Bonneau E 2003 Pelagic and epiphytic summer distributions of Prorocentrum lima and P mexicanum at two mussel farms in the Gulf of St Lawrence Aquat Microbiol Ecol 30283-293

Maranda L Corwin S Dover S amp Morton S L 2007a Prorocentrum lima (Dinophyceae) in northeastern USA coastal waters II Toxin load in the epibiota and in shellfish Harmful Algae 6 632-641

Maranda L Corwin S Hargraves P E 2007b Prorocentrum lima (Dinophyceae) in 19 northeastern USA coastal waters I Abundance and distribution Harmful Algae 6 623ndash631

Quilliam MA Gilgan MW amp Pleasance S 1993 Confirmation of an incident of diarrhetic shellfish poisoning in eastern Canada In Smayda TJ Shimizu Y (Eds) Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea Elsevier New York pp 547ndash552

Suzuki T Ota H amp Yamasaki M 1999 Direct evidence of transformation of dinophysistoxin-1 to 7-O-acyl-dinophysistoxin-1 (Dinophysis-3) in the scallop Patinopecten yessoensis Toxicon 37 187-198

Vale P amp Sampayo M A 2002 First confirmation of human diarrhoeic poisonings by okadaic acid esters after ingestion of razor clams (Solen marginatus) and green crabs (Carcinus maenas) in Aveiro lagoon Portugal and detection of okadaic acid esters in phytoplankton Toxicon 40989-996

Vale P Veloso V amp Amorim A 2009 Toxin composition of a Prorocentrum lima strain isolated from the Portuguese coast Toxicon 54145ndash152

Agradecimientos Intecmar de la Xunta de Galicia Espantildea donde se realizaron los anaacutelisis de toxinas proyecto

SUBPESCA ldquoManejo y Monitoreo de Mareas Rojas en las regiones de Los Lagos Ayseacuten y Magallanes IV etapa 2010rdquo

ANEXO 4

Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten

ANEXO 5

Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de Magallanes

TASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

O

EJE

MP

LA

R P

AR

A E

L IN

TE

RE

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LIQ

UID

AC

IOacuteN

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

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IATASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

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Sello Fecha Nuacutemero

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BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

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NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

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9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

0 9

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2 4INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

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NTASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

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Sello Fecha Nuacutemero

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BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

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NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

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AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

9520 euros

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CONSELLERIA DE FACENDA

ANEXO 6

Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para cierre

de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

Seccioacuten Ediciones y Produccioacuten Almte Manuel Blanco Encalada 839

Fono 56-32-2151500 Valparaiacuteso Chile

wwwifopcl

Page 9: “Análisis de toxinas lipofílicas mediante LC-MS/MS en ...metadatos.mma.gob.cl/sinia/Informe_final_Analisis_toxinas_lipofilicas_656-055.pdfSUBSECRETARÍA DE ECONOMÍA: INFORME FINAL:

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo

2

2 OBJETIVOS 21 General del proyecto

Establecer mediante LC-MSMS los perfiles de toxinas lipofiacutelicas en muestras de moluscos y de plancton recolectadas durante la floracioacuten de dinoflagelados ocurrida durante el verano 2013 en la regioacuten de Magallanes

22 Objetivo especiacutefico

Establecer los perfiles de toxinas lipofiacutelicas en transvectores centinelas fitoplancton y microalgas aisladas por micromanipulacioacuten recolectados en diferentes sectores de Magallanes durante el monitoreo regular realizados durante una floracioacuten de Dinophysis spp y Protoceratium reticulatum

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SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo

3

3 METODOLOGIacuteA En esta seccioacuten se describen las metodologiacuteas asociadas a las actividades realizadas para el logro de los objetivos asiacute como tambieacuten los conceptos e ideas que la fundamentan

31 Obtencioacuten del extracto - Carne de mariscos Dependiendo de la cantidad de material se procesoacute soacutelo el hepatopaacutencreas

o carne total Se maceroacute y pesoacute el material Se realizoacute extraccioacuten con metanol en una de 11 pv Los extractos fueron centrifugados y el sobrenadante filtrado por filtros de nylon de 045 microm y vaciado a un vial

- Extracto en metanol de muestras de fitoplancton (ie el ensamble total de microalgas sin separar

especies) Aliacutecuotas de agua previamente filtradas por malla de 250 microm para eliminar el zooplancton de tamantildeo mayor fueron filtradas en filtros de fibra de vidrio muflados de 13 mm de diaacutemetro (tamantildeo de poro nominal de 07 microm) Los filtros fueron puestos por separado seguacuten sitio de recolecta y fecha en ependorfs de 15 ml y congelados hasta ser extraiacutedos con 1 mL de metanol centrifugados El sobrenadante fue filtrado por filtros de nylon de 045 microm y vaciado a un vial

- Extracto en metanol de D acuminata y P reticulatum La microalgas aisladas por

micromanipulacioacuten bajo un microscopio invertido (siempre y cuando el nuacutemero de D acuminata y de P reticulatum fuera suficiente como para lograr reunir un nuacutemero cercano a las 30 ceacutelulas por cada especie) fueron puestas en un ependorf de 15 ml con 1 ml de metanol Para obtener el extracto de toxina las muestras fueron mezcladas en vortex y filtradas por filtros de nylon de 045 microm El extracto filtrado fue puesto en un vial Solo en una ocasioacuten fue posible acumular un nuacutemero suficiente de ceacutelulas de D acuta por ello fue posible obtener solo una muestra para esta especie

- Todos los extractos fueron secados con nitroacutegeno gas a 38ordmC Este proceso evita los problemas

de traslado de extractos en solventes orgaacutenicos y yo evitar eventuales peacuterdidas de liacutequidos en las muestras durante el trayecto

32 Laboratorio de anaacutelisis dotado de LC-MSMS La metodologiacutea para el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas se realizoacute mediante espectrometriacutea de masas acoplada a un cromatoacutegrafo liacutequido (LC-MSMS) Por tratarse de una teacutecnica auacuten no implementada en Chile en aspectos de determinacioacuten de toxinas marinas a nivel comercial y certificada ni tampoco para realizar investigacioacuten baacutesica de rutina fue necesario enviar las muestras a un laboratorio extranjero certificado Tal laboratorio pertenece al Instituto Tecnoloacutegico del Mar (INTECMAR) Galicia Espantildea

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4

El contacto se realizoacute a traveacutes de grupos de investigacioacuten extranjeros de vasta y reconocida experiencia en el tema para prospectar la factibilidad de donde realizar los anaacutelisis Los mismos aconsejaron al laboratorio perteneciente a INTECMAR INTECMAR es una entidad de investigacioacuten estatal encargada de realizar los monitoreos semanales en Galicia donde tambieacuten se encuentra fiacutesicamente su sede Actualmente estaacute certificada para la deteccioacuten de toxinas lipofiacutelicas en moluscos entre otros anaacutelisis que realiza (Anexo 1 y 2) El Anexo 2 contiene el costo del anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas (equivalente a cotizacioacuten) El laboratorio seleccionado posee un cromatoacutegrafo UPLC Acquity Waters acoplado a un triple cuadrupolo Waters Xevo TQ con la suficiente sensibilidad en la deteccioacuten de toxinas en microalgas aisladas por micromanipulacioacuten sensibilidad que fuera confirmada anteriormente al establecer cuantitativamente el perfil de toxinas lipofiacutelicas en muestras de microalgas aisladas desde muestras de sedimentos de Magallanes (ver Anexo 3) Previo al enviacuteo de extractos de moluscos y contrato de ensayo de anaacutelisis exigido por INTECMAR se realizoacute la consulta acerca de nuestro intereacutes tambieacuten por analizar toxinas en microalgas aun cuando no estuviesen certificados en esta matriz en particular La solicitud de anaacutelisis fue aceptada por parte de INTECMAR Una vez aceptado el contrato de ensayo por parte de INTECMAR (Anexo 4) se procedioacute entonces a enviar las muestras de 29 extractos de microalgas y 29 extractos de moluscos mientras INTECMAR facturoacute por costos de anaacutelisis solicitados por IFOP en el contrato de ensayo (Anexo 5) Si bien el nuacutemero de extractos obtenidos fue cercano a las 140 muestras el nuacutemero de muestras enviadas se ajustoacute al presupuesto otorgado para este proyecto al mismo tiempo que la informacioacuten obtenida fuera suficiente como para tener una visioacuten regional de los perfiles de toxinas que estuvieron presentes durante la floracioacuten estival de 2013 33 Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por LC-MSMS

Las toxinas lipofiacutelicas a determinar en las muestras fueron aacutecido okadaico (AO) dinofisistoxina-2 (DTX2) dinofisistoxina-1 (DTX1) pectenotoxinas (PTX1 PTX2) azaspiraacutecidos (AZA1 AZA2 AZA3) yesotoxinas (YTX homoYTX 45OHYTX 45OHhomoYTX) y espiroacutelidos (SPX1) El anaacutelisis se realizoacute con los siguientes elementos

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5

Equipos

Sistema cromatograacutefico Acquity Ultra Performance (Coacutedigo B191C)

Espectroacutemetro de masas equipado con interfase ESI y taacutendem MSMS Xevo TQMS (Coacutedigo B192C)

Software del programa TargetLynx (Coacutedigo 196)

Columna cromatograacutefica de fase reversa C18 17 microm 21 x 100 mm Acquity UPLC BEH

Reactivos y disolventes

Metanol grado HPLC gradiente

H2O Milli-Q Ellix

Acetonitrilo grado HPLC o Hipergrado para LC-MS

Acido foacutermico 98-100

Hidroacutexido amoacutenico 25

MeOHAgua 50

AcetonitriloAgua 90

Aacutecido clorhiacutedrico 37

Disolucioacuten de aacutecido clorhiacutedrico 25 M Hidroacutexido Soacutedico (le 99 pureza)

Disolucioacuten de hidroacutexido soacutedico 25 M

Disolventes cromatograacuteficos

Disolucioacuten tampoacuten hidroacutexido amoacutenico al 0125

Fase moacutevil A Agua conteniendo 67 mM de NH4OH

Fase moacutevil B Acetonitrilo conteniendo 67 mM de NH4OH

Cada fase moacutevil se filtra a vaciacuteo a traveacutes de filtros de membrana de nylon de 022 microm

Toxinas de Referencia

Disolucioacuten certificada de aacutecido ocadaico en metanol (NRC CRM-OA-c) Cod PB015

Disolucioacuten certificada de Yessotoxina Yessotoxin di-sodium salt en metanol (CRM-00-YTX) Cod PB018

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6

Disolucioacuten certificada de Homo-yessotoxina 1aHomoyessotoxin di-sodium salt en metanol (CRM-00-hYTX) Cod PB019

Disolucioacuten certificada de calibracioacuten de Azaspiraacutecido 1 en metanol (NRC CRM-AZA1) Cod PB020

Disolucioacuten certificada de calibracioacuten de Azaspiraacutecido 2 en metanol (NRC CRM-AZA2) Cod PB021

Disolucioacuten certificada de calibracioacuten de Azaspiraacutecido 3 en metanol (NRC CRM-AZA3) Cod PB022

Disolucioacuten de calibracioacuten de Dinofisistoxina 2 en metanol (00-DTX2) Cod PB026

Disolucioacuten de calibracioacuten de Dinofisistoxina 1 en metanol (CRM-00-DTX1) Cod PB032

Disolucioacuten de calibracioacuten de Pectenotoxina 2 en metanol (00-PTX2) Cod PB031

Material de Referencia Certificado (Mussel Tissue Reference Material for DSP Toxins NRC CRM-DSP-Mus-b) con AO y DTX1 101 plusmn 08 microgg y 13 plusmn 02 microgg respectivamente Homogeneizado de mejilloacuten (Mytilus edulis) Cod PB014

Material de Referencia Certificado (Mussel Tissue Reference Material for AZA Toxins NRC CRM-AZA-Mus) con AZA1 116 plusmn 010 microgg AZA2 0273 plusmn 0023 microgg y AZA3 0211 plusmn 0022 microgg Homogeneizado de mejilloacuten (Mytilus edulis) Cod PB030

Disolucioacuten certificada de calibracioacuten de 13-dismetil espiroacutelido C en metanol (NRC CRM-SPX1) Cod PB027

La Tabla 1 muestra las condiciones cromatograacuteficas usando una columna de UPLC C18 en fase reversa y medio baacutesico mientras que los paraacutemetros de la fuente de ionizacioacuten para el Xevo TQMS (Waters) se muestran en la Tabla 2

34 Extraccioacuten de toxinas

A los extractos metanoacutelicos en seco de las 29 muestras de moluscos y 29 muestras de microalgas se le adicionaron hasta un total de 25 mL de metanol dispensadas en pequentildeas aliacutecuotas agitando el vial con un vortex durante 30 segundos Anaacutelisis de las formas libres del AO DTX1 y DTX2 y de las toxinas de los grupos PTXs AZAs y YTXs Para la determinacioacuten de las formas libres del AO DTX1 y DTX2 y de las toxinas de los grupos PTXs AZAs y YTXs se filtroacute un volumen de aproximadamente 12 ml del extracto metanoacutelico a traveacutes de filtros

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de jeringa de 045 microm para su posterior hidroacutelisis (seccioacuten siguiente) Otra aliacutecuota del mismo extracto filtrada a traveacutes de filtro de jeringa compatible con el disolvente de 022 microm se diluyoacute a la mitad con MeOH 100 y se inyectoacute 5 microl en el sistema LC-MSMS Hidroacutelisis y cuantificacioacuten del contenido total de AO DTX1 y DTX2 Para detectar y cuantificar el contenido total de AO DTX1 y DTX2 se requiere una hidroacutelisis baacutesica previa a la inyeccioacuten de los extractos en el sistema de LC-MSMS Procedimiento En un vial que contiene 1 ml de extracto metanoacutelico previamente filtrado por filtros de jeringa de 045 microm se antildeaden 125 microl de NaOH 25 M se agita manualmente 10 segundos y la mezcla fue sometida a 76 plusmn 4 ordmC durante 40 minutos en un bantildeo Se enfrioacute a temperatura ambiente se pesoacute y luego neutralizoacute con 125 microl de HCl 25 M Finalmente se homogenizoacute nuevamente con el vortex durante 30 segundos Una aliacutecuota del extracto resultante se filtroacute con filtros de jeringa de 022 microm y diluyoacute 58 con MeOH 100 Una aliacutecuota de 5 microl fue inyectada en el sistema de LC-MSMS Durante el proceso de hidroacutelisis el vial debe estar bien cerrado para evitar peacuterdidas por evaporacioacuten (la temperatura de ebullicioacuten del MeOH es 65 ordmC) Las peacuterdidas se pueden detectar mediante pesada del vial antes y despueacutes de la hidroacutelisis en caso de confirmarse se completaraacute el peso con metanol La deteccioacuten con el espectroacutemetro de masas se realizoacute usando dos transiciones por toxina la de mayor intensidad se utilizoacute para cuantificar y la de menor intensidad para confirmar (Tabla 3) Identificacioacuten y Confirmacioacuten La identificacioacuten de la presencia de toxinas se realizaraacute por comparacioacuten del tiempo de retencioacuten de cada una de las toxinas en la muestra con el tiempo de retencioacuten obtenido en las disoluciones de calibrado estaacutendar inyectadas en un mismo diacutea de anaacutelisis Se permite una desviacioacuten maacutexima entre ambos tiempos del 25 Para las toxinas que se cuantifican con la recta de calibrado del anaacutelogo correspondiente se establece un TRR con una tolerancia seguacuten se indica en la Tabla 4 Para una correcta identificacioacuten se exige una separacioacuten entre picos calculada mediante aplicacioacuten de la expresioacuten

2 x (RT2-RT1) RS = ----------------------

(W1+W2)

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En donde RT1 y RT2 y W1 y W2 son respectivamente los tiempos de retencioacuten y las anchuras en la liacutenea base de dos picos adyacentes RT2gtRT1 La resolucioacuten seraacute aceptable cuando Rs gt10 y la resolucioacuten a liacutenea base se consideraraacute completa cuando Rs gt15 La confirmacioacuten de la presencia de toxina seguacuten el criterio de la Decisioacuten de la Comisioacuten 2002657EC se basa en la relacioacuten entre las dos transiciones empleadas para la determinacioacuten (cuantificacioacuten y confirmacioacuten)

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9

4 RESULTADOS

41 Toxinas en moluscos

Las toxinas detectadas en moluscos fueron PTX2 YTX 45OHYTX DTX1 y SPX1 (Tabla 5) La mayor concentracioacuten la presentoacute el grupo de las YTXs (40-294 microg kg-1) en muestras de choritos provenientes del sector de Seno Otway (Fig 1) En este mismo sector las PTXs tambieacuten presentaron las mayores concentraciones (3-45 microg kg-1) en estos transvectores En el caso del ostioacuten tanto el PTX2 como las YTXs fueron detectadas en el contenido gaacutestrico El DTX1 fue detectado en choritos (1-18 microg kg-1 considerando DTX1 libre y total) procedentes del sector Seno Otway y sectores adyacentes a Punta Arenas El AO no fue detectado en ninguna aacuterea de la Regioacuten Los SPXs fueron principalmente detectados en choritos de las aacutereas centro y sur de Magallanes y en una estacioacuten del estero Peel (M13) en el aacuterea norte de la regioacuten No obstante que los niveles son muy bajos (01- 25 microg kg-1) incluso del nivel letal 50 en ratones inyectados intraperitonealmente 40 microg kg-1 (Richard et al 2000) los valores encontrados son iguales o mayor al encontrado en el caracol piquilhue recolectado en julio de 2012 y que en ese entonces produjo la muerte de ratones provocando el cierre de aacutereas de extraccioacuten por la autoridad de salud regional (Anexo 6) De las cinco toxinas detectadas en los moluscos solo DTX1 mostroacute estar localizada en el aacuterea centro de Magallanes mientras que las restantes fueron detectadas en las tres aacutereas de monitoreo Norte centro y sur de Magallanes No se encontraron PTX1 DTX2 ni AZPs en las muestras de moluscos Los resultados muestran que de los cuatro grupos de toxinas PTX YTXs DTXs y SPXs tres de ellas pueden estar presentes simultaacuteneamente en los moluscos vale decir PTXs YTXs y DTX1 o bien SPXs en vez de DTX1 42 Toxinas en microalgas

En las microalgas se detectaron PTXs y YTXs (Tabla 6) Las PTXs fueron detectadas aunque a nivel de trazas en ceacutelulas de D acuminata seleccionadas por micromanipulacioacuten desde muestras de agua procedentes de estero Silva Palma (M25) estero Wickham (M26) y Cutter Cove (M29) (Fig1) Tambieacuten fue detectada en filtrados de agua (fitoplancton) de Pto Fontaine (M21) e I Engelfield (M29N1) Las YTXs fueron detectadas en ceacutelulas de P reticulatum seleccionadas por micromanipulacioacuten y en cultivos de esta microalga que se logroacute establecer a partir de muestras de agua provenientes de C Adalberto (M04) Cutter Cove (M29) e I Engelfield (M29N1) Solo en los cultivos se detectoacute

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homoYTX y en uno de ellos tambieacuten se detectoacute aunque miacutenimamente 45OHYTX un derivado de la YTX que normalmente se encuentra en los moluscos como producto de bio-transformacioacuten La presencia de 45OHYTX en el cultivo pudo deberse a la presencia de ceacutelulas ya en fase de declinacioacuten de la curva de crecimiento

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5 ANAacuteLISIS Y DISCUSIOacuteN DE LOS DATOS

51 Toxinas en moluscos De las toxinas lipofiacutelicas se sabe que AO DTXs y AZAs causan trastornos gastrointestinales en los seres humanos (Gerssen et al 2010) Para las toxinas restantes (YTXs PTXs y SPXs) auacuten cuando no se han reportado casos de intoxicacioacuten en los seres humanos eacutestas son letales o altamente toacutexicas cuando los ratones son inyectados por viacutea intraperitoneal (Paz et al 2008 Richard et al 2000 Miles et al 2004) Es el caso de los SPXs la toxicidad en ratones inyectados por viacutea intraperitoneal supera a la del resto de las toxinas pues su dosis letal 50 es de 40 microg kg-1 (Richard et al 2000) Tal es asiacute que como referencia (Tabla 5) el transvector caracol piquilhue recolectadas en Julio de 2012 y cuyos niveles de toxicidad provocaron la muerte de los ratones solo presentoacute 01 microg kg-1 deteccioacuten que fue realizada durante este estudio en muestras de carne almacenadas durante no maacutes de 1 antildeo a -20 ordmC Sin embargo no se puede descartar una peacuterdida de la actividad por transformacioacuten durante el periodo de conservacioacuten A excepcioacuten de los SPXs el resto de las toxinas mencionadas estaacuten reguladas por la legislacioacuten europea tanto para consumo interno como importacioacuten de moluscos y tunicados para garantizar la salud de las personas Asiacute tambieacuten estaacuten reguladas por la legislacioacuten chilena a traveacutes del Instituto de Salud Puacuteblica (ISP) estableciendo los mismos niveles de referencia europeo en base al bioensayo ratoacuten Aun cuando los niveles de toxinas detectadas en los moluscos durante este estudio estaacuten por debajo de lo exigido por las regulaciones e incluso de los niveles propuestos por el EFSA (Tabla 7) la presencia de dos y tres tipos de toxinas en los moluscos representa una complejidad en la determinacioacuten de los niveles de toxicidad especialmente si se encuentran presentes toxinas altamente toacutexicas para ratones inyectados intraperitonealmente como son los SPXs Aunque se sospechaba la concurrencia de diferentes tipos de toxinas tal hecho no habiacutea sido confirmado anteriormente Sin embargo los SPXs siguen siendo una incoacutegnita pues se desconoce la fuente de estas toxinas A ostenfeldii la especie que podriacutea ser candidata a confirmar estuvo ausente (Tabla 8 modificado de Guzmaacuten et al 2014) durante el periodo en que se detectoacute en los moluscos Los escasos antecedentes toxigeacutenicos de esta especie en Chile la han confirmado como productora de toxinas paralizantes en Ayseacuten (Pizarro et al 2012) pero no de SPXs No obstante la produccioacuten de SPXs por esta especie en la regioacuten de Magallanes auacuten no se puede descartar Las YTXs fueron las toxinas maacutes abundantes en los moluscos analizados condicioacuten que se corresponde con la alta abundancia relativa de esta especie en el ambiente (Tabla 8) en la mayoriacutea de los casos (Tabla 5)

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Los resultados sugieren que los falsos positivos por bioensayo ratoacuten pudieran ser maacutes frecuentes de lo que se piensa actualmente para la regioacuten de Magallanes 52 Toxinas en microalgas Los resultados indican que P reticulatum encontrado en Magallanes producen YTXs al igual que las especies reportadas en la regioacuten de Antofagasta y Ayseacuten (Aacutelvarez et al 2011 Pizarro et al 2012) Tal resultado hace altamente probable que esta especie es la fuente de YTXs detectadas en los moluscos durante el periodo de estudio De acuerdo a las toxinas detectadas en las muestras de D acuminata aisladas asiacute como en el fitoplancton con gran abundancia de esta especie (Tabla 8) sugiere que esta microalga podriacutea ser una fuente primaria de PTXs tal como ocurre en el norte y sur del paiacutes (Blanco et al 2007 Fux et al 2011) Aunque la especie tambieacuten ha sido asociada a la presencia de DTX1 en moluscos en un evento toacutexico ocurrido en 1998 en Magallanes (Uribe et al 2001) el DTX1 no fue detectado en las muestras de D acuminata durante este estudio El no hallazgo de DTX1 en estas muestras pudo deberse a una fuente microalgal distinta como D acuta yo P lima D acuta ha sido asociada a DTX1 en moluscos de la regioacuten de Ayseacuten (Lembeye et al 1993 y Zhao et al 1993) mientras que P lima es productora solo de DTX1 en la regioacuten de Magallanes (Salgado et al 2012) Sin embargo cuando se detectoacute DTX1 en las muestras de moluscos durante este estudio D acuta estuvo ausente en las muestras de agua mientras que D acuminata presentoacute una abundancia relativa alta Por otro lado el volumen de resuspensioacuten de los extractos pudo ser elevado al seguir el mismo procedimiento protocolar que se aplica a las muestras de moluscos de acuerdo a la normativa europea actual Por tal razoacuten el LC-MSMS no logroacute detectar PTXs ni DTX1 en las muestras de microalgas En estos casos un protocolo para el anaacutelisis de las microalgas debiera incluir un volumen menor de resuspensioacuten de los extractos secos en referencia al utilizado para los moluscos o bien seleccionar por micromanipulacioacuten un nuacutemero mayor de microalgas (gt 130 ceacutelulas) Sin embargo esto uacuteltimo es maacutes difiacutecil de lograr en latitudes australes debido a la baja densidad de ceacutelulas en las que se presenta normalmente esta especie en condiciones naturales Por tal motivo se recomienda realizar pruebas con un volumen de resuspensioacuten menor a 1 mL aun cuando se trate de un LC-MSMS triple cuadrupolo

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13

6 CONCLUSIONES

a Los moluscos de la regioacuten de Magallanes pueden presentar PTX2 YTX 45OHYTX DTX1 y SPX1

b El hecho que los moluscos puedan presentar dos o maacutes tipos de toxinas lipofiacutelicas dificulta establecer el nivel de toxicidad total

c P reticulatum en Magallanes produce YTXs al igual que la especie del norte y sur del paiacutes

d La abundancia relativa ambiental de P reticulatum durante el periodo de estudio coincidioacute con la presencia de YTXs en los moluscos

e Los SPXs encontrados anteriormente en caracoles piquilhue tambieacuten fue posible detectarlos en choritos durante este estudio

f Auacuten queda por confirmar el tipo de SPXs presentes y su eventual fuente primaria La presencia de SPXs en los moluscos no siempre coincidioacute con la presencia de A ostenfeldii en el ambiente y su abundancia relativa maacutexima fue solo de nivel 1 (raro) durante el periodo de estudio

g La PTX2 detectada en los moluscos coincidioacute con una alta abundancia relativa ambiental de D acuminata No obstante auacuten queda por confirmar si esta especie es la fuente primaria Para ello se hace necesario ajustar (disminuir) el volumen de dilucioacuten de los extractos secos de microalgas aisladas por micromanipulacioacuten aun cuando se trata de un espectroacutemetro de masas como un triple cuadrupolo

h La deteccioacuten de DTX1 en los moluscos coincidioacute con la ausencia de D acuta en el ambiente La toxina tampoco fue detectada en los moluscos cuando esta microalga estuvo a niveles de 2 y 3 (escaso y regular) Queda por confirmar la produccioacuten de DTX1 por esta especie en Magallanes

i No se encontraron PTX1 DTX2 ni AZPs en las muestras de moluscos durante el periodo de estudio

j Los resultados demuestran la presencia de toxinas en los moluscos que se hace necesario identificar y cuantificar utilizando teacutecnicas distintas al bioensayo

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(Dinophyceae) aislado desde la costa de Magallanes sur de Chile In Proceedings of Libro de resuacutemenes del XXXII Congreso de Ciencias del Mar Punta Arenas Chile 22-26 de Octubre 2012 p 228

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southeastern Pacific Ocean reveal a diverse but patchy distribution of phycotoxins Toxicon 58(5) 389ndash397

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F I G U R A

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Figura 1 Estaciones y sectores muestreados (ciacuterculo rojo) y sector Fortuna donde fue recolectado el

caracol piquilhue (ciacuterculo amarillo)

T A B L A S

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Tabla 1 Condiciones cromatograacuteficas para el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas usando

una columna de UPLC C18 en fase reversa y medio baacutesico

Columna Acquity UPLC BEH C18 17 microm 21x100 mm

Temperatura columna 45 ordmC

Flujo 04 mlmin

Volumen inyeccioacuten 5 microl

Temperatura muestras 10 plusmn 5 ordmC

Gradiente

Tiempo (min) Fase A () Fase B ()

0 75 25

066 75 25

330 5 95

528 5 95

726 75 25

900 75 25

Tabla 2 Paraacutemetros de la fuente de ionizacioacuten para el Xevo TQMS (Waters) en la determinacioacuten de toxinas lipofiacutelicas

PARAacuteMETROS DE LA FUENTE

ESI- ESI+

AO DTX2 DTX1 YTX homoYTX 45OH YTX y 45OH

homoYTX

AZA1 AZA2 AZA3 PTX2 PTX1 y SPX1

Voltaje de capilar (V) 100 200

Temperatura de solvatacioacuten (ordmC) 450 450

Flujo gas de solvatacioacuten (lh) 850 850

Flujo gas cono (lh) 50 50

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Tabla 3

Resumen de las condiciones de espectrometriacutea de masas empleadas con el Xevo TQMS (Waters) en el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas

Compuesto tR (min)

ESI

Ioacuten Precursor

(mz)

Ioacuten Producto

(mz)

Dwell time (s)

Energiacutea colisioacuten

(eV)

Voltaje cono (V)

AO 189 NEG 8035 2552 0010 46 86

113 0010 56 86

DTX2 210 NEG 8035 2552 0010 46 86

113 0010 56 86

DTX1 214 NEG 8175 5634 0010 43 86

2552 0010 48 86

YTX 202 NEG 5704 4674 0010 30 45

3963 0010 35 45

45OH-YTX 182 NEG 5784 4674 0010 30 45

3964 0010 30 45

HomoYTX 203 NEG 5775 4744 0010 30 48

4034 0010 30 48

45OH-homoYTX 182 NEG 5855 4034 0010 30 45

4744 0010 30 45

PTX1 306 POS 8925 8395 0015 25 36

8215 0015 25 36

PTX2 362 POS 8765 8415 0015 20 36

8235 0015 25 36

AZA1 263 POS 8425 6545 0015 55 50

3622 0015 50 50

AZA2 270 POS 8565 6725 0015 45 27

6545 0015 45 27

AZA3 236 POS 8285 6404 0015 55 47

3622 0015 55 47

SPX1 368 POS 6925 6744 0015 27 60

1643 0015 42 60 Transicioacuten cuantificadora

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Tabla 4 TRR y valores de tolerancia para las toxinas analizadas

TOXINA TRR TOLERANCIA

Toxinas del grupo de AO

AO 1000 0990-1010

DTX2 1040 1014-1066

DTX1 1140 1111-1168

Toxinas del grupo de PTX

PTX2 1000 0990-1010

PTX1 0850 0829-0871

Toxinas del grupo de YTX

YTX 1000 0990-1010

45OH-YTX 0894 0871-0916

Homo YTX 1000 0990-1010

45OH-homoYTX 0899 0876-0921

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Tabla 5 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de moluscos

Nordm estMes

recolectaLocalidad Molusco

cuerpo

enterohepat

gramos

carne

toxicidad

VDM ratoacuten

PTX2

(ugKg)

YTX

(ugKg)

45OHYTX

(ugKg)

DTX1

libre

(ugKg)

DTX1

total

(ugkg)

SPX 1

(ugKg)

M13 ene-13 E Peel chorito x 5086 + 01 02

M13 ene-13 E Peel ostioacuten x 5155 No real izado 16 21

M33 ene-13 B Bell chorito x 5253 + 04

M37 ene-13 B Agua Fresca chorito x 5039 + 05 01

M35 ene-13 C San Isidro chorito x 5289 + 000 01

M42 ene-13 V Holanda chorito x 5231 + 06 13

M43 ene-13 B Yendegaia chorito x 5193 + 04 25

M45 ene-13 Pto Williams chorito x 5161 - 28 07

M08 feb-13 E Falcon cholga x 5027 - 14

M09 feb-13 E Penguumlin cholga x 5103 + 14

M22 feb-13 E de las Montantildeas cholga x 5052 - 26

M23 feb-13 I Ballesteros cholga x 5204 - 87

M24 feb-13 B Fanny chorito x 2016 - 38 1071 479 12

M25 feb-13 E Silva Palma chorito x 1447 - 59 1077 898 09

M26 feb-13 E Wickham chorito x 1093 - 194 2940 2232 66 66

M27 feb-13 E Sullivan chorito x 1137 - 450 1944 1478

M28 feb-13 E Nuntildeez chorito x 1179 + 33 721 407

M29 feb-13 Cutter Cove chorito x 1003 - 65 501 309

M29N1 feb-13 I Engelfield chorito x 1116 - 297 2007 1483

M31 feb-13 B Nash chorito x 2231 +

M33 feb-13 B Bell chorito x 1181 - 93

M34 feb-13 S Pedro chorito x 0726 -

M35 feb-13 C San Isidro chorito x 1178 + 110

M36 feb-13 B Buena chorito x 1367 +

M37 feb-13 B Agua Fresca chorito x 0850 + 45 100 80

M39 feb-13 Pto Zenteno chorito x 3241 + 28

M39N2 feb-13 Pta San Valentin chorito x 1712 - 11

M39N3 feb-13 Pto Yartou chorito x 2035 - 11

sector

Fortunajul-12 B Inuacutetil

caracol

piquilhuex 107000 + 01

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Tabla 6 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de microalgas

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Tabla 7 Niveles actualmente permitidos por la legislacioacuten europea (bioensayo) y los niveles propuestos por la

autoridad europea para la seguridad alimentaria (EFSA) (Gerssen et al 2010)

Toxin Legislacioacuten (μg kg-

1) Proposicioacuten

EFSA (μg kg-1)

Validacioacuten LC-MSMS

(μg kg-1)

OA and DTXs 160 45

PTXs 120

YTXs 1000 3750

AZAs 160 32

SPXs 400 (Gerssen et al2010)

European Food Safety Authority Decisioacuten 2002657 de la Unioacuten Europea EC Incluye PTXs

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Tabla 8 Abundancia relativa ambiental de las microalgas al momento de recolectar las muestras de moluscos En rojo se indica la deteccioacuten de toxina positiva en los moluscos asociada a la supuesta microalga fuente PTXs (D

acuminata) YTXs (P reticulatum) SPXs (A ostenfeldii) DTX1 (A acuta)

(Tabla modificada de Guzmaacuten et al 2014)

A N E X O S

ANEXO 1

Certificacioacuten laboratorio INTECMAR

ANEXO 2

Lista de anaacutelisis que realiza INTECMAR y sus costos (en euros) 2013

scv 1 de 7

GUIA PARA LA AUTOLIQUIDACIOacuteN DE TASAS A FAVOR DE LA COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA 2013 Los aspectos financieros de los servicios prestados por Intecmar en el marco de su actividad e vienen regulados en la Ley 62003 de 9 de diciembre de tasas precios y exenciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia (DOG nuacutem 240 de 11122003) y fueron actualizados posteriormente en la Ley 142010 de 27 de diciembre de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2011 (DOG nuacutem 250 de 30122010) y en la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013 (DOG nuacutem 42 de 28022013) Existen dos maneras de liquidar las tasas correspondientes a los servicios prestados por Intecmar

1 De forma manual cubriendo el modelo A de autoliquidacioacuten que se descarga en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda y que adjunto en pdf y se lleva al banco para su pago httpwwwconselleriadefacendaeswebportalconfeccion-impresos

2 De forma telemaacutetica en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda viacutenculo httpshostcixtecesXEITObinlionwebXeitodllxmit a traveacutes del modelo 730

Ambos modelos de liquidacioacuten de tasas adjuntamos ejemplo al final de este documento deben ser remitidos por mail a Intecmar con el sello del banco fiacutesico o virtual como paso previo a la emisioacuten del certificado Los coacutedigos generales necesarios son

minus Consejeriacutea de Medio Rural y de Mar Coacutedigo 09 minus Delegacioacuten de Pontevedra Coacutedigo 40 minus Servicio de Intecmar Coacutedigo 24

Los coacutedigos y descripcioacuten de las tasas son los regulados en la legislacioacuten vigente y los hemos resumido en los anexos siguientes Vilaxoaacuten 4 de marzo de 2013

scv 2 de 7

TARIFAS DE TASAS VIGENTES PARA 2013 - Ley 22013 d e 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013

(DOG nuacutem 42 de 28022013)

Estas tarifas son consecuencia de la actualizacioacuten de las tarifas contenidas en los anexos 1 2 3 4 y 5 de la Ley 62003 del 9 de diciembre de tasas precios y exacciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia por la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 Seraacuten aplicables desde el diacutea de la entrada en vigor de la Ley de

presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 TASA POR SERVICIOS ADMINISTRATIVOS

No sujecioacuten No se exigiraacute la tasa por servicios administrativos cuando se trate de compulsas o cotejos de documentos que deban acompantildear a solicitudes escritos o comunicaciones presentadas por el ciudadano y realizadas en el aacutembito de actuacioacuten de los registros seguacuten lo dispuesto en el artiacuteculo 385 de la Ley 301992 del 26 de noviembre de reacutegimen juriacutedico de las administraciones puacuteblicas y del procedimiento administrativo comuacuten

Excepciones Estaraacuten exentos de la presente tasa

1- La expedicioacuten de certificados de retribuciones satisfechas por la Xunta de Galicia con el objeto de justificacioacuten en relacioacuten con el impuesto sobre la renta de las personas fiacutesicas

2- La expedicioacuten de certificados y compulsa que el personal de la Administracioacuten solicite respecto a las necesidades propias del puesto de trabajo o relacioacuten de servicios

3- Los alumnos por cualquier actuacioacuten en materia de ensentildeanzas no universitarias

scv 3 de 7

4- Las compulsas realizadas en las oficinas de empleo para los desempleados en la tramitacioacuten de expedientes que sean competencia de dichas oficinas

5 La inscripcioacuten en las convocatorias para a seleccioacuten de personal de la comunidad autoacutenoma despueacutes de justificacioacuten documental solicitada por

- Personas con discapacidad igual o superior al 33 - Personas que sean miembros de familias numerosas clasificadas en la

categoriacutea especial Se aplicaraacute una bonificacioacuten del 50 a la inscripcioacuten solicitada por - Personas que sean miembros de familias numerosas de categoriacutea

general - Personas que figurasen como demandantes de empleo desde por lo

menos seis meses antes a la fecha de la convocatoria de pruebas selectivas de personal en las que soliciten su participacioacuten y no esteacuten percibiendo prestacioacuten o subsidio por desempleo

6- La expedicioacuten de certificados relativos a la situacioacuten fiscal 7- El Estado y los demaacutes entes puacuteblicos territoriales o institucionales

siempre que los servicios o actividades de que sean beneficiarios se presten o se realicen en el marco del principio de colaboracioacuten entre administraciones

8- Las viacutectimas de actos terroristas asiacute como sus coacutenyuges y sus hijos por cualquier actuacioacuten en materia educativa realizada en centros oficiales de estudios en todos los niveles de ensentildeanza

9- Los miembros de los organismos consultivos de la Administracioacuten puacuteblica gallega respecto de los certificados emitidos por dichos organismos

COacuteDIGO TASAS

DESCRIPCIOacuteN IMPORTE euro

314400 Prestacioacuten de servicios en el Instituto Tecnoloacutegico para el Control del Medio Marino de Galicia

314401 Anaacutelisis de biotoxinas marinas en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de Yasumoto 1978 4752

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en rato segundo o meacutetodo de Yasumoto 1984 5432

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS)

9520 -Anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten

seguacuten el meacutetodo de la AOAC 4752

scv 4 de 7

-Anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo da AOAC 4752

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1978 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10186

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1984 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10865

-Anaacutelisis combinada en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS) anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo AOAC y anaacutelisis de toxicidad de tipo ASP por cromatografiacutea liquida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo de la AOAC 15000

314402 Anaacutelisis de muestras en agua de mar -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton marino mediante

microscopiacutea oacuteptica 15133 -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton toacutexico marino

mediante microscopiacutea oacuteptica 13333 - Anaacutelisis de carbono orgaacutenico disuelto 5093 -Anaacutelisis de nutrientes inorgaacutenicos disueltos 3500 -Anaacutelisis de pigmentos fotosinteacuteticos (clorofila ldquoardquo) por

espectrofluorimetria 1698 314403 Anaacutelisis microbioloacutegicos en moluscos y otros organismos

procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Cuantificacioacuten de E Coli 10186 - Deteccioacuten de Salmonella spp 16975 -Enumeracioacuten de Escherichia coli en moluscos bivalvos

vivos por la teacutecnica de medida directa de impedancia con el sistema BacTrac 4300 6800

314404 Anaacutelisis de contaminantes de origen quiacutemica en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Determinacioacuten de metales pesados (Pb Cd Cu Zn As Hg Ni Cr Ag) mediante espectrofotometriacutea de absorcioacuten atoacutemica por metal

6790

-Determinacioacuten de compuestos bifenilos policlorados (PCB) mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

scv 5 de 7

-Determinacioacuten de pesticidas organoclorados mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

-Determinacioacuten de hidrocarburos aromaacuteticos policiacuteclicos (HAPs) mediante cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de fluorescencia

28200

314405 Anaacutelisis histopatoloacutegica de moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Estudio hispatoloacutegico Determinacioacuten de Bonamia Marteillia Perkinsus y otras alteraciones patoloacutegicas

101852

314406 Emisioacuten de certificaciones e informes teacutecnicos y otras actuaciones a peticioacuten del interesado

Emisioacuten de certificados a peticioacuten de los interesados sobre las actuaciones llevadas a cabo por el Instituto

1000

Emisioacuten de informes teacutecnicos a peticioacuten del interesado (euros por hora o fraccioacuten)

4000

scv 6 de 7

scv 7 de 7

ANEXO 3

Resultados de anaacutelisis en muestras de microalgas anteriormente enviadas procedentes de Magallanes por el equipo de espectrometriacutea de masas utilizado por INTECMAR Trabajo presentado a las XXXII

Congreso de Ciencias del Mar realizado en Punta Arenas 22-25 octubre de 2012

PERFIL DE TOXINAS DE PROROCENTRUM LIMA (DINOPHYCEAE) AISLADO DESDE LA COSTA DE MAGALLANES SUR DE CHILE P Salgado1 G Pizarro1 JM Franco2 P Rioboacute2 e I Bravo3

1Instituto de Fomento Pesquero (IFOP) Punta Arenas Chile gemitapizarroifopcl 2Instituto de Investigaciones Marinas (CSIC) Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea 3Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea

Prorocentrum lima (Ehrenberg) es un dinoflagelado marino bentoacutenico que se encuentra adherido generalmente

sobre macroalgas sedimentos y detrito flotante y menos comuacutenmente en el plancton (Bravo et al 2001) Es una especie neriacutetica y estuarina y su rango de distribucioacuten geograacutefica variacutea desde aguas costeras tropicales a templadas (Faust 1991) La importancia de P lima se debe a que son productoras de toxinas diarreogeacutenicas en las personas (veneno diarreico de los mariscos VDM) al igual que algunas especies de Dinophysis aunque raramente se le han asociado con episodios toacutexicos por VDM por su caraacutecter epiacutefito y bentoacutenico El complejo VDM producido por P lima incluye moleacuteculas conocidas como el aacutecido okadaico (AO) y derivados dinofisistoxinas (DTX-1 DTX-2) (Bravo et al 2001 Vale et al 2009) No obstante existen casos citados para USA donde se detectoacute toxicidad por VDM en bivalvos de cultivos asociadas a P lima aunque en bajos niveles (Maranda et al 2007a) En Canadaacute tambieacuten se llevoacute a cabo un estudio en moluscos de cultivo cuya finalidad fue determinar el origen del VDM en la que P lima fue la principal especie sospechosa tras la ocurrencia de un evento toacutexico humano por VDM ocurrido en 1998 (Levasseur et al 2003) y en antildeos anteriores (Quilliam et al 1993) Aunque Levasseur et al (2003) no logroacute probar la toxicidad de los mariscos en cultivo a causa de P lima cabe hacer notar que lo que buscaron fue OA y DTX1 no DTX 3 este uacuteltimo principal derivado de las anteriores tras su transformacioacuten en los moluscos (eg Suzuki et al 1999 Vale amp Sampayo 2002)

En consecuencia el rol de P lima en eventos toacutexicos por VDM auacuten no puede descartarse por cuanto podriacutean llegar a ser importantes en ambientes turbulentos debido a la eventual remocioacuten de microalgas adheridas en sustratos por efecto de vientos (Levasseur et al 2003) factor de importancia si se trata de sedimentos o contrariamente en zonas someras y estables de cultivos de moluscos que al mismo tiempo favorecen microambientes para sustratos en los que prolifera la epiacutefita P lima (Lawrence et al 2000) quedando expuestas a re-suspensiones temporales que favorecen la filtracioacuten de estas microalgas por los bivalvos en cultivo (Maranda et al 2007a)

Chile posee escaso conocimiento sobre esta especie en su medio natural incluido su perfil de toxinas y potencial rol en la toxificacioacuten de moluscos por VDM Por tal razoacuten resultoacute interesante aportar al conocimiento de estos aspectos en muestras de sedimentos recolectadas en el estrecho de Magallanes en las que esta especie se encontroacute inhabitualmente abundante

Las ceacutelulas utilizadas en este estudio fueron aisladas desde sedimentos superficiales (0-3 cm) recolectados en el invierno de 2010 en la localidad de cabo San Isidro durante el muestreo regular del programa de monitoreo de marea roja en la regioacuten de Magallanes En esa oportunidad se logroacute cuantificar hasta 1002 quistes tecadoscm3 de Prorocentrum lima la mayor concentracioacuten respecto a otros sitios de recolecta (Fig 1) Los sedimentos de esta localidad presentaron una coloracioacuten oscura y un fuerte olor a sulfuro de hidroacutegeno (H2S) producto de anoxia local

Se aislaron entre 27 y 87 quistes tecados (Fig 1 a) directamente desde los sedimentos mientras otras 60 ceacutelulas vegetativas (Fig 1 b) fueron aisladas luego de promover la actividad y divisioacuten de los quistes en condiciones de 15 ordmC y un ciclo de luzoscuridad de 1212 horas (Tabla 1) Para este fin se aislaron quistes tecados y trasvasijaron a placas Petri de 5 cm de diaacutemetro conteniendo 5 mL de medio de cultivo L1 Para el anaacutelisis de toxinas las ceacutelulas aisladas fueron trasvasijadas a un tubo Eppendorf de 15 mL y congelados a -80 ordmC Una aliacutecuota de sedimento huacutemedo (100 microL aproximados) tambieacuten fue vaciada en un tubo Eppendorf y congelado Para extraer la toxina se antildeadioacute 500 microL de metanol 100 a cada tubo se mezcloacute por 1 min y filtroacute por 045 microm trasvasijando a un vial El extracto fue secado bajo nitroacutegeno gas a 40 ordmC y conservado a 4 ordmC hasta su anaacutelisis Previo al anaacutelisis de toxinas los extractos fueron resuspendidos en 150 microl de metanol

La presencia de la toxina dinofisistoxina 1 (DTX-1) en las muestras (Fig2) fue confirmada en modo negativo a traveacutes de su ioacuten precursor [M-H]- mz 8175 y sus iones productos mz 5634 y 2552 mediante un cromatoacutegrafo UPLC Acquity Waters acoplado a un triple cuadrupolo Waters Xevo TQ (LC-MS) La columna utilizada fue una Acquity UPLC BEH C18 17microm 21 x 100 mm a 45 ordmC La fase moacutevil consistioacute en (A) hidroacutexido amoacutenico a pH 11 y (B) hidroacutexido amoacutenico en acetonitrilo (67 mM) con una tasa de flujo de 4 mLmin El gradiente de elucioacuten utilizado fue el siguiente mantencioacuten al 75 de A entre 0 y 066 min cambio a 5 de A entre 066 y 330 min mantener 5

de A entre 330 y 528 min recuperacioacuten del 75 de A entre 528 y 726 min mantencioacuten al 75 de A hasta 9 min Se pinchoacute 5microL de muestra en el LC-MS El contenido de DTX-1 en las muestras fue cuantificado en base al ion precursor

Los tres tipos de muestras fueron positivas a la presencia de DTX-1 pero las ceacutelulas vegetativas fueron las que presentaron un mayor contenido de DTX-1 por ceacutelula La deteccioacuten de DTX-1 en los sedimentos (Tabla 2) reflejoacute la presencia de los quistes tecados en eacutestos

Figura 1 Concentraciones de quistes tecados de Prorocentrum lima (quistescm3 de sedimento huacutemedo) en estaciones de muestreo en el Estrecho de Magallanes (M26 Estero Wickham M29N1 Isla Engenfield M31 Bahiacutea Nash M35 Cabo San Isidro M39C1 Bahiacutea Gente Grande M39C2 Bahiacutea Inuacutetil M39C3 Canal Gabriel) y Canal Beagle (M41 Ventisquero Espantildea M42 Ventisquero Holanda) (a) Quistes tecados (b) ceacutelulas vegetativas obtenidas de germinacioacuten de quistes tecados bajo condiciones de laboratorio Barra de escala 20 microm

Tabla 1 Sedimento y ceacutelulas de Prorocentrum lima aisladas para anaacutelisis de toxinas

Extracto metanoacutelico Nordm de ceacutelulas TR ngmL pg DTX-1 ceacutel

G1 quistes tecados 27 213 lt2 -

G2 quistes tecados 67 214 05 11

G3 quistes tecados 87 215 12 21

G4 ceacutelulas vegetativas 60 215 34 87

G6 sedimentos aliacutecuota 213 13 19 pg microL sed

TR tiempo de retencioacuten

Figura 2 Cromatogramas de extractos metanoacutelicos de Prorocentrum lima quistes tecados (a) ceacutelulas vegetativas (b) y sedimentos (c)

Tabla 2 Caracteriacutesticas del sedimento con quistes tecados de Prorocentrum lima

Tipo Tamantildeo (mm)

Grava 2 35

Arena media 025 - 05 32

Arena muy fina 0063 - 0125 2

Limo-arcilla lt 0063 1

Estos resultados constituyen otra eventual posibilidad de toxicidad en los moluscos por VDM no soacutelo de aquellos con modalidad de vida bentoacutenica superficial sino de aquellos que tambieacuten viven enterrados en la arena (eg almeja huepo) Maacutes auacuten si se conoce que P lima posee la capacidad de desarrollar poblaciones naturales en aguas templadas en nuacutemeros que podriacutean justificar una toxicidad por VDM en los mariscos (eg Maranda et al 2007a b)

Referencias

Bravo I ML Fernaacutendez I Ramilo amp A Martinez 2001 Toxin composition of the toxic dinofagellate Prorocentrum lima isolated from different locations along the Galician coast (NW Spain) Toxicon 39 1537ndash1545

Faust MA 1991 Morphology of ciguatera-causing Prorocentrum lima (Pyrrophyta) from widely differing sites J Phycol 27 642-648

Lawrence J E Grant J Quilliam M A Bauder A G amp Cembella A D 2000 Colonizaition and growth of the toxic dinoflagellate Prorocentrum lima and associated fouling macroalgae on mussels in suspended culture Mar Ecol Prog Ser 201 147-154

Levasseur M Couture J Y Weise A M Michaud S Elbrachter M Sauveacute G amp Bonneau E 2003 Pelagic and epiphytic summer distributions of Prorocentrum lima and P mexicanum at two mussel farms in the Gulf of St Lawrence Aquat Microbiol Ecol 30283-293

Maranda L Corwin S Dover S amp Morton S L 2007a Prorocentrum lima (Dinophyceae) in northeastern USA coastal waters II Toxin load in the epibiota and in shellfish Harmful Algae 6 632-641

Maranda L Corwin S Hargraves P E 2007b Prorocentrum lima (Dinophyceae) in 19 northeastern USA coastal waters I Abundance and distribution Harmful Algae 6 623ndash631

Quilliam MA Gilgan MW amp Pleasance S 1993 Confirmation of an incident of diarrhetic shellfish poisoning in eastern Canada In Smayda TJ Shimizu Y (Eds) Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea Elsevier New York pp 547ndash552

Suzuki T Ota H amp Yamasaki M 1999 Direct evidence of transformation of dinophysistoxin-1 to 7-O-acyl-dinophysistoxin-1 (Dinophysis-3) in the scallop Patinopecten yessoensis Toxicon 37 187-198

Vale P amp Sampayo M A 2002 First confirmation of human diarrhoeic poisonings by okadaic acid esters after ingestion of razor clams (Solen marginatus) and green crabs (Carcinus maenas) in Aveiro lagoon Portugal and detection of okadaic acid esters in phytoplankton Toxicon 40989-996

Vale P Veloso V amp Amorim A 2009 Toxin composition of a Prorocentrum lima strain isolated from the Portuguese coast Toxicon 54145ndash152

Agradecimientos Intecmar de la Xunta de Galicia Espantildea donde se realizaron los anaacutelisis de toxinas proyecto

SUBPESCA ldquoManejo y Monitoreo de Mareas Rojas en las regiones de Los Lagos Ayseacuten y Magallanes IV etapa 2010rdquo

ANEXO 4

Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten

ANEXO 5

Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de Magallanes

TASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

O

EJE

MP

LA

R P

AR

A E

L IN

TE

RE

SA

DO

LIQ

UID

AC

IOacuteN

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

EN

TID

AD

BA

NC

AR

IATASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

0 9

4 0

2 4INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

AD

MIN

IST

RA

CIOacute

NTASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

9520 euros

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

CONSELLERIA DE FACENDA

ANEXO 6

Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para cierre

de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

Seccioacuten Ediciones y Produccioacuten Almte Manuel Blanco Encalada 839

Fono 56-32-2151500 Valparaiacuteso Chile

wwwifopcl

Page 10: “Análisis de toxinas lipofílicas mediante LC-MS/MS en ...metadatos.mma.gob.cl/sinia/Informe_final_Analisis_toxinas_lipofilicas_656-055.pdfSUBSECRETARÍA DE ECONOMÍA: INFORME FINAL:

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo

3

3 METODOLOGIacuteA En esta seccioacuten se describen las metodologiacuteas asociadas a las actividades realizadas para el logro de los objetivos asiacute como tambieacuten los conceptos e ideas que la fundamentan

31 Obtencioacuten del extracto - Carne de mariscos Dependiendo de la cantidad de material se procesoacute soacutelo el hepatopaacutencreas

o carne total Se maceroacute y pesoacute el material Se realizoacute extraccioacuten con metanol en una de 11 pv Los extractos fueron centrifugados y el sobrenadante filtrado por filtros de nylon de 045 microm y vaciado a un vial

- Extracto en metanol de muestras de fitoplancton (ie el ensamble total de microalgas sin separar

especies) Aliacutecuotas de agua previamente filtradas por malla de 250 microm para eliminar el zooplancton de tamantildeo mayor fueron filtradas en filtros de fibra de vidrio muflados de 13 mm de diaacutemetro (tamantildeo de poro nominal de 07 microm) Los filtros fueron puestos por separado seguacuten sitio de recolecta y fecha en ependorfs de 15 ml y congelados hasta ser extraiacutedos con 1 mL de metanol centrifugados El sobrenadante fue filtrado por filtros de nylon de 045 microm y vaciado a un vial

- Extracto en metanol de D acuminata y P reticulatum La microalgas aisladas por

micromanipulacioacuten bajo un microscopio invertido (siempre y cuando el nuacutemero de D acuminata y de P reticulatum fuera suficiente como para lograr reunir un nuacutemero cercano a las 30 ceacutelulas por cada especie) fueron puestas en un ependorf de 15 ml con 1 ml de metanol Para obtener el extracto de toxina las muestras fueron mezcladas en vortex y filtradas por filtros de nylon de 045 microm El extracto filtrado fue puesto en un vial Solo en una ocasioacuten fue posible acumular un nuacutemero suficiente de ceacutelulas de D acuta por ello fue posible obtener solo una muestra para esta especie

- Todos los extractos fueron secados con nitroacutegeno gas a 38ordmC Este proceso evita los problemas

de traslado de extractos en solventes orgaacutenicos y yo evitar eventuales peacuterdidas de liacutequidos en las muestras durante el trayecto

32 Laboratorio de anaacutelisis dotado de LC-MSMS La metodologiacutea para el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas se realizoacute mediante espectrometriacutea de masas acoplada a un cromatoacutegrafo liacutequido (LC-MSMS) Por tratarse de una teacutecnica auacuten no implementada en Chile en aspectos de determinacioacuten de toxinas marinas a nivel comercial y certificada ni tampoco para realizar investigacioacuten baacutesica de rutina fue necesario enviar las muestras a un laboratorio extranjero certificado Tal laboratorio pertenece al Instituto Tecnoloacutegico del Mar (INTECMAR) Galicia Espantildea

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo

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El contacto se realizoacute a traveacutes de grupos de investigacioacuten extranjeros de vasta y reconocida experiencia en el tema para prospectar la factibilidad de donde realizar los anaacutelisis Los mismos aconsejaron al laboratorio perteneciente a INTECMAR INTECMAR es una entidad de investigacioacuten estatal encargada de realizar los monitoreos semanales en Galicia donde tambieacuten se encuentra fiacutesicamente su sede Actualmente estaacute certificada para la deteccioacuten de toxinas lipofiacutelicas en moluscos entre otros anaacutelisis que realiza (Anexo 1 y 2) El Anexo 2 contiene el costo del anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas (equivalente a cotizacioacuten) El laboratorio seleccionado posee un cromatoacutegrafo UPLC Acquity Waters acoplado a un triple cuadrupolo Waters Xevo TQ con la suficiente sensibilidad en la deteccioacuten de toxinas en microalgas aisladas por micromanipulacioacuten sensibilidad que fuera confirmada anteriormente al establecer cuantitativamente el perfil de toxinas lipofiacutelicas en muestras de microalgas aisladas desde muestras de sedimentos de Magallanes (ver Anexo 3) Previo al enviacuteo de extractos de moluscos y contrato de ensayo de anaacutelisis exigido por INTECMAR se realizoacute la consulta acerca de nuestro intereacutes tambieacuten por analizar toxinas en microalgas aun cuando no estuviesen certificados en esta matriz en particular La solicitud de anaacutelisis fue aceptada por parte de INTECMAR Una vez aceptado el contrato de ensayo por parte de INTECMAR (Anexo 4) se procedioacute entonces a enviar las muestras de 29 extractos de microalgas y 29 extractos de moluscos mientras INTECMAR facturoacute por costos de anaacutelisis solicitados por IFOP en el contrato de ensayo (Anexo 5) Si bien el nuacutemero de extractos obtenidos fue cercano a las 140 muestras el nuacutemero de muestras enviadas se ajustoacute al presupuesto otorgado para este proyecto al mismo tiempo que la informacioacuten obtenida fuera suficiente como para tener una visioacuten regional de los perfiles de toxinas que estuvieron presentes durante la floracioacuten estival de 2013 33 Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por LC-MSMS

Las toxinas lipofiacutelicas a determinar en las muestras fueron aacutecido okadaico (AO) dinofisistoxina-2 (DTX2) dinofisistoxina-1 (DTX1) pectenotoxinas (PTX1 PTX2) azaspiraacutecidos (AZA1 AZA2 AZA3) yesotoxinas (YTX homoYTX 45OHYTX 45OHhomoYTX) y espiroacutelidos (SPX1) El anaacutelisis se realizoacute con los siguientes elementos

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Equipos

Sistema cromatograacutefico Acquity Ultra Performance (Coacutedigo B191C)

Espectroacutemetro de masas equipado con interfase ESI y taacutendem MSMS Xevo TQMS (Coacutedigo B192C)

Software del programa TargetLynx (Coacutedigo 196)

Columna cromatograacutefica de fase reversa C18 17 microm 21 x 100 mm Acquity UPLC BEH

Reactivos y disolventes

Metanol grado HPLC gradiente

H2O Milli-Q Ellix

Acetonitrilo grado HPLC o Hipergrado para LC-MS

Acido foacutermico 98-100

Hidroacutexido amoacutenico 25

MeOHAgua 50

AcetonitriloAgua 90

Aacutecido clorhiacutedrico 37

Disolucioacuten de aacutecido clorhiacutedrico 25 M Hidroacutexido Soacutedico (le 99 pureza)

Disolucioacuten de hidroacutexido soacutedico 25 M

Disolventes cromatograacuteficos

Disolucioacuten tampoacuten hidroacutexido amoacutenico al 0125

Fase moacutevil A Agua conteniendo 67 mM de NH4OH

Fase moacutevil B Acetonitrilo conteniendo 67 mM de NH4OH

Cada fase moacutevil se filtra a vaciacuteo a traveacutes de filtros de membrana de nylon de 022 microm

Toxinas de Referencia

Disolucioacuten certificada de aacutecido ocadaico en metanol (NRC CRM-OA-c) Cod PB015

Disolucioacuten certificada de Yessotoxina Yessotoxin di-sodium salt en metanol (CRM-00-YTX) Cod PB018

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Disolucioacuten certificada de Homo-yessotoxina 1aHomoyessotoxin di-sodium salt en metanol (CRM-00-hYTX) Cod PB019

Disolucioacuten certificada de calibracioacuten de Azaspiraacutecido 1 en metanol (NRC CRM-AZA1) Cod PB020

Disolucioacuten certificada de calibracioacuten de Azaspiraacutecido 2 en metanol (NRC CRM-AZA2) Cod PB021

Disolucioacuten certificada de calibracioacuten de Azaspiraacutecido 3 en metanol (NRC CRM-AZA3) Cod PB022

Disolucioacuten de calibracioacuten de Dinofisistoxina 2 en metanol (00-DTX2) Cod PB026

Disolucioacuten de calibracioacuten de Dinofisistoxina 1 en metanol (CRM-00-DTX1) Cod PB032

Disolucioacuten de calibracioacuten de Pectenotoxina 2 en metanol (00-PTX2) Cod PB031

Material de Referencia Certificado (Mussel Tissue Reference Material for DSP Toxins NRC CRM-DSP-Mus-b) con AO y DTX1 101 plusmn 08 microgg y 13 plusmn 02 microgg respectivamente Homogeneizado de mejilloacuten (Mytilus edulis) Cod PB014

Material de Referencia Certificado (Mussel Tissue Reference Material for AZA Toxins NRC CRM-AZA-Mus) con AZA1 116 plusmn 010 microgg AZA2 0273 plusmn 0023 microgg y AZA3 0211 plusmn 0022 microgg Homogeneizado de mejilloacuten (Mytilus edulis) Cod PB030

Disolucioacuten certificada de calibracioacuten de 13-dismetil espiroacutelido C en metanol (NRC CRM-SPX1) Cod PB027

La Tabla 1 muestra las condiciones cromatograacuteficas usando una columna de UPLC C18 en fase reversa y medio baacutesico mientras que los paraacutemetros de la fuente de ionizacioacuten para el Xevo TQMS (Waters) se muestran en la Tabla 2

34 Extraccioacuten de toxinas

A los extractos metanoacutelicos en seco de las 29 muestras de moluscos y 29 muestras de microalgas se le adicionaron hasta un total de 25 mL de metanol dispensadas en pequentildeas aliacutecuotas agitando el vial con un vortex durante 30 segundos Anaacutelisis de las formas libres del AO DTX1 y DTX2 y de las toxinas de los grupos PTXs AZAs y YTXs Para la determinacioacuten de las formas libres del AO DTX1 y DTX2 y de las toxinas de los grupos PTXs AZAs y YTXs se filtroacute un volumen de aproximadamente 12 ml del extracto metanoacutelico a traveacutes de filtros

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de jeringa de 045 microm para su posterior hidroacutelisis (seccioacuten siguiente) Otra aliacutecuota del mismo extracto filtrada a traveacutes de filtro de jeringa compatible con el disolvente de 022 microm se diluyoacute a la mitad con MeOH 100 y se inyectoacute 5 microl en el sistema LC-MSMS Hidroacutelisis y cuantificacioacuten del contenido total de AO DTX1 y DTX2 Para detectar y cuantificar el contenido total de AO DTX1 y DTX2 se requiere una hidroacutelisis baacutesica previa a la inyeccioacuten de los extractos en el sistema de LC-MSMS Procedimiento En un vial que contiene 1 ml de extracto metanoacutelico previamente filtrado por filtros de jeringa de 045 microm se antildeaden 125 microl de NaOH 25 M se agita manualmente 10 segundos y la mezcla fue sometida a 76 plusmn 4 ordmC durante 40 minutos en un bantildeo Se enfrioacute a temperatura ambiente se pesoacute y luego neutralizoacute con 125 microl de HCl 25 M Finalmente se homogenizoacute nuevamente con el vortex durante 30 segundos Una aliacutecuota del extracto resultante se filtroacute con filtros de jeringa de 022 microm y diluyoacute 58 con MeOH 100 Una aliacutecuota de 5 microl fue inyectada en el sistema de LC-MSMS Durante el proceso de hidroacutelisis el vial debe estar bien cerrado para evitar peacuterdidas por evaporacioacuten (la temperatura de ebullicioacuten del MeOH es 65 ordmC) Las peacuterdidas se pueden detectar mediante pesada del vial antes y despueacutes de la hidroacutelisis en caso de confirmarse se completaraacute el peso con metanol La deteccioacuten con el espectroacutemetro de masas se realizoacute usando dos transiciones por toxina la de mayor intensidad se utilizoacute para cuantificar y la de menor intensidad para confirmar (Tabla 3) Identificacioacuten y Confirmacioacuten La identificacioacuten de la presencia de toxinas se realizaraacute por comparacioacuten del tiempo de retencioacuten de cada una de las toxinas en la muestra con el tiempo de retencioacuten obtenido en las disoluciones de calibrado estaacutendar inyectadas en un mismo diacutea de anaacutelisis Se permite una desviacioacuten maacutexima entre ambos tiempos del 25 Para las toxinas que se cuantifican con la recta de calibrado del anaacutelogo correspondiente se establece un TRR con una tolerancia seguacuten se indica en la Tabla 4 Para una correcta identificacioacuten se exige una separacioacuten entre picos calculada mediante aplicacioacuten de la expresioacuten

2 x (RT2-RT1) RS = ----------------------

(W1+W2)

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En donde RT1 y RT2 y W1 y W2 son respectivamente los tiempos de retencioacuten y las anchuras en la liacutenea base de dos picos adyacentes RT2gtRT1 La resolucioacuten seraacute aceptable cuando Rs gt10 y la resolucioacuten a liacutenea base se consideraraacute completa cuando Rs gt15 La confirmacioacuten de la presencia de toxina seguacuten el criterio de la Decisioacuten de la Comisioacuten 2002657EC se basa en la relacioacuten entre las dos transiciones empleadas para la determinacioacuten (cuantificacioacuten y confirmacioacuten)

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4 RESULTADOS

41 Toxinas en moluscos

Las toxinas detectadas en moluscos fueron PTX2 YTX 45OHYTX DTX1 y SPX1 (Tabla 5) La mayor concentracioacuten la presentoacute el grupo de las YTXs (40-294 microg kg-1) en muestras de choritos provenientes del sector de Seno Otway (Fig 1) En este mismo sector las PTXs tambieacuten presentaron las mayores concentraciones (3-45 microg kg-1) en estos transvectores En el caso del ostioacuten tanto el PTX2 como las YTXs fueron detectadas en el contenido gaacutestrico El DTX1 fue detectado en choritos (1-18 microg kg-1 considerando DTX1 libre y total) procedentes del sector Seno Otway y sectores adyacentes a Punta Arenas El AO no fue detectado en ninguna aacuterea de la Regioacuten Los SPXs fueron principalmente detectados en choritos de las aacutereas centro y sur de Magallanes y en una estacioacuten del estero Peel (M13) en el aacuterea norte de la regioacuten No obstante que los niveles son muy bajos (01- 25 microg kg-1) incluso del nivel letal 50 en ratones inyectados intraperitonealmente 40 microg kg-1 (Richard et al 2000) los valores encontrados son iguales o mayor al encontrado en el caracol piquilhue recolectado en julio de 2012 y que en ese entonces produjo la muerte de ratones provocando el cierre de aacutereas de extraccioacuten por la autoridad de salud regional (Anexo 6) De las cinco toxinas detectadas en los moluscos solo DTX1 mostroacute estar localizada en el aacuterea centro de Magallanes mientras que las restantes fueron detectadas en las tres aacutereas de monitoreo Norte centro y sur de Magallanes No se encontraron PTX1 DTX2 ni AZPs en las muestras de moluscos Los resultados muestran que de los cuatro grupos de toxinas PTX YTXs DTXs y SPXs tres de ellas pueden estar presentes simultaacuteneamente en los moluscos vale decir PTXs YTXs y DTX1 o bien SPXs en vez de DTX1 42 Toxinas en microalgas

En las microalgas se detectaron PTXs y YTXs (Tabla 6) Las PTXs fueron detectadas aunque a nivel de trazas en ceacutelulas de D acuminata seleccionadas por micromanipulacioacuten desde muestras de agua procedentes de estero Silva Palma (M25) estero Wickham (M26) y Cutter Cove (M29) (Fig1) Tambieacuten fue detectada en filtrados de agua (fitoplancton) de Pto Fontaine (M21) e I Engelfield (M29N1) Las YTXs fueron detectadas en ceacutelulas de P reticulatum seleccionadas por micromanipulacioacuten y en cultivos de esta microalga que se logroacute establecer a partir de muestras de agua provenientes de C Adalberto (M04) Cutter Cove (M29) e I Engelfield (M29N1) Solo en los cultivos se detectoacute

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homoYTX y en uno de ellos tambieacuten se detectoacute aunque miacutenimamente 45OHYTX un derivado de la YTX que normalmente se encuentra en los moluscos como producto de bio-transformacioacuten La presencia de 45OHYTX en el cultivo pudo deberse a la presencia de ceacutelulas ya en fase de declinacioacuten de la curva de crecimiento

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5 ANAacuteLISIS Y DISCUSIOacuteN DE LOS DATOS

51 Toxinas en moluscos De las toxinas lipofiacutelicas se sabe que AO DTXs y AZAs causan trastornos gastrointestinales en los seres humanos (Gerssen et al 2010) Para las toxinas restantes (YTXs PTXs y SPXs) auacuten cuando no se han reportado casos de intoxicacioacuten en los seres humanos eacutestas son letales o altamente toacutexicas cuando los ratones son inyectados por viacutea intraperitoneal (Paz et al 2008 Richard et al 2000 Miles et al 2004) Es el caso de los SPXs la toxicidad en ratones inyectados por viacutea intraperitoneal supera a la del resto de las toxinas pues su dosis letal 50 es de 40 microg kg-1 (Richard et al 2000) Tal es asiacute que como referencia (Tabla 5) el transvector caracol piquilhue recolectadas en Julio de 2012 y cuyos niveles de toxicidad provocaron la muerte de los ratones solo presentoacute 01 microg kg-1 deteccioacuten que fue realizada durante este estudio en muestras de carne almacenadas durante no maacutes de 1 antildeo a -20 ordmC Sin embargo no se puede descartar una peacuterdida de la actividad por transformacioacuten durante el periodo de conservacioacuten A excepcioacuten de los SPXs el resto de las toxinas mencionadas estaacuten reguladas por la legislacioacuten europea tanto para consumo interno como importacioacuten de moluscos y tunicados para garantizar la salud de las personas Asiacute tambieacuten estaacuten reguladas por la legislacioacuten chilena a traveacutes del Instituto de Salud Puacuteblica (ISP) estableciendo los mismos niveles de referencia europeo en base al bioensayo ratoacuten Aun cuando los niveles de toxinas detectadas en los moluscos durante este estudio estaacuten por debajo de lo exigido por las regulaciones e incluso de los niveles propuestos por el EFSA (Tabla 7) la presencia de dos y tres tipos de toxinas en los moluscos representa una complejidad en la determinacioacuten de los niveles de toxicidad especialmente si se encuentran presentes toxinas altamente toacutexicas para ratones inyectados intraperitonealmente como son los SPXs Aunque se sospechaba la concurrencia de diferentes tipos de toxinas tal hecho no habiacutea sido confirmado anteriormente Sin embargo los SPXs siguen siendo una incoacutegnita pues se desconoce la fuente de estas toxinas A ostenfeldii la especie que podriacutea ser candidata a confirmar estuvo ausente (Tabla 8 modificado de Guzmaacuten et al 2014) durante el periodo en que se detectoacute en los moluscos Los escasos antecedentes toxigeacutenicos de esta especie en Chile la han confirmado como productora de toxinas paralizantes en Ayseacuten (Pizarro et al 2012) pero no de SPXs No obstante la produccioacuten de SPXs por esta especie en la regioacuten de Magallanes auacuten no se puede descartar Las YTXs fueron las toxinas maacutes abundantes en los moluscos analizados condicioacuten que se corresponde con la alta abundancia relativa de esta especie en el ambiente (Tabla 8) en la mayoriacutea de los casos (Tabla 5)

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Los resultados sugieren que los falsos positivos por bioensayo ratoacuten pudieran ser maacutes frecuentes de lo que se piensa actualmente para la regioacuten de Magallanes 52 Toxinas en microalgas Los resultados indican que P reticulatum encontrado en Magallanes producen YTXs al igual que las especies reportadas en la regioacuten de Antofagasta y Ayseacuten (Aacutelvarez et al 2011 Pizarro et al 2012) Tal resultado hace altamente probable que esta especie es la fuente de YTXs detectadas en los moluscos durante el periodo de estudio De acuerdo a las toxinas detectadas en las muestras de D acuminata aisladas asiacute como en el fitoplancton con gran abundancia de esta especie (Tabla 8) sugiere que esta microalga podriacutea ser una fuente primaria de PTXs tal como ocurre en el norte y sur del paiacutes (Blanco et al 2007 Fux et al 2011) Aunque la especie tambieacuten ha sido asociada a la presencia de DTX1 en moluscos en un evento toacutexico ocurrido en 1998 en Magallanes (Uribe et al 2001) el DTX1 no fue detectado en las muestras de D acuminata durante este estudio El no hallazgo de DTX1 en estas muestras pudo deberse a una fuente microalgal distinta como D acuta yo P lima D acuta ha sido asociada a DTX1 en moluscos de la regioacuten de Ayseacuten (Lembeye et al 1993 y Zhao et al 1993) mientras que P lima es productora solo de DTX1 en la regioacuten de Magallanes (Salgado et al 2012) Sin embargo cuando se detectoacute DTX1 en las muestras de moluscos durante este estudio D acuta estuvo ausente en las muestras de agua mientras que D acuminata presentoacute una abundancia relativa alta Por otro lado el volumen de resuspensioacuten de los extractos pudo ser elevado al seguir el mismo procedimiento protocolar que se aplica a las muestras de moluscos de acuerdo a la normativa europea actual Por tal razoacuten el LC-MSMS no logroacute detectar PTXs ni DTX1 en las muestras de microalgas En estos casos un protocolo para el anaacutelisis de las microalgas debiera incluir un volumen menor de resuspensioacuten de los extractos secos en referencia al utilizado para los moluscos o bien seleccionar por micromanipulacioacuten un nuacutemero mayor de microalgas (gt 130 ceacutelulas) Sin embargo esto uacuteltimo es maacutes difiacutecil de lograr en latitudes australes debido a la baja densidad de ceacutelulas en las que se presenta normalmente esta especie en condiciones naturales Por tal motivo se recomienda realizar pruebas con un volumen de resuspensioacuten menor a 1 mL aun cuando se trate de un LC-MSMS triple cuadrupolo

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6 CONCLUSIONES

a Los moluscos de la regioacuten de Magallanes pueden presentar PTX2 YTX 45OHYTX DTX1 y SPX1

b El hecho que los moluscos puedan presentar dos o maacutes tipos de toxinas lipofiacutelicas dificulta establecer el nivel de toxicidad total

c P reticulatum en Magallanes produce YTXs al igual que la especie del norte y sur del paiacutes

d La abundancia relativa ambiental de P reticulatum durante el periodo de estudio coincidioacute con la presencia de YTXs en los moluscos

e Los SPXs encontrados anteriormente en caracoles piquilhue tambieacuten fue posible detectarlos en choritos durante este estudio

f Auacuten queda por confirmar el tipo de SPXs presentes y su eventual fuente primaria La presencia de SPXs en los moluscos no siempre coincidioacute con la presencia de A ostenfeldii en el ambiente y su abundancia relativa maacutexima fue solo de nivel 1 (raro) durante el periodo de estudio

g La PTX2 detectada en los moluscos coincidioacute con una alta abundancia relativa ambiental de D acuminata No obstante auacuten queda por confirmar si esta especie es la fuente primaria Para ello se hace necesario ajustar (disminuir) el volumen de dilucioacuten de los extractos secos de microalgas aisladas por micromanipulacioacuten aun cuando se trata de un espectroacutemetro de masas como un triple cuadrupolo

h La deteccioacuten de DTX1 en los moluscos coincidioacute con la ausencia de D acuta en el ambiente La toxina tampoco fue detectada en los moluscos cuando esta microalga estuvo a niveles de 2 y 3 (escaso y regular) Queda por confirmar la produccioacuten de DTX1 por esta especie en Magallanes

i No se encontraron PTX1 DTX2 ni AZPs en las muestras de moluscos durante el periodo de estudio

j Los resultados demuestran la presencia de toxinas en los moluscos que se hace necesario identificar y cuantificar utilizando teacutecnicas distintas al bioensayo

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Magellanic fjords southern Chile J Shellfish Res 2069-74 Yasumoto T Oshima Y amp Yamaguchi M 1978 Occurrence of a new type of shellfish poisoning in

the Tohoku district Bull Jpn Soc Sci Fish 44 1249-1255 Yasumoto T Murata M Lee J-S amp Torigoe KTD 1989 Polyether toxins produced by

dinoflagellates In Natori S Hashimoto K Ueno Y (Eds) Mycotoxins and Phycotoxins rsquo88 Elsevier Amsterdam pp 375ndash382

Yasumoto T amp Takizawa A 1997 Fluorometric measurements of yessotoxins in shellfish high-

pressure liquid chromatography Biosci Biotech Biochem 611775-1777 Zhao J Lembeye G Cenci G Wall B amp Yasumoto T 1993 Determination of okadaic acid and

dinophysistoxin-1 in mussels from Chile Italy and Ireland In Smayda T J amp Shimizu Y (Eds) Toxic phytoplankton blooms in the sea Elsevier Amsterdam pp 587-592

F I G U R A

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Figura 1 Estaciones y sectores muestreados (ciacuterculo rojo) y sector Fortuna donde fue recolectado el

caracol piquilhue (ciacuterculo amarillo)

T A B L A S

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Tabla 1 Condiciones cromatograacuteficas para el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas usando

una columna de UPLC C18 en fase reversa y medio baacutesico

Columna Acquity UPLC BEH C18 17 microm 21x100 mm

Temperatura columna 45 ordmC

Flujo 04 mlmin

Volumen inyeccioacuten 5 microl

Temperatura muestras 10 plusmn 5 ordmC

Gradiente

Tiempo (min) Fase A () Fase B ()

0 75 25

066 75 25

330 5 95

528 5 95

726 75 25

900 75 25

Tabla 2 Paraacutemetros de la fuente de ionizacioacuten para el Xevo TQMS (Waters) en la determinacioacuten de toxinas lipofiacutelicas

PARAacuteMETROS DE LA FUENTE

ESI- ESI+

AO DTX2 DTX1 YTX homoYTX 45OH YTX y 45OH

homoYTX

AZA1 AZA2 AZA3 PTX2 PTX1 y SPX1

Voltaje de capilar (V) 100 200

Temperatura de solvatacioacuten (ordmC) 450 450

Flujo gas de solvatacioacuten (lh) 850 850

Flujo gas cono (lh) 50 50

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Tabla 3

Resumen de las condiciones de espectrometriacutea de masas empleadas con el Xevo TQMS (Waters) en el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas

Compuesto tR (min)

ESI

Ioacuten Precursor

(mz)

Ioacuten Producto

(mz)

Dwell time (s)

Energiacutea colisioacuten

(eV)

Voltaje cono (V)

AO 189 NEG 8035 2552 0010 46 86

113 0010 56 86

DTX2 210 NEG 8035 2552 0010 46 86

113 0010 56 86

DTX1 214 NEG 8175 5634 0010 43 86

2552 0010 48 86

YTX 202 NEG 5704 4674 0010 30 45

3963 0010 35 45

45OH-YTX 182 NEG 5784 4674 0010 30 45

3964 0010 30 45

HomoYTX 203 NEG 5775 4744 0010 30 48

4034 0010 30 48

45OH-homoYTX 182 NEG 5855 4034 0010 30 45

4744 0010 30 45

PTX1 306 POS 8925 8395 0015 25 36

8215 0015 25 36

PTX2 362 POS 8765 8415 0015 20 36

8235 0015 25 36

AZA1 263 POS 8425 6545 0015 55 50

3622 0015 50 50

AZA2 270 POS 8565 6725 0015 45 27

6545 0015 45 27

AZA3 236 POS 8285 6404 0015 55 47

3622 0015 55 47

SPX1 368 POS 6925 6744 0015 27 60

1643 0015 42 60 Transicioacuten cuantificadora

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Tabla 4 TRR y valores de tolerancia para las toxinas analizadas

TOXINA TRR TOLERANCIA

Toxinas del grupo de AO

AO 1000 0990-1010

DTX2 1040 1014-1066

DTX1 1140 1111-1168

Toxinas del grupo de PTX

PTX2 1000 0990-1010

PTX1 0850 0829-0871

Toxinas del grupo de YTX

YTX 1000 0990-1010

45OH-YTX 0894 0871-0916

Homo YTX 1000 0990-1010

45OH-homoYTX 0899 0876-0921

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Tabla 5 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de moluscos

Nordm estMes

recolectaLocalidad Molusco

cuerpo

enterohepat

gramos

carne

toxicidad

VDM ratoacuten

PTX2

(ugKg)

YTX

(ugKg)

45OHYTX

(ugKg)

DTX1

libre

(ugKg)

DTX1

total

(ugkg)

SPX 1

(ugKg)

M13 ene-13 E Peel chorito x 5086 + 01 02

M13 ene-13 E Peel ostioacuten x 5155 No real izado 16 21

M33 ene-13 B Bell chorito x 5253 + 04

M37 ene-13 B Agua Fresca chorito x 5039 + 05 01

M35 ene-13 C San Isidro chorito x 5289 + 000 01

M42 ene-13 V Holanda chorito x 5231 + 06 13

M43 ene-13 B Yendegaia chorito x 5193 + 04 25

M45 ene-13 Pto Williams chorito x 5161 - 28 07

M08 feb-13 E Falcon cholga x 5027 - 14

M09 feb-13 E Penguumlin cholga x 5103 + 14

M22 feb-13 E de las Montantildeas cholga x 5052 - 26

M23 feb-13 I Ballesteros cholga x 5204 - 87

M24 feb-13 B Fanny chorito x 2016 - 38 1071 479 12

M25 feb-13 E Silva Palma chorito x 1447 - 59 1077 898 09

M26 feb-13 E Wickham chorito x 1093 - 194 2940 2232 66 66

M27 feb-13 E Sullivan chorito x 1137 - 450 1944 1478

M28 feb-13 E Nuntildeez chorito x 1179 + 33 721 407

M29 feb-13 Cutter Cove chorito x 1003 - 65 501 309

M29N1 feb-13 I Engelfield chorito x 1116 - 297 2007 1483

M31 feb-13 B Nash chorito x 2231 +

M33 feb-13 B Bell chorito x 1181 - 93

M34 feb-13 S Pedro chorito x 0726 -

M35 feb-13 C San Isidro chorito x 1178 + 110

M36 feb-13 B Buena chorito x 1367 +

M37 feb-13 B Agua Fresca chorito x 0850 + 45 100 80

M39 feb-13 Pto Zenteno chorito x 3241 + 28

M39N2 feb-13 Pta San Valentin chorito x 1712 - 11

M39N3 feb-13 Pto Yartou chorito x 2035 - 11

sector

Fortunajul-12 B Inuacutetil

caracol

piquilhuex 107000 + 01

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Tabla 6 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de microalgas

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Tabla 7 Niveles actualmente permitidos por la legislacioacuten europea (bioensayo) y los niveles propuestos por la

autoridad europea para la seguridad alimentaria (EFSA) (Gerssen et al 2010)

Toxin Legislacioacuten (μg kg-

1) Proposicioacuten

EFSA (μg kg-1)

Validacioacuten LC-MSMS

(μg kg-1)

OA and DTXs 160 45

PTXs 120

YTXs 1000 3750

AZAs 160 32

SPXs 400 (Gerssen et al2010)

European Food Safety Authority Decisioacuten 2002657 de la Unioacuten Europea EC Incluye PTXs

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Tabla 8 Abundancia relativa ambiental de las microalgas al momento de recolectar las muestras de moluscos En rojo se indica la deteccioacuten de toxina positiva en los moluscos asociada a la supuesta microalga fuente PTXs (D

acuminata) YTXs (P reticulatum) SPXs (A ostenfeldii) DTX1 (A acuta)

(Tabla modificada de Guzmaacuten et al 2014)

A N E X O S

ANEXO 1

Certificacioacuten laboratorio INTECMAR

ANEXO 2

Lista de anaacutelisis que realiza INTECMAR y sus costos (en euros) 2013

scv 1 de 7

GUIA PARA LA AUTOLIQUIDACIOacuteN DE TASAS A FAVOR DE LA COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA 2013 Los aspectos financieros de los servicios prestados por Intecmar en el marco de su actividad e vienen regulados en la Ley 62003 de 9 de diciembre de tasas precios y exenciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia (DOG nuacutem 240 de 11122003) y fueron actualizados posteriormente en la Ley 142010 de 27 de diciembre de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2011 (DOG nuacutem 250 de 30122010) y en la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013 (DOG nuacutem 42 de 28022013) Existen dos maneras de liquidar las tasas correspondientes a los servicios prestados por Intecmar

1 De forma manual cubriendo el modelo A de autoliquidacioacuten que se descarga en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda y que adjunto en pdf y se lleva al banco para su pago httpwwwconselleriadefacendaeswebportalconfeccion-impresos

2 De forma telemaacutetica en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda viacutenculo httpshostcixtecesXEITObinlionwebXeitodllxmit a traveacutes del modelo 730

Ambos modelos de liquidacioacuten de tasas adjuntamos ejemplo al final de este documento deben ser remitidos por mail a Intecmar con el sello del banco fiacutesico o virtual como paso previo a la emisioacuten del certificado Los coacutedigos generales necesarios son

minus Consejeriacutea de Medio Rural y de Mar Coacutedigo 09 minus Delegacioacuten de Pontevedra Coacutedigo 40 minus Servicio de Intecmar Coacutedigo 24

Los coacutedigos y descripcioacuten de las tasas son los regulados en la legislacioacuten vigente y los hemos resumido en los anexos siguientes Vilaxoaacuten 4 de marzo de 2013

scv 2 de 7

TARIFAS DE TASAS VIGENTES PARA 2013 - Ley 22013 d e 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013

(DOG nuacutem 42 de 28022013)

Estas tarifas son consecuencia de la actualizacioacuten de las tarifas contenidas en los anexos 1 2 3 4 y 5 de la Ley 62003 del 9 de diciembre de tasas precios y exacciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia por la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 Seraacuten aplicables desde el diacutea de la entrada en vigor de la Ley de

presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 TASA POR SERVICIOS ADMINISTRATIVOS

No sujecioacuten No se exigiraacute la tasa por servicios administrativos cuando se trate de compulsas o cotejos de documentos que deban acompantildear a solicitudes escritos o comunicaciones presentadas por el ciudadano y realizadas en el aacutembito de actuacioacuten de los registros seguacuten lo dispuesto en el artiacuteculo 385 de la Ley 301992 del 26 de noviembre de reacutegimen juriacutedico de las administraciones puacuteblicas y del procedimiento administrativo comuacuten

Excepciones Estaraacuten exentos de la presente tasa

1- La expedicioacuten de certificados de retribuciones satisfechas por la Xunta de Galicia con el objeto de justificacioacuten en relacioacuten con el impuesto sobre la renta de las personas fiacutesicas

2- La expedicioacuten de certificados y compulsa que el personal de la Administracioacuten solicite respecto a las necesidades propias del puesto de trabajo o relacioacuten de servicios

3- Los alumnos por cualquier actuacioacuten en materia de ensentildeanzas no universitarias

scv 3 de 7

4- Las compulsas realizadas en las oficinas de empleo para los desempleados en la tramitacioacuten de expedientes que sean competencia de dichas oficinas

5 La inscripcioacuten en las convocatorias para a seleccioacuten de personal de la comunidad autoacutenoma despueacutes de justificacioacuten documental solicitada por

- Personas con discapacidad igual o superior al 33 - Personas que sean miembros de familias numerosas clasificadas en la

categoriacutea especial Se aplicaraacute una bonificacioacuten del 50 a la inscripcioacuten solicitada por - Personas que sean miembros de familias numerosas de categoriacutea

general - Personas que figurasen como demandantes de empleo desde por lo

menos seis meses antes a la fecha de la convocatoria de pruebas selectivas de personal en las que soliciten su participacioacuten y no esteacuten percibiendo prestacioacuten o subsidio por desempleo

6- La expedicioacuten de certificados relativos a la situacioacuten fiscal 7- El Estado y los demaacutes entes puacuteblicos territoriales o institucionales

siempre que los servicios o actividades de que sean beneficiarios se presten o se realicen en el marco del principio de colaboracioacuten entre administraciones

8- Las viacutectimas de actos terroristas asiacute como sus coacutenyuges y sus hijos por cualquier actuacioacuten en materia educativa realizada en centros oficiales de estudios en todos los niveles de ensentildeanza

9- Los miembros de los organismos consultivos de la Administracioacuten puacuteblica gallega respecto de los certificados emitidos por dichos organismos

COacuteDIGO TASAS

DESCRIPCIOacuteN IMPORTE euro

314400 Prestacioacuten de servicios en el Instituto Tecnoloacutegico para el Control del Medio Marino de Galicia

314401 Anaacutelisis de biotoxinas marinas en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de Yasumoto 1978 4752

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en rato segundo o meacutetodo de Yasumoto 1984 5432

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS)

9520 -Anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten

seguacuten el meacutetodo de la AOAC 4752

scv 4 de 7

-Anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo da AOAC 4752

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1978 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10186

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1984 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10865

-Anaacutelisis combinada en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS) anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo AOAC y anaacutelisis de toxicidad de tipo ASP por cromatografiacutea liquida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo de la AOAC 15000

314402 Anaacutelisis de muestras en agua de mar -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton marino mediante

microscopiacutea oacuteptica 15133 -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton toacutexico marino

mediante microscopiacutea oacuteptica 13333 - Anaacutelisis de carbono orgaacutenico disuelto 5093 -Anaacutelisis de nutrientes inorgaacutenicos disueltos 3500 -Anaacutelisis de pigmentos fotosinteacuteticos (clorofila ldquoardquo) por

espectrofluorimetria 1698 314403 Anaacutelisis microbioloacutegicos en moluscos y otros organismos

procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Cuantificacioacuten de E Coli 10186 - Deteccioacuten de Salmonella spp 16975 -Enumeracioacuten de Escherichia coli en moluscos bivalvos

vivos por la teacutecnica de medida directa de impedancia con el sistema BacTrac 4300 6800

314404 Anaacutelisis de contaminantes de origen quiacutemica en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Determinacioacuten de metales pesados (Pb Cd Cu Zn As Hg Ni Cr Ag) mediante espectrofotometriacutea de absorcioacuten atoacutemica por metal

6790

-Determinacioacuten de compuestos bifenilos policlorados (PCB) mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

scv 5 de 7

-Determinacioacuten de pesticidas organoclorados mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

-Determinacioacuten de hidrocarburos aromaacuteticos policiacuteclicos (HAPs) mediante cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de fluorescencia

28200

314405 Anaacutelisis histopatoloacutegica de moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Estudio hispatoloacutegico Determinacioacuten de Bonamia Marteillia Perkinsus y otras alteraciones patoloacutegicas

101852

314406 Emisioacuten de certificaciones e informes teacutecnicos y otras actuaciones a peticioacuten del interesado

Emisioacuten de certificados a peticioacuten de los interesados sobre las actuaciones llevadas a cabo por el Instituto

1000

Emisioacuten de informes teacutecnicos a peticioacuten del interesado (euros por hora o fraccioacuten)

4000

scv 6 de 7

scv 7 de 7

ANEXO 3

Resultados de anaacutelisis en muestras de microalgas anteriormente enviadas procedentes de Magallanes por el equipo de espectrometriacutea de masas utilizado por INTECMAR Trabajo presentado a las XXXII

Congreso de Ciencias del Mar realizado en Punta Arenas 22-25 octubre de 2012

PERFIL DE TOXINAS DE PROROCENTRUM LIMA (DINOPHYCEAE) AISLADO DESDE LA COSTA DE MAGALLANES SUR DE CHILE P Salgado1 G Pizarro1 JM Franco2 P Rioboacute2 e I Bravo3

1Instituto de Fomento Pesquero (IFOP) Punta Arenas Chile gemitapizarroifopcl 2Instituto de Investigaciones Marinas (CSIC) Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea 3Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea

Prorocentrum lima (Ehrenberg) es un dinoflagelado marino bentoacutenico que se encuentra adherido generalmente

sobre macroalgas sedimentos y detrito flotante y menos comuacutenmente en el plancton (Bravo et al 2001) Es una especie neriacutetica y estuarina y su rango de distribucioacuten geograacutefica variacutea desde aguas costeras tropicales a templadas (Faust 1991) La importancia de P lima se debe a que son productoras de toxinas diarreogeacutenicas en las personas (veneno diarreico de los mariscos VDM) al igual que algunas especies de Dinophysis aunque raramente se le han asociado con episodios toacutexicos por VDM por su caraacutecter epiacutefito y bentoacutenico El complejo VDM producido por P lima incluye moleacuteculas conocidas como el aacutecido okadaico (AO) y derivados dinofisistoxinas (DTX-1 DTX-2) (Bravo et al 2001 Vale et al 2009) No obstante existen casos citados para USA donde se detectoacute toxicidad por VDM en bivalvos de cultivos asociadas a P lima aunque en bajos niveles (Maranda et al 2007a) En Canadaacute tambieacuten se llevoacute a cabo un estudio en moluscos de cultivo cuya finalidad fue determinar el origen del VDM en la que P lima fue la principal especie sospechosa tras la ocurrencia de un evento toacutexico humano por VDM ocurrido en 1998 (Levasseur et al 2003) y en antildeos anteriores (Quilliam et al 1993) Aunque Levasseur et al (2003) no logroacute probar la toxicidad de los mariscos en cultivo a causa de P lima cabe hacer notar que lo que buscaron fue OA y DTX1 no DTX 3 este uacuteltimo principal derivado de las anteriores tras su transformacioacuten en los moluscos (eg Suzuki et al 1999 Vale amp Sampayo 2002)

En consecuencia el rol de P lima en eventos toacutexicos por VDM auacuten no puede descartarse por cuanto podriacutean llegar a ser importantes en ambientes turbulentos debido a la eventual remocioacuten de microalgas adheridas en sustratos por efecto de vientos (Levasseur et al 2003) factor de importancia si se trata de sedimentos o contrariamente en zonas someras y estables de cultivos de moluscos que al mismo tiempo favorecen microambientes para sustratos en los que prolifera la epiacutefita P lima (Lawrence et al 2000) quedando expuestas a re-suspensiones temporales que favorecen la filtracioacuten de estas microalgas por los bivalvos en cultivo (Maranda et al 2007a)

Chile posee escaso conocimiento sobre esta especie en su medio natural incluido su perfil de toxinas y potencial rol en la toxificacioacuten de moluscos por VDM Por tal razoacuten resultoacute interesante aportar al conocimiento de estos aspectos en muestras de sedimentos recolectadas en el estrecho de Magallanes en las que esta especie se encontroacute inhabitualmente abundante

Las ceacutelulas utilizadas en este estudio fueron aisladas desde sedimentos superficiales (0-3 cm) recolectados en el invierno de 2010 en la localidad de cabo San Isidro durante el muestreo regular del programa de monitoreo de marea roja en la regioacuten de Magallanes En esa oportunidad se logroacute cuantificar hasta 1002 quistes tecadoscm3 de Prorocentrum lima la mayor concentracioacuten respecto a otros sitios de recolecta (Fig 1) Los sedimentos de esta localidad presentaron una coloracioacuten oscura y un fuerte olor a sulfuro de hidroacutegeno (H2S) producto de anoxia local

Se aislaron entre 27 y 87 quistes tecados (Fig 1 a) directamente desde los sedimentos mientras otras 60 ceacutelulas vegetativas (Fig 1 b) fueron aisladas luego de promover la actividad y divisioacuten de los quistes en condiciones de 15 ordmC y un ciclo de luzoscuridad de 1212 horas (Tabla 1) Para este fin se aislaron quistes tecados y trasvasijaron a placas Petri de 5 cm de diaacutemetro conteniendo 5 mL de medio de cultivo L1 Para el anaacutelisis de toxinas las ceacutelulas aisladas fueron trasvasijadas a un tubo Eppendorf de 15 mL y congelados a -80 ordmC Una aliacutecuota de sedimento huacutemedo (100 microL aproximados) tambieacuten fue vaciada en un tubo Eppendorf y congelado Para extraer la toxina se antildeadioacute 500 microL de metanol 100 a cada tubo se mezcloacute por 1 min y filtroacute por 045 microm trasvasijando a un vial El extracto fue secado bajo nitroacutegeno gas a 40 ordmC y conservado a 4 ordmC hasta su anaacutelisis Previo al anaacutelisis de toxinas los extractos fueron resuspendidos en 150 microl de metanol

La presencia de la toxina dinofisistoxina 1 (DTX-1) en las muestras (Fig2) fue confirmada en modo negativo a traveacutes de su ioacuten precursor [M-H]- mz 8175 y sus iones productos mz 5634 y 2552 mediante un cromatoacutegrafo UPLC Acquity Waters acoplado a un triple cuadrupolo Waters Xevo TQ (LC-MS) La columna utilizada fue una Acquity UPLC BEH C18 17microm 21 x 100 mm a 45 ordmC La fase moacutevil consistioacute en (A) hidroacutexido amoacutenico a pH 11 y (B) hidroacutexido amoacutenico en acetonitrilo (67 mM) con una tasa de flujo de 4 mLmin El gradiente de elucioacuten utilizado fue el siguiente mantencioacuten al 75 de A entre 0 y 066 min cambio a 5 de A entre 066 y 330 min mantener 5

de A entre 330 y 528 min recuperacioacuten del 75 de A entre 528 y 726 min mantencioacuten al 75 de A hasta 9 min Se pinchoacute 5microL de muestra en el LC-MS El contenido de DTX-1 en las muestras fue cuantificado en base al ion precursor

Los tres tipos de muestras fueron positivas a la presencia de DTX-1 pero las ceacutelulas vegetativas fueron las que presentaron un mayor contenido de DTX-1 por ceacutelula La deteccioacuten de DTX-1 en los sedimentos (Tabla 2) reflejoacute la presencia de los quistes tecados en eacutestos

Figura 1 Concentraciones de quistes tecados de Prorocentrum lima (quistescm3 de sedimento huacutemedo) en estaciones de muestreo en el Estrecho de Magallanes (M26 Estero Wickham M29N1 Isla Engenfield M31 Bahiacutea Nash M35 Cabo San Isidro M39C1 Bahiacutea Gente Grande M39C2 Bahiacutea Inuacutetil M39C3 Canal Gabriel) y Canal Beagle (M41 Ventisquero Espantildea M42 Ventisquero Holanda) (a) Quistes tecados (b) ceacutelulas vegetativas obtenidas de germinacioacuten de quistes tecados bajo condiciones de laboratorio Barra de escala 20 microm

Tabla 1 Sedimento y ceacutelulas de Prorocentrum lima aisladas para anaacutelisis de toxinas

Extracto metanoacutelico Nordm de ceacutelulas TR ngmL pg DTX-1 ceacutel

G1 quistes tecados 27 213 lt2 -

G2 quistes tecados 67 214 05 11

G3 quistes tecados 87 215 12 21

G4 ceacutelulas vegetativas 60 215 34 87

G6 sedimentos aliacutecuota 213 13 19 pg microL sed

TR tiempo de retencioacuten

Figura 2 Cromatogramas de extractos metanoacutelicos de Prorocentrum lima quistes tecados (a) ceacutelulas vegetativas (b) y sedimentos (c)

Tabla 2 Caracteriacutesticas del sedimento con quistes tecados de Prorocentrum lima

Tipo Tamantildeo (mm)

Grava 2 35

Arena media 025 - 05 32

Arena muy fina 0063 - 0125 2

Limo-arcilla lt 0063 1

Estos resultados constituyen otra eventual posibilidad de toxicidad en los moluscos por VDM no soacutelo de aquellos con modalidad de vida bentoacutenica superficial sino de aquellos que tambieacuten viven enterrados en la arena (eg almeja huepo) Maacutes auacuten si se conoce que P lima posee la capacidad de desarrollar poblaciones naturales en aguas templadas en nuacutemeros que podriacutean justificar una toxicidad por VDM en los mariscos (eg Maranda et al 2007a b)

Referencias

Bravo I ML Fernaacutendez I Ramilo amp A Martinez 2001 Toxin composition of the toxic dinofagellate Prorocentrum lima isolated from different locations along the Galician coast (NW Spain) Toxicon 39 1537ndash1545

Faust MA 1991 Morphology of ciguatera-causing Prorocentrum lima (Pyrrophyta) from widely differing sites J Phycol 27 642-648

Lawrence J E Grant J Quilliam M A Bauder A G amp Cembella A D 2000 Colonizaition and growth of the toxic dinoflagellate Prorocentrum lima and associated fouling macroalgae on mussels in suspended culture Mar Ecol Prog Ser 201 147-154

Levasseur M Couture J Y Weise A M Michaud S Elbrachter M Sauveacute G amp Bonneau E 2003 Pelagic and epiphytic summer distributions of Prorocentrum lima and P mexicanum at two mussel farms in the Gulf of St Lawrence Aquat Microbiol Ecol 30283-293

Maranda L Corwin S Dover S amp Morton S L 2007a Prorocentrum lima (Dinophyceae) in northeastern USA coastal waters II Toxin load in the epibiota and in shellfish Harmful Algae 6 632-641

Maranda L Corwin S Hargraves P E 2007b Prorocentrum lima (Dinophyceae) in 19 northeastern USA coastal waters I Abundance and distribution Harmful Algae 6 623ndash631

Quilliam MA Gilgan MW amp Pleasance S 1993 Confirmation of an incident of diarrhetic shellfish poisoning in eastern Canada In Smayda TJ Shimizu Y (Eds) Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea Elsevier New York pp 547ndash552

Suzuki T Ota H amp Yamasaki M 1999 Direct evidence of transformation of dinophysistoxin-1 to 7-O-acyl-dinophysistoxin-1 (Dinophysis-3) in the scallop Patinopecten yessoensis Toxicon 37 187-198

Vale P amp Sampayo M A 2002 First confirmation of human diarrhoeic poisonings by okadaic acid esters after ingestion of razor clams (Solen marginatus) and green crabs (Carcinus maenas) in Aveiro lagoon Portugal and detection of okadaic acid esters in phytoplankton Toxicon 40989-996

Vale P Veloso V amp Amorim A 2009 Toxin composition of a Prorocentrum lima strain isolated from the Portuguese coast Toxicon 54145ndash152

Agradecimientos Intecmar de la Xunta de Galicia Espantildea donde se realizaron los anaacutelisis de toxinas proyecto

SUBPESCA ldquoManejo y Monitoreo de Mareas Rojas en las regiones de Los Lagos Ayseacuten y Magallanes IV etapa 2010rdquo

ANEXO 4

Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten

ANEXO 5

Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de Magallanes

TASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

O

EJE

MP

LA

R P

AR

A E

L IN

TE

RE

SA

DO

LIQ

UID

AC

IOacuteN

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

EN

TID

AD

BA

NC

AR

IATASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

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Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

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SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

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NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

0 9

4 0

2 4INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

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MIN

IST

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CIOacute

NTASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

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N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

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NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

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COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

9520 euros

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

CONSELLERIA DE FACENDA

ANEXO 6

Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para cierre

de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

Seccioacuten Ediciones y Produccioacuten Almte Manuel Blanco Encalada 839

Fono 56-32-2151500 Valparaiacuteso Chile

wwwifopcl

Page 11: “Análisis de toxinas lipofílicas mediante LC-MS/MS en ...metadatos.mma.gob.cl/sinia/Informe_final_Analisis_toxinas_lipofilicas_656-055.pdfSUBSECRETARÍA DE ECONOMÍA: INFORME FINAL:

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo

4

El contacto se realizoacute a traveacutes de grupos de investigacioacuten extranjeros de vasta y reconocida experiencia en el tema para prospectar la factibilidad de donde realizar los anaacutelisis Los mismos aconsejaron al laboratorio perteneciente a INTECMAR INTECMAR es una entidad de investigacioacuten estatal encargada de realizar los monitoreos semanales en Galicia donde tambieacuten se encuentra fiacutesicamente su sede Actualmente estaacute certificada para la deteccioacuten de toxinas lipofiacutelicas en moluscos entre otros anaacutelisis que realiza (Anexo 1 y 2) El Anexo 2 contiene el costo del anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas (equivalente a cotizacioacuten) El laboratorio seleccionado posee un cromatoacutegrafo UPLC Acquity Waters acoplado a un triple cuadrupolo Waters Xevo TQ con la suficiente sensibilidad en la deteccioacuten de toxinas en microalgas aisladas por micromanipulacioacuten sensibilidad que fuera confirmada anteriormente al establecer cuantitativamente el perfil de toxinas lipofiacutelicas en muestras de microalgas aisladas desde muestras de sedimentos de Magallanes (ver Anexo 3) Previo al enviacuteo de extractos de moluscos y contrato de ensayo de anaacutelisis exigido por INTECMAR se realizoacute la consulta acerca de nuestro intereacutes tambieacuten por analizar toxinas en microalgas aun cuando no estuviesen certificados en esta matriz en particular La solicitud de anaacutelisis fue aceptada por parte de INTECMAR Una vez aceptado el contrato de ensayo por parte de INTECMAR (Anexo 4) se procedioacute entonces a enviar las muestras de 29 extractos de microalgas y 29 extractos de moluscos mientras INTECMAR facturoacute por costos de anaacutelisis solicitados por IFOP en el contrato de ensayo (Anexo 5) Si bien el nuacutemero de extractos obtenidos fue cercano a las 140 muestras el nuacutemero de muestras enviadas se ajustoacute al presupuesto otorgado para este proyecto al mismo tiempo que la informacioacuten obtenida fuera suficiente como para tener una visioacuten regional de los perfiles de toxinas que estuvieron presentes durante la floracioacuten estival de 2013 33 Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por LC-MSMS

Las toxinas lipofiacutelicas a determinar en las muestras fueron aacutecido okadaico (AO) dinofisistoxina-2 (DTX2) dinofisistoxina-1 (DTX1) pectenotoxinas (PTX1 PTX2) azaspiraacutecidos (AZA1 AZA2 AZA3) yesotoxinas (YTX homoYTX 45OHYTX 45OHhomoYTX) y espiroacutelidos (SPX1) El anaacutelisis se realizoacute con los siguientes elementos

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5

Equipos

Sistema cromatograacutefico Acquity Ultra Performance (Coacutedigo B191C)

Espectroacutemetro de masas equipado con interfase ESI y taacutendem MSMS Xevo TQMS (Coacutedigo B192C)

Software del programa TargetLynx (Coacutedigo 196)

Columna cromatograacutefica de fase reversa C18 17 microm 21 x 100 mm Acquity UPLC BEH

Reactivos y disolventes

Metanol grado HPLC gradiente

H2O Milli-Q Ellix

Acetonitrilo grado HPLC o Hipergrado para LC-MS

Acido foacutermico 98-100

Hidroacutexido amoacutenico 25

MeOHAgua 50

AcetonitriloAgua 90

Aacutecido clorhiacutedrico 37

Disolucioacuten de aacutecido clorhiacutedrico 25 M Hidroacutexido Soacutedico (le 99 pureza)

Disolucioacuten de hidroacutexido soacutedico 25 M

Disolventes cromatograacuteficos

Disolucioacuten tampoacuten hidroacutexido amoacutenico al 0125

Fase moacutevil A Agua conteniendo 67 mM de NH4OH

Fase moacutevil B Acetonitrilo conteniendo 67 mM de NH4OH

Cada fase moacutevil se filtra a vaciacuteo a traveacutes de filtros de membrana de nylon de 022 microm

Toxinas de Referencia

Disolucioacuten certificada de aacutecido ocadaico en metanol (NRC CRM-OA-c) Cod PB015

Disolucioacuten certificada de Yessotoxina Yessotoxin di-sodium salt en metanol (CRM-00-YTX) Cod PB018

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6

Disolucioacuten certificada de Homo-yessotoxina 1aHomoyessotoxin di-sodium salt en metanol (CRM-00-hYTX) Cod PB019

Disolucioacuten certificada de calibracioacuten de Azaspiraacutecido 1 en metanol (NRC CRM-AZA1) Cod PB020

Disolucioacuten certificada de calibracioacuten de Azaspiraacutecido 2 en metanol (NRC CRM-AZA2) Cod PB021

Disolucioacuten certificada de calibracioacuten de Azaspiraacutecido 3 en metanol (NRC CRM-AZA3) Cod PB022

Disolucioacuten de calibracioacuten de Dinofisistoxina 2 en metanol (00-DTX2) Cod PB026

Disolucioacuten de calibracioacuten de Dinofisistoxina 1 en metanol (CRM-00-DTX1) Cod PB032

Disolucioacuten de calibracioacuten de Pectenotoxina 2 en metanol (00-PTX2) Cod PB031

Material de Referencia Certificado (Mussel Tissue Reference Material for DSP Toxins NRC CRM-DSP-Mus-b) con AO y DTX1 101 plusmn 08 microgg y 13 plusmn 02 microgg respectivamente Homogeneizado de mejilloacuten (Mytilus edulis) Cod PB014

Material de Referencia Certificado (Mussel Tissue Reference Material for AZA Toxins NRC CRM-AZA-Mus) con AZA1 116 plusmn 010 microgg AZA2 0273 plusmn 0023 microgg y AZA3 0211 plusmn 0022 microgg Homogeneizado de mejilloacuten (Mytilus edulis) Cod PB030

Disolucioacuten certificada de calibracioacuten de 13-dismetil espiroacutelido C en metanol (NRC CRM-SPX1) Cod PB027

La Tabla 1 muestra las condiciones cromatograacuteficas usando una columna de UPLC C18 en fase reversa y medio baacutesico mientras que los paraacutemetros de la fuente de ionizacioacuten para el Xevo TQMS (Waters) se muestran en la Tabla 2

34 Extraccioacuten de toxinas

A los extractos metanoacutelicos en seco de las 29 muestras de moluscos y 29 muestras de microalgas se le adicionaron hasta un total de 25 mL de metanol dispensadas en pequentildeas aliacutecuotas agitando el vial con un vortex durante 30 segundos Anaacutelisis de las formas libres del AO DTX1 y DTX2 y de las toxinas de los grupos PTXs AZAs y YTXs Para la determinacioacuten de las formas libres del AO DTX1 y DTX2 y de las toxinas de los grupos PTXs AZAs y YTXs se filtroacute un volumen de aproximadamente 12 ml del extracto metanoacutelico a traveacutes de filtros

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7

de jeringa de 045 microm para su posterior hidroacutelisis (seccioacuten siguiente) Otra aliacutecuota del mismo extracto filtrada a traveacutes de filtro de jeringa compatible con el disolvente de 022 microm se diluyoacute a la mitad con MeOH 100 y se inyectoacute 5 microl en el sistema LC-MSMS Hidroacutelisis y cuantificacioacuten del contenido total de AO DTX1 y DTX2 Para detectar y cuantificar el contenido total de AO DTX1 y DTX2 se requiere una hidroacutelisis baacutesica previa a la inyeccioacuten de los extractos en el sistema de LC-MSMS Procedimiento En un vial que contiene 1 ml de extracto metanoacutelico previamente filtrado por filtros de jeringa de 045 microm se antildeaden 125 microl de NaOH 25 M se agita manualmente 10 segundos y la mezcla fue sometida a 76 plusmn 4 ordmC durante 40 minutos en un bantildeo Se enfrioacute a temperatura ambiente se pesoacute y luego neutralizoacute con 125 microl de HCl 25 M Finalmente se homogenizoacute nuevamente con el vortex durante 30 segundos Una aliacutecuota del extracto resultante se filtroacute con filtros de jeringa de 022 microm y diluyoacute 58 con MeOH 100 Una aliacutecuota de 5 microl fue inyectada en el sistema de LC-MSMS Durante el proceso de hidroacutelisis el vial debe estar bien cerrado para evitar peacuterdidas por evaporacioacuten (la temperatura de ebullicioacuten del MeOH es 65 ordmC) Las peacuterdidas se pueden detectar mediante pesada del vial antes y despueacutes de la hidroacutelisis en caso de confirmarse se completaraacute el peso con metanol La deteccioacuten con el espectroacutemetro de masas se realizoacute usando dos transiciones por toxina la de mayor intensidad se utilizoacute para cuantificar y la de menor intensidad para confirmar (Tabla 3) Identificacioacuten y Confirmacioacuten La identificacioacuten de la presencia de toxinas se realizaraacute por comparacioacuten del tiempo de retencioacuten de cada una de las toxinas en la muestra con el tiempo de retencioacuten obtenido en las disoluciones de calibrado estaacutendar inyectadas en un mismo diacutea de anaacutelisis Se permite una desviacioacuten maacutexima entre ambos tiempos del 25 Para las toxinas que se cuantifican con la recta de calibrado del anaacutelogo correspondiente se establece un TRR con una tolerancia seguacuten se indica en la Tabla 4 Para una correcta identificacioacuten se exige una separacioacuten entre picos calculada mediante aplicacioacuten de la expresioacuten

2 x (RT2-RT1) RS = ----------------------

(W1+W2)

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8

En donde RT1 y RT2 y W1 y W2 son respectivamente los tiempos de retencioacuten y las anchuras en la liacutenea base de dos picos adyacentes RT2gtRT1 La resolucioacuten seraacute aceptable cuando Rs gt10 y la resolucioacuten a liacutenea base se consideraraacute completa cuando Rs gt15 La confirmacioacuten de la presencia de toxina seguacuten el criterio de la Decisioacuten de la Comisioacuten 2002657EC se basa en la relacioacuten entre las dos transiciones empleadas para la determinacioacuten (cuantificacioacuten y confirmacioacuten)

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9

4 RESULTADOS

41 Toxinas en moluscos

Las toxinas detectadas en moluscos fueron PTX2 YTX 45OHYTX DTX1 y SPX1 (Tabla 5) La mayor concentracioacuten la presentoacute el grupo de las YTXs (40-294 microg kg-1) en muestras de choritos provenientes del sector de Seno Otway (Fig 1) En este mismo sector las PTXs tambieacuten presentaron las mayores concentraciones (3-45 microg kg-1) en estos transvectores En el caso del ostioacuten tanto el PTX2 como las YTXs fueron detectadas en el contenido gaacutestrico El DTX1 fue detectado en choritos (1-18 microg kg-1 considerando DTX1 libre y total) procedentes del sector Seno Otway y sectores adyacentes a Punta Arenas El AO no fue detectado en ninguna aacuterea de la Regioacuten Los SPXs fueron principalmente detectados en choritos de las aacutereas centro y sur de Magallanes y en una estacioacuten del estero Peel (M13) en el aacuterea norte de la regioacuten No obstante que los niveles son muy bajos (01- 25 microg kg-1) incluso del nivel letal 50 en ratones inyectados intraperitonealmente 40 microg kg-1 (Richard et al 2000) los valores encontrados son iguales o mayor al encontrado en el caracol piquilhue recolectado en julio de 2012 y que en ese entonces produjo la muerte de ratones provocando el cierre de aacutereas de extraccioacuten por la autoridad de salud regional (Anexo 6) De las cinco toxinas detectadas en los moluscos solo DTX1 mostroacute estar localizada en el aacuterea centro de Magallanes mientras que las restantes fueron detectadas en las tres aacutereas de monitoreo Norte centro y sur de Magallanes No se encontraron PTX1 DTX2 ni AZPs en las muestras de moluscos Los resultados muestran que de los cuatro grupos de toxinas PTX YTXs DTXs y SPXs tres de ellas pueden estar presentes simultaacuteneamente en los moluscos vale decir PTXs YTXs y DTX1 o bien SPXs en vez de DTX1 42 Toxinas en microalgas

En las microalgas se detectaron PTXs y YTXs (Tabla 6) Las PTXs fueron detectadas aunque a nivel de trazas en ceacutelulas de D acuminata seleccionadas por micromanipulacioacuten desde muestras de agua procedentes de estero Silva Palma (M25) estero Wickham (M26) y Cutter Cove (M29) (Fig1) Tambieacuten fue detectada en filtrados de agua (fitoplancton) de Pto Fontaine (M21) e I Engelfield (M29N1) Las YTXs fueron detectadas en ceacutelulas de P reticulatum seleccionadas por micromanipulacioacuten y en cultivos de esta microalga que se logroacute establecer a partir de muestras de agua provenientes de C Adalberto (M04) Cutter Cove (M29) e I Engelfield (M29N1) Solo en los cultivos se detectoacute

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10

homoYTX y en uno de ellos tambieacuten se detectoacute aunque miacutenimamente 45OHYTX un derivado de la YTX que normalmente se encuentra en los moluscos como producto de bio-transformacioacuten La presencia de 45OHYTX en el cultivo pudo deberse a la presencia de ceacutelulas ya en fase de declinacioacuten de la curva de crecimiento

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11

5 ANAacuteLISIS Y DISCUSIOacuteN DE LOS DATOS

51 Toxinas en moluscos De las toxinas lipofiacutelicas se sabe que AO DTXs y AZAs causan trastornos gastrointestinales en los seres humanos (Gerssen et al 2010) Para las toxinas restantes (YTXs PTXs y SPXs) auacuten cuando no se han reportado casos de intoxicacioacuten en los seres humanos eacutestas son letales o altamente toacutexicas cuando los ratones son inyectados por viacutea intraperitoneal (Paz et al 2008 Richard et al 2000 Miles et al 2004) Es el caso de los SPXs la toxicidad en ratones inyectados por viacutea intraperitoneal supera a la del resto de las toxinas pues su dosis letal 50 es de 40 microg kg-1 (Richard et al 2000) Tal es asiacute que como referencia (Tabla 5) el transvector caracol piquilhue recolectadas en Julio de 2012 y cuyos niveles de toxicidad provocaron la muerte de los ratones solo presentoacute 01 microg kg-1 deteccioacuten que fue realizada durante este estudio en muestras de carne almacenadas durante no maacutes de 1 antildeo a -20 ordmC Sin embargo no se puede descartar una peacuterdida de la actividad por transformacioacuten durante el periodo de conservacioacuten A excepcioacuten de los SPXs el resto de las toxinas mencionadas estaacuten reguladas por la legislacioacuten europea tanto para consumo interno como importacioacuten de moluscos y tunicados para garantizar la salud de las personas Asiacute tambieacuten estaacuten reguladas por la legislacioacuten chilena a traveacutes del Instituto de Salud Puacuteblica (ISP) estableciendo los mismos niveles de referencia europeo en base al bioensayo ratoacuten Aun cuando los niveles de toxinas detectadas en los moluscos durante este estudio estaacuten por debajo de lo exigido por las regulaciones e incluso de los niveles propuestos por el EFSA (Tabla 7) la presencia de dos y tres tipos de toxinas en los moluscos representa una complejidad en la determinacioacuten de los niveles de toxicidad especialmente si se encuentran presentes toxinas altamente toacutexicas para ratones inyectados intraperitonealmente como son los SPXs Aunque se sospechaba la concurrencia de diferentes tipos de toxinas tal hecho no habiacutea sido confirmado anteriormente Sin embargo los SPXs siguen siendo una incoacutegnita pues se desconoce la fuente de estas toxinas A ostenfeldii la especie que podriacutea ser candidata a confirmar estuvo ausente (Tabla 8 modificado de Guzmaacuten et al 2014) durante el periodo en que se detectoacute en los moluscos Los escasos antecedentes toxigeacutenicos de esta especie en Chile la han confirmado como productora de toxinas paralizantes en Ayseacuten (Pizarro et al 2012) pero no de SPXs No obstante la produccioacuten de SPXs por esta especie en la regioacuten de Magallanes auacuten no se puede descartar Las YTXs fueron las toxinas maacutes abundantes en los moluscos analizados condicioacuten que se corresponde con la alta abundancia relativa de esta especie en el ambiente (Tabla 8) en la mayoriacutea de los casos (Tabla 5)

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Los resultados sugieren que los falsos positivos por bioensayo ratoacuten pudieran ser maacutes frecuentes de lo que se piensa actualmente para la regioacuten de Magallanes 52 Toxinas en microalgas Los resultados indican que P reticulatum encontrado en Magallanes producen YTXs al igual que las especies reportadas en la regioacuten de Antofagasta y Ayseacuten (Aacutelvarez et al 2011 Pizarro et al 2012) Tal resultado hace altamente probable que esta especie es la fuente de YTXs detectadas en los moluscos durante el periodo de estudio De acuerdo a las toxinas detectadas en las muestras de D acuminata aisladas asiacute como en el fitoplancton con gran abundancia de esta especie (Tabla 8) sugiere que esta microalga podriacutea ser una fuente primaria de PTXs tal como ocurre en el norte y sur del paiacutes (Blanco et al 2007 Fux et al 2011) Aunque la especie tambieacuten ha sido asociada a la presencia de DTX1 en moluscos en un evento toacutexico ocurrido en 1998 en Magallanes (Uribe et al 2001) el DTX1 no fue detectado en las muestras de D acuminata durante este estudio El no hallazgo de DTX1 en estas muestras pudo deberse a una fuente microalgal distinta como D acuta yo P lima D acuta ha sido asociada a DTX1 en moluscos de la regioacuten de Ayseacuten (Lembeye et al 1993 y Zhao et al 1993) mientras que P lima es productora solo de DTX1 en la regioacuten de Magallanes (Salgado et al 2012) Sin embargo cuando se detectoacute DTX1 en las muestras de moluscos durante este estudio D acuta estuvo ausente en las muestras de agua mientras que D acuminata presentoacute una abundancia relativa alta Por otro lado el volumen de resuspensioacuten de los extractos pudo ser elevado al seguir el mismo procedimiento protocolar que se aplica a las muestras de moluscos de acuerdo a la normativa europea actual Por tal razoacuten el LC-MSMS no logroacute detectar PTXs ni DTX1 en las muestras de microalgas En estos casos un protocolo para el anaacutelisis de las microalgas debiera incluir un volumen menor de resuspensioacuten de los extractos secos en referencia al utilizado para los moluscos o bien seleccionar por micromanipulacioacuten un nuacutemero mayor de microalgas (gt 130 ceacutelulas) Sin embargo esto uacuteltimo es maacutes difiacutecil de lograr en latitudes australes debido a la baja densidad de ceacutelulas en las que se presenta normalmente esta especie en condiciones naturales Por tal motivo se recomienda realizar pruebas con un volumen de resuspensioacuten menor a 1 mL aun cuando se trate de un LC-MSMS triple cuadrupolo

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13

6 CONCLUSIONES

a Los moluscos de la regioacuten de Magallanes pueden presentar PTX2 YTX 45OHYTX DTX1 y SPX1

b El hecho que los moluscos puedan presentar dos o maacutes tipos de toxinas lipofiacutelicas dificulta establecer el nivel de toxicidad total

c P reticulatum en Magallanes produce YTXs al igual que la especie del norte y sur del paiacutes

d La abundancia relativa ambiental de P reticulatum durante el periodo de estudio coincidioacute con la presencia de YTXs en los moluscos

e Los SPXs encontrados anteriormente en caracoles piquilhue tambieacuten fue posible detectarlos en choritos durante este estudio

f Auacuten queda por confirmar el tipo de SPXs presentes y su eventual fuente primaria La presencia de SPXs en los moluscos no siempre coincidioacute con la presencia de A ostenfeldii en el ambiente y su abundancia relativa maacutexima fue solo de nivel 1 (raro) durante el periodo de estudio

g La PTX2 detectada en los moluscos coincidioacute con una alta abundancia relativa ambiental de D acuminata No obstante auacuten queda por confirmar si esta especie es la fuente primaria Para ello se hace necesario ajustar (disminuir) el volumen de dilucioacuten de los extractos secos de microalgas aisladas por micromanipulacioacuten aun cuando se trata de un espectroacutemetro de masas como un triple cuadrupolo

h La deteccioacuten de DTX1 en los moluscos coincidioacute con la ausencia de D acuta en el ambiente La toxina tampoco fue detectada en los moluscos cuando esta microalga estuvo a niveles de 2 y 3 (escaso y regular) Queda por confirmar la produccioacuten de DTX1 por esta especie en Magallanes

i No se encontraron PTX1 DTX2 ni AZPs en las muestras de moluscos durante el periodo de estudio

j Los resultados demuestran la presencia de toxinas en los moluscos que se hace necesario identificar y cuantificar utilizando teacutecnicas distintas al bioensayo

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(Dinophyceae) aislado desde la costa de Magallanes sur de Chile In Proceedings of Libro de resuacutemenes del XXXII Congreso de Ciencias del Mar Punta Arenas Chile 22-26 de Octubre 2012 p 228

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southeastern Pacific Ocean reveal a diverse but patchy distribution of phycotoxins Toxicon 58(5) 389ndash397

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F I G U R A

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Figura 1 Estaciones y sectores muestreados (ciacuterculo rojo) y sector Fortuna donde fue recolectado el

caracol piquilhue (ciacuterculo amarillo)

T A B L A S

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Tabla 1 Condiciones cromatograacuteficas para el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas usando

una columna de UPLC C18 en fase reversa y medio baacutesico

Columna Acquity UPLC BEH C18 17 microm 21x100 mm

Temperatura columna 45 ordmC

Flujo 04 mlmin

Volumen inyeccioacuten 5 microl

Temperatura muestras 10 plusmn 5 ordmC

Gradiente

Tiempo (min) Fase A () Fase B ()

0 75 25

066 75 25

330 5 95

528 5 95

726 75 25

900 75 25

Tabla 2 Paraacutemetros de la fuente de ionizacioacuten para el Xevo TQMS (Waters) en la determinacioacuten de toxinas lipofiacutelicas

PARAacuteMETROS DE LA FUENTE

ESI- ESI+

AO DTX2 DTX1 YTX homoYTX 45OH YTX y 45OH

homoYTX

AZA1 AZA2 AZA3 PTX2 PTX1 y SPX1

Voltaje de capilar (V) 100 200

Temperatura de solvatacioacuten (ordmC) 450 450

Flujo gas de solvatacioacuten (lh) 850 850

Flujo gas cono (lh) 50 50

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Tabla 3

Resumen de las condiciones de espectrometriacutea de masas empleadas con el Xevo TQMS (Waters) en el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas

Compuesto tR (min)

ESI

Ioacuten Precursor

(mz)

Ioacuten Producto

(mz)

Dwell time (s)

Energiacutea colisioacuten

(eV)

Voltaje cono (V)

AO 189 NEG 8035 2552 0010 46 86

113 0010 56 86

DTX2 210 NEG 8035 2552 0010 46 86

113 0010 56 86

DTX1 214 NEG 8175 5634 0010 43 86

2552 0010 48 86

YTX 202 NEG 5704 4674 0010 30 45

3963 0010 35 45

45OH-YTX 182 NEG 5784 4674 0010 30 45

3964 0010 30 45

HomoYTX 203 NEG 5775 4744 0010 30 48

4034 0010 30 48

45OH-homoYTX 182 NEG 5855 4034 0010 30 45

4744 0010 30 45

PTX1 306 POS 8925 8395 0015 25 36

8215 0015 25 36

PTX2 362 POS 8765 8415 0015 20 36

8235 0015 25 36

AZA1 263 POS 8425 6545 0015 55 50

3622 0015 50 50

AZA2 270 POS 8565 6725 0015 45 27

6545 0015 45 27

AZA3 236 POS 8285 6404 0015 55 47

3622 0015 55 47

SPX1 368 POS 6925 6744 0015 27 60

1643 0015 42 60 Transicioacuten cuantificadora

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Tabla 4 TRR y valores de tolerancia para las toxinas analizadas

TOXINA TRR TOLERANCIA

Toxinas del grupo de AO

AO 1000 0990-1010

DTX2 1040 1014-1066

DTX1 1140 1111-1168

Toxinas del grupo de PTX

PTX2 1000 0990-1010

PTX1 0850 0829-0871

Toxinas del grupo de YTX

YTX 1000 0990-1010

45OH-YTX 0894 0871-0916

Homo YTX 1000 0990-1010

45OH-homoYTX 0899 0876-0921

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Tabla 5 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de moluscos

Nordm estMes

recolectaLocalidad Molusco

cuerpo

enterohepat

gramos

carne

toxicidad

VDM ratoacuten

PTX2

(ugKg)

YTX

(ugKg)

45OHYTX

(ugKg)

DTX1

libre

(ugKg)

DTX1

total

(ugkg)

SPX 1

(ugKg)

M13 ene-13 E Peel chorito x 5086 + 01 02

M13 ene-13 E Peel ostioacuten x 5155 No real izado 16 21

M33 ene-13 B Bell chorito x 5253 + 04

M37 ene-13 B Agua Fresca chorito x 5039 + 05 01

M35 ene-13 C San Isidro chorito x 5289 + 000 01

M42 ene-13 V Holanda chorito x 5231 + 06 13

M43 ene-13 B Yendegaia chorito x 5193 + 04 25

M45 ene-13 Pto Williams chorito x 5161 - 28 07

M08 feb-13 E Falcon cholga x 5027 - 14

M09 feb-13 E Penguumlin cholga x 5103 + 14

M22 feb-13 E de las Montantildeas cholga x 5052 - 26

M23 feb-13 I Ballesteros cholga x 5204 - 87

M24 feb-13 B Fanny chorito x 2016 - 38 1071 479 12

M25 feb-13 E Silva Palma chorito x 1447 - 59 1077 898 09

M26 feb-13 E Wickham chorito x 1093 - 194 2940 2232 66 66

M27 feb-13 E Sullivan chorito x 1137 - 450 1944 1478

M28 feb-13 E Nuntildeez chorito x 1179 + 33 721 407

M29 feb-13 Cutter Cove chorito x 1003 - 65 501 309

M29N1 feb-13 I Engelfield chorito x 1116 - 297 2007 1483

M31 feb-13 B Nash chorito x 2231 +

M33 feb-13 B Bell chorito x 1181 - 93

M34 feb-13 S Pedro chorito x 0726 -

M35 feb-13 C San Isidro chorito x 1178 + 110

M36 feb-13 B Buena chorito x 1367 +

M37 feb-13 B Agua Fresca chorito x 0850 + 45 100 80

M39 feb-13 Pto Zenteno chorito x 3241 + 28

M39N2 feb-13 Pta San Valentin chorito x 1712 - 11

M39N3 feb-13 Pto Yartou chorito x 2035 - 11

sector

Fortunajul-12 B Inuacutetil

caracol

piquilhuex 107000 + 01

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Tabla 6 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de microalgas

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Tabla 7 Niveles actualmente permitidos por la legislacioacuten europea (bioensayo) y los niveles propuestos por la

autoridad europea para la seguridad alimentaria (EFSA) (Gerssen et al 2010)

Toxin Legislacioacuten (μg kg-

1) Proposicioacuten

EFSA (μg kg-1)

Validacioacuten LC-MSMS

(μg kg-1)

OA and DTXs 160 45

PTXs 120

YTXs 1000 3750

AZAs 160 32

SPXs 400 (Gerssen et al2010)

European Food Safety Authority Decisioacuten 2002657 de la Unioacuten Europea EC Incluye PTXs

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Tabla 8 Abundancia relativa ambiental de las microalgas al momento de recolectar las muestras de moluscos En rojo se indica la deteccioacuten de toxina positiva en los moluscos asociada a la supuesta microalga fuente PTXs (D

acuminata) YTXs (P reticulatum) SPXs (A ostenfeldii) DTX1 (A acuta)

(Tabla modificada de Guzmaacuten et al 2014)

A N E X O S

ANEXO 1

Certificacioacuten laboratorio INTECMAR

ANEXO 2

Lista de anaacutelisis que realiza INTECMAR y sus costos (en euros) 2013

scv 1 de 7

GUIA PARA LA AUTOLIQUIDACIOacuteN DE TASAS A FAVOR DE LA COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA 2013 Los aspectos financieros de los servicios prestados por Intecmar en el marco de su actividad e vienen regulados en la Ley 62003 de 9 de diciembre de tasas precios y exenciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia (DOG nuacutem 240 de 11122003) y fueron actualizados posteriormente en la Ley 142010 de 27 de diciembre de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2011 (DOG nuacutem 250 de 30122010) y en la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013 (DOG nuacutem 42 de 28022013) Existen dos maneras de liquidar las tasas correspondientes a los servicios prestados por Intecmar

1 De forma manual cubriendo el modelo A de autoliquidacioacuten que se descarga en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda y que adjunto en pdf y se lleva al banco para su pago httpwwwconselleriadefacendaeswebportalconfeccion-impresos

2 De forma telemaacutetica en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda viacutenculo httpshostcixtecesXEITObinlionwebXeitodllxmit a traveacutes del modelo 730

Ambos modelos de liquidacioacuten de tasas adjuntamos ejemplo al final de este documento deben ser remitidos por mail a Intecmar con el sello del banco fiacutesico o virtual como paso previo a la emisioacuten del certificado Los coacutedigos generales necesarios son

minus Consejeriacutea de Medio Rural y de Mar Coacutedigo 09 minus Delegacioacuten de Pontevedra Coacutedigo 40 minus Servicio de Intecmar Coacutedigo 24

Los coacutedigos y descripcioacuten de las tasas son los regulados en la legislacioacuten vigente y los hemos resumido en los anexos siguientes Vilaxoaacuten 4 de marzo de 2013

scv 2 de 7

TARIFAS DE TASAS VIGENTES PARA 2013 - Ley 22013 d e 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013

(DOG nuacutem 42 de 28022013)

Estas tarifas son consecuencia de la actualizacioacuten de las tarifas contenidas en los anexos 1 2 3 4 y 5 de la Ley 62003 del 9 de diciembre de tasas precios y exacciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia por la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 Seraacuten aplicables desde el diacutea de la entrada en vigor de la Ley de

presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 TASA POR SERVICIOS ADMINISTRATIVOS

No sujecioacuten No se exigiraacute la tasa por servicios administrativos cuando se trate de compulsas o cotejos de documentos que deban acompantildear a solicitudes escritos o comunicaciones presentadas por el ciudadano y realizadas en el aacutembito de actuacioacuten de los registros seguacuten lo dispuesto en el artiacuteculo 385 de la Ley 301992 del 26 de noviembre de reacutegimen juriacutedico de las administraciones puacuteblicas y del procedimiento administrativo comuacuten

Excepciones Estaraacuten exentos de la presente tasa

1- La expedicioacuten de certificados de retribuciones satisfechas por la Xunta de Galicia con el objeto de justificacioacuten en relacioacuten con el impuesto sobre la renta de las personas fiacutesicas

2- La expedicioacuten de certificados y compulsa que el personal de la Administracioacuten solicite respecto a las necesidades propias del puesto de trabajo o relacioacuten de servicios

3- Los alumnos por cualquier actuacioacuten en materia de ensentildeanzas no universitarias

scv 3 de 7

4- Las compulsas realizadas en las oficinas de empleo para los desempleados en la tramitacioacuten de expedientes que sean competencia de dichas oficinas

5 La inscripcioacuten en las convocatorias para a seleccioacuten de personal de la comunidad autoacutenoma despueacutes de justificacioacuten documental solicitada por

- Personas con discapacidad igual o superior al 33 - Personas que sean miembros de familias numerosas clasificadas en la

categoriacutea especial Se aplicaraacute una bonificacioacuten del 50 a la inscripcioacuten solicitada por - Personas que sean miembros de familias numerosas de categoriacutea

general - Personas que figurasen como demandantes de empleo desde por lo

menos seis meses antes a la fecha de la convocatoria de pruebas selectivas de personal en las que soliciten su participacioacuten y no esteacuten percibiendo prestacioacuten o subsidio por desempleo

6- La expedicioacuten de certificados relativos a la situacioacuten fiscal 7- El Estado y los demaacutes entes puacuteblicos territoriales o institucionales

siempre que los servicios o actividades de que sean beneficiarios se presten o se realicen en el marco del principio de colaboracioacuten entre administraciones

8- Las viacutectimas de actos terroristas asiacute como sus coacutenyuges y sus hijos por cualquier actuacioacuten en materia educativa realizada en centros oficiales de estudios en todos los niveles de ensentildeanza

9- Los miembros de los organismos consultivos de la Administracioacuten puacuteblica gallega respecto de los certificados emitidos por dichos organismos

COacuteDIGO TASAS

DESCRIPCIOacuteN IMPORTE euro

314400 Prestacioacuten de servicios en el Instituto Tecnoloacutegico para el Control del Medio Marino de Galicia

314401 Anaacutelisis de biotoxinas marinas en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de Yasumoto 1978 4752

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en rato segundo o meacutetodo de Yasumoto 1984 5432

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS)

9520 -Anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten

seguacuten el meacutetodo de la AOAC 4752

scv 4 de 7

-Anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo da AOAC 4752

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1978 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10186

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1984 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10865

-Anaacutelisis combinada en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS) anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo AOAC y anaacutelisis de toxicidad de tipo ASP por cromatografiacutea liquida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo de la AOAC 15000

314402 Anaacutelisis de muestras en agua de mar -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton marino mediante

microscopiacutea oacuteptica 15133 -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton toacutexico marino

mediante microscopiacutea oacuteptica 13333 - Anaacutelisis de carbono orgaacutenico disuelto 5093 -Anaacutelisis de nutrientes inorgaacutenicos disueltos 3500 -Anaacutelisis de pigmentos fotosinteacuteticos (clorofila ldquoardquo) por

espectrofluorimetria 1698 314403 Anaacutelisis microbioloacutegicos en moluscos y otros organismos

procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Cuantificacioacuten de E Coli 10186 - Deteccioacuten de Salmonella spp 16975 -Enumeracioacuten de Escherichia coli en moluscos bivalvos

vivos por la teacutecnica de medida directa de impedancia con el sistema BacTrac 4300 6800

314404 Anaacutelisis de contaminantes de origen quiacutemica en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Determinacioacuten de metales pesados (Pb Cd Cu Zn As Hg Ni Cr Ag) mediante espectrofotometriacutea de absorcioacuten atoacutemica por metal

6790

-Determinacioacuten de compuestos bifenilos policlorados (PCB) mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

scv 5 de 7

-Determinacioacuten de pesticidas organoclorados mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

-Determinacioacuten de hidrocarburos aromaacuteticos policiacuteclicos (HAPs) mediante cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de fluorescencia

28200

314405 Anaacutelisis histopatoloacutegica de moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Estudio hispatoloacutegico Determinacioacuten de Bonamia Marteillia Perkinsus y otras alteraciones patoloacutegicas

101852

314406 Emisioacuten de certificaciones e informes teacutecnicos y otras actuaciones a peticioacuten del interesado

Emisioacuten de certificados a peticioacuten de los interesados sobre las actuaciones llevadas a cabo por el Instituto

1000

Emisioacuten de informes teacutecnicos a peticioacuten del interesado (euros por hora o fraccioacuten)

4000

scv 6 de 7

scv 7 de 7

ANEXO 3

Resultados de anaacutelisis en muestras de microalgas anteriormente enviadas procedentes de Magallanes por el equipo de espectrometriacutea de masas utilizado por INTECMAR Trabajo presentado a las XXXII

Congreso de Ciencias del Mar realizado en Punta Arenas 22-25 octubre de 2012

PERFIL DE TOXINAS DE PROROCENTRUM LIMA (DINOPHYCEAE) AISLADO DESDE LA COSTA DE MAGALLANES SUR DE CHILE P Salgado1 G Pizarro1 JM Franco2 P Rioboacute2 e I Bravo3

1Instituto de Fomento Pesquero (IFOP) Punta Arenas Chile gemitapizarroifopcl 2Instituto de Investigaciones Marinas (CSIC) Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea 3Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea

Prorocentrum lima (Ehrenberg) es un dinoflagelado marino bentoacutenico que se encuentra adherido generalmente

sobre macroalgas sedimentos y detrito flotante y menos comuacutenmente en el plancton (Bravo et al 2001) Es una especie neriacutetica y estuarina y su rango de distribucioacuten geograacutefica variacutea desde aguas costeras tropicales a templadas (Faust 1991) La importancia de P lima se debe a que son productoras de toxinas diarreogeacutenicas en las personas (veneno diarreico de los mariscos VDM) al igual que algunas especies de Dinophysis aunque raramente se le han asociado con episodios toacutexicos por VDM por su caraacutecter epiacutefito y bentoacutenico El complejo VDM producido por P lima incluye moleacuteculas conocidas como el aacutecido okadaico (AO) y derivados dinofisistoxinas (DTX-1 DTX-2) (Bravo et al 2001 Vale et al 2009) No obstante existen casos citados para USA donde se detectoacute toxicidad por VDM en bivalvos de cultivos asociadas a P lima aunque en bajos niveles (Maranda et al 2007a) En Canadaacute tambieacuten se llevoacute a cabo un estudio en moluscos de cultivo cuya finalidad fue determinar el origen del VDM en la que P lima fue la principal especie sospechosa tras la ocurrencia de un evento toacutexico humano por VDM ocurrido en 1998 (Levasseur et al 2003) y en antildeos anteriores (Quilliam et al 1993) Aunque Levasseur et al (2003) no logroacute probar la toxicidad de los mariscos en cultivo a causa de P lima cabe hacer notar que lo que buscaron fue OA y DTX1 no DTX 3 este uacuteltimo principal derivado de las anteriores tras su transformacioacuten en los moluscos (eg Suzuki et al 1999 Vale amp Sampayo 2002)

En consecuencia el rol de P lima en eventos toacutexicos por VDM auacuten no puede descartarse por cuanto podriacutean llegar a ser importantes en ambientes turbulentos debido a la eventual remocioacuten de microalgas adheridas en sustratos por efecto de vientos (Levasseur et al 2003) factor de importancia si se trata de sedimentos o contrariamente en zonas someras y estables de cultivos de moluscos que al mismo tiempo favorecen microambientes para sustratos en los que prolifera la epiacutefita P lima (Lawrence et al 2000) quedando expuestas a re-suspensiones temporales que favorecen la filtracioacuten de estas microalgas por los bivalvos en cultivo (Maranda et al 2007a)

Chile posee escaso conocimiento sobre esta especie en su medio natural incluido su perfil de toxinas y potencial rol en la toxificacioacuten de moluscos por VDM Por tal razoacuten resultoacute interesante aportar al conocimiento de estos aspectos en muestras de sedimentos recolectadas en el estrecho de Magallanes en las que esta especie se encontroacute inhabitualmente abundante

Las ceacutelulas utilizadas en este estudio fueron aisladas desde sedimentos superficiales (0-3 cm) recolectados en el invierno de 2010 en la localidad de cabo San Isidro durante el muestreo regular del programa de monitoreo de marea roja en la regioacuten de Magallanes En esa oportunidad se logroacute cuantificar hasta 1002 quistes tecadoscm3 de Prorocentrum lima la mayor concentracioacuten respecto a otros sitios de recolecta (Fig 1) Los sedimentos de esta localidad presentaron una coloracioacuten oscura y un fuerte olor a sulfuro de hidroacutegeno (H2S) producto de anoxia local

Se aislaron entre 27 y 87 quistes tecados (Fig 1 a) directamente desde los sedimentos mientras otras 60 ceacutelulas vegetativas (Fig 1 b) fueron aisladas luego de promover la actividad y divisioacuten de los quistes en condiciones de 15 ordmC y un ciclo de luzoscuridad de 1212 horas (Tabla 1) Para este fin se aislaron quistes tecados y trasvasijaron a placas Petri de 5 cm de diaacutemetro conteniendo 5 mL de medio de cultivo L1 Para el anaacutelisis de toxinas las ceacutelulas aisladas fueron trasvasijadas a un tubo Eppendorf de 15 mL y congelados a -80 ordmC Una aliacutecuota de sedimento huacutemedo (100 microL aproximados) tambieacuten fue vaciada en un tubo Eppendorf y congelado Para extraer la toxina se antildeadioacute 500 microL de metanol 100 a cada tubo se mezcloacute por 1 min y filtroacute por 045 microm trasvasijando a un vial El extracto fue secado bajo nitroacutegeno gas a 40 ordmC y conservado a 4 ordmC hasta su anaacutelisis Previo al anaacutelisis de toxinas los extractos fueron resuspendidos en 150 microl de metanol

La presencia de la toxina dinofisistoxina 1 (DTX-1) en las muestras (Fig2) fue confirmada en modo negativo a traveacutes de su ioacuten precursor [M-H]- mz 8175 y sus iones productos mz 5634 y 2552 mediante un cromatoacutegrafo UPLC Acquity Waters acoplado a un triple cuadrupolo Waters Xevo TQ (LC-MS) La columna utilizada fue una Acquity UPLC BEH C18 17microm 21 x 100 mm a 45 ordmC La fase moacutevil consistioacute en (A) hidroacutexido amoacutenico a pH 11 y (B) hidroacutexido amoacutenico en acetonitrilo (67 mM) con una tasa de flujo de 4 mLmin El gradiente de elucioacuten utilizado fue el siguiente mantencioacuten al 75 de A entre 0 y 066 min cambio a 5 de A entre 066 y 330 min mantener 5

de A entre 330 y 528 min recuperacioacuten del 75 de A entre 528 y 726 min mantencioacuten al 75 de A hasta 9 min Se pinchoacute 5microL de muestra en el LC-MS El contenido de DTX-1 en las muestras fue cuantificado en base al ion precursor

Los tres tipos de muestras fueron positivas a la presencia de DTX-1 pero las ceacutelulas vegetativas fueron las que presentaron un mayor contenido de DTX-1 por ceacutelula La deteccioacuten de DTX-1 en los sedimentos (Tabla 2) reflejoacute la presencia de los quistes tecados en eacutestos

Figura 1 Concentraciones de quistes tecados de Prorocentrum lima (quistescm3 de sedimento huacutemedo) en estaciones de muestreo en el Estrecho de Magallanes (M26 Estero Wickham M29N1 Isla Engenfield M31 Bahiacutea Nash M35 Cabo San Isidro M39C1 Bahiacutea Gente Grande M39C2 Bahiacutea Inuacutetil M39C3 Canal Gabriel) y Canal Beagle (M41 Ventisquero Espantildea M42 Ventisquero Holanda) (a) Quistes tecados (b) ceacutelulas vegetativas obtenidas de germinacioacuten de quistes tecados bajo condiciones de laboratorio Barra de escala 20 microm

Tabla 1 Sedimento y ceacutelulas de Prorocentrum lima aisladas para anaacutelisis de toxinas

Extracto metanoacutelico Nordm de ceacutelulas TR ngmL pg DTX-1 ceacutel

G1 quistes tecados 27 213 lt2 -

G2 quistes tecados 67 214 05 11

G3 quistes tecados 87 215 12 21

G4 ceacutelulas vegetativas 60 215 34 87

G6 sedimentos aliacutecuota 213 13 19 pg microL sed

TR tiempo de retencioacuten

Figura 2 Cromatogramas de extractos metanoacutelicos de Prorocentrum lima quistes tecados (a) ceacutelulas vegetativas (b) y sedimentos (c)

Tabla 2 Caracteriacutesticas del sedimento con quistes tecados de Prorocentrum lima

Tipo Tamantildeo (mm)

Grava 2 35

Arena media 025 - 05 32

Arena muy fina 0063 - 0125 2

Limo-arcilla lt 0063 1

Estos resultados constituyen otra eventual posibilidad de toxicidad en los moluscos por VDM no soacutelo de aquellos con modalidad de vida bentoacutenica superficial sino de aquellos que tambieacuten viven enterrados en la arena (eg almeja huepo) Maacutes auacuten si se conoce que P lima posee la capacidad de desarrollar poblaciones naturales en aguas templadas en nuacutemeros que podriacutean justificar una toxicidad por VDM en los mariscos (eg Maranda et al 2007a b)

Referencias

Bravo I ML Fernaacutendez I Ramilo amp A Martinez 2001 Toxin composition of the toxic dinofagellate Prorocentrum lima isolated from different locations along the Galician coast (NW Spain) Toxicon 39 1537ndash1545

Faust MA 1991 Morphology of ciguatera-causing Prorocentrum lima (Pyrrophyta) from widely differing sites J Phycol 27 642-648

Lawrence J E Grant J Quilliam M A Bauder A G amp Cembella A D 2000 Colonizaition and growth of the toxic dinoflagellate Prorocentrum lima and associated fouling macroalgae on mussels in suspended culture Mar Ecol Prog Ser 201 147-154

Levasseur M Couture J Y Weise A M Michaud S Elbrachter M Sauveacute G amp Bonneau E 2003 Pelagic and epiphytic summer distributions of Prorocentrum lima and P mexicanum at two mussel farms in the Gulf of St Lawrence Aquat Microbiol Ecol 30283-293

Maranda L Corwin S Dover S amp Morton S L 2007a Prorocentrum lima (Dinophyceae) in northeastern USA coastal waters II Toxin load in the epibiota and in shellfish Harmful Algae 6 632-641

Maranda L Corwin S Hargraves P E 2007b Prorocentrum lima (Dinophyceae) in 19 northeastern USA coastal waters I Abundance and distribution Harmful Algae 6 623ndash631

Quilliam MA Gilgan MW amp Pleasance S 1993 Confirmation of an incident of diarrhetic shellfish poisoning in eastern Canada In Smayda TJ Shimizu Y (Eds) Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea Elsevier New York pp 547ndash552

Suzuki T Ota H amp Yamasaki M 1999 Direct evidence of transformation of dinophysistoxin-1 to 7-O-acyl-dinophysistoxin-1 (Dinophysis-3) in the scallop Patinopecten yessoensis Toxicon 37 187-198

Vale P amp Sampayo M A 2002 First confirmation of human diarrhoeic poisonings by okadaic acid esters after ingestion of razor clams (Solen marginatus) and green crabs (Carcinus maenas) in Aveiro lagoon Portugal and detection of okadaic acid esters in phytoplankton Toxicon 40989-996

Vale P Veloso V amp Amorim A 2009 Toxin composition of a Prorocentrum lima strain isolated from the Portuguese coast Toxicon 54145ndash152

Agradecimientos Intecmar de la Xunta de Galicia Espantildea donde se realizaron los anaacutelisis de toxinas proyecto

SUBPESCA ldquoManejo y Monitoreo de Mareas Rojas en las regiones de Los Lagos Ayseacuten y Magallanes IV etapa 2010rdquo

ANEXO 4

Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten

ANEXO 5

Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de Magallanes

TASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

O

EJE

MP

LA

R P

AR

A E

L IN

TE

RE

SA

DO

LIQ

UID

AC

IOacuteN

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

EN

TID

AD

BA

NC

AR

IATASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

0 9

4 0

2 4INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

AD

MIN

IST

RA

CIOacute

NTASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

9520 euros

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

CONSELLERIA DE FACENDA

ANEXO 6

Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para cierre

de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

Seccioacuten Ediciones y Produccioacuten Almte Manuel Blanco Encalada 839

Fono 56-32-2151500 Valparaiacuteso Chile

wwwifopcl

Page 12: “Análisis de toxinas lipofílicas mediante LC-MS/MS en ...metadatos.mma.gob.cl/sinia/Informe_final_Analisis_toxinas_lipofilicas_656-055.pdfSUBSECRETARÍA DE ECONOMÍA: INFORME FINAL:

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo

5

Equipos

Sistema cromatograacutefico Acquity Ultra Performance (Coacutedigo B191C)

Espectroacutemetro de masas equipado con interfase ESI y taacutendem MSMS Xevo TQMS (Coacutedigo B192C)

Software del programa TargetLynx (Coacutedigo 196)

Columna cromatograacutefica de fase reversa C18 17 microm 21 x 100 mm Acquity UPLC BEH

Reactivos y disolventes

Metanol grado HPLC gradiente

H2O Milli-Q Ellix

Acetonitrilo grado HPLC o Hipergrado para LC-MS

Acido foacutermico 98-100

Hidroacutexido amoacutenico 25

MeOHAgua 50

AcetonitriloAgua 90

Aacutecido clorhiacutedrico 37

Disolucioacuten de aacutecido clorhiacutedrico 25 M Hidroacutexido Soacutedico (le 99 pureza)

Disolucioacuten de hidroacutexido soacutedico 25 M

Disolventes cromatograacuteficos

Disolucioacuten tampoacuten hidroacutexido amoacutenico al 0125

Fase moacutevil A Agua conteniendo 67 mM de NH4OH

Fase moacutevil B Acetonitrilo conteniendo 67 mM de NH4OH

Cada fase moacutevil se filtra a vaciacuteo a traveacutes de filtros de membrana de nylon de 022 microm

Toxinas de Referencia

Disolucioacuten certificada de aacutecido ocadaico en metanol (NRC CRM-OA-c) Cod PB015

Disolucioacuten certificada de Yessotoxina Yessotoxin di-sodium salt en metanol (CRM-00-YTX) Cod PB018

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo

6

Disolucioacuten certificada de Homo-yessotoxina 1aHomoyessotoxin di-sodium salt en metanol (CRM-00-hYTX) Cod PB019

Disolucioacuten certificada de calibracioacuten de Azaspiraacutecido 1 en metanol (NRC CRM-AZA1) Cod PB020

Disolucioacuten certificada de calibracioacuten de Azaspiraacutecido 2 en metanol (NRC CRM-AZA2) Cod PB021

Disolucioacuten certificada de calibracioacuten de Azaspiraacutecido 3 en metanol (NRC CRM-AZA3) Cod PB022

Disolucioacuten de calibracioacuten de Dinofisistoxina 2 en metanol (00-DTX2) Cod PB026

Disolucioacuten de calibracioacuten de Dinofisistoxina 1 en metanol (CRM-00-DTX1) Cod PB032

Disolucioacuten de calibracioacuten de Pectenotoxina 2 en metanol (00-PTX2) Cod PB031

Material de Referencia Certificado (Mussel Tissue Reference Material for DSP Toxins NRC CRM-DSP-Mus-b) con AO y DTX1 101 plusmn 08 microgg y 13 plusmn 02 microgg respectivamente Homogeneizado de mejilloacuten (Mytilus edulis) Cod PB014

Material de Referencia Certificado (Mussel Tissue Reference Material for AZA Toxins NRC CRM-AZA-Mus) con AZA1 116 plusmn 010 microgg AZA2 0273 plusmn 0023 microgg y AZA3 0211 plusmn 0022 microgg Homogeneizado de mejilloacuten (Mytilus edulis) Cod PB030

Disolucioacuten certificada de calibracioacuten de 13-dismetil espiroacutelido C en metanol (NRC CRM-SPX1) Cod PB027

La Tabla 1 muestra las condiciones cromatograacuteficas usando una columna de UPLC C18 en fase reversa y medio baacutesico mientras que los paraacutemetros de la fuente de ionizacioacuten para el Xevo TQMS (Waters) se muestran en la Tabla 2

34 Extraccioacuten de toxinas

A los extractos metanoacutelicos en seco de las 29 muestras de moluscos y 29 muestras de microalgas se le adicionaron hasta un total de 25 mL de metanol dispensadas en pequentildeas aliacutecuotas agitando el vial con un vortex durante 30 segundos Anaacutelisis de las formas libres del AO DTX1 y DTX2 y de las toxinas de los grupos PTXs AZAs y YTXs Para la determinacioacuten de las formas libres del AO DTX1 y DTX2 y de las toxinas de los grupos PTXs AZAs y YTXs se filtroacute un volumen de aproximadamente 12 ml del extracto metanoacutelico a traveacutes de filtros

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de jeringa de 045 microm para su posterior hidroacutelisis (seccioacuten siguiente) Otra aliacutecuota del mismo extracto filtrada a traveacutes de filtro de jeringa compatible con el disolvente de 022 microm se diluyoacute a la mitad con MeOH 100 y se inyectoacute 5 microl en el sistema LC-MSMS Hidroacutelisis y cuantificacioacuten del contenido total de AO DTX1 y DTX2 Para detectar y cuantificar el contenido total de AO DTX1 y DTX2 se requiere una hidroacutelisis baacutesica previa a la inyeccioacuten de los extractos en el sistema de LC-MSMS Procedimiento En un vial que contiene 1 ml de extracto metanoacutelico previamente filtrado por filtros de jeringa de 045 microm se antildeaden 125 microl de NaOH 25 M se agita manualmente 10 segundos y la mezcla fue sometida a 76 plusmn 4 ordmC durante 40 minutos en un bantildeo Se enfrioacute a temperatura ambiente se pesoacute y luego neutralizoacute con 125 microl de HCl 25 M Finalmente se homogenizoacute nuevamente con el vortex durante 30 segundos Una aliacutecuota del extracto resultante se filtroacute con filtros de jeringa de 022 microm y diluyoacute 58 con MeOH 100 Una aliacutecuota de 5 microl fue inyectada en el sistema de LC-MSMS Durante el proceso de hidroacutelisis el vial debe estar bien cerrado para evitar peacuterdidas por evaporacioacuten (la temperatura de ebullicioacuten del MeOH es 65 ordmC) Las peacuterdidas se pueden detectar mediante pesada del vial antes y despueacutes de la hidroacutelisis en caso de confirmarse se completaraacute el peso con metanol La deteccioacuten con el espectroacutemetro de masas se realizoacute usando dos transiciones por toxina la de mayor intensidad se utilizoacute para cuantificar y la de menor intensidad para confirmar (Tabla 3) Identificacioacuten y Confirmacioacuten La identificacioacuten de la presencia de toxinas se realizaraacute por comparacioacuten del tiempo de retencioacuten de cada una de las toxinas en la muestra con el tiempo de retencioacuten obtenido en las disoluciones de calibrado estaacutendar inyectadas en un mismo diacutea de anaacutelisis Se permite una desviacioacuten maacutexima entre ambos tiempos del 25 Para las toxinas que se cuantifican con la recta de calibrado del anaacutelogo correspondiente se establece un TRR con una tolerancia seguacuten se indica en la Tabla 4 Para una correcta identificacioacuten se exige una separacioacuten entre picos calculada mediante aplicacioacuten de la expresioacuten

2 x (RT2-RT1) RS = ----------------------

(W1+W2)

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En donde RT1 y RT2 y W1 y W2 son respectivamente los tiempos de retencioacuten y las anchuras en la liacutenea base de dos picos adyacentes RT2gtRT1 La resolucioacuten seraacute aceptable cuando Rs gt10 y la resolucioacuten a liacutenea base se consideraraacute completa cuando Rs gt15 La confirmacioacuten de la presencia de toxina seguacuten el criterio de la Decisioacuten de la Comisioacuten 2002657EC se basa en la relacioacuten entre las dos transiciones empleadas para la determinacioacuten (cuantificacioacuten y confirmacioacuten)

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4 RESULTADOS

41 Toxinas en moluscos

Las toxinas detectadas en moluscos fueron PTX2 YTX 45OHYTX DTX1 y SPX1 (Tabla 5) La mayor concentracioacuten la presentoacute el grupo de las YTXs (40-294 microg kg-1) en muestras de choritos provenientes del sector de Seno Otway (Fig 1) En este mismo sector las PTXs tambieacuten presentaron las mayores concentraciones (3-45 microg kg-1) en estos transvectores En el caso del ostioacuten tanto el PTX2 como las YTXs fueron detectadas en el contenido gaacutestrico El DTX1 fue detectado en choritos (1-18 microg kg-1 considerando DTX1 libre y total) procedentes del sector Seno Otway y sectores adyacentes a Punta Arenas El AO no fue detectado en ninguna aacuterea de la Regioacuten Los SPXs fueron principalmente detectados en choritos de las aacutereas centro y sur de Magallanes y en una estacioacuten del estero Peel (M13) en el aacuterea norte de la regioacuten No obstante que los niveles son muy bajos (01- 25 microg kg-1) incluso del nivel letal 50 en ratones inyectados intraperitonealmente 40 microg kg-1 (Richard et al 2000) los valores encontrados son iguales o mayor al encontrado en el caracol piquilhue recolectado en julio de 2012 y que en ese entonces produjo la muerte de ratones provocando el cierre de aacutereas de extraccioacuten por la autoridad de salud regional (Anexo 6) De las cinco toxinas detectadas en los moluscos solo DTX1 mostroacute estar localizada en el aacuterea centro de Magallanes mientras que las restantes fueron detectadas en las tres aacutereas de monitoreo Norte centro y sur de Magallanes No se encontraron PTX1 DTX2 ni AZPs en las muestras de moluscos Los resultados muestran que de los cuatro grupos de toxinas PTX YTXs DTXs y SPXs tres de ellas pueden estar presentes simultaacuteneamente en los moluscos vale decir PTXs YTXs y DTX1 o bien SPXs en vez de DTX1 42 Toxinas en microalgas

En las microalgas se detectaron PTXs y YTXs (Tabla 6) Las PTXs fueron detectadas aunque a nivel de trazas en ceacutelulas de D acuminata seleccionadas por micromanipulacioacuten desde muestras de agua procedentes de estero Silva Palma (M25) estero Wickham (M26) y Cutter Cove (M29) (Fig1) Tambieacuten fue detectada en filtrados de agua (fitoplancton) de Pto Fontaine (M21) e I Engelfield (M29N1) Las YTXs fueron detectadas en ceacutelulas de P reticulatum seleccionadas por micromanipulacioacuten y en cultivos de esta microalga que se logroacute establecer a partir de muestras de agua provenientes de C Adalberto (M04) Cutter Cove (M29) e I Engelfield (M29N1) Solo en los cultivos se detectoacute

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homoYTX y en uno de ellos tambieacuten se detectoacute aunque miacutenimamente 45OHYTX un derivado de la YTX que normalmente se encuentra en los moluscos como producto de bio-transformacioacuten La presencia de 45OHYTX en el cultivo pudo deberse a la presencia de ceacutelulas ya en fase de declinacioacuten de la curva de crecimiento

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5 ANAacuteLISIS Y DISCUSIOacuteN DE LOS DATOS

51 Toxinas en moluscos De las toxinas lipofiacutelicas se sabe que AO DTXs y AZAs causan trastornos gastrointestinales en los seres humanos (Gerssen et al 2010) Para las toxinas restantes (YTXs PTXs y SPXs) auacuten cuando no se han reportado casos de intoxicacioacuten en los seres humanos eacutestas son letales o altamente toacutexicas cuando los ratones son inyectados por viacutea intraperitoneal (Paz et al 2008 Richard et al 2000 Miles et al 2004) Es el caso de los SPXs la toxicidad en ratones inyectados por viacutea intraperitoneal supera a la del resto de las toxinas pues su dosis letal 50 es de 40 microg kg-1 (Richard et al 2000) Tal es asiacute que como referencia (Tabla 5) el transvector caracol piquilhue recolectadas en Julio de 2012 y cuyos niveles de toxicidad provocaron la muerte de los ratones solo presentoacute 01 microg kg-1 deteccioacuten que fue realizada durante este estudio en muestras de carne almacenadas durante no maacutes de 1 antildeo a -20 ordmC Sin embargo no se puede descartar una peacuterdida de la actividad por transformacioacuten durante el periodo de conservacioacuten A excepcioacuten de los SPXs el resto de las toxinas mencionadas estaacuten reguladas por la legislacioacuten europea tanto para consumo interno como importacioacuten de moluscos y tunicados para garantizar la salud de las personas Asiacute tambieacuten estaacuten reguladas por la legislacioacuten chilena a traveacutes del Instituto de Salud Puacuteblica (ISP) estableciendo los mismos niveles de referencia europeo en base al bioensayo ratoacuten Aun cuando los niveles de toxinas detectadas en los moluscos durante este estudio estaacuten por debajo de lo exigido por las regulaciones e incluso de los niveles propuestos por el EFSA (Tabla 7) la presencia de dos y tres tipos de toxinas en los moluscos representa una complejidad en la determinacioacuten de los niveles de toxicidad especialmente si se encuentran presentes toxinas altamente toacutexicas para ratones inyectados intraperitonealmente como son los SPXs Aunque se sospechaba la concurrencia de diferentes tipos de toxinas tal hecho no habiacutea sido confirmado anteriormente Sin embargo los SPXs siguen siendo una incoacutegnita pues se desconoce la fuente de estas toxinas A ostenfeldii la especie que podriacutea ser candidata a confirmar estuvo ausente (Tabla 8 modificado de Guzmaacuten et al 2014) durante el periodo en que se detectoacute en los moluscos Los escasos antecedentes toxigeacutenicos de esta especie en Chile la han confirmado como productora de toxinas paralizantes en Ayseacuten (Pizarro et al 2012) pero no de SPXs No obstante la produccioacuten de SPXs por esta especie en la regioacuten de Magallanes auacuten no se puede descartar Las YTXs fueron las toxinas maacutes abundantes en los moluscos analizados condicioacuten que se corresponde con la alta abundancia relativa de esta especie en el ambiente (Tabla 8) en la mayoriacutea de los casos (Tabla 5)

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Los resultados sugieren que los falsos positivos por bioensayo ratoacuten pudieran ser maacutes frecuentes de lo que se piensa actualmente para la regioacuten de Magallanes 52 Toxinas en microalgas Los resultados indican que P reticulatum encontrado en Magallanes producen YTXs al igual que las especies reportadas en la regioacuten de Antofagasta y Ayseacuten (Aacutelvarez et al 2011 Pizarro et al 2012) Tal resultado hace altamente probable que esta especie es la fuente de YTXs detectadas en los moluscos durante el periodo de estudio De acuerdo a las toxinas detectadas en las muestras de D acuminata aisladas asiacute como en el fitoplancton con gran abundancia de esta especie (Tabla 8) sugiere que esta microalga podriacutea ser una fuente primaria de PTXs tal como ocurre en el norte y sur del paiacutes (Blanco et al 2007 Fux et al 2011) Aunque la especie tambieacuten ha sido asociada a la presencia de DTX1 en moluscos en un evento toacutexico ocurrido en 1998 en Magallanes (Uribe et al 2001) el DTX1 no fue detectado en las muestras de D acuminata durante este estudio El no hallazgo de DTX1 en estas muestras pudo deberse a una fuente microalgal distinta como D acuta yo P lima D acuta ha sido asociada a DTX1 en moluscos de la regioacuten de Ayseacuten (Lembeye et al 1993 y Zhao et al 1993) mientras que P lima es productora solo de DTX1 en la regioacuten de Magallanes (Salgado et al 2012) Sin embargo cuando se detectoacute DTX1 en las muestras de moluscos durante este estudio D acuta estuvo ausente en las muestras de agua mientras que D acuminata presentoacute una abundancia relativa alta Por otro lado el volumen de resuspensioacuten de los extractos pudo ser elevado al seguir el mismo procedimiento protocolar que se aplica a las muestras de moluscos de acuerdo a la normativa europea actual Por tal razoacuten el LC-MSMS no logroacute detectar PTXs ni DTX1 en las muestras de microalgas En estos casos un protocolo para el anaacutelisis de las microalgas debiera incluir un volumen menor de resuspensioacuten de los extractos secos en referencia al utilizado para los moluscos o bien seleccionar por micromanipulacioacuten un nuacutemero mayor de microalgas (gt 130 ceacutelulas) Sin embargo esto uacuteltimo es maacutes difiacutecil de lograr en latitudes australes debido a la baja densidad de ceacutelulas en las que se presenta normalmente esta especie en condiciones naturales Por tal motivo se recomienda realizar pruebas con un volumen de resuspensioacuten menor a 1 mL aun cuando se trate de un LC-MSMS triple cuadrupolo

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6 CONCLUSIONES

a Los moluscos de la regioacuten de Magallanes pueden presentar PTX2 YTX 45OHYTX DTX1 y SPX1

b El hecho que los moluscos puedan presentar dos o maacutes tipos de toxinas lipofiacutelicas dificulta establecer el nivel de toxicidad total

c P reticulatum en Magallanes produce YTXs al igual que la especie del norte y sur del paiacutes

d La abundancia relativa ambiental de P reticulatum durante el periodo de estudio coincidioacute con la presencia de YTXs en los moluscos

e Los SPXs encontrados anteriormente en caracoles piquilhue tambieacuten fue posible detectarlos en choritos durante este estudio

f Auacuten queda por confirmar el tipo de SPXs presentes y su eventual fuente primaria La presencia de SPXs en los moluscos no siempre coincidioacute con la presencia de A ostenfeldii en el ambiente y su abundancia relativa maacutexima fue solo de nivel 1 (raro) durante el periodo de estudio

g La PTX2 detectada en los moluscos coincidioacute con una alta abundancia relativa ambiental de D acuminata No obstante auacuten queda por confirmar si esta especie es la fuente primaria Para ello se hace necesario ajustar (disminuir) el volumen de dilucioacuten de los extractos secos de microalgas aisladas por micromanipulacioacuten aun cuando se trata de un espectroacutemetro de masas como un triple cuadrupolo

h La deteccioacuten de DTX1 en los moluscos coincidioacute con la ausencia de D acuta en el ambiente La toxina tampoco fue detectada en los moluscos cuando esta microalga estuvo a niveles de 2 y 3 (escaso y regular) Queda por confirmar la produccioacuten de DTX1 por esta especie en Magallanes

i No se encontraron PTX1 DTX2 ni AZPs en las muestras de moluscos durante el periodo de estudio

j Los resultados demuestran la presencia de toxinas en los moluscos que se hace necesario identificar y cuantificar utilizando teacutecnicas distintas al bioensayo

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F I G U R A

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Figura 1 Estaciones y sectores muestreados (ciacuterculo rojo) y sector Fortuna donde fue recolectado el

caracol piquilhue (ciacuterculo amarillo)

T A B L A S

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Tabla 1 Condiciones cromatograacuteficas para el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas usando

una columna de UPLC C18 en fase reversa y medio baacutesico

Columna Acquity UPLC BEH C18 17 microm 21x100 mm

Temperatura columna 45 ordmC

Flujo 04 mlmin

Volumen inyeccioacuten 5 microl

Temperatura muestras 10 plusmn 5 ordmC

Gradiente

Tiempo (min) Fase A () Fase B ()

0 75 25

066 75 25

330 5 95

528 5 95

726 75 25

900 75 25

Tabla 2 Paraacutemetros de la fuente de ionizacioacuten para el Xevo TQMS (Waters) en la determinacioacuten de toxinas lipofiacutelicas

PARAacuteMETROS DE LA FUENTE

ESI- ESI+

AO DTX2 DTX1 YTX homoYTX 45OH YTX y 45OH

homoYTX

AZA1 AZA2 AZA3 PTX2 PTX1 y SPX1

Voltaje de capilar (V) 100 200

Temperatura de solvatacioacuten (ordmC) 450 450

Flujo gas de solvatacioacuten (lh) 850 850

Flujo gas cono (lh) 50 50

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Tabla 3

Resumen de las condiciones de espectrometriacutea de masas empleadas con el Xevo TQMS (Waters) en el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas

Compuesto tR (min)

ESI

Ioacuten Precursor

(mz)

Ioacuten Producto

(mz)

Dwell time (s)

Energiacutea colisioacuten

(eV)

Voltaje cono (V)

AO 189 NEG 8035 2552 0010 46 86

113 0010 56 86

DTX2 210 NEG 8035 2552 0010 46 86

113 0010 56 86

DTX1 214 NEG 8175 5634 0010 43 86

2552 0010 48 86

YTX 202 NEG 5704 4674 0010 30 45

3963 0010 35 45

45OH-YTX 182 NEG 5784 4674 0010 30 45

3964 0010 30 45

HomoYTX 203 NEG 5775 4744 0010 30 48

4034 0010 30 48

45OH-homoYTX 182 NEG 5855 4034 0010 30 45

4744 0010 30 45

PTX1 306 POS 8925 8395 0015 25 36

8215 0015 25 36

PTX2 362 POS 8765 8415 0015 20 36

8235 0015 25 36

AZA1 263 POS 8425 6545 0015 55 50

3622 0015 50 50

AZA2 270 POS 8565 6725 0015 45 27

6545 0015 45 27

AZA3 236 POS 8285 6404 0015 55 47

3622 0015 55 47

SPX1 368 POS 6925 6744 0015 27 60

1643 0015 42 60 Transicioacuten cuantificadora

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SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo TABLAS

Tabla 4 TRR y valores de tolerancia para las toxinas analizadas

TOXINA TRR TOLERANCIA

Toxinas del grupo de AO

AO 1000 0990-1010

DTX2 1040 1014-1066

DTX1 1140 1111-1168

Toxinas del grupo de PTX

PTX2 1000 0990-1010

PTX1 0850 0829-0871

Toxinas del grupo de YTX

YTX 1000 0990-1010

45OH-YTX 0894 0871-0916

Homo YTX 1000 0990-1010

45OH-homoYTX 0899 0876-0921

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Tabla 5 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de moluscos

Nordm estMes

recolectaLocalidad Molusco

cuerpo

enterohepat

gramos

carne

toxicidad

VDM ratoacuten

PTX2

(ugKg)

YTX

(ugKg)

45OHYTX

(ugKg)

DTX1

libre

(ugKg)

DTX1

total

(ugkg)

SPX 1

(ugKg)

M13 ene-13 E Peel chorito x 5086 + 01 02

M13 ene-13 E Peel ostioacuten x 5155 No real izado 16 21

M33 ene-13 B Bell chorito x 5253 + 04

M37 ene-13 B Agua Fresca chorito x 5039 + 05 01

M35 ene-13 C San Isidro chorito x 5289 + 000 01

M42 ene-13 V Holanda chorito x 5231 + 06 13

M43 ene-13 B Yendegaia chorito x 5193 + 04 25

M45 ene-13 Pto Williams chorito x 5161 - 28 07

M08 feb-13 E Falcon cholga x 5027 - 14

M09 feb-13 E Penguumlin cholga x 5103 + 14

M22 feb-13 E de las Montantildeas cholga x 5052 - 26

M23 feb-13 I Ballesteros cholga x 5204 - 87

M24 feb-13 B Fanny chorito x 2016 - 38 1071 479 12

M25 feb-13 E Silva Palma chorito x 1447 - 59 1077 898 09

M26 feb-13 E Wickham chorito x 1093 - 194 2940 2232 66 66

M27 feb-13 E Sullivan chorito x 1137 - 450 1944 1478

M28 feb-13 E Nuntildeez chorito x 1179 + 33 721 407

M29 feb-13 Cutter Cove chorito x 1003 - 65 501 309

M29N1 feb-13 I Engelfield chorito x 1116 - 297 2007 1483

M31 feb-13 B Nash chorito x 2231 +

M33 feb-13 B Bell chorito x 1181 - 93

M34 feb-13 S Pedro chorito x 0726 -

M35 feb-13 C San Isidro chorito x 1178 + 110

M36 feb-13 B Buena chorito x 1367 +

M37 feb-13 B Agua Fresca chorito x 0850 + 45 100 80

M39 feb-13 Pto Zenteno chorito x 3241 + 28

M39N2 feb-13 Pta San Valentin chorito x 1712 - 11

M39N3 feb-13 Pto Yartou chorito x 2035 - 11

sector

Fortunajul-12 B Inuacutetil

caracol

piquilhuex 107000 + 01

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Tabla 6 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de microalgas

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Tabla 7 Niveles actualmente permitidos por la legislacioacuten europea (bioensayo) y los niveles propuestos por la

autoridad europea para la seguridad alimentaria (EFSA) (Gerssen et al 2010)

Toxin Legislacioacuten (μg kg-

1) Proposicioacuten

EFSA (μg kg-1)

Validacioacuten LC-MSMS

(μg kg-1)

OA and DTXs 160 45

PTXs 120

YTXs 1000 3750

AZAs 160 32

SPXs 400 (Gerssen et al2010)

European Food Safety Authority Decisioacuten 2002657 de la Unioacuten Europea EC Incluye PTXs

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Tabla 8 Abundancia relativa ambiental de las microalgas al momento de recolectar las muestras de moluscos En rojo se indica la deteccioacuten de toxina positiva en los moluscos asociada a la supuesta microalga fuente PTXs (D

acuminata) YTXs (P reticulatum) SPXs (A ostenfeldii) DTX1 (A acuta)

(Tabla modificada de Guzmaacuten et al 2014)

A N E X O S

ANEXO 1

Certificacioacuten laboratorio INTECMAR

ANEXO 2

Lista de anaacutelisis que realiza INTECMAR y sus costos (en euros) 2013

scv 1 de 7

GUIA PARA LA AUTOLIQUIDACIOacuteN DE TASAS A FAVOR DE LA COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA 2013 Los aspectos financieros de los servicios prestados por Intecmar en el marco de su actividad e vienen regulados en la Ley 62003 de 9 de diciembre de tasas precios y exenciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia (DOG nuacutem 240 de 11122003) y fueron actualizados posteriormente en la Ley 142010 de 27 de diciembre de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2011 (DOG nuacutem 250 de 30122010) y en la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013 (DOG nuacutem 42 de 28022013) Existen dos maneras de liquidar las tasas correspondientes a los servicios prestados por Intecmar

1 De forma manual cubriendo el modelo A de autoliquidacioacuten que se descarga en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda y que adjunto en pdf y se lleva al banco para su pago httpwwwconselleriadefacendaeswebportalconfeccion-impresos

2 De forma telemaacutetica en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda viacutenculo httpshostcixtecesXEITObinlionwebXeitodllxmit a traveacutes del modelo 730

Ambos modelos de liquidacioacuten de tasas adjuntamos ejemplo al final de este documento deben ser remitidos por mail a Intecmar con el sello del banco fiacutesico o virtual como paso previo a la emisioacuten del certificado Los coacutedigos generales necesarios son

minus Consejeriacutea de Medio Rural y de Mar Coacutedigo 09 minus Delegacioacuten de Pontevedra Coacutedigo 40 minus Servicio de Intecmar Coacutedigo 24

Los coacutedigos y descripcioacuten de las tasas son los regulados en la legislacioacuten vigente y los hemos resumido en los anexos siguientes Vilaxoaacuten 4 de marzo de 2013

scv 2 de 7

TARIFAS DE TASAS VIGENTES PARA 2013 - Ley 22013 d e 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013

(DOG nuacutem 42 de 28022013)

Estas tarifas son consecuencia de la actualizacioacuten de las tarifas contenidas en los anexos 1 2 3 4 y 5 de la Ley 62003 del 9 de diciembre de tasas precios y exacciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia por la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 Seraacuten aplicables desde el diacutea de la entrada en vigor de la Ley de

presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 TASA POR SERVICIOS ADMINISTRATIVOS

No sujecioacuten No se exigiraacute la tasa por servicios administrativos cuando se trate de compulsas o cotejos de documentos que deban acompantildear a solicitudes escritos o comunicaciones presentadas por el ciudadano y realizadas en el aacutembito de actuacioacuten de los registros seguacuten lo dispuesto en el artiacuteculo 385 de la Ley 301992 del 26 de noviembre de reacutegimen juriacutedico de las administraciones puacuteblicas y del procedimiento administrativo comuacuten

Excepciones Estaraacuten exentos de la presente tasa

1- La expedicioacuten de certificados de retribuciones satisfechas por la Xunta de Galicia con el objeto de justificacioacuten en relacioacuten con el impuesto sobre la renta de las personas fiacutesicas

2- La expedicioacuten de certificados y compulsa que el personal de la Administracioacuten solicite respecto a las necesidades propias del puesto de trabajo o relacioacuten de servicios

3- Los alumnos por cualquier actuacioacuten en materia de ensentildeanzas no universitarias

scv 3 de 7

4- Las compulsas realizadas en las oficinas de empleo para los desempleados en la tramitacioacuten de expedientes que sean competencia de dichas oficinas

5 La inscripcioacuten en las convocatorias para a seleccioacuten de personal de la comunidad autoacutenoma despueacutes de justificacioacuten documental solicitada por

- Personas con discapacidad igual o superior al 33 - Personas que sean miembros de familias numerosas clasificadas en la

categoriacutea especial Se aplicaraacute una bonificacioacuten del 50 a la inscripcioacuten solicitada por - Personas que sean miembros de familias numerosas de categoriacutea

general - Personas que figurasen como demandantes de empleo desde por lo

menos seis meses antes a la fecha de la convocatoria de pruebas selectivas de personal en las que soliciten su participacioacuten y no esteacuten percibiendo prestacioacuten o subsidio por desempleo

6- La expedicioacuten de certificados relativos a la situacioacuten fiscal 7- El Estado y los demaacutes entes puacuteblicos territoriales o institucionales

siempre que los servicios o actividades de que sean beneficiarios se presten o se realicen en el marco del principio de colaboracioacuten entre administraciones

8- Las viacutectimas de actos terroristas asiacute como sus coacutenyuges y sus hijos por cualquier actuacioacuten en materia educativa realizada en centros oficiales de estudios en todos los niveles de ensentildeanza

9- Los miembros de los organismos consultivos de la Administracioacuten puacuteblica gallega respecto de los certificados emitidos por dichos organismos

COacuteDIGO TASAS

DESCRIPCIOacuteN IMPORTE euro

314400 Prestacioacuten de servicios en el Instituto Tecnoloacutegico para el Control del Medio Marino de Galicia

314401 Anaacutelisis de biotoxinas marinas en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de Yasumoto 1978 4752

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en rato segundo o meacutetodo de Yasumoto 1984 5432

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS)

9520 -Anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten

seguacuten el meacutetodo de la AOAC 4752

scv 4 de 7

-Anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo da AOAC 4752

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1978 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10186

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1984 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10865

-Anaacutelisis combinada en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS) anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo AOAC y anaacutelisis de toxicidad de tipo ASP por cromatografiacutea liquida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo de la AOAC 15000

314402 Anaacutelisis de muestras en agua de mar -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton marino mediante

microscopiacutea oacuteptica 15133 -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton toacutexico marino

mediante microscopiacutea oacuteptica 13333 - Anaacutelisis de carbono orgaacutenico disuelto 5093 -Anaacutelisis de nutrientes inorgaacutenicos disueltos 3500 -Anaacutelisis de pigmentos fotosinteacuteticos (clorofila ldquoardquo) por

espectrofluorimetria 1698 314403 Anaacutelisis microbioloacutegicos en moluscos y otros organismos

procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Cuantificacioacuten de E Coli 10186 - Deteccioacuten de Salmonella spp 16975 -Enumeracioacuten de Escherichia coli en moluscos bivalvos

vivos por la teacutecnica de medida directa de impedancia con el sistema BacTrac 4300 6800

314404 Anaacutelisis de contaminantes de origen quiacutemica en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Determinacioacuten de metales pesados (Pb Cd Cu Zn As Hg Ni Cr Ag) mediante espectrofotometriacutea de absorcioacuten atoacutemica por metal

6790

-Determinacioacuten de compuestos bifenilos policlorados (PCB) mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

scv 5 de 7

-Determinacioacuten de pesticidas organoclorados mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

-Determinacioacuten de hidrocarburos aromaacuteticos policiacuteclicos (HAPs) mediante cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de fluorescencia

28200

314405 Anaacutelisis histopatoloacutegica de moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Estudio hispatoloacutegico Determinacioacuten de Bonamia Marteillia Perkinsus y otras alteraciones patoloacutegicas

101852

314406 Emisioacuten de certificaciones e informes teacutecnicos y otras actuaciones a peticioacuten del interesado

Emisioacuten de certificados a peticioacuten de los interesados sobre las actuaciones llevadas a cabo por el Instituto

1000

Emisioacuten de informes teacutecnicos a peticioacuten del interesado (euros por hora o fraccioacuten)

4000

scv 6 de 7

scv 7 de 7

ANEXO 3

Resultados de anaacutelisis en muestras de microalgas anteriormente enviadas procedentes de Magallanes por el equipo de espectrometriacutea de masas utilizado por INTECMAR Trabajo presentado a las XXXII

Congreso de Ciencias del Mar realizado en Punta Arenas 22-25 octubre de 2012

PERFIL DE TOXINAS DE PROROCENTRUM LIMA (DINOPHYCEAE) AISLADO DESDE LA COSTA DE MAGALLANES SUR DE CHILE P Salgado1 G Pizarro1 JM Franco2 P Rioboacute2 e I Bravo3

1Instituto de Fomento Pesquero (IFOP) Punta Arenas Chile gemitapizarroifopcl 2Instituto de Investigaciones Marinas (CSIC) Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea 3Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea

Prorocentrum lima (Ehrenberg) es un dinoflagelado marino bentoacutenico que se encuentra adherido generalmente

sobre macroalgas sedimentos y detrito flotante y menos comuacutenmente en el plancton (Bravo et al 2001) Es una especie neriacutetica y estuarina y su rango de distribucioacuten geograacutefica variacutea desde aguas costeras tropicales a templadas (Faust 1991) La importancia de P lima se debe a que son productoras de toxinas diarreogeacutenicas en las personas (veneno diarreico de los mariscos VDM) al igual que algunas especies de Dinophysis aunque raramente se le han asociado con episodios toacutexicos por VDM por su caraacutecter epiacutefito y bentoacutenico El complejo VDM producido por P lima incluye moleacuteculas conocidas como el aacutecido okadaico (AO) y derivados dinofisistoxinas (DTX-1 DTX-2) (Bravo et al 2001 Vale et al 2009) No obstante existen casos citados para USA donde se detectoacute toxicidad por VDM en bivalvos de cultivos asociadas a P lima aunque en bajos niveles (Maranda et al 2007a) En Canadaacute tambieacuten se llevoacute a cabo un estudio en moluscos de cultivo cuya finalidad fue determinar el origen del VDM en la que P lima fue la principal especie sospechosa tras la ocurrencia de un evento toacutexico humano por VDM ocurrido en 1998 (Levasseur et al 2003) y en antildeos anteriores (Quilliam et al 1993) Aunque Levasseur et al (2003) no logroacute probar la toxicidad de los mariscos en cultivo a causa de P lima cabe hacer notar que lo que buscaron fue OA y DTX1 no DTX 3 este uacuteltimo principal derivado de las anteriores tras su transformacioacuten en los moluscos (eg Suzuki et al 1999 Vale amp Sampayo 2002)

En consecuencia el rol de P lima en eventos toacutexicos por VDM auacuten no puede descartarse por cuanto podriacutean llegar a ser importantes en ambientes turbulentos debido a la eventual remocioacuten de microalgas adheridas en sustratos por efecto de vientos (Levasseur et al 2003) factor de importancia si se trata de sedimentos o contrariamente en zonas someras y estables de cultivos de moluscos que al mismo tiempo favorecen microambientes para sustratos en los que prolifera la epiacutefita P lima (Lawrence et al 2000) quedando expuestas a re-suspensiones temporales que favorecen la filtracioacuten de estas microalgas por los bivalvos en cultivo (Maranda et al 2007a)

Chile posee escaso conocimiento sobre esta especie en su medio natural incluido su perfil de toxinas y potencial rol en la toxificacioacuten de moluscos por VDM Por tal razoacuten resultoacute interesante aportar al conocimiento de estos aspectos en muestras de sedimentos recolectadas en el estrecho de Magallanes en las que esta especie se encontroacute inhabitualmente abundante

Las ceacutelulas utilizadas en este estudio fueron aisladas desde sedimentos superficiales (0-3 cm) recolectados en el invierno de 2010 en la localidad de cabo San Isidro durante el muestreo regular del programa de monitoreo de marea roja en la regioacuten de Magallanes En esa oportunidad se logroacute cuantificar hasta 1002 quistes tecadoscm3 de Prorocentrum lima la mayor concentracioacuten respecto a otros sitios de recolecta (Fig 1) Los sedimentos de esta localidad presentaron una coloracioacuten oscura y un fuerte olor a sulfuro de hidroacutegeno (H2S) producto de anoxia local

Se aislaron entre 27 y 87 quistes tecados (Fig 1 a) directamente desde los sedimentos mientras otras 60 ceacutelulas vegetativas (Fig 1 b) fueron aisladas luego de promover la actividad y divisioacuten de los quistes en condiciones de 15 ordmC y un ciclo de luzoscuridad de 1212 horas (Tabla 1) Para este fin se aislaron quistes tecados y trasvasijaron a placas Petri de 5 cm de diaacutemetro conteniendo 5 mL de medio de cultivo L1 Para el anaacutelisis de toxinas las ceacutelulas aisladas fueron trasvasijadas a un tubo Eppendorf de 15 mL y congelados a -80 ordmC Una aliacutecuota de sedimento huacutemedo (100 microL aproximados) tambieacuten fue vaciada en un tubo Eppendorf y congelado Para extraer la toxina se antildeadioacute 500 microL de metanol 100 a cada tubo se mezcloacute por 1 min y filtroacute por 045 microm trasvasijando a un vial El extracto fue secado bajo nitroacutegeno gas a 40 ordmC y conservado a 4 ordmC hasta su anaacutelisis Previo al anaacutelisis de toxinas los extractos fueron resuspendidos en 150 microl de metanol

La presencia de la toxina dinofisistoxina 1 (DTX-1) en las muestras (Fig2) fue confirmada en modo negativo a traveacutes de su ioacuten precursor [M-H]- mz 8175 y sus iones productos mz 5634 y 2552 mediante un cromatoacutegrafo UPLC Acquity Waters acoplado a un triple cuadrupolo Waters Xevo TQ (LC-MS) La columna utilizada fue una Acquity UPLC BEH C18 17microm 21 x 100 mm a 45 ordmC La fase moacutevil consistioacute en (A) hidroacutexido amoacutenico a pH 11 y (B) hidroacutexido amoacutenico en acetonitrilo (67 mM) con una tasa de flujo de 4 mLmin El gradiente de elucioacuten utilizado fue el siguiente mantencioacuten al 75 de A entre 0 y 066 min cambio a 5 de A entre 066 y 330 min mantener 5

de A entre 330 y 528 min recuperacioacuten del 75 de A entre 528 y 726 min mantencioacuten al 75 de A hasta 9 min Se pinchoacute 5microL de muestra en el LC-MS El contenido de DTX-1 en las muestras fue cuantificado en base al ion precursor

Los tres tipos de muestras fueron positivas a la presencia de DTX-1 pero las ceacutelulas vegetativas fueron las que presentaron un mayor contenido de DTX-1 por ceacutelula La deteccioacuten de DTX-1 en los sedimentos (Tabla 2) reflejoacute la presencia de los quistes tecados en eacutestos

Figura 1 Concentraciones de quistes tecados de Prorocentrum lima (quistescm3 de sedimento huacutemedo) en estaciones de muestreo en el Estrecho de Magallanes (M26 Estero Wickham M29N1 Isla Engenfield M31 Bahiacutea Nash M35 Cabo San Isidro M39C1 Bahiacutea Gente Grande M39C2 Bahiacutea Inuacutetil M39C3 Canal Gabriel) y Canal Beagle (M41 Ventisquero Espantildea M42 Ventisquero Holanda) (a) Quistes tecados (b) ceacutelulas vegetativas obtenidas de germinacioacuten de quistes tecados bajo condiciones de laboratorio Barra de escala 20 microm

Tabla 1 Sedimento y ceacutelulas de Prorocentrum lima aisladas para anaacutelisis de toxinas

Extracto metanoacutelico Nordm de ceacutelulas TR ngmL pg DTX-1 ceacutel

G1 quistes tecados 27 213 lt2 -

G2 quistes tecados 67 214 05 11

G3 quistes tecados 87 215 12 21

G4 ceacutelulas vegetativas 60 215 34 87

G6 sedimentos aliacutecuota 213 13 19 pg microL sed

TR tiempo de retencioacuten

Figura 2 Cromatogramas de extractos metanoacutelicos de Prorocentrum lima quistes tecados (a) ceacutelulas vegetativas (b) y sedimentos (c)

Tabla 2 Caracteriacutesticas del sedimento con quistes tecados de Prorocentrum lima

Tipo Tamantildeo (mm)

Grava 2 35

Arena media 025 - 05 32

Arena muy fina 0063 - 0125 2

Limo-arcilla lt 0063 1

Estos resultados constituyen otra eventual posibilidad de toxicidad en los moluscos por VDM no soacutelo de aquellos con modalidad de vida bentoacutenica superficial sino de aquellos que tambieacuten viven enterrados en la arena (eg almeja huepo) Maacutes auacuten si se conoce que P lima posee la capacidad de desarrollar poblaciones naturales en aguas templadas en nuacutemeros que podriacutean justificar una toxicidad por VDM en los mariscos (eg Maranda et al 2007a b)

Referencias

Bravo I ML Fernaacutendez I Ramilo amp A Martinez 2001 Toxin composition of the toxic dinofagellate Prorocentrum lima isolated from different locations along the Galician coast (NW Spain) Toxicon 39 1537ndash1545

Faust MA 1991 Morphology of ciguatera-causing Prorocentrum lima (Pyrrophyta) from widely differing sites J Phycol 27 642-648

Lawrence J E Grant J Quilliam M A Bauder A G amp Cembella A D 2000 Colonizaition and growth of the toxic dinoflagellate Prorocentrum lima and associated fouling macroalgae on mussels in suspended culture Mar Ecol Prog Ser 201 147-154

Levasseur M Couture J Y Weise A M Michaud S Elbrachter M Sauveacute G amp Bonneau E 2003 Pelagic and epiphytic summer distributions of Prorocentrum lima and P mexicanum at two mussel farms in the Gulf of St Lawrence Aquat Microbiol Ecol 30283-293

Maranda L Corwin S Dover S amp Morton S L 2007a Prorocentrum lima (Dinophyceae) in northeastern USA coastal waters II Toxin load in the epibiota and in shellfish Harmful Algae 6 632-641

Maranda L Corwin S Hargraves P E 2007b Prorocentrum lima (Dinophyceae) in 19 northeastern USA coastal waters I Abundance and distribution Harmful Algae 6 623ndash631

Quilliam MA Gilgan MW amp Pleasance S 1993 Confirmation of an incident of diarrhetic shellfish poisoning in eastern Canada In Smayda TJ Shimizu Y (Eds) Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea Elsevier New York pp 547ndash552

Suzuki T Ota H amp Yamasaki M 1999 Direct evidence of transformation of dinophysistoxin-1 to 7-O-acyl-dinophysistoxin-1 (Dinophysis-3) in the scallop Patinopecten yessoensis Toxicon 37 187-198

Vale P amp Sampayo M A 2002 First confirmation of human diarrhoeic poisonings by okadaic acid esters after ingestion of razor clams (Solen marginatus) and green crabs (Carcinus maenas) in Aveiro lagoon Portugal and detection of okadaic acid esters in phytoplankton Toxicon 40989-996

Vale P Veloso V amp Amorim A 2009 Toxin composition of a Prorocentrum lima strain isolated from the Portuguese coast Toxicon 54145ndash152

Agradecimientos Intecmar de la Xunta de Galicia Espantildea donde se realizaron los anaacutelisis de toxinas proyecto

SUBPESCA ldquoManejo y Monitoreo de Mareas Rojas en las regiones de Los Lagos Ayseacuten y Magallanes IV etapa 2010rdquo

ANEXO 4

Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten

ANEXO 5

Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de Magallanes

TASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

O

EJE

MP

LA

R P

AR

A E

L IN

TE

RE

SA

DO

LIQ

UID

AC

IOacuteN

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

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VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

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DIG

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AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

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BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

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Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

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IATASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

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BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

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IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

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ANEXO 6

Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para cierre

de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

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6

Disolucioacuten certificada de Homo-yessotoxina 1aHomoyessotoxin di-sodium salt en metanol (CRM-00-hYTX) Cod PB019

Disolucioacuten certificada de calibracioacuten de Azaspiraacutecido 1 en metanol (NRC CRM-AZA1) Cod PB020

Disolucioacuten certificada de calibracioacuten de Azaspiraacutecido 2 en metanol (NRC CRM-AZA2) Cod PB021

Disolucioacuten certificada de calibracioacuten de Azaspiraacutecido 3 en metanol (NRC CRM-AZA3) Cod PB022

Disolucioacuten de calibracioacuten de Dinofisistoxina 2 en metanol (00-DTX2) Cod PB026

Disolucioacuten de calibracioacuten de Dinofisistoxina 1 en metanol (CRM-00-DTX1) Cod PB032

Disolucioacuten de calibracioacuten de Pectenotoxina 2 en metanol (00-PTX2) Cod PB031

Material de Referencia Certificado (Mussel Tissue Reference Material for DSP Toxins NRC CRM-DSP-Mus-b) con AO y DTX1 101 plusmn 08 microgg y 13 plusmn 02 microgg respectivamente Homogeneizado de mejilloacuten (Mytilus edulis) Cod PB014

Material de Referencia Certificado (Mussel Tissue Reference Material for AZA Toxins NRC CRM-AZA-Mus) con AZA1 116 plusmn 010 microgg AZA2 0273 plusmn 0023 microgg y AZA3 0211 plusmn 0022 microgg Homogeneizado de mejilloacuten (Mytilus edulis) Cod PB030

Disolucioacuten certificada de calibracioacuten de 13-dismetil espiroacutelido C en metanol (NRC CRM-SPX1) Cod PB027

La Tabla 1 muestra las condiciones cromatograacuteficas usando una columna de UPLC C18 en fase reversa y medio baacutesico mientras que los paraacutemetros de la fuente de ionizacioacuten para el Xevo TQMS (Waters) se muestran en la Tabla 2

34 Extraccioacuten de toxinas

A los extractos metanoacutelicos en seco de las 29 muestras de moluscos y 29 muestras de microalgas se le adicionaron hasta un total de 25 mL de metanol dispensadas en pequentildeas aliacutecuotas agitando el vial con un vortex durante 30 segundos Anaacutelisis de las formas libres del AO DTX1 y DTX2 y de las toxinas de los grupos PTXs AZAs y YTXs Para la determinacioacuten de las formas libres del AO DTX1 y DTX2 y de las toxinas de los grupos PTXs AZAs y YTXs se filtroacute un volumen de aproximadamente 12 ml del extracto metanoacutelico a traveacutes de filtros

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de jeringa de 045 microm para su posterior hidroacutelisis (seccioacuten siguiente) Otra aliacutecuota del mismo extracto filtrada a traveacutes de filtro de jeringa compatible con el disolvente de 022 microm se diluyoacute a la mitad con MeOH 100 y se inyectoacute 5 microl en el sistema LC-MSMS Hidroacutelisis y cuantificacioacuten del contenido total de AO DTX1 y DTX2 Para detectar y cuantificar el contenido total de AO DTX1 y DTX2 se requiere una hidroacutelisis baacutesica previa a la inyeccioacuten de los extractos en el sistema de LC-MSMS Procedimiento En un vial que contiene 1 ml de extracto metanoacutelico previamente filtrado por filtros de jeringa de 045 microm se antildeaden 125 microl de NaOH 25 M se agita manualmente 10 segundos y la mezcla fue sometida a 76 plusmn 4 ordmC durante 40 minutos en un bantildeo Se enfrioacute a temperatura ambiente se pesoacute y luego neutralizoacute con 125 microl de HCl 25 M Finalmente se homogenizoacute nuevamente con el vortex durante 30 segundos Una aliacutecuota del extracto resultante se filtroacute con filtros de jeringa de 022 microm y diluyoacute 58 con MeOH 100 Una aliacutecuota de 5 microl fue inyectada en el sistema de LC-MSMS Durante el proceso de hidroacutelisis el vial debe estar bien cerrado para evitar peacuterdidas por evaporacioacuten (la temperatura de ebullicioacuten del MeOH es 65 ordmC) Las peacuterdidas se pueden detectar mediante pesada del vial antes y despueacutes de la hidroacutelisis en caso de confirmarse se completaraacute el peso con metanol La deteccioacuten con el espectroacutemetro de masas se realizoacute usando dos transiciones por toxina la de mayor intensidad se utilizoacute para cuantificar y la de menor intensidad para confirmar (Tabla 3) Identificacioacuten y Confirmacioacuten La identificacioacuten de la presencia de toxinas se realizaraacute por comparacioacuten del tiempo de retencioacuten de cada una de las toxinas en la muestra con el tiempo de retencioacuten obtenido en las disoluciones de calibrado estaacutendar inyectadas en un mismo diacutea de anaacutelisis Se permite una desviacioacuten maacutexima entre ambos tiempos del 25 Para las toxinas que se cuantifican con la recta de calibrado del anaacutelogo correspondiente se establece un TRR con una tolerancia seguacuten se indica en la Tabla 4 Para una correcta identificacioacuten se exige una separacioacuten entre picos calculada mediante aplicacioacuten de la expresioacuten

2 x (RT2-RT1) RS = ----------------------

(W1+W2)

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En donde RT1 y RT2 y W1 y W2 son respectivamente los tiempos de retencioacuten y las anchuras en la liacutenea base de dos picos adyacentes RT2gtRT1 La resolucioacuten seraacute aceptable cuando Rs gt10 y la resolucioacuten a liacutenea base se consideraraacute completa cuando Rs gt15 La confirmacioacuten de la presencia de toxina seguacuten el criterio de la Decisioacuten de la Comisioacuten 2002657EC se basa en la relacioacuten entre las dos transiciones empleadas para la determinacioacuten (cuantificacioacuten y confirmacioacuten)

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4 RESULTADOS

41 Toxinas en moluscos

Las toxinas detectadas en moluscos fueron PTX2 YTX 45OHYTX DTX1 y SPX1 (Tabla 5) La mayor concentracioacuten la presentoacute el grupo de las YTXs (40-294 microg kg-1) en muestras de choritos provenientes del sector de Seno Otway (Fig 1) En este mismo sector las PTXs tambieacuten presentaron las mayores concentraciones (3-45 microg kg-1) en estos transvectores En el caso del ostioacuten tanto el PTX2 como las YTXs fueron detectadas en el contenido gaacutestrico El DTX1 fue detectado en choritos (1-18 microg kg-1 considerando DTX1 libre y total) procedentes del sector Seno Otway y sectores adyacentes a Punta Arenas El AO no fue detectado en ninguna aacuterea de la Regioacuten Los SPXs fueron principalmente detectados en choritos de las aacutereas centro y sur de Magallanes y en una estacioacuten del estero Peel (M13) en el aacuterea norte de la regioacuten No obstante que los niveles son muy bajos (01- 25 microg kg-1) incluso del nivel letal 50 en ratones inyectados intraperitonealmente 40 microg kg-1 (Richard et al 2000) los valores encontrados son iguales o mayor al encontrado en el caracol piquilhue recolectado en julio de 2012 y que en ese entonces produjo la muerte de ratones provocando el cierre de aacutereas de extraccioacuten por la autoridad de salud regional (Anexo 6) De las cinco toxinas detectadas en los moluscos solo DTX1 mostroacute estar localizada en el aacuterea centro de Magallanes mientras que las restantes fueron detectadas en las tres aacutereas de monitoreo Norte centro y sur de Magallanes No se encontraron PTX1 DTX2 ni AZPs en las muestras de moluscos Los resultados muestran que de los cuatro grupos de toxinas PTX YTXs DTXs y SPXs tres de ellas pueden estar presentes simultaacuteneamente en los moluscos vale decir PTXs YTXs y DTX1 o bien SPXs en vez de DTX1 42 Toxinas en microalgas

En las microalgas se detectaron PTXs y YTXs (Tabla 6) Las PTXs fueron detectadas aunque a nivel de trazas en ceacutelulas de D acuminata seleccionadas por micromanipulacioacuten desde muestras de agua procedentes de estero Silva Palma (M25) estero Wickham (M26) y Cutter Cove (M29) (Fig1) Tambieacuten fue detectada en filtrados de agua (fitoplancton) de Pto Fontaine (M21) e I Engelfield (M29N1) Las YTXs fueron detectadas en ceacutelulas de P reticulatum seleccionadas por micromanipulacioacuten y en cultivos de esta microalga que se logroacute establecer a partir de muestras de agua provenientes de C Adalberto (M04) Cutter Cove (M29) e I Engelfield (M29N1) Solo en los cultivos se detectoacute

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homoYTX y en uno de ellos tambieacuten se detectoacute aunque miacutenimamente 45OHYTX un derivado de la YTX que normalmente se encuentra en los moluscos como producto de bio-transformacioacuten La presencia de 45OHYTX en el cultivo pudo deberse a la presencia de ceacutelulas ya en fase de declinacioacuten de la curva de crecimiento

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5 ANAacuteLISIS Y DISCUSIOacuteN DE LOS DATOS

51 Toxinas en moluscos De las toxinas lipofiacutelicas se sabe que AO DTXs y AZAs causan trastornos gastrointestinales en los seres humanos (Gerssen et al 2010) Para las toxinas restantes (YTXs PTXs y SPXs) auacuten cuando no se han reportado casos de intoxicacioacuten en los seres humanos eacutestas son letales o altamente toacutexicas cuando los ratones son inyectados por viacutea intraperitoneal (Paz et al 2008 Richard et al 2000 Miles et al 2004) Es el caso de los SPXs la toxicidad en ratones inyectados por viacutea intraperitoneal supera a la del resto de las toxinas pues su dosis letal 50 es de 40 microg kg-1 (Richard et al 2000) Tal es asiacute que como referencia (Tabla 5) el transvector caracol piquilhue recolectadas en Julio de 2012 y cuyos niveles de toxicidad provocaron la muerte de los ratones solo presentoacute 01 microg kg-1 deteccioacuten que fue realizada durante este estudio en muestras de carne almacenadas durante no maacutes de 1 antildeo a -20 ordmC Sin embargo no se puede descartar una peacuterdida de la actividad por transformacioacuten durante el periodo de conservacioacuten A excepcioacuten de los SPXs el resto de las toxinas mencionadas estaacuten reguladas por la legislacioacuten europea tanto para consumo interno como importacioacuten de moluscos y tunicados para garantizar la salud de las personas Asiacute tambieacuten estaacuten reguladas por la legislacioacuten chilena a traveacutes del Instituto de Salud Puacuteblica (ISP) estableciendo los mismos niveles de referencia europeo en base al bioensayo ratoacuten Aun cuando los niveles de toxinas detectadas en los moluscos durante este estudio estaacuten por debajo de lo exigido por las regulaciones e incluso de los niveles propuestos por el EFSA (Tabla 7) la presencia de dos y tres tipos de toxinas en los moluscos representa una complejidad en la determinacioacuten de los niveles de toxicidad especialmente si se encuentran presentes toxinas altamente toacutexicas para ratones inyectados intraperitonealmente como son los SPXs Aunque se sospechaba la concurrencia de diferentes tipos de toxinas tal hecho no habiacutea sido confirmado anteriormente Sin embargo los SPXs siguen siendo una incoacutegnita pues se desconoce la fuente de estas toxinas A ostenfeldii la especie que podriacutea ser candidata a confirmar estuvo ausente (Tabla 8 modificado de Guzmaacuten et al 2014) durante el periodo en que se detectoacute en los moluscos Los escasos antecedentes toxigeacutenicos de esta especie en Chile la han confirmado como productora de toxinas paralizantes en Ayseacuten (Pizarro et al 2012) pero no de SPXs No obstante la produccioacuten de SPXs por esta especie en la regioacuten de Magallanes auacuten no se puede descartar Las YTXs fueron las toxinas maacutes abundantes en los moluscos analizados condicioacuten que se corresponde con la alta abundancia relativa de esta especie en el ambiente (Tabla 8) en la mayoriacutea de los casos (Tabla 5)

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Los resultados sugieren que los falsos positivos por bioensayo ratoacuten pudieran ser maacutes frecuentes de lo que se piensa actualmente para la regioacuten de Magallanes 52 Toxinas en microalgas Los resultados indican que P reticulatum encontrado en Magallanes producen YTXs al igual que las especies reportadas en la regioacuten de Antofagasta y Ayseacuten (Aacutelvarez et al 2011 Pizarro et al 2012) Tal resultado hace altamente probable que esta especie es la fuente de YTXs detectadas en los moluscos durante el periodo de estudio De acuerdo a las toxinas detectadas en las muestras de D acuminata aisladas asiacute como en el fitoplancton con gran abundancia de esta especie (Tabla 8) sugiere que esta microalga podriacutea ser una fuente primaria de PTXs tal como ocurre en el norte y sur del paiacutes (Blanco et al 2007 Fux et al 2011) Aunque la especie tambieacuten ha sido asociada a la presencia de DTX1 en moluscos en un evento toacutexico ocurrido en 1998 en Magallanes (Uribe et al 2001) el DTX1 no fue detectado en las muestras de D acuminata durante este estudio El no hallazgo de DTX1 en estas muestras pudo deberse a una fuente microalgal distinta como D acuta yo P lima D acuta ha sido asociada a DTX1 en moluscos de la regioacuten de Ayseacuten (Lembeye et al 1993 y Zhao et al 1993) mientras que P lima es productora solo de DTX1 en la regioacuten de Magallanes (Salgado et al 2012) Sin embargo cuando se detectoacute DTX1 en las muestras de moluscos durante este estudio D acuta estuvo ausente en las muestras de agua mientras que D acuminata presentoacute una abundancia relativa alta Por otro lado el volumen de resuspensioacuten de los extractos pudo ser elevado al seguir el mismo procedimiento protocolar que se aplica a las muestras de moluscos de acuerdo a la normativa europea actual Por tal razoacuten el LC-MSMS no logroacute detectar PTXs ni DTX1 en las muestras de microalgas En estos casos un protocolo para el anaacutelisis de las microalgas debiera incluir un volumen menor de resuspensioacuten de los extractos secos en referencia al utilizado para los moluscos o bien seleccionar por micromanipulacioacuten un nuacutemero mayor de microalgas (gt 130 ceacutelulas) Sin embargo esto uacuteltimo es maacutes difiacutecil de lograr en latitudes australes debido a la baja densidad de ceacutelulas en las que se presenta normalmente esta especie en condiciones naturales Por tal motivo se recomienda realizar pruebas con un volumen de resuspensioacuten menor a 1 mL aun cuando se trate de un LC-MSMS triple cuadrupolo

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6 CONCLUSIONES

a Los moluscos de la regioacuten de Magallanes pueden presentar PTX2 YTX 45OHYTX DTX1 y SPX1

b El hecho que los moluscos puedan presentar dos o maacutes tipos de toxinas lipofiacutelicas dificulta establecer el nivel de toxicidad total

c P reticulatum en Magallanes produce YTXs al igual que la especie del norte y sur del paiacutes

d La abundancia relativa ambiental de P reticulatum durante el periodo de estudio coincidioacute con la presencia de YTXs en los moluscos

e Los SPXs encontrados anteriormente en caracoles piquilhue tambieacuten fue posible detectarlos en choritos durante este estudio

f Auacuten queda por confirmar el tipo de SPXs presentes y su eventual fuente primaria La presencia de SPXs en los moluscos no siempre coincidioacute con la presencia de A ostenfeldii en el ambiente y su abundancia relativa maacutexima fue solo de nivel 1 (raro) durante el periodo de estudio

g La PTX2 detectada en los moluscos coincidioacute con una alta abundancia relativa ambiental de D acuminata No obstante auacuten queda por confirmar si esta especie es la fuente primaria Para ello se hace necesario ajustar (disminuir) el volumen de dilucioacuten de los extractos secos de microalgas aisladas por micromanipulacioacuten aun cuando se trata de un espectroacutemetro de masas como un triple cuadrupolo

h La deteccioacuten de DTX1 en los moluscos coincidioacute con la ausencia de D acuta en el ambiente La toxina tampoco fue detectada en los moluscos cuando esta microalga estuvo a niveles de 2 y 3 (escaso y regular) Queda por confirmar la produccioacuten de DTX1 por esta especie en Magallanes

i No se encontraron PTX1 DTX2 ni AZPs en las muestras de moluscos durante el periodo de estudio

j Los resultados demuestran la presencia de toxinas en los moluscos que se hace necesario identificar y cuantificar utilizando teacutecnicas distintas al bioensayo

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spirolides in Mesodesma donacium and Mulinia edulis from Northern Chile Toxicon 55 638ndash641

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Bay North Chile as determined by tandem mass spectrometry Toxicon 54 364-367

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15

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Paz B Daranas AH Norte M Rioboacute P Franco JM amp Fernaacutendez JJ 2008 Yessotoxins a

group of marine polyether toxins an overview Mar Drugs 673-102 Pizarro G Alarcoacuten C Franco JM Escalera L Reguera B Vidal G Palma M amp Guzmaacuten L 2011

Distribucioacuten espacial de Dinophysis spp y deteccioacuten de toxinas DSP en el agua mediante resinas DIAION (verano 2006 X regioacuten de Chile) CiencTecnol 34(1)25-50

Pizarro G Paz B Salgado P Aacutelvarez-Chaver P Garrido C amp Guzmaacuten L 2012 Perfil de toxinas

de Protoceratium reticulatum aislados de la regioacuten de Ayseacuten XXXII Congreso de Ciencias del Mar 22-25 octubre 2012 Universidad de Magallanes Punta Arenas Chile Libro de resuacutemenes p 83

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and pharmacology of spirolides a novel group of shellfish toxins In Hallegraeff GM Blackburn SI Bolch CJ Lewis RJ (eds) Proceedings of the 9th conference on harmful algal blooms Hobart Australia pp 383ndash386

Salgado P Pizarro G Franco JM Rioboacute P Bravo I Perfil de toxinas de Prorocentrum lima

(Dinophyceae) aislado desde la costa de Magallanes sur de Chile In Proceedings of Libro de resuacutemenes del XXXII Congreso de Ciencias del Mar Punta Arenas Chile 22-26 de Octubre 2012 p 228

Trefault N B Krock N Delherbe A Cembella amp M Vaacutesquez 2011 Latitudinal transects in the

southeastern Pacific Ocean reveal a diverse but patchy distribution of phycotoxins Toxicon 58(5) 389ndash397

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16

Uribe J C Garciacutea C Rivas M and Lagos N 2001 First report of diarrhetic shellfish toxins in

Magellanic fjords southern Chile J Shellfish Res 2069-74 Yasumoto T Oshima Y amp Yamaguchi M 1978 Occurrence of a new type of shellfish poisoning in

the Tohoku district Bull Jpn Soc Sci Fish 44 1249-1255 Yasumoto T Murata M Lee J-S amp Torigoe KTD 1989 Polyether toxins produced by

dinoflagellates In Natori S Hashimoto K Ueno Y (Eds) Mycotoxins and Phycotoxins rsquo88 Elsevier Amsterdam pp 375ndash382

Yasumoto T amp Takizawa A 1997 Fluorometric measurements of yessotoxins in shellfish high-

pressure liquid chromatography Biosci Biotech Biochem 611775-1777 Zhao J Lembeye G Cenci G Wall B amp Yasumoto T 1993 Determination of okadaic acid and

dinophysistoxin-1 in mussels from Chile Italy and Ireland In Smayda T J amp Shimizu Y (Eds) Toxic phytoplankton blooms in the sea Elsevier Amsterdam pp 587-592

F I G U R A

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Figura 1 Estaciones y sectores muestreados (ciacuterculo rojo) y sector Fortuna donde fue recolectado el

caracol piquilhue (ciacuterculo amarillo)

T A B L A S

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Tabla 1 Condiciones cromatograacuteficas para el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas usando

una columna de UPLC C18 en fase reversa y medio baacutesico

Columna Acquity UPLC BEH C18 17 microm 21x100 mm

Temperatura columna 45 ordmC

Flujo 04 mlmin

Volumen inyeccioacuten 5 microl

Temperatura muestras 10 plusmn 5 ordmC

Gradiente

Tiempo (min) Fase A () Fase B ()

0 75 25

066 75 25

330 5 95

528 5 95

726 75 25

900 75 25

Tabla 2 Paraacutemetros de la fuente de ionizacioacuten para el Xevo TQMS (Waters) en la determinacioacuten de toxinas lipofiacutelicas

PARAacuteMETROS DE LA FUENTE

ESI- ESI+

AO DTX2 DTX1 YTX homoYTX 45OH YTX y 45OH

homoYTX

AZA1 AZA2 AZA3 PTX2 PTX1 y SPX1

Voltaje de capilar (V) 100 200

Temperatura de solvatacioacuten (ordmC) 450 450

Flujo gas de solvatacioacuten (lh) 850 850

Flujo gas cono (lh) 50 50

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Tabla 3

Resumen de las condiciones de espectrometriacutea de masas empleadas con el Xevo TQMS (Waters) en el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas

Compuesto tR (min)

ESI

Ioacuten Precursor

(mz)

Ioacuten Producto

(mz)

Dwell time (s)

Energiacutea colisioacuten

(eV)

Voltaje cono (V)

AO 189 NEG 8035 2552 0010 46 86

113 0010 56 86

DTX2 210 NEG 8035 2552 0010 46 86

113 0010 56 86

DTX1 214 NEG 8175 5634 0010 43 86

2552 0010 48 86

YTX 202 NEG 5704 4674 0010 30 45

3963 0010 35 45

45OH-YTX 182 NEG 5784 4674 0010 30 45

3964 0010 30 45

HomoYTX 203 NEG 5775 4744 0010 30 48

4034 0010 30 48

45OH-homoYTX 182 NEG 5855 4034 0010 30 45

4744 0010 30 45

PTX1 306 POS 8925 8395 0015 25 36

8215 0015 25 36

PTX2 362 POS 8765 8415 0015 20 36

8235 0015 25 36

AZA1 263 POS 8425 6545 0015 55 50

3622 0015 50 50

AZA2 270 POS 8565 6725 0015 45 27

6545 0015 45 27

AZA3 236 POS 8285 6404 0015 55 47

3622 0015 55 47

SPX1 368 POS 6925 6744 0015 27 60

1643 0015 42 60 Transicioacuten cuantificadora

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Tabla 4 TRR y valores de tolerancia para las toxinas analizadas

TOXINA TRR TOLERANCIA

Toxinas del grupo de AO

AO 1000 0990-1010

DTX2 1040 1014-1066

DTX1 1140 1111-1168

Toxinas del grupo de PTX

PTX2 1000 0990-1010

PTX1 0850 0829-0871

Toxinas del grupo de YTX

YTX 1000 0990-1010

45OH-YTX 0894 0871-0916

Homo YTX 1000 0990-1010

45OH-homoYTX 0899 0876-0921

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Tabla 5 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de moluscos

Nordm estMes

recolectaLocalidad Molusco

cuerpo

enterohepat

gramos

carne

toxicidad

VDM ratoacuten

PTX2

(ugKg)

YTX

(ugKg)

45OHYTX

(ugKg)

DTX1

libre

(ugKg)

DTX1

total

(ugkg)

SPX 1

(ugKg)

M13 ene-13 E Peel chorito x 5086 + 01 02

M13 ene-13 E Peel ostioacuten x 5155 No real izado 16 21

M33 ene-13 B Bell chorito x 5253 + 04

M37 ene-13 B Agua Fresca chorito x 5039 + 05 01

M35 ene-13 C San Isidro chorito x 5289 + 000 01

M42 ene-13 V Holanda chorito x 5231 + 06 13

M43 ene-13 B Yendegaia chorito x 5193 + 04 25

M45 ene-13 Pto Williams chorito x 5161 - 28 07

M08 feb-13 E Falcon cholga x 5027 - 14

M09 feb-13 E Penguumlin cholga x 5103 + 14

M22 feb-13 E de las Montantildeas cholga x 5052 - 26

M23 feb-13 I Ballesteros cholga x 5204 - 87

M24 feb-13 B Fanny chorito x 2016 - 38 1071 479 12

M25 feb-13 E Silva Palma chorito x 1447 - 59 1077 898 09

M26 feb-13 E Wickham chorito x 1093 - 194 2940 2232 66 66

M27 feb-13 E Sullivan chorito x 1137 - 450 1944 1478

M28 feb-13 E Nuntildeez chorito x 1179 + 33 721 407

M29 feb-13 Cutter Cove chorito x 1003 - 65 501 309

M29N1 feb-13 I Engelfield chorito x 1116 - 297 2007 1483

M31 feb-13 B Nash chorito x 2231 +

M33 feb-13 B Bell chorito x 1181 - 93

M34 feb-13 S Pedro chorito x 0726 -

M35 feb-13 C San Isidro chorito x 1178 + 110

M36 feb-13 B Buena chorito x 1367 +

M37 feb-13 B Agua Fresca chorito x 0850 + 45 100 80

M39 feb-13 Pto Zenteno chorito x 3241 + 28

M39N2 feb-13 Pta San Valentin chorito x 1712 - 11

M39N3 feb-13 Pto Yartou chorito x 2035 - 11

sector

Fortunajul-12 B Inuacutetil

caracol

piquilhuex 107000 + 01

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Tabla 6 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de microalgas

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Tabla 7 Niveles actualmente permitidos por la legislacioacuten europea (bioensayo) y los niveles propuestos por la

autoridad europea para la seguridad alimentaria (EFSA) (Gerssen et al 2010)

Toxin Legislacioacuten (μg kg-

1) Proposicioacuten

EFSA (μg kg-1)

Validacioacuten LC-MSMS

(μg kg-1)

OA and DTXs 160 45

PTXs 120

YTXs 1000 3750

AZAs 160 32

SPXs 400 (Gerssen et al2010)

European Food Safety Authority Decisioacuten 2002657 de la Unioacuten Europea EC Incluye PTXs

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Tabla 8 Abundancia relativa ambiental de las microalgas al momento de recolectar las muestras de moluscos En rojo se indica la deteccioacuten de toxina positiva en los moluscos asociada a la supuesta microalga fuente PTXs (D

acuminata) YTXs (P reticulatum) SPXs (A ostenfeldii) DTX1 (A acuta)

(Tabla modificada de Guzmaacuten et al 2014)

A N E X O S

ANEXO 1

Certificacioacuten laboratorio INTECMAR

ANEXO 2

Lista de anaacutelisis que realiza INTECMAR y sus costos (en euros) 2013

scv 1 de 7

GUIA PARA LA AUTOLIQUIDACIOacuteN DE TASAS A FAVOR DE LA COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA 2013 Los aspectos financieros de los servicios prestados por Intecmar en el marco de su actividad e vienen regulados en la Ley 62003 de 9 de diciembre de tasas precios y exenciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia (DOG nuacutem 240 de 11122003) y fueron actualizados posteriormente en la Ley 142010 de 27 de diciembre de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2011 (DOG nuacutem 250 de 30122010) y en la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013 (DOG nuacutem 42 de 28022013) Existen dos maneras de liquidar las tasas correspondientes a los servicios prestados por Intecmar

1 De forma manual cubriendo el modelo A de autoliquidacioacuten que se descarga en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda y que adjunto en pdf y se lleva al banco para su pago httpwwwconselleriadefacendaeswebportalconfeccion-impresos

2 De forma telemaacutetica en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda viacutenculo httpshostcixtecesXEITObinlionwebXeitodllxmit a traveacutes del modelo 730

Ambos modelos de liquidacioacuten de tasas adjuntamos ejemplo al final de este documento deben ser remitidos por mail a Intecmar con el sello del banco fiacutesico o virtual como paso previo a la emisioacuten del certificado Los coacutedigos generales necesarios son

minus Consejeriacutea de Medio Rural y de Mar Coacutedigo 09 minus Delegacioacuten de Pontevedra Coacutedigo 40 minus Servicio de Intecmar Coacutedigo 24

Los coacutedigos y descripcioacuten de las tasas son los regulados en la legislacioacuten vigente y los hemos resumido en los anexos siguientes Vilaxoaacuten 4 de marzo de 2013

scv 2 de 7

TARIFAS DE TASAS VIGENTES PARA 2013 - Ley 22013 d e 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013

(DOG nuacutem 42 de 28022013)

Estas tarifas son consecuencia de la actualizacioacuten de las tarifas contenidas en los anexos 1 2 3 4 y 5 de la Ley 62003 del 9 de diciembre de tasas precios y exacciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia por la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 Seraacuten aplicables desde el diacutea de la entrada en vigor de la Ley de

presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 TASA POR SERVICIOS ADMINISTRATIVOS

No sujecioacuten No se exigiraacute la tasa por servicios administrativos cuando se trate de compulsas o cotejos de documentos que deban acompantildear a solicitudes escritos o comunicaciones presentadas por el ciudadano y realizadas en el aacutembito de actuacioacuten de los registros seguacuten lo dispuesto en el artiacuteculo 385 de la Ley 301992 del 26 de noviembre de reacutegimen juriacutedico de las administraciones puacuteblicas y del procedimiento administrativo comuacuten

Excepciones Estaraacuten exentos de la presente tasa

1- La expedicioacuten de certificados de retribuciones satisfechas por la Xunta de Galicia con el objeto de justificacioacuten en relacioacuten con el impuesto sobre la renta de las personas fiacutesicas

2- La expedicioacuten de certificados y compulsa que el personal de la Administracioacuten solicite respecto a las necesidades propias del puesto de trabajo o relacioacuten de servicios

3- Los alumnos por cualquier actuacioacuten en materia de ensentildeanzas no universitarias

scv 3 de 7

4- Las compulsas realizadas en las oficinas de empleo para los desempleados en la tramitacioacuten de expedientes que sean competencia de dichas oficinas

5 La inscripcioacuten en las convocatorias para a seleccioacuten de personal de la comunidad autoacutenoma despueacutes de justificacioacuten documental solicitada por

- Personas con discapacidad igual o superior al 33 - Personas que sean miembros de familias numerosas clasificadas en la

categoriacutea especial Se aplicaraacute una bonificacioacuten del 50 a la inscripcioacuten solicitada por - Personas que sean miembros de familias numerosas de categoriacutea

general - Personas que figurasen como demandantes de empleo desde por lo

menos seis meses antes a la fecha de la convocatoria de pruebas selectivas de personal en las que soliciten su participacioacuten y no esteacuten percibiendo prestacioacuten o subsidio por desempleo

6- La expedicioacuten de certificados relativos a la situacioacuten fiscal 7- El Estado y los demaacutes entes puacuteblicos territoriales o institucionales

siempre que los servicios o actividades de que sean beneficiarios se presten o se realicen en el marco del principio de colaboracioacuten entre administraciones

8- Las viacutectimas de actos terroristas asiacute como sus coacutenyuges y sus hijos por cualquier actuacioacuten en materia educativa realizada en centros oficiales de estudios en todos los niveles de ensentildeanza

9- Los miembros de los organismos consultivos de la Administracioacuten puacuteblica gallega respecto de los certificados emitidos por dichos organismos

COacuteDIGO TASAS

DESCRIPCIOacuteN IMPORTE euro

314400 Prestacioacuten de servicios en el Instituto Tecnoloacutegico para el Control del Medio Marino de Galicia

314401 Anaacutelisis de biotoxinas marinas en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de Yasumoto 1978 4752

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en rato segundo o meacutetodo de Yasumoto 1984 5432

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS)

9520 -Anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten

seguacuten el meacutetodo de la AOAC 4752

scv 4 de 7

-Anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo da AOAC 4752

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1978 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10186

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1984 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10865

-Anaacutelisis combinada en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS) anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo AOAC y anaacutelisis de toxicidad de tipo ASP por cromatografiacutea liquida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo de la AOAC 15000

314402 Anaacutelisis de muestras en agua de mar -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton marino mediante

microscopiacutea oacuteptica 15133 -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton toacutexico marino

mediante microscopiacutea oacuteptica 13333 - Anaacutelisis de carbono orgaacutenico disuelto 5093 -Anaacutelisis de nutrientes inorgaacutenicos disueltos 3500 -Anaacutelisis de pigmentos fotosinteacuteticos (clorofila ldquoardquo) por

espectrofluorimetria 1698 314403 Anaacutelisis microbioloacutegicos en moluscos y otros organismos

procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Cuantificacioacuten de E Coli 10186 - Deteccioacuten de Salmonella spp 16975 -Enumeracioacuten de Escherichia coli en moluscos bivalvos

vivos por la teacutecnica de medida directa de impedancia con el sistema BacTrac 4300 6800

314404 Anaacutelisis de contaminantes de origen quiacutemica en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Determinacioacuten de metales pesados (Pb Cd Cu Zn As Hg Ni Cr Ag) mediante espectrofotometriacutea de absorcioacuten atoacutemica por metal

6790

-Determinacioacuten de compuestos bifenilos policlorados (PCB) mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

scv 5 de 7

-Determinacioacuten de pesticidas organoclorados mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

-Determinacioacuten de hidrocarburos aromaacuteticos policiacuteclicos (HAPs) mediante cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de fluorescencia

28200

314405 Anaacutelisis histopatoloacutegica de moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Estudio hispatoloacutegico Determinacioacuten de Bonamia Marteillia Perkinsus y otras alteraciones patoloacutegicas

101852

314406 Emisioacuten de certificaciones e informes teacutecnicos y otras actuaciones a peticioacuten del interesado

Emisioacuten de certificados a peticioacuten de los interesados sobre las actuaciones llevadas a cabo por el Instituto

1000

Emisioacuten de informes teacutecnicos a peticioacuten del interesado (euros por hora o fraccioacuten)

4000

scv 6 de 7

scv 7 de 7

ANEXO 3

Resultados de anaacutelisis en muestras de microalgas anteriormente enviadas procedentes de Magallanes por el equipo de espectrometriacutea de masas utilizado por INTECMAR Trabajo presentado a las XXXII

Congreso de Ciencias del Mar realizado en Punta Arenas 22-25 octubre de 2012

PERFIL DE TOXINAS DE PROROCENTRUM LIMA (DINOPHYCEAE) AISLADO DESDE LA COSTA DE MAGALLANES SUR DE CHILE P Salgado1 G Pizarro1 JM Franco2 P Rioboacute2 e I Bravo3

1Instituto de Fomento Pesquero (IFOP) Punta Arenas Chile gemitapizarroifopcl 2Instituto de Investigaciones Marinas (CSIC) Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea 3Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea

Prorocentrum lima (Ehrenberg) es un dinoflagelado marino bentoacutenico que se encuentra adherido generalmente

sobre macroalgas sedimentos y detrito flotante y menos comuacutenmente en el plancton (Bravo et al 2001) Es una especie neriacutetica y estuarina y su rango de distribucioacuten geograacutefica variacutea desde aguas costeras tropicales a templadas (Faust 1991) La importancia de P lima se debe a que son productoras de toxinas diarreogeacutenicas en las personas (veneno diarreico de los mariscos VDM) al igual que algunas especies de Dinophysis aunque raramente se le han asociado con episodios toacutexicos por VDM por su caraacutecter epiacutefito y bentoacutenico El complejo VDM producido por P lima incluye moleacuteculas conocidas como el aacutecido okadaico (AO) y derivados dinofisistoxinas (DTX-1 DTX-2) (Bravo et al 2001 Vale et al 2009) No obstante existen casos citados para USA donde se detectoacute toxicidad por VDM en bivalvos de cultivos asociadas a P lima aunque en bajos niveles (Maranda et al 2007a) En Canadaacute tambieacuten se llevoacute a cabo un estudio en moluscos de cultivo cuya finalidad fue determinar el origen del VDM en la que P lima fue la principal especie sospechosa tras la ocurrencia de un evento toacutexico humano por VDM ocurrido en 1998 (Levasseur et al 2003) y en antildeos anteriores (Quilliam et al 1993) Aunque Levasseur et al (2003) no logroacute probar la toxicidad de los mariscos en cultivo a causa de P lima cabe hacer notar que lo que buscaron fue OA y DTX1 no DTX 3 este uacuteltimo principal derivado de las anteriores tras su transformacioacuten en los moluscos (eg Suzuki et al 1999 Vale amp Sampayo 2002)

En consecuencia el rol de P lima en eventos toacutexicos por VDM auacuten no puede descartarse por cuanto podriacutean llegar a ser importantes en ambientes turbulentos debido a la eventual remocioacuten de microalgas adheridas en sustratos por efecto de vientos (Levasseur et al 2003) factor de importancia si se trata de sedimentos o contrariamente en zonas someras y estables de cultivos de moluscos que al mismo tiempo favorecen microambientes para sustratos en los que prolifera la epiacutefita P lima (Lawrence et al 2000) quedando expuestas a re-suspensiones temporales que favorecen la filtracioacuten de estas microalgas por los bivalvos en cultivo (Maranda et al 2007a)

Chile posee escaso conocimiento sobre esta especie en su medio natural incluido su perfil de toxinas y potencial rol en la toxificacioacuten de moluscos por VDM Por tal razoacuten resultoacute interesante aportar al conocimiento de estos aspectos en muestras de sedimentos recolectadas en el estrecho de Magallanes en las que esta especie se encontroacute inhabitualmente abundante

Las ceacutelulas utilizadas en este estudio fueron aisladas desde sedimentos superficiales (0-3 cm) recolectados en el invierno de 2010 en la localidad de cabo San Isidro durante el muestreo regular del programa de monitoreo de marea roja en la regioacuten de Magallanes En esa oportunidad se logroacute cuantificar hasta 1002 quistes tecadoscm3 de Prorocentrum lima la mayor concentracioacuten respecto a otros sitios de recolecta (Fig 1) Los sedimentos de esta localidad presentaron una coloracioacuten oscura y un fuerte olor a sulfuro de hidroacutegeno (H2S) producto de anoxia local

Se aislaron entre 27 y 87 quistes tecados (Fig 1 a) directamente desde los sedimentos mientras otras 60 ceacutelulas vegetativas (Fig 1 b) fueron aisladas luego de promover la actividad y divisioacuten de los quistes en condiciones de 15 ordmC y un ciclo de luzoscuridad de 1212 horas (Tabla 1) Para este fin se aislaron quistes tecados y trasvasijaron a placas Petri de 5 cm de diaacutemetro conteniendo 5 mL de medio de cultivo L1 Para el anaacutelisis de toxinas las ceacutelulas aisladas fueron trasvasijadas a un tubo Eppendorf de 15 mL y congelados a -80 ordmC Una aliacutecuota de sedimento huacutemedo (100 microL aproximados) tambieacuten fue vaciada en un tubo Eppendorf y congelado Para extraer la toxina se antildeadioacute 500 microL de metanol 100 a cada tubo se mezcloacute por 1 min y filtroacute por 045 microm trasvasijando a un vial El extracto fue secado bajo nitroacutegeno gas a 40 ordmC y conservado a 4 ordmC hasta su anaacutelisis Previo al anaacutelisis de toxinas los extractos fueron resuspendidos en 150 microl de metanol

La presencia de la toxina dinofisistoxina 1 (DTX-1) en las muestras (Fig2) fue confirmada en modo negativo a traveacutes de su ioacuten precursor [M-H]- mz 8175 y sus iones productos mz 5634 y 2552 mediante un cromatoacutegrafo UPLC Acquity Waters acoplado a un triple cuadrupolo Waters Xevo TQ (LC-MS) La columna utilizada fue una Acquity UPLC BEH C18 17microm 21 x 100 mm a 45 ordmC La fase moacutevil consistioacute en (A) hidroacutexido amoacutenico a pH 11 y (B) hidroacutexido amoacutenico en acetonitrilo (67 mM) con una tasa de flujo de 4 mLmin El gradiente de elucioacuten utilizado fue el siguiente mantencioacuten al 75 de A entre 0 y 066 min cambio a 5 de A entre 066 y 330 min mantener 5

de A entre 330 y 528 min recuperacioacuten del 75 de A entre 528 y 726 min mantencioacuten al 75 de A hasta 9 min Se pinchoacute 5microL de muestra en el LC-MS El contenido de DTX-1 en las muestras fue cuantificado en base al ion precursor

Los tres tipos de muestras fueron positivas a la presencia de DTX-1 pero las ceacutelulas vegetativas fueron las que presentaron un mayor contenido de DTX-1 por ceacutelula La deteccioacuten de DTX-1 en los sedimentos (Tabla 2) reflejoacute la presencia de los quistes tecados en eacutestos

Figura 1 Concentraciones de quistes tecados de Prorocentrum lima (quistescm3 de sedimento huacutemedo) en estaciones de muestreo en el Estrecho de Magallanes (M26 Estero Wickham M29N1 Isla Engenfield M31 Bahiacutea Nash M35 Cabo San Isidro M39C1 Bahiacutea Gente Grande M39C2 Bahiacutea Inuacutetil M39C3 Canal Gabriel) y Canal Beagle (M41 Ventisquero Espantildea M42 Ventisquero Holanda) (a) Quistes tecados (b) ceacutelulas vegetativas obtenidas de germinacioacuten de quistes tecados bajo condiciones de laboratorio Barra de escala 20 microm

Tabla 1 Sedimento y ceacutelulas de Prorocentrum lima aisladas para anaacutelisis de toxinas

Extracto metanoacutelico Nordm de ceacutelulas TR ngmL pg DTX-1 ceacutel

G1 quistes tecados 27 213 lt2 -

G2 quistes tecados 67 214 05 11

G3 quistes tecados 87 215 12 21

G4 ceacutelulas vegetativas 60 215 34 87

G6 sedimentos aliacutecuota 213 13 19 pg microL sed

TR tiempo de retencioacuten

Figura 2 Cromatogramas de extractos metanoacutelicos de Prorocentrum lima quistes tecados (a) ceacutelulas vegetativas (b) y sedimentos (c)

Tabla 2 Caracteriacutesticas del sedimento con quistes tecados de Prorocentrum lima

Tipo Tamantildeo (mm)

Grava 2 35

Arena media 025 - 05 32

Arena muy fina 0063 - 0125 2

Limo-arcilla lt 0063 1

Estos resultados constituyen otra eventual posibilidad de toxicidad en los moluscos por VDM no soacutelo de aquellos con modalidad de vida bentoacutenica superficial sino de aquellos que tambieacuten viven enterrados en la arena (eg almeja huepo) Maacutes auacuten si se conoce que P lima posee la capacidad de desarrollar poblaciones naturales en aguas templadas en nuacutemeros que podriacutean justificar una toxicidad por VDM en los mariscos (eg Maranda et al 2007a b)

Referencias

Bravo I ML Fernaacutendez I Ramilo amp A Martinez 2001 Toxin composition of the toxic dinofagellate Prorocentrum lima isolated from different locations along the Galician coast (NW Spain) Toxicon 39 1537ndash1545

Faust MA 1991 Morphology of ciguatera-causing Prorocentrum lima (Pyrrophyta) from widely differing sites J Phycol 27 642-648

Lawrence J E Grant J Quilliam M A Bauder A G amp Cembella A D 2000 Colonizaition and growth of the toxic dinoflagellate Prorocentrum lima and associated fouling macroalgae on mussels in suspended culture Mar Ecol Prog Ser 201 147-154

Levasseur M Couture J Y Weise A M Michaud S Elbrachter M Sauveacute G amp Bonneau E 2003 Pelagic and epiphytic summer distributions of Prorocentrum lima and P mexicanum at two mussel farms in the Gulf of St Lawrence Aquat Microbiol Ecol 30283-293

Maranda L Corwin S Dover S amp Morton S L 2007a Prorocentrum lima (Dinophyceae) in northeastern USA coastal waters II Toxin load in the epibiota and in shellfish Harmful Algae 6 632-641

Maranda L Corwin S Hargraves P E 2007b Prorocentrum lima (Dinophyceae) in 19 northeastern USA coastal waters I Abundance and distribution Harmful Algae 6 623ndash631

Quilliam MA Gilgan MW amp Pleasance S 1993 Confirmation of an incident of diarrhetic shellfish poisoning in eastern Canada In Smayda TJ Shimizu Y (Eds) Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea Elsevier New York pp 547ndash552

Suzuki T Ota H amp Yamasaki M 1999 Direct evidence of transformation of dinophysistoxin-1 to 7-O-acyl-dinophysistoxin-1 (Dinophysis-3) in the scallop Patinopecten yessoensis Toxicon 37 187-198

Vale P amp Sampayo M A 2002 First confirmation of human diarrhoeic poisonings by okadaic acid esters after ingestion of razor clams (Solen marginatus) and green crabs (Carcinus maenas) in Aveiro lagoon Portugal and detection of okadaic acid esters in phytoplankton Toxicon 40989-996

Vale P Veloso V amp Amorim A 2009 Toxin composition of a Prorocentrum lima strain isolated from the Portuguese coast Toxicon 54145ndash152

Agradecimientos Intecmar de la Xunta de Galicia Espantildea donde se realizaron los anaacutelisis de toxinas proyecto

SUBPESCA ldquoManejo y Monitoreo de Mareas Rojas en las regiones de Los Lagos Ayseacuten y Magallanes IV etapa 2010rdquo

ANEXO 4

Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten

ANEXO 5

Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de Magallanes

TASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

O

EJE

MP

LA

R P

AR

A E

L IN

TE

RE

SA

DO

LIQ

UID

AC

IOacuteN

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

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TID

AD

BA

NC

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IATASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

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Firma del declarante o representante legal

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Sello Fecha Nuacutemero

SU

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OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

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NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

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DIG

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COacute

DIG

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9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

0 9

4 0

2 4INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS3 1 4 4 0 1

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BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

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NTASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

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Firma del declarante o representante legal

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Sello Fecha Nuacutemero

SU

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BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

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NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

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MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

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3 1 4 4 0 1

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

9520 euros

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CONSELLERIA DE FACENDA

ANEXO 6

Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para cierre

de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

Seccioacuten Ediciones y Produccioacuten Almte Manuel Blanco Encalada 839

Fono 56-32-2151500 Valparaiacuteso Chile

wwwifopcl

Page 14: “Análisis de toxinas lipofílicas mediante LC-MS/MS en ...metadatos.mma.gob.cl/sinia/Informe_final_Analisis_toxinas_lipofilicas_656-055.pdfSUBSECRETARÍA DE ECONOMÍA: INFORME FINAL:

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo

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de jeringa de 045 microm para su posterior hidroacutelisis (seccioacuten siguiente) Otra aliacutecuota del mismo extracto filtrada a traveacutes de filtro de jeringa compatible con el disolvente de 022 microm se diluyoacute a la mitad con MeOH 100 y se inyectoacute 5 microl en el sistema LC-MSMS Hidroacutelisis y cuantificacioacuten del contenido total de AO DTX1 y DTX2 Para detectar y cuantificar el contenido total de AO DTX1 y DTX2 se requiere una hidroacutelisis baacutesica previa a la inyeccioacuten de los extractos en el sistema de LC-MSMS Procedimiento En un vial que contiene 1 ml de extracto metanoacutelico previamente filtrado por filtros de jeringa de 045 microm se antildeaden 125 microl de NaOH 25 M se agita manualmente 10 segundos y la mezcla fue sometida a 76 plusmn 4 ordmC durante 40 minutos en un bantildeo Se enfrioacute a temperatura ambiente se pesoacute y luego neutralizoacute con 125 microl de HCl 25 M Finalmente se homogenizoacute nuevamente con el vortex durante 30 segundos Una aliacutecuota del extracto resultante se filtroacute con filtros de jeringa de 022 microm y diluyoacute 58 con MeOH 100 Una aliacutecuota de 5 microl fue inyectada en el sistema de LC-MSMS Durante el proceso de hidroacutelisis el vial debe estar bien cerrado para evitar peacuterdidas por evaporacioacuten (la temperatura de ebullicioacuten del MeOH es 65 ordmC) Las peacuterdidas se pueden detectar mediante pesada del vial antes y despueacutes de la hidroacutelisis en caso de confirmarse se completaraacute el peso con metanol La deteccioacuten con el espectroacutemetro de masas se realizoacute usando dos transiciones por toxina la de mayor intensidad se utilizoacute para cuantificar y la de menor intensidad para confirmar (Tabla 3) Identificacioacuten y Confirmacioacuten La identificacioacuten de la presencia de toxinas se realizaraacute por comparacioacuten del tiempo de retencioacuten de cada una de las toxinas en la muestra con el tiempo de retencioacuten obtenido en las disoluciones de calibrado estaacutendar inyectadas en un mismo diacutea de anaacutelisis Se permite una desviacioacuten maacutexima entre ambos tiempos del 25 Para las toxinas que se cuantifican con la recta de calibrado del anaacutelogo correspondiente se establece un TRR con una tolerancia seguacuten se indica en la Tabla 4 Para una correcta identificacioacuten se exige una separacioacuten entre picos calculada mediante aplicacioacuten de la expresioacuten

2 x (RT2-RT1) RS = ----------------------

(W1+W2)

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En donde RT1 y RT2 y W1 y W2 son respectivamente los tiempos de retencioacuten y las anchuras en la liacutenea base de dos picos adyacentes RT2gtRT1 La resolucioacuten seraacute aceptable cuando Rs gt10 y la resolucioacuten a liacutenea base se consideraraacute completa cuando Rs gt15 La confirmacioacuten de la presencia de toxina seguacuten el criterio de la Decisioacuten de la Comisioacuten 2002657EC se basa en la relacioacuten entre las dos transiciones empleadas para la determinacioacuten (cuantificacioacuten y confirmacioacuten)

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4 RESULTADOS

41 Toxinas en moluscos

Las toxinas detectadas en moluscos fueron PTX2 YTX 45OHYTX DTX1 y SPX1 (Tabla 5) La mayor concentracioacuten la presentoacute el grupo de las YTXs (40-294 microg kg-1) en muestras de choritos provenientes del sector de Seno Otway (Fig 1) En este mismo sector las PTXs tambieacuten presentaron las mayores concentraciones (3-45 microg kg-1) en estos transvectores En el caso del ostioacuten tanto el PTX2 como las YTXs fueron detectadas en el contenido gaacutestrico El DTX1 fue detectado en choritos (1-18 microg kg-1 considerando DTX1 libre y total) procedentes del sector Seno Otway y sectores adyacentes a Punta Arenas El AO no fue detectado en ninguna aacuterea de la Regioacuten Los SPXs fueron principalmente detectados en choritos de las aacutereas centro y sur de Magallanes y en una estacioacuten del estero Peel (M13) en el aacuterea norte de la regioacuten No obstante que los niveles son muy bajos (01- 25 microg kg-1) incluso del nivel letal 50 en ratones inyectados intraperitonealmente 40 microg kg-1 (Richard et al 2000) los valores encontrados son iguales o mayor al encontrado en el caracol piquilhue recolectado en julio de 2012 y que en ese entonces produjo la muerte de ratones provocando el cierre de aacutereas de extraccioacuten por la autoridad de salud regional (Anexo 6) De las cinco toxinas detectadas en los moluscos solo DTX1 mostroacute estar localizada en el aacuterea centro de Magallanes mientras que las restantes fueron detectadas en las tres aacutereas de monitoreo Norte centro y sur de Magallanes No se encontraron PTX1 DTX2 ni AZPs en las muestras de moluscos Los resultados muestran que de los cuatro grupos de toxinas PTX YTXs DTXs y SPXs tres de ellas pueden estar presentes simultaacuteneamente en los moluscos vale decir PTXs YTXs y DTX1 o bien SPXs en vez de DTX1 42 Toxinas en microalgas

En las microalgas se detectaron PTXs y YTXs (Tabla 6) Las PTXs fueron detectadas aunque a nivel de trazas en ceacutelulas de D acuminata seleccionadas por micromanipulacioacuten desde muestras de agua procedentes de estero Silva Palma (M25) estero Wickham (M26) y Cutter Cove (M29) (Fig1) Tambieacuten fue detectada en filtrados de agua (fitoplancton) de Pto Fontaine (M21) e I Engelfield (M29N1) Las YTXs fueron detectadas en ceacutelulas de P reticulatum seleccionadas por micromanipulacioacuten y en cultivos de esta microalga que se logroacute establecer a partir de muestras de agua provenientes de C Adalberto (M04) Cutter Cove (M29) e I Engelfield (M29N1) Solo en los cultivos se detectoacute

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homoYTX y en uno de ellos tambieacuten se detectoacute aunque miacutenimamente 45OHYTX un derivado de la YTX que normalmente se encuentra en los moluscos como producto de bio-transformacioacuten La presencia de 45OHYTX en el cultivo pudo deberse a la presencia de ceacutelulas ya en fase de declinacioacuten de la curva de crecimiento

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5 ANAacuteLISIS Y DISCUSIOacuteN DE LOS DATOS

51 Toxinas en moluscos De las toxinas lipofiacutelicas se sabe que AO DTXs y AZAs causan trastornos gastrointestinales en los seres humanos (Gerssen et al 2010) Para las toxinas restantes (YTXs PTXs y SPXs) auacuten cuando no se han reportado casos de intoxicacioacuten en los seres humanos eacutestas son letales o altamente toacutexicas cuando los ratones son inyectados por viacutea intraperitoneal (Paz et al 2008 Richard et al 2000 Miles et al 2004) Es el caso de los SPXs la toxicidad en ratones inyectados por viacutea intraperitoneal supera a la del resto de las toxinas pues su dosis letal 50 es de 40 microg kg-1 (Richard et al 2000) Tal es asiacute que como referencia (Tabla 5) el transvector caracol piquilhue recolectadas en Julio de 2012 y cuyos niveles de toxicidad provocaron la muerte de los ratones solo presentoacute 01 microg kg-1 deteccioacuten que fue realizada durante este estudio en muestras de carne almacenadas durante no maacutes de 1 antildeo a -20 ordmC Sin embargo no se puede descartar una peacuterdida de la actividad por transformacioacuten durante el periodo de conservacioacuten A excepcioacuten de los SPXs el resto de las toxinas mencionadas estaacuten reguladas por la legislacioacuten europea tanto para consumo interno como importacioacuten de moluscos y tunicados para garantizar la salud de las personas Asiacute tambieacuten estaacuten reguladas por la legislacioacuten chilena a traveacutes del Instituto de Salud Puacuteblica (ISP) estableciendo los mismos niveles de referencia europeo en base al bioensayo ratoacuten Aun cuando los niveles de toxinas detectadas en los moluscos durante este estudio estaacuten por debajo de lo exigido por las regulaciones e incluso de los niveles propuestos por el EFSA (Tabla 7) la presencia de dos y tres tipos de toxinas en los moluscos representa una complejidad en la determinacioacuten de los niveles de toxicidad especialmente si se encuentran presentes toxinas altamente toacutexicas para ratones inyectados intraperitonealmente como son los SPXs Aunque se sospechaba la concurrencia de diferentes tipos de toxinas tal hecho no habiacutea sido confirmado anteriormente Sin embargo los SPXs siguen siendo una incoacutegnita pues se desconoce la fuente de estas toxinas A ostenfeldii la especie que podriacutea ser candidata a confirmar estuvo ausente (Tabla 8 modificado de Guzmaacuten et al 2014) durante el periodo en que se detectoacute en los moluscos Los escasos antecedentes toxigeacutenicos de esta especie en Chile la han confirmado como productora de toxinas paralizantes en Ayseacuten (Pizarro et al 2012) pero no de SPXs No obstante la produccioacuten de SPXs por esta especie en la regioacuten de Magallanes auacuten no se puede descartar Las YTXs fueron las toxinas maacutes abundantes en los moluscos analizados condicioacuten que se corresponde con la alta abundancia relativa de esta especie en el ambiente (Tabla 8) en la mayoriacutea de los casos (Tabla 5)

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Los resultados sugieren que los falsos positivos por bioensayo ratoacuten pudieran ser maacutes frecuentes de lo que se piensa actualmente para la regioacuten de Magallanes 52 Toxinas en microalgas Los resultados indican que P reticulatum encontrado en Magallanes producen YTXs al igual que las especies reportadas en la regioacuten de Antofagasta y Ayseacuten (Aacutelvarez et al 2011 Pizarro et al 2012) Tal resultado hace altamente probable que esta especie es la fuente de YTXs detectadas en los moluscos durante el periodo de estudio De acuerdo a las toxinas detectadas en las muestras de D acuminata aisladas asiacute como en el fitoplancton con gran abundancia de esta especie (Tabla 8) sugiere que esta microalga podriacutea ser una fuente primaria de PTXs tal como ocurre en el norte y sur del paiacutes (Blanco et al 2007 Fux et al 2011) Aunque la especie tambieacuten ha sido asociada a la presencia de DTX1 en moluscos en un evento toacutexico ocurrido en 1998 en Magallanes (Uribe et al 2001) el DTX1 no fue detectado en las muestras de D acuminata durante este estudio El no hallazgo de DTX1 en estas muestras pudo deberse a una fuente microalgal distinta como D acuta yo P lima D acuta ha sido asociada a DTX1 en moluscos de la regioacuten de Ayseacuten (Lembeye et al 1993 y Zhao et al 1993) mientras que P lima es productora solo de DTX1 en la regioacuten de Magallanes (Salgado et al 2012) Sin embargo cuando se detectoacute DTX1 en las muestras de moluscos durante este estudio D acuta estuvo ausente en las muestras de agua mientras que D acuminata presentoacute una abundancia relativa alta Por otro lado el volumen de resuspensioacuten de los extractos pudo ser elevado al seguir el mismo procedimiento protocolar que se aplica a las muestras de moluscos de acuerdo a la normativa europea actual Por tal razoacuten el LC-MSMS no logroacute detectar PTXs ni DTX1 en las muestras de microalgas En estos casos un protocolo para el anaacutelisis de las microalgas debiera incluir un volumen menor de resuspensioacuten de los extractos secos en referencia al utilizado para los moluscos o bien seleccionar por micromanipulacioacuten un nuacutemero mayor de microalgas (gt 130 ceacutelulas) Sin embargo esto uacuteltimo es maacutes difiacutecil de lograr en latitudes australes debido a la baja densidad de ceacutelulas en las que se presenta normalmente esta especie en condiciones naturales Por tal motivo se recomienda realizar pruebas con un volumen de resuspensioacuten menor a 1 mL aun cuando se trate de un LC-MSMS triple cuadrupolo

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6 CONCLUSIONES

a Los moluscos de la regioacuten de Magallanes pueden presentar PTX2 YTX 45OHYTX DTX1 y SPX1

b El hecho que los moluscos puedan presentar dos o maacutes tipos de toxinas lipofiacutelicas dificulta establecer el nivel de toxicidad total

c P reticulatum en Magallanes produce YTXs al igual que la especie del norte y sur del paiacutes

d La abundancia relativa ambiental de P reticulatum durante el periodo de estudio coincidioacute con la presencia de YTXs en los moluscos

e Los SPXs encontrados anteriormente en caracoles piquilhue tambieacuten fue posible detectarlos en choritos durante este estudio

f Auacuten queda por confirmar el tipo de SPXs presentes y su eventual fuente primaria La presencia de SPXs en los moluscos no siempre coincidioacute con la presencia de A ostenfeldii en el ambiente y su abundancia relativa maacutexima fue solo de nivel 1 (raro) durante el periodo de estudio

g La PTX2 detectada en los moluscos coincidioacute con una alta abundancia relativa ambiental de D acuminata No obstante auacuten queda por confirmar si esta especie es la fuente primaria Para ello se hace necesario ajustar (disminuir) el volumen de dilucioacuten de los extractos secos de microalgas aisladas por micromanipulacioacuten aun cuando se trata de un espectroacutemetro de masas como un triple cuadrupolo

h La deteccioacuten de DTX1 en los moluscos coincidioacute con la ausencia de D acuta en el ambiente La toxina tampoco fue detectada en los moluscos cuando esta microalga estuvo a niveles de 2 y 3 (escaso y regular) Queda por confirmar la produccioacuten de DTX1 por esta especie en Magallanes

i No se encontraron PTX1 DTX2 ni AZPs en las muestras de moluscos durante el periodo de estudio

j Los resultados demuestran la presencia de toxinas en los moluscos que se hace necesario identificar y cuantificar utilizando teacutecnicas distintas al bioensayo

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14

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F I G U R A

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Figura 1 Estaciones y sectores muestreados (ciacuterculo rojo) y sector Fortuna donde fue recolectado el

caracol piquilhue (ciacuterculo amarillo)

T A B L A S

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Tabla 1 Condiciones cromatograacuteficas para el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas usando

una columna de UPLC C18 en fase reversa y medio baacutesico

Columna Acquity UPLC BEH C18 17 microm 21x100 mm

Temperatura columna 45 ordmC

Flujo 04 mlmin

Volumen inyeccioacuten 5 microl

Temperatura muestras 10 plusmn 5 ordmC

Gradiente

Tiempo (min) Fase A () Fase B ()

0 75 25

066 75 25

330 5 95

528 5 95

726 75 25

900 75 25

Tabla 2 Paraacutemetros de la fuente de ionizacioacuten para el Xevo TQMS (Waters) en la determinacioacuten de toxinas lipofiacutelicas

PARAacuteMETROS DE LA FUENTE

ESI- ESI+

AO DTX2 DTX1 YTX homoYTX 45OH YTX y 45OH

homoYTX

AZA1 AZA2 AZA3 PTX2 PTX1 y SPX1

Voltaje de capilar (V) 100 200

Temperatura de solvatacioacuten (ordmC) 450 450

Flujo gas de solvatacioacuten (lh) 850 850

Flujo gas cono (lh) 50 50

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Tabla 3

Resumen de las condiciones de espectrometriacutea de masas empleadas con el Xevo TQMS (Waters) en el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas

Compuesto tR (min)

ESI

Ioacuten Precursor

(mz)

Ioacuten Producto

(mz)

Dwell time (s)

Energiacutea colisioacuten

(eV)

Voltaje cono (V)

AO 189 NEG 8035 2552 0010 46 86

113 0010 56 86

DTX2 210 NEG 8035 2552 0010 46 86

113 0010 56 86

DTX1 214 NEG 8175 5634 0010 43 86

2552 0010 48 86

YTX 202 NEG 5704 4674 0010 30 45

3963 0010 35 45

45OH-YTX 182 NEG 5784 4674 0010 30 45

3964 0010 30 45

HomoYTX 203 NEG 5775 4744 0010 30 48

4034 0010 30 48

45OH-homoYTX 182 NEG 5855 4034 0010 30 45

4744 0010 30 45

PTX1 306 POS 8925 8395 0015 25 36

8215 0015 25 36

PTX2 362 POS 8765 8415 0015 20 36

8235 0015 25 36

AZA1 263 POS 8425 6545 0015 55 50

3622 0015 50 50

AZA2 270 POS 8565 6725 0015 45 27

6545 0015 45 27

AZA3 236 POS 8285 6404 0015 55 47

3622 0015 55 47

SPX1 368 POS 6925 6744 0015 27 60

1643 0015 42 60 Transicioacuten cuantificadora

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Tabla 4 TRR y valores de tolerancia para las toxinas analizadas

TOXINA TRR TOLERANCIA

Toxinas del grupo de AO

AO 1000 0990-1010

DTX2 1040 1014-1066

DTX1 1140 1111-1168

Toxinas del grupo de PTX

PTX2 1000 0990-1010

PTX1 0850 0829-0871

Toxinas del grupo de YTX

YTX 1000 0990-1010

45OH-YTX 0894 0871-0916

Homo YTX 1000 0990-1010

45OH-homoYTX 0899 0876-0921

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Tabla 5 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de moluscos

Nordm estMes

recolectaLocalidad Molusco

cuerpo

enterohepat

gramos

carne

toxicidad

VDM ratoacuten

PTX2

(ugKg)

YTX

(ugKg)

45OHYTX

(ugKg)

DTX1

libre

(ugKg)

DTX1

total

(ugkg)

SPX 1

(ugKg)

M13 ene-13 E Peel chorito x 5086 + 01 02

M13 ene-13 E Peel ostioacuten x 5155 No real izado 16 21

M33 ene-13 B Bell chorito x 5253 + 04

M37 ene-13 B Agua Fresca chorito x 5039 + 05 01

M35 ene-13 C San Isidro chorito x 5289 + 000 01

M42 ene-13 V Holanda chorito x 5231 + 06 13

M43 ene-13 B Yendegaia chorito x 5193 + 04 25

M45 ene-13 Pto Williams chorito x 5161 - 28 07

M08 feb-13 E Falcon cholga x 5027 - 14

M09 feb-13 E Penguumlin cholga x 5103 + 14

M22 feb-13 E de las Montantildeas cholga x 5052 - 26

M23 feb-13 I Ballesteros cholga x 5204 - 87

M24 feb-13 B Fanny chorito x 2016 - 38 1071 479 12

M25 feb-13 E Silva Palma chorito x 1447 - 59 1077 898 09

M26 feb-13 E Wickham chorito x 1093 - 194 2940 2232 66 66

M27 feb-13 E Sullivan chorito x 1137 - 450 1944 1478

M28 feb-13 E Nuntildeez chorito x 1179 + 33 721 407

M29 feb-13 Cutter Cove chorito x 1003 - 65 501 309

M29N1 feb-13 I Engelfield chorito x 1116 - 297 2007 1483

M31 feb-13 B Nash chorito x 2231 +

M33 feb-13 B Bell chorito x 1181 - 93

M34 feb-13 S Pedro chorito x 0726 -

M35 feb-13 C San Isidro chorito x 1178 + 110

M36 feb-13 B Buena chorito x 1367 +

M37 feb-13 B Agua Fresca chorito x 0850 + 45 100 80

M39 feb-13 Pto Zenteno chorito x 3241 + 28

M39N2 feb-13 Pta San Valentin chorito x 1712 - 11

M39N3 feb-13 Pto Yartou chorito x 2035 - 11

sector

Fortunajul-12 B Inuacutetil

caracol

piquilhuex 107000 + 01

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Tabla 6 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de microalgas

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Tabla 7 Niveles actualmente permitidos por la legislacioacuten europea (bioensayo) y los niveles propuestos por la

autoridad europea para la seguridad alimentaria (EFSA) (Gerssen et al 2010)

Toxin Legislacioacuten (μg kg-

1) Proposicioacuten

EFSA (μg kg-1)

Validacioacuten LC-MSMS

(μg kg-1)

OA and DTXs 160 45

PTXs 120

YTXs 1000 3750

AZAs 160 32

SPXs 400 (Gerssen et al2010)

European Food Safety Authority Decisioacuten 2002657 de la Unioacuten Europea EC Incluye PTXs

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Tabla 8 Abundancia relativa ambiental de las microalgas al momento de recolectar las muestras de moluscos En rojo se indica la deteccioacuten de toxina positiva en los moluscos asociada a la supuesta microalga fuente PTXs (D

acuminata) YTXs (P reticulatum) SPXs (A ostenfeldii) DTX1 (A acuta)

(Tabla modificada de Guzmaacuten et al 2014)

A N E X O S

ANEXO 1

Certificacioacuten laboratorio INTECMAR

ANEXO 2

Lista de anaacutelisis que realiza INTECMAR y sus costos (en euros) 2013

scv 1 de 7

GUIA PARA LA AUTOLIQUIDACIOacuteN DE TASAS A FAVOR DE LA COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA 2013 Los aspectos financieros de los servicios prestados por Intecmar en el marco de su actividad e vienen regulados en la Ley 62003 de 9 de diciembre de tasas precios y exenciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia (DOG nuacutem 240 de 11122003) y fueron actualizados posteriormente en la Ley 142010 de 27 de diciembre de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2011 (DOG nuacutem 250 de 30122010) y en la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013 (DOG nuacutem 42 de 28022013) Existen dos maneras de liquidar las tasas correspondientes a los servicios prestados por Intecmar

1 De forma manual cubriendo el modelo A de autoliquidacioacuten que se descarga en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda y que adjunto en pdf y se lleva al banco para su pago httpwwwconselleriadefacendaeswebportalconfeccion-impresos

2 De forma telemaacutetica en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda viacutenculo httpshostcixtecesXEITObinlionwebXeitodllxmit a traveacutes del modelo 730

Ambos modelos de liquidacioacuten de tasas adjuntamos ejemplo al final de este documento deben ser remitidos por mail a Intecmar con el sello del banco fiacutesico o virtual como paso previo a la emisioacuten del certificado Los coacutedigos generales necesarios son

minus Consejeriacutea de Medio Rural y de Mar Coacutedigo 09 minus Delegacioacuten de Pontevedra Coacutedigo 40 minus Servicio de Intecmar Coacutedigo 24

Los coacutedigos y descripcioacuten de las tasas son los regulados en la legislacioacuten vigente y los hemos resumido en los anexos siguientes Vilaxoaacuten 4 de marzo de 2013

scv 2 de 7

TARIFAS DE TASAS VIGENTES PARA 2013 - Ley 22013 d e 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013

(DOG nuacutem 42 de 28022013)

Estas tarifas son consecuencia de la actualizacioacuten de las tarifas contenidas en los anexos 1 2 3 4 y 5 de la Ley 62003 del 9 de diciembre de tasas precios y exacciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia por la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 Seraacuten aplicables desde el diacutea de la entrada en vigor de la Ley de

presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 TASA POR SERVICIOS ADMINISTRATIVOS

No sujecioacuten No se exigiraacute la tasa por servicios administrativos cuando se trate de compulsas o cotejos de documentos que deban acompantildear a solicitudes escritos o comunicaciones presentadas por el ciudadano y realizadas en el aacutembito de actuacioacuten de los registros seguacuten lo dispuesto en el artiacuteculo 385 de la Ley 301992 del 26 de noviembre de reacutegimen juriacutedico de las administraciones puacuteblicas y del procedimiento administrativo comuacuten

Excepciones Estaraacuten exentos de la presente tasa

1- La expedicioacuten de certificados de retribuciones satisfechas por la Xunta de Galicia con el objeto de justificacioacuten en relacioacuten con el impuesto sobre la renta de las personas fiacutesicas

2- La expedicioacuten de certificados y compulsa que el personal de la Administracioacuten solicite respecto a las necesidades propias del puesto de trabajo o relacioacuten de servicios

3- Los alumnos por cualquier actuacioacuten en materia de ensentildeanzas no universitarias

scv 3 de 7

4- Las compulsas realizadas en las oficinas de empleo para los desempleados en la tramitacioacuten de expedientes que sean competencia de dichas oficinas

5 La inscripcioacuten en las convocatorias para a seleccioacuten de personal de la comunidad autoacutenoma despueacutes de justificacioacuten documental solicitada por

- Personas con discapacidad igual o superior al 33 - Personas que sean miembros de familias numerosas clasificadas en la

categoriacutea especial Se aplicaraacute una bonificacioacuten del 50 a la inscripcioacuten solicitada por - Personas que sean miembros de familias numerosas de categoriacutea

general - Personas que figurasen como demandantes de empleo desde por lo

menos seis meses antes a la fecha de la convocatoria de pruebas selectivas de personal en las que soliciten su participacioacuten y no esteacuten percibiendo prestacioacuten o subsidio por desempleo

6- La expedicioacuten de certificados relativos a la situacioacuten fiscal 7- El Estado y los demaacutes entes puacuteblicos territoriales o institucionales

siempre que los servicios o actividades de que sean beneficiarios se presten o se realicen en el marco del principio de colaboracioacuten entre administraciones

8- Las viacutectimas de actos terroristas asiacute como sus coacutenyuges y sus hijos por cualquier actuacioacuten en materia educativa realizada en centros oficiales de estudios en todos los niveles de ensentildeanza

9- Los miembros de los organismos consultivos de la Administracioacuten puacuteblica gallega respecto de los certificados emitidos por dichos organismos

COacuteDIGO TASAS

DESCRIPCIOacuteN IMPORTE euro

314400 Prestacioacuten de servicios en el Instituto Tecnoloacutegico para el Control del Medio Marino de Galicia

314401 Anaacutelisis de biotoxinas marinas en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de Yasumoto 1978 4752

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en rato segundo o meacutetodo de Yasumoto 1984 5432

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS)

9520 -Anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten

seguacuten el meacutetodo de la AOAC 4752

scv 4 de 7

-Anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo da AOAC 4752

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1978 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10186

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1984 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10865

-Anaacutelisis combinada en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS) anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo AOAC y anaacutelisis de toxicidad de tipo ASP por cromatografiacutea liquida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo de la AOAC 15000

314402 Anaacutelisis de muestras en agua de mar -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton marino mediante

microscopiacutea oacuteptica 15133 -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton toacutexico marino

mediante microscopiacutea oacuteptica 13333 - Anaacutelisis de carbono orgaacutenico disuelto 5093 -Anaacutelisis de nutrientes inorgaacutenicos disueltos 3500 -Anaacutelisis de pigmentos fotosinteacuteticos (clorofila ldquoardquo) por

espectrofluorimetria 1698 314403 Anaacutelisis microbioloacutegicos en moluscos y otros organismos

procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Cuantificacioacuten de E Coli 10186 - Deteccioacuten de Salmonella spp 16975 -Enumeracioacuten de Escherichia coli en moluscos bivalvos

vivos por la teacutecnica de medida directa de impedancia con el sistema BacTrac 4300 6800

314404 Anaacutelisis de contaminantes de origen quiacutemica en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Determinacioacuten de metales pesados (Pb Cd Cu Zn As Hg Ni Cr Ag) mediante espectrofotometriacutea de absorcioacuten atoacutemica por metal

6790

-Determinacioacuten de compuestos bifenilos policlorados (PCB) mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

scv 5 de 7

-Determinacioacuten de pesticidas organoclorados mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

-Determinacioacuten de hidrocarburos aromaacuteticos policiacuteclicos (HAPs) mediante cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de fluorescencia

28200

314405 Anaacutelisis histopatoloacutegica de moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Estudio hispatoloacutegico Determinacioacuten de Bonamia Marteillia Perkinsus y otras alteraciones patoloacutegicas

101852

314406 Emisioacuten de certificaciones e informes teacutecnicos y otras actuaciones a peticioacuten del interesado

Emisioacuten de certificados a peticioacuten de los interesados sobre las actuaciones llevadas a cabo por el Instituto

1000

Emisioacuten de informes teacutecnicos a peticioacuten del interesado (euros por hora o fraccioacuten)

4000

scv 6 de 7

scv 7 de 7

ANEXO 3

Resultados de anaacutelisis en muestras de microalgas anteriormente enviadas procedentes de Magallanes por el equipo de espectrometriacutea de masas utilizado por INTECMAR Trabajo presentado a las XXXII

Congreso de Ciencias del Mar realizado en Punta Arenas 22-25 octubre de 2012

PERFIL DE TOXINAS DE PROROCENTRUM LIMA (DINOPHYCEAE) AISLADO DESDE LA COSTA DE MAGALLANES SUR DE CHILE P Salgado1 G Pizarro1 JM Franco2 P Rioboacute2 e I Bravo3

1Instituto de Fomento Pesquero (IFOP) Punta Arenas Chile gemitapizarroifopcl 2Instituto de Investigaciones Marinas (CSIC) Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea 3Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea

Prorocentrum lima (Ehrenberg) es un dinoflagelado marino bentoacutenico que se encuentra adherido generalmente

sobre macroalgas sedimentos y detrito flotante y menos comuacutenmente en el plancton (Bravo et al 2001) Es una especie neriacutetica y estuarina y su rango de distribucioacuten geograacutefica variacutea desde aguas costeras tropicales a templadas (Faust 1991) La importancia de P lima se debe a que son productoras de toxinas diarreogeacutenicas en las personas (veneno diarreico de los mariscos VDM) al igual que algunas especies de Dinophysis aunque raramente se le han asociado con episodios toacutexicos por VDM por su caraacutecter epiacutefito y bentoacutenico El complejo VDM producido por P lima incluye moleacuteculas conocidas como el aacutecido okadaico (AO) y derivados dinofisistoxinas (DTX-1 DTX-2) (Bravo et al 2001 Vale et al 2009) No obstante existen casos citados para USA donde se detectoacute toxicidad por VDM en bivalvos de cultivos asociadas a P lima aunque en bajos niveles (Maranda et al 2007a) En Canadaacute tambieacuten se llevoacute a cabo un estudio en moluscos de cultivo cuya finalidad fue determinar el origen del VDM en la que P lima fue la principal especie sospechosa tras la ocurrencia de un evento toacutexico humano por VDM ocurrido en 1998 (Levasseur et al 2003) y en antildeos anteriores (Quilliam et al 1993) Aunque Levasseur et al (2003) no logroacute probar la toxicidad de los mariscos en cultivo a causa de P lima cabe hacer notar que lo que buscaron fue OA y DTX1 no DTX 3 este uacuteltimo principal derivado de las anteriores tras su transformacioacuten en los moluscos (eg Suzuki et al 1999 Vale amp Sampayo 2002)

En consecuencia el rol de P lima en eventos toacutexicos por VDM auacuten no puede descartarse por cuanto podriacutean llegar a ser importantes en ambientes turbulentos debido a la eventual remocioacuten de microalgas adheridas en sustratos por efecto de vientos (Levasseur et al 2003) factor de importancia si se trata de sedimentos o contrariamente en zonas someras y estables de cultivos de moluscos que al mismo tiempo favorecen microambientes para sustratos en los que prolifera la epiacutefita P lima (Lawrence et al 2000) quedando expuestas a re-suspensiones temporales que favorecen la filtracioacuten de estas microalgas por los bivalvos en cultivo (Maranda et al 2007a)

Chile posee escaso conocimiento sobre esta especie en su medio natural incluido su perfil de toxinas y potencial rol en la toxificacioacuten de moluscos por VDM Por tal razoacuten resultoacute interesante aportar al conocimiento de estos aspectos en muestras de sedimentos recolectadas en el estrecho de Magallanes en las que esta especie se encontroacute inhabitualmente abundante

Las ceacutelulas utilizadas en este estudio fueron aisladas desde sedimentos superficiales (0-3 cm) recolectados en el invierno de 2010 en la localidad de cabo San Isidro durante el muestreo regular del programa de monitoreo de marea roja en la regioacuten de Magallanes En esa oportunidad se logroacute cuantificar hasta 1002 quistes tecadoscm3 de Prorocentrum lima la mayor concentracioacuten respecto a otros sitios de recolecta (Fig 1) Los sedimentos de esta localidad presentaron una coloracioacuten oscura y un fuerte olor a sulfuro de hidroacutegeno (H2S) producto de anoxia local

Se aislaron entre 27 y 87 quistes tecados (Fig 1 a) directamente desde los sedimentos mientras otras 60 ceacutelulas vegetativas (Fig 1 b) fueron aisladas luego de promover la actividad y divisioacuten de los quistes en condiciones de 15 ordmC y un ciclo de luzoscuridad de 1212 horas (Tabla 1) Para este fin se aislaron quistes tecados y trasvasijaron a placas Petri de 5 cm de diaacutemetro conteniendo 5 mL de medio de cultivo L1 Para el anaacutelisis de toxinas las ceacutelulas aisladas fueron trasvasijadas a un tubo Eppendorf de 15 mL y congelados a -80 ordmC Una aliacutecuota de sedimento huacutemedo (100 microL aproximados) tambieacuten fue vaciada en un tubo Eppendorf y congelado Para extraer la toxina se antildeadioacute 500 microL de metanol 100 a cada tubo se mezcloacute por 1 min y filtroacute por 045 microm trasvasijando a un vial El extracto fue secado bajo nitroacutegeno gas a 40 ordmC y conservado a 4 ordmC hasta su anaacutelisis Previo al anaacutelisis de toxinas los extractos fueron resuspendidos en 150 microl de metanol

La presencia de la toxina dinofisistoxina 1 (DTX-1) en las muestras (Fig2) fue confirmada en modo negativo a traveacutes de su ioacuten precursor [M-H]- mz 8175 y sus iones productos mz 5634 y 2552 mediante un cromatoacutegrafo UPLC Acquity Waters acoplado a un triple cuadrupolo Waters Xevo TQ (LC-MS) La columna utilizada fue una Acquity UPLC BEH C18 17microm 21 x 100 mm a 45 ordmC La fase moacutevil consistioacute en (A) hidroacutexido amoacutenico a pH 11 y (B) hidroacutexido amoacutenico en acetonitrilo (67 mM) con una tasa de flujo de 4 mLmin El gradiente de elucioacuten utilizado fue el siguiente mantencioacuten al 75 de A entre 0 y 066 min cambio a 5 de A entre 066 y 330 min mantener 5

de A entre 330 y 528 min recuperacioacuten del 75 de A entre 528 y 726 min mantencioacuten al 75 de A hasta 9 min Se pinchoacute 5microL de muestra en el LC-MS El contenido de DTX-1 en las muestras fue cuantificado en base al ion precursor

Los tres tipos de muestras fueron positivas a la presencia de DTX-1 pero las ceacutelulas vegetativas fueron las que presentaron un mayor contenido de DTX-1 por ceacutelula La deteccioacuten de DTX-1 en los sedimentos (Tabla 2) reflejoacute la presencia de los quistes tecados en eacutestos

Figura 1 Concentraciones de quistes tecados de Prorocentrum lima (quistescm3 de sedimento huacutemedo) en estaciones de muestreo en el Estrecho de Magallanes (M26 Estero Wickham M29N1 Isla Engenfield M31 Bahiacutea Nash M35 Cabo San Isidro M39C1 Bahiacutea Gente Grande M39C2 Bahiacutea Inuacutetil M39C3 Canal Gabriel) y Canal Beagle (M41 Ventisquero Espantildea M42 Ventisquero Holanda) (a) Quistes tecados (b) ceacutelulas vegetativas obtenidas de germinacioacuten de quistes tecados bajo condiciones de laboratorio Barra de escala 20 microm

Tabla 1 Sedimento y ceacutelulas de Prorocentrum lima aisladas para anaacutelisis de toxinas

Extracto metanoacutelico Nordm de ceacutelulas TR ngmL pg DTX-1 ceacutel

G1 quistes tecados 27 213 lt2 -

G2 quistes tecados 67 214 05 11

G3 quistes tecados 87 215 12 21

G4 ceacutelulas vegetativas 60 215 34 87

G6 sedimentos aliacutecuota 213 13 19 pg microL sed

TR tiempo de retencioacuten

Figura 2 Cromatogramas de extractos metanoacutelicos de Prorocentrum lima quistes tecados (a) ceacutelulas vegetativas (b) y sedimentos (c)

Tabla 2 Caracteriacutesticas del sedimento con quistes tecados de Prorocentrum lima

Tipo Tamantildeo (mm)

Grava 2 35

Arena media 025 - 05 32

Arena muy fina 0063 - 0125 2

Limo-arcilla lt 0063 1

Estos resultados constituyen otra eventual posibilidad de toxicidad en los moluscos por VDM no soacutelo de aquellos con modalidad de vida bentoacutenica superficial sino de aquellos que tambieacuten viven enterrados en la arena (eg almeja huepo) Maacutes auacuten si se conoce que P lima posee la capacidad de desarrollar poblaciones naturales en aguas templadas en nuacutemeros que podriacutean justificar una toxicidad por VDM en los mariscos (eg Maranda et al 2007a b)

Referencias

Bravo I ML Fernaacutendez I Ramilo amp A Martinez 2001 Toxin composition of the toxic dinofagellate Prorocentrum lima isolated from different locations along the Galician coast (NW Spain) Toxicon 39 1537ndash1545

Faust MA 1991 Morphology of ciguatera-causing Prorocentrum lima (Pyrrophyta) from widely differing sites J Phycol 27 642-648

Lawrence J E Grant J Quilliam M A Bauder A G amp Cembella A D 2000 Colonizaition and growth of the toxic dinoflagellate Prorocentrum lima and associated fouling macroalgae on mussels in suspended culture Mar Ecol Prog Ser 201 147-154

Levasseur M Couture J Y Weise A M Michaud S Elbrachter M Sauveacute G amp Bonneau E 2003 Pelagic and epiphytic summer distributions of Prorocentrum lima and P mexicanum at two mussel farms in the Gulf of St Lawrence Aquat Microbiol Ecol 30283-293

Maranda L Corwin S Dover S amp Morton S L 2007a Prorocentrum lima (Dinophyceae) in northeastern USA coastal waters II Toxin load in the epibiota and in shellfish Harmful Algae 6 632-641

Maranda L Corwin S Hargraves P E 2007b Prorocentrum lima (Dinophyceae) in 19 northeastern USA coastal waters I Abundance and distribution Harmful Algae 6 623ndash631

Quilliam MA Gilgan MW amp Pleasance S 1993 Confirmation of an incident of diarrhetic shellfish poisoning in eastern Canada In Smayda TJ Shimizu Y (Eds) Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea Elsevier New York pp 547ndash552

Suzuki T Ota H amp Yamasaki M 1999 Direct evidence of transformation of dinophysistoxin-1 to 7-O-acyl-dinophysistoxin-1 (Dinophysis-3) in the scallop Patinopecten yessoensis Toxicon 37 187-198

Vale P amp Sampayo M A 2002 First confirmation of human diarrhoeic poisonings by okadaic acid esters after ingestion of razor clams (Solen marginatus) and green crabs (Carcinus maenas) in Aveiro lagoon Portugal and detection of okadaic acid esters in phytoplankton Toxicon 40989-996

Vale P Veloso V amp Amorim A 2009 Toxin composition of a Prorocentrum lima strain isolated from the Portuguese coast Toxicon 54145ndash152

Agradecimientos Intecmar de la Xunta de Galicia Espantildea donde se realizaron los anaacutelisis de toxinas proyecto

SUBPESCA ldquoManejo y Monitoreo de Mareas Rojas en las regiones de Los Lagos Ayseacuten y Magallanes IV etapa 2010rdquo

ANEXO 4

Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten

ANEXO 5

Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de Magallanes

TASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

O

EJE

MP

LA

R P

AR

A E

L IN

TE

RE

SA

DO

LIQ

UID

AC

IOacuteN

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

EN

TID

AD

BA

NC

AR

IATASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

0 9

4 0

2 4INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

AD

MIN

IST

RA

CIOacute

NTASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

9520 euros

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

CONSELLERIA DE FACENDA

ANEXO 6

Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para cierre

de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

Seccioacuten Ediciones y Produccioacuten Almte Manuel Blanco Encalada 839

Fono 56-32-2151500 Valparaiacuteso Chile

wwwifopcl

Page 15: “Análisis de toxinas lipofílicas mediante LC-MS/MS en ...metadatos.mma.gob.cl/sinia/Informe_final_Analisis_toxinas_lipofilicas_656-055.pdfSUBSECRETARÍA DE ECONOMÍA: INFORME FINAL:

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo

8

En donde RT1 y RT2 y W1 y W2 son respectivamente los tiempos de retencioacuten y las anchuras en la liacutenea base de dos picos adyacentes RT2gtRT1 La resolucioacuten seraacute aceptable cuando Rs gt10 y la resolucioacuten a liacutenea base se consideraraacute completa cuando Rs gt15 La confirmacioacuten de la presencia de toxina seguacuten el criterio de la Decisioacuten de la Comisioacuten 2002657EC se basa en la relacioacuten entre las dos transiciones empleadas para la determinacioacuten (cuantificacioacuten y confirmacioacuten)

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SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo

9

4 RESULTADOS

41 Toxinas en moluscos

Las toxinas detectadas en moluscos fueron PTX2 YTX 45OHYTX DTX1 y SPX1 (Tabla 5) La mayor concentracioacuten la presentoacute el grupo de las YTXs (40-294 microg kg-1) en muestras de choritos provenientes del sector de Seno Otway (Fig 1) En este mismo sector las PTXs tambieacuten presentaron las mayores concentraciones (3-45 microg kg-1) en estos transvectores En el caso del ostioacuten tanto el PTX2 como las YTXs fueron detectadas en el contenido gaacutestrico El DTX1 fue detectado en choritos (1-18 microg kg-1 considerando DTX1 libre y total) procedentes del sector Seno Otway y sectores adyacentes a Punta Arenas El AO no fue detectado en ninguna aacuterea de la Regioacuten Los SPXs fueron principalmente detectados en choritos de las aacutereas centro y sur de Magallanes y en una estacioacuten del estero Peel (M13) en el aacuterea norte de la regioacuten No obstante que los niveles son muy bajos (01- 25 microg kg-1) incluso del nivel letal 50 en ratones inyectados intraperitonealmente 40 microg kg-1 (Richard et al 2000) los valores encontrados son iguales o mayor al encontrado en el caracol piquilhue recolectado en julio de 2012 y que en ese entonces produjo la muerte de ratones provocando el cierre de aacutereas de extraccioacuten por la autoridad de salud regional (Anexo 6) De las cinco toxinas detectadas en los moluscos solo DTX1 mostroacute estar localizada en el aacuterea centro de Magallanes mientras que las restantes fueron detectadas en las tres aacutereas de monitoreo Norte centro y sur de Magallanes No se encontraron PTX1 DTX2 ni AZPs en las muestras de moluscos Los resultados muestran que de los cuatro grupos de toxinas PTX YTXs DTXs y SPXs tres de ellas pueden estar presentes simultaacuteneamente en los moluscos vale decir PTXs YTXs y DTX1 o bien SPXs en vez de DTX1 42 Toxinas en microalgas

En las microalgas se detectaron PTXs y YTXs (Tabla 6) Las PTXs fueron detectadas aunque a nivel de trazas en ceacutelulas de D acuminata seleccionadas por micromanipulacioacuten desde muestras de agua procedentes de estero Silva Palma (M25) estero Wickham (M26) y Cutter Cove (M29) (Fig1) Tambieacuten fue detectada en filtrados de agua (fitoplancton) de Pto Fontaine (M21) e I Engelfield (M29N1) Las YTXs fueron detectadas en ceacutelulas de P reticulatum seleccionadas por micromanipulacioacuten y en cultivos de esta microalga que se logroacute establecer a partir de muestras de agua provenientes de C Adalberto (M04) Cutter Cove (M29) e I Engelfield (M29N1) Solo en los cultivos se detectoacute

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10

homoYTX y en uno de ellos tambieacuten se detectoacute aunque miacutenimamente 45OHYTX un derivado de la YTX que normalmente se encuentra en los moluscos como producto de bio-transformacioacuten La presencia de 45OHYTX en el cultivo pudo deberse a la presencia de ceacutelulas ya en fase de declinacioacuten de la curva de crecimiento

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11

5 ANAacuteLISIS Y DISCUSIOacuteN DE LOS DATOS

51 Toxinas en moluscos De las toxinas lipofiacutelicas se sabe que AO DTXs y AZAs causan trastornos gastrointestinales en los seres humanos (Gerssen et al 2010) Para las toxinas restantes (YTXs PTXs y SPXs) auacuten cuando no se han reportado casos de intoxicacioacuten en los seres humanos eacutestas son letales o altamente toacutexicas cuando los ratones son inyectados por viacutea intraperitoneal (Paz et al 2008 Richard et al 2000 Miles et al 2004) Es el caso de los SPXs la toxicidad en ratones inyectados por viacutea intraperitoneal supera a la del resto de las toxinas pues su dosis letal 50 es de 40 microg kg-1 (Richard et al 2000) Tal es asiacute que como referencia (Tabla 5) el transvector caracol piquilhue recolectadas en Julio de 2012 y cuyos niveles de toxicidad provocaron la muerte de los ratones solo presentoacute 01 microg kg-1 deteccioacuten que fue realizada durante este estudio en muestras de carne almacenadas durante no maacutes de 1 antildeo a -20 ordmC Sin embargo no se puede descartar una peacuterdida de la actividad por transformacioacuten durante el periodo de conservacioacuten A excepcioacuten de los SPXs el resto de las toxinas mencionadas estaacuten reguladas por la legislacioacuten europea tanto para consumo interno como importacioacuten de moluscos y tunicados para garantizar la salud de las personas Asiacute tambieacuten estaacuten reguladas por la legislacioacuten chilena a traveacutes del Instituto de Salud Puacuteblica (ISP) estableciendo los mismos niveles de referencia europeo en base al bioensayo ratoacuten Aun cuando los niveles de toxinas detectadas en los moluscos durante este estudio estaacuten por debajo de lo exigido por las regulaciones e incluso de los niveles propuestos por el EFSA (Tabla 7) la presencia de dos y tres tipos de toxinas en los moluscos representa una complejidad en la determinacioacuten de los niveles de toxicidad especialmente si se encuentran presentes toxinas altamente toacutexicas para ratones inyectados intraperitonealmente como son los SPXs Aunque se sospechaba la concurrencia de diferentes tipos de toxinas tal hecho no habiacutea sido confirmado anteriormente Sin embargo los SPXs siguen siendo una incoacutegnita pues se desconoce la fuente de estas toxinas A ostenfeldii la especie que podriacutea ser candidata a confirmar estuvo ausente (Tabla 8 modificado de Guzmaacuten et al 2014) durante el periodo en que se detectoacute en los moluscos Los escasos antecedentes toxigeacutenicos de esta especie en Chile la han confirmado como productora de toxinas paralizantes en Ayseacuten (Pizarro et al 2012) pero no de SPXs No obstante la produccioacuten de SPXs por esta especie en la regioacuten de Magallanes auacuten no se puede descartar Las YTXs fueron las toxinas maacutes abundantes en los moluscos analizados condicioacuten que se corresponde con la alta abundancia relativa de esta especie en el ambiente (Tabla 8) en la mayoriacutea de los casos (Tabla 5)

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Los resultados sugieren que los falsos positivos por bioensayo ratoacuten pudieran ser maacutes frecuentes de lo que se piensa actualmente para la regioacuten de Magallanes 52 Toxinas en microalgas Los resultados indican que P reticulatum encontrado en Magallanes producen YTXs al igual que las especies reportadas en la regioacuten de Antofagasta y Ayseacuten (Aacutelvarez et al 2011 Pizarro et al 2012) Tal resultado hace altamente probable que esta especie es la fuente de YTXs detectadas en los moluscos durante el periodo de estudio De acuerdo a las toxinas detectadas en las muestras de D acuminata aisladas asiacute como en el fitoplancton con gran abundancia de esta especie (Tabla 8) sugiere que esta microalga podriacutea ser una fuente primaria de PTXs tal como ocurre en el norte y sur del paiacutes (Blanco et al 2007 Fux et al 2011) Aunque la especie tambieacuten ha sido asociada a la presencia de DTX1 en moluscos en un evento toacutexico ocurrido en 1998 en Magallanes (Uribe et al 2001) el DTX1 no fue detectado en las muestras de D acuminata durante este estudio El no hallazgo de DTX1 en estas muestras pudo deberse a una fuente microalgal distinta como D acuta yo P lima D acuta ha sido asociada a DTX1 en moluscos de la regioacuten de Ayseacuten (Lembeye et al 1993 y Zhao et al 1993) mientras que P lima es productora solo de DTX1 en la regioacuten de Magallanes (Salgado et al 2012) Sin embargo cuando se detectoacute DTX1 en las muestras de moluscos durante este estudio D acuta estuvo ausente en las muestras de agua mientras que D acuminata presentoacute una abundancia relativa alta Por otro lado el volumen de resuspensioacuten de los extractos pudo ser elevado al seguir el mismo procedimiento protocolar que se aplica a las muestras de moluscos de acuerdo a la normativa europea actual Por tal razoacuten el LC-MSMS no logroacute detectar PTXs ni DTX1 en las muestras de microalgas En estos casos un protocolo para el anaacutelisis de las microalgas debiera incluir un volumen menor de resuspensioacuten de los extractos secos en referencia al utilizado para los moluscos o bien seleccionar por micromanipulacioacuten un nuacutemero mayor de microalgas (gt 130 ceacutelulas) Sin embargo esto uacuteltimo es maacutes difiacutecil de lograr en latitudes australes debido a la baja densidad de ceacutelulas en las que se presenta normalmente esta especie en condiciones naturales Por tal motivo se recomienda realizar pruebas con un volumen de resuspensioacuten menor a 1 mL aun cuando se trate de un LC-MSMS triple cuadrupolo

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6 CONCLUSIONES

a Los moluscos de la regioacuten de Magallanes pueden presentar PTX2 YTX 45OHYTX DTX1 y SPX1

b El hecho que los moluscos puedan presentar dos o maacutes tipos de toxinas lipofiacutelicas dificulta establecer el nivel de toxicidad total

c P reticulatum en Magallanes produce YTXs al igual que la especie del norte y sur del paiacutes

d La abundancia relativa ambiental de P reticulatum durante el periodo de estudio coincidioacute con la presencia de YTXs en los moluscos

e Los SPXs encontrados anteriormente en caracoles piquilhue tambieacuten fue posible detectarlos en choritos durante este estudio

f Auacuten queda por confirmar el tipo de SPXs presentes y su eventual fuente primaria La presencia de SPXs en los moluscos no siempre coincidioacute con la presencia de A ostenfeldii en el ambiente y su abundancia relativa maacutexima fue solo de nivel 1 (raro) durante el periodo de estudio

g La PTX2 detectada en los moluscos coincidioacute con una alta abundancia relativa ambiental de D acuminata No obstante auacuten queda por confirmar si esta especie es la fuente primaria Para ello se hace necesario ajustar (disminuir) el volumen de dilucioacuten de los extractos secos de microalgas aisladas por micromanipulacioacuten aun cuando se trata de un espectroacutemetro de masas como un triple cuadrupolo

h La deteccioacuten de DTX1 en los moluscos coincidioacute con la ausencia de D acuta en el ambiente La toxina tampoco fue detectada en los moluscos cuando esta microalga estuvo a niveles de 2 y 3 (escaso y regular) Queda por confirmar la produccioacuten de DTX1 por esta especie en Magallanes

i No se encontraron PTX1 DTX2 ni AZPs en las muestras de moluscos durante el periodo de estudio

j Los resultados demuestran la presencia de toxinas en los moluscos que se hace necesario identificar y cuantificar utilizando teacutecnicas distintas al bioensayo

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F I G U R A

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Figura 1 Estaciones y sectores muestreados (ciacuterculo rojo) y sector Fortuna donde fue recolectado el

caracol piquilhue (ciacuterculo amarillo)

T A B L A S

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Tabla 1 Condiciones cromatograacuteficas para el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas usando

una columna de UPLC C18 en fase reversa y medio baacutesico

Columna Acquity UPLC BEH C18 17 microm 21x100 mm

Temperatura columna 45 ordmC

Flujo 04 mlmin

Volumen inyeccioacuten 5 microl

Temperatura muestras 10 plusmn 5 ordmC

Gradiente

Tiempo (min) Fase A () Fase B ()

0 75 25

066 75 25

330 5 95

528 5 95

726 75 25

900 75 25

Tabla 2 Paraacutemetros de la fuente de ionizacioacuten para el Xevo TQMS (Waters) en la determinacioacuten de toxinas lipofiacutelicas

PARAacuteMETROS DE LA FUENTE

ESI- ESI+

AO DTX2 DTX1 YTX homoYTX 45OH YTX y 45OH

homoYTX

AZA1 AZA2 AZA3 PTX2 PTX1 y SPX1

Voltaje de capilar (V) 100 200

Temperatura de solvatacioacuten (ordmC) 450 450

Flujo gas de solvatacioacuten (lh) 850 850

Flujo gas cono (lh) 50 50

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Tabla 3

Resumen de las condiciones de espectrometriacutea de masas empleadas con el Xevo TQMS (Waters) en el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas

Compuesto tR (min)

ESI

Ioacuten Precursor

(mz)

Ioacuten Producto

(mz)

Dwell time (s)

Energiacutea colisioacuten

(eV)

Voltaje cono (V)

AO 189 NEG 8035 2552 0010 46 86

113 0010 56 86

DTX2 210 NEG 8035 2552 0010 46 86

113 0010 56 86

DTX1 214 NEG 8175 5634 0010 43 86

2552 0010 48 86

YTX 202 NEG 5704 4674 0010 30 45

3963 0010 35 45

45OH-YTX 182 NEG 5784 4674 0010 30 45

3964 0010 30 45

HomoYTX 203 NEG 5775 4744 0010 30 48

4034 0010 30 48

45OH-homoYTX 182 NEG 5855 4034 0010 30 45

4744 0010 30 45

PTX1 306 POS 8925 8395 0015 25 36

8215 0015 25 36

PTX2 362 POS 8765 8415 0015 20 36

8235 0015 25 36

AZA1 263 POS 8425 6545 0015 55 50

3622 0015 50 50

AZA2 270 POS 8565 6725 0015 45 27

6545 0015 45 27

AZA3 236 POS 8285 6404 0015 55 47

3622 0015 55 47

SPX1 368 POS 6925 6744 0015 27 60

1643 0015 42 60 Transicioacuten cuantificadora

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Tabla 4 TRR y valores de tolerancia para las toxinas analizadas

TOXINA TRR TOLERANCIA

Toxinas del grupo de AO

AO 1000 0990-1010

DTX2 1040 1014-1066

DTX1 1140 1111-1168

Toxinas del grupo de PTX

PTX2 1000 0990-1010

PTX1 0850 0829-0871

Toxinas del grupo de YTX

YTX 1000 0990-1010

45OH-YTX 0894 0871-0916

Homo YTX 1000 0990-1010

45OH-homoYTX 0899 0876-0921

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Tabla 5 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de moluscos

Nordm estMes

recolectaLocalidad Molusco

cuerpo

enterohepat

gramos

carne

toxicidad

VDM ratoacuten

PTX2

(ugKg)

YTX

(ugKg)

45OHYTX

(ugKg)

DTX1

libre

(ugKg)

DTX1

total

(ugkg)

SPX 1

(ugKg)

M13 ene-13 E Peel chorito x 5086 + 01 02

M13 ene-13 E Peel ostioacuten x 5155 No real izado 16 21

M33 ene-13 B Bell chorito x 5253 + 04

M37 ene-13 B Agua Fresca chorito x 5039 + 05 01

M35 ene-13 C San Isidro chorito x 5289 + 000 01

M42 ene-13 V Holanda chorito x 5231 + 06 13

M43 ene-13 B Yendegaia chorito x 5193 + 04 25

M45 ene-13 Pto Williams chorito x 5161 - 28 07

M08 feb-13 E Falcon cholga x 5027 - 14

M09 feb-13 E Penguumlin cholga x 5103 + 14

M22 feb-13 E de las Montantildeas cholga x 5052 - 26

M23 feb-13 I Ballesteros cholga x 5204 - 87

M24 feb-13 B Fanny chorito x 2016 - 38 1071 479 12

M25 feb-13 E Silva Palma chorito x 1447 - 59 1077 898 09

M26 feb-13 E Wickham chorito x 1093 - 194 2940 2232 66 66

M27 feb-13 E Sullivan chorito x 1137 - 450 1944 1478

M28 feb-13 E Nuntildeez chorito x 1179 + 33 721 407

M29 feb-13 Cutter Cove chorito x 1003 - 65 501 309

M29N1 feb-13 I Engelfield chorito x 1116 - 297 2007 1483

M31 feb-13 B Nash chorito x 2231 +

M33 feb-13 B Bell chorito x 1181 - 93

M34 feb-13 S Pedro chorito x 0726 -

M35 feb-13 C San Isidro chorito x 1178 + 110

M36 feb-13 B Buena chorito x 1367 +

M37 feb-13 B Agua Fresca chorito x 0850 + 45 100 80

M39 feb-13 Pto Zenteno chorito x 3241 + 28

M39N2 feb-13 Pta San Valentin chorito x 1712 - 11

M39N3 feb-13 Pto Yartou chorito x 2035 - 11

sector

Fortunajul-12 B Inuacutetil

caracol

piquilhuex 107000 + 01

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Tabla 6 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de microalgas

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Tabla 7 Niveles actualmente permitidos por la legislacioacuten europea (bioensayo) y los niveles propuestos por la

autoridad europea para la seguridad alimentaria (EFSA) (Gerssen et al 2010)

Toxin Legislacioacuten (μg kg-

1) Proposicioacuten

EFSA (μg kg-1)

Validacioacuten LC-MSMS

(μg kg-1)

OA and DTXs 160 45

PTXs 120

YTXs 1000 3750

AZAs 160 32

SPXs 400 (Gerssen et al2010)

European Food Safety Authority Decisioacuten 2002657 de la Unioacuten Europea EC Incluye PTXs

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Tabla 8 Abundancia relativa ambiental de las microalgas al momento de recolectar las muestras de moluscos En rojo se indica la deteccioacuten de toxina positiva en los moluscos asociada a la supuesta microalga fuente PTXs (D

acuminata) YTXs (P reticulatum) SPXs (A ostenfeldii) DTX1 (A acuta)

(Tabla modificada de Guzmaacuten et al 2014)

A N E X O S

ANEXO 1

Certificacioacuten laboratorio INTECMAR

ANEXO 2

Lista de anaacutelisis que realiza INTECMAR y sus costos (en euros) 2013

scv 1 de 7

GUIA PARA LA AUTOLIQUIDACIOacuteN DE TASAS A FAVOR DE LA COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA 2013 Los aspectos financieros de los servicios prestados por Intecmar en el marco de su actividad e vienen regulados en la Ley 62003 de 9 de diciembre de tasas precios y exenciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia (DOG nuacutem 240 de 11122003) y fueron actualizados posteriormente en la Ley 142010 de 27 de diciembre de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2011 (DOG nuacutem 250 de 30122010) y en la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013 (DOG nuacutem 42 de 28022013) Existen dos maneras de liquidar las tasas correspondientes a los servicios prestados por Intecmar

1 De forma manual cubriendo el modelo A de autoliquidacioacuten que se descarga en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda y que adjunto en pdf y se lleva al banco para su pago httpwwwconselleriadefacendaeswebportalconfeccion-impresos

2 De forma telemaacutetica en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda viacutenculo httpshostcixtecesXEITObinlionwebXeitodllxmit a traveacutes del modelo 730

Ambos modelos de liquidacioacuten de tasas adjuntamos ejemplo al final de este documento deben ser remitidos por mail a Intecmar con el sello del banco fiacutesico o virtual como paso previo a la emisioacuten del certificado Los coacutedigos generales necesarios son

minus Consejeriacutea de Medio Rural y de Mar Coacutedigo 09 minus Delegacioacuten de Pontevedra Coacutedigo 40 minus Servicio de Intecmar Coacutedigo 24

Los coacutedigos y descripcioacuten de las tasas son los regulados en la legislacioacuten vigente y los hemos resumido en los anexos siguientes Vilaxoaacuten 4 de marzo de 2013

scv 2 de 7

TARIFAS DE TASAS VIGENTES PARA 2013 - Ley 22013 d e 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013

(DOG nuacutem 42 de 28022013)

Estas tarifas son consecuencia de la actualizacioacuten de las tarifas contenidas en los anexos 1 2 3 4 y 5 de la Ley 62003 del 9 de diciembre de tasas precios y exacciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia por la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 Seraacuten aplicables desde el diacutea de la entrada en vigor de la Ley de

presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 TASA POR SERVICIOS ADMINISTRATIVOS

No sujecioacuten No se exigiraacute la tasa por servicios administrativos cuando se trate de compulsas o cotejos de documentos que deban acompantildear a solicitudes escritos o comunicaciones presentadas por el ciudadano y realizadas en el aacutembito de actuacioacuten de los registros seguacuten lo dispuesto en el artiacuteculo 385 de la Ley 301992 del 26 de noviembre de reacutegimen juriacutedico de las administraciones puacuteblicas y del procedimiento administrativo comuacuten

Excepciones Estaraacuten exentos de la presente tasa

1- La expedicioacuten de certificados de retribuciones satisfechas por la Xunta de Galicia con el objeto de justificacioacuten en relacioacuten con el impuesto sobre la renta de las personas fiacutesicas

2- La expedicioacuten de certificados y compulsa que el personal de la Administracioacuten solicite respecto a las necesidades propias del puesto de trabajo o relacioacuten de servicios

3- Los alumnos por cualquier actuacioacuten en materia de ensentildeanzas no universitarias

scv 3 de 7

4- Las compulsas realizadas en las oficinas de empleo para los desempleados en la tramitacioacuten de expedientes que sean competencia de dichas oficinas

5 La inscripcioacuten en las convocatorias para a seleccioacuten de personal de la comunidad autoacutenoma despueacutes de justificacioacuten documental solicitada por

- Personas con discapacidad igual o superior al 33 - Personas que sean miembros de familias numerosas clasificadas en la

categoriacutea especial Se aplicaraacute una bonificacioacuten del 50 a la inscripcioacuten solicitada por - Personas que sean miembros de familias numerosas de categoriacutea

general - Personas que figurasen como demandantes de empleo desde por lo

menos seis meses antes a la fecha de la convocatoria de pruebas selectivas de personal en las que soliciten su participacioacuten y no esteacuten percibiendo prestacioacuten o subsidio por desempleo

6- La expedicioacuten de certificados relativos a la situacioacuten fiscal 7- El Estado y los demaacutes entes puacuteblicos territoriales o institucionales

siempre que los servicios o actividades de que sean beneficiarios se presten o se realicen en el marco del principio de colaboracioacuten entre administraciones

8- Las viacutectimas de actos terroristas asiacute como sus coacutenyuges y sus hijos por cualquier actuacioacuten en materia educativa realizada en centros oficiales de estudios en todos los niveles de ensentildeanza

9- Los miembros de los organismos consultivos de la Administracioacuten puacuteblica gallega respecto de los certificados emitidos por dichos organismos

COacuteDIGO TASAS

DESCRIPCIOacuteN IMPORTE euro

314400 Prestacioacuten de servicios en el Instituto Tecnoloacutegico para el Control del Medio Marino de Galicia

314401 Anaacutelisis de biotoxinas marinas en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de Yasumoto 1978 4752

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en rato segundo o meacutetodo de Yasumoto 1984 5432

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS)

9520 -Anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten

seguacuten el meacutetodo de la AOAC 4752

scv 4 de 7

-Anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo da AOAC 4752

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1978 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10186

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1984 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10865

-Anaacutelisis combinada en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS) anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo AOAC y anaacutelisis de toxicidad de tipo ASP por cromatografiacutea liquida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo de la AOAC 15000

314402 Anaacutelisis de muestras en agua de mar -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton marino mediante

microscopiacutea oacuteptica 15133 -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton toacutexico marino

mediante microscopiacutea oacuteptica 13333 - Anaacutelisis de carbono orgaacutenico disuelto 5093 -Anaacutelisis de nutrientes inorgaacutenicos disueltos 3500 -Anaacutelisis de pigmentos fotosinteacuteticos (clorofila ldquoardquo) por

espectrofluorimetria 1698 314403 Anaacutelisis microbioloacutegicos en moluscos y otros organismos

procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Cuantificacioacuten de E Coli 10186 - Deteccioacuten de Salmonella spp 16975 -Enumeracioacuten de Escherichia coli en moluscos bivalvos

vivos por la teacutecnica de medida directa de impedancia con el sistema BacTrac 4300 6800

314404 Anaacutelisis de contaminantes de origen quiacutemica en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Determinacioacuten de metales pesados (Pb Cd Cu Zn As Hg Ni Cr Ag) mediante espectrofotometriacutea de absorcioacuten atoacutemica por metal

6790

-Determinacioacuten de compuestos bifenilos policlorados (PCB) mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

scv 5 de 7

-Determinacioacuten de pesticidas organoclorados mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

-Determinacioacuten de hidrocarburos aromaacuteticos policiacuteclicos (HAPs) mediante cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de fluorescencia

28200

314405 Anaacutelisis histopatoloacutegica de moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Estudio hispatoloacutegico Determinacioacuten de Bonamia Marteillia Perkinsus y otras alteraciones patoloacutegicas

101852

314406 Emisioacuten de certificaciones e informes teacutecnicos y otras actuaciones a peticioacuten del interesado

Emisioacuten de certificados a peticioacuten de los interesados sobre las actuaciones llevadas a cabo por el Instituto

1000

Emisioacuten de informes teacutecnicos a peticioacuten del interesado (euros por hora o fraccioacuten)

4000

scv 6 de 7

scv 7 de 7

ANEXO 3

Resultados de anaacutelisis en muestras de microalgas anteriormente enviadas procedentes de Magallanes por el equipo de espectrometriacutea de masas utilizado por INTECMAR Trabajo presentado a las XXXII

Congreso de Ciencias del Mar realizado en Punta Arenas 22-25 octubre de 2012

PERFIL DE TOXINAS DE PROROCENTRUM LIMA (DINOPHYCEAE) AISLADO DESDE LA COSTA DE MAGALLANES SUR DE CHILE P Salgado1 G Pizarro1 JM Franco2 P Rioboacute2 e I Bravo3

1Instituto de Fomento Pesquero (IFOP) Punta Arenas Chile gemitapizarroifopcl 2Instituto de Investigaciones Marinas (CSIC) Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea 3Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea

Prorocentrum lima (Ehrenberg) es un dinoflagelado marino bentoacutenico que se encuentra adherido generalmente

sobre macroalgas sedimentos y detrito flotante y menos comuacutenmente en el plancton (Bravo et al 2001) Es una especie neriacutetica y estuarina y su rango de distribucioacuten geograacutefica variacutea desde aguas costeras tropicales a templadas (Faust 1991) La importancia de P lima se debe a que son productoras de toxinas diarreogeacutenicas en las personas (veneno diarreico de los mariscos VDM) al igual que algunas especies de Dinophysis aunque raramente se le han asociado con episodios toacutexicos por VDM por su caraacutecter epiacutefito y bentoacutenico El complejo VDM producido por P lima incluye moleacuteculas conocidas como el aacutecido okadaico (AO) y derivados dinofisistoxinas (DTX-1 DTX-2) (Bravo et al 2001 Vale et al 2009) No obstante existen casos citados para USA donde se detectoacute toxicidad por VDM en bivalvos de cultivos asociadas a P lima aunque en bajos niveles (Maranda et al 2007a) En Canadaacute tambieacuten se llevoacute a cabo un estudio en moluscos de cultivo cuya finalidad fue determinar el origen del VDM en la que P lima fue la principal especie sospechosa tras la ocurrencia de un evento toacutexico humano por VDM ocurrido en 1998 (Levasseur et al 2003) y en antildeos anteriores (Quilliam et al 1993) Aunque Levasseur et al (2003) no logroacute probar la toxicidad de los mariscos en cultivo a causa de P lima cabe hacer notar que lo que buscaron fue OA y DTX1 no DTX 3 este uacuteltimo principal derivado de las anteriores tras su transformacioacuten en los moluscos (eg Suzuki et al 1999 Vale amp Sampayo 2002)

En consecuencia el rol de P lima en eventos toacutexicos por VDM auacuten no puede descartarse por cuanto podriacutean llegar a ser importantes en ambientes turbulentos debido a la eventual remocioacuten de microalgas adheridas en sustratos por efecto de vientos (Levasseur et al 2003) factor de importancia si se trata de sedimentos o contrariamente en zonas someras y estables de cultivos de moluscos que al mismo tiempo favorecen microambientes para sustratos en los que prolifera la epiacutefita P lima (Lawrence et al 2000) quedando expuestas a re-suspensiones temporales que favorecen la filtracioacuten de estas microalgas por los bivalvos en cultivo (Maranda et al 2007a)

Chile posee escaso conocimiento sobre esta especie en su medio natural incluido su perfil de toxinas y potencial rol en la toxificacioacuten de moluscos por VDM Por tal razoacuten resultoacute interesante aportar al conocimiento de estos aspectos en muestras de sedimentos recolectadas en el estrecho de Magallanes en las que esta especie se encontroacute inhabitualmente abundante

Las ceacutelulas utilizadas en este estudio fueron aisladas desde sedimentos superficiales (0-3 cm) recolectados en el invierno de 2010 en la localidad de cabo San Isidro durante el muestreo regular del programa de monitoreo de marea roja en la regioacuten de Magallanes En esa oportunidad se logroacute cuantificar hasta 1002 quistes tecadoscm3 de Prorocentrum lima la mayor concentracioacuten respecto a otros sitios de recolecta (Fig 1) Los sedimentos de esta localidad presentaron una coloracioacuten oscura y un fuerte olor a sulfuro de hidroacutegeno (H2S) producto de anoxia local

Se aislaron entre 27 y 87 quistes tecados (Fig 1 a) directamente desde los sedimentos mientras otras 60 ceacutelulas vegetativas (Fig 1 b) fueron aisladas luego de promover la actividad y divisioacuten de los quistes en condiciones de 15 ordmC y un ciclo de luzoscuridad de 1212 horas (Tabla 1) Para este fin se aislaron quistes tecados y trasvasijaron a placas Petri de 5 cm de diaacutemetro conteniendo 5 mL de medio de cultivo L1 Para el anaacutelisis de toxinas las ceacutelulas aisladas fueron trasvasijadas a un tubo Eppendorf de 15 mL y congelados a -80 ordmC Una aliacutecuota de sedimento huacutemedo (100 microL aproximados) tambieacuten fue vaciada en un tubo Eppendorf y congelado Para extraer la toxina se antildeadioacute 500 microL de metanol 100 a cada tubo se mezcloacute por 1 min y filtroacute por 045 microm trasvasijando a un vial El extracto fue secado bajo nitroacutegeno gas a 40 ordmC y conservado a 4 ordmC hasta su anaacutelisis Previo al anaacutelisis de toxinas los extractos fueron resuspendidos en 150 microl de metanol

La presencia de la toxina dinofisistoxina 1 (DTX-1) en las muestras (Fig2) fue confirmada en modo negativo a traveacutes de su ioacuten precursor [M-H]- mz 8175 y sus iones productos mz 5634 y 2552 mediante un cromatoacutegrafo UPLC Acquity Waters acoplado a un triple cuadrupolo Waters Xevo TQ (LC-MS) La columna utilizada fue una Acquity UPLC BEH C18 17microm 21 x 100 mm a 45 ordmC La fase moacutevil consistioacute en (A) hidroacutexido amoacutenico a pH 11 y (B) hidroacutexido amoacutenico en acetonitrilo (67 mM) con una tasa de flujo de 4 mLmin El gradiente de elucioacuten utilizado fue el siguiente mantencioacuten al 75 de A entre 0 y 066 min cambio a 5 de A entre 066 y 330 min mantener 5

de A entre 330 y 528 min recuperacioacuten del 75 de A entre 528 y 726 min mantencioacuten al 75 de A hasta 9 min Se pinchoacute 5microL de muestra en el LC-MS El contenido de DTX-1 en las muestras fue cuantificado en base al ion precursor

Los tres tipos de muestras fueron positivas a la presencia de DTX-1 pero las ceacutelulas vegetativas fueron las que presentaron un mayor contenido de DTX-1 por ceacutelula La deteccioacuten de DTX-1 en los sedimentos (Tabla 2) reflejoacute la presencia de los quistes tecados en eacutestos

Figura 1 Concentraciones de quistes tecados de Prorocentrum lima (quistescm3 de sedimento huacutemedo) en estaciones de muestreo en el Estrecho de Magallanes (M26 Estero Wickham M29N1 Isla Engenfield M31 Bahiacutea Nash M35 Cabo San Isidro M39C1 Bahiacutea Gente Grande M39C2 Bahiacutea Inuacutetil M39C3 Canal Gabriel) y Canal Beagle (M41 Ventisquero Espantildea M42 Ventisquero Holanda) (a) Quistes tecados (b) ceacutelulas vegetativas obtenidas de germinacioacuten de quistes tecados bajo condiciones de laboratorio Barra de escala 20 microm

Tabla 1 Sedimento y ceacutelulas de Prorocentrum lima aisladas para anaacutelisis de toxinas

Extracto metanoacutelico Nordm de ceacutelulas TR ngmL pg DTX-1 ceacutel

G1 quistes tecados 27 213 lt2 -

G2 quistes tecados 67 214 05 11

G3 quistes tecados 87 215 12 21

G4 ceacutelulas vegetativas 60 215 34 87

G6 sedimentos aliacutecuota 213 13 19 pg microL sed

TR tiempo de retencioacuten

Figura 2 Cromatogramas de extractos metanoacutelicos de Prorocentrum lima quistes tecados (a) ceacutelulas vegetativas (b) y sedimentos (c)

Tabla 2 Caracteriacutesticas del sedimento con quistes tecados de Prorocentrum lima

Tipo Tamantildeo (mm)

Grava 2 35

Arena media 025 - 05 32

Arena muy fina 0063 - 0125 2

Limo-arcilla lt 0063 1

Estos resultados constituyen otra eventual posibilidad de toxicidad en los moluscos por VDM no soacutelo de aquellos con modalidad de vida bentoacutenica superficial sino de aquellos que tambieacuten viven enterrados en la arena (eg almeja huepo) Maacutes auacuten si se conoce que P lima posee la capacidad de desarrollar poblaciones naturales en aguas templadas en nuacutemeros que podriacutean justificar una toxicidad por VDM en los mariscos (eg Maranda et al 2007a b)

Referencias

Bravo I ML Fernaacutendez I Ramilo amp A Martinez 2001 Toxin composition of the toxic dinofagellate Prorocentrum lima isolated from different locations along the Galician coast (NW Spain) Toxicon 39 1537ndash1545

Faust MA 1991 Morphology of ciguatera-causing Prorocentrum lima (Pyrrophyta) from widely differing sites J Phycol 27 642-648

Lawrence J E Grant J Quilliam M A Bauder A G amp Cembella A D 2000 Colonizaition and growth of the toxic dinoflagellate Prorocentrum lima and associated fouling macroalgae on mussels in suspended culture Mar Ecol Prog Ser 201 147-154

Levasseur M Couture J Y Weise A M Michaud S Elbrachter M Sauveacute G amp Bonneau E 2003 Pelagic and epiphytic summer distributions of Prorocentrum lima and P mexicanum at two mussel farms in the Gulf of St Lawrence Aquat Microbiol Ecol 30283-293

Maranda L Corwin S Dover S amp Morton S L 2007a Prorocentrum lima (Dinophyceae) in northeastern USA coastal waters II Toxin load in the epibiota and in shellfish Harmful Algae 6 632-641

Maranda L Corwin S Hargraves P E 2007b Prorocentrum lima (Dinophyceae) in 19 northeastern USA coastal waters I Abundance and distribution Harmful Algae 6 623ndash631

Quilliam MA Gilgan MW amp Pleasance S 1993 Confirmation of an incident of diarrhetic shellfish poisoning in eastern Canada In Smayda TJ Shimizu Y (Eds) Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea Elsevier New York pp 547ndash552

Suzuki T Ota H amp Yamasaki M 1999 Direct evidence of transformation of dinophysistoxin-1 to 7-O-acyl-dinophysistoxin-1 (Dinophysis-3) in the scallop Patinopecten yessoensis Toxicon 37 187-198

Vale P amp Sampayo M A 2002 First confirmation of human diarrhoeic poisonings by okadaic acid esters after ingestion of razor clams (Solen marginatus) and green crabs (Carcinus maenas) in Aveiro lagoon Portugal and detection of okadaic acid esters in phytoplankton Toxicon 40989-996

Vale P Veloso V amp Amorim A 2009 Toxin composition of a Prorocentrum lima strain isolated from the Portuguese coast Toxicon 54145ndash152

Agradecimientos Intecmar de la Xunta de Galicia Espantildea donde se realizaron los anaacutelisis de toxinas proyecto

SUBPESCA ldquoManejo y Monitoreo de Mareas Rojas en las regiones de Los Lagos Ayseacuten y Magallanes IV etapa 2010rdquo

ANEXO 4

Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten

ANEXO 5

Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de Magallanes

TASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

O

EJE

MP

LA

R P

AR

A E

L IN

TE

RE

SA

DO

LIQ

UID

AC

IOacuteN

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

EN

TID

AD

BA

NC

AR

IATASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

0 9

4 0

2 4INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

AD

MIN

IST

RA

CIOacute

NTASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

9520 euros

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

CONSELLERIA DE FACENDA

ANEXO 6

Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para cierre

de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

Seccioacuten Ediciones y Produccioacuten Almte Manuel Blanco Encalada 839

Fono 56-32-2151500 Valparaiacuteso Chile

wwwifopcl

Page 16: “Análisis de toxinas lipofílicas mediante LC-MS/MS en ...metadatos.mma.gob.cl/sinia/Informe_final_Analisis_toxinas_lipofilicas_656-055.pdfSUBSECRETARÍA DE ECONOMÍA: INFORME FINAL:

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo

9

4 RESULTADOS

41 Toxinas en moluscos

Las toxinas detectadas en moluscos fueron PTX2 YTX 45OHYTX DTX1 y SPX1 (Tabla 5) La mayor concentracioacuten la presentoacute el grupo de las YTXs (40-294 microg kg-1) en muestras de choritos provenientes del sector de Seno Otway (Fig 1) En este mismo sector las PTXs tambieacuten presentaron las mayores concentraciones (3-45 microg kg-1) en estos transvectores En el caso del ostioacuten tanto el PTX2 como las YTXs fueron detectadas en el contenido gaacutestrico El DTX1 fue detectado en choritos (1-18 microg kg-1 considerando DTX1 libre y total) procedentes del sector Seno Otway y sectores adyacentes a Punta Arenas El AO no fue detectado en ninguna aacuterea de la Regioacuten Los SPXs fueron principalmente detectados en choritos de las aacutereas centro y sur de Magallanes y en una estacioacuten del estero Peel (M13) en el aacuterea norte de la regioacuten No obstante que los niveles son muy bajos (01- 25 microg kg-1) incluso del nivel letal 50 en ratones inyectados intraperitonealmente 40 microg kg-1 (Richard et al 2000) los valores encontrados son iguales o mayor al encontrado en el caracol piquilhue recolectado en julio de 2012 y que en ese entonces produjo la muerte de ratones provocando el cierre de aacutereas de extraccioacuten por la autoridad de salud regional (Anexo 6) De las cinco toxinas detectadas en los moluscos solo DTX1 mostroacute estar localizada en el aacuterea centro de Magallanes mientras que las restantes fueron detectadas en las tres aacutereas de monitoreo Norte centro y sur de Magallanes No se encontraron PTX1 DTX2 ni AZPs en las muestras de moluscos Los resultados muestran que de los cuatro grupos de toxinas PTX YTXs DTXs y SPXs tres de ellas pueden estar presentes simultaacuteneamente en los moluscos vale decir PTXs YTXs y DTX1 o bien SPXs en vez de DTX1 42 Toxinas en microalgas

En las microalgas se detectaron PTXs y YTXs (Tabla 6) Las PTXs fueron detectadas aunque a nivel de trazas en ceacutelulas de D acuminata seleccionadas por micromanipulacioacuten desde muestras de agua procedentes de estero Silva Palma (M25) estero Wickham (M26) y Cutter Cove (M29) (Fig1) Tambieacuten fue detectada en filtrados de agua (fitoplancton) de Pto Fontaine (M21) e I Engelfield (M29N1) Las YTXs fueron detectadas en ceacutelulas de P reticulatum seleccionadas por micromanipulacioacuten y en cultivos de esta microalga que se logroacute establecer a partir de muestras de agua provenientes de C Adalberto (M04) Cutter Cove (M29) e I Engelfield (M29N1) Solo en los cultivos se detectoacute

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo

10

homoYTX y en uno de ellos tambieacuten se detectoacute aunque miacutenimamente 45OHYTX un derivado de la YTX que normalmente se encuentra en los moluscos como producto de bio-transformacioacuten La presencia de 45OHYTX en el cultivo pudo deberse a la presencia de ceacutelulas ya en fase de declinacioacuten de la curva de crecimiento

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo

11

5 ANAacuteLISIS Y DISCUSIOacuteN DE LOS DATOS

51 Toxinas en moluscos De las toxinas lipofiacutelicas se sabe que AO DTXs y AZAs causan trastornos gastrointestinales en los seres humanos (Gerssen et al 2010) Para las toxinas restantes (YTXs PTXs y SPXs) auacuten cuando no se han reportado casos de intoxicacioacuten en los seres humanos eacutestas son letales o altamente toacutexicas cuando los ratones son inyectados por viacutea intraperitoneal (Paz et al 2008 Richard et al 2000 Miles et al 2004) Es el caso de los SPXs la toxicidad en ratones inyectados por viacutea intraperitoneal supera a la del resto de las toxinas pues su dosis letal 50 es de 40 microg kg-1 (Richard et al 2000) Tal es asiacute que como referencia (Tabla 5) el transvector caracol piquilhue recolectadas en Julio de 2012 y cuyos niveles de toxicidad provocaron la muerte de los ratones solo presentoacute 01 microg kg-1 deteccioacuten que fue realizada durante este estudio en muestras de carne almacenadas durante no maacutes de 1 antildeo a -20 ordmC Sin embargo no se puede descartar una peacuterdida de la actividad por transformacioacuten durante el periodo de conservacioacuten A excepcioacuten de los SPXs el resto de las toxinas mencionadas estaacuten reguladas por la legislacioacuten europea tanto para consumo interno como importacioacuten de moluscos y tunicados para garantizar la salud de las personas Asiacute tambieacuten estaacuten reguladas por la legislacioacuten chilena a traveacutes del Instituto de Salud Puacuteblica (ISP) estableciendo los mismos niveles de referencia europeo en base al bioensayo ratoacuten Aun cuando los niveles de toxinas detectadas en los moluscos durante este estudio estaacuten por debajo de lo exigido por las regulaciones e incluso de los niveles propuestos por el EFSA (Tabla 7) la presencia de dos y tres tipos de toxinas en los moluscos representa una complejidad en la determinacioacuten de los niveles de toxicidad especialmente si se encuentran presentes toxinas altamente toacutexicas para ratones inyectados intraperitonealmente como son los SPXs Aunque se sospechaba la concurrencia de diferentes tipos de toxinas tal hecho no habiacutea sido confirmado anteriormente Sin embargo los SPXs siguen siendo una incoacutegnita pues se desconoce la fuente de estas toxinas A ostenfeldii la especie que podriacutea ser candidata a confirmar estuvo ausente (Tabla 8 modificado de Guzmaacuten et al 2014) durante el periodo en que se detectoacute en los moluscos Los escasos antecedentes toxigeacutenicos de esta especie en Chile la han confirmado como productora de toxinas paralizantes en Ayseacuten (Pizarro et al 2012) pero no de SPXs No obstante la produccioacuten de SPXs por esta especie en la regioacuten de Magallanes auacuten no se puede descartar Las YTXs fueron las toxinas maacutes abundantes en los moluscos analizados condicioacuten que se corresponde con la alta abundancia relativa de esta especie en el ambiente (Tabla 8) en la mayoriacutea de los casos (Tabla 5)

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Los resultados sugieren que los falsos positivos por bioensayo ratoacuten pudieran ser maacutes frecuentes de lo que se piensa actualmente para la regioacuten de Magallanes 52 Toxinas en microalgas Los resultados indican que P reticulatum encontrado en Magallanes producen YTXs al igual que las especies reportadas en la regioacuten de Antofagasta y Ayseacuten (Aacutelvarez et al 2011 Pizarro et al 2012) Tal resultado hace altamente probable que esta especie es la fuente de YTXs detectadas en los moluscos durante el periodo de estudio De acuerdo a las toxinas detectadas en las muestras de D acuminata aisladas asiacute como en el fitoplancton con gran abundancia de esta especie (Tabla 8) sugiere que esta microalga podriacutea ser una fuente primaria de PTXs tal como ocurre en el norte y sur del paiacutes (Blanco et al 2007 Fux et al 2011) Aunque la especie tambieacuten ha sido asociada a la presencia de DTX1 en moluscos en un evento toacutexico ocurrido en 1998 en Magallanes (Uribe et al 2001) el DTX1 no fue detectado en las muestras de D acuminata durante este estudio El no hallazgo de DTX1 en estas muestras pudo deberse a una fuente microalgal distinta como D acuta yo P lima D acuta ha sido asociada a DTX1 en moluscos de la regioacuten de Ayseacuten (Lembeye et al 1993 y Zhao et al 1993) mientras que P lima es productora solo de DTX1 en la regioacuten de Magallanes (Salgado et al 2012) Sin embargo cuando se detectoacute DTX1 en las muestras de moluscos durante este estudio D acuta estuvo ausente en las muestras de agua mientras que D acuminata presentoacute una abundancia relativa alta Por otro lado el volumen de resuspensioacuten de los extractos pudo ser elevado al seguir el mismo procedimiento protocolar que se aplica a las muestras de moluscos de acuerdo a la normativa europea actual Por tal razoacuten el LC-MSMS no logroacute detectar PTXs ni DTX1 en las muestras de microalgas En estos casos un protocolo para el anaacutelisis de las microalgas debiera incluir un volumen menor de resuspensioacuten de los extractos secos en referencia al utilizado para los moluscos o bien seleccionar por micromanipulacioacuten un nuacutemero mayor de microalgas (gt 130 ceacutelulas) Sin embargo esto uacuteltimo es maacutes difiacutecil de lograr en latitudes australes debido a la baja densidad de ceacutelulas en las que se presenta normalmente esta especie en condiciones naturales Por tal motivo se recomienda realizar pruebas con un volumen de resuspensioacuten menor a 1 mL aun cuando se trate de un LC-MSMS triple cuadrupolo

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13

6 CONCLUSIONES

a Los moluscos de la regioacuten de Magallanes pueden presentar PTX2 YTX 45OHYTX DTX1 y SPX1

b El hecho que los moluscos puedan presentar dos o maacutes tipos de toxinas lipofiacutelicas dificulta establecer el nivel de toxicidad total

c P reticulatum en Magallanes produce YTXs al igual que la especie del norte y sur del paiacutes

d La abundancia relativa ambiental de P reticulatum durante el periodo de estudio coincidioacute con la presencia de YTXs en los moluscos

e Los SPXs encontrados anteriormente en caracoles piquilhue tambieacuten fue posible detectarlos en choritos durante este estudio

f Auacuten queda por confirmar el tipo de SPXs presentes y su eventual fuente primaria La presencia de SPXs en los moluscos no siempre coincidioacute con la presencia de A ostenfeldii en el ambiente y su abundancia relativa maacutexima fue solo de nivel 1 (raro) durante el periodo de estudio

g La PTX2 detectada en los moluscos coincidioacute con una alta abundancia relativa ambiental de D acuminata No obstante auacuten queda por confirmar si esta especie es la fuente primaria Para ello se hace necesario ajustar (disminuir) el volumen de dilucioacuten de los extractos secos de microalgas aisladas por micromanipulacioacuten aun cuando se trata de un espectroacutemetro de masas como un triple cuadrupolo

h La deteccioacuten de DTX1 en los moluscos coincidioacute con la ausencia de D acuta en el ambiente La toxina tampoco fue detectada en los moluscos cuando esta microalga estuvo a niveles de 2 y 3 (escaso y regular) Queda por confirmar la produccioacuten de DTX1 por esta especie en Magallanes

i No se encontraron PTX1 DTX2 ni AZPs en las muestras de moluscos durante el periodo de estudio

j Los resultados demuestran la presencia de toxinas en los moluscos que se hace necesario identificar y cuantificar utilizando teacutecnicas distintas al bioensayo

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(Dinophyceae) aislado desde la costa de Magallanes sur de Chile In Proceedings of Libro de resuacutemenes del XXXII Congreso de Ciencias del Mar Punta Arenas Chile 22-26 de Octubre 2012 p 228

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southeastern Pacific Ocean reveal a diverse but patchy distribution of phycotoxins Toxicon 58(5) 389ndash397

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F I G U R A

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Figura 1 Estaciones y sectores muestreados (ciacuterculo rojo) y sector Fortuna donde fue recolectado el

caracol piquilhue (ciacuterculo amarillo)

T A B L A S

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Tabla 1 Condiciones cromatograacuteficas para el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas usando

una columna de UPLC C18 en fase reversa y medio baacutesico

Columna Acquity UPLC BEH C18 17 microm 21x100 mm

Temperatura columna 45 ordmC

Flujo 04 mlmin

Volumen inyeccioacuten 5 microl

Temperatura muestras 10 plusmn 5 ordmC

Gradiente

Tiempo (min) Fase A () Fase B ()

0 75 25

066 75 25

330 5 95

528 5 95

726 75 25

900 75 25

Tabla 2 Paraacutemetros de la fuente de ionizacioacuten para el Xevo TQMS (Waters) en la determinacioacuten de toxinas lipofiacutelicas

PARAacuteMETROS DE LA FUENTE

ESI- ESI+

AO DTX2 DTX1 YTX homoYTX 45OH YTX y 45OH

homoYTX

AZA1 AZA2 AZA3 PTX2 PTX1 y SPX1

Voltaje de capilar (V) 100 200

Temperatura de solvatacioacuten (ordmC) 450 450

Flujo gas de solvatacioacuten (lh) 850 850

Flujo gas cono (lh) 50 50

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Tabla 3

Resumen de las condiciones de espectrometriacutea de masas empleadas con el Xevo TQMS (Waters) en el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas

Compuesto tR (min)

ESI

Ioacuten Precursor

(mz)

Ioacuten Producto

(mz)

Dwell time (s)

Energiacutea colisioacuten

(eV)

Voltaje cono (V)

AO 189 NEG 8035 2552 0010 46 86

113 0010 56 86

DTX2 210 NEG 8035 2552 0010 46 86

113 0010 56 86

DTX1 214 NEG 8175 5634 0010 43 86

2552 0010 48 86

YTX 202 NEG 5704 4674 0010 30 45

3963 0010 35 45

45OH-YTX 182 NEG 5784 4674 0010 30 45

3964 0010 30 45

HomoYTX 203 NEG 5775 4744 0010 30 48

4034 0010 30 48

45OH-homoYTX 182 NEG 5855 4034 0010 30 45

4744 0010 30 45

PTX1 306 POS 8925 8395 0015 25 36

8215 0015 25 36

PTX2 362 POS 8765 8415 0015 20 36

8235 0015 25 36

AZA1 263 POS 8425 6545 0015 55 50

3622 0015 50 50

AZA2 270 POS 8565 6725 0015 45 27

6545 0015 45 27

AZA3 236 POS 8285 6404 0015 55 47

3622 0015 55 47

SPX1 368 POS 6925 6744 0015 27 60

1643 0015 42 60 Transicioacuten cuantificadora

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Tabla 4 TRR y valores de tolerancia para las toxinas analizadas

TOXINA TRR TOLERANCIA

Toxinas del grupo de AO

AO 1000 0990-1010

DTX2 1040 1014-1066

DTX1 1140 1111-1168

Toxinas del grupo de PTX

PTX2 1000 0990-1010

PTX1 0850 0829-0871

Toxinas del grupo de YTX

YTX 1000 0990-1010

45OH-YTX 0894 0871-0916

Homo YTX 1000 0990-1010

45OH-homoYTX 0899 0876-0921

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Tabla 5 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de moluscos

Nordm estMes

recolectaLocalidad Molusco

cuerpo

enterohepat

gramos

carne

toxicidad

VDM ratoacuten

PTX2

(ugKg)

YTX

(ugKg)

45OHYTX

(ugKg)

DTX1

libre

(ugKg)

DTX1

total

(ugkg)

SPX 1

(ugKg)

M13 ene-13 E Peel chorito x 5086 + 01 02

M13 ene-13 E Peel ostioacuten x 5155 No real izado 16 21

M33 ene-13 B Bell chorito x 5253 + 04

M37 ene-13 B Agua Fresca chorito x 5039 + 05 01

M35 ene-13 C San Isidro chorito x 5289 + 000 01

M42 ene-13 V Holanda chorito x 5231 + 06 13

M43 ene-13 B Yendegaia chorito x 5193 + 04 25

M45 ene-13 Pto Williams chorito x 5161 - 28 07

M08 feb-13 E Falcon cholga x 5027 - 14

M09 feb-13 E Penguumlin cholga x 5103 + 14

M22 feb-13 E de las Montantildeas cholga x 5052 - 26

M23 feb-13 I Ballesteros cholga x 5204 - 87

M24 feb-13 B Fanny chorito x 2016 - 38 1071 479 12

M25 feb-13 E Silva Palma chorito x 1447 - 59 1077 898 09

M26 feb-13 E Wickham chorito x 1093 - 194 2940 2232 66 66

M27 feb-13 E Sullivan chorito x 1137 - 450 1944 1478

M28 feb-13 E Nuntildeez chorito x 1179 + 33 721 407

M29 feb-13 Cutter Cove chorito x 1003 - 65 501 309

M29N1 feb-13 I Engelfield chorito x 1116 - 297 2007 1483

M31 feb-13 B Nash chorito x 2231 +

M33 feb-13 B Bell chorito x 1181 - 93

M34 feb-13 S Pedro chorito x 0726 -

M35 feb-13 C San Isidro chorito x 1178 + 110

M36 feb-13 B Buena chorito x 1367 +

M37 feb-13 B Agua Fresca chorito x 0850 + 45 100 80

M39 feb-13 Pto Zenteno chorito x 3241 + 28

M39N2 feb-13 Pta San Valentin chorito x 1712 - 11

M39N3 feb-13 Pto Yartou chorito x 2035 - 11

sector

Fortunajul-12 B Inuacutetil

caracol

piquilhuex 107000 + 01

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Tabla 6 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de microalgas

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Tabla 7 Niveles actualmente permitidos por la legislacioacuten europea (bioensayo) y los niveles propuestos por la

autoridad europea para la seguridad alimentaria (EFSA) (Gerssen et al 2010)

Toxin Legislacioacuten (μg kg-

1) Proposicioacuten

EFSA (μg kg-1)

Validacioacuten LC-MSMS

(μg kg-1)

OA and DTXs 160 45

PTXs 120

YTXs 1000 3750

AZAs 160 32

SPXs 400 (Gerssen et al2010)

European Food Safety Authority Decisioacuten 2002657 de la Unioacuten Europea EC Incluye PTXs

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Tabla 8 Abundancia relativa ambiental de las microalgas al momento de recolectar las muestras de moluscos En rojo se indica la deteccioacuten de toxina positiva en los moluscos asociada a la supuesta microalga fuente PTXs (D

acuminata) YTXs (P reticulatum) SPXs (A ostenfeldii) DTX1 (A acuta)

(Tabla modificada de Guzmaacuten et al 2014)

A N E X O S

ANEXO 1

Certificacioacuten laboratorio INTECMAR

ANEXO 2

Lista de anaacutelisis que realiza INTECMAR y sus costos (en euros) 2013

scv 1 de 7

GUIA PARA LA AUTOLIQUIDACIOacuteN DE TASAS A FAVOR DE LA COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA 2013 Los aspectos financieros de los servicios prestados por Intecmar en el marco de su actividad e vienen regulados en la Ley 62003 de 9 de diciembre de tasas precios y exenciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia (DOG nuacutem 240 de 11122003) y fueron actualizados posteriormente en la Ley 142010 de 27 de diciembre de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2011 (DOG nuacutem 250 de 30122010) y en la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013 (DOG nuacutem 42 de 28022013) Existen dos maneras de liquidar las tasas correspondientes a los servicios prestados por Intecmar

1 De forma manual cubriendo el modelo A de autoliquidacioacuten que se descarga en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda y que adjunto en pdf y se lleva al banco para su pago httpwwwconselleriadefacendaeswebportalconfeccion-impresos

2 De forma telemaacutetica en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda viacutenculo httpshostcixtecesXEITObinlionwebXeitodllxmit a traveacutes del modelo 730

Ambos modelos de liquidacioacuten de tasas adjuntamos ejemplo al final de este documento deben ser remitidos por mail a Intecmar con el sello del banco fiacutesico o virtual como paso previo a la emisioacuten del certificado Los coacutedigos generales necesarios son

minus Consejeriacutea de Medio Rural y de Mar Coacutedigo 09 minus Delegacioacuten de Pontevedra Coacutedigo 40 minus Servicio de Intecmar Coacutedigo 24

Los coacutedigos y descripcioacuten de las tasas son los regulados en la legislacioacuten vigente y los hemos resumido en los anexos siguientes Vilaxoaacuten 4 de marzo de 2013

scv 2 de 7

TARIFAS DE TASAS VIGENTES PARA 2013 - Ley 22013 d e 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013

(DOG nuacutem 42 de 28022013)

Estas tarifas son consecuencia de la actualizacioacuten de las tarifas contenidas en los anexos 1 2 3 4 y 5 de la Ley 62003 del 9 de diciembre de tasas precios y exacciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia por la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 Seraacuten aplicables desde el diacutea de la entrada en vigor de la Ley de

presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 TASA POR SERVICIOS ADMINISTRATIVOS

No sujecioacuten No se exigiraacute la tasa por servicios administrativos cuando se trate de compulsas o cotejos de documentos que deban acompantildear a solicitudes escritos o comunicaciones presentadas por el ciudadano y realizadas en el aacutembito de actuacioacuten de los registros seguacuten lo dispuesto en el artiacuteculo 385 de la Ley 301992 del 26 de noviembre de reacutegimen juriacutedico de las administraciones puacuteblicas y del procedimiento administrativo comuacuten

Excepciones Estaraacuten exentos de la presente tasa

1- La expedicioacuten de certificados de retribuciones satisfechas por la Xunta de Galicia con el objeto de justificacioacuten en relacioacuten con el impuesto sobre la renta de las personas fiacutesicas

2- La expedicioacuten de certificados y compulsa que el personal de la Administracioacuten solicite respecto a las necesidades propias del puesto de trabajo o relacioacuten de servicios

3- Los alumnos por cualquier actuacioacuten en materia de ensentildeanzas no universitarias

scv 3 de 7

4- Las compulsas realizadas en las oficinas de empleo para los desempleados en la tramitacioacuten de expedientes que sean competencia de dichas oficinas

5 La inscripcioacuten en las convocatorias para a seleccioacuten de personal de la comunidad autoacutenoma despueacutes de justificacioacuten documental solicitada por

- Personas con discapacidad igual o superior al 33 - Personas que sean miembros de familias numerosas clasificadas en la

categoriacutea especial Se aplicaraacute una bonificacioacuten del 50 a la inscripcioacuten solicitada por - Personas que sean miembros de familias numerosas de categoriacutea

general - Personas que figurasen como demandantes de empleo desde por lo

menos seis meses antes a la fecha de la convocatoria de pruebas selectivas de personal en las que soliciten su participacioacuten y no esteacuten percibiendo prestacioacuten o subsidio por desempleo

6- La expedicioacuten de certificados relativos a la situacioacuten fiscal 7- El Estado y los demaacutes entes puacuteblicos territoriales o institucionales

siempre que los servicios o actividades de que sean beneficiarios se presten o se realicen en el marco del principio de colaboracioacuten entre administraciones

8- Las viacutectimas de actos terroristas asiacute como sus coacutenyuges y sus hijos por cualquier actuacioacuten en materia educativa realizada en centros oficiales de estudios en todos los niveles de ensentildeanza

9- Los miembros de los organismos consultivos de la Administracioacuten puacuteblica gallega respecto de los certificados emitidos por dichos organismos

COacuteDIGO TASAS

DESCRIPCIOacuteN IMPORTE euro

314400 Prestacioacuten de servicios en el Instituto Tecnoloacutegico para el Control del Medio Marino de Galicia

314401 Anaacutelisis de biotoxinas marinas en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de Yasumoto 1978 4752

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en rato segundo o meacutetodo de Yasumoto 1984 5432

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS)

9520 -Anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten

seguacuten el meacutetodo de la AOAC 4752

scv 4 de 7

-Anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo da AOAC 4752

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1978 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10186

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1984 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10865

-Anaacutelisis combinada en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS) anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo AOAC y anaacutelisis de toxicidad de tipo ASP por cromatografiacutea liquida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo de la AOAC 15000

314402 Anaacutelisis de muestras en agua de mar -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton marino mediante

microscopiacutea oacuteptica 15133 -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton toacutexico marino

mediante microscopiacutea oacuteptica 13333 - Anaacutelisis de carbono orgaacutenico disuelto 5093 -Anaacutelisis de nutrientes inorgaacutenicos disueltos 3500 -Anaacutelisis de pigmentos fotosinteacuteticos (clorofila ldquoardquo) por

espectrofluorimetria 1698 314403 Anaacutelisis microbioloacutegicos en moluscos y otros organismos

procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Cuantificacioacuten de E Coli 10186 - Deteccioacuten de Salmonella spp 16975 -Enumeracioacuten de Escherichia coli en moluscos bivalvos

vivos por la teacutecnica de medida directa de impedancia con el sistema BacTrac 4300 6800

314404 Anaacutelisis de contaminantes de origen quiacutemica en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Determinacioacuten de metales pesados (Pb Cd Cu Zn As Hg Ni Cr Ag) mediante espectrofotometriacutea de absorcioacuten atoacutemica por metal

6790

-Determinacioacuten de compuestos bifenilos policlorados (PCB) mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

scv 5 de 7

-Determinacioacuten de pesticidas organoclorados mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

-Determinacioacuten de hidrocarburos aromaacuteticos policiacuteclicos (HAPs) mediante cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de fluorescencia

28200

314405 Anaacutelisis histopatoloacutegica de moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Estudio hispatoloacutegico Determinacioacuten de Bonamia Marteillia Perkinsus y otras alteraciones patoloacutegicas

101852

314406 Emisioacuten de certificaciones e informes teacutecnicos y otras actuaciones a peticioacuten del interesado

Emisioacuten de certificados a peticioacuten de los interesados sobre las actuaciones llevadas a cabo por el Instituto

1000

Emisioacuten de informes teacutecnicos a peticioacuten del interesado (euros por hora o fraccioacuten)

4000

scv 6 de 7

scv 7 de 7

ANEXO 3

Resultados de anaacutelisis en muestras de microalgas anteriormente enviadas procedentes de Magallanes por el equipo de espectrometriacutea de masas utilizado por INTECMAR Trabajo presentado a las XXXII

Congreso de Ciencias del Mar realizado en Punta Arenas 22-25 octubre de 2012

PERFIL DE TOXINAS DE PROROCENTRUM LIMA (DINOPHYCEAE) AISLADO DESDE LA COSTA DE MAGALLANES SUR DE CHILE P Salgado1 G Pizarro1 JM Franco2 P Rioboacute2 e I Bravo3

1Instituto de Fomento Pesquero (IFOP) Punta Arenas Chile gemitapizarroifopcl 2Instituto de Investigaciones Marinas (CSIC) Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea 3Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea

Prorocentrum lima (Ehrenberg) es un dinoflagelado marino bentoacutenico que se encuentra adherido generalmente

sobre macroalgas sedimentos y detrito flotante y menos comuacutenmente en el plancton (Bravo et al 2001) Es una especie neriacutetica y estuarina y su rango de distribucioacuten geograacutefica variacutea desde aguas costeras tropicales a templadas (Faust 1991) La importancia de P lima se debe a que son productoras de toxinas diarreogeacutenicas en las personas (veneno diarreico de los mariscos VDM) al igual que algunas especies de Dinophysis aunque raramente se le han asociado con episodios toacutexicos por VDM por su caraacutecter epiacutefito y bentoacutenico El complejo VDM producido por P lima incluye moleacuteculas conocidas como el aacutecido okadaico (AO) y derivados dinofisistoxinas (DTX-1 DTX-2) (Bravo et al 2001 Vale et al 2009) No obstante existen casos citados para USA donde se detectoacute toxicidad por VDM en bivalvos de cultivos asociadas a P lima aunque en bajos niveles (Maranda et al 2007a) En Canadaacute tambieacuten se llevoacute a cabo un estudio en moluscos de cultivo cuya finalidad fue determinar el origen del VDM en la que P lima fue la principal especie sospechosa tras la ocurrencia de un evento toacutexico humano por VDM ocurrido en 1998 (Levasseur et al 2003) y en antildeos anteriores (Quilliam et al 1993) Aunque Levasseur et al (2003) no logroacute probar la toxicidad de los mariscos en cultivo a causa de P lima cabe hacer notar que lo que buscaron fue OA y DTX1 no DTX 3 este uacuteltimo principal derivado de las anteriores tras su transformacioacuten en los moluscos (eg Suzuki et al 1999 Vale amp Sampayo 2002)

En consecuencia el rol de P lima en eventos toacutexicos por VDM auacuten no puede descartarse por cuanto podriacutean llegar a ser importantes en ambientes turbulentos debido a la eventual remocioacuten de microalgas adheridas en sustratos por efecto de vientos (Levasseur et al 2003) factor de importancia si se trata de sedimentos o contrariamente en zonas someras y estables de cultivos de moluscos que al mismo tiempo favorecen microambientes para sustratos en los que prolifera la epiacutefita P lima (Lawrence et al 2000) quedando expuestas a re-suspensiones temporales que favorecen la filtracioacuten de estas microalgas por los bivalvos en cultivo (Maranda et al 2007a)

Chile posee escaso conocimiento sobre esta especie en su medio natural incluido su perfil de toxinas y potencial rol en la toxificacioacuten de moluscos por VDM Por tal razoacuten resultoacute interesante aportar al conocimiento de estos aspectos en muestras de sedimentos recolectadas en el estrecho de Magallanes en las que esta especie se encontroacute inhabitualmente abundante

Las ceacutelulas utilizadas en este estudio fueron aisladas desde sedimentos superficiales (0-3 cm) recolectados en el invierno de 2010 en la localidad de cabo San Isidro durante el muestreo regular del programa de monitoreo de marea roja en la regioacuten de Magallanes En esa oportunidad se logroacute cuantificar hasta 1002 quistes tecadoscm3 de Prorocentrum lima la mayor concentracioacuten respecto a otros sitios de recolecta (Fig 1) Los sedimentos de esta localidad presentaron una coloracioacuten oscura y un fuerte olor a sulfuro de hidroacutegeno (H2S) producto de anoxia local

Se aislaron entre 27 y 87 quistes tecados (Fig 1 a) directamente desde los sedimentos mientras otras 60 ceacutelulas vegetativas (Fig 1 b) fueron aisladas luego de promover la actividad y divisioacuten de los quistes en condiciones de 15 ordmC y un ciclo de luzoscuridad de 1212 horas (Tabla 1) Para este fin se aislaron quistes tecados y trasvasijaron a placas Petri de 5 cm de diaacutemetro conteniendo 5 mL de medio de cultivo L1 Para el anaacutelisis de toxinas las ceacutelulas aisladas fueron trasvasijadas a un tubo Eppendorf de 15 mL y congelados a -80 ordmC Una aliacutecuota de sedimento huacutemedo (100 microL aproximados) tambieacuten fue vaciada en un tubo Eppendorf y congelado Para extraer la toxina se antildeadioacute 500 microL de metanol 100 a cada tubo se mezcloacute por 1 min y filtroacute por 045 microm trasvasijando a un vial El extracto fue secado bajo nitroacutegeno gas a 40 ordmC y conservado a 4 ordmC hasta su anaacutelisis Previo al anaacutelisis de toxinas los extractos fueron resuspendidos en 150 microl de metanol

La presencia de la toxina dinofisistoxina 1 (DTX-1) en las muestras (Fig2) fue confirmada en modo negativo a traveacutes de su ioacuten precursor [M-H]- mz 8175 y sus iones productos mz 5634 y 2552 mediante un cromatoacutegrafo UPLC Acquity Waters acoplado a un triple cuadrupolo Waters Xevo TQ (LC-MS) La columna utilizada fue una Acquity UPLC BEH C18 17microm 21 x 100 mm a 45 ordmC La fase moacutevil consistioacute en (A) hidroacutexido amoacutenico a pH 11 y (B) hidroacutexido amoacutenico en acetonitrilo (67 mM) con una tasa de flujo de 4 mLmin El gradiente de elucioacuten utilizado fue el siguiente mantencioacuten al 75 de A entre 0 y 066 min cambio a 5 de A entre 066 y 330 min mantener 5

de A entre 330 y 528 min recuperacioacuten del 75 de A entre 528 y 726 min mantencioacuten al 75 de A hasta 9 min Se pinchoacute 5microL de muestra en el LC-MS El contenido de DTX-1 en las muestras fue cuantificado en base al ion precursor

Los tres tipos de muestras fueron positivas a la presencia de DTX-1 pero las ceacutelulas vegetativas fueron las que presentaron un mayor contenido de DTX-1 por ceacutelula La deteccioacuten de DTX-1 en los sedimentos (Tabla 2) reflejoacute la presencia de los quistes tecados en eacutestos

Figura 1 Concentraciones de quistes tecados de Prorocentrum lima (quistescm3 de sedimento huacutemedo) en estaciones de muestreo en el Estrecho de Magallanes (M26 Estero Wickham M29N1 Isla Engenfield M31 Bahiacutea Nash M35 Cabo San Isidro M39C1 Bahiacutea Gente Grande M39C2 Bahiacutea Inuacutetil M39C3 Canal Gabriel) y Canal Beagle (M41 Ventisquero Espantildea M42 Ventisquero Holanda) (a) Quistes tecados (b) ceacutelulas vegetativas obtenidas de germinacioacuten de quistes tecados bajo condiciones de laboratorio Barra de escala 20 microm

Tabla 1 Sedimento y ceacutelulas de Prorocentrum lima aisladas para anaacutelisis de toxinas

Extracto metanoacutelico Nordm de ceacutelulas TR ngmL pg DTX-1 ceacutel

G1 quistes tecados 27 213 lt2 -

G2 quistes tecados 67 214 05 11

G3 quistes tecados 87 215 12 21

G4 ceacutelulas vegetativas 60 215 34 87

G6 sedimentos aliacutecuota 213 13 19 pg microL sed

TR tiempo de retencioacuten

Figura 2 Cromatogramas de extractos metanoacutelicos de Prorocentrum lima quistes tecados (a) ceacutelulas vegetativas (b) y sedimentos (c)

Tabla 2 Caracteriacutesticas del sedimento con quistes tecados de Prorocentrum lima

Tipo Tamantildeo (mm)

Grava 2 35

Arena media 025 - 05 32

Arena muy fina 0063 - 0125 2

Limo-arcilla lt 0063 1

Estos resultados constituyen otra eventual posibilidad de toxicidad en los moluscos por VDM no soacutelo de aquellos con modalidad de vida bentoacutenica superficial sino de aquellos que tambieacuten viven enterrados en la arena (eg almeja huepo) Maacutes auacuten si se conoce que P lima posee la capacidad de desarrollar poblaciones naturales en aguas templadas en nuacutemeros que podriacutean justificar una toxicidad por VDM en los mariscos (eg Maranda et al 2007a b)

Referencias

Bravo I ML Fernaacutendez I Ramilo amp A Martinez 2001 Toxin composition of the toxic dinofagellate Prorocentrum lima isolated from different locations along the Galician coast (NW Spain) Toxicon 39 1537ndash1545

Faust MA 1991 Morphology of ciguatera-causing Prorocentrum lima (Pyrrophyta) from widely differing sites J Phycol 27 642-648

Lawrence J E Grant J Quilliam M A Bauder A G amp Cembella A D 2000 Colonizaition and growth of the toxic dinoflagellate Prorocentrum lima and associated fouling macroalgae on mussels in suspended culture Mar Ecol Prog Ser 201 147-154

Levasseur M Couture J Y Weise A M Michaud S Elbrachter M Sauveacute G amp Bonneau E 2003 Pelagic and epiphytic summer distributions of Prorocentrum lima and P mexicanum at two mussel farms in the Gulf of St Lawrence Aquat Microbiol Ecol 30283-293

Maranda L Corwin S Dover S amp Morton S L 2007a Prorocentrum lima (Dinophyceae) in northeastern USA coastal waters II Toxin load in the epibiota and in shellfish Harmful Algae 6 632-641

Maranda L Corwin S Hargraves P E 2007b Prorocentrum lima (Dinophyceae) in 19 northeastern USA coastal waters I Abundance and distribution Harmful Algae 6 623ndash631

Quilliam MA Gilgan MW amp Pleasance S 1993 Confirmation of an incident of diarrhetic shellfish poisoning in eastern Canada In Smayda TJ Shimizu Y (Eds) Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea Elsevier New York pp 547ndash552

Suzuki T Ota H amp Yamasaki M 1999 Direct evidence of transformation of dinophysistoxin-1 to 7-O-acyl-dinophysistoxin-1 (Dinophysis-3) in the scallop Patinopecten yessoensis Toxicon 37 187-198

Vale P amp Sampayo M A 2002 First confirmation of human diarrhoeic poisonings by okadaic acid esters after ingestion of razor clams (Solen marginatus) and green crabs (Carcinus maenas) in Aveiro lagoon Portugal and detection of okadaic acid esters in phytoplankton Toxicon 40989-996

Vale P Veloso V amp Amorim A 2009 Toxin composition of a Prorocentrum lima strain isolated from the Portuguese coast Toxicon 54145ndash152

Agradecimientos Intecmar de la Xunta de Galicia Espantildea donde se realizaron los anaacutelisis de toxinas proyecto

SUBPESCA ldquoManejo y Monitoreo de Mareas Rojas en las regiones de Los Lagos Ayseacuten y Magallanes IV etapa 2010rdquo

ANEXO 4

Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten

ANEXO 5

Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de Magallanes

TASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

O

EJE

MP

LA

R P

AR

A E

L IN

TE

RE

SA

DO

LIQ

UID

AC

IOacuteN

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

EN

TID

AD

BA

NC

AR

IATASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

0 9

4 0

2 4INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

AD

MIN

IST

RA

CIOacute

NTASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

9520 euros

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

CONSELLERIA DE FACENDA

ANEXO 6

Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para cierre

de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

Seccioacuten Ediciones y Produccioacuten Almte Manuel Blanco Encalada 839

Fono 56-32-2151500 Valparaiacuteso Chile

wwwifopcl

Page 17: “Análisis de toxinas lipofílicas mediante LC-MS/MS en ...metadatos.mma.gob.cl/sinia/Informe_final_Analisis_toxinas_lipofilicas_656-055.pdfSUBSECRETARÍA DE ECONOMÍA: INFORME FINAL:

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo

10

homoYTX y en uno de ellos tambieacuten se detectoacute aunque miacutenimamente 45OHYTX un derivado de la YTX que normalmente se encuentra en los moluscos como producto de bio-transformacioacuten La presencia de 45OHYTX en el cultivo pudo deberse a la presencia de ceacutelulas ya en fase de declinacioacuten de la curva de crecimiento

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo

11

5 ANAacuteLISIS Y DISCUSIOacuteN DE LOS DATOS

51 Toxinas en moluscos De las toxinas lipofiacutelicas se sabe que AO DTXs y AZAs causan trastornos gastrointestinales en los seres humanos (Gerssen et al 2010) Para las toxinas restantes (YTXs PTXs y SPXs) auacuten cuando no se han reportado casos de intoxicacioacuten en los seres humanos eacutestas son letales o altamente toacutexicas cuando los ratones son inyectados por viacutea intraperitoneal (Paz et al 2008 Richard et al 2000 Miles et al 2004) Es el caso de los SPXs la toxicidad en ratones inyectados por viacutea intraperitoneal supera a la del resto de las toxinas pues su dosis letal 50 es de 40 microg kg-1 (Richard et al 2000) Tal es asiacute que como referencia (Tabla 5) el transvector caracol piquilhue recolectadas en Julio de 2012 y cuyos niveles de toxicidad provocaron la muerte de los ratones solo presentoacute 01 microg kg-1 deteccioacuten que fue realizada durante este estudio en muestras de carne almacenadas durante no maacutes de 1 antildeo a -20 ordmC Sin embargo no se puede descartar una peacuterdida de la actividad por transformacioacuten durante el periodo de conservacioacuten A excepcioacuten de los SPXs el resto de las toxinas mencionadas estaacuten reguladas por la legislacioacuten europea tanto para consumo interno como importacioacuten de moluscos y tunicados para garantizar la salud de las personas Asiacute tambieacuten estaacuten reguladas por la legislacioacuten chilena a traveacutes del Instituto de Salud Puacuteblica (ISP) estableciendo los mismos niveles de referencia europeo en base al bioensayo ratoacuten Aun cuando los niveles de toxinas detectadas en los moluscos durante este estudio estaacuten por debajo de lo exigido por las regulaciones e incluso de los niveles propuestos por el EFSA (Tabla 7) la presencia de dos y tres tipos de toxinas en los moluscos representa una complejidad en la determinacioacuten de los niveles de toxicidad especialmente si se encuentran presentes toxinas altamente toacutexicas para ratones inyectados intraperitonealmente como son los SPXs Aunque se sospechaba la concurrencia de diferentes tipos de toxinas tal hecho no habiacutea sido confirmado anteriormente Sin embargo los SPXs siguen siendo una incoacutegnita pues se desconoce la fuente de estas toxinas A ostenfeldii la especie que podriacutea ser candidata a confirmar estuvo ausente (Tabla 8 modificado de Guzmaacuten et al 2014) durante el periodo en que se detectoacute en los moluscos Los escasos antecedentes toxigeacutenicos de esta especie en Chile la han confirmado como productora de toxinas paralizantes en Ayseacuten (Pizarro et al 2012) pero no de SPXs No obstante la produccioacuten de SPXs por esta especie en la regioacuten de Magallanes auacuten no se puede descartar Las YTXs fueron las toxinas maacutes abundantes en los moluscos analizados condicioacuten que se corresponde con la alta abundancia relativa de esta especie en el ambiente (Tabla 8) en la mayoriacutea de los casos (Tabla 5)

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Los resultados sugieren que los falsos positivos por bioensayo ratoacuten pudieran ser maacutes frecuentes de lo que se piensa actualmente para la regioacuten de Magallanes 52 Toxinas en microalgas Los resultados indican que P reticulatum encontrado en Magallanes producen YTXs al igual que las especies reportadas en la regioacuten de Antofagasta y Ayseacuten (Aacutelvarez et al 2011 Pizarro et al 2012) Tal resultado hace altamente probable que esta especie es la fuente de YTXs detectadas en los moluscos durante el periodo de estudio De acuerdo a las toxinas detectadas en las muestras de D acuminata aisladas asiacute como en el fitoplancton con gran abundancia de esta especie (Tabla 8) sugiere que esta microalga podriacutea ser una fuente primaria de PTXs tal como ocurre en el norte y sur del paiacutes (Blanco et al 2007 Fux et al 2011) Aunque la especie tambieacuten ha sido asociada a la presencia de DTX1 en moluscos en un evento toacutexico ocurrido en 1998 en Magallanes (Uribe et al 2001) el DTX1 no fue detectado en las muestras de D acuminata durante este estudio El no hallazgo de DTX1 en estas muestras pudo deberse a una fuente microalgal distinta como D acuta yo P lima D acuta ha sido asociada a DTX1 en moluscos de la regioacuten de Ayseacuten (Lembeye et al 1993 y Zhao et al 1993) mientras que P lima es productora solo de DTX1 en la regioacuten de Magallanes (Salgado et al 2012) Sin embargo cuando se detectoacute DTX1 en las muestras de moluscos durante este estudio D acuta estuvo ausente en las muestras de agua mientras que D acuminata presentoacute una abundancia relativa alta Por otro lado el volumen de resuspensioacuten de los extractos pudo ser elevado al seguir el mismo procedimiento protocolar que se aplica a las muestras de moluscos de acuerdo a la normativa europea actual Por tal razoacuten el LC-MSMS no logroacute detectar PTXs ni DTX1 en las muestras de microalgas En estos casos un protocolo para el anaacutelisis de las microalgas debiera incluir un volumen menor de resuspensioacuten de los extractos secos en referencia al utilizado para los moluscos o bien seleccionar por micromanipulacioacuten un nuacutemero mayor de microalgas (gt 130 ceacutelulas) Sin embargo esto uacuteltimo es maacutes difiacutecil de lograr en latitudes australes debido a la baja densidad de ceacutelulas en las que se presenta normalmente esta especie en condiciones naturales Por tal motivo se recomienda realizar pruebas con un volumen de resuspensioacuten menor a 1 mL aun cuando se trate de un LC-MSMS triple cuadrupolo

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13

6 CONCLUSIONES

a Los moluscos de la regioacuten de Magallanes pueden presentar PTX2 YTX 45OHYTX DTX1 y SPX1

b El hecho que los moluscos puedan presentar dos o maacutes tipos de toxinas lipofiacutelicas dificulta establecer el nivel de toxicidad total

c P reticulatum en Magallanes produce YTXs al igual que la especie del norte y sur del paiacutes

d La abundancia relativa ambiental de P reticulatum durante el periodo de estudio coincidioacute con la presencia de YTXs en los moluscos

e Los SPXs encontrados anteriormente en caracoles piquilhue tambieacuten fue posible detectarlos en choritos durante este estudio

f Auacuten queda por confirmar el tipo de SPXs presentes y su eventual fuente primaria La presencia de SPXs en los moluscos no siempre coincidioacute con la presencia de A ostenfeldii en el ambiente y su abundancia relativa maacutexima fue solo de nivel 1 (raro) durante el periodo de estudio

g La PTX2 detectada en los moluscos coincidioacute con una alta abundancia relativa ambiental de D acuminata No obstante auacuten queda por confirmar si esta especie es la fuente primaria Para ello se hace necesario ajustar (disminuir) el volumen de dilucioacuten de los extractos secos de microalgas aisladas por micromanipulacioacuten aun cuando se trata de un espectroacutemetro de masas como un triple cuadrupolo

h La deteccioacuten de DTX1 en los moluscos coincidioacute con la ausencia de D acuta en el ambiente La toxina tampoco fue detectada en los moluscos cuando esta microalga estuvo a niveles de 2 y 3 (escaso y regular) Queda por confirmar la produccioacuten de DTX1 por esta especie en Magallanes

i No se encontraron PTX1 DTX2 ni AZPs en las muestras de moluscos durante el periodo de estudio

j Los resultados demuestran la presencia de toxinas en los moluscos que se hace necesario identificar y cuantificar utilizando teacutecnicas distintas al bioensayo

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(Dinophyceae) aislado desde la costa de Magallanes sur de Chile In Proceedings of Libro de resuacutemenes del XXXII Congreso de Ciencias del Mar Punta Arenas Chile 22-26 de Octubre 2012 p 228

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southeastern Pacific Ocean reveal a diverse but patchy distribution of phycotoxins Toxicon 58(5) 389ndash397

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F I G U R A

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Figura 1 Estaciones y sectores muestreados (ciacuterculo rojo) y sector Fortuna donde fue recolectado el

caracol piquilhue (ciacuterculo amarillo)

T A B L A S

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Tabla 1 Condiciones cromatograacuteficas para el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas usando

una columna de UPLC C18 en fase reversa y medio baacutesico

Columna Acquity UPLC BEH C18 17 microm 21x100 mm

Temperatura columna 45 ordmC

Flujo 04 mlmin

Volumen inyeccioacuten 5 microl

Temperatura muestras 10 plusmn 5 ordmC

Gradiente

Tiempo (min) Fase A () Fase B ()

0 75 25

066 75 25

330 5 95

528 5 95

726 75 25

900 75 25

Tabla 2 Paraacutemetros de la fuente de ionizacioacuten para el Xevo TQMS (Waters) en la determinacioacuten de toxinas lipofiacutelicas

PARAacuteMETROS DE LA FUENTE

ESI- ESI+

AO DTX2 DTX1 YTX homoYTX 45OH YTX y 45OH

homoYTX

AZA1 AZA2 AZA3 PTX2 PTX1 y SPX1

Voltaje de capilar (V) 100 200

Temperatura de solvatacioacuten (ordmC) 450 450

Flujo gas de solvatacioacuten (lh) 850 850

Flujo gas cono (lh) 50 50

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Tabla 3

Resumen de las condiciones de espectrometriacutea de masas empleadas con el Xevo TQMS (Waters) en el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas

Compuesto tR (min)

ESI

Ioacuten Precursor

(mz)

Ioacuten Producto

(mz)

Dwell time (s)

Energiacutea colisioacuten

(eV)

Voltaje cono (V)

AO 189 NEG 8035 2552 0010 46 86

113 0010 56 86

DTX2 210 NEG 8035 2552 0010 46 86

113 0010 56 86

DTX1 214 NEG 8175 5634 0010 43 86

2552 0010 48 86

YTX 202 NEG 5704 4674 0010 30 45

3963 0010 35 45

45OH-YTX 182 NEG 5784 4674 0010 30 45

3964 0010 30 45

HomoYTX 203 NEG 5775 4744 0010 30 48

4034 0010 30 48

45OH-homoYTX 182 NEG 5855 4034 0010 30 45

4744 0010 30 45

PTX1 306 POS 8925 8395 0015 25 36

8215 0015 25 36

PTX2 362 POS 8765 8415 0015 20 36

8235 0015 25 36

AZA1 263 POS 8425 6545 0015 55 50

3622 0015 50 50

AZA2 270 POS 8565 6725 0015 45 27

6545 0015 45 27

AZA3 236 POS 8285 6404 0015 55 47

3622 0015 55 47

SPX1 368 POS 6925 6744 0015 27 60

1643 0015 42 60 Transicioacuten cuantificadora

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Tabla 4 TRR y valores de tolerancia para las toxinas analizadas

TOXINA TRR TOLERANCIA

Toxinas del grupo de AO

AO 1000 0990-1010

DTX2 1040 1014-1066

DTX1 1140 1111-1168

Toxinas del grupo de PTX

PTX2 1000 0990-1010

PTX1 0850 0829-0871

Toxinas del grupo de YTX

YTX 1000 0990-1010

45OH-YTX 0894 0871-0916

Homo YTX 1000 0990-1010

45OH-homoYTX 0899 0876-0921

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Tabla 5 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de moluscos

Nordm estMes

recolectaLocalidad Molusco

cuerpo

enterohepat

gramos

carne

toxicidad

VDM ratoacuten

PTX2

(ugKg)

YTX

(ugKg)

45OHYTX

(ugKg)

DTX1

libre

(ugKg)

DTX1

total

(ugkg)

SPX 1

(ugKg)

M13 ene-13 E Peel chorito x 5086 + 01 02

M13 ene-13 E Peel ostioacuten x 5155 No real izado 16 21

M33 ene-13 B Bell chorito x 5253 + 04

M37 ene-13 B Agua Fresca chorito x 5039 + 05 01

M35 ene-13 C San Isidro chorito x 5289 + 000 01

M42 ene-13 V Holanda chorito x 5231 + 06 13

M43 ene-13 B Yendegaia chorito x 5193 + 04 25

M45 ene-13 Pto Williams chorito x 5161 - 28 07

M08 feb-13 E Falcon cholga x 5027 - 14

M09 feb-13 E Penguumlin cholga x 5103 + 14

M22 feb-13 E de las Montantildeas cholga x 5052 - 26

M23 feb-13 I Ballesteros cholga x 5204 - 87

M24 feb-13 B Fanny chorito x 2016 - 38 1071 479 12

M25 feb-13 E Silva Palma chorito x 1447 - 59 1077 898 09

M26 feb-13 E Wickham chorito x 1093 - 194 2940 2232 66 66

M27 feb-13 E Sullivan chorito x 1137 - 450 1944 1478

M28 feb-13 E Nuntildeez chorito x 1179 + 33 721 407

M29 feb-13 Cutter Cove chorito x 1003 - 65 501 309

M29N1 feb-13 I Engelfield chorito x 1116 - 297 2007 1483

M31 feb-13 B Nash chorito x 2231 +

M33 feb-13 B Bell chorito x 1181 - 93

M34 feb-13 S Pedro chorito x 0726 -

M35 feb-13 C San Isidro chorito x 1178 + 110

M36 feb-13 B Buena chorito x 1367 +

M37 feb-13 B Agua Fresca chorito x 0850 + 45 100 80

M39 feb-13 Pto Zenteno chorito x 3241 + 28

M39N2 feb-13 Pta San Valentin chorito x 1712 - 11

M39N3 feb-13 Pto Yartou chorito x 2035 - 11

sector

Fortunajul-12 B Inuacutetil

caracol

piquilhuex 107000 + 01

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Tabla 6 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de microalgas

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Tabla 7 Niveles actualmente permitidos por la legislacioacuten europea (bioensayo) y los niveles propuestos por la

autoridad europea para la seguridad alimentaria (EFSA) (Gerssen et al 2010)

Toxin Legislacioacuten (μg kg-

1) Proposicioacuten

EFSA (μg kg-1)

Validacioacuten LC-MSMS

(μg kg-1)

OA and DTXs 160 45

PTXs 120

YTXs 1000 3750

AZAs 160 32

SPXs 400 (Gerssen et al2010)

European Food Safety Authority Decisioacuten 2002657 de la Unioacuten Europea EC Incluye PTXs

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Tabla 8 Abundancia relativa ambiental de las microalgas al momento de recolectar las muestras de moluscos En rojo se indica la deteccioacuten de toxina positiva en los moluscos asociada a la supuesta microalga fuente PTXs (D

acuminata) YTXs (P reticulatum) SPXs (A ostenfeldii) DTX1 (A acuta)

(Tabla modificada de Guzmaacuten et al 2014)

A N E X O S

ANEXO 1

Certificacioacuten laboratorio INTECMAR

ANEXO 2

Lista de anaacutelisis que realiza INTECMAR y sus costos (en euros) 2013

scv 1 de 7

GUIA PARA LA AUTOLIQUIDACIOacuteN DE TASAS A FAVOR DE LA COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA 2013 Los aspectos financieros de los servicios prestados por Intecmar en el marco de su actividad e vienen regulados en la Ley 62003 de 9 de diciembre de tasas precios y exenciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia (DOG nuacutem 240 de 11122003) y fueron actualizados posteriormente en la Ley 142010 de 27 de diciembre de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2011 (DOG nuacutem 250 de 30122010) y en la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013 (DOG nuacutem 42 de 28022013) Existen dos maneras de liquidar las tasas correspondientes a los servicios prestados por Intecmar

1 De forma manual cubriendo el modelo A de autoliquidacioacuten que se descarga en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda y que adjunto en pdf y se lleva al banco para su pago httpwwwconselleriadefacendaeswebportalconfeccion-impresos

2 De forma telemaacutetica en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda viacutenculo httpshostcixtecesXEITObinlionwebXeitodllxmit a traveacutes del modelo 730

Ambos modelos de liquidacioacuten de tasas adjuntamos ejemplo al final de este documento deben ser remitidos por mail a Intecmar con el sello del banco fiacutesico o virtual como paso previo a la emisioacuten del certificado Los coacutedigos generales necesarios son

minus Consejeriacutea de Medio Rural y de Mar Coacutedigo 09 minus Delegacioacuten de Pontevedra Coacutedigo 40 minus Servicio de Intecmar Coacutedigo 24

Los coacutedigos y descripcioacuten de las tasas son los regulados en la legislacioacuten vigente y los hemos resumido en los anexos siguientes Vilaxoaacuten 4 de marzo de 2013

scv 2 de 7

TARIFAS DE TASAS VIGENTES PARA 2013 - Ley 22013 d e 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013

(DOG nuacutem 42 de 28022013)

Estas tarifas son consecuencia de la actualizacioacuten de las tarifas contenidas en los anexos 1 2 3 4 y 5 de la Ley 62003 del 9 de diciembre de tasas precios y exacciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia por la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 Seraacuten aplicables desde el diacutea de la entrada en vigor de la Ley de

presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 TASA POR SERVICIOS ADMINISTRATIVOS

No sujecioacuten No se exigiraacute la tasa por servicios administrativos cuando se trate de compulsas o cotejos de documentos que deban acompantildear a solicitudes escritos o comunicaciones presentadas por el ciudadano y realizadas en el aacutembito de actuacioacuten de los registros seguacuten lo dispuesto en el artiacuteculo 385 de la Ley 301992 del 26 de noviembre de reacutegimen juriacutedico de las administraciones puacuteblicas y del procedimiento administrativo comuacuten

Excepciones Estaraacuten exentos de la presente tasa

1- La expedicioacuten de certificados de retribuciones satisfechas por la Xunta de Galicia con el objeto de justificacioacuten en relacioacuten con el impuesto sobre la renta de las personas fiacutesicas

2- La expedicioacuten de certificados y compulsa que el personal de la Administracioacuten solicite respecto a las necesidades propias del puesto de trabajo o relacioacuten de servicios

3- Los alumnos por cualquier actuacioacuten en materia de ensentildeanzas no universitarias

scv 3 de 7

4- Las compulsas realizadas en las oficinas de empleo para los desempleados en la tramitacioacuten de expedientes que sean competencia de dichas oficinas

5 La inscripcioacuten en las convocatorias para a seleccioacuten de personal de la comunidad autoacutenoma despueacutes de justificacioacuten documental solicitada por

- Personas con discapacidad igual o superior al 33 - Personas que sean miembros de familias numerosas clasificadas en la

categoriacutea especial Se aplicaraacute una bonificacioacuten del 50 a la inscripcioacuten solicitada por - Personas que sean miembros de familias numerosas de categoriacutea

general - Personas que figurasen como demandantes de empleo desde por lo

menos seis meses antes a la fecha de la convocatoria de pruebas selectivas de personal en las que soliciten su participacioacuten y no esteacuten percibiendo prestacioacuten o subsidio por desempleo

6- La expedicioacuten de certificados relativos a la situacioacuten fiscal 7- El Estado y los demaacutes entes puacuteblicos territoriales o institucionales

siempre que los servicios o actividades de que sean beneficiarios se presten o se realicen en el marco del principio de colaboracioacuten entre administraciones

8- Las viacutectimas de actos terroristas asiacute como sus coacutenyuges y sus hijos por cualquier actuacioacuten en materia educativa realizada en centros oficiales de estudios en todos los niveles de ensentildeanza

9- Los miembros de los organismos consultivos de la Administracioacuten puacuteblica gallega respecto de los certificados emitidos por dichos organismos

COacuteDIGO TASAS

DESCRIPCIOacuteN IMPORTE euro

314400 Prestacioacuten de servicios en el Instituto Tecnoloacutegico para el Control del Medio Marino de Galicia

314401 Anaacutelisis de biotoxinas marinas en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de Yasumoto 1978 4752

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en rato segundo o meacutetodo de Yasumoto 1984 5432

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS)

9520 -Anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten

seguacuten el meacutetodo de la AOAC 4752

scv 4 de 7

-Anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo da AOAC 4752

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1978 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10186

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1984 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10865

-Anaacutelisis combinada en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS) anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo AOAC y anaacutelisis de toxicidad de tipo ASP por cromatografiacutea liquida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo de la AOAC 15000

314402 Anaacutelisis de muestras en agua de mar -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton marino mediante

microscopiacutea oacuteptica 15133 -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton toacutexico marino

mediante microscopiacutea oacuteptica 13333 - Anaacutelisis de carbono orgaacutenico disuelto 5093 -Anaacutelisis de nutrientes inorgaacutenicos disueltos 3500 -Anaacutelisis de pigmentos fotosinteacuteticos (clorofila ldquoardquo) por

espectrofluorimetria 1698 314403 Anaacutelisis microbioloacutegicos en moluscos y otros organismos

procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Cuantificacioacuten de E Coli 10186 - Deteccioacuten de Salmonella spp 16975 -Enumeracioacuten de Escherichia coli en moluscos bivalvos

vivos por la teacutecnica de medida directa de impedancia con el sistema BacTrac 4300 6800

314404 Anaacutelisis de contaminantes de origen quiacutemica en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Determinacioacuten de metales pesados (Pb Cd Cu Zn As Hg Ni Cr Ag) mediante espectrofotometriacutea de absorcioacuten atoacutemica por metal

6790

-Determinacioacuten de compuestos bifenilos policlorados (PCB) mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

scv 5 de 7

-Determinacioacuten de pesticidas organoclorados mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

-Determinacioacuten de hidrocarburos aromaacuteticos policiacuteclicos (HAPs) mediante cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de fluorescencia

28200

314405 Anaacutelisis histopatoloacutegica de moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Estudio hispatoloacutegico Determinacioacuten de Bonamia Marteillia Perkinsus y otras alteraciones patoloacutegicas

101852

314406 Emisioacuten de certificaciones e informes teacutecnicos y otras actuaciones a peticioacuten del interesado

Emisioacuten de certificados a peticioacuten de los interesados sobre las actuaciones llevadas a cabo por el Instituto

1000

Emisioacuten de informes teacutecnicos a peticioacuten del interesado (euros por hora o fraccioacuten)

4000

scv 6 de 7

scv 7 de 7

ANEXO 3

Resultados de anaacutelisis en muestras de microalgas anteriormente enviadas procedentes de Magallanes por el equipo de espectrometriacutea de masas utilizado por INTECMAR Trabajo presentado a las XXXII

Congreso de Ciencias del Mar realizado en Punta Arenas 22-25 octubre de 2012

PERFIL DE TOXINAS DE PROROCENTRUM LIMA (DINOPHYCEAE) AISLADO DESDE LA COSTA DE MAGALLANES SUR DE CHILE P Salgado1 G Pizarro1 JM Franco2 P Rioboacute2 e I Bravo3

1Instituto de Fomento Pesquero (IFOP) Punta Arenas Chile gemitapizarroifopcl 2Instituto de Investigaciones Marinas (CSIC) Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea 3Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea

Prorocentrum lima (Ehrenberg) es un dinoflagelado marino bentoacutenico que se encuentra adherido generalmente

sobre macroalgas sedimentos y detrito flotante y menos comuacutenmente en el plancton (Bravo et al 2001) Es una especie neriacutetica y estuarina y su rango de distribucioacuten geograacutefica variacutea desde aguas costeras tropicales a templadas (Faust 1991) La importancia de P lima se debe a que son productoras de toxinas diarreogeacutenicas en las personas (veneno diarreico de los mariscos VDM) al igual que algunas especies de Dinophysis aunque raramente se le han asociado con episodios toacutexicos por VDM por su caraacutecter epiacutefito y bentoacutenico El complejo VDM producido por P lima incluye moleacuteculas conocidas como el aacutecido okadaico (AO) y derivados dinofisistoxinas (DTX-1 DTX-2) (Bravo et al 2001 Vale et al 2009) No obstante existen casos citados para USA donde se detectoacute toxicidad por VDM en bivalvos de cultivos asociadas a P lima aunque en bajos niveles (Maranda et al 2007a) En Canadaacute tambieacuten se llevoacute a cabo un estudio en moluscos de cultivo cuya finalidad fue determinar el origen del VDM en la que P lima fue la principal especie sospechosa tras la ocurrencia de un evento toacutexico humano por VDM ocurrido en 1998 (Levasseur et al 2003) y en antildeos anteriores (Quilliam et al 1993) Aunque Levasseur et al (2003) no logroacute probar la toxicidad de los mariscos en cultivo a causa de P lima cabe hacer notar que lo que buscaron fue OA y DTX1 no DTX 3 este uacuteltimo principal derivado de las anteriores tras su transformacioacuten en los moluscos (eg Suzuki et al 1999 Vale amp Sampayo 2002)

En consecuencia el rol de P lima en eventos toacutexicos por VDM auacuten no puede descartarse por cuanto podriacutean llegar a ser importantes en ambientes turbulentos debido a la eventual remocioacuten de microalgas adheridas en sustratos por efecto de vientos (Levasseur et al 2003) factor de importancia si se trata de sedimentos o contrariamente en zonas someras y estables de cultivos de moluscos que al mismo tiempo favorecen microambientes para sustratos en los que prolifera la epiacutefita P lima (Lawrence et al 2000) quedando expuestas a re-suspensiones temporales que favorecen la filtracioacuten de estas microalgas por los bivalvos en cultivo (Maranda et al 2007a)

Chile posee escaso conocimiento sobre esta especie en su medio natural incluido su perfil de toxinas y potencial rol en la toxificacioacuten de moluscos por VDM Por tal razoacuten resultoacute interesante aportar al conocimiento de estos aspectos en muestras de sedimentos recolectadas en el estrecho de Magallanes en las que esta especie se encontroacute inhabitualmente abundante

Las ceacutelulas utilizadas en este estudio fueron aisladas desde sedimentos superficiales (0-3 cm) recolectados en el invierno de 2010 en la localidad de cabo San Isidro durante el muestreo regular del programa de monitoreo de marea roja en la regioacuten de Magallanes En esa oportunidad se logroacute cuantificar hasta 1002 quistes tecadoscm3 de Prorocentrum lima la mayor concentracioacuten respecto a otros sitios de recolecta (Fig 1) Los sedimentos de esta localidad presentaron una coloracioacuten oscura y un fuerte olor a sulfuro de hidroacutegeno (H2S) producto de anoxia local

Se aislaron entre 27 y 87 quistes tecados (Fig 1 a) directamente desde los sedimentos mientras otras 60 ceacutelulas vegetativas (Fig 1 b) fueron aisladas luego de promover la actividad y divisioacuten de los quistes en condiciones de 15 ordmC y un ciclo de luzoscuridad de 1212 horas (Tabla 1) Para este fin se aislaron quistes tecados y trasvasijaron a placas Petri de 5 cm de diaacutemetro conteniendo 5 mL de medio de cultivo L1 Para el anaacutelisis de toxinas las ceacutelulas aisladas fueron trasvasijadas a un tubo Eppendorf de 15 mL y congelados a -80 ordmC Una aliacutecuota de sedimento huacutemedo (100 microL aproximados) tambieacuten fue vaciada en un tubo Eppendorf y congelado Para extraer la toxina se antildeadioacute 500 microL de metanol 100 a cada tubo se mezcloacute por 1 min y filtroacute por 045 microm trasvasijando a un vial El extracto fue secado bajo nitroacutegeno gas a 40 ordmC y conservado a 4 ordmC hasta su anaacutelisis Previo al anaacutelisis de toxinas los extractos fueron resuspendidos en 150 microl de metanol

La presencia de la toxina dinofisistoxina 1 (DTX-1) en las muestras (Fig2) fue confirmada en modo negativo a traveacutes de su ioacuten precursor [M-H]- mz 8175 y sus iones productos mz 5634 y 2552 mediante un cromatoacutegrafo UPLC Acquity Waters acoplado a un triple cuadrupolo Waters Xevo TQ (LC-MS) La columna utilizada fue una Acquity UPLC BEH C18 17microm 21 x 100 mm a 45 ordmC La fase moacutevil consistioacute en (A) hidroacutexido amoacutenico a pH 11 y (B) hidroacutexido amoacutenico en acetonitrilo (67 mM) con una tasa de flujo de 4 mLmin El gradiente de elucioacuten utilizado fue el siguiente mantencioacuten al 75 de A entre 0 y 066 min cambio a 5 de A entre 066 y 330 min mantener 5

de A entre 330 y 528 min recuperacioacuten del 75 de A entre 528 y 726 min mantencioacuten al 75 de A hasta 9 min Se pinchoacute 5microL de muestra en el LC-MS El contenido de DTX-1 en las muestras fue cuantificado en base al ion precursor

Los tres tipos de muestras fueron positivas a la presencia de DTX-1 pero las ceacutelulas vegetativas fueron las que presentaron un mayor contenido de DTX-1 por ceacutelula La deteccioacuten de DTX-1 en los sedimentos (Tabla 2) reflejoacute la presencia de los quistes tecados en eacutestos

Figura 1 Concentraciones de quistes tecados de Prorocentrum lima (quistescm3 de sedimento huacutemedo) en estaciones de muestreo en el Estrecho de Magallanes (M26 Estero Wickham M29N1 Isla Engenfield M31 Bahiacutea Nash M35 Cabo San Isidro M39C1 Bahiacutea Gente Grande M39C2 Bahiacutea Inuacutetil M39C3 Canal Gabriel) y Canal Beagle (M41 Ventisquero Espantildea M42 Ventisquero Holanda) (a) Quistes tecados (b) ceacutelulas vegetativas obtenidas de germinacioacuten de quistes tecados bajo condiciones de laboratorio Barra de escala 20 microm

Tabla 1 Sedimento y ceacutelulas de Prorocentrum lima aisladas para anaacutelisis de toxinas

Extracto metanoacutelico Nordm de ceacutelulas TR ngmL pg DTX-1 ceacutel

G1 quistes tecados 27 213 lt2 -

G2 quistes tecados 67 214 05 11

G3 quistes tecados 87 215 12 21

G4 ceacutelulas vegetativas 60 215 34 87

G6 sedimentos aliacutecuota 213 13 19 pg microL sed

TR tiempo de retencioacuten

Figura 2 Cromatogramas de extractos metanoacutelicos de Prorocentrum lima quistes tecados (a) ceacutelulas vegetativas (b) y sedimentos (c)

Tabla 2 Caracteriacutesticas del sedimento con quistes tecados de Prorocentrum lima

Tipo Tamantildeo (mm)

Grava 2 35

Arena media 025 - 05 32

Arena muy fina 0063 - 0125 2

Limo-arcilla lt 0063 1

Estos resultados constituyen otra eventual posibilidad de toxicidad en los moluscos por VDM no soacutelo de aquellos con modalidad de vida bentoacutenica superficial sino de aquellos que tambieacuten viven enterrados en la arena (eg almeja huepo) Maacutes auacuten si se conoce que P lima posee la capacidad de desarrollar poblaciones naturales en aguas templadas en nuacutemeros que podriacutean justificar una toxicidad por VDM en los mariscos (eg Maranda et al 2007a b)

Referencias

Bravo I ML Fernaacutendez I Ramilo amp A Martinez 2001 Toxin composition of the toxic dinofagellate Prorocentrum lima isolated from different locations along the Galician coast (NW Spain) Toxicon 39 1537ndash1545

Faust MA 1991 Morphology of ciguatera-causing Prorocentrum lima (Pyrrophyta) from widely differing sites J Phycol 27 642-648

Lawrence J E Grant J Quilliam M A Bauder A G amp Cembella A D 2000 Colonizaition and growth of the toxic dinoflagellate Prorocentrum lima and associated fouling macroalgae on mussels in suspended culture Mar Ecol Prog Ser 201 147-154

Levasseur M Couture J Y Weise A M Michaud S Elbrachter M Sauveacute G amp Bonneau E 2003 Pelagic and epiphytic summer distributions of Prorocentrum lima and P mexicanum at two mussel farms in the Gulf of St Lawrence Aquat Microbiol Ecol 30283-293

Maranda L Corwin S Dover S amp Morton S L 2007a Prorocentrum lima (Dinophyceae) in northeastern USA coastal waters II Toxin load in the epibiota and in shellfish Harmful Algae 6 632-641

Maranda L Corwin S Hargraves P E 2007b Prorocentrum lima (Dinophyceae) in 19 northeastern USA coastal waters I Abundance and distribution Harmful Algae 6 623ndash631

Quilliam MA Gilgan MW amp Pleasance S 1993 Confirmation of an incident of diarrhetic shellfish poisoning in eastern Canada In Smayda TJ Shimizu Y (Eds) Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea Elsevier New York pp 547ndash552

Suzuki T Ota H amp Yamasaki M 1999 Direct evidence of transformation of dinophysistoxin-1 to 7-O-acyl-dinophysistoxin-1 (Dinophysis-3) in the scallop Patinopecten yessoensis Toxicon 37 187-198

Vale P amp Sampayo M A 2002 First confirmation of human diarrhoeic poisonings by okadaic acid esters after ingestion of razor clams (Solen marginatus) and green crabs (Carcinus maenas) in Aveiro lagoon Portugal and detection of okadaic acid esters in phytoplankton Toxicon 40989-996

Vale P Veloso V amp Amorim A 2009 Toxin composition of a Prorocentrum lima strain isolated from the Portuguese coast Toxicon 54145ndash152

Agradecimientos Intecmar de la Xunta de Galicia Espantildea donde se realizaron los anaacutelisis de toxinas proyecto

SUBPESCA ldquoManejo y Monitoreo de Mareas Rojas en las regiones de Los Lagos Ayseacuten y Magallanes IV etapa 2010rdquo

ANEXO 4

Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten

ANEXO 5

Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de Magallanes

TASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

O

EJE

MP

LA

R P

AR

A E

L IN

TE

RE

SA

DO

LIQ

UID

AC

IOacuteN

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

EN

TID

AD

BA

NC

AR

IATASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

0 9

4 0

2 4INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

AD

MIN

IST

RA

CIOacute

NTASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

9520 euros

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

CONSELLERIA DE FACENDA

ANEXO 6

Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para cierre

de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

Seccioacuten Ediciones y Produccioacuten Almte Manuel Blanco Encalada 839

Fono 56-32-2151500 Valparaiacuteso Chile

wwwifopcl

Page 18: “Análisis de toxinas lipofílicas mediante LC-MS/MS en ...metadatos.mma.gob.cl/sinia/Informe_final_Analisis_toxinas_lipofilicas_656-055.pdfSUBSECRETARÍA DE ECONOMÍA: INFORME FINAL:

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo

11

5 ANAacuteLISIS Y DISCUSIOacuteN DE LOS DATOS

51 Toxinas en moluscos De las toxinas lipofiacutelicas se sabe que AO DTXs y AZAs causan trastornos gastrointestinales en los seres humanos (Gerssen et al 2010) Para las toxinas restantes (YTXs PTXs y SPXs) auacuten cuando no se han reportado casos de intoxicacioacuten en los seres humanos eacutestas son letales o altamente toacutexicas cuando los ratones son inyectados por viacutea intraperitoneal (Paz et al 2008 Richard et al 2000 Miles et al 2004) Es el caso de los SPXs la toxicidad en ratones inyectados por viacutea intraperitoneal supera a la del resto de las toxinas pues su dosis letal 50 es de 40 microg kg-1 (Richard et al 2000) Tal es asiacute que como referencia (Tabla 5) el transvector caracol piquilhue recolectadas en Julio de 2012 y cuyos niveles de toxicidad provocaron la muerte de los ratones solo presentoacute 01 microg kg-1 deteccioacuten que fue realizada durante este estudio en muestras de carne almacenadas durante no maacutes de 1 antildeo a -20 ordmC Sin embargo no se puede descartar una peacuterdida de la actividad por transformacioacuten durante el periodo de conservacioacuten A excepcioacuten de los SPXs el resto de las toxinas mencionadas estaacuten reguladas por la legislacioacuten europea tanto para consumo interno como importacioacuten de moluscos y tunicados para garantizar la salud de las personas Asiacute tambieacuten estaacuten reguladas por la legislacioacuten chilena a traveacutes del Instituto de Salud Puacuteblica (ISP) estableciendo los mismos niveles de referencia europeo en base al bioensayo ratoacuten Aun cuando los niveles de toxinas detectadas en los moluscos durante este estudio estaacuten por debajo de lo exigido por las regulaciones e incluso de los niveles propuestos por el EFSA (Tabla 7) la presencia de dos y tres tipos de toxinas en los moluscos representa una complejidad en la determinacioacuten de los niveles de toxicidad especialmente si se encuentran presentes toxinas altamente toacutexicas para ratones inyectados intraperitonealmente como son los SPXs Aunque se sospechaba la concurrencia de diferentes tipos de toxinas tal hecho no habiacutea sido confirmado anteriormente Sin embargo los SPXs siguen siendo una incoacutegnita pues se desconoce la fuente de estas toxinas A ostenfeldii la especie que podriacutea ser candidata a confirmar estuvo ausente (Tabla 8 modificado de Guzmaacuten et al 2014) durante el periodo en que se detectoacute en los moluscos Los escasos antecedentes toxigeacutenicos de esta especie en Chile la han confirmado como productora de toxinas paralizantes en Ayseacuten (Pizarro et al 2012) pero no de SPXs No obstante la produccioacuten de SPXs por esta especie en la regioacuten de Magallanes auacuten no se puede descartar Las YTXs fueron las toxinas maacutes abundantes en los moluscos analizados condicioacuten que se corresponde con la alta abundancia relativa de esta especie en el ambiente (Tabla 8) en la mayoriacutea de los casos (Tabla 5)

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo

12

Los resultados sugieren que los falsos positivos por bioensayo ratoacuten pudieran ser maacutes frecuentes de lo que se piensa actualmente para la regioacuten de Magallanes 52 Toxinas en microalgas Los resultados indican que P reticulatum encontrado en Magallanes producen YTXs al igual que las especies reportadas en la regioacuten de Antofagasta y Ayseacuten (Aacutelvarez et al 2011 Pizarro et al 2012) Tal resultado hace altamente probable que esta especie es la fuente de YTXs detectadas en los moluscos durante el periodo de estudio De acuerdo a las toxinas detectadas en las muestras de D acuminata aisladas asiacute como en el fitoplancton con gran abundancia de esta especie (Tabla 8) sugiere que esta microalga podriacutea ser una fuente primaria de PTXs tal como ocurre en el norte y sur del paiacutes (Blanco et al 2007 Fux et al 2011) Aunque la especie tambieacuten ha sido asociada a la presencia de DTX1 en moluscos en un evento toacutexico ocurrido en 1998 en Magallanes (Uribe et al 2001) el DTX1 no fue detectado en las muestras de D acuminata durante este estudio El no hallazgo de DTX1 en estas muestras pudo deberse a una fuente microalgal distinta como D acuta yo P lima D acuta ha sido asociada a DTX1 en moluscos de la regioacuten de Ayseacuten (Lembeye et al 1993 y Zhao et al 1993) mientras que P lima es productora solo de DTX1 en la regioacuten de Magallanes (Salgado et al 2012) Sin embargo cuando se detectoacute DTX1 en las muestras de moluscos durante este estudio D acuta estuvo ausente en las muestras de agua mientras que D acuminata presentoacute una abundancia relativa alta Por otro lado el volumen de resuspensioacuten de los extractos pudo ser elevado al seguir el mismo procedimiento protocolar que se aplica a las muestras de moluscos de acuerdo a la normativa europea actual Por tal razoacuten el LC-MSMS no logroacute detectar PTXs ni DTX1 en las muestras de microalgas En estos casos un protocolo para el anaacutelisis de las microalgas debiera incluir un volumen menor de resuspensioacuten de los extractos secos en referencia al utilizado para los moluscos o bien seleccionar por micromanipulacioacuten un nuacutemero mayor de microalgas (gt 130 ceacutelulas) Sin embargo esto uacuteltimo es maacutes difiacutecil de lograr en latitudes australes debido a la baja densidad de ceacutelulas en las que se presenta normalmente esta especie en condiciones naturales Por tal motivo se recomienda realizar pruebas con un volumen de resuspensioacuten menor a 1 mL aun cuando se trate de un LC-MSMS triple cuadrupolo

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6 CONCLUSIONES

a Los moluscos de la regioacuten de Magallanes pueden presentar PTX2 YTX 45OHYTX DTX1 y SPX1

b El hecho que los moluscos puedan presentar dos o maacutes tipos de toxinas lipofiacutelicas dificulta establecer el nivel de toxicidad total

c P reticulatum en Magallanes produce YTXs al igual que la especie del norte y sur del paiacutes

d La abundancia relativa ambiental de P reticulatum durante el periodo de estudio coincidioacute con la presencia de YTXs en los moluscos

e Los SPXs encontrados anteriormente en caracoles piquilhue tambieacuten fue posible detectarlos en choritos durante este estudio

f Auacuten queda por confirmar el tipo de SPXs presentes y su eventual fuente primaria La presencia de SPXs en los moluscos no siempre coincidioacute con la presencia de A ostenfeldii en el ambiente y su abundancia relativa maacutexima fue solo de nivel 1 (raro) durante el periodo de estudio

g La PTX2 detectada en los moluscos coincidioacute con una alta abundancia relativa ambiental de D acuminata No obstante auacuten queda por confirmar si esta especie es la fuente primaria Para ello se hace necesario ajustar (disminuir) el volumen de dilucioacuten de los extractos secos de microalgas aisladas por micromanipulacioacuten aun cuando se trata de un espectroacutemetro de masas como un triple cuadrupolo

h La deteccioacuten de DTX1 en los moluscos coincidioacute con la ausencia de D acuta en el ambiente La toxina tampoco fue detectada en los moluscos cuando esta microalga estuvo a niveles de 2 y 3 (escaso y regular) Queda por confirmar la produccioacuten de DTX1 por esta especie en Magallanes

i No se encontraron PTX1 DTX2 ni AZPs en las muestras de moluscos durante el periodo de estudio

j Los resultados demuestran la presencia de toxinas en los moluscos que se hace necesario identificar y cuantificar utilizando teacutecnicas distintas al bioensayo

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F I G U R A

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Figura 1 Estaciones y sectores muestreados (ciacuterculo rojo) y sector Fortuna donde fue recolectado el

caracol piquilhue (ciacuterculo amarillo)

T A B L A S

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Tabla 1 Condiciones cromatograacuteficas para el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas usando

una columna de UPLC C18 en fase reversa y medio baacutesico

Columna Acquity UPLC BEH C18 17 microm 21x100 mm

Temperatura columna 45 ordmC

Flujo 04 mlmin

Volumen inyeccioacuten 5 microl

Temperatura muestras 10 plusmn 5 ordmC

Gradiente

Tiempo (min) Fase A () Fase B ()

0 75 25

066 75 25

330 5 95

528 5 95

726 75 25

900 75 25

Tabla 2 Paraacutemetros de la fuente de ionizacioacuten para el Xevo TQMS (Waters) en la determinacioacuten de toxinas lipofiacutelicas

PARAacuteMETROS DE LA FUENTE

ESI- ESI+

AO DTX2 DTX1 YTX homoYTX 45OH YTX y 45OH

homoYTX

AZA1 AZA2 AZA3 PTX2 PTX1 y SPX1

Voltaje de capilar (V) 100 200

Temperatura de solvatacioacuten (ordmC) 450 450

Flujo gas de solvatacioacuten (lh) 850 850

Flujo gas cono (lh) 50 50

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Tabla 3

Resumen de las condiciones de espectrometriacutea de masas empleadas con el Xevo TQMS (Waters) en el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas

Compuesto tR (min)

ESI

Ioacuten Precursor

(mz)

Ioacuten Producto

(mz)

Dwell time (s)

Energiacutea colisioacuten

(eV)

Voltaje cono (V)

AO 189 NEG 8035 2552 0010 46 86

113 0010 56 86

DTX2 210 NEG 8035 2552 0010 46 86

113 0010 56 86

DTX1 214 NEG 8175 5634 0010 43 86

2552 0010 48 86

YTX 202 NEG 5704 4674 0010 30 45

3963 0010 35 45

45OH-YTX 182 NEG 5784 4674 0010 30 45

3964 0010 30 45

HomoYTX 203 NEG 5775 4744 0010 30 48

4034 0010 30 48

45OH-homoYTX 182 NEG 5855 4034 0010 30 45

4744 0010 30 45

PTX1 306 POS 8925 8395 0015 25 36

8215 0015 25 36

PTX2 362 POS 8765 8415 0015 20 36

8235 0015 25 36

AZA1 263 POS 8425 6545 0015 55 50

3622 0015 50 50

AZA2 270 POS 8565 6725 0015 45 27

6545 0015 45 27

AZA3 236 POS 8285 6404 0015 55 47

3622 0015 55 47

SPX1 368 POS 6925 6744 0015 27 60

1643 0015 42 60 Transicioacuten cuantificadora

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Tabla 4 TRR y valores de tolerancia para las toxinas analizadas

TOXINA TRR TOLERANCIA

Toxinas del grupo de AO

AO 1000 0990-1010

DTX2 1040 1014-1066

DTX1 1140 1111-1168

Toxinas del grupo de PTX

PTX2 1000 0990-1010

PTX1 0850 0829-0871

Toxinas del grupo de YTX

YTX 1000 0990-1010

45OH-YTX 0894 0871-0916

Homo YTX 1000 0990-1010

45OH-homoYTX 0899 0876-0921

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Tabla 5 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de moluscos

Nordm estMes

recolectaLocalidad Molusco

cuerpo

enterohepat

gramos

carne

toxicidad

VDM ratoacuten

PTX2

(ugKg)

YTX

(ugKg)

45OHYTX

(ugKg)

DTX1

libre

(ugKg)

DTX1

total

(ugkg)

SPX 1

(ugKg)

M13 ene-13 E Peel chorito x 5086 + 01 02

M13 ene-13 E Peel ostioacuten x 5155 No real izado 16 21

M33 ene-13 B Bell chorito x 5253 + 04

M37 ene-13 B Agua Fresca chorito x 5039 + 05 01

M35 ene-13 C San Isidro chorito x 5289 + 000 01

M42 ene-13 V Holanda chorito x 5231 + 06 13

M43 ene-13 B Yendegaia chorito x 5193 + 04 25

M45 ene-13 Pto Williams chorito x 5161 - 28 07

M08 feb-13 E Falcon cholga x 5027 - 14

M09 feb-13 E Penguumlin cholga x 5103 + 14

M22 feb-13 E de las Montantildeas cholga x 5052 - 26

M23 feb-13 I Ballesteros cholga x 5204 - 87

M24 feb-13 B Fanny chorito x 2016 - 38 1071 479 12

M25 feb-13 E Silva Palma chorito x 1447 - 59 1077 898 09

M26 feb-13 E Wickham chorito x 1093 - 194 2940 2232 66 66

M27 feb-13 E Sullivan chorito x 1137 - 450 1944 1478

M28 feb-13 E Nuntildeez chorito x 1179 + 33 721 407

M29 feb-13 Cutter Cove chorito x 1003 - 65 501 309

M29N1 feb-13 I Engelfield chorito x 1116 - 297 2007 1483

M31 feb-13 B Nash chorito x 2231 +

M33 feb-13 B Bell chorito x 1181 - 93

M34 feb-13 S Pedro chorito x 0726 -

M35 feb-13 C San Isidro chorito x 1178 + 110

M36 feb-13 B Buena chorito x 1367 +

M37 feb-13 B Agua Fresca chorito x 0850 + 45 100 80

M39 feb-13 Pto Zenteno chorito x 3241 + 28

M39N2 feb-13 Pta San Valentin chorito x 1712 - 11

M39N3 feb-13 Pto Yartou chorito x 2035 - 11

sector

Fortunajul-12 B Inuacutetil

caracol

piquilhuex 107000 + 01

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Tabla 6 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de microalgas

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Tabla 7 Niveles actualmente permitidos por la legislacioacuten europea (bioensayo) y los niveles propuestos por la

autoridad europea para la seguridad alimentaria (EFSA) (Gerssen et al 2010)

Toxin Legislacioacuten (μg kg-

1) Proposicioacuten

EFSA (μg kg-1)

Validacioacuten LC-MSMS

(μg kg-1)

OA and DTXs 160 45

PTXs 120

YTXs 1000 3750

AZAs 160 32

SPXs 400 (Gerssen et al2010)

European Food Safety Authority Decisioacuten 2002657 de la Unioacuten Europea EC Incluye PTXs

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Tabla 8 Abundancia relativa ambiental de las microalgas al momento de recolectar las muestras de moluscos En rojo se indica la deteccioacuten de toxina positiva en los moluscos asociada a la supuesta microalga fuente PTXs (D

acuminata) YTXs (P reticulatum) SPXs (A ostenfeldii) DTX1 (A acuta)

(Tabla modificada de Guzmaacuten et al 2014)

A N E X O S

ANEXO 1

Certificacioacuten laboratorio INTECMAR

ANEXO 2

Lista de anaacutelisis que realiza INTECMAR y sus costos (en euros) 2013

scv 1 de 7

GUIA PARA LA AUTOLIQUIDACIOacuteN DE TASAS A FAVOR DE LA COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA 2013 Los aspectos financieros de los servicios prestados por Intecmar en el marco de su actividad e vienen regulados en la Ley 62003 de 9 de diciembre de tasas precios y exenciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia (DOG nuacutem 240 de 11122003) y fueron actualizados posteriormente en la Ley 142010 de 27 de diciembre de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2011 (DOG nuacutem 250 de 30122010) y en la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013 (DOG nuacutem 42 de 28022013) Existen dos maneras de liquidar las tasas correspondientes a los servicios prestados por Intecmar

1 De forma manual cubriendo el modelo A de autoliquidacioacuten que se descarga en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda y que adjunto en pdf y se lleva al banco para su pago httpwwwconselleriadefacendaeswebportalconfeccion-impresos

2 De forma telemaacutetica en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda viacutenculo httpshostcixtecesXEITObinlionwebXeitodllxmit a traveacutes del modelo 730

Ambos modelos de liquidacioacuten de tasas adjuntamos ejemplo al final de este documento deben ser remitidos por mail a Intecmar con el sello del banco fiacutesico o virtual como paso previo a la emisioacuten del certificado Los coacutedigos generales necesarios son

minus Consejeriacutea de Medio Rural y de Mar Coacutedigo 09 minus Delegacioacuten de Pontevedra Coacutedigo 40 minus Servicio de Intecmar Coacutedigo 24

Los coacutedigos y descripcioacuten de las tasas son los regulados en la legislacioacuten vigente y los hemos resumido en los anexos siguientes Vilaxoaacuten 4 de marzo de 2013

scv 2 de 7

TARIFAS DE TASAS VIGENTES PARA 2013 - Ley 22013 d e 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013

(DOG nuacutem 42 de 28022013)

Estas tarifas son consecuencia de la actualizacioacuten de las tarifas contenidas en los anexos 1 2 3 4 y 5 de la Ley 62003 del 9 de diciembre de tasas precios y exacciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia por la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 Seraacuten aplicables desde el diacutea de la entrada en vigor de la Ley de

presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 TASA POR SERVICIOS ADMINISTRATIVOS

No sujecioacuten No se exigiraacute la tasa por servicios administrativos cuando se trate de compulsas o cotejos de documentos que deban acompantildear a solicitudes escritos o comunicaciones presentadas por el ciudadano y realizadas en el aacutembito de actuacioacuten de los registros seguacuten lo dispuesto en el artiacuteculo 385 de la Ley 301992 del 26 de noviembre de reacutegimen juriacutedico de las administraciones puacuteblicas y del procedimiento administrativo comuacuten

Excepciones Estaraacuten exentos de la presente tasa

1- La expedicioacuten de certificados de retribuciones satisfechas por la Xunta de Galicia con el objeto de justificacioacuten en relacioacuten con el impuesto sobre la renta de las personas fiacutesicas

2- La expedicioacuten de certificados y compulsa que el personal de la Administracioacuten solicite respecto a las necesidades propias del puesto de trabajo o relacioacuten de servicios

3- Los alumnos por cualquier actuacioacuten en materia de ensentildeanzas no universitarias

scv 3 de 7

4- Las compulsas realizadas en las oficinas de empleo para los desempleados en la tramitacioacuten de expedientes que sean competencia de dichas oficinas

5 La inscripcioacuten en las convocatorias para a seleccioacuten de personal de la comunidad autoacutenoma despueacutes de justificacioacuten documental solicitada por

- Personas con discapacidad igual o superior al 33 - Personas que sean miembros de familias numerosas clasificadas en la

categoriacutea especial Se aplicaraacute una bonificacioacuten del 50 a la inscripcioacuten solicitada por - Personas que sean miembros de familias numerosas de categoriacutea

general - Personas que figurasen como demandantes de empleo desde por lo

menos seis meses antes a la fecha de la convocatoria de pruebas selectivas de personal en las que soliciten su participacioacuten y no esteacuten percibiendo prestacioacuten o subsidio por desempleo

6- La expedicioacuten de certificados relativos a la situacioacuten fiscal 7- El Estado y los demaacutes entes puacuteblicos territoriales o institucionales

siempre que los servicios o actividades de que sean beneficiarios se presten o se realicen en el marco del principio de colaboracioacuten entre administraciones

8- Las viacutectimas de actos terroristas asiacute como sus coacutenyuges y sus hijos por cualquier actuacioacuten en materia educativa realizada en centros oficiales de estudios en todos los niveles de ensentildeanza

9- Los miembros de los organismos consultivos de la Administracioacuten puacuteblica gallega respecto de los certificados emitidos por dichos organismos

COacuteDIGO TASAS

DESCRIPCIOacuteN IMPORTE euro

314400 Prestacioacuten de servicios en el Instituto Tecnoloacutegico para el Control del Medio Marino de Galicia

314401 Anaacutelisis de biotoxinas marinas en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de Yasumoto 1978 4752

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en rato segundo o meacutetodo de Yasumoto 1984 5432

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS)

9520 -Anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten

seguacuten el meacutetodo de la AOAC 4752

scv 4 de 7

-Anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo da AOAC 4752

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1978 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10186

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1984 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10865

-Anaacutelisis combinada en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS) anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo AOAC y anaacutelisis de toxicidad de tipo ASP por cromatografiacutea liquida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo de la AOAC 15000

314402 Anaacutelisis de muestras en agua de mar -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton marino mediante

microscopiacutea oacuteptica 15133 -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton toacutexico marino

mediante microscopiacutea oacuteptica 13333 - Anaacutelisis de carbono orgaacutenico disuelto 5093 -Anaacutelisis de nutrientes inorgaacutenicos disueltos 3500 -Anaacutelisis de pigmentos fotosinteacuteticos (clorofila ldquoardquo) por

espectrofluorimetria 1698 314403 Anaacutelisis microbioloacutegicos en moluscos y otros organismos

procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Cuantificacioacuten de E Coli 10186 - Deteccioacuten de Salmonella spp 16975 -Enumeracioacuten de Escherichia coli en moluscos bivalvos

vivos por la teacutecnica de medida directa de impedancia con el sistema BacTrac 4300 6800

314404 Anaacutelisis de contaminantes de origen quiacutemica en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Determinacioacuten de metales pesados (Pb Cd Cu Zn As Hg Ni Cr Ag) mediante espectrofotometriacutea de absorcioacuten atoacutemica por metal

6790

-Determinacioacuten de compuestos bifenilos policlorados (PCB) mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

scv 5 de 7

-Determinacioacuten de pesticidas organoclorados mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

-Determinacioacuten de hidrocarburos aromaacuteticos policiacuteclicos (HAPs) mediante cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de fluorescencia

28200

314405 Anaacutelisis histopatoloacutegica de moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Estudio hispatoloacutegico Determinacioacuten de Bonamia Marteillia Perkinsus y otras alteraciones patoloacutegicas

101852

314406 Emisioacuten de certificaciones e informes teacutecnicos y otras actuaciones a peticioacuten del interesado

Emisioacuten de certificados a peticioacuten de los interesados sobre las actuaciones llevadas a cabo por el Instituto

1000

Emisioacuten de informes teacutecnicos a peticioacuten del interesado (euros por hora o fraccioacuten)

4000

scv 6 de 7

scv 7 de 7

ANEXO 3

Resultados de anaacutelisis en muestras de microalgas anteriormente enviadas procedentes de Magallanes por el equipo de espectrometriacutea de masas utilizado por INTECMAR Trabajo presentado a las XXXII

Congreso de Ciencias del Mar realizado en Punta Arenas 22-25 octubre de 2012

PERFIL DE TOXINAS DE PROROCENTRUM LIMA (DINOPHYCEAE) AISLADO DESDE LA COSTA DE MAGALLANES SUR DE CHILE P Salgado1 G Pizarro1 JM Franco2 P Rioboacute2 e I Bravo3

1Instituto de Fomento Pesquero (IFOP) Punta Arenas Chile gemitapizarroifopcl 2Instituto de Investigaciones Marinas (CSIC) Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea 3Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea

Prorocentrum lima (Ehrenberg) es un dinoflagelado marino bentoacutenico que se encuentra adherido generalmente

sobre macroalgas sedimentos y detrito flotante y menos comuacutenmente en el plancton (Bravo et al 2001) Es una especie neriacutetica y estuarina y su rango de distribucioacuten geograacutefica variacutea desde aguas costeras tropicales a templadas (Faust 1991) La importancia de P lima se debe a que son productoras de toxinas diarreogeacutenicas en las personas (veneno diarreico de los mariscos VDM) al igual que algunas especies de Dinophysis aunque raramente se le han asociado con episodios toacutexicos por VDM por su caraacutecter epiacutefito y bentoacutenico El complejo VDM producido por P lima incluye moleacuteculas conocidas como el aacutecido okadaico (AO) y derivados dinofisistoxinas (DTX-1 DTX-2) (Bravo et al 2001 Vale et al 2009) No obstante existen casos citados para USA donde se detectoacute toxicidad por VDM en bivalvos de cultivos asociadas a P lima aunque en bajos niveles (Maranda et al 2007a) En Canadaacute tambieacuten se llevoacute a cabo un estudio en moluscos de cultivo cuya finalidad fue determinar el origen del VDM en la que P lima fue la principal especie sospechosa tras la ocurrencia de un evento toacutexico humano por VDM ocurrido en 1998 (Levasseur et al 2003) y en antildeos anteriores (Quilliam et al 1993) Aunque Levasseur et al (2003) no logroacute probar la toxicidad de los mariscos en cultivo a causa de P lima cabe hacer notar que lo que buscaron fue OA y DTX1 no DTX 3 este uacuteltimo principal derivado de las anteriores tras su transformacioacuten en los moluscos (eg Suzuki et al 1999 Vale amp Sampayo 2002)

En consecuencia el rol de P lima en eventos toacutexicos por VDM auacuten no puede descartarse por cuanto podriacutean llegar a ser importantes en ambientes turbulentos debido a la eventual remocioacuten de microalgas adheridas en sustratos por efecto de vientos (Levasseur et al 2003) factor de importancia si se trata de sedimentos o contrariamente en zonas someras y estables de cultivos de moluscos que al mismo tiempo favorecen microambientes para sustratos en los que prolifera la epiacutefita P lima (Lawrence et al 2000) quedando expuestas a re-suspensiones temporales que favorecen la filtracioacuten de estas microalgas por los bivalvos en cultivo (Maranda et al 2007a)

Chile posee escaso conocimiento sobre esta especie en su medio natural incluido su perfil de toxinas y potencial rol en la toxificacioacuten de moluscos por VDM Por tal razoacuten resultoacute interesante aportar al conocimiento de estos aspectos en muestras de sedimentos recolectadas en el estrecho de Magallanes en las que esta especie se encontroacute inhabitualmente abundante

Las ceacutelulas utilizadas en este estudio fueron aisladas desde sedimentos superficiales (0-3 cm) recolectados en el invierno de 2010 en la localidad de cabo San Isidro durante el muestreo regular del programa de monitoreo de marea roja en la regioacuten de Magallanes En esa oportunidad se logroacute cuantificar hasta 1002 quistes tecadoscm3 de Prorocentrum lima la mayor concentracioacuten respecto a otros sitios de recolecta (Fig 1) Los sedimentos de esta localidad presentaron una coloracioacuten oscura y un fuerte olor a sulfuro de hidroacutegeno (H2S) producto de anoxia local

Se aislaron entre 27 y 87 quistes tecados (Fig 1 a) directamente desde los sedimentos mientras otras 60 ceacutelulas vegetativas (Fig 1 b) fueron aisladas luego de promover la actividad y divisioacuten de los quistes en condiciones de 15 ordmC y un ciclo de luzoscuridad de 1212 horas (Tabla 1) Para este fin se aislaron quistes tecados y trasvasijaron a placas Petri de 5 cm de diaacutemetro conteniendo 5 mL de medio de cultivo L1 Para el anaacutelisis de toxinas las ceacutelulas aisladas fueron trasvasijadas a un tubo Eppendorf de 15 mL y congelados a -80 ordmC Una aliacutecuota de sedimento huacutemedo (100 microL aproximados) tambieacuten fue vaciada en un tubo Eppendorf y congelado Para extraer la toxina se antildeadioacute 500 microL de metanol 100 a cada tubo se mezcloacute por 1 min y filtroacute por 045 microm trasvasijando a un vial El extracto fue secado bajo nitroacutegeno gas a 40 ordmC y conservado a 4 ordmC hasta su anaacutelisis Previo al anaacutelisis de toxinas los extractos fueron resuspendidos en 150 microl de metanol

La presencia de la toxina dinofisistoxina 1 (DTX-1) en las muestras (Fig2) fue confirmada en modo negativo a traveacutes de su ioacuten precursor [M-H]- mz 8175 y sus iones productos mz 5634 y 2552 mediante un cromatoacutegrafo UPLC Acquity Waters acoplado a un triple cuadrupolo Waters Xevo TQ (LC-MS) La columna utilizada fue una Acquity UPLC BEH C18 17microm 21 x 100 mm a 45 ordmC La fase moacutevil consistioacute en (A) hidroacutexido amoacutenico a pH 11 y (B) hidroacutexido amoacutenico en acetonitrilo (67 mM) con una tasa de flujo de 4 mLmin El gradiente de elucioacuten utilizado fue el siguiente mantencioacuten al 75 de A entre 0 y 066 min cambio a 5 de A entre 066 y 330 min mantener 5

de A entre 330 y 528 min recuperacioacuten del 75 de A entre 528 y 726 min mantencioacuten al 75 de A hasta 9 min Se pinchoacute 5microL de muestra en el LC-MS El contenido de DTX-1 en las muestras fue cuantificado en base al ion precursor

Los tres tipos de muestras fueron positivas a la presencia de DTX-1 pero las ceacutelulas vegetativas fueron las que presentaron un mayor contenido de DTX-1 por ceacutelula La deteccioacuten de DTX-1 en los sedimentos (Tabla 2) reflejoacute la presencia de los quistes tecados en eacutestos

Figura 1 Concentraciones de quistes tecados de Prorocentrum lima (quistescm3 de sedimento huacutemedo) en estaciones de muestreo en el Estrecho de Magallanes (M26 Estero Wickham M29N1 Isla Engenfield M31 Bahiacutea Nash M35 Cabo San Isidro M39C1 Bahiacutea Gente Grande M39C2 Bahiacutea Inuacutetil M39C3 Canal Gabriel) y Canal Beagle (M41 Ventisquero Espantildea M42 Ventisquero Holanda) (a) Quistes tecados (b) ceacutelulas vegetativas obtenidas de germinacioacuten de quistes tecados bajo condiciones de laboratorio Barra de escala 20 microm

Tabla 1 Sedimento y ceacutelulas de Prorocentrum lima aisladas para anaacutelisis de toxinas

Extracto metanoacutelico Nordm de ceacutelulas TR ngmL pg DTX-1 ceacutel

G1 quistes tecados 27 213 lt2 -

G2 quistes tecados 67 214 05 11

G3 quistes tecados 87 215 12 21

G4 ceacutelulas vegetativas 60 215 34 87

G6 sedimentos aliacutecuota 213 13 19 pg microL sed

TR tiempo de retencioacuten

Figura 2 Cromatogramas de extractos metanoacutelicos de Prorocentrum lima quistes tecados (a) ceacutelulas vegetativas (b) y sedimentos (c)

Tabla 2 Caracteriacutesticas del sedimento con quistes tecados de Prorocentrum lima

Tipo Tamantildeo (mm)

Grava 2 35

Arena media 025 - 05 32

Arena muy fina 0063 - 0125 2

Limo-arcilla lt 0063 1

Estos resultados constituyen otra eventual posibilidad de toxicidad en los moluscos por VDM no soacutelo de aquellos con modalidad de vida bentoacutenica superficial sino de aquellos que tambieacuten viven enterrados en la arena (eg almeja huepo) Maacutes auacuten si se conoce que P lima posee la capacidad de desarrollar poblaciones naturales en aguas templadas en nuacutemeros que podriacutean justificar una toxicidad por VDM en los mariscos (eg Maranda et al 2007a b)

Referencias

Bravo I ML Fernaacutendez I Ramilo amp A Martinez 2001 Toxin composition of the toxic dinofagellate Prorocentrum lima isolated from different locations along the Galician coast (NW Spain) Toxicon 39 1537ndash1545

Faust MA 1991 Morphology of ciguatera-causing Prorocentrum lima (Pyrrophyta) from widely differing sites J Phycol 27 642-648

Lawrence J E Grant J Quilliam M A Bauder A G amp Cembella A D 2000 Colonizaition and growth of the toxic dinoflagellate Prorocentrum lima and associated fouling macroalgae on mussels in suspended culture Mar Ecol Prog Ser 201 147-154

Levasseur M Couture J Y Weise A M Michaud S Elbrachter M Sauveacute G amp Bonneau E 2003 Pelagic and epiphytic summer distributions of Prorocentrum lima and P mexicanum at two mussel farms in the Gulf of St Lawrence Aquat Microbiol Ecol 30283-293

Maranda L Corwin S Dover S amp Morton S L 2007a Prorocentrum lima (Dinophyceae) in northeastern USA coastal waters II Toxin load in the epibiota and in shellfish Harmful Algae 6 632-641

Maranda L Corwin S Hargraves P E 2007b Prorocentrum lima (Dinophyceae) in 19 northeastern USA coastal waters I Abundance and distribution Harmful Algae 6 623ndash631

Quilliam MA Gilgan MW amp Pleasance S 1993 Confirmation of an incident of diarrhetic shellfish poisoning in eastern Canada In Smayda TJ Shimizu Y (Eds) Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea Elsevier New York pp 547ndash552

Suzuki T Ota H amp Yamasaki M 1999 Direct evidence of transformation of dinophysistoxin-1 to 7-O-acyl-dinophysistoxin-1 (Dinophysis-3) in the scallop Patinopecten yessoensis Toxicon 37 187-198

Vale P amp Sampayo M A 2002 First confirmation of human diarrhoeic poisonings by okadaic acid esters after ingestion of razor clams (Solen marginatus) and green crabs (Carcinus maenas) in Aveiro lagoon Portugal and detection of okadaic acid esters in phytoplankton Toxicon 40989-996

Vale P Veloso V amp Amorim A 2009 Toxin composition of a Prorocentrum lima strain isolated from the Portuguese coast Toxicon 54145ndash152

Agradecimientos Intecmar de la Xunta de Galicia Espantildea donde se realizaron los anaacutelisis de toxinas proyecto

SUBPESCA ldquoManejo y Monitoreo de Mareas Rojas en las regiones de Los Lagos Ayseacuten y Magallanes IV etapa 2010rdquo

ANEXO 4

Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten

ANEXO 5

Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de Magallanes

TASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

O

EJE

MP

LA

R P

AR

A E

L IN

TE

RE

SA

DO

LIQ

UID

AC

IOacuteN

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

EN

TID

AD

BA

NC

AR

IATASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

0 9

4 0

2 4INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

AD

MIN

IST

RA

CIOacute

NTASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

9520 euros

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

CONSELLERIA DE FACENDA

ANEXO 6

Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para cierre

de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

Seccioacuten Ediciones y Produccioacuten Almte Manuel Blanco Encalada 839

Fono 56-32-2151500 Valparaiacuteso Chile

wwwifopcl

Page 19: “Análisis de toxinas lipofílicas mediante LC-MS/MS en ...metadatos.mma.gob.cl/sinia/Informe_final_Analisis_toxinas_lipofilicas_656-055.pdfSUBSECRETARÍA DE ECONOMÍA: INFORME FINAL:

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo

12

Los resultados sugieren que los falsos positivos por bioensayo ratoacuten pudieran ser maacutes frecuentes de lo que se piensa actualmente para la regioacuten de Magallanes 52 Toxinas en microalgas Los resultados indican que P reticulatum encontrado en Magallanes producen YTXs al igual que las especies reportadas en la regioacuten de Antofagasta y Ayseacuten (Aacutelvarez et al 2011 Pizarro et al 2012) Tal resultado hace altamente probable que esta especie es la fuente de YTXs detectadas en los moluscos durante el periodo de estudio De acuerdo a las toxinas detectadas en las muestras de D acuminata aisladas asiacute como en el fitoplancton con gran abundancia de esta especie (Tabla 8) sugiere que esta microalga podriacutea ser una fuente primaria de PTXs tal como ocurre en el norte y sur del paiacutes (Blanco et al 2007 Fux et al 2011) Aunque la especie tambieacuten ha sido asociada a la presencia de DTX1 en moluscos en un evento toacutexico ocurrido en 1998 en Magallanes (Uribe et al 2001) el DTX1 no fue detectado en las muestras de D acuminata durante este estudio El no hallazgo de DTX1 en estas muestras pudo deberse a una fuente microalgal distinta como D acuta yo P lima D acuta ha sido asociada a DTX1 en moluscos de la regioacuten de Ayseacuten (Lembeye et al 1993 y Zhao et al 1993) mientras que P lima es productora solo de DTX1 en la regioacuten de Magallanes (Salgado et al 2012) Sin embargo cuando se detectoacute DTX1 en las muestras de moluscos durante este estudio D acuta estuvo ausente en las muestras de agua mientras que D acuminata presentoacute una abundancia relativa alta Por otro lado el volumen de resuspensioacuten de los extractos pudo ser elevado al seguir el mismo procedimiento protocolar que se aplica a las muestras de moluscos de acuerdo a la normativa europea actual Por tal razoacuten el LC-MSMS no logroacute detectar PTXs ni DTX1 en las muestras de microalgas En estos casos un protocolo para el anaacutelisis de las microalgas debiera incluir un volumen menor de resuspensioacuten de los extractos secos en referencia al utilizado para los moluscos o bien seleccionar por micromanipulacioacuten un nuacutemero mayor de microalgas (gt 130 ceacutelulas) Sin embargo esto uacuteltimo es maacutes difiacutecil de lograr en latitudes australes debido a la baja densidad de ceacutelulas en las que se presenta normalmente esta especie en condiciones naturales Por tal motivo se recomienda realizar pruebas con un volumen de resuspensioacuten menor a 1 mL aun cuando se trate de un LC-MSMS triple cuadrupolo

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo

13

6 CONCLUSIONES

a Los moluscos de la regioacuten de Magallanes pueden presentar PTX2 YTX 45OHYTX DTX1 y SPX1

b El hecho que los moluscos puedan presentar dos o maacutes tipos de toxinas lipofiacutelicas dificulta establecer el nivel de toxicidad total

c P reticulatum en Magallanes produce YTXs al igual que la especie del norte y sur del paiacutes

d La abundancia relativa ambiental de P reticulatum durante el periodo de estudio coincidioacute con la presencia de YTXs en los moluscos

e Los SPXs encontrados anteriormente en caracoles piquilhue tambieacuten fue posible detectarlos en choritos durante este estudio

f Auacuten queda por confirmar el tipo de SPXs presentes y su eventual fuente primaria La presencia de SPXs en los moluscos no siempre coincidioacute con la presencia de A ostenfeldii en el ambiente y su abundancia relativa maacutexima fue solo de nivel 1 (raro) durante el periodo de estudio

g La PTX2 detectada en los moluscos coincidioacute con una alta abundancia relativa ambiental de D acuminata No obstante auacuten queda por confirmar si esta especie es la fuente primaria Para ello se hace necesario ajustar (disminuir) el volumen de dilucioacuten de los extractos secos de microalgas aisladas por micromanipulacioacuten aun cuando se trata de un espectroacutemetro de masas como un triple cuadrupolo

h La deteccioacuten de DTX1 en los moluscos coincidioacute con la ausencia de D acuta en el ambiente La toxina tampoco fue detectada en los moluscos cuando esta microalga estuvo a niveles de 2 y 3 (escaso y regular) Queda por confirmar la produccioacuten de DTX1 por esta especie en Magallanes

i No se encontraron PTX1 DTX2 ni AZPs en las muestras de moluscos durante el periodo de estudio

j Los resultados demuestran la presencia de toxinas en los moluscos que se hace necesario identificar y cuantificar utilizando teacutecnicas distintas al bioensayo

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo

14

7 REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS Aacutelvarez G Uribe E Aacutevalos P Marintildeo C amp Blanco J 2010 First identification of azaspiracid and

spirolides in Mesodesma donacium and Mulinia edulis from Northern Chile Toxicon 55 638ndash641

Aacutelvarez G Uribe E Diacuteaz R Braun M Marintildeo C amp Blanco J 2011 Bloom of the Yessotoxin

producing dinoflagellate Protoceratium reticulatum (Dinophyceae) in Northern Chile Journal of Sea Research 65 427ndash434

Blanco J Aacutelvarez G amp Uribe E 2007 Identification of pectenotoxins in plankton filterfeeders and

isolated cells of a Dinophysis acuminata with an atypical toxin profile from Chile Toxicon 710-716

Fujiki H Suganuma M Suguri S Yoshizawa S Takagi K Sassa T Uda N Wakamatsu

KYamada K Yasumoto T Kato Y Fusetani N Hashimoto K amp Sugimura T 1989 New tumor promoters from marine sources The okadaic acid class In Natori S Hashimoto K amp Ueno Y (Eds) Mycotoxins and Phycotoxins rsquo88 Elsevier Amsterdam pp 453- 460

Fux E Smith JL Tong T Guzmaacuten L amp Anderson DM 2011 Toxin profiles of five geographical

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Gerssen A van Olst EHW Mulder PPJ amp de Boer J 2010 In-house validation of a liquid

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Guzmaacuten et al 2014 Manejo y monitoreo de toxinas marinas y fitoplancton nocivo en las regiones de

Los Lagos Ayseacuten y Magallanes VII etapa (2013-114) Proyecto SUBPESCA Informe Final Base de Datos

Krock B Seguel CG Valderrama K amp Tillmann U 2009 Pectenotoxins and yessotoxin from Arica

Bay North Chile as determined by tandem mass spectrometry Toxicon 54 364-367

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15

Lembeye G Yasumoto Y Zhao J amp Fernaacutendez R 1993 DSP outbreak in Chilean fiords In

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Paz B Daranas AH Norte M Rioboacute P Franco JM amp Fernaacutendez JJ 2008 Yessotoxins a

group of marine polyether toxins an overview Mar Drugs 673-102 Pizarro G Alarcoacuten C Franco JM Escalera L Reguera B Vidal G Palma M amp Guzmaacuten L 2011

Distribucioacuten espacial de Dinophysis spp y deteccioacuten de toxinas DSP en el agua mediante resinas DIAION (verano 2006 X regioacuten de Chile) CiencTecnol 34(1)25-50

Pizarro G Paz B Salgado P Aacutelvarez-Chaver P Garrido C amp Guzmaacuten L 2012 Perfil de toxinas

de Protoceratium reticulatum aislados de la regioacuten de Ayseacuten XXXII Congreso de Ciencias del Mar 22-25 octubre 2012 Universidad de Magallanes Punta Arenas Chile Libro de resuacutemenes p 83

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Salgado P Pizarro G Franco JM Rioboacute P Bravo I Perfil de toxinas de Prorocentrum lima

(Dinophyceae) aislado desde la costa de Magallanes sur de Chile In Proceedings of Libro de resuacutemenes del XXXII Congreso de Ciencias del Mar Punta Arenas Chile 22-26 de Octubre 2012 p 228

Trefault N B Krock N Delherbe A Cembella amp M Vaacutesquez 2011 Latitudinal transects in the

southeastern Pacific Ocean reveal a diverse but patchy distribution of phycotoxins Toxicon 58(5) 389ndash397

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16

Uribe J C Garciacutea C Rivas M and Lagos N 2001 First report of diarrhetic shellfish toxins in

Magellanic fjords southern Chile J Shellfish Res 2069-74 Yasumoto T Oshima Y amp Yamaguchi M 1978 Occurrence of a new type of shellfish poisoning in

the Tohoku district Bull Jpn Soc Sci Fish 44 1249-1255 Yasumoto T Murata M Lee J-S amp Torigoe KTD 1989 Polyether toxins produced by

dinoflagellates In Natori S Hashimoto K Ueno Y (Eds) Mycotoxins and Phycotoxins rsquo88 Elsevier Amsterdam pp 375ndash382

Yasumoto T amp Takizawa A 1997 Fluorometric measurements of yessotoxins in shellfish high-

pressure liquid chromatography Biosci Biotech Biochem 611775-1777 Zhao J Lembeye G Cenci G Wall B amp Yasumoto T 1993 Determination of okadaic acid and

dinophysistoxin-1 in mussels from Chile Italy and Ireland In Smayda T J amp Shimizu Y (Eds) Toxic phytoplankton blooms in the sea Elsevier Amsterdam pp 587-592

F I G U R A

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Figura 1 Estaciones y sectores muestreados (ciacuterculo rojo) y sector Fortuna donde fue recolectado el

caracol piquilhue (ciacuterculo amarillo)

T A B L A S

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Tabla 1 Condiciones cromatograacuteficas para el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas usando

una columna de UPLC C18 en fase reversa y medio baacutesico

Columna Acquity UPLC BEH C18 17 microm 21x100 mm

Temperatura columna 45 ordmC

Flujo 04 mlmin

Volumen inyeccioacuten 5 microl

Temperatura muestras 10 plusmn 5 ordmC

Gradiente

Tiempo (min) Fase A () Fase B ()

0 75 25

066 75 25

330 5 95

528 5 95

726 75 25

900 75 25

Tabla 2 Paraacutemetros de la fuente de ionizacioacuten para el Xevo TQMS (Waters) en la determinacioacuten de toxinas lipofiacutelicas

PARAacuteMETROS DE LA FUENTE

ESI- ESI+

AO DTX2 DTX1 YTX homoYTX 45OH YTX y 45OH

homoYTX

AZA1 AZA2 AZA3 PTX2 PTX1 y SPX1

Voltaje de capilar (V) 100 200

Temperatura de solvatacioacuten (ordmC) 450 450

Flujo gas de solvatacioacuten (lh) 850 850

Flujo gas cono (lh) 50 50

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Tabla 3

Resumen de las condiciones de espectrometriacutea de masas empleadas con el Xevo TQMS (Waters) en el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas

Compuesto tR (min)

ESI

Ioacuten Precursor

(mz)

Ioacuten Producto

(mz)

Dwell time (s)

Energiacutea colisioacuten

(eV)

Voltaje cono (V)

AO 189 NEG 8035 2552 0010 46 86

113 0010 56 86

DTX2 210 NEG 8035 2552 0010 46 86

113 0010 56 86

DTX1 214 NEG 8175 5634 0010 43 86

2552 0010 48 86

YTX 202 NEG 5704 4674 0010 30 45

3963 0010 35 45

45OH-YTX 182 NEG 5784 4674 0010 30 45

3964 0010 30 45

HomoYTX 203 NEG 5775 4744 0010 30 48

4034 0010 30 48

45OH-homoYTX 182 NEG 5855 4034 0010 30 45

4744 0010 30 45

PTX1 306 POS 8925 8395 0015 25 36

8215 0015 25 36

PTX2 362 POS 8765 8415 0015 20 36

8235 0015 25 36

AZA1 263 POS 8425 6545 0015 55 50

3622 0015 50 50

AZA2 270 POS 8565 6725 0015 45 27

6545 0015 45 27

AZA3 236 POS 8285 6404 0015 55 47

3622 0015 55 47

SPX1 368 POS 6925 6744 0015 27 60

1643 0015 42 60 Transicioacuten cuantificadora

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Tabla 4 TRR y valores de tolerancia para las toxinas analizadas

TOXINA TRR TOLERANCIA

Toxinas del grupo de AO

AO 1000 0990-1010

DTX2 1040 1014-1066

DTX1 1140 1111-1168

Toxinas del grupo de PTX

PTX2 1000 0990-1010

PTX1 0850 0829-0871

Toxinas del grupo de YTX

YTX 1000 0990-1010

45OH-YTX 0894 0871-0916

Homo YTX 1000 0990-1010

45OH-homoYTX 0899 0876-0921

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Tabla 5 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de moluscos

Nordm estMes

recolectaLocalidad Molusco

cuerpo

enterohepat

gramos

carne

toxicidad

VDM ratoacuten

PTX2

(ugKg)

YTX

(ugKg)

45OHYTX

(ugKg)

DTX1

libre

(ugKg)

DTX1

total

(ugkg)

SPX 1

(ugKg)

M13 ene-13 E Peel chorito x 5086 + 01 02

M13 ene-13 E Peel ostioacuten x 5155 No real izado 16 21

M33 ene-13 B Bell chorito x 5253 + 04

M37 ene-13 B Agua Fresca chorito x 5039 + 05 01

M35 ene-13 C San Isidro chorito x 5289 + 000 01

M42 ene-13 V Holanda chorito x 5231 + 06 13

M43 ene-13 B Yendegaia chorito x 5193 + 04 25

M45 ene-13 Pto Williams chorito x 5161 - 28 07

M08 feb-13 E Falcon cholga x 5027 - 14

M09 feb-13 E Penguumlin cholga x 5103 + 14

M22 feb-13 E de las Montantildeas cholga x 5052 - 26

M23 feb-13 I Ballesteros cholga x 5204 - 87

M24 feb-13 B Fanny chorito x 2016 - 38 1071 479 12

M25 feb-13 E Silva Palma chorito x 1447 - 59 1077 898 09

M26 feb-13 E Wickham chorito x 1093 - 194 2940 2232 66 66

M27 feb-13 E Sullivan chorito x 1137 - 450 1944 1478

M28 feb-13 E Nuntildeez chorito x 1179 + 33 721 407

M29 feb-13 Cutter Cove chorito x 1003 - 65 501 309

M29N1 feb-13 I Engelfield chorito x 1116 - 297 2007 1483

M31 feb-13 B Nash chorito x 2231 +

M33 feb-13 B Bell chorito x 1181 - 93

M34 feb-13 S Pedro chorito x 0726 -

M35 feb-13 C San Isidro chorito x 1178 + 110

M36 feb-13 B Buena chorito x 1367 +

M37 feb-13 B Agua Fresca chorito x 0850 + 45 100 80

M39 feb-13 Pto Zenteno chorito x 3241 + 28

M39N2 feb-13 Pta San Valentin chorito x 1712 - 11

M39N3 feb-13 Pto Yartou chorito x 2035 - 11

sector

Fortunajul-12 B Inuacutetil

caracol

piquilhuex 107000 + 01

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Tabla 6 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de microalgas

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Tabla 7 Niveles actualmente permitidos por la legislacioacuten europea (bioensayo) y los niveles propuestos por la

autoridad europea para la seguridad alimentaria (EFSA) (Gerssen et al 2010)

Toxin Legislacioacuten (μg kg-

1) Proposicioacuten

EFSA (μg kg-1)

Validacioacuten LC-MSMS

(μg kg-1)

OA and DTXs 160 45

PTXs 120

YTXs 1000 3750

AZAs 160 32

SPXs 400 (Gerssen et al2010)

European Food Safety Authority Decisioacuten 2002657 de la Unioacuten Europea EC Incluye PTXs

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Tabla 8 Abundancia relativa ambiental de las microalgas al momento de recolectar las muestras de moluscos En rojo se indica la deteccioacuten de toxina positiva en los moluscos asociada a la supuesta microalga fuente PTXs (D

acuminata) YTXs (P reticulatum) SPXs (A ostenfeldii) DTX1 (A acuta)

(Tabla modificada de Guzmaacuten et al 2014)

A N E X O S

ANEXO 1

Certificacioacuten laboratorio INTECMAR

ANEXO 2

Lista de anaacutelisis que realiza INTECMAR y sus costos (en euros) 2013

scv 1 de 7

GUIA PARA LA AUTOLIQUIDACIOacuteN DE TASAS A FAVOR DE LA COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA 2013 Los aspectos financieros de los servicios prestados por Intecmar en el marco de su actividad e vienen regulados en la Ley 62003 de 9 de diciembre de tasas precios y exenciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia (DOG nuacutem 240 de 11122003) y fueron actualizados posteriormente en la Ley 142010 de 27 de diciembre de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2011 (DOG nuacutem 250 de 30122010) y en la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013 (DOG nuacutem 42 de 28022013) Existen dos maneras de liquidar las tasas correspondientes a los servicios prestados por Intecmar

1 De forma manual cubriendo el modelo A de autoliquidacioacuten que se descarga en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda y que adjunto en pdf y se lleva al banco para su pago httpwwwconselleriadefacendaeswebportalconfeccion-impresos

2 De forma telemaacutetica en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda viacutenculo httpshostcixtecesXEITObinlionwebXeitodllxmit a traveacutes del modelo 730

Ambos modelos de liquidacioacuten de tasas adjuntamos ejemplo al final de este documento deben ser remitidos por mail a Intecmar con el sello del banco fiacutesico o virtual como paso previo a la emisioacuten del certificado Los coacutedigos generales necesarios son

minus Consejeriacutea de Medio Rural y de Mar Coacutedigo 09 minus Delegacioacuten de Pontevedra Coacutedigo 40 minus Servicio de Intecmar Coacutedigo 24

Los coacutedigos y descripcioacuten de las tasas son los regulados en la legislacioacuten vigente y los hemos resumido en los anexos siguientes Vilaxoaacuten 4 de marzo de 2013

scv 2 de 7

TARIFAS DE TASAS VIGENTES PARA 2013 - Ley 22013 d e 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013

(DOG nuacutem 42 de 28022013)

Estas tarifas son consecuencia de la actualizacioacuten de las tarifas contenidas en los anexos 1 2 3 4 y 5 de la Ley 62003 del 9 de diciembre de tasas precios y exacciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia por la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 Seraacuten aplicables desde el diacutea de la entrada en vigor de la Ley de

presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 TASA POR SERVICIOS ADMINISTRATIVOS

No sujecioacuten No se exigiraacute la tasa por servicios administrativos cuando se trate de compulsas o cotejos de documentos que deban acompantildear a solicitudes escritos o comunicaciones presentadas por el ciudadano y realizadas en el aacutembito de actuacioacuten de los registros seguacuten lo dispuesto en el artiacuteculo 385 de la Ley 301992 del 26 de noviembre de reacutegimen juriacutedico de las administraciones puacuteblicas y del procedimiento administrativo comuacuten

Excepciones Estaraacuten exentos de la presente tasa

1- La expedicioacuten de certificados de retribuciones satisfechas por la Xunta de Galicia con el objeto de justificacioacuten en relacioacuten con el impuesto sobre la renta de las personas fiacutesicas

2- La expedicioacuten de certificados y compulsa que el personal de la Administracioacuten solicite respecto a las necesidades propias del puesto de trabajo o relacioacuten de servicios

3- Los alumnos por cualquier actuacioacuten en materia de ensentildeanzas no universitarias

scv 3 de 7

4- Las compulsas realizadas en las oficinas de empleo para los desempleados en la tramitacioacuten de expedientes que sean competencia de dichas oficinas

5 La inscripcioacuten en las convocatorias para a seleccioacuten de personal de la comunidad autoacutenoma despueacutes de justificacioacuten documental solicitada por

- Personas con discapacidad igual o superior al 33 - Personas que sean miembros de familias numerosas clasificadas en la

categoriacutea especial Se aplicaraacute una bonificacioacuten del 50 a la inscripcioacuten solicitada por - Personas que sean miembros de familias numerosas de categoriacutea

general - Personas que figurasen como demandantes de empleo desde por lo

menos seis meses antes a la fecha de la convocatoria de pruebas selectivas de personal en las que soliciten su participacioacuten y no esteacuten percibiendo prestacioacuten o subsidio por desempleo

6- La expedicioacuten de certificados relativos a la situacioacuten fiscal 7- El Estado y los demaacutes entes puacuteblicos territoriales o institucionales

siempre que los servicios o actividades de que sean beneficiarios se presten o se realicen en el marco del principio de colaboracioacuten entre administraciones

8- Las viacutectimas de actos terroristas asiacute como sus coacutenyuges y sus hijos por cualquier actuacioacuten en materia educativa realizada en centros oficiales de estudios en todos los niveles de ensentildeanza

9- Los miembros de los organismos consultivos de la Administracioacuten puacuteblica gallega respecto de los certificados emitidos por dichos organismos

COacuteDIGO TASAS

DESCRIPCIOacuteN IMPORTE euro

314400 Prestacioacuten de servicios en el Instituto Tecnoloacutegico para el Control del Medio Marino de Galicia

314401 Anaacutelisis de biotoxinas marinas en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de Yasumoto 1978 4752

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en rato segundo o meacutetodo de Yasumoto 1984 5432

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS)

9520 -Anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten

seguacuten el meacutetodo de la AOAC 4752

scv 4 de 7

-Anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo da AOAC 4752

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1978 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10186

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1984 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10865

-Anaacutelisis combinada en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS) anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo AOAC y anaacutelisis de toxicidad de tipo ASP por cromatografiacutea liquida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo de la AOAC 15000

314402 Anaacutelisis de muestras en agua de mar -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton marino mediante

microscopiacutea oacuteptica 15133 -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton toacutexico marino

mediante microscopiacutea oacuteptica 13333 - Anaacutelisis de carbono orgaacutenico disuelto 5093 -Anaacutelisis de nutrientes inorgaacutenicos disueltos 3500 -Anaacutelisis de pigmentos fotosinteacuteticos (clorofila ldquoardquo) por

espectrofluorimetria 1698 314403 Anaacutelisis microbioloacutegicos en moluscos y otros organismos

procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Cuantificacioacuten de E Coli 10186 - Deteccioacuten de Salmonella spp 16975 -Enumeracioacuten de Escherichia coli en moluscos bivalvos

vivos por la teacutecnica de medida directa de impedancia con el sistema BacTrac 4300 6800

314404 Anaacutelisis de contaminantes de origen quiacutemica en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Determinacioacuten de metales pesados (Pb Cd Cu Zn As Hg Ni Cr Ag) mediante espectrofotometriacutea de absorcioacuten atoacutemica por metal

6790

-Determinacioacuten de compuestos bifenilos policlorados (PCB) mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

scv 5 de 7

-Determinacioacuten de pesticidas organoclorados mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

-Determinacioacuten de hidrocarburos aromaacuteticos policiacuteclicos (HAPs) mediante cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de fluorescencia

28200

314405 Anaacutelisis histopatoloacutegica de moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Estudio hispatoloacutegico Determinacioacuten de Bonamia Marteillia Perkinsus y otras alteraciones patoloacutegicas

101852

314406 Emisioacuten de certificaciones e informes teacutecnicos y otras actuaciones a peticioacuten del interesado

Emisioacuten de certificados a peticioacuten de los interesados sobre las actuaciones llevadas a cabo por el Instituto

1000

Emisioacuten de informes teacutecnicos a peticioacuten del interesado (euros por hora o fraccioacuten)

4000

scv 6 de 7

scv 7 de 7

ANEXO 3

Resultados de anaacutelisis en muestras de microalgas anteriormente enviadas procedentes de Magallanes por el equipo de espectrometriacutea de masas utilizado por INTECMAR Trabajo presentado a las XXXII

Congreso de Ciencias del Mar realizado en Punta Arenas 22-25 octubre de 2012

PERFIL DE TOXINAS DE PROROCENTRUM LIMA (DINOPHYCEAE) AISLADO DESDE LA COSTA DE MAGALLANES SUR DE CHILE P Salgado1 G Pizarro1 JM Franco2 P Rioboacute2 e I Bravo3

1Instituto de Fomento Pesquero (IFOP) Punta Arenas Chile gemitapizarroifopcl 2Instituto de Investigaciones Marinas (CSIC) Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea 3Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea

Prorocentrum lima (Ehrenberg) es un dinoflagelado marino bentoacutenico que se encuentra adherido generalmente

sobre macroalgas sedimentos y detrito flotante y menos comuacutenmente en el plancton (Bravo et al 2001) Es una especie neriacutetica y estuarina y su rango de distribucioacuten geograacutefica variacutea desde aguas costeras tropicales a templadas (Faust 1991) La importancia de P lima se debe a que son productoras de toxinas diarreogeacutenicas en las personas (veneno diarreico de los mariscos VDM) al igual que algunas especies de Dinophysis aunque raramente se le han asociado con episodios toacutexicos por VDM por su caraacutecter epiacutefito y bentoacutenico El complejo VDM producido por P lima incluye moleacuteculas conocidas como el aacutecido okadaico (AO) y derivados dinofisistoxinas (DTX-1 DTX-2) (Bravo et al 2001 Vale et al 2009) No obstante existen casos citados para USA donde se detectoacute toxicidad por VDM en bivalvos de cultivos asociadas a P lima aunque en bajos niveles (Maranda et al 2007a) En Canadaacute tambieacuten se llevoacute a cabo un estudio en moluscos de cultivo cuya finalidad fue determinar el origen del VDM en la que P lima fue la principal especie sospechosa tras la ocurrencia de un evento toacutexico humano por VDM ocurrido en 1998 (Levasseur et al 2003) y en antildeos anteriores (Quilliam et al 1993) Aunque Levasseur et al (2003) no logroacute probar la toxicidad de los mariscos en cultivo a causa de P lima cabe hacer notar que lo que buscaron fue OA y DTX1 no DTX 3 este uacuteltimo principal derivado de las anteriores tras su transformacioacuten en los moluscos (eg Suzuki et al 1999 Vale amp Sampayo 2002)

En consecuencia el rol de P lima en eventos toacutexicos por VDM auacuten no puede descartarse por cuanto podriacutean llegar a ser importantes en ambientes turbulentos debido a la eventual remocioacuten de microalgas adheridas en sustratos por efecto de vientos (Levasseur et al 2003) factor de importancia si se trata de sedimentos o contrariamente en zonas someras y estables de cultivos de moluscos que al mismo tiempo favorecen microambientes para sustratos en los que prolifera la epiacutefita P lima (Lawrence et al 2000) quedando expuestas a re-suspensiones temporales que favorecen la filtracioacuten de estas microalgas por los bivalvos en cultivo (Maranda et al 2007a)

Chile posee escaso conocimiento sobre esta especie en su medio natural incluido su perfil de toxinas y potencial rol en la toxificacioacuten de moluscos por VDM Por tal razoacuten resultoacute interesante aportar al conocimiento de estos aspectos en muestras de sedimentos recolectadas en el estrecho de Magallanes en las que esta especie se encontroacute inhabitualmente abundante

Las ceacutelulas utilizadas en este estudio fueron aisladas desde sedimentos superficiales (0-3 cm) recolectados en el invierno de 2010 en la localidad de cabo San Isidro durante el muestreo regular del programa de monitoreo de marea roja en la regioacuten de Magallanes En esa oportunidad se logroacute cuantificar hasta 1002 quistes tecadoscm3 de Prorocentrum lima la mayor concentracioacuten respecto a otros sitios de recolecta (Fig 1) Los sedimentos de esta localidad presentaron una coloracioacuten oscura y un fuerte olor a sulfuro de hidroacutegeno (H2S) producto de anoxia local

Se aislaron entre 27 y 87 quistes tecados (Fig 1 a) directamente desde los sedimentos mientras otras 60 ceacutelulas vegetativas (Fig 1 b) fueron aisladas luego de promover la actividad y divisioacuten de los quistes en condiciones de 15 ordmC y un ciclo de luzoscuridad de 1212 horas (Tabla 1) Para este fin se aislaron quistes tecados y trasvasijaron a placas Petri de 5 cm de diaacutemetro conteniendo 5 mL de medio de cultivo L1 Para el anaacutelisis de toxinas las ceacutelulas aisladas fueron trasvasijadas a un tubo Eppendorf de 15 mL y congelados a -80 ordmC Una aliacutecuota de sedimento huacutemedo (100 microL aproximados) tambieacuten fue vaciada en un tubo Eppendorf y congelado Para extraer la toxina se antildeadioacute 500 microL de metanol 100 a cada tubo se mezcloacute por 1 min y filtroacute por 045 microm trasvasijando a un vial El extracto fue secado bajo nitroacutegeno gas a 40 ordmC y conservado a 4 ordmC hasta su anaacutelisis Previo al anaacutelisis de toxinas los extractos fueron resuspendidos en 150 microl de metanol

La presencia de la toxina dinofisistoxina 1 (DTX-1) en las muestras (Fig2) fue confirmada en modo negativo a traveacutes de su ioacuten precursor [M-H]- mz 8175 y sus iones productos mz 5634 y 2552 mediante un cromatoacutegrafo UPLC Acquity Waters acoplado a un triple cuadrupolo Waters Xevo TQ (LC-MS) La columna utilizada fue una Acquity UPLC BEH C18 17microm 21 x 100 mm a 45 ordmC La fase moacutevil consistioacute en (A) hidroacutexido amoacutenico a pH 11 y (B) hidroacutexido amoacutenico en acetonitrilo (67 mM) con una tasa de flujo de 4 mLmin El gradiente de elucioacuten utilizado fue el siguiente mantencioacuten al 75 de A entre 0 y 066 min cambio a 5 de A entre 066 y 330 min mantener 5

de A entre 330 y 528 min recuperacioacuten del 75 de A entre 528 y 726 min mantencioacuten al 75 de A hasta 9 min Se pinchoacute 5microL de muestra en el LC-MS El contenido de DTX-1 en las muestras fue cuantificado en base al ion precursor

Los tres tipos de muestras fueron positivas a la presencia de DTX-1 pero las ceacutelulas vegetativas fueron las que presentaron un mayor contenido de DTX-1 por ceacutelula La deteccioacuten de DTX-1 en los sedimentos (Tabla 2) reflejoacute la presencia de los quistes tecados en eacutestos

Figura 1 Concentraciones de quistes tecados de Prorocentrum lima (quistescm3 de sedimento huacutemedo) en estaciones de muestreo en el Estrecho de Magallanes (M26 Estero Wickham M29N1 Isla Engenfield M31 Bahiacutea Nash M35 Cabo San Isidro M39C1 Bahiacutea Gente Grande M39C2 Bahiacutea Inuacutetil M39C3 Canal Gabriel) y Canal Beagle (M41 Ventisquero Espantildea M42 Ventisquero Holanda) (a) Quistes tecados (b) ceacutelulas vegetativas obtenidas de germinacioacuten de quistes tecados bajo condiciones de laboratorio Barra de escala 20 microm

Tabla 1 Sedimento y ceacutelulas de Prorocentrum lima aisladas para anaacutelisis de toxinas

Extracto metanoacutelico Nordm de ceacutelulas TR ngmL pg DTX-1 ceacutel

G1 quistes tecados 27 213 lt2 -

G2 quistes tecados 67 214 05 11

G3 quistes tecados 87 215 12 21

G4 ceacutelulas vegetativas 60 215 34 87

G6 sedimentos aliacutecuota 213 13 19 pg microL sed

TR tiempo de retencioacuten

Figura 2 Cromatogramas de extractos metanoacutelicos de Prorocentrum lima quistes tecados (a) ceacutelulas vegetativas (b) y sedimentos (c)

Tabla 2 Caracteriacutesticas del sedimento con quistes tecados de Prorocentrum lima

Tipo Tamantildeo (mm)

Grava 2 35

Arena media 025 - 05 32

Arena muy fina 0063 - 0125 2

Limo-arcilla lt 0063 1

Estos resultados constituyen otra eventual posibilidad de toxicidad en los moluscos por VDM no soacutelo de aquellos con modalidad de vida bentoacutenica superficial sino de aquellos que tambieacuten viven enterrados en la arena (eg almeja huepo) Maacutes auacuten si se conoce que P lima posee la capacidad de desarrollar poblaciones naturales en aguas templadas en nuacutemeros que podriacutean justificar una toxicidad por VDM en los mariscos (eg Maranda et al 2007a b)

Referencias

Bravo I ML Fernaacutendez I Ramilo amp A Martinez 2001 Toxin composition of the toxic dinofagellate Prorocentrum lima isolated from different locations along the Galician coast (NW Spain) Toxicon 39 1537ndash1545

Faust MA 1991 Morphology of ciguatera-causing Prorocentrum lima (Pyrrophyta) from widely differing sites J Phycol 27 642-648

Lawrence J E Grant J Quilliam M A Bauder A G amp Cembella A D 2000 Colonizaition and growth of the toxic dinoflagellate Prorocentrum lima and associated fouling macroalgae on mussels in suspended culture Mar Ecol Prog Ser 201 147-154

Levasseur M Couture J Y Weise A M Michaud S Elbrachter M Sauveacute G amp Bonneau E 2003 Pelagic and epiphytic summer distributions of Prorocentrum lima and P mexicanum at two mussel farms in the Gulf of St Lawrence Aquat Microbiol Ecol 30283-293

Maranda L Corwin S Dover S amp Morton S L 2007a Prorocentrum lima (Dinophyceae) in northeastern USA coastal waters II Toxin load in the epibiota and in shellfish Harmful Algae 6 632-641

Maranda L Corwin S Hargraves P E 2007b Prorocentrum lima (Dinophyceae) in 19 northeastern USA coastal waters I Abundance and distribution Harmful Algae 6 623ndash631

Quilliam MA Gilgan MW amp Pleasance S 1993 Confirmation of an incident of diarrhetic shellfish poisoning in eastern Canada In Smayda TJ Shimizu Y (Eds) Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea Elsevier New York pp 547ndash552

Suzuki T Ota H amp Yamasaki M 1999 Direct evidence of transformation of dinophysistoxin-1 to 7-O-acyl-dinophysistoxin-1 (Dinophysis-3) in the scallop Patinopecten yessoensis Toxicon 37 187-198

Vale P amp Sampayo M A 2002 First confirmation of human diarrhoeic poisonings by okadaic acid esters after ingestion of razor clams (Solen marginatus) and green crabs (Carcinus maenas) in Aveiro lagoon Portugal and detection of okadaic acid esters in phytoplankton Toxicon 40989-996

Vale P Veloso V amp Amorim A 2009 Toxin composition of a Prorocentrum lima strain isolated from the Portuguese coast Toxicon 54145ndash152

Agradecimientos Intecmar de la Xunta de Galicia Espantildea donde se realizaron los anaacutelisis de toxinas proyecto

SUBPESCA ldquoManejo y Monitoreo de Mareas Rojas en las regiones de Los Lagos Ayseacuten y Magallanes IV etapa 2010rdquo

ANEXO 4

Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten

ANEXO 5

Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de Magallanes

TASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

O

EJE

MP

LA

R P

AR

A E

L IN

TE

RE

SA

DO

LIQ

UID

AC

IOacuteN

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

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EN

TID

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BA

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IATASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

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Sello Fecha Nuacutemero

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OL

IQU

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BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

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NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

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DIG

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DIG

OS

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

0 9

4 0

2 4INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

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MIN

IST

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NTASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

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Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

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SIV

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N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

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NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

9520 euros

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

CONSELLERIA DE FACENDA

ANEXO 6

Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para cierre

de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

Seccioacuten Ediciones y Produccioacuten Almte Manuel Blanco Encalada 839

Fono 56-32-2151500 Valparaiacuteso Chile

wwwifopcl

Page 20: “Análisis de toxinas lipofílicas mediante LC-MS/MS en ...metadatos.mma.gob.cl/sinia/Informe_final_Analisis_toxinas_lipofilicas_656-055.pdfSUBSECRETARÍA DE ECONOMÍA: INFORME FINAL:

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo

13

6 CONCLUSIONES

a Los moluscos de la regioacuten de Magallanes pueden presentar PTX2 YTX 45OHYTX DTX1 y SPX1

b El hecho que los moluscos puedan presentar dos o maacutes tipos de toxinas lipofiacutelicas dificulta establecer el nivel de toxicidad total

c P reticulatum en Magallanes produce YTXs al igual que la especie del norte y sur del paiacutes

d La abundancia relativa ambiental de P reticulatum durante el periodo de estudio coincidioacute con la presencia de YTXs en los moluscos

e Los SPXs encontrados anteriormente en caracoles piquilhue tambieacuten fue posible detectarlos en choritos durante este estudio

f Auacuten queda por confirmar el tipo de SPXs presentes y su eventual fuente primaria La presencia de SPXs en los moluscos no siempre coincidioacute con la presencia de A ostenfeldii en el ambiente y su abundancia relativa maacutexima fue solo de nivel 1 (raro) durante el periodo de estudio

g La PTX2 detectada en los moluscos coincidioacute con una alta abundancia relativa ambiental de D acuminata No obstante auacuten queda por confirmar si esta especie es la fuente primaria Para ello se hace necesario ajustar (disminuir) el volumen de dilucioacuten de los extractos secos de microalgas aisladas por micromanipulacioacuten aun cuando se trata de un espectroacutemetro de masas como un triple cuadrupolo

h La deteccioacuten de DTX1 en los moluscos coincidioacute con la ausencia de D acuta en el ambiente La toxina tampoco fue detectada en los moluscos cuando esta microalga estuvo a niveles de 2 y 3 (escaso y regular) Queda por confirmar la produccioacuten de DTX1 por esta especie en Magallanes

i No se encontraron PTX1 DTX2 ni AZPs en las muestras de moluscos durante el periodo de estudio

j Los resultados demuestran la presencia de toxinas en los moluscos que se hace necesario identificar y cuantificar utilizando teacutecnicas distintas al bioensayo

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SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo

14

7 REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS Aacutelvarez G Uribe E Aacutevalos P Marintildeo C amp Blanco J 2010 First identification of azaspiracid and

spirolides in Mesodesma donacium and Mulinia edulis from Northern Chile Toxicon 55 638ndash641

Aacutelvarez G Uribe E Diacuteaz R Braun M Marintildeo C amp Blanco J 2011 Bloom of the Yessotoxin

producing dinoflagellate Protoceratium reticulatum (Dinophyceae) in Northern Chile Journal of Sea Research 65 427ndash434

Blanco J Aacutelvarez G amp Uribe E 2007 Identification of pectenotoxins in plankton filterfeeders and

isolated cells of a Dinophysis acuminata with an atypical toxin profile from Chile Toxicon 710-716

Fujiki H Suganuma M Suguri S Yoshizawa S Takagi K Sassa T Uda N Wakamatsu

KYamada K Yasumoto T Kato Y Fusetani N Hashimoto K amp Sugimura T 1989 New tumor promoters from marine sources The okadaic acid class In Natori S Hashimoto K amp Ueno Y (Eds) Mycotoxins and Phycotoxins rsquo88 Elsevier Amsterdam pp 453- 460

Fux E Smith JL Tong T Guzmaacuten L amp Anderson DM 2011 Toxin profiles of five geographical

isolates of Dinophysis spp from North and South America Toxicon 57(2) 275-287 Garciacutea C Truan D Lagos M Santelices JP Diacuteaz JC amp Lagos N 2005 Metabolic

transformation of dinophysistoxin-3 into dinophysistoxin-1 causes human intoxication by consumption of O-acyl-derivatives dinophysistoxins contamined shellfish Journal Toxicological Sciences 30 287-296

Gerssen A van Olst EHW Mulder PPJ amp de Boer J 2010 In-house validation of a liquid

chromatography tandem mass spectrometry method for the analysis of lipophilic marine toxins in shellfish using matrix-matched calibration Anal Bioanal Chem 3973079-3088

Guzmaacuten et al 2014 Manejo y monitoreo de toxinas marinas y fitoplancton nocivo en las regiones de

Los Lagos Ayseacuten y Magallanes VII etapa (2013-114) Proyecto SUBPESCA Informe Final Base de Datos

Krock B Seguel CG Valderrama K amp Tillmann U 2009 Pectenotoxins and yessotoxin from Arica

Bay North Chile as determined by tandem mass spectrometry Toxicon 54 364-367

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15

Lembeye G Yasumoto Y Zhao J amp Fernaacutendez R 1993 DSP outbreak in Chilean fiords In

Smayda T J amp Shimizu Y (Eds) Toxic phytoplankton blooms in the sea Elsevier Amsterdam pp 525-529

Loacutepez-Rivera A OrsquoCallaghan K Moriarty M OrsquoDriscoll D Hamilton B Lehane M James KJ

amp Furey A 2010 First evidence of azaspiracids (AZAs) A family of lipophilic polyether marine toxins in scallops (Argopecten purpuratus) and mussels (Mytilus chilensis) collected in two regions of Chile Toxicon 55 692-701

Miles CO Wilkins AL Munday R Dines MH Hawkes AD Briggs LR Sandvik M Jensen

DJ Cooney JM Holland PT Quilliam MA MacKenzie AL Beuzenberg V amp Towers NR 2004 Isolation of pectenotoxin-2 from Dinophysis acuta and its conversion to pectenotoxin-2 seco acid and preliminary assessment of their acute toxicities Toxicon 431ndash9

Paz B Daranas AH Norte M Rioboacute P Franco JM amp Fernaacutendez JJ 2008 Yessotoxins a

group of marine polyether toxins an overview Mar Drugs 673-102 Pizarro G Alarcoacuten C Franco JM Escalera L Reguera B Vidal G Palma M amp Guzmaacuten L 2011

Distribucioacuten espacial de Dinophysis spp y deteccioacuten de toxinas DSP en el agua mediante resinas DIAION (verano 2006 X regioacuten de Chile) CiencTecnol 34(1)25-50

Pizarro G Paz B Salgado P Aacutelvarez-Chaver P Garrido C amp Guzmaacuten L 2012 Perfil de toxinas

de Protoceratium reticulatum aislados de la regioacuten de Ayseacuten XXXII Congreso de Ciencias del Mar 22-25 octubre 2012 Universidad de Magallanes Punta Arenas Chile Libro de resuacutemenes p 83

Richard DJA Arsenault E Cembella AD Quilliam MA 2000 Investigations into the toxicology

and pharmacology of spirolides a novel group of shellfish toxins In Hallegraeff GM Blackburn SI Bolch CJ Lewis RJ (eds) Proceedings of the 9th conference on harmful algal blooms Hobart Australia pp 383ndash386

Salgado P Pizarro G Franco JM Rioboacute P Bravo I Perfil de toxinas de Prorocentrum lima

(Dinophyceae) aislado desde la costa de Magallanes sur de Chile In Proceedings of Libro de resuacutemenes del XXXII Congreso de Ciencias del Mar Punta Arenas Chile 22-26 de Octubre 2012 p 228

Trefault N B Krock N Delherbe A Cembella amp M Vaacutesquez 2011 Latitudinal transects in the

southeastern Pacific Ocean reveal a diverse but patchy distribution of phycotoxins Toxicon 58(5) 389ndash397

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16

Uribe J C Garciacutea C Rivas M and Lagos N 2001 First report of diarrhetic shellfish toxins in

Magellanic fjords southern Chile J Shellfish Res 2069-74 Yasumoto T Oshima Y amp Yamaguchi M 1978 Occurrence of a new type of shellfish poisoning in

the Tohoku district Bull Jpn Soc Sci Fish 44 1249-1255 Yasumoto T Murata M Lee J-S amp Torigoe KTD 1989 Polyether toxins produced by

dinoflagellates In Natori S Hashimoto K Ueno Y (Eds) Mycotoxins and Phycotoxins rsquo88 Elsevier Amsterdam pp 375ndash382

Yasumoto T amp Takizawa A 1997 Fluorometric measurements of yessotoxins in shellfish high-

pressure liquid chromatography Biosci Biotech Biochem 611775-1777 Zhao J Lembeye G Cenci G Wall B amp Yasumoto T 1993 Determination of okadaic acid and

dinophysistoxin-1 in mussels from Chile Italy and Ireland In Smayda T J amp Shimizu Y (Eds) Toxic phytoplankton blooms in the sea Elsevier Amsterdam pp 587-592

F I G U R A

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Figura 1 Estaciones y sectores muestreados (ciacuterculo rojo) y sector Fortuna donde fue recolectado el

caracol piquilhue (ciacuterculo amarillo)

T A B L A S

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Tabla 1 Condiciones cromatograacuteficas para el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas usando

una columna de UPLC C18 en fase reversa y medio baacutesico

Columna Acquity UPLC BEH C18 17 microm 21x100 mm

Temperatura columna 45 ordmC

Flujo 04 mlmin

Volumen inyeccioacuten 5 microl

Temperatura muestras 10 plusmn 5 ordmC

Gradiente

Tiempo (min) Fase A () Fase B ()

0 75 25

066 75 25

330 5 95

528 5 95

726 75 25

900 75 25

Tabla 2 Paraacutemetros de la fuente de ionizacioacuten para el Xevo TQMS (Waters) en la determinacioacuten de toxinas lipofiacutelicas

PARAacuteMETROS DE LA FUENTE

ESI- ESI+

AO DTX2 DTX1 YTX homoYTX 45OH YTX y 45OH

homoYTX

AZA1 AZA2 AZA3 PTX2 PTX1 y SPX1

Voltaje de capilar (V) 100 200

Temperatura de solvatacioacuten (ordmC) 450 450

Flujo gas de solvatacioacuten (lh) 850 850

Flujo gas cono (lh) 50 50

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Tabla 3

Resumen de las condiciones de espectrometriacutea de masas empleadas con el Xevo TQMS (Waters) en el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas

Compuesto tR (min)

ESI

Ioacuten Precursor

(mz)

Ioacuten Producto

(mz)

Dwell time (s)

Energiacutea colisioacuten

(eV)

Voltaje cono (V)

AO 189 NEG 8035 2552 0010 46 86

113 0010 56 86

DTX2 210 NEG 8035 2552 0010 46 86

113 0010 56 86

DTX1 214 NEG 8175 5634 0010 43 86

2552 0010 48 86

YTX 202 NEG 5704 4674 0010 30 45

3963 0010 35 45

45OH-YTX 182 NEG 5784 4674 0010 30 45

3964 0010 30 45

HomoYTX 203 NEG 5775 4744 0010 30 48

4034 0010 30 48

45OH-homoYTX 182 NEG 5855 4034 0010 30 45

4744 0010 30 45

PTX1 306 POS 8925 8395 0015 25 36

8215 0015 25 36

PTX2 362 POS 8765 8415 0015 20 36

8235 0015 25 36

AZA1 263 POS 8425 6545 0015 55 50

3622 0015 50 50

AZA2 270 POS 8565 6725 0015 45 27

6545 0015 45 27

AZA3 236 POS 8285 6404 0015 55 47

3622 0015 55 47

SPX1 368 POS 6925 6744 0015 27 60

1643 0015 42 60 Transicioacuten cuantificadora

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Tabla 4 TRR y valores de tolerancia para las toxinas analizadas

TOXINA TRR TOLERANCIA

Toxinas del grupo de AO

AO 1000 0990-1010

DTX2 1040 1014-1066

DTX1 1140 1111-1168

Toxinas del grupo de PTX

PTX2 1000 0990-1010

PTX1 0850 0829-0871

Toxinas del grupo de YTX

YTX 1000 0990-1010

45OH-YTX 0894 0871-0916

Homo YTX 1000 0990-1010

45OH-homoYTX 0899 0876-0921

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Tabla 5 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de moluscos

Nordm estMes

recolectaLocalidad Molusco

cuerpo

enterohepat

gramos

carne

toxicidad

VDM ratoacuten

PTX2

(ugKg)

YTX

(ugKg)

45OHYTX

(ugKg)

DTX1

libre

(ugKg)

DTX1

total

(ugkg)

SPX 1

(ugKg)

M13 ene-13 E Peel chorito x 5086 + 01 02

M13 ene-13 E Peel ostioacuten x 5155 No real izado 16 21

M33 ene-13 B Bell chorito x 5253 + 04

M37 ene-13 B Agua Fresca chorito x 5039 + 05 01

M35 ene-13 C San Isidro chorito x 5289 + 000 01

M42 ene-13 V Holanda chorito x 5231 + 06 13

M43 ene-13 B Yendegaia chorito x 5193 + 04 25

M45 ene-13 Pto Williams chorito x 5161 - 28 07

M08 feb-13 E Falcon cholga x 5027 - 14

M09 feb-13 E Penguumlin cholga x 5103 + 14

M22 feb-13 E de las Montantildeas cholga x 5052 - 26

M23 feb-13 I Ballesteros cholga x 5204 - 87

M24 feb-13 B Fanny chorito x 2016 - 38 1071 479 12

M25 feb-13 E Silva Palma chorito x 1447 - 59 1077 898 09

M26 feb-13 E Wickham chorito x 1093 - 194 2940 2232 66 66

M27 feb-13 E Sullivan chorito x 1137 - 450 1944 1478

M28 feb-13 E Nuntildeez chorito x 1179 + 33 721 407

M29 feb-13 Cutter Cove chorito x 1003 - 65 501 309

M29N1 feb-13 I Engelfield chorito x 1116 - 297 2007 1483

M31 feb-13 B Nash chorito x 2231 +

M33 feb-13 B Bell chorito x 1181 - 93

M34 feb-13 S Pedro chorito x 0726 -

M35 feb-13 C San Isidro chorito x 1178 + 110

M36 feb-13 B Buena chorito x 1367 +

M37 feb-13 B Agua Fresca chorito x 0850 + 45 100 80

M39 feb-13 Pto Zenteno chorito x 3241 + 28

M39N2 feb-13 Pta San Valentin chorito x 1712 - 11

M39N3 feb-13 Pto Yartou chorito x 2035 - 11

sector

Fortunajul-12 B Inuacutetil

caracol

piquilhuex 107000 + 01

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Tabla 6 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de microalgas

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Tabla 7 Niveles actualmente permitidos por la legislacioacuten europea (bioensayo) y los niveles propuestos por la

autoridad europea para la seguridad alimentaria (EFSA) (Gerssen et al 2010)

Toxin Legislacioacuten (μg kg-

1) Proposicioacuten

EFSA (μg kg-1)

Validacioacuten LC-MSMS

(μg kg-1)

OA and DTXs 160 45

PTXs 120

YTXs 1000 3750

AZAs 160 32

SPXs 400 (Gerssen et al2010)

European Food Safety Authority Decisioacuten 2002657 de la Unioacuten Europea EC Incluye PTXs

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Tabla 8 Abundancia relativa ambiental de las microalgas al momento de recolectar las muestras de moluscos En rojo se indica la deteccioacuten de toxina positiva en los moluscos asociada a la supuesta microalga fuente PTXs (D

acuminata) YTXs (P reticulatum) SPXs (A ostenfeldii) DTX1 (A acuta)

(Tabla modificada de Guzmaacuten et al 2014)

A N E X O S

ANEXO 1

Certificacioacuten laboratorio INTECMAR

ANEXO 2

Lista de anaacutelisis que realiza INTECMAR y sus costos (en euros) 2013

scv 1 de 7

GUIA PARA LA AUTOLIQUIDACIOacuteN DE TASAS A FAVOR DE LA COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA 2013 Los aspectos financieros de los servicios prestados por Intecmar en el marco de su actividad e vienen regulados en la Ley 62003 de 9 de diciembre de tasas precios y exenciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia (DOG nuacutem 240 de 11122003) y fueron actualizados posteriormente en la Ley 142010 de 27 de diciembre de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2011 (DOG nuacutem 250 de 30122010) y en la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013 (DOG nuacutem 42 de 28022013) Existen dos maneras de liquidar las tasas correspondientes a los servicios prestados por Intecmar

1 De forma manual cubriendo el modelo A de autoliquidacioacuten que se descarga en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda y que adjunto en pdf y se lleva al banco para su pago httpwwwconselleriadefacendaeswebportalconfeccion-impresos

2 De forma telemaacutetica en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda viacutenculo httpshostcixtecesXEITObinlionwebXeitodllxmit a traveacutes del modelo 730

Ambos modelos de liquidacioacuten de tasas adjuntamos ejemplo al final de este documento deben ser remitidos por mail a Intecmar con el sello del banco fiacutesico o virtual como paso previo a la emisioacuten del certificado Los coacutedigos generales necesarios son

minus Consejeriacutea de Medio Rural y de Mar Coacutedigo 09 minus Delegacioacuten de Pontevedra Coacutedigo 40 minus Servicio de Intecmar Coacutedigo 24

Los coacutedigos y descripcioacuten de las tasas son los regulados en la legislacioacuten vigente y los hemos resumido en los anexos siguientes Vilaxoaacuten 4 de marzo de 2013

scv 2 de 7

TARIFAS DE TASAS VIGENTES PARA 2013 - Ley 22013 d e 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013

(DOG nuacutem 42 de 28022013)

Estas tarifas son consecuencia de la actualizacioacuten de las tarifas contenidas en los anexos 1 2 3 4 y 5 de la Ley 62003 del 9 de diciembre de tasas precios y exacciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia por la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 Seraacuten aplicables desde el diacutea de la entrada en vigor de la Ley de

presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 TASA POR SERVICIOS ADMINISTRATIVOS

No sujecioacuten No se exigiraacute la tasa por servicios administrativos cuando se trate de compulsas o cotejos de documentos que deban acompantildear a solicitudes escritos o comunicaciones presentadas por el ciudadano y realizadas en el aacutembito de actuacioacuten de los registros seguacuten lo dispuesto en el artiacuteculo 385 de la Ley 301992 del 26 de noviembre de reacutegimen juriacutedico de las administraciones puacuteblicas y del procedimiento administrativo comuacuten

Excepciones Estaraacuten exentos de la presente tasa

1- La expedicioacuten de certificados de retribuciones satisfechas por la Xunta de Galicia con el objeto de justificacioacuten en relacioacuten con el impuesto sobre la renta de las personas fiacutesicas

2- La expedicioacuten de certificados y compulsa que el personal de la Administracioacuten solicite respecto a las necesidades propias del puesto de trabajo o relacioacuten de servicios

3- Los alumnos por cualquier actuacioacuten en materia de ensentildeanzas no universitarias

scv 3 de 7

4- Las compulsas realizadas en las oficinas de empleo para los desempleados en la tramitacioacuten de expedientes que sean competencia de dichas oficinas

5 La inscripcioacuten en las convocatorias para a seleccioacuten de personal de la comunidad autoacutenoma despueacutes de justificacioacuten documental solicitada por

- Personas con discapacidad igual o superior al 33 - Personas que sean miembros de familias numerosas clasificadas en la

categoriacutea especial Se aplicaraacute una bonificacioacuten del 50 a la inscripcioacuten solicitada por - Personas que sean miembros de familias numerosas de categoriacutea

general - Personas que figurasen como demandantes de empleo desde por lo

menos seis meses antes a la fecha de la convocatoria de pruebas selectivas de personal en las que soliciten su participacioacuten y no esteacuten percibiendo prestacioacuten o subsidio por desempleo

6- La expedicioacuten de certificados relativos a la situacioacuten fiscal 7- El Estado y los demaacutes entes puacuteblicos territoriales o institucionales

siempre que los servicios o actividades de que sean beneficiarios se presten o se realicen en el marco del principio de colaboracioacuten entre administraciones

8- Las viacutectimas de actos terroristas asiacute como sus coacutenyuges y sus hijos por cualquier actuacioacuten en materia educativa realizada en centros oficiales de estudios en todos los niveles de ensentildeanza

9- Los miembros de los organismos consultivos de la Administracioacuten puacuteblica gallega respecto de los certificados emitidos por dichos organismos

COacuteDIGO TASAS

DESCRIPCIOacuteN IMPORTE euro

314400 Prestacioacuten de servicios en el Instituto Tecnoloacutegico para el Control del Medio Marino de Galicia

314401 Anaacutelisis de biotoxinas marinas en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de Yasumoto 1978 4752

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en rato segundo o meacutetodo de Yasumoto 1984 5432

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS)

9520 -Anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten

seguacuten el meacutetodo de la AOAC 4752

scv 4 de 7

-Anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo da AOAC 4752

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1978 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10186

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1984 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10865

-Anaacutelisis combinada en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS) anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo AOAC y anaacutelisis de toxicidad de tipo ASP por cromatografiacutea liquida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo de la AOAC 15000

314402 Anaacutelisis de muestras en agua de mar -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton marino mediante

microscopiacutea oacuteptica 15133 -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton toacutexico marino

mediante microscopiacutea oacuteptica 13333 - Anaacutelisis de carbono orgaacutenico disuelto 5093 -Anaacutelisis de nutrientes inorgaacutenicos disueltos 3500 -Anaacutelisis de pigmentos fotosinteacuteticos (clorofila ldquoardquo) por

espectrofluorimetria 1698 314403 Anaacutelisis microbioloacutegicos en moluscos y otros organismos

procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Cuantificacioacuten de E Coli 10186 - Deteccioacuten de Salmonella spp 16975 -Enumeracioacuten de Escherichia coli en moluscos bivalvos

vivos por la teacutecnica de medida directa de impedancia con el sistema BacTrac 4300 6800

314404 Anaacutelisis de contaminantes de origen quiacutemica en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Determinacioacuten de metales pesados (Pb Cd Cu Zn As Hg Ni Cr Ag) mediante espectrofotometriacutea de absorcioacuten atoacutemica por metal

6790

-Determinacioacuten de compuestos bifenilos policlorados (PCB) mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

scv 5 de 7

-Determinacioacuten de pesticidas organoclorados mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

-Determinacioacuten de hidrocarburos aromaacuteticos policiacuteclicos (HAPs) mediante cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de fluorescencia

28200

314405 Anaacutelisis histopatoloacutegica de moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Estudio hispatoloacutegico Determinacioacuten de Bonamia Marteillia Perkinsus y otras alteraciones patoloacutegicas

101852

314406 Emisioacuten de certificaciones e informes teacutecnicos y otras actuaciones a peticioacuten del interesado

Emisioacuten de certificados a peticioacuten de los interesados sobre las actuaciones llevadas a cabo por el Instituto

1000

Emisioacuten de informes teacutecnicos a peticioacuten del interesado (euros por hora o fraccioacuten)

4000

scv 6 de 7

scv 7 de 7

ANEXO 3

Resultados de anaacutelisis en muestras de microalgas anteriormente enviadas procedentes de Magallanes por el equipo de espectrometriacutea de masas utilizado por INTECMAR Trabajo presentado a las XXXII

Congreso de Ciencias del Mar realizado en Punta Arenas 22-25 octubre de 2012

PERFIL DE TOXINAS DE PROROCENTRUM LIMA (DINOPHYCEAE) AISLADO DESDE LA COSTA DE MAGALLANES SUR DE CHILE P Salgado1 G Pizarro1 JM Franco2 P Rioboacute2 e I Bravo3

1Instituto de Fomento Pesquero (IFOP) Punta Arenas Chile gemitapizarroifopcl 2Instituto de Investigaciones Marinas (CSIC) Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea 3Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea

Prorocentrum lima (Ehrenberg) es un dinoflagelado marino bentoacutenico que se encuentra adherido generalmente

sobre macroalgas sedimentos y detrito flotante y menos comuacutenmente en el plancton (Bravo et al 2001) Es una especie neriacutetica y estuarina y su rango de distribucioacuten geograacutefica variacutea desde aguas costeras tropicales a templadas (Faust 1991) La importancia de P lima se debe a que son productoras de toxinas diarreogeacutenicas en las personas (veneno diarreico de los mariscos VDM) al igual que algunas especies de Dinophysis aunque raramente se le han asociado con episodios toacutexicos por VDM por su caraacutecter epiacutefito y bentoacutenico El complejo VDM producido por P lima incluye moleacuteculas conocidas como el aacutecido okadaico (AO) y derivados dinofisistoxinas (DTX-1 DTX-2) (Bravo et al 2001 Vale et al 2009) No obstante existen casos citados para USA donde se detectoacute toxicidad por VDM en bivalvos de cultivos asociadas a P lima aunque en bajos niveles (Maranda et al 2007a) En Canadaacute tambieacuten se llevoacute a cabo un estudio en moluscos de cultivo cuya finalidad fue determinar el origen del VDM en la que P lima fue la principal especie sospechosa tras la ocurrencia de un evento toacutexico humano por VDM ocurrido en 1998 (Levasseur et al 2003) y en antildeos anteriores (Quilliam et al 1993) Aunque Levasseur et al (2003) no logroacute probar la toxicidad de los mariscos en cultivo a causa de P lima cabe hacer notar que lo que buscaron fue OA y DTX1 no DTX 3 este uacuteltimo principal derivado de las anteriores tras su transformacioacuten en los moluscos (eg Suzuki et al 1999 Vale amp Sampayo 2002)

En consecuencia el rol de P lima en eventos toacutexicos por VDM auacuten no puede descartarse por cuanto podriacutean llegar a ser importantes en ambientes turbulentos debido a la eventual remocioacuten de microalgas adheridas en sustratos por efecto de vientos (Levasseur et al 2003) factor de importancia si se trata de sedimentos o contrariamente en zonas someras y estables de cultivos de moluscos que al mismo tiempo favorecen microambientes para sustratos en los que prolifera la epiacutefita P lima (Lawrence et al 2000) quedando expuestas a re-suspensiones temporales que favorecen la filtracioacuten de estas microalgas por los bivalvos en cultivo (Maranda et al 2007a)

Chile posee escaso conocimiento sobre esta especie en su medio natural incluido su perfil de toxinas y potencial rol en la toxificacioacuten de moluscos por VDM Por tal razoacuten resultoacute interesante aportar al conocimiento de estos aspectos en muestras de sedimentos recolectadas en el estrecho de Magallanes en las que esta especie se encontroacute inhabitualmente abundante

Las ceacutelulas utilizadas en este estudio fueron aisladas desde sedimentos superficiales (0-3 cm) recolectados en el invierno de 2010 en la localidad de cabo San Isidro durante el muestreo regular del programa de monitoreo de marea roja en la regioacuten de Magallanes En esa oportunidad se logroacute cuantificar hasta 1002 quistes tecadoscm3 de Prorocentrum lima la mayor concentracioacuten respecto a otros sitios de recolecta (Fig 1) Los sedimentos de esta localidad presentaron una coloracioacuten oscura y un fuerte olor a sulfuro de hidroacutegeno (H2S) producto de anoxia local

Se aislaron entre 27 y 87 quistes tecados (Fig 1 a) directamente desde los sedimentos mientras otras 60 ceacutelulas vegetativas (Fig 1 b) fueron aisladas luego de promover la actividad y divisioacuten de los quistes en condiciones de 15 ordmC y un ciclo de luzoscuridad de 1212 horas (Tabla 1) Para este fin se aislaron quistes tecados y trasvasijaron a placas Petri de 5 cm de diaacutemetro conteniendo 5 mL de medio de cultivo L1 Para el anaacutelisis de toxinas las ceacutelulas aisladas fueron trasvasijadas a un tubo Eppendorf de 15 mL y congelados a -80 ordmC Una aliacutecuota de sedimento huacutemedo (100 microL aproximados) tambieacuten fue vaciada en un tubo Eppendorf y congelado Para extraer la toxina se antildeadioacute 500 microL de metanol 100 a cada tubo se mezcloacute por 1 min y filtroacute por 045 microm trasvasijando a un vial El extracto fue secado bajo nitroacutegeno gas a 40 ordmC y conservado a 4 ordmC hasta su anaacutelisis Previo al anaacutelisis de toxinas los extractos fueron resuspendidos en 150 microl de metanol

La presencia de la toxina dinofisistoxina 1 (DTX-1) en las muestras (Fig2) fue confirmada en modo negativo a traveacutes de su ioacuten precursor [M-H]- mz 8175 y sus iones productos mz 5634 y 2552 mediante un cromatoacutegrafo UPLC Acquity Waters acoplado a un triple cuadrupolo Waters Xevo TQ (LC-MS) La columna utilizada fue una Acquity UPLC BEH C18 17microm 21 x 100 mm a 45 ordmC La fase moacutevil consistioacute en (A) hidroacutexido amoacutenico a pH 11 y (B) hidroacutexido amoacutenico en acetonitrilo (67 mM) con una tasa de flujo de 4 mLmin El gradiente de elucioacuten utilizado fue el siguiente mantencioacuten al 75 de A entre 0 y 066 min cambio a 5 de A entre 066 y 330 min mantener 5

de A entre 330 y 528 min recuperacioacuten del 75 de A entre 528 y 726 min mantencioacuten al 75 de A hasta 9 min Se pinchoacute 5microL de muestra en el LC-MS El contenido de DTX-1 en las muestras fue cuantificado en base al ion precursor

Los tres tipos de muestras fueron positivas a la presencia de DTX-1 pero las ceacutelulas vegetativas fueron las que presentaron un mayor contenido de DTX-1 por ceacutelula La deteccioacuten de DTX-1 en los sedimentos (Tabla 2) reflejoacute la presencia de los quistes tecados en eacutestos

Figura 1 Concentraciones de quistes tecados de Prorocentrum lima (quistescm3 de sedimento huacutemedo) en estaciones de muestreo en el Estrecho de Magallanes (M26 Estero Wickham M29N1 Isla Engenfield M31 Bahiacutea Nash M35 Cabo San Isidro M39C1 Bahiacutea Gente Grande M39C2 Bahiacutea Inuacutetil M39C3 Canal Gabriel) y Canal Beagle (M41 Ventisquero Espantildea M42 Ventisquero Holanda) (a) Quistes tecados (b) ceacutelulas vegetativas obtenidas de germinacioacuten de quistes tecados bajo condiciones de laboratorio Barra de escala 20 microm

Tabla 1 Sedimento y ceacutelulas de Prorocentrum lima aisladas para anaacutelisis de toxinas

Extracto metanoacutelico Nordm de ceacutelulas TR ngmL pg DTX-1 ceacutel

G1 quistes tecados 27 213 lt2 -

G2 quistes tecados 67 214 05 11

G3 quistes tecados 87 215 12 21

G4 ceacutelulas vegetativas 60 215 34 87

G6 sedimentos aliacutecuota 213 13 19 pg microL sed

TR tiempo de retencioacuten

Figura 2 Cromatogramas de extractos metanoacutelicos de Prorocentrum lima quistes tecados (a) ceacutelulas vegetativas (b) y sedimentos (c)

Tabla 2 Caracteriacutesticas del sedimento con quistes tecados de Prorocentrum lima

Tipo Tamantildeo (mm)

Grava 2 35

Arena media 025 - 05 32

Arena muy fina 0063 - 0125 2

Limo-arcilla lt 0063 1

Estos resultados constituyen otra eventual posibilidad de toxicidad en los moluscos por VDM no soacutelo de aquellos con modalidad de vida bentoacutenica superficial sino de aquellos que tambieacuten viven enterrados en la arena (eg almeja huepo) Maacutes auacuten si se conoce que P lima posee la capacidad de desarrollar poblaciones naturales en aguas templadas en nuacutemeros que podriacutean justificar una toxicidad por VDM en los mariscos (eg Maranda et al 2007a b)

Referencias

Bravo I ML Fernaacutendez I Ramilo amp A Martinez 2001 Toxin composition of the toxic dinofagellate Prorocentrum lima isolated from different locations along the Galician coast (NW Spain) Toxicon 39 1537ndash1545

Faust MA 1991 Morphology of ciguatera-causing Prorocentrum lima (Pyrrophyta) from widely differing sites J Phycol 27 642-648

Lawrence J E Grant J Quilliam M A Bauder A G amp Cembella A D 2000 Colonizaition and growth of the toxic dinoflagellate Prorocentrum lima and associated fouling macroalgae on mussels in suspended culture Mar Ecol Prog Ser 201 147-154

Levasseur M Couture J Y Weise A M Michaud S Elbrachter M Sauveacute G amp Bonneau E 2003 Pelagic and epiphytic summer distributions of Prorocentrum lima and P mexicanum at two mussel farms in the Gulf of St Lawrence Aquat Microbiol Ecol 30283-293

Maranda L Corwin S Dover S amp Morton S L 2007a Prorocentrum lima (Dinophyceae) in northeastern USA coastal waters II Toxin load in the epibiota and in shellfish Harmful Algae 6 632-641

Maranda L Corwin S Hargraves P E 2007b Prorocentrum lima (Dinophyceae) in 19 northeastern USA coastal waters I Abundance and distribution Harmful Algae 6 623ndash631

Quilliam MA Gilgan MW amp Pleasance S 1993 Confirmation of an incident of diarrhetic shellfish poisoning in eastern Canada In Smayda TJ Shimizu Y (Eds) Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea Elsevier New York pp 547ndash552

Suzuki T Ota H amp Yamasaki M 1999 Direct evidence of transformation of dinophysistoxin-1 to 7-O-acyl-dinophysistoxin-1 (Dinophysis-3) in the scallop Patinopecten yessoensis Toxicon 37 187-198

Vale P amp Sampayo M A 2002 First confirmation of human diarrhoeic poisonings by okadaic acid esters after ingestion of razor clams (Solen marginatus) and green crabs (Carcinus maenas) in Aveiro lagoon Portugal and detection of okadaic acid esters in phytoplankton Toxicon 40989-996

Vale P Veloso V amp Amorim A 2009 Toxin composition of a Prorocentrum lima strain isolated from the Portuguese coast Toxicon 54145ndash152

Agradecimientos Intecmar de la Xunta de Galicia Espantildea donde se realizaron los anaacutelisis de toxinas proyecto

SUBPESCA ldquoManejo y Monitoreo de Mareas Rojas en las regiones de Los Lagos Ayseacuten y Magallanes IV etapa 2010rdquo

ANEXO 4

Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten

ANEXO 5

Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de Magallanes

TASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

O

EJE

MP

LA

R P

AR

A E

L IN

TE

RE

SA

DO

LIQ

UID

AC

IOacuteN

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

EN

TID

AD

BA

NC

AR

IATASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

0 9

4 0

2 4INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

AD

MIN

IST

RA

CIOacute

NTASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

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N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

9520 euros

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

CONSELLERIA DE FACENDA

ANEXO 6

Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para cierre

de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

Seccioacuten Ediciones y Produccioacuten Almte Manuel Blanco Encalada 839

Fono 56-32-2151500 Valparaiacuteso Chile

wwwifopcl

Page 21: “Análisis de toxinas lipofílicas mediante LC-MS/MS en ...metadatos.mma.gob.cl/sinia/Informe_final_Analisis_toxinas_lipofilicas_656-055.pdfSUBSECRETARÍA DE ECONOMÍA: INFORME FINAL:

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo

14

7 REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS Aacutelvarez G Uribe E Aacutevalos P Marintildeo C amp Blanco J 2010 First identification of azaspiracid and

spirolides in Mesodesma donacium and Mulinia edulis from Northern Chile Toxicon 55 638ndash641

Aacutelvarez G Uribe E Diacuteaz R Braun M Marintildeo C amp Blanco J 2011 Bloom of the Yessotoxin

producing dinoflagellate Protoceratium reticulatum (Dinophyceae) in Northern Chile Journal of Sea Research 65 427ndash434

Blanco J Aacutelvarez G amp Uribe E 2007 Identification of pectenotoxins in plankton filterfeeders and

isolated cells of a Dinophysis acuminata with an atypical toxin profile from Chile Toxicon 710-716

Fujiki H Suganuma M Suguri S Yoshizawa S Takagi K Sassa T Uda N Wakamatsu

KYamada K Yasumoto T Kato Y Fusetani N Hashimoto K amp Sugimura T 1989 New tumor promoters from marine sources The okadaic acid class In Natori S Hashimoto K amp Ueno Y (Eds) Mycotoxins and Phycotoxins rsquo88 Elsevier Amsterdam pp 453- 460

Fux E Smith JL Tong T Guzmaacuten L amp Anderson DM 2011 Toxin profiles of five geographical

isolates of Dinophysis spp from North and South America Toxicon 57(2) 275-287 Garciacutea C Truan D Lagos M Santelices JP Diacuteaz JC amp Lagos N 2005 Metabolic

transformation of dinophysistoxin-3 into dinophysistoxin-1 causes human intoxication by consumption of O-acyl-derivatives dinophysistoxins contamined shellfish Journal Toxicological Sciences 30 287-296

Gerssen A van Olst EHW Mulder PPJ amp de Boer J 2010 In-house validation of a liquid

chromatography tandem mass spectrometry method for the analysis of lipophilic marine toxins in shellfish using matrix-matched calibration Anal Bioanal Chem 3973079-3088

Guzmaacuten et al 2014 Manejo y monitoreo de toxinas marinas y fitoplancton nocivo en las regiones de

Los Lagos Ayseacuten y Magallanes VII etapa (2013-114) Proyecto SUBPESCA Informe Final Base de Datos

Krock B Seguel CG Valderrama K amp Tillmann U 2009 Pectenotoxins and yessotoxin from Arica

Bay North Chile as determined by tandem mass spectrometry Toxicon 54 364-367

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo

15

Lembeye G Yasumoto Y Zhao J amp Fernaacutendez R 1993 DSP outbreak in Chilean fiords In

Smayda T J amp Shimizu Y (Eds) Toxic phytoplankton blooms in the sea Elsevier Amsterdam pp 525-529

Loacutepez-Rivera A OrsquoCallaghan K Moriarty M OrsquoDriscoll D Hamilton B Lehane M James KJ

amp Furey A 2010 First evidence of azaspiracids (AZAs) A family of lipophilic polyether marine toxins in scallops (Argopecten purpuratus) and mussels (Mytilus chilensis) collected in two regions of Chile Toxicon 55 692-701

Miles CO Wilkins AL Munday R Dines MH Hawkes AD Briggs LR Sandvik M Jensen

DJ Cooney JM Holland PT Quilliam MA MacKenzie AL Beuzenberg V amp Towers NR 2004 Isolation of pectenotoxin-2 from Dinophysis acuta and its conversion to pectenotoxin-2 seco acid and preliminary assessment of their acute toxicities Toxicon 431ndash9

Paz B Daranas AH Norte M Rioboacute P Franco JM amp Fernaacutendez JJ 2008 Yessotoxins a

group of marine polyether toxins an overview Mar Drugs 673-102 Pizarro G Alarcoacuten C Franco JM Escalera L Reguera B Vidal G Palma M amp Guzmaacuten L 2011

Distribucioacuten espacial de Dinophysis spp y deteccioacuten de toxinas DSP en el agua mediante resinas DIAION (verano 2006 X regioacuten de Chile) CiencTecnol 34(1)25-50

Pizarro G Paz B Salgado P Aacutelvarez-Chaver P Garrido C amp Guzmaacuten L 2012 Perfil de toxinas

de Protoceratium reticulatum aislados de la regioacuten de Ayseacuten XXXII Congreso de Ciencias del Mar 22-25 octubre 2012 Universidad de Magallanes Punta Arenas Chile Libro de resuacutemenes p 83

Richard DJA Arsenault E Cembella AD Quilliam MA 2000 Investigations into the toxicology

and pharmacology of spirolides a novel group of shellfish toxins In Hallegraeff GM Blackburn SI Bolch CJ Lewis RJ (eds) Proceedings of the 9th conference on harmful algal blooms Hobart Australia pp 383ndash386

Salgado P Pizarro G Franco JM Rioboacute P Bravo I Perfil de toxinas de Prorocentrum lima

(Dinophyceae) aislado desde la costa de Magallanes sur de Chile In Proceedings of Libro de resuacutemenes del XXXII Congreso de Ciencias del Mar Punta Arenas Chile 22-26 de Octubre 2012 p 228

Trefault N B Krock N Delherbe A Cembella amp M Vaacutesquez 2011 Latitudinal transects in the

southeastern Pacific Ocean reveal a diverse but patchy distribution of phycotoxins Toxicon 58(5) 389ndash397

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16

Uribe J C Garciacutea C Rivas M and Lagos N 2001 First report of diarrhetic shellfish toxins in

Magellanic fjords southern Chile J Shellfish Res 2069-74 Yasumoto T Oshima Y amp Yamaguchi M 1978 Occurrence of a new type of shellfish poisoning in

the Tohoku district Bull Jpn Soc Sci Fish 44 1249-1255 Yasumoto T Murata M Lee J-S amp Torigoe KTD 1989 Polyether toxins produced by

dinoflagellates In Natori S Hashimoto K Ueno Y (Eds) Mycotoxins and Phycotoxins rsquo88 Elsevier Amsterdam pp 375ndash382

Yasumoto T amp Takizawa A 1997 Fluorometric measurements of yessotoxins in shellfish high-

pressure liquid chromatography Biosci Biotech Biochem 611775-1777 Zhao J Lembeye G Cenci G Wall B amp Yasumoto T 1993 Determination of okadaic acid and

dinophysistoxin-1 in mussels from Chile Italy and Ireland In Smayda T J amp Shimizu Y (Eds) Toxic phytoplankton blooms in the sea Elsevier Amsterdam pp 587-592

F I G U R A

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Figura 1 Estaciones y sectores muestreados (ciacuterculo rojo) y sector Fortuna donde fue recolectado el

caracol piquilhue (ciacuterculo amarillo)

T A B L A S

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Tabla 1 Condiciones cromatograacuteficas para el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas usando

una columna de UPLC C18 en fase reversa y medio baacutesico

Columna Acquity UPLC BEH C18 17 microm 21x100 mm

Temperatura columna 45 ordmC

Flujo 04 mlmin

Volumen inyeccioacuten 5 microl

Temperatura muestras 10 plusmn 5 ordmC

Gradiente

Tiempo (min) Fase A () Fase B ()

0 75 25

066 75 25

330 5 95

528 5 95

726 75 25

900 75 25

Tabla 2 Paraacutemetros de la fuente de ionizacioacuten para el Xevo TQMS (Waters) en la determinacioacuten de toxinas lipofiacutelicas

PARAacuteMETROS DE LA FUENTE

ESI- ESI+

AO DTX2 DTX1 YTX homoYTX 45OH YTX y 45OH

homoYTX

AZA1 AZA2 AZA3 PTX2 PTX1 y SPX1

Voltaje de capilar (V) 100 200

Temperatura de solvatacioacuten (ordmC) 450 450

Flujo gas de solvatacioacuten (lh) 850 850

Flujo gas cono (lh) 50 50

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Tabla 3

Resumen de las condiciones de espectrometriacutea de masas empleadas con el Xevo TQMS (Waters) en el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas

Compuesto tR (min)

ESI

Ioacuten Precursor

(mz)

Ioacuten Producto

(mz)

Dwell time (s)

Energiacutea colisioacuten

(eV)

Voltaje cono (V)

AO 189 NEG 8035 2552 0010 46 86

113 0010 56 86

DTX2 210 NEG 8035 2552 0010 46 86

113 0010 56 86

DTX1 214 NEG 8175 5634 0010 43 86

2552 0010 48 86

YTX 202 NEG 5704 4674 0010 30 45

3963 0010 35 45

45OH-YTX 182 NEG 5784 4674 0010 30 45

3964 0010 30 45

HomoYTX 203 NEG 5775 4744 0010 30 48

4034 0010 30 48

45OH-homoYTX 182 NEG 5855 4034 0010 30 45

4744 0010 30 45

PTX1 306 POS 8925 8395 0015 25 36

8215 0015 25 36

PTX2 362 POS 8765 8415 0015 20 36

8235 0015 25 36

AZA1 263 POS 8425 6545 0015 55 50

3622 0015 50 50

AZA2 270 POS 8565 6725 0015 45 27

6545 0015 45 27

AZA3 236 POS 8285 6404 0015 55 47

3622 0015 55 47

SPX1 368 POS 6925 6744 0015 27 60

1643 0015 42 60 Transicioacuten cuantificadora

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Tabla 4 TRR y valores de tolerancia para las toxinas analizadas

TOXINA TRR TOLERANCIA

Toxinas del grupo de AO

AO 1000 0990-1010

DTX2 1040 1014-1066

DTX1 1140 1111-1168

Toxinas del grupo de PTX

PTX2 1000 0990-1010

PTX1 0850 0829-0871

Toxinas del grupo de YTX

YTX 1000 0990-1010

45OH-YTX 0894 0871-0916

Homo YTX 1000 0990-1010

45OH-homoYTX 0899 0876-0921

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Tabla 5 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de moluscos

Nordm estMes

recolectaLocalidad Molusco

cuerpo

enterohepat

gramos

carne

toxicidad

VDM ratoacuten

PTX2

(ugKg)

YTX

(ugKg)

45OHYTX

(ugKg)

DTX1

libre

(ugKg)

DTX1

total

(ugkg)

SPX 1

(ugKg)

M13 ene-13 E Peel chorito x 5086 + 01 02

M13 ene-13 E Peel ostioacuten x 5155 No real izado 16 21

M33 ene-13 B Bell chorito x 5253 + 04

M37 ene-13 B Agua Fresca chorito x 5039 + 05 01

M35 ene-13 C San Isidro chorito x 5289 + 000 01

M42 ene-13 V Holanda chorito x 5231 + 06 13

M43 ene-13 B Yendegaia chorito x 5193 + 04 25

M45 ene-13 Pto Williams chorito x 5161 - 28 07

M08 feb-13 E Falcon cholga x 5027 - 14

M09 feb-13 E Penguumlin cholga x 5103 + 14

M22 feb-13 E de las Montantildeas cholga x 5052 - 26

M23 feb-13 I Ballesteros cholga x 5204 - 87

M24 feb-13 B Fanny chorito x 2016 - 38 1071 479 12

M25 feb-13 E Silva Palma chorito x 1447 - 59 1077 898 09

M26 feb-13 E Wickham chorito x 1093 - 194 2940 2232 66 66

M27 feb-13 E Sullivan chorito x 1137 - 450 1944 1478

M28 feb-13 E Nuntildeez chorito x 1179 + 33 721 407

M29 feb-13 Cutter Cove chorito x 1003 - 65 501 309

M29N1 feb-13 I Engelfield chorito x 1116 - 297 2007 1483

M31 feb-13 B Nash chorito x 2231 +

M33 feb-13 B Bell chorito x 1181 - 93

M34 feb-13 S Pedro chorito x 0726 -

M35 feb-13 C San Isidro chorito x 1178 + 110

M36 feb-13 B Buena chorito x 1367 +

M37 feb-13 B Agua Fresca chorito x 0850 + 45 100 80

M39 feb-13 Pto Zenteno chorito x 3241 + 28

M39N2 feb-13 Pta San Valentin chorito x 1712 - 11

M39N3 feb-13 Pto Yartou chorito x 2035 - 11

sector

Fortunajul-12 B Inuacutetil

caracol

piquilhuex 107000 + 01

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Tabla 6 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de microalgas

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Tabla 7 Niveles actualmente permitidos por la legislacioacuten europea (bioensayo) y los niveles propuestos por la

autoridad europea para la seguridad alimentaria (EFSA) (Gerssen et al 2010)

Toxin Legislacioacuten (μg kg-

1) Proposicioacuten

EFSA (μg kg-1)

Validacioacuten LC-MSMS

(μg kg-1)

OA and DTXs 160 45

PTXs 120

YTXs 1000 3750

AZAs 160 32

SPXs 400 (Gerssen et al2010)

European Food Safety Authority Decisioacuten 2002657 de la Unioacuten Europea EC Incluye PTXs

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Tabla 8 Abundancia relativa ambiental de las microalgas al momento de recolectar las muestras de moluscos En rojo se indica la deteccioacuten de toxina positiva en los moluscos asociada a la supuesta microalga fuente PTXs (D

acuminata) YTXs (P reticulatum) SPXs (A ostenfeldii) DTX1 (A acuta)

(Tabla modificada de Guzmaacuten et al 2014)

A N E X O S

ANEXO 1

Certificacioacuten laboratorio INTECMAR

ANEXO 2

Lista de anaacutelisis que realiza INTECMAR y sus costos (en euros) 2013

scv 1 de 7

GUIA PARA LA AUTOLIQUIDACIOacuteN DE TASAS A FAVOR DE LA COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA 2013 Los aspectos financieros de los servicios prestados por Intecmar en el marco de su actividad e vienen regulados en la Ley 62003 de 9 de diciembre de tasas precios y exenciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia (DOG nuacutem 240 de 11122003) y fueron actualizados posteriormente en la Ley 142010 de 27 de diciembre de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2011 (DOG nuacutem 250 de 30122010) y en la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013 (DOG nuacutem 42 de 28022013) Existen dos maneras de liquidar las tasas correspondientes a los servicios prestados por Intecmar

1 De forma manual cubriendo el modelo A de autoliquidacioacuten que se descarga en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda y que adjunto en pdf y se lleva al banco para su pago httpwwwconselleriadefacendaeswebportalconfeccion-impresos

2 De forma telemaacutetica en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda viacutenculo httpshostcixtecesXEITObinlionwebXeitodllxmit a traveacutes del modelo 730

Ambos modelos de liquidacioacuten de tasas adjuntamos ejemplo al final de este documento deben ser remitidos por mail a Intecmar con el sello del banco fiacutesico o virtual como paso previo a la emisioacuten del certificado Los coacutedigos generales necesarios son

minus Consejeriacutea de Medio Rural y de Mar Coacutedigo 09 minus Delegacioacuten de Pontevedra Coacutedigo 40 minus Servicio de Intecmar Coacutedigo 24

Los coacutedigos y descripcioacuten de las tasas son los regulados en la legislacioacuten vigente y los hemos resumido en los anexos siguientes Vilaxoaacuten 4 de marzo de 2013

scv 2 de 7

TARIFAS DE TASAS VIGENTES PARA 2013 - Ley 22013 d e 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013

(DOG nuacutem 42 de 28022013)

Estas tarifas son consecuencia de la actualizacioacuten de las tarifas contenidas en los anexos 1 2 3 4 y 5 de la Ley 62003 del 9 de diciembre de tasas precios y exacciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia por la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 Seraacuten aplicables desde el diacutea de la entrada en vigor de la Ley de

presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 TASA POR SERVICIOS ADMINISTRATIVOS

No sujecioacuten No se exigiraacute la tasa por servicios administrativos cuando se trate de compulsas o cotejos de documentos que deban acompantildear a solicitudes escritos o comunicaciones presentadas por el ciudadano y realizadas en el aacutembito de actuacioacuten de los registros seguacuten lo dispuesto en el artiacuteculo 385 de la Ley 301992 del 26 de noviembre de reacutegimen juriacutedico de las administraciones puacuteblicas y del procedimiento administrativo comuacuten

Excepciones Estaraacuten exentos de la presente tasa

1- La expedicioacuten de certificados de retribuciones satisfechas por la Xunta de Galicia con el objeto de justificacioacuten en relacioacuten con el impuesto sobre la renta de las personas fiacutesicas

2- La expedicioacuten de certificados y compulsa que el personal de la Administracioacuten solicite respecto a las necesidades propias del puesto de trabajo o relacioacuten de servicios

3- Los alumnos por cualquier actuacioacuten en materia de ensentildeanzas no universitarias

scv 3 de 7

4- Las compulsas realizadas en las oficinas de empleo para los desempleados en la tramitacioacuten de expedientes que sean competencia de dichas oficinas

5 La inscripcioacuten en las convocatorias para a seleccioacuten de personal de la comunidad autoacutenoma despueacutes de justificacioacuten documental solicitada por

- Personas con discapacidad igual o superior al 33 - Personas que sean miembros de familias numerosas clasificadas en la

categoriacutea especial Se aplicaraacute una bonificacioacuten del 50 a la inscripcioacuten solicitada por - Personas que sean miembros de familias numerosas de categoriacutea

general - Personas que figurasen como demandantes de empleo desde por lo

menos seis meses antes a la fecha de la convocatoria de pruebas selectivas de personal en las que soliciten su participacioacuten y no esteacuten percibiendo prestacioacuten o subsidio por desempleo

6- La expedicioacuten de certificados relativos a la situacioacuten fiscal 7- El Estado y los demaacutes entes puacuteblicos territoriales o institucionales

siempre que los servicios o actividades de que sean beneficiarios se presten o se realicen en el marco del principio de colaboracioacuten entre administraciones

8- Las viacutectimas de actos terroristas asiacute como sus coacutenyuges y sus hijos por cualquier actuacioacuten en materia educativa realizada en centros oficiales de estudios en todos los niveles de ensentildeanza

9- Los miembros de los organismos consultivos de la Administracioacuten puacuteblica gallega respecto de los certificados emitidos por dichos organismos

COacuteDIGO TASAS

DESCRIPCIOacuteN IMPORTE euro

314400 Prestacioacuten de servicios en el Instituto Tecnoloacutegico para el Control del Medio Marino de Galicia

314401 Anaacutelisis de biotoxinas marinas en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de Yasumoto 1978 4752

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en rato segundo o meacutetodo de Yasumoto 1984 5432

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS)

9520 -Anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten

seguacuten el meacutetodo de la AOAC 4752

scv 4 de 7

-Anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo da AOAC 4752

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1978 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10186

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1984 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10865

-Anaacutelisis combinada en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS) anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo AOAC y anaacutelisis de toxicidad de tipo ASP por cromatografiacutea liquida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo de la AOAC 15000

314402 Anaacutelisis de muestras en agua de mar -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton marino mediante

microscopiacutea oacuteptica 15133 -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton toacutexico marino

mediante microscopiacutea oacuteptica 13333 - Anaacutelisis de carbono orgaacutenico disuelto 5093 -Anaacutelisis de nutrientes inorgaacutenicos disueltos 3500 -Anaacutelisis de pigmentos fotosinteacuteticos (clorofila ldquoardquo) por

espectrofluorimetria 1698 314403 Anaacutelisis microbioloacutegicos en moluscos y otros organismos

procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Cuantificacioacuten de E Coli 10186 - Deteccioacuten de Salmonella spp 16975 -Enumeracioacuten de Escherichia coli en moluscos bivalvos

vivos por la teacutecnica de medida directa de impedancia con el sistema BacTrac 4300 6800

314404 Anaacutelisis de contaminantes de origen quiacutemica en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Determinacioacuten de metales pesados (Pb Cd Cu Zn As Hg Ni Cr Ag) mediante espectrofotometriacutea de absorcioacuten atoacutemica por metal

6790

-Determinacioacuten de compuestos bifenilos policlorados (PCB) mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

scv 5 de 7

-Determinacioacuten de pesticidas organoclorados mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

-Determinacioacuten de hidrocarburos aromaacuteticos policiacuteclicos (HAPs) mediante cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de fluorescencia

28200

314405 Anaacutelisis histopatoloacutegica de moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Estudio hispatoloacutegico Determinacioacuten de Bonamia Marteillia Perkinsus y otras alteraciones patoloacutegicas

101852

314406 Emisioacuten de certificaciones e informes teacutecnicos y otras actuaciones a peticioacuten del interesado

Emisioacuten de certificados a peticioacuten de los interesados sobre las actuaciones llevadas a cabo por el Instituto

1000

Emisioacuten de informes teacutecnicos a peticioacuten del interesado (euros por hora o fraccioacuten)

4000

scv 6 de 7

scv 7 de 7

ANEXO 3

Resultados de anaacutelisis en muestras de microalgas anteriormente enviadas procedentes de Magallanes por el equipo de espectrometriacutea de masas utilizado por INTECMAR Trabajo presentado a las XXXII

Congreso de Ciencias del Mar realizado en Punta Arenas 22-25 octubre de 2012

PERFIL DE TOXINAS DE PROROCENTRUM LIMA (DINOPHYCEAE) AISLADO DESDE LA COSTA DE MAGALLANES SUR DE CHILE P Salgado1 G Pizarro1 JM Franco2 P Rioboacute2 e I Bravo3

1Instituto de Fomento Pesquero (IFOP) Punta Arenas Chile gemitapizarroifopcl 2Instituto de Investigaciones Marinas (CSIC) Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea 3Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea

Prorocentrum lima (Ehrenberg) es un dinoflagelado marino bentoacutenico que se encuentra adherido generalmente

sobre macroalgas sedimentos y detrito flotante y menos comuacutenmente en el plancton (Bravo et al 2001) Es una especie neriacutetica y estuarina y su rango de distribucioacuten geograacutefica variacutea desde aguas costeras tropicales a templadas (Faust 1991) La importancia de P lima se debe a que son productoras de toxinas diarreogeacutenicas en las personas (veneno diarreico de los mariscos VDM) al igual que algunas especies de Dinophysis aunque raramente se le han asociado con episodios toacutexicos por VDM por su caraacutecter epiacutefito y bentoacutenico El complejo VDM producido por P lima incluye moleacuteculas conocidas como el aacutecido okadaico (AO) y derivados dinofisistoxinas (DTX-1 DTX-2) (Bravo et al 2001 Vale et al 2009) No obstante existen casos citados para USA donde se detectoacute toxicidad por VDM en bivalvos de cultivos asociadas a P lima aunque en bajos niveles (Maranda et al 2007a) En Canadaacute tambieacuten se llevoacute a cabo un estudio en moluscos de cultivo cuya finalidad fue determinar el origen del VDM en la que P lima fue la principal especie sospechosa tras la ocurrencia de un evento toacutexico humano por VDM ocurrido en 1998 (Levasseur et al 2003) y en antildeos anteriores (Quilliam et al 1993) Aunque Levasseur et al (2003) no logroacute probar la toxicidad de los mariscos en cultivo a causa de P lima cabe hacer notar que lo que buscaron fue OA y DTX1 no DTX 3 este uacuteltimo principal derivado de las anteriores tras su transformacioacuten en los moluscos (eg Suzuki et al 1999 Vale amp Sampayo 2002)

En consecuencia el rol de P lima en eventos toacutexicos por VDM auacuten no puede descartarse por cuanto podriacutean llegar a ser importantes en ambientes turbulentos debido a la eventual remocioacuten de microalgas adheridas en sustratos por efecto de vientos (Levasseur et al 2003) factor de importancia si se trata de sedimentos o contrariamente en zonas someras y estables de cultivos de moluscos que al mismo tiempo favorecen microambientes para sustratos en los que prolifera la epiacutefita P lima (Lawrence et al 2000) quedando expuestas a re-suspensiones temporales que favorecen la filtracioacuten de estas microalgas por los bivalvos en cultivo (Maranda et al 2007a)

Chile posee escaso conocimiento sobre esta especie en su medio natural incluido su perfil de toxinas y potencial rol en la toxificacioacuten de moluscos por VDM Por tal razoacuten resultoacute interesante aportar al conocimiento de estos aspectos en muestras de sedimentos recolectadas en el estrecho de Magallanes en las que esta especie se encontroacute inhabitualmente abundante

Las ceacutelulas utilizadas en este estudio fueron aisladas desde sedimentos superficiales (0-3 cm) recolectados en el invierno de 2010 en la localidad de cabo San Isidro durante el muestreo regular del programa de monitoreo de marea roja en la regioacuten de Magallanes En esa oportunidad se logroacute cuantificar hasta 1002 quistes tecadoscm3 de Prorocentrum lima la mayor concentracioacuten respecto a otros sitios de recolecta (Fig 1) Los sedimentos de esta localidad presentaron una coloracioacuten oscura y un fuerte olor a sulfuro de hidroacutegeno (H2S) producto de anoxia local

Se aislaron entre 27 y 87 quistes tecados (Fig 1 a) directamente desde los sedimentos mientras otras 60 ceacutelulas vegetativas (Fig 1 b) fueron aisladas luego de promover la actividad y divisioacuten de los quistes en condiciones de 15 ordmC y un ciclo de luzoscuridad de 1212 horas (Tabla 1) Para este fin se aislaron quistes tecados y trasvasijaron a placas Petri de 5 cm de diaacutemetro conteniendo 5 mL de medio de cultivo L1 Para el anaacutelisis de toxinas las ceacutelulas aisladas fueron trasvasijadas a un tubo Eppendorf de 15 mL y congelados a -80 ordmC Una aliacutecuota de sedimento huacutemedo (100 microL aproximados) tambieacuten fue vaciada en un tubo Eppendorf y congelado Para extraer la toxina se antildeadioacute 500 microL de metanol 100 a cada tubo se mezcloacute por 1 min y filtroacute por 045 microm trasvasijando a un vial El extracto fue secado bajo nitroacutegeno gas a 40 ordmC y conservado a 4 ordmC hasta su anaacutelisis Previo al anaacutelisis de toxinas los extractos fueron resuspendidos en 150 microl de metanol

La presencia de la toxina dinofisistoxina 1 (DTX-1) en las muestras (Fig2) fue confirmada en modo negativo a traveacutes de su ioacuten precursor [M-H]- mz 8175 y sus iones productos mz 5634 y 2552 mediante un cromatoacutegrafo UPLC Acquity Waters acoplado a un triple cuadrupolo Waters Xevo TQ (LC-MS) La columna utilizada fue una Acquity UPLC BEH C18 17microm 21 x 100 mm a 45 ordmC La fase moacutevil consistioacute en (A) hidroacutexido amoacutenico a pH 11 y (B) hidroacutexido amoacutenico en acetonitrilo (67 mM) con una tasa de flujo de 4 mLmin El gradiente de elucioacuten utilizado fue el siguiente mantencioacuten al 75 de A entre 0 y 066 min cambio a 5 de A entre 066 y 330 min mantener 5

de A entre 330 y 528 min recuperacioacuten del 75 de A entre 528 y 726 min mantencioacuten al 75 de A hasta 9 min Se pinchoacute 5microL de muestra en el LC-MS El contenido de DTX-1 en las muestras fue cuantificado en base al ion precursor

Los tres tipos de muestras fueron positivas a la presencia de DTX-1 pero las ceacutelulas vegetativas fueron las que presentaron un mayor contenido de DTX-1 por ceacutelula La deteccioacuten de DTX-1 en los sedimentos (Tabla 2) reflejoacute la presencia de los quistes tecados en eacutestos

Figura 1 Concentraciones de quistes tecados de Prorocentrum lima (quistescm3 de sedimento huacutemedo) en estaciones de muestreo en el Estrecho de Magallanes (M26 Estero Wickham M29N1 Isla Engenfield M31 Bahiacutea Nash M35 Cabo San Isidro M39C1 Bahiacutea Gente Grande M39C2 Bahiacutea Inuacutetil M39C3 Canal Gabriel) y Canal Beagle (M41 Ventisquero Espantildea M42 Ventisquero Holanda) (a) Quistes tecados (b) ceacutelulas vegetativas obtenidas de germinacioacuten de quistes tecados bajo condiciones de laboratorio Barra de escala 20 microm

Tabla 1 Sedimento y ceacutelulas de Prorocentrum lima aisladas para anaacutelisis de toxinas

Extracto metanoacutelico Nordm de ceacutelulas TR ngmL pg DTX-1 ceacutel

G1 quistes tecados 27 213 lt2 -

G2 quistes tecados 67 214 05 11

G3 quistes tecados 87 215 12 21

G4 ceacutelulas vegetativas 60 215 34 87

G6 sedimentos aliacutecuota 213 13 19 pg microL sed

TR tiempo de retencioacuten

Figura 2 Cromatogramas de extractos metanoacutelicos de Prorocentrum lima quistes tecados (a) ceacutelulas vegetativas (b) y sedimentos (c)

Tabla 2 Caracteriacutesticas del sedimento con quistes tecados de Prorocentrum lima

Tipo Tamantildeo (mm)

Grava 2 35

Arena media 025 - 05 32

Arena muy fina 0063 - 0125 2

Limo-arcilla lt 0063 1

Estos resultados constituyen otra eventual posibilidad de toxicidad en los moluscos por VDM no soacutelo de aquellos con modalidad de vida bentoacutenica superficial sino de aquellos que tambieacuten viven enterrados en la arena (eg almeja huepo) Maacutes auacuten si se conoce que P lima posee la capacidad de desarrollar poblaciones naturales en aguas templadas en nuacutemeros que podriacutean justificar una toxicidad por VDM en los mariscos (eg Maranda et al 2007a b)

Referencias

Bravo I ML Fernaacutendez I Ramilo amp A Martinez 2001 Toxin composition of the toxic dinofagellate Prorocentrum lima isolated from different locations along the Galician coast (NW Spain) Toxicon 39 1537ndash1545

Faust MA 1991 Morphology of ciguatera-causing Prorocentrum lima (Pyrrophyta) from widely differing sites J Phycol 27 642-648

Lawrence J E Grant J Quilliam M A Bauder A G amp Cembella A D 2000 Colonizaition and growth of the toxic dinoflagellate Prorocentrum lima and associated fouling macroalgae on mussels in suspended culture Mar Ecol Prog Ser 201 147-154

Levasseur M Couture J Y Weise A M Michaud S Elbrachter M Sauveacute G amp Bonneau E 2003 Pelagic and epiphytic summer distributions of Prorocentrum lima and P mexicanum at two mussel farms in the Gulf of St Lawrence Aquat Microbiol Ecol 30283-293

Maranda L Corwin S Dover S amp Morton S L 2007a Prorocentrum lima (Dinophyceae) in northeastern USA coastal waters II Toxin load in the epibiota and in shellfish Harmful Algae 6 632-641

Maranda L Corwin S Hargraves P E 2007b Prorocentrum lima (Dinophyceae) in 19 northeastern USA coastal waters I Abundance and distribution Harmful Algae 6 623ndash631

Quilliam MA Gilgan MW amp Pleasance S 1993 Confirmation of an incident of diarrhetic shellfish poisoning in eastern Canada In Smayda TJ Shimizu Y (Eds) Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea Elsevier New York pp 547ndash552

Suzuki T Ota H amp Yamasaki M 1999 Direct evidence of transformation of dinophysistoxin-1 to 7-O-acyl-dinophysistoxin-1 (Dinophysis-3) in the scallop Patinopecten yessoensis Toxicon 37 187-198

Vale P amp Sampayo M A 2002 First confirmation of human diarrhoeic poisonings by okadaic acid esters after ingestion of razor clams (Solen marginatus) and green crabs (Carcinus maenas) in Aveiro lagoon Portugal and detection of okadaic acid esters in phytoplankton Toxicon 40989-996

Vale P Veloso V amp Amorim A 2009 Toxin composition of a Prorocentrum lima strain isolated from the Portuguese coast Toxicon 54145ndash152

Agradecimientos Intecmar de la Xunta de Galicia Espantildea donde se realizaron los anaacutelisis de toxinas proyecto

SUBPESCA ldquoManejo y Monitoreo de Mareas Rojas en las regiones de Los Lagos Ayseacuten y Magallanes IV etapa 2010rdquo

ANEXO 4

Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten

ANEXO 5

Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de Magallanes

TASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

O

EJE

MP

LA

R P

AR

A E

L IN

TE

RE

SA

DO

LIQ

UID

AC

IOacuteN

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

EN

TID

AD

BA

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AR

IATASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

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Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

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SIV

OL

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CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

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NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

0 9

4 0

2 4INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

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LA

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RA

CIOacute

NTASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

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Firma del declarante o representante legal

de de 20

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SU

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N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

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NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

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COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

9520 euros

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

CONSELLERIA DE FACENDA

ANEXO 6

Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para cierre

de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

Seccioacuten Ediciones y Produccioacuten Almte Manuel Blanco Encalada 839

Fono 56-32-2151500 Valparaiacuteso Chile

wwwifopcl

Page 22: “Análisis de toxinas lipofílicas mediante LC-MS/MS en ...metadatos.mma.gob.cl/sinia/Informe_final_Analisis_toxinas_lipofilicas_656-055.pdfSUBSECRETARÍA DE ECONOMÍA: INFORME FINAL:

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo

15

Lembeye G Yasumoto Y Zhao J amp Fernaacutendez R 1993 DSP outbreak in Chilean fiords In

Smayda T J amp Shimizu Y (Eds) Toxic phytoplankton blooms in the sea Elsevier Amsterdam pp 525-529

Loacutepez-Rivera A OrsquoCallaghan K Moriarty M OrsquoDriscoll D Hamilton B Lehane M James KJ

amp Furey A 2010 First evidence of azaspiracids (AZAs) A family of lipophilic polyether marine toxins in scallops (Argopecten purpuratus) and mussels (Mytilus chilensis) collected in two regions of Chile Toxicon 55 692-701

Miles CO Wilkins AL Munday R Dines MH Hawkes AD Briggs LR Sandvik M Jensen

DJ Cooney JM Holland PT Quilliam MA MacKenzie AL Beuzenberg V amp Towers NR 2004 Isolation of pectenotoxin-2 from Dinophysis acuta and its conversion to pectenotoxin-2 seco acid and preliminary assessment of their acute toxicities Toxicon 431ndash9

Paz B Daranas AH Norte M Rioboacute P Franco JM amp Fernaacutendez JJ 2008 Yessotoxins a

group of marine polyether toxins an overview Mar Drugs 673-102 Pizarro G Alarcoacuten C Franco JM Escalera L Reguera B Vidal G Palma M amp Guzmaacuten L 2011

Distribucioacuten espacial de Dinophysis spp y deteccioacuten de toxinas DSP en el agua mediante resinas DIAION (verano 2006 X regioacuten de Chile) CiencTecnol 34(1)25-50

Pizarro G Paz B Salgado P Aacutelvarez-Chaver P Garrido C amp Guzmaacuten L 2012 Perfil de toxinas

de Protoceratium reticulatum aislados de la regioacuten de Ayseacuten XXXII Congreso de Ciencias del Mar 22-25 octubre 2012 Universidad de Magallanes Punta Arenas Chile Libro de resuacutemenes p 83

Richard DJA Arsenault E Cembella AD Quilliam MA 2000 Investigations into the toxicology

and pharmacology of spirolides a novel group of shellfish toxins In Hallegraeff GM Blackburn SI Bolch CJ Lewis RJ (eds) Proceedings of the 9th conference on harmful algal blooms Hobart Australia pp 383ndash386

Salgado P Pizarro G Franco JM Rioboacute P Bravo I Perfil de toxinas de Prorocentrum lima

(Dinophyceae) aislado desde la costa de Magallanes sur de Chile In Proceedings of Libro de resuacutemenes del XXXII Congreso de Ciencias del Mar Punta Arenas Chile 22-26 de Octubre 2012 p 228

Trefault N B Krock N Delherbe A Cembella amp M Vaacutesquez 2011 Latitudinal transects in the

southeastern Pacific Ocean reveal a diverse but patchy distribution of phycotoxins Toxicon 58(5) 389ndash397

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16

Uribe J C Garciacutea C Rivas M and Lagos N 2001 First report of diarrhetic shellfish toxins in

Magellanic fjords southern Chile J Shellfish Res 2069-74 Yasumoto T Oshima Y amp Yamaguchi M 1978 Occurrence of a new type of shellfish poisoning in

the Tohoku district Bull Jpn Soc Sci Fish 44 1249-1255 Yasumoto T Murata M Lee J-S amp Torigoe KTD 1989 Polyether toxins produced by

dinoflagellates In Natori S Hashimoto K Ueno Y (Eds) Mycotoxins and Phycotoxins rsquo88 Elsevier Amsterdam pp 375ndash382

Yasumoto T amp Takizawa A 1997 Fluorometric measurements of yessotoxins in shellfish high-

pressure liquid chromatography Biosci Biotech Biochem 611775-1777 Zhao J Lembeye G Cenci G Wall B amp Yasumoto T 1993 Determination of okadaic acid and

dinophysistoxin-1 in mussels from Chile Italy and Ireland In Smayda T J amp Shimizu Y (Eds) Toxic phytoplankton blooms in the sea Elsevier Amsterdam pp 587-592

F I G U R A

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Figura 1 Estaciones y sectores muestreados (ciacuterculo rojo) y sector Fortuna donde fue recolectado el

caracol piquilhue (ciacuterculo amarillo)

T A B L A S

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Tabla 1 Condiciones cromatograacuteficas para el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas usando

una columna de UPLC C18 en fase reversa y medio baacutesico

Columna Acquity UPLC BEH C18 17 microm 21x100 mm

Temperatura columna 45 ordmC

Flujo 04 mlmin

Volumen inyeccioacuten 5 microl

Temperatura muestras 10 plusmn 5 ordmC

Gradiente

Tiempo (min) Fase A () Fase B ()

0 75 25

066 75 25

330 5 95

528 5 95

726 75 25

900 75 25

Tabla 2 Paraacutemetros de la fuente de ionizacioacuten para el Xevo TQMS (Waters) en la determinacioacuten de toxinas lipofiacutelicas

PARAacuteMETROS DE LA FUENTE

ESI- ESI+

AO DTX2 DTX1 YTX homoYTX 45OH YTX y 45OH

homoYTX

AZA1 AZA2 AZA3 PTX2 PTX1 y SPX1

Voltaje de capilar (V) 100 200

Temperatura de solvatacioacuten (ordmC) 450 450

Flujo gas de solvatacioacuten (lh) 850 850

Flujo gas cono (lh) 50 50

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Tabla 3

Resumen de las condiciones de espectrometriacutea de masas empleadas con el Xevo TQMS (Waters) en el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas

Compuesto tR (min)

ESI

Ioacuten Precursor

(mz)

Ioacuten Producto

(mz)

Dwell time (s)

Energiacutea colisioacuten

(eV)

Voltaje cono (V)

AO 189 NEG 8035 2552 0010 46 86

113 0010 56 86

DTX2 210 NEG 8035 2552 0010 46 86

113 0010 56 86

DTX1 214 NEG 8175 5634 0010 43 86

2552 0010 48 86

YTX 202 NEG 5704 4674 0010 30 45

3963 0010 35 45

45OH-YTX 182 NEG 5784 4674 0010 30 45

3964 0010 30 45

HomoYTX 203 NEG 5775 4744 0010 30 48

4034 0010 30 48

45OH-homoYTX 182 NEG 5855 4034 0010 30 45

4744 0010 30 45

PTX1 306 POS 8925 8395 0015 25 36

8215 0015 25 36

PTX2 362 POS 8765 8415 0015 20 36

8235 0015 25 36

AZA1 263 POS 8425 6545 0015 55 50

3622 0015 50 50

AZA2 270 POS 8565 6725 0015 45 27

6545 0015 45 27

AZA3 236 POS 8285 6404 0015 55 47

3622 0015 55 47

SPX1 368 POS 6925 6744 0015 27 60

1643 0015 42 60 Transicioacuten cuantificadora

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Tabla 4 TRR y valores de tolerancia para las toxinas analizadas

TOXINA TRR TOLERANCIA

Toxinas del grupo de AO

AO 1000 0990-1010

DTX2 1040 1014-1066

DTX1 1140 1111-1168

Toxinas del grupo de PTX

PTX2 1000 0990-1010

PTX1 0850 0829-0871

Toxinas del grupo de YTX

YTX 1000 0990-1010

45OH-YTX 0894 0871-0916

Homo YTX 1000 0990-1010

45OH-homoYTX 0899 0876-0921

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Tabla 5 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de moluscos

Nordm estMes

recolectaLocalidad Molusco

cuerpo

enterohepat

gramos

carne

toxicidad

VDM ratoacuten

PTX2

(ugKg)

YTX

(ugKg)

45OHYTX

(ugKg)

DTX1

libre

(ugKg)

DTX1

total

(ugkg)

SPX 1

(ugKg)

M13 ene-13 E Peel chorito x 5086 + 01 02

M13 ene-13 E Peel ostioacuten x 5155 No real izado 16 21

M33 ene-13 B Bell chorito x 5253 + 04

M37 ene-13 B Agua Fresca chorito x 5039 + 05 01

M35 ene-13 C San Isidro chorito x 5289 + 000 01

M42 ene-13 V Holanda chorito x 5231 + 06 13

M43 ene-13 B Yendegaia chorito x 5193 + 04 25

M45 ene-13 Pto Williams chorito x 5161 - 28 07

M08 feb-13 E Falcon cholga x 5027 - 14

M09 feb-13 E Penguumlin cholga x 5103 + 14

M22 feb-13 E de las Montantildeas cholga x 5052 - 26

M23 feb-13 I Ballesteros cholga x 5204 - 87

M24 feb-13 B Fanny chorito x 2016 - 38 1071 479 12

M25 feb-13 E Silva Palma chorito x 1447 - 59 1077 898 09

M26 feb-13 E Wickham chorito x 1093 - 194 2940 2232 66 66

M27 feb-13 E Sullivan chorito x 1137 - 450 1944 1478

M28 feb-13 E Nuntildeez chorito x 1179 + 33 721 407

M29 feb-13 Cutter Cove chorito x 1003 - 65 501 309

M29N1 feb-13 I Engelfield chorito x 1116 - 297 2007 1483

M31 feb-13 B Nash chorito x 2231 +

M33 feb-13 B Bell chorito x 1181 - 93

M34 feb-13 S Pedro chorito x 0726 -

M35 feb-13 C San Isidro chorito x 1178 + 110

M36 feb-13 B Buena chorito x 1367 +

M37 feb-13 B Agua Fresca chorito x 0850 + 45 100 80

M39 feb-13 Pto Zenteno chorito x 3241 + 28

M39N2 feb-13 Pta San Valentin chorito x 1712 - 11

M39N3 feb-13 Pto Yartou chorito x 2035 - 11

sector

Fortunajul-12 B Inuacutetil

caracol

piquilhuex 107000 + 01

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Tabla 6 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de microalgas

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Tabla 7 Niveles actualmente permitidos por la legislacioacuten europea (bioensayo) y los niveles propuestos por la

autoridad europea para la seguridad alimentaria (EFSA) (Gerssen et al 2010)

Toxin Legislacioacuten (μg kg-

1) Proposicioacuten

EFSA (μg kg-1)

Validacioacuten LC-MSMS

(μg kg-1)

OA and DTXs 160 45

PTXs 120

YTXs 1000 3750

AZAs 160 32

SPXs 400 (Gerssen et al2010)

European Food Safety Authority Decisioacuten 2002657 de la Unioacuten Europea EC Incluye PTXs

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Tabla 8 Abundancia relativa ambiental de las microalgas al momento de recolectar las muestras de moluscos En rojo se indica la deteccioacuten de toxina positiva en los moluscos asociada a la supuesta microalga fuente PTXs (D

acuminata) YTXs (P reticulatum) SPXs (A ostenfeldii) DTX1 (A acuta)

(Tabla modificada de Guzmaacuten et al 2014)

A N E X O S

ANEXO 1

Certificacioacuten laboratorio INTECMAR

ANEXO 2

Lista de anaacutelisis que realiza INTECMAR y sus costos (en euros) 2013

scv 1 de 7

GUIA PARA LA AUTOLIQUIDACIOacuteN DE TASAS A FAVOR DE LA COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA 2013 Los aspectos financieros de los servicios prestados por Intecmar en el marco de su actividad e vienen regulados en la Ley 62003 de 9 de diciembre de tasas precios y exenciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia (DOG nuacutem 240 de 11122003) y fueron actualizados posteriormente en la Ley 142010 de 27 de diciembre de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2011 (DOG nuacutem 250 de 30122010) y en la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013 (DOG nuacutem 42 de 28022013) Existen dos maneras de liquidar las tasas correspondientes a los servicios prestados por Intecmar

1 De forma manual cubriendo el modelo A de autoliquidacioacuten que se descarga en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda y que adjunto en pdf y se lleva al banco para su pago httpwwwconselleriadefacendaeswebportalconfeccion-impresos

2 De forma telemaacutetica en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda viacutenculo httpshostcixtecesXEITObinlionwebXeitodllxmit a traveacutes del modelo 730

Ambos modelos de liquidacioacuten de tasas adjuntamos ejemplo al final de este documento deben ser remitidos por mail a Intecmar con el sello del banco fiacutesico o virtual como paso previo a la emisioacuten del certificado Los coacutedigos generales necesarios son

minus Consejeriacutea de Medio Rural y de Mar Coacutedigo 09 minus Delegacioacuten de Pontevedra Coacutedigo 40 minus Servicio de Intecmar Coacutedigo 24

Los coacutedigos y descripcioacuten de las tasas son los regulados en la legislacioacuten vigente y los hemos resumido en los anexos siguientes Vilaxoaacuten 4 de marzo de 2013

scv 2 de 7

TARIFAS DE TASAS VIGENTES PARA 2013 - Ley 22013 d e 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013

(DOG nuacutem 42 de 28022013)

Estas tarifas son consecuencia de la actualizacioacuten de las tarifas contenidas en los anexos 1 2 3 4 y 5 de la Ley 62003 del 9 de diciembre de tasas precios y exacciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia por la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 Seraacuten aplicables desde el diacutea de la entrada en vigor de la Ley de

presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 TASA POR SERVICIOS ADMINISTRATIVOS

No sujecioacuten No se exigiraacute la tasa por servicios administrativos cuando se trate de compulsas o cotejos de documentos que deban acompantildear a solicitudes escritos o comunicaciones presentadas por el ciudadano y realizadas en el aacutembito de actuacioacuten de los registros seguacuten lo dispuesto en el artiacuteculo 385 de la Ley 301992 del 26 de noviembre de reacutegimen juriacutedico de las administraciones puacuteblicas y del procedimiento administrativo comuacuten

Excepciones Estaraacuten exentos de la presente tasa

1- La expedicioacuten de certificados de retribuciones satisfechas por la Xunta de Galicia con el objeto de justificacioacuten en relacioacuten con el impuesto sobre la renta de las personas fiacutesicas

2- La expedicioacuten de certificados y compulsa que el personal de la Administracioacuten solicite respecto a las necesidades propias del puesto de trabajo o relacioacuten de servicios

3- Los alumnos por cualquier actuacioacuten en materia de ensentildeanzas no universitarias

scv 3 de 7

4- Las compulsas realizadas en las oficinas de empleo para los desempleados en la tramitacioacuten de expedientes que sean competencia de dichas oficinas

5 La inscripcioacuten en las convocatorias para a seleccioacuten de personal de la comunidad autoacutenoma despueacutes de justificacioacuten documental solicitada por

- Personas con discapacidad igual o superior al 33 - Personas que sean miembros de familias numerosas clasificadas en la

categoriacutea especial Se aplicaraacute una bonificacioacuten del 50 a la inscripcioacuten solicitada por - Personas que sean miembros de familias numerosas de categoriacutea

general - Personas que figurasen como demandantes de empleo desde por lo

menos seis meses antes a la fecha de la convocatoria de pruebas selectivas de personal en las que soliciten su participacioacuten y no esteacuten percibiendo prestacioacuten o subsidio por desempleo

6- La expedicioacuten de certificados relativos a la situacioacuten fiscal 7- El Estado y los demaacutes entes puacuteblicos territoriales o institucionales

siempre que los servicios o actividades de que sean beneficiarios se presten o se realicen en el marco del principio de colaboracioacuten entre administraciones

8- Las viacutectimas de actos terroristas asiacute como sus coacutenyuges y sus hijos por cualquier actuacioacuten en materia educativa realizada en centros oficiales de estudios en todos los niveles de ensentildeanza

9- Los miembros de los organismos consultivos de la Administracioacuten puacuteblica gallega respecto de los certificados emitidos por dichos organismos

COacuteDIGO TASAS

DESCRIPCIOacuteN IMPORTE euro

314400 Prestacioacuten de servicios en el Instituto Tecnoloacutegico para el Control del Medio Marino de Galicia

314401 Anaacutelisis de biotoxinas marinas en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de Yasumoto 1978 4752

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en rato segundo o meacutetodo de Yasumoto 1984 5432

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS)

9520 -Anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten

seguacuten el meacutetodo de la AOAC 4752

scv 4 de 7

-Anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo da AOAC 4752

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1978 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10186

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1984 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10865

-Anaacutelisis combinada en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS) anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo AOAC y anaacutelisis de toxicidad de tipo ASP por cromatografiacutea liquida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo de la AOAC 15000

314402 Anaacutelisis de muestras en agua de mar -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton marino mediante

microscopiacutea oacuteptica 15133 -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton toacutexico marino

mediante microscopiacutea oacuteptica 13333 - Anaacutelisis de carbono orgaacutenico disuelto 5093 -Anaacutelisis de nutrientes inorgaacutenicos disueltos 3500 -Anaacutelisis de pigmentos fotosinteacuteticos (clorofila ldquoardquo) por

espectrofluorimetria 1698 314403 Anaacutelisis microbioloacutegicos en moluscos y otros organismos

procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Cuantificacioacuten de E Coli 10186 - Deteccioacuten de Salmonella spp 16975 -Enumeracioacuten de Escherichia coli en moluscos bivalvos

vivos por la teacutecnica de medida directa de impedancia con el sistema BacTrac 4300 6800

314404 Anaacutelisis de contaminantes de origen quiacutemica en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Determinacioacuten de metales pesados (Pb Cd Cu Zn As Hg Ni Cr Ag) mediante espectrofotometriacutea de absorcioacuten atoacutemica por metal

6790

-Determinacioacuten de compuestos bifenilos policlorados (PCB) mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

scv 5 de 7

-Determinacioacuten de pesticidas organoclorados mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

-Determinacioacuten de hidrocarburos aromaacuteticos policiacuteclicos (HAPs) mediante cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de fluorescencia

28200

314405 Anaacutelisis histopatoloacutegica de moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Estudio hispatoloacutegico Determinacioacuten de Bonamia Marteillia Perkinsus y otras alteraciones patoloacutegicas

101852

314406 Emisioacuten de certificaciones e informes teacutecnicos y otras actuaciones a peticioacuten del interesado

Emisioacuten de certificados a peticioacuten de los interesados sobre las actuaciones llevadas a cabo por el Instituto

1000

Emisioacuten de informes teacutecnicos a peticioacuten del interesado (euros por hora o fraccioacuten)

4000

scv 6 de 7

scv 7 de 7

ANEXO 3

Resultados de anaacutelisis en muestras de microalgas anteriormente enviadas procedentes de Magallanes por el equipo de espectrometriacutea de masas utilizado por INTECMAR Trabajo presentado a las XXXII

Congreso de Ciencias del Mar realizado en Punta Arenas 22-25 octubre de 2012

PERFIL DE TOXINAS DE PROROCENTRUM LIMA (DINOPHYCEAE) AISLADO DESDE LA COSTA DE MAGALLANES SUR DE CHILE P Salgado1 G Pizarro1 JM Franco2 P Rioboacute2 e I Bravo3

1Instituto de Fomento Pesquero (IFOP) Punta Arenas Chile gemitapizarroifopcl 2Instituto de Investigaciones Marinas (CSIC) Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea 3Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea

Prorocentrum lima (Ehrenberg) es un dinoflagelado marino bentoacutenico que se encuentra adherido generalmente

sobre macroalgas sedimentos y detrito flotante y menos comuacutenmente en el plancton (Bravo et al 2001) Es una especie neriacutetica y estuarina y su rango de distribucioacuten geograacutefica variacutea desde aguas costeras tropicales a templadas (Faust 1991) La importancia de P lima se debe a que son productoras de toxinas diarreogeacutenicas en las personas (veneno diarreico de los mariscos VDM) al igual que algunas especies de Dinophysis aunque raramente se le han asociado con episodios toacutexicos por VDM por su caraacutecter epiacutefito y bentoacutenico El complejo VDM producido por P lima incluye moleacuteculas conocidas como el aacutecido okadaico (AO) y derivados dinofisistoxinas (DTX-1 DTX-2) (Bravo et al 2001 Vale et al 2009) No obstante existen casos citados para USA donde se detectoacute toxicidad por VDM en bivalvos de cultivos asociadas a P lima aunque en bajos niveles (Maranda et al 2007a) En Canadaacute tambieacuten se llevoacute a cabo un estudio en moluscos de cultivo cuya finalidad fue determinar el origen del VDM en la que P lima fue la principal especie sospechosa tras la ocurrencia de un evento toacutexico humano por VDM ocurrido en 1998 (Levasseur et al 2003) y en antildeos anteriores (Quilliam et al 1993) Aunque Levasseur et al (2003) no logroacute probar la toxicidad de los mariscos en cultivo a causa de P lima cabe hacer notar que lo que buscaron fue OA y DTX1 no DTX 3 este uacuteltimo principal derivado de las anteriores tras su transformacioacuten en los moluscos (eg Suzuki et al 1999 Vale amp Sampayo 2002)

En consecuencia el rol de P lima en eventos toacutexicos por VDM auacuten no puede descartarse por cuanto podriacutean llegar a ser importantes en ambientes turbulentos debido a la eventual remocioacuten de microalgas adheridas en sustratos por efecto de vientos (Levasseur et al 2003) factor de importancia si se trata de sedimentos o contrariamente en zonas someras y estables de cultivos de moluscos que al mismo tiempo favorecen microambientes para sustratos en los que prolifera la epiacutefita P lima (Lawrence et al 2000) quedando expuestas a re-suspensiones temporales que favorecen la filtracioacuten de estas microalgas por los bivalvos en cultivo (Maranda et al 2007a)

Chile posee escaso conocimiento sobre esta especie en su medio natural incluido su perfil de toxinas y potencial rol en la toxificacioacuten de moluscos por VDM Por tal razoacuten resultoacute interesante aportar al conocimiento de estos aspectos en muestras de sedimentos recolectadas en el estrecho de Magallanes en las que esta especie se encontroacute inhabitualmente abundante

Las ceacutelulas utilizadas en este estudio fueron aisladas desde sedimentos superficiales (0-3 cm) recolectados en el invierno de 2010 en la localidad de cabo San Isidro durante el muestreo regular del programa de monitoreo de marea roja en la regioacuten de Magallanes En esa oportunidad se logroacute cuantificar hasta 1002 quistes tecadoscm3 de Prorocentrum lima la mayor concentracioacuten respecto a otros sitios de recolecta (Fig 1) Los sedimentos de esta localidad presentaron una coloracioacuten oscura y un fuerte olor a sulfuro de hidroacutegeno (H2S) producto de anoxia local

Se aislaron entre 27 y 87 quistes tecados (Fig 1 a) directamente desde los sedimentos mientras otras 60 ceacutelulas vegetativas (Fig 1 b) fueron aisladas luego de promover la actividad y divisioacuten de los quistes en condiciones de 15 ordmC y un ciclo de luzoscuridad de 1212 horas (Tabla 1) Para este fin se aislaron quistes tecados y trasvasijaron a placas Petri de 5 cm de diaacutemetro conteniendo 5 mL de medio de cultivo L1 Para el anaacutelisis de toxinas las ceacutelulas aisladas fueron trasvasijadas a un tubo Eppendorf de 15 mL y congelados a -80 ordmC Una aliacutecuota de sedimento huacutemedo (100 microL aproximados) tambieacuten fue vaciada en un tubo Eppendorf y congelado Para extraer la toxina se antildeadioacute 500 microL de metanol 100 a cada tubo se mezcloacute por 1 min y filtroacute por 045 microm trasvasijando a un vial El extracto fue secado bajo nitroacutegeno gas a 40 ordmC y conservado a 4 ordmC hasta su anaacutelisis Previo al anaacutelisis de toxinas los extractos fueron resuspendidos en 150 microl de metanol

La presencia de la toxina dinofisistoxina 1 (DTX-1) en las muestras (Fig2) fue confirmada en modo negativo a traveacutes de su ioacuten precursor [M-H]- mz 8175 y sus iones productos mz 5634 y 2552 mediante un cromatoacutegrafo UPLC Acquity Waters acoplado a un triple cuadrupolo Waters Xevo TQ (LC-MS) La columna utilizada fue una Acquity UPLC BEH C18 17microm 21 x 100 mm a 45 ordmC La fase moacutevil consistioacute en (A) hidroacutexido amoacutenico a pH 11 y (B) hidroacutexido amoacutenico en acetonitrilo (67 mM) con una tasa de flujo de 4 mLmin El gradiente de elucioacuten utilizado fue el siguiente mantencioacuten al 75 de A entre 0 y 066 min cambio a 5 de A entre 066 y 330 min mantener 5

de A entre 330 y 528 min recuperacioacuten del 75 de A entre 528 y 726 min mantencioacuten al 75 de A hasta 9 min Se pinchoacute 5microL de muestra en el LC-MS El contenido de DTX-1 en las muestras fue cuantificado en base al ion precursor

Los tres tipos de muestras fueron positivas a la presencia de DTX-1 pero las ceacutelulas vegetativas fueron las que presentaron un mayor contenido de DTX-1 por ceacutelula La deteccioacuten de DTX-1 en los sedimentos (Tabla 2) reflejoacute la presencia de los quistes tecados en eacutestos

Figura 1 Concentraciones de quistes tecados de Prorocentrum lima (quistescm3 de sedimento huacutemedo) en estaciones de muestreo en el Estrecho de Magallanes (M26 Estero Wickham M29N1 Isla Engenfield M31 Bahiacutea Nash M35 Cabo San Isidro M39C1 Bahiacutea Gente Grande M39C2 Bahiacutea Inuacutetil M39C3 Canal Gabriel) y Canal Beagle (M41 Ventisquero Espantildea M42 Ventisquero Holanda) (a) Quistes tecados (b) ceacutelulas vegetativas obtenidas de germinacioacuten de quistes tecados bajo condiciones de laboratorio Barra de escala 20 microm

Tabla 1 Sedimento y ceacutelulas de Prorocentrum lima aisladas para anaacutelisis de toxinas

Extracto metanoacutelico Nordm de ceacutelulas TR ngmL pg DTX-1 ceacutel

G1 quistes tecados 27 213 lt2 -

G2 quistes tecados 67 214 05 11

G3 quistes tecados 87 215 12 21

G4 ceacutelulas vegetativas 60 215 34 87

G6 sedimentos aliacutecuota 213 13 19 pg microL sed

TR tiempo de retencioacuten

Figura 2 Cromatogramas de extractos metanoacutelicos de Prorocentrum lima quistes tecados (a) ceacutelulas vegetativas (b) y sedimentos (c)

Tabla 2 Caracteriacutesticas del sedimento con quistes tecados de Prorocentrum lima

Tipo Tamantildeo (mm)

Grava 2 35

Arena media 025 - 05 32

Arena muy fina 0063 - 0125 2

Limo-arcilla lt 0063 1

Estos resultados constituyen otra eventual posibilidad de toxicidad en los moluscos por VDM no soacutelo de aquellos con modalidad de vida bentoacutenica superficial sino de aquellos que tambieacuten viven enterrados en la arena (eg almeja huepo) Maacutes auacuten si se conoce que P lima posee la capacidad de desarrollar poblaciones naturales en aguas templadas en nuacutemeros que podriacutean justificar una toxicidad por VDM en los mariscos (eg Maranda et al 2007a b)

Referencias

Bravo I ML Fernaacutendez I Ramilo amp A Martinez 2001 Toxin composition of the toxic dinofagellate Prorocentrum lima isolated from different locations along the Galician coast (NW Spain) Toxicon 39 1537ndash1545

Faust MA 1991 Morphology of ciguatera-causing Prorocentrum lima (Pyrrophyta) from widely differing sites J Phycol 27 642-648

Lawrence J E Grant J Quilliam M A Bauder A G amp Cembella A D 2000 Colonizaition and growth of the toxic dinoflagellate Prorocentrum lima and associated fouling macroalgae on mussels in suspended culture Mar Ecol Prog Ser 201 147-154

Levasseur M Couture J Y Weise A M Michaud S Elbrachter M Sauveacute G amp Bonneau E 2003 Pelagic and epiphytic summer distributions of Prorocentrum lima and P mexicanum at two mussel farms in the Gulf of St Lawrence Aquat Microbiol Ecol 30283-293

Maranda L Corwin S Dover S amp Morton S L 2007a Prorocentrum lima (Dinophyceae) in northeastern USA coastal waters II Toxin load in the epibiota and in shellfish Harmful Algae 6 632-641

Maranda L Corwin S Hargraves P E 2007b Prorocentrum lima (Dinophyceae) in 19 northeastern USA coastal waters I Abundance and distribution Harmful Algae 6 623ndash631

Quilliam MA Gilgan MW amp Pleasance S 1993 Confirmation of an incident of diarrhetic shellfish poisoning in eastern Canada In Smayda TJ Shimizu Y (Eds) Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea Elsevier New York pp 547ndash552

Suzuki T Ota H amp Yamasaki M 1999 Direct evidence of transformation of dinophysistoxin-1 to 7-O-acyl-dinophysistoxin-1 (Dinophysis-3) in the scallop Patinopecten yessoensis Toxicon 37 187-198

Vale P amp Sampayo M A 2002 First confirmation of human diarrhoeic poisonings by okadaic acid esters after ingestion of razor clams (Solen marginatus) and green crabs (Carcinus maenas) in Aveiro lagoon Portugal and detection of okadaic acid esters in phytoplankton Toxicon 40989-996

Vale P Veloso V amp Amorim A 2009 Toxin composition of a Prorocentrum lima strain isolated from the Portuguese coast Toxicon 54145ndash152

Agradecimientos Intecmar de la Xunta de Galicia Espantildea donde se realizaron los anaacutelisis de toxinas proyecto

SUBPESCA ldquoManejo y Monitoreo de Mareas Rojas en las regiones de Los Lagos Ayseacuten y Magallanes IV etapa 2010rdquo

ANEXO 4

Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten

ANEXO 5

Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de Magallanes

TASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

O

EJE

MP

LA

R P

AR

A E

L IN

TE

RE

SA

DO

LIQ

UID

AC

IOacuteN

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

EN

TID

AD

BA

NC

AR

IATASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

0 9

4 0

2 4INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

AD

MIN

IST

RA

CIOacute

NTASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

9520 euros

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

CONSELLERIA DE FACENDA

ANEXO 6

Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para cierre

de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

Seccioacuten Ediciones y Produccioacuten Almte Manuel Blanco Encalada 839

Fono 56-32-2151500 Valparaiacuteso Chile

wwwifopcl

Page 23: “Análisis de toxinas lipofílicas mediante LC-MS/MS en ...metadatos.mma.gob.cl/sinia/Informe_final_Analisis_toxinas_lipofilicas_656-055.pdfSUBSECRETARÍA DE ECONOMÍA: INFORME FINAL:

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo

16

Uribe J C Garciacutea C Rivas M and Lagos N 2001 First report of diarrhetic shellfish toxins in

Magellanic fjords southern Chile J Shellfish Res 2069-74 Yasumoto T Oshima Y amp Yamaguchi M 1978 Occurrence of a new type of shellfish poisoning in

the Tohoku district Bull Jpn Soc Sci Fish 44 1249-1255 Yasumoto T Murata M Lee J-S amp Torigoe KTD 1989 Polyether toxins produced by

dinoflagellates In Natori S Hashimoto K Ueno Y (Eds) Mycotoxins and Phycotoxins rsquo88 Elsevier Amsterdam pp 375ndash382

Yasumoto T amp Takizawa A 1997 Fluorometric measurements of yessotoxins in shellfish high-

pressure liquid chromatography Biosci Biotech Biochem 611775-1777 Zhao J Lembeye G Cenci G Wall B amp Yasumoto T 1993 Determination of okadaic acid and

dinophysistoxin-1 in mussels from Chile Italy and Ireland In Smayda T J amp Shimizu Y (Eds) Toxic phytoplankton blooms in the sea Elsevier Amsterdam pp 587-592

F I G U R A

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo FIGURA

Figura 1 Estaciones y sectores muestreados (ciacuterculo rojo) y sector Fortuna donde fue recolectado el

caracol piquilhue (ciacuterculo amarillo)

T A B L A S

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

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Tabla 1 Condiciones cromatograacuteficas para el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas usando

una columna de UPLC C18 en fase reversa y medio baacutesico

Columna Acquity UPLC BEH C18 17 microm 21x100 mm

Temperatura columna 45 ordmC

Flujo 04 mlmin

Volumen inyeccioacuten 5 microl

Temperatura muestras 10 plusmn 5 ordmC

Gradiente

Tiempo (min) Fase A () Fase B ()

0 75 25

066 75 25

330 5 95

528 5 95

726 75 25

900 75 25

Tabla 2 Paraacutemetros de la fuente de ionizacioacuten para el Xevo TQMS (Waters) en la determinacioacuten de toxinas lipofiacutelicas

PARAacuteMETROS DE LA FUENTE

ESI- ESI+

AO DTX2 DTX1 YTX homoYTX 45OH YTX y 45OH

homoYTX

AZA1 AZA2 AZA3 PTX2 PTX1 y SPX1

Voltaje de capilar (V) 100 200

Temperatura de solvatacioacuten (ordmC) 450 450

Flujo gas de solvatacioacuten (lh) 850 850

Flujo gas cono (lh) 50 50

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SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo TABLAS

Tabla 3

Resumen de las condiciones de espectrometriacutea de masas empleadas con el Xevo TQMS (Waters) en el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas

Compuesto tR (min)

ESI

Ioacuten Precursor

(mz)

Ioacuten Producto

(mz)

Dwell time (s)

Energiacutea colisioacuten

(eV)

Voltaje cono (V)

AO 189 NEG 8035 2552 0010 46 86

113 0010 56 86

DTX2 210 NEG 8035 2552 0010 46 86

113 0010 56 86

DTX1 214 NEG 8175 5634 0010 43 86

2552 0010 48 86

YTX 202 NEG 5704 4674 0010 30 45

3963 0010 35 45

45OH-YTX 182 NEG 5784 4674 0010 30 45

3964 0010 30 45

HomoYTX 203 NEG 5775 4744 0010 30 48

4034 0010 30 48

45OH-homoYTX 182 NEG 5855 4034 0010 30 45

4744 0010 30 45

PTX1 306 POS 8925 8395 0015 25 36

8215 0015 25 36

PTX2 362 POS 8765 8415 0015 20 36

8235 0015 25 36

AZA1 263 POS 8425 6545 0015 55 50

3622 0015 50 50

AZA2 270 POS 8565 6725 0015 45 27

6545 0015 45 27

AZA3 236 POS 8285 6404 0015 55 47

3622 0015 55 47

SPX1 368 POS 6925 6744 0015 27 60

1643 0015 42 60 Transicioacuten cuantificadora

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Tabla 4 TRR y valores de tolerancia para las toxinas analizadas

TOXINA TRR TOLERANCIA

Toxinas del grupo de AO

AO 1000 0990-1010

DTX2 1040 1014-1066

DTX1 1140 1111-1168

Toxinas del grupo de PTX

PTX2 1000 0990-1010

PTX1 0850 0829-0871

Toxinas del grupo de YTX

YTX 1000 0990-1010

45OH-YTX 0894 0871-0916

Homo YTX 1000 0990-1010

45OH-homoYTX 0899 0876-0921

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Tabla 5 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de moluscos

Nordm estMes

recolectaLocalidad Molusco

cuerpo

enterohepat

gramos

carne

toxicidad

VDM ratoacuten

PTX2

(ugKg)

YTX

(ugKg)

45OHYTX

(ugKg)

DTX1

libre

(ugKg)

DTX1

total

(ugkg)

SPX 1

(ugKg)

M13 ene-13 E Peel chorito x 5086 + 01 02

M13 ene-13 E Peel ostioacuten x 5155 No real izado 16 21

M33 ene-13 B Bell chorito x 5253 + 04

M37 ene-13 B Agua Fresca chorito x 5039 + 05 01

M35 ene-13 C San Isidro chorito x 5289 + 000 01

M42 ene-13 V Holanda chorito x 5231 + 06 13

M43 ene-13 B Yendegaia chorito x 5193 + 04 25

M45 ene-13 Pto Williams chorito x 5161 - 28 07

M08 feb-13 E Falcon cholga x 5027 - 14

M09 feb-13 E Penguumlin cholga x 5103 + 14

M22 feb-13 E de las Montantildeas cholga x 5052 - 26

M23 feb-13 I Ballesteros cholga x 5204 - 87

M24 feb-13 B Fanny chorito x 2016 - 38 1071 479 12

M25 feb-13 E Silva Palma chorito x 1447 - 59 1077 898 09

M26 feb-13 E Wickham chorito x 1093 - 194 2940 2232 66 66

M27 feb-13 E Sullivan chorito x 1137 - 450 1944 1478

M28 feb-13 E Nuntildeez chorito x 1179 + 33 721 407

M29 feb-13 Cutter Cove chorito x 1003 - 65 501 309

M29N1 feb-13 I Engelfield chorito x 1116 - 297 2007 1483

M31 feb-13 B Nash chorito x 2231 +

M33 feb-13 B Bell chorito x 1181 - 93

M34 feb-13 S Pedro chorito x 0726 -

M35 feb-13 C San Isidro chorito x 1178 + 110

M36 feb-13 B Buena chorito x 1367 +

M37 feb-13 B Agua Fresca chorito x 0850 + 45 100 80

M39 feb-13 Pto Zenteno chorito x 3241 + 28

M39N2 feb-13 Pta San Valentin chorito x 1712 - 11

M39N3 feb-13 Pto Yartou chorito x 2035 - 11

sector

Fortunajul-12 B Inuacutetil

caracol

piquilhuex 107000 + 01

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Tabla 6 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de microalgas

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Tabla 7 Niveles actualmente permitidos por la legislacioacuten europea (bioensayo) y los niveles propuestos por la

autoridad europea para la seguridad alimentaria (EFSA) (Gerssen et al 2010)

Toxin Legislacioacuten (μg kg-

1) Proposicioacuten

EFSA (μg kg-1)

Validacioacuten LC-MSMS

(μg kg-1)

OA and DTXs 160 45

PTXs 120

YTXs 1000 3750

AZAs 160 32

SPXs 400 (Gerssen et al2010)

European Food Safety Authority Decisioacuten 2002657 de la Unioacuten Europea EC Incluye PTXs

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Tabla 8 Abundancia relativa ambiental de las microalgas al momento de recolectar las muestras de moluscos En rojo se indica la deteccioacuten de toxina positiva en los moluscos asociada a la supuesta microalga fuente PTXs (D

acuminata) YTXs (P reticulatum) SPXs (A ostenfeldii) DTX1 (A acuta)

(Tabla modificada de Guzmaacuten et al 2014)

A N E X O S

ANEXO 1

Certificacioacuten laboratorio INTECMAR

ANEXO 2

Lista de anaacutelisis que realiza INTECMAR y sus costos (en euros) 2013

scv 1 de 7

GUIA PARA LA AUTOLIQUIDACIOacuteN DE TASAS A FAVOR DE LA COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA 2013 Los aspectos financieros de los servicios prestados por Intecmar en el marco de su actividad e vienen regulados en la Ley 62003 de 9 de diciembre de tasas precios y exenciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia (DOG nuacutem 240 de 11122003) y fueron actualizados posteriormente en la Ley 142010 de 27 de diciembre de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2011 (DOG nuacutem 250 de 30122010) y en la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013 (DOG nuacutem 42 de 28022013) Existen dos maneras de liquidar las tasas correspondientes a los servicios prestados por Intecmar

1 De forma manual cubriendo el modelo A de autoliquidacioacuten que se descarga en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda y que adjunto en pdf y se lleva al banco para su pago httpwwwconselleriadefacendaeswebportalconfeccion-impresos

2 De forma telemaacutetica en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda viacutenculo httpshostcixtecesXEITObinlionwebXeitodllxmit a traveacutes del modelo 730

Ambos modelos de liquidacioacuten de tasas adjuntamos ejemplo al final de este documento deben ser remitidos por mail a Intecmar con el sello del banco fiacutesico o virtual como paso previo a la emisioacuten del certificado Los coacutedigos generales necesarios son

minus Consejeriacutea de Medio Rural y de Mar Coacutedigo 09 minus Delegacioacuten de Pontevedra Coacutedigo 40 minus Servicio de Intecmar Coacutedigo 24

Los coacutedigos y descripcioacuten de las tasas son los regulados en la legislacioacuten vigente y los hemos resumido en los anexos siguientes Vilaxoaacuten 4 de marzo de 2013

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TARIFAS DE TASAS VIGENTES PARA 2013 - Ley 22013 d e 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013

(DOG nuacutem 42 de 28022013)

Estas tarifas son consecuencia de la actualizacioacuten de las tarifas contenidas en los anexos 1 2 3 4 y 5 de la Ley 62003 del 9 de diciembre de tasas precios y exacciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia por la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 Seraacuten aplicables desde el diacutea de la entrada en vigor de la Ley de

presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 TASA POR SERVICIOS ADMINISTRATIVOS

No sujecioacuten No se exigiraacute la tasa por servicios administrativos cuando se trate de compulsas o cotejos de documentos que deban acompantildear a solicitudes escritos o comunicaciones presentadas por el ciudadano y realizadas en el aacutembito de actuacioacuten de los registros seguacuten lo dispuesto en el artiacuteculo 385 de la Ley 301992 del 26 de noviembre de reacutegimen juriacutedico de las administraciones puacuteblicas y del procedimiento administrativo comuacuten

Excepciones Estaraacuten exentos de la presente tasa

1- La expedicioacuten de certificados de retribuciones satisfechas por la Xunta de Galicia con el objeto de justificacioacuten en relacioacuten con el impuesto sobre la renta de las personas fiacutesicas

2- La expedicioacuten de certificados y compulsa que el personal de la Administracioacuten solicite respecto a las necesidades propias del puesto de trabajo o relacioacuten de servicios

3- Los alumnos por cualquier actuacioacuten en materia de ensentildeanzas no universitarias

scv 3 de 7

4- Las compulsas realizadas en las oficinas de empleo para los desempleados en la tramitacioacuten de expedientes que sean competencia de dichas oficinas

5 La inscripcioacuten en las convocatorias para a seleccioacuten de personal de la comunidad autoacutenoma despueacutes de justificacioacuten documental solicitada por

- Personas con discapacidad igual o superior al 33 - Personas que sean miembros de familias numerosas clasificadas en la

categoriacutea especial Se aplicaraacute una bonificacioacuten del 50 a la inscripcioacuten solicitada por - Personas que sean miembros de familias numerosas de categoriacutea

general - Personas que figurasen como demandantes de empleo desde por lo

menos seis meses antes a la fecha de la convocatoria de pruebas selectivas de personal en las que soliciten su participacioacuten y no esteacuten percibiendo prestacioacuten o subsidio por desempleo

6- La expedicioacuten de certificados relativos a la situacioacuten fiscal 7- El Estado y los demaacutes entes puacuteblicos territoriales o institucionales

siempre que los servicios o actividades de que sean beneficiarios se presten o se realicen en el marco del principio de colaboracioacuten entre administraciones

8- Las viacutectimas de actos terroristas asiacute como sus coacutenyuges y sus hijos por cualquier actuacioacuten en materia educativa realizada en centros oficiales de estudios en todos los niveles de ensentildeanza

9- Los miembros de los organismos consultivos de la Administracioacuten puacuteblica gallega respecto de los certificados emitidos por dichos organismos

COacuteDIGO TASAS

DESCRIPCIOacuteN IMPORTE euro

314400 Prestacioacuten de servicios en el Instituto Tecnoloacutegico para el Control del Medio Marino de Galicia

314401 Anaacutelisis de biotoxinas marinas en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de Yasumoto 1978 4752

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en rato segundo o meacutetodo de Yasumoto 1984 5432

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS)

9520 -Anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten

seguacuten el meacutetodo de la AOAC 4752

scv 4 de 7

-Anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo da AOAC 4752

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1978 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10186

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1984 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10865

-Anaacutelisis combinada en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS) anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo AOAC y anaacutelisis de toxicidad de tipo ASP por cromatografiacutea liquida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo de la AOAC 15000

314402 Anaacutelisis de muestras en agua de mar -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton marino mediante

microscopiacutea oacuteptica 15133 -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton toacutexico marino

mediante microscopiacutea oacuteptica 13333 - Anaacutelisis de carbono orgaacutenico disuelto 5093 -Anaacutelisis de nutrientes inorgaacutenicos disueltos 3500 -Anaacutelisis de pigmentos fotosinteacuteticos (clorofila ldquoardquo) por

espectrofluorimetria 1698 314403 Anaacutelisis microbioloacutegicos en moluscos y otros organismos

procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Cuantificacioacuten de E Coli 10186 - Deteccioacuten de Salmonella spp 16975 -Enumeracioacuten de Escherichia coli en moluscos bivalvos

vivos por la teacutecnica de medida directa de impedancia con el sistema BacTrac 4300 6800

314404 Anaacutelisis de contaminantes de origen quiacutemica en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Determinacioacuten de metales pesados (Pb Cd Cu Zn As Hg Ni Cr Ag) mediante espectrofotometriacutea de absorcioacuten atoacutemica por metal

6790

-Determinacioacuten de compuestos bifenilos policlorados (PCB) mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

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-Determinacioacuten de pesticidas organoclorados mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

-Determinacioacuten de hidrocarburos aromaacuteticos policiacuteclicos (HAPs) mediante cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de fluorescencia

28200

314405 Anaacutelisis histopatoloacutegica de moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Estudio hispatoloacutegico Determinacioacuten de Bonamia Marteillia Perkinsus y otras alteraciones patoloacutegicas

101852

314406 Emisioacuten de certificaciones e informes teacutecnicos y otras actuaciones a peticioacuten del interesado

Emisioacuten de certificados a peticioacuten de los interesados sobre las actuaciones llevadas a cabo por el Instituto

1000

Emisioacuten de informes teacutecnicos a peticioacuten del interesado (euros por hora o fraccioacuten)

4000

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scv 7 de 7

ANEXO 3

Resultados de anaacutelisis en muestras de microalgas anteriormente enviadas procedentes de Magallanes por el equipo de espectrometriacutea de masas utilizado por INTECMAR Trabajo presentado a las XXXII

Congreso de Ciencias del Mar realizado en Punta Arenas 22-25 octubre de 2012

PERFIL DE TOXINAS DE PROROCENTRUM LIMA (DINOPHYCEAE) AISLADO DESDE LA COSTA DE MAGALLANES SUR DE CHILE P Salgado1 G Pizarro1 JM Franco2 P Rioboacute2 e I Bravo3

1Instituto de Fomento Pesquero (IFOP) Punta Arenas Chile gemitapizarroifopcl 2Instituto de Investigaciones Marinas (CSIC) Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea 3Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea

Prorocentrum lima (Ehrenberg) es un dinoflagelado marino bentoacutenico que se encuentra adherido generalmente

sobre macroalgas sedimentos y detrito flotante y menos comuacutenmente en el plancton (Bravo et al 2001) Es una especie neriacutetica y estuarina y su rango de distribucioacuten geograacutefica variacutea desde aguas costeras tropicales a templadas (Faust 1991) La importancia de P lima se debe a que son productoras de toxinas diarreogeacutenicas en las personas (veneno diarreico de los mariscos VDM) al igual que algunas especies de Dinophysis aunque raramente se le han asociado con episodios toacutexicos por VDM por su caraacutecter epiacutefito y bentoacutenico El complejo VDM producido por P lima incluye moleacuteculas conocidas como el aacutecido okadaico (AO) y derivados dinofisistoxinas (DTX-1 DTX-2) (Bravo et al 2001 Vale et al 2009) No obstante existen casos citados para USA donde se detectoacute toxicidad por VDM en bivalvos de cultivos asociadas a P lima aunque en bajos niveles (Maranda et al 2007a) En Canadaacute tambieacuten se llevoacute a cabo un estudio en moluscos de cultivo cuya finalidad fue determinar el origen del VDM en la que P lima fue la principal especie sospechosa tras la ocurrencia de un evento toacutexico humano por VDM ocurrido en 1998 (Levasseur et al 2003) y en antildeos anteriores (Quilliam et al 1993) Aunque Levasseur et al (2003) no logroacute probar la toxicidad de los mariscos en cultivo a causa de P lima cabe hacer notar que lo que buscaron fue OA y DTX1 no DTX 3 este uacuteltimo principal derivado de las anteriores tras su transformacioacuten en los moluscos (eg Suzuki et al 1999 Vale amp Sampayo 2002)

En consecuencia el rol de P lima en eventos toacutexicos por VDM auacuten no puede descartarse por cuanto podriacutean llegar a ser importantes en ambientes turbulentos debido a la eventual remocioacuten de microalgas adheridas en sustratos por efecto de vientos (Levasseur et al 2003) factor de importancia si se trata de sedimentos o contrariamente en zonas someras y estables de cultivos de moluscos que al mismo tiempo favorecen microambientes para sustratos en los que prolifera la epiacutefita P lima (Lawrence et al 2000) quedando expuestas a re-suspensiones temporales que favorecen la filtracioacuten de estas microalgas por los bivalvos en cultivo (Maranda et al 2007a)

Chile posee escaso conocimiento sobre esta especie en su medio natural incluido su perfil de toxinas y potencial rol en la toxificacioacuten de moluscos por VDM Por tal razoacuten resultoacute interesante aportar al conocimiento de estos aspectos en muestras de sedimentos recolectadas en el estrecho de Magallanes en las que esta especie se encontroacute inhabitualmente abundante

Las ceacutelulas utilizadas en este estudio fueron aisladas desde sedimentos superficiales (0-3 cm) recolectados en el invierno de 2010 en la localidad de cabo San Isidro durante el muestreo regular del programa de monitoreo de marea roja en la regioacuten de Magallanes En esa oportunidad se logroacute cuantificar hasta 1002 quistes tecadoscm3 de Prorocentrum lima la mayor concentracioacuten respecto a otros sitios de recolecta (Fig 1) Los sedimentos de esta localidad presentaron una coloracioacuten oscura y un fuerte olor a sulfuro de hidroacutegeno (H2S) producto de anoxia local

Se aislaron entre 27 y 87 quistes tecados (Fig 1 a) directamente desde los sedimentos mientras otras 60 ceacutelulas vegetativas (Fig 1 b) fueron aisladas luego de promover la actividad y divisioacuten de los quistes en condiciones de 15 ordmC y un ciclo de luzoscuridad de 1212 horas (Tabla 1) Para este fin se aislaron quistes tecados y trasvasijaron a placas Petri de 5 cm de diaacutemetro conteniendo 5 mL de medio de cultivo L1 Para el anaacutelisis de toxinas las ceacutelulas aisladas fueron trasvasijadas a un tubo Eppendorf de 15 mL y congelados a -80 ordmC Una aliacutecuota de sedimento huacutemedo (100 microL aproximados) tambieacuten fue vaciada en un tubo Eppendorf y congelado Para extraer la toxina se antildeadioacute 500 microL de metanol 100 a cada tubo se mezcloacute por 1 min y filtroacute por 045 microm trasvasijando a un vial El extracto fue secado bajo nitroacutegeno gas a 40 ordmC y conservado a 4 ordmC hasta su anaacutelisis Previo al anaacutelisis de toxinas los extractos fueron resuspendidos en 150 microl de metanol

La presencia de la toxina dinofisistoxina 1 (DTX-1) en las muestras (Fig2) fue confirmada en modo negativo a traveacutes de su ioacuten precursor [M-H]- mz 8175 y sus iones productos mz 5634 y 2552 mediante un cromatoacutegrafo UPLC Acquity Waters acoplado a un triple cuadrupolo Waters Xevo TQ (LC-MS) La columna utilizada fue una Acquity UPLC BEH C18 17microm 21 x 100 mm a 45 ordmC La fase moacutevil consistioacute en (A) hidroacutexido amoacutenico a pH 11 y (B) hidroacutexido amoacutenico en acetonitrilo (67 mM) con una tasa de flujo de 4 mLmin El gradiente de elucioacuten utilizado fue el siguiente mantencioacuten al 75 de A entre 0 y 066 min cambio a 5 de A entre 066 y 330 min mantener 5

de A entre 330 y 528 min recuperacioacuten del 75 de A entre 528 y 726 min mantencioacuten al 75 de A hasta 9 min Se pinchoacute 5microL de muestra en el LC-MS El contenido de DTX-1 en las muestras fue cuantificado en base al ion precursor

Los tres tipos de muestras fueron positivas a la presencia de DTX-1 pero las ceacutelulas vegetativas fueron las que presentaron un mayor contenido de DTX-1 por ceacutelula La deteccioacuten de DTX-1 en los sedimentos (Tabla 2) reflejoacute la presencia de los quistes tecados en eacutestos

Figura 1 Concentraciones de quistes tecados de Prorocentrum lima (quistescm3 de sedimento huacutemedo) en estaciones de muestreo en el Estrecho de Magallanes (M26 Estero Wickham M29N1 Isla Engenfield M31 Bahiacutea Nash M35 Cabo San Isidro M39C1 Bahiacutea Gente Grande M39C2 Bahiacutea Inuacutetil M39C3 Canal Gabriel) y Canal Beagle (M41 Ventisquero Espantildea M42 Ventisquero Holanda) (a) Quistes tecados (b) ceacutelulas vegetativas obtenidas de germinacioacuten de quistes tecados bajo condiciones de laboratorio Barra de escala 20 microm

Tabla 1 Sedimento y ceacutelulas de Prorocentrum lima aisladas para anaacutelisis de toxinas

Extracto metanoacutelico Nordm de ceacutelulas TR ngmL pg DTX-1 ceacutel

G1 quistes tecados 27 213 lt2 -

G2 quistes tecados 67 214 05 11

G3 quistes tecados 87 215 12 21

G4 ceacutelulas vegetativas 60 215 34 87

G6 sedimentos aliacutecuota 213 13 19 pg microL sed

TR tiempo de retencioacuten

Figura 2 Cromatogramas de extractos metanoacutelicos de Prorocentrum lima quistes tecados (a) ceacutelulas vegetativas (b) y sedimentos (c)

Tabla 2 Caracteriacutesticas del sedimento con quistes tecados de Prorocentrum lima

Tipo Tamantildeo (mm)

Grava 2 35

Arena media 025 - 05 32

Arena muy fina 0063 - 0125 2

Limo-arcilla lt 0063 1

Estos resultados constituyen otra eventual posibilidad de toxicidad en los moluscos por VDM no soacutelo de aquellos con modalidad de vida bentoacutenica superficial sino de aquellos que tambieacuten viven enterrados en la arena (eg almeja huepo) Maacutes auacuten si se conoce que P lima posee la capacidad de desarrollar poblaciones naturales en aguas templadas en nuacutemeros que podriacutean justificar una toxicidad por VDM en los mariscos (eg Maranda et al 2007a b)

Referencias

Bravo I ML Fernaacutendez I Ramilo amp A Martinez 2001 Toxin composition of the toxic dinofagellate Prorocentrum lima isolated from different locations along the Galician coast (NW Spain) Toxicon 39 1537ndash1545

Faust MA 1991 Morphology of ciguatera-causing Prorocentrum lima (Pyrrophyta) from widely differing sites J Phycol 27 642-648

Lawrence J E Grant J Quilliam M A Bauder A G amp Cembella A D 2000 Colonizaition and growth of the toxic dinoflagellate Prorocentrum lima and associated fouling macroalgae on mussels in suspended culture Mar Ecol Prog Ser 201 147-154

Levasseur M Couture J Y Weise A M Michaud S Elbrachter M Sauveacute G amp Bonneau E 2003 Pelagic and epiphytic summer distributions of Prorocentrum lima and P mexicanum at two mussel farms in the Gulf of St Lawrence Aquat Microbiol Ecol 30283-293

Maranda L Corwin S Dover S amp Morton S L 2007a Prorocentrum lima (Dinophyceae) in northeastern USA coastal waters II Toxin load in the epibiota and in shellfish Harmful Algae 6 632-641

Maranda L Corwin S Hargraves P E 2007b Prorocentrum lima (Dinophyceae) in 19 northeastern USA coastal waters I Abundance and distribution Harmful Algae 6 623ndash631

Quilliam MA Gilgan MW amp Pleasance S 1993 Confirmation of an incident of diarrhetic shellfish poisoning in eastern Canada In Smayda TJ Shimizu Y (Eds) Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea Elsevier New York pp 547ndash552

Suzuki T Ota H amp Yamasaki M 1999 Direct evidence of transformation of dinophysistoxin-1 to 7-O-acyl-dinophysistoxin-1 (Dinophysis-3) in the scallop Patinopecten yessoensis Toxicon 37 187-198

Vale P amp Sampayo M A 2002 First confirmation of human diarrhoeic poisonings by okadaic acid esters after ingestion of razor clams (Solen marginatus) and green crabs (Carcinus maenas) in Aveiro lagoon Portugal and detection of okadaic acid esters in phytoplankton Toxicon 40989-996

Vale P Veloso V amp Amorim A 2009 Toxin composition of a Prorocentrum lima strain isolated from the Portuguese coast Toxicon 54145ndash152

Agradecimientos Intecmar de la Xunta de Galicia Espantildea donde se realizaron los anaacutelisis de toxinas proyecto

SUBPESCA ldquoManejo y Monitoreo de Mareas Rojas en las regiones de Los Lagos Ayseacuten y Magallanes IV etapa 2010rdquo

ANEXO 4

Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten

ANEXO 5

Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de Magallanes

TASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

O

EJE

MP

LA

R P

AR

A E

L IN

TE

RE

SA

DO

LIQ

UID

AC

IOacuteN

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

EN

TID

AD

BA

NC

AR

IATASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

0 9

4 0

2 4INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

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MIN

IST

RA

CIOacute

NTASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

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IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

9520 euros

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

CONSELLERIA DE FACENDA

ANEXO 6

Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para cierre

de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

Seccioacuten Ediciones y Produccioacuten Almte Manuel Blanco Encalada 839

Fono 56-32-2151500 Valparaiacuteso Chile

wwwifopcl

Page 24: “Análisis de toxinas lipofílicas mediante LC-MS/MS en ...metadatos.mma.gob.cl/sinia/Informe_final_Analisis_toxinas_lipofilicas_656-055.pdfSUBSECRETARÍA DE ECONOMÍA: INFORME FINAL:

F I G U R A

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo FIGURA

Figura 1 Estaciones y sectores muestreados (ciacuterculo rojo) y sector Fortuna donde fue recolectado el

caracol piquilhue (ciacuterculo amarillo)

T A B L A S

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo TABLAS

Tabla 1 Condiciones cromatograacuteficas para el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas usando

una columna de UPLC C18 en fase reversa y medio baacutesico

Columna Acquity UPLC BEH C18 17 microm 21x100 mm

Temperatura columna 45 ordmC

Flujo 04 mlmin

Volumen inyeccioacuten 5 microl

Temperatura muestras 10 plusmn 5 ordmC

Gradiente

Tiempo (min) Fase A () Fase B ()

0 75 25

066 75 25

330 5 95

528 5 95

726 75 25

900 75 25

Tabla 2 Paraacutemetros de la fuente de ionizacioacuten para el Xevo TQMS (Waters) en la determinacioacuten de toxinas lipofiacutelicas

PARAacuteMETROS DE LA FUENTE

ESI- ESI+

AO DTX2 DTX1 YTX homoYTX 45OH YTX y 45OH

homoYTX

AZA1 AZA2 AZA3 PTX2 PTX1 y SPX1

Voltaje de capilar (V) 100 200

Temperatura de solvatacioacuten (ordmC) 450 450

Flujo gas de solvatacioacuten (lh) 850 850

Flujo gas cono (lh) 50 50

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Tabla 3

Resumen de las condiciones de espectrometriacutea de masas empleadas con el Xevo TQMS (Waters) en el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas

Compuesto tR (min)

ESI

Ioacuten Precursor

(mz)

Ioacuten Producto

(mz)

Dwell time (s)

Energiacutea colisioacuten

(eV)

Voltaje cono (V)

AO 189 NEG 8035 2552 0010 46 86

113 0010 56 86

DTX2 210 NEG 8035 2552 0010 46 86

113 0010 56 86

DTX1 214 NEG 8175 5634 0010 43 86

2552 0010 48 86

YTX 202 NEG 5704 4674 0010 30 45

3963 0010 35 45

45OH-YTX 182 NEG 5784 4674 0010 30 45

3964 0010 30 45

HomoYTX 203 NEG 5775 4744 0010 30 48

4034 0010 30 48

45OH-homoYTX 182 NEG 5855 4034 0010 30 45

4744 0010 30 45

PTX1 306 POS 8925 8395 0015 25 36

8215 0015 25 36

PTX2 362 POS 8765 8415 0015 20 36

8235 0015 25 36

AZA1 263 POS 8425 6545 0015 55 50

3622 0015 50 50

AZA2 270 POS 8565 6725 0015 45 27

6545 0015 45 27

AZA3 236 POS 8285 6404 0015 55 47

3622 0015 55 47

SPX1 368 POS 6925 6744 0015 27 60

1643 0015 42 60 Transicioacuten cuantificadora

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Tabla 4 TRR y valores de tolerancia para las toxinas analizadas

TOXINA TRR TOLERANCIA

Toxinas del grupo de AO

AO 1000 0990-1010

DTX2 1040 1014-1066

DTX1 1140 1111-1168

Toxinas del grupo de PTX

PTX2 1000 0990-1010

PTX1 0850 0829-0871

Toxinas del grupo de YTX

YTX 1000 0990-1010

45OH-YTX 0894 0871-0916

Homo YTX 1000 0990-1010

45OH-homoYTX 0899 0876-0921

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Tabla 5 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de moluscos

Nordm estMes

recolectaLocalidad Molusco

cuerpo

enterohepat

gramos

carne

toxicidad

VDM ratoacuten

PTX2

(ugKg)

YTX

(ugKg)

45OHYTX

(ugKg)

DTX1

libre

(ugKg)

DTX1

total

(ugkg)

SPX 1

(ugKg)

M13 ene-13 E Peel chorito x 5086 + 01 02

M13 ene-13 E Peel ostioacuten x 5155 No real izado 16 21

M33 ene-13 B Bell chorito x 5253 + 04

M37 ene-13 B Agua Fresca chorito x 5039 + 05 01

M35 ene-13 C San Isidro chorito x 5289 + 000 01

M42 ene-13 V Holanda chorito x 5231 + 06 13

M43 ene-13 B Yendegaia chorito x 5193 + 04 25

M45 ene-13 Pto Williams chorito x 5161 - 28 07

M08 feb-13 E Falcon cholga x 5027 - 14

M09 feb-13 E Penguumlin cholga x 5103 + 14

M22 feb-13 E de las Montantildeas cholga x 5052 - 26

M23 feb-13 I Ballesteros cholga x 5204 - 87

M24 feb-13 B Fanny chorito x 2016 - 38 1071 479 12

M25 feb-13 E Silva Palma chorito x 1447 - 59 1077 898 09

M26 feb-13 E Wickham chorito x 1093 - 194 2940 2232 66 66

M27 feb-13 E Sullivan chorito x 1137 - 450 1944 1478

M28 feb-13 E Nuntildeez chorito x 1179 + 33 721 407

M29 feb-13 Cutter Cove chorito x 1003 - 65 501 309

M29N1 feb-13 I Engelfield chorito x 1116 - 297 2007 1483

M31 feb-13 B Nash chorito x 2231 +

M33 feb-13 B Bell chorito x 1181 - 93

M34 feb-13 S Pedro chorito x 0726 -

M35 feb-13 C San Isidro chorito x 1178 + 110

M36 feb-13 B Buena chorito x 1367 +

M37 feb-13 B Agua Fresca chorito x 0850 + 45 100 80

M39 feb-13 Pto Zenteno chorito x 3241 + 28

M39N2 feb-13 Pta San Valentin chorito x 1712 - 11

M39N3 feb-13 Pto Yartou chorito x 2035 - 11

sector

Fortunajul-12 B Inuacutetil

caracol

piquilhuex 107000 + 01

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Tabla 6 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de microalgas

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Tabla 7 Niveles actualmente permitidos por la legislacioacuten europea (bioensayo) y los niveles propuestos por la

autoridad europea para la seguridad alimentaria (EFSA) (Gerssen et al 2010)

Toxin Legislacioacuten (μg kg-

1) Proposicioacuten

EFSA (μg kg-1)

Validacioacuten LC-MSMS

(μg kg-1)

OA and DTXs 160 45

PTXs 120

YTXs 1000 3750

AZAs 160 32

SPXs 400 (Gerssen et al2010)

European Food Safety Authority Decisioacuten 2002657 de la Unioacuten Europea EC Incluye PTXs

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Tabla 8 Abundancia relativa ambiental de las microalgas al momento de recolectar las muestras de moluscos En rojo se indica la deteccioacuten de toxina positiva en los moluscos asociada a la supuesta microalga fuente PTXs (D

acuminata) YTXs (P reticulatum) SPXs (A ostenfeldii) DTX1 (A acuta)

(Tabla modificada de Guzmaacuten et al 2014)

A N E X O S

ANEXO 1

Certificacioacuten laboratorio INTECMAR

ANEXO 2

Lista de anaacutelisis que realiza INTECMAR y sus costos (en euros) 2013

scv 1 de 7

GUIA PARA LA AUTOLIQUIDACIOacuteN DE TASAS A FAVOR DE LA COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA 2013 Los aspectos financieros de los servicios prestados por Intecmar en el marco de su actividad e vienen regulados en la Ley 62003 de 9 de diciembre de tasas precios y exenciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia (DOG nuacutem 240 de 11122003) y fueron actualizados posteriormente en la Ley 142010 de 27 de diciembre de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2011 (DOG nuacutem 250 de 30122010) y en la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013 (DOG nuacutem 42 de 28022013) Existen dos maneras de liquidar las tasas correspondientes a los servicios prestados por Intecmar

1 De forma manual cubriendo el modelo A de autoliquidacioacuten que se descarga en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda y que adjunto en pdf y se lleva al banco para su pago httpwwwconselleriadefacendaeswebportalconfeccion-impresos

2 De forma telemaacutetica en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda viacutenculo httpshostcixtecesXEITObinlionwebXeitodllxmit a traveacutes del modelo 730

Ambos modelos de liquidacioacuten de tasas adjuntamos ejemplo al final de este documento deben ser remitidos por mail a Intecmar con el sello del banco fiacutesico o virtual como paso previo a la emisioacuten del certificado Los coacutedigos generales necesarios son

minus Consejeriacutea de Medio Rural y de Mar Coacutedigo 09 minus Delegacioacuten de Pontevedra Coacutedigo 40 minus Servicio de Intecmar Coacutedigo 24

Los coacutedigos y descripcioacuten de las tasas son los regulados en la legislacioacuten vigente y los hemos resumido en los anexos siguientes Vilaxoaacuten 4 de marzo de 2013

scv 2 de 7

TARIFAS DE TASAS VIGENTES PARA 2013 - Ley 22013 d e 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013

(DOG nuacutem 42 de 28022013)

Estas tarifas son consecuencia de la actualizacioacuten de las tarifas contenidas en los anexos 1 2 3 4 y 5 de la Ley 62003 del 9 de diciembre de tasas precios y exacciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia por la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 Seraacuten aplicables desde el diacutea de la entrada en vigor de la Ley de

presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 TASA POR SERVICIOS ADMINISTRATIVOS

No sujecioacuten No se exigiraacute la tasa por servicios administrativos cuando se trate de compulsas o cotejos de documentos que deban acompantildear a solicitudes escritos o comunicaciones presentadas por el ciudadano y realizadas en el aacutembito de actuacioacuten de los registros seguacuten lo dispuesto en el artiacuteculo 385 de la Ley 301992 del 26 de noviembre de reacutegimen juriacutedico de las administraciones puacuteblicas y del procedimiento administrativo comuacuten

Excepciones Estaraacuten exentos de la presente tasa

1- La expedicioacuten de certificados de retribuciones satisfechas por la Xunta de Galicia con el objeto de justificacioacuten en relacioacuten con el impuesto sobre la renta de las personas fiacutesicas

2- La expedicioacuten de certificados y compulsa que el personal de la Administracioacuten solicite respecto a las necesidades propias del puesto de trabajo o relacioacuten de servicios

3- Los alumnos por cualquier actuacioacuten en materia de ensentildeanzas no universitarias

scv 3 de 7

4- Las compulsas realizadas en las oficinas de empleo para los desempleados en la tramitacioacuten de expedientes que sean competencia de dichas oficinas

5 La inscripcioacuten en las convocatorias para a seleccioacuten de personal de la comunidad autoacutenoma despueacutes de justificacioacuten documental solicitada por

- Personas con discapacidad igual o superior al 33 - Personas que sean miembros de familias numerosas clasificadas en la

categoriacutea especial Se aplicaraacute una bonificacioacuten del 50 a la inscripcioacuten solicitada por - Personas que sean miembros de familias numerosas de categoriacutea

general - Personas que figurasen como demandantes de empleo desde por lo

menos seis meses antes a la fecha de la convocatoria de pruebas selectivas de personal en las que soliciten su participacioacuten y no esteacuten percibiendo prestacioacuten o subsidio por desempleo

6- La expedicioacuten de certificados relativos a la situacioacuten fiscal 7- El Estado y los demaacutes entes puacuteblicos territoriales o institucionales

siempre que los servicios o actividades de que sean beneficiarios se presten o se realicen en el marco del principio de colaboracioacuten entre administraciones

8- Las viacutectimas de actos terroristas asiacute como sus coacutenyuges y sus hijos por cualquier actuacioacuten en materia educativa realizada en centros oficiales de estudios en todos los niveles de ensentildeanza

9- Los miembros de los organismos consultivos de la Administracioacuten puacuteblica gallega respecto de los certificados emitidos por dichos organismos

COacuteDIGO TASAS

DESCRIPCIOacuteN IMPORTE euro

314400 Prestacioacuten de servicios en el Instituto Tecnoloacutegico para el Control del Medio Marino de Galicia

314401 Anaacutelisis de biotoxinas marinas en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de Yasumoto 1978 4752

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en rato segundo o meacutetodo de Yasumoto 1984 5432

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS)

9520 -Anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten

seguacuten el meacutetodo de la AOAC 4752

scv 4 de 7

-Anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo da AOAC 4752

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1978 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10186

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1984 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10865

-Anaacutelisis combinada en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS) anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo AOAC y anaacutelisis de toxicidad de tipo ASP por cromatografiacutea liquida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo de la AOAC 15000

314402 Anaacutelisis de muestras en agua de mar -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton marino mediante

microscopiacutea oacuteptica 15133 -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton toacutexico marino

mediante microscopiacutea oacuteptica 13333 - Anaacutelisis de carbono orgaacutenico disuelto 5093 -Anaacutelisis de nutrientes inorgaacutenicos disueltos 3500 -Anaacutelisis de pigmentos fotosinteacuteticos (clorofila ldquoardquo) por

espectrofluorimetria 1698 314403 Anaacutelisis microbioloacutegicos en moluscos y otros organismos

procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Cuantificacioacuten de E Coli 10186 - Deteccioacuten de Salmonella spp 16975 -Enumeracioacuten de Escherichia coli en moluscos bivalvos

vivos por la teacutecnica de medida directa de impedancia con el sistema BacTrac 4300 6800

314404 Anaacutelisis de contaminantes de origen quiacutemica en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Determinacioacuten de metales pesados (Pb Cd Cu Zn As Hg Ni Cr Ag) mediante espectrofotometriacutea de absorcioacuten atoacutemica por metal

6790

-Determinacioacuten de compuestos bifenilos policlorados (PCB) mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

scv 5 de 7

-Determinacioacuten de pesticidas organoclorados mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

-Determinacioacuten de hidrocarburos aromaacuteticos policiacuteclicos (HAPs) mediante cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de fluorescencia

28200

314405 Anaacutelisis histopatoloacutegica de moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Estudio hispatoloacutegico Determinacioacuten de Bonamia Marteillia Perkinsus y otras alteraciones patoloacutegicas

101852

314406 Emisioacuten de certificaciones e informes teacutecnicos y otras actuaciones a peticioacuten del interesado

Emisioacuten de certificados a peticioacuten de los interesados sobre las actuaciones llevadas a cabo por el Instituto

1000

Emisioacuten de informes teacutecnicos a peticioacuten del interesado (euros por hora o fraccioacuten)

4000

scv 6 de 7

scv 7 de 7

ANEXO 3

Resultados de anaacutelisis en muestras de microalgas anteriormente enviadas procedentes de Magallanes por el equipo de espectrometriacutea de masas utilizado por INTECMAR Trabajo presentado a las XXXII

Congreso de Ciencias del Mar realizado en Punta Arenas 22-25 octubre de 2012

PERFIL DE TOXINAS DE PROROCENTRUM LIMA (DINOPHYCEAE) AISLADO DESDE LA COSTA DE MAGALLANES SUR DE CHILE P Salgado1 G Pizarro1 JM Franco2 P Rioboacute2 e I Bravo3

1Instituto de Fomento Pesquero (IFOP) Punta Arenas Chile gemitapizarroifopcl 2Instituto de Investigaciones Marinas (CSIC) Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea 3Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea

Prorocentrum lima (Ehrenberg) es un dinoflagelado marino bentoacutenico que se encuentra adherido generalmente

sobre macroalgas sedimentos y detrito flotante y menos comuacutenmente en el plancton (Bravo et al 2001) Es una especie neriacutetica y estuarina y su rango de distribucioacuten geograacutefica variacutea desde aguas costeras tropicales a templadas (Faust 1991) La importancia de P lima se debe a que son productoras de toxinas diarreogeacutenicas en las personas (veneno diarreico de los mariscos VDM) al igual que algunas especies de Dinophysis aunque raramente se le han asociado con episodios toacutexicos por VDM por su caraacutecter epiacutefito y bentoacutenico El complejo VDM producido por P lima incluye moleacuteculas conocidas como el aacutecido okadaico (AO) y derivados dinofisistoxinas (DTX-1 DTX-2) (Bravo et al 2001 Vale et al 2009) No obstante existen casos citados para USA donde se detectoacute toxicidad por VDM en bivalvos de cultivos asociadas a P lima aunque en bajos niveles (Maranda et al 2007a) En Canadaacute tambieacuten se llevoacute a cabo un estudio en moluscos de cultivo cuya finalidad fue determinar el origen del VDM en la que P lima fue la principal especie sospechosa tras la ocurrencia de un evento toacutexico humano por VDM ocurrido en 1998 (Levasseur et al 2003) y en antildeos anteriores (Quilliam et al 1993) Aunque Levasseur et al (2003) no logroacute probar la toxicidad de los mariscos en cultivo a causa de P lima cabe hacer notar que lo que buscaron fue OA y DTX1 no DTX 3 este uacuteltimo principal derivado de las anteriores tras su transformacioacuten en los moluscos (eg Suzuki et al 1999 Vale amp Sampayo 2002)

En consecuencia el rol de P lima en eventos toacutexicos por VDM auacuten no puede descartarse por cuanto podriacutean llegar a ser importantes en ambientes turbulentos debido a la eventual remocioacuten de microalgas adheridas en sustratos por efecto de vientos (Levasseur et al 2003) factor de importancia si se trata de sedimentos o contrariamente en zonas someras y estables de cultivos de moluscos que al mismo tiempo favorecen microambientes para sustratos en los que prolifera la epiacutefita P lima (Lawrence et al 2000) quedando expuestas a re-suspensiones temporales que favorecen la filtracioacuten de estas microalgas por los bivalvos en cultivo (Maranda et al 2007a)

Chile posee escaso conocimiento sobre esta especie en su medio natural incluido su perfil de toxinas y potencial rol en la toxificacioacuten de moluscos por VDM Por tal razoacuten resultoacute interesante aportar al conocimiento de estos aspectos en muestras de sedimentos recolectadas en el estrecho de Magallanes en las que esta especie se encontroacute inhabitualmente abundante

Las ceacutelulas utilizadas en este estudio fueron aisladas desde sedimentos superficiales (0-3 cm) recolectados en el invierno de 2010 en la localidad de cabo San Isidro durante el muestreo regular del programa de monitoreo de marea roja en la regioacuten de Magallanes En esa oportunidad se logroacute cuantificar hasta 1002 quistes tecadoscm3 de Prorocentrum lima la mayor concentracioacuten respecto a otros sitios de recolecta (Fig 1) Los sedimentos de esta localidad presentaron una coloracioacuten oscura y un fuerte olor a sulfuro de hidroacutegeno (H2S) producto de anoxia local

Se aislaron entre 27 y 87 quistes tecados (Fig 1 a) directamente desde los sedimentos mientras otras 60 ceacutelulas vegetativas (Fig 1 b) fueron aisladas luego de promover la actividad y divisioacuten de los quistes en condiciones de 15 ordmC y un ciclo de luzoscuridad de 1212 horas (Tabla 1) Para este fin se aislaron quistes tecados y trasvasijaron a placas Petri de 5 cm de diaacutemetro conteniendo 5 mL de medio de cultivo L1 Para el anaacutelisis de toxinas las ceacutelulas aisladas fueron trasvasijadas a un tubo Eppendorf de 15 mL y congelados a -80 ordmC Una aliacutecuota de sedimento huacutemedo (100 microL aproximados) tambieacuten fue vaciada en un tubo Eppendorf y congelado Para extraer la toxina se antildeadioacute 500 microL de metanol 100 a cada tubo se mezcloacute por 1 min y filtroacute por 045 microm trasvasijando a un vial El extracto fue secado bajo nitroacutegeno gas a 40 ordmC y conservado a 4 ordmC hasta su anaacutelisis Previo al anaacutelisis de toxinas los extractos fueron resuspendidos en 150 microl de metanol

La presencia de la toxina dinofisistoxina 1 (DTX-1) en las muestras (Fig2) fue confirmada en modo negativo a traveacutes de su ioacuten precursor [M-H]- mz 8175 y sus iones productos mz 5634 y 2552 mediante un cromatoacutegrafo UPLC Acquity Waters acoplado a un triple cuadrupolo Waters Xevo TQ (LC-MS) La columna utilizada fue una Acquity UPLC BEH C18 17microm 21 x 100 mm a 45 ordmC La fase moacutevil consistioacute en (A) hidroacutexido amoacutenico a pH 11 y (B) hidroacutexido amoacutenico en acetonitrilo (67 mM) con una tasa de flujo de 4 mLmin El gradiente de elucioacuten utilizado fue el siguiente mantencioacuten al 75 de A entre 0 y 066 min cambio a 5 de A entre 066 y 330 min mantener 5

de A entre 330 y 528 min recuperacioacuten del 75 de A entre 528 y 726 min mantencioacuten al 75 de A hasta 9 min Se pinchoacute 5microL de muestra en el LC-MS El contenido de DTX-1 en las muestras fue cuantificado en base al ion precursor

Los tres tipos de muestras fueron positivas a la presencia de DTX-1 pero las ceacutelulas vegetativas fueron las que presentaron un mayor contenido de DTX-1 por ceacutelula La deteccioacuten de DTX-1 en los sedimentos (Tabla 2) reflejoacute la presencia de los quistes tecados en eacutestos

Figura 1 Concentraciones de quistes tecados de Prorocentrum lima (quistescm3 de sedimento huacutemedo) en estaciones de muestreo en el Estrecho de Magallanes (M26 Estero Wickham M29N1 Isla Engenfield M31 Bahiacutea Nash M35 Cabo San Isidro M39C1 Bahiacutea Gente Grande M39C2 Bahiacutea Inuacutetil M39C3 Canal Gabriel) y Canal Beagle (M41 Ventisquero Espantildea M42 Ventisquero Holanda) (a) Quistes tecados (b) ceacutelulas vegetativas obtenidas de germinacioacuten de quistes tecados bajo condiciones de laboratorio Barra de escala 20 microm

Tabla 1 Sedimento y ceacutelulas de Prorocentrum lima aisladas para anaacutelisis de toxinas

Extracto metanoacutelico Nordm de ceacutelulas TR ngmL pg DTX-1 ceacutel

G1 quistes tecados 27 213 lt2 -

G2 quistes tecados 67 214 05 11

G3 quistes tecados 87 215 12 21

G4 ceacutelulas vegetativas 60 215 34 87

G6 sedimentos aliacutecuota 213 13 19 pg microL sed

TR tiempo de retencioacuten

Figura 2 Cromatogramas de extractos metanoacutelicos de Prorocentrum lima quistes tecados (a) ceacutelulas vegetativas (b) y sedimentos (c)

Tabla 2 Caracteriacutesticas del sedimento con quistes tecados de Prorocentrum lima

Tipo Tamantildeo (mm)

Grava 2 35

Arena media 025 - 05 32

Arena muy fina 0063 - 0125 2

Limo-arcilla lt 0063 1

Estos resultados constituyen otra eventual posibilidad de toxicidad en los moluscos por VDM no soacutelo de aquellos con modalidad de vida bentoacutenica superficial sino de aquellos que tambieacuten viven enterrados en la arena (eg almeja huepo) Maacutes auacuten si se conoce que P lima posee la capacidad de desarrollar poblaciones naturales en aguas templadas en nuacutemeros que podriacutean justificar una toxicidad por VDM en los mariscos (eg Maranda et al 2007a b)

Referencias

Bravo I ML Fernaacutendez I Ramilo amp A Martinez 2001 Toxin composition of the toxic dinofagellate Prorocentrum lima isolated from different locations along the Galician coast (NW Spain) Toxicon 39 1537ndash1545

Faust MA 1991 Morphology of ciguatera-causing Prorocentrum lima (Pyrrophyta) from widely differing sites J Phycol 27 642-648

Lawrence J E Grant J Quilliam M A Bauder A G amp Cembella A D 2000 Colonizaition and growth of the toxic dinoflagellate Prorocentrum lima and associated fouling macroalgae on mussels in suspended culture Mar Ecol Prog Ser 201 147-154

Levasseur M Couture J Y Weise A M Michaud S Elbrachter M Sauveacute G amp Bonneau E 2003 Pelagic and epiphytic summer distributions of Prorocentrum lima and P mexicanum at two mussel farms in the Gulf of St Lawrence Aquat Microbiol Ecol 30283-293

Maranda L Corwin S Dover S amp Morton S L 2007a Prorocentrum lima (Dinophyceae) in northeastern USA coastal waters II Toxin load in the epibiota and in shellfish Harmful Algae 6 632-641

Maranda L Corwin S Hargraves P E 2007b Prorocentrum lima (Dinophyceae) in 19 northeastern USA coastal waters I Abundance and distribution Harmful Algae 6 623ndash631

Quilliam MA Gilgan MW amp Pleasance S 1993 Confirmation of an incident of diarrhetic shellfish poisoning in eastern Canada In Smayda TJ Shimizu Y (Eds) Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea Elsevier New York pp 547ndash552

Suzuki T Ota H amp Yamasaki M 1999 Direct evidence of transformation of dinophysistoxin-1 to 7-O-acyl-dinophysistoxin-1 (Dinophysis-3) in the scallop Patinopecten yessoensis Toxicon 37 187-198

Vale P amp Sampayo M A 2002 First confirmation of human diarrhoeic poisonings by okadaic acid esters after ingestion of razor clams (Solen marginatus) and green crabs (Carcinus maenas) in Aveiro lagoon Portugal and detection of okadaic acid esters in phytoplankton Toxicon 40989-996

Vale P Veloso V amp Amorim A 2009 Toxin composition of a Prorocentrum lima strain isolated from the Portuguese coast Toxicon 54145ndash152

Agradecimientos Intecmar de la Xunta de Galicia Espantildea donde se realizaron los anaacutelisis de toxinas proyecto

SUBPESCA ldquoManejo y Monitoreo de Mareas Rojas en las regiones de Los Lagos Ayseacuten y Magallanes IV etapa 2010rdquo

ANEXO 4

Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten

ANEXO 5

Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de Magallanes

TASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

O

EJE

MP

LA

R P

AR

A E

L IN

TE

RE

SA

DO

LIQ

UID

AC

IOacuteN

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

EN

TID

AD

BA

NC

AR

IATASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

0 9

4 0

2 4INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

AD

MIN

IST

RA

CIOacute

NTASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

9520 euros

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

CONSELLERIA DE FACENDA

ANEXO 6

Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para cierre

de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

Seccioacuten Ediciones y Produccioacuten Almte Manuel Blanco Encalada 839

Fono 56-32-2151500 Valparaiacuteso Chile

wwwifopcl

Page 25: “Análisis de toxinas lipofílicas mediante LC-MS/MS en ...metadatos.mma.gob.cl/sinia/Informe_final_Analisis_toxinas_lipofilicas_656-055.pdfSUBSECRETARÍA DE ECONOMÍA: INFORME FINAL:

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo FIGURA

Figura 1 Estaciones y sectores muestreados (ciacuterculo rojo) y sector Fortuna donde fue recolectado el

caracol piquilhue (ciacuterculo amarillo)

T A B L A S

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Tabla 1 Condiciones cromatograacuteficas para el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas usando

una columna de UPLC C18 en fase reversa y medio baacutesico

Columna Acquity UPLC BEH C18 17 microm 21x100 mm

Temperatura columna 45 ordmC

Flujo 04 mlmin

Volumen inyeccioacuten 5 microl

Temperatura muestras 10 plusmn 5 ordmC

Gradiente

Tiempo (min) Fase A () Fase B ()

0 75 25

066 75 25

330 5 95

528 5 95

726 75 25

900 75 25

Tabla 2 Paraacutemetros de la fuente de ionizacioacuten para el Xevo TQMS (Waters) en la determinacioacuten de toxinas lipofiacutelicas

PARAacuteMETROS DE LA FUENTE

ESI- ESI+

AO DTX2 DTX1 YTX homoYTX 45OH YTX y 45OH

homoYTX

AZA1 AZA2 AZA3 PTX2 PTX1 y SPX1

Voltaje de capilar (V) 100 200

Temperatura de solvatacioacuten (ordmC) 450 450

Flujo gas de solvatacioacuten (lh) 850 850

Flujo gas cono (lh) 50 50

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Tabla 3

Resumen de las condiciones de espectrometriacutea de masas empleadas con el Xevo TQMS (Waters) en el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas

Compuesto tR (min)

ESI

Ioacuten Precursor

(mz)

Ioacuten Producto

(mz)

Dwell time (s)

Energiacutea colisioacuten

(eV)

Voltaje cono (V)

AO 189 NEG 8035 2552 0010 46 86

113 0010 56 86

DTX2 210 NEG 8035 2552 0010 46 86

113 0010 56 86

DTX1 214 NEG 8175 5634 0010 43 86

2552 0010 48 86

YTX 202 NEG 5704 4674 0010 30 45

3963 0010 35 45

45OH-YTX 182 NEG 5784 4674 0010 30 45

3964 0010 30 45

HomoYTX 203 NEG 5775 4744 0010 30 48

4034 0010 30 48

45OH-homoYTX 182 NEG 5855 4034 0010 30 45

4744 0010 30 45

PTX1 306 POS 8925 8395 0015 25 36

8215 0015 25 36

PTX2 362 POS 8765 8415 0015 20 36

8235 0015 25 36

AZA1 263 POS 8425 6545 0015 55 50

3622 0015 50 50

AZA2 270 POS 8565 6725 0015 45 27

6545 0015 45 27

AZA3 236 POS 8285 6404 0015 55 47

3622 0015 55 47

SPX1 368 POS 6925 6744 0015 27 60

1643 0015 42 60 Transicioacuten cuantificadora

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Tabla 4 TRR y valores de tolerancia para las toxinas analizadas

TOXINA TRR TOLERANCIA

Toxinas del grupo de AO

AO 1000 0990-1010

DTX2 1040 1014-1066

DTX1 1140 1111-1168

Toxinas del grupo de PTX

PTX2 1000 0990-1010

PTX1 0850 0829-0871

Toxinas del grupo de YTX

YTX 1000 0990-1010

45OH-YTX 0894 0871-0916

Homo YTX 1000 0990-1010

45OH-homoYTX 0899 0876-0921

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Tabla 5 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de moluscos

Nordm estMes

recolectaLocalidad Molusco

cuerpo

enterohepat

gramos

carne

toxicidad

VDM ratoacuten

PTX2

(ugKg)

YTX

(ugKg)

45OHYTX

(ugKg)

DTX1

libre

(ugKg)

DTX1

total

(ugkg)

SPX 1

(ugKg)

M13 ene-13 E Peel chorito x 5086 + 01 02

M13 ene-13 E Peel ostioacuten x 5155 No real izado 16 21

M33 ene-13 B Bell chorito x 5253 + 04

M37 ene-13 B Agua Fresca chorito x 5039 + 05 01

M35 ene-13 C San Isidro chorito x 5289 + 000 01

M42 ene-13 V Holanda chorito x 5231 + 06 13

M43 ene-13 B Yendegaia chorito x 5193 + 04 25

M45 ene-13 Pto Williams chorito x 5161 - 28 07

M08 feb-13 E Falcon cholga x 5027 - 14

M09 feb-13 E Penguumlin cholga x 5103 + 14

M22 feb-13 E de las Montantildeas cholga x 5052 - 26

M23 feb-13 I Ballesteros cholga x 5204 - 87

M24 feb-13 B Fanny chorito x 2016 - 38 1071 479 12

M25 feb-13 E Silva Palma chorito x 1447 - 59 1077 898 09

M26 feb-13 E Wickham chorito x 1093 - 194 2940 2232 66 66

M27 feb-13 E Sullivan chorito x 1137 - 450 1944 1478

M28 feb-13 E Nuntildeez chorito x 1179 + 33 721 407

M29 feb-13 Cutter Cove chorito x 1003 - 65 501 309

M29N1 feb-13 I Engelfield chorito x 1116 - 297 2007 1483

M31 feb-13 B Nash chorito x 2231 +

M33 feb-13 B Bell chorito x 1181 - 93

M34 feb-13 S Pedro chorito x 0726 -

M35 feb-13 C San Isidro chorito x 1178 + 110

M36 feb-13 B Buena chorito x 1367 +

M37 feb-13 B Agua Fresca chorito x 0850 + 45 100 80

M39 feb-13 Pto Zenteno chorito x 3241 + 28

M39N2 feb-13 Pta San Valentin chorito x 1712 - 11

M39N3 feb-13 Pto Yartou chorito x 2035 - 11

sector

Fortunajul-12 B Inuacutetil

caracol

piquilhuex 107000 + 01

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Tabla 6 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de microalgas

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Tabla 7 Niveles actualmente permitidos por la legislacioacuten europea (bioensayo) y los niveles propuestos por la

autoridad europea para la seguridad alimentaria (EFSA) (Gerssen et al 2010)

Toxin Legislacioacuten (μg kg-

1) Proposicioacuten

EFSA (μg kg-1)

Validacioacuten LC-MSMS

(μg kg-1)

OA and DTXs 160 45

PTXs 120

YTXs 1000 3750

AZAs 160 32

SPXs 400 (Gerssen et al2010)

European Food Safety Authority Decisioacuten 2002657 de la Unioacuten Europea EC Incluye PTXs

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Tabla 8 Abundancia relativa ambiental de las microalgas al momento de recolectar las muestras de moluscos En rojo se indica la deteccioacuten de toxina positiva en los moluscos asociada a la supuesta microalga fuente PTXs (D

acuminata) YTXs (P reticulatum) SPXs (A ostenfeldii) DTX1 (A acuta)

(Tabla modificada de Guzmaacuten et al 2014)

A N E X O S

ANEXO 1

Certificacioacuten laboratorio INTECMAR

ANEXO 2

Lista de anaacutelisis que realiza INTECMAR y sus costos (en euros) 2013

scv 1 de 7

GUIA PARA LA AUTOLIQUIDACIOacuteN DE TASAS A FAVOR DE LA COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA 2013 Los aspectos financieros de los servicios prestados por Intecmar en el marco de su actividad e vienen regulados en la Ley 62003 de 9 de diciembre de tasas precios y exenciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia (DOG nuacutem 240 de 11122003) y fueron actualizados posteriormente en la Ley 142010 de 27 de diciembre de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2011 (DOG nuacutem 250 de 30122010) y en la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013 (DOG nuacutem 42 de 28022013) Existen dos maneras de liquidar las tasas correspondientes a los servicios prestados por Intecmar

1 De forma manual cubriendo el modelo A de autoliquidacioacuten que se descarga en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda y que adjunto en pdf y se lleva al banco para su pago httpwwwconselleriadefacendaeswebportalconfeccion-impresos

2 De forma telemaacutetica en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda viacutenculo httpshostcixtecesXEITObinlionwebXeitodllxmit a traveacutes del modelo 730

Ambos modelos de liquidacioacuten de tasas adjuntamos ejemplo al final de este documento deben ser remitidos por mail a Intecmar con el sello del banco fiacutesico o virtual como paso previo a la emisioacuten del certificado Los coacutedigos generales necesarios son

minus Consejeriacutea de Medio Rural y de Mar Coacutedigo 09 minus Delegacioacuten de Pontevedra Coacutedigo 40 minus Servicio de Intecmar Coacutedigo 24

Los coacutedigos y descripcioacuten de las tasas son los regulados en la legislacioacuten vigente y los hemos resumido en los anexos siguientes Vilaxoaacuten 4 de marzo de 2013

scv 2 de 7

TARIFAS DE TASAS VIGENTES PARA 2013 - Ley 22013 d e 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013

(DOG nuacutem 42 de 28022013)

Estas tarifas son consecuencia de la actualizacioacuten de las tarifas contenidas en los anexos 1 2 3 4 y 5 de la Ley 62003 del 9 de diciembre de tasas precios y exacciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia por la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 Seraacuten aplicables desde el diacutea de la entrada en vigor de la Ley de

presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 TASA POR SERVICIOS ADMINISTRATIVOS

No sujecioacuten No se exigiraacute la tasa por servicios administrativos cuando se trate de compulsas o cotejos de documentos que deban acompantildear a solicitudes escritos o comunicaciones presentadas por el ciudadano y realizadas en el aacutembito de actuacioacuten de los registros seguacuten lo dispuesto en el artiacuteculo 385 de la Ley 301992 del 26 de noviembre de reacutegimen juriacutedico de las administraciones puacuteblicas y del procedimiento administrativo comuacuten

Excepciones Estaraacuten exentos de la presente tasa

1- La expedicioacuten de certificados de retribuciones satisfechas por la Xunta de Galicia con el objeto de justificacioacuten en relacioacuten con el impuesto sobre la renta de las personas fiacutesicas

2- La expedicioacuten de certificados y compulsa que el personal de la Administracioacuten solicite respecto a las necesidades propias del puesto de trabajo o relacioacuten de servicios

3- Los alumnos por cualquier actuacioacuten en materia de ensentildeanzas no universitarias

scv 3 de 7

4- Las compulsas realizadas en las oficinas de empleo para los desempleados en la tramitacioacuten de expedientes que sean competencia de dichas oficinas

5 La inscripcioacuten en las convocatorias para a seleccioacuten de personal de la comunidad autoacutenoma despueacutes de justificacioacuten documental solicitada por

- Personas con discapacidad igual o superior al 33 - Personas que sean miembros de familias numerosas clasificadas en la

categoriacutea especial Se aplicaraacute una bonificacioacuten del 50 a la inscripcioacuten solicitada por - Personas que sean miembros de familias numerosas de categoriacutea

general - Personas que figurasen como demandantes de empleo desde por lo

menos seis meses antes a la fecha de la convocatoria de pruebas selectivas de personal en las que soliciten su participacioacuten y no esteacuten percibiendo prestacioacuten o subsidio por desempleo

6- La expedicioacuten de certificados relativos a la situacioacuten fiscal 7- El Estado y los demaacutes entes puacuteblicos territoriales o institucionales

siempre que los servicios o actividades de que sean beneficiarios se presten o se realicen en el marco del principio de colaboracioacuten entre administraciones

8- Las viacutectimas de actos terroristas asiacute como sus coacutenyuges y sus hijos por cualquier actuacioacuten en materia educativa realizada en centros oficiales de estudios en todos los niveles de ensentildeanza

9- Los miembros de los organismos consultivos de la Administracioacuten puacuteblica gallega respecto de los certificados emitidos por dichos organismos

COacuteDIGO TASAS

DESCRIPCIOacuteN IMPORTE euro

314400 Prestacioacuten de servicios en el Instituto Tecnoloacutegico para el Control del Medio Marino de Galicia

314401 Anaacutelisis de biotoxinas marinas en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de Yasumoto 1978 4752

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en rato segundo o meacutetodo de Yasumoto 1984 5432

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS)

9520 -Anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten

seguacuten el meacutetodo de la AOAC 4752

scv 4 de 7

-Anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo da AOAC 4752

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1978 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10186

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1984 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10865

-Anaacutelisis combinada en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS) anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo AOAC y anaacutelisis de toxicidad de tipo ASP por cromatografiacutea liquida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo de la AOAC 15000

314402 Anaacutelisis de muestras en agua de mar -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton marino mediante

microscopiacutea oacuteptica 15133 -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton toacutexico marino

mediante microscopiacutea oacuteptica 13333 - Anaacutelisis de carbono orgaacutenico disuelto 5093 -Anaacutelisis de nutrientes inorgaacutenicos disueltos 3500 -Anaacutelisis de pigmentos fotosinteacuteticos (clorofila ldquoardquo) por

espectrofluorimetria 1698 314403 Anaacutelisis microbioloacutegicos en moluscos y otros organismos

procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Cuantificacioacuten de E Coli 10186 - Deteccioacuten de Salmonella spp 16975 -Enumeracioacuten de Escherichia coli en moluscos bivalvos

vivos por la teacutecnica de medida directa de impedancia con el sistema BacTrac 4300 6800

314404 Anaacutelisis de contaminantes de origen quiacutemica en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Determinacioacuten de metales pesados (Pb Cd Cu Zn As Hg Ni Cr Ag) mediante espectrofotometriacutea de absorcioacuten atoacutemica por metal

6790

-Determinacioacuten de compuestos bifenilos policlorados (PCB) mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

scv 5 de 7

-Determinacioacuten de pesticidas organoclorados mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

-Determinacioacuten de hidrocarburos aromaacuteticos policiacuteclicos (HAPs) mediante cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de fluorescencia

28200

314405 Anaacutelisis histopatoloacutegica de moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Estudio hispatoloacutegico Determinacioacuten de Bonamia Marteillia Perkinsus y otras alteraciones patoloacutegicas

101852

314406 Emisioacuten de certificaciones e informes teacutecnicos y otras actuaciones a peticioacuten del interesado

Emisioacuten de certificados a peticioacuten de los interesados sobre las actuaciones llevadas a cabo por el Instituto

1000

Emisioacuten de informes teacutecnicos a peticioacuten del interesado (euros por hora o fraccioacuten)

4000

scv 6 de 7

scv 7 de 7

ANEXO 3

Resultados de anaacutelisis en muestras de microalgas anteriormente enviadas procedentes de Magallanes por el equipo de espectrometriacutea de masas utilizado por INTECMAR Trabajo presentado a las XXXII

Congreso de Ciencias del Mar realizado en Punta Arenas 22-25 octubre de 2012

PERFIL DE TOXINAS DE PROROCENTRUM LIMA (DINOPHYCEAE) AISLADO DESDE LA COSTA DE MAGALLANES SUR DE CHILE P Salgado1 G Pizarro1 JM Franco2 P Rioboacute2 e I Bravo3

1Instituto de Fomento Pesquero (IFOP) Punta Arenas Chile gemitapizarroifopcl 2Instituto de Investigaciones Marinas (CSIC) Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea 3Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea

Prorocentrum lima (Ehrenberg) es un dinoflagelado marino bentoacutenico que se encuentra adherido generalmente

sobre macroalgas sedimentos y detrito flotante y menos comuacutenmente en el plancton (Bravo et al 2001) Es una especie neriacutetica y estuarina y su rango de distribucioacuten geograacutefica variacutea desde aguas costeras tropicales a templadas (Faust 1991) La importancia de P lima se debe a que son productoras de toxinas diarreogeacutenicas en las personas (veneno diarreico de los mariscos VDM) al igual que algunas especies de Dinophysis aunque raramente se le han asociado con episodios toacutexicos por VDM por su caraacutecter epiacutefito y bentoacutenico El complejo VDM producido por P lima incluye moleacuteculas conocidas como el aacutecido okadaico (AO) y derivados dinofisistoxinas (DTX-1 DTX-2) (Bravo et al 2001 Vale et al 2009) No obstante existen casos citados para USA donde se detectoacute toxicidad por VDM en bivalvos de cultivos asociadas a P lima aunque en bajos niveles (Maranda et al 2007a) En Canadaacute tambieacuten se llevoacute a cabo un estudio en moluscos de cultivo cuya finalidad fue determinar el origen del VDM en la que P lima fue la principal especie sospechosa tras la ocurrencia de un evento toacutexico humano por VDM ocurrido en 1998 (Levasseur et al 2003) y en antildeos anteriores (Quilliam et al 1993) Aunque Levasseur et al (2003) no logroacute probar la toxicidad de los mariscos en cultivo a causa de P lima cabe hacer notar que lo que buscaron fue OA y DTX1 no DTX 3 este uacuteltimo principal derivado de las anteriores tras su transformacioacuten en los moluscos (eg Suzuki et al 1999 Vale amp Sampayo 2002)

En consecuencia el rol de P lima en eventos toacutexicos por VDM auacuten no puede descartarse por cuanto podriacutean llegar a ser importantes en ambientes turbulentos debido a la eventual remocioacuten de microalgas adheridas en sustratos por efecto de vientos (Levasseur et al 2003) factor de importancia si se trata de sedimentos o contrariamente en zonas someras y estables de cultivos de moluscos que al mismo tiempo favorecen microambientes para sustratos en los que prolifera la epiacutefita P lima (Lawrence et al 2000) quedando expuestas a re-suspensiones temporales que favorecen la filtracioacuten de estas microalgas por los bivalvos en cultivo (Maranda et al 2007a)

Chile posee escaso conocimiento sobre esta especie en su medio natural incluido su perfil de toxinas y potencial rol en la toxificacioacuten de moluscos por VDM Por tal razoacuten resultoacute interesante aportar al conocimiento de estos aspectos en muestras de sedimentos recolectadas en el estrecho de Magallanes en las que esta especie se encontroacute inhabitualmente abundante

Las ceacutelulas utilizadas en este estudio fueron aisladas desde sedimentos superficiales (0-3 cm) recolectados en el invierno de 2010 en la localidad de cabo San Isidro durante el muestreo regular del programa de monitoreo de marea roja en la regioacuten de Magallanes En esa oportunidad se logroacute cuantificar hasta 1002 quistes tecadoscm3 de Prorocentrum lima la mayor concentracioacuten respecto a otros sitios de recolecta (Fig 1) Los sedimentos de esta localidad presentaron una coloracioacuten oscura y un fuerte olor a sulfuro de hidroacutegeno (H2S) producto de anoxia local

Se aislaron entre 27 y 87 quistes tecados (Fig 1 a) directamente desde los sedimentos mientras otras 60 ceacutelulas vegetativas (Fig 1 b) fueron aisladas luego de promover la actividad y divisioacuten de los quistes en condiciones de 15 ordmC y un ciclo de luzoscuridad de 1212 horas (Tabla 1) Para este fin se aislaron quistes tecados y trasvasijaron a placas Petri de 5 cm de diaacutemetro conteniendo 5 mL de medio de cultivo L1 Para el anaacutelisis de toxinas las ceacutelulas aisladas fueron trasvasijadas a un tubo Eppendorf de 15 mL y congelados a -80 ordmC Una aliacutecuota de sedimento huacutemedo (100 microL aproximados) tambieacuten fue vaciada en un tubo Eppendorf y congelado Para extraer la toxina se antildeadioacute 500 microL de metanol 100 a cada tubo se mezcloacute por 1 min y filtroacute por 045 microm trasvasijando a un vial El extracto fue secado bajo nitroacutegeno gas a 40 ordmC y conservado a 4 ordmC hasta su anaacutelisis Previo al anaacutelisis de toxinas los extractos fueron resuspendidos en 150 microl de metanol

La presencia de la toxina dinofisistoxina 1 (DTX-1) en las muestras (Fig2) fue confirmada en modo negativo a traveacutes de su ioacuten precursor [M-H]- mz 8175 y sus iones productos mz 5634 y 2552 mediante un cromatoacutegrafo UPLC Acquity Waters acoplado a un triple cuadrupolo Waters Xevo TQ (LC-MS) La columna utilizada fue una Acquity UPLC BEH C18 17microm 21 x 100 mm a 45 ordmC La fase moacutevil consistioacute en (A) hidroacutexido amoacutenico a pH 11 y (B) hidroacutexido amoacutenico en acetonitrilo (67 mM) con una tasa de flujo de 4 mLmin El gradiente de elucioacuten utilizado fue el siguiente mantencioacuten al 75 de A entre 0 y 066 min cambio a 5 de A entre 066 y 330 min mantener 5

de A entre 330 y 528 min recuperacioacuten del 75 de A entre 528 y 726 min mantencioacuten al 75 de A hasta 9 min Se pinchoacute 5microL de muestra en el LC-MS El contenido de DTX-1 en las muestras fue cuantificado en base al ion precursor

Los tres tipos de muestras fueron positivas a la presencia de DTX-1 pero las ceacutelulas vegetativas fueron las que presentaron un mayor contenido de DTX-1 por ceacutelula La deteccioacuten de DTX-1 en los sedimentos (Tabla 2) reflejoacute la presencia de los quistes tecados en eacutestos

Figura 1 Concentraciones de quistes tecados de Prorocentrum lima (quistescm3 de sedimento huacutemedo) en estaciones de muestreo en el Estrecho de Magallanes (M26 Estero Wickham M29N1 Isla Engenfield M31 Bahiacutea Nash M35 Cabo San Isidro M39C1 Bahiacutea Gente Grande M39C2 Bahiacutea Inuacutetil M39C3 Canal Gabriel) y Canal Beagle (M41 Ventisquero Espantildea M42 Ventisquero Holanda) (a) Quistes tecados (b) ceacutelulas vegetativas obtenidas de germinacioacuten de quistes tecados bajo condiciones de laboratorio Barra de escala 20 microm

Tabla 1 Sedimento y ceacutelulas de Prorocentrum lima aisladas para anaacutelisis de toxinas

Extracto metanoacutelico Nordm de ceacutelulas TR ngmL pg DTX-1 ceacutel

G1 quistes tecados 27 213 lt2 -

G2 quistes tecados 67 214 05 11

G3 quistes tecados 87 215 12 21

G4 ceacutelulas vegetativas 60 215 34 87

G6 sedimentos aliacutecuota 213 13 19 pg microL sed

TR tiempo de retencioacuten

Figura 2 Cromatogramas de extractos metanoacutelicos de Prorocentrum lima quistes tecados (a) ceacutelulas vegetativas (b) y sedimentos (c)

Tabla 2 Caracteriacutesticas del sedimento con quistes tecados de Prorocentrum lima

Tipo Tamantildeo (mm)

Grava 2 35

Arena media 025 - 05 32

Arena muy fina 0063 - 0125 2

Limo-arcilla lt 0063 1

Estos resultados constituyen otra eventual posibilidad de toxicidad en los moluscos por VDM no soacutelo de aquellos con modalidad de vida bentoacutenica superficial sino de aquellos que tambieacuten viven enterrados en la arena (eg almeja huepo) Maacutes auacuten si se conoce que P lima posee la capacidad de desarrollar poblaciones naturales en aguas templadas en nuacutemeros que podriacutean justificar una toxicidad por VDM en los mariscos (eg Maranda et al 2007a b)

Referencias

Bravo I ML Fernaacutendez I Ramilo amp A Martinez 2001 Toxin composition of the toxic dinofagellate Prorocentrum lima isolated from different locations along the Galician coast (NW Spain) Toxicon 39 1537ndash1545

Faust MA 1991 Morphology of ciguatera-causing Prorocentrum lima (Pyrrophyta) from widely differing sites J Phycol 27 642-648

Lawrence J E Grant J Quilliam M A Bauder A G amp Cembella A D 2000 Colonizaition and growth of the toxic dinoflagellate Prorocentrum lima and associated fouling macroalgae on mussels in suspended culture Mar Ecol Prog Ser 201 147-154

Levasseur M Couture J Y Weise A M Michaud S Elbrachter M Sauveacute G amp Bonneau E 2003 Pelagic and epiphytic summer distributions of Prorocentrum lima and P mexicanum at two mussel farms in the Gulf of St Lawrence Aquat Microbiol Ecol 30283-293

Maranda L Corwin S Dover S amp Morton S L 2007a Prorocentrum lima (Dinophyceae) in northeastern USA coastal waters II Toxin load in the epibiota and in shellfish Harmful Algae 6 632-641

Maranda L Corwin S Hargraves P E 2007b Prorocentrum lima (Dinophyceae) in 19 northeastern USA coastal waters I Abundance and distribution Harmful Algae 6 623ndash631

Quilliam MA Gilgan MW amp Pleasance S 1993 Confirmation of an incident of diarrhetic shellfish poisoning in eastern Canada In Smayda TJ Shimizu Y (Eds) Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea Elsevier New York pp 547ndash552

Suzuki T Ota H amp Yamasaki M 1999 Direct evidence of transformation of dinophysistoxin-1 to 7-O-acyl-dinophysistoxin-1 (Dinophysis-3) in the scallop Patinopecten yessoensis Toxicon 37 187-198

Vale P amp Sampayo M A 2002 First confirmation of human diarrhoeic poisonings by okadaic acid esters after ingestion of razor clams (Solen marginatus) and green crabs (Carcinus maenas) in Aveiro lagoon Portugal and detection of okadaic acid esters in phytoplankton Toxicon 40989-996

Vale P Veloso V amp Amorim A 2009 Toxin composition of a Prorocentrum lima strain isolated from the Portuguese coast Toxicon 54145ndash152

Agradecimientos Intecmar de la Xunta de Galicia Espantildea donde se realizaron los anaacutelisis de toxinas proyecto

SUBPESCA ldquoManejo y Monitoreo de Mareas Rojas en las regiones de Los Lagos Ayseacuten y Magallanes IV etapa 2010rdquo

ANEXO 4

Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten

ANEXO 5

Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de Magallanes

TASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

O

EJE

MP

LA

R P

AR

A E

L IN

TE

RE

SA

DO

LIQ

UID

AC

IOacuteN

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

EN

TID

AD

BA

NC

AR

IATASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

0 9

4 0

2 4INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

AD

MIN

IST

RA

CIOacute

NTASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

9520 euros

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

CONSELLERIA DE FACENDA

ANEXO 6

Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para cierre

de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

Seccioacuten Ediciones y Produccioacuten Almte Manuel Blanco Encalada 839

Fono 56-32-2151500 Valparaiacuteso Chile

wwwifopcl

Page 26: “Análisis de toxinas lipofílicas mediante LC-MS/MS en ...metadatos.mma.gob.cl/sinia/Informe_final_Analisis_toxinas_lipofilicas_656-055.pdfSUBSECRETARÍA DE ECONOMÍA: INFORME FINAL:

T A B L A S

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo TABLAS

Tabla 1 Condiciones cromatograacuteficas para el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas usando

una columna de UPLC C18 en fase reversa y medio baacutesico

Columna Acquity UPLC BEH C18 17 microm 21x100 mm

Temperatura columna 45 ordmC

Flujo 04 mlmin

Volumen inyeccioacuten 5 microl

Temperatura muestras 10 plusmn 5 ordmC

Gradiente

Tiempo (min) Fase A () Fase B ()

0 75 25

066 75 25

330 5 95

528 5 95

726 75 25

900 75 25

Tabla 2 Paraacutemetros de la fuente de ionizacioacuten para el Xevo TQMS (Waters) en la determinacioacuten de toxinas lipofiacutelicas

PARAacuteMETROS DE LA FUENTE

ESI- ESI+

AO DTX2 DTX1 YTX homoYTX 45OH YTX y 45OH

homoYTX

AZA1 AZA2 AZA3 PTX2 PTX1 y SPX1

Voltaje de capilar (V) 100 200

Temperatura de solvatacioacuten (ordmC) 450 450

Flujo gas de solvatacioacuten (lh) 850 850

Flujo gas cono (lh) 50 50

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo TABLAS

Tabla 3

Resumen de las condiciones de espectrometriacutea de masas empleadas con el Xevo TQMS (Waters) en el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas

Compuesto tR (min)

ESI

Ioacuten Precursor

(mz)

Ioacuten Producto

(mz)

Dwell time (s)

Energiacutea colisioacuten

(eV)

Voltaje cono (V)

AO 189 NEG 8035 2552 0010 46 86

113 0010 56 86

DTX2 210 NEG 8035 2552 0010 46 86

113 0010 56 86

DTX1 214 NEG 8175 5634 0010 43 86

2552 0010 48 86

YTX 202 NEG 5704 4674 0010 30 45

3963 0010 35 45

45OH-YTX 182 NEG 5784 4674 0010 30 45

3964 0010 30 45

HomoYTX 203 NEG 5775 4744 0010 30 48

4034 0010 30 48

45OH-homoYTX 182 NEG 5855 4034 0010 30 45

4744 0010 30 45

PTX1 306 POS 8925 8395 0015 25 36

8215 0015 25 36

PTX2 362 POS 8765 8415 0015 20 36

8235 0015 25 36

AZA1 263 POS 8425 6545 0015 55 50

3622 0015 50 50

AZA2 270 POS 8565 6725 0015 45 27

6545 0015 45 27

AZA3 236 POS 8285 6404 0015 55 47

3622 0015 55 47

SPX1 368 POS 6925 6744 0015 27 60

1643 0015 42 60 Transicioacuten cuantificadora

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo TABLAS

Tabla 4 TRR y valores de tolerancia para las toxinas analizadas

TOXINA TRR TOLERANCIA

Toxinas del grupo de AO

AO 1000 0990-1010

DTX2 1040 1014-1066

DTX1 1140 1111-1168

Toxinas del grupo de PTX

PTX2 1000 0990-1010

PTX1 0850 0829-0871

Toxinas del grupo de YTX

YTX 1000 0990-1010

45OH-YTX 0894 0871-0916

Homo YTX 1000 0990-1010

45OH-homoYTX 0899 0876-0921

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo TABLAS

Tabla 5 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de moluscos

Nordm estMes

recolectaLocalidad Molusco

cuerpo

enterohepat

gramos

carne

toxicidad

VDM ratoacuten

PTX2

(ugKg)

YTX

(ugKg)

45OHYTX

(ugKg)

DTX1

libre

(ugKg)

DTX1

total

(ugkg)

SPX 1

(ugKg)

M13 ene-13 E Peel chorito x 5086 + 01 02

M13 ene-13 E Peel ostioacuten x 5155 No real izado 16 21

M33 ene-13 B Bell chorito x 5253 + 04

M37 ene-13 B Agua Fresca chorito x 5039 + 05 01

M35 ene-13 C San Isidro chorito x 5289 + 000 01

M42 ene-13 V Holanda chorito x 5231 + 06 13

M43 ene-13 B Yendegaia chorito x 5193 + 04 25

M45 ene-13 Pto Williams chorito x 5161 - 28 07

M08 feb-13 E Falcon cholga x 5027 - 14

M09 feb-13 E Penguumlin cholga x 5103 + 14

M22 feb-13 E de las Montantildeas cholga x 5052 - 26

M23 feb-13 I Ballesteros cholga x 5204 - 87

M24 feb-13 B Fanny chorito x 2016 - 38 1071 479 12

M25 feb-13 E Silva Palma chorito x 1447 - 59 1077 898 09

M26 feb-13 E Wickham chorito x 1093 - 194 2940 2232 66 66

M27 feb-13 E Sullivan chorito x 1137 - 450 1944 1478

M28 feb-13 E Nuntildeez chorito x 1179 + 33 721 407

M29 feb-13 Cutter Cove chorito x 1003 - 65 501 309

M29N1 feb-13 I Engelfield chorito x 1116 - 297 2007 1483

M31 feb-13 B Nash chorito x 2231 +

M33 feb-13 B Bell chorito x 1181 - 93

M34 feb-13 S Pedro chorito x 0726 -

M35 feb-13 C San Isidro chorito x 1178 + 110

M36 feb-13 B Buena chorito x 1367 +

M37 feb-13 B Agua Fresca chorito x 0850 + 45 100 80

M39 feb-13 Pto Zenteno chorito x 3241 + 28

M39N2 feb-13 Pta San Valentin chorito x 1712 - 11

M39N3 feb-13 Pto Yartou chorito x 2035 - 11

sector

Fortunajul-12 B Inuacutetil

caracol

piquilhuex 107000 + 01

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo TABLAS

Tabla 6 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de microalgas

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo TABLAS

Tabla 7 Niveles actualmente permitidos por la legislacioacuten europea (bioensayo) y los niveles propuestos por la

autoridad europea para la seguridad alimentaria (EFSA) (Gerssen et al 2010)

Toxin Legislacioacuten (μg kg-

1) Proposicioacuten

EFSA (μg kg-1)

Validacioacuten LC-MSMS

(μg kg-1)

OA and DTXs 160 45

PTXs 120

YTXs 1000 3750

AZAs 160 32

SPXs 400 (Gerssen et al2010)

European Food Safety Authority Decisioacuten 2002657 de la Unioacuten Europea EC Incluye PTXs

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo TABLAS

Tabla 8 Abundancia relativa ambiental de las microalgas al momento de recolectar las muestras de moluscos En rojo se indica la deteccioacuten de toxina positiva en los moluscos asociada a la supuesta microalga fuente PTXs (D

acuminata) YTXs (P reticulatum) SPXs (A ostenfeldii) DTX1 (A acuta)

(Tabla modificada de Guzmaacuten et al 2014)

A N E X O S

ANEXO 1

Certificacioacuten laboratorio INTECMAR

ANEXO 2

Lista de anaacutelisis que realiza INTECMAR y sus costos (en euros) 2013

scv 1 de 7

GUIA PARA LA AUTOLIQUIDACIOacuteN DE TASAS A FAVOR DE LA COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA 2013 Los aspectos financieros de los servicios prestados por Intecmar en el marco de su actividad e vienen regulados en la Ley 62003 de 9 de diciembre de tasas precios y exenciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia (DOG nuacutem 240 de 11122003) y fueron actualizados posteriormente en la Ley 142010 de 27 de diciembre de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2011 (DOG nuacutem 250 de 30122010) y en la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013 (DOG nuacutem 42 de 28022013) Existen dos maneras de liquidar las tasas correspondientes a los servicios prestados por Intecmar

1 De forma manual cubriendo el modelo A de autoliquidacioacuten que se descarga en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda y que adjunto en pdf y se lleva al banco para su pago httpwwwconselleriadefacendaeswebportalconfeccion-impresos

2 De forma telemaacutetica en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda viacutenculo httpshostcixtecesXEITObinlionwebXeitodllxmit a traveacutes del modelo 730

Ambos modelos de liquidacioacuten de tasas adjuntamos ejemplo al final de este documento deben ser remitidos por mail a Intecmar con el sello del banco fiacutesico o virtual como paso previo a la emisioacuten del certificado Los coacutedigos generales necesarios son

minus Consejeriacutea de Medio Rural y de Mar Coacutedigo 09 minus Delegacioacuten de Pontevedra Coacutedigo 40 minus Servicio de Intecmar Coacutedigo 24

Los coacutedigos y descripcioacuten de las tasas son los regulados en la legislacioacuten vigente y los hemos resumido en los anexos siguientes Vilaxoaacuten 4 de marzo de 2013

scv 2 de 7

TARIFAS DE TASAS VIGENTES PARA 2013 - Ley 22013 d e 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013

(DOG nuacutem 42 de 28022013)

Estas tarifas son consecuencia de la actualizacioacuten de las tarifas contenidas en los anexos 1 2 3 4 y 5 de la Ley 62003 del 9 de diciembre de tasas precios y exacciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia por la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 Seraacuten aplicables desde el diacutea de la entrada en vigor de la Ley de

presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 TASA POR SERVICIOS ADMINISTRATIVOS

No sujecioacuten No se exigiraacute la tasa por servicios administrativos cuando se trate de compulsas o cotejos de documentos que deban acompantildear a solicitudes escritos o comunicaciones presentadas por el ciudadano y realizadas en el aacutembito de actuacioacuten de los registros seguacuten lo dispuesto en el artiacuteculo 385 de la Ley 301992 del 26 de noviembre de reacutegimen juriacutedico de las administraciones puacuteblicas y del procedimiento administrativo comuacuten

Excepciones Estaraacuten exentos de la presente tasa

1- La expedicioacuten de certificados de retribuciones satisfechas por la Xunta de Galicia con el objeto de justificacioacuten en relacioacuten con el impuesto sobre la renta de las personas fiacutesicas

2- La expedicioacuten de certificados y compulsa que el personal de la Administracioacuten solicite respecto a las necesidades propias del puesto de trabajo o relacioacuten de servicios

3- Los alumnos por cualquier actuacioacuten en materia de ensentildeanzas no universitarias

scv 3 de 7

4- Las compulsas realizadas en las oficinas de empleo para los desempleados en la tramitacioacuten de expedientes que sean competencia de dichas oficinas

5 La inscripcioacuten en las convocatorias para a seleccioacuten de personal de la comunidad autoacutenoma despueacutes de justificacioacuten documental solicitada por

- Personas con discapacidad igual o superior al 33 - Personas que sean miembros de familias numerosas clasificadas en la

categoriacutea especial Se aplicaraacute una bonificacioacuten del 50 a la inscripcioacuten solicitada por - Personas que sean miembros de familias numerosas de categoriacutea

general - Personas que figurasen como demandantes de empleo desde por lo

menos seis meses antes a la fecha de la convocatoria de pruebas selectivas de personal en las que soliciten su participacioacuten y no esteacuten percibiendo prestacioacuten o subsidio por desempleo

6- La expedicioacuten de certificados relativos a la situacioacuten fiscal 7- El Estado y los demaacutes entes puacuteblicos territoriales o institucionales

siempre que los servicios o actividades de que sean beneficiarios se presten o se realicen en el marco del principio de colaboracioacuten entre administraciones

8- Las viacutectimas de actos terroristas asiacute como sus coacutenyuges y sus hijos por cualquier actuacioacuten en materia educativa realizada en centros oficiales de estudios en todos los niveles de ensentildeanza

9- Los miembros de los organismos consultivos de la Administracioacuten puacuteblica gallega respecto de los certificados emitidos por dichos organismos

COacuteDIGO TASAS

DESCRIPCIOacuteN IMPORTE euro

314400 Prestacioacuten de servicios en el Instituto Tecnoloacutegico para el Control del Medio Marino de Galicia

314401 Anaacutelisis de biotoxinas marinas en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de Yasumoto 1978 4752

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en rato segundo o meacutetodo de Yasumoto 1984 5432

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS)

9520 -Anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten

seguacuten el meacutetodo de la AOAC 4752

scv 4 de 7

-Anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo da AOAC 4752

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1978 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10186

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1984 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10865

-Anaacutelisis combinada en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS) anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo AOAC y anaacutelisis de toxicidad de tipo ASP por cromatografiacutea liquida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo de la AOAC 15000

314402 Anaacutelisis de muestras en agua de mar -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton marino mediante

microscopiacutea oacuteptica 15133 -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton toacutexico marino

mediante microscopiacutea oacuteptica 13333 - Anaacutelisis de carbono orgaacutenico disuelto 5093 -Anaacutelisis de nutrientes inorgaacutenicos disueltos 3500 -Anaacutelisis de pigmentos fotosinteacuteticos (clorofila ldquoardquo) por

espectrofluorimetria 1698 314403 Anaacutelisis microbioloacutegicos en moluscos y otros organismos

procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Cuantificacioacuten de E Coli 10186 - Deteccioacuten de Salmonella spp 16975 -Enumeracioacuten de Escherichia coli en moluscos bivalvos

vivos por la teacutecnica de medida directa de impedancia con el sistema BacTrac 4300 6800

314404 Anaacutelisis de contaminantes de origen quiacutemica en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Determinacioacuten de metales pesados (Pb Cd Cu Zn As Hg Ni Cr Ag) mediante espectrofotometriacutea de absorcioacuten atoacutemica por metal

6790

-Determinacioacuten de compuestos bifenilos policlorados (PCB) mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

scv 5 de 7

-Determinacioacuten de pesticidas organoclorados mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

-Determinacioacuten de hidrocarburos aromaacuteticos policiacuteclicos (HAPs) mediante cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de fluorescencia

28200

314405 Anaacutelisis histopatoloacutegica de moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Estudio hispatoloacutegico Determinacioacuten de Bonamia Marteillia Perkinsus y otras alteraciones patoloacutegicas

101852

314406 Emisioacuten de certificaciones e informes teacutecnicos y otras actuaciones a peticioacuten del interesado

Emisioacuten de certificados a peticioacuten de los interesados sobre las actuaciones llevadas a cabo por el Instituto

1000

Emisioacuten de informes teacutecnicos a peticioacuten del interesado (euros por hora o fraccioacuten)

4000

scv 6 de 7

scv 7 de 7

ANEXO 3

Resultados de anaacutelisis en muestras de microalgas anteriormente enviadas procedentes de Magallanes por el equipo de espectrometriacutea de masas utilizado por INTECMAR Trabajo presentado a las XXXII

Congreso de Ciencias del Mar realizado en Punta Arenas 22-25 octubre de 2012

PERFIL DE TOXINAS DE PROROCENTRUM LIMA (DINOPHYCEAE) AISLADO DESDE LA COSTA DE MAGALLANES SUR DE CHILE P Salgado1 G Pizarro1 JM Franco2 P Rioboacute2 e I Bravo3

1Instituto de Fomento Pesquero (IFOP) Punta Arenas Chile gemitapizarroifopcl 2Instituto de Investigaciones Marinas (CSIC) Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea 3Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea

Prorocentrum lima (Ehrenberg) es un dinoflagelado marino bentoacutenico que se encuentra adherido generalmente

sobre macroalgas sedimentos y detrito flotante y menos comuacutenmente en el plancton (Bravo et al 2001) Es una especie neriacutetica y estuarina y su rango de distribucioacuten geograacutefica variacutea desde aguas costeras tropicales a templadas (Faust 1991) La importancia de P lima se debe a que son productoras de toxinas diarreogeacutenicas en las personas (veneno diarreico de los mariscos VDM) al igual que algunas especies de Dinophysis aunque raramente se le han asociado con episodios toacutexicos por VDM por su caraacutecter epiacutefito y bentoacutenico El complejo VDM producido por P lima incluye moleacuteculas conocidas como el aacutecido okadaico (AO) y derivados dinofisistoxinas (DTX-1 DTX-2) (Bravo et al 2001 Vale et al 2009) No obstante existen casos citados para USA donde se detectoacute toxicidad por VDM en bivalvos de cultivos asociadas a P lima aunque en bajos niveles (Maranda et al 2007a) En Canadaacute tambieacuten se llevoacute a cabo un estudio en moluscos de cultivo cuya finalidad fue determinar el origen del VDM en la que P lima fue la principal especie sospechosa tras la ocurrencia de un evento toacutexico humano por VDM ocurrido en 1998 (Levasseur et al 2003) y en antildeos anteriores (Quilliam et al 1993) Aunque Levasseur et al (2003) no logroacute probar la toxicidad de los mariscos en cultivo a causa de P lima cabe hacer notar que lo que buscaron fue OA y DTX1 no DTX 3 este uacuteltimo principal derivado de las anteriores tras su transformacioacuten en los moluscos (eg Suzuki et al 1999 Vale amp Sampayo 2002)

En consecuencia el rol de P lima en eventos toacutexicos por VDM auacuten no puede descartarse por cuanto podriacutean llegar a ser importantes en ambientes turbulentos debido a la eventual remocioacuten de microalgas adheridas en sustratos por efecto de vientos (Levasseur et al 2003) factor de importancia si se trata de sedimentos o contrariamente en zonas someras y estables de cultivos de moluscos que al mismo tiempo favorecen microambientes para sustratos en los que prolifera la epiacutefita P lima (Lawrence et al 2000) quedando expuestas a re-suspensiones temporales que favorecen la filtracioacuten de estas microalgas por los bivalvos en cultivo (Maranda et al 2007a)

Chile posee escaso conocimiento sobre esta especie en su medio natural incluido su perfil de toxinas y potencial rol en la toxificacioacuten de moluscos por VDM Por tal razoacuten resultoacute interesante aportar al conocimiento de estos aspectos en muestras de sedimentos recolectadas en el estrecho de Magallanes en las que esta especie se encontroacute inhabitualmente abundante

Las ceacutelulas utilizadas en este estudio fueron aisladas desde sedimentos superficiales (0-3 cm) recolectados en el invierno de 2010 en la localidad de cabo San Isidro durante el muestreo regular del programa de monitoreo de marea roja en la regioacuten de Magallanes En esa oportunidad se logroacute cuantificar hasta 1002 quistes tecadoscm3 de Prorocentrum lima la mayor concentracioacuten respecto a otros sitios de recolecta (Fig 1) Los sedimentos de esta localidad presentaron una coloracioacuten oscura y un fuerte olor a sulfuro de hidroacutegeno (H2S) producto de anoxia local

Se aislaron entre 27 y 87 quistes tecados (Fig 1 a) directamente desde los sedimentos mientras otras 60 ceacutelulas vegetativas (Fig 1 b) fueron aisladas luego de promover la actividad y divisioacuten de los quistes en condiciones de 15 ordmC y un ciclo de luzoscuridad de 1212 horas (Tabla 1) Para este fin se aislaron quistes tecados y trasvasijaron a placas Petri de 5 cm de diaacutemetro conteniendo 5 mL de medio de cultivo L1 Para el anaacutelisis de toxinas las ceacutelulas aisladas fueron trasvasijadas a un tubo Eppendorf de 15 mL y congelados a -80 ordmC Una aliacutecuota de sedimento huacutemedo (100 microL aproximados) tambieacuten fue vaciada en un tubo Eppendorf y congelado Para extraer la toxina se antildeadioacute 500 microL de metanol 100 a cada tubo se mezcloacute por 1 min y filtroacute por 045 microm trasvasijando a un vial El extracto fue secado bajo nitroacutegeno gas a 40 ordmC y conservado a 4 ordmC hasta su anaacutelisis Previo al anaacutelisis de toxinas los extractos fueron resuspendidos en 150 microl de metanol

La presencia de la toxina dinofisistoxina 1 (DTX-1) en las muestras (Fig2) fue confirmada en modo negativo a traveacutes de su ioacuten precursor [M-H]- mz 8175 y sus iones productos mz 5634 y 2552 mediante un cromatoacutegrafo UPLC Acquity Waters acoplado a un triple cuadrupolo Waters Xevo TQ (LC-MS) La columna utilizada fue una Acquity UPLC BEH C18 17microm 21 x 100 mm a 45 ordmC La fase moacutevil consistioacute en (A) hidroacutexido amoacutenico a pH 11 y (B) hidroacutexido amoacutenico en acetonitrilo (67 mM) con una tasa de flujo de 4 mLmin El gradiente de elucioacuten utilizado fue el siguiente mantencioacuten al 75 de A entre 0 y 066 min cambio a 5 de A entre 066 y 330 min mantener 5

de A entre 330 y 528 min recuperacioacuten del 75 de A entre 528 y 726 min mantencioacuten al 75 de A hasta 9 min Se pinchoacute 5microL de muestra en el LC-MS El contenido de DTX-1 en las muestras fue cuantificado en base al ion precursor

Los tres tipos de muestras fueron positivas a la presencia de DTX-1 pero las ceacutelulas vegetativas fueron las que presentaron un mayor contenido de DTX-1 por ceacutelula La deteccioacuten de DTX-1 en los sedimentos (Tabla 2) reflejoacute la presencia de los quistes tecados en eacutestos

Figura 1 Concentraciones de quistes tecados de Prorocentrum lima (quistescm3 de sedimento huacutemedo) en estaciones de muestreo en el Estrecho de Magallanes (M26 Estero Wickham M29N1 Isla Engenfield M31 Bahiacutea Nash M35 Cabo San Isidro M39C1 Bahiacutea Gente Grande M39C2 Bahiacutea Inuacutetil M39C3 Canal Gabriel) y Canal Beagle (M41 Ventisquero Espantildea M42 Ventisquero Holanda) (a) Quistes tecados (b) ceacutelulas vegetativas obtenidas de germinacioacuten de quistes tecados bajo condiciones de laboratorio Barra de escala 20 microm

Tabla 1 Sedimento y ceacutelulas de Prorocentrum lima aisladas para anaacutelisis de toxinas

Extracto metanoacutelico Nordm de ceacutelulas TR ngmL pg DTX-1 ceacutel

G1 quistes tecados 27 213 lt2 -

G2 quistes tecados 67 214 05 11

G3 quistes tecados 87 215 12 21

G4 ceacutelulas vegetativas 60 215 34 87

G6 sedimentos aliacutecuota 213 13 19 pg microL sed

TR tiempo de retencioacuten

Figura 2 Cromatogramas de extractos metanoacutelicos de Prorocentrum lima quistes tecados (a) ceacutelulas vegetativas (b) y sedimentos (c)

Tabla 2 Caracteriacutesticas del sedimento con quistes tecados de Prorocentrum lima

Tipo Tamantildeo (mm)

Grava 2 35

Arena media 025 - 05 32

Arena muy fina 0063 - 0125 2

Limo-arcilla lt 0063 1

Estos resultados constituyen otra eventual posibilidad de toxicidad en los moluscos por VDM no soacutelo de aquellos con modalidad de vida bentoacutenica superficial sino de aquellos que tambieacuten viven enterrados en la arena (eg almeja huepo) Maacutes auacuten si se conoce que P lima posee la capacidad de desarrollar poblaciones naturales en aguas templadas en nuacutemeros que podriacutean justificar una toxicidad por VDM en los mariscos (eg Maranda et al 2007a b)

Referencias

Bravo I ML Fernaacutendez I Ramilo amp A Martinez 2001 Toxin composition of the toxic dinofagellate Prorocentrum lima isolated from different locations along the Galician coast (NW Spain) Toxicon 39 1537ndash1545

Faust MA 1991 Morphology of ciguatera-causing Prorocentrum lima (Pyrrophyta) from widely differing sites J Phycol 27 642-648

Lawrence J E Grant J Quilliam M A Bauder A G amp Cembella A D 2000 Colonizaition and growth of the toxic dinoflagellate Prorocentrum lima and associated fouling macroalgae on mussels in suspended culture Mar Ecol Prog Ser 201 147-154

Levasseur M Couture J Y Weise A M Michaud S Elbrachter M Sauveacute G amp Bonneau E 2003 Pelagic and epiphytic summer distributions of Prorocentrum lima and P mexicanum at two mussel farms in the Gulf of St Lawrence Aquat Microbiol Ecol 30283-293

Maranda L Corwin S Dover S amp Morton S L 2007a Prorocentrum lima (Dinophyceae) in northeastern USA coastal waters II Toxin load in the epibiota and in shellfish Harmful Algae 6 632-641

Maranda L Corwin S Hargraves P E 2007b Prorocentrum lima (Dinophyceae) in 19 northeastern USA coastal waters I Abundance and distribution Harmful Algae 6 623ndash631

Quilliam MA Gilgan MW amp Pleasance S 1993 Confirmation of an incident of diarrhetic shellfish poisoning in eastern Canada In Smayda TJ Shimizu Y (Eds) Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea Elsevier New York pp 547ndash552

Suzuki T Ota H amp Yamasaki M 1999 Direct evidence of transformation of dinophysistoxin-1 to 7-O-acyl-dinophysistoxin-1 (Dinophysis-3) in the scallop Patinopecten yessoensis Toxicon 37 187-198

Vale P amp Sampayo M A 2002 First confirmation of human diarrhoeic poisonings by okadaic acid esters after ingestion of razor clams (Solen marginatus) and green crabs (Carcinus maenas) in Aveiro lagoon Portugal and detection of okadaic acid esters in phytoplankton Toxicon 40989-996

Vale P Veloso V amp Amorim A 2009 Toxin composition of a Prorocentrum lima strain isolated from the Portuguese coast Toxicon 54145ndash152

Agradecimientos Intecmar de la Xunta de Galicia Espantildea donde se realizaron los anaacutelisis de toxinas proyecto

SUBPESCA ldquoManejo y Monitoreo de Mareas Rojas en las regiones de Los Lagos Ayseacuten y Magallanes IV etapa 2010rdquo

ANEXO 4

Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten

ANEXO 5

Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de Magallanes

TASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

O

EJE

MP

LA

R P

AR

A E

L IN

TE

RE

SA

DO

LIQ

UID

AC

IOacuteN

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

EN

TID

AD

BA

NC

AR

IATASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

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Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

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CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

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DIG

OS

COacute

DIG

OS

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

0 9

4 0

2 4INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

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NTASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

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Firma del declarante o representante legal

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Sello Fecha Nuacutemero

SU

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BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

9520 euros

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

CONSELLERIA DE FACENDA

ANEXO 6

Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para cierre

de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

Seccioacuten Ediciones y Produccioacuten Almte Manuel Blanco Encalada 839

Fono 56-32-2151500 Valparaiacuteso Chile

wwwifopcl

Page 27: “Análisis de toxinas lipofílicas mediante LC-MS/MS en ...metadatos.mma.gob.cl/sinia/Informe_final_Analisis_toxinas_lipofilicas_656-055.pdfSUBSECRETARÍA DE ECONOMÍA: INFORME FINAL:

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SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo TABLAS

Tabla 1 Condiciones cromatograacuteficas para el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas usando

una columna de UPLC C18 en fase reversa y medio baacutesico

Columna Acquity UPLC BEH C18 17 microm 21x100 mm

Temperatura columna 45 ordmC

Flujo 04 mlmin

Volumen inyeccioacuten 5 microl

Temperatura muestras 10 plusmn 5 ordmC

Gradiente

Tiempo (min) Fase A () Fase B ()

0 75 25

066 75 25

330 5 95

528 5 95

726 75 25

900 75 25

Tabla 2 Paraacutemetros de la fuente de ionizacioacuten para el Xevo TQMS (Waters) en la determinacioacuten de toxinas lipofiacutelicas

PARAacuteMETROS DE LA FUENTE

ESI- ESI+

AO DTX2 DTX1 YTX homoYTX 45OH YTX y 45OH

homoYTX

AZA1 AZA2 AZA3 PTX2 PTX1 y SPX1

Voltaje de capilar (V) 100 200

Temperatura de solvatacioacuten (ordmC) 450 450

Flujo gas de solvatacioacuten (lh) 850 850

Flujo gas cono (lh) 50 50

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Tabla 3

Resumen de las condiciones de espectrometriacutea de masas empleadas con el Xevo TQMS (Waters) en el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas

Compuesto tR (min)

ESI

Ioacuten Precursor

(mz)

Ioacuten Producto

(mz)

Dwell time (s)

Energiacutea colisioacuten

(eV)

Voltaje cono (V)

AO 189 NEG 8035 2552 0010 46 86

113 0010 56 86

DTX2 210 NEG 8035 2552 0010 46 86

113 0010 56 86

DTX1 214 NEG 8175 5634 0010 43 86

2552 0010 48 86

YTX 202 NEG 5704 4674 0010 30 45

3963 0010 35 45

45OH-YTX 182 NEG 5784 4674 0010 30 45

3964 0010 30 45

HomoYTX 203 NEG 5775 4744 0010 30 48

4034 0010 30 48

45OH-homoYTX 182 NEG 5855 4034 0010 30 45

4744 0010 30 45

PTX1 306 POS 8925 8395 0015 25 36

8215 0015 25 36

PTX2 362 POS 8765 8415 0015 20 36

8235 0015 25 36

AZA1 263 POS 8425 6545 0015 55 50

3622 0015 50 50

AZA2 270 POS 8565 6725 0015 45 27

6545 0015 45 27

AZA3 236 POS 8285 6404 0015 55 47

3622 0015 55 47

SPX1 368 POS 6925 6744 0015 27 60

1643 0015 42 60 Transicioacuten cuantificadora

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Tabla 4 TRR y valores de tolerancia para las toxinas analizadas

TOXINA TRR TOLERANCIA

Toxinas del grupo de AO

AO 1000 0990-1010

DTX2 1040 1014-1066

DTX1 1140 1111-1168

Toxinas del grupo de PTX

PTX2 1000 0990-1010

PTX1 0850 0829-0871

Toxinas del grupo de YTX

YTX 1000 0990-1010

45OH-YTX 0894 0871-0916

Homo YTX 1000 0990-1010

45OH-homoYTX 0899 0876-0921

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Tabla 5 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de moluscos

Nordm estMes

recolectaLocalidad Molusco

cuerpo

enterohepat

gramos

carne

toxicidad

VDM ratoacuten

PTX2

(ugKg)

YTX

(ugKg)

45OHYTX

(ugKg)

DTX1

libre

(ugKg)

DTX1

total

(ugkg)

SPX 1

(ugKg)

M13 ene-13 E Peel chorito x 5086 + 01 02

M13 ene-13 E Peel ostioacuten x 5155 No real izado 16 21

M33 ene-13 B Bell chorito x 5253 + 04

M37 ene-13 B Agua Fresca chorito x 5039 + 05 01

M35 ene-13 C San Isidro chorito x 5289 + 000 01

M42 ene-13 V Holanda chorito x 5231 + 06 13

M43 ene-13 B Yendegaia chorito x 5193 + 04 25

M45 ene-13 Pto Williams chorito x 5161 - 28 07

M08 feb-13 E Falcon cholga x 5027 - 14

M09 feb-13 E Penguumlin cholga x 5103 + 14

M22 feb-13 E de las Montantildeas cholga x 5052 - 26

M23 feb-13 I Ballesteros cholga x 5204 - 87

M24 feb-13 B Fanny chorito x 2016 - 38 1071 479 12

M25 feb-13 E Silva Palma chorito x 1447 - 59 1077 898 09

M26 feb-13 E Wickham chorito x 1093 - 194 2940 2232 66 66

M27 feb-13 E Sullivan chorito x 1137 - 450 1944 1478

M28 feb-13 E Nuntildeez chorito x 1179 + 33 721 407

M29 feb-13 Cutter Cove chorito x 1003 - 65 501 309

M29N1 feb-13 I Engelfield chorito x 1116 - 297 2007 1483

M31 feb-13 B Nash chorito x 2231 +

M33 feb-13 B Bell chorito x 1181 - 93

M34 feb-13 S Pedro chorito x 0726 -

M35 feb-13 C San Isidro chorito x 1178 + 110

M36 feb-13 B Buena chorito x 1367 +

M37 feb-13 B Agua Fresca chorito x 0850 + 45 100 80

M39 feb-13 Pto Zenteno chorito x 3241 + 28

M39N2 feb-13 Pta San Valentin chorito x 1712 - 11

M39N3 feb-13 Pto Yartou chorito x 2035 - 11

sector

Fortunajul-12 B Inuacutetil

caracol

piquilhuex 107000 + 01

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Tabla 6 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de microalgas

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Tabla 7 Niveles actualmente permitidos por la legislacioacuten europea (bioensayo) y los niveles propuestos por la

autoridad europea para la seguridad alimentaria (EFSA) (Gerssen et al 2010)

Toxin Legislacioacuten (μg kg-

1) Proposicioacuten

EFSA (μg kg-1)

Validacioacuten LC-MSMS

(μg kg-1)

OA and DTXs 160 45

PTXs 120

YTXs 1000 3750

AZAs 160 32

SPXs 400 (Gerssen et al2010)

European Food Safety Authority Decisioacuten 2002657 de la Unioacuten Europea EC Incluye PTXs

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Tabla 8 Abundancia relativa ambiental de las microalgas al momento de recolectar las muestras de moluscos En rojo se indica la deteccioacuten de toxina positiva en los moluscos asociada a la supuesta microalga fuente PTXs (D

acuminata) YTXs (P reticulatum) SPXs (A ostenfeldii) DTX1 (A acuta)

(Tabla modificada de Guzmaacuten et al 2014)

A N E X O S

ANEXO 1

Certificacioacuten laboratorio INTECMAR

ANEXO 2

Lista de anaacutelisis que realiza INTECMAR y sus costos (en euros) 2013

scv 1 de 7

GUIA PARA LA AUTOLIQUIDACIOacuteN DE TASAS A FAVOR DE LA COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA 2013 Los aspectos financieros de los servicios prestados por Intecmar en el marco de su actividad e vienen regulados en la Ley 62003 de 9 de diciembre de tasas precios y exenciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia (DOG nuacutem 240 de 11122003) y fueron actualizados posteriormente en la Ley 142010 de 27 de diciembre de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2011 (DOG nuacutem 250 de 30122010) y en la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013 (DOG nuacutem 42 de 28022013) Existen dos maneras de liquidar las tasas correspondientes a los servicios prestados por Intecmar

1 De forma manual cubriendo el modelo A de autoliquidacioacuten que se descarga en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda y que adjunto en pdf y se lleva al banco para su pago httpwwwconselleriadefacendaeswebportalconfeccion-impresos

2 De forma telemaacutetica en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda viacutenculo httpshostcixtecesXEITObinlionwebXeitodllxmit a traveacutes del modelo 730

Ambos modelos de liquidacioacuten de tasas adjuntamos ejemplo al final de este documento deben ser remitidos por mail a Intecmar con el sello del banco fiacutesico o virtual como paso previo a la emisioacuten del certificado Los coacutedigos generales necesarios son

minus Consejeriacutea de Medio Rural y de Mar Coacutedigo 09 minus Delegacioacuten de Pontevedra Coacutedigo 40 minus Servicio de Intecmar Coacutedigo 24

Los coacutedigos y descripcioacuten de las tasas son los regulados en la legislacioacuten vigente y los hemos resumido en los anexos siguientes Vilaxoaacuten 4 de marzo de 2013

scv 2 de 7

TARIFAS DE TASAS VIGENTES PARA 2013 - Ley 22013 d e 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013

(DOG nuacutem 42 de 28022013)

Estas tarifas son consecuencia de la actualizacioacuten de las tarifas contenidas en los anexos 1 2 3 4 y 5 de la Ley 62003 del 9 de diciembre de tasas precios y exacciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia por la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 Seraacuten aplicables desde el diacutea de la entrada en vigor de la Ley de

presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 TASA POR SERVICIOS ADMINISTRATIVOS

No sujecioacuten No se exigiraacute la tasa por servicios administrativos cuando se trate de compulsas o cotejos de documentos que deban acompantildear a solicitudes escritos o comunicaciones presentadas por el ciudadano y realizadas en el aacutembito de actuacioacuten de los registros seguacuten lo dispuesto en el artiacuteculo 385 de la Ley 301992 del 26 de noviembre de reacutegimen juriacutedico de las administraciones puacuteblicas y del procedimiento administrativo comuacuten

Excepciones Estaraacuten exentos de la presente tasa

1- La expedicioacuten de certificados de retribuciones satisfechas por la Xunta de Galicia con el objeto de justificacioacuten en relacioacuten con el impuesto sobre la renta de las personas fiacutesicas

2- La expedicioacuten de certificados y compulsa que el personal de la Administracioacuten solicite respecto a las necesidades propias del puesto de trabajo o relacioacuten de servicios

3- Los alumnos por cualquier actuacioacuten en materia de ensentildeanzas no universitarias

scv 3 de 7

4- Las compulsas realizadas en las oficinas de empleo para los desempleados en la tramitacioacuten de expedientes que sean competencia de dichas oficinas

5 La inscripcioacuten en las convocatorias para a seleccioacuten de personal de la comunidad autoacutenoma despueacutes de justificacioacuten documental solicitada por

- Personas con discapacidad igual o superior al 33 - Personas que sean miembros de familias numerosas clasificadas en la

categoriacutea especial Se aplicaraacute una bonificacioacuten del 50 a la inscripcioacuten solicitada por - Personas que sean miembros de familias numerosas de categoriacutea

general - Personas que figurasen como demandantes de empleo desde por lo

menos seis meses antes a la fecha de la convocatoria de pruebas selectivas de personal en las que soliciten su participacioacuten y no esteacuten percibiendo prestacioacuten o subsidio por desempleo

6- La expedicioacuten de certificados relativos a la situacioacuten fiscal 7- El Estado y los demaacutes entes puacuteblicos territoriales o institucionales

siempre que los servicios o actividades de que sean beneficiarios se presten o se realicen en el marco del principio de colaboracioacuten entre administraciones

8- Las viacutectimas de actos terroristas asiacute como sus coacutenyuges y sus hijos por cualquier actuacioacuten en materia educativa realizada en centros oficiales de estudios en todos los niveles de ensentildeanza

9- Los miembros de los organismos consultivos de la Administracioacuten puacuteblica gallega respecto de los certificados emitidos por dichos organismos

COacuteDIGO TASAS

DESCRIPCIOacuteN IMPORTE euro

314400 Prestacioacuten de servicios en el Instituto Tecnoloacutegico para el Control del Medio Marino de Galicia

314401 Anaacutelisis de biotoxinas marinas en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de Yasumoto 1978 4752

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en rato segundo o meacutetodo de Yasumoto 1984 5432

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS)

9520 -Anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten

seguacuten el meacutetodo de la AOAC 4752

scv 4 de 7

-Anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo da AOAC 4752

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1978 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10186

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1984 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10865

-Anaacutelisis combinada en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS) anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo AOAC y anaacutelisis de toxicidad de tipo ASP por cromatografiacutea liquida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo de la AOAC 15000

314402 Anaacutelisis de muestras en agua de mar -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton marino mediante

microscopiacutea oacuteptica 15133 -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton toacutexico marino

mediante microscopiacutea oacuteptica 13333 - Anaacutelisis de carbono orgaacutenico disuelto 5093 -Anaacutelisis de nutrientes inorgaacutenicos disueltos 3500 -Anaacutelisis de pigmentos fotosinteacuteticos (clorofila ldquoardquo) por

espectrofluorimetria 1698 314403 Anaacutelisis microbioloacutegicos en moluscos y otros organismos

procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Cuantificacioacuten de E Coli 10186 - Deteccioacuten de Salmonella spp 16975 -Enumeracioacuten de Escherichia coli en moluscos bivalvos

vivos por la teacutecnica de medida directa de impedancia con el sistema BacTrac 4300 6800

314404 Anaacutelisis de contaminantes de origen quiacutemica en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Determinacioacuten de metales pesados (Pb Cd Cu Zn As Hg Ni Cr Ag) mediante espectrofotometriacutea de absorcioacuten atoacutemica por metal

6790

-Determinacioacuten de compuestos bifenilos policlorados (PCB) mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

scv 5 de 7

-Determinacioacuten de pesticidas organoclorados mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

-Determinacioacuten de hidrocarburos aromaacuteticos policiacuteclicos (HAPs) mediante cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de fluorescencia

28200

314405 Anaacutelisis histopatoloacutegica de moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Estudio hispatoloacutegico Determinacioacuten de Bonamia Marteillia Perkinsus y otras alteraciones patoloacutegicas

101852

314406 Emisioacuten de certificaciones e informes teacutecnicos y otras actuaciones a peticioacuten del interesado

Emisioacuten de certificados a peticioacuten de los interesados sobre las actuaciones llevadas a cabo por el Instituto

1000

Emisioacuten de informes teacutecnicos a peticioacuten del interesado (euros por hora o fraccioacuten)

4000

scv 6 de 7

scv 7 de 7

ANEXO 3

Resultados de anaacutelisis en muestras de microalgas anteriormente enviadas procedentes de Magallanes por el equipo de espectrometriacutea de masas utilizado por INTECMAR Trabajo presentado a las XXXII

Congreso de Ciencias del Mar realizado en Punta Arenas 22-25 octubre de 2012

PERFIL DE TOXINAS DE PROROCENTRUM LIMA (DINOPHYCEAE) AISLADO DESDE LA COSTA DE MAGALLANES SUR DE CHILE P Salgado1 G Pizarro1 JM Franco2 P Rioboacute2 e I Bravo3

1Instituto de Fomento Pesquero (IFOP) Punta Arenas Chile gemitapizarroifopcl 2Instituto de Investigaciones Marinas (CSIC) Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea 3Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea

Prorocentrum lima (Ehrenberg) es un dinoflagelado marino bentoacutenico que se encuentra adherido generalmente

sobre macroalgas sedimentos y detrito flotante y menos comuacutenmente en el plancton (Bravo et al 2001) Es una especie neriacutetica y estuarina y su rango de distribucioacuten geograacutefica variacutea desde aguas costeras tropicales a templadas (Faust 1991) La importancia de P lima se debe a que son productoras de toxinas diarreogeacutenicas en las personas (veneno diarreico de los mariscos VDM) al igual que algunas especies de Dinophysis aunque raramente se le han asociado con episodios toacutexicos por VDM por su caraacutecter epiacutefito y bentoacutenico El complejo VDM producido por P lima incluye moleacuteculas conocidas como el aacutecido okadaico (AO) y derivados dinofisistoxinas (DTX-1 DTX-2) (Bravo et al 2001 Vale et al 2009) No obstante existen casos citados para USA donde se detectoacute toxicidad por VDM en bivalvos de cultivos asociadas a P lima aunque en bajos niveles (Maranda et al 2007a) En Canadaacute tambieacuten se llevoacute a cabo un estudio en moluscos de cultivo cuya finalidad fue determinar el origen del VDM en la que P lima fue la principal especie sospechosa tras la ocurrencia de un evento toacutexico humano por VDM ocurrido en 1998 (Levasseur et al 2003) y en antildeos anteriores (Quilliam et al 1993) Aunque Levasseur et al (2003) no logroacute probar la toxicidad de los mariscos en cultivo a causa de P lima cabe hacer notar que lo que buscaron fue OA y DTX1 no DTX 3 este uacuteltimo principal derivado de las anteriores tras su transformacioacuten en los moluscos (eg Suzuki et al 1999 Vale amp Sampayo 2002)

En consecuencia el rol de P lima en eventos toacutexicos por VDM auacuten no puede descartarse por cuanto podriacutean llegar a ser importantes en ambientes turbulentos debido a la eventual remocioacuten de microalgas adheridas en sustratos por efecto de vientos (Levasseur et al 2003) factor de importancia si se trata de sedimentos o contrariamente en zonas someras y estables de cultivos de moluscos que al mismo tiempo favorecen microambientes para sustratos en los que prolifera la epiacutefita P lima (Lawrence et al 2000) quedando expuestas a re-suspensiones temporales que favorecen la filtracioacuten de estas microalgas por los bivalvos en cultivo (Maranda et al 2007a)

Chile posee escaso conocimiento sobre esta especie en su medio natural incluido su perfil de toxinas y potencial rol en la toxificacioacuten de moluscos por VDM Por tal razoacuten resultoacute interesante aportar al conocimiento de estos aspectos en muestras de sedimentos recolectadas en el estrecho de Magallanes en las que esta especie se encontroacute inhabitualmente abundante

Las ceacutelulas utilizadas en este estudio fueron aisladas desde sedimentos superficiales (0-3 cm) recolectados en el invierno de 2010 en la localidad de cabo San Isidro durante el muestreo regular del programa de monitoreo de marea roja en la regioacuten de Magallanes En esa oportunidad se logroacute cuantificar hasta 1002 quistes tecadoscm3 de Prorocentrum lima la mayor concentracioacuten respecto a otros sitios de recolecta (Fig 1) Los sedimentos de esta localidad presentaron una coloracioacuten oscura y un fuerte olor a sulfuro de hidroacutegeno (H2S) producto de anoxia local

Se aislaron entre 27 y 87 quistes tecados (Fig 1 a) directamente desde los sedimentos mientras otras 60 ceacutelulas vegetativas (Fig 1 b) fueron aisladas luego de promover la actividad y divisioacuten de los quistes en condiciones de 15 ordmC y un ciclo de luzoscuridad de 1212 horas (Tabla 1) Para este fin se aislaron quistes tecados y trasvasijaron a placas Petri de 5 cm de diaacutemetro conteniendo 5 mL de medio de cultivo L1 Para el anaacutelisis de toxinas las ceacutelulas aisladas fueron trasvasijadas a un tubo Eppendorf de 15 mL y congelados a -80 ordmC Una aliacutecuota de sedimento huacutemedo (100 microL aproximados) tambieacuten fue vaciada en un tubo Eppendorf y congelado Para extraer la toxina se antildeadioacute 500 microL de metanol 100 a cada tubo se mezcloacute por 1 min y filtroacute por 045 microm trasvasijando a un vial El extracto fue secado bajo nitroacutegeno gas a 40 ordmC y conservado a 4 ordmC hasta su anaacutelisis Previo al anaacutelisis de toxinas los extractos fueron resuspendidos en 150 microl de metanol

La presencia de la toxina dinofisistoxina 1 (DTX-1) en las muestras (Fig2) fue confirmada en modo negativo a traveacutes de su ioacuten precursor [M-H]- mz 8175 y sus iones productos mz 5634 y 2552 mediante un cromatoacutegrafo UPLC Acquity Waters acoplado a un triple cuadrupolo Waters Xevo TQ (LC-MS) La columna utilizada fue una Acquity UPLC BEH C18 17microm 21 x 100 mm a 45 ordmC La fase moacutevil consistioacute en (A) hidroacutexido amoacutenico a pH 11 y (B) hidroacutexido amoacutenico en acetonitrilo (67 mM) con una tasa de flujo de 4 mLmin El gradiente de elucioacuten utilizado fue el siguiente mantencioacuten al 75 de A entre 0 y 066 min cambio a 5 de A entre 066 y 330 min mantener 5

de A entre 330 y 528 min recuperacioacuten del 75 de A entre 528 y 726 min mantencioacuten al 75 de A hasta 9 min Se pinchoacute 5microL de muestra en el LC-MS El contenido de DTX-1 en las muestras fue cuantificado en base al ion precursor

Los tres tipos de muestras fueron positivas a la presencia de DTX-1 pero las ceacutelulas vegetativas fueron las que presentaron un mayor contenido de DTX-1 por ceacutelula La deteccioacuten de DTX-1 en los sedimentos (Tabla 2) reflejoacute la presencia de los quistes tecados en eacutestos

Figura 1 Concentraciones de quistes tecados de Prorocentrum lima (quistescm3 de sedimento huacutemedo) en estaciones de muestreo en el Estrecho de Magallanes (M26 Estero Wickham M29N1 Isla Engenfield M31 Bahiacutea Nash M35 Cabo San Isidro M39C1 Bahiacutea Gente Grande M39C2 Bahiacutea Inuacutetil M39C3 Canal Gabriel) y Canal Beagle (M41 Ventisquero Espantildea M42 Ventisquero Holanda) (a) Quistes tecados (b) ceacutelulas vegetativas obtenidas de germinacioacuten de quistes tecados bajo condiciones de laboratorio Barra de escala 20 microm

Tabla 1 Sedimento y ceacutelulas de Prorocentrum lima aisladas para anaacutelisis de toxinas

Extracto metanoacutelico Nordm de ceacutelulas TR ngmL pg DTX-1 ceacutel

G1 quistes tecados 27 213 lt2 -

G2 quistes tecados 67 214 05 11

G3 quistes tecados 87 215 12 21

G4 ceacutelulas vegetativas 60 215 34 87

G6 sedimentos aliacutecuota 213 13 19 pg microL sed

TR tiempo de retencioacuten

Figura 2 Cromatogramas de extractos metanoacutelicos de Prorocentrum lima quistes tecados (a) ceacutelulas vegetativas (b) y sedimentos (c)

Tabla 2 Caracteriacutesticas del sedimento con quistes tecados de Prorocentrum lima

Tipo Tamantildeo (mm)

Grava 2 35

Arena media 025 - 05 32

Arena muy fina 0063 - 0125 2

Limo-arcilla lt 0063 1

Estos resultados constituyen otra eventual posibilidad de toxicidad en los moluscos por VDM no soacutelo de aquellos con modalidad de vida bentoacutenica superficial sino de aquellos que tambieacuten viven enterrados en la arena (eg almeja huepo) Maacutes auacuten si se conoce que P lima posee la capacidad de desarrollar poblaciones naturales en aguas templadas en nuacutemeros que podriacutean justificar una toxicidad por VDM en los mariscos (eg Maranda et al 2007a b)

Referencias

Bravo I ML Fernaacutendez I Ramilo amp A Martinez 2001 Toxin composition of the toxic dinofagellate Prorocentrum lima isolated from different locations along the Galician coast (NW Spain) Toxicon 39 1537ndash1545

Faust MA 1991 Morphology of ciguatera-causing Prorocentrum lima (Pyrrophyta) from widely differing sites J Phycol 27 642-648

Lawrence J E Grant J Quilliam M A Bauder A G amp Cembella A D 2000 Colonizaition and growth of the toxic dinoflagellate Prorocentrum lima and associated fouling macroalgae on mussels in suspended culture Mar Ecol Prog Ser 201 147-154

Levasseur M Couture J Y Weise A M Michaud S Elbrachter M Sauveacute G amp Bonneau E 2003 Pelagic and epiphytic summer distributions of Prorocentrum lima and P mexicanum at two mussel farms in the Gulf of St Lawrence Aquat Microbiol Ecol 30283-293

Maranda L Corwin S Dover S amp Morton S L 2007a Prorocentrum lima (Dinophyceae) in northeastern USA coastal waters II Toxin load in the epibiota and in shellfish Harmful Algae 6 632-641

Maranda L Corwin S Hargraves P E 2007b Prorocentrum lima (Dinophyceae) in 19 northeastern USA coastal waters I Abundance and distribution Harmful Algae 6 623ndash631

Quilliam MA Gilgan MW amp Pleasance S 1993 Confirmation of an incident of diarrhetic shellfish poisoning in eastern Canada In Smayda TJ Shimizu Y (Eds) Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea Elsevier New York pp 547ndash552

Suzuki T Ota H amp Yamasaki M 1999 Direct evidence of transformation of dinophysistoxin-1 to 7-O-acyl-dinophysistoxin-1 (Dinophysis-3) in the scallop Patinopecten yessoensis Toxicon 37 187-198

Vale P amp Sampayo M A 2002 First confirmation of human diarrhoeic poisonings by okadaic acid esters after ingestion of razor clams (Solen marginatus) and green crabs (Carcinus maenas) in Aveiro lagoon Portugal and detection of okadaic acid esters in phytoplankton Toxicon 40989-996

Vale P Veloso V amp Amorim A 2009 Toxin composition of a Prorocentrum lima strain isolated from the Portuguese coast Toxicon 54145ndash152

Agradecimientos Intecmar de la Xunta de Galicia Espantildea donde se realizaron los anaacutelisis de toxinas proyecto

SUBPESCA ldquoManejo y Monitoreo de Mareas Rojas en las regiones de Los Lagos Ayseacuten y Magallanes IV etapa 2010rdquo

ANEXO 4

Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten

ANEXO 5

Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de Magallanes

TASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

O

EJE

MP

LA

R P

AR

A E

L IN

TE

RE

SA

DO

LIQ

UID

AC

IOacuteN

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

EN

TID

AD

BA

NC

AR

IATASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

0 9

4 0

2 4INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

AD

MIN

IST

RA

CIOacute

NTASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

9520 euros

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

CONSELLERIA DE FACENDA

ANEXO 6

Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para cierre

de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

Seccioacuten Ediciones y Produccioacuten Almte Manuel Blanco Encalada 839

Fono 56-32-2151500 Valparaiacuteso Chile

wwwifopcl

Page 28: “Análisis de toxinas lipofílicas mediante LC-MS/MS en ...metadatos.mma.gob.cl/sinia/Informe_final_Analisis_toxinas_lipofilicas_656-055.pdfSUBSECRETARÍA DE ECONOMÍA: INFORME FINAL:

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo TABLAS

Tabla 3

Resumen de las condiciones de espectrometriacutea de masas empleadas con el Xevo TQMS (Waters) en el anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas

Compuesto tR (min)

ESI

Ioacuten Precursor

(mz)

Ioacuten Producto

(mz)

Dwell time (s)

Energiacutea colisioacuten

(eV)

Voltaje cono (V)

AO 189 NEG 8035 2552 0010 46 86

113 0010 56 86

DTX2 210 NEG 8035 2552 0010 46 86

113 0010 56 86

DTX1 214 NEG 8175 5634 0010 43 86

2552 0010 48 86

YTX 202 NEG 5704 4674 0010 30 45

3963 0010 35 45

45OH-YTX 182 NEG 5784 4674 0010 30 45

3964 0010 30 45

HomoYTX 203 NEG 5775 4744 0010 30 48

4034 0010 30 48

45OH-homoYTX 182 NEG 5855 4034 0010 30 45

4744 0010 30 45

PTX1 306 POS 8925 8395 0015 25 36

8215 0015 25 36

PTX2 362 POS 8765 8415 0015 20 36

8235 0015 25 36

AZA1 263 POS 8425 6545 0015 55 50

3622 0015 50 50

AZA2 270 POS 8565 6725 0015 45 27

6545 0015 45 27

AZA3 236 POS 8285 6404 0015 55 47

3622 0015 55 47

SPX1 368 POS 6925 6744 0015 27 60

1643 0015 42 60 Transicioacuten cuantificadora

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SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo TABLAS

Tabla 4 TRR y valores de tolerancia para las toxinas analizadas

TOXINA TRR TOLERANCIA

Toxinas del grupo de AO

AO 1000 0990-1010

DTX2 1040 1014-1066

DTX1 1140 1111-1168

Toxinas del grupo de PTX

PTX2 1000 0990-1010

PTX1 0850 0829-0871

Toxinas del grupo de YTX

YTX 1000 0990-1010

45OH-YTX 0894 0871-0916

Homo YTX 1000 0990-1010

45OH-homoYTX 0899 0876-0921

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Tabla 5 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de moluscos

Nordm estMes

recolectaLocalidad Molusco

cuerpo

enterohepat

gramos

carne

toxicidad

VDM ratoacuten

PTX2

(ugKg)

YTX

(ugKg)

45OHYTX

(ugKg)

DTX1

libre

(ugKg)

DTX1

total

(ugkg)

SPX 1

(ugKg)

M13 ene-13 E Peel chorito x 5086 + 01 02

M13 ene-13 E Peel ostioacuten x 5155 No real izado 16 21

M33 ene-13 B Bell chorito x 5253 + 04

M37 ene-13 B Agua Fresca chorito x 5039 + 05 01

M35 ene-13 C San Isidro chorito x 5289 + 000 01

M42 ene-13 V Holanda chorito x 5231 + 06 13

M43 ene-13 B Yendegaia chorito x 5193 + 04 25

M45 ene-13 Pto Williams chorito x 5161 - 28 07

M08 feb-13 E Falcon cholga x 5027 - 14

M09 feb-13 E Penguumlin cholga x 5103 + 14

M22 feb-13 E de las Montantildeas cholga x 5052 - 26

M23 feb-13 I Ballesteros cholga x 5204 - 87

M24 feb-13 B Fanny chorito x 2016 - 38 1071 479 12

M25 feb-13 E Silva Palma chorito x 1447 - 59 1077 898 09

M26 feb-13 E Wickham chorito x 1093 - 194 2940 2232 66 66

M27 feb-13 E Sullivan chorito x 1137 - 450 1944 1478

M28 feb-13 E Nuntildeez chorito x 1179 + 33 721 407

M29 feb-13 Cutter Cove chorito x 1003 - 65 501 309

M29N1 feb-13 I Engelfield chorito x 1116 - 297 2007 1483

M31 feb-13 B Nash chorito x 2231 +

M33 feb-13 B Bell chorito x 1181 - 93

M34 feb-13 S Pedro chorito x 0726 -

M35 feb-13 C San Isidro chorito x 1178 + 110

M36 feb-13 B Buena chorito x 1367 +

M37 feb-13 B Agua Fresca chorito x 0850 + 45 100 80

M39 feb-13 Pto Zenteno chorito x 3241 + 28

M39N2 feb-13 Pta San Valentin chorito x 1712 - 11

M39N3 feb-13 Pto Yartou chorito x 2035 - 11

sector

Fortunajul-12 B Inuacutetil

caracol

piquilhuex 107000 + 01

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Tabla 6 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de microalgas

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Tabla 7 Niveles actualmente permitidos por la legislacioacuten europea (bioensayo) y los niveles propuestos por la

autoridad europea para la seguridad alimentaria (EFSA) (Gerssen et al 2010)

Toxin Legislacioacuten (μg kg-

1) Proposicioacuten

EFSA (μg kg-1)

Validacioacuten LC-MSMS

(μg kg-1)

OA and DTXs 160 45

PTXs 120

YTXs 1000 3750

AZAs 160 32

SPXs 400 (Gerssen et al2010)

European Food Safety Authority Decisioacuten 2002657 de la Unioacuten Europea EC Incluye PTXs

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Tabla 8 Abundancia relativa ambiental de las microalgas al momento de recolectar las muestras de moluscos En rojo se indica la deteccioacuten de toxina positiva en los moluscos asociada a la supuesta microalga fuente PTXs (D

acuminata) YTXs (P reticulatum) SPXs (A ostenfeldii) DTX1 (A acuta)

(Tabla modificada de Guzmaacuten et al 2014)

A N E X O S

ANEXO 1

Certificacioacuten laboratorio INTECMAR

ANEXO 2

Lista de anaacutelisis que realiza INTECMAR y sus costos (en euros) 2013

scv 1 de 7

GUIA PARA LA AUTOLIQUIDACIOacuteN DE TASAS A FAVOR DE LA COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA 2013 Los aspectos financieros de los servicios prestados por Intecmar en el marco de su actividad e vienen regulados en la Ley 62003 de 9 de diciembre de tasas precios y exenciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia (DOG nuacutem 240 de 11122003) y fueron actualizados posteriormente en la Ley 142010 de 27 de diciembre de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2011 (DOG nuacutem 250 de 30122010) y en la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013 (DOG nuacutem 42 de 28022013) Existen dos maneras de liquidar las tasas correspondientes a los servicios prestados por Intecmar

1 De forma manual cubriendo el modelo A de autoliquidacioacuten que se descarga en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda y que adjunto en pdf y se lleva al banco para su pago httpwwwconselleriadefacendaeswebportalconfeccion-impresos

2 De forma telemaacutetica en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda viacutenculo httpshostcixtecesXEITObinlionwebXeitodllxmit a traveacutes del modelo 730

Ambos modelos de liquidacioacuten de tasas adjuntamos ejemplo al final de este documento deben ser remitidos por mail a Intecmar con el sello del banco fiacutesico o virtual como paso previo a la emisioacuten del certificado Los coacutedigos generales necesarios son

minus Consejeriacutea de Medio Rural y de Mar Coacutedigo 09 minus Delegacioacuten de Pontevedra Coacutedigo 40 minus Servicio de Intecmar Coacutedigo 24

Los coacutedigos y descripcioacuten de las tasas son los regulados en la legislacioacuten vigente y los hemos resumido en los anexos siguientes Vilaxoaacuten 4 de marzo de 2013

scv 2 de 7

TARIFAS DE TASAS VIGENTES PARA 2013 - Ley 22013 d e 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013

(DOG nuacutem 42 de 28022013)

Estas tarifas son consecuencia de la actualizacioacuten de las tarifas contenidas en los anexos 1 2 3 4 y 5 de la Ley 62003 del 9 de diciembre de tasas precios y exacciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia por la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 Seraacuten aplicables desde el diacutea de la entrada en vigor de la Ley de

presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 TASA POR SERVICIOS ADMINISTRATIVOS

No sujecioacuten No se exigiraacute la tasa por servicios administrativos cuando se trate de compulsas o cotejos de documentos que deban acompantildear a solicitudes escritos o comunicaciones presentadas por el ciudadano y realizadas en el aacutembito de actuacioacuten de los registros seguacuten lo dispuesto en el artiacuteculo 385 de la Ley 301992 del 26 de noviembre de reacutegimen juriacutedico de las administraciones puacuteblicas y del procedimiento administrativo comuacuten

Excepciones Estaraacuten exentos de la presente tasa

1- La expedicioacuten de certificados de retribuciones satisfechas por la Xunta de Galicia con el objeto de justificacioacuten en relacioacuten con el impuesto sobre la renta de las personas fiacutesicas

2- La expedicioacuten de certificados y compulsa que el personal de la Administracioacuten solicite respecto a las necesidades propias del puesto de trabajo o relacioacuten de servicios

3- Los alumnos por cualquier actuacioacuten en materia de ensentildeanzas no universitarias

scv 3 de 7

4- Las compulsas realizadas en las oficinas de empleo para los desempleados en la tramitacioacuten de expedientes que sean competencia de dichas oficinas

5 La inscripcioacuten en las convocatorias para a seleccioacuten de personal de la comunidad autoacutenoma despueacutes de justificacioacuten documental solicitada por

- Personas con discapacidad igual o superior al 33 - Personas que sean miembros de familias numerosas clasificadas en la

categoriacutea especial Se aplicaraacute una bonificacioacuten del 50 a la inscripcioacuten solicitada por - Personas que sean miembros de familias numerosas de categoriacutea

general - Personas que figurasen como demandantes de empleo desde por lo

menos seis meses antes a la fecha de la convocatoria de pruebas selectivas de personal en las que soliciten su participacioacuten y no esteacuten percibiendo prestacioacuten o subsidio por desempleo

6- La expedicioacuten de certificados relativos a la situacioacuten fiscal 7- El Estado y los demaacutes entes puacuteblicos territoriales o institucionales

siempre que los servicios o actividades de que sean beneficiarios se presten o se realicen en el marco del principio de colaboracioacuten entre administraciones

8- Las viacutectimas de actos terroristas asiacute como sus coacutenyuges y sus hijos por cualquier actuacioacuten en materia educativa realizada en centros oficiales de estudios en todos los niveles de ensentildeanza

9- Los miembros de los organismos consultivos de la Administracioacuten puacuteblica gallega respecto de los certificados emitidos por dichos organismos

COacuteDIGO TASAS

DESCRIPCIOacuteN IMPORTE euro

314400 Prestacioacuten de servicios en el Instituto Tecnoloacutegico para el Control del Medio Marino de Galicia

314401 Anaacutelisis de biotoxinas marinas en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de Yasumoto 1978 4752

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en rato segundo o meacutetodo de Yasumoto 1984 5432

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS)

9520 -Anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten

seguacuten el meacutetodo de la AOAC 4752

scv 4 de 7

-Anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo da AOAC 4752

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1978 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10186

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1984 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10865

-Anaacutelisis combinada en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS) anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo AOAC y anaacutelisis de toxicidad de tipo ASP por cromatografiacutea liquida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo de la AOAC 15000

314402 Anaacutelisis de muestras en agua de mar -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton marino mediante

microscopiacutea oacuteptica 15133 -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton toacutexico marino

mediante microscopiacutea oacuteptica 13333 - Anaacutelisis de carbono orgaacutenico disuelto 5093 -Anaacutelisis de nutrientes inorgaacutenicos disueltos 3500 -Anaacutelisis de pigmentos fotosinteacuteticos (clorofila ldquoardquo) por

espectrofluorimetria 1698 314403 Anaacutelisis microbioloacutegicos en moluscos y otros organismos

procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Cuantificacioacuten de E Coli 10186 - Deteccioacuten de Salmonella spp 16975 -Enumeracioacuten de Escherichia coli en moluscos bivalvos

vivos por la teacutecnica de medida directa de impedancia con el sistema BacTrac 4300 6800

314404 Anaacutelisis de contaminantes de origen quiacutemica en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Determinacioacuten de metales pesados (Pb Cd Cu Zn As Hg Ni Cr Ag) mediante espectrofotometriacutea de absorcioacuten atoacutemica por metal

6790

-Determinacioacuten de compuestos bifenilos policlorados (PCB) mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

scv 5 de 7

-Determinacioacuten de pesticidas organoclorados mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

-Determinacioacuten de hidrocarburos aromaacuteticos policiacuteclicos (HAPs) mediante cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de fluorescencia

28200

314405 Anaacutelisis histopatoloacutegica de moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Estudio hispatoloacutegico Determinacioacuten de Bonamia Marteillia Perkinsus y otras alteraciones patoloacutegicas

101852

314406 Emisioacuten de certificaciones e informes teacutecnicos y otras actuaciones a peticioacuten del interesado

Emisioacuten de certificados a peticioacuten de los interesados sobre las actuaciones llevadas a cabo por el Instituto

1000

Emisioacuten de informes teacutecnicos a peticioacuten del interesado (euros por hora o fraccioacuten)

4000

scv 6 de 7

scv 7 de 7

ANEXO 3

Resultados de anaacutelisis en muestras de microalgas anteriormente enviadas procedentes de Magallanes por el equipo de espectrometriacutea de masas utilizado por INTECMAR Trabajo presentado a las XXXII

Congreso de Ciencias del Mar realizado en Punta Arenas 22-25 octubre de 2012

PERFIL DE TOXINAS DE PROROCENTRUM LIMA (DINOPHYCEAE) AISLADO DESDE LA COSTA DE MAGALLANES SUR DE CHILE P Salgado1 G Pizarro1 JM Franco2 P Rioboacute2 e I Bravo3

1Instituto de Fomento Pesquero (IFOP) Punta Arenas Chile gemitapizarroifopcl 2Instituto de Investigaciones Marinas (CSIC) Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea 3Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea

Prorocentrum lima (Ehrenberg) es un dinoflagelado marino bentoacutenico que se encuentra adherido generalmente

sobre macroalgas sedimentos y detrito flotante y menos comuacutenmente en el plancton (Bravo et al 2001) Es una especie neriacutetica y estuarina y su rango de distribucioacuten geograacutefica variacutea desde aguas costeras tropicales a templadas (Faust 1991) La importancia de P lima se debe a que son productoras de toxinas diarreogeacutenicas en las personas (veneno diarreico de los mariscos VDM) al igual que algunas especies de Dinophysis aunque raramente se le han asociado con episodios toacutexicos por VDM por su caraacutecter epiacutefito y bentoacutenico El complejo VDM producido por P lima incluye moleacuteculas conocidas como el aacutecido okadaico (AO) y derivados dinofisistoxinas (DTX-1 DTX-2) (Bravo et al 2001 Vale et al 2009) No obstante existen casos citados para USA donde se detectoacute toxicidad por VDM en bivalvos de cultivos asociadas a P lima aunque en bajos niveles (Maranda et al 2007a) En Canadaacute tambieacuten se llevoacute a cabo un estudio en moluscos de cultivo cuya finalidad fue determinar el origen del VDM en la que P lima fue la principal especie sospechosa tras la ocurrencia de un evento toacutexico humano por VDM ocurrido en 1998 (Levasseur et al 2003) y en antildeos anteriores (Quilliam et al 1993) Aunque Levasseur et al (2003) no logroacute probar la toxicidad de los mariscos en cultivo a causa de P lima cabe hacer notar que lo que buscaron fue OA y DTX1 no DTX 3 este uacuteltimo principal derivado de las anteriores tras su transformacioacuten en los moluscos (eg Suzuki et al 1999 Vale amp Sampayo 2002)

En consecuencia el rol de P lima en eventos toacutexicos por VDM auacuten no puede descartarse por cuanto podriacutean llegar a ser importantes en ambientes turbulentos debido a la eventual remocioacuten de microalgas adheridas en sustratos por efecto de vientos (Levasseur et al 2003) factor de importancia si se trata de sedimentos o contrariamente en zonas someras y estables de cultivos de moluscos que al mismo tiempo favorecen microambientes para sustratos en los que prolifera la epiacutefita P lima (Lawrence et al 2000) quedando expuestas a re-suspensiones temporales que favorecen la filtracioacuten de estas microalgas por los bivalvos en cultivo (Maranda et al 2007a)

Chile posee escaso conocimiento sobre esta especie en su medio natural incluido su perfil de toxinas y potencial rol en la toxificacioacuten de moluscos por VDM Por tal razoacuten resultoacute interesante aportar al conocimiento de estos aspectos en muestras de sedimentos recolectadas en el estrecho de Magallanes en las que esta especie se encontroacute inhabitualmente abundante

Las ceacutelulas utilizadas en este estudio fueron aisladas desde sedimentos superficiales (0-3 cm) recolectados en el invierno de 2010 en la localidad de cabo San Isidro durante el muestreo regular del programa de monitoreo de marea roja en la regioacuten de Magallanes En esa oportunidad se logroacute cuantificar hasta 1002 quistes tecadoscm3 de Prorocentrum lima la mayor concentracioacuten respecto a otros sitios de recolecta (Fig 1) Los sedimentos de esta localidad presentaron una coloracioacuten oscura y un fuerte olor a sulfuro de hidroacutegeno (H2S) producto de anoxia local

Se aislaron entre 27 y 87 quistes tecados (Fig 1 a) directamente desde los sedimentos mientras otras 60 ceacutelulas vegetativas (Fig 1 b) fueron aisladas luego de promover la actividad y divisioacuten de los quistes en condiciones de 15 ordmC y un ciclo de luzoscuridad de 1212 horas (Tabla 1) Para este fin se aislaron quistes tecados y trasvasijaron a placas Petri de 5 cm de diaacutemetro conteniendo 5 mL de medio de cultivo L1 Para el anaacutelisis de toxinas las ceacutelulas aisladas fueron trasvasijadas a un tubo Eppendorf de 15 mL y congelados a -80 ordmC Una aliacutecuota de sedimento huacutemedo (100 microL aproximados) tambieacuten fue vaciada en un tubo Eppendorf y congelado Para extraer la toxina se antildeadioacute 500 microL de metanol 100 a cada tubo se mezcloacute por 1 min y filtroacute por 045 microm trasvasijando a un vial El extracto fue secado bajo nitroacutegeno gas a 40 ordmC y conservado a 4 ordmC hasta su anaacutelisis Previo al anaacutelisis de toxinas los extractos fueron resuspendidos en 150 microl de metanol

La presencia de la toxina dinofisistoxina 1 (DTX-1) en las muestras (Fig2) fue confirmada en modo negativo a traveacutes de su ioacuten precursor [M-H]- mz 8175 y sus iones productos mz 5634 y 2552 mediante un cromatoacutegrafo UPLC Acquity Waters acoplado a un triple cuadrupolo Waters Xevo TQ (LC-MS) La columna utilizada fue una Acquity UPLC BEH C18 17microm 21 x 100 mm a 45 ordmC La fase moacutevil consistioacute en (A) hidroacutexido amoacutenico a pH 11 y (B) hidroacutexido amoacutenico en acetonitrilo (67 mM) con una tasa de flujo de 4 mLmin El gradiente de elucioacuten utilizado fue el siguiente mantencioacuten al 75 de A entre 0 y 066 min cambio a 5 de A entre 066 y 330 min mantener 5

de A entre 330 y 528 min recuperacioacuten del 75 de A entre 528 y 726 min mantencioacuten al 75 de A hasta 9 min Se pinchoacute 5microL de muestra en el LC-MS El contenido de DTX-1 en las muestras fue cuantificado en base al ion precursor

Los tres tipos de muestras fueron positivas a la presencia de DTX-1 pero las ceacutelulas vegetativas fueron las que presentaron un mayor contenido de DTX-1 por ceacutelula La deteccioacuten de DTX-1 en los sedimentos (Tabla 2) reflejoacute la presencia de los quistes tecados en eacutestos

Figura 1 Concentraciones de quistes tecados de Prorocentrum lima (quistescm3 de sedimento huacutemedo) en estaciones de muestreo en el Estrecho de Magallanes (M26 Estero Wickham M29N1 Isla Engenfield M31 Bahiacutea Nash M35 Cabo San Isidro M39C1 Bahiacutea Gente Grande M39C2 Bahiacutea Inuacutetil M39C3 Canal Gabriel) y Canal Beagle (M41 Ventisquero Espantildea M42 Ventisquero Holanda) (a) Quistes tecados (b) ceacutelulas vegetativas obtenidas de germinacioacuten de quistes tecados bajo condiciones de laboratorio Barra de escala 20 microm

Tabla 1 Sedimento y ceacutelulas de Prorocentrum lima aisladas para anaacutelisis de toxinas

Extracto metanoacutelico Nordm de ceacutelulas TR ngmL pg DTX-1 ceacutel

G1 quistes tecados 27 213 lt2 -

G2 quistes tecados 67 214 05 11

G3 quistes tecados 87 215 12 21

G4 ceacutelulas vegetativas 60 215 34 87

G6 sedimentos aliacutecuota 213 13 19 pg microL sed

TR tiempo de retencioacuten

Figura 2 Cromatogramas de extractos metanoacutelicos de Prorocentrum lima quistes tecados (a) ceacutelulas vegetativas (b) y sedimentos (c)

Tabla 2 Caracteriacutesticas del sedimento con quistes tecados de Prorocentrum lima

Tipo Tamantildeo (mm)

Grava 2 35

Arena media 025 - 05 32

Arena muy fina 0063 - 0125 2

Limo-arcilla lt 0063 1

Estos resultados constituyen otra eventual posibilidad de toxicidad en los moluscos por VDM no soacutelo de aquellos con modalidad de vida bentoacutenica superficial sino de aquellos que tambieacuten viven enterrados en la arena (eg almeja huepo) Maacutes auacuten si se conoce que P lima posee la capacidad de desarrollar poblaciones naturales en aguas templadas en nuacutemeros que podriacutean justificar una toxicidad por VDM en los mariscos (eg Maranda et al 2007a b)

Referencias

Bravo I ML Fernaacutendez I Ramilo amp A Martinez 2001 Toxin composition of the toxic dinofagellate Prorocentrum lima isolated from different locations along the Galician coast (NW Spain) Toxicon 39 1537ndash1545

Faust MA 1991 Morphology of ciguatera-causing Prorocentrum lima (Pyrrophyta) from widely differing sites J Phycol 27 642-648

Lawrence J E Grant J Quilliam M A Bauder A G amp Cembella A D 2000 Colonizaition and growth of the toxic dinoflagellate Prorocentrum lima and associated fouling macroalgae on mussels in suspended culture Mar Ecol Prog Ser 201 147-154

Levasseur M Couture J Y Weise A M Michaud S Elbrachter M Sauveacute G amp Bonneau E 2003 Pelagic and epiphytic summer distributions of Prorocentrum lima and P mexicanum at two mussel farms in the Gulf of St Lawrence Aquat Microbiol Ecol 30283-293

Maranda L Corwin S Dover S amp Morton S L 2007a Prorocentrum lima (Dinophyceae) in northeastern USA coastal waters II Toxin load in the epibiota and in shellfish Harmful Algae 6 632-641

Maranda L Corwin S Hargraves P E 2007b Prorocentrum lima (Dinophyceae) in 19 northeastern USA coastal waters I Abundance and distribution Harmful Algae 6 623ndash631

Quilliam MA Gilgan MW amp Pleasance S 1993 Confirmation of an incident of diarrhetic shellfish poisoning in eastern Canada In Smayda TJ Shimizu Y (Eds) Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea Elsevier New York pp 547ndash552

Suzuki T Ota H amp Yamasaki M 1999 Direct evidence of transformation of dinophysistoxin-1 to 7-O-acyl-dinophysistoxin-1 (Dinophysis-3) in the scallop Patinopecten yessoensis Toxicon 37 187-198

Vale P amp Sampayo M A 2002 First confirmation of human diarrhoeic poisonings by okadaic acid esters after ingestion of razor clams (Solen marginatus) and green crabs (Carcinus maenas) in Aveiro lagoon Portugal and detection of okadaic acid esters in phytoplankton Toxicon 40989-996

Vale P Veloso V amp Amorim A 2009 Toxin composition of a Prorocentrum lima strain isolated from the Portuguese coast Toxicon 54145ndash152

Agradecimientos Intecmar de la Xunta de Galicia Espantildea donde se realizaron los anaacutelisis de toxinas proyecto

SUBPESCA ldquoManejo y Monitoreo de Mareas Rojas en las regiones de Los Lagos Ayseacuten y Magallanes IV etapa 2010rdquo

ANEXO 4

Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten

ANEXO 5

Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de Magallanes

TASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

O

EJE

MP

LA

R P

AR

A E

L IN

TE

RE

SA

DO

LIQ

UID

AC

IOacuteN

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

EN

TID

AD

BA

NC

AR

IATASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

0 9

4 0

2 4INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

AD

MIN

IST

RA

CIOacute

NTASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

9520 euros

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

CONSELLERIA DE FACENDA

ANEXO 6

Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para cierre

de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

Seccioacuten Ediciones y Produccioacuten Almte Manuel Blanco Encalada 839

Fono 56-32-2151500 Valparaiacuteso Chile

wwwifopcl

Page 29: “Análisis de toxinas lipofílicas mediante LC-MS/MS en ...metadatos.mma.gob.cl/sinia/Informe_final_Analisis_toxinas_lipofilicas_656-055.pdfSUBSECRETARÍA DE ECONOMÍA: INFORME FINAL:

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo TABLAS

Tabla 4 TRR y valores de tolerancia para las toxinas analizadas

TOXINA TRR TOLERANCIA

Toxinas del grupo de AO

AO 1000 0990-1010

DTX2 1040 1014-1066

DTX1 1140 1111-1168

Toxinas del grupo de PTX

PTX2 1000 0990-1010

PTX1 0850 0829-0871

Toxinas del grupo de YTX

YTX 1000 0990-1010

45OH-YTX 0894 0871-0916

Homo YTX 1000 0990-1010

45OH-homoYTX 0899 0876-0921

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo TABLAS

Tabla 5 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de moluscos

Nordm estMes

recolectaLocalidad Molusco

cuerpo

enterohepat

gramos

carne

toxicidad

VDM ratoacuten

PTX2

(ugKg)

YTX

(ugKg)

45OHYTX

(ugKg)

DTX1

libre

(ugKg)

DTX1

total

(ugkg)

SPX 1

(ugKg)

M13 ene-13 E Peel chorito x 5086 + 01 02

M13 ene-13 E Peel ostioacuten x 5155 No real izado 16 21

M33 ene-13 B Bell chorito x 5253 + 04

M37 ene-13 B Agua Fresca chorito x 5039 + 05 01

M35 ene-13 C San Isidro chorito x 5289 + 000 01

M42 ene-13 V Holanda chorito x 5231 + 06 13

M43 ene-13 B Yendegaia chorito x 5193 + 04 25

M45 ene-13 Pto Williams chorito x 5161 - 28 07

M08 feb-13 E Falcon cholga x 5027 - 14

M09 feb-13 E Penguumlin cholga x 5103 + 14

M22 feb-13 E de las Montantildeas cholga x 5052 - 26

M23 feb-13 I Ballesteros cholga x 5204 - 87

M24 feb-13 B Fanny chorito x 2016 - 38 1071 479 12

M25 feb-13 E Silva Palma chorito x 1447 - 59 1077 898 09

M26 feb-13 E Wickham chorito x 1093 - 194 2940 2232 66 66

M27 feb-13 E Sullivan chorito x 1137 - 450 1944 1478

M28 feb-13 E Nuntildeez chorito x 1179 + 33 721 407

M29 feb-13 Cutter Cove chorito x 1003 - 65 501 309

M29N1 feb-13 I Engelfield chorito x 1116 - 297 2007 1483

M31 feb-13 B Nash chorito x 2231 +

M33 feb-13 B Bell chorito x 1181 - 93

M34 feb-13 S Pedro chorito x 0726 -

M35 feb-13 C San Isidro chorito x 1178 + 110

M36 feb-13 B Buena chorito x 1367 +

M37 feb-13 B Agua Fresca chorito x 0850 + 45 100 80

M39 feb-13 Pto Zenteno chorito x 3241 + 28

M39N2 feb-13 Pta San Valentin chorito x 1712 - 11

M39N3 feb-13 Pto Yartou chorito x 2035 - 11

sector

Fortunajul-12 B Inuacutetil

caracol

piquilhuex 107000 + 01

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo TABLAS

Tabla 6 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de microalgas

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo TABLAS

Tabla 7 Niveles actualmente permitidos por la legislacioacuten europea (bioensayo) y los niveles propuestos por la

autoridad europea para la seguridad alimentaria (EFSA) (Gerssen et al 2010)

Toxin Legislacioacuten (μg kg-

1) Proposicioacuten

EFSA (μg kg-1)

Validacioacuten LC-MSMS

(μg kg-1)

OA and DTXs 160 45

PTXs 120

YTXs 1000 3750

AZAs 160 32

SPXs 400 (Gerssen et al2010)

European Food Safety Authority Decisioacuten 2002657 de la Unioacuten Europea EC Incluye PTXs

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo TABLAS

Tabla 8 Abundancia relativa ambiental de las microalgas al momento de recolectar las muestras de moluscos En rojo se indica la deteccioacuten de toxina positiva en los moluscos asociada a la supuesta microalga fuente PTXs (D

acuminata) YTXs (P reticulatum) SPXs (A ostenfeldii) DTX1 (A acuta)

(Tabla modificada de Guzmaacuten et al 2014)

A N E X O S

ANEXO 1

Certificacioacuten laboratorio INTECMAR

ANEXO 2

Lista de anaacutelisis que realiza INTECMAR y sus costos (en euros) 2013

scv 1 de 7

GUIA PARA LA AUTOLIQUIDACIOacuteN DE TASAS A FAVOR DE LA COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA 2013 Los aspectos financieros de los servicios prestados por Intecmar en el marco de su actividad e vienen regulados en la Ley 62003 de 9 de diciembre de tasas precios y exenciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia (DOG nuacutem 240 de 11122003) y fueron actualizados posteriormente en la Ley 142010 de 27 de diciembre de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2011 (DOG nuacutem 250 de 30122010) y en la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013 (DOG nuacutem 42 de 28022013) Existen dos maneras de liquidar las tasas correspondientes a los servicios prestados por Intecmar

1 De forma manual cubriendo el modelo A de autoliquidacioacuten que se descarga en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda y que adjunto en pdf y se lleva al banco para su pago httpwwwconselleriadefacendaeswebportalconfeccion-impresos

2 De forma telemaacutetica en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda viacutenculo httpshostcixtecesXEITObinlionwebXeitodllxmit a traveacutes del modelo 730

Ambos modelos de liquidacioacuten de tasas adjuntamos ejemplo al final de este documento deben ser remitidos por mail a Intecmar con el sello del banco fiacutesico o virtual como paso previo a la emisioacuten del certificado Los coacutedigos generales necesarios son

minus Consejeriacutea de Medio Rural y de Mar Coacutedigo 09 minus Delegacioacuten de Pontevedra Coacutedigo 40 minus Servicio de Intecmar Coacutedigo 24

Los coacutedigos y descripcioacuten de las tasas son los regulados en la legislacioacuten vigente y los hemos resumido en los anexos siguientes Vilaxoaacuten 4 de marzo de 2013

scv 2 de 7

TARIFAS DE TASAS VIGENTES PARA 2013 - Ley 22013 d e 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013

(DOG nuacutem 42 de 28022013)

Estas tarifas son consecuencia de la actualizacioacuten de las tarifas contenidas en los anexos 1 2 3 4 y 5 de la Ley 62003 del 9 de diciembre de tasas precios y exacciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia por la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 Seraacuten aplicables desde el diacutea de la entrada en vigor de la Ley de

presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 TASA POR SERVICIOS ADMINISTRATIVOS

No sujecioacuten No se exigiraacute la tasa por servicios administrativos cuando se trate de compulsas o cotejos de documentos que deban acompantildear a solicitudes escritos o comunicaciones presentadas por el ciudadano y realizadas en el aacutembito de actuacioacuten de los registros seguacuten lo dispuesto en el artiacuteculo 385 de la Ley 301992 del 26 de noviembre de reacutegimen juriacutedico de las administraciones puacuteblicas y del procedimiento administrativo comuacuten

Excepciones Estaraacuten exentos de la presente tasa

1- La expedicioacuten de certificados de retribuciones satisfechas por la Xunta de Galicia con el objeto de justificacioacuten en relacioacuten con el impuesto sobre la renta de las personas fiacutesicas

2- La expedicioacuten de certificados y compulsa que el personal de la Administracioacuten solicite respecto a las necesidades propias del puesto de trabajo o relacioacuten de servicios

3- Los alumnos por cualquier actuacioacuten en materia de ensentildeanzas no universitarias

scv 3 de 7

4- Las compulsas realizadas en las oficinas de empleo para los desempleados en la tramitacioacuten de expedientes que sean competencia de dichas oficinas

5 La inscripcioacuten en las convocatorias para a seleccioacuten de personal de la comunidad autoacutenoma despueacutes de justificacioacuten documental solicitada por

- Personas con discapacidad igual o superior al 33 - Personas que sean miembros de familias numerosas clasificadas en la

categoriacutea especial Se aplicaraacute una bonificacioacuten del 50 a la inscripcioacuten solicitada por - Personas que sean miembros de familias numerosas de categoriacutea

general - Personas que figurasen como demandantes de empleo desde por lo

menos seis meses antes a la fecha de la convocatoria de pruebas selectivas de personal en las que soliciten su participacioacuten y no esteacuten percibiendo prestacioacuten o subsidio por desempleo

6- La expedicioacuten de certificados relativos a la situacioacuten fiscal 7- El Estado y los demaacutes entes puacuteblicos territoriales o institucionales

siempre que los servicios o actividades de que sean beneficiarios se presten o se realicen en el marco del principio de colaboracioacuten entre administraciones

8- Las viacutectimas de actos terroristas asiacute como sus coacutenyuges y sus hijos por cualquier actuacioacuten en materia educativa realizada en centros oficiales de estudios en todos los niveles de ensentildeanza

9- Los miembros de los organismos consultivos de la Administracioacuten puacuteblica gallega respecto de los certificados emitidos por dichos organismos

COacuteDIGO TASAS

DESCRIPCIOacuteN IMPORTE euro

314400 Prestacioacuten de servicios en el Instituto Tecnoloacutegico para el Control del Medio Marino de Galicia

314401 Anaacutelisis de biotoxinas marinas en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de Yasumoto 1978 4752

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en rato segundo o meacutetodo de Yasumoto 1984 5432

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS)

9520 -Anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten

seguacuten el meacutetodo de la AOAC 4752

scv 4 de 7

-Anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo da AOAC 4752

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1978 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10186

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1984 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10865

-Anaacutelisis combinada en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS) anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo AOAC y anaacutelisis de toxicidad de tipo ASP por cromatografiacutea liquida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo de la AOAC 15000

314402 Anaacutelisis de muestras en agua de mar -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton marino mediante

microscopiacutea oacuteptica 15133 -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton toacutexico marino

mediante microscopiacutea oacuteptica 13333 - Anaacutelisis de carbono orgaacutenico disuelto 5093 -Anaacutelisis de nutrientes inorgaacutenicos disueltos 3500 -Anaacutelisis de pigmentos fotosinteacuteticos (clorofila ldquoardquo) por

espectrofluorimetria 1698 314403 Anaacutelisis microbioloacutegicos en moluscos y otros organismos

procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Cuantificacioacuten de E Coli 10186 - Deteccioacuten de Salmonella spp 16975 -Enumeracioacuten de Escherichia coli en moluscos bivalvos

vivos por la teacutecnica de medida directa de impedancia con el sistema BacTrac 4300 6800

314404 Anaacutelisis de contaminantes de origen quiacutemica en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Determinacioacuten de metales pesados (Pb Cd Cu Zn As Hg Ni Cr Ag) mediante espectrofotometriacutea de absorcioacuten atoacutemica por metal

6790

-Determinacioacuten de compuestos bifenilos policlorados (PCB) mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

scv 5 de 7

-Determinacioacuten de pesticidas organoclorados mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

-Determinacioacuten de hidrocarburos aromaacuteticos policiacuteclicos (HAPs) mediante cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de fluorescencia

28200

314405 Anaacutelisis histopatoloacutegica de moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Estudio hispatoloacutegico Determinacioacuten de Bonamia Marteillia Perkinsus y otras alteraciones patoloacutegicas

101852

314406 Emisioacuten de certificaciones e informes teacutecnicos y otras actuaciones a peticioacuten del interesado

Emisioacuten de certificados a peticioacuten de los interesados sobre las actuaciones llevadas a cabo por el Instituto

1000

Emisioacuten de informes teacutecnicos a peticioacuten del interesado (euros por hora o fraccioacuten)

4000

scv 6 de 7

scv 7 de 7

ANEXO 3

Resultados de anaacutelisis en muestras de microalgas anteriormente enviadas procedentes de Magallanes por el equipo de espectrometriacutea de masas utilizado por INTECMAR Trabajo presentado a las XXXII

Congreso de Ciencias del Mar realizado en Punta Arenas 22-25 octubre de 2012

PERFIL DE TOXINAS DE PROROCENTRUM LIMA (DINOPHYCEAE) AISLADO DESDE LA COSTA DE MAGALLANES SUR DE CHILE P Salgado1 G Pizarro1 JM Franco2 P Rioboacute2 e I Bravo3

1Instituto de Fomento Pesquero (IFOP) Punta Arenas Chile gemitapizarroifopcl 2Instituto de Investigaciones Marinas (CSIC) Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea 3Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea

Prorocentrum lima (Ehrenberg) es un dinoflagelado marino bentoacutenico que se encuentra adherido generalmente

sobre macroalgas sedimentos y detrito flotante y menos comuacutenmente en el plancton (Bravo et al 2001) Es una especie neriacutetica y estuarina y su rango de distribucioacuten geograacutefica variacutea desde aguas costeras tropicales a templadas (Faust 1991) La importancia de P lima se debe a que son productoras de toxinas diarreogeacutenicas en las personas (veneno diarreico de los mariscos VDM) al igual que algunas especies de Dinophysis aunque raramente se le han asociado con episodios toacutexicos por VDM por su caraacutecter epiacutefito y bentoacutenico El complejo VDM producido por P lima incluye moleacuteculas conocidas como el aacutecido okadaico (AO) y derivados dinofisistoxinas (DTX-1 DTX-2) (Bravo et al 2001 Vale et al 2009) No obstante existen casos citados para USA donde se detectoacute toxicidad por VDM en bivalvos de cultivos asociadas a P lima aunque en bajos niveles (Maranda et al 2007a) En Canadaacute tambieacuten se llevoacute a cabo un estudio en moluscos de cultivo cuya finalidad fue determinar el origen del VDM en la que P lima fue la principal especie sospechosa tras la ocurrencia de un evento toacutexico humano por VDM ocurrido en 1998 (Levasseur et al 2003) y en antildeos anteriores (Quilliam et al 1993) Aunque Levasseur et al (2003) no logroacute probar la toxicidad de los mariscos en cultivo a causa de P lima cabe hacer notar que lo que buscaron fue OA y DTX1 no DTX 3 este uacuteltimo principal derivado de las anteriores tras su transformacioacuten en los moluscos (eg Suzuki et al 1999 Vale amp Sampayo 2002)

En consecuencia el rol de P lima en eventos toacutexicos por VDM auacuten no puede descartarse por cuanto podriacutean llegar a ser importantes en ambientes turbulentos debido a la eventual remocioacuten de microalgas adheridas en sustratos por efecto de vientos (Levasseur et al 2003) factor de importancia si se trata de sedimentos o contrariamente en zonas someras y estables de cultivos de moluscos que al mismo tiempo favorecen microambientes para sustratos en los que prolifera la epiacutefita P lima (Lawrence et al 2000) quedando expuestas a re-suspensiones temporales que favorecen la filtracioacuten de estas microalgas por los bivalvos en cultivo (Maranda et al 2007a)

Chile posee escaso conocimiento sobre esta especie en su medio natural incluido su perfil de toxinas y potencial rol en la toxificacioacuten de moluscos por VDM Por tal razoacuten resultoacute interesante aportar al conocimiento de estos aspectos en muestras de sedimentos recolectadas en el estrecho de Magallanes en las que esta especie se encontroacute inhabitualmente abundante

Las ceacutelulas utilizadas en este estudio fueron aisladas desde sedimentos superficiales (0-3 cm) recolectados en el invierno de 2010 en la localidad de cabo San Isidro durante el muestreo regular del programa de monitoreo de marea roja en la regioacuten de Magallanes En esa oportunidad se logroacute cuantificar hasta 1002 quistes tecadoscm3 de Prorocentrum lima la mayor concentracioacuten respecto a otros sitios de recolecta (Fig 1) Los sedimentos de esta localidad presentaron una coloracioacuten oscura y un fuerte olor a sulfuro de hidroacutegeno (H2S) producto de anoxia local

Se aislaron entre 27 y 87 quistes tecados (Fig 1 a) directamente desde los sedimentos mientras otras 60 ceacutelulas vegetativas (Fig 1 b) fueron aisladas luego de promover la actividad y divisioacuten de los quistes en condiciones de 15 ordmC y un ciclo de luzoscuridad de 1212 horas (Tabla 1) Para este fin se aislaron quistes tecados y trasvasijaron a placas Petri de 5 cm de diaacutemetro conteniendo 5 mL de medio de cultivo L1 Para el anaacutelisis de toxinas las ceacutelulas aisladas fueron trasvasijadas a un tubo Eppendorf de 15 mL y congelados a -80 ordmC Una aliacutecuota de sedimento huacutemedo (100 microL aproximados) tambieacuten fue vaciada en un tubo Eppendorf y congelado Para extraer la toxina se antildeadioacute 500 microL de metanol 100 a cada tubo se mezcloacute por 1 min y filtroacute por 045 microm trasvasijando a un vial El extracto fue secado bajo nitroacutegeno gas a 40 ordmC y conservado a 4 ordmC hasta su anaacutelisis Previo al anaacutelisis de toxinas los extractos fueron resuspendidos en 150 microl de metanol

La presencia de la toxina dinofisistoxina 1 (DTX-1) en las muestras (Fig2) fue confirmada en modo negativo a traveacutes de su ioacuten precursor [M-H]- mz 8175 y sus iones productos mz 5634 y 2552 mediante un cromatoacutegrafo UPLC Acquity Waters acoplado a un triple cuadrupolo Waters Xevo TQ (LC-MS) La columna utilizada fue una Acquity UPLC BEH C18 17microm 21 x 100 mm a 45 ordmC La fase moacutevil consistioacute en (A) hidroacutexido amoacutenico a pH 11 y (B) hidroacutexido amoacutenico en acetonitrilo (67 mM) con una tasa de flujo de 4 mLmin El gradiente de elucioacuten utilizado fue el siguiente mantencioacuten al 75 de A entre 0 y 066 min cambio a 5 de A entre 066 y 330 min mantener 5

de A entre 330 y 528 min recuperacioacuten del 75 de A entre 528 y 726 min mantencioacuten al 75 de A hasta 9 min Se pinchoacute 5microL de muestra en el LC-MS El contenido de DTX-1 en las muestras fue cuantificado en base al ion precursor

Los tres tipos de muestras fueron positivas a la presencia de DTX-1 pero las ceacutelulas vegetativas fueron las que presentaron un mayor contenido de DTX-1 por ceacutelula La deteccioacuten de DTX-1 en los sedimentos (Tabla 2) reflejoacute la presencia de los quistes tecados en eacutestos

Figura 1 Concentraciones de quistes tecados de Prorocentrum lima (quistescm3 de sedimento huacutemedo) en estaciones de muestreo en el Estrecho de Magallanes (M26 Estero Wickham M29N1 Isla Engenfield M31 Bahiacutea Nash M35 Cabo San Isidro M39C1 Bahiacutea Gente Grande M39C2 Bahiacutea Inuacutetil M39C3 Canal Gabriel) y Canal Beagle (M41 Ventisquero Espantildea M42 Ventisquero Holanda) (a) Quistes tecados (b) ceacutelulas vegetativas obtenidas de germinacioacuten de quistes tecados bajo condiciones de laboratorio Barra de escala 20 microm

Tabla 1 Sedimento y ceacutelulas de Prorocentrum lima aisladas para anaacutelisis de toxinas

Extracto metanoacutelico Nordm de ceacutelulas TR ngmL pg DTX-1 ceacutel

G1 quistes tecados 27 213 lt2 -

G2 quistes tecados 67 214 05 11

G3 quistes tecados 87 215 12 21

G4 ceacutelulas vegetativas 60 215 34 87

G6 sedimentos aliacutecuota 213 13 19 pg microL sed

TR tiempo de retencioacuten

Figura 2 Cromatogramas de extractos metanoacutelicos de Prorocentrum lima quistes tecados (a) ceacutelulas vegetativas (b) y sedimentos (c)

Tabla 2 Caracteriacutesticas del sedimento con quistes tecados de Prorocentrum lima

Tipo Tamantildeo (mm)

Grava 2 35

Arena media 025 - 05 32

Arena muy fina 0063 - 0125 2

Limo-arcilla lt 0063 1

Estos resultados constituyen otra eventual posibilidad de toxicidad en los moluscos por VDM no soacutelo de aquellos con modalidad de vida bentoacutenica superficial sino de aquellos que tambieacuten viven enterrados en la arena (eg almeja huepo) Maacutes auacuten si se conoce que P lima posee la capacidad de desarrollar poblaciones naturales en aguas templadas en nuacutemeros que podriacutean justificar una toxicidad por VDM en los mariscos (eg Maranda et al 2007a b)

Referencias

Bravo I ML Fernaacutendez I Ramilo amp A Martinez 2001 Toxin composition of the toxic dinofagellate Prorocentrum lima isolated from different locations along the Galician coast (NW Spain) Toxicon 39 1537ndash1545

Faust MA 1991 Morphology of ciguatera-causing Prorocentrum lima (Pyrrophyta) from widely differing sites J Phycol 27 642-648

Lawrence J E Grant J Quilliam M A Bauder A G amp Cembella A D 2000 Colonizaition and growth of the toxic dinoflagellate Prorocentrum lima and associated fouling macroalgae on mussels in suspended culture Mar Ecol Prog Ser 201 147-154

Levasseur M Couture J Y Weise A M Michaud S Elbrachter M Sauveacute G amp Bonneau E 2003 Pelagic and epiphytic summer distributions of Prorocentrum lima and P mexicanum at two mussel farms in the Gulf of St Lawrence Aquat Microbiol Ecol 30283-293

Maranda L Corwin S Dover S amp Morton S L 2007a Prorocentrum lima (Dinophyceae) in northeastern USA coastal waters II Toxin load in the epibiota and in shellfish Harmful Algae 6 632-641

Maranda L Corwin S Hargraves P E 2007b Prorocentrum lima (Dinophyceae) in 19 northeastern USA coastal waters I Abundance and distribution Harmful Algae 6 623ndash631

Quilliam MA Gilgan MW amp Pleasance S 1993 Confirmation of an incident of diarrhetic shellfish poisoning in eastern Canada In Smayda TJ Shimizu Y (Eds) Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea Elsevier New York pp 547ndash552

Suzuki T Ota H amp Yamasaki M 1999 Direct evidence of transformation of dinophysistoxin-1 to 7-O-acyl-dinophysistoxin-1 (Dinophysis-3) in the scallop Patinopecten yessoensis Toxicon 37 187-198

Vale P amp Sampayo M A 2002 First confirmation of human diarrhoeic poisonings by okadaic acid esters after ingestion of razor clams (Solen marginatus) and green crabs (Carcinus maenas) in Aveiro lagoon Portugal and detection of okadaic acid esters in phytoplankton Toxicon 40989-996

Vale P Veloso V amp Amorim A 2009 Toxin composition of a Prorocentrum lima strain isolated from the Portuguese coast Toxicon 54145ndash152

Agradecimientos Intecmar de la Xunta de Galicia Espantildea donde se realizaron los anaacutelisis de toxinas proyecto

SUBPESCA ldquoManejo y Monitoreo de Mareas Rojas en las regiones de Los Lagos Ayseacuten y Magallanes IV etapa 2010rdquo

ANEXO 4

Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten

ANEXO 5

Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de Magallanes

TASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

O

EJE

MP

LA

R P

AR

A E

L IN

TE

RE

SA

DO

LIQ

UID

AC

IOacuteN

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

EN

TID

AD

BA

NC

AR

IATASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

0 9

4 0

2 4INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

AD

MIN

IST

RA

CIOacute

NTASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

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IDA

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N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

9520 euros

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

CONSELLERIA DE FACENDA

ANEXO 6

Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para cierre

de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

Seccioacuten Ediciones y Produccioacuten Almte Manuel Blanco Encalada 839

Fono 56-32-2151500 Valparaiacuteso Chile

wwwifopcl

Page 30: “Análisis de toxinas lipofílicas mediante LC-MS/MS en ...metadatos.mma.gob.cl/sinia/Informe_final_Analisis_toxinas_lipofilicas_656-055.pdfSUBSECRETARÍA DE ECONOMÍA: INFORME FINAL:

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo TABLAS

Tabla 5 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de moluscos

Nordm estMes

recolectaLocalidad Molusco

cuerpo

enterohepat

gramos

carne

toxicidad

VDM ratoacuten

PTX2

(ugKg)

YTX

(ugKg)

45OHYTX

(ugKg)

DTX1

libre

(ugKg)

DTX1

total

(ugkg)

SPX 1

(ugKg)

M13 ene-13 E Peel chorito x 5086 + 01 02

M13 ene-13 E Peel ostioacuten x 5155 No real izado 16 21

M33 ene-13 B Bell chorito x 5253 + 04

M37 ene-13 B Agua Fresca chorito x 5039 + 05 01

M35 ene-13 C San Isidro chorito x 5289 + 000 01

M42 ene-13 V Holanda chorito x 5231 + 06 13

M43 ene-13 B Yendegaia chorito x 5193 + 04 25

M45 ene-13 Pto Williams chorito x 5161 - 28 07

M08 feb-13 E Falcon cholga x 5027 - 14

M09 feb-13 E Penguumlin cholga x 5103 + 14

M22 feb-13 E de las Montantildeas cholga x 5052 - 26

M23 feb-13 I Ballesteros cholga x 5204 - 87

M24 feb-13 B Fanny chorito x 2016 - 38 1071 479 12

M25 feb-13 E Silva Palma chorito x 1447 - 59 1077 898 09

M26 feb-13 E Wickham chorito x 1093 - 194 2940 2232 66 66

M27 feb-13 E Sullivan chorito x 1137 - 450 1944 1478

M28 feb-13 E Nuntildeez chorito x 1179 + 33 721 407

M29 feb-13 Cutter Cove chorito x 1003 - 65 501 309

M29N1 feb-13 I Engelfield chorito x 1116 - 297 2007 1483

M31 feb-13 B Nash chorito x 2231 +

M33 feb-13 B Bell chorito x 1181 - 93

M34 feb-13 S Pedro chorito x 0726 -

M35 feb-13 C San Isidro chorito x 1178 + 110

M36 feb-13 B Buena chorito x 1367 +

M37 feb-13 B Agua Fresca chorito x 0850 + 45 100 80

M39 feb-13 Pto Zenteno chorito x 3241 + 28

M39N2 feb-13 Pta San Valentin chorito x 1712 - 11

M39N3 feb-13 Pto Yartou chorito x 2035 - 11

sector

Fortunajul-12 B Inuacutetil

caracol

piquilhuex 107000 + 01

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo TABLAS

Tabla 6 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de microalgas

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo TABLAS

Tabla 7 Niveles actualmente permitidos por la legislacioacuten europea (bioensayo) y los niveles propuestos por la

autoridad europea para la seguridad alimentaria (EFSA) (Gerssen et al 2010)

Toxin Legislacioacuten (μg kg-

1) Proposicioacuten

EFSA (μg kg-1)

Validacioacuten LC-MSMS

(μg kg-1)

OA and DTXs 160 45

PTXs 120

YTXs 1000 3750

AZAs 160 32

SPXs 400 (Gerssen et al2010)

European Food Safety Authority Decisioacuten 2002657 de la Unioacuten Europea EC Incluye PTXs

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo TABLAS

Tabla 8 Abundancia relativa ambiental de las microalgas al momento de recolectar las muestras de moluscos En rojo se indica la deteccioacuten de toxina positiva en los moluscos asociada a la supuesta microalga fuente PTXs (D

acuminata) YTXs (P reticulatum) SPXs (A ostenfeldii) DTX1 (A acuta)

(Tabla modificada de Guzmaacuten et al 2014)

A N E X O S

ANEXO 1

Certificacioacuten laboratorio INTECMAR

ANEXO 2

Lista de anaacutelisis que realiza INTECMAR y sus costos (en euros) 2013

scv 1 de 7

GUIA PARA LA AUTOLIQUIDACIOacuteN DE TASAS A FAVOR DE LA COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA 2013 Los aspectos financieros de los servicios prestados por Intecmar en el marco de su actividad e vienen regulados en la Ley 62003 de 9 de diciembre de tasas precios y exenciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia (DOG nuacutem 240 de 11122003) y fueron actualizados posteriormente en la Ley 142010 de 27 de diciembre de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2011 (DOG nuacutem 250 de 30122010) y en la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013 (DOG nuacutem 42 de 28022013) Existen dos maneras de liquidar las tasas correspondientes a los servicios prestados por Intecmar

1 De forma manual cubriendo el modelo A de autoliquidacioacuten que se descarga en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda y que adjunto en pdf y se lleva al banco para su pago httpwwwconselleriadefacendaeswebportalconfeccion-impresos

2 De forma telemaacutetica en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda viacutenculo httpshostcixtecesXEITObinlionwebXeitodllxmit a traveacutes del modelo 730

Ambos modelos de liquidacioacuten de tasas adjuntamos ejemplo al final de este documento deben ser remitidos por mail a Intecmar con el sello del banco fiacutesico o virtual como paso previo a la emisioacuten del certificado Los coacutedigos generales necesarios son

minus Consejeriacutea de Medio Rural y de Mar Coacutedigo 09 minus Delegacioacuten de Pontevedra Coacutedigo 40 minus Servicio de Intecmar Coacutedigo 24

Los coacutedigos y descripcioacuten de las tasas son los regulados en la legislacioacuten vigente y los hemos resumido en los anexos siguientes Vilaxoaacuten 4 de marzo de 2013

scv 2 de 7

TARIFAS DE TASAS VIGENTES PARA 2013 - Ley 22013 d e 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013

(DOG nuacutem 42 de 28022013)

Estas tarifas son consecuencia de la actualizacioacuten de las tarifas contenidas en los anexos 1 2 3 4 y 5 de la Ley 62003 del 9 de diciembre de tasas precios y exacciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia por la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 Seraacuten aplicables desde el diacutea de la entrada en vigor de la Ley de

presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 TASA POR SERVICIOS ADMINISTRATIVOS

No sujecioacuten No se exigiraacute la tasa por servicios administrativos cuando se trate de compulsas o cotejos de documentos que deban acompantildear a solicitudes escritos o comunicaciones presentadas por el ciudadano y realizadas en el aacutembito de actuacioacuten de los registros seguacuten lo dispuesto en el artiacuteculo 385 de la Ley 301992 del 26 de noviembre de reacutegimen juriacutedico de las administraciones puacuteblicas y del procedimiento administrativo comuacuten

Excepciones Estaraacuten exentos de la presente tasa

1- La expedicioacuten de certificados de retribuciones satisfechas por la Xunta de Galicia con el objeto de justificacioacuten en relacioacuten con el impuesto sobre la renta de las personas fiacutesicas

2- La expedicioacuten de certificados y compulsa que el personal de la Administracioacuten solicite respecto a las necesidades propias del puesto de trabajo o relacioacuten de servicios

3- Los alumnos por cualquier actuacioacuten en materia de ensentildeanzas no universitarias

scv 3 de 7

4- Las compulsas realizadas en las oficinas de empleo para los desempleados en la tramitacioacuten de expedientes que sean competencia de dichas oficinas

5 La inscripcioacuten en las convocatorias para a seleccioacuten de personal de la comunidad autoacutenoma despueacutes de justificacioacuten documental solicitada por

- Personas con discapacidad igual o superior al 33 - Personas que sean miembros de familias numerosas clasificadas en la

categoriacutea especial Se aplicaraacute una bonificacioacuten del 50 a la inscripcioacuten solicitada por - Personas que sean miembros de familias numerosas de categoriacutea

general - Personas que figurasen como demandantes de empleo desde por lo

menos seis meses antes a la fecha de la convocatoria de pruebas selectivas de personal en las que soliciten su participacioacuten y no esteacuten percibiendo prestacioacuten o subsidio por desempleo

6- La expedicioacuten de certificados relativos a la situacioacuten fiscal 7- El Estado y los demaacutes entes puacuteblicos territoriales o institucionales

siempre que los servicios o actividades de que sean beneficiarios se presten o se realicen en el marco del principio de colaboracioacuten entre administraciones

8- Las viacutectimas de actos terroristas asiacute como sus coacutenyuges y sus hijos por cualquier actuacioacuten en materia educativa realizada en centros oficiales de estudios en todos los niveles de ensentildeanza

9- Los miembros de los organismos consultivos de la Administracioacuten puacuteblica gallega respecto de los certificados emitidos por dichos organismos

COacuteDIGO TASAS

DESCRIPCIOacuteN IMPORTE euro

314400 Prestacioacuten de servicios en el Instituto Tecnoloacutegico para el Control del Medio Marino de Galicia

314401 Anaacutelisis de biotoxinas marinas en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de Yasumoto 1978 4752

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en rato segundo o meacutetodo de Yasumoto 1984 5432

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS)

9520 -Anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten

seguacuten el meacutetodo de la AOAC 4752

scv 4 de 7

-Anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo da AOAC 4752

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1978 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10186

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1984 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10865

-Anaacutelisis combinada en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS) anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo AOAC y anaacutelisis de toxicidad de tipo ASP por cromatografiacutea liquida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo de la AOAC 15000

314402 Anaacutelisis de muestras en agua de mar -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton marino mediante

microscopiacutea oacuteptica 15133 -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton toacutexico marino

mediante microscopiacutea oacuteptica 13333 - Anaacutelisis de carbono orgaacutenico disuelto 5093 -Anaacutelisis de nutrientes inorgaacutenicos disueltos 3500 -Anaacutelisis de pigmentos fotosinteacuteticos (clorofila ldquoardquo) por

espectrofluorimetria 1698 314403 Anaacutelisis microbioloacutegicos en moluscos y otros organismos

procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Cuantificacioacuten de E Coli 10186 - Deteccioacuten de Salmonella spp 16975 -Enumeracioacuten de Escherichia coli en moluscos bivalvos

vivos por la teacutecnica de medida directa de impedancia con el sistema BacTrac 4300 6800

314404 Anaacutelisis de contaminantes de origen quiacutemica en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Determinacioacuten de metales pesados (Pb Cd Cu Zn As Hg Ni Cr Ag) mediante espectrofotometriacutea de absorcioacuten atoacutemica por metal

6790

-Determinacioacuten de compuestos bifenilos policlorados (PCB) mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

scv 5 de 7

-Determinacioacuten de pesticidas organoclorados mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

-Determinacioacuten de hidrocarburos aromaacuteticos policiacuteclicos (HAPs) mediante cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de fluorescencia

28200

314405 Anaacutelisis histopatoloacutegica de moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Estudio hispatoloacutegico Determinacioacuten de Bonamia Marteillia Perkinsus y otras alteraciones patoloacutegicas

101852

314406 Emisioacuten de certificaciones e informes teacutecnicos y otras actuaciones a peticioacuten del interesado

Emisioacuten de certificados a peticioacuten de los interesados sobre las actuaciones llevadas a cabo por el Instituto

1000

Emisioacuten de informes teacutecnicos a peticioacuten del interesado (euros por hora o fraccioacuten)

4000

scv 6 de 7

scv 7 de 7

ANEXO 3

Resultados de anaacutelisis en muestras de microalgas anteriormente enviadas procedentes de Magallanes por el equipo de espectrometriacutea de masas utilizado por INTECMAR Trabajo presentado a las XXXII

Congreso de Ciencias del Mar realizado en Punta Arenas 22-25 octubre de 2012

PERFIL DE TOXINAS DE PROROCENTRUM LIMA (DINOPHYCEAE) AISLADO DESDE LA COSTA DE MAGALLANES SUR DE CHILE P Salgado1 G Pizarro1 JM Franco2 P Rioboacute2 e I Bravo3

1Instituto de Fomento Pesquero (IFOP) Punta Arenas Chile gemitapizarroifopcl 2Instituto de Investigaciones Marinas (CSIC) Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea 3Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea

Prorocentrum lima (Ehrenberg) es un dinoflagelado marino bentoacutenico que se encuentra adherido generalmente

sobre macroalgas sedimentos y detrito flotante y menos comuacutenmente en el plancton (Bravo et al 2001) Es una especie neriacutetica y estuarina y su rango de distribucioacuten geograacutefica variacutea desde aguas costeras tropicales a templadas (Faust 1991) La importancia de P lima se debe a que son productoras de toxinas diarreogeacutenicas en las personas (veneno diarreico de los mariscos VDM) al igual que algunas especies de Dinophysis aunque raramente se le han asociado con episodios toacutexicos por VDM por su caraacutecter epiacutefito y bentoacutenico El complejo VDM producido por P lima incluye moleacuteculas conocidas como el aacutecido okadaico (AO) y derivados dinofisistoxinas (DTX-1 DTX-2) (Bravo et al 2001 Vale et al 2009) No obstante existen casos citados para USA donde se detectoacute toxicidad por VDM en bivalvos de cultivos asociadas a P lima aunque en bajos niveles (Maranda et al 2007a) En Canadaacute tambieacuten se llevoacute a cabo un estudio en moluscos de cultivo cuya finalidad fue determinar el origen del VDM en la que P lima fue la principal especie sospechosa tras la ocurrencia de un evento toacutexico humano por VDM ocurrido en 1998 (Levasseur et al 2003) y en antildeos anteriores (Quilliam et al 1993) Aunque Levasseur et al (2003) no logroacute probar la toxicidad de los mariscos en cultivo a causa de P lima cabe hacer notar que lo que buscaron fue OA y DTX1 no DTX 3 este uacuteltimo principal derivado de las anteriores tras su transformacioacuten en los moluscos (eg Suzuki et al 1999 Vale amp Sampayo 2002)

En consecuencia el rol de P lima en eventos toacutexicos por VDM auacuten no puede descartarse por cuanto podriacutean llegar a ser importantes en ambientes turbulentos debido a la eventual remocioacuten de microalgas adheridas en sustratos por efecto de vientos (Levasseur et al 2003) factor de importancia si se trata de sedimentos o contrariamente en zonas someras y estables de cultivos de moluscos que al mismo tiempo favorecen microambientes para sustratos en los que prolifera la epiacutefita P lima (Lawrence et al 2000) quedando expuestas a re-suspensiones temporales que favorecen la filtracioacuten de estas microalgas por los bivalvos en cultivo (Maranda et al 2007a)

Chile posee escaso conocimiento sobre esta especie en su medio natural incluido su perfil de toxinas y potencial rol en la toxificacioacuten de moluscos por VDM Por tal razoacuten resultoacute interesante aportar al conocimiento de estos aspectos en muestras de sedimentos recolectadas en el estrecho de Magallanes en las que esta especie se encontroacute inhabitualmente abundante

Las ceacutelulas utilizadas en este estudio fueron aisladas desde sedimentos superficiales (0-3 cm) recolectados en el invierno de 2010 en la localidad de cabo San Isidro durante el muestreo regular del programa de monitoreo de marea roja en la regioacuten de Magallanes En esa oportunidad se logroacute cuantificar hasta 1002 quistes tecadoscm3 de Prorocentrum lima la mayor concentracioacuten respecto a otros sitios de recolecta (Fig 1) Los sedimentos de esta localidad presentaron una coloracioacuten oscura y un fuerte olor a sulfuro de hidroacutegeno (H2S) producto de anoxia local

Se aislaron entre 27 y 87 quistes tecados (Fig 1 a) directamente desde los sedimentos mientras otras 60 ceacutelulas vegetativas (Fig 1 b) fueron aisladas luego de promover la actividad y divisioacuten de los quistes en condiciones de 15 ordmC y un ciclo de luzoscuridad de 1212 horas (Tabla 1) Para este fin se aislaron quistes tecados y trasvasijaron a placas Petri de 5 cm de diaacutemetro conteniendo 5 mL de medio de cultivo L1 Para el anaacutelisis de toxinas las ceacutelulas aisladas fueron trasvasijadas a un tubo Eppendorf de 15 mL y congelados a -80 ordmC Una aliacutecuota de sedimento huacutemedo (100 microL aproximados) tambieacuten fue vaciada en un tubo Eppendorf y congelado Para extraer la toxina se antildeadioacute 500 microL de metanol 100 a cada tubo se mezcloacute por 1 min y filtroacute por 045 microm trasvasijando a un vial El extracto fue secado bajo nitroacutegeno gas a 40 ordmC y conservado a 4 ordmC hasta su anaacutelisis Previo al anaacutelisis de toxinas los extractos fueron resuspendidos en 150 microl de metanol

La presencia de la toxina dinofisistoxina 1 (DTX-1) en las muestras (Fig2) fue confirmada en modo negativo a traveacutes de su ioacuten precursor [M-H]- mz 8175 y sus iones productos mz 5634 y 2552 mediante un cromatoacutegrafo UPLC Acquity Waters acoplado a un triple cuadrupolo Waters Xevo TQ (LC-MS) La columna utilizada fue una Acquity UPLC BEH C18 17microm 21 x 100 mm a 45 ordmC La fase moacutevil consistioacute en (A) hidroacutexido amoacutenico a pH 11 y (B) hidroacutexido amoacutenico en acetonitrilo (67 mM) con una tasa de flujo de 4 mLmin El gradiente de elucioacuten utilizado fue el siguiente mantencioacuten al 75 de A entre 0 y 066 min cambio a 5 de A entre 066 y 330 min mantener 5

de A entre 330 y 528 min recuperacioacuten del 75 de A entre 528 y 726 min mantencioacuten al 75 de A hasta 9 min Se pinchoacute 5microL de muestra en el LC-MS El contenido de DTX-1 en las muestras fue cuantificado en base al ion precursor

Los tres tipos de muestras fueron positivas a la presencia de DTX-1 pero las ceacutelulas vegetativas fueron las que presentaron un mayor contenido de DTX-1 por ceacutelula La deteccioacuten de DTX-1 en los sedimentos (Tabla 2) reflejoacute la presencia de los quistes tecados en eacutestos

Figura 1 Concentraciones de quistes tecados de Prorocentrum lima (quistescm3 de sedimento huacutemedo) en estaciones de muestreo en el Estrecho de Magallanes (M26 Estero Wickham M29N1 Isla Engenfield M31 Bahiacutea Nash M35 Cabo San Isidro M39C1 Bahiacutea Gente Grande M39C2 Bahiacutea Inuacutetil M39C3 Canal Gabriel) y Canal Beagle (M41 Ventisquero Espantildea M42 Ventisquero Holanda) (a) Quistes tecados (b) ceacutelulas vegetativas obtenidas de germinacioacuten de quistes tecados bajo condiciones de laboratorio Barra de escala 20 microm

Tabla 1 Sedimento y ceacutelulas de Prorocentrum lima aisladas para anaacutelisis de toxinas

Extracto metanoacutelico Nordm de ceacutelulas TR ngmL pg DTX-1 ceacutel

G1 quistes tecados 27 213 lt2 -

G2 quistes tecados 67 214 05 11

G3 quistes tecados 87 215 12 21

G4 ceacutelulas vegetativas 60 215 34 87

G6 sedimentos aliacutecuota 213 13 19 pg microL sed

TR tiempo de retencioacuten

Figura 2 Cromatogramas de extractos metanoacutelicos de Prorocentrum lima quistes tecados (a) ceacutelulas vegetativas (b) y sedimentos (c)

Tabla 2 Caracteriacutesticas del sedimento con quistes tecados de Prorocentrum lima

Tipo Tamantildeo (mm)

Grava 2 35

Arena media 025 - 05 32

Arena muy fina 0063 - 0125 2

Limo-arcilla lt 0063 1

Estos resultados constituyen otra eventual posibilidad de toxicidad en los moluscos por VDM no soacutelo de aquellos con modalidad de vida bentoacutenica superficial sino de aquellos que tambieacuten viven enterrados en la arena (eg almeja huepo) Maacutes auacuten si se conoce que P lima posee la capacidad de desarrollar poblaciones naturales en aguas templadas en nuacutemeros que podriacutean justificar una toxicidad por VDM en los mariscos (eg Maranda et al 2007a b)

Referencias

Bravo I ML Fernaacutendez I Ramilo amp A Martinez 2001 Toxin composition of the toxic dinofagellate Prorocentrum lima isolated from different locations along the Galician coast (NW Spain) Toxicon 39 1537ndash1545

Faust MA 1991 Morphology of ciguatera-causing Prorocentrum lima (Pyrrophyta) from widely differing sites J Phycol 27 642-648

Lawrence J E Grant J Quilliam M A Bauder A G amp Cembella A D 2000 Colonizaition and growth of the toxic dinoflagellate Prorocentrum lima and associated fouling macroalgae on mussels in suspended culture Mar Ecol Prog Ser 201 147-154

Levasseur M Couture J Y Weise A M Michaud S Elbrachter M Sauveacute G amp Bonneau E 2003 Pelagic and epiphytic summer distributions of Prorocentrum lima and P mexicanum at two mussel farms in the Gulf of St Lawrence Aquat Microbiol Ecol 30283-293

Maranda L Corwin S Dover S amp Morton S L 2007a Prorocentrum lima (Dinophyceae) in northeastern USA coastal waters II Toxin load in the epibiota and in shellfish Harmful Algae 6 632-641

Maranda L Corwin S Hargraves P E 2007b Prorocentrum lima (Dinophyceae) in 19 northeastern USA coastal waters I Abundance and distribution Harmful Algae 6 623ndash631

Quilliam MA Gilgan MW amp Pleasance S 1993 Confirmation of an incident of diarrhetic shellfish poisoning in eastern Canada In Smayda TJ Shimizu Y (Eds) Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea Elsevier New York pp 547ndash552

Suzuki T Ota H amp Yamasaki M 1999 Direct evidence of transformation of dinophysistoxin-1 to 7-O-acyl-dinophysistoxin-1 (Dinophysis-3) in the scallop Patinopecten yessoensis Toxicon 37 187-198

Vale P amp Sampayo M A 2002 First confirmation of human diarrhoeic poisonings by okadaic acid esters after ingestion of razor clams (Solen marginatus) and green crabs (Carcinus maenas) in Aveiro lagoon Portugal and detection of okadaic acid esters in phytoplankton Toxicon 40989-996

Vale P Veloso V amp Amorim A 2009 Toxin composition of a Prorocentrum lima strain isolated from the Portuguese coast Toxicon 54145ndash152

Agradecimientos Intecmar de la Xunta de Galicia Espantildea donde se realizaron los anaacutelisis de toxinas proyecto

SUBPESCA ldquoManejo y Monitoreo de Mareas Rojas en las regiones de Los Lagos Ayseacuten y Magallanes IV etapa 2010rdquo

ANEXO 4

Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten

ANEXO 5

Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de Magallanes

TASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

O

EJE

MP

LA

R P

AR

A E

L IN

TE

RE

SA

DO

LIQ

UID

AC

IOacuteN

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

EN

TID

AD

BA

NC

AR

IATASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

0 9

4 0

2 4INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

AD

MIN

IST

RA

CIOacute

NTASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

9520 euros

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

CONSELLERIA DE FACENDA

ANEXO 6

Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para cierre

de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

Seccioacuten Ediciones y Produccioacuten Almte Manuel Blanco Encalada 839

Fono 56-32-2151500 Valparaiacuteso Chile

wwwifopcl

Page 31: “Análisis de toxinas lipofílicas mediante LC-MS/MS en ...metadatos.mma.gob.cl/sinia/Informe_final_Analisis_toxinas_lipofilicas_656-055.pdfSUBSECRETARÍA DE ECONOMÍA: INFORME FINAL:

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo TABLAS

Tabla 6 Toxinas lipofiacutelicas detectadas en las muestras de microalgas

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo TABLAS

Tabla 7 Niveles actualmente permitidos por la legislacioacuten europea (bioensayo) y los niveles propuestos por la

autoridad europea para la seguridad alimentaria (EFSA) (Gerssen et al 2010)

Toxin Legislacioacuten (μg kg-

1) Proposicioacuten

EFSA (μg kg-1)

Validacioacuten LC-MSMS

(μg kg-1)

OA and DTXs 160 45

PTXs 120

YTXs 1000 3750

AZAs 160 32

SPXs 400 (Gerssen et al2010)

European Food Safety Authority Decisioacuten 2002657 de la Unioacuten Europea EC Incluye PTXs

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo TABLAS

Tabla 8 Abundancia relativa ambiental de las microalgas al momento de recolectar las muestras de moluscos En rojo se indica la deteccioacuten de toxina positiva en los moluscos asociada a la supuesta microalga fuente PTXs (D

acuminata) YTXs (P reticulatum) SPXs (A ostenfeldii) DTX1 (A acuta)

(Tabla modificada de Guzmaacuten et al 2014)

A N E X O S

ANEXO 1

Certificacioacuten laboratorio INTECMAR

ANEXO 2

Lista de anaacutelisis que realiza INTECMAR y sus costos (en euros) 2013

scv 1 de 7

GUIA PARA LA AUTOLIQUIDACIOacuteN DE TASAS A FAVOR DE LA COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA 2013 Los aspectos financieros de los servicios prestados por Intecmar en el marco de su actividad e vienen regulados en la Ley 62003 de 9 de diciembre de tasas precios y exenciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia (DOG nuacutem 240 de 11122003) y fueron actualizados posteriormente en la Ley 142010 de 27 de diciembre de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2011 (DOG nuacutem 250 de 30122010) y en la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013 (DOG nuacutem 42 de 28022013) Existen dos maneras de liquidar las tasas correspondientes a los servicios prestados por Intecmar

1 De forma manual cubriendo el modelo A de autoliquidacioacuten que se descarga en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda y que adjunto en pdf y se lleva al banco para su pago httpwwwconselleriadefacendaeswebportalconfeccion-impresos

2 De forma telemaacutetica en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda viacutenculo httpshostcixtecesXEITObinlionwebXeitodllxmit a traveacutes del modelo 730

Ambos modelos de liquidacioacuten de tasas adjuntamos ejemplo al final de este documento deben ser remitidos por mail a Intecmar con el sello del banco fiacutesico o virtual como paso previo a la emisioacuten del certificado Los coacutedigos generales necesarios son

minus Consejeriacutea de Medio Rural y de Mar Coacutedigo 09 minus Delegacioacuten de Pontevedra Coacutedigo 40 minus Servicio de Intecmar Coacutedigo 24

Los coacutedigos y descripcioacuten de las tasas son los regulados en la legislacioacuten vigente y los hemos resumido en los anexos siguientes Vilaxoaacuten 4 de marzo de 2013

scv 2 de 7

TARIFAS DE TASAS VIGENTES PARA 2013 - Ley 22013 d e 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013

(DOG nuacutem 42 de 28022013)

Estas tarifas son consecuencia de la actualizacioacuten de las tarifas contenidas en los anexos 1 2 3 4 y 5 de la Ley 62003 del 9 de diciembre de tasas precios y exacciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia por la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 Seraacuten aplicables desde el diacutea de la entrada en vigor de la Ley de

presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 TASA POR SERVICIOS ADMINISTRATIVOS

No sujecioacuten No se exigiraacute la tasa por servicios administrativos cuando se trate de compulsas o cotejos de documentos que deban acompantildear a solicitudes escritos o comunicaciones presentadas por el ciudadano y realizadas en el aacutembito de actuacioacuten de los registros seguacuten lo dispuesto en el artiacuteculo 385 de la Ley 301992 del 26 de noviembre de reacutegimen juriacutedico de las administraciones puacuteblicas y del procedimiento administrativo comuacuten

Excepciones Estaraacuten exentos de la presente tasa

1- La expedicioacuten de certificados de retribuciones satisfechas por la Xunta de Galicia con el objeto de justificacioacuten en relacioacuten con el impuesto sobre la renta de las personas fiacutesicas

2- La expedicioacuten de certificados y compulsa que el personal de la Administracioacuten solicite respecto a las necesidades propias del puesto de trabajo o relacioacuten de servicios

3- Los alumnos por cualquier actuacioacuten en materia de ensentildeanzas no universitarias

scv 3 de 7

4- Las compulsas realizadas en las oficinas de empleo para los desempleados en la tramitacioacuten de expedientes que sean competencia de dichas oficinas

5 La inscripcioacuten en las convocatorias para a seleccioacuten de personal de la comunidad autoacutenoma despueacutes de justificacioacuten documental solicitada por

- Personas con discapacidad igual o superior al 33 - Personas que sean miembros de familias numerosas clasificadas en la

categoriacutea especial Se aplicaraacute una bonificacioacuten del 50 a la inscripcioacuten solicitada por - Personas que sean miembros de familias numerosas de categoriacutea

general - Personas que figurasen como demandantes de empleo desde por lo

menos seis meses antes a la fecha de la convocatoria de pruebas selectivas de personal en las que soliciten su participacioacuten y no esteacuten percibiendo prestacioacuten o subsidio por desempleo

6- La expedicioacuten de certificados relativos a la situacioacuten fiscal 7- El Estado y los demaacutes entes puacuteblicos territoriales o institucionales

siempre que los servicios o actividades de que sean beneficiarios se presten o se realicen en el marco del principio de colaboracioacuten entre administraciones

8- Las viacutectimas de actos terroristas asiacute como sus coacutenyuges y sus hijos por cualquier actuacioacuten en materia educativa realizada en centros oficiales de estudios en todos los niveles de ensentildeanza

9- Los miembros de los organismos consultivos de la Administracioacuten puacuteblica gallega respecto de los certificados emitidos por dichos organismos

COacuteDIGO TASAS

DESCRIPCIOacuteN IMPORTE euro

314400 Prestacioacuten de servicios en el Instituto Tecnoloacutegico para el Control del Medio Marino de Galicia

314401 Anaacutelisis de biotoxinas marinas en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de Yasumoto 1978 4752

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en rato segundo o meacutetodo de Yasumoto 1984 5432

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS)

9520 -Anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten

seguacuten el meacutetodo de la AOAC 4752

scv 4 de 7

-Anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo da AOAC 4752

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1978 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10186

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1984 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10865

-Anaacutelisis combinada en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS) anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo AOAC y anaacutelisis de toxicidad de tipo ASP por cromatografiacutea liquida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo de la AOAC 15000

314402 Anaacutelisis de muestras en agua de mar -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton marino mediante

microscopiacutea oacuteptica 15133 -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton toacutexico marino

mediante microscopiacutea oacuteptica 13333 - Anaacutelisis de carbono orgaacutenico disuelto 5093 -Anaacutelisis de nutrientes inorgaacutenicos disueltos 3500 -Anaacutelisis de pigmentos fotosinteacuteticos (clorofila ldquoardquo) por

espectrofluorimetria 1698 314403 Anaacutelisis microbioloacutegicos en moluscos y otros organismos

procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Cuantificacioacuten de E Coli 10186 - Deteccioacuten de Salmonella spp 16975 -Enumeracioacuten de Escherichia coli en moluscos bivalvos

vivos por la teacutecnica de medida directa de impedancia con el sistema BacTrac 4300 6800

314404 Anaacutelisis de contaminantes de origen quiacutemica en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Determinacioacuten de metales pesados (Pb Cd Cu Zn As Hg Ni Cr Ag) mediante espectrofotometriacutea de absorcioacuten atoacutemica por metal

6790

-Determinacioacuten de compuestos bifenilos policlorados (PCB) mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

scv 5 de 7

-Determinacioacuten de pesticidas organoclorados mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

-Determinacioacuten de hidrocarburos aromaacuteticos policiacuteclicos (HAPs) mediante cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de fluorescencia

28200

314405 Anaacutelisis histopatoloacutegica de moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Estudio hispatoloacutegico Determinacioacuten de Bonamia Marteillia Perkinsus y otras alteraciones patoloacutegicas

101852

314406 Emisioacuten de certificaciones e informes teacutecnicos y otras actuaciones a peticioacuten del interesado

Emisioacuten de certificados a peticioacuten de los interesados sobre las actuaciones llevadas a cabo por el Instituto

1000

Emisioacuten de informes teacutecnicos a peticioacuten del interesado (euros por hora o fraccioacuten)

4000

scv 6 de 7

scv 7 de 7

ANEXO 3

Resultados de anaacutelisis en muestras de microalgas anteriormente enviadas procedentes de Magallanes por el equipo de espectrometriacutea de masas utilizado por INTECMAR Trabajo presentado a las XXXII

Congreso de Ciencias del Mar realizado en Punta Arenas 22-25 octubre de 2012

PERFIL DE TOXINAS DE PROROCENTRUM LIMA (DINOPHYCEAE) AISLADO DESDE LA COSTA DE MAGALLANES SUR DE CHILE P Salgado1 G Pizarro1 JM Franco2 P Rioboacute2 e I Bravo3

1Instituto de Fomento Pesquero (IFOP) Punta Arenas Chile gemitapizarroifopcl 2Instituto de Investigaciones Marinas (CSIC) Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea 3Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea

Prorocentrum lima (Ehrenberg) es un dinoflagelado marino bentoacutenico que se encuentra adherido generalmente

sobre macroalgas sedimentos y detrito flotante y menos comuacutenmente en el plancton (Bravo et al 2001) Es una especie neriacutetica y estuarina y su rango de distribucioacuten geograacutefica variacutea desde aguas costeras tropicales a templadas (Faust 1991) La importancia de P lima se debe a que son productoras de toxinas diarreogeacutenicas en las personas (veneno diarreico de los mariscos VDM) al igual que algunas especies de Dinophysis aunque raramente se le han asociado con episodios toacutexicos por VDM por su caraacutecter epiacutefito y bentoacutenico El complejo VDM producido por P lima incluye moleacuteculas conocidas como el aacutecido okadaico (AO) y derivados dinofisistoxinas (DTX-1 DTX-2) (Bravo et al 2001 Vale et al 2009) No obstante existen casos citados para USA donde se detectoacute toxicidad por VDM en bivalvos de cultivos asociadas a P lima aunque en bajos niveles (Maranda et al 2007a) En Canadaacute tambieacuten se llevoacute a cabo un estudio en moluscos de cultivo cuya finalidad fue determinar el origen del VDM en la que P lima fue la principal especie sospechosa tras la ocurrencia de un evento toacutexico humano por VDM ocurrido en 1998 (Levasseur et al 2003) y en antildeos anteriores (Quilliam et al 1993) Aunque Levasseur et al (2003) no logroacute probar la toxicidad de los mariscos en cultivo a causa de P lima cabe hacer notar que lo que buscaron fue OA y DTX1 no DTX 3 este uacuteltimo principal derivado de las anteriores tras su transformacioacuten en los moluscos (eg Suzuki et al 1999 Vale amp Sampayo 2002)

En consecuencia el rol de P lima en eventos toacutexicos por VDM auacuten no puede descartarse por cuanto podriacutean llegar a ser importantes en ambientes turbulentos debido a la eventual remocioacuten de microalgas adheridas en sustratos por efecto de vientos (Levasseur et al 2003) factor de importancia si se trata de sedimentos o contrariamente en zonas someras y estables de cultivos de moluscos que al mismo tiempo favorecen microambientes para sustratos en los que prolifera la epiacutefita P lima (Lawrence et al 2000) quedando expuestas a re-suspensiones temporales que favorecen la filtracioacuten de estas microalgas por los bivalvos en cultivo (Maranda et al 2007a)

Chile posee escaso conocimiento sobre esta especie en su medio natural incluido su perfil de toxinas y potencial rol en la toxificacioacuten de moluscos por VDM Por tal razoacuten resultoacute interesante aportar al conocimiento de estos aspectos en muestras de sedimentos recolectadas en el estrecho de Magallanes en las que esta especie se encontroacute inhabitualmente abundante

Las ceacutelulas utilizadas en este estudio fueron aisladas desde sedimentos superficiales (0-3 cm) recolectados en el invierno de 2010 en la localidad de cabo San Isidro durante el muestreo regular del programa de monitoreo de marea roja en la regioacuten de Magallanes En esa oportunidad se logroacute cuantificar hasta 1002 quistes tecadoscm3 de Prorocentrum lima la mayor concentracioacuten respecto a otros sitios de recolecta (Fig 1) Los sedimentos de esta localidad presentaron una coloracioacuten oscura y un fuerte olor a sulfuro de hidroacutegeno (H2S) producto de anoxia local

Se aislaron entre 27 y 87 quistes tecados (Fig 1 a) directamente desde los sedimentos mientras otras 60 ceacutelulas vegetativas (Fig 1 b) fueron aisladas luego de promover la actividad y divisioacuten de los quistes en condiciones de 15 ordmC y un ciclo de luzoscuridad de 1212 horas (Tabla 1) Para este fin se aislaron quistes tecados y trasvasijaron a placas Petri de 5 cm de diaacutemetro conteniendo 5 mL de medio de cultivo L1 Para el anaacutelisis de toxinas las ceacutelulas aisladas fueron trasvasijadas a un tubo Eppendorf de 15 mL y congelados a -80 ordmC Una aliacutecuota de sedimento huacutemedo (100 microL aproximados) tambieacuten fue vaciada en un tubo Eppendorf y congelado Para extraer la toxina se antildeadioacute 500 microL de metanol 100 a cada tubo se mezcloacute por 1 min y filtroacute por 045 microm trasvasijando a un vial El extracto fue secado bajo nitroacutegeno gas a 40 ordmC y conservado a 4 ordmC hasta su anaacutelisis Previo al anaacutelisis de toxinas los extractos fueron resuspendidos en 150 microl de metanol

La presencia de la toxina dinofisistoxina 1 (DTX-1) en las muestras (Fig2) fue confirmada en modo negativo a traveacutes de su ioacuten precursor [M-H]- mz 8175 y sus iones productos mz 5634 y 2552 mediante un cromatoacutegrafo UPLC Acquity Waters acoplado a un triple cuadrupolo Waters Xevo TQ (LC-MS) La columna utilizada fue una Acquity UPLC BEH C18 17microm 21 x 100 mm a 45 ordmC La fase moacutevil consistioacute en (A) hidroacutexido amoacutenico a pH 11 y (B) hidroacutexido amoacutenico en acetonitrilo (67 mM) con una tasa de flujo de 4 mLmin El gradiente de elucioacuten utilizado fue el siguiente mantencioacuten al 75 de A entre 0 y 066 min cambio a 5 de A entre 066 y 330 min mantener 5

de A entre 330 y 528 min recuperacioacuten del 75 de A entre 528 y 726 min mantencioacuten al 75 de A hasta 9 min Se pinchoacute 5microL de muestra en el LC-MS El contenido de DTX-1 en las muestras fue cuantificado en base al ion precursor

Los tres tipos de muestras fueron positivas a la presencia de DTX-1 pero las ceacutelulas vegetativas fueron las que presentaron un mayor contenido de DTX-1 por ceacutelula La deteccioacuten de DTX-1 en los sedimentos (Tabla 2) reflejoacute la presencia de los quistes tecados en eacutestos

Figura 1 Concentraciones de quistes tecados de Prorocentrum lima (quistescm3 de sedimento huacutemedo) en estaciones de muestreo en el Estrecho de Magallanes (M26 Estero Wickham M29N1 Isla Engenfield M31 Bahiacutea Nash M35 Cabo San Isidro M39C1 Bahiacutea Gente Grande M39C2 Bahiacutea Inuacutetil M39C3 Canal Gabriel) y Canal Beagle (M41 Ventisquero Espantildea M42 Ventisquero Holanda) (a) Quistes tecados (b) ceacutelulas vegetativas obtenidas de germinacioacuten de quistes tecados bajo condiciones de laboratorio Barra de escala 20 microm

Tabla 1 Sedimento y ceacutelulas de Prorocentrum lima aisladas para anaacutelisis de toxinas

Extracto metanoacutelico Nordm de ceacutelulas TR ngmL pg DTX-1 ceacutel

G1 quistes tecados 27 213 lt2 -

G2 quistes tecados 67 214 05 11

G3 quistes tecados 87 215 12 21

G4 ceacutelulas vegetativas 60 215 34 87

G6 sedimentos aliacutecuota 213 13 19 pg microL sed

TR tiempo de retencioacuten

Figura 2 Cromatogramas de extractos metanoacutelicos de Prorocentrum lima quistes tecados (a) ceacutelulas vegetativas (b) y sedimentos (c)

Tabla 2 Caracteriacutesticas del sedimento con quistes tecados de Prorocentrum lima

Tipo Tamantildeo (mm)

Grava 2 35

Arena media 025 - 05 32

Arena muy fina 0063 - 0125 2

Limo-arcilla lt 0063 1

Estos resultados constituyen otra eventual posibilidad de toxicidad en los moluscos por VDM no soacutelo de aquellos con modalidad de vida bentoacutenica superficial sino de aquellos que tambieacuten viven enterrados en la arena (eg almeja huepo) Maacutes auacuten si se conoce que P lima posee la capacidad de desarrollar poblaciones naturales en aguas templadas en nuacutemeros que podriacutean justificar una toxicidad por VDM en los mariscos (eg Maranda et al 2007a b)

Referencias

Bravo I ML Fernaacutendez I Ramilo amp A Martinez 2001 Toxin composition of the toxic dinofagellate Prorocentrum lima isolated from different locations along the Galician coast (NW Spain) Toxicon 39 1537ndash1545

Faust MA 1991 Morphology of ciguatera-causing Prorocentrum lima (Pyrrophyta) from widely differing sites J Phycol 27 642-648

Lawrence J E Grant J Quilliam M A Bauder A G amp Cembella A D 2000 Colonizaition and growth of the toxic dinoflagellate Prorocentrum lima and associated fouling macroalgae on mussels in suspended culture Mar Ecol Prog Ser 201 147-154

Levasseur M Couture J Y Weise A M Michaud S Elbrachter M Sauveacute G amp Bonneau E 2003 Pelagic and epiphytic summer distributions of Prorocentrum lima and P mexicanum at two mussel farms in the Gulf of St Lawrence Aquat Microbiol Ecol 30283-293

Maranda L Corwin S Dover S amp Morton S L 2007a Prorocentrum lima (Dinophyceae) in northeastern USA coastal waters II Toxin load in the epibiota and in shellfish Harmful Algae 6 632-641

Maranda L Corwin S Hargraves P E 2007b Prorocentrum lima (Dinophyceae) in 19 northeastern USA coastal waters I Abundance and distribution Harmful Algae 6 623ndash631

Quilliam MA Gilgan MW amp Pleasance S 1993 Confirmation of an incident of diarrhetic shellfish poisoning in eastern Canada In Smayda TJ Shimizu Y (Eds) Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea Elsevier New York pp 547ndash552

Suzuki T Ota H amp Yamasaki M 1999 Direct evidence of transformation of dinophysistoxin-1 to 7-O-acyl-dinophysistoxin-1 (Dinophysis-3) in the scallop Patinopecten yessoensis Toxicon 37 187-198

Vale P amp Sampayo M A 2002 First confirmation of human diarrhoeic poisonings by okadaic acid esters after ingestion of razor clams (Solen marginatus) and green crabs (Carcinus maenas) in Aveiro lagoon Portugal and detection of okadaic acid esters in phytoplankton Toxicon 40989-996

Vale P Veloso V amp Amorim A 2009 Toxin composition of a Prorocentrum lima strain isolated from the Portuguese coast Toxicon 54145ndash152

Agradecimientos Intecmar de la Xunta de Galicia Espantildea donde se realizaron los anaacutelisis de toxinas proyecto

SUBPESCA ldquoManejo y Monitoreo de Mareas Rojas en las regiones de Los Lagos Ayseacuten y Magallanes IV etapa 2010rdquo

ANEXO 4

Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten

ANEXO 5

Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de Magallanes

TASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

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O

EJE

MP

LA

R P

AR

A E

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SA

DO

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UID

AC

IOacuteN

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

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DIG

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DIG

OS

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DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

EN

TID

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BA

NC

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IATASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

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OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

0 9

4 0

2 4INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

AD

MIN

IST

RA

CIOacute

NTASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

9520 euros

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

CONSELLERIA DE FACENDA

ANEXO 6

Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para cierre

de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

Seccioacuten Ediciones y Produccioacuten Almte Manuel Blanco Encalada 839

Fono 56-32-2151500 Valparaiacuteso Chile

wwwifopcl

Page 32: “Análisis de toxinas lipofílicas mediante LC-MS/MS en ...metadatos.mma.gob.cl/sinia/Informe_final_Analisis_toxinas_lipofilicas_656-055.pdfSUBSECRETARÍA DE ECONOMÍA: INFORME FINAL:

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo TABLAS

Tabla 7 Niveles actualmente permitidos por la legislacioacuten europea (bioensayo) y los niveles propuestos por la

autoridad europea para la seguridad alimentaria (EFSA) (Gerssen et al 2010)

Toxin Legislacioacuten (μg kg-

1) Proposicioacuten

EFSA (μg kg-1)

Validacioacuten LC-MSMS

(μg kg-1)

OA and DTXs 160 45

PTXs 120

YTXs 1000 3750

AZAs 160 32

SPXs 400 (Gerssen et al2010)

European Food Safety Authority Decisioacuten 2002657 de la Unioacuten Europea EC Incluye PTXs

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo TABLAS

Tabla 8 Abundancia relativa ambiental de las microalgas al momento de recolectar las muestras de moluscos En rojo se indica la deteccioacuten de toxina positiva en los moluscos asociada a la supuesta microalga fuente PTXs (D

acuminata) YTXs (P reticulatum) SPXs (A ostenfeldii) DTX1 (A acuta)

(Tabla modificada de Guzmaacuten et al 2014)

A N E X O S

ANEXO 1

Certificacioacuten laboratorio INTECMAR

ANEXO 2

Lista de anaacutelisis que realiza INTECMAR y sus costos (en euros) 2013

scv 1 de 7

GUIA PARA LA AUTOLIQUIDACIOacuteN DE TASAS A FAVOR DE LA COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA 2013 Los aspectos financieros de los servicios prestados por Intecmar en el marco de su actividad e vienen regulados en la Ley 62003 de 9 de diciembre de tasas precios y exenciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia (DOG nuacutem 240 de 11122003) y fueron actualizados posteriormente en la Ley 142010 de 27 de diciembre de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2011 (DOG nuacutem 250 de 30122010) y en la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013 (DOG nuacutem 42 de 28022013) Existen dos maneras de liquidar las tasas correspondientes a los servicios prestados por Intecmar

1 De forma manual cubriendo el modelo A de autoliquidacioacuten que se descarga en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda y que adjunto en pdf y se lleva al banco para su pago httpwwwconselleriadefacendaeswebportalconfeccion-impresos

2 De forma telemaacutetica en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda viacutenculo httpshostcixtecesXEITObinlionwebXeitodllxmit a traveacutes del modelo 730

Ambos modelos de liquidacioacuten de tasas adjuntamos ejemplo al final de este documento deben ser remitidos por mail a Intecmar con el sello del banco fiacutesico o virtual como paso previo a la emisioacuten del certificado Los coacutedigos generales necesarios son

minus Consejeriacutea de Medio Rural y de Mar Coacutedigo 09 minus Delegacioacuten de Pontevedra Coacutedigo 40 minus Servicio de Intecmar Coacutedigo 24

Los coacutedigos y descripcioacuten de las tasas son los regulados en la legislacioacuten vigente y los hemos resumido en los anexos siguientes Vilaxoaacuten 4 de marzo de 2013

scv 2 de 7

TARIFAS DE TASAS VIGENTES PARA 2013 - Ley 22013 d e 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013

(DOG nuacutem 42 de 28022013)

Estas tarifas son consecuencia de la actualizacioacuten de las tarifas contenidas en los anexos 1 2 3 4 y 5 de la Ley 62003 del 9 de diciembre de tasas precios y exacciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia por la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 Seraacuten aplicables desde el diacutea de la entrada en vigor de la Ley de

presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 TASA POR SERVICIOS ADMINISTRATIVOS

No sujecioacuten No se exigiraacute la tasa por servicios administrativos cuando se trate de compulsas o cotejos de documentos que deban acompantildear a solicitudes escritos o comunicaciones presentadas por el ciudadano y realizadas en el aacutembito de actuacioacuten de los registros seguacuten lo dispuesto en el artiacuteculo 385 de la Ley 301992 del 26 de noviembre de reacutegimen juriacutedico de las administraciones puacuteblicas y del procedimiento administrativo comuacuten

Excepciones Estaraacuten exentos de la presente tasa

1- La expedicioacuten de certificados de retribuciones satisfechas por la Xunta de Galicia con el objeto de justificacioacuten en relacioacuten con el impuesto sobre la renta de las personas fiacutesicas

2- La expedicioacuten de certificados y compulsa que el personal de la Administracioacuten solicite respecto a las necesidades propias del puesto de trabajo o relacioacuten de servicios

3- Los alumnos por cualquier actuacioacuten en materia de ensentildeanzas no universitarias

scv 3 de 7

4- Las compulsas realizadas en las oficinas de empleo para los desempleados en la tramitacioacuten de expedientes que sean competencia de dichas oficinas

5 La inscripcioacuten en las convocatorias para a seleccioacuten de personal de la comunidad autoacutenoma despueacutes de justificacioacuten documental solicitada por

- Personas con discapacidad igual o superior al 33 - Personas que sean miembros de familias numerosas clasificadas en la

categoriacutea especial Se aplicaraacute una bonificacioacuten del 50 a la inscripcioacuten solicitada por - Personas que sean miembros de familias numerosas de categoriacutea

general - Personas que figurasen como demandantes de empleo desde por lo

menos seis meses antes a la fecha de la convocatoria de pruebas selectivas de personal en las que soliciten su participacioacuten y no esteacuten percibiendo prestacioacuten o subsidio por desempleo

6- La expedicioacuten de certificados relativos a la situacioacuten fiscal 7- El Estado y los demaacutes entes puacuteblicos territoriales o institucionales

siempre que los servicios o actividades de que sean beneficiarios se presten o se realicen en el marco del principio de colaboracioacuten entre administraciones

8- Las viacutectimas de actos terroristas asiacute como sus coacutenyuges y sus hijos por cualquier actuacioacuten en materia educativa realizada en centros oficiales de estudios en todos los niveles de ensentildeanza

9- Los miembros de los organismos consultivos de la Administracioacuten puacuteblica gallega respecto de los certificados emitidos por dichos organismos

COacuteDIGO TASAS

DESCRIPCIOacuteN IMPORTE euro

314400 Prestacioacuten de servicios en el Instituto Tecnoloacutegico para el Control del Medio Marino de Galicia

314401 Anaacutelisis de biotoxinas marinas en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de Yasumoto 1978 4752

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en rato segundo o meacutetodo de Yasumoto 1984 5432

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS)

9520 -Anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten

seguacuten el meacutetodo de la AOAC 4752

scv 4 de 7

-Anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo da AOAC 4752

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1978 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10186

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1984 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10865

-Anaacutelisis combinada en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS) anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo AOAC y anaacutelisis de toxicidad de tipo ASP por cromatografiacutea liquida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo de la AOAC 15000

314402 Anaacutelisis de muestras en agua de mar -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton marino mediante

microscopiacutea oacuteptica 15133 -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton toacutexico marino

mediante microscopiacutea oacuteptica 13333 - Anaacutelisis de carbono orgaacutenico disuelto 5093 -Anaacutelisis de nutrientes inorgaacutenicos disueltos 3500 -Anaacutelisis de pigmentos fotosinteacuteticos (clorofila ldquoardquo) por

espectrofluorimetria 1698 314403 Anaacutelisis microbioloacutegicos en moluscos y otros organismos

procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Cuantificacioacuten de E Coli 10186 - Deteccioacuten de Salmonella spp 16975 -Enumeracioacuten de Escherichia coli en moluscos bivalvos

vivos por la teacutecnica de medida directa de impedancia con el sistema BacTrac 4300 6800

314404 Anaacutelisis de contaminantes de origen quiacutemica en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Determinacioacuten de metales pesados (Pb Cd Cu Zn As Hg Ni Cr Ag) mediante espectrofotometriacutea de absorcioacuten atoacutemica por metal

6790

-Determinacioacuten de compuestos bifenilos policlorados (PCB) mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

scv 5 de 7

-Determinacioacuten de pesticidas organoclorados mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

-Determinacioacuten de hidrocarburos aromaacuteticos policiacuteclicos (HAPs) mediante cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de fluorescencia

28200

314405 Anaacutelisis histopatoloacutegica de moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Estudio hispatoloacutegico Determinacioacuten de Bonamia Marteillia Perkinsus y otras alteraciones patoloacutegicas

101852

314406 Emisioacuten de certificaciones e informes teacutecnicos y otras actuaciones a peticioacuten del interesado

Emisioacuten de certificados a peticioacuten de los interesados sobre las actuaciones llevadas a cabo por el Instituto

1000

Emisioacuten de informes teacutecnicos a peticioacuten del interesado (euros por hora o fraccioacuten)

4000

scv 6 de 7

scv 7 de 7

ANEXO 3

Resultados de anaacutelisis en muestras de microalgas anteriormente enviadas procedentes de Magallanes por el equipo de espectrometriacutea de masas utilizado por INTECMAR Trabajo presentado a las XXXII

Congreso de Ciencias del Mar realizado en Punta Arenas 22-25 octubre de 2012

PERFIL DE TOXINAS DE PROROCENTRUM LIMA (DINOPHYCEAE) AISLADO DESDE LA COSTA DE MAGALLANES SUR DE CHILE P Salgado1 G Pizarro1 JM Franco2 P Rioboacute2 e I Bravo3

1Instituto de Fomento Pesquero (IFOP) Punta Arenas Chile gemitapizarroifopcl 2Instituto de Investigaciones Marinas (CSIC) Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea 3Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea

Prorocentrum lima (Ehrenberg) es un dinoflagelado marino bentoacutenico que se encuentra adherido generalmente

sobre macroalgas sedimentos y detrito flotante y menos comuacutenmente en el plancton (Bravo et al 2001) Es una especie neriacutetica y estuarina y su rango de distribucioacuten geograacutefica variacutea desde aguas costeras tropicales a templadas (Faust 1991) La importancia de P lima se debe a que son productoras de toxinas diarreogeacutenicas en las personas (veneno diarreico de los mariscos VDM) al igual que algunas especies de Dinophysis aunque raramente se le han asociado con episodios toacutexicos por VDM por su caraacutecter epiacutefito y bentoacutenico El complejo VDM producido por P lima incluye moleacuteculas conocidas como el aacutecido okadaico (AO) y derivados dinofisistoxinas (DTX-1 DTX-2) (Bravo et al 2001 Vale et al 2009) No obstante existen casos citados para USA donde se detectoacute toxicidad por VDM en bivalvos de cultivos asociadas a P lima aunque en bajos niveles (Maranda et al 2007a) En Canadaacute tambieacuten se llevoacute a cabo un estudio en moluscos de cultivo cuya finalidad fue determinar el origen del VDM en la que P lima fue la principal especie sospechosa tras la ocurrencia de un evento toacutexico humano por VDM ocurrido en 1998 (Levasseur et al 2003) y en antildeos anteriores (Quilliam et al 1993) Aunque Levasseur et al (2003) no logroacute probar la toxicidad de los mariscos en cultivo a causa de P lima cabe hacer notar que lo que buscaron fue OA y DTX1 no DTX 3 este uacuteltimo principal derivado de las anteriores tras su transformacioacuten en los moluscos (eg Suzuki et al 1999 Vale amp Sampayo 2002)

En consecuencia el rol de P lima en eventos toacutexicos por VDM auacuten no puede descartarse por cuanto podriacutean llegar a ser importantes en ambientes turbulentos debido a la eventual remocioacuten de microalgas adheridas en sustratos por efecto de vientos (Levasseur et al 2003) factor de importancia si se trata de sedimentos o contrariamente en zonas someras y estables de cultivos de moluscos que al mismo tiempo favorecen microambientes para sustratos en los que prolifera la epiacutefita P lima (Lawrence et al 2000) quedando expuestas a re-suspensiones temporales que favorecen la filtracioacuten de estas microalgas por los bivalvos en cultivo (Maranda et al 2007a)

Chile posee escaso conocimiento sobre esta especie en su medio natural incluido su perfil de toxinas y potencial rol en la toxificacioacuten de moluscos por VDM Por tal razoacuten resultoacute interesante aportar al conocimiento de estos aspectos en muestras de sedimentos recolectadas en el estrecho de Magallanes en las que esta especie se encontroacute inhabitualmente abundante

Las ceacutelulas utilizadas en este estudio fueron aisladas desde sedimentos superficiales (0-3 cm) recolectados en el invierno de 2010 en la localidad de cabo San Isidro durante el muestreo regular del programa de monitoreo de marea roja en la regioacuten de Magallanes En esa oportunidad se logroacute cuantificar hasta 1002 quistes tecadoscm3 de Prorocentrum lima la mayor concentracioacuten respecto a otros sitios de recolecta (Fig 1) Los sedimentos de esta localidad presentaron una coloracioacuten oscura y un fuerte olor a sulfuro de hidroacutegeno (H2S) producto de anoxia local

Se aislaron entre 27 y 87 quistes tecados (Fig 1 a) directamente desde los sedimentos mientras otras 60 ceacutelulas vegetativas (Fig 1 b) fueron aisladas luego de promover la actividad y divisioacuten de los quistes en condiciones de 15 ordmC y un ciclo de luzoscuridad de 1212 horas (Tabla 1) Para este fin se aislaron quistes tecados y trasvasijaron a placas Petri de 5 cm de diaacutemetro conteniendo 5 mL de medio de cultivo L1 Para el anaacutelisis de toxinas las ceacutelulas aisladas fueron trasvasijadas a un tubo Eppendorf de 15 mL y congelados a -80 ordmC Una aliacutecuota de sedimento huacutemedo (100 microL aproximados) tambieacuten fue vaciada en un tubo Eppendorf y congelado Para extraer la toxina se antildeadioacute 500 microL de metanol 100 a cada tubo se mezcloacute por 1 min y filtroacute por 045 microm trasvasijando a un vial El extracto fue secado bajo nitroacutegeno gas a 40 ordmC y conservado a 4 ordmC hasta su anaacutelisis Previo al anaacutelisis de toxinas los extractos fueron resuspendidos en 150 microl de metanol

La presencia de la toxina dinofisistoxina 1 (DTX-1) en las muestras (Fig2) fue confirmada en modo negativo a traveacutes de su ioacuten precursor [M-H]- mz 8175 y sus iones productos mz 5634 y 2552 mediante un cromatoacutegrafo UPLC Acquity Waters acoplado a un triple cuadrupolo Waters Xevo TQ (LC-MS) La columna utilizada fue una Acquity UPLC BEH C18 17microm 21 x 100 mm a 45 ordmC La fase moacutevil consistioacute en (A) hidroacutexido amoacutenico a pH 11 y (B) hidroacutexido amoacutenico en acetonitrilo (67 mM) con una tasa de flujo de 4 mLmin El gradiente de elucioacuten utilizado fue el siguiente mantencioacuten al 75 de A entre 0 y 066 min cambio a 5 de A entre 066 y 330 min mantener 5

de A entre 330 y 528 min recuperacioacuten del 75 de A entre 528 y 726 min mantencioacuten al 75 de A hasta 9 min Se pinchoacute 5microL de muestra en el LC-MS El contenido de DTX-1 en las muestras fue cuantificado en base al ion precursor

Los tres tipos de muestras fueron positivas a la presencia de DTX-1 pero las ceacutelulas vegetativas fueron las que presentaron un mayor contenido de DTX-1 por ceacutelula La deteccioacuten de DTX-1 en los sedimentos (Tabla 2) reflejoacute la presencia de los quistes tecados en eacutestos

Figura 1 Concentraciones de quistes tecados de Prorocentrum lima (quistescm3 de sedimento huacutemedo) en estaciones de muestreo en el Estrecho de Magallanes (M26 Estero Wickham M29N1 Isla Engenfield M31 Bahiacutea Nash M35 Cabo San Isidro M39C1 Bahiacutea Gente Grande M39C2 Bahiacutea Inuacutetil M39C3 Canal Gabriel) y Canal Beagle (M41 Ventisquero Espantildea M42 Ventisquero Holanda) (a) Quistes tecados (b) ceacutelulas vegetativas obtenidas de germinacioacuten de quistes tecados bajo condiciones de laboratorio Barra de escala 20 microm

Tabla 1 Sedimento y ceacutelulas de Prorocentrum lima aisladas para anaacutelisis de toxinas

Extracto metanoacutelico Nordm de ceacutelulas TR ngmL pg DTX-1 ceacutel

G1 quistes tecados 27 213 lt2 -

G2 quistes tecados 67 214 05 11

G3 quistes tecados 87 215 12 21

G4 ceacutelulas vegetativas 60 215 34 87

G6 sedimentos aliacutecuota 213 13 19 pg microL sed

TR tiempo de retencioacuten

Figura 2 Cromatogramas de extractos metanoacutelicos de Prorocentrum lima quistes tecados (a) ceacutelulas vegetativas (b) y sedimentos (c)

Tabla 2 Caracteriacutesticas del sedimento con quistes tecados de Prorocentrum lima

Tipo Tamantildeo (mm)

Grava 2 35

Arena media 025 - 05 32

Arena muy fina 0063 - 0125 2

Limo-arcilla lt 0063 1

Estos resultados constituyen otra eventual posibilidad de toxicidad en los moluscos por VDM no soacutelo de aquellos con modalidad de vida bentoacutenica superficial sino de aquellos que tambieacuten viven enterrados en la arena (eg almeja huepo) Maacutes auacuten si se conoce que P lima posee la capacidad de desarrollar poblaciones naturales en aguas templadas en nuacutemeros que podriacutean justificar una toxicidad por VDM en los mariscos (eg Maranda et al 2007a b)

Referencias

Bravo I ML Fernaacutendez I Ramilo amp A Martinez 2001 Toxin composition of the toxic dinofagellate Prorocentrum lima isolated from different locations along the Galician coast (NW Spain) Toxicon 39 1537ndash1545

Faust MA 1991 Morphology of ciguatera-causing Prorocentrum lima (Pyrrophyta) from widely differing sites J Phycol 27 642-648

Lawrence J E Grant J Quilliam M A Bauder A G amp Cembella A D 2000 Colonizaition and growth of the toxic dinoflagellate Prorocentrum lima and associated fouling macroalgae on mussels in suspended culture Mar Ecol Prog Ser 201 147-154

Levasseur M Couture J Y Weise A M Michaud S Elbrachter M Sauveacute G amp Bonneau E 2003 Pelagic and epiphytic summer distributions of Prorocentrum lima and P mexicanum at two mussel farms in the Gulf of St Lawrence Aquat Microbiol Ecol 30283-293

Maranda L Corwin S Dover S amp Morton S L 2007a Prorocentrum lima (Dinophyceae) in northeastern USA coastal waters II Toxin load in the epibiota and in shellfish Harmful Algae 6 632-641

Maranda L Corwin S Hargraves P E 2007b Prorocentrum lima (Dinophyceae) in 19 northeastern USA coastal waters I Abundance and distribution Harmful Algae 6 623ndash631

Quilliam MA Gilgan MW amp Pleasance S 1993 Confirmation of an incident of diarrhetic shellfish poisoning in eastern Canada In Smayda TJ Shimizu Y (Eds) Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea Elsevier New York pp 547ndash552

Suzuki T Ota H amp Yamasaki M 1999 Direct evidence of transformation of dinophysistoxin-1 to 7-O-acyl-dinophysistoxin-1 (Dinophysis-3) in the scallop Patinopecten yessoensis Toxicon 37 187-198

Vale P amp Sampayo M A 2002 First confirmation of human diarrhoeic poisonings by okadaic acid esters after ingestion of razor clams (Solen marginatus) and green crabs (Carcinus maenas) in Aveiro lagoon Portugal and detection of okadaic acid esters in phytoplankton Toxicon 40989-996

Vale P Veloso V amp Amorim A 2009 Toxin composition of a Prorocentrum lima strain isolated from the Portuguese coast Toxicon 54145ndash152

Agradecimientos Intecmar de la Xunta de Galicia Espantildea donde se realizaron los anaacutelisis de toxinas proyecto

SUBPESCA ldquoManejo y Monitoreo de Mareas Rojas en las regiones de Los Lagos Ayseacuten y Magallanes IV etapa 2010rdquo

ANEXO 4

Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten

ANEXO 5

Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de Magallanes

TASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

O

EJE

MP

LA

R P

AR

A E

L IN

TE

RE

SA

DO

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UID

AC

IOacuteN

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

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DIG

OS

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DIG

OS

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DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

EN

TID

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BA

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IATASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

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N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

0 9

4 0

2 4INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

AD

MIN

IST

RA

CIOacute

NTASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

9520 euros

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

CONSELLERIA DE FACENDA

ANEXO 6

Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para cierre

de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

Seccioacuten Ediciones y Produccioacuten Almte Manuel Blanco Encalada 839

Fono 56-32-2151500 Valparaiacuteso Chile

wwwifopcl

Page 33: “Análisis de toxinas lipofílicas mediante LC-MS/MS en ...metadatos.mma.gob.cl/sinia/Informe_final_Analisis_toxinas_lipofilicas_656-055.pdfSUBSECRETARÍA DE ECONOMÍA: INFORME FINAL:

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO DIVISIOacuteN INVESTIGACIOacuteN EN ACUICULTURA

SUBSECRETARIacuteA DE ECONOMIacuteA INFORME FINAL ldquoANAacuteLISIS DE TOXINAS LIPOFIacuteLICAS MEDIANTE LC-MSMS EN MUESTRAS DE FITOPLANCTON Y MOLUSCOS RECOLECTADAS DURANTE LA FLORACIOacuteN ESTIVAL 2013 DE Dinophysis spp EN MAGALLANESrdquo TABLAS

Tabla 8 Abundancia relativa ambiental de las microalgas al momento de recolectar las muestras de moluscos En rojo se indica la deteccioacuten de toxina positiva en los moluscos asociada a la supuesta microalga fuente PTXs (D

acuminata) YTXs (P reticulatum) SPXs (A ostenfeldii) DTX1 (A acuta)

(Tabla modificada de Guzmaacuten et al 2014)

A N E X O S

ANEXO 1

Certificacioacuten laboratorio INTECMAR

ANEXO 2

Lista de anaacutelisis que realiza INTECMAR y sus costos (en euros) 2013

scv 1 de 7

GUIA PARA LA AUTOLIQUIDACIOacuteN DE TASAS A FAVOR DE LA COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA 2013 Los aspectos financieros de los servicios prestados por Intecmar en el marco de su actividad e vienen regulados en la Ley 62003 de 9 de diciembre de tasas precios y exenciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia (DOG nuacutem 240 de 11122003) y fueron actualizados posteriormente en la Ley 142010 de 27 de diciembre de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2011 (DOG nuacutem 250 de 30122010) y en la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013 (DOG nuacutem 42 de 28022013) Existen dos maneras de liquidar las tasas correspondientes a los servicios prestados por Intecmar

1 De forma manual cubriendo el modelo A de autoliquidacioacuten que se descarga en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda y que adjunto en pdf y se lleva al banco para su pago httpwwwconselleriadefacendaeswebportalconfeccion-impresos

2 De forma telemaacutetica en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda viacutenculo httpshostcixtecesXEITObinlionwebXeitodllxmit a traveacutes del modelo 730

Ambos modelos de liquidacioacuten de tasas adjuntamos ejemplo al final de este documento deben ser remitidos por mail a Intecmar con el sello del banco fiacutesico o virtual como paso previo a la emisioacuten del certificado Los coacutedigos generales necesarios son

minus Consejeriacutea de Medio Rural y de Mar Coacutedigo 09 minus Delegacioacuten de Pontevedra Coacutedigo 40 minus Servicio de Intecmar Coacutedigo 24

Los coacutedigos y descripcioacuten de las tasas son los regulados en la legislacioacuten vigente y los hemos resumido en los anexos siguientes Vilaxoaacuten 4 de marzo de 2013

scv 2 de 7

TARIFAS DE TASAS VIGENTES PARA 2013 - Ley 22013 d e 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013

(DOG nuacutem 42 de 28022013)

Estas tarifas son consecuencia de la actualizacioacuten de las tarifas contenidas en los anexos 1 2 3 4 y 5 de la Ley 62003 del 9 de diciembre de tasas precios y exacciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia por la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 Seraacuten aplicables desde el diacutea de la entrada en vigor de la Ley de

presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 TASA POR SERVICIOS ADMINISTRATIVOS

No sujecioacuten No se exigiraacute la tasa por servicios administrativos cuando se trate de compulsas o cotejos de documentos que deban acompantildear a solicitudes escritos o comunicaciones presentadas por el ciudadano y realizadas en el aacutembito de actuacioacuten de los registros seguacuten lo dispuesto en el artiacuteculo 385 de la Ley 301992 del 26 de noviembre de reacutegimen juriacutedico de las administraciones puacuteblicas y del procedimiento administrativo comuacuten

Excepciones Estaraacuten exentos de la presente tasa

1- La expedicioacuten de certificados de retribuciones satisfechas por la Xunta de Galicia con el objeto de justificacioacuten en relacioacuten con el impuesto sobre la renta de las personas fiacutesicas

2- La expedicioacuten de certificados y compulsa que el personal de la Administracioacuten solicite respecto a las necesidades propias del puesto de trabajo o relacioacuten de servicios

3- Los alumnos por cualquier actuacioacuten en materia de ensentildeanzas no universitarias

scv 3 de 7

4- Las compulsas realizadas en las oficinas de empleo para los desempleados en la tramitacioacuten de expedientes que sean competencia de dichas oficinas

5 La inscripcioacuten en las convocatorias para a seleccioacuten de personal de la comunidad autoacutenoma despueacutes de justificacioacuten documental solicitada por

- Personas con discapacidad igual o superior al 33 - Personas que sean miembros de familias numerosas clasificadas en la

categoriacutea especial Se aplicaraacute una bonificacioacuten del 50 a la inscripcioacuten solicitada por - Personas que sean miembros de familias numerosas de categoriacutea

general - Personas que figurasen como demandantes de empleo desde por lo

menos seis meses antes a la fecha de la convocatoria de pruebas selectivas de personal en las que soliciten su participacioacuten y no esteacuten percibiendo prestacioacuten o subsidio por desempleo

6- La expedicioacuten de certificados relativos a la situacioacuten fiscal 7- El Estado y los demaacutes entes puacuteblicos territoriales o institucionales

siempre que los servicios o actividades de que sean beneficiarios se presten o se realicen en el marco del principio de colaboracioacuten entre administraciones

8- Las viacutectimas de actos terroristas asiacute como sus coacutenyuges y sus hijos por cualquier actuacioacuten en materia educativa realizada en centros oficiales de estudios en todos los niveles de ensentildeanza

9- Los miembros de los organismos consultivos de la Administracioacuten puacuteblica gallega respecto de los certificados emitidos por dichos organismos

COacuteDIGO TASAS

DESCRIPCIOacuteN IMPORTE euro

314400 Prestacioacuten de servicios en el Instituto Tecnoloacutegico para el Control del Medio Marino de Galicia

314401 Anaacutelisis de biotoxinas marinas en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de Yasumoto 1978 4752

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en rato segundo o meacutetodo de Yasumoto 1984 5432

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS)

9520 -Anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten

seguacuten el meacutetodo de la AOAC 4752

scv 4 de 7

-Anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo da AOAC 4752

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1978 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10186

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1984 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10865

-Anaacutelisis combinada en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS) anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo AOAC y anaacutelisis de toxicidad de tipo ASP por cromatografiacutea liquida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo de la AOAC 15000

314402 Anaacutelisis de muestras en agua de mar -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton marino mediante

microscopiacutea oacuteptica 15133 -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton toacutexico marino

mediante microscopiacutea oacuteptica 13333 - Anaacutelisis de carbono orgaacutenico disuelto 5093 -Anaacutelisis de nutrientes inorgaacutenicos disueltos 3500 -Anaacutelisis de pigmentos fotosinteacuteticos (clorofila ldquoardquo) por

espectrofluorimetria 1698 314403 Anaacutelisis microbioloacutegicos en moluscos y otros organismos

procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Cuantificacioacuten de E Coli 10186 - Deteccioacuten de Salmonella spp 16975 -Enumeracioacuten de Escherichia coli en moluscos bivalvos

vivos por la teacutecnica de medida directa de impedancia con el sistema BacTrac 4300 6800

314404 Anaacutelisis de contaminantes de origen quiacutemica en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Determinacioacuten de metales pesados (Pb Cd Cu Zn As Hg Ni Cr Ag) mediante espectrofotometriacutea de absorcioacuten atoacutemica por metal

6790

-Determinacioacuten de compuestos bifenilos policlorados (PCB) mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

scv 5 de 7

-Determinacioacuten de pesticidas organoclorados mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

-Determinacioacuten de hidrocarburos aromaacuteticos policiacuteclicos (HAPs) mediante cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de fluorescencia

28200

314405 Anaacutelisis histopatoloacutegica de moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Estudio hispatoloacutegico Determinacioacuten de Bonamia Marteillia Perkinsus y otras alteraciones patoloacutegicas

101852

314406 Emisioacuten de certificaciones e informes teacutecnicos y otras actuaciones a peticioacuten del interesado

Emisioacuten de certificados a peticioacuten de los interesados sobre las actuaciones llevadas a cabo por el Instituto

1000

Emisioacuten de informes teacutecnicos a peticioacuten del interesado (euros por hora o fraccioacuten)

4000

scv 6 de 7

scv 7 de 7

ANEXO 3

Resultados de anaacutelisis en muestras de microalgas anteriormente enviadas procedentes de Magallanes por el equipo de espectrometriacutea de masas utilizado por INTECMAR Trabajo presentado a las XXXII

Congreso de Ciencias del Mar realizado en Punta Arenas 22-25 octubre de 2012

PERFIL DE TOXINAS DE PROROCENTRUM LIMA (DINOPHYCEAE) AISLADO DESDE LA COSTA DE MAGALLANES SUR DE CHILE P Salgado1 G Pizarro1 JM Franco2 P Rioboacute2 e I Bravo3

1Instituto de Fomento Pesquero (IFOP) Punta Arenas Chile gemitapizarroifopcl 2Instituto de Investigaciones Marinas (CSIC) Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea 3Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea

Prorocentrum lima (Ehrenberg) es un dinoflagelado marino bentoacutenico que se encuentra adherido generalmente

sobre macroalgas sedimentos y detrito flotante y menos comuacutenmente en el plancton (Bravo et al 2001) Es una especie neriacutetica y estuarina y su rango de distribucioacuten geograacutefica variacutea desde aguas costeras tropicales a templadas (Faust 1991) La importancia de P lima se debe a que son productoras de toxinas diarreogeacutenicas en las personas (veneno diarreico de los mariscos VDM) al igual que algunas especies de Dinophysis aunque raramente se le han asociado con episodios toacutexicos por VDM por su caraacutecter epiacutefito y bentoacutenico El complejo VDM producido por P lima incluye moleacuteculas conocidas como el aacutecido okadaico (AO) y derivados dinofisistoxinas (DTX-1 DTX-2) (Bravo et al 2001 Vale et al 2009) No obstante existen casos citados para USA donde se detectoacute toxicidad por VDM en bivalvos de cultivos asociadas a P lima aunque en bajos niveles (Maranda et al 2007a) En Canadaacute tambieacuten se llevoacute a cabo un estudio en moluscos de cultivo cuya finalidad fue determinar el origen del VDM en la que P lima fue la principal especie sospechosa tras la ocurrencia de un evento toacutexico humano por VDM ocurrido en 1998 (Levasseur et al 2003) y en antildeos anteriores (Quilliam et al 1993) Aunque Levasseur et al (2003) no logroacute probar la toxicidad de los mariscos en cultivo a causa de P lima cabe hacer notar que lo que buscaron fue OA y DTX1 no DTX 3 este uacuteltimo principal derivado de las anteriores tras su transformacioacuten en los moluscos (eg Suzuki et al 1999 Vale amp Sampayo 2002)

En consecuencia el rol de P lima en eventos toacutexicos por VDM auacuten no puede descartarse por cuanto podriacutean llegar a ser importantes en ambientes turbulentos debido a la eventual remocioacuten de microalgas adheridas en sustratos por efecto de vientos (Levasseur et al 2003) factor de importancia si se trata de sedimentos o contrariamente en zonas someras y estables de cultivos de moluscos que al mismo tiempo favorecen microambientes para sustratos en los que prolifera la epiacutefita P lima (Lawrence et al 2000) quedando expuestas a re-suspensiones temporales que favorecen la filtracioacuten de estas microalgas por los bivalvos en cultivo (Maranda et al 2007a)

Chile posee escaso conocimiento sobre esta especie en su medio natural incluido su perfil de toxinas y potencial rol en la toxificacioacuten de moluscos por VDM Por tal razoacuten resultoacute interesante aportar al conocimiento de estos aspectos en muestras de sedimentos recolectadas en el estrecho de Magallanes en las que esta especie se encontroacute inhabitualmente abundante

Las ceacutelulas utilizadas en este estudio fueron aisladas desde sedimentos superficiales (0-3 cm) recolectados en el invierno de 2010 en la localidad de cabo San Isidro durante el muestreo regular del programa de monitoreo de marea roja en la regioacuten de Magallanes En esa oportunidad se logroacute cuantificar hasta 1002 quistes tecadoscm3 de Prorocentrum lima la mayor concentracioacuten respecto a otros sitios de recolecta (Fig 1) Los sedimentos de esta localidad presentaron una coloracioacuten oscura y un fuerte olor a sulfuro de hidroacutegeno (H2S) producto de anoxia local

Se aislaron entre 27 y 87 quistes tecados (Fig 1 a) directamente desde los sedimentos mientras otras 60 ceacutelulas vegetativas (Fig 1 b) fueron aisladas luego de promover la actividad y divisioacuten de los quistes en condiciones de 15 ordmC y un ciclo de luzoscuridad de 1212 horas (Tabla 1) Para este fin se aislaron quistes tecados y trasvasijaron a placas Petri de 5 cm de diaacutemetro conteniendo 5 mL de medio de cultivo L1 Para el anaacutelisis de toxinas las ceacutelulas aisladas fueron trasvasijadas a un tubo Eppendorf de 15 mL y congelados a -80 ordmC Una aliacutecuota de sedimento huacutemedo (100 microL aproximados) tambieacuten fue vaciada en un tubo Eppendorf y congelado Para extraer la toxina se antildeadioacute 500 microL de metanol 100 a cada tubo se mezcloacute por 1 min y filtroacute por 045 microm trasvasijando a un vial El extracto fue secado bajo nitroacutegeno gas a 40 ordmC y conservado a 4 ordmC hasta su anaacutelisis Previo al anaacutelisis de toxinas los extractos fueron resuspendidos en 150 microl de metanol

La presencia de la toxina dinofisistoxina 1 (DTX-1) en las muestras (Fig2) fue confirmada en modo negativo a traveacutes de su ioacuten precursor [M-H]- mz 8175 y sus iones productos mz 5634 y 2552 mediante un cromatoacutegrafo UPLC Acquity Waters acoplado a un triple cuadrupolo Waters Xevo TQ (LC-MS) La columna utilizada fue una Acquity UPLC BEH C18 17microm 21 x 100 mm a 45 ordmC La fase moacutevil consistioacute en (A) hidroacutexido amoacutenico a pH 11 y (B) hidroacutexido amoacutenico en acetonitrilo (67 mM) con una tasa de flujo de 4 mLmin El gradiente de elucioacuten utilizado fue el siguiente mantencioacuten al 75 de A entre 0 y 066 min cambio a 5 de A entre 066 y 330 min mantener 5

de A entre 330 y 528 min recuperacioacuten del 75 de A entre 528 y 726 min mantencioacuten al 75 de A hasta 9 min Se pinchoacute 5microL de muestra en el LC-MS El contenido de DTX-1 en las muestras fue cuantificado en base al ion precursor

Los tres tipos de muestras fueron positivas a la presencia de DTX-1 pero las ceacutelulas vegetativas fueron las que presentaron un mayor contenido de DTX-1 por ceacutelula La deteccioacuten de DTX-1 en los sedimentos (Tabla 2) reflejoacute la presencia de los quistes tecados en eacutestos

Figura 1 Concentraciones de quistes tecados de Prorocentrum lima (quistescm3 de sedimento huacutemedo) en estaciones de muestreo en el Estrecho de Magallanes (M26 Estero Wickham M29N1 Isla Engenfield M31 Bahiacutea Nash M35 Cabo San Isidro M39C1 Bahiacutea Gente Grande M39C2 Bahiacutea Inuacutetil M39C3 Canal Gabriel) y Canal Beagle (M41 Ventisquero Espantildea M42 Ventisquero Holanda) (a) Quistes tecados (b) ceacutelulas vegetativas obtenidas de germinacioacuten de quistes tecados bajo condiciones de laboratorio Barra de escala 20 microm

Tabla 1 Sedimento y ceacutelulas de Prorocentrum lima aisladas para anaacutelisis de toxinas

Extracto metanoacutelico Nordm de ceacutelulas TR ngmL pg DTX-1 ceacutel

G1 quistes tecados 27 213 lt2 -

G2 quistes tecados 67 214 05 11

G3 quistes tecados 87 215 12 21

G4 ceacutelulas vegetativas 60 215 34 87

G6 sedimentos aliacutecuota 213 13 19 pg microL sed

TR tiempo de retencioacuten

Figura 2 Cromatogramas de extractos metanoacutelicos de Prorocentrum lima quistes tecados (a) ceacutelulas vegetativas (b) y sedimentos (c)

Tabla 2 Caracteriacutesticas del sedimento con quistes tecados de Prorocentrum lima

Tipo Tamantildeo (mm)

Grava 2 35

Arena media 025 - 05 32

Arena muy fina 0063 - 0125 2

Limo-arcilla lt 0063 1

Estos resultados constituyen otra eventual posibilidad de toxicidad en los moluscos por VDM no soacutelo de aquellos con modalidad de vida bentoacutenica superficial sino de aquellos que tambieacuten viven enterrados en la arena (eg almeja huepo) Maacutes auacuten si se conoce que P lima posee la capacidad de desarrollar poblaciones naturales en aguas templadas en nuacutemeros que podriacutean justificar una toxicidad por VDM en los mariscos (eg Maranda et al 2007a b)

Referencias

Bravo I ML Fernaacutendez I Ramilo amp A Martinez 2001 Toxin composition of the toxic dinofagellate Prorocentrum lima isolated from different locations along the Galician coast (NW Spain) Toxicon 39 1537ndash1545

Faust MA 1991 Morphology of ciguatera-causing Prorocentrum lima (Pyrrophyta) from widely differing sites J Phycol 27 642-648

Lawrence J E Grant J Quilliam M A Bauder A G amp Cembella A D 2000 Colonizaition and growth of the toxic dinoflagellate Prorocentrum lima and associated fouling macroalgae on mussels in suspended culture Mar Ecol Prog Ser 201 147-154

Levasseur M Couture J Y Weise A M Michaud S Elbrachter M Sauveacute G amp Bonneau E 2003 Pelagic and epiphytic summer distributions of Prorocentrum lima and P mexicanum at two mussel farms in the Gulf of St Lawrence Aquat Microbiol Ecol 30283-293

Maranda L Corwin S Dover S amp Morton S L 2007a Prorocentrum lima (Dinophyceae) in northeastern USA coastal waters II Toxin load in the epibiota and in shellfish Harmful Algae 6 632-641

Maranda L Corwin S Hargraves P E 2007b Prorocentrum lima (Dinophyceae) in 19 northeastern USA coastal waters I Abundance and distribution Harmful Algae 6 623ndash631

Quilliam MA Gilgan MW amp Pleasance S 1993 Confirmation of an incident of diarrhetic shellfish poisoning in eastern Canada In Smayda TJ Shimizu Y (Eds) Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea Elsevier New York pp 547ndash552

Suzuki T Ota H amp Yamasaki M 1999 Direct evidence of transformation of dinophysistoxin-1 to 7-O-acyl-dinophysistoxin-1 (Dinophysis-3) in the scallop Patinopecten yessoensis Toxicon 37 187-198

Vale P amp Sampayo M A 2002 First confirmation of human diarrhoeic poisonings by okadaic acid esters after ingestion of razor clams (Solen marginatus) and green crabs (Carcinus maenas) in Aveiro lagoon Portugal and detection of okadaic acid esters in phytoplankton Toxicon 40989-996

Vale P Veloso V amp Amorim A 2009 Toxin composition of a Prorocentrum lima strain isolated from the Portuguese coast Toxicon 54145ndash152

Agradecimientos Intecmar de la Xunta de Galicia Espantildea donde se realizaron los anaacutelisis de toxinas proyecto

SUBPESCA ldquoManejo y Monitoreo de Mareas Rojas en las regiones de Los Lagos Ayseacuten y Magallanes IV etapa 2010rdquo

ANEXO 4

Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten

ANEXO 5

Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de Magallanes

TASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

O

EJE

MP

LA

R P

AR

A E

L IN

TE

RE

SA

DO

LIQ

UID

AC

IOacuteN

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

EN

TID

AD

BA

NC

AR

IATASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

0 9

4 0

2 4INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

AD

MIN

IST

RA

CIOacute

NTASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

9520 euros

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

CONSELLERIA DE FACENDA

ANEXO 6

Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para cierre

de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

Seccioacuten Ediciones y Produccioacuten Almte Manuel Blanco Encalada 839

Fono 56-32-2151500 Valparaiacuteso Chile

wwwifopcl

Page 34: “Análisis de toxinas lipofílicas mediante LC-MS/MS en ...metadatos.mma.gob.cl/sinia/Informe_final_Analisis_toxinas_lipofilicas_656-055.pdfSUBSECRETARÍA DE ECONOMÍA: INFORME FINAL:

A N E X O S

ANEXO 1

Certificacioacuten laboratorio INTECMAR

ANEXO 2

Lista de anaacutelisis que realiza INTECMAR y sus costos (en euros) 2013

scv 1 de 7

GUIA PARA LA AUTOLIQUIDACIOacuteN DE TASAS A FAVOR DE LA COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA 2013 Los aspectos financieros de los servicios prestados por Intecmar en el marco de su actividad e vienen regulados en la Ley 62003 de 9 de diciembre de tasas precios y exenciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia (DOG nuacutem 240 de 11122003) y fueron actualizados posteriormente en la Ley 142010 de 27 de diciembre de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2011 (DOG nuacutem 250 de 30122010) y en la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013 (DOG nuacutem 42 de 28022013) Existen dos maneras de liquidar las tasas correspondientes a los servicios prestados por Intecmar

1 De forma manual cubriendo el modelo A de autoliquidacioacuten que se descarga en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda y que adjunto en pdf y se lleva al banco para su pago httpwwwconselleriadefacendaeswebportalconfeccion-impresos

2 De forma telemaacutetica en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda viacutenculo httpshostcixtecesXEITObinlionwebXeitodllxmit a traveacutes del modelo 730

Ambos modelos de liquidacioacuten de tasas adjuntamos ejemplo al final de este documento deben ser remitidos por mail a Intecmar con el sello del banco fiacutesico o virtual como paso previo a la emisioacuten del certificado Los coacutedigos generales necesarios son

minus Consejeriacutea de Medio Rural y de Mar Coacutedigo 09 minus Delegacioacuten de Pontevedra Coacutedigo 40 minus Servicio de Intecmar Coacutedigo 24

Los coacutedigos y descripcioacuten de las tasas son los regulados en la legislacioacuten vigente y los hemos resumido en los anexos siguientes Vilaxoaacuten 4 de marzo de 2013

scv 2 de 7

TARIFAS DE TASAS VIGENTES PARA 2013 - Ley 22013 d e 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013

(DOG nuacutem 42 de 28022013)

Estas tarifas son consecuencia de la actualizacioacuten de las tarifas contenidas en los anexos 1 2 3 4 y 5 de la Ley 62003 del 9 de diciembre de tasas precios y exacciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia por la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 Seraacuten aplicables desde el diacutea de la entrada en vigor de la Ley de

presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 TASA POR SERVICIOS ADMINISTRATIVOS

No sujecioacuten No se exigiraacute la tasa por servicios administrativos cuando se trate de compulsas o cotejos de documentos que deban acompantildear a solicitudes escritos o comunicaciones presentadas por el ciudadano y realizadas en el aacutembito de actuacioacuten de los registros seguacuten lo dispuesto en el artiacuteculo 385 de la Ley 301992 del 26 de noviembre de reacutegimen juriacutedico de las administraciones puacuteblicas y del procedimiento administrativo comuacuten

Excepciones Estaraacuten exentos de la presente tasa

1- La expedicioacuten de certificados de retribuciones satisfechas por la Xunta de Galicia con el objeto de justificacioacuten en relacioacuten con el impuesto sobre la renta de las personas fiacutesicas

2- La expedicioacuten de certificados y compulsa que el personal de la Administracioacuten solicite respecto a las necesidades propias del puesto de trabajo o relacioacuten de servicios

3- Los alumnos por cualquier actuacioacuten en materia de ensentildeanzas no universitarias

scv 3 de 7

4- Las compulsas realizadas en las oficinas de empleo para los desempleados en la tramitacioacuten de expedientes que sean competencia de dichas oficinas

5 La inscripcioacuten en las convocatorias para a seleccioacuten de personal de la comunidad autoacutenoma despueacutes de justificacioacuten documental solicitada por

- Personas con discapacidad igual o superior al 33 - Personas que sean miembros de familias numerosas clasificadas en la

categoriacutea especial Se aplicaraacute una bonificacioacuten del 50 a la inscripcioacuten solicitada por - Personas que sean miembros de familias numerosas de categoriacutea

general - Personas que figurasen como demandantes de empleo desde por lo

menos seis meses antes a la fecha de la convocatoria de pruebas selectivas de personal en las que soliciten su participacioacuten y no esteacuten percibiendo prestacioacuten o subsidio por desempleo

6- La expedicioacuten de certificados relativos a la situacioacuten fiscal 7- El Estado y los demaacutes entes puacuteblicos territoriales o institucionales

siempre que los servicios o actividades de que sean beneficiarios se presten o se realicen en el marco del principio de colaboracioacuten entre administraciones

8- Las viacutectimas de actos terroristas asiacute como sus coacutenyuges y sus hijos por cualquier actuacioacuten en materia educativa realizada en centros oficiales de estudios en todos los niveles de ensentildeanza

9- Los miembros de los organismos consultivos de la Administracioacuten puacuteblica gallega respecto de los certificados emitidos por dichos organismos

COacuteDIGO TASAS

DESCRIPCIOacuteN IMPORTE euro

314400 Prestacioacuten de servicios en el Instituto Tecnoloacutegico para el Control del Medio Marino de Galicia

314401 Anaacutelisis de biotoxinas marinas en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de Yasumoto 1978 4752

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en rato segundo o meacutetodo de Yasumoto 1984 5432

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS)

9520 -Anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten

seguacuten el meacutetodo de la AOAC 4752

scv 4 de 7

-Anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo da AOAC 4752

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1978 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10186

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1984 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10865

-Anaacutelisis combinada en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS) anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo AOAC y anaacutelisis de toxicidad de tipo ASP por cromatografiacutea liquida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo de la AOAC 15000

314402 Anaacutelisis de muestras en agua de mar -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton marino mediante

microscopiacutea oacuteptica 15133 -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton toacutexico marino

mediante microscopiacutea oacuteptica 13333 - Anaacutelisis de carbono orgaacutenico disuelto 5093 -Anaacutelisis de nutrientes inorgaacutenicos disueltos 3500 -Anaacutelisis de pigmentos fotosinteacuteticos (clorofila ldquoardquo) por

espectrofluorimetria 1698 314403 Anaacutelisis microbioloacutegicos en moluscos y otros organismos

procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Cuantificacioacuten de E Coli 10186 - Deteccioacuten de Salmonella spp 16975 -Enumeracioacuten de Escherichia coli en moluscos bivalvos

vivos por la teacutecnica de medida directa de impedancia con el sistema BacTrac 4300 6800

314404 Anaacutelisis de contaminantes de origen quiacutemica en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Determinacioacuten de metales pesados (Pb Cd Cu Zn As Hg Ni Cr Ag) mediante espectrofotometriacutea de absorcioacuten atoacutemica por metal

6790

-Determinacioacuten de compuestos bifenilos policlorados (PCB) mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

scv 5 de 7

-Determinacioacuten de pesticidas organoclorados mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

-Determinacioacuten de hidrocarburos aromaacuteticos policiacuteclicos (HAPs) mediante cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de fluorescencia

28200

314405 Anaacutelisis histopatoloacutegica de moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Estudio hispatoloacutegico Determinacioacuten de Bonamia Marteillia Perkinsus y otras alteraciones patoloacutegicas

101852

314406 Emisioacuten de certificaciones e informes teacutecnicos y otras actuaciones a peticioacuten del interesado

Emisioacuten de certificados a peticioacuten de los interesados sobre las actuaciones llevadas a cabo por el Instituto

1000

Emisioacuten de informes teacutecnicos a peticioacuten del interesado (euros por hora o fraccioacuten)

4000

scv 6 de 7

scv 7 de 7

ANEXO 3

Resultados de anaacutelisis en muestras de microalgas anteriormente enviadas procedentes de Magallanes por el equipo de espectrometriacutea de masas utilizado por INTECMAR Trabajo presentado a las XXXII

Congreso de Ciencias del Mar realizado en Punta Arenas 22-25 octubre de 2012

PERFIL DE TOXINAS DE PROROCENTRUM LIMA (DINOPHYCEAE) AISLADO DESDE LA COSTA DE MAGALLANES SUR DE CHILE P Salgado1 G Pizarro1 JM Franco2 P Rioboacute2 e I Bravo3

1Instituto de Fomento Pesquero (IFOP) Punta Arenas Chile gemitapizarroifopcl 2Instituto de Investigaciones Marinas (CSIC) Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea 3Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea

Prorocentrum lima (Ehrenberg) es un dinoflagelado marino bentoacutenico que se encuentra adherido generalmente

sobre macroalgas sedimentos y detrito flotante y menos comuacutenmente en el plancton (Bravo et al 2001) Es una especie neriacutetica y estuarina y su rango de distribucioacuten geograacutefica variacutea desde aguas costeras tropicales a templadas (Faust 1991) La importancia de P lima se debe a que son productoras de toxinas diarreogeacutenicas en las personas (veneno diarreico de los mariscos VDM) al igual que algunas especies de Dinophysis aunque raramente se le han asociado con episodios toacutexicos por VDM por su caraacutecter epiacutefito y bentoacutenico El complejo VDM producido por P lima incluye moleacuteculas conocidas como el aacutecido okadaico (AO) y derivados dinofisistoxinas (DTX-1 DTX-2) (Bravo et al 2001 Vale et al 2009) No obstante existen casos citados para USA donde se detectoacute toxicidad por VDM en bivalvos de cultivos asociadas a P lima aunque en bajos niveles (Maranda et al 2007a) En Canadaacute tambieacuten se llevoacute a cabo un estudio en moluscos de cultivo cuya finalidad fue determinar el origen del VDM en la que P lima fue la principal especie sospechosa tras la ocurrencia de un evento toacutexico humano por VDM ocurrido en 1998 (Levasseur et al 2003) y en antildeos anteriores (Quilliam et al 1993) Aunque Levasseur et al (2003) no logroacute probar la toxicidad de los mariscos en cultivo a causa de P lima cabe hacer notar que lo que buscaron fue OA y DTX1 no DTX 3 este uacuteltimo principal derivado de las anteriores tras su transformacioacuten en los moluscos (eg Suzuki et al 1999 Vale amp Sampayo 2002)

En consecuencia el rol de P lima en eventos toacutexicos por VDM auacuten no puede descartarse por cuanto podriacutean llegar a ser importantes en ambientes turbulentos debido a la eventual remocioacuten de microalgas adheridas en sustratos por efecto de vientos (Levasseur et al 2003) factor de importancia si se trata de sedimentos o contrariamente en zonas someras y estables de cultivos de moluscos que al mismo tiempo favorecen microambientes para sustratos en los que prolifera la epiacutefita P lima (Lawrence et al 2000) quedando expuestas a re-suspensiones temporales que favorecen la filtracioacuten de estas microalgas por los bivalvos en cultivo (Maranda et al 2007a)

Chile posee escaso conocimiento sobre esta especie en su medio natural incluido su perfil de toxinas y potencial rol en la toxificacioacuten de moluscos por VDM Por tal razoacuten resultoacute interesante aportar al conocimiento de estos aspectos en muestras de sedimentos recolectadas en el estrecho de Magallanes en las que esta especie se encontroacute inhabitualmente abundante

Las ceacutelulas utilizadas en este estudio fueron aisladas desde sedimentos superficiales (0-3 cm) recolectados en el invierno de 2010 en la localidad de cabo San Isidro durante el muestreo regular del programa de monitoreo de marea roja en la regioacuten de Magallanes En esa oportunidad se logroacute cuantificar hasta 1002 quistes tecadoscm3 de Prorocentrum lima la mayor concentracioacuten respecto a otros sitios de recolecta (Fig 1) Los sedimentos de esta localidad presentaron una coloracioacuten oscura y un fuerte olor a sulfuro de hidroacutegeno (H2S) producto de anoxia local

Se aislaron entre 27 y 87 quistes tecados (Fig 1 a) directamente desde los sedimentos mientras otras 60 ceacutelulas vegetativas (Fig 1 b) fueron aisladas luego de promover la actividad y divisioacuten de los quistes en condiciones de 15 ordmC y un ciclo de luzoscuridad de 1212 horas (Tabla 1) Para este fin se aislaron quistes tecados y trasvasijaron a placas Petri de 5 cm de diaacutemetro conteniendo 5 mL de medio de cultivo L1 Para el anaacutelisis de toxinas las ceacutelulas aisladas fueron trasvasijadas a un tubo Eppendorf de 15 mL y congelados a -80 ordmC Una aliacutecuota de sedimento huacutemedo (100 microL aproximados) tambieacuten fue vaciada en un tubo Eppendorf y congelado Para extraer la toxina se antildeadioacute 500 microL de metanol 100 a cada tubo se mezcloacute por 1 min y filtroacute por 045 microm trasvasijando a un vial El extracto fue secado bajo nitroacutegeno gas a 40 ordmC y conservado a 4 ordmC hasta su anaacutelisis Previo al anaacutelisis de toxinas los extractos fueron resuspendidos en 150 microl de metanol

La presencia de la toxina dinofisistoxina 1 (DTX-1) en las muestras (Fig2) fue confirmada en modo negativo a traveacutes de su ioacuten precursor [M-H]- mz 8175 y sus iones productos mz 5634 y 2552 mediante un cromatoacutegrafo UPLC Acquity Waters acoplado a un triple cuadrupolo Waters Xevo TQ (LC-MS) La columna utilizada fue una Acquity UPLC BEH C18 17microm 21 x 100 mm a 45 ordmC La fase moacutevil consistioacute en (A) hidroacutexido amoacutenico a pH 11 y (B) hidroacutexido amoacutenico en acetonitrilo (67 mM) con una tasa de flujo de 4 mLmin El gradiente de elucioacuten utilizado fue el siguiente mantencioacuten al 75 de A entre 0 y 066 min cambio a 5 de A entre 066 y 330 min mantener 5

de A entre 330 y 528 min recuperacioacuten del 75 de A entre 528 y 726 min mantencioacuten al 75 de A hasta 9 min Se pinchoacute 5microL de muestra en el LC-MS El contenido de DTX-1 en las muestras fue cuantificado en base al ion precursor

Los tres tipos de muestras fueron positivas a la presencia de DTX-1 pero las ceacutelulas vegetativas fueron las que presentaron un mayor contenido de DTX-1 por ceacutelula La deteccioacuten de DTX-1 en los sedimentos (Tabla 2) reflejoacute la presencia de los quistes tecados en eacutestos

Figura 1 Concentraciones de quistes tecados de Prorocentrum lima (quistescm3 de sedimento huacutemedo) en estaciones de muestreo en el Estrecho de Magallanes (M26 Estero Wickham M29N1 Isla Engenfield M31 Bahiacutea Nash M35 Cabo San Isidro M39C1 Bahiacutea Gente Grande M39C2 Bahiacutea Inuacutetil M39C3 Canal Gabriel) y Canal Beagle (M41 Ventisquero Espantildea M42 Ventisquero Holanda) (a) Quistes tecados (b) ceacutelulas vegetativas obtenidas de germinacioacuten de quistes tecados bajo condiciones de laboratorio Barra de escala 20 microm

Tabla 1 Sedimento y ceacutelulas de Prorocentrum lima aisladas para anaacutelisis de toxinas

Extracto metanoacutelico Nordm de ceacutelulas TR ngmL pg DTX-1 ceacutel

G1 quistes tecados 27 213 lt2 -

G2 quistes tecados 67 214 05 11

G3 quistes tecados 87 215 12 21

G4 ceacutelulas vegetativas 60 215 34 87

G6 sedimentos aliacutecuota 213 13 19 pg microL sed

TR tiempo de retencioacuten

Figura 2 Cromatogramas de extractos metanoacutelicos de Prorocentrum lima quistes tecados (a) ceacutelulas vegetativas (b) y sedimentos (c)

Tabla 2 Caracteriacutesticas del sedimento con quistes tecados de Prorocentrum lima

Tipo Tamantildeo (mm)

Grava 2 35

Arena media 025 - 05 32

Arena muy fina 0063 - 0125 2

Limo-arcilla lt 0063 1

Estos resultados constituyen otra eventual posibilidad de toxicidad en los moluscos por VDM no soacutelo de aquellos con modalidad de vida bentoacutenica superficial sino de aquellos que tambieacuten viven enterrados en la arena (eg almeja huepo) Maacutes auacuten si se conoce que P lima posee la capacidad de desarrollar poblaciones naturales en aguas templadas en nuacutemeros que podriacutean justificar una toxicidad por VDM en los mariscos (eg Maranda et al 2007a b)

Referencias

Bravo I ML Fernaacutendez I Ramilo amp A Martinez 2001 Toxin composition of the toxic dinofagellate Prorocentrum lima isolated from different locations along the Galician coast (NW Spain) Toxicon 39 1537ndash1545

Faust MA 1991 Morphology of ciguatera-causing Prorocentrum lima (Pyrrophyta) from widely differing sites J Phycol 27 642-648

Lawrence J E Grant J Quilliam M A Bauder A G amp Cembella A D 2000 Colonizaition and growth of the toxic dinoflagellate Prorocentrum lima and associated fouling macroalgae on mussels in suspended culture Mar Ecol Prog Ser 201 147-154

Levasseur M Couture J Y Weise A M Michaud S Elbrachter M Sauveacute G amp Bonneau E 2003 Pelagic and epiphytic summer distributions of Prorocentrum lima and P mexicanum at two mussel farms in the Gulf of St Lawrence Aquat Microbiol Ecol 30283-293

Maranda L Corwin S Dover S amp Morton S L 2007a Prorocentrum lima (Dinophyceae) in northeastern USA coastal waters II Toxin load in the epibiota and in shellfish Harmful Algae 6 632-641

Maranda L Corwin S Hargraves P E 2007b Prorocentrum lima (Dinophyceae) in 19 northeastern USA coastal waters I Abundance and distribution Harmful Algae 6 623ndash631

Quilliam MA Gilgan MW amp Pleasance S 1993 Confirmation of an incident of diarrhetic shellfish poisoning in eastern Canada In Smayda TJ Shimizu Y (Eds) Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea Elsevier New York pp 547ndash552

Suzuki T Ota H amp Yamasaki M 1999 Direct evidence of transformation of dinophysistoxin-1 to 7-O-acyl-dinophysistoxin-1 (Dinophysis-3) in the scallop Patinopecten yessoensis Toxicon 37 187-198

Vale P amp Sampayo M A 2002 First confirmation of human diarrhoeic poisonings by okadaic acid esters after ingestion of razor clams (Solen marginatus) and green crabs (Carcinus maenas) in Aveiro lagoon Portugal and detection of okadaic acid esters in phytoplankton Toxicon 40989-996

Vale P Veloso V amp Amorim A 2009 Toxin composition of a Prorocentrum lima strain isolated from the Portuguese coast Toxicon 54145ndash152

Agradecimientos Intecmar de la Xunta de Galicia Espantildea donde se realizaron los anaacutelisis de toxinas proyecto

SUBPESCA ldquoManejo y Monitoreo de Mareas Rojas en las regiones de Los Lagos Ayseacuten y Magallanes IV etapa 2010rdquo

ANEXO 4

Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten

ANEXO 5

Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de Magallanes

TASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

O

EJE

MP

LA

R P

AR

A E

L IN

TE

RE

SA

DO

LIQ

UID

AC

IOacuteN

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

EN

TID

AD

BA

NC

AR

IATASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

0 9

4 0

2 4INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

AD

MIN

IST

RA

CIOacute

NTASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

9520 euros

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

CONSELLERIA DE FACENDA

ANEXO 6

Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para cierre

de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

Seccioacuten Ediciones y Produccioacuten Almte Manuel Blanco Encalada 839

Fono 56-32-2151500 Valparaiacuteso Chile

wwwifopcl

Page 35: “Análisis de toxinas lipofílicas mediante LC-MS/MS en ...metadatos.mma.gob.cl/sinia/Informe_final_Analisis_toxinas_lipofilicas_656-055.pdfSUBSECRETARÍA DE ECONOMÍA: INFORME FINAL:

ANEXO 1

Certificacioacuten laboratorio INTECMAR

ANEXO 2

Lista de anaacutelisis que realiza INTECMAR y sus costos (en euros) 2013

scv 1 de 7

GUIA PARA LA AUTOLIQUIDACIOacuteN DE TASAS A FAVOR DE LA COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA 2013 Los aspectos financieros de los servicios prestados por Intecmar en el marco de su actividad e vienen regulados en la Ley 62003 de 9 de diciembre de tasas precios y exenciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia (DOG nuacutem 240 de 11122003) y fueron actualizados posteriormente en la Ley 142010 de 27 de diciembre de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2011 (DOG nuacutem 250 de 30122010) y en la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013 (DOG nuacutem 42 de 28022013) Existen dos maneras de liquidar las tasas correspondientes a los servicios prestados por Intecmar

1 De forma manual cubriendo el modelo A de autoliquidacioacuten que se descarga en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda y que adjunto en pdf y se lleva al banco para su pago httpwwwconselleriadefacendaeswebportalconfeccion-impresos

2 De forma telemaacutetica en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda viacutenculo httpshostcixtecesXEITObinlionwebXeitodllxmit a traveacutes del modelo 730

Ambos modelos de liquidacioacuten de tasas adjuntamos ejemplo al final de este documento deben ser remitidos por mail a Intecmar con el sello del banco fiacutesico o virtual como paso previo a la emisioacuten del certificado Los coacutedigos generales necesarios son

minus Consejeriacutea de Medio Rural y de Mar Coacutedigo 09 minus Delegacioacuten de Pontevedra Coacutedigo 40 minus Servicio de Intecmar Coacutedigo 24

Los coacutedigos y descripcioacuten de las tasas son los regulados en la legislacioacuten vigente y los hemos resumido en los anexos siguientes Vilaxoaacuten 4 de marzo de 2013

scv 2 de 7

TARIFAS DE TASAS VIGENTES PARA 2013 - Ley 22013 d e 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013

(DOG nuacutem 42 de 28022013)

Estas tarifas son consecuencia de la actualizacioacuten de las tarifas contenidas en los anexos 1 2 3 4 y 5 de la Ley 62003 del 9 de diciembre de tasas precios y exacciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia por la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 Seraacuten aplicables desde el diacutea de la entrada en vigor de la Ley de

presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 TASA POR SERVICIOS ADMINISTRATIVOS

No sujecioacuten No se exigiraacute la tasa por servicios administrativos cuando se trate de compulsas o cotejos de documentos que deban acompantildear a solicitudes escritos o comunicaciones presentadas por el ciudadano y realizadas en el aacutembito de actuacioacuten de los registros seguacuten lo dispuesto en el artiacuteculo 385 de la Ley 301992 del 26 de noviembre de reacutegimen juriacutedico de las administraciones puacuteblicas y del procedimiento administrativo comuacuten

Excepciones Estaraacuten exentos de la presente tasa

1- La expedicioacuten de certificados de retribuciones satisfechas por la Xunta de Galicia con el objeto de justificacioacuten en relacioacuten con el impuesto sobre la renta de las personas fiacutesicas

2- La expedicioacuten de certificados y compulsa que el personal de la Administracioacuten solicite respecto a las necesidades propias del puesto de trabajo o relacioacuten de servicios

3- Los alumnos por cualquier actuacioacuten en materia de ensentildeanzas no universitarias

scv 3 de 7

4- Las compulsas realizadas en las oficinas de empleo para los desempleados en la tramitacioacuten de expedientes que sean competencia de dichas oficinas

5 La inscripcioacuten en las convocatorias para a seleccioacuten de personal de la comunidad autoacutenoma despueacutes de justificacioacuten documental solicitada por

- Personas con discapacidad igual o superior al 33 - Personas que sean miembros de familias numerosas clasificadas en la

categoriacutea especial Se aplicaraacute una bonificacioacuten del 50 a la inscripcioacuten solicitada por - Personas que sean miembros de familias numerosas de categoriacutea

general - Personas que figurasen como demandantes de empleo desde por lo

menos seis meses antes a la fecha de la convocatoria de pruebas selectivas de personal en las que soliciten su participacioacuten y no esteacuten percibiendo prestacioacuten o subsidio por desempleo

6- La expedicioacuten de certificados relativos a la situacioacuten fiscal 7- El Estado y los demaacutes entes puacuteblicos territoriales o institucionales

siempre que los servicios o actividades de que sean beneficiarios se presten o se realicen en el marco del principio de colaboracioacuten entre administraciones

8- Las viacutectimas de actos terroristas asiacute como sus coacutenyuges y sus hijos por cualquier actuacioacuten en materia educativa realizada en centros oficiales de estudios en todos los niveles de ensentildeanza

9- Los miembros de los organismos consultivos de la Administracioacuten puacuteblica gallega respecto de los certificados emitidos por dichos organismos

COacuteDIGO TASAS

DESCRIPCIOacuteN IMPORTE euro

314400 Prestacioacuten de servicios en el Instituto Tecnoloacutegico para el Control del Medio Marino de Galicia

314401 Anaacutelisis de biotoxinas marinas en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de Yasumoto 1978 4752

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en rato segundo o meacutetodo de Yasumoto 1984 5432

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS)

9520 -Anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten

seguacuten el meacutetodo de la AOAC 4752

scv 4 de 7

-Anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo da AOAC 4752

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1978 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10186

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1984 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10865

-Anaacutelisis combinada en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS) anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo AOAC y anaacutelisis de toxicidad de tipo ASP por cromatografiacutea liquida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo de la AOAC 15000

314402 Anaacutelisis de muestras en agua de mar -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton marino mediante

microscopiacutea oacuteptica 15133 -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton toacutexico marino

mediante microscopiacutea oacuteptica 13333 - Anaacutelisis de carbono orgaacutenico disuelto 5093 -Anaacutelisis de nutrientes inorgaacutenicos disueltos 3500 -Anaacutelisis de pigmentos fotosinteacuteticos (clorofila ldquoardquo) por

espectrofluorimetria 1698 314403 Anaacutelisis microbioloacutegicos en moluscos y otros organismos

procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Cuantificacioacuten de E Coli 10186 - Deteccioacuten de Salmonella spp 16975 -Enumeracioacuten de Escherichia coli en moluscos bivalvos

vivos por la teacutecnica de medida directa de impedancia con el sistema BacTrac 4300 6800

314404 Anaacutelisis de contaminantes de origen quiacutemica en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Determinacioacuten de metales pesados (Pb Cd Cu Zn As Hg Ni Cr Ag) mediante espectrofotometriacutea de absorcioacuten atoacutemica por metal

6790

-Determinacioacuten de compuestos bifenilos policlorados (PCB) mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

scv 5 de 7

-Determinacioacuten de pesticidas organoclorados mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

-Determinacioacuten de hidrocarburos aromaacuteticos policiacuteclicos (HAPs) mediante cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de fluorescencia

28200

314405 Anaacutelisis histopatoloacutegica de moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Estudio hispatoloacutegico Determinacioacuten de Bonamia Marteillia Perkinsus y otras alteraciones patoloacutegicas

101852

314406 Emisioacuten de certificaciones e informes teacutecnicos y otras actuaciones a peticioacuten del interesado

Emisioacuten de certificados a peticioacuten de los interesados sobre las actuaciones llevadas a cabo por el Instituto

1000

Emisioacuten de informes teacutecnicos a peticioacuten del interesado (euros por hora o fraccioacuten)

4000

scv 6 de 7

scv 7 de 7

ANEXO 3

Resultados de anaacutelisis en muestras de microalgas anteriormente enviadas procedentes de Magallanes por el equipo de espectrometriacutea de masas utilizado por INTECMAR Trabajo presentado a las XXXII

Congreso de Ciencias del Mar realizado en Punta Arenas 22-25 octubre de 2012

PERFIL DE TOXINAS DE PROROCENTRUM LIMA (DINOPHYCEAE) AISLADO DESDE LA COSTA DE MAGALLANES SUR DE CHILE P Salgado1 G Pizarro1 JM Franco2 P Rioboacute2 e I Bravo3

1Instituto de Fomento Pesquero (IFOP) Punta Arenas Chile gemitapizarroifopcl 2Instituto de Investigaciones Marinas (CSIC) Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea 3Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea

Prorocentrum lima (Ehrenberg) es un dinoflagelado marino bentoacutenico que se encuentra adherido generalmente

sobre macroalgas sedimentos y detrito flotante y menos comuacutenmente en el plancton (Bravo et al 2001) Es una especie neriacutetica y estuarina y su rango de distribucioacuten geograacutefica variacutea desde aguas costeras tropicales a templadas (Faust 1991) La importancia de P lima se debe a que son productoras de toxinas diarreogeacutenicas en las personas (veneno diarreico de los mariscos VDM) al igual que algunas especies de Dinophysis aunque raramente se le han asociado con episodios toacutexicos por VDM por su caraacutecter epiacutefito y bentoacutenico El complejo VDM producido por P lima incluye moleacuteculas conocidas como el aacutecido okadaico (AO) y derivados dinofisistoxinas (DTX-1 DTX-2) (Bravo et al 2001 Vale et al 2009) No obstante existen casos citados para USA donde se detectoacute toxicidad por VDM en bivalvos de cultivos asociadas a P lima aunque en bajos niveles (Maranda et al 2007a) En Canadaacute tambieacuten se llevoacute a cabo un estudio en moluscos de cultivo cuya finalidad fue determinar el origen del VDM en la que P lima fue la principal especie sospechosa tras la ocurrencia de un evento toacutexico humano por VDM ocurrido en 1998 (Levasseur et al 2003) y en antildeos anteriores (Quilliam et al 1993) Aunque Levasseur et al (2003) no logroacute probar la toxicidad de los mariscos en cultivo a causa de P lima cabe hacer notar que lo que buscaron fue OA y DTX1 no DTX 3 este uacuteltimo principal derivado de las anteriores tras su transformacioacuten en los moluscos (eg Suzuki et al 1999 Vale amp Sampayo 2002)

En consecuencia el rol de P lima en eventos toacutexicos por VDM auacuten no puede descartarse por cuanto podriacutean llegar a ser importantes en ambientes turbulentos debido a la eventual remocioacuten de microalgas adheridas en sustratos por efecto de vientos (Levasseur et al 2003) factor de importancia si se trata de sedimentos o contrariamente en zonas someras y estables de cultivos de moluscos que al mismo tiempo favorecen microambientes para sustratos en los que prolifera la epiacutefita P lima (Lawrence et al 2000) quedando expuestas a re-suspensiones temporales que favorecen la filtracioacuten de estas microalgas por los bivalvos en cultivo (Maranda et al 2007a)

Chile posee escaso conocimiento sobre esta especie en su medio natural incluido su perfil de toxinas y potencial rol en la toxificacioacuten de moluscos por VDM Por tal razoacuten resultoacute interesante aportar al conocimiento de estos aspectos en muestras de sedimentos recolectadas en el estrecho de Magallanes en las que esta especie se encontroacute inhabitualmente abundante

Las ceacutelulas utilizadas en este estudio fueron aisladas desde sedimentos superficiales (0-3 cm) recolectados en el invierno de 2010 en la localidad de cabo San Isidro durante el muestreo regular del programa de monitoreo de marea roja en la regioacuten de Magallanes En esa oportunidad se logroacute cuantificar hasta 1002 quistes tecadoscm3 de Prorocentrum lima la mayor concentracioacuten respecto a otros sitios de recolecta (Fig 1) Los sedimentos de esta localidad presentaron una coloracioacuten oscura y un fuerte olor a sulfuro de hidroacutegeno (H2S) producto de anoxia local

Se aislaron entre 27 y 87 quistes tecados (Fig 1 a) directamente desde los sedimentos mientras otras 60 ceacutelulas vegetativas (Fig 1 b) fueron aisladas luego de promover la actividad y divisioacuten de los quistes en condiciones de 15 ordmC y un ciclo de luzoscuridad de 1212 horas (Tabla 1) Para este fin se aislaron quistes tecados y trasvasijaron a placas Petri de 5 cm de diaacutemetro conteniendo 5 mL de medio de cultivo L1 Para el anaacutelisis de toxinas las ceacutelulas aisladas fueron trasvasijadas a un tubo Eppendorf de 15 mL y congelados a -80 ordmC Una aliacutecuota de sedimento huacutemedo (100 microL aproximados) tambieacuten fue vaciada en un tubo Eppendorf y congelado Para extraer la toxina se antildeadioacute 500 microL de metanol 100 a cada tubo se mezcloacute por 1 min y filtroacute por 045 microm trasvasijando a un vial El extracto fue secado bajo nitroacutegeno gas a 40 ordmC y conservado a 4 ordmC hasta su anaacutelisis Previo al anaacutelisis de toxinas los extractos fueron resuspendidos en 150 microl de metanol

La presencia de la toxina dinofisistoxina 1 (DTX-1) en las muestras (Fig2) fue confirmada en modo negativo a traveacutes de su ioacuten precursor [M-H]- mz 8175 y sus iones productos mz 5634 y 2552 mediante un cromatoacutegrafo UPLC Acquity Waters acoplado a un triple cuadrupolo Waters Xevo TQ (LC-MS) La columna utilizada fue una Acquity UPLC BEH C18 17microm 21 x 100 mm a 45 ordmC La fase moacutevil consistioacute en (A) hidroacutexido amoacutenico a pH 11 y (B) hidroacutexido amoacutenico en acetonitrilo (67 mM) con una tasa de flujo de 4 mLmin El gradiente de elucioacuten utilizado fue el siguiente mantencioacuten al 75 de A entre 0 y 066 min cambio a 5 de A entre 066 y 330 min mantener 5

de A entre 330 y 528 min recuperacioacuten del 75 de A entre 528 y 726 min mantencioacuten al 75 de A hasta 9 min Se pinchoacute 5microL de muestra en el LC-MS El contenido de DTX-1 en las muestras fue cuantificado en base al ion precursor

Los tres tipos de muestras fueron positivas a la presencia de DTX-1 pero las ceacutelulas vegetativas fueron las que presentaron un mayor contenido de DTX-1 por ceacutelula La deteccioacuten de DTX-1 en los sedimentos (Tabla 2) reflejoacute la presencia de los quistes tecados en eacutestos

Figura 1 Concentraciones de quistes tecados de Prorocentrum lima (quistescm3 de sedimento huacutemedo) en estaciones de muestreo en el Estrecho de Magallanes (M26 Estero Wickham M29N1 Isla Engenfield M31 Bahiacutea Nash M35 Cabo San Isidro M39C1 Bahiacutea Gente Grande M39C2 Bahiacutea Inuacutetil M39C3 Canal Gabriel) y Canal Beagle (M41 Ventisquero Espantildea M42 Ventisquero Holanda) (a) Quistes tecados (b) ceacutelulas vegetativas obtenidas de germinacioacuten de quistes tecados bajo condiciones de laboratorio Barra de escala 20 microm

Tabla 1 Sedimento y ceacutelulas de Prorocentrum lima aisladas para anaacutelisis de toxinas

Extracto metanoacutelico Nordm de ceacutelulas TR ngmL pg DTX-1 ceacutel

G1 quistes tecados 27 213 lt2 -

G2 quistes tecados 67 214 05 11

G3 quistes tecados 87 215 12 21

G4 ceacutelulas vegetativas 60 215 34 87

G6 sedimentos aliacutecuota 213 13 19 pg microL sed

TR tiempo de retencioacuten

Figura 2 Cromatogramas de extractos metanoacutelicos de Prorocentrum lima quistes tecados (a) ceacutelulas vegetativas (b) y sedimentos (c)

Tabla 2 Caracteriacutesticas del sedimento con quistes tecados de Prorocentrum lima

Tipo Tamantildeo (mm)

Grava 2 35

Arena media 025 - 05 32

Arena muy fina 0063 - 0125 2

Limo-arcilla lt 0063 1

Estos resultados constituyen otra eventual posibilidad de toxicidad en los moluscos por VDM no soacutelo de aquellos con modalidad de vida bentoacutenica superficial sino de aquellos que tambieacuten viven enterrados en la arena (eg almeja huepo) Maacutes auacuten si se conoce que P lima posee la capacidad de desarrollar poblaciones naturales en aguas templadas en nuacutemeros que podriacutean justificar una toxicidad por VDM en los mariscos (eg Maranda et al 2007a b)

Referencias

Bravo I ML Fernaacutendez I Ramilo amp A Martinez 2001 Toxin composition of the toxic dinofagellate Prorocentrum lima isolated from different locations along the Galician coast (NW Spain) Toxicon 39 1537ndash1545

Faust MA 1991 Morphology of ciguatera-causing Prorocentrum lima (Pyrrophyta) from widely differing sites J Phycol 27 642-648

Lawrence J E Grant J Quilliam M A Bauder A G amp Cembella A D 2000 Colonizaition and growth of the toxic dinoflagellate Prorocentrum lima and associated fouling macroalgae on mussels in suspended culture Mar Ecol Prog Ser 201 147-154

Levasseur M Couture J Y Weise A M Michaud S Elbrachter M Sauveacute G amp Bonneau E 2003 Pelagic and epiphytic summer distributions of Prorocentrum lima and P mexicanum at two mussel farms in the Gulf of St Lawrence Aquat Microbiol Ecol 30283-293

Maranda L Corwin S Dover S amp Morton S L 2007a Prorocentrum lima (Dinophyceae) in northeastern USA coastal waters II Toxin load in the epibiota and in shellfish Harmful Algae 6 632-641

Maranda L Corwin S Hargraves P E 2007b Prorocentrum lima (Dinophyceae) in 19 northeastern USA coastal waters I Abundance and distribution Harmful Algae 6 623ndash631

Quilliam MA Gilgan MW amp Pleasance S 1993 Confirmation of an incident of diarrhetic shellfish poisoning in eastern Canada In Smayda TJ Shimizu Y (Eds) Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea Elsevier New York pp 547ndash552

Suzuki T Ota H amp Yamasaki M 1999 Direct evidence of transformation of dinophysistoxin-1 to 7-O-acyl-dinophysistoxin-1 (Dinophysis-3) in the scallop Patinopecten yessoensis Toxicon 37 187-198

Vale P amp Sampayo M A 2002 First confirmation of human diarrhoeic poisonings by okadaic acid esters after ingestion of razor clams (Solen marginatus) and green crabs (Carcinus maenas) in Aveiro lagoon Portugal and detection of okadaic acid esters in phytoplankton Toxicon 40989-996

Vale P Veloso V amp Amorim A 2009 Toxin composition of a Prorocentrum lima strain isolated from the Portuguese coast Toxicon 54145ndash152

Agradecimientos Intecmar de la Xunta de Galicia Espantildea donde se realizaron los anaacutelisis de toxinas proyecto

SUBPESCA ldquoManejo y Monitoreo de Mareas Rojas en las regiones de Los Lagos Ayseacuten y Magallanes IV etapa 2010rdquo

ANEXO 4

Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten

ANEXO 5

Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de Magallanes

TASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

O

EJE

MP

LA

R P

AR

A E

L IN

TE

RE

SA

DO

LIQ

UID

AC

IOacuteN

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

EN

TID

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BA

NC

AR

IATASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

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Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

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OL

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N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

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NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

0 9

4 0

2 4INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

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MIN

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RA

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NTASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

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N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

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NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

9520 euros

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

CONSELLERIA DE FACENDA

ANEXO 6

Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para cierre

de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

Seccioacuten Ediciones y Produccioacuten Almte Manuel Blanco Encalada 839

Fono 56-32-2151500 Valparaiacuteso Chile

wwwifopcl

Page 36: “Análisis de toxinas lipofílicas mediante LC-MS/MS en ...metadatos.mma.gob.cl/sinia/Informe_final_Analisis_toxinas_lipofilicas_656-055.pdfSUBSECRETARÍA DE ECONOMÍA: INFORME FINAL:

ANEXO 2

Lista de anaacutelisis que realiza INTECMAR y sus costos (en euros) 2013

scv 1 de 7

GUIA PARA LA AUTOLIQUIDACIOacuteN DE TASAS A FAVOR DE LA COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA 2013 Los aspectos financieros de los servicios prestados por Intecmar en el marco de su actividad e vienen regulados en la Ley 62003 de 9 de diciembre de tasas precios y exenciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia (DOG nuacutem 240 de 11122003) y fueron actualizados posteriormente en la Ley 142010 de 27 de diciembre de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2011 (DOG nuacutem 250 de 30122010) y en la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013 (DOG nuacutem 42 de 28022013) Existen dos maneras de liquidar las tasas correspondientes a los servicios prestados por Intecmar

1 De forma manual cubriendo el modelo A de autoliquidacioacuten que se descarga en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda y que adjunto en pdf y se lleva al banco para su pago httpwwwconselleriadefacendaeswebportalconfeccion-impresos

2 De forma telemaacutetica en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda viacutenculo httpshostcixtecesXEITObinlionwebXeitodllxmit a traveacutes del modelo 730

Ambos modelos de liquidacioacuten de tasas adjuntamos ejemplo al final de este documento deben ser remitidos por mail a Intecmar con el sello del banco fiacutesico o virtual como paso previo a la emisioacuten del certificado Los coacutedigos generales necesarios son

minus Consejeriacutea de Medio Rural y de Mar Coacutedigo 09 minus Delegacioacuten de Pontevedra Coacutedigo 40 minus Servicio de Intecmar Coacutedigo 24

Los coacutedigos y descripcioacuten de las tasas son los regulados en la legislacioacuten vigente y los hemos resumido en los anexos siguientes Vilaxoaacuten 4 de marzo de 2013

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TARIFAS DE TASAS VIGENTES PARA 2013 - Ley 22013 d e 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013

(DOG nuacutem 42 de 28022013)

Estas tarifas son consecuencia de la actualizacioacuten de las tarifas contenidas en los anexos 1 2 3 4 y 5 de la Ley 62003 del 9 de diciembre de tasas precios y exacciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia por la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 Seraacuten aplicables desde el diacutea de la entrada en vigor de la Ley de

presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 TASA POR SERVICIOS ADMINISTRATIVOS

No sujecioacuten No se exigiraacute la tasa por servicios administrativos cuando se trate de compulsas o cotejos de documentos que deban acompantildear a solicitudes escritos o comunicaciones presentadas por el ciudadano y realizadas en el aacutembito de actuacioacuten de los registros seguacuten lo dispuesto en el artiacuteculo 385 de la Ley 301992 del 26 de noviembre de reacutegimen juriacutedico de las administraciones puacuteblicas y del procedimiento administrativo comuacuten

Excepciones Estaraacuten exentos de la presente tasa

1- La expedicioacuten de certificados de retribuciones satisfechas por la Xunta de Galicia con el objeto de justificacioacuten en relacioacuten con el impuesto sobre la renta de las personas fiacutesicas

2- La expedicioacuten de certificados y compulsa que el personal de la Administracioacuten solicite respecto a las necesidades propias del puesto de trabajo o relacioacuten de servicios

3- Los alumnos por cualquier actuacioacuten en materia de ensentildeanzas no universitarias

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4- Las compulsas realizadas en las oficinas de empleo para los desempleados en la tramitacioacuten de expedientes que sean competencia de dichas oficinas

5 La inscripcioacuten en las convocatorias para a seleccioacuten de personal de la comunidad autoacutenoma despueacutes de justificacioacuten documental solicitada por

- Personas con discapacidad igual o superior al 33 - Personas que sean miembros de familias numerosas clasificadas en la

categoriacutea especial Se aplicaraacute una bonificacioacuten del 50 a la inscripcioacuten solicitada por - Personas que sean miembros de familias numerosas de categoriacutea

general - Personas que figurasen como demandantes de empleo desde por lo

menos seis meses antes a la fecha de la convocatoria de pruebas selectivas de personal en las que soliciten su participacioacuten y no esteacuten percibiendo prestacioacuten o subsidio por desempleo

6- La expedicioacuten de certificados relativos a la situacioacuten fiscal 7- El Estado y los demaacutes entes puacuteblicos territoriales o institucionales

siempre que los servicios o actividades de que sean beneficiarios se presten o se realicen en el marco del principio de colaboracioacuten entre administraciones

8- Las viacutectimas de actos terroristas asiacute como sus coacutenyuges y sus hijos por cualquier actuacioacuten en materia educativa realizada en centros oficiales de estudios en todos los niveles de ensentildeanza

9- Los miembros de los organismos consultivos de la Administracioacuten puacuteblica gallega respecto de los certificados emitidos por dichos organismos

COacuteDIGO TASAS

DESCRIPCIOacuteN IMPORTE euro

314400 Prestacioacuten de servicios en el Instituto Tecnoloacutegico para el Control del Medio Marino de Galicia

314401 Anaacutelisis de biotoxinas marinas en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de Yasumoto 1978 4752

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en rato segundo o meacutetodo de Yasumoto 1984 5432

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS)

9520 -Anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten

seguacuten el meacutetodo de la AOAC 4752

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-Anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo da AOAC 4752

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1978 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10186

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1984 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10865

-Anaacutelisis combinada en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS) anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo AOAC y anaacutelisis de toxicidad de tipo ASP por cromatografiacutea liquida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo de la AOAC 15000

314402 Anaacutelisis de muestras en agua de mar -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton marino mediante

microscopiacutea oacuteptica 15133 -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton toacutexico marino

mediante microscopiacutea oacuteptica 13333 - Anaacutelisis de carbono orgaacutenico disuelto 5093 -Anaacutelisis de nutrientes inorgaacutenicos disueltos 3500 -Anaacutelisis de pigmentos fotosinteacuteticos (clorofila ldquoardquo) por

espectrofluorimetria 1698 314403 Anaacutelisis microbioloacutegicos en moluscos y otros organismos

procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Cuantificacioacuten de E Coli 10186 - Deteccioacuten de Salmonella spp 16975 -Enumeracioacuten de Escherichia coli en moluscos bivalvos

vivos por la teacutecnica de medida directa de impedancia con el sistema BacTrac 4300 6800

314404 Anaacutelisis de contaminantes de origen quiacutemica en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Determinacioacuten de metales pesados (Pb Cd Cu Zn As Hg Ni Cr Ag) mediante espectrofotometriacutea de absorcioacuten atoacutemica por metal

6790

-Determinacioacuten de compuestos bifenilos policlorados (PCB) mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

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-Determinacioacuten de pesticidas organoclorados mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

-Determinacioacuten de hidrocarburos aromaacuteticos policiacuteclicos (HAPs) mediante cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de fluorescencia

28200

314405 Anaacutelisis histopatoloacutegica de moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Estudio hispatoloacutegico Determinacioacuten de Bonamia Marteillia Perkinsus y otras alteraciones patoloacutegicas

101852

314406 Emisioacuten de certificaciones e informes teacutecnicos y otras actuaciones a peticioacuten del interesado

Emisioacuten de certificados a peticioacuten de los interesados sobre las actuaciones llevadas a cabo por el Instituto

1000

Emisioacuten de informes teacutecnicos a peticioacuten del interesado (euros por hora o fraccioacuten)

4000

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ANEXO 3

Resultados de anaacutelisis en muestras de microalgas anteriormente enviadas procedentes de Magallanes por el equipo de espectrometriacutea de masas utilizado por INTECMAR Trabajo presentado a las XXXII

Congreso de Ciencias del Mar realizado en Punta Arenas 22-25 octubre de 2012

PERFIL DE TOXINAS DE PROROCENTRUM LIMA (DINOPHYCEAE) AISLADO DESDE LA COSTA DE MAGALLANES SUR DE CHILE P Salgado1 G Pizarro1 JM Franco2 P Rioboacute2 e I Bravo3

1Instituto de Fomento Pesquero (IFOP) Punta Arenas Chile gemitapizarroifopcl 2Instituto de Investigaciones Marinas (CSIC) Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea 3Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea

Prorocentrum lima (Ehrenberg) es un dinoflagelado marino bentoacutenico que se encuentra adherido generalmente

sobre macroalgas sedimentos y detrito flotante y menos comuacutenmente en el plancton (Bravo et al 2001) Es una especie neriacutetica y estuarina y su rango de distribucioacuten geograacutefica variacutea desde aguas costeras tropicales a templadas (Faust 1991) La importancia de P lima se debe a que son productoras de toxinas diarreogeacutenicas en las personas (veneno diarreico de los mariscos VDM) al igual que algunas especies de Dinophysis aunque raramente se le han asociado con episodios toacutexicos por VDM por su caraacutecter epiacutefito y bentoacutenico El complejo VDM producido por P lima incluye moleacuteculas conocidas como el aacutecido okadaico (AO) y derivados dinofisistoxinas (DTX-1 DTX-2) (Bravo et al 2001 Vale et al 2009) No obstante existen casos citados para USA donde se detectoacute toxicidad por VDM en bivalvos de cultivos asociadas a P lima aunque en bajos niveles (Maranda et al 2007a) En Canadaacute tambieacuten se llevoacute a cabo un estudio en moluscos de cultivo cuya finalidad fue determinar el origen del VDM en la que P lima fue la principal especie sospechosa tras la ocurrencia de un evento toacutexico humano por VDM ocurrido en 1998 (Levasseur et al 2003) y en antildeos anteriores (Quilliam et al 1993) Aunque Levasseur et al (2003) no logroacute probar la toxicidad de los mariscos en cultivo a causa de P lima cabe hacer notar que lo que buscaron fue OA y DTX1 no DTX 3 este uacuteltimo principal derivado de las anteriores tras su transformacioacuten en los moluscos (eg Suzuki et al 1999 Vale amp Sampayo 2002)

En consecuencia el rol de P lima en eventos toacutexicos por VDM auacuten no puede descartarse por cuanto podriacutean llegar a ser importantes en ambientes turbulentos debido a la eventual remocioacuten de microalgas adheridas en sustratos por efecto de vientos (Levasseur et al 2003) factor de importancia si se trata de sedimentos o contrariamente en zonas someras y estables de cultivos de moluscos que al mismo tiempo favorecen microambientes para sustratos en los que prolifera la epiacutefita P lima (Lawrence et al 2000) quedando expuestas a re-suspensiones temporales que favorecen la filtracioacuten de estas microalgas por los bivalvos en cultivo (Maranda et al 2007a)

Chile posee escaso conocimiento sobre esta especie en su medio natural incluido su perfil de toxinas y potencial rol en la toxificacioacuten de moluscos por VDM Por tal razoacuten resultoacute interesante aportar al conocimiento de estos aspectos en muestras de sedimentos recolectadas en el estrecho de Magallanes en las que esta especie se encontroacute inhabitualmente abundante

Las ceacutelulas utilizadas en este estudio fueron aisladas desde sedimentos superficiales (0-3 cm) recolectados en el invierno de 2010 en la localidad de cabo San Isidro durante el muestreo regular del programa de monitoreo de marea roja en la regioacuten de Magallanes En esa oportunidad se logroacute cuantificar hasta 1002 quistes tecadoscm3 de Prorocentrum lima la mayor concentracioacuten respecto a otros sitios de recolecta (Fig 1) Los sedimentos de esta localidad presentaron una coloracioacuten oscura y un fuerte olor a sulfuro de hidroacutegeno (H2S) producto de anoxia local

Se aislaron entre 27 y 87 quistes tecados (Fig 1 a) directamente desde los sedimentos mientras otras 60 ceacutelulas vegetativas (Fig 1 b) fueron aisladas luego de promover la actividad y divisioacuten de los quistes en condiciones de 15 ordmC y un ciclo de luzoscuridad de 1212 horas (Tabla 1) Para este fin se aislaron quistes tecados y trasvasijaron a placas Petri de 5 cm de diaacutemetro conteniendo 5 mL de medio de cultivo L1 Para el anaacutelisis de toxinas las ceacutelulas aisladas fueron trasvasijadas a un tubo Eppendorf de 15 mL y congelados a -80 ordmC Una aliacutecuota de sedimento huacutemedo (100 microL aproximados) tambieacuten fue vaciada en un tubo Eppendorf y congelado Para extraer la toxina se antildeadioacute 500 microL de metanol 100 a cada tubo se mezcloacute por 1 min y filtroacute por 045 microm trasvasijando a un vial El extracto fue secado bajo nitroacutegeno gas a 40 ordmC y conservado a 4 ordmC hasta su anaacutelisis Previo al anaacutelisis de toxinas los extractos fueron resuspendidos en 150 microl de metanol

La presencia de la toxina dinofisistoxina 1 (DTX-1) en las muestras (Fig2) fue confirmada en modo negativo a traveacutes de su ioacuten precursor [M-H]- mz 8175 y sus iones productos mz 5634 y 2552 mediante un cromatoacutegrafo UPLC Acquity Waters acoplado a un triple cuadrupolo Waters Xevo TQ (LC-MS) La columna utilizada fue una Acquity UPLC BEH C18 17microm 21 x 100 mm a 45 ordmC La fase moacutevil consistioacute en (A) hidroacutexido amoacutenico a pH 11 y (B) hidroacutexido amoacutenico en acetonitrilo (67 mM) con una tasa de flujo de 4 mLmin El gradiente de elucioacuten utilizado fue el siguiente mantencioacuten al 75 de A entre 0 y 066 min cambio a 5 de A entre 066 y 330 min mantener 5

de A entre 330 y 528 min recuperacioacuten del 75 de A entre 528 y 726 min mantencioacuten al 75 de A hasta 9 min Se pinchoacute 5microL de muestra en el LC-MS El contenido de DTX-1 en las muestras fue cuantificado en base al ion precursor

Los tres tipos de muestras fueron positivas a la presencia de DTX-1 pero las ceacutelulas vegetativas fueron las que presentaron un mayor contenido de DTX-1 por ceacutelula La deteccioacuten de DTX-1 en los sedimentos (Tabla 2) reflejoacute la presencia de los quistes tecados en eacutestos

Figura 1 Concentraciones de quistes tecados de Prorocentrum lima (quistescm3 de sedimento huacutemedo) en estaciones de muestreo en el Estrecho de Magallanes (M26 Estero Wickham M29N1 Isla Engenfield M31 Bahiacutea Nash M35 Cabo San Isidro M39C1 Bahiacutea Gente Grande M39C2 Bahiacutea Inuacutetil M39C3 Canal Gabriel) y Canal Beagle (M41 Ventisquero Espantildea M42 Ventisquero Holanda) (a) Quistes tecados (b) ceacutelulas vegetativas obtenidas de germinacioacuten de quistes tecados bajo condiciones de laboratorio Barra de escala 20 microm

Tabla 1 Sedimento y ceacutelulas de Prorocentrum lima aisladas para anaacutelisis de toxinas

Extracto metanoacutelico Nordm de ceacutelulas TR ngmL pg DTX-1 ceacutel

G1 quistes tecados 27 213 lt2 -

G2 quistes tecados 67 214 05 11

G3 quistes tecados 87 215 12 21

G4 ceacutelulas vegetativas 60 215 34 87

G6 sedimentos aliacutecuota 213 13 19 pg microL sed

TR tiempo de retencioacuten

Figura 2 Cromatogramas de extractos metanoacutelicos de Prorocentrum lima quistes tecados (a) ceacutelulas vegetativas (b) y sedimentos (c)

Tabla 2 Caracteriacutesticas del sedimento con quistes tecados de Prorocentrum lima

Tipo Tamantildeo (mm)

Grava 2 35

Arena media 025 - 05 32

Arena muy fina 0063 - 0125 2

Limo-arcilla lt 0063 1

Estos resultados constituyen otra eventual posibilidad de toxicidad en los moluscos por VDM no soacutelo de aquellos con modalidad de vida bentoacutenica superficial sino de aquellos que tambieacuten viven enterrados en la arena (eg almeja huepo) Maacutes auacuten si se conoce que P lima posee la capacidad de desarrollar poblaciones naturales en aguas templadas en nuacutemeros que podriacutean justificar una toxicidad por VDM en los mariscos (eg Maranda et al 2007a b)

Referencias

Bravo I ML Fernaacutendez I Ramilo amp A Martinez 2001 Toxin composition of the toxic dinofagellate Prorocentrum lima isolated from different locations along the Galician coast (NW Spain) Toxicon 39 1537ndash1545

Faust MA 1991 Morphology of ciguatera-causing Prorocentrum lima (Pyrrophyta) from widely differing sites J Phycol 27 642-648

Lawrence J E Grant J Quilliam M A Bauder A G amp Cembella A D 2000 Colonizaition and growth of the toxic dinoflagellate Prorocentrum lima and associated fouling macroalgae on mussels in suspended culture Mar Ecol Prog Ser 201 147-154

Levasseur M Couture J Y Weise A M Michaud S Elbrachter M Sauveacute G amp Bonneau E 2003 Pelagic and epiphytic summer distributions of Prorocentrum lima and P mexicanum at two mussel farms in the Gulf of St Lawrence Aquat Microbiol Ecol 30283-293

Maranda L Corwin S Dover S amp Morton S L 2007a Prorocentrum lima (Dinophyceae) in northeastern USA coastal waters II Toxin load in the epibiota and in shellfish Harmful Algae 6 632-641

Maranda L Corwin S Hargraves P E 2007b Prorocentrum lima (Dinophyceae) in 19 northeastern USA coastal waters I Abundance and distribution Harmful Algae 6 623ndash631

Quilliam MA Gilgan MW amp Pleasance S 1993 Confirmation of an incident of diarrhetic shellfish poisoning in eastern Canada In Smayda TJ Shimizu Y (Eds) Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea Elsevier New York pp 547ndash552

Suzuki T Ota H amp Yamasaki M 1999 Direct evidence of transformation of dinophysistoxin-1 to 7-O-acyl-dinophysistoxin-1 (Dinophysis-3) in the scallop Patinopecten yessoensis Toxicon 37 187-198

Vale P amp Sampayo M A 2002 First confirmation of human diarrhoeic poisonings by okadaic acid esters after ingestion of razor clams (Solen marginatus) and green crabs (Carcinus maenas) in Aveiro lagoon Portugal and detection of okadaic acid esters in phytoplankton Toxicon 40989-996

Vale P Veloso V amp Amorim A 2009 Toxin composition of a Prorocentrum lima strain isolated from the Portuguese coast Toxicon 54145ndash152

Agradecimientos Intecmar de la Xunta de Galicia Espantildea donde se realizaron los anaacutelisis de toxinas proyecto

SUBPESCA ldquoManejo y Monitoreo de Mareas Rojas en las regiones de Los Lagos Ayseacuten y Magallanes IV etapa 2010rdquo

ANEXO 4

Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten

ANEXO 5

Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de Magallanes

TASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

O

EJE

MP

LA

R P

AR

A E

L IN

TE

RE

SA

DO

LIQ

UID

AC

IOacuteN

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

EN

TID

AD

BA

NC

AR

IATASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

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PA

SIV

OL

IQU

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CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

0 9

4 0

2 4INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

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PA

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LA

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MIN

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CIOacute

NTASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

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N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

9520 euros

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

CONSELLERIA DE FACENDA

ANEXO 6

Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para cierre

de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

Seccioacuten Ediciones y Produccioacuten Almte Manuel Blanco Encalada 839

Fono 56-32-2151500 Valparaiacuteso Chile

wwwifopcl

Page 37: “Análisis de toxinas lipofílicas mediante LC-MS/MS en ...metadatos.mma.gob.cl/sinia/Informe_final_Analisis_toxinas_lipofilicas_656-055.pdfSUBSECRETARÍA DE ECONOMÍA: INFORME FINAL:

scv 1 de 7

GUIA PARA LA AUTOLIQUIDACIOacuteN DE TASAS A FAVOR DE LA COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA 2013 Los aspectos financieros de los servicios prestados por Intecmar en el marco de su actividad e vienen regulados en la Ley 62003 de 9 de diciembre de tasas precios y exenciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia (DOG nuacutem 240 de 11122003) y fueron actualizados posteriormente en la Ley 142010 de 27 de diciembre de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2011 (DOG nuacutem 250 de 30122010) y en la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013 (DOG nuacutem 42 de 28022013) Existen dos maneras de liquidar las tasas correspondientes a los servicios prestados por Intecmar

1 De forma manual cubriendo el modelo A de autoliquidacioacuten que se descarga en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda y que adjunto en pdf y se lleva al banco para su pago httpwwwconselleriadefacendaeswebportalconfeccion-impresos

2 De forma telemaacutetica en la Web de la Consejeriacutea de Hacienda viacutenculo httpshostcixtecesXEITObinlionwebXeitodllxmit a traveacutes del modelo 730

Ambos modelos de liquidacioacuten de tasas adjuntamos ejemplo al final de este documento deben ser remitidos por mail a Intecmar con el sello del banco fiacutesico o virtual como paso previo a la emisioacuten del certificado Los coacutedigos generales necesarios son

minus Consejeriacutea de Medio Rural y de Mar Coacutedigo 09 minus Delegacioacuten de Pontevedra Coacutedigo 40 minus Servicio de Intecmar Coacutedigo 24

Los coacutedigos y descripcioacuten de las tasas son los regulados en la legislacioacuten vigente y los hemos resumido en los anexos siguientes Vilaxoaacuten 4 de marzo de 2013

scv 2 de 7

TARIFAS DE TASAS VIGENTES PARA 2013 - Ley 22013 d e 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013

(DOG nuacutem 42 de 28022013)

Estas tarifas son consecuencia de la actualizacioacuten de las tarifas contenidas en los anexos 1 2 3 4 y 5 de la Ley 62003 del 9 de diciembre de tasas precios y exacciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia por la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 Seraacuten aplicables desde el diacutea de la entrada en vigor de la Ley de

presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 TASA POR SERVICIOS ADMINISTRATIVOS

No sujecioacuten No se exigiraacute la tasa por servicios administrativos cuando se trate de compulsas o cotejos de documentos que deban acompantildear a solicitudes escritos o comunicaciones presentadas por el ciudadano y realizadas en el aacutembito de actuacioacuten de los registros seguacuten lo dispuesto en el artiacuteculo 385 de la Ley 301992 del 26 de noviembre de reacutegimen juriacutedico de las administraciones puacuteblicas y del procedimiento administrativo comuacuten

Excepciones Estaraacuten exentos de la presente tasa

1- La expedicioacuten de certificados de retribuciones satisfechas por la Xunta de Galicia con el objeto de justificacioacuten en relacioacuten con el impuesto sobre la renta de las personas fiacutesicas

2- La expedicioacuten de certificados y compulsa que el personal de la Administracioacuten solicite respecto a las necesidades propias del puesto de trabajo o relacioacuten de servicios

3- Los alumnos por cualquier actuacioacuten en materia de ensentildeanzas no universitarias

scv 3 de 7

4- Las compulsas realizadas en las oficinas de empleo para los desempleados en la tramitacioacuten de expedientes que sean competencia de dichas oficinas

5 La inscripcioacuten en las convocatorias para a seleccioacuten de personal de la comunidad autoacutenoma despueacutes de justificacioacuten documental solicitada por

- Personas con discapacidad igual o superior al 33 - Personas que sean miembros de familias numerosas clasificadas en la

categoriacutea especial Se aplicaraacute una bonificacioacuten del 50 a la inscripcioacuten solicitada por - Personas que sean miembros de familias numerosas de categoriacutea

general - Personas que figurasen como demandantes de empleo desde por lo

menos seis meses antes a la fecha de la convocatoria de pruebas selectivas de personal en las que soliciten su participacioacuten y no esteacuten percibiendo prestacioacuten o subsidio por desempleo

6- La expedicioacuten de certificados relativos a la situacioacuten fiscal 7- El Estado y los demaacutes entes puacuteblicos territoriales o institucionales

siempre que los servicios o actividades de que sean beneficiarios se presten o se realicen en el marco del principio de colaboracioacuten entre administraciones

8- Las viacutectimas de actos terroristas asiacute como sus coacutenyuges y sus hijos por cualquier actuacioacuten en materia educativa realizada en centros oficiales de estudios en todos los niveles de ensentildeanza

9- Los miembros de los organismos consultivos de la Administracioacuten puacuteblica gallega respecto de los certificados emitidos por dichos organismos

COacuteDIGO TASAS

DESCRIPCIOacuteN IMPORTE euro

314400 Prestacioacuten de servicios en el Instituto Tecnoloacutegico para el Control del Medio Marino de Galicia

314401 Anaacutelisis de biotoxinas marinas en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de Yasumoto 1978 4752

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en rato segundo o meacutetodo de Yasumoto 1984 5432

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS)

9520 -Anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten

seguacuten el meacutetodo de la AOAC 4752

scv 4 de 7

-Anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo da AOAC 4752

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1978 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10186

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1984 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10865

-Anaacutelisis combinada en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS) anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo AOAC y anaacutelisis de toxicidad de tipo ASP por cromatografiacutea liquida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo de la AOAC 15000

314402 Anaacutelisis de muestras en agua de mar -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton marino mediante

microscopiacutea oacuteptica 15133 -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton toacutexico marino

mediante microscopiacutea oacuteptica 13333 - Anaacutelisis de carbono orgaacutenico disuelto 5093 -Anaacutelisis de nutrientes inorgaacutenicos disueltos 3500 -Anaacutelisis de pigmentos fotosinteacuteticos (clorofila ldquoardquo) por

espectrofluorimetria 1698 314403 Anaacutelisis microbioloacutegicos en moluscos y otros organismos

procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Cuantificacioacuten de E Coli 10186 - Deteccioacuten de Salmonella spp 16975 -Enumeracioacuten de Escherichia coli en moluscos bivalvos

vivos por la teacutecnica de medida directa de impedancia con el sistema BacTrac 4300 6800

314404 Anaacutelisis de contaminantes de origen quiacutemica en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Determinacioacuten de metales pesados (Pb Cd Cu Zn As Hg Ni Cr Ag) mediante espectrofotometriacutea de absorcioacuten atoacutemica por metal

6790

-Determinacioacuten de compuestos bifenilos policlorados (PCB) mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

scv 5 de 7

-Determinacioacuten de pesticidas organoclorados mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

-Determinacioacuten de hidrocarburos aromaacuteticos policiacuteclicos (HAPs) mediante cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de fluorescencia

28200

314405 Anaacutelisis histopatoloacutegica de moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Estudio hispatoloacutegico Determinacioacuten de Bonamia Marteillia Perkinsus y otras alteraciones patoloacutegicas

101852

314406 Emisioacuten de certificaciones e informes teacutecnicos y otras actuaciones a peticioacuten del interesado

Emisioacuten de certificados a peticioacuten de los interesados sobre las actuaciones llevadas a cabo por el Instituto

1000

Emisioacuten de informes teacutecnicos a peticioacuten del interesado (euros por hora o fraccioacuten)

4000

scv 6 de 7

scv 7 de 7

ANEXO 3

Resultados de anaacutelisis en muestras de microalgas anteriormente enviadas procedentes de Magallanes por el equipo de espectrometriacutea de masas utilizado por INTECMAR Trabajo presentado a las XXXII

Congreso de Ciencias del Mar realizado en Punta Arenas 22-25 octubre de 2012

PERFIL DE TOXINAS DE PROROCENTRUM LIMA (DINOPHYCEAE) AISLADO DESDE LA COSTA DE MAGALLANES SUR DE CHILE P Salgado1 G Pizarro1 JM Franco2 P Rioboacute2 e I Bravo3

1Instituto de Fomento Pesquero (IFOP) Punta Arenas Chile gemitapizarroifopcl 2Instituto de Investigaciones Marinas (CSIC) Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea 3Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea

Prorocentrum lima (Ehrenberg) es un dinoflagelado marino bentoacutenico que se encuentra adherido generalmente

sobre macroalgas sedimentos y detrito flotante y menos comuacutenmente en el plancton (Bravo et al 2001) Es una especie neriacutetica y estuarina y su rango de distribucioacuten geograacutefica variacutea desde aguas costeras tropicales a templadas (Faust 1991) La importancia de P lima se debe a que son productoras de toxinas diarreogeacutenicas en las personas (veneno diarreico de los mariscos VDM) al igual que algunas especies de Dinophysis aunque raramente se le han asociado con episodios toacutexicos por VDM por su caraacutecter epiacutefito y bentoacutenico El complejo VDM producido por P lima incluye moleacuteculas conocidas como el aacutecido okadaico (AO) y derivados dinofisistoxinas (DTX-1 DTX-2) (Bravo et al 2001 Vale et al 2009) No obstante existen casos citados para USA donde se detectoacute toxicidad por VDM en bivalvos de cultivos asociadas a P lima aunque en bajos niveles (Maranda et al 2007a) En Canadaacute tambieacuten se llevoacute a cabo un estudio en moluscos de cultivo cuya finalidad fue determinar el origen del VDM en la que P lima fue la principal especie sospechosa tras la ocurrencia de un evento toacutexico humano por VDM ocurrido en 1998 (Levasseur et al 2003) y en antildeos anteriores (Quilliam et al 1993) Aunque Levasseur et al (2003) no logroacute probar la toxicidad de los mariscos en cultivo a causa de P lima cabe hacer notar que lo que buscaron fue OA y DTX1 no DTX 3 este uacuteltimo principal derivado de las anteriores tras su transformacioacuten en los moluscos (eg Suzuki et al 1999 Vale amp Sampayo 2002)

En consecuencia el rol de P lima en eventos toacutexicos por VDM auacuten no puede descartarse por cuanto podriacutean llegar a ser importantes en ambientes turbulentos debido a la eventual remocioacuten de microalgas adheridas en sustratos por efecto de vientos (Levasseur et al 2003) factor de importancia si se trata de sedimentos o contrariamente en zonas someras y estables de cultivos de moluscos que al mismo tiempo favorecen microambientes para sustratos en los que prolifera la epiacutefita P lima (Lawrence et al 2000) quedando expuestas a re-suspensiones temporales que favorecen la filtracioacuten de estas microalgas por los bivalvos en cultivo (Maranda et al 2007a)

Chile posee escaso conocimiento sobre esta especie en su medio natural incluido su perfil de toxinas y potencial rol en la toxificacioacuten de moluscos por VDM Por tal razoacuten resultoacute interesante aportar al conocimiento de estos aspectos en muestras de sedimentos recolectadas en el estrecho de Magallanes en las que esta especie se encontroacute inhabitualmente abundante

Las ceacutelulas utilizadas en este estudio fueron aisladas desde sedimentos superficiales (0-3 cm) recolectados en el invierno de 2010 en la localidad de cabo San Isidro durante el muestreo regular del programa de monitoreo de marea roja en la regioacuten de Magallanes En esa oportunidad se logroacute cuantificar hasta 1002 quistes tecadoscm3 de Prorocentrum lima la mayor concentracioacuten respecto a otros sitios de recolecta (Fig 1) Los sedimentos de esta localidad presentaron una coloracioacuten oscura y un fuerte olor a sulfuro de hidroacutegeno (H2S) producto de anoxia local

Se aislaron entre 27 y 87 quistes tecados (Fig 1 a) directamente desde los sedimentos mientras otras 60 ceacutelulas vegetativas (Fig 1 b) fueron aisladas luego de promover la actividad y divisioacuten de los quistes en condiciones de 15 ordmC y un ciclo de luzoscuridad de 1212 horas (Tabla 1) Para este fin se aislaron quistes tecados y trasvasijaron a placas Petri de 5 cm de diaacutemetro conteniendo 5 mL de medio de cultivo L1 Para el anaacutelisis de toxinas las ceacutelulas aisladas fueron trasvasijadas a un tubo Eppendorf de 15 mL y congelados a -80 ordmC Una aliacutecuota de sedimento huacutemedo (100 microL aproximados) tambieacuten fue vaciada en un tubo Eppendorf y congelado Para extraer la toxina se antildeadioacute 500 microL de metanol 100 a cada tubo se mezcloacute por 1 min y filtroacute por 045 microm trasvasijando a un vial El extracto fue secado bajo nitroacutegeno gas a 40 ordmC y conservado a 4 ordmC hasta su anaacutelisis Previo al anaacutelisis de toxinas los extractos fueron resuspendidos en 150 microl de metanol

La presencia de la toxina dinofisistoxina 1 (DTX-1) en las muestras (Fig2) fue confirmada en modo negativo a traveacutes de su ioacuten precursor [M-H]- mz 8175 y sus iones productos mz 5634 y 2552 mediante un cromatoacutegrafo UPLC Acquity Waters acoplado a un triple cuadrupolo Waters Xevo TQ (LC-MS) La columna utilizada fue una Acquity UPLC BEH C18 17microm 21 x 100 mm a 45 ordmC La fase moacutevil consistioacute en (A) hidroacutexido amoacutenico a pH 11 y (B) hidroacutexido amoacutenico en acetonitrilo (67 mM) con una tasa de flujo de 4 mLmin El gradiente de elucioacuten utilizado fue el siguiente mantencioacuten al 75 de A entre 0 y 066 min cambio a 5 de A entre 066 y 330 min mantener 5

de A entre 330 y 528 min recuperacioacuten del 75 de A entre 528 y 726 min mantencioacuten al 75 de A hasta 9 min Se pinchoacute 5microL de muestra en el LC-MS El contenido de DTX-1 en las muestras fue cuantificado en base al ion precursor

Los tres tipos de muestras fueron positivas a la presencia de DTX-1 pero las ceacutelulas vegetativas fueron las que presentaron un mayor contenido de DTX-1 por ceacutelula La deteccioacuten de DTX-1 en los sedimentos (Tabla 2) reflejoacute la presencia de los quistes tecados en eacutestos

Figura 1 Concentraciones de quistes tecados de Prorocentrum lima (quistescm3 de sedimento huacutemedo) en estaciones de muestreo en el Estrecho de Magallanes (M26 Estero Wickham M29N1 Isla Engenfield M31 Bahiacutea Nash M35 Cabo San Isidro M39C1 Bahiacutea Gente Grande M39C2 Bahiacutea Inuacutetil M39C3 Canal Gabriel) y Canal Beagle (M41 Ventisquero Espantildea M42 Ventisquero Holanda) (a) Quistes tecados (b) ceacutelulas vegetativas obtenidas de germinacioacuten de quistes tecados bajo condiciones de laboratorio Barra de escala 20 microm

Tabla 1 Sedimento y ceacutelulas de Prorocentrum lima aisladas para anaacutelisis de toxinas

Extracto metanoacutelico Nordm de ceacutelulas TR ngmL pg DTX-1 ceacutel

G1 quistes tecados 27 213 lt2 -

G2 quistes tecados 67 214 05 11

G3 quistes tecados 87 215 12 21

G4 ceacutelulas vegetativas 60 215 34 87

G6 sedimentos aliacutecuota 213 13 19 pg microL sed

TR tiempo de retencioacuten

Figura 2 Cromatogramas de extractos metanoacutelicos de Prorocentrum lima quistes tecados (a) ceacutelulas vegetativas (b) y sedimentos (c)

Tabla 2 Caracteriacutesticas del sedimento con quistes tecados de Prorocentrum lima

Tipo Tamantildeo (mm)

Grava 2 35

Arena media 025 - 05 32

Arena muy fina 0063 - 0125 2

Limo-arcilla lt 0063 1

Estos resultados constituyen otra eventual posibilidad de toxicidad en los moluscos por VDM no soacutelo de aquellos con modalidad de vida bentoacutenica superficial sino de aquellos que tambieacuten viven enterrados en la arena (eg almeja huepo) Maacutes auacuten si se conoce que P lima posee la capacidad de desarrollar poblaciones naturales en aguas templadas en nuacutemeros que podriacutean justificar una toxicidad por VDM en los mariscos (eg Maranda et al 2007a b)

Referencias

Bravo I ML Fernaacutendez I Ramilo amp A Martinez 2001 Toxin composition of the toxic dinofagellate Prorocentrum lima isolated from different locations along the Galician coast (NW Spain) Toxicon 39 1537ndash1545

Faust MA 1991 Morphology of ciguatera-causing Prorocentrum lima (Pyrrophyta) from widely differing sites J Phycol 27 642-648

Lawrence J E Grant J Quilliam M A Bauder A G amp Cembella A D 2000 Colonizaition and growth of the toxic dinoflagellate Prorocentrum lima and associated fouling macroalgae on mussels in suspended culture Mar Ecol Prog Ser 201 147-154

Levasseur M Couture J Y Weise A M Michaud S Elbrachter M Sauveacute G amp Bonneau E 2003 Pelagic and epiphytic summer distributions of Prorocentrum lima and P mexicanum at two mussel farms in the Gulf of St Lawrence Aquat Microbiol Ecol 30283-293

Maranda L Corwin S Dover S amp Morton S L 2007a Prorocentrum lima (Dinophyceae) in northeastern USA coastal waters II Toxin load in the epibiota and in shellfish Harmful Algae 6 632-641

Maranda L Corwin S Hargraves P E 2007b Prorocentrum lima (Dinophyceae) in 19 northeastern USA coastal waters I Abundance and distribution Harmful Algae 6 623ndash631

Quilliam MA Gilgan MW amp Pleasance S 1993 Confirmation of an incident of diarrhetic shellfish poisoning in eastern Canada In Smayda TJ Shimizu Y (Eds) Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea Elsevier New York pp 547ndash552

Suzuki T Ota H amp Yamasaki M 1999 Direct evidence of transformation of dinophysistoxin-1 to 7-O-acyl-dinophysistoxin-1 (Dinophysis-3) in the scallop Patinopecten yessoensis Toxicon 37 187-198

Vale P amp Sampayo M A 2002 First confirmation of human diarrhoeic poisonings by okadaic acid esters after ingestion of razor clams (Solen marginatus) and green crabs (Carcinus maenas) in Aveiro lagoon Portugal and detection of okadaic acid esters in phytoplankton Toxicon 40989-996

Vale P Veloso V amp Amorim A 2009 Toxin composition of a Prorocentrum lima strain isolated from the Portuguese coast Toxicon 54145ndash152

Agradecimientos Intecmar de la Xunta de Galicia Espantildea donde se realizaron los anaacutelisis de toxinas proyecto

SUBPESCA ldquoManejo y Monitoreo de Mareas Rojas en las regiones de Los Lagos Ayseacuten y Magallanes IV etapa 2010rdquo

ANEXO 4

Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten

ANEXO 5

Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de Magallanes

TASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

O

EJE

MP

LA

R P

AR

A E

L IN

TE

RE

SA

DO

LIQ

UID

AC

IOacuteN

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

EN

TID

AD

BA

NC

AR

IATASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

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SIV

OL

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IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

0 9

4 0

2 4INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

AD

MIN

IST

RA

CIOacute

NTASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

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SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

9520 euros

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

CONSELLERIA DE FACENDA

ANEXO 6

Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para cierre

de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

Seccioacuten Ediciones y Produccioacuten Almte Manuel Blanco Encalada 839

Fono 56-32-2151500 Valparaiacuteso Chile

wwwifopcl

Page 38: “Análisis de toxinas lipofílicas mediante LC-MS/MS en ...metadatos.mma.gob.cl/sinia/Informe_final_Analisis_toxinas_lipofilicas_656-055.pdfSUBSECRETARÍA DE ECONOMÍA: INFORME FINAL:

scv 2 de 7

TARIFAS DE TASAS VIGENTES PARA 2013 - Ley 22013 d e 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para 2013

(DOG nuacutem 42 de 28022013)

Estas tarifas son consecuencia de la actualizacioacuten de las tarifas contenidas en los anexos 1 2 3 4 y 5 de la Ley 62003 del 9 de diciembre de tasas precios y exacciones reguladoras de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia por la Ley 22013 de 27 de febrero de presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 Seraacuten aplicables desde el diacutea de la entrada en vigor de la Ley de

presupuestos generales de la Comunidad Autoacutenoma de Galicia para el 2013 TASA POR SERVICIOS ADMINISTRATIVOS

No sujecioacuten No se exigiraacute la tasa por servicios administrativos cuando se trate de compulsas o cotejos de documentos que deban acompantildear a solicitudes escritos o comunicaciones presentadas por el ciudadano y realizadas en el aacutembito de actuacioacuten de los registros seguacuten lo dispuesto en el artiacuteculo 385 de la Ley 301992 del 26 de noviembre de reacutegimen juriacutedico de las administraciones puacuteblicas y del procedimiento administrativo comuacuten

Excepciones Estaraacuten exentos de la presente tasa

1- La expedicioacuten de certificados de retribuciones satisfechas por la Xunta de Galicia con el objeto de justificacioacuten en relacioacuten con el impuesto sobre la renta de las personas fiacutesicas

2- La expedicioacuten de certificados y compulsa que el personal de la Administracioacuten solicite respecto a las necesidades propias del puesto de trabajo o relacioacuten de servicios

3- Los alumnos por cualquier actuacioacuten en materia de ensentildeanzas no universitarias

scv 3 de 7

4- Las compulsas realizadas en las oficinas de empleo para los desempleados en la tramitacioacuten de expedientes que sean competencia de dichas oficinas

5 La inscripcioacuten en las convocatorias para a seleccioacuten de personal de la comunidad autoacutenoma despueacutes de justificacioacuten documental solicitada por

- Personas con discapacidad igual o superior al 33 - Personas que sean miembros de familias numerosas clasificadas en la

categoriacutea especial Se aplicaraacute una bonificacioacuten del 50 a la inscripcioacuten solicitada por - Personas que sean miembros de familias numerosas de categoriacutea

general - Personas que figurasen como demandantes de empleo desde por lo

menos seis meses antes a la fecha de la convocatoria de pruebas selectivas de personal en las que soliciten su participacioacuten y no esteacuten percibiendo prestacioacuten o subsidio por desempleo

6- La expedicioacuten de certificados relativos a la situacioacuten fiscal 7- El Estado y los demaacutes entes puacuteblicos territoriales o institucionales

siempre que los servicios o actividades de que sean beneficiarios se presten o se realicen en el marco del principio de colaboracioacuten entre administraciones

8- Las viacutectimas de actos terroristas asiacute como sus coacutenyuges y sus hijos por cualquier actuacioacuten en materia educativa realizada en centros oficiales de estudios en todos los niveles de ensentildeanza

9- Los miembros de los organismos consultivos de la Administracioacuten puacuteblica gallega respecto de los certificados emitidos por dichos organismos

COacuteDIGO TASAS

DESCRIPCIOacuteN IMPORTE euro

314400 Prestacioacuten de servicios en el Instituto Tecnoloacutegico para el Control del Medio Marino de Galicia

314401 Anaacutelisis de biotoxinas marinas en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de Yasumoto 1978 4752

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en rato segundo o meacutetodo de Yasumoto 1984 5432

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS)

9520 -Anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten

seguacuten el meacutetodo de la AOAC 4752

scv 4 de 7

-Anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo da AOAC 4752

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1978 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10186

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1984 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10865

-Anaacutelisis combinada en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS) anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo AOAC y anaacutelisis de toxicidad de tipo ASP por cromatografiacutea liquida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo de la AOAC 15000

314402 Anaacutelisis de muestras en agua de mar -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton marino mediante

microscopiacutea oacuteptica 15133 -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton toacutexico marino

mediante microscopiacutea oacuteptica 13333 - Anaacutelisis de carbono orgaacutenico disuelto 5093 -Anaacutelisis de nutrientes inorgaacutenicos disueltos 3500 -Anaacutelisis de pigmentos fotosinteacuteticos (clorofila ldquoardquo) por

espectrofluorimetria 1698 314403 Anaacutelisis microbioloacutegicos en moluscos y otros organismos

procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Cuantificacioacuten de E Coli 10186 - Deteccioacuten de Salmonella spp 16975 -Enumeracioacuten de Escherichia coli en moluscos bivalvos

vivos por la teacutecnica de medida directa de impedancia con el sistema BacTrac 4300 6800

314404 Anaacutelisis de contaminantes de origen quiacutemica en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Determinacioacuten de metales pesados (Pb Cd Cu Zn As Hg Ni Cr Ag) mediante espectrofotometriacutea de absorcioacuten atoacutemica por metal

6790

-Determinacioacuten de compuestos bifenilos policlorados (PCB) mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

scv 5 de 7

-Determinacioacuten de pesticidas organoclorados mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

-Determinacioacuten de hidrocarburos aromaacuteticos policiacuteclicos (HAPs) mediante cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de fluorescencia

28200

314405 Anaacutelisis histopatoloacutegica de moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Estudio hispatoloacutegico Determinacioacuten de Bonamia Marteillia Perkinsus y otras alteraciones patoloacutegicas

101852

314406 Emisioacuten de certificaciones e informes teacutecnicos y otras actuaciones a peticioacuten del interesado

Emisioacuten de certificados a peticioacuten de los interesados sobre las actuaciones llevadas a cabo por el Instituto

1000

Emisioacuten de informes teacutecnicos a peticioacuten del interesado (euros por hora o fraccioacuten)

4000

scv 6 de 7

scv 7 de 7

ANEXO 3

Resultados de anaacutelisis en muestras de microalgas anteriormente enviadas procedentes de Magallanes por el equipo de espectrometriacutea de masas utilizado por INTECMAR Trabajo presentado a las XXXII

Congreso de Ciencias del Mar realizado en Punta Arenas 22-25 octubre de 2012

PERFIL DE TOXINAS DE PROROCENTRUM LIMA (DINOPHYCEAE) AISLADO DESDE LA COSTA DE MAGALLANES SUR DE CHILE P Salgado1 G Pizarro1 JM Franco2 P Rioboacute2 e I Bravo3

1Instituto de Fomento Pesquero (IFOP) Punta Arenas Chile gemitapizarroifopcl 2Instituto de Investigaciones Marinas (CSIC) Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea 3Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea

Prorocentrum lima (Ehrenberg) es un dinoflagelado marino bentoacutenico que se encuentra adherido generalmente

sobre macroalgas sedimentos y detrito flotante y menos comuacutenmente en el plancton (Bravo et al 2001) Es una especie neriacutetica y estuarina y su rango de distribucioacuten geograacutefica variacutea desde aguas costeras tropicales a templadas (Faust 1991) La importancia de P lima se debe a que son productoras de toxinas diarreogeacutenicas en las personas (veneno diarreico de los mariscos VDM) al igual que algunas especies de Dinophysis aunque raramente se le han asociado con episodios toacutexicos por VDM por su caraacutecter epiacutefito y bentoacutenico El complejo VDM producido por P lima incluye moleacuteculas conocidas como el aacutecido okadaico (AO) y derivados dinofisistoxinas (DTX-1 DTX-2) (Bravo et al 2001 Vale et al 2009) No obstante existen casos citados para USA donde se detectoacute toxicidad por VDM en bivalvos de cultivos asociadas a P lima aunque en bajos niveles (Maranda et al 2007a) En Canadaacute tambieacuten se llevoacute a cabo un estudio en moluscos de cultivo cuya finalidad fue determinar el origen del VDM en la que P lima fue la principal especie sospechosa tras la ocurrencia de un evento toacutexico humano por VDM ocurrido en 1998 (Levasseur et al 2003) y en antildeos anteriores (Quilliam et al 1993) Aunque Levasseur et al (2003) no logroacute probar la toxicidad de los mariscos en cultivo a causa de P lima cabe hacer notar que lo que buscaron fue OA y DTX1 no DTX 3 este uacuteltimo principal derivado de las anteriores tras su transformacioacuten en los moluscos (eg Suzuki et al 1999 Vale amp Sampayo 2002)

En consecuencia el rol de P lima en eventos toacutexicos por VDM auacuten no puede descartarse por cuanto podriacutean llegar a ser importantes en ambientes turbulentos debido a la eventual remocioacuten de microalgas adheridas en sustratos por efecto de vientos (Levasseur et al 2003) factor de importancia si se trata de sedimentos o contrariamente en zonas someras y estables de cultivos de moluscos que al mismo tiempo favorecen microambientes para sustratos en los que prolifera la epiacutefita P lima (Lawrence et al 2000) quedando expuestas a re-suspensiones temporales que favorecen la filtracioacuten de estas microalgas por los bivalvos en cultivo (Maranda et al 2007a)

Chile posee escaso conocimiento sobre esta especie en su medio natural incluido su perfil de toxinas y potencial rol en la toxificacioacuten de moluscos por VDM Por tal razoacuten resultoacute interesante aportar al conocimiento de estos aspectos en muestras de sedimentos recolectadas en el estrecho de Magallanes en las que esta especie se encontroacute inhabitualmente abundante

Las ceacutelulas utilizadas en este estudio fueron aisladas desde sedimentos superficiales (0-3 cm) recolectados en el invierno de 2010 en la localidad de cabo San Isidro durante el muestreo regular del programa de monitoreo de marea roja en la regioacuten de Magallanes En esa oportunidad se logroacute cuantificar hasta 1002 quistes tecadoscm3 de Prorocentrum lima la mayor concentracioacuten respecto a otros sitios de recolecta (Fig 1) Los sedimentos de esta localidad presentaron una coloracioacuten oscura y un fuerte olor a sulfuro de hidroacutegeno (H2S) producto de anoxia local

Se aislaron entre 27 y 87 quistes tecados (Fig 1 a) directamente desde los sedimentos mientras otras 60 ceacutelulas vegetativas (Fig 1 b) fueron aisladas luego de promover la actividad y divisioacuten de los quistes en condiciones de 15 ordmC y un ciclo de luzoscuridad de 1212 horas (Tabla 1) Para este fin se aislaron quistes tecados y trasvasijaron a placas Petri de 5 cm de diaacutemetro conteniendo 5 mL de medio de cultivo L1 Para el anaacutelisis de toxinas las ceacutelulas aisladas fueron trasvasijadas a un tubo Eppendorf de 15 mL y congelados a -80 ordmC Una aliacutecuota de sedimento huacutemedo (100 microL aproximados) tambieacuten fue vaciada en un tubo Eppendorf y congelado Para extraer la toxina se antildeadioacute 500 microL de metanol 100 a cada tubo se mezcloacute por 1 min y filtroacute por 045 microm trasvasijando a un vial El extracto fue secado bajo nitroacutegeno gas a 40 ordmC y conservado a 4 ordmC hasta su anaacutelisis Previo al anaacutelisis de toxinas los extractos fueron resuspendidos en 150 microl de metanol

La presencia de la toxina dinofisistoxina 1 (DTX-1) en las muestras (Fig2) fue confirmada en modo negativo a traveacutes de su ioacuten precursor [M-H]- mz 8175 y sus iones productos mz 5634 y 2552 mediante un cromatoacutegrafo UPLC Acquity Waters acoplado a un triple cuadrupolo Waters Xevo TQ (LC-MS) La columna utilizada fue una Acquity UPLC BEH C18 17microm 21 x 100 mm a 45 ordmC La fase moacutevil consistioacute en (A) hidroacutexido amoacutenico a pH 11 y (B) hidroacutexido amoacutenico en acetonitrilo (67 mM) con una tasa de flujo de 4 mLmin El gradiente de elucioacuten utilizado fue el siguiente mantencioacuten al 75 de A entre 0 y 066 min cambio a 5 de A entre 066 y 330 min mantener 5

de A entre 330 y 528 min recuperacioacuten del 75 de A entre 528 y 726 min mantencioacuten al 75 de A hasta 9 min Se pinchoacute 5microL de muestra en el LC-MS El contenido de DTX-1 en las muestras fue cuantificado en base al ion precursor

Los tres tipos de muestras fueron positivas a la presencia de DTX-1 pero las ceacutelulas vegetativas fueron las que presentaron un mayor contenido de DTX-1 por ceacutelula La deteccioacuten de DTX-1 en los sedimentos (Tabla 2) reflejoacute la presencia de los quistes tecados en eacutestos

Figura 1 Concentraciones de quistes tecados de Prorocentrum lima (quistescm3 de sedimento huacutemedo) en estaciones de muestreo en el Estrecho de Magallanes (M26 Estero Wickham M29N1 Isla Engenfield M31 Bahiacutea Nash M35 Cabo San Isidro M39C1 Bahiacutea Gente Grande M39C2 Bahiacutea Inuacutetil M39C3 Canal Gabriel) y Canal Beagle (M41 Ventisquero Espantildea M42 Ventisquero Holanda) (a) Quistes tecados (b) ceacutelulas vegetativas obtenidas de germinacioacuten de quistes tecados bajo condiciones de laboratorio Barra de escala 20 microm

Tabla 1 Sedimento y ceacutelulas de Prorocentrum lima aisladas para anaacutelisis de toxinas

Extracto metanoacutelico Nordm de ceacutelulas TR ngmL pg DTX-1 ceacutel

G1 quistes tecados 27 213 lt2 -

G2 quistes tecados 67 214 05 11

G3 quistes tecados 87 215 12 21

G4 ceacutelulas vegetativas 60 215 34 87

G6 sedimentos aliacutecuota 213 13 19 pg microL sed

TR tiempo de retencioacuten

Figura 2 Cromatogramas de extractos metanoacutelicos de Prorocentrum lima quistes tecados (a) ceacutelulas vegetativas (b) y sedimentos (c)

Tabla 2 Caracteriacutesticas del sedimento con quistes tecados de Prorocentrum lima

Tipo Tamantildeo (mm)

Grava 2 35

Arena media 025 - 05 32

Arena muy fina 0063 - 0125 2

Limo-arcilla lt 0063 1

Estos resultados constituyen otra eventual posibilidad de toxicidad en los moluscos por VDM no soacutelo de aquellos con modalidad de vida bentoacutenica superficial sino de aquellos que tambieacuten viven enterrados en la arena (eg almeja huepo) Maacutes auacuten si se conoce que P lima posee la capacidad de desarrollar poblaciones naturales en aguas templadas en nuacutemeros que podriacutean justificar una toxicidad por VDM en los mariscos (eg Maranda et al 2007a b)

Referencias

Bravo I ML Fernaacutendez I Ramilo amp A Martinez 2001 Toxin composition of the toxic dinofagellate Prorocentrum lima isolated from different locations along the Galician coast (NW Spain) Toxicon 39 1537ndash1545

Faust MA 1991 Morphology of ciguatera-causing Prorocentrum lima (Pyrrophyta) from widely differing sites J Phycol 27 642-648

Lawrence J E Grant J Quilliam M A Bauder A G amp Cembella A D 2000 Colonizaition and growth of the toxic dinoflagellate Prorocentrum lima and associated fouling macroalgae on mussels in suspended culture Mar Ecol Prog Ser 201 147-154

Levasseur M Couture J Y Weise A M Michaud S Elbrachter M Sauveacute G amp Bonneau E 2003 Pelagic and epiphytic summer distributions of Prorocentrum lima and P mexicanum at two mussel farms in the Gulf of St Lawrence Aquat Microbiol Ecol 30283-293

Maranda L Corwin S Dover S amp Morton S L 2007a Prorocentrum lima (Dinophyceae) in northeastern USA coastal waters II Toxin load in the epibiota and in shellfish Harmful Algae 6 632-641

Maranda L Corwin S Hargraves P E 2007b Prorocentrum lima (Dinophyceae) in 19 northeastern USA coastal waters I Abundance and distribution Harmful Algae 6 623ndash631

Quilliam MA Gilgan MW amp Pleasance S 1993 Confirmation of an incident of diarrhetic shellfish poisoning in eastern Canada In Smayda TJ Shimizu Y (Eds) Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea Elsevier New York pp 547ndash552

Suzuki T Ota H amp Yamasaki M 1999 Direct evidence of transformation of dinophysistoxin-1 to 7-O-acyl-dinophysistoxin-1 (Dinophysis-3) in the scallop Patinopecten yessoensis Toxicon 37 187-198

Vale P amp Sampayo M A 2002 First confirmation of human diarrhoeic poisonings by okadaic acid esters after ingestion of razor clams (Solen marginatus) and green crabs (Carcinus maenas) in Aveiro lagoon Portugal and detection of okadaic acid esters in phytoplankton Toxicon 40989-996

Vale P Veloso V amp Amorim A 2009 Toxin composition of a Prorocentrum lima strain isolated from the Portuguese coast Toxicon 54145ndash152

Agradecimientos Intecmar de la Xunta de Galicia Espantildea donde se realizaron los anaacutelisis de toxinas proyecto

SUBPESCA ldquoManejo y Monitoreo de Mareas Rojas en las regiones de Los Lagos Ayseacuten y Magallanes IV etapa 2010rdquo

ANEXO 4

Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten

ANEXO 5

Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de Magallanes

TASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

O

EJE

MP

LA

R P

AR

A E

L IN

TE

RE

SA

DO

LIQ

UID

AC

IOacuteN

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

EN

TID

AD

BA

NC

AR

IATASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

0 9

4 0

2 4INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

AD

MIN

IST

RA

CIOacute

NTASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

9520 euros

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

CONSELLERIA DE FACENDA

ANEXO 6

Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para cierre

de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

Seccioacuten Ediciones y Produccioacuten Almte Manuel Blanco Encalada 839

Fono 56-32-2151500 Valparaiacuteso Chile

wwwifopcl

Page 39: “Análisis de toxinas lipofílicas mediante LC-MS/MS en ...metadatos.mma.gob.cl/sinia/Informe_final_Analisis_toxinas_lipofilicas_656-055.pdfSUBSECRETARÍA DE ECONOMÍA: INFORME FINAL:

scv 3 de 7

4- Las compulsas realizadas en las oficinas de empleo para los desempleados en la tramitacioacuten de expedientes que sean competencia de dichas oficinas

5 La inscripcioacuten en las convocatorias para a seleccioacuten de personal de la comunidad autoacutenoma despueacutes de justificacioacuten documental solicitada por

- Personas con discapacidad igual o superior al 33 - Personas que sean miembros de familias numerosas clasificadas en la

categoriacutea especial Se aplicaraacute una bonificacioacuten del 50 a la inscripcioacuten solicitada por - Personas que sean miembros de familias numerosas de categoriacutea

general - Personas que figurasen como demandantes de empleo desde por lo

menos seis meses antes a la fecha de la convocatoria de pruebas selectivas de personal en las que soliciten su participacioacuten y no esteacuten percibiendo prestacioacuten o subsidio por desempleo

6- La expedicioacuten de certificados relativos a la situacioacuten fiscal 7- El Estado y los demaacutes entes puacuteblicos territoriales o institucionales

siempre que los servicios o actividades de que sean beneficiarios se presten o se realicen en el marco del principio de colaboracioacuten entre administraciones

8- Las viacutectimas de actos terroristas asiacute como sus coacutenyuges y sus hijos por cualquier actuacioacuten en materia educativa realizada en centros oficiales de estudios en todos los niveles de ensentildeanza

9- Los miembros de los organismos consultivos de la Administracioacuten puacuteblica gallega respecto de los certificados emitidos por dichos organismos

COacuteDIGO TASAS

DESCRIPCIOacuteN IMPORTE euro

314400 Prestacioacuten de servicios en el Instituto Tecnoloacutegico para el Control del Medio Marino de Galicia

314401 Anaacutelisis de biotoxinas marinas en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de Yasumoto 1978 4752

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en rato segundo o meacutetodo de Yasumoto 1984 5432

-Anaacutelisis de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS)

9520 -Anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten

seguacuten el meacutetodo de la AOAC 4752

scv 4 de 7

-Anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo da AOAC 4752

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1978 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10186

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1984 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10865

-Anaacutelisis combinada en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS) anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo AOAC y anaacutelisis de toxicidad de tipo ASP por cromatografiacutea liquida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo de la AOAC 15000

314402 Anaacutelisis de muestras en agua de mar -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton marino mediante

microscopiacutea oacuteptica 15133 -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton toacutexico marino

mediante microscopiacutea oacuteptica 13333 - Anaacutelisis de carbono orgaacutenico disuelto 5093 -Anaacutelisis de nutrientes inorgaacutenicos disueltos 3500 -Anaacutelisis de pigmentos fotosinteacuteticos (clorofila ldquoardquo) por

espectrofluorimetria 1698 314403 Anaacutelisis microbioloacutegicos en moluscos y otros organismos

procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Cuantificacioacuten de E Coli 10186 - Deteccioacuten de Salmonella spp 16975 -Enumeracioacuten de Escherichia coli en moluscos bivalvos

vivos por la teacutecnica de medida directa de impedancia con el sistema BacTrac 4300 6800

314404 Anaacutelisis de contaminantes de origen quiacutemica en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Determinacioacuten de metales pesados (Pb Cd Cu Zn As Hg Ni Cr Ag) mediante espectrofotometriacutea de absorcioacuten atoacutemica por metal

6790

-Determinacioacuten de compuestos bifenilos policlorados (PCB) mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

scv 5 de 7

-Determinacioacuten de pesticidas organoclorados mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

-Determinacioacuten de hidrocarburos aromaacuteticos policiacuteclicos (HAPs) mediante cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de fluorescencia

28200

314405 Anaacutelisis histopatoloacutegica de moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Estudio hispatoloacutegico Determinacioacuten de Bonamia Marteillia Perkinsus y otras alteraciones patoloacutegicas

101852

314406 Emisioacuten de certificaciones e informes teacutecnicos y otras actuaciones a peticioacuten del interesado

Emisioacuten de certificados a peticioacuten de los interesados sobre las actuaciones llevadas a cabo por el Instituto

1000

Emisioacuten de informes teacutecnicos a peticioacuten del interesado (euros por hora o fraccioacuten)

4000

scv 6 de 7

scv 7 de 7

ANEXO 3

Resultados de anaacutelisis en muestras de microalgas anteriormente enviadas procedentes de Magallanes por el equipo de espectrometriacutea de masas utilizado por INTECMAR Trabajo presentado a las XXXII

Congreso de Ciencias del Mar realizado en Punta Arenas 22-25 octubre de 2012

PERFIL DE TOXINAS DE PROROCENTRUM LIMA (DINOPHYCEAE) AISLADO DESDE LA COSTA DE MAGALLANES SUR DE CHILE P Salgado1 G Pizarro1 JM Franco2 P Rioboacute2 e I Bravo3

1Instituto de Fomento Pesquero (IFOP) Punta Arenas Chile gemitapizarroifopcl 2Instituto de Investigaciones Marinas (CSIC) Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea 3Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea

Prorocentrum lima (Ehrenberg) es un dinoflagelado marino bentoacutenico que se encuentra adherido generalmente

sobre macroalgas sedimentos y detrito flotante y menos comuacutenmente en el plancton (Bravo et al 2001) Es una especie neriacutetica y estuarina y su rango de distribucioacuten geograacutefica variacutea desde aguas costeras tropicales a templadas (Faust 1991) La importancia de P lima se debe a que son productoras de toxinas diarreogeacutenicas en las personas (veneno diarreico de los mariscos VDM) al igual que algunas especies de Dinophysis aunque raramente se le han asociado con episodios toacutexicos por VDM por su caraacutecter epiacutefito y bentoacutenico El complejo VDM producido por P lima incluye moleacuteculas conocidas como el aacutecido okadaico (AO) y derivados dinofisistoxinas (DTX-1 DTX-2) (Bravo et al 2001 Vale et al 2009) No obstante existen casos citados para USA donde se detectoacute toxicidad por VDM en bivalvos de cultivos asociadas a P lima aunque en bajos niveles (Maranda et al 2007a) En Canadaacute tambieacuten se llevoacute a cabo un estudio en moluscos de cultivo cuya finalidad fue determinar el origen del VDM en la que P lima fue la principal especie sospechosa tras la ocurrencia de un evento toacutexico humano por VDM ocurrido en 1998 (Levasseur et al 2003) y en antildeos anteriores (Quilliam et al 1993) Aunque Levasseur et al (2003) no logroacute probar la toxicidad de los mariscos en cultivo a causa de P lima cabe hacer notar que lo que buscaron fue OA y DTX1 no DTX 3 este uacuteltimo principal derivado de las anteriores tras su transformacioacuten en los moluscos (eg Suzuki et al 1999 Vale amp Sampayo 2002)

En consecuencia el rol de P lima en eventos toacutexicos por VDM auacuten no puede descartarse por cuanto podriacutean llegar a ser importantes en ambientes turbulentos debido a la eventual remocioacuten de microalgas adheridas en sustratos por efecto de vientos (Levasseur et al 2003) factor de importancia si se trata de sedimentos o contrariamente en zonas someras y estables de cultivos de moluscos que al mismo tiempo favorecen microambientes para sustratos en los que prolifera la epiacutefita P lima (Lawrence et al 2000) quedando expuestas a re-suspensiones temporales que favorecen la filtracioacuten de estas microalgas por los bivalvos en cultivo (Maranda et al 2007a)

Chile posee escaso conocimiento sobre esta especie en su medio natural incluido su perfil de toxinas y potencial rol en la toxificacioacuten de moluscos por VDM Por tal razoacuten resultoacute interesante aportar al conocimiento de estos aspectos en muestras de sedimentos recolectadas en el estrecho de Magallanes en las que esta especie se encontroacute inhabitualmente abundante

Las ceacutelulas utilizadas en este estudio fueron aisladas desde sedimentos superficiales (0-3 cm) recolectados en el invierno de 2010 en la localidad de cabo San Isidro durante el muestreo regular del programa de monitoreo de marea roja en la regioacuten de Magallanes En esa oportunidad se logroacute cuantificar hasta 1002 quistes tecadoscm3 de Prorocentrum lima la mayor concentracioacuten respecto a otros sitios de recolecta (Fig 1) Los sedimentos de esta localidad presentaron una coloracioacuten oscura y un fuerte olor a sulfuro de hidroacutegeno (H2S) producto de anoxia local

Se aislaron entre 27 y 87 quistes tecados (Fig 1 a) directamente desde los sedimentos mientras otras 60 ceacutelulas vegetativas (Fig 1 b) fueron aisladas luego de promover la actividad y divisioacuten de los quistes en condiciones de 15 ordmC y un ciclo de luzoscuridad de 1212 horas (Tabla 1) Para este fin se aislaron quistes tecados y trasvasijaron a placas Petri de 5 cm de diaacutemetro conteniendo 5 mL de medio de cultivo L1 Para el anaacutelisis de toxinas las ceacutelulas aisladas fueron trasvasijadas a un tubo Eppendorf de 15 mL y congelados a -80 ordmC Una aliacutecuota de sedimento huacutemedo (100 microL aproximados) tambieacuten fue vaciada en un tubo Eppendorf y congelado Para extraer la toxina se antildeadioacute 500 microL de metanol 100 a cada tubo se mezcloacute por 1 min y filtroacute por 045 microm trasvasijando a un vial El extracto fue secado bajo nitroacutegeno gas a 40 ordmC y conservado a 4 ordmC hasta su anaacutelisis Previo al anaacutelisis de toxinas los extractos fueron resuspendidos en 150 microl de metanol

La presencia de la toxina dinofisistoxina 1 (DTX-1) en las muestras (Fig2) fue confirmada en modo negativo a traveacutes de su ioacuten precursor [M-H]- mz 8175 y sus iones productos mz 5634 y 2552 mediante un cromatoacutegrafo UPLC Acquity Waters acoplado a un triple cuadrupolo Waters Xevo TQ (LC-MS) La columna utilizada fue una Acquity UPLC BEH C18 17microm 21 x 100 mm a 45 ordmC La fase moacutevil consistioacute en (A) hidroacutexido amoacutenico a pH 11 y (B) hidroacutexido amoacutenico en acetonitrilo (67 mM) con una tasa de flujo de 4 mLmin El gradiente de elucioacuten utilizado fue el siguiente mantencioacuten al 75 de A entre 0 y 066 min cambio a 5 de A entre 066 y 330 min mantener 5

de A entre 330 y 528 min recuperacioacuten del 75 de A entre 528 y 726 min mantencioacuten al 75 de A hasta 9 min Se pinchoacute 5microL de muestra en el LC-MS El contenido de DTX-1 en las muestras fue cuantificado en base al ion precursor

Los tres tipos de muestras fueron positivas a la presencia de DTX-1 pero las ceacutelulas vegetativas fueron las que presentaron un mayor contenido de DTX-1 por ceacutelula La deteccioacuten de DTX-1 en los sedimentos (Tabla 2) reflejoacute la presencia de los quistes tecados en eacutestos

Figura 1 Concentraciones de quistes tecados de Prorocentrum lima (quistescm3 de sedimento huacutemedo) en estaciones de muestreo en el Estrecho de Magallanes (M26 Estero Wickham M29N1 Isla Engenfield M31 Bahiacutea Nash M35 Cabo San Isidro M39C1 Bahiacutea Gente Grande M39C2 Bahiacutea Inuacutetil M39C3 Canal Gabriel) y Canal Beagle (M41 Ventisquero Espantildea M42 Ventisquero Holanda) (a) Quistes tecados (b) ceacutelulas vegetativas obtenidas de germinacioacuten de quistes tecados bajo condiciones de laboratorio Barra de escala 20 microm

Tabla 1 Sedimento y ceacutelulas de Prorocentrum lima aisladas para anaacutelisis de toxinas

Extracto metanoacutelico Nordm de ceacutelulas TR ngmL pg DTX-1 ceacutel

G1 quistes tecados 27 213 lt2 -

G2 quistes tecados 67 214 05 11

G3 quistes tecados 87 215 12 21

G4 ceacutelulas vegetativas 60 215 34 87

G6 sedimentos aliacutecuota 213 13 19 pg microL sed

TR tiempo de retencioacuten

Figura 2 Cromatogramas de extractos metanoacutelicos de Prorocentrum lima quistes tecados (a) ceacutelulas vegetativas (b) y sedimentos (c)

Tabla 2 Caracteriacutesticas del sedimento con quistes tecados de Prorocentrum lima

Tipo Tamantildeo (mm)

Grava 2 35

Arena media 025 - 05 32

Arena muy fina 0063 - 0125 2

Limo-arcilla lt 0063 1

Estos resultados constituyen otra eventual posibilidad de toxicidad en los moluscos por VDM no soacutelo de aquellos con modalidad de vida bentoacutenica superficial sino de aquellos que tambieacuten viven enterrados en la arena (eg almeja huepo) Maacutes auacuten si se conoce que P lima posee la capacidad de desarrollar poblaciones naturales en aguas templadas en nuacutemeros que podriacutean justificar una toxicidad por VDM en los mariscos (eg Maranda et al 2007a b)

Referencias

Bravo I ML Fernaacutendez I Ramilo amp A Martinez 2001 Toxin composition of the toxic dinofagellate Prorocentrum lima isolated from different locations along the Galician coast (NW Spain) Toxicon 39 1537ndash1545

Faust MA 1991 Morphology of ciguatera-causing Prorocentrum lima (Pyrrophyta) from widely differing sites J Phycol 27 642-648

Lawrence J E Grant J Quilliam M A Bauder A G amp Cembella A D 2000 Colonizaition and growth of the toxic dinoflagellate Prorocentrum lima and associated fouling macroalgae on mussels in suspended culture Mar Ecol Prog Ser 201 147-154

Levasseur M Couture J Y Weise A M Michaud S Elbrachter M Sauveacute G amp Bonneau E 2003 Pelagic and epiphytic summer distributions of Prorocentrum lima and P mexicanum at two mussel farms in the Gulf of St Lawrence Aquat Microbiol Ecol 30283-293

Maranda L Corwin S Dover S amp Morton S L 2007a Prorocentrum lima (Dinophyceae) in northeastern USA coastal waters II Toxin load in the epibiota and in shellfish Harmful Algae 6 632-641

Maranda L Corwin S Hargraves P E 2007b Prorocentrum lima (Dinophyceae) in 19 northeastern USA coastal waters I Abundance and distribution Harmful Algae 6 623ndash631

Quilliam MA Gilgan MW amp Pleasance S 1993 Confirmation of an incident of diarrhetic shellfish poisoning in eastern Canada In Smayda TJ Shimizu Y (Eds) Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea Elsevier New York pp 547ndash552

Suzuki T Ota H amp Yamasaki M 1999 Direct evidence of transformation of dinophysistoxin-1 to 7-O-acyl-dinophysistoxin-1 (Dinophysis-3) in the scallop Patinopecten yessoensis Toxicon 37 187-198

Vale P amp Sampayo M A 2002 First confirmation of human diarrhoeic poisonings by okadaic acid esters after ingestion of razor clams (Solen marginatus) and green crabs (Carcinus maenas) in Aveiro lagoon Portugal and detection of okadaic acid esters in phytoplankton Toxicon 40989-996

Vale P Veloso V amp Amorim A 2009 Toxin composition of a Prorocentrum lima strain isolated from the Portuguese coast Toxicon 54145ndash152

Agradecimientos Intecmar de la Xunta de Galicia Espantildea donde se realizaron los anaacutelisis de toxinas proyecto

SUBPESCA ldquoManejo y Monitoreo de Mareas Rojas en las regiones de Los Lagos Ayseacuten y Magallanes IV etapa 2010rdquo

ANEXO 4

Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten

ANEXO 5

Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de Magallanes

TASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

O

EJE

MP

LA

R P

AR

A E

L IN

TE

RE

SA

DO

LIQ

UID

AC

IOacuteN

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

EN

TID

AD

BA

NC

AR

IATASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

0 9

4 0

2 4INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

AD

MIN

IST

RA

CIOacute

NTASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

9520 euros

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

CONSELLERIA DE FACENDA

ANEXO 6

Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para cierre

de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

Seccioacuten Ediciones y Produccioacuten Almte Manuel Blanco Encalada 839

Fono 56-32-2151500 Valparaiacuteso Chile

wwwifopcl

Page 40: “Análisis de toxinas lipofílicas mediante LC-MS/MS en ...metadatos.mma.gob.cl/sinia/Informe_final_Analisis_toxinas_lipofilicas_656-055.pdfSUBSECRETARÍA DE ECONOMÍA: INFORME FINAL:

scv 4 de 7

-Anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo da AOAC 4752

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1978 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10186

-Anaacutelisis combinado en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo Yasumoto 1984 anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo de la AOAC y anaacutelisis de toxicidad tipo ASP por cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia meacutetodo de la AOAC 10865

-Anaacutelisis combinada en una misma muestra de toxinas lipofiacutelicas por cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de espectrometriacutea de masas (LC-MSMS) anaacutelisis de toxicidad tipo PSP por bioensayos en ratoacuten seguacuten el meacutetodo AOAC y anaacutelisis de toxicidad de tipo ASP por cromatografiacutea liquida de alta eficacia seguacuten el meacutetodo de la AOAC 15000

314402 Anaacutelisis de muestras en agua de mar -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton marino mediante

microscopiacutea oacuteptica 15133 -Identificacioacuten y recuento de fitoplancton toacutexico marino

mediante microscopiacutea oacuteptica 13333 - Anaacutelisis de carbono orgaacutenico disuelto 5093 -Anaacutelisis de nutrientes inorgaacutenicos disueltos 3500 -Anaacutelisis de pigmentos fotosinteacuteticos (clorofila ldquoardquo) por

espectrofluorimetria 1698 314403 Anaacutelisis microbioloacutegicos en moluscos y otros organismos

procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Cuantificacioacuten de E Coli 10186 - Deteccioacuten de Salmonella spp 16975 -Enumeracioacuten de Escherichia coli en moluscos bivalvos

vivos por la teacutecnica de medida directa de impedancia con el sistema BacTrac 4300 6800

314404 Anaacutelisis de contaminantes de origen quiacutemica en moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Determinacioacuten de metales pesados (Pb Cd Cu Zn As Hg Ni Cr Ag) mediante espectrofotometriacutea de absorcioacuten atoacutemica por metal

6790

-Determinacioacuten de compuestos bifenilos policlorados (PCB) mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

scv 5 de 7

-Determinacioacuten de pesticidas organoclorados mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

-Determinacioacuten de hidrocarburos aromaacuteticos policiacuteclicos (HAPs) mediante cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de fluorescencia

28200

314405 Anaacutelisis histopatoloacutegica de moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Estudio hispatoloacutegico Determinacioacuten de Bonamia Marteillia Perkinsus y otras alteraciones patoloacutegicas

101852

314406 Emisioacuten de certificaciones e informes teacutecnicos y otras actuaciones a peticioacuten del interesado

Emisioacuten de certificados a peticioacuten de los interesados sobre las actuaciones llevadas a cabo por el Instituto

1000

Emisioacuten de informes teacutecnicos a peticioacuten del interesado (euros por hora o fraccioacuten)

4000

scv 6 de 7

scv 7 de 7

ANEXO 3

Resultados de anaacutelisis en muestras de microalgas anteriormente enviadas procedentes de Magallanes por el equipo de espectrometriacutea de masas utilizado por INTECMAR Trabajo presentado a las XXXII

Congreso de Ciencias del Mar realizado en Punta Arenas 22-25 octubre de 2012

PERFIL DE TOXINAS DE PROROCENTRUM LIMA (DINOPHYCEAE) AISLADO DESDE LA COSTA DE MAGALLANES SUR DE CHILE P Salgado1 G Pizarro1 JM Franco2 P Rioboacute2 e I Bravo3

1Instituto de Fomento Pesquero (IFOP) Punta Arenas Chile gemitapizarroifopcl 2Instituto de Investigaciones Marinas (CSIC) Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea 3Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea

Prorocentrum lima (Ehrenberg) es un dinoflagelado marino bentoacutenico que se encuentra adherido generalmente

sobre macroalgas sedimentos y detrito flotante y menos comuacutenmente en el plancton (Bravo et al 2001) Es una especie neriacutetica y estuarina y su rango de distribucioacuten geograacutefica variacutea desde aguas costeras tropicales a templadas (Faust 1991) La importancia de P lima se debe a que son productoras de toxinas diarreogeacutenicas en las personas (veneno diarreico de los mariscos VDM) al igual que algunas especies de Dinophysis aunque raramente se le han asociado con episodios toacutexicos por VDM por su caraacutecter epiacutefito y bentoacutenico El complejo VDM producido por P lima incluye moleacuteculas conocidas como el aacutecido okadaico (AO) y derivados dinofisistoxinas (DTX-1 DTX-2) (Bravo et al 2001 Vale et al 2009) No obstante existen casos citados para USA donde se detectoacute toxicidad por VDM en bivalvos de cultivos asociadas a P lima aunque en bajos niveles (Maranda et al 2007a) En Canadaacute tambieacuten se llevoacute a cabo un estudio en moluscos de cultivo cuya finalidad fue determinar el origen del VDM en la que P lima fue la principal especie sospechosa tras la ocurrencia de un evento toacutexico humano por VDM ocurrido en 1998 (Levasseur et al 2003) y en antildeos anteriores (Quilliam et al 1993) Aunque Levasseur et al (2003) no logroacute probar la toxicidad de los mariscos en cultivo a causa de P lima cabe hacer notar que lo que buscaron fue OA y DTX1 no DTX 3 este uacuteltimo principal derivado de las anteriores tras su transformacioacuten en los moluscos (eg Suzuki et al 1999 Vale amp Sampayo 2002)

En consecuencia el rol de P lima en eventos toacutexicos por VDM auacuten no puede descartarse por cuanto podriacutean llegar a ser importantes en ambientes turbulentos debido a la eventual remocioacuten de microalgas adheridas en sustratos por efecto de vientos (Levasseur et al 2003) factor de importancia si se trata de sedimentos o contrariamente en zonas someras y estables de cultivos de moluscos que al mismo tiempo favorecen microambientes para sustratos en los que prolifera la epiacutefita P lima (Lawrence et al 2000) quedando expuestas a re-suspensiones temporales que favorecen la filtracioacuten de estas microalgas por los bivalvos en cultivo (Maranda et al 2007a)

Chile posee escaso conocimiento sobre esta especie en su medio natural incluido su perfil de toxinas y potencial rol en la toxificacioacuten de moluscos por VDM Por tal razoacuten resultoacute interesante aportar al conocimiento de estos aspectos en muestras de sedimentos recolectadas en el estrecho de Magallanes en las que esta especie se encontroacute inhabitualmente abundante

Las ceacutelulas utilizadas en este estudio fueron aisladas desde sedimentos superficiales (0-3 cm) recolectados en el invierno de 2010 en la localidad de cabo San Isidro durante el muestreo regular del programa de monitoreo de marea roja en la regioacuten de Magallanes En esa oportunidad se logroacute cuantificar hasta 1002 quistes tecadoscm3 de Prorocentrum lima la mayor concentracioacuten respecto a otros sitios de recolecta (Fig 1) Los sedimentos de esta localidad presentaron una coloracioacuten oscura y un fuerte olor a sulfuro de hidroacutegeno (H2S) producto de anoxia local

Se aislaron entre 27 y 87 quistes tecados (Fig 1 a) directamente desde los sedimentos mientras otras 60 ceacutelulas vegetativas (Fig 1 b) fueron aisladas luego de promover la actividad y divisioacuten de los quistes en condiciones de 15 ordmC y un ciclo de luzoscuridad de 1212 horas (Tabla 1) Para este fin se aislaron quistes tecados y trasvasijaron a placas Petri de 5 cm de diaacutemetro conteniendo 5 mL de medio de cultivo L1 Para el anaacutelisis de toxinas las ceacutelulas aisladas fueron trasvasijadas a un tubo Eppendorf de 15 mL y congelados a -80 ordmC Una aliacutecuota de sedimento huacutemedo (100 microL aproximados) tambieacuten fue vaciada en un tubo Eppendorf y congelado Para extraer la toxina se antildeadioacute 500 microL de metanol 100 a cada tubo se mezcloacute por 1 min y filtroacute por 045 microm trasvasijando a un vial El extracto fue secado bajo nitroacutegeno gas a 40 ordmC y conservado a 4 ordmC hasta su anaacutelisis Previo al anaacutelisis de toxinas los extractos fueron resuspendidos en 150 microl de metanol

La presencia de la toxina dinofisistoxina 1 (DTX-1) en las muestras (Fig2) fue confirmada en modo negativo a traveacutes de su ioacuten precursor [M-H]- mz 8175 y sus iones productos mz 5634 y 2552 mediante un cromatoacutegrafo UPLC Acquity Waters acoplado a un triple cuadrupolo Waters Xevo TQ (LC-MS) La columna utilizada fue una Acquity UPLC BEH C18 17microm 21 x 100 mm a 45 ordmC La fase moacutevil consistioacute en (A) hidroacutexido amoacutenico a pH 11 y (B) hidroacutexido amoacutenico en acetonitrilo (67 mM) con una tasa de flujo de 4 mLmin El gradiente de elucioacuten utilizado fue el siguiente mantencioacuten al 75 de A entre 0 y 066 min cambio a 5 de A entre 066 y 330 min mantener 5

de A entre 330 y 528 min recuperacioacuten del 75 de A entre 528 y 726 min mantencioacuten al 75 de A hasta 9 min Se pinchoacute 5microL de muestra en el LC-MS El contenido de DTX-1 en las muestras fue cuantificado en base al ion precursor

Los tres tipos de muestras fueron positivas a la presencia de DTX-1 pero las ceacutelulas vegetativas fueron las que presentaron un mayor contenido de DTX-1 por ceacutelula La deteccioacuten de DTX-1 en los sedimentos (Tabla 2) reflejoacute la presencia de los quistes tecados en eacutestos

Figura 1 Concentraciones de quistes tecados de Prorocentrum lima (quistescm3 de sedimento huacutemedo) en estaciones de muestreo en el Estrecho de Magallanes (M26 Estero Wickham M29N1 Isla Engenfield M31 Bahiacutea Nash M35 Cabo San Isidro M39C1 Bahiacutea Gente Grande M39C2 Bahiacutea Inuacutetil M39C3 Canal Gabriel) y Canal Beagle (M41 Ventisquero Espantildea M42 Ventisquero Holanda) (a) Quistes tecados (b) ceacutelulas vegetativas obtenidas de germinacioacuten de quistes tecados bajo condiciones de laboratorio Barra de escala 20 microm

Tabla 1 Sedimento y ceacutelulas de Prorocentrum lima aisladas para anaacutelisis de toxinas

Extracto metanoacutelico Nordm de ceacutelulas TR ngmL pg DTX-1 ceacutel

G1 quistes tecados 27 213 lt2 -

G2 quistes tecados 67 214 05 11

G3 quistes tecados 87 215 12 21

G4 ceacutelulas vegetativas 60 215 34 87

G6 sedimentos aliacutecuota 213 13 19 pg microL sed

TR tiempo de retencioacuten

Figura 2 Cromatogramas de extractos metanoacutelicos de Prorocentrum lima quistes tecados (a) ceacutelulas vegetativas (b) y sedimentos (c)

Tabla 2 Caracteriacutesticas del sedimento con quistes tecados de Prorocentrum lima

Tipo Tamantildeo (mm)

Grava 2 35

Arena media 025 - 05 32

Arena muy fina 0063 - 0125 2

Limo-arcilla lt 0063 1

Estos resultados constituyen otra eventual posibilidad de toxicidad en los moluscos por VDM no soacutelo de aquellos con modalidad de vida bentoacutenica superficial sino de aquellos que tambieacuten viven enterrados en la arena (eg almeja huepo) Maacutes auacuten si se conoce que P lima posee la capacidad de desarrollar poblaciones naturales en aguas templadas en nuacutemeros que podriacutean justificar una toxicidad por VDM en los mariscos (eg Maranda et al 2007a b)

Referencias

Bravo I ML Fernaacutendez I Ramilo amp A Martinez 2001 Toxin composition of the toxic dinofagellate Prorocentrum lima isolated from different locations along the Galician coast (NW Spain) Toxicon 39 1537ndash1545

Faust MA 1991 Morphology of ciguatera-causing Prorocentrum lima (Pyrrophyta) from widely differing sites J Phycol 27 642-648

Lawrence J E Grant J Quilliam M A Bauder A G amp Cembella A D 2000 Colonizaition and growth of the toxic dinoflagellate Prorocentrum lima and associated fouling macroalgae on mussels in suspended culture Mar Ecol Prog Ser 201 147-154

Levasseur M Couture J Y Weise A M Michaud S Elbrachter M Sauveacute G amp Bonneau E 2003 Pelagic and epiphytic summer distributions of Prorocentrum lima and P mexicanum at two mussel farms in the Gulf of St Lawrence Aquat Microbiol Ecol 30283-293

Maranda L Corwin S Dover S amp Morton S L 2007a Prorocentrum lima (Dinophyceae) in northeastern USA coastal waters II Toxin load in the epibiota and in shellfish Harmful Algae 6 632-641

Maranda L Corwin S Hargraves P E 2007b Prorocentrum lima (Dinophyceae) in 19 northeastern USA coastal waters I Abundance and distribution Harmful Algae 6 623ndash631

Quilliam MA Gilgan MW amp Pleasance S 1993 Confirmation of an incident of diarrhetic shellfish poisoning in eastern Canada In Smayda TJ Shimizu Y (Eds) Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea Elsevier New York pp 547ndash552

Suzuki T Ota H amp Yamasaki M 1999 Direct evidence of transformation of dinophysistoxin-1 to 7-O-acyl-dinophysistoxin-1 (Dinophysis-3) in the scallop Patinopecten yessoensis Toxicon 37 187-198

Vale P amp Sampayo M A 2002 First confirmation of human diarrhoeic poisonings by okadaic acid esters after ingestion of razor clams (Solen marginatus) and green crabs (Carcinus maenas) in Aveiro lagoon Portugal and detection of okadaic acid esters in phytoplankton Toxicon 40989-996

Vale P Veloso V amp Amorim A 2009 Toxin composition of a Prorocentrum lima strain isolated from the Portuguese coast Toxicon 54145ndash152

Agradecimientos Intecmar de la Xunta de Galicia Espantildea donde se realizaron los anaacutelisis de toxinas proyecto

SUBPESCA ldquoManejo y Monitoreo de Mareas Rojas en las regiones de Los Lagos Ayseacuten y Magallanes IV etapa 2010rdquo

ANEXO 4

Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten

ANEXO 5

Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de Magallanes

TASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

O

EJE

MP

LA

R P

AR

A E

L IN

TE

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DO

LIQ

UID

AC

IOacuteN

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

EN

TID

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BA

NC

AR

IATASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

0 9

4 0

2 4INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

AD

MIN

IST

RA

CIOacute

NTASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

9520 euros

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

CONSELLERIA DE FACENDA

ANEXO 6

Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para cierre

de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

Seccioacuten Ediciones y Produccioacuten Almte Manuel Blanco Encalada 839

Fono 56-32-2151500 Valparaiacuteso Chile

wwwifopcl

Page 41: “Análisis de toxinas lipofílicas mediante LC-MS/MS en ...metadatos.mma.gob.cl/sinia/Informe_final_Analisis_toxinas_lipofilicas_656-055.pdfSUBSECRETARÍA DE ECONOMÍA: INFORME FINAL:

scv 5 de 7

-Determinacioacuten de pesticidas organoclorados mediante cromatografiacutea de gases-espectrometriacutea de masas

50926

-Determinacioacuten de hidrocarburos aromaacuteticos policiacuteclicos (HAPs) mediante cromatografiacutea liacutequida con deteccioacuten de fluorescencia

28200

314405 Anaacutelisis histopatoloacutegica de moluscos y otros organismos procedentes de la pesca el marisqueo y la acuicultura

- Estudio hispatoloacutegico Determinacioacuten de Bonamia Marteillia Perkinsus y otras alteraciones patoloacutegicas

101852

314406 Emisioacuten de certificaciones e informes teacutecnicos y otras actuaciones a peticioacuten del interesado

Emisioacuten de certificados a peticioacuten de los interesados sobre las actuaciones llevadas a cabo por el Instituto

1000

Emisioacuten de informes teacutecnicos a peticioacuten del interesado (euros por hora o fraccioacuten)

4000

scv 6 de 7

scv 7 de 7

ANEXO 3

Resultados de anaacutelisis en muestras de microalgas anteriormente enviadas procedentes de Magallanes por el equipo de espectrometriacutea de masas utilizado por INTECMAR Trabajo presentado a las XXXII

Congreso de Ciencias del Mar realizado en Punta Arenas 22-25 octubre de 2012

PERFIL DE TOXINAS DE PROROCENTRUM LIMA (DINOPHYCEAE) AISLADO DESDE LA COSTA DE MAGALLANES SUR DE CHILE P Salgado1 G Pizarro1 JM Franco2 P Rioboacute2 e I Bravo3

1Instituto de Fomento Pesquero (IFOP) Punta Arenas Chile gemitapizarroifopcl 2Instituto de Investigaciones Marinas (CSIC) Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea 3Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea

Prorocentrum lima (Ehrenberg) es un dinoflagelado marino bentoacutenico que se encuentra adherido generalmente

sobre macroalgas sedimentos y detrito flotante y menos comuacutenmente en el plancton (Bravo et al 2001) Es una especie neriacutetica y estuarina y su rango de distribucioacuten geograacutefica variacutea desde aguas costeras tropicales a templadas (Faust 1991) La importancia de P lima se debe a que son productoras de toxinas diarreogeacutenicas en las personas (veneno diarreico de los mariscos VDM) al igual que algunas especies de Dinophysis aunque raramente se le han asociado con episodios toacutexicos por VDM por su caraacutecter epiacutefito y bentoacutenico El complejo VDM producido por P lima incluye moleacuteculas conocidas como el aacutecido okadaico (AO) y derivados dinofisistoxinas (DTX-1 DTX-2) (Bravo et al 2001 Vale et al 2009) No obstante existen casos citados para USA donde se detectoacute toxicidad por VDM en bivalvos de cultivos asociadas a P lima aunque en bajos niveles (Maranda et al 2007a) En Canadaacute tambieacuten se llevoacute a cabo un estudio en moluscos de cultivo cuya finalidad fue determinar el origen del VDM en la que P lima fue la principal especie sospechosa tras la ocurrencia de un evento toacutexico humano por VDM ocurrido en 1998 (Levasseur et al 2003) y en antildeos anteriores (Quilliam et al 1993) Aunque Levasseur et al (2003) no logroacute probar la toxicidad de los mariscos en cultivo a causa de P lima cabe hacer notar que lo que buscaron fue OA y DTX1 no DTX 3 este uacuteltimo principal derivado de las anteriores tras su transformacioacuten en los moluscos (eg Suzuki et al 1999 Vale amp Sampayo 2002)

En consecuencia el rol de P lima en eventos toacutexicos por VDM auacuten no puede descartarse por cuanto podriacutean llegar a ser importantes en ambientes turbulentos debido a la eventual remocioacuten de microalgas adheridas en sustratos por efecto de vientos (Levasseur et al 2003) factor de importancia si se trata de sedimentos o contrariamente en zonas someras y estables de cultivos de moluscos que al mismo tiempo favorecen microambientes para sustratos en los que prolifera la epiacutefita P lima (Lawrence et al 2000) quedando expuestas a re-suspensiones temporales que favorecen la filtracioacuten de estas microalgas por los bivalvos en cultivo (Maranda et al 2007a)

Chile posee escaso conocimiento sobre esta especie en su medio natural incluido su perfil de toxinas y potencial rol en la toxificacioacuten de moluscos por VDM Por tal razoacuten resultoacute interesante aportar al conocimiento de estos aspectos en muestras de sedimentos recolectadas en el estrecho de Magallanes en las que esta especie se encontroacute inhabitualmente abundante

Las ceacutelulas utilizadas en este estudio fueron aisladas desde sedimentos superficiales (0-3 cm) recolectados en el invierno de 2010 en la localidad de cabo San Isidro durante el muestreo regular del programa de monitoreo de marea roja en la regioacuten de Magallanes En esa oportunidad se logroacute cuantificar hasta 1002 quistes tecadoscm3 de Prorocentrum lima la mayor concentracioacuten respecto a otros sitios de recolecta (Fig 1) Los sedimentos de esta localidad presentaron una coloracioacuten oscura y un fuerte olor a sulfuro de hidroacutegeno (H2S) producto de anoxia local

Se aislaron entre 27 y 87 quistes tecados (Fig 1 a) directamente desde los sedimentos mientras otras 60 ceacutelulas vegetativas (Fig 1 b) fueron aisladas luego de promover la actividad y divisioacuten de los quistes en condiciones de 15 ordmC y un ciclo de luzoscuridad de 1212 horas (Tabla 1) Para este fin se aislaron quistes tecados y trasvasijaron a placas Petri de 5 cm de diaacutemetro conteniendo 5 mL de medio de cultivo L1 Para el anaacutelisis de toxinas las ceacutelulas aisladas fueron trasvasijadas a un tubo Eppendorf de 15 mL y congelados a -80 ordmC Una aliacutecuota de sedimento huacutemedo (100 microL aproximados) tambieacuten fue vaciada en un tubo Eppendorf y congelado Para extraer la toxina se antildeadioacute 500 microL de metanol 100 a cada tubo se mezcloacute por 1 min y filtroacute por 045 microm trasvasijando a un vial El extracto fue secado bajo nitroacutegeno gas a 40 ordmC y conservado a 4 ordmC hasta su anaacutelisis Previo al anaacutelisis de toxinas los extractos fueron resuspendidos en 150 microl de metanol

La presencia de la toxina dinofisistoxina 1 (DTX-1) en las muestras (Fig2) fue confirmada en modo negativo a traveacutes de su ioacuten precursor [M-H]- mz 8175 y sus iones productos mz 5634 y 2552 mediante un cromatoacutegrafo UPLC Acquity Waters acoplado a un triple cuadrupolo Waters Xevo TQ (LC-MS) La columna utilizada fue una Acquity UPLC BEH C18 17microm 21 x 100 mm a 45 ordmC La fase moacutevil consistioacute en (A) hidroacutexido amoacutenico a pH 11 y (B) hidroacutexido amoacutenico en acetonitrilo (67 mM) con una tasa de flujo de 4 mLmin El gradiente de elucioacuten utilizado fue el siguiente mantencioacuten al 75 de A entre 0 y 066 min cambio a 5 de A entre 066 y 330 min mantener 5

de A entre 330 y 528 min recuperacioacuten del 75 de A entre 528 y 726 min mantencioacuten al 75 de A hasta 9 min Se pinchoacute 5microL de muestra en el LC-MS El contenido de DTX-1 en las muestras fue cuantificado en base al ion precursor

Los tres tipos de muestras fueron positivas a la presencia de DTX-1 pero las ceacutelulas vegetativas fueron las que presentaron un mayor contenido de DTX-1 por ceacutelula La deteccioacuten de DTX-1 en los sedimentos (Tabla 2) reflejoacute la presencia de los quistes tecados en eacutestos

Figura 1 Concentraciones de quistes tecados de Prorocentrum lima (quistescm3 de sedimento huacutemedo) en estaciones de muestreo en el Estrecho de Magallanes (M26 Estero Wickham M29N1 Isla Engenfield M31 Bahiacutea Nash M35 Cabo San Isidro M39C1 Bahiacutea Gente Grande M39C2 Bahiacutea Inuacutetil M39C3 Canal Gabriel) y Canal Beagle (M41 Ventisquero Espantildea M42 Ventisquero Holanda) (a) Quistes tecados (b) ceacutelulas vegetativas obtenidas de germinacioacuten de quistes tecados bajo condiciones de laboratorio Barra de escala 20 microm

Tabla 1 Sedimento y ceacutelulas de Prorocentrum lima aisladas para anaacutelisis de toxinas

Extracto metanoacutelico Nordm de ceacutelulas TR ngmL pg DTX-1 ceacutel

G1 quistes tecados 27 213 lt2 -

G2 quistes tecados 67 214 05 11

G3 quistes tecados 87 215 12 21

G4 ceacutelulas vegetativas 60 215 34 87

G6 sedimentos aliacutecuota 213 13 19 pg microL sed

TR tiempo de retencioacuten

Figura 2 Cromatogramas de extractos metanoacutelicos de Prorocentrum lima quistes tecados (a) ceacutelulas vegetativas (b) y sedimentos (c)

Tabla 2 Caracteriacutesticas del sedimento con quistes tecados de Prorocentrum lima

Tipo Tamantildeo (mm)

Grava 2 35

Arena media 025 - 05 32

Arena muy fina 0063 - 0125 2

Limo-arcilla lt 0063 1

Estos resultados constituyen otra eventual posibilidad de toxicidad en los moluscos por VDM no soacutelo de aquellos con modalidad de vida bentoacutenica superficial sino de aquellos que tambieacuten viven enterrados en la arena (eg almeja huepo) Maacutes auacuten si se conoce que P lima posee la capacidad de desarrollar poblaciones naturales en aguas templadas en nuacutemeros que podriacutean justificar una toxicidad por VDM en los mariscos (eg Maranda et al 2007a b)

Referencias

Bravo I ML Fernaacutendez I Ramilo amp A Martinez 2001 Toxin composition of the toxic dinofagellate Prorocentrum lima isolated from different locations along the Galician coast (NW Spain) Toxicon 39 1537ndash1545

Faust MA 1991 Morphology of ciguatera-causing Prorocentrum lima (Pyrrophyta) from widely differing sites J Phycol 27 642-648

Lawrence J E Grant J Quilliam M A Bauder A G amp Cembella A D 2000 Colonizaition and growth of the toxic dinoflagellate Prorocentrum lima and associated fouling macroalgae on mussels in suspended culture Mar Ecol Prog Ser 201 147-154

Levasseur M Couture J Y Weise A M Michaud S Elbrachter M Sauveacute G amp Bonneau E 2003 Pelagic and epiphytic summer distributions of Prorocentrum lima and P mexicanum at two mussel farms in the Gulf of St Lawrence Aquat Microbiol Ecol 30283-293

Maranda L Corwin S Dover S amp Morton S L 2007a Prorocentrum lima (Dinophyceae) in northeastern USA coastal waters II Toxin load in the epibiota and in shellfish Harmful Algae 6 632-641

Maranda L Corwin S Hargraves P E 2007b Prorocentrum lima (Dinophyceae) in 19 northeastern USA coastal waters I Abundance and distribution Harmful Algae 6 623ndash631

Quilliam MA Gilgan MW amp Pleasance S 1993 Confirmation of an incident of diarrhetic shellfish poisoning in eastern Canada In Smayda TJ Shimizu Y (Eds) Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea Elsevier New York pp 547ndash552

Suzuki T Ota H amp Yamasaki M 1999 Direct evidence of transformation of dinophysistoxin-1 to 7-O-acyl-dinophysistoxin-1 (Dinophysis-3) in the scallop Patinopecten yessoensis Toxicon 37 187-198

Vale P amp Sampayo M A 2002 First confirmation of human diarrhoeic poisonings by okadaic acid esters after ingestion of razor clams (Solen marginatus) and green crabs (Carcinus maenas) in Aveiro lagoon Portugal and detection of okadaic acid esters in phytoplankton Toxicon 40989-996

Vale P Veloso V amp Amorim A 2009 Toxin composition of a Prorocentrum lima strain isolated from the Portuguese coast Toxicon 54145ndash152

Agradecimientos Intecmar de la Xunta de Galicia Espantildea donde se realizaron los anaacutelisis de toxinas proyecto

SUBPESCA ldquoManejo y Monitoreo de Mareas Rojas en las regiones de Los Lagos Ayseacuten y Magallanes IV etapa 2010rdquo

ANEXO 4

Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten

ANEXO 5

Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de Magallanes

TASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

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O

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MP

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BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

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NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

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AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

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TID

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BA

NC

AR

IATASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

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CIOacute

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BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

0 9

4 0

2 4INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

AD

MIN

IST

RA

CIOacute

NTASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

9520 euros

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

CONSELLERIA DE FACENDA

ANEXO 6

Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para cierre

de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

Seccioacuten Ediciones y Produccioacuten Almte Manuel Blanco Encalada 839

Fono 56-32-2151500 Valparaiacuteso Chile

wwwifopcl

Page 42: “Análisis de toxinas lipofílicas mediante LC-MS/MS en ...metadatos.mma.gob.cl/sinia/Informe_final_Analisis_toxinas_lipofilicas_656-055.pdfSUBSECRETARÍA DE ECONOMÍA: INFORME FINAL:

scv 6 de 7

scv 7 de 7

ANEXO 3

Resultados de anaacutelisis en muestras de microalgas anteriormente enviadas procedentes de Magallanes por el equipo de espectrometriacutea de masas utilizado por INTECMAR Trabajo presentado a las XXXII

Congreso de Ciencias del Mar realizado en Punta Arenas 22-25 octubre de 2012

PERFIL DE TOXINAS DE PROROCENTRUM LIMA (DINOPHYCEAE) AISLADO DESDE LA COSTA DE MAGALLANES SUR DE CHILE P Salgado1 G Pizarro1 JM Franco2 P Rioboacute2 e I Bravo3

1Instituto de Fomento Pesquero (IFOP) Punta Arenas Chile gemitapizarroifopcl 2Instituto de Investigaciones Marinas (CSIC) Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea 3Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea

Prorocentrum lima (Ehrenberg) es un dinoflagelado marino bentoacutenico que se encuentra adherido generalmente

sobre macroalgas sedimentos y detrito flotante y menos comuacutenmente en el plancton (Bravo et al 2001) Es una especie neriacutetica y estuarina y su rango de distribucioacuten geograacutefica variacutea desde aguas costeras tropicales a templadas (Faust 1991) La importancia de P lima se debe a que son productoras de toxinas diarreogeacutenicas en las personas (veneno diarreico de los mariscos VDM) al igual que algunas especies de Dinophysis aunque raramente se le han asociado con episodios toacutexicos por VDM por su caraacutecter epiacutefito y bentoacutenico El complejo VDM producido por P lima incluye moleacuteculas conocidas como el aacutecido okadaico (AO) y derivados dinofisistoxinas (DTX-1 DTX-2) (Bravo et al 2001 Vale et al 2009) No obstante existen casos citados para USA donde se detectoacute toxicidad por VDM en bivalvos de cultivos asociadas a P lima aunque en bajos niveles (Maranda et al 2007a) En Canadaacute tambieacuten se llevoacute a cabo un estudio en moluscos de cultivo cuya finalidad fue determinar el origen del VDM en la que P lima fue la principal especie sospechosa tras la ocurrencia de un evento toacutexico humano por VDM ocurrido en 1998 (Levasseur et al 2003) y en antildeos anteriores (Quilliam et al 1993) Aunque Levasseur et al (2003) no logroacute probar la toxicidad de los mariscos en cultivo a causa de P lima cabe hacer notar que lo que buscaron fue OA y DTX1 no DTX 3 este uacuteltimo principal derivado de las anteriores tras su transformacioacuten en los moluscos (eg Suzuki et al 1999 Vale amp Sampayo 2002)

En consecuencia el rol de P lima en eventos toacutexicos por VDM auacuten no puede descartarse por cuanto podriacutean llegar a ser importantes en ambientes turbulentos debido a la eventual remocioacuten de microalgas adheridas en sustratos por efecto de vientos (Levasseur et al 2003) factor de importancia si se trata de sedimentos o contrariamente en zonas someras y estables de cultivos de moluscos que al mismo tiempo favorecen microambientes para sustratos en los que prolifera la epiacutefita P lima (Lawrence et al 2000) quedando expuestas a re-suspensiones temporales que favorecen la filtracioacuten de estas microalgas por los bivalvos en cultivo (Maranda et al 2007a)

Chile posee escaso conocimiento sobre esta especie en su medio natural incluido su perfil de toxinas y potencial rol en la toxificacioacuten de moluscos por VDM Por tal razoacuten resultoacute interesante aportar al conocimiento de estos aspectos en muestras de sedimentos recolectadas en el estrecho de Magallanes en las que esta especie se encontroacute inhabitualmente abundante

Las ceacutelulas utilizadas en este estudio fueron aisladas desde sedimentos superficiales (0-3 cm) recolectados en el invierno de 2010 en la localidad de cabo San Isidro durante el muestreo regular del programa de monitoreo de marea roja en la regioacuten de Magallanes En esa oportunidad se logroacute cuantificar hasta 1002 quistes tecadoscm3 de Prorocentrum lima la mayor concentracioacuten respecto a otros sitios de recolecta (Fig 1) Los sedimentos de esta localidad presentaron una coloracioacuten oscura y un fuerte olor a sulfuro de hidroacutegeno (H2S) producto de anoxia local

Se aislaron entre 27 y 87 quistes tecados (Fig 1 a) directamente desde los sedimentos mientras otras 60 ceacutelulas vegetativas (Fig 1 b) fueron aisladas luego de promover la actividad y divisioacuten de los quistes en condiciones de 15 ordmC y un ciclo de luzoscuridad de 1212 horas (Tabla 1) Para este fin se aislaron quistes tecados y trasvasijaron a placas Petri de 5 cm de diaacutemetro conteniendo 5 mL de medio de cultivo L1 Para el anaacutelisis de toxinas las ceacutelulas aisladas fueron trasvasijadas a un tubo Eppendorf de 15 mL y congelados a -80 ordmC Una aliacutecuota de sedimento huacutemedo (100 microL aproximados) tambieacuten fue vaciada en un tubo Eppendorf y congelado Para extraer la toxina se antildeadioacute 500 microL de metanol 100 a cada tubo se mezcloacute por 1 min y filtroacute por 045 microm trasvasijando a un vial El extracto fue secado bajo nitroacutegeno gas a 40 ordmC y conservado a 4 ordmC hasta su anaacutelisis Previo al anaacutelisis de toxinas los extractos fueron resuspendidos en 150 microl de metanol

La presencia de la toxina dinofisistoxina 1 (DTX-1) en las muestras (Fig2) fue confirmada en modo negativo a traveacutes de su ioacuten precursor [M-H]- mz 8175 y sus iones productos mz 5634 y 2552 mediante un cromatoacutegrafo UPLC Acquity Waters acoplado a un triple cuadrupolo Waters Xevo TQ (LC-MS) La columna utilizada fue una Acquity UPLC BEH C18 17microm 21 x 100 mm a 45 ordmC La fase moacutevil consistioacute en (A) hidroacutexido amoacutenico a pH 11 y (B) hidroacutexido amoacutenico en acetonitrilo (67 mM) con una tasa de flujo de 4 mLmin El gradiente de elucioacuten utilizado fue el siguiente mantencioacuten al 75 de A entre 0 y 066 min cambio a 5 de A entre 066 y 330 min mantener 5

de A entre 330 y 528 min recuperacioacuten del 75 de A entre 528 y 726 min mantencioacuten al 75 de A hasta 9 min Se pinchoacute 5microL de muestra en el LC-MS El contenido de DTX-1 en las muestras fue cuantificado en base al ion precursor

Los tres tipos de muestras fueron positivas a la presencia de DTX-1 pero las ceacutelulas vegetativas fueron las que presentaron un mayor contenido de DTX-1 por ceacutelula La deteccioacuten de DTX-1 en los sedimentos (Tabla 2) reflejoacute la presencia de los quistes tecados en eacutestos

Figura 1 Concentraciones de quistes tecados de Prorocentrum lima (quistescm3 de sedimento huacutemedo) en estaciones de muestreo en el Estrecho de Magallanes (M26 Estero Wickham M29N1 Isla Engenfield M31 Bahiacutea Nash M35 Cabo San Isidro M39C1 Bahiacutea Gente Grande M39C2 Bahiacutea Inuacutetil M39C3 Canal Gabriel) y Canal Beagle (M41 Ventisquero Espantildea M42 Ventisquero Holanda) (a) Quistes tecados (b) ceacutelulas vegetativas obtenidas de germinacioacuten de quistes tecados bajo condiciones de laboratorio Barra de escala 20 microm

Tabla 1 Sedimento y ceacutelulas de Prorocentrum lima aisladas para anaacutelisis de toxinas

Extracto metanoacutelico Nordm de ceacutelulas TR ngmL pg DTX-1 ceacutel

G1 quistes tecados 27 213 lt2 -

G2 quistes tecados 67 214 05 11

G3 quistes tecados 87 215 12 21

G4 ceacutelulas vegetativas 60 215 34 87

G6 sedimentos aliacutecuota 213 13 19 pg microL sed

TR tiempo de retencioacuten

Figura 2 Cromatogramas de extractos metanoacutelicos de Prorocentrum lima quistes tecados (a) ceacutelulas vegetativas (b) y sedimentos (c)

Tabla 2 Caracteriacutesticas del sedimento con quistes tecados de Prorocentrum lima

Tipo Tamantildeo (mm)

Grava 2 35

Arena media 025 - 05 32

Arena muy fina 0063 - 0125 2

Limo-arcilla lt 0063 1

Estos resultados constituyen otra eventual posibilidad de toxicidad en los moluscos por VDM no soacutelo de aquellos con modalidad de vida bentoacutenica superficial sino de aquellos que tambieacuten viven enterrados en la arena (eg almeja huepo) Maacutes auacuten si se conoce que P lima posee la capacidad de desarrollar poblaciones naturales en aguas templadas en nuacutemeros que podriacutean justificar una toxicidad por VDM en los mariscos (eg Maranda et al 2007a b)

Referencias

Bravo I ML Fernaacutendez I Ramilo amp A Martinez 2001 Toxin composition of the toxic dinofagellate Prorocentrum lima isolated from different locations along the Galician coast (NW Spain) Toxicon 39 1537ndash1545

Faust MA 1991 Morphology of ciguatera-causing Prorocentrum lima (Pyrrophyta) from widely differing sites J Phycol 27 642-648

Lawrence J E Grant J Quilliam M A Bauder A G amp Cembella A D 2000 Colonizaition and growth of the toxic dinoflagellate Prorocentrum lima and associated fouling macroalgae on mussels in suspended culture Mar Ecol Prog Ser 201 147-154

Levasseur M Couture J Y Weise A M Michaud S Elbrachter M Sauveacute G amp Bonneau E 2003 Pelagic and epiphytic summer distributions of Prorocentrum lima and P mexicanum at two mussel farms in the Gulf of St Lawrence Aquat Microbiol Ecol 30283-293

Maranda L Corwin S Dover S amp Morton S L 2007a Prorocentrum lima (Dinophyceae) in northeastern USA coastal waters II Toxin load in the epibiota and in shellfish Harmful Algae 6 632-641

Maranda L Corwin S Hargraves P E 2007b Prorocentrum lima (Dinophyceae) in 19 northeastern USA coastal waters I Abundance and distribution Harmful Algae 6 623ndash631

Quilliam MA Gilgan MW amp Pleasance S 1993 Confirmation of an incident of diarrhetic shellfish poisoning in eastern Canada In Smayda TJ Shimizu Y (Eds) Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea Elsevier New York pp 547ndash552

Suzuki T Ota H amp Yamasaki M 1999 Direct evidence of transformation of dinophysistoxin-1 to 7-O-acyl-dinophysistoxin-1 (Dinophysis-3) in the scallop Patinopecten yessoensis Toxicon 37 187-198

Vale P amp Sampayo M A 2002 First confirmation of human diarrhoeic poisonings by okadaic acid esters after ingestion of razor clams (Solen marginatus) and green crabs (Carcinus maenas) in Aveiro lagoon Portugal and detection of okadaic acid esters in phytoplankton Toxicon 40989-996

Vale P Veloso V amp Amorim A 2009 Toxin composition of a Prorocentrum lima strain isolated from the Portuguese coast Toxicon 54145ndash152

Agradecimientos Intecmar de la Xunta de Galicia Espantildea donde se realizaron los anaacutelisis de toxinas proyecto

SUBPESCA ldquoManejo y Monitoreo de Mareas Rojas en las regiones de Los Lagos Ayseacuten y Magallanes IV etapa 2010rdquo

ANEXO 4

Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten

ANEXO 5

Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de Magallanes

TASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

O

EJE

MP

LA

R P

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A E

L IN

TE

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SA

DO

LIQ

UID

AC

IOacuteN

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

EN

TID

AD

BA

NC

AR

IATASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

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OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

0 9

4 0

2 4INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

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MIN

IST

RA

CIOacute

NTASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

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OL

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CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

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DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

9520 euros

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

CONSELLERIA DE FACENDA

ANEXO 6

Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para cierre

de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

Seccioacuten Ediciones y Produccioacuten Almte Manuel Blanco Encalada 839

Fono 56-32-2151500 Valparaiacuteso Chile

wwwifopcl

Page 43: “Análisis de toxinas lipofílicas mediante LC-MS/MS en ...metadatos.mma.gob.cl/sinia/Informe_final_Analisis_toxinas_lipofilicas_656-055.pdfSUBSECRETARÍA DE ECONOMÍA: INFORME FINAL:

scv 7 de 7

ANEXO 3

Resultados de anaacutelisis en muestras de microalgas anteriormente enviadas procedentes de Magallanes por el equipo de espectrometriacutea de masas utilizado por INTECMAR Trabajo presentado a las XXXII

Congreso de Ciencias del Mar realizado en Punta Arenas 22-25 octubre de 2012

PERFIL DE TOXINAS DE PROROCENTRUM LIMA (DINOPHYCEAE) AISLADO DESDE LA COSTA DE MAGALLANES SUR DE CHILE P Salgado1 G Pizarro1 JM Franco2 P Rioboacute2 e I Bravo3

1Instituto de Fomento Pesquero (IFOP) Punta Arenas Chile gemitapizarroifopcl 2Instituto de Investigaciones Marinas (CSIC) Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea 3Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea

Prorocentrum lima (Ehrenberg) es un dinoflagelado marino bentoacutenico que se encuentra adherido generalmente

sobre macroalgas sedimentos y detrito flotante y menos comuacutenmente en el plancton (Bravo et al 2001) Es una especie neriacutetica y estuarina y su rango de distribucioacuten geograacutefica variacutea desde aguas costeras tropicales a templadas (Faust 1991) La importancia de P lima se debe a que son productoras de toxinas diarreogeacutenicas en las personas (veneno diarreico de los mariscos VDM) al igual que algunas especies de Dinophysis aunque raramente se le han asociado con episodios toacutexicos por VDM por su caraacutecter epiacutefito y bentoacutenico El complejo VDM producido por P lima incluye moleacuteculas conocidas como el aacutecido okadaico (AO) y derivados dinofisistoxinas (DTX-1 DTX-2) (Bravo et al 2001 Vale et al 2009) No obstante existen casos citados para USA donde se detectoacute toxicidad por VDM en bivalvos de cultivos asociadas a P lima aunque en bajos niveles (Maranda et al 2007a) En Canadaacute tambieacuten se llevoacute a cabo un estudio en moluscos de cultivo cuya finalidad fue determinar el origen del VDM en la que P lima fue la principal especie sospechosa tras la ocurrencia de un evento toacutexico humano por VDM ocurrido en 1998 (Levasseur et al 2003) y en antildeos anteriores (Quilliam et al 1993) Aunque Levasseur et al (2003) no logroacute probar la toxicidad de los mariscos en cultivo a causa de P lima cabe hacer notar que lo que buscaron fue OA y DTX1 no DTX 3 este uacuteltimo principal derivado de las anteriores tras su transformacioacuten en los moluscos (eg Suzuki et al 1999 Vale amp Sampayo 2002)

En consecuencia el rol de P lima en eventos toacutexicos por VDM auacuten no puede descartarse por cuanto podriacutean llegar a ser importantes en ambientes turbulentos debido a la eventual remocioacuten de microalgas adheridas en sustratos por efecto de vientos (Levasseur et al 2003) factor de importancia si se trata de sedimentos o contrariamente en zonas someras y estables de cultivos de moluscos que al mismo tiempo favorecen microambientes para sustratos en los que prolifera la epiacutefita P lima (Lawrence et al 2000) quedando expuestas a re-suspensiones temporales que favorecen la filtracioacuten de estas microalgas por los bivalvos en cultivo (Maranda et al 2007a)

Chile posee escaso conocimiento sobre esta especie en su medio natural incluido su perfil de toxinas y potencial rol en la toxificacioacuten de moluscos por VDM Por tal razoacuten resultoacute interesante aportar al conocimiento de estos aspectos en muestras de sedimentos recolectadas en el estrecho de Magallanes en las que esta especie se encontroacute inhabitualmente abundante

Las ceacutelulas utilizadas en este estudio fueron aisladas desde sedimentos superficiales (0-3 cm) recolectados en el invierno de 2010 en la localidad de cabo San Isidro durante el muestreo regular del programa de monitoreo de marea roja en la regioacuten de Magallanes En esa oportunidad se logroacute cuantificar hasta 1002 quistes tecadoscm3 de Prorocentrum lima la mayor concentracioacuten respecto a otros sitios de recolecta (Fig 1) Los sedimentos de esta localidad presentaron una coloracioacuten oscura y un fuerte olor a sulfuro de hidroacutegeno (H2S) producto de anoxia local

Se aislaron entre 27 y 87 quistes tecados (Fig 1 a) directamente desde los sedimentos mientras otras 60 ceacutelulas vegetativas (Fig 1 b) fueron aisladas luego de promover la actividad y divisioacuten de los quistes en condiciones de 15 ordmC y un ciclo de luzoscuridad de 1212 horas (Tabla 1) Para este fin se aislaron quistes tecados y trasvasijaron a placas Petri de 5 cm de diaacutemetro conteniendo 5 mL de medio de cultivo L1 Para el anaacutelisis de toxinas las ceacutelulas aisladas fueron trasvasijadas a un tubo Eppendorf de 15 mL y congelados a -80 ordmC Una aliacutecuota de sedimento huacutemedo (100 microL aproximados) tambieacuten fue vaciada en un tubo Eppendorf y congelado Para extraer la toxina se antildeadioacute 500 microL de metanol 100 a cada tubo se mezcloacute por 1 min y filtroacute por 045 microm trasvasijando a un vial El extracto fue secado bajo nitroacutegeno gas a 40 ordmC y conservado a 4 ordmC hasta su anaacutelisis Previo al anaacutelisis de toxinas los extractos fueron resuspendidos en 150 microl de metanol

La presencia de la toxina dinofisistoxina 1 (DTX-1) en las muestras (Fig2) fue confirmada en modo negativo a traveacutes de su ioacuten precursor [M-H]- mz 8175 y sus iones productos mz 5634 y 2552 mediante un cromatoacutegrafo UPLC Acquity Waters acoplado a un triple cuadrupolo Waters Xevo TQ (LC-MS) La columna utilizada fue una Acquity UPLC BEH C18 17microm 21 x 100 mm a 45 ordmC La fase moacutevil consistioacute en (A) hidroacutexido amoacutenico a pH 11 y (B) hidroacutexido amoacutenico en acetonitrilo (67 mM) con una tasa de flujo de 4 mLmin El gradiente de elucioacuten utilizado fue el siguiente mantencioacuten al 75 de A entre 0 y 066 min cambio a 5 de A entre 066 y 330 min mantener 5

de A entre 330 y 528 min recuperacioacuten del 75 de A entre 528 y 726 min mantencioacuten al 75 de A hasta 9 min Se pinchoacute 5microL de muestra en el LC-MS El contenido de DTX-1 en las muestras fue cuantificado en base al ion precursor

Los tres tipos de muestras fueron positivas a la presencia de DTX-1 pero las ceacutelulas vegetativas fueron las que presentaron un mayor contenido de DTX-1 por ceacutelula La deteccioacuten de DTX-1 en los sedimentos (Tabla 2) reflejoacute la presencia de los quistes tecados en eacutestos

Figura 1 Concentraciones de quistes tecados de Prorocentrum lima (quistescm3 de sedimento huacutemedo) en estaciones de muestreo en el Estrecho de Magallanes (M26 Estero Wickham M29N1 Isla Engenfield M31 Bahiacutea Nash M35 Cabo San Isidro M39C1 Bahiacutea Gente Grande M39C2 Bahiacutea Inuacutetil M39C3 Canal Gabriel) y Canal Beagle (M41 Ventisquero Espantildea M42 Ventisquero Holanda) (a) Quistes tecados (b) ceacutelulas vegetativas obtenidas de germinacioacuten de quistes tecados bajo condiciones de laboratorio Barra de escala 20 microm

Tabla 1 Sedimento y ceacutelulas de Prorocentrum lima aisladas para anaacutelisis de toxinas

Extracto metanoacutelico Nordm de ceacutelulas TR ngmL pg DTX-1 ceacutel

G1 quistes tecados 27 213 lt2 -

G2 quistes tecados 67 214 05 11

G3 quistes tecados 87 215 12 21

G4 ceacutelulas vegetativas 60 215 34 87

G6 sedimentos aliacutecuota 213 13 19 pg microL sed

TR tiempo de retencioacuten

Figura 2 Cromatogramas de extractos metanoacutelicos de Prorocentrum lima quistes tecados (a) ceacutelulas vegetativas (b) y sedimentos (c)

Tabla 2 Caracteriacutesticas del sedimento con quistes tecados de Prorocentrum lima

Tipo Tamantildeo (mm)

Grava 2 35

Arena media 025 - 05 32

Arena muy fina 0063 - 0125 2

Limo-arcilla lt 0063 1

Estos resultados constituyen otra eventual posibilidad de toxicidad en los moluscos por VDM no soacutelo de aquellos con modalidad de vida bentoacutenica superficial sino de aquellos que tambieacuten viven enterrados en la arena (eg almeja huepo) Maacutes auacuten si se conoce que P lima posee la capacidad de desarrollar poblaciones naturales en aguas templadas en nuacutemeros que podriacutean justificar una toxicidad por VDM en los mariscos (eg Maranda et al 2007a b)

Referencias

Bravo I ML Fernaacutendez I Ramilo amp A Martinez 2001 Toxin composition of the toxic dinofagellate Prorocentrum lima isolated from different locations along the Galician coast (NW Spain) Toxicon 39 1537ndash1545

Faust MA 1991 Morphology of ciguatera-causing Prorocentrum lima (Pyrrophyta) from widely differing sites J Phycol 27 642-648

Lawrence J E Grant J Quilliam M A Bauder A G amp Cembella A D 2000 Colonizaition and growth of the toxic dinoflagellate Prorocentrum lima and associated fouling macroalgae on mussels in suspended culture Mar Ecol Prog Ser 201 147-154

Levasseur M Couture J Y Weise A M Michaud S Elbrachter M Sauveacute G amp Bonneau E 2003 Pelagic and epiphytic summer distributions of Prorocentrum lima and P mexicanum at two mussel farms in the Gulf of St Lawrence Aquat Microbiol Ecol 30283-293

Maranda L Corwin S Dover S amp Morton S L 2007a Prorocentrum lima (Dinophyceae) in northeastern USA coastal waters II Toxin load in the epibiota and in shellfish Harmful Algae 6 632-641

Maranda L Corwin S Hargraves P E 2007b Prorocentrum lima (Dinophyceae) in 19 northeastern USA coastal waters I Abundance and distribution Harmful Algae 6 623ndash631

Quilliam MA Gilgan MW amp Pleasance S 1993 Confirmation of an incident of diarrhetic shellfish poisoning in eastern Canada In Smayda TJ Shimizu Y (Eds) Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea Elsevier New York pp 547ndash552

Suzuki T Ota H amp Yamasaki M 1999 Direct evidence of transformation of dinophysistoxin-1 to 7-O-acyl-dinophysistoxin-1 (Dinophysis-3) in the scallop Patinopecten yessoensis Toxicon 37 187-198

Vale P amp Sampayo M A 2002 First confirmation of human diarrhoeic poisonings by okadaic acid esters after ingestion of razor clams (Solen marginatus) and green crabs (Carcinus maenas) in Aveiro lagoon Portugal and detection of okadaic acid esters in phytoplankton Toxicon 40989-996

Vale P Veloso V amp Amorim A 2009 Toxin composition of a Prorocentrum lima strain isolated from the Portuguese coast Toxicon 54145ndash152

Agradecimientos Intecmar de la Xunta de Galicia Espantildea donde se realizaron los anaacutelisis de toxinas proyecto

SUBPESCA ldquoManejo y Monitoreo de Mareas Rojas en las regiones de Los Lagos Ayseacuten y Magallanes IV etapa 2010rdquo

ANEXO 4

Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten

ANEXO 5

Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de Magallanes

TASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

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IOacuteN

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

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NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

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AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

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2 4

3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

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TID

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IATASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

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Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

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BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

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VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

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9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

0 9

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2 4INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

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BASE DE CALCULO O BASE IM-

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TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

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PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

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3 1 4 4 0 1

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

9520 euros

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

CONSELLERIA DE FACENDA

ANEXO 6

Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para cierre

de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

Seccioacuten Ediciones y Produccioacuten Almte Manuel Blanco Encalada 839

Fono 56-32-2151500 Valparaiacuteso Chile

wwwifopcl

Page 44: “Análisis de toxinas lipofílicas mediante LC-MS/MS en ...metadatos.mma.gob.cl/sinia/Informe_final_Analisis_toxinas_lipofilicas_656-055.pdfSUBSECRETARÍA DE ECONOMÍA: INFORME FINAL:

ANEXO 3

Resultados de anaacutelisis en muestras de microalgas anteriormente enviadas procedentes de Magallanes por el equipo de espectrometriacutea de masas utilizado por INTECMAR Trabajo presentado a las XXXII

Congreso de Ciencias del Mar realizado en Punta Arenas 22-25 octubre de 2012

PERFIL DE TOXINAS DE PROROCENTRUM LIMA (DINOPHYCEAE) AISLADO DESDE LA COSTA DE MAGALLANES SUR DE CHILE P Salgado1 G Pizarro1 JM Franco2 P Rioboacute2 e I Bravo3

1Instituto de Fomento Pesquero (IFOP) Punta Arenas Chile gemitapizarroifopcl 2Instituto de Investigaciones Marinas (CSIC) Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea 3Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea

Prorocentrum lima (Ehrenberg) es un dinoflagelado marino bentoacutenico que se encuentra adherido generalmente

sobre macroalgas sedimentos y detrito flotante y menos comuacutenmente en el plancton (Bravo et al 2001) Es una especie neriacutetica y estuarina y su rango de distribucioacuten geograacutefica variacutea desde aguas costeras tropicales a templadas (Faust 1991) La importancia de P lima se debe a que son productoras de toxinas diarreogeacutenicas en las personas (veneno diarreico de los mariscos VDM) al igual que algunas especies de Dinophysis aunque raramente se le han asociado con episodios toacutexicos por VDM por su caraacutecter epiacutefito y bentoacutenico El complejo VDM producido por P lima incluye moleacuteculas conocidas como el aacutecido okadaico (AO) y derivados dinofisistoxinas (DTX-1 DTX-2) (Bravo et al 2001 Vale et al 2009) No obstante existen casos citados para USA donde se detectoacute toxicidad por VDM en bivalvos de cultivos asociadas a P lima aunque en bajos niveles (Maranda et al 2007a) En Canadaacute tambieacuten se llevoacute a cabo un estudio en moluscos de cultivo cuya finalidad fue determinar el origen del VDM en la que P lima fue la principal especie sospechosa tras la ocurrencia de un evento toacutexico humano por VDM ocurrido en 1998 (Levasseur et al 2003) y en antildeos anteriores (Quilliam et al 1993) Aunque Levasseur et al (2003) no logroacute probar la toxicidad de los mariscos en cultivo a causa de P lima cabe hacer notar que lo que buscaron fue OA y DTX1 no DTX 3 este uacuteltimo principal derivado de las anteriores tras su transformacioacuten en los moluscos (eg Suzuki et al 1999 Vale amp Sampayo 2002)

En consecuencia el rol de P lima en eventos toacutexicos por VDM auacuten no puede descartarse por cuanto podriacutean llegar a ser importantes en ambientes turbulentos debido a la eventual remocioacuten de microalgas adheridas en sustratos por efecto de vientos (Levasseur et al 2003) factor de importancia si se trata de sedimentos o contrariamente en zonas someras y estables de cultivos de moluscos que al mismo tiempo favorecen microambientes para sustratos en los que prolifera la epiacutefita P lima (Lawrence et al 2000) quedando expuestas a re-suspensiones temporales que favorecen la filtracioacuten de estas microalgas por los bivalvos en cultivo (Maranda et al 2007a)

Chile posee escaso conocimiento sobre esta especie en su medio natural incluido su perfil de toxinas y potencial rol en la toxificacioacuten de moluscos por VDM Por tal razoacuten resultoacute interesante aportar al conocimiento de estos aspectos en muestras de sedimentos recolectadas en el estrecho de Magallanes en las que esta especie se encontroacute inhabitualmente abundante

Las ceacutelulas utilizadas en este estudio fueron aisladas desde sedimentos superficiales (0-3 cm) recolectados en el invierno de 2010 en la localidad de cabo San Isidro durante el muestreo regular del programa de monitoreo de marea roja en la regioacuten de Magallanes En esa oportunidad se logroacute cuantificar hasta 1002 quistes tecadoscm3 de Prorocentrum lima la mayor concentracioacuten respecto a otros sitios de recolecta (Fig 1) Los sedimentos de esta localidad presentaron una coloracioacuten oscura y un fuerte olor a sulfuro de hidroacutegeno (H2S) producto de anoxia local

Se aislaron entre 27 y 87 quistes tecados (Fig 1 a) directamente desde los sedimentos mientras otras 60 ceacutelulas vegetativas (Fig 1 b) fueron aisladas luego de promover la actividad y divisioacuten de los quistes en condiciones de 15 ordmC y un ciclo de luzoscuridad de 1212 horas (Tabla 1) Para este fin se aislaron quistes tecados y trasvasijaron a placas Petri de 5 cm de diaacutemetro conteniendo 5 mL de medio de cultivo L1 Para el anaacutelisis de toxinas las ceacutelulas aisladas fueron trasvasijadas a un tubo Eppendorf de 15 mL y congelados a -80 ordmC Una aliacutecuota de sedimento huacutemedo (100 microL aproximados) tambieacuten fue vaciada en un tubo Eppendorf y congelado Para extraer la toxina se antildeadioacute 500 microL de metanol 100 a cada tubo se mezcloacute por 1 min y filtroacute por 045 microm trasvasijando a un vial El extracto fue secado bajo nitroacutegeno gas a 40 ordmC y conservado a 4 ordmC hasta su anaacutelisis Previo al anaacutelisis de toxinas los extractos fueron resuspendidos en 150 microl de metanol

La presencia de la toxina dinofisistoxina 1 (DTX-1) en las muestras (Fig2) fue confirmada en modo negativo a traveacutes de su ioacuten precursor [M-H]- mz 8175 y sus iones productos mz 5634 y 2552 mediante un cromatoacutegrafo UPLC Acquity Waters acoplado a un triple cuadrupolo Waters Xevo TQ (LC-MS) La columna utilizada fue una Acquity UPLC BEH C18 17microm 21 x 100 mm a 45 ordmC La fase moacutevil consistioacute en (A) hidroacutexido amoacutenico a pH 11 y (B) hidroacutexido amoacutenico en acetonitrilo (67 mM) con una tasa de flujo de 4 mLmin El gradiente de elucioacuten utilizado fue el siguiente mantencioacuten al 75 de A entre 0 y 066 min cambio a 5 de A entre 066 y 330 min mantener 5

de A entre 330 y 528 min recuperacioacuten del 75 de A entre 528 y 726 min mantencioacuten al 75 de A hasta 9 min Se pinchoacute 5microL de muestra en el LC-MS El contenido de DTX-1 en las muestras fue cuantificado en base al ion precursor

Los tres tipos de muestras fueron positivas a la presencia de DTX-1 pero las ceacutelulas vegetativas fueron las que presentaron un mayor contenido de DTX-1 por ceacutelula La deteccioacuten de DTX-1 en los sedimentos (Tabla 2) reflejoacute la presencia de los quistes tecados en eacutestos

Figura 1 Concentraciones de quistes tecados de Prorocentrum lima (quistescm3 de sedimento huacutemedo) en estaciones de muestreo en el Estrecho de Magallanes (M26 Estero Wickham M29N1 Isla Engenfield M31 Bahiacutea Nash M35 Cabo San Isidro M39C1 Bahiacutea Gente Grande M39C2 Bahiacutea Inuacutetil M39C3 Canal Gabriel) y Canal Beagle (M41 Ventisquero Espantildea M42 Ventisquero Holanda) (a) Quistes tecados (b) ceacutelulas vegetativas obtenidas de germinacioacuten de quistes tecados bajo condiciones de laboratorio Barra de escala 20 microm

Tabla 1 Sedimento y ceacutelulas de Prorocentrum lima aisladas para anaacutelisis de toxinas

Extracto metanoacutelico Nordm de ceacutelulas TR ngmL pg DTX-1 ceacutel

G1 quistes tecados 27 213 lt2 -

G2 quistes tecados 67 214 05 11

G3 quistes tecados 87 215 12 21

G4 ceacutelulas vegetativas 60 215 34 87

G6 sedimentos aliacutecuota 213 13 19 pg microL sed

TR tiempo de retencioacuten

Figura 2 Cromatogramas de extractos metanoacutelicos de Prorocentrum lima quistes tecados (a) ceacutelulas vegetativas (b) y sedimentos (c)

Tabla 2 Caracteriacutesticas del sedimento con quistes tecados de Prorocentrum lima

Tipo Tamantildeo (mm)

Grava 2 35

Arena media 025 - 05 32

Arena muy fina 0063 - 0125 2

Limo-arcilla lt 0063 1

Estos resultados constituyen otra eventual posibilidad de toxicidad en los moluscos por VDM no soacutelo de aquellos con modalidad de vida bentoacutenica superficial sino de aquellos que tambieacuten viven enterrados en la arena (eg almeja huepo) Maacutes auacuten si se conoce que P lima posee la capacidad de desarrollar poblaciones naturales en aguas templadas en nuacutemeros que podriacutean justificar una toxicidad por VDM en los mariscos (eg Maranda et al 2007a b)

Referencias

Bravo I ML Fernaacutendez I Ramilo amp A Martinez 2001 Toxin composition of the toxic dinofagellate Prorocentrum lima isolated from different locations along the Galician coast (NW Spain) Toxicon 39 1537ndash1545

Faust MA 1991 Morphology of ciguatera-causing Prorocentrum lima (Pyrrophyta) from widely differing sites J Phycol 27 642-648

Lawrence J E Grant J Quilliam M A Bauder A G amp Cembella A D 2000 Colonizaition and growth of the toxic dinoflagellate Prorocentrum lima and associated fouling macroalgae on mussels in suspended culture Mar Ecol Prog Ser 201 147-154

Levasseur M Couture J Y Weise A M Michaud S Elbrachter M Sauveacute G amp Bonneau E 2003 Pelagic and epiphytic summer distributions of Prorocentrum lima and P mexicanum at two mussel farms in the Gulf of St Lawrence Aquat Microbiol Ecol 30283-293

Maranda L Corwin S Dover S amp Morton S L 2007a Prorocentrum lima (Dinophyceae) in northeastern USA coastal waters II Toxin load in the epibiota and in shellfish Harmful Algae 6 632-641

Maranda L Corwin S Hargraves P E 2007b Prorocentrum lima (Dinophyceae) in 19 northeastern USA coastal waters I Abundance and distribution Harmful Algae 6 623ndash631

Quilliam MA Gilgan MW amp Pleasance S 1993 Confirmation of an incident of diarrhetic shellfish poisoning in eastern Canada In Smayda TJ Shimizu Y (Eds) Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea Elsevier New York pp 547ndash552

Suzuki T Ota H amp Yamasaki M 1999 Direct evidence of transformation of dinophysistoxin-1 to 7-O-acyl-dinophysistoxin-1 (Dinophysis-3) in the scallop Patinopecten yessoensis Toxicon 37 187-198

Vale P amp Sampayo M A 2002 First confirmation of human diarrhoeic poisonings by okadaic acid esters after ingestion of razor clams (Solen marginatus) and green crabs (Carcinus maenas) in Aveiro lagoon Portugal and detection of okadaic acid esters in phytoplankton Toxicon 40989-996

Vale P Veloso V amp Amorim A 2009 Toxin composition of a Prorocentrum lima strain isolated from the Portuguese coast Toxicon 54145ndash152

Agradecimientos Intecmar de la Xunta de Galicia Espantildea donde se realizaron los anaacutelisis de toxinas proyecto

SUBPESCA ldquoManejo y Monitoreo de Mareas Rojas en las regiones de Los Lagos Ayseacuten y Magallanes IV etapa 2010rdquo

ANEXO 4

Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten

ANEXO 5

Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de Magallanes

TASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

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TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

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IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

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TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

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9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

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Sello Fecha Nuacutemero

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BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

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IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

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VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

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9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

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MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

0 9

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2 4INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

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NTASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

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BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

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Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

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NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

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MEDIO RURAL E DO MAR

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ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

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BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

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Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

9520 euros

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

CONSELLERIA DE FACENDA

ANEXO 6

Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para cierre

de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

Seccioacuten Ediciones y Produccioacuten Almte Manuel Blanco Encalada 839

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PERFIL DE TOXINAS DE PROROCENTRUM LIMA (DINOPHYCEAE) AISLADO DESDE LA COSTA DE MAGALLANES SUR DE CHILE P Salgado1 G Pizarro1 JM Franco2 P Rioboacute2 e I Bravo3

1Instituto de Fomento Pesquero (IFOP) Punta Arenas Chile gemitapizarroifopcl 2Instituto de Investigaciones Marinas (CSIC) Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea 3Instituto Espantildeol de Oceanografiacutea Centro Oceanograacutefico de Vigo (IEO) Vigo Espantildea

Prorocentrum lima (Ehrenberg) es un dinoflagelado marino bentoacutenico que se encuentra adherido generalmente

sobre macroalgas sedimentos y detrito flotante y menos comuacutenmente en el plancton (Bravo et al 2001) Es una especie neriacutetica y estuarina y su rango de distribucioacuten geograacutefica variacutea desde aguas costeras tropicales a templadas (Faust 1991) La importancia de P lima se debe a que son productoras de toxinas diarreogeacutenicas en las personas (veneno diarreico de los mariscos VDM) al igual que algunas especies de Dinophysis aunque raramente se le han asociado con episodios toacutexicos por VDM por su caraacutecter epiacutefito y bentoacutenico El complejo VDM producido por P lima incluye moleacuteculas conocidas como el aacutecido okadaico (AO) y derivados dinofisistoxinas (DTX-1 DTX-2) (Bravo et al 2001 Vale et al 2009) No obstante existen casos citados para USA donde se detectoacute toxicidad por VDM en bivalvos de cultivos asociadas a P lima aunque en bajos niveles (Maranda et al 2007a) En Canadaacute tambieacuten se llevoacute a cabo un estudio en moluscos de cultivo cuya finalidad fue determinar el origen del VDM en la que P lima fue la principal especie sospechosa tras la ocurrencia de un evento toacutexico humano por VDM ocurrido en 1998 (Levasseur et al 2003) y en antildeos anteriores (Quilliam et al 1993) Aunque Levasseur et al (2003) no logroacute probar la toxicidad de los mariscos en cultivo a causa de P lima cabe hacer notar que lo que buscaron fue OA y DTX1 no DTX 3 este uacuteltimo principal derivado de las anteriores tras su transformacioacuten en los moluscos (eg Suzuki et al 1999 Vale amp Sampayo 2002)

En consecuencia el rol de P lima en eventos toacutexicos por VDM auacuten no puede descartarse por cuanto podriacutean llegar a ser importantes en ambientes turbulentos debido a la eventual remocioacuten de microalgas adheridas en sustratos por efecto de vientos (Levasseur et al 2003) factor de importancia si se trata de sedimentos o contrariamente en zonas someras y estables de cultivos de moluscos que al mismo tiempo favorecen microambientes para sustratos en los que prolifera la epiacutefita P lima (Lawrence et al 2000) quedando expuestas a re-suspensiones temporales que favorecen la filtracioacuten de estas microalgas por los bivalvos en cultivo (Maranda et al 2007a)

Chile posee escaso conocimiento sobre esta especie en su medio natural incluido su perfil de toxinas y potencial rol en la toxificacioacuten de moluscos por VDM Por tal razoacuten resultoacute interesante aportar al conocimiento de estos aspectos en muestras de sedimentos recolectadas en el estrecho de Magallanes en las que esta especie se encontroacute inhabitualmente abundante

Las ceacutelulas utilizadas en este estudio fueron aisladas desde sedimentos superficiales (0-3 cm) recolectados en el invierno de 2010 en la localidad de cabo San Isidro durante el muestreo regular del programa de monitoreo de marea roja en la regioacuten de Magallanes En esa oportunidad se logroacute cuantificar hasta 1002 quistes tecadoscm3 de Prorocentrum lima la mayor concentracioacuten respecto a otros sitios de recolecta (Fig 1) Los sedimentos de esta localidad presentaron una coloracioacuten oscura y un fuerte olor a sulfuro de hidroacutegeno (H2S) producto de anoxia local

Se aislaron entre 27 y 87 quistes tecados (Fig 1 a) directamente desde los sedimentos mientras otras 60 ceacutelulas vegetativas (Fig 1 b) fueron aisladas luego de promover la actividad y divisioacuten de los quistes en condiciones de 15 ordmC y un ciclo de luzoscuridad de 1212 horas (Tabla 1) Para este fin se aislaron quistes tecados y trasvasijaron a placas Petri de 5 cm de diaacutemetro conteniendo 5 mL de medio de cultivo L1 Para el anaacutelisis de toxinas las ceacutelulas aisladas fueron trasvasijadas a un tubo Eppendorf de 15 mL y congelados a -80 ordmC Una aliacutecuota de sedimento huacutemedo (100 microL aproximados) tambieacuten fue vaciada en un tubo Eppendorf y congelado Para extraer la toxina se antildeadioacute 500 microL de metanol 100 a cada tubo se mezcloacute por 1 min y filtroacute por 045 microm trasvasijando a un vial El extracto fue secado bajo nitroacutegeno gas a 40 ordmC y conservado a 4 ordmC hasta su anaacutelisis Previo al anaacutelisis de toxinas los extractos fueron resuspendidos en 150 microl de metanol

La presencia de la toxina dinofisistoxina 1 (DTX-1) en las muestras (Fig2) fue confirmada en modo negativo a traveacutes de su ioacuten precursor [M-H]- mz 8175 y sus iones productos mz 5634 y 2552 mediante un cromatoacutegrafo UPLC Acquity Waters acoplado a un triple cuadrupolo Waters Xevo TQ (LC-MS) La columna utilizada fue una Acquity UPLC BEH C18 17microm 21 x 100 mm a 45 ordmC La fase moacutevil consistioacute en (A) hidroacutexido amoacutenico a pH 11 y (B) hidroacutexido amoacutenico en acetonitrilo (67 mM) con una tasa de flujo de 4 mLmin El gradiente de elucioacuten utilizado fue el siguiente mantencioacuten al 75 de A entre 0 y 066 min cambio a 5 de A entre 066 y 330 min mantener 5

de A entre 330 y 528 min recuperacioacuten del 75 de A entre 528 y 726 min mantencioacuten al 75 de A hasta 9 min Se pinchoacute 5microL de muestra en el LC-MS El contenido de DTX-1 en las muestras fue cuantificado en base al ion precursor

Los tres tipos de muestras fueron positivas a la presencia de DTX-1 pero las ceacutelulas vegetativas fueron las que presentaron un mayor contenido de DTX-1 por ceacutelula La deteccioacuten de DTX-1 en los sedimentos (Tabla 2) reflejoacute la presencia de los quistes tecados en eacutestos

Figura 1 Concentraciones de quistes tecados de Prorocentrum lima (quistescm3 de sedimento huacutemedo) en estaciones de muestreo en el Estrecho de Magallanes (M26 Estero Wickham M29N1 Isla Engenfield M31 Bahiacutea Nash M35 Cabo San Isidro M39C1 Bahiacutea Gente Grande M39C2 Bahiacutea Inuacutetil M39C3 Canal Gabriel) y Canal Beagle (M41 Ventisquero Espantildea M42 Ventisquero Holanda) (a) Quistes tecados (b) ceacutelulas vegetativas obtenidas de germinacioacuten de quistes tecados bajo condiciones de laboratorio Barra de escala 20 microm

Tabla 1 Sedimento y ceacutelulas de Prorocentrum lima aisladas para anaacutelisis de toxinas

Extracto metanoacutelico Nordm de ceacutelulas TR ngmL pg DTX-1 ceacutel

G1 quistes tecados 27 213 lt2 -

G2 quistes tecados 67 214 05 11

G3 quistes tecados 87 215 12 21

G4 ceacutelulas vegetativas 60 215 34 87

G6 sedimentos aliacutecuota 213 13 19 pg microL sed

TR tiempo de retencioacuten

Figura 2 Cromatogramas de extractos metanoacutelicos de Prorocentrum lima quistes tecados (a) ceacutelulas vegetativas (b) y sedimentos (c)

Tabla 2 Caracteriacutesticas del sedimento con quistes tecados de Prorocentrum lima

Tipo Tamantildeo (mm)

Grava 2 35

Arena media 025 - 05 32

Arena muy fina 0063 - 0125 2

Limo-arcilla lt 0063 1

Estos resultados constituyen otra eventual posibilidad de toxicidad en los moluscos por VDM no soacutelo de aquellos con modalidad de vida bentoacutenica superficial sino de aquellos que tambieacuten viven enterrados en la arena (eg almeja huepo) Maacutes auacuten si se conoce que P lima posee la capacidad de desarrollar poblaciones naturales en aguas templadas en nuacutemeros que podriacutean justificar una toxicidad por VDM en los mariscos (eg Maranda et al 2007a b)

Referencias

Bravo I ML Fernaacutendez I Ramilo amp A Martinez 2001 Toxin composition of the toxic dinofagellate Prorocentrum lima isolated from different locations along the Galician coast (NW Spain) Toxicon 39 1537ndash1545

Faust MA 1991 Morphology of ciguatera-causing Prorocentrum lima (Pyrrophyta) from widely differing sites J Phycol 27 642-648

Lawrence J E Grant J Quilliam M A Bauder A G amp Cembella A D 2000 Colonizaition and growth of the toxic dinoflagellate Prorocentrum lima and associated fouling macroalgae on mussels in suspended culture Mar Ecol Prog Ser 201 147-154

Levasseur M Couture J Y Weise A M Michaud S Elbrachter M Sauveacute G amp Bonneau E 2003 Pelagic and epiphytic summer distributions of Prorocentrum lima and P mexicanum at two mussel farms in the Gulf of St Lawrence Aquat Microbiol Ecol 30283-293

Maranda L Corwin S Dover S amp Morton S L 2007a Prorocentrum lima (Dinophyceae) in northeastern USA coastal waters II Toxin load in the epibiota and in shellfish Harmful Algae 6 632-641

Maranda L Corwin S Hargraves P E 2007b Prorocentrum lima (Dinophyceae) in 19 northeastern USA coastal waters I Abundance and distribution Harmful Algae 6 623ndash631

Quilliam MA Gilgan MW amp Pleasance S 1993 Confirmation of an incident of diarrhetic shellfish poisoning in eastern Canada In Smayda TJ Shimizu Y (Eds) Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea Elsevier New York pp 547ndash552

Suzuki T Ota H amp Yamasaki M 1999 Direct evidence of transformation of dinophysistoxin-1 to 7-O-acyl-dinophysistoxin-1 (Dinophysis-3) in the scallop Patinopecten yessoensis Toxicon 37 187-198

Vale P amp Sampayo M A 2002 First confirmation of human diarrhoeic poisonings by okadaic acid esters after ingestion of razor clams (Solen marginatus) and green crabs (Carcinus maenas) in Aveiro lagoon Portugal and detection of okadaic acid esters in phytoplankton Toxicon 40989-996

Vale P Veloso V amp Amorim A 2009 Toxin composition of a Prorocentrum lima strain isolated from the Portuguese coast Toxicon 54145ndash152

Agradecimientos Intecmar de la Xunta de Galicia Espantildea donde se realizaron los anaacutelisis de toxinas proyecto

SUBPESCA ldquoManejo y Monitoreo de Mareas Rojas en las regiones de Los Lagos Ayseacuten y Magallanes IV etapa 2010rdquo

ANEXO 4

Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten

ANEXO 5

Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de Magallanes

TASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

O

EJE

MP

LA

R P

AR

A E

L IN

TE

RE

SA

DO

LIQ

UID

AC

IOacuteN

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

EN

TID

AD

BA

NC

AR

IATASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

0 9

4 0

2 4INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

AD

MIN

IST

RA

CIOacute

NTASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

9520 euros

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

CONSELLERIA DE FACENDA

ANEXO 6

Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para cierre

de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

Seccioacuten Ediciones y Produccioacuten Almte Manuel Blanco Encalada 839

Fono 56-32-2151500 Valparaiacuteso Chile

wwwifopcl

Page 46: “Análisis de toxinas lipofílicas mediante LC-MS/MS en ...metadatos.mma.gob.cl/sinia/Informe_final_Analisis_toxinas_lipofilicas_656-055.pdfSUBSECRETARÍA DE ECONOMÍA: INFORME FINAL:

de A entre 330 y 528 min recuperacioacuten del 75 de A entre 528 y 726 min mantencioacuten al 75 de A hasta 9 min Se pinchoacute 5microL de muestra en el LC-MS El contenido de DTX-1 en las muestras fue cuantificado en base al ion precursor

Los tres tipos de muestras fueron positivas a la presencia de DTX-1 pero las ceacutelulas vegetativas fueron las que presentaron un mayor contenido de DTX-1 por ceacutelula La deteccioacuten de DTX-1 en los sedimentos (Tabla 2) reflejoacute la presencia de los quistes tecados en eacutestos

Figura 1 Concentraciones de quistes tecados de Prorocentrum lima (quistescm3 de sedimento huacutemedo) en estaciones de muestreo en el Estrecho de Magallanes (M26 Estero Wickham M29N1 Isla Engenfield M31 Bahiacutea Nash M35 Cabo San Isidro M39C1 Bahiacutea Gente Grande M39C2 Bahiacutea Inuacutetil M39C3 Canal Gabriel) y Canal Beagle (M41 Ventisquero Espantildea M42 Ventisquero Holanda) (a) Quistes tecados (b) ceacutelulas vegetativas obtenidas de germinacioacuten de quistes tecados bajo condiciones de laboratorio Barra de escala 20 microm

Tabla 1 Sedimento y ceacutelulas de Prorocentrum lima aisladas para anaacutelisis de toxinas

Extracto metanoacutelico Nordm de ceacutelulas TR ngmL pg DTX-1 ceacutel

G1 quistes tecados 27 213 lt2 -

G2 quistes tecados 67 214 05 11

G3 quistes tecados 87 215 12 21

G4 ceacutelulas vegetativas 60 215 34 87

G6 sedimentos aliacutecuota 213 13 19 pg microL sed

TR tiempo de retencioacuten

Figura 2 Cromatogramas de extractos metanoacutelicos de Prorocentrum lima quistes tecados (a) ceacutelulas vegetativas (b) y sedimentos (c)

Tabla 2 Caracteriacutesticas del sedimento con quistes tecados de Prorocentrum lima

Tipo Tamantildeo (mm)

Grava 2 35

Arena media 025 - 05 32

Arena muy fina 0063 - 0125 2

Limo-arcilla lt 0063 1

Estos resultados constituyen otra eventual posibilidad de toxicidad en los moluscos por VDM no soacutelo de aquellos con modalidad de vida bentoacutenica superficial sino de aquellos que tambieacuten viven enterrados en la arena (eg almeja huepo) Maacutes auacuten si se conoce que P lima posee la capacidad de desarrollar poblaciones naturales en aguas templadas en nuacutemeros que podriacutean justificar una toxicidad por VDM en los mariscos (eg Maranda et al 2007a b)

Referencias

Bravo I ML Fernaacutendez I Ramilo amp A Martinez 2001 Toxin composition of the toxic dinofagellate Prorocentrum lima isolated from different locations along the Galician coast (NW Spain) Toxicon 39 1537ndash1545

Faust MA 1991 Morphology of ciguatera-causing Prorocentrum lima (Pyrrophyta) from widely differing sites J Phycol 27 642-648

Lawrence J E Grant J Quilliam M A Bauder A G amp Cembella A D 2000 Colonizaition and growth of the toxic dinoflagellate Prorocentrum lima and associated fouling macroalgae on mussels in suspended culture Mar Ecol Prog Ser 201 147-154

Levasseur M Couture J Y Weise A M Michaud S Elbrachter M Sauveacute G amp Bonneau E 2003 Pelagic and epiphytic summer distributions of Prorocentrum lima and P mexicanum at two mussel farms in the Gulf of St Lawrence Aquat Microbiol Ecol 30283-293

Maranda L Corwin S Dover S amp Morton S L 2007a Prorocentrum lima (Dinophyceae) in northeastern USA coastal waters II Toxin load in the epibiota and in shellfish Harmful Algae 6 632-641

Maranda L Corwin S Hargraves P E 2007b Prorocentrum lima (Dinophyceae) in 19 northeastern USA coastal waters I Abundance and distribution Harmful Algae 6 623ndash631

Quilliam MA Gilgan MW amp Pleasance S 1993 Confirmation of an incident of diarrhetic shellfish poisoning in eastern Canada In Smayda TJ Shimizu Y (Eds) Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea Elsevier New York pp 547ndash552

Suzuki T Ota H amp Yamasaki M 1999 Direct evidence of transformation of dinophysistoxin-1 to 7-O-acyl-dinophysistoxin-1 (Dinophysis-3) in the scallop Patinopecten yessoensis Toxicon 37 187-198

Vale P amp Sampayo M A 2002 First confirmation of human diarrhoeic poisonings by okadaic acid esters after ingestion of razor clams (Solen marginatus) and green crabs (Carcinus maenas) in Aveiro lagoon Portugal and detection of okadaic acid esters in phytoplankton Toxicon 40989-996

Vale P Veloso V amp Amorim A 2009 Toxin composition of a Prorocentrum lima strain isolated from the Portuguese coast Toxicon 54145ndash152

Agradecimientos Intecmar de la Xunta de Galicia Espantildea donde se realizaron los anaacutelisis de toxinas proyecto

SUBPESCA ldquoManejo y Monitoreo de Mareas Rojas en las regiones de Los Lagos Ayseacuten y Magallanes IV etapa 2010rdquo

ANEXO 4

Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten

ANEXO 5

Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de Magallanes

TASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

O

EJE

MP

LA

R P

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A E

L IN

TE

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SA

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UID

AC

IOacuteN

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

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OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

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LA

EN

TID

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BA

NC

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IATASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

0 9

4 0

2 4INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

AD

MIN

IST

RA

CIOacute

NTASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

9520 euros

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

CONSELLERIA DE FACENDA

ANEXO 6

Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para cierre

de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

Seccioacuten Ediciones y Produccioacuten Almte Manuel Blanco Encalada 839

Fono 56-32-2151500 Valparaiacuteso Chile

wwwifopcl

Page 47: “Análisis de toxinas lipofílicas mediante LC-MS/MS en ...metadatos.mma.gob.cl/sinia/Informe_final_Analisis_toxinas_lipofilicas_656-055.pdfSUBSECRETARÍA DE ECONOMÍA: INFORME FINAL:

Figura 2 Cromatogramas de extractos metanoacutelicos de Prorocentrum lima quistes tecados (a) ceacutelulas vegetativas (b) y sedimentos (c)

Tabla 2 Caracteriacutesticas del sedimento con quistes tecados de Prorocentrum lima

Tipo Tamantildeo (mm)

Grava 2 35

Arena media 025 - 05 32

Arena muy fina 0063 - 0125 2

Limo-arcilla lt 0063 1

Estos resultados constituyen otra eventual posibilidad de toxicidad en los moluscos por VDM no soacutelo de aquellos con modalidad de vida bentoacutenica superficial sino de aquellos que tambieacuten viven enterrados en la arena (eg almeja huepo) Maacutes auacuten si se conoce que P lima posee la capacidad de desarrollar poblaciones naturales en aguas templadas en nuacutemeros que podriacutean justificar una toxicidad por VDM en los mariscos (eg Maranda et al 2007a b)

Referencias

Bravo I ML Fernaacutendez I Ramilo amp A Martinez 2001 Toxin composition of the toxic dinofagellate Prorocentrum lima isolated from different locations along the Galician coast (NW Spain) Toxicon 39 1537ndash1545

Faust MA 1991 Morphology of ciguatera-causing Prorocentrum lima (Pyrrophyta) from widely differing sites J Phycol 27 642-648

Lawrence J E Grant J Quilliam M A Bauder A G amp Cembella A D 2000 Colonizaition and growth of the toxic dinoflagellate Prorocentrum lima and associated fouling macroalgae on mussels in suspended culture Mar Ecol Prog Ser 201 147-154

Levasseur M Couture J Y Weise A M Michaud S Elbrachter M Sauveacute G amp Bonneau E 2003 Pelagic and epiphytic summer distributions of Prorocentrum lima and P mexicanum at two mussel farms in the Gulf of St Lawrence Aquat Microbiol Ecol 30283-293

Maranda L Corwin S Dover S amp Morton S L 2007a Prorocentrum lima (Dinophyceae) in northeastern USA coastal waters II Toxin load in the epibiota and in shellfish Harmful Algae 6 632-641

Maranda L Corwin S Hargraves P E 2007b Prorocentrum lima (Dinophyceae) in 19 northeastern USA coastal waters I Abundance and distribution Harmful Algae 6 623ndash631

Quilliam MA Gilgan MW amp Pleasance S 1993 Confirmation of an incident of diarrhetic shellfish poisoning in eastern Canada In Smayda TJ Shimizu Y (Eds) Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea Elsevier New York pp 547ndash552

Suzuki T Ota H amp Yamasaki M 1999 Direct evidence of transformation of dinophysistoxin-1 to 7-O-acyl-dinophysistoxin-1 (Dinophysis-3) in the scallop Patinopecten yessoensis Toxicon 37 187-198

Vale P amp Sampayo M A 2002 First confirmation of human diarrhoeic poisonings by okadaic acid esters after ingestion of razor clams (Solen marginatus) and green crabs (Carcinus maenas) in Aveiro lagoon Portugal and detection of okadaic acid esters in phytoplankton Toxicon 40989-996

Vale P Veloso V amp Amorim A 2009 Toxin composition of a Prorocentrum lima strain isolated from the Portuguese coast Toxicon 54145ndash152

Agradecimientos Intecmar de la Xunta de Galicia Espantildea donde se realizaron los anaacutelisis de toxinas proyecto

SUBPESCA ldquoManejo y Monitoreo de Mareas Rojas en las regiones de Los Lagos Ayseacuten y Magallanes IV etapa 2010rdquo

ANEXO 4

Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten

ANEXO 5

Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de Magallanes

TASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

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EJE

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BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

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DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

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LA

EN

TID

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BA

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AR

IATASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

0 9

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2 4INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

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MIN

IST

RA

CIOacute

NTASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

9520 euros

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

CONSELLERIA DE FACENDA

ANEXO 6

Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para cierre

de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

Seccioacuten Ediciones y Produccioacuten Almte Manuel Blanco Encalada 839

Fono 56-32-2151500 Valparaiacuteso Chile

wwwifopcl

Page 48: “Análisis de toxinas lipofílicas mediante LC-MS/MS en ...metadatos.mma.gob.cl/sinia/Informe_final_Analisis_toxinas_lipofilicas_656-055.pdfSUBSECRETARÍA DE ECONOMÍA: INFORME FINAL:

Referencias

Bravo I ML Fernaacutendez I Ramilo amp A Martinez 2001 Toxin composition of the toxic dinofagellate Prorocentrum lima isolated from different locations along the Galician coast (NW Spain) Toxicon 39 1537ndash1545

Faust MA 1991 Morphology of ciguatera-causing Prorocentrum lima (Pyrrophyta) from widely differing sites J Phycol 27 642-648

Lawrence J E Grant J Quilliam M A Bauder A G amp Cembella A D 2000 Colonizaition and growth of the toxic dinoflagellate Prorocentrum lima and associated fouling macroalgae on mussels in suspended culture Mar Ecol Prog Ser 201 147-154

Levasseur M Couture J Y Weise A M Michaud S Elbrachter M Sauveacute G amp Bonneau E 2003 Pelagic and epiphytic summer distributions of Prorocentrum lima and P mexicanum at two mussel farms in the Gulf of St Lawrence Aquat Microbiol Ecol 30283-293

Maranda L Corwin S Dover S amp Morton S L 2007a Prorocentrum lima (Dinophyceae) in northeastern USA coastal waters II Toxin load in the epibiota and in shellfish Harmful Algae 6 632-641

Maranda L Corwin S Hargraves P E 2007b Prorocentrum lima (Dinophyceae) in 19 northeastern USA coastal waters I Abundance and distribution Harmful Algae 6 623ndash631

Quilliam MA Gilgan MW amp Pleasance S 1993 Confirmation of an incident of diarrhetic shellfish poisoning in eastern Canada In Smayda TJ Shimizu Y (Eds) Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea Elsevier New York pp 547ndash552

Suzuki T Ota H amp Yamasaki M 1999 Direct evidence of transformation of dinophysistoxin-1 to 7-O-acyl-dinophysistoxin-1 (Dinophysis-3) in the scallop Patinopecten yessoensis Toxicon 37 187-198

Vale P amp Sampayo M A 2002 First confirmation of human diarrhoeic poisonings by okadaic acid esters after ingestion of razor clams (Solen marginatus) and green crabs (Carcinus maenas) in Aveiro lagoon Portugal and detection of okadaic acid esters in phytoplankton Toxicon 40989-996

Vale P Veloso V amp Amorim A 2009 Toxin composition of a Prorocentrum lima strain isolated from the Portuguese coast Toxicon 54145ndash152

Agradecimientos Intecmar de la Xunta de Galicia Espantildea donde se realizaron los anaacutelisis de toxinas proyecto

SUBPESCA ldquoManejo y Monitoreo de Mareas Rojas en las regiones de Los Lagos Ayseacuten y Magallanes IV etapa 2010rdquo

ANEXO 4

Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten

ANEXO 5

Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de Magallanes

TASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

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BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

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MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

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2 4

3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

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TID

AD

BA

NC

AR

IATASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

0 9

4 0

2 4INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

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NTASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

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BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

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COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

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DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

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2 4

3 1 4 4 0 1

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

9520 euros

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

CONSELLERIA DE FACENDA

ANEXO 6

Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para cierre

de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

Seccioacuten Ediciones y Produccioacuten Almte Manuel Blanco Encalada 839

Fono 56-32-2151500 Valparaiacuteso Chile

wwwifopcl

Page 49: “Análisis de toxinas lipofílicas mediante LC-MS/MS en ...metadatos.mma.gob.cl/sinia/Informe_final_Analisis_toxinas_lipofilicas_656-055.pdfSUBSECRETARÍA DE ECONOMÍA: INFORME FINAL:

ANEXO 4

Contrato de ensayo propuesto por IFOP y aceptado por INTECMAR para facturacioacuten

ANEXO 5

Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de Magallanes

TASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

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BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

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Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

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DIG

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DIG

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AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

EN

TID

AD

BA

NC

AR

IATASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

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N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

0 9

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2 4INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

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NTASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

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BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

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OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

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MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

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Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

9520 euros

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

CONSELLERIA DE FACENDA

ANEXO 6

Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para cierre

de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

Seccioacuten Ediciones y Produccioacuten Almte Manuel Blanco Encalada 839

Fono 56-32-2151500 Valparaiacuteso Chile

wwwifopcl

Page 50: “Análisis de toxinas lipofílicas mediante LC-MS/MS en ...metadatos.mma.gob.cl/sinia/Informe_final_Analisis_toxinas_lipofilicas_656-055.pdfSUBSECRETARÍA DE ECONOMÍA: INFORME FINAL:

ANEXO 5

Costos del anaacutelisis de 58 muestras enviadas a INTECMAR procedentes de Magallanes

TASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

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BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

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NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

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AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

EN

TID

AD

BA

NC

AR

IATASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

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N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

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COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

0 9

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2 4INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

CONSELLERIA DE FACENDA

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NTASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

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Firma del declarante o representante legal

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PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

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NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

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MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

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BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

9520 euros

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

CONSELLERIA DE FACENDA

ANEXO 6

Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para cierre

de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

Seccioacuten Ediciones y Produccioacuten Almte Manuel Blanco Encalada 839

Fono 56-32-2151500 Valparaiacuteso Chile

wwwifopcl

Page 51: “Análisis de toxinas lipofílicas mediante LC-MS/MS en ...metadatos.mma.gob.cl/sinia/Informe_final_Analisis_toxinas_lipofilicas_656-055.pdfSUBSECRETARÍA DE ECONOMÍA: INFORME FINAL:

TASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

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Firma del declarante o representante legal

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BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

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NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

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INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

EN

TID

AD

BA

NC

AR

IATASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

0 9

4 0

2 4INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

AD

MIN

IST

RA

CIOacute

NTASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

9520 euros

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

CONSELLERIA DE FACENDA

ANEXO 6

Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para cierre

de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

Seccioacuten Ediciones y Produccioacuten Almte Manuel Blanco Encalada 839

Fono 56-32-2151500 Valparaiacuteso Chile

wwwifopcl

Page 52: “Análisis de toxinas lipofílicas mediante LC-MS/MS en ...metadatos.mma.gob.cl/sinia/Informe_final_Analisis_toxinas_lipofilicas_656-055.pdfSUBSECRETARÍA DE ECONOMÍA: INFORME FINAL:

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

EN

TID

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BA

NC

AR

IATASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

9520 euros58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

0 9

4 0

2 4INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS3 1 4 4 0 1

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

CONSELLERIA DE FACENDA

EJE

MP

LAR

PA

RA

LA

AD

MIN

IST

RA

CIOacute

NTASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

AUTOLIQUIDACIOacuteN

a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

TO

PA

SIV

OL

IQU

IDA

CIOacute

N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

COacute

DIG

OS

NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

OS

COacute

DIG

OS

AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

9520 euros

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

CONSELLERIA DE FACENDA

ANEXO 6

Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para cierre

de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

Seccioacuten Ediciones y Produccioacuten Almte Manuel Blanco Encalada 839

Fono 56-32-2151500 Valparaiacuteso Chile

wwwifopcl

Page 53: “Análisis de toxinas lipofílicas mediante LC-MS/MS en ...metadatos.mma.gob.cl/sinia/Informe_final_Analisis_toxinas_lipofilicas_656-055.pdfSUBSECRETARÍA DE ECONOMÍA: INFORME FINAL:

EJE

MP

LAR

PA

RA

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MIN

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RA

CIOacute

NTASAS de la COMUNIDAD AUTOacuteNOMA DE GALICIA

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a

Firma del declarante o representante legal

de de 20

Sello Fecha Nuacutemero

SU

JE

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SIV

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N

BASE DE CALCULO O BASE IM-

PONIBLE O UNIDADES

TIPO O TARIFA IMPORTE A INGRESAR

TOTAL

IMPORTANTE El ingreso deberaacute realizarse en cualquiera de las sucursales de las entidades financieras colaborado-

ras en la recaudacioacuten

Modelo

AIEUROS

Conselleriacutea de

Delegacioacuten de

Servicio de

Tasa denominacioacuten

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

Coacutedigo

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DIG

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NIF APELLIDOS Y NOMBRE O RAZOacuteN SOCIAL

VIacuteA PUBLICA NUacuteMERO ESCAL PISO PUERTA TELEacuteFONO

AYUNTAMIENTO PROVINCIA COacuteDIGO POSTAL

COacute

DIG

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DIG

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AI0337397 3

MEDIO RURAL E DO MAR

PONTEVEDRA

INTECMAR

ANALISIS DE BIOTOXINAS MARINAS EN MOLUSCOS_

TOXINAS LIPOFIacuteLICAS LC-MSMS

0 9

4 0

2 4

3 1 4 4 0 1

BLANCO 839 VALPARAISO CHILE

5521 60

Ley 62003 del 9 de diciembre Decreto 612005 del 7 de abril

58 anaacutelisis de toxinas

lipofiacutelicas por cromatografiacutea

liacutequida con deteccioacuten de

espectrometriacutea de masas

(LC-MSMS)

9520 euros

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

CONSELLERIA DE FACENDA

ANEXO 6

Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para cierre

de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

Seccioacuten Ediciones y Produccioacuten Almte Manuel Blanco Encalada 839

Fono 56-32-2151500 Valparaiacuteso Chile

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ANEXO 6

Resolucioacuten nordm 2614 de 17 julio 2012 emitido por la SEREMI Salud Magallanes para cierre

de aacuterea para la extraccioacuten de caracol piquilhue

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

Seccioacuten Ediciones y Produccioacuten Almte Manuel Blanco Encalada 839

Fono 56-32-2151500 Valparaiacuteso Chile

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Page 55: “Análisis de toxinas lipofílicas mediante LC-MS/MS en ...metadatos.mma.gob.cl/sinia/Informe_final_Analisis_toxinas_lipofilicas_656-055.pdfSUBSECRETARÍA DE ECONOMÍA: INFORME FINAL:

INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO

Seccioacuten Ediciones y Produccioacuten Almte Manuel Blanco Encalada 839

Fono 56-32-2151500 Valparaiacuteso Chile

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Page 56: “Análisis de toxinas lipofílicas mediante LC-MS/MS en ...metadatos.mma.gob.cl/sinia/Informe_final_Analisis_toxinas_lipofilicas_656-055.pdfSUBSECRETARÍA DE ECONOMÍA: INFORME FINAL: