SIR MYCOPLASMA 62781 10 TESTES ANTIBIOGRAMA PARA MICOPLASMAS UROGENITAIS

1- USO CLÍNICO O SIR MYCOPLASMA é um reagente destinado à análise do antibiograma de micoplasmas urogenitais: Ureaplasma spp (Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum) e Mycoplasma hominis (Mh). Actualmente, é difícil efectuar a identificação diferencial do Ureaplasma urealyticum e do U. parvum. O SIR MYCOPLASMA consiste numa microplaca com 8 antibióticos activos contra estes microrganismos e usados normalmente no tratamento das infecções genitais. O aparecimento de estirpes resistentes, especialmente às ciclinas e aos macrólidos (que são antibióticos usados no tratamento de 1.ª linha) (10, 11, 18), torna imprescindível a análise do antibiograma de modo a evitar falhas terapêuticas. A utilização de um inóculo padronizado torna esta técnica muitíssimo concordante com o método de referência (9).

2- PRINCÍPIO O SIR MYCOPLASMA é um antibiograma em meio líquido, no qual cada antibiótico está presente em duas concentrações diferentes (doxiciclina, tetraciclina, azitromicina, josamicina, eritromicina, ofloxacina) ou numa única concentração (clindamicina, pristinamicina). O teste é baseado na inibição metabólica. O crescimento dos micoplasmas é medido objectivamente através da sua actividade metabólica: hidrólise da ureia em caldo U9 pelo Ureaplasma spp e hidrólise da arginina em caldo de arginina pelo Mh, com libertação de amónia, o que torna o meio alcalino e o indicador de pH (vermelho de fenol) presente no meio passa de amarelo a vermelho. Se o microrganismo for sensível ao antibiótico testado, o seu metabolismo é inibido e o meio permanece amarelo. Se o microrganismo for resistente, vai ser capaz de crescer e o meio fica vermelho.

3- APRESENTAÇÃO O SIR MYCOPLASMA contém: • 10 microplacas SIR (o diagrama dos 16 poços é reproduzido no rótulo, permitindo a identificação da amostra). • 10 películas adesivas de protecção. • 1 folheto informativo. Cada microplaca é envolvida individualmente, com uma saqueta de exsicante, em folha de alumínio selada.

4- ARMAZENAMENTO O SIR MYCOPLASMA pode ser utilizado até à data de validade impressa na embalagem, se for armazenado entre + 2 e 8°C.

5- EQUIPAMENTO NECESSÁRIO (NÃO FORNECIDO) • Caldo U9: referência 62762 (embalagem de 10 ampolas de caldo U9 liofilizado QSP 2 ml) • Caldo de arginina: referência 62763 (embalagem de 10 ampolas de caldo de arginina liofilizado QSP 2 ml) • MYCOPLASMA DUO (caixa de 20 testes – referência 62740) • Água destilada esterilizada • Pipetas de 2 ml, 200 µl, 100 µl e 20 µl • Estufa de bacteriologia a 37°C • Contentor para eliminação de resíduos contaminados

6- MODO DE FUNCIONAMENTO A) A MICROPLACA SIR A microplaca SIR é uma microgaleria com duas filas de 8 poços revestidos com os diferentes antibióticos. Os antibióticos são reidratados quando o inóculo é pipetado para os poços de forma a obter concentrações próximas das concentrações críticas e deste modo permitir a análise do perfil de sensibilidade das estirpes testadas assim como a sua classificação como sensíveis, intermédias ou resistentes em relação a cada antibiótico.

Controlo do crescimento na ausência de antibiótico Doxiciclina (4 mg/l e 8 mg/l)

Tetraciclina (4 mg/l e 8 mg/l)

Azitromicina (2 mg/l e 4 mg/l)

Josamicina (2 mg/l e 8 mg/l)

Eritromicina (1 mg/l e 4 mg/l)

Clindamicina (2 mg/l)

Pristinamicina (2 mg/l)

Ofloxacina (1 mg/l e 4 mg/l)

B) SELECÇÃO DOS ANTIBIÓTICOS

A selecção dos antibióticos a serem testados foi efectuada tendo por base as prescrições terapêuticas para infecções neonatais e genitais causadas por micoplasmas (17). Até à presente data, não há uma concentração crítica específica para os micoplasmas. Desse modo, as concentrações críticas escolhidas para a microgaleria SIR MYCOPLASMA baseiam-se nas encontradas numa série de publicações científicas e/ou recomendadas por sociedades médicas como a CA-SFM (Comité dos Antibiogramas - Sociedade Francesa de Microbiologia). A escolha das concentrações de azitromicina foi baseada numa avaliação efectuada com estirpes clínicas (19). Ciclinas testadas: tetraciclina e doxiciclina (nas concentrações de 4 e 8 mg/l). As estirpes de Mh e Ureaplasma spp descritas como sendo resistentes às tetraciclinas foram detectadas inequivocamente desde que foi publicado que as Concentrações Inibitórias Mínimas (CIM) eram ≥ 8 mg/l em oposição a ≤ 2 mg/l, para as estirpes sensíveis (15, 18). Para esta classe de antibióticos, existem resistências de baixo nível que requerem uma incubação de 48 horas (19). A taxa de frequência de resistência às ciclinas entre as várias estirpes varia de acordo com o país e o nível de exposição aos antibióticos (18). Macrólidos testados: eritromicina (nas concentrações de 1 e 4 mg/l), azitromicina (nas concentrações de 2 e 4 mg/l) e josamicina (nas concentrações de 2 e 8 mg/l). As estirpes de Mh são naturalmente resistentes à eritromicina e à azitromicina. A josamicina permanece activa. Consequentemente, os resultados obtidos com estes antibióticos devem confirmar a identificação da estirpe previamente obtida. A frequência da resistência adquirida aos macrólidos entre Mh e as estirpes de Ureaplasma spp isoladas na clínica não é conhecida mas é provavelmente muito baixa (18). Lincosamidas testadas: clindamicina (na concentração de 2 mg/l). As estirpes de Ureaplasma spp são naturalmente resistentes a este antibiótico (18). Estreptograminas testadas: pristinamicina (na concentração de 2 mg/l). As estirpes de Mycoplasma são extremamente sensíveis a este antibiótico. Fluoroquinolonas testadas: ofloxacina (nas concentrações de 1 e 4 mg/l). Esta molécula é activa para Mh e Ureaplasma spp. A frequência de resistência não é bem conhecida mas foi estimada como sendo inferior a 1% para Ureaplasma spp. (6, 18). C) EXECUÇÃO DO ANTIBIOGRAMA O antibiograma pode ser feito a partir do conteúdo do poço X do MYCOPLASMA DUO (referência 62740). Para informações sobre a duração e a temperatura de armazenamento da amostra biológica, consulte as recomendações actualmente em vigor (13). 1) Padronização do inóculo De modo a semear o antibiograma com um inóculo de 103 a 105 CCU/ml (CCU = Colour Changing Units = Unidades de Mudança de Cor), é necessário efectuar uma pré-cultura do meio semeado com a amostra. A pré-cultura (efectuada de acordo com os protocolos descritos de seguida) leva ao crescimento dos micoplasmas com um título máximo de 106 a 107 CCU/ml. A diluição 1:100 desta pré-cultura em caldo U9 ou de arginina, dependendo das espécies isoladas, produz um inóculo padronizado.

• UTILIZANDO O MYCOPLASMA DUO Quando o antibiograma é efectuado a partir do MYCOPLASMA DUO, o conteúdo do poço X, após 24 ou 48 horas de incubação para o Mh ou 24 horas para Ureaplasma spp, corresponde à pré-cultura. Posteriormente, o conteúdo do poço necessita de ser diluído em caldo U9 ou de arginina, de acordo com o protocolo descrito de seguida, de modo a obter o inóculo padronizado.

1. Para Mycoplasma hominis Partindo do poço X (após 24 ou 48 h de incubação), prepare uma diluição 1:100 em caldo de arginina (20 µl do conteúdo do poço X em 2 ml de caldo de arginina). 2. Para Ureaplasma spp • Após 24 h de incubação: prepare uma diluição 1:100 do conteúdo do poço X em caldo U9 (20 µl do conteúdo do poço X em 2 ml de caldo U9). • Após 48 h de incubação: neste caso, não é possível utilizar o conteúdo do poço X pois há o risco de o Ureaplasma ter sofrido autólise. Prepare uma diluição 1:10 da suspensão em meio de transporte armazenada a + 4°C (200 µl em 2 ml de caldo U9).

• PARTINDO DO CALDO DE CULTURA ENRIQUECIDO COM MICOPLASMAS A amostra urogenital pode ser colocada num meio de cultura específico para micoplasmas (15). Caso se esteja a aguardar os resultados da identificação e contagem, o antibiograma pode ser feito mais tarde e o meio pode ser armazenado a +4°C (ver o folheto do meio de cultura utilizado). De seguida, recomenda-se a incubação do meio de cultura a 37°C durante 16 horas, de modo a obter um inóculo enriquecido com micoplasmas. O título normalmente obtido é de 106-107 CCU/ml. De acordo com as recomendações publicadas (15), a realização do antibiograma sugere a utilização de um inóculo padronizado. Desse modo, 20 µl do meio de cultura enriquecido são diluídos em 2 ml de caldo U9 ou de arginina (diluição 1:100), dependendo da identificação da estirpe de micoplasma. 2) Pipetagem do inóculo padronizado Para cada poço da microplaca SIR são pipetados 100 µl do inóculo padronizado (diluição 1:100 da pré-cultura em caldo U9 ou de arginina). Tape a microplaca com a película adesiva e incube a 37°C durante 48 horas.

D) AMOSTRAS COM Ureaplasma spp e Mh Neste caso, semeie 2 microplacas SIR: uma com o inóculo padronizado obtido pela diluição em caldo U9 (antibiograma da estirpe Ureaplasma spp) e outra com o inóculo padronizado obtido pela diluição em caldo de arginina (antibiograma da estirpe Mh).

7- INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS O antibiograma pode ser lido logo que os poços de controlo de crescimento tenham mudado de amarelo para vermelho. É feita uma leitura às 24 h e outra às 48 h. A leitura às 48 h permite a detecção de resistências de baixo nível às ciclinas (19) e a confirmação dos resultados quando o inóculo inicial é baixo (103 CCU/ml) ou quando a mudança de cor é duvidosa após 24 horas.

Para a clindamicina e para a pristinamicina (uma única concentração), apenas 2 resultados são possíveis: Sensível ou Resistente. Exemplo: amarelo/ amarelo: S estirpe Sensível vermelho/ amarelo: I estirpe Intermédia

vermelho / vermelho: R estirpe Resistente

Caso particular: se aparecer uma cor laranja. Pode ser observado o início da uma mudança de amarelo para vermelho, resultando numa cor laranja nos poços de baixa concentração. Deve ser interpretado como positivo e pode ser obtida uma mudança inequívoca de cor após 48 horas.

8- CONTROLO DE QUALIDADE DO FABRICANTE Todos os produtos fabricados e comercializados pela Bio-Rad são monitorizados por um sistema de garantia da qualidade, desde a recepção das matérias-primas até à comercialização do produto final. Cada lote de produto final é sujeito a um controlo de qualidade e só será comercializado caso cumpra os critérios de aceitação. Os documentos respeitantes à produção e controlo de cada lote são guardados para referência. 9– CONTROLO DE QUALIDADE INTERNO O controlo de qualidade pode ser efectuado utilizando uma estirpe de um banco liofilizado (Ureaplasma parvum ATCC 700970). Ressuspenda a estirpe liofilizada em 1 ml de meio U9 reconstituído fresco (referência 62762). Prepare uma diluição 1:10 em meio U9 reconstituído fresco. Incube o meio U9 semeado a 37°C durante 18 horas, sob atmosfera aeróbia. A partir deste meio U9 enriquecido em Ureaplasma, prepare uma diluição 1:100 (adicione uma alíquota de 20 µl de meio a 2 ml de caldo U9 reconstituído). A sementeira da microgaleria SIR MYCOPLASMA é efectuada de acordo com o protocolo habitual, i.e., pipetando 100 µl para cada poço. Tape a microgaleria com a película adesiva e incube a 37°C durante 48 horas. A microgaleria pode ser lida logo que os poços de controlo de crescimento tenham mudado de amarelo para vermelho.

2 poços amarelos:

Ausência de crescimento Estirpe sensível

2 poços vermelhos:

Crescimento na presença do antibiótico Estirpe resistente

Poço com baixa concentração de antibiótico: vermelho Poço com alta concentração de antibiótico: amarelo

Estirpe intermédia

O perfil esperado é o seguinte:

de

cres

cim

ent

de

cres

cim

ent

DO 4-8 mg/l

TE 4-8 mg/l

JM 2-8 mg/l

AZM 2-4 mg/l

E 1-4 mg/l

CM 2 mg/l

PT 2 mg/l

OFX 1-4 mg/l

+ + S S S S S/I R S S/I

10- DESEMPENHOS A selecção dos antibióticos testados com o SIR MYCOPLASMA tem evoluído de acordo com os tratamentos terapêuticos e o antibiograma SIR MYCOPLASMA tem sido reavaliado tendo em conta os tratamentos modificados. Nos casos das duas avaliações descritas mais à frente, o método de referência utilizado foi o das Concentrações Inibitórias Mínimas (CIM) em meio líquido (6, 15). A primeira avaliação (sem os poços de azitromicina) foi efectuada em 80 estirpes, incluindo 60 de Ureaplasma spp e 20 de Mycoplasma hominis (9). Com estirpes de Ureaplasma spp: Para as tetraciclinas, as percentagens de concordância variavam entre 90% [79,5 - 96,2%]a e 95% [86,1 - 99%]a, dependendo do antibiótico. Para os macrólidos, as percentagens de concordância variavam entre 92% [81,6 - 97,3%]a e 100% [95,1 - 100%]a, dependendo do antibiótico. Para a clindamicina, a percentagem de concordância era de 85% [73,4 - 92,9%]a. Para a pristinamicina, a percentagem de concordância era de 100% [95,1 - 100%]a. Para as fluoroquinolonas, a percentagem de concordância era de 93% [83,8 - 98,2%]a. Com as estirpes de Mycoplasma hominis: A percentagem de concordância era de 85% [62,1 - 96,8%]a para a tetraciclina e de 100% [86,1 - 100%]a para os restantes antibióticos. A concordância total para todos os antibióticos anteriormente mencionados era de 94,6% [92,4 - 96,4%]a com 2,6% de discordâncias importantes. Não foi encontrada nenhuma estirpe que fosse sensível com a microgaleria SIR MYCOPLASMA e resistente com o método de referência (nenhuma discordância muito importante). Foi efectuada uma segunda avaliação após a substituição da minociclina por azitromicina com concentrações de 2 e 4 µg/ml. Foi efectuado um estudo comparativo entre o método de determinação das CIM em meio líquido e a microgaleria SIR MYCOPLASMA, para os poços de azitromicina. As estirpes testadas são estirpes de referência e estirpes clínicas do tipo selvagem. Cada inóculo foi padronizado e confirmado como estando dentro dos limites aceitáveis e recomendados, i.e., 104 e 105 CCU/ml (15). Os resultados obtidos pelos dois métodos foram interpretados como Sensível (S), Intermédia (I) ou Resistente (R) para as várias concentrações da microgaleria. Para 15 estirpes de referência de micoplasmas (13 estirpes ATCC Ureaplasma spp e 2 estirpes ATCC Mycoplasma hominis), a percentagem de concordância para as classificações clínicas S ou R era de 100% [81,9 - 100%]a. Todas as estirpes de Ureaplasma spp tinham um perfil sensível e duas estirpes de Mycoplasma hominis tinham um perfil resistente, o que corresponde à resistência natural desta espécie. Para 15 isolados clínicos de Ureaplasma spp, a concordância era de 100% [81,9 - 100%]a entre a classificação clínica fornecida pela microgaleria SIR MYCOPLASMA e a obtida com as CIMs de referência. a: [IC 95%] = intervalo de confiança de 95%.

11– LIMITES DO TESTE Se o meio muda para vermelho e fica turvo, significa que houve crescimento de bactérias e não de micoplasmas (o crescimento destes últimos não altera a limpidez do meio). Este fenómeno pode ser observado nos caldos de cultura de arginina e U9 se estes tiverem sido incubados a 37°C. A presença de bactérias pode ser confirmada em meio ágar chocolate. A interpretação final dos resultados, como qualquer outra interpretação de resultados biológicos, não pode ser baseada num único teste e necessita de suporte de outros dados clínicos assim como de resultados bioquímicos, citológicos e imunológicos. Se o inóculo usado para a sementeira da microgaleria SIR MYCOPLASMA for baixo (<103 CCU/ml), a mudança de cor nos poços pode ser duvidosa. Caso o resultado pareça anormal, recomenda-se a repetição do inóculo padronizado e do antibiograma usando outra microgaleria SIR MYCOPLASMA. Se, para um determinado antibiótico, o poço com maior concentração ficar vermelho e o de menor concentração permanecer amarelo, o resultado é inválido. Recomenda-se a execução de outro antibiograma com um novo inóculo padronizado. Os macrólidos, especialmente a eritromicina, são conhecidos pela sua sensibilidade ao pH (14). De facto, pode ser observada mudança de cor no poço de baixa concentração, levando a um resultado intermédio devido a um efeito de pH e não à actividade do antibiótico. O fenómeno de mudança de cor também pode ser observado nos poços de azitromicina.

12- REFERÊNCIAS 1. BEBEAR C. Activité comparée de la minocycline et doxycycline sur les mycoplasmes pathogènes pour l'homme. Pathol.

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