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Anotação de Genomas e Metabolismo Secundário

Danillo Oliveira de Alvarenga

Departamento de TecnologiaUniversidade Estadual Paulista

Jaboticabal-SP

Metabolismo

● Reações químicas que ocorrem em organismos vivos

– anabolismo: síntese de biomoléculas

– catabolismo: quebra de biomoléculas

● Vias metabólicas

– série de reações em cadeia

– substrato(s) que sofre(m) modifcações

– enzimas que promovem modifcações

Metabolismo Primário

● Metabolismo fundamental

– essencial para o organismo

– função fsiológica

– moléculas estruturais ou regulatórias

Metabólitos Primários

● Biomoléculas mais abundantes

– nucleotídeos e ácidos nucleicos

– aminoácidos e proteínas

– carboidratos

– lipídeos

– outras

● Encontrados em todos os organismos

Metabolismo Secundário

● Metabolismo especializado

– não é essencial para o organismo

– função ecológica

– moléculas bioativas

Metabólitos Secundários

● Estruturas mais simples

– alcaloides: cafeína, nicotina

– terpenoides: limoneno, mentol, caroteno

● Estruturas mais complexas

– peptídeos ribossômicos modifcados pós-traducionalmente: bacteriocinas

– peptídeos não ribossômicos: gramicidina, ciclosporina

– policetídeos: afatoxina, antramicina

● Maior diversidade em bactérias, fungos e plantas

Alcaloides

● Derivados de moléculas nitrogenadas

– aminoácidos

– bases nitrogenadas

– outras

nicotina cafeína

ciclopamina

Terpenoides

● Derivados de isopreno

– hemiterpenos

– monoterpenos

– sesquiterpenos

– diterpenosmentol

isopreno

beta-caroteno geosmina

Peptídeos Ribossômicos Modifcados

● Precursor ribossômico

– um ou mais peptídeos

microviridina

● Enzimas modifcadoras pós-tradução

– ciclização

– desidratação

– alteração da cadeia lateral

Peptídeos Não Ribossômicos

● Peptídeo sintetases não ribossômicas (NRPS)– gastam ATP– aminoácidos proteinogênicos– aminoácidos não proteinogênicos

● Domínios mínimos– adenilação– condensação– carreador de peptidil

● Domínios complementares– metiltransferase– cetorredutase– epimerase

gramicidina

Policetídeos

● Policetídeo sintases– não usam ATP– ácidos carboxilícos

● Domínios mínimos– cetossintase– aciltransferase– carreador de acila

● Domínios complementares– cetorredutase– desidratase– enoil redutase

afatoxina

doxiciclina

Produtos Naturais

● Molécula sintetizada por um organismo vivo

– substância encontrada na natureza

– pode ser obtida por síntese química

● Bioprospecção

– processos industriais

– medicamentos

– cosméticos

– recuperação ecológica

Integração de Muitas Disciplinas

PRODUTOSNATURAIS

BIOQUÍMICA

QUÍMICA ORGÂNICA

QUÍMICAANALÍTICA

ECOLOGIA

FARMACOLOGIA

BIOINFORMÁTICA

GENÔMICA

BIOLOGIAMOLECULAR

● Ecologia

– interações

– ecofsiologia

– ecotoxicologia

● Biossegurança

– toxicologia

– bioterrorismo

Outros Interesses

● Bioquímica

– metabolismo completo

– evolução de vias

– comunicação química

● Genômica

– informação

– caracterização

Vias Metabólicas Codifcadas no Genoma

● Operons– genes controlados pela mesma região promotora– RNA mensageiro policistrônico em procariotos

● Agrupamentos gênicos– genes funcionalmente relacionados em proximidade– envolvidos no mesmo processo– interação entre agrupamentos

● Conservação de agrupamentos– pressão evolutiva– transferência vertical ou horizontal

Motivação de Projetos de Genômica

Penicilina

● Alexander Fleming (1928)

– descoberta e isolamento

● Microbiologia

– Staphylococcus sp.

– Penicillium notatum

– halo de inibição

● Nobel de Medicina (1945)

Penicilina

● Dorothy Hodgkin (1945)

– confrmação da estrutura

● Bioquímica

– cristalografa de raios-X

– contráriou algumas hipóteses

– insulina, vitamina B12

● Nobel de Química (1964)

Penicilina

● Bruno Díez & Juan Martín (1990)

– descrição do agrupamento gênico

● Biologia Molecular

– ligação a cosmídeo

– clonagem em E. coli

– sequenciamento

– expressão heteróloga

PenicilinaO

OHO

OH

NH2

ácido α-aminoadípico cisteína valina

isopenicilina N

penicilina G

+ +

δ (L-α-aminoadipil)-L-cisteinil-D-valina

2

ACV sintetase

isopenicilina N sintase

isopenicilina N N-aciltransferase

Penicilina

pcbAB: δ (L-α-aminoadipil)-L-cisteinil-D-valina sintetase

pcbC: isopenicilina N sintase

penDE: isopenicilina N N-aciltransferase

pcbAB pcbC penDE

peptídeo sintetase não ribossômica

oxidorredutase

aciltransferase

Actinobactérias

● Bactérias gram-positivas de alto GC

– metabólitos secundários

– geosmina

● Modos de vida

– livre

– simbiose

● Distribuição

– solos

– rizosfera

– ambientes marinhos

– ambientes áridos

● Metabólitos secundários

– ≃42% dos 30.000 conhecidos

● Principal fonte de antibióticos

– 45-55% dos 10.000 conhecidos

– Streptomyces spp.

● Bioatividade

– antibiótica

– antitumoral

– imunomodulatória

Metabólitos Secundários Actinobacterianos

● Genômica

– 17 anos depois do primeiro genoma

– 12.670 genomas actinobacterianos

– 800 completos

● Streptomyces spp.

– 985 genomas

– 78 completos

Genomas Actinobacterianos

● Processo praticamente aleatório

– isolamento

– cultivo e fermentação

– geração de extrato bruto

– testes de bioatividade

– caracterização química

Bioprospecção Tradicional

Bachmann et al,, 2014

● Limites para descoberta

– alvos específcos

– ensaios pré-determinados

– atividades conhecidas

– expressão e regulação

– alta concentração

Mineração Genômica

● Descoberta de metabolitos secundários a partir de genomas

– detecção de genes e agrupamentos

– predição e caracterização de candidatos

– orientação de análises químicas posteriores

● Função biológica

– papel fsiológico

– papel em interações

● Bentley et al. (2000)

– Streptomyces coelicolor A3(2)

– mais que o esperado

Bioprospecção Baseada em Genômica

Bachmann et al,, 2014

● Processo direcionado

– isolamento opcional

– caracterização genômica

– busca in silico

– expressão homóloga/heteróloga

– caracterização química

Outras Vantagens

● Evolução– herança

– variação

● Monitoramento

– detecção

– controle

● Síntese

– química– clonagem

● Biossíntese desconhecida para muitas moléculas

● Das moléculas para os genes

– hipóteses biossintéticas a partir da estrutura

– genética da biossíntese

● Biologia da molécula

– evolução

– distribuição

– regulação

Indo na Direção Oposta

Limitações da Genômica

● Grande número de agrupamentos órfãos

– sequências desconhecidas em bancos de dados

– biossíntese desconhecida

– moléculas desconhecidas

● Bancos de dados precisam ser aprimorados

– mais dados de alta qualidade

– melhor anotação e curadoria

● Espécimes cultivados

– linhagens isoladas axenicamente

● Bancos de dados parciais

– viés taxonômico

– viés ecológico

– viés geográfco

Conhecimento Limitado para Vários Grupos

● Quadro incompleto

– alta sub-representação

– maior grau de homogeneidade

– baixa diversidade metabólica

Metagenômica

● Genômica

– um organismo

– linhagem cultivada

– ambiente estranho

– mineração com expressão homóloga ou heteróloga

● Metagenômica

– vários organismos

– não cultivados ou em cocultivo

– genômica ambiental / genômica de comunidades

– mineração com expressão heteróloga

Metagenômica

● Caracterização e comparação de comunidades

– perfl taxonômico

– perfl funcional

● Acessar organismos inacessíveis por métodos tradicionais

– micro-organismos atualmente não cultiváveis

– ≃ 99 % de toda a diversidade bacteriana

– enorme número de genes desconhecidos

– enorme número de vias e metabólitos desconhecidos

Hug et al., 2016

Metagenômica

Metagenômica

Parks et al., 2017

● Alvo

– domínio/reino/flo

– espécies-tipo

– linhagens consagradas

– ambientes e regiões subexplorados

– táxons subexplorados e/ou novos

– tamanho do genoma

● Método

– tradicional ou pós-genômico

– isolados ou amostras mistas

– equipe interdisciplinar

Encontrando Novos Metabólitos Secundários

Anotação

● Identifcação de características biológicas

– regiões codifcantes e não codifcantes

– prováveis produtos

– regiões de repetição

● Métodos

– automático– manual

● Comparações entre sequências

– referências conhecidas

– algoritmos de predição

Anotação

Anotação

● Gene

– região que codifca proteína ou RNA– gene/rRNA/tRNA

– intron/exon– pseudo

● Sequência codifcante

– coding sequence (CDS)– éxons em eucariotos

● Quadro aberto de leitura

– open reading frame (ORF)– ATG → TAA/TAG/TGA

● Detecção de metabólitos secundários

– bancos de dados em expansão

– mais algoritmos

● Predição de agrupamentos– http://www.secondarymetabolites.org/mining/

Avanço nas ferramentas bioinformáticas

● Alinhamentos locais

– encontra regiões com similaridade signifcativa

● Qualquer banco de dados que quiser

– NCBI GenBank/WGS

– banco local

● BLAST contra referências de produtos naturais

– agrupamentos de metabólitos já conhecidos

– inspecionar predições automáticas

BLAST

● Anotação genômica automática

– subsistemas

– SEED: função em um processo ou estrutura biológica

● Predições funcionais

– possibilidades metabólicas do organismo

● Curadoria

– melhor para micro-organismos populares

– pouca informação sobre metabólitos secundários

RAST

NaPDoS

antiSMASH

● Agrupamentos gênicos de metabólitos secundários

– banco de dados curado

– mais de 40 tipos detectados

● Predição algorítmica ou comparativa

– agrupamentos similares a sequências conhecidas

– agrupamentos hipotéticos

● Alguns agrupamentos não são preditos

– nenhum modelo implementado

antiSMASH

● Anotações padronizadas

– agrupamentos gênicos de metabólitos secundários

– produtos desses agrupamentos

● Vias conhecidas

– genética

– bioquímica

● Diversos organismos

– bactérias

– fungos

– plantas

MIBiG

Artemis

● Navegador de anotações genômicas

– visualizar e adicionar informações a arquivos GenBank/EMBL

– rodar BLAST sobre sequências codifcantes

● Curadoria manual

– inspecionar predições automáticas

– predizer agrupamentos gênicos

Artemis

Prática

I. Baixando um genoma

1) Abra a página do NCBI Genome em https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome.


2) Visualize os genomas disponíveis por organismo.


3) Navegue pelas opções e escolha um genoma.


4) Visualize o relatório de montagem e anotação dos genomas do táxon.


5) Escolha o genoma de uma linhagem do táxon.


6) Baixe o arquivo GenBank com o genoma-alvo anotado.


7) Descomprima o genoma baixado.


8) Renomeie o arquivo com a extensão .gb ou .gbk.

II. Predizendo agrupamentos gênicos

1) Abra a página do antiSMASH em http://antismash.secondarymetabolites.org/.


2) Indique o tipo de organismo a ser analisado.


3) Entre o endereço para envio dos resultados.


4) Clique na opção de enviar arquivo.


5) Busque pelo arquivo do genoma no seu computador.


6) Submeta o arquivo à análise e espere pelos resultados.


7) Vá para http://genomics.fcav.unesp.br/Anabaena90/ e encontre os resultados para a análise do genoma da cianobactéria Anabaena sp. 90.


8) Verifque os resultados e diferencie agrupamentos com produtos potencialmente conhecidos e agrupamentos órfãos.


9) Baixe os arquivos GenBank para o agrupamento de interesse.

III. Analisando agrupamentos gênicos

1) Abra o Artemis.


2) Selecione a tabela de código genético para bactérias e cloroplastos.


3) Abra o arquivo GenBank baixado.


4) Olhe a anotação e rode o BLAST em uma CDS.


5) Adicione a informação do gene à CDS com base nos resultados de BLAST.


6) Salve a anotação.

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