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Universidade de Brasília Faculdade de Medicina Programa de Pós Graduação em Ciências Médicas
Clarice Cunha Taveira
Ação antimicrobiana de extratos de plantas do Cerrado e isolamento
de substância ativa de Kielmeyera coriacea
Brasília 2007
CLARICE CUNHA TAVEIRA
Ação antimicrobiana de extratos de plantas do Cerrado e isolamento de
substância ativa de Kielmeyera coriacea
Brasília
2007
Dissertação apresentada como parte dos requisitos à obtenção do grau de Mestre em Ciências Médicas no Programa de Pós Graduação em Ciências Médicas da Faculdade de Medicina da Universidade de Brasília. Orientadora: Profa. Dra. Laila Salmen Espindola
Sumário
Agradecimentos I
Lista de abreviaturas III
Lista de figuras IV
Lista de Tabelas V
Resumo VI
Abstract VII
1. Introdução 1
2. Objetivos 27
3. Materiais e Métodos 28
3.1 Material vegetal e produção dos extratos 28
3.2 Microrganismos 30
3.3 Teste de susceptibilidade à ação antimicrobiana dos extratos vegetais 30
3.3.1 Método de difusão em discos 30
3.3.2 Teste antibacteriano 30
3.3.3 Teste antifúngico 31
3.3.4 Bioautografia 32
3.3.5 Método de diluição – Concentração inibitória mínima 33
4. Estudo químico biomonitorado 34
5. Resultados e discussão 35
6. Conclusão 52
7. Referências bibliográficas 53
I
Agradecimentos Agradeço imensamente a Deus, que me deu saúde, paciência e perseverança. Em tudo eu sempre via Sua ação providencial principalmente quando surgiam situações aparentemente sem solução. Agradeço a Ele pelo Cerrado, rico em beleza e em remédios naturais, que é a fonte de matéria-prima para nossas pesquisas. Agradeço a Nossa Senhora, por sua intercessão poderosa em todas as circunstâncias. Ao meu pai, que durante toda a minha vida fez mais que podia para me proporcionar oportunidades para estudar, eu espero ser para ele motivo de orgulho para retribuir pelo menos um pouquinho da sua dedicação incondicional. À minha mãe, que desde muito cedo me incentivou a estudar, participou ativamente de cada conquista minha e principalmente entendeu minhas ausências. À Laila, por ser uma orientadora sem igual, que acompanha de perto cada experimento, aconselha, dá sugestões e motiva todos no laboratório, além de ser o nosso maior exemplo de perseverança e paciência mesmo na falta de recursos. Ao Professor Bergmann Morais Ribeiro e à Professora Silene de Paulino Lozzi, obrigada por aceitarem fazer parte da banca e pelas valiosas sugestões. À Mariana, pela enorme ajuda com as colunas cromatográficas, por me motivar e ser otimista quando eu desanimava e por ter muita paciência comigo. À Lorena, que ensinou com muita paciência todas as técnicas e não estressou pelas milhares de vezes que eu liguei para tirar dúvidas. À minha irmã Vanessa, que quebrou muitos galhos emprestando material do Ciex, ajudou nas faxinas, lavou vidraria, me motivou e tirou dúvidas na hora de escrever a dissertação. À minha irmã Mariane que me dava carona pra voltar pra casa e também tinha orgulho de dizer para os colegas: “minha irmã faz mestrado.” Ao Thiago pela competência e boa vontade em ajudar nos experimentos e também por ser um ótimo amigo. Ao Arthur, pelo interesse em ajudar com os experimentos, por me incentivar e ainda por ouvir minhas lamentações quando alguma coisa não ia bem. A todos os estagiários do laboratório por ajudarem na preparação dos extratos. Ao estagiário Marcos, que durante um semestre acompanhou o meu trabalho com muito interesse e dedicação de profissional.
II
À Fernanda, que sempre foi um anjo e ajudou nos experimentos e colunas e trouxe sugestões e idéias inovadoras que enriqueceram meu trabalho. Ao Jair não só pela ajuda com as colunas mas também pelo carinho e amizade. A todos os colegas do laboratório: Renata, Nashira, Alice, e Dani, por alegrarem minhas tardes e por darem sugestões para os meus experimentos e apresentações. Aos colegas Aline, Ellen e Everton, pela ajuda preciosa na preparação da apresentação. Vocês foram verdadeiros “anjos da guarda”. Às meninas do Ciex, Gabriela e Édelyn, por me socorrerem quando faltava algum material. Ao professor Albino, pela boa vontade em nos ajudar e emprestar alguns equipamentos. Agradeço imensamente ao professor José Elias pelas coletas e identificação das plantas. Ao pessoal do laboratório de Dermatomicologia por me emprestarem a autoclave. Ao Sr. Paulo pelas fotos lindíssimas. À Elaine, do laboratório de Bioquímica, que mesmo sem me conhecer demonstrou uma enorme boa vontade em ajudar com o teste do MIC. Ao professor Edilberto e ao Daniel (UFC) pelo esforço e dedicação na tentativa de isolar elucidar a substância ativa.
III
Lista de abreviaturas µg – micrograma
ATCC – American type culture collection
B. fragilis – Bacterioides fragilis
CCD – Cromatografia em camada delgada
CIM – Concentração inibitória mínima
CLSI - Clinical and Laboratory Standards Institute
Da - Dalton
DMSO – Dimetilsulfóxido
DNA – Ácido desoxirribonucléico
E. coli – Escherichia coli
E. faecalis – Enterococcus faecalis
INCQS – Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde
mL – mililitro
mm – milímetro
MRSA – Staphylococcus aureus resistente a meticilina
MTT - brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol- 2-yl)-2,5-difeniltetrazolium
OMS – Organização Mundial de Saúde
P. aeruginosa – Pseudomonas aeruginosa
Rf – fator de retenção
RNA – Ácido ribonucléico
S. aureus – Staphylococcus aureus
S. choleraesuis – Salmonella choleraesuis
UFC/mL – Unidade formadora de colônia/mL
UV – ultravioleta
VRSA – Staphylococcus aureus resistente a vancomicina
Km2 – quilomêtros quadrados
IV
Lista de figuras Figura 1: Estrutura da parede celular das bactérias Gram-positivas 2 Figura 2: Estrutura da parede celular das bactérias Gram-negativas 2 Figura 3: Ácido 6-aminopenicilânico 8
Figura 4: Anel beta-lactâmico 10
Figura 5: Estrutura básica das sulfonamidas 10
Figura 6: Estrutura molecular da estreptomicina 11
Figura 7: Ácido 7-aminocefalosporânico – núcleo central das cefalosporinas 12
Figura 8: Estrutura química do cloranfenicol 13
Figura 9: Estrutura básica das tetraciclinas 14
Figura 10: Estrutura molecular da eritromicina 15
Figura 11: Estruturas moleculares dos glicopeptídeos 16
Figura 12: Estrutura básica das quinolonas 17
Figura 13: Estruturas moleculares das estreptograminas 18
Figura 14: Estrutura molecular da tienamicina 19
Figura 15: Estrutura molecular da linezolida 20
Figura 16: Estrutura molecular da daptomicina 21
Figura 17: Kielmeyera coriacea Mart. & Zucc. 25
Figura 18: Seqüência de produção dos extratos brutos 29
Figura 19: Bioautografia - halo de inibição formado em torno da substância ativa 32
Figura 20: Teste de diluição seriada – concentração inibitória mínima (CIM) 34
Figura 21: Xantonas (A) e bifenil (B) de K. coriacea com atividade antifúngica 39
Figura 22: Kielmeyera coriacea: halos de inibição formados sobre S. aureus 42
Figura 23: Kielmeyera coriacea: Perfil em CCD do sub-grupo ativo SG8 43
V
Lista de tabelas
Tabela 1. Extratos do Banco de Extratos de Plantas do bioma Cerrado utilizados na
triagem de atividade antimicrobiana 45
Tabela 2. Extratos ativos sobre microrganismos, após triagem do Banco de Extratos de
Plantas pelo método de difusão em ágar 47
Tabela 3. Kielmeyera coriacea: grupos obtidos após a reunião das frações oriundas do
fracionamento químico do extrato hexânico da casca da raiz 49
Tabela 4. Kielmeyera coriacea: sub-grupos obtidos após reunião das frações oriundas do fracionamento
dos grupos ativos G5 e G6, oriundos do estudo químico do extrato hexânico da casca da raiz 50
Tabela 5. Kielmeyera coriacea: sub-grupos obtidos após reunião das frações oriundas do fracionamento
dos sub-grupos ativos SG6 e SG7, oriundos do estudo químico do extrato hexânico da casca da raiz. 51
VI
Resumo As doenças infecciosas têm sido uma importante causa de morbimortalidade em todo o
mundo. Apesar da descoberta e desenvolvimento dos antibióticos, o tratamento dessas
doenças atualmente nem sempre tem sido bem sucedido devido à emergência da resistência
bacteriana, a qual tem como causa principal o uso irracional dos antibióticos. Essa situação
justifica a busca por novos medicamentos. Com esse propósito foi realizada uma triagem do
Banco de Extratos de Plantas do bioma Cerrado (Laboratório de Farmacognosia/UnB)
sobre bactérias patogênicas aos seres humanos, responsáveis por infecções hospitalares e
comunitárias. Sessenta e cinco extratos brutos hexânicos, diclorometânicos e
hidroalcoólicos, obtidos de treze espécies, pertencentes a nove famílias foram testados
in vitro sobre três espécies de bactérias Gram-negativas Escherichia coli (ATCC 8739),
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027) e Salmonella choleraesuis (ATCC 14028), duas
espécies Gram-positivas Staphylococcus aureus (ATCC 6538) e Enterococcus faecalis
(ATCC 29212) e sobre o fungo Candida albicans (ATCC 10231). O método de difusão em
ágar foi utilizado para avaliar a atividade dos extratos, em uma concentração de 1000
µg/mL, e os resultados foram expressos pelo diâmetro do halo de inibição. O extrato
hexânico da casca da raiz de Kielmeyera coriacea foi selecionado para o estudo químico
biomonitorado devido à sua significativa atividade sobre S. aureus (halo de inibição de 14
mm). Após três sucessivas colunas cromatográficas foi detectado o sub-grupo ativo (SG8)
com duas substâncias (Rf 0,57 e 0,65), que apresentou halo de inibição de 16 mm (técnica
de difusão em ágar) e concentração inibitória mínima (CIM) de 31,25 µg/mL. A
bioautografia permitiu identificar que a substância de menor Rf (0,57) é a responsável pela
atividade antibacteriana. Essa substância encontra-se em fase final de purificação e
elucidação molecular.
Palavras-chave: Cerrado, extratos de plantas, atividade antimicrobiana, Kielmeyera
coriacea, estudos químicos biomonitorados.
VII
Abstract
Infectious diseases have been an important cause of morbity and mortality all over the
world. Although the discovery and development of the antibiotics, the treatment of
infectious diseases nowadays is not always successful due to the emergency of microbial
resistance, witch is caused specially by the misuse of the antibiotics. Consequently it is
necessary to search for new drugs. With this purpose a screening was conducted of the
Cerrado biome Plant Extract Bank (Pharmacognosy Laboratory/UnB), for human
pathogenic bacteria causing nosocomial and community-acquired infections. Sixty five
crude hexanic, dichloromethane and hidroalcoholic extracts, obtained from thirteen species
belonging to nine families, were tested in vitro against three Gram-negative bacteria
Escherichia coli (ATCC 8739), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), Salmonella
choleraesuis (ATCC 14028), two Gram-positive Staphylococcus aureus (ATCC 6538) and
Enterococcus faecalis (ATCC 29212) and the yeast Candida albicans (ATCC 10231). The
agar diffusion method was used to evaluate the activity of the extracts, at the concentration
of 1000 µg/mL and the results were expressed according to the diameter of the zones of
inhibition. The hexanic root bark extract of Kielmeyera coriacea was selected for bioguided
studies due to the significant activity against S. aureus (zone of inhibition of 14 mm). After
three successive silica gel column cromatographies it was identified the sub-group,
composed by two substances (Rf 0,57 e 0,65), with best inhibitory activity (SG8). The zone
of inhibition was 16 mm (disc diffusion method) and minimal inhibitory concentration
(MIC) 31,25 µg/mL. Bioautography showed that the substance with Rf 0,57 is responsible
for the activity against S. aureus. Investigations of this substances are in progress to isolate
and elucidate the chemical structure.
Keywords: Cerrado, plant extracts, antimicrobial activity, Kielmeyera coriacea, bioguided
studies.
1
1. Introdução
Doenças infecciosas
Desde a pré-história os microrganismos provocam doenças no homem. Com os
trabalhos de Pasteur e Koch e seus contemporâneos, a partir de 1878, iniciou-se a
compreensão da origem infecciosa de várias enfermidades (Tavares, 2001). Doenças como
peste, sarampo e tuberculose tiveram efeitos devastadores no passado e algumas ainda
continuam sendo causas importantes de mortalidade (Oli et al., 2006). O problema tem se
agravado devido ao surgimento de microrganismos resistentes aos antibióticos, presentes
em infecções hospitalares e comunitárias, restringindo as opções de antimicrobianos na
terapêutica (Levy, 2005). Segundo dados da Organização Mundial de Saúde (OMS), as
doenças infecciosas causaram 14,7 milhões de mortes em 2001, o que representa 26% da
mortalidade global (Becker et al., 2006).
As bactérias são células procarióticas desprovidas de núcleo e retículo
endoplasmático que sintetizam seu próprio DNA, RNA e proteína (Cotran et al., 2000). São
classificadas de acordo com as características estruturais do invólucro bacteriano e
identificadas por suas propriedades tintoriais com o corante de Gram (Rubbin & Fabber,
1999). Nas bactérias Gram-positivas, a estrutura da parede celular é simples constituída por
uma espessa camada de peptídeoglicano, que corresponde a 60% de sua composição
(Figura 1) e a parede celular das bactérias Gram-negativas é mais complexa, com uma fina
camada de peptídeoglicano, coberta por uma membrana externa constituída por
lipopolissacarídeos, fosfolipídeos e proteínas (Figura 2) (Tavares, 2001).
As bactérias Gram-positivas são importantes causadoras de infecções hospitalares e
comunitárias, como várias infecções de pele, respiratórias e sepse, com surgimento e
proliferação rápida nos últimos anos de cepas resistentes inclusive aos antibióticos mais
2
modernos, como Staphylococcus aureus resistente à meticilina, enterococos resistentes à
vancomicina e pneumococos resistentes à penicilina (Wareham et al., 2005; Appelbaum &
Jacobs, 2005; Bhavnani & Ballow, 2000).
A prevalência de bactérias Gram-negativas multi-resistentes também tem aumentado,
especialmente em unidades de terapia intensiva. Essas bactérias caracterizam-se por
apresentar rápido desenvolvimento de resistência a mais de uma classe de antimicrobianos,
incluindo aminoglicosídeos, fluorquinolonas e carbapenemas (Kwa et al., 2007).
Proteína Ácido teicóico
Peptídeoglicano
Membrana citoplasmática
Ácido lipoteicóico
Figura 1: Estrutura da parede celular das bactérias Gram-positivas
Polissacarídeos
Periplasma
Membrana externa
Membrana citoplamática
Lipoproteína
Peptídeoglicano
Proteína Lipídeos Porinas
Figura 2: Estrutura da parede celular das bactérias Gram-negativas
3
A seguir serão descritas algumas bactérias patogênicas aos seres humanos,
responsáveis por inúmeras infecções hospitalares e comunitárias; as diferentes classes de
antibióticos e o fenômeno de resistência aos antimicrobianos disponíveis na terapêutica.
Staphylococcus aureus
O Staphylococcus aureus é um coco Gram-positivo que reside sobre a pele,
mucosas e trato respiratório superior e é incapaz de invadir a pele ou as membranas
intactas. Porém a infecção geralmente se inicia com a inoculação traumática do
microrganismo, patógeno virulento que secreta enzimas e toxinas lesivas às membranas,
capazes de destruir eritrócitos, leucócitos, plaquetas, fibroblastos e outras células (Rubin &
Fabber, 1999). S. aureus pode expressar uma grande variedade de fatores de virulência
como proteínas de superfície que aderem a tecidos lesados, causando a redução da resposta
imunológica. Secretam exotoxinas e enzimas causadoras de infecções de pele como
impetigo, furúnculos e abscesso subcutâneo e infecções sistêmicas como síndrome do
choque tóxico e síndrome do choque tóxico neonatal (Iwatsuki et al., 2006).
Nos anos 50, o número de isolados clínicos de S. aureus resistente à penicilina
aumentou rapidamente. No início da década de 60 a meticilina começou a ser utilizada no
tratamento de infecções resistentes à penicilina. No entanto, um ano depois foi encontrada
uma cepa resistente ao antibiótico. Desde então S. aureus resistente à meticilina (MRSA)
tem sido um patógeno freqüente em infecções hospitalares em todo o mundo (Brown &
Ngeno, 2007).
Em 1997, foi isolada uma cepa de S. aureus com sensibilidade reduzida à
vancomicina (VRSA). Foi observado que cepas resistentes à vancomicina apresentam
4
resistência também à meticilina, aminoglicosídeos, macrolídeos e fluorquinolonas o que
representa um desafio à terapêutica (Levy, 2005).
Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa é um bacilo Gram-negativo aeróbio, patógeno oportunista
presente em infecções hospitalares, urinárias e sepse, estando mais suscetíveis pacientes
com queimaduras, cateterismo urinário, fibrose cística, diabetes e neutropenia (Marra et al.,
2006; Thompson & Bonomo, 2005).
P. aeruginosa é um patógeno comum em infecções nosocomiais sistêmicas, com
alta mortalidade a qual pode chegar a 33% em pacientes imunocomprometidos (Marra et
al., 2006). A variedade de sítios de infecção e a aquisição de mecanismos de resistência
revelam a grande capacidade de adaptação ao meio. Apresenta vários fatores de virulência,
dentre eles os polissacarídeos, flagelos e pili tipo IV, importantes para a adesão e
colonização dos tecidos. Outros fatores de virulência são as piocianinas, que impedem a
proliferação da epiderme e de linfócitos, ramnolipídeos, que solubilizam o surfactante
pulmonar e elastases que reduzem a elasticidade pulmonar, facilitando a colonização do
tecido (Berre et al., 2006).
Escherichia coli
Escherichia coli compreende um grupo de cepas de bactérias Gram-negativas
aeróbias que habitam o trato intestinal de humanos e animais. A espécie apresenta diversos
sorotipos, ou seja, variações antigênicas. Cada sorotipo é capaz de causar diferentes
infecções como entéricas, urinárias e bacteremias nosocomiais, utilizando diferentes
combinações de fatores de virulência (Marrs et al., 2005).
5
O surgimento de cepas de E. coli multirresistentes tem aumentado em todo o
mundo, sendo que a resistência às penicilinas de amplo espectro de ação e à trimetoprima é
mais elevada que às cefalosporinas de terceira geração e à nitrofurantoína. Além disso têm
surgido cepas resistentes às fluorquinolonas e também produtoras de beta-lactamases
(Baum & Marre, 2005). As beta-lactamases são enzimas que hidrolisam o anel beta-
lactâmico inativando os antimicrobianos que possuem esse anel em sua estrutura como as
penicilinas, cefalosporinas e carbapenemas (Babic et al., 2006).
Salmonella choleraesuis
O gênero Salmonella compreende mais de 1500 tipos de bacilos Gram-negativos
antigenicamente distintos, porém genética e bioquimicamente relacionados, causadores de
enterocolites, adquiridas após a ingestão de alimentos contaminados (Tibbetts et al., 2002).
A salmonelose é um problema comum de saúde pública, apesar das melhorias nas
condições sanitárias e de processamento dos alimentos. As formas clínicas podem se
apresentar como diarréia aquosa e/ou inflamatória, algumas vezes bacteremia, febre
entérica e outras infecções extra-intestinais (Ho & Chou, 2001).
As espécies do gênero Salmonella são capazes de produzir fatores de virulência
como as enterotoxinas e citotoxinas, causadoras de danos celulares e conseqüente
disseminação da bactéria na mucosa intestinal (Ho et al., 2004).
A S. choleraesuis é normalmente um patógeno causador de doenças em suínos, no
entanto, a ingestão de alimentos contaminados por essa espécie é a causa mais comum de
enterocolites por Salmonella no homem (Lichtensteiger & Vimr, 2003).
6
S. choleraesuis é capaz de sobreviver por muito tempo no ambiente e contaminar
animais, água e alimentos. A ingestão destes provoca infecção no homem, a qual podem se
agravar e evoluir para septicemia (Shiau et al., 2005).
O uso indiscriminado de antimicrobianos é uma das principais causas do surgimento
de cepas de S. choleraesuis resistentes a diversas classes de antimicrobianos incluindo os
beta-lactâmicos, aminoglicosídeos, tetraciclinas e sulfonamidas (Hsu et al., 2006).
Enterococcus faecalis
Os enterococos habitam naturalmente os tratos digestivo e genital e a cavidade oral,
normalmente apresentam baixa patogenicidade, porém são causa de diversas infecções,
sendo a espécie Enterococcus faecalis responsável em média por 85% das infecções
enterocócicas (Izumi et al., 2005).
E. faecalis é um coco Gram-positivo, anaeróbio facultativo freqüentemente
associado a infecções intra-abdominal e pélvica, bem como bacteremia fatal, meningite,
endocardite, infecções urinárias e odontológicas (Babalola et al., 2004).
E. faecalis é o terceiro patógeno mais comum nas infecções nosocomiais, após
E. coli e S. aureus. Apesar de muitas infecções serem originadas no trato urinário ou em
cateteres intravenosos, uma grande porcentagem se deve à migração do microrganismo
através da parede intestinal, o que causa lesão do epitélio, seguida de invasão dos tecidos
subepiteliais e posterior infecção sistêmica (Rozdzinski et al., 2001).
E. faecalis apresenta resistência natural aos antimicrobianos como cefalosporinas e
penicilinas resistentes às enzimas penicilinases. Além disso, tem sido observada a
resistência à quinupristina-dalfopristina, alguns aminoglicosídeos, fluorquinolonas,
penicilinas, ampicilina e raramente à vancomicina (Scott et al., 2003).
7
Os antibióticos
Produtos naturais isolados de microrganismos tem sido a principal fonte na
descoberta dos antibióticos (Pélaez, 2006). A história dos antimicrobianos iniciou-se em
1929, quando Alexander Fleming observou um halo de inibição em uma cultura de
S. aureus contaminada por um fungo. Essa descoberta levou ao isolamento, elucidação da
estrutura, estudos clínicos e comercialização da primeira penicilina, denominada Penicilina
G (Singh & Barrett, 2006). Certamente não era a primeira vez que uma cultura bacteriana
contaminava, a genialidade de Fleming é que ele compreendeu a importância do fenômeno
e o explicou.
Comparando os anos que antecedem a descoberta das penicilinas com os últimos 50
anos percebe-se que a pesquisa e descoberta dos antibióticos tem sido bem sucedida, pois
houve uma redução drástica na mortalidade por doenças infecciosas (Overbye & Barrett,
2005).
A introdução das penicilinas revolucionou a prática clínica e a pesquisa. Nos anos
seguintes a triagem de produtos naturais permitiu a descoberta de novos compostos com
ação antimicrobiana, o que resultou na descoberta das classes de antibióticos conhecidas
atualmente, das quais destacam-se além das penicilinas, quatro gerações de cefalosporinas,
quatro gerações de quinolonas, carbapenemas, aminoglicosídeos, glicopeptídeos e as
oxazolidinonas (Singh & Barrett, 2006; Taylor et al., 2002).
As penicilinas
A penicilina G, também conhecida como benzilpenicilina, foi o primeiro antibiótico
descoberto e utilizado na prática clínica. Após a descoberta de sua fórmula química,
pesquisadores conseguiram isolar o ácido 6-aminopenicilânico (Figura 3), que constitui o
8
núcleo básico da molécula da penicilina e é um intermediário importante na fabricação das
penicilinas semi-sintéticas (Shen et al., 2006).
Uma limitação do uso da penicilina G é a sua rápida eliminação pelo organismo, por
isso foram testadas associações que retardassem sua eliminação e prolongassem seu tempo
de ação, o que foi conseguido com a utilização de seus ésteres, a penicilina G procaína e a
penicilina G benzatina. A penicilina G tem ação bactericida sobre bactérias Gram-positivas,
cocos Gram-negativos, espiroquetas e actinomicetos (Tavares, 2001).
O peptídeoglicano é essencial para a manutenção da rigidez e forma da parede
celular bacteriana. É constituído por unidades alternadas de N-acetilglucosamina e ácido N-
acetilmurâmico, formando longas cadeias nas quais estão fixadas cadeias peptídicas, as
quais se ligam a outras cadeias peptídicas adjacentes, por ligações cruzadas, formando uma
rede. As transpeptidases são enzimas essenciais que catalizam a formação das ligações
cruzadas (Babic et al., 2006). As penicilinas e outros antibióticos beta-lactâmicos se ligam
às transpeptidases impedindo a formação das ligações cruzadas, conseqüentemente a parede
formada é frágil e se rompe, ocorre então a entrada de água do meio externo na célula,
causando lise osmótica (Oshiro, 1999).
A má-absorção oral da penicilina G limita seu uso à via intramuscular, no entanto
atualmente existem diversas penicilinas de uso oral como a ampicilina, amoxicilina,
Figura 3: Ácido 6-aminopenicilânico
9
carbernicilina, ticarcilina, piperacilina, mezlocilina e azlocilina. Esses fármacos possuem
maior atividade sobre bactérias Gram-negativas e são úteis no tratamento das infecções
comuns do trato urinário, causadas por bactérias coliformes Gram-negativas, ou das
infecções bacterianas secundárias mistas do trato respiratório (Katzung, 1998).
Apesar da excelente atividade sobre estafilococos, a aquisição de resistência devido
à produção de penicilinases limitou o uso da penicilina G. A adição de novos grupamentos
na posição 6 da molécula permitiram o desenvolvimento das penicilinas resistentes às
penicilinases, como a meticilina, a qual somente é utilizada pela via parenteral por ser
inativada em meio ácido (Cavallo et al., 2004).
Foram desenvolvidas penicilinas resistentes à ação das beta-lactamases, assim como
associações desses antibióticos com substâncias inibidoras dessas enzimas, como o ácido
clavulânico, sulbactam ou tazobatam, que aumentaram sua eficácia no tratamento de
infecções causadas por bactérias resistentes (Oshiro, 1999).
Atualmente existem cinco categorias de penicilinas semi-sintéticas, disponíveis para
uso clínico: penicilinas com atividade sobre estafilococos produtores de beta-lactamases
(meticilina, oxacilina, cloxacilina, dicloxacilina e nafcilina), aminopenicilinas (ampicilina,
amoxicilina), carboxipenicilinas (carbenicilina, ticarcilina) ureidopenicilinas (mezlocilina,
piperacilina) e penicilinas resistentes às beta-lactamases (amoxicilina associada ao ácido
clavulânico, ampicilina associada a sulbactam) (Oshiro, 1999).
Antibióticos beta-lactâmicos
Antibióticos pertencentes às classes das penicilinas, cefalosporinas e carbapenemas
também são denominados beta-lactâmicos devido à presença em sua estrutura química do
anel beta-lactâmico (Figura 4), o qual é indispensável à atividade antimicrobiana. O anel
10
beta-lactâmico é constituído por uma amida cíclica com quatro lados, na qual se dá o
fechamento da cadeia pela ligação do nitrogênio (Cavallo et al., 2004).
Tais antibióticos apresentam atividade sobre organismos Gram-positivos, Gram-
negativos e anaeróbios e seu mecanismo de ação deve-se à inibição da síntese de
peptídeoglicano. Uma limitação do uso clínico é o surgimento de resistência bacteriana,
principalmente pela destruição do antibiótico pelas enzimas beta-lactamases, que
hidrolisam o anel beta-lactâmico, inativando o antibiótico. Além disso, existem outros
mecanismos de resistência como modificações nos sítios de ligação, diminuição da
penetração ou eliminação por efluxo (Fraise, 2006; Mimoz, 2001).
Sulfonamidas
As sulfonamidas são antimicrobianos de origem sintética (Figura 5), descobertos em
1932, são essencialmente bacteriostáticos, utilizados no tratamento de infecções causadas
por bactérias, fungos e protozoários. Possuem ação terapêutica nas colites ulcerativas,
algumas dermatites, meningoencefalites, sepse e infecções causadas por germes sensíveis à
sua ação (Tavares, 2001).
Figura 4: Anel beta-lactâmico
Figura 5: Estrutura básica das sulfonamidas
11
Os microrganismos utilizam o ácido paraminobenzóico (PABA) para a síntese de
purinas, na primeira etapa deste processo ocorre a transformação do PABA em ácido
diidrofólico, por ação da enzima diidropteroato-sintetase, as sulfas agem competindo com o
PABA pela enzima, impedindo a síntese de purinas, o que resulta em inibição da síntese de
ácidos nucléicos e proteínas (Enne et al., 2001; Katzung, 1998).
Ao serem introduzidas na terapêutica, em 1935, as sulfonamidas tiveram uma
grande utilização para o tratamento das infecções em humanos e animais, mas atualmente
seu uso tem sido bastante limitado devido ao rápido surgimento de cepas de bactérias
resistentes à sua ação (Infante et al., 2005).
Aminoglicosídeos
A Estreptomicina (Figura 6) foi o primeiro aminoglicosídeo de utilidade clínica,
descoberto em 1944, após diversos estudos com Streptomyces griseus. São ativos sobre
enterobactérias Gram-negativas aeróbias, sendo úteis no tratamento de infecções causadas
por Escherichia coli, Klebsiela, Enterobacter, Proteus, Morganella, Serratia, Citrobacter e
Salmonella (Tavares, 2001).
Figura 6: Estrutura molecular da estreptomicina
12
Os aminoglicosídeos se ligam irreversivelmente à subunidade 30S do ribossomo
bacteriano, resultando em uma união anormal dos aminoácidos e conseqüente formação de
proteínas defeituosas, causando alterações lesivas à bactéria, levando-a a morte (Serrano &
Silva, 2006). Porém seu uso prolongado resultou em um aumento de microrganismos
resistentes, devido à produção de enzimas dos grupos das acetiltransferases,
fosfotransferases e adenililtransferases, que inativam esses antibióticos (Neonakis et al.,
2003).
Cefalosporinas
A descoberta das cefalosporinas ocorreu em 1945, após ser observado que o fungo
Cephalosporium acremonium, encontrado na água do mar da costa da Sardenha, próximo à
desembocadura de um cano de esgoto, provocava inibição do crescimento de
microrganismos à sua volta. Neste período, os extratos de culturas desse fungo foram
utilizados clinicamente no tratamento de infecções estafilocócicas e febre tifóide (Del
Rosso, 2003).
Novas pesquisas levaram à descoberta da cefalosporina C, da qual foi isolado seu
núcleo central, o ácido 7-aminocefalosporânico (Figura 7), que possibilitou o
desenvolvimento de derivados semi-sintéticos, sendo que em 1962 foi lançada a cefalotina,
primeira cefalosporina de uso clínico (Del Rosso, 2003).
Figura 7: Ácido 7-aminocefalosporânico – núcleo central das cefalosporinas
13
Modificações nas cadeias laterais do núcleo central deram origem aos derivados
cefalosporínicos. O grupo com características semelhantes à cefalotina, passou a ser
chamado cefalosporinas de primeira geração. Atualmente existem quatro gerações de
cefalosporinas caracterizadas por apresentar um aumento no espectro de ação, resistência às
beta-lactamases, absorção por via oral e menor toxicidade (Tavares, 2001).
O mecanismo de ação das cefalosporinas consiste em inibir a síntese de
peptídeoglicano. Devido ao seu amplo espectro de ação e à baixa incidência de reações
alérgicas são os antibióticos mais prescritos nos hospitais (Cavallo et al., 2004).
Visto que as cefalosporinas são antibióticos beta-lactâmicos o principal mecanismo
de resistência bacteriana é a sua inativação pelas enzimas beta-lactamases (Dancer, 2001).
Cloranfenicol
O Cloranfenicol (Figura 8) foi descoberto em 1947, a partir de Streptomyces
venezuelae, e atualmente é obtido por síntese laboratorial. Possui ação bacteriostática. Seu
mecanismo de ação consiste em inibir a síntese protéica, unindo-se às frações 30S e 50S do
ribossomo, impedindo a ligação do RNA-mensageiro e bloqueando a união dos
aminoácidos na formação do polipeptídeo. Apresenta amplo espectro de ação, com
atividade sobre estreptococos, enterococos, pneumococos, S. aureus, neisserias e
enterobactérias (Tavares, 2001).
Figura 8: Estrutura química do cloranfenicol
14
Tetraciclinas
A primeira tetraciclina descoberta foi a aureomicina, obtida em 1948 a partir de
culturas de Streptomyces aureofaciens. São antibióticos bacteriostáticos, derivados de
hidrocarbonetos (Figura 9). O mecanismo de ação consiste em inibir a síntese protéica, por
se ligarem à fração 30S do ribossomo bacteriano, impedindo a fixação do RNA-
transportador (Tsankov et al., 2004).
Apresentam atividade sobre bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, riquétsias,
micoplasmas, clamídias, espiroquetas, borrélias, actinomicetos, legionelas e algumas
micobactérias (Sapadin & Fleishmajer, 2006).
A resistência tem aumentado devido à aquisição de genes que codificam bombas de
efluxo, que são proteínas situadas na membrana citoplasmática com capacidade de expulsar
o medicamento da célula bacteriana. Outro mecanismo de resistência é a proteção do
ribossomo por meio de modificações em suas proteínas, impedindo a ligação do antibiótico,
ou ainda as bactérias Gram-negativas podem sofrer mudanças na membrana externa
resultando em redução da captação do antibiótico (Chopra, 2002).
Figura 9: Estrutura básica das tetraciclinas
15
Macrolídeos
O primeiro macrolídeo utilizado na medicina foi a eritromicina (Figura 10),
descoberta em 1952, a partir de culturas de Streptomyces erythreus. A ação dos
macrolídeos é bacteriostática por ligação à subunidade 50S do ribossomo e consequente
bloqueio da síntese protéica (Abu-Gharbieh et al., 2004).
Possuem atividade sobre cocos Gram-positivos, como S. aureus, espécies de
estreptococos, alguns enterococos, cocos Gram-negativos, bactérias atípicas e anaeróbias
(Tavares, 2001).
São utilizados no tratamento de infecções causadas por bactérias Gram-positivas e
alguns patógenos intracelulares facultativos como Mycoplasma pneumoniae e Legionella
pneumophila ou ainda no tratamento de infecções por Helicobacter pylori e micobactérias
causadoras de doenças pulmonares. Adicionalmente, os macrolídeos apresentam atividade
antiinflamatória, pela inibição da função dos linfócitos, promoção da diferenciação
monócito-macrófago, modulação da expressão e produção de interleucina 8 (Ishimatsu et
al., 2004).
Figura 10: Estrutura molecular da eritromicina
16
Glicopeptídeos
A classe dos glicopeptídeos compreende os antibióticos vancomicina e teicoplamina
(Figura 11). A vancomicina foi introduzida na terapêutica em 1956, extraída de culturas de
Streptomyces orientalis. Possui grande importância clínica, devido à sua ação sobre
estafilococos meticilina-resistentes, no tratamento de colites causadas por Clostridium
difficile, infecções estafilocócicas resistentes à meticilina e às cefalosporinas, enterococos
resistentes à penicilina e meningites causadas por pneumococos com elevada resistência à
penicilina (Tavares, 2001).
Os glicopeptídeos agem como inibidores da síntese de peptídeoglicanos por se
ligarem com alta especificidade e afinidade à porção terminal de precursores do
peptídeoglicano, prevenindo o acesso das transpeptidases e transglicosidases, enzimas
responsáveis pela reticulação desses precursores (Bambeke, 2004).
Apesar da importância no combate às infecções causadas por organismos
multirresistentes, já foram identificadas cepas de enterococos e estafilococos resistentes à
ação dos glicopeptídeos. A unidade básica do peptídeoglicano é constituída pelos
açúcares ácido N-acetilmurâmico e N-acetilglucosamina, ligados a um pentapeptídeo. As
A B
Figura 11: Estruturas moleculares dos glicopetídeos A) Vancomicina B) Teicoplamina
A B
17
bactérias podem sofrer modificações na composição do pentapeptídeo, reduzindo a
afinidade pelo antibiótico, resultando em resistência à ação deste (Lehmann et al., 2002).
Fluorquinolonas
O primeiro fármaco da família das quinolonas, o ácido nalidíxico, constitui um
derivado de um subproduto da fabricação da cloroquina, descoberto em 1962. A adição de
um átomo de flúor na posição 6 da molécula das quinolonas mais antigas, um grupo
carboxila na posição 3 e uma função cetona na posição 4 deu origem ao grupo das
fluorquinolonas. Essas modificações estruturais possibilitaram melhor penetração celular e
portanto maior atividade sobre bactérias intracelulares como micobactérias e salmonelas
(Gendrel et al., 2001).
Atualmente existem quatro gerações de quinolonas, as quais se originaram a partir
da adição de grupamentos em determinadas posições da molécula básica (Figura 12).
Segundo propriedades antimicrobianas e farmacocinéticas são classificados nas diferentes
gerações (Tavares, 2001).
Nas quinolonas de primeira geração (ácido nalidíxico e cinoxacino), a ação limita-se
às enterobactérias e ao tratamento de infecções do trato urinário e intestino. As quinolonas
de segunda geração tratam as infecções sistêmicas. A terceira geração inclui substâncias
com atividade terapêutica sobre as infecções sistêmicas por bactérias Gram-negativas,
Figura 12: Estrutura básica das quinolonas
18
Gram-positivas, estreptococos hemolíticos e pneumococo. As quinolonas de quarta geração
apresentam atividade sobre anaeróbios, incluindo B. fragilis, Gram-positivas, Gram-
negativas e atípicas (Efthimiadou et al., 2006).
O mecanismo de ação consiste em inibir a DNA girase e a topoisomerase IV, essas
enzimas são responsáveis por manter o DNA bacteriano de forma superespiralada. A
ligação das quinolonas à essas enzimas provoca o relaxamento das espirais do DNA, o qual
passa a ocupar maior espaço na célula, fazendo com que esta apresente um formato
excessivamente alongado e em seguida sofra rompimento (Efthimiadou et al., 2006).
As quinolonas possuem atividade in vitro sobre bactérias Gram-positivas e Gram-
negativas, Pseudomonas, aeróbias e anaeróbias (Wang et al., 2006).
Estreptograminas
As estreptograminas foram descobertas há 50 anos, e seu uso foi aprovado em 1999,
para o tratamento de infecções graves causadas por bactérias Gram-positivas
multirresistentes, inclusive enterococos resistentes à vancomicina (Mukhtar et al., 2005).
Os antibióticos representantes dessa classe são a quinupristina e dalfopristina,
(Figura 13) derivados semi-sintéticos da pristamicina, extraída de culturas de Streptomyces
pristinaepiralis (Murchison, 2002).
A B
Figura 13: Estruturas moleculares das estreptograminas A) Quinupristina B) Dalfopristina
19
Somente a combinação de quinupristina e dalfopristina foi aprovada para uso, pois
isoladas apresentam ação bacteriostática sobre bactérias Gram-positivas suscetíveis, mas
em combinação apresentam efeito bactericida (Klastersky, 2003). A associação desses
antibióticos bloqueia a síntese protéica ao se ligar à subunidade 50S do ribossomo
bacteriano. A dalfopristina bloqueia a ligação dos aminoácidos ao peptídeo em formação e
a quinupristina impede o alongamento da cadeia peptídica, que é liberada precocemente,
sem a adequada formação da proteína (Hancock, 2005).
Infecções por microrganismos resistentes às estreptograminas são raras, porém foi
identificada em estafilococos devido à desmetilação de um resíduo de adenina na posição
N-6 da subunidade 23S do ribossomo bacteriano, resultando em redução da afinidade pela
quinupristina (Stratton, 2002).
Carbapenemas
As carbapenemas são antibióticos derivados da tienamicina (Figura 14), substância
produzida por Streptomyces cattleya. Os dois principais representantes da classe são o
imipenen e meropenen. Possuem amplo espectro de ação no tratamento de infecções graves
em adultos e crianças. Seu mecanismo de ação, como nos outros antibióticos beta-
lactâmicos consiste em inibir a síntese de peptídeoglicano. No entanto as carbapenemas, ao
contrário dos outros beta-lactâmicos, possuem um significativo efeito pós-antibiótico sobre
bactérias Gram-negativas, inclusive Pseudomonas aeruginosa (Knapp & English, 2001).
Figura 14: Estrutura molecular da tienamicina
20
Alguns microrganismos intracelulares apresentam resistência a esses antibióticos,
como as riquétsias, ureaplasmas, clamídias e espécies como Stenotrophomonas maltophilia,
Enterococcus faecium, cepas de S. aureus resistentes à meticilina e Pseudomonas cepacia
(Darville, 1999).
Apresentam estabilidade na presença das enzimas beta-lactamases, porém sofrem
hidrólise por metalo-beta-lactamases de Stenotrophomonas maltophilia e por beta-
lactamases produzidas por alguns bacilos e bacterioides (Knapp & English, 2001).
A resistência às carbapenemas tem sido observada com uma freqüência crescente
devido à mutações que provocam a redução da expressão de porinas e conseqüente redução
da penetração do antibiótico na célula bacteriana (Knapp & English, 2001).
Oxazolidinonas
As oxazolidinonas são antimicrobianos de origem sintética relatadas em 1987. No
ano 2000 a linezolida (Figura 15), principal representante dessa classe, foi aprovada para
uso clínico (Thompson et al., 2002).
As oxazolidinonas têm atividade sobre diversas espécies de bactérias Gram-
positivas, incluindo cepas multirresistentes. A linezolida tem demonstrado bons resultados
no tratamento de pneumonia causada por S. aureus resistente à meticilina ou por
Streptococcus pneumoniae multirresistente, além de infecções de pele e de tecidos moles
Figura 15: Estrutura molecular da linezolida
21
causadas por cepas de S. aureus, Streptococcus pyogens, e Streptococcus agalatiae
resistentes a meticilina, assim como no tratamento de infecções por Enterococcus faecium
resistente à vancomicina (Nagiec et al., 2005).
O mecanismo de ação consiste em inibir a síntese protéica ao ligar-se à fração 50S
do ribossomo, impedindo a ligação do RNA transportador e conseqüentemente o início da
formação do complexo peptídico (Patel et al., 2001).
Daptomicina
A Daptomicina (Figura 16) é um antibiótico semi-sintético, originalmente derivado
de Streptomyces roseosporus, pertencente à nova classe dos lipopeptídeos, desenvolvido
em 1984 e licenciado nos Estados Unidos em 1999, onde se iniciaram ensaios clínicos para
tratamento de infecções hospitalares por bactérias Gram-positivas (Sakoulas et al., 2003).
Estudos in vitro demonstraram potente atividade bactericida sobre bactérias Gram-
positivas como enterococos resistentes à vancomicina, S. aureus resistente à meticilina e
Streptococcus pneumoniae resistente à penicilina (Sakoulas et al., 2003).
Figura 16: Estrutura molecular da daptomicina
22
O antibiótico foi recentemente aprovado nos Estados Unidos para o tratamento de
infecções de pele complicadas causadas por S. aureus sensível e resistente à meticilina e
infecções causadas por E. faecalis, Streptococcus pyogenes e Streptococcus agalactiae
sensível à vancomicina (Streit et al., 2004).
O mecanismo de ação ainda não foi totalmente elucidado. No entanto pesquisas
sugerem a inibição da síntese de peptídeoglicano e de ácido lipoteicóico, presente na parede
celular e a capacidade de inserção na membrana citoplasmática, provocando seu
rompimento e liberação de íons importantes para a célula bacteriana, levando-a
rapidamente à morte (Streit et al., 2004; King & Phillips, 2001).
Resistência aos antibióticos
O surgimento de microrganismos resistentes tem como causa principal o mau uso
dos antibióticos, que não são causadores diretos de resistência, mas selecionam
microrganismos resistentes, ao agirem sobre os sensíveis e possibilitarem aos resistentes de
se desenvolverem e ocuparem o lugar da população sensível. Ou ainda bactérias sensíveis
podem adquirir genes de resistência, provenientes de outras espécies (Jansen et al., 2006;
Skurnik & Andremont, 2006).
Os mecanismos de resistência devem-se à possibilidade dos microrganismos de
produzirem enzimas como as beta-lactamases, que destroem antibióticos beta-lactâmicos,
expulsarem o medicamento da célula bacteriana por bombas de efluxo, impedindo-o de
alcançar o sítio de ação, modificarem a estrutura da parede de forma que esta não contenha
os locais de ligação aos antibióticos ou ainda sofrerem mutações e reduzirem o número de
porinas, dificultando a entrada do antibiótico (Tenover, 2006).
23
O fenômeno de comunicação entre as bactérias denominado quorum-sensing lhes
permite regular diversas funções celulares como luminescência, formação de biofilmes,
produção de antibióticos, expressão de fatores de virulência e motilidade. O conhecimento
dessa “linguagem bacteriana” e conseqüentemente a sua inibição pode resultar na
descoberta de novas substâncias eficazes no tratamento de infecções (Adonizio et al.,
2006).
O quorum-sensing se deve à produção, pelas bactérias, de pequenas substâncias que
se difundem pelas membranas. À medida que a população bacteriana aumenta, essas
moléculas atingem uma concentração crítica que permite a indução ou repressão de
numerosos genes (Berre et al., 2006).
A formação de biofilmes é outro fenômeno que contribui para a resistência aos
antibióticos, e consiste na adesão de bactérias a uma matriz polimérica formada por
exopolissacarídeo, que desenvolve em uma comunidade complexa, dinâmica, formada por
uma ou mais espécies de bactérias (Smith, 2005).
Os biofilmes se desenvolvem a partir da aderência de bactérias a superfícies de
próteses e cateteres e são difíceis de serem detectados na prática clínica. O biofilme
aumenta a resistência aos antibióticos devido à dificuldade de penetração, pois é coberto
por um polímero hidrofílico complexo, o glicocalix, de natureza aniônica, com o qual o
fármaco pode reagir quimicamente ou ser adsorvido por ele (Smith, 2005; Sutherland,
2001).
Mutação, seleção e transferência entre bactérias de genes de resistência fazem com
que os microrganismos rapidamente se adaptem à presença do antibiótico no meio
(Tenover, 2006).
24
Plantas medicinais
De acordo com a Organização Mundial de Saúde os remédios extraídos de plantas
são utilizados por 80% da população mundial, em especial nas áreas rurais dos países em
desenvolvimento ou em locais onde a população não tem acesso ou condições de adquirir
medicamentos (Tadeg, 2005).
No Brasil, é comum a utilização de plantas medicinais para o tratamento de
doenças. Mas pouco se conhece sobre essas plantas, sendo necessário aprofundar os estudos
etnofarmacológicos a fim de detectar substâncias úteis para a produção de novos
medicamentos (Mesquita et al., 2007; Lima et al., 2006; Cos et al., 2006; Hiruma-Lima et
al., 2006; Napolitano et al., 2005; Souza et al., 2004; Batalha et al., 2002; Karaman et al.,
2001).
O aumento da resistência dos microrganismos aos medicamentos disponíveis
justifica a busca de novas substâncias antimicrobianas. Compostos com baixa toxicidade
para as células humanas, capazes de inibir o crescimento, provocar a morte de
microrganismos ou inibir fenômenos como quorum-sensing e outros fatores de resistência
são candidatos ao desenvolvimento de novos medicamentos (Adonisio et al., 2006;
Karaman et al., 2001; Ahmad et al., 2001).
Cerrado
Uma estratégia para se obter novos antimicrobianos é a pesquisa de substâncias
ativas extraídas de produtos naturais, importante fonte de fármacos e moléculas líderes para
o desenvolvimento de novos medicamentos (Chin et al., 2006).
Uma análise sobre a origem dos medicamentos produzidos entre 1981 e 2002
mostrou que 52% das novas substâncias químicas introduzidas no mercado são derivadas
25
ou foram sintetizadas a partir de produtos naturais. Elas são indicadas para o tratamento de
87% de todas as categorias de doenças humanas como antibacterianos, anticancerígenos,
anticoagulantes, antiparasitários e agentes imunossupressores (Chin et al., 2006).
O Cerrado é o segundo maior bioma brasileiro, ocupando originalmente 23% do
território, sua flora é bastante variada, sendo 44% das espécies endêmicas (Klink &
Machado, 2005).
Neste trabalho, o Banco de Extratos de Plantas do Bioma Cerrado/Laboratório de
Farmacognosia/UnB possibilitou a investigação da atividade de extratos e substâncias
vegetais sobre bactérias e fungo patogênicos aos seres humanos. Após triagem a espécie
Kielmeyera coriacea (Figura 17) foi selecionada para estudo químico biomonitorado, a fim
de isolar a molécula responsável pela atividade antimicrobiana.
Figura 17: Kielmeyera coriacea Mart. & Zucc.
26
Nome científico: Kielmeyera coriacea Mart. & Zucc.
Família: Clusiaceae
Sinonímia científica: Bonnetia coriacea Spreng., Martineria arborea Vill.
Nomenclatura popular: pau-santo, folha-santa, pau-de-josé, saco-de-boi
Bioma: Cerrado
Ecossistema: Cerrado senso strictu
Arbusto pequeno de caule cilíndrico e contorcido, casca grossa, até 3 cm de
espessura, ramos alternos, folhas terminais denso aglomeradas no ápice dos ramos, quase
sésseis, lanceolado-obovadas de 10-20 cm de comprimento e 3-10 cm de largura, coriáceas,
flores brancas, fruto cápsula ovóide, carnosa, triangular e trilocular, sementes compridas,
subcuneiformes, aladas, imbricadas (Pio Correia, 1969).
O extrato aquoso do caule de K. coriacea é utilizado na medicina tradicional para o
tratamento de infecções fúngicas e bacterianas, esquistossomose, leishmaniose e malária
(Zagoto et al., 2006; Goulart et al., 2005).
Estudos demonstram variadas atividades de extratos de K. coriacea, como a
atividade anti-ulcerosa do extrato hidroalcoolico do caule (Goulart et al., 2005). Atividade
fungicida de substâncias isoladas de extratos metanólico e diclorometânico do caule e das
folhas sobre Cladosporium cucumerinum e Candida albicans (Cortez et al., 1998). Efeito
ansiolítico em ratos do extrato hidroalcoólico das folhas (Audi et al., 2002).
27
2. Objetivos
Objetivo geral
Realizar uma triagem da atividade in vitro de extratos de plantas do bioma Cerrado sobre
bactérias Gram-negativas (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella
choleraesuis), Gram-positivas (Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis) e o fungo
Candida albicans causadores de infecções hospitalares e comunitárias.
Objetivos específicos
- Identificar extratos de plantas do Cerrado com atividade antimicrobiana
- Isolar e identificar a substância vegetal responsável pela atividade antimicrobiana
- Determinar a concentração inibitória mínima (CIM) da substância ativa
28
3. Materiais e Métodos
3.1. Material vegetal e produção dos extratos
O material vegetal foi coletado no bioma Cerrado, no entorno de Brasília/DF
juntamente com o botânico Prof. José Elias de Paula/UnB. Excicatas foram mantidas no
Herbário (UB)/UnB. Os diferentes órgãos vegetais foram separados (cascas e madeira do
caule e da raiz, fruto, sementes e folhas), dessecados, estabilizados, pulverizados em
moinho de facas e submetidos a extrações exaustivas por maceração com solventes de
diferentes polaridades: hexano, diclorometano e solução hidroalcoólica (etanol 80% e água
20%). A solução extrativa foi recuperada por filtração e concentrada em rotavapor,
obtendo-se os diferentes extratos brutos. Os diferentes extratos brutos foram mantidos à
temperatura de -20º C (Figura 18). Para a realização dos testes cada extrato foi dissolvido
em dimetilsulfóxido (DMSO) a uma concentração de 1000 µg/mL.
29
Coleta e identificação Prof. José Elias de Paula
Separação dos órgãos vegetais Dessecação-Estabilização
Órgão vegetal pulverizado
Concentração em rotavapor
Figura 18: Seqüência de produção dos extratos brutos
Maceração Filtração
Extratos brutos
30
3.2. Microrganismos
Para as avaliações antimicrobianas foram utilizadas cepas da American Type
Culture Collection (ATCC) cedidas pelo Instituto Nacional de Controle de Qualidade em
Saúde (INCQS) da Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ). As bactérias foram mantidas em
ágar Müeller-Hinton inclinado à temperatura ambiente e os fungos foram mantidos em ágar
Sabouraud inclinado a temperatura ambiente.
Os organismos usados nos testes foram: Escherichia coli (ATCC 8739),
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), Staphylococcus aureus (ATCC 6538), Salmonella
choleraesuis (ATCC 14028), Enterococcus faecalis (ATCC 29212) e o fungo Candida
albicans (ATCC 10231).
As culturas dos microrganismos foram preparadas 24 h antes dos testes, realizados
em duplicata e o resultado foi obtido pela média aritmética da medida dos halos de inibição.
3.3. Teste de susceptibilidade à ação antimicrobiana dos extratos vegetais
3.3.1. Método de difusão em discos
3.3.2. Teste antibacteriano
Foi utilizada a metodologia adotada pelo Clinical and Laboratory Standards Institute
(CLSI). As bactérias foram mantidas em ágar Müeller-Hinton inclinado por 24 h em estufa
à temperatura de 37 ºC, em seguida foram ressuspendidas em solução salina estéril 0,85% e
ajustadas de acordo com o padrão 0,5 da escala de McFarland (108 UFC/mL).
A suspensão contendo as bactérias foi inoculada homogeneamente em placas de
Petri, contendo 20 mL de ágar Müeller-Hinton e após 15 minutos foram depositados discos
estéreis de papel de filtro de 6 mm de diâmetro na superfície do meio de cultura. 10 µL do
31
extrato diluído na concentração de 1000 µg/mL foi depositada sobre os discos e as placas
foram incubadas à 37 ºC por 24 h.
A inibição do crescimento bacteriano foi determinada pela medição, com auxílio de
um paquímetro, do diâmetro dos halos, incluindo o diâmetro do disco. Discos impregnados
com 10 µg de gentamicina e ampicilina (Laborclin®) foram utilizados como controles
positivos e DMSO 100% como controle negativo.
3.3.3. Teste antifúngico
Foi utilizada a metodologia adotada pelo Clinical and Laboratory Standards Institute
(CLSI). O fungo C. albicans foi mantido em ágar Sabouraud inclinado por 24 h à
temperatura ambiente e em seguida foi ressuspendido em solução salina estéril 0,85% e
ajustado de acordo com o padrão 0,5 da escala de McFarland (108 UFC/mL).
A suspensão contendo o fungo foi inoculada homogeneamente em placas de Petri,
contendo 20 mL de ágar Sabouraud e após 15 minutos foram depositados discos estéreis de
papel de filtro de 6 mm de diâmetro na superfície do meio de cultura. 10 µL dos extratos
diluídos na concentração de 1000 µg/mL foram depositados sobre os discos e as placas
foram incubadas à temperatura ambiente por 24 a 36 h.
A inibição do crescimento microbiano foi determinada pela medição, com auxílio
de um paquímetro, do diâmetro dos halos, incluindo o diâmetro do disco. Tioconazol foi
utilizado como controle positivo, na concentração de 50 µg/mL e DMSO 100% como
controle negativo.
32
3.3.4. Bioautografia
A bioautografia é utilizada para identificar a substância responsável pela atividade
antimicrobiana de uma amostra. A técnica utiliza a cromatografia em camada delgada
(CCD) para separar as substâncias presentes no extrato bruto. A CCD eluída é depositada
em uma placa de Petri, onde é adicionado o ágar, o qual deve solidificar, para então
adicionar o inóculo bacteriano. As substâncias presentes na CCD se difundem no ágar e
observa-se um halo de inibição em torno da (s) substância (s) responsável (is) pela
atividade antimicrobiana.
Alíquotas de 1 µL do extrato diluído foram depositadas em placas de CCD, eluídas
em ciclohexano:acetato de etila (80:20). Em seguida, as placas CCD eluídas foram
colocadas em placa de Petri estéril, sobre a qual foi adicionado o meio Müeller-Hinton. A
espécie S. aureus foi inoculada a uma concentração equivalente ao padrão 0,5 da escala de
McFarland. A placa de Petri foi incubada por 24 h a 37 ºC. A atividade foi avaliada pela
medição dos halos de inibição, formados em torno das substâncias eluídas em CCD (Figura
19).
Figura 19: Bioautografia - halo de inibição formado em torno da substância ativa
33
3.3.5. Método de diluição – Concentração inibitória mínima
Foi determinada a concentração inibitória mínima (CIM) do sub-grupo ativo, por
meio do método de diluição seriada. Esse sub-grupo foi obtido pelo fracionamento químico
biomonitorado do extrato ativo.
O sub-grupo foi dissolvido em DMSO (concentração 5%) e água Mili Q a uma
concentração de 2000 µg/mL. 100 µL dessa solução foram transferidos para o primeiro
poço de uma placa de 96 poços e diluídos com ágar Müeller-Hinton para a concentração de
1000 µg/mL. Foram realizadas diluições sucessivas do sub-grupo até a concentração de
0,48 µg/mL.
O inóculo bacteriano foi dissolvido em solução salina em uma concentração
equivalente ao padrão 0,5 da escala de McFarland (108 UFC/mL), diluído 1/100 para obter
a concentração 106 UFC/mL e inoculado em cada poço da placa contendo as diluições
sucessivas do sub-grupo ativo em meio de cultura. As culturas foram incubadas a 37 ºC por
24 h. Para indicar o crescimento bacteriano foram adicionados 40 µL de MTT (0,2 mg/mL)
em cada poço e incubado de 1 a 2 h.
O MTT é um sal de tetrazolium, cuja coloração inicial é amarela, no entanto em
células viáveis esse sal é reduzido a formazan, que apresenta coloração azul.
A cor azul indica crescimento bacteriano, portanto a menor concentração do sub-
grupo em que não houve crescimento (amarela) foi considerada a concentração inibitória
mínima (Figura 20). Para o experimento foi realizado teste de esterilidade (2% de DMSO
em meio de cultura), controle negativo (2% de DMSO, meio de cultura e inóculo) e
controle positivo (2% de DMSO, meio de cultura, inóculo e ampicilina). O experimento foi
realizado em triplicata (Dickson et al., 2007; Okusa et al., 2007; Langfield et al., 2004).
34
4. Estudo químico biomonitorado
O extrato bruto hexânico ativo foi fracionado em coluna cromatográfica aberta de
sílica gel 60 (120 g), sob gradiente de ciclohexano:acetato de etila 100:0; 98:2; 95:5; 90:10;
80:20; 60:40; 20:80; 10:90; 0:100 e metanol 100. O fracionamento permitiu o recolhimento
de frações de 100 mL, que foram reunidas em grupos (G), conforme o perfil cromatográfico
em CCD (placa de sílica gel 60 F254 – Merck) revelada em UV e vanilina sulfúrica,
seguida de aquecimento a 100 ºC.
A atividade dos grupos foi avaliada sobre S. aureus, pelo teste de difusão em disco e
bioautografia. Dois grupos ativos (2,06 g) foram fracionados novamente em coluna aberta
de sílica gel 60 (62 g) sob gradiente de ciclohexano:acetato de etila 95:5; 90:10; 80:20;
50:50; 0:100 e metanol 100.
Figura 20: Teste de diluição seriada – determinação concentração inibitória mínima (CIM).
Coloração azul = bactérias vivas. Coloração amarela = bactérias mortas.
Controle positivo Ampicilina
1000 µg/mL 0,48 µg/mL
Controle de crescimento
Controle de crescimento
35
A atividade antimicrobiana dos sub-grupos foi monitorada sobre S. aureus, pelo
método de difusão em disco e bioautografia. O sub-grupo ativo (1,22 g) foi fracionado
novamente em coluna aberta de sílica gel 60 (73,2 g), sob gradiente de ciclohexano:acetato
de etila 98:2; 95:5; 92,5:7,5; 90:10; 85:15; 80:20; 70:30; 50:50; 0:100. Novamente a
atividade foi monitorada pelo método de difusão em disco e bioautografia. Após a seleção
do sub-grupo ativo, foi determinada sua concentração inibitória mínima (CIM) pelo método
de diluição.
A purificação e a elucidação estrutural do sub-grupo ativo está sendo realizada junto
com o Prof. Edilberto R. Silveira/UFC.
5. Resultados e Discussão
Foram testados 65 extratos brutos hexânicos, diclorometânicos e hidroalcoólicos,
em uma concentração de 1000 µg/mL, obtidos a partir de 13 espécies pertencentes a 9
famílias vegetais (Tabela 1) sobre as espécies Gram-positivas Staphylococcus aureus
(ATCC 6538) e Enterococcus faecalis (ATCC 29212), Gram-negativas Escherichia coli
(ATCC 8739), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027) e Salmonella choleraesuis (ATCC
14028) e sobre o fungo Candida albicans (ATCC 10231). Foram identificados 14 extratos
com atividade sobre uma ou duas espécies de bactérias dentre as cinco espécies utilizadas
(Tabela 2). Destes extratos 7 inibiram o crescimento das espécies Gram-positivas S. aureus
e E. faecalis, 6 inibiram apenas o crescimento de S. aureus e 1 extrato inibiu o crescimento
de E. faecalis e do fungo C. albicans. Dos extratos ativos 8 eram hexânicos (apolares),
sendo 2 provenientes das folhas, 5 do caule e raiz e 1 do fruto; 1 extrato hidroalcoólico
36
(polar) proveniente da raiz; 5 extratos diclorometânicos (média polaridade), sendo 2
provenientes das folhas, 2 da raiz e 1 do caule.
Os resultados foram expressos pelo diâmetro do halo de inibição: 8 a 13 mm:
extrato moderadamente ativo, ≥ 14 mm: extrato muito ativo (Mothana & Lindequist, 2005;
Karaman et al., 2001).
Dos extratos testados 13 inibiram o crescimento de S. aureus e 8 inibiram o
crescimento de E. faecalis. Os extratos ativos sobre S. aureus e E. faecalis foram os
diclorometânicos: folha e raiz de Calophyllum brasiliense e folha de Schinus
terebinthifolius; extratos hexânicos: folha de C. brasiliense e de S. terebinthifolius e
madeira da raiz de Kielmeyera coriacea; extrato hidroalcoólico: raiz de C. brasiliense.
Os extratos ativos somente sobre S. aureus foram os extratos hexânicos: madeira e
casca do caule, casca da raiz e frutos de K. coriacea, madeira da raiz de Qualea parviflora e
o extrato diclorometânico da madeira da raiz de K. coriacea.
O extrato ativo somente sobre E. faecalis e sobre o fungo C. albicans foi o extrato
diclorometânico da madeira do caule de Qualea grandiflora, com halos de inibição de 8 e 9
mm, respectivamente.
Dentre os extratos ativos os que apresentaram maior halo de inibição foram os
extratos hexânicos de madeira e casca da raiz (14 mm), madeira do caule (14 mm) e frutos
de K. coriacea (16 mm). Tal atividade foi observada somente sobre a espécie Gram-
positiva S. aureus.
Foram utilizados como controles positivos discos impregnados com 10 µg de
Ampicilina ou Gentamicina (Laborclin®), que apresentaram halos de inibição variando de
37
12 a 28 mm. DMSO foi utilizado como controle negativo a 100% e não inibiu o
crescimento das bactérias.
Para o teste antifúngico foi utilizado como controle positivo Tioconazol em uma
concentração de 50 µg/mL e foi observado halo de inibição de 29 mm. DMSO foi utilizado
como controle negativo a 100% e não inibiu o crescimento do fungo.
Os halos de inibição dos extratos vegetais normalmente apresentam-se menores que
os halos dos controles positivos, visto que os extratos vegetais apresentam uma grande
diversidade de substâncias, sendo desconhecida à substância responsável pela atividade
antimicrobiana, bem como sua concentração no extrato bruto. Como controles positivos são
utilizados discos impregnados com concentrações determinadas de antibiótico, o qual é
uma substância pura e conseqüentemente apresenta halos de inibição maiores.
Os extratos ativos pertencem às famílias Anacardiaceae, Clusiaceae e Vochysiaceae.
A atividade antimicrobiana de algumas plantas da família Anacardiaceae sobre S. aureus,
P. aeruginosa, E. coli e E. faecalis foi descrita na literatura. Essa atividade pode estar
relacionada à presença de alcalóides e triterpenóides (Bbosa et al., 2007). Dentro desta
família vegetal pode-se destacar a espécie Schinus terebinthifolius, utilizada na medicina
tradicional no tratamento de tumores e hanseníase, cuja atividade antifúngica e
antibacteriana do extrato aquoso das folhas já foram descritas na literatura (Schmourlo,
2005).
Duas espécies da família Vochysiaceae apresentaram fraca atividade
antimicrobiana, Qualea grandiflora e Q. parviflora. A espécie Q. grandiflora é
popularmente utilizada no tratamento de ferimentos, diarréias, amebíase, doenças
inflamatórias e desordens gastrointestinais (Hiruma-Lima et al., 2006). No entanto não
38
existem na literatura dados a respeito da atividade antimicrobiana dessa espécie e da família
Vochysiaceae.
Os extratos com maior atividade antibacteriana pertencem à família Clusiaceae. A
literatura descreve atividade antimicrobiana, antitumoral e antiviral em extratos de plantas
dessa família, devido à presença de xantonas, flavonóides, benzofenonas e cumarinas
(Zhang et al., 2007; Prachyawarakorn et al., 2006; Teixeira & Cruz, 2005; Yasunaka et al.,
2005; Yimdjo et al., 2004).
Segundo Tanaka & Takaishi (2006) a família Clusiaceae é rica em xantonas, com
atividades como: efeito antibacteriano sobre cepas de S. aureus resistente a meticilina e
enterococos resistente a vancomicina e ainda apresentam atividade antitumoral,
antimalárica e inibição seletiva da ciclooxigenase-2.
A espécie Calophyllum brasiliense é utilizada popularmente no tratamento de
úlceras crônicas, reumatismo e hemorróidas. Estudos fitoquímicos revelaram a presença de
diversos tipos de xantonas e substâncias com importante atividade anti-retroviral (Reyes-
Chilpa et al., 2004; Sartori et al., 1999).
Neste estudo pode-se observar que diferentes extratos obtidos a partir de Kielmeyera
coriacea apresentaram atividade sobre S. aureus. Na medicina tradicional, o extrato aquoso
do caule de K.coriacea é preparado por decocção e utilizado no tratamento de infecções
bacterianas e fúngicas, malária, esquistossomose e leishmaniose. Porém pouco se conhece a
respeito da eficácia terapêutica de seu extrato ou de suas substâncias isoladas (Zagoto et al.,
2006).
Em estudos já realizados utilizando extratos metanólico e diclorometânico do caule
e das folhas, foram encontrados triterpenos, bifenil e dez diferentes tipos de xantonas.
39
Quatro xantonas e o bifenil aucuparina (Figura 21) apresentaram efeito antifúngico sobre as
espécies Cladosporium cucumerinum e Candida albicans (Cortez et al., 1998).
Zagoto et al. (2006), utilizando o extrato hidroalcoolico do caule de K. coriacea
observaram que em mitocôndrias isoladas o extrato causa o desacoplamento da fosforilação
oxidativa e a inibição de atividades enzimáticas ligadas à cadeia respiratória. Esse resultado
sugere uma possível toxidade do extrato, mas também sugere seu possível mecanismo de
ação sobre fungos e protozoários.
A fosforilação oxidativa é a etapa final da respiração celular, que ocorre na
mitocôndria das células de organismos aeróbios e consiste na síntese de ATP direcionada
pela transferência de elétrons, portanto substâncias que atuam como desacopladoras pode
Figura 21: Xantonas (A) e bifenil (B) de K. coriacea com atividade antifúngica
A A A
B
40
causar redução do controle respiratório, redução da taxa de ADP e aumento da hidrólise de
ATP (Zagoto et al., 2006).
Em nosso estudo, não detectamos atividade dos extratos sobre espécies de bactérias
Gram-negativas. Provavelmente deve-se à estrutura de sua parede celular mais complexa,
com uma membrana externa, uma fina camada de peptídeoglicana e o espaço
periplasmático (Denyer & Maillard, 2002). Os lipopolissacarídeos, da membrana externa
possuem carga negativa, responsável em grande parte pela impermeabilidade aos
antimicrobianos. A penetração de moléculas hidrofóbicas é bastante lenta, contribuindo
para a resistência natural a muitos antibióticos. A penetração de moléculas hidrofílicas
pelas porinas é limitada pelo tamanho dos canais (Denyer & Maillard, 2002).
A estrutura da parede celular das bactérias Gram-positivas é menos complexa,
hidrofílica, composta por polímeros aniônicos como o ácido teicóico e teicurônico,
covalentemente ligados à peptídeoglicana, formando uma rede que permite a passagem de
moléculas com pesos de 30 000 a 57 000 Da, o que faz com que muitos antibióticos,
desinfetantes e anti-sépticos consigam penetrá-la (Lambert, 2002).
Não foi observada atividade significativa sobre C. albicans. A parede fúngica é
formada por múltiplas camadas de carboidratos, proteínas, lipídios, β-glucanas e quitina
formando uma rede microfibrilar rígida com proteínas e glicoproteínas ligadas a esse
esqueleto (Lopez-Ribot et al., 2004).
O extrato hexânico da casca da raiz de Kielmeyera coriacea, ativo sobre a espécie S.
aureus (halo de inibição de 14 mm) foi selecionado para fracionamento químico
biomonitorado em coluna aberta de sílica com o objetivo de isolar e identificar a substância
responsável pela atividade antibacteriana. O extrato (4 g) foi fracionado em coluna aberta
de sílica gel 60 (120 g). Foram recolhidas 54 frações de 100 mL, reunidas em 10 grupos
41
(G), após análise do perfil cromatográfico em CCD. O rendimento total dos grupos obtidos
foi de 54,81%, devido a perdas que podem ser atribuídas às frações desprezadas por
conterem substâncias intermediárias a dois grupos, além dos procedimentos laboratoriais
como transferências de uma vidraria para outra. O grupo G6 obteve o maior rendimento
(13,5%) e o grupo G4 obteve o menor rendimento (0,025%) (Tabela 3).
A atividade antimicrobiana dos grupos foi avaliada pelo método de difusão em
disco e pela técnica de bioautografia sobre S. aureus. Os grupos G5 e G6, obtidos nos
sistemas eluente ciclohexano:acetato de etila (80:20 e 60:40), apresentaram melhor
atividade com halos de inibição de 13 mm (G5) e 15 mm (G6), no teste de difusão em disco
e halos de 13 mm (G5) e 11 mm (G6) na técnica de bioautografia.
Devido à maior atividade dos grupos G5 e G6, esses foram reunidos (2,07 g) e
recromatografados em coluna aberta de sílica (62 g) em um gradiente crescente de
polaridade de ciclohexano:acetato de etila 95:5; 90:10; 80:20; 50:50; 0:100 e metanol
(100). Foram recolhidas 353 frações de 50 mL, reunidas em 8 sub-grupos (SG) após análise
do perfil cromatográfico em CCD. O rendimento total dos sub-grupos foi de 99,63%. O
sub-grupo SG6 obteve o maior rendimento (34,05%) e os sub-grupos SG2, SG3 e SG4
obtiveram os menores rendimentos (0,5%) (Tabela 4).
A atividade dos sub-grupos foi avaliada pelo método de difusão em disco sobre
S. aureus. Os sub-grupos SG6 e SG7, obtidos nos sistemas eluentes ciclohexano:acetato de
etila (98:2, 95:5, 90:10 80:20 e 50:50), apresentaram maior atividade, com halos de inibição
de 12 mm e 14 mm respectivamente. Estes sub-grupos foram reunidos (1,22 g) e
submetidos a um novo fracionamento em coluna aberta de sílica gel 60 (72 g), em gradiente
de ciclohexano:acetato de etila 98:2; 95:5; 92,5:7,5; 90:10; 85:15; 80:20; 70:30; 50:50;
42
0:100. Foram recolhidas 584 sub-frações de 10 mL reunidas em 8 sub-grupos (SG), após
análise do perfil cromatográfico em CCD.
O rendimento total dos sub-grupos obtidos foi de 99,96%. O sub-grupo SG6 obteve
o maior rendimento (22,34%), e os sub-grupos SG3 e SG5 obtiveram o menor rendimento
(1,06%) (Tabela 5).
A atividade dos sub-grupos foi avaliada sobre S. aureus (Figura 22). O sub-grupo
SG8, obtido no sistema eluente ciclohexano:acetato de etila (50:50 e 0:100), apresentou
maior atividade com halo de inibição de 16 mm (método de difusão em disco) e 11 mm
(bioautografia).
A CCD de SG8 eluída em ciclohexano:acetato de etila (73:27) revelada com
vanilina sulfúrica, seguida de aquecimento a 100 °C, apresenta duas substâncias com fator
de retenção (Rf) de 0,57 e 0,65 (Figura 23). A bioautografia confirmou a atividade da
substância de menor Rf. A proximidade das duas substâncias dificultou a separação em
coluna aberta de sílica.
Figura 22: Kielmeyera coriacea: halos de inibição formados sobre S. aureus (Sa).
1 a 8 = Sub-grupos obtidos do estudo químico extrato hexânico casca da raiz de K.
43
A análise do sub-grupo ativo SG8 em CCD sugere que a substância com atividade
antimicrobiana tenha caráter mais polar, o que facilita a pesquisa de novas moléculas
ativas, pois podem ser melhor solubilizadas e portanto favorecer o estudo com melhor
absorção e biodisponibilização para o organismo.
A atividade desses sub-grupos somente sobre a bactéria Gram-positiva S. aureus,
talvez deva-se à hidrofilicidade de sua parede celular. Esse sub-grupo ativo SG8 apresentou
concentração inibitória mínima (CIM) sobre S. aureus de 31,25 µg/mL. A literatura
apresenta como atividade interessante valores de CIM < 100 µg/mL para um extrato bruto
(Rios & Recio, 2005).
Informações baseadas em estudos etnofarmacológicos são de grande valor na busca
por novas substâncias com potencial terapêutico (Raza, 2006). O estudo da atividade
Figura 23: Kielmeyera coriacea: Perfil em CCD do sub-grupo ativo SG8.
Substância ativa detectada pela bioautografia.
Rf = 0,57
44
antimicrobiana de K. coriacea está de acordo com o seu uso etnomedicinal, o qual tem sido
uma ferramenta importante na descoberta de novos medicamentos.
45
Família
Nome científico
Parte da planta
(solvente)i
Número do
herbário
Nome popular Uso popular
Alismataceae
Echinodorus macrophyllus Michel Fa(D,SH) - Chapéu-de-couro Antiinflamatório, diurético
Anacardiaceae
Schinus terebinthifolius Raddi
F(H,D) RMb (H,D,SH)
Cc(H,D)
(UB) 3753 Aroeira vermelha Tumores, hanseníase
Apocynaceae
Aspidosperma tomentosum Mart. F(H,SH,D) Rd(H) CCe(H,
D,SH) CMf (H)
(UB) 3692 Peroba do campo Antiparasitária
Clusiaceae
Calophyllum brasiliense Camb. F(H,SH,D) R(H,D,SH) (UB) 3754 Guanandi Reumatismo, úlceras
Tabela 1: Extratos do Banco de Extratos de Plantas do bioma Cerrado (Farmacognosia/UnB), utilizados na triagem de atividade antimicrobiana
46
CM(D,H) CC(H) crônicas
Kielmeyera coriacea Mart. & Zucc. F(H,D) CC(H) CM (H,D,SH)
RCg (H) RM (H,D) Frh(H)
(UB) 3745 Pau-santo Infecções, doenças
tropicais
Malphighiaceae
Byrsonima crassa Nied.
F(H,D,SH) (UB) 3743 Murici cascudo Úlcera gástrica, diarréia
Mimosaceae
Enterolobium ellipticum Benth. F(H,D,SH) C(D,H)
RM(H,D,SH)
(UB) 3739 Favela branca Doenças pulmonares
Stryphnodendron adstringens Mart. F(H,D) (UB) 3740 Barbatimão Leucorréia, diarréia,
inflamações
Rubiaceae
Chomelia pohliana Müll. Arg. F(H,D,SH) (UB) 3741 Limaorana Antifúngico, herbicida
Palicourea rigida H.B. & K.
F(H,D) (UB) 3661 Bate caixa Diurético
Solanaceae
47
Solanum lycocarpum A. St.-Hil.
F(H) Lobeira Diabetes
Vochysiaceae
Qualea grandiflora Mart. F(H,D,SH) R(H) CM(D,H) (UB) 3695 Pau-terra do campo Diarréia, amebíase
Qualea parviflora Mart.
RC(H,D,SH) RM (H) (UB) 3742 Pau-terra de flor
miudinha
-
iSolventes: H: hexano, D: diclorometano; SH: solução hidroalcoólica; aF: Folha; bRM: Madeira da raiz; cC: Caule (madeira +casca);
Raiz (madeira +casca); eCC: Casca do caule; fCM Madeira do caule; gRC: Casca da raiz; hFr: Fruto
48
Microrganismos
Gram negativos Gram positivos Fungo
E. coli P. aeruginosa S. chloresuis S. aureus E. faecalis C. albicans
Família
Nome científico
Parte
da
planta
testada
Solvente
Anacardiaceae
Schinus terebinthifolius Fa H n n n 9 8 n
F D n n n 8 8 n
Clusiaceae
Calophyllum brasiliense F D n n n 8 10 n
F H n n n 10 8 n
Rb SH n n n 9 9 n
R D n n n 9 9 n
Kielmeyera coriacea RMc H n n n 14 11 n
CMd H n n n 14 n n
CCe H n n n 11 n n
Frf H n n n 16 n n
RM D n n n 13 n n
Tabela 2: Extratos ativos sobre os microrganismos, após triagem do Banco de Extratos de Plantas, pelo método de difusão em ágar
Halos de inibição em milímetros (mm)
49
RCg H n n n 14 n n
Vochysiaceae
Qualea grandiflora CM D n n n n 8 9
Qualea parviflora RM H n n n 8 n n
Controles
Ampicilina (10 µg) 12 n 18 20 22 n
Gentamicina (10 µg) 28 23 23 26 18 n
Tioconazol (50 µg/mL)
DMSO (100%)
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
29
n
Resultados representados pela medida dos halos em milimetro (mm), determinados a partir de três experimentos independentes;
Solventes: H: hexano, D: diclorometano; SH: solução hidroalcoólica. aF: Folha; bR: Raiz (madeira+casca); cRM: Madeira da raiz; dCM: Madeira do caule; eCC: Casca do caule; fFr: Fruto. n: não inibiu. DMSO: dimetilsulfóxido (controle negativo).
50
Tabela 3: Kielmeyera coriacea: grupos obtidos após a reunião das frações oriundas do
fracionamento químico do extrato hexânico da casca da raiz
Eluente
a Grupo
Fração Gradiente de
polaridade
Volume
total (mL)
Peso (mg)
Rendimento (%)
G1 F1-12 C (100) C:AcEt (98:2)
790 120 3,0
G2 F13-F17 C:AcEt (98:2) C:AcEt (95:5)
750 300 7,5
G3 F18-F20 C:AcEt (95:5) C:AcEt (90:10)
500 300 7,5
G4 F21-F23 C:AcEt (90:10) C:AcEt (80:20)
500 1,01 0,025
G5 F24-F27 C:AcEt (80:20) C:AcEt (60:40)
500 1,58 0,039
G6 F28-F30 C:AcEt (60:40) 500 540 13,5 G7 F31-F39 C:AcEt (40:60)
C:AcEt (20:80) 500 400 10
G8 F40-F45 AcEt (100) 500 140 3,5 G9 F46-F50 AcEt (100) 500 260 6,5 G10 F51-F54 M (100) 200 130 3,25 G: grupo; F: fração; a Eluente: C: ciclohexano; AcEt: acetato de etila; M: metanol
51
Tabela 4: Kielmeyera coriacea: sub-grupos obtidos após reunião das frações oriundas do
fracionamento dos grupos ativos G5 e G6, oriundos do estudo químico do extrato hexânico
da casca da raiz
Eluente
a Sub-grupo
Fração Gradiente de
polaridade
Volume
total (mL)
Peso (mg)
Rendimento (%)
SG1 F1-34 C:AcEt (98:2) 50 2,57 SG2 F35-F45 C:AcEt (98:2) 10 0,5 SG3 F46-F63 C:AcEt (98:2) 10 0,5 SG4 F64-F95 C:AcEt (98:2) 10 0,5 SG5 F96-F115 C:AcEt (98:2)
9000
4 2,06 SG6 F116-F264 C:AcEt (98:2)
C:AcEt (95:5)
1000 63 34,05
SG7 F265-F312 C:AcEt (95:5) C:AcEt (90:10) C:AcEt (80:20) C:AcEt (50:50)
1000 1000 1500
60 32,43
SG8 F313-F353 AcEt (100) M (100)
500 500
50 27,02
SG: sub-grupo; F: fração.aEluente: C: ciclohexano; AcEt: acetato de etila; M: metanol
52
Tabela 5: Kielmeyera coriacea: sub-grupos obtidos após reunião das frações oriundas do
fracionamento dos sub-grupos ativos SG6 e SG7, oriundos do estudo químico do extrato
hexânico da casca da raiz
SG: sub-grupo; F: fração. aEluente: C: ciclohexano; AcEt: acetato de etila
Eluentea
Grupo
Fração Gradiente de
polaridade
Volume
total (mL)
Peso (mg)
Rendimento (%)
SG1 F1-134 C:AcEt (98:2) C:AcEt (95:5)
1750 20 21,27
SG2 F135-F197 C:AcEt (95:5) C:AcEt (92,5:7,5)
11 11,70
SG3 F198-F221 C:AcEt (92,5:7,5) 1,0 1,06
SG4 F222-F289 C:AcEt (92,5:7,5)
2500
1,4 14,89 SG5 F290-F424 C:AcEt (92,5:7,5)
C:AcEt (90:10) C:AcEt (85:15) C:AcEt (80:20)
4000 1,0 1,06
SG6 F425-F480 C:AcEt (80:20) C:AcEt (70:30)
500 2,1 22,34
SG7 F481-F499 C:AcEt (70:30) C:AcEt (50:50)
1000 1,3 13,82
SG8 F500-F584 C:AcEt (50:50) C:AcEt (0:100)
500 1,3 13,82
53
6. Conclusão
Estudos de triagem do Banco de Extratos de Plantas do Bioma Cerrado (Laboratório
de Farmacognosia/UnB) sobre as três espécies Gram-negativas Escherichia coli (ATCC
8739), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), Salmonella choleraesuis (ATCC 14028),
as duas espécies Gram-positivas Staphylococcus aureus (ATCC 6538), Enterococcus
faecalis (ATCC 29212) e o fungo Candida albicans (ATCC 10231), permitiram selecionar
o extrato hexânico da casca da raiz de Kielmeyera coriacea. Esse extrato, na concentração
de 1000 µg/mL apresentou atividade in vitro sobre a bactéria S. aureus, com halo de
inibição de 14 mm, pela técnica de difusão em ágar.
O fracionamento químico biomonitorado em três sucessivas colunas
cromatográficas abertas de sílica gel, permitiu a obtenção de um grupo ativo com 2
substâncias (SG8). Essas substâncias apresentam Rf 0,57 e 0,65 em CCD eluída em
ciclohexano:acetato de etila (73:27). A técnica de bioautografia permitiu observar que a
substância de menor Rf (0,57) é a responsável pela atividade sobre S. aureus. A atividade
de SG8 sobre S. aureus, pela técnica de difusão em ágar, na concentração de 1000 µg/mL
apresentou halo de inibição de 16 mm.
A concentração inibitória mínima (CIM) de SG8 sobre S. aureus foi de 31,25
µg/mL. A literatura considera ativa o extrato com CIM < 100 µg/mL (Rios & Recio, 2005).
Portanto SG8 apresenta atividade promissora sobre S. aureus e provavelmente à substância
pura (Rf = 0,57) será mais ativa.
A proximidade das duas substâncias não permitiu sua separação em coluna
cromatográfica aberta de sílica gel. A purificação final da substância ativa e sua elucidação
estrutural está sendo realizada junto com o Prof. Edilberto R. Silveira (UFC).
54
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