ANDREWS KRUPINSKI EMERENCIANO

EXTRAÇÃO, PURIFICAÇÃO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE FAGOCÍTICA DO

EQUINOCROMO EM OURIÇOS-DO-MAR LYTECHINUS VARIEGATUS

(LAMARCK, 1816)

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Tecidual do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para a obtenção do Título de Mestre em Ciências (Biologia Celular e Tecidual)

São Paulo 2014

ANDREWS KRUPINSKI EMERENCIANO

Extração, purificação e avaliação da atividade fagocítica do equinocromo em

ouriços-do-mar Lytechinus variegatus (Lamarck, 1816)

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Tecidual do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para a obtenção do Título de Mestre em Ciências. Área de concentração: Biologia Celular e Tecidual Orientadora: Prof. Dr. José Roberto Machado Cunha da Silva Versão original

São Paulo

2014

Aos meus pais, Ivone Cecilia

Krupinski Emerenciano e Airton

Emerenciano, por todo apoio e

motivação para seguir em frente. A

Deus.

Dedico!

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais, Ivone e Airton, por me terem dado educação, valores e por me terem

ensinado tudo, me apoiando em todas as decisões e vibrando a cada conquista. A

vocês que, muitas vezes, renunciaram aos seus sonhos para que eu pudesse realizar

o meu, partilho a alegria deste momento. Amo vocês.

Ao meu orientador, Prof. Dr. José Roberto Machado Cunha da Silva, pela amizade,

oportunidade, confiança e paciência. Obrigado pelos ensinamentos, por confiar no

meu trabalho, e dar liberdade para o meu crescimento pessoal e profissional.

Ao Prof. Dr. João Carlos Shimada Borges, pela amizade, confiança e por abrir as

portas da sua casa, me acolhendo tão bem. Obrigado pelos ensinamentos, toda ajuda,

pelos momentos de descontração e por me apresentar ao Laboratório de

Histofisiologia Evolutiva. Valeu gordinho...

Aos meus colegas do Laboratório de Histofisiologia Evolutiva, pelo suporte e todos os

momentos juntos: Alfonso, Camila, Débora, Douglas, Flávia Gabriel, Joana, João,

Karina, Leandro, Lígia, Luciana, Paola, Paula, Renan, Renata, Ricardo, Tânia, Yoel.

À amiga, Luciana Dzik, que além da amizade incondicional, me proporcionou bons

momentos de alegria e descontração, por sempre estar do meu lado, pelas conversas,

por sempre me incentivar a continuar, vibrar com as minhas conquistas, pelas loucuras

e abraços, e a seus pais, Renato e Sandra Dzik, que me acolheram como um filho.

Hoje sei que, além de amiga você é uma Irmã e passou a fazer parte da minha família.

Aos colaboradores, Débora Alvares Leite Figueiredo, Douglas Amaral dos Santos,

João C. Shimada Borges e Paola Cristina Branco, por toda a ajuda, pelas sugestões,

pela ajuda nos experimentos no CEBIMar, amizade e pelos bons momentos ao longo

desses anos de convivência.

À Emilia Ribeiro, que além de uma excelente técnica, se tornou uma grande e

inestimável amiga, abriu as portas de sua casa e me acolheu tão gentilmente.

Obrigado por toda ajuda, amizade e os valiosos ensinamentos.

Ao Leandro Pressinotti, pelas longas conversas, conselhos e ensinamentos valiosos

e por auxiliar na análise estatística.

Aos amigos Diogo Palermo e Joana Mona, por todos os ensinamentos, ajuda e

amizade, pelos momentos de descontração jogando cartas e tomando whisky.

Ao Ricardo Borges, por todas as conversas, conselhos e reforços positivos.

À Karina Rezende, por toda a ajuda, pela amizade ao longo desses anos e claro as

risadas e conversas no trem.

Aos secretários do Departamento Celiana, Paulo, Eloize e Ana Lúcia, por toda a ajuda.

Em especial à Regina Valbom, pelo apoio infinito, por estar sempre disposta a ajudar

e pelos prazos cumpridos.

Às Profs Marinilce Fagundes dos Santos e Chao Yun Irene Yan pela orientação

acadêmica. A elas, meus agradecimentos.

Aos técnicos do CEBIMar, Alex, Eduardo, Elso, Joseilto e Joseph (In memoriam), por

toda a ajuda nas coletas, durante os experimentos, pelas risadas e saídas de barco

nas horas vagas.

Aos secretários Emerson, Graça, Simone e todos os funcionários do CEBIMar, pelo

apoio e ajuda com a burocracia durante as estadias.

Aos amigos, Andrea Arevalo, Aline Olivé, Christiane Araujo, Eloíza Rezende, Fábio

Feitoza, Felipe Souza e Magna Magalhães, pela ajuda, risadas e momentos de

descontração.

Ao Prof. Dr. Daniel Carvalho Pimento do Laboratório de Biofísica e Bioquímica do

Instituto Butantan, por abrir as portas do seu laboratório para que eu realiza-se todos

os experimentos de purificação.

À Juliana Mozer Sciani, por me dar todo o suporte para a realização das etapas de

purificação e por toda a ajuda.

Aos amigos do Araçá, André, Bárbara, Camila, Carol, Cesar, Fernanda, Latinha, Lidia,

Marcella, Marina, Marinella, Milton, Nemias, Priscila, Profª Carmem, Profª Lucy,

Rafael, Riguel, Silvia, Thiago e Valéria, por todos os ensinamentos, amizade e

momentos de alegria.

Aos amigos da disciplina de Imuno do Butantan, Aline, Bruno, Giovanna, Ivana, Katie,

Luis, Thalita, Thiago e Marcela, pela ajuda, por ficarem me zoando depois da

apresentação, pelas risadas, as festas, os bares e pelos momentos de alegria.

Aos Profs. Vicente Gomes, Maria Inês Borella e José Roberto Kfoury pelas sugestões

durante o exame de qualificação.

Aos professores do Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento, pelos

ensinamentos em aulas, contribuições e ajudas.

A todos os alunos do Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento.

Aos técnicos de laboratório, Braz, Junior, Marcos, Marley e Gabriella pelo apoio

técnico.

Aos funcionários da biblioteca e a todos os funcionários do ICB.

A todos os meus familiares, tios e primos. Não citarei nomes, para não me esquecer

de ninguém. Mas há aquelas pessoas especiais que diretamente me incentivaram.

Às minhas tias, Mari, Salete e Lúcia, por sempre estarem ao meu lado, pelo carinho e

afeto que sempre tiveram por mim, por vibrarem a cada vitória e pelos momentos de

alegria e descontração. Amo vocês.

Aos meus primos, que sempre estiveram ao meu lado, acompanhando cada

momento, Jociane, Francis, Sophia, Junior, Thaylla, Bianca, Erick e as minhas

pequenas Paula, Karoll e Kamilla.

Aos meus irmãos, Wanderson, Amanda e Fernanda (In memoriam), por

compartilharem todos os momentos bons e ruins, pelas risadas, amizade e toda

motivação.

Aos meus sobrinhos, Pedro e Laura, por deixarem minha vida mais alegre com seus

sorrisos.

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela bolsa

concedida (2011/14129-0).

Enfim, à todos aqueles que direta ou indiretamente contribuíram com o presente

trabalho, MUITO OBRIGADO!

“Que os vossos esforços desafiem

as impossibilidades, lembrai-vos

de que as grandes coisas do

homem foram conquistadas do

que parecia impossível.”

Charles Chaplin

RESUMO

Emerenciano AK. Extração, purificação e avaliação da atividade fagocítica do equinocromo em ouriços-do-mar Lytechinus variegatus (Lamarck, 1816). [dissertação (Mestrado em Biologia Celular e Tecidual)]. São Paulo: Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo; 2014.

Em ouriços-do-mar, os esferulócitos vermelhos são responsáveis pela biossíntese do equinocromo, um pigmento naftaquinônico considerado antioxidante e bactericida, atuando nas infecções e defesa do organismo, no entanto seu papel na resposta imune permanece pouco elucidado. Estas células são consideradas biomarcadores, uma vez que em condições de estresse sua proporção encontra-se alterada. O presente trabalho avaliou a reposta imune inata de ouriços-do-mar Lytechinus variegatus, por meio da atividade fagocítica frente a diferentes concentrações de equinocromo (50 e 100 µg/ml). Para tanto, o equinocromo foi extraído do líquido celomático e purificado por RP-HPLC (reversed phase high-performance liquid chromatography). Nossos resultados demonstraram que o equinocromo em ambas as concentrações modula positivamente a fagocitose, aumentando a quantidade de células fagocitando. A concentração de 50 µg/ml foi capaz de ativar os amebócitos fagocíticos (AF), e aumentar a quantidade de AF com quatro ou mais leveduras fagocitadas. Já na concentração de 100 µg/ml, além da ativação dos AF, aumentou também, a quantidade de AF com uma, duas, quatro ou mais leveduras fagocitadas, sugerindo uma atuação dose-dependente. Desta forma, os dados apresentados demonstram que o equinocromo exerce um importante papel na resposta imune, trazendo novas perspectivas para acrescentar a literatura, contribuindo assim, para uma melhor compreensão do papel dos esferulócitos vermelhos em ouriços-do-mar. Palavras-chave: Equinocromo. Imunidade inata. Fagocitose. Ouriço-do-mar. Lytechinus variegatus.

ABSTRACT

Emerenciano AK. Extraction, purification and evaluation of the phagocytic activity of echinochrome in the sea urchins Lytechinus variegatus (Lamarck, 1816) [dissertation (Cell and Tissue Biology)]. Sao Paulo: Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo; 2014.

In sea urchins, the biosynthesis of echinochrome is mediated by red sphere cell. This naphthoquinone pigment presents antioxidant and bactericidal characteristics, acting in infections and host defense. However, the echinochrome role in immune response remains unclear. Stress conditions alter the number of red sphere cell, taking them to be considered biomarkers. In this study, we evaluated the innate immune response of the sea urchin Lytechinus variegatus. To this purpose, the echinochrome was extracted and purified from coelomic fluid by RP-HPLC (reversed phase high-performance liquid chromatography). Finally, phagocytic amoebocytes were exposed to different concentrations of echinochrome (50 and 100 mg/ml), when phagocytic activity was analysed. Here, we showed that echinochrome positively modulate phagocytosis, increasing the number of phagocytizing cells. The concentration of 50 mg/ml activated phagocytic amoebocytes (AF), and increased the number of AF containing four or more phagocytosed yeasts. For the other hand, at 100 mg/ml exposure, the activation of AF also increased the number of AF with one, two, four or more yeast phagocytosed, suggesting a dose-dependent activity. Thus, the data presented demonstrated that echinochrome plays an important role in the immune response. Additionally, this study contributed to a better understanding of the role of red sphere cell in sea urchins. Keywords: Echinochrome. Innate immunity. Phagocytosis. Sea urchin. Lytechinus variegatus.

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AF – Amebócito fagocítico

CTR – Grupo controle

CV – Célula vibrátil

EI – Esferulócito incolor

EV – Esferulócito vermelho

MS – Espectrometria de massa

NF𝜅𝐵 – “Nuclear fator kappa B”

RP-HPLC – “Reversed Phase - High Performance Liquid Chromatography”

Q1/2/3/4 – quadrante 1, 2, 3 e 4

TFA – ácido trifluoroacético

TLR – Toll like receptor

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Filogenia do ouriço-do-mar............................................................. 19

Figura 2 – Anatomia do ouriço-do-mar............................................................ 21

Figura 3 – Esquema representativo das etapas da fagocitose........................ 29

Figura 4 – Espécime do ouriço-do-mar Lytechinus variegatus........................ 32

Figura 5 – Georeferenciação do ponto de coleta............................................. 33

Figura 6 – Fluxograma da metodologia empregada para a obtenção do material, análise e ensaio................................................................................. 39

Figura 7 – Fotomicrografias de células a fresco do ouriço-do-mar Lytechinus variegatus em contraste de fase....................................................................... 41

Figura 8 – Proporção dos tipos celulares do ouriço-do-mar Lytechinus variegatus (n=10)............................................................................................. 42

Figura 9 – Perfil cromatográfico obtido através da injeção do extrato contendo o pigmento de Lytechinus variegatus, λ=214.................................... 43

Figura 10 – Perfil cromatográfico obtido através da injeção do extrato contendo o pigmento de Lytechinus variegatus, λ=475.................................... 44

Figura 11 – Perfil cromatográfico obtido para a repurificação do pico coletado, em coluna C-18, λ=214..................................................................... 45

Figura 12 – Perfil cromatográfico obtido para a repurificação do pico coletado, em coluna C-18, λ=475..................................................................... 47

Figura 13 – Espectro de massa do último pico coletado para repurificação em RP-HPLC................................................................................................... 48

Figura 14 – Fotomicrografias de ensaio de fagocitose in vitro com células do ouriço-do-mar Lytechinus variegatus em contraste de fase............................. 49

Figura 15 – Atividade fagocítica de amebócitos fagocíticos expostos a diferentes concentrações de equinocromo em ouriços-do-mar Lytechinus variegatus......................................................................................................... 51

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO.............................................................................................. 17

1.1 Ouriços-do-mar........................................................................................... 18

1.2 Imunidade inata.......................................................................................... 22

1.3 Células do sistema imune.......................................................................... 24

1.4 Fagocitose.................................................................................................. 27

2 OBJETIVO.................................................................................................... 31

3 MATERIAL E MÉTODOS............................................................................. 32

3.1 Coleta dos animais..................................................................................... 32

3.2 Transporte e manutenção dos animais...................................................... 33

3.3 Procedimentos gerais para obtenção do líquido celomático...................... 34

3.4 Classificação dos celomócitos.................................................................... 34

3.5 Contagem relativa e absoluta dos celomócitos.......................................... 35

3.6 Ensaio de viabilidade celular...................................................................... 35

3.7 Extração do equinocromo........................................................................... 36

3.8 Purificação do equinocromo por HPLC...................................................... 36

3.9 Análise por espectrometria de massa........................................................ 37

3.10 Contagem de leveduras Saccharomyces cerevisiae................................ 37

3.11 Ensaio de fagocitose in vitro..................................................................... 38

3.12 Análise estatística..................................................................................... 38

4 RESULTADOS.............................................................................................. 40

4.1 Contagem diferencial dos celomócitos....................................................... 40

4.2 Viabilidade celular...................................................................................... 42

4.3 Extração e purificação do equinocromo..................................................... 42

4.4 Análise por espectrometria de massa (MS)............................................... 46

4.5 Avaliação da atividade fagocítica in vitro.................................................... 49

5 DISCUSSÃO................................................................................................. 52

6 CONCLUSÃO............................................................................................... 58

REFERÊNCIAS................................................................................................ 59

17 INTRODUÇÃO

1 INTRODUÇÃO

Os ouriços-do-mar são equinodermos que encontram-se bem estabelecidos e

amplamente distribuídos, ao redor de todos os continentes. Estes animais pertencem

à classe Echinoidea, que apresenta características únicas e altamente especializadas,

como o sistema aquífero, desenvolvimento deuterostômico e pés ambulacrais

(Hyman, 1955; Smith et al., 1992). Os invertebrados marinhos pertencentes ao filo dos

equinodermos desempenhando importantes papéis nas comunidades ou

ecossistemas que habitam (Menge et al., 1994). Diferentes aspectos deste filo vêm

sendo avaliados, dentre os quais destacam-se os imunológicos, que envolvem o

estudo de mecanismos de defesa exercidos por seus celomócitos, presentes no

celoma perivisceral, e principais responsáveis pela resposta imune inata (Gross et al.,

1999).

A posição filogenética dos equinodermos apresenta uma base comum com os

vertebrados (Hibino et al., 2006), de forma que padrões similares de emergência de

moléculas relacionadas à imunologia, sugerem que alguns dos mecanismos celulares

empregados pelos vertebrados, para regulação da diversidade adaptativa e

receptores, podem ter emergido de sistemas antes estabelecidos em ancestrais

deuterostômicos, com a finalidade de controlar o sistema inato (Litman et al., 2005;

Litman et al., 2007)

Na última década, alguns autores observaram o aumento do número de

celomócitos e esferulócitos vermelhos em ouriços-do-mar submetidos a diferentes

tipos de estresse (Borges et al., 2010; Branco et al., 2012; Matranga et al., 2005; Smith

et al., 2010), passando a considerar estas células como biomarcadoras de estresse

ambiental (Coteur et al., 2002). Apesar do crescente número de estudos envolvendo

os celomócitos, a grande maioria baseia-se na análise destes como resposta a

mudanças ambientais, havendo um déficit de dados relacionados à função biológica

destas células.

Sabe-se que, ao degranularem, os esferulócitos vermelhos liberam equinocromo

(Johnson, Chapman, 1970), substância que possui atividade bactericida e

antioxidante (Service, Wardlaw, 1984), de forma que diversos estudos apresentem

como principal análise, as características farmacológicas desta substância. Com base

nisso, estudos que avaliem a função biológica dos diferentes tipos celulares de

ouriços-do-mar tornam-se necessários.

18 INTRODUÇÃO

Levando em conta a mudança de concentração do equinocromo mediante

alterações ambientais e diferentes condições de estresse, este pigmento é

considerado um biomarcador sensível e confiável (Bay et al., 1983). Desta forma,

avaliar o papel dele na resposta imune inata de ouriço-do-mar Lytechinus variegatus,

apresenta grande valia.

1.1 Ouriços-do-mar

Os ouriços-do-mar são invertebrados marinhos, pertencentes a classe

echinoidea, que encontra-se no Filo Echinodermata. Este filo é composto por

organismos celomados, com simetria bilateral na fase larval, mas pentaradial na fase

adulta, apresentando duas regiões corporais: oral e aboral. O sistema nervoso

apresenta-se simples e as redes dos cordões nervosos seguem o padrão pentaradial.

Os animais deste filo são exclusivamente marinhos e bentônicos, sendo muitos

deles sésseis ou com reduzida capacidade de locomoção. Possuem um esqueleto

interno composto por ossículos calcários, podendo estes serem mais flexíveis, como

nas estrelas-do-mar e ofiuroides, ou mais rígidos - formando uma superfície

esquelética - como nos ouriços-do-mar e nas bolachas-do-mar, e apresentam ainda

espinhos ou tubérculos fixos ao esqueleto (Hyman., 1955).

Além de constituírem um dos grupos de grande importância das comunidades

bentônicas, ocupando diferentes níveis tróficos, podendo ser encontrados em zonas

polares e tropicais, com ampla distribuição geográfica (Pearse, 2006; Ventura et al.,

2006). Estes animais são essencialmente herbívoros, apresentando um trato

digestório completo – composto por boca e ânus – ausente em ofiuróides e asteróides.

As espécimes podem ser diferenciadas de acordo com o sexo, sendo dióicas, e a

fecundação ocorre no meio externo.

Características únicas, como a presença de sistema hidrovascular ou

ambulacrário, diferem estes animais de outros grupos. Este sistema é constituído por

um singular sistema de canais celomáticos e apêndices superficiais, que são

prolongamentos ocos denominados pés ambulacrais, podendo atuar na captura de

alimentos, locomoção ou percepção ambiental. (Hyman, 1955; Ruppert, Barnes,

1996).

No mundo, existem aproximadamente 7.000 espécies e 13.000 fósseis (Pawson,

2007), sendo que sua classificação apresentou alterações ao longo do tempo, e

19 INTRODUÇÃO

somente o avanço das tecnologias para o estudo da embriogênese em invertebrados

permitiu que Huxley (1875) propusesse o grupo Deuterostomata (região da boca é

formada depois da região anal). Posteriormente, esse grupo passou a englobar quatro

Filos: Chaetognatha, Echinodermata, Hemichordata e Chordata (Cuénot, 1948). O filo

echinodermata é atualmente subdividido em cinco classes: Crinoidea (lírios-do-mar),

Asteroidea (estrelas-do-mar), Ophiuroidea (serpentes-do-mar), Echinoidea (ouriços-

do-mar e bolachas-do-mar) e Holothuroidea (pepinos-do-mar). A partir das relações

filogenéticas aceitas atualmente, evidenciou-se a proximidade dos equinodermos com

os cordados (Halanych, 2004) (Figura 1).

Figura 1 – Filogenia do ouriço-do-mar

Árvore filogenética mostrando a relação entre ouriços-do-mar e outros grupos animais e sua proximidade aos cordados (Retirado de Consortium Sea Urchin Genome Sequencing Consortium 2006).

Devido a essa proximidade com os cordados, os equinodermos tornam-se

importantes ferramentas de estudo das características evolutivas apresentadas pelos

vertebrados.

O sequenciamento do genoma do ouriço-do-mar Strongylocentrotus purpuratus,

demonstra que este consiste de 23.300 genes, incluindo muitos previamente

considerados inovações de vertebrados, ou apenas conhecidos fora dos

deuterostomados (sugerindo uma possível perda nos vertebrados) (Sea Urchin

Genome Sequencing Consortium, 2006). Dentre os quais há mais de 1.000 genes

com relevância direta à imunidade e outras funções celulares (Hibino et al., 2006) com

representantes homólogos de importantes reguladores imunes e hematopoiéticos de

cordados, assim como genes que são importantes na imunidade adaptativa de

20 INTRODUÇÃO

vertebrados mandibulados (Rast et al., 2006). Este quadro, portanto, demonstra a

posição filogenética desse filo animal e sua proximidade com os cordados, justificando

seu papel como modelo animal para estudos de imunidade inata. Desta forma, os

ouriços-do-mar podem ajudar a desvendar variações adicionais para proteção contra

patógenos, e fornecer um recurso, até então, pouco conhecidos para aplicações

antimicrobianas e identificação de novas funções imunes em deuterostomados, com

relevância direta à saúde humana.

Os equinóides, podem ser subdivididos em dois grupos: regulares (ouriços-do-

mar) e irregulares (bolachas-do-mar). Os ouriços-do-mar são tipicamente de forma

globosa, sendo mais ou menos achatados nos polos, apesar de alguns serem ovais.

Formados por uma carapaça de carbonato de cálcio, na qual estão fixos os espinhos,

e que delimita a cavidade celomática, que por sua vez é preenchida por líquido

celomático, onde circulam os elementos celulares, denominados celomócitos.

Possuem a boca diametralmente oposta ao ânus, sendo que a mesma fica em contato

com a superfície, rodeada por uma membrana ligeiramente calcificada, denominada

membrana peristomial, que delimita os cinco dentes da lanterna de Aristóteles, órgão

utilizado para alimentação. Na cavidade celomática, encontram-se as gônadas, o

aparelho digestivo e outros órgãos do animal. As brânquias ficam externas à

carapaça, rodeando a membrana peristomial em sentido perpendicular a mesma

(Ruppert, Barnes, 1996) (Figura 2).

21 INTRODUÇÃO

Figura 2 – Anatomia de um ouriço-do-mar.

Esquema ilustrando as características internas de um ouriço-do-mar (retirado de Ruppert, Barnes,1996).

A composição do líquido celomático assemelha-se à da água-do-mar, diferindo

um pouco na concentração de alguns compostos como potássio, lipídeos, proteínas e

açucares dissolvidos (Chia, Xing, 1996). Os celomócitos, presentes no líquido

celomático, são classificados basicamente em quatro tipos diferentes, sendo eles:

amebócitos fagocíticos, esferulócitos vermelhos, esferulócitos incolores e células

vibráteis. Estes possuem diferentes funções, e são responsáveis pela defesa do

organismo (Borges et al., 2010; Chia, Xing, 1996; Smith et al., 2006). A proporção dos

tipos celulares pode variar de acordo com a espécie, ou até mesmo entre indivíduos

da mesma espécie, levando em conta as condições fisiológicas. (Matranga et al.,

2005).

A espécie Lytechinus variegatus ocorre em uma grande variedade de habitats,

podendo variar entre lugares rasos, e fundos onde encontram-se cobertos com algas,

rochas, conchas ou areia, apresentam uma ampla distribuição geográfica, podendo

ser encontrada da Carolina do Norte até o Sul do Brasil e no Golfo do México. São

intolerantes a locais com material particulado em suspensão, abandonando as áreas

de turbidez. A temperatura é o fator que mais influência na distribuição e abundância

da espécie, sendo o limiar de temperatura aceitável entre 11 e 35 °C. Em 1978 no

22 INTRODUÇÃO

Panamá, foi relatado uma mortalidade em massa devido ao aumento da temperatura

para 39,5 °C, de forma que alguns autores argumentam que fatores abióticos foram

mais importantes na regulação da população do que fatores bióticos (Watts et al.,

2013).

1.2 Imunidade inata

A imunidade inata, também conhecida como inespecífica, é comum a todos os

organismos multicelulares, sendo considerada a primeira linha de defesa. Além disso,

é um mecanismo de defesa filogeneticamente conservado e mais antigo em relação

a imunidade adquirida, que pode ser definida como um conjunto de mecanismos

responsáveis por proteger o organismo contra infecções, independente de prévia

exposição a micro-organismos ou outros patógenos (Bols et al., 2001; Medzhitov,

Janeway, 1998). O sistema imune inato evoluiu, desenvolvendo uma série de

estratégias para identificação do próprio/não-próprio, que são baseadas no

reconhecimento de padrões moleculares, demarcando o que é próprio e não

infeccioso, assim como o normal e anormal dentro de seu próprio organismo. Estes

padrões são decifrados por receptores que induzem ou inibem uma resposta

imunológica, dependendo do significado destes sinais (Medzhitov, Janeway, 2002).

Assim, após o reconhecimento do patógeno, ocorre a ativação de mecanismos que

normalmente visam a sua destruição (Kurtz, 2004).

A base do reconhecimento do não-próprio está na capacidade do hospedeiro de

reconhecer padrões conservados do metabolismo microbiano, que são exclusivos

para o mesmo. Esta estratégia permite que o sistema imune inato consiga diferenciar

entre "não-próprio infeccioso" e "próprio não-infecciosa". Outro mecanismo, é a

detecção de marcadores de “estado normal”. Este reconhecimento está acoplado a

várias vias inibitórias, que bloqueiam o início da resposta imune contra o próprio

organismo. Os marcadores deste estado são produtos de genes específicos, e

produtos de vias metabólicas exclusivas para o hospedeiro e ausentes em

microorganismos. Além disso, temos o reconhecimento de auto-antígenos, que

baseia-se na detecção de marcadores específicos de “estado anormal” que são

induzidos após a infecção (principalmente infecções virais), e a transformação celular.

Estes marcadores identificam as células infectadas para a eliminação desta por meio

do sistema imunitário (Medzhitov, Janeway, 2002).

23 INTRODUÇÃO

Memória específica é uma característica do sistema imunológico adaptativo dos

vertebrados, que baseia-se em linfócitos e anticorpos, sendo a parte mais estudada

do nosso sistema imunológico. A maioria dos patógenos são eliminados por

mecanismos inatos, muitas vezes, já antes de o sistema imunológico adaptativo torna-

se ativo (Kurtz, 2004), sendo assim, tanto a iniciação das respostas imunes

adaptativas, quanto a indução de mecanismos efetores particulares parecem

depender dos sinais fornecidos pelo sistema imune inato (Medzhitov, Janeway, 1998).

Estudos indicam que a memória específica pode também existir em sistemas

imunológicos inato, uma vez que, diferentes táxons de invertebrados, como baratas,

camarões e besouros apresentaram uma resposta melhorada à exposição secundária

(Little et al., 2005), porém, os mecanismos são desconhecidos, sendo este fato uma

importante evidencia para compreensão dos princípios e evolução da resposta

imunológica. (Kurtz, 2004).

A resposta imune em invertebrados é um sistema “não adaptativo”, baseada em

componentes celulares e humorais. Através do emprego de uma variedade de células

que são capazes de realizar fagocitose, citotoxidade ou respostas inflamatórias, além

de peptídeos antimicrobianos e outros componentes, incluindo a síntese de óxido

nítrico, reações de coagulação e inibidores de serina protease, um conjunto amplo de

possíveis respostas imunitárias inatas são acionados quando um organismo é

imunologicamente desafiado (Ellis et al., 2011; Little et al., 2005)

A multiplicidade de mecanismos imunológicos pode ser grande dentro de um

indivíduo, ou até mesmo dentro das várias classes ou filos. Essa grande variedade de

mecanismos faz-se necessária devido a importância da atividade a ser realizada,

sendo raro que uma função importante seja desempenhada por um único mecanismo

dentro de um indivíduo (Pasquier, 2001).

As respostas imunológicas apresentadas por equinodermos, fazem parte do

sistema imune inato, e podem ser divididas em dois tipos de reposta, sendo uma

resposta celular e a outra humoral. A resposta celular é desempenhada pelas células

presentes no líquido celomático, uma população morfologicamente heterogênea de

células livres, capazes de reconhecer e neutralizar os agentes patogênicos, por meio

de fagocitose, encapsulação, coagulação, citotoxidade e cicatrização de feridas. Já a

resposta imune humoral, é mediada por uma grande variedade de compostos

secretados no líquido celomático, desempenhando um papel importante na defesa

contra infecção. Estes compostos podem variar entre lectinas, aglutininas, perforinas,

24 INTRODUÇÃO

complemento e algumas citocinas que compõem algumas das respostas humorais de

equinodermos (Gross et al., 1999; Smith et al., 2006).

1.3 Células do sistema imune

As células de ouriços-do-mar encontram-se distribuídas no líquido celomático,

na cavidade celomática e são também chamadas de celomócitos. Estas células são

diferentes quanto a morfologia, tamanho, abundância relativa e função, fato que torna

a classificação padrão para todos os equinodermos uma tarefa difícil (García-Arrarás,

Ramirez-Gomez, 2010). Atualmente, os celomócitos em equinoide são classificados

em quatro tipos distintos: amebócitos fagocíticos - que podem ser encontrados em

duas formas - petalóide ou filopodial, seguidos por células vibráteis, esferulócitos

incolores e esferulócitos vermelhos (Borges et al., 2010; García-Arrarás, Ramirez-

Gomez, 2010; Gross et al., 1999; Smith, 1981). As proporções de cada tipo de

celomócito pode variar consideravelmente, podendo variar entre indivíduos de

espécies diferentes ou até mesmo entre indivíduos da mesma espécie. Estas

mudanças poder ser em resposta a um desbalanço fisiológico - como o estado

nutricional, imunológico - ou até mesmo em decorrência de estresse causado por

mudanças ambientais (García-Arrarás, Ramirez-Gomez, 2010; Matranga et al., 2005;

Smith et al., 2006). Os embriões de ouriços-do-mar também possuem células que

agem na defesa imune (Silva, 2000), incluindo células blastocelulares, aptas para

fagocitose e degradação de bactérias (Tamboline, Burke, 1992), e células granulares

pigmentadas que produzem equinocromo (Calestani et al., 2003), e estão envolvidas

na defesa da ectoderme larval e na cicatrização de feridas (Hibino et al., 2006).

Os amebócitos fagocíticos correspondem ao tipo celular mais abundante no

líquido celomático de ouriços-do-mar, compondo aproximadamente 40 a 80 % do

número total. Seu tamanho pode variar de 3 -20 µm, e sua função está relacionada

principalmente com a fagocitose, quimiotaxia, rejeição de tecidos enxertados,

produção de espécies reativas de oxigênio, aglutinação e as reações de coagulação.

Adicionalmente, os amebócitos parecem ser o principal tipo celular a expressar genes

imunológicos, incluindo os homólogos de complemento, um tipo C de lecitina e um

homólogo de NFkB. Desta forma os amebócitos são considerados como o principal

efetor da resposta imune inata (García-Arrarás, Ramirez-Gomez, 2010; Gross et al.,

1999; Hibino et al., 2006; Matranga et al., 2005).

25 INTRODUÇÃO

A morfologia dos amebócitos fagocíticos pode variar, subdividindo-os em

petalóide e filopodial. Diferenças entre estes dois tipos de células incluem a

localização subcelular de cinesina, microtúbulos, e miosina II, em adição ao

posicionamento das mitocôndrias. Possíveis relações entre estes subtipos de

fagócitos e suas funções específicas ainda não foram descritas (García-Arrarás,

Ramirez-Gomez, 2010; Hibino et al., 2006).

As células vibráteis, por outro lado, são esféricas e possuem um longo flagelo,

que auxilia na movimentação. Seu tamanho pode variar de 6 a 20 µm, e sua

distribuição no líquido celomático perivisceral pode variar de 9 a 20% do total de

células, sendo que sua função permanece pouco elucidada, estando relacionada

principalmente à reações de coagulação e na movimentação do líquido celomático

(García-Arrarás, Ramirez-Gomez, 2010; Gross et al., 1999; Hibino et al., 2006;

Matranga et al., 2005).

Os esferulócitos, por sua vez, são divididos em dois tipos, esferulócitos incolores

e esferulócitos vermelhos. Eles são caracterizados pela presença de grânulos no

interior de seu citoplasma, esses grânulos podem conter pigmento ou serem incolores.

Variam em tamanho, de 8 a 20 µm, e a sua distribuição varia substancialmente entre

espécies. Eles são semelhantes e ambos possuem movimentos amebóides. A função

dos esferulócitos incolores permanece desconhecida, ao passo que os esferulócitos

vermelhos apresentam atividade bactericida, em processos inflamatórios, além de

serem encontrados em torno de lesões e locais de infecções. Sua atividade

bactericida, tanto para bactérias gram-positivas, quanto gram-negativas, está

relacionada com a presença do equinocromo (3,5,7,8-pentahidroxi-6-etil-1,4-

naftoquinona), degranulado do interior de seus grânulos, uma naftoquinona que dá as

células a cor vermelha característica, além de possuir atividade antioxidante. Desta

forma, estas células e o equinocromo desempenham um importante papel na resposta

imune em ouriços (García-Arrarás, Ramirez-Gomez, 2010; Gross et al., 1999; Smith

et al., 2006; Matranga et al., 2005).

Na espécie Echinus esculentus, o equinocromo está presente nas células numa

concentração entre 3 e 60 μg/ml, e é ativo contra uma série de bactérias gram-

positivas e gram-negativas, na concentração de 50 μg/mL (Service, Wardlaw, 1984).

As bactérias gram-negativas estimulam, no ouriço S. purpuratus, a ação quimiotática

dos amebócitos fagocíticos para o foco da infecção, além de acumulação de

esferulócitos vermelhos e consequente liberação do equinocromo por degranulação.

26 INTRODUÇÃO

Por outro lado, a resposta à bactérias gram-positivas consiste na migração de

amebócitos fagocíticos e de células vibráteis (Johnson, 1969 lll). Provavelmente, os

efeitos bactericidas do equinocromo estão relacionados à quelação de ferro e auxílio

da prevenção de colonização microbial após a desova e fertilização, uma vez que

estão presentes também em ovos de ouriços-do-mar e larvas, (Smith et al., 2010).

Smith e Smith (1985), estudando a resposta ao estresse em bolachas-do-mar

Mellita quinquiesperforata, observaram que a liberação do equinocromo dos

esferulócitos vermelhos é similar à liberação de mediadores indutores de alergia de

basófilos e mastócitos de mamíferos, e concluíram que a sensibilização de células,

degranulação sem lise celular, liberação de histamina e similaridades das células

envolvidas, sugerem uma possível correlação com a resposta alérgica de mamíferos.

Alterações na proporção dos esferulócitos vermelhos tem sido observadas frente

a diferentes tipos de estresse, tais como: lesões no esqueleto calcário e na derme

(D’Andrea-Winslow, Novitski, 2008); contaminação do meio por metais, tais como

ferro, cobre, zinco e arsênio (Pinsino et al., 2008); contaminação do meio por fração

solúvel de petróleo (Borges et al., 2010); contaminação do meio por resíduos

industriais (Matranga et al., 2000), e aumento da temperatura (Branco et al., 2012;

Branco et al., 2013).

Segundo Matranga e colaboradores (2000), seria interessante conhecer as

origens da grande população de esferulócitos vermelhos observada em ocasiões de

estresse induzido, ambiental e experimentalmente em equinodermos, cujos

resultados apontam apenas um aumento da proporção dessas células, enquanto o

número total de células permanece estável. No trabalho, o grupo sugere que os outros

tipos celulares presentes no fluído celomático convertam-se em esferulócitos

vermelhos, o que confirmaria antigas teorias de que os esferulócitos incolores e

vermelhos são o mesmo tipo celular em diferentes momentos fisiológicos. Outra

possibilidade é de que as regiões hematopoiéticas liberariam os esferulócitos

vermelhos.

O equinocromo foi descrito inicialmente por MacMunn (1885), sendo

considerado um carregador de oxigênio. Em 1912, McClendon questionou a função

respiratória do pigmento, pois suas soluções não continham quantidade significativa

de ferro e, quando submetidas a vácuo, não absorveram nenhuma quantidade

apreciável de oxigênio atmosférico, além da afinidade ao oxigênio do pigmento

27 INTRODUÇÃO

reduzido ser tão alta, que era necessário muito cuidado para evitar que as soluções

fossem reoxidadas pelo ar.

Amostras puras de equinocromo, só foram isoladas a partir de 1934 (Ball, 1934),

e sua estrutura molecular foi identificada em 1940 por Kuhn e Wallenfels. Dentre todos

os pigmentos conhecidos dos equinodermos, é o que apresenta a maior atividade

antioxidante (Gerasimenko et al., 2006). Em 1939, Hartmann e colaboradores

reportaram que o equinocromo é responsável por estimular na ativação e aglutinação

do esperma de Arbacia pustulosa, porém Tyler (1939), estudando o efeito do

equinocromo purificado na espécie S. purpuratus, não encontrou o mesmo resultado,

sugerindo que o estimulador efetivo do esperma na experiência de Hartmann e

colaboradores, fosse o complexo formado pelo equinocromo e proteínas do extrato de

ovos daquela espécie.

O equinocromo, sendo uma naftoquinona (quinona com um anel naftalênico –

Silva et al., 2003), constitui uma classe estruturalmente diversificada de componentes

fenólicos, com uma ampla extensão de propriedades farmacológicas, sendo

amplamente utilizado na farmácia e medicina (Martínez, Benito, 2005). Assim, em

1988, as propriedades antioxidantes, antimicrobianas, de estabilizar membranas de

eritrócitos e de reduzir o nível de colesterol no sangue já eram conhecidas (Lebedev

et al., 2001). Em 1999, foi desenvolvida na Rússia uma preparação solúvel em água

nomeada Histocromo, com o equinocromo como princípio ativo, indicado para o

tratamento de doenças oculares e cardíacas como a doença arterial coronariana e o

ataque cardíaco (Mishchenko et al., 2003). Ao contrário dos antioxidantes endógenos,

(como as naftoquinonas vitamina E e ubiquinona), o equinocromo é capaz de

neutralizar os catalisadores da oxidação de membranas lipídicas, tais como cátions

de ferro acumulados na região de dano isquêmico dos tecidos (Lebedev et al., 2008).

Embora existam estudos envolvendo o equinocromo, seu papel ainda não está

bem elucidado, e há divergências sobre a função dos celomócitos, sendo que alguns

autores não descrevem a função de cada tipo de celomócito, referindo apenas o papel

destes na imunidade (Bertheussen, Seljelid, 1978; Chia, Xing, 1996; Smith, 1981).

1.4 Fagocitose

O significado biológico da fagocitose foi demonstrado pelo biólogo Russo Elie

Metchnikoff há mais de 100 anos em um equinodermo. Desde então, tem sido

28 INTRODUÇÃO

reconhecido como um componente crítico das respostas imunes inata e adaptativa

contra agentes patogênicos. Além disso, recentes estudos revelam que a fagocitose

é crucial para manter a homeostase (Flannagan et al., 2012). Durante esse processo,

células especializadas são responsáveis por englobar partículas estranhas ao

organismo, e transportá-las do meio extracelular para vacúolos intracelulares

(fagossomos), onde são degradadas (Henricks et al., 1986). A fagocitose é um

processo filogeneticamente conservado e de grande importância biológica (Flannagan

et al., 2012; Zong et al., 2008).

A análise detalhada de alguns modelos específicos tem permitido o

estabelecimento de princípios fundamentais da fagocitose, como o papel da

sinalização espaço-temporalmente coordenados, a necessidade de rearranjo do

citoesqueleto, e a ocorrência de remodelação da membrana (Flannagan et al., 2012).

O sucesso de agentes patogênicos resulta na quebra da primeira linha de defesa

do hospedeiro, que envolve barreiras físicas - promovidas pelos revestimentos

externos do corpo – posteriormente, deparam-se com moléculas genéricas e

específicas que restringem a infecção, seguido da ativação da segunda linha de

defesa, composta por células capazes de fagocitar substâncias ou organismos

patogênicos (Matranga et al., 2005).

A fagocitose é um processo complexo, que envolve várias etapas, incluindo:

quimiotaxia, onde a célula fagocítica é atraída através de substâncias quimiotáticas

(como produtos microbianos, complemento ou células danificadas); em seguida

ocorre a adesão, etapa em que os fagócitos se ligam uns aos outros e aderem a

partícula a ser fagocitada. Posteriormente, ocorre a opsonização, fase em que ocorre

o aumento da adesão celular, através de proteínas específicas que recobrem a

superfície da partícula a ser fagocitada. Finalmente as células prolongam suas

projeções celulares, englobando o organismo estranho em um processo denominado

ingestão (Matranga et al., 2005) (figura 3).

29 INTRODUÇÃO

Figura 3 – Esquema das etapas da fagocitose

Esquema representativo do processo de fagocitose: Amebócito fagocítico e levedura, por meio de quimiotaxia a célula se aproxima da levedura, para engloba-la, ocorrendo em seguida a adesão, formação dos pseudópodes e internalização da levedura, gerando o fagossoma que posteriormente se funde ao lisossoma, que libera enzimas digestivas, formando o fagolisossoma, que degrada a levedura, e os restos celulares são exocitados.

A realização da fagocitose é finalizada com o englobamento da partícula, no

entanto, outro processo se inicia com objetivo de degradar a mesma. O processo de

internalização, em todos os casos, culmina na formação de um vacúolo ligado à

membrana, o fagossoma. O fagossoma recém formado é inócuo, isso se deve as

características da sua membrana limitante que assemelham-se a qual foi derivada, e

o seu conteúdo é apenas um reflexo do meio extracelular. Desta forma, a fagocitose

por si só é insuficiente para mediar a destruição de micro-organismos, no entanto, a

cisão com o lisossoma é seguida por uma série de modificações bioquímicas que

convertem o fagossoma numa organela potencialmente microbicida, o fagolisossoma.

A capacidade destrutiva impressionante do fagolisossoma é atribuída à atividade

combinada de vários efetores, incluindo enzimas hidrolíticas, oxidantes e peptídeos

catiônicos (Flannagan et al., 2012).

Em ouriços-do-mar, esse importante mecanismo de “limpeza” é eficientemente

desempenhado por uma subpopulação dos celomócitos, os amebócitos fagocíticos,

que são responsáveis por degradar e fagocitar partículas estranhas (Gross et al.,

1999). As primeiras observações de fagocitose por celomócitos de equinodermos

30 INTRODUÇÃO

foram realizadas em estrelas-do-mar Asteria rubens, após injeção de tinta da china,

as células fagocitando foram encontradas em diferentes partes do corpo (Smith,

1981). Desta forma, avaliar mecanismos de defesa que fazem parte do sistema imune

inato é uma ferramenta de extrema importância, por tratar-se do principal mecanismo

responsável pela defesa destes organismos contra patógenos.

Compreender exatamente como o sistema imunológico em invertebrados

responde a mudanças no ambiente é de extrema importância para compreender como

as interações patógeno/hospedeiro serão afetadas por essas mudanças, que por sua

vez irá ajudar-nos a compreender e prever como as mudanças na imunocompetência,

causadas ou não, pela variabilidade ambiental, pode ter impacto a nível de

comunidade ou da população (Ellis et al., 2011)

31 OBJETIVO

2 OBJETIVO

Correlacionar o equinocromo com processos do sistema imunológico inato do

ouriço-do-mar Lytechinus variegatus, por meio da ação de diferentes concentrações

de equinocromo (50 e 100 μg/ml) na atividade fagocítica de amebócitos fagócitos

desafiados por leveduras Saccharomyces cerevisiae.

32 MATERIAL E MÉTODOS

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Coleta dos Animais

Indivíduos adultos de ouriços-do-mar Lytechinus variegatus (Lamarck, 1816)

(figura 4), (n=20) foram coletados manualmente por mergulho livre, a uma

profundidade de 2 à 10 m, no Parcel da Praia Grande (23° 51,200’ Sul e 045° 24,973’

Oeste), no canal de São Sebastião-Ilha Bela, litoral norte do Estado de São Paulo

(figura 5), sem distinção quanto ao sexo, com volume aproximado de 200 20 ml, sob

autorização para coleta, transporte e manutenção temporária de espécimes e

amostras biológicas emitida pelo Ministério do Meio Ambiente, por meio do SISBIO

(n° 30644-2).

Figura 4 – Espécime do ouriço-do-mar Lytechinus variegatus (Barra de escala em

cm).

Durante o estudo, foram realizadas duas coletas: na primeira, os animais foram

empregados para extração e purificação do equinocromo, realizadas no laboratório de

Histofisiologia Evolutiva no Instituto de Ciências Biomédicas e no laboratório de

Bioquímica e Biofísica no Instituto Butantan, na segunda coleta, os animais foram

33 MATERIAL E MÉTODOS

empregados para a realização dos ensaios biológicos, realizados no Centro de

Biologia Marinha da Universidade de São Paulo.

Figura 5 – Georeferênciação do ponto de coleta.

Fonte: Google Maps

3.2 Transporte e Manutenção dos animais

Após coletados, os animais empregados para extração e purificação do

equinocromo, foram transportados para o biotério do Laboratório de Histofisiologia

Evolutiva do Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento, do Instituto de

Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, utilizando-se bolsas de tela de

nylon em galões de 30 litros com arejamento intermitente. No biotério, os animais

foram mantidos em caixas d'água plásticas (Marfinite) com capacidade para 200 litros,

troca de 20% da água semanalmente e arejamento constante.

Os animais empregados para os ensaios biológicos, foram coletados em bolsas

de tela de nylon e posteriormente transportados em galões até os tanques de

manutenção, situados no Centro de Biologia Marinha da Universidade de São Paulo.

Os animais foram mantidos nos tanques de fibra de vidro (500 litros), a água foi

renovada constantemente.

Todos os animais, pós coletados, foram aclimatados por pelo menos uma

semana antes do início dos experimentos, minimizando desta forma um possível

estresse causado pela captura. O fotoperíodo estabelecido foi o natural e os animais

34 MATERIAL E MÉTODOS

foram alimentados semanalmente ad libitum com algas marinhas (Ulva sp. e

Sargassum sp.) colhidas no mesmo local dos animais. Decorrido o período de

aclimatação, deu-se início aos experimentos propostos.

Os parâmetros físico-químicos analisados foram monitorados diariamente. A

salinidade foi monitorada com o auxílio de um refratômetro para salinidade com

compensação automática para temperatura (SR-3) e mantida em 35,0‰ 1‰ pela

adição, quando necessária, de água destilada.

A concentração de nitrito e oxigênio dissolvido foram monitorado com auxílio

de testes de nitrito (TetraTest® (Tetra Werke, Melle, Germany), mantido entre 0 e

0,1mg/l), e oxigênio dissolvido (LabconTest, mantido entre 8 e 11 ppm).

As leituras de temperatura foram realizadas, utilizando-se termostatos (Full

Gauge), e mantida a 20,0º 2,0 C através de termostatos ligados a aquecedores

(40w), assim como pelo resfriamento do ambiente através de ar condicionado

(Springer, 3000bti).

3.3 Procedimentos gerais para obtenção do líquido celomático

O líquido celomático do celoma perivisceral foi obtido com o auxílio de uma

seringa de 1 ml com agulha de 13x3,3 via membrana peristomial (Plytycs, Seljelid,

1993). A seringa foi inserida num ângulo transversalmente oposto ao da lanterna de

Aristóteles, evitando assim que o tubo digestivo e as gônadas fossem perfurados.

3.4 Classificação dos celomócitos

Após obtenção de amostras do líquido celomático perivisceral de cada ouriço,

uma fração de aproximadamente 0,1 ml foi destinada para classificação dos diferentes

tipos celulares. O líquido celomático foi então depositado sobre lâminas de vidro,

cobertas com lamínulas e observadas sob fotomicroscópio de contraste de fase (Zeiss

Standard 25, Carl Zeiss, German).

A classificação dos celomócitos foi realizada seguindo características próprias

de cada tipo celular com o auxílio da literatura existente para ouriços-do-mar (Borges

et al., 2005; Chia, Xing,1996; Smith, 1981; Smith et al., 2006). Desta forma, as células

foram subdivididas em quatro tipos:

35 MATERIAL E MÉTODOS

Amebócitos Fagocíticos: células com vasto citoplasma translúcido com capacidade de

adesão e espraiamento, apresentam ainda, filopódios e lamelipódios.

Esferulócitos Vermelhos: células esféricas com movimentos ameboides e presença

de grânulos intracitoplasmáticos vermelhos.

Esferulócitos Incolores: células esféricas com movimentos ameboides e presença de

grânulos intracitoplasmáticos incolor.

Células Vibráteis: pequenas células esféricas, dotadas de um único flagelo

responsável por contínuos movimentos circulares.

3.5 Contagem relativa e absoluta de celomócitos

A contagem relativa e absoluta dos celomócitos foram realizadas em câmara

de Neubauer, que consiste em uma lâmina de vidro com divisões que auxiliam na

contagem.

Após colocada a lamínula de vidro sobre a câmara, adicionou-se uma alíquota

do líquido celomático e foram realizada as contagens utilizando os quatro quadrantes

externos.

Na contagem absoluta dos celomócitos em câmara de Neubauer o número de

células por ml foi obtido pela seguinte equação:

Q1 + Q2 + Q3 + Q4

4 × 104 = n° de células/mL

Já na contagem relativa dos celomócitos a porcentagem de cada tipo celular foi

obtido pela seguinte equação:

n° de cada tipo celular × 100

n° total de células contadas

3.6 Ensaio de viabilidade celular

Para a análise de viabilidade celular utilizou-se o protocolo segundo Freshney

(1987), onde uma alíquota de 50µl do líquido celomático de cada animal foi adicionada

à 50µl da solução de azul de Tripan 0,4% (Sigma® St Louis, MO, EUA) e após 5

minutos foi colocado em Câmara de Neubauer e analisado sob microscópio óptico.

O azul de Tripan é um corante vital que não atravessa membranas íntegras,

sendo assim, as células vivas não permitem a passagem do corante, não adquirindo

36 MATERIAL E MÉTODOS

coloração, já as células mortas, apresentam suas membranas danificadas, permitindo

o fluxo de corante para o interior da célula e apresentando uma coloração azul. A

proporção foi obtida através do número total de células contadas e o número de

células mortas.

3.7 Extração do equinocromo

Para a obtenção de um extrato bruto contendo os pigmentos presentes no

líquido celomático do ouriço-do-mar Lytechinus variegatus foi utilizado o método

descrito por Amarowicz e colaboradores (1994), com algumas modificações. Após

retirar o líquido celomático o mesmo foi centrifugado a 1200 rpm por 10 minutos para

diminuir o volume do líquido em relação as células, 5ml do líquido celomático

juntamente com o pellet de células, foi ressuspendido e adicionado uma solução de

ácido clorídrico HCl 6M (10 ml). Após a adição de HCl as células foram então lisadas

e o pigmento liberado. O pigmento foi extraído da solução com a adição de três vezes

o volume em éter etílico. A camada de éter etílico contendo o pigmento foi então

lavada por três vezes com uma solução salina (5% NaCl) para total remoção do HCl.

A solução de éter contendo o pigmento foi seca, por meio da evaporação do éter.

O extrato contendo o pigmento foi ressuspendido em etanol e armazenado no

freezer a -20 °C, posteriormente o pigmento foi submetido a purificação por HPLC, no

Laboratório de Bioquímica e Biofísica do Instituto Butantan.

3.8 Purificação por HPLC do equinocromo

Para a purificação do pigmento resultante da extração foi usado um sistema de

cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (RP-HPLC), (20A Prominence,

Shimadzu Co., Kyoto, Japão), em uma coluna C18 (ACE® C18, 5 μm, 100 Å, 250 mm

x 4,6 mm), com uma eluição isocrática, sendo os solventes A = ácido trifluoroacético

(TFA) / água (1:1000) e solvente B = metanol / acetonitrila (5:9), em fluxo constante

de 0,5 ml/min, a 38 °C. O conteúdo eluído foi monitorado por um detector Shimadzu

SPD-M20A PDA, na faixa de 200 a 500 nm e coletado manualmente.

A fração proveniente da primeira purificação foi submetida a uma repurificação

utilizando a mesma coluna, porém uma eluição em um gradiente linear, de 0 a 100%

do solvente B em 20 minutos, sendo o solvente A ácido trifluoroacético (TFA) / água

37 MATERIAL E MÉTODOS

(1:1000) e solvente B TFA / acetonitrila / água (1:900:100), em fluxo constante de 1

mL/min, a 38 °C. A eluição do equinocromo foi monitorado pelo comprimento de onda

de 475 nm.

3.9 Análise por espectrometria de massas

Todas as etapas de purificação, bem como as análises por espectrometria de

massas foram realizadas no Laboratório de Bioquímica e Biofísica, do Instituto

Butantan.

A análise de massa foi realizada em um espectrômetro ESI-IT-ToF (Shimadzu

Co., Japão) para determinação da massa molecular e pureza do composto obtido da

purificação em cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (RP-HPLC). A

amostra foi diluída em metanol 50% e inserida diretamente no espectrômetro por

injeção manual, em um injetor Rheodyne, em modo negativo, a um fluxo de 50 µL/min.

A voltagem utilizada da interface foi 4,5 kV e a voltagem do detector, 1,8 kV, com

temperatura de 200 °C. Os espectros foram obtidos na faixa de 50 a 2000 m/z.

3.10 Contagem de leveduras Saccharomyces cerevisiae

Para avaliar a atividade fagocítica dos amebócitos fagocíticos foram utilizadas

nos ensaios leveduras Saccharomyces cerevisiae (Meyen ex E. C. Hansen, 1883),

elas foram escolhidas por serem micro-organismos capazes de induzir uma resposta

imune, serem de fácil obtenção e manipulação, além de ser um organismo não

patogênico, evitando a contaminação em caso de acidentes.

As leveduras utilizadas foram obtidas comercialmente como fermento biológico

fresco Fleischmann®. Uma solução de levedura foi preparada contendo 200µg de

levedura em 10 ml de água do mar filtrada. A solução foi passada por uma seringa de

insulina para dissociação das leveduras e posterior contagem nos quatro quadrantes

externos da câmara de Neubauer.

A proporção de leveduras para cada amebócito fagocítico foi obtida na razão

de 10:1, conforme estabelecido por Silva e Peck (2000).

38 MATERIAL E MÉTODOS

3.11 Ensaio de fagocitose in vitro

Para o ensaio de fagocitose in vitro, foram utilizados dez animais, sendo que

para cada animal foram feitas nove lâminas, divididas em um grupo controle, e dois

grupos tratados com diferentes concentrações de pigmento.

Alíquotas de 100 µL do líquido celomático foram adicionadas à lâminas de

vidro, e incubadas por um período de uma hora em câmara úmida, para a adesão e

espraiamento das células. Transcorrido o período de uma hora, adicionou-se a

suspensão de leveduras Saccharomyces cerevisiae. Após adicionar a suspensão de

leveduras, as lâminas foram reincubadas por mais uma hora em câmara úmida, e em

seguida observadas em microscopia de contraste de fase (Carl Zeiss® -

Fotomicroscópio II) para a avaliação da fagocitose, além de permitir a visualização

das leveduras internalizadas pelos amebócitos fagocíticos.

Para a análise da fagocitose, em cada lâmina foram contadas cem células,

analisadas de acordo com a quantidade de leveduras Saccharomyces cerevisiae

fagocitadas. Dessa forma, a contagem foi subdividida em:

Amebócitos fagocíticos sem leveduras

Amebócitos fagocíticos com 1 levedura

Amebócitos fagocíticos com 2 leveduras

Amebócitos fagocíticos com 3 leveduras

Amebócitos fagocíticos com 4 ou + leveduras

Para verificar a ação do equinocromo na atividade fagocítica dos amebócitos

fagocíticos, foram adicionadas 50 e 100 µg/ml de equinocromo previamente purificado

aos ensaios de fagocitose in vitro.

3.12 Análise estatística

Os dados foram submetidos a análises pelo teste de Kruskal Wallis para dados

não paramétricos. Para as análises foi usado o software STATISTICA 7.0 StatSoft.

Inc. Diferenças foram consideradas significantes quando o P<0,05.

39 MATERIAL E MÉTODOS

Figura 6 – Fluxograma da metodologia empregada para obtenção do material, análise

e ensaio.

40 RESULTADOS

4 RESULTADOS

4.1 Contagem diferencial dos celomócitos

Os quatro diferentes tipos celulares (Figura 7), foram observados em todos os

animais utilizados, sendo que os amebócitos fagocíticos (AF), tanto na forma filopodial

– caracterizada pela emissão de estreitos prolongamentos citoplasmáticos,

distribuídos radialmente em torno da região central da célula – quanto na petalóide –

caracterizada pela presença de largos prolongamentos citoplasmáticos que lembram

pétalas – estas foram as células mais abundantes encontradas no líquido celomático

do ouriço-do-mar Lytechinus variegatus, sem distinção das diferentes formas,

seguidas pelas células vibráteis (CV), esferulócitos incolores (EI) e esferulócitos

vermelhos (EV), respectivamente. Não foram observadas alterações entre as

proporções dos tipos celulares para cada animal (Figura 8).

41 RESULTADOS

Figura 7 – Fotomicrografias de células a fresco do ouriço-do-mar Lytechinus variegatus em contraste de fase.

A: Líquido celomático contendo os diferentes tipos celulares (barra de escala = 50 µm). B: Célula vibrátil em maior aumento, presença de um longo flagelo (barra de escala = 20 µm). C: Amebócito fagocítico na forma filopodial em maior aumento (barra de escala = 20 µm). D: Amebócito fagocítico na forma petalóide em maior aumento (barra de escala = 20 µm). E: Esferulócito incolor em maior aumento, presença de grânulos incolores (barra de escala = 20 µm). F: Esferulócito vermelho em maior aumento, presença de grânulos vermelhos contendo equinocromo (barra de escala = 20 µm).

42 RESULTADOS

Figura 8 – Proporção dos tipos celulares de ouriços-do-mar Lytechinus variegatus

(n=10).

Valores expressos em porcentagem. Barras equivalem as médias ± DVP.

4.2 Viabilidade celular

A viabilidade celular dos celomócitos foram avaliadas em todos os animais

utilizados nos experimentos, e se manteve superior a 98%.

4.3 Extração e Purificação

O líquido celomático do ouriço-do-mar Lytechinus variegatus se mostrou como

uma excelente fonte para a obtenção do pigmento. A fração com o pigmento, obtida

após a extração foi submetida a purificação – por RP-HPLC – em coluna C18, como

descrito anteriormente. As figuras 9 e 10 apresentam os cromatogramas obtidos da

extração, com absorbância nos comprimentos de ondas de 214 e 475 nm,

respectivamente.

A eluição de todo o pigmento na amostra injetada ocorreu entre 0 a 15 min, o

pico de maior intensidade foi observado no tempo de retenção de 11,108 min no

comprimento de onda de 475 nm (figura 10). No entanto, outros picos puderam ser

observados com maior intensidade no comprimento de onda 214nm (figura 9). O pico

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

1

Po

rcen

tage

m (

%)

Celomograma Amebócito Fagocítico Esferulócito Incolor Esferulócito Vermelho Célula Vibrátil

43 RESULTADOS

marcado com asterisco foi selecionado como o pico de interesse e coletado

manualmente.

Figura 9 – Perfil cromatográfico obtido através da injeção do extrato contendo o pigmento de L. variegatus, λ=214.

Presença de diferentes picos com diferentes intensidades. O asterisco corresponde ao pico de interesse coletado manualmente.

44 RESULTADOS

Figura 10 – Perfil cromatográfico obtido através da injeção do extrato contendo o pigmento de L. variegatus, λ=475.

Diminuição da intensidade de alguns picos observados em 214 nm. O asterisco corresponde ao pico de interesse coletado manualmente.

De acordo com as análises dos perfis cromatográficos obtidos, foi possível

verificar que o pico de interesse coletado não estava puro. A partir disso o pico

coletado foi submetido a uma repurificação, onde a eluição do pigmento proveniente

da repurificação ocorreu entre 0 a 45 min, e foi monitorado nos comprimentos de onda

de 214 e 475 nm. No comprimento de onda de 214 nm (figura 11), podemos observar

a presença de mais de um pico, sendo escolhido o pico de interesse com maior

intensidade, o tempo de retenção foi de 22,160 min.

45 RESULTADOS

Figura 11 – Perfil cromatográfico obtido para a repurificação do pico coletado, em coluna C-18, λ=214.

O pico de maior intensidade (*) foi coletado manualmente para analises. Observa-se a presença de diferentes picos em menor intensidade.

46 RESULTADOS

46

Já o comprimento de onda de 475 nm, apresentou um pico de grande

intensidade no tempo de retenção de 22,116 min (figura 12), que foi coletado

manualmente. Com a repurificação do primeiro pico coletado, obtivemos uma alíquota

pura do pigmento, que foi submetida a análise por espectrometria de massas (MS)

para confirmar a presença e pureza do equinocromo. Posteriormente a atividade do

pigmento obtido por RP-HPLC foi avaliada nos ensaios de fagocitose in vitro.

4.4 Análise por espectrometria de massa (MS)

Para verificar a presença do equinocromo, bem como a pureza da molécula,

foram feitas análises por espectrometria de massa.

A análise dos dados obtidos por espectrometria de massa (MS), permitiu

confirmar que as etapas de extração do equinocromo do líquido celomático de L.

variegatus, assim como a purificação do mesmo por RP-HPLC, foram realizadas com

êxito. Na figura 13 observamos um íon de grande intensidade 265,03 Da, que

corresponde ao peso molecular do Equinocromo A. Após confirmação, demos início

aos estudos in vitro da atividade do equinocromo no sistema imune inato de L.

variegatus.

47 RESULTADOS

Figura 12 – Perfil cromatográfico obtido para a repurificação do pico coletado, em coluna C-18, λ=475.

Pico de maior intensidade (*) foi coletado manualmente, representando o equinocromo purificado.

48 RESULTADOS

Figura 13 – Espectro de massas do último pico coletado para repurificação em RP-HPLC.

O íon de maior intensidade correspondente ao equinocromo 265, 0311 Da.

49 RESULTADOS

49

4.5 Avaliação da atividade fagocítica in vitro

Os ensaios de fagocitose in vitro demonstraram que as únicas células do líquido

celomático de L. variegatus, com capacidade para realizar fagocitose são os

amebócitos fagocíticos (figura 14).

Figura 14 – Fotomicrografias de ensaio de fagocitose in vitro com células do ouriço-do-mar Lytechinus variegatus em contraste de fase.

A – F Amebócitos fagocíticos, fagocitando uma ou mais leveduras Saccharomyces cerevisiae (setas branca), bem como a presença de amebócitos fagocíticos que não fagocitaram leveduras (setas vermelha). Barra de escala = 20 µm.

50 RESULTADOS

50

Os amebócitos fagocíticos foram expostos à duas concentrações diferentes –

previamente estipuladas – de equinocromo (50 e 100 µg/ml), onde analisou-se os

amebócitos que estavam fagocitando, bem como a quantidade de leveduras

Saccharomyces cerevisiae presente em cada um deles.

O número de amebócitos fagocíticos que estavam fagocitando encontram-se

significativamente aumentados, nos dois grupos tratados com equinocromo (figura

15). O número de amebócitos sem leveduras internalizadas diminuiu

significativamente em ambos os grupos, sendo mais significativo no grupo tradado

com 100 µg (0,0001), do que no grupo tratado com 50 µg (0,0010), ambos em relação

ao controle, no entanto não foram encontradas diferenças significativas quando

comparamos os grupos tratados entre si.

O número de leveduras Saccharomyces cerevisiae fagocitadas pelos

amebócitos fagocíticos, nas duas concentrações de equinocromo, foram analisados,

sendo que na concentração de 50 µg, o número de leveduras fagocitadas foi

significativamente maior (p= 0.0177), apenas nos amebócitos com quatro ou mais

leveduras. O número de amebócitos com uma levedura foi significantemente maior

(p= 0,0197) no grupo tratado com 100 µg de pigmento, em relação ao controle. Os

amebócitos com duas e quatro ou mais leveduras tiveram um aumento significativo

(p= 0,0167 e 0,0177, respectivamente), no grupo tratado com 100 µg, em relação aos

seus respectivos controles. Nenhum dos grupos testados apresentou diferenças

significativas quando comparamos os grupos tratados entre si. O único grupo que não

apresentou diferenças significativas em nenhum dos tratamentos foi o de amebócitos

com três leveduras.

De modo geral, o tratamento de 50 µg de equinocromo demonstrou um

aumento na quantidade de amebócitos que estavam fagocitando, e uma tendência a

aumentar a quantidade de leveduras fagocitadas por amebócitos fagocíticos, apesar

deste resultado não ser significativo em todos os grupos. Já o tratamento com 100 µg

de equinocromo, apresentou uma resposta significativa em quase todos os grupos,

exceto no de amebócitos com três leveduras.

51 RESULTADOS

51

Figura 15 – Atividade fagocítica de amebócitos fagocíticos expostos a diferentes concentrações de equinocromo em ouriços-do-mar Lytechinus variegatus.

Diferenças significativas (*) entre os grupos tratados com 50 µg e 100 µg de equinocromo e seu respectivo controle.

52 DISCUSSÃO

52

5 DISCUSSÃO

Os métodos utilizados para obtenção e purificação do equinocromo do líquido

celomático do ouriço-do-mar Lytechinus variegatus foram eficientes. A eficiência do

método foi testada por meio da análise da composição da última fração coletada do

RP-HPLC, através de espectrometria de massas, e foi possível confirmar a presença,

bem como a pureza da molécula do equinocromo. Este método vem sendo utilizado

para separação de pigmentos oriundos de carapaças de outras espécies de ouriço-

do-mar, além de peptídeos presentes no líquido celomático (Kuwahara et al., 2009;

Sciani et al., 2013), apresentando uma alta eficiência.

No líquido celomático perivisceral de ouriços-do-mar, bem como na carapaça,

espinho e outros órgãos, são encontrados compostos polihidroxilados de coloração

variada, como o equinocromo (Anderson et al., 1969; Kuwahara et al., 2010). As

células responsáveis por sua biossíntese são os esferulócitos vermelhos, porém, o

seu papel ainda permanece pouco elucidado. Sua função, até então descrita, está

relacionada com a atividade bactericida e antioxidante (Ramírez-Gómez, García-

Arrarás, 2010). Sendo assim, os resultados do presente estudo trazem dados inéditos

e ainda pouco explorados na literatura.

Os ensaios de fagocitose in vitro, demostraram que o único tipo celular apto a

realizar a fagocitose em L. variegatus, é o amebócito fagocítico, os demais tipos

celulares não participaram efetivamente deste processo. Esses dados, estão de

acordo com a literatura existente para equinodermos (Borges et al., 2005; Borges et

al., 2010; Branco et al., 2012; Johnson, 1969).

A adição do equinocromo nos ensaios de fagocitose in vitro, acarretou em um

aumento significativo da atividade dos amebócitos fagocíticos, observada através da

diminuição significativa do número de amebócitos fagocíticos sem leveduras

fagocitadas. Desta forma, tanto o grupo tratado com 50 µg/ml, quanto o tratado com

100 µg/ml de equinocromo, foram capazes de recrutar e/ou induzir um maior número

de amebócitos fagocíticos a realizarem a fagocitose. Esses dados indicam que a

atuação do equinocromo seria capaz de modular positivamente o processo fagocítico

em L. variegatus, através do aumento do número de amebócitos fagocíticos que

efetivamente estavam fagocitando.

53 DISCUSSÃO

53

Em paralelo, dados do nosso grupo de pesquisa demonstraram que ouriços-do-

mar antárticos Sterechinus neumayeri, submetidos ao estresse por aumento da

temperatura, apresentaram o aumento do número de esferulócitos vermelhos,

positivamente correlacionado ao aumento da capacidade fagocítica (Branco et al.,

2012). Este aumento dos esferulócitos vermelhos em resposta a um agente estressor

leva, consequentemente, a um aumento da concentração de equinocromo, uma vez

que a célula degranula, liberando o pigmento na tentativa de reestabelecer a

homeostase por meio de sua atividade bactericida, antioxidante e potencializadora da

fagocitose. Juntos, os dados sugerem que o aumento da concentração de

equinocromo influencia positivamente a fagocitose, inclusive em ambientes antárticos.

O englobamento e a destruição de partículas e micro-organismos invasores por

fagocitose, são componentes críticos e essenciais da resposta imune inata

(Flannagan et al., 2012). Desta forma, a resposta fagocítica está diretamente

relacionada com a capacidade que o organismo tem de manter a homeostase do

sistema como um todo. Levando em consideração a fagocitose como um componente

essencial, estudos que avaliem este tipo de resposta são de extrema importância. As

leveduras são comumente utilizadas em ensaios de fagocitose, devido à presença de

β-glucan em sua membrana, o que atua como estimulador da resposta imune de

maneira bastante eficaz, além de ser um organismo não patogênico (Secombes,

Fletcher, 1992; Silva et al., 2007).

Além do aumento no número de amebócitos fagocíticos ativados, também

observamos um aumento significativo do número de amebócitos com uma, duas, três

e quatro ou mais leveduras Saccharomyces cerevisiae fagocitadas. Sendo que na

concentração de 50 µg/ml de equinocromo, esse aumento foi observado apenas para

os amebócitos com quatro ou mais leveduras. Já na concentração de 100 µg/ml de

equinocromo, os amebócitos contendo uma, duas, três, e quatro ou mais leveduras

internalizadas apresentaram diferenças significativas. Desta forma, a atuação do

equinocromo não estaria apenas relacionada à ativação dos amebócitos fagocíticos,

mas também apresentaria um papel na ativação destes amebócitos, quando se leva

em consideração a alteração do número de leveduras fagocitadas por célula. Este

aumento apresentou-se de maneira dose-dependente, uma vez que a maior

concentração de equinocromo levou a um maior aumento no número de leveduras

fagocitadas por célula. Esses dados reforçam a nossa hipótese, de que o equinocromo

estaria atuando modulando positivamente o processo fagocítico.

54 DISCUSSÃO

54

Levando em conta os resultados obtidos, podemos verificar que ambas as

concentrações apresentaram efeitos. Além disso, o equinocromo aumentou o número

de amebócitos com 4 ou mais leveduras à partir da dose de 50 µg/ml, desta forma,

indicando que o equinocromo ativa os amebócitos para realizarem a fagocitose. No

entanto, essa ativação não necessariamente aumentaria a quantidade de leveduras

fagocitadas, podendo haver mais amebócitos com uma levedura apenas. Para

aumentar o número de leveduras fagocitadas, poderia ser necessário uma segunda

molécula que auxiliaria este segundo processo de ativação. Porém, o equinocromo,

por si só, foi capaz de ativar tanto os amebócitos a fagocitarem, quanto a aumentar a

quantidade de levedura fagocitada por amebócito. Nesse sentido, ele teria efeito na

comunicação celular ou tornaria o metabolismo da célula mais ativo. Sendo assim,

com adição do equinocromo nos ensaios fagocíticos, acelerou, mas não exatamente

ordenou o “evento” fagocitose.

Um fator que poderia influenciar nos ensaios de fagocitose, seria a utilização de

diferentes proporções de leveduras Saccharomyces cerevisiae por célula. Xing e

colaboradores (1998), demonstraram o aumento do número total de partículas

fagocitadas por amebócitos do pepino-do-mar Holothuria leucospilota, e esse

aumento foi positivamente correlacionado com a quantidade adicionada de partículas

por células. No presente estudo, as proporções estabelecidas foram de dez leveduras

por célula, para todos os ensaios, evitando assim falsas interpretações.

A atividade bactericida do equinocromo foi previamente demonstrada em

diferentes concentrações, 37,5 e 50 µg/ml, sendo que estas encontram-se no limite

superior do intervalo fisiológico (3 – 60 µg/ml (Service, Wardlaw, 1984)). No presente

estudo, utilizamos duas contrações diferentes, uma dentro do intervalo fisiológico e

outra superior. A concentração de 50 µg/ml fui suficiente para ativar a fagocitose dos

amebócitos, no entanto o número de amebócitos com uma, duas e três leveduras

fagocitadas não aumentou, ao passo que os amebócitos com quatro ou mais

leveduras apresentaram-se como os únicos a aumentar significativamente. Quando

comparamos com a concentração de 100 µg/ml, apenas os amebócitos com três

leveduras não apresentaram um aumento significativo, o número de amebócitos com

uma, duas, quatro ou mais leveduras aumentou significativamente. Adicionalmente,

Hatate e colaboradores (2002), demonstraram a atividade antioxidante de pigmentos

provenientes de carapaças de ouriços-do-mar, roxo, vermelho e verde, e que a

atividade antioxidante observada está diretamente relacionada com a concentração

55 DISCUSSÃO

55

utilizada, e não a espécie de ouriço. Sendo assim, nossos dados corroboram com o

resultado descrito anteriormente, uma vez que observamos respostas diferentes de

acordo com a concentração.

O equinocromo sendo uma naftoquinona, pertence a uma classe estruturalmente

diversa de compostos fenólicos: as quinonas, que por sua vez, apresentam uma vasta

gama de propriedades farmacológicas, como atividade antineoplásica,

antiinflamatória, antioxidante, antiviral, antifúngica, mutagênica, bactericida, laxante,

antipsoriático entre outras, e sua distribuição varia entre bactérias, fungos, líquens,

gimnospermas, angiospermas e equinodermos (Martínez, Benito, 2005). O papel do

equinocromo como antioxidante e bactericida, já está bem estabelecido na literatura

para equinodermos (Johnson, 1969; Kuwahara et al., 2009, 2010; Shankarlal et al.,

2011), no entanto, sua atuação no sistema imune de equinodermos ainda permanece

pouco elucidada.

A contagem diferencial dos celomócitos é um método utilizado para a análise da

proporção dos diferentes tipos celulares, sendo que as proporções aqui descritas para

cada tipo celular do ouriço-do-mar Lytechinus variegatus foi semelhante aos dados da

literatura para ouriços (Borges et al., 2005; Branco et al., 2012; Johnson, 1969; Smith

et al., 1992).

Alterações nas proporções dos diferentes tipos celulares podem servir como um

indicativo de algum tipo de estresse. O aumento no número de esferulócitos

vermelhos, foi relatado em ouriços-do-mar submetidos a diferentes tipos de estresse

como: lesão no esqueleto e derme, contaminação ambiental por metais pesados,

petróleo e resíduos industriais (Borges et al., 2010; D’Andrea-Winslow, Novitski, 2008;

Matranga et al., 2000; Pinsino et al., 2008). Pesquisas envolvendo estrela-do-mar

submetidas ao estresse por variação de pH, demonstraram uma redução no número

total de celomócitos, em paralelo a uma reduzida capacidade fagocítica (Hernroth et

al., 2011). Adicionalmente, a inoculação de bactérias gram-positivas no líquido

celomático de Asteria rubens acarretou em aumento da concentração de dois tipos

celulares (Coteur et al., 2002). Desta forma, mudanças no número de esferulócitos

vermelhos podem servir como biomarcadores de estresse ambiental, como descrito

anteriormente por Bay e Oshida (1983). Os animais utilizados não apresentaram

alterações nas proporções celulares, indicando assim, que os mesmos encontravam-

se em condições ideais.

56 DISCUSSÃO

56

Uma vez que o ambiente marinho é um local prolífico quanto ao surgimento de

espécies microbianas, os organismos que nele habitam necessitam de um mecanismo

de defesa bastante eficaz. Desta forma, o equinocromo estaria atuando tanto no

combate ativo contra diversos microrganismos, quanto na modulação de suas células

fagocíticas em resposta ao desafio.

Juntos, nossos dados indicam que os esferulócitos vermelhos possuem um

papel fundamental na resposta imune inata de ouriços-do-mar, tendo sua quantidade

e degranulação elevada em diferentes condições de estresse, liberando assim o

equinocromo como resposta bactericida e ativadora da resposta fagocítica, na

tentativa de manter sua homeostase. Entretanto, o mecanismo pelo qual o

equinocromo estaria atuando para gerar essa resposta, ainda permanece

desconhecido. O sequenciamento do genoma do ouriço-do-mar Strongylocentrotus

purpuratus, demonstrou que 4 à 5% dos genes identificados no genoma estão

diretamente relacionados com funções imunológicas (Rast et al., 2006), esses genes

codificam, dentre outros, receptores que são essências para resposta imunológica.

Desta forma, o equinocromo poderia estar atuando através de algum desses

receptores transmembrana expressos.

Adicionalmente, um estudo recente de Sun e colaboradores (2013) envolvendo

a análise da expressão de dois genes codificantes de receptores TLRs – responsáveis

pelo reconhecimento de patógenos durante a resposta imune inata – em pepinos-do-

mar, mostrou um aumento na expressão destes em resposta à bactérias gram-

positivas e gram-negativas, em diferentes órgãos, mostrando uma correlação entre o

aumento da expressão de genes que codificam esses receptores com a exposição à

fatores patogênicos. Desta forma, o aumento da fagocitose poderia estar envolvido

com uma maior expressão desses receptores TLRs, que seriam induzidos pela

mudança na concentração do equinocromo em decorrência ao estresse sofrido. No

entanto, essas são apenas suposições de um mecanismo pelo qual o equinocromo

atuaria, podendo também atuar por outros receptores, ou até mesmo possuir a

capacidade de atravessar a membrana da células devido a suas característica

hidrofóbicas. Apesar de tudo, este mecanismo de atuação, permanece pouco

elucidado na literatura, fazendo-se necessário estudos aprofundados.

Nossos resultados mostram-se essenciais para o entendimento da biofisiologia

deste animal fascinante, trazendo novas perspectivas de atuação do equinocromo

durante a resposta imune inata, porém, estudos adicionais são necessários para o

57 DISCUSSÃO

57

completo entendimento do mecanismo pelo qual este pigmento atua nas células

fagocíticas de ouriços-do-mar.

58 CONCLUSÃO

58

6 CONCLUSÃO

Os resultados demonstram dados até então pouco explorados na literatura,

relacionando a função de celomócitos com o sistema imune inato de ouriço-do-mar,

onde pudemos identificar um novo papel para o equinocromo presente nos

esferulócitos vermelhos de L. variegatus.

A resposta imune inata, aqui avaliada por ensaios de fagocitose, foi modulada

positivamente com a utilização de 50 e 100 µg/ml de equinocromo, desempenhando

assim, um papel na ativação e/ou recrutamento dos amebócitos fagocíticos, onde

observou-se um aumento no número das células fagocitando.

As diferentes concentrações utilizadas de equinocromo aumentaram a

quantidade de leveduras S. cerevisiae fagocitadas por amebócito fagocítico, também

modulando positivamente essa resposta. Além disso, essa modulação aparentemente

ocorre de forma dose-dependente, uma vez que a quantidade de leveduras

internalizadas aumentam significativamente na maior concentração de equinocromo

utilizada.

Desta forma, nossos resultados demonstram que o equinocromo apresenta outra

função, além das descritas até o momento, reforçando sua atuação no sistema imune

inato de ouriços-do-mar através, também, da modulação da fagocitose.

* De acordo com: International Committee of Medical Journal Editors. [Internet]. Uniform requirements for manuscripts submitted to Biomedical Journal: sample references. [updated 2011 Jul 15]. Available from: http://www.icmje.org

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