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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MORFOLÓGICAS

ANDRESSA SILVA DE FREITAS

“ACOPLAMENTO JUNCIONAL NA ZONA

SUBVENTRICULAR: A CONTRIBUIÇÃO DA CÉLULA DE

GLIA RADIAL”

TESE APRESENTADA Á UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

COMO PRÉ-REQUISITO À OBTENÇÃO DO TÍTULO DE MESTRE EM

CIÊNCIAS MORFOLÓGICAS

RIO DE JANEIRO MARÇO 2008

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ACOPLAMENTO JUNCIONAL NA ZONA SUBVENTRICULAR: A CONTRIBUIÇÃO DA CÉLULA DE

GLIA RADIAL

TESE APRESENTADA À UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO COMO PRÉ-REQUISITO À

OBTENÇÃO DO TÍTULO DE MESTRE EM CIÊNCIAS MORFOLÓGICAS

Orientadores: Prof. João Ricardo Lacerda de Menezes Profa. Maira Monteiro Fróes

Rio de Janeiro Março 2008

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FICHA CATALOGRÁFICA FREITAS, Andressa

ACOPLAMENTO JUNCIONAL NA ZONA SUBVENTRICULAR: A CONTRIBUIÇÃO DA CÉLULA DE GLIA RADIAL / ANDRESSA SILVA DE FREITAS, RIO DE JANEIRO, 2008. xiv, 101 f

Orientador: Prof. João Ricardo Lacerda de Menezes Orientadora: Maira Monteiro Fróes Tese (Mestrado em Ciências Morfológicas) – UFRJ – Instituto de Ciências Biomédicas – Programa de Pós-Graduação em Ciências Morfológicas, 2007.

1. Comunicação juncional. 2. Célula de Glia Radial 3. Zona Subventricular. I.

Menezes, João Ricardo. II. Fróes, Maira Monteiro. III.Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de Ciências Biomédicas. Programa de Pós-Graduação em Ciências Morfológicas. IV.Título.

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“ACOPLAMENTO JUNCIONAL NA ZONA SUBVENTRICULAR: A CONTRIBUIÇÃO DA CÉLULA DE GLIA RADIAL”

TESE APRESENTADA À UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO COMO PRÉ-REQUISITO À

OBTENÇÃO DO TÍTULO DE MESTRE EM CIÊNCIAS MORFOLÓGICAS

Aprovada por: Prof. Dr. _________________________________________

Prof. Vivaldo Moura Neto Presidente da Banca

Prof. Dr. _________________________________________

Prof. João Ricardo Lacerda de Menezes Membro

Prof. Dr. _________________________________________

Prof. José Garcia Ribeiro Abreu Jr Revisor e membro

Prof. Dr. _________________________________________

Profa. Luis Anastacio Alves - Fiocruz Membro

Prof. Dr. _________________________________________ Prof. Jean Christophe Houzel Membro

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A percepção do desconhecido é a mais fascinante das experiências. O homem que não tem os olhos abertos para o misterioso

passará pela vida sem ver nada. Albert Einstein

v

A minha família, pilar de minha existência.

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AGRADECIMENTOS

“A felicidade é um susto. Chega na calada da noite, na fala do dia, no improviso

das horas. Felicidade é animal arisco. Tem que ser admirada à distância porque não aceita a jaula que preparamos para ela. Vê-la solta e livre, no campo, correndo com sua velocidade tão elegante é uma sublime forma de possuí-la. Felicidade é chuva que cai na madrugada, quando dormimos. O que vemos é a terra agradecida. Felicidade é coisa que não tem nome. É silêncio que perpassa os dias tornando-os mais belos e falantes. Felicidade é carinho de mãe em situação de desespero. É olhar de amigo em horas de abandono. Felicidade é palavra pouca que diz muito. É frase dita na hora certa e que vale por livros inteiros. Eu busco a frase de cada dia, o recado de Deus escrito na minha geladeira... O que quero é o olhar de Jesus refletido no olhar de quem amo. Isso sim é felicidade sem medidas. O café quente na tarde fria, a conversa tão cheia de humor, o choro de vez em quando. Felicidades pequenas... A felicidade é coisa sem jeito, mas com ela eu me ajeito. Não forço para que seja como quero, apenas acolho sua chegada, quando menos espero. E então sorrio...”. (texto de Pe. Fábio de Melo)

Como dizia Albert Eisntein, no meio da dificuldade reside a oportunidade. E fazer

uma tese é uma dificuldade porque além de toda a problemática, e como diria Leo

Morita, sofrimento que o ato em si já implica não se deve esquecer que a ciência é feita

por pessoas aparentemente normais, segundo João Ricardo. Mas apesar de tudo, foi

uma boa oportunidade para conhecer e reconhecer meus verdadeiros objetivos na vida,

meus verdadeiros amigos e companheiros, pois estes estiveram ao meu lado tanto no

“rise” quanto no “fall”.

Sendo assim, eu gostaria de agradecer primeiramente a Deus, meu pai superior

que me permitiu chegar até aqui e me deu de presente a companhia de pessoas

maravilhosas.

Gostaria também de agradecer a minha família, minha mãe Marlene, forte como

uma leoa, protegendo-me em todos os momentos e me levando comida, porque comer

definitivamente não é minha atividade predileta. Meu pai Onair, que sempre me mostrou

que devo defender minhas idéias mesmo que seja para argumentar a favor do

Flamengo. Meu irmão Leonardo, gênio na informática, ajudando-me a ter calma, dar

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boas risadas e mostrando-me que a vida segue seu rumo sempre. Meus lindos avós

Juracy e Alcides que sempre torceram por mim e me ajudaram a ter fé.

Meu amado chefe João. Acho que já falei, mil vezes, que te admiro muito e quero

ser assim quando crescer (a parte científica que fique bem claro...). Cientista brilhante,

dono de uma memória invejável, pessoa maravilhosa que sabe ser sensível, amigo,

pai... muito obrigado pela confiança e paciência, essa última em doses cavalares por

sinal.

Minha querida co-orientadora Maira, sua inteligência é impressionante, você me

ensinou a ser disciplinada, determinada e corajosa, meu exemplo na carreira e na vida.

Minha querida Cecília, sempre perspicaz você me ensinou a ser autocrítica, uma

tarefa difícil. Tenha certeza que sempre ouvia sua voz no meu subconsciente antes de

cometer os mesmos erros...

Meu revisor José Garcia, obrigado pela confiança.

Tem irmãos que a vida te dá de presente como uma benção e eu recebi uma,

essa é Carla Moreira. Minha amiga, irmã, colaboradora ... eu amo essa menina. Não sei

o que seria de mim sem ela. Essa tese também é sua, muito obrigada por tudo e, não

pense que acabou...

Meus queridos amigos do LNC Áurea, mesmo longe você é um exemplo para

mim. Ana Cristina, muito obrigado pelas conversas, pela orelha... menina sábia, quero

ser assim.

Léo Morita, você sempre me ensina que o silencio às vezes é sábio, mas eu sou

uma tagarela... fazer o que. Anna Lenice, minha aluninha amada você ensina que a

responsabilidade de aprender é ensinar porque o conhecimento só é válido quando se

pode passar. Dudu, rapaz inteligentíssimo que me mostrou que a vida sempre tem que

continuar. Todos os amigos do LNC, Luciana Nogarolli, José Eduardo... obrigado pela

amizade. Meus queridos ICs Leonardo, Elisa Sasse obrigado por me mostrar que a

inocência é uma maravilha.

Aos meus amigos do Departamento, Alexandra, Antonia, Adiel, Jane e muitos

outros que não caberiam nessa página. A convivência com todos foi um prazer imenso.

viii

Luciana Romão e Karla Menezes, sempre tentando diminuir meu tempo com meu

orientador. Obrigada por me ensinar a dividir (mesmo que vocês tenham feito isso

exageradamente).

Ah...

E por fim obrigada à vida, que hoje me dá a oportunidade de recomeçar.

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Andressa Silva de Freitas

ACOPLAMENTO JUNCIONAL NA ZONA SUBVENTRICULAR: A CONTRIBUIÇÃO DA CÉLULA DE GLIA RADIAL

Tese de Mestrado, apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Morfológicas (Neurobiologia do Desenvolvimento), Departamento de Anatomia, no Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências Morfológicas (Neurobiologia do desenvolvimento).

Esta tese foi desenvolvida, no Laboratório de Neuroanatomia Celular, sob a orientação do Prof. João Ricardo Lacerda de Menezes e co-orientação da Profa. Maira Monteiro Fróes e contou com o apoio financeiro das seguintes entidades: CAPES, CNPq, CNPq/PRONEX , FAPERJ, FUJB.

Rio de Janeiro 2008

x

Resumo

Nesse estudo analisamos a contribuição específica da célula de glia radial (CGR) para

o acoplamento celular mediado por junções comunicantes na zona subventricular (SVZ)

pós natal. Para tanto, desenvolvemos uma técnica para revelar o acoplamento mediado

por corantes in situ envolvendo o carregamento direto pelos prolongamentos piais da

CGR usando uma mistura de fluorocromos permeante (lucifer yellow, LY) e não

permeante juncional (rodamina-conjugada dextran 3KDa, RD). Secções de criostato e

vibratomo foram analisadas para identificar as células carregadas diretamente

(LY+RD+) ou acopladas (LY+RD-) na SVZ. Células LY+RD+ foram restritas a regiões

abaixo o carregamento pial. O acoplamento celular apresentou uma distribuição

espacial bimodal com um gupo de células próximo a luz ventricular e outro à superfície

externa da SVZ. Este padrão manteve-se durante toda a primeira semana pós-natal. A

ausência de expressão pelas células acopladas de marcadores de neuroblastos indicou

que o acoplamento das CGR é aparentemente homocelular. Tratamentos de bloqueio

de junções comunicantes diminuíram o número de células acopladas. O extenso

acoplamento celular a partir de CGR na SVZ sugere uma possível regulação em

funções neurogênicas e na regionalização na desta camada.

xi

ABSTRACT

In this study, we have analyzed the specific contribution of the cortical radial glia (RG)

for cellular junctional coupling within the postnatal subventricular zone (SVZ). To

specifically target RG as sources of dye-coupling in situ, we have developed a new

technique that involves direct cell loading through the processes that reach the pial

surface, using a mix of gap junction permeant (lucifer yellow, LY) and non-permeant

(rhodamine-conjugated dextran 3KDa, RD) fluorochromes. Cryostat or vibratome

sections were analyzed for identification of directly loaded (LY+RD+) or coupled cells

(LY+RD-) in the SVZ. LY+RD+ cells were restricted to the region underlying the pial

loading surface area. Coupled cell were distributed in a bimodal manner, with coupled

chains in the dorsal surface of the SVZ and in the region aligning the ventricle, leaving

the SVZ core relatively free of coupled cells. Coupling by RG seems to be mostly

homocellular. Blocking gap junctional communication prior to pial loading greatly

reduced or abolished dye coupling. The participation of RG in extensive cell coupling

suggests a possible role in regulation of neurogenesis and regional specialization of the

postnatal SVZ.

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Lista de Abreviaturas

AJ – acoplamento juncional

BLBP – Proteina cerebral ligante de lipideos (do inglês, brain lipid binding protein)

BrdU – bromodeoxiuridina

CBX – Carbenoxolone

CGR - célula de glia radial

CP – placa cortical (do inglês, cortical plate)

Ctx – córtex cerebral

Cx - conexina

DAPI - 4’,6’-diamidina-2’-fenilindol

DNA – ácido desoxirribonucleico

EGL – camada granular externa do cerebelo (do inglês, external granular layer)

GABA – ácido -aminobutírico

GFAP – proteína acídica fibrilar glial (do inglês glial fibrilary acid protein)

GFP – proteína fluorescente verde (do inglês green fluorescent protein)

GLAST - transportador de glutamato específico de astrócitos (do inglês glutamate

astrocity specific transporter)

IZ – zona intermediária (do inglês, intermediate zone)

LGE – eminência ganglionar lateral (do inglês, lateral ganglionar eminence)

LY – Lucifer Yellow

MGE – eminência ganglionar medial (do inglês, medial ganglionar eminence)

MZ – zona marginal (do inglês, marginal zone)

PBS – solução salina tamponada com fosfato

PSA-NCAM – Molécula de adesão neural polisialilada (do inglês, polysialylated neural

cell adsion molecule)

PFA - paraformaldeído

RD – Rodamina Dextrana

RMS – via migratória rostral (do inglês, rostral migratory stream)

GSS – solução salina de Gey (do inglês, Gey´s salt solution)

SVZ – zona subventricular (do inglês, subventricular zone)

xiii

TA – temperatura ambiente

vl – ventrículo lateral

VZ – zona ventricular (do inglês, ventricular zone)

WM – substância branca (do inglês, white mater)

Ca2+ - livre de Ca2+

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SUMÁRIO

I. Introdução 01 1. Camadas Germinativas 02

1.1. Zona Subventricular pós-natal 03 2. Compartimentalização nas camadas germinativas 07 3. Neurogênese Pós-Natal 12 4. Célula de Glia Radial 14 5. Junções Comunicantes 17

5.1 Junções Comunicantes no SNC 20 6. Junções Comunicantes e Camadas Germinativas 24 II. Objetivos 32 1. Objetivos Específicos 32 III. Metodologia 33 1. Animais e Anestesia 33 2. Carregamento Pial 33 3. Injeção Intraventricular de Carbenoxolone 35 4. Excesso de Cálcio Extracelular 36 5. Marcação com Carbocianina 36 6. Imuno-histoquímica e análise 36 IV. Resultados 38 4.1. Células carregadas pelos corantes na SVZ apresentam uma distribuição bimodal

41

4.2. Células carregadas pelos corantes na SVZ são glia radial 44 4.3. Células carregadas pelos corantes não são marcadas por captação inespecífica

46

4.4. Células LY-positivas são Beta III tubulina negativas 48 4.5. Agentes desacoplantes diminuem a incidência de perfis celulares monomarcados na SVZ/RMS

50

V. Discussão 53 5.1. Considerações técnicas 53 5.2. O acoplamento celular é aparentemente homocelular 56 5.3. O acoplamento celular evidenciado por corantes possivelmente é mediado por junções comunicantes

57

5.4. A célula de glia radial na dinâmica da SVZ 60 VI. Conclusões 65 VII. Referências Bibliográficas 66

1

I. Introdução .

A capacidade de regeneração do sistema nervoso central no adulto é limitada.

Apesar disso, a capacidade de gerar novos neurônios é mantida em regiões específicas

do cérebro maduro. Entender os fatores que influenciam essa capacidade pode ser de

crucial importância para futuras terapias de reposição celular de tecidos lesionados.

Dentre os fatores que podem influenciar a proliferação celular nestas regiões

estão as interações celulares do tipo junção comunicante do tipo gap. Em trabalho

anterior, nosso grupo mostrou que a região germinativa conhecida como zona

subventricular (SVZ), presente no período pós-natal, apresentava acoplamento celular

evidenciado por corante de baixo peso molecular, sugestivo da existência de junções

comunicantes entre algumas de suas células (Menezes et al., 2000; Marins, 2006). No

entanto, não foi possível, na ocasião, identificar os tipos celulares envolvidos nesta

rede.

A SVZ pós-natal é composta primordialmente por neuroblastos migratórios,

progenitores intermediários, astrócitos, e corpos celulares de glia radial (Alves et al.,

2002; para revisão, Menezes et al., 2002). Buscando descobrir quais seriam os

parceiros celulares cuja interação é promovida por junções comunicantes na SVZ,

desenvolvemos uma técnica in situ de carregamento intracelular de fluorocromos de

baixo peso molecular que revela redes de acoplamento celular. Esta metodologia é

capaz de carregar diretamente células da glia radial (CGR), através de seus pedículos

que se ramificam logo abaixo da superfície pial, evidenciando a distribuição espacial de

células acopladas a partir deste tipo celular específico.

2

Uma vez que as células de glia radial parecem ter múltiplos papéis no

desenvolvimento, e.g., como progenitores de neurônios e glia, e, como importantes

substratos para migração neuronal, torna-se fundamental entender a relevância das

junções comunicantes para este tipo celular. É necessário entender se promovem a

interação entre células de diferentes tipos, em diferentes estágios de diferenciação e

principalmente se exercem um papel importante na regulação de proliferação, migração

e diferenciação na zona subventricular.

1. Camadas Germinativas .

Todas as células do sistema nervoso são geradas, direta ou indiretamente, a partir

de duas regiões germinativas principais chamadas de zona ventricular (ventricular zone

- VZ) e subventricular (subventricular zone - SVZ; Boulder Committee, 1970; Jacobson,

1991; Bayer e Altman, 1994; Takahashi et al., 1995). Essas camadas geram neurônios

e células gliais (Temple e Quian, 1996; Kriegstein e Noctor, 2004). Após o fechamento

do tubo neural, as células que compõem o neuroepitélio germinativo apresentam um

grande potencial proliferativo, e formam uma camada que envolve a luz dos ventrículos

cerebrais, designada de zona ventricular (Boulder Comitee, 1970; Rakic, 1974;

Caviness, 1982). Esta camada é um epitélio pseudo-estratificado, transitório, altamente

proliferativo (Jacobson, 1991; Shimada e Langman, 1970) que apresenta um padrão

específico de deslocamento dos núcleos celulares, conhecido como migração nuclear

intercinética, cuja posição baso-apical depende da fase do ciclo mitótico (Sauer, 1935).

Na fase S (de síntese de DNA) estes núcleos aproximam-se da borda mais externa da

3

VZ, no limite com a zona intermediária (Sauer, 1935; Takahashi et al., 1992, 1993).

Acredita-se que no período perinatal em roedores a VZ se reduza às células do

epêndima (Tramontin et al., 2003; Altman e Bayer, 1990). O epêndima reveste a luz dos

ventrículos (e também o canal central da medula) e é composto por células colunares

compactadas, que apresentam cílios direcionados para a luz ventricular (Spassky et al.,

2005; Boulder Comittee, 1970). No telencéfalo, tardiamente, mas ainda no período

embrionário, uma segunda camada germinativa emerge, a zona subventricular (SVZ),

que se desenvolve como camada sucessora da VZ no papel de sitio neurogênico

(Alvarez-Buylla et al., 2002.)

Algumas regiões do SNC apresentam proliferação celular persistente no período

pós-natal como, a VZ (Tramontin et al., 2003), a SVZ (Allen, 1912), o hipocampo

(Altman e Das, 1965) e a camada granular externa do cerebelo (External Granular

Layer - EGL - Miale e Sidman, 1961), dentre outras (Gould et al., 1999; Horner et al.,

2000). Entretanto, no adulto, apenas a SVZ telencefálica e a camada subgranular do

giro denteado persistem como zonas neurogênicas ativas (Emsley et al., 2005).

1.1. Zona Subventricular pós-natal

No período embrionário a SVZ está localizada imediatamente suprajacente a VZ

e se estende ao redor da mesma, desde a parede lateral posterior do ventrículo lateral

até a sua porção mais rostral (Altman e Bayer, 1990; Privat, 1972). Seu aparecimento é

concomitante à neurogênese cortical (Altman, 1969). Suas células são arredondadas ou

ovais, apresentando-se em vários níveis através da espessura da camada, e não

4

sofrem migração nuclear intercinética, como as células ventriculares (Boulder

Commitee, 1970).

No período pós-natal, é também chamada de camada subependimária, por estar

localizada imediatamente externa ao epêndima. Concomitante à regressão da VZ, a

camada subventricular muda suas características, aumentando seu potencial

proliferativo e tornando-se mais densa (Takahashi et al., 1995b). Na sua porção cortical

é revestida externamente pela substância branca (Alvarez-Buylla e Ihrie, 2007).

A composição e a organização tridimensional da SVZ adulta de mamíferos foi

descrita através de critérios ultra-estruturais e imunocitoquímicos (Doetsch et al., 1997).

Três tipos celulares principais foram identificados: (1) neuroblastos ou células tipo A; (2)

astrócitos ou células tipo B, subdivididas em B1 e B2; e (3) células indiferenciadas ou

tipo C, que podem corresponder a precursores indiferenciados, entendidos atualmente

como células precursoras amplificadoras (Doetsch et al., 2002). Formando a parede

ventricular e separando a SVZ do liquido céfalo-raquidiano encontram-se células

ependimárias.

Células tipo A com morfologia alongada e um prolongamento líder, acompanhado

de um cone de crescimento, são encontradas em agregados formando cadeias

tangencialmente orientadas, paralelas à parede do ventrículo (Lois et al., 1996;

Wichterle et al., 1997). Estas expressam marcadores neuronais precoces como classe

III beta-tubulina (Menezes et al., 1995) e PSA-NCAM, (Hu et al., 2000) e são

considerados verdadeiros neuroblastos. Estes neuroblastos formam cadeias

migratórias, estendendo-se da SVZ até o bulbo olfatório (Fig. 1), sem dispersão,

embainhadas por estruturas semelhantes a túneis, formadas por astrócitos (Peretto et

5

al., 1997; Doetsch et al., 1997). As células tipo C, com alto potencial proliferativo, são

marcadas positivamente para nestina e agrupadas em clusters próximos às cadeias de

células tipo A (Doetsch et al., 1997), são considerados como progenitores

intermediários amplificadores, com uma capacidade multipotente restrita (Doetsch et al.,

2001). Quanto aos astrócitos, as células tipo B, ainda não existe definição se estes

correspondem a dois tipos diferentes ou dois estágios de um mesmo tipo astrocitário

(Doetsch, et al., 1997, 1999; Alves et al., 2002; Menezes et al., 2002). São

considerados como as células-tronco neurais presentes na SVZ pós-natal e do adulto

(Doetsch et al., 1999; Garcia et al., 1998).

Figura 1. Neurogênese na SVZ adulta (A) Secção coronal de um cérebro de rato adulto. O azul claro mostra o ventrículo lateral (LV, lateral ventricle, do inglês), espaço preenchido por fluido cérebro-espinhal. (B) Arquitetura celular da SVZ. Célula B (azul escuras) são os astrócitos que podem cumprir uma dupla função como células-tronco da SVZ e também estrutural compondo a formação do nicho celular neurogênico. Algumas das células B tocam o lúmen ventricular e tem um cílio único. As células tipo C (verdes) são de divisão rápida, células de amplificação transitória derivadas das células B. Células tipo C dão origem a células A (vermelhas), neuroblastos que migram para o bulbo olfatório onde se tornam interneurônios locais. Vasos sanguíneos (BV, do inglês blood vessel; rosa) são mostrados com macrófagos perivasculares (pontilhado), lamina basal (BL, do inglês basal lamina; amarela) que se estende desde os vasos sanguíneos e se interdigita extensivamente pelas células da SVZ. As células ependimárias ciliadas (cinzas) revestem as paredes do ventrículo (C) Linhagem de células da SVZ. Retirado de Alvarez-Buylla e Lim (2004).

6

Durante as primeiras semanas pós-natais ocorre a migração massiva de

neurônios e neuroblastos saídos da SVZ que migram por dentro da extensão anterior

da própria SVZ (Fig. 2; também chamada de fluxo migratório rostral; RMS, do inglês

rostral migratory stream) em direção ao bulbo olfatório, para gerar os interneurônios

granulares e periglomerulares (Altman, 1969; Kishi et al., 1990; Luskin, 1993; Lois e

Alvarez-Buylla, 1994).

Figura. 2. Esquema sagital do encéfalo adulto, com o bulbo olfatório (OB) à esquerda e o cerebelo à direita. A SVZ se entende lateralmente ao ventrículo lateral (LV). Novos neurônios são constantemente produzidos na SVZ. Esses novos neurônios tornam-se alinhados em longas cadeias formando uma complexa rede interconectada na SVZ. Muitas dessas cadeias na SVZ anterior conectam-se a RMS que os leva ao OB. No OB, essas células se dispersam radialmente como células individuais e completam sua diferenciação como interneurônios granulares e periglomerulares. Retirado de Alvarez-Buylla (2002)

A SVZ é um importante sítio germinativo que mantém o potencial proliferativo por

toda a vida (Tropepe et al.,1997). Sendo assim, há grande expectativa de que seu

potencial neurogênico tenha aplicações terapêuticas. A substituição celular é uma

demanda para a recuperação de várias doenças neurodegenerativas. Até o momento,

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não existem terapias neuroprotetoras eficazes em prevenir a perda celular; além disso,

grande parte desta perda celular acontece antes do diagnóstico patológico.

Novos neurônios e/ou oligodendrócitos podem ser produzidos a partir de várias

células-tronco e precursores neurais, embrionários ou adultos (Zhao et al., 2008, Lathia

et al., 2007, Menn et al., 2006), porém a eficácia relativa destas matrizes para fins

terapêuticos não está ainda bem estabelecida. Além disso, o transplante celular

objetivado por muitas pesquisas pode ter inúmeras complicações naturais de qualquer

transplante alôgenico, de ordem imunológica, logística ou econômica. Uma alternativa,

e, possivelmente, uma terapêutica complementar seria manipular o destino e o

comportamento in vivo de células-tronco intrínsecas ao sistema nervoso central (SNC)

pós-natal e adulto (Sohur et al., 2006).

2. Compartimentalização nas camadas germinativas .

A importância da compartimentalização de tipos celulares é reconhecida em

estudos de desenvolvimento de invertebrados desde antes da era da biologia

molecular. Foi postulado que barreiras de compartimentalização possuem duas funções

durante o desenvolvimento: (i) não permitir a mistura de células que contribuem para

diferentes destinos durante a embriogênese e, (ii) prover informação posicional para

populações celulares vizinhas. Acredita-se assim que estas barreiras sejam essenciais

para a coordenação do crescimento e a padronização de um embrião que cresce

rapidamente em tamanho e complexidade (Kiecker et al., 2005).

8

Historicamente, diferentes mecanismos foram propostos para estabelecer a

restrição de linhagens celulares, tanto entre compartimentos como entre camadas

germinativas. Em 1960, Holtfreter Steinberg e colegas propuseram que diferentes

propriedades adesivas da superfície celular seriam responsáveis por esse fenômeno.

No encéfalo, as barreiras inter-romboméricas expressam marcadores específicos

e são caracterizadas por um maior espaço intercelular, pelo acúmulo de células de glia

radial, por componentes de matriz extracelular e pela formação precoce da zona

marginal (Puelles e Arouca, 2005). Todas essas características poderiam funcionar

como mecanismos de barreira celular. Contudo, nenhuma mistura entre tipos celulares

dos rombômeros é observada após a ablação dessas barreiras (Nittenberg et al., 1997;

Guthrie e Lumsden, 1991). Essas observações indicam que a formação das barreiras

celulares não é a causa primária da restrição celular entre os rombômeros (Kiecker et

al., 2005). Ainda assim, devido a sua prevalência, a formação de barreiras e a atividade

dos centros de sinalização local devem desempenhar um papel chave no

desenvolvimento do sistema nervoso de vertebrados.

Em se tratando da SVZ pós-natal, sua divisão foi proposta em dois

compartimentos distintos (Luskin, 1993), que não apresentam uma barreira morfológica

clara, mas que refletem dois potenciais genéticos básicos ao longo de sua extensão. De

acordo com Luskin, a porção anterior da SVZ adjacente ao terço anterior do ventrículo

lateral, (SVZa; Luskin, 1993), mais espessa, seria principalmente responsável pela

geração de neurônios destinados ao bulbo olfatório. Outra porção, menos espessa e

que ocupa o terço posterior do ventrículo lateral, chamada SVZ posterior, foi apontada

como sendo responsável pela produção exclusiva de células gliais para o córtex

cerebral (Luskin, 1993). Contudo, esta proposta inicial de compartimentos não se

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confirmou, tendo-se demonstrado, anos mais tarde que, mesmo em idades pós-natais

jovens, a porção posterior é capaz de gerar neuroblastos (Suzuki et al., 2003). Esta

divisão funcional também não foi demonstrada na SVZ do adulto (Doetsch et al., 1997).

Apesar desta hipótese ter sido descartada, novas evidências demonstram claramente a

regionalização do trajeto SVZ/RMS; a presença de precursores restritos, que geram

apenas subtipos de interneurônios, é relatável ao longo de todo o trajeto da SVZ/RMS,

do córtex ao bulbo olfatório, tanto no eixo ântero-posterior (Hack et al., 2005), como no

médio-lateral, e envolvem domínios intra- e inter-telencefálicos (Kelsch et al., 2007,

Merkle et al. 2007; Marchis et al., 2007; Seri et al., 2006).

Pode-se ainda considerar a formação de compartimentos celulares intra-regionais,

como a formação de microdomínios (fisiológicos) e de nichos (morfológicos) para a

manutenção de células especificas. Em relação à SVZ/RMS, existem evidências de que

a distribuição celular não é homogênea como se poderia supor da observação por

técnicas histológicas comuns. Por exemplo, células em fase-S estão preferencialmente

localizadas nas bordas interna e externa da SVZ/RMS durante os 10 primeiros dias pós

natais (Menezes et al., 1998). Sabe-se também que há a formação de pequenos grupos

e de grandes cadeias de células acopladas através de junções comunicantes na borda

externa da SVZa (Menezes et al., 2000). Há ainda a concentração de corpos de células

de glia radial na interface SVZ/WM, formando possivelmente uma borda de

confinamento para a SVZ/RMS (Alves et al., 2002). A formação de ilhas de proliferação

após a ativação da sinalização de receptores tirosina kinase Eph/efrinas (Conover et al.,

2000), e um conjunto de outras evidências apontam para uma distribuição heterogênea

de tipos celulares e moleculares no interior da SVZ/RMS (Fasolo et al., 2002; Merkle

2004; Marshall e Goldman, 2002). Esses achados sugerem fortemente que, apesar da

10

aparente homogeneidade morfológica, a SVZ pode ser dividida em compartimentos

celulares discretos (Peretto et al., 2005).

Estudos de imuno-histoquímica realizados na SVZ sugerem que a população glial

pode ser heterogênea, por exemplo, quando parte dos astrócitos da SVZ continuam a

expressar vimentina e nestina, apesar da pequena diferença observada em níveis ultra-

estruturais (Doetsch et al.,1997). Combinando estudos morfológicos e funcionais

estima-se que 12% das células da SVZ são GFAP positivas mas somente 1% das

células geram neurosferas (Doetsch et al., 1999) indicando que nem todos os astrócitos

são células-tronco.

Esta sugestão de micro-domínios e de distribuição heterogênea de células na

SVZ/RMS pós-natal e adulta fica ainda mais relevante quando se considera que esta

camada é um rico sitio de células-tronco neurais.

As células-tronco são responsáveis pelo crescimento, homeostase e o reparo

dos tecidos. A manutenção e a sobrevivência destas células são reguladas por

sinalizações do seu micro-ambiente, referido como “nichos de células-tronco”. A

hipótese dos nichos foi desenvolvida por Schofield (1978) que propôs que as células-

tronco residem em compartimentos fixos ou nichos que são responsáveis pela

manutenção das propriedades definitivas das células-tronco. Postula-se então que o

nicho representa um compartimento anatômico definido que provêm sinais para as

células-tronco. Sinais estes que regulam a função destas células tanto em

invertebrados quanto em vertebrados, por exemplo: controlam o destino das células-

filhas, protegem da exaustão e da morte; provêm suporte estrutural, trófico, informação

topográfica e pistas fisiológicas apropriadas. (Jones e Wagers et al., 2008).

11

Estudos em modelos de Drosophila melanogaster e Caenorhabditis elegans

revelaram algumas características dos nichos de células-tronco que são importantes

para controlar seu comportamento. Primeiramente, sinais emanados deste nicho

regulam a auto-renovação, sobrevivência e manutenção das células-tronco (Jones e

Wagers et al., 2008, Kimbel et al., 1981; Henderson et al., 1994; Xie et al., 2000). Em

segundo lugar, a relação espacial particular entre as células-tronco e as células de

suporte pode provocar a polarização das primeiras para promover divisões assimétricas

(Deng et al., 1997; Yamashita et al., 2003). Em terceiro lugar, a adesão entre as

células-tronco e as células de suporte e/ou as moléculas de matriz extracelular ancoram

as células ao nicho promovendo a auto-renovação e os sinais para sobrevivência

celular (Song et al., 2002).

Sintetizando muitos estudos, pode se propor uma hipótese sobre os

componentes necessários para compor nichos de célula-tronco: 1. a célula-tronco

propriamente dita; 2. as células de suporte (O exemplo clássico sendo as celulas

estromais da medula óssea) que interagem diretamente com as células-tronco, através

de junções comunicantes, fatores solúveis, proteínas de matriz extracelular que podem

promover a estrutura, organização e sinais mecânicos para o nicho; 3. vasos

sanguíneos, que provêem o nicho germinativo de lâmina basal cuja composição parece

ser necessária para sua manutenção (Nikolova et al., 2007). Estes também trazem

sinais sistêmicos e promovem a condução e o recrutamento de células inflamatórias e

outras células ao nicho germinativo; 4. inervação e sinais neurais que podem comunicar

informações fisiológicas distantes ao micro-ambiente do nicho (Jones e Wagers et al.,

2008). Apesar de nem todos os nichos necessariamente apresentarem todos esses

componentes, fica claro que o nicho representa uma entidade complexa e dinâmica

12

onde a integração de múltiplos sinais são necessários para a manutenção da função e

do número das células tronco. Na SVZ, os componentes que conferem a esta região

características de nicho germinativo ainda não são completamente conhecidos. A CGR

tem o duplo potencial de ser um importante componente do nicho germinativo da SVZ e

também contribuir ela mesma como célula-tronco. A interação através de junções

comunicantes pode ser relevante na regulação das funções da CGR no nicho

germinativo da SVZ, como encontrado para outros exemplos de nichos de células-

tronco (para revisão, Jones e Wagers et al., 2008; Trosko, 2007; Worsdorfer et al.,

2008; Todorova et al., 2008)

3. Célula de Glia Radial .

As células de glia radial foram primeiramente visualizadas através do método de

Golgi e existem sugestões de que Magini (1894) tenha sido seu primeiro observador.

Logo após, Santiago Ramon y Cajal confirmou os achados em embriões de galinha (V.

Bentivoglio e Mazzarello, 1999) . Na época, porém, ainda não existia a nomenclatura

clássica de células de glia radial, sendo então chamadas de fibras radiais ou

ependimárias. (Bentivoglio e Mazzarello, 1999).

A função e o refinamento da descrição, além da denominação “célula de glia

radial” datam do inicio da década de 70, com os trabalhos de Pasko Rakic (1971, 1972).

Neste trabalho, em fetos de primatas, a CGR foi descrita como sendo uma célula

bipolar simples, núcleo ovóide localizado dentro das camadas germinativas, um curto e

fino prolongamento aderido à parede ventricular e um longo e fino prolongamento no

13

pólo oposto, com sua extremidade arborizando na camada molecular e terminando na

superfície pial onde forma a membrana limitante glial externa (Fig. 3; Rakic, 1972;

Peters e Feldman 1973; Misson et al., 1991; Kettenmann e Ransom, Neuroglia, 1995)

além do acúmulo de glicogênio no citoplasma (Choi, 1981).

Figura 3. Citoarquitetura das células de Glia Radial. (A) Reconstrução tridimensional esquemática da porção medial do parênquima cerebral ao nível da fissura calcarina em um feto de macaco (80 dias). A reconstrução ilustra como cada ponto na VZ é conectado pelas fibras de RG que se expandem por todo o parênquima cerebral. (B) Reconstrução tridimensional de neurônios migratórios baseado em eletromicrografia de lobo occipital de fetos de macacos. Retirado de Rakic (1972).

A glia radial possui características astrocitárias pois expressa moléculas como a

proteína acida fibrilar glial, a GFAP (do inglês, glial fibrillary acidic protein), a proteína

cerebral ligante de lipídeos, BLBP (do inglês, brain lipid binding protein) e o

transportador específico de glutamato, GLAST (do inglês glutamate astrocyte

transporter) todas específicas de astrócitos maduros (Hartfuss et al., 2001). Por outro

lado, a célula de glia radial também compartilha características moleculares com células

progenitoras, como o marcador de precursores neurais, nestina (Frederiksen e McKay,

1988).

14

As células de glia radial são consideradas como uma população celular transitória

e de ocorrência precoce no desenvolvimento do SNC, antes mesmo da neurogênese

cortical (Schmechel e Rakic, 1979; Campbell e Gotz, 2002; Huttner e Gotz, 2005;

Gressens et al., 1992) e são ubiquitárias no SNC (Huttner e Gotz, 2005; Anthony et al.,

2005; Edwards et al., 1990). Aumentam significativamente em número durante a

neurogênese e migração neuronal (Levitt e Rakic, 1980), e em geral desaparecem

rapidamente após o nascimento (Schmechel e Rakic, 1979; Voigt, 1989; Pixley e Vellis,

1984).

No córtex cerebral, logo após o fim do período neurogênico, as CGR abandonam

a camada germinativa cortical e migram radialmente concomitantes com sua

transformação em astrócitos que povoarão o córtex cerebral (Noctor e Kriegstein, 2004;

Rakic, 2005; Noctor et al., 2005). Por outro lado, algumas CGR subcorticais

aparentemente dão origem a interneurônios do bulbo olfatório durante a primeira

semana pós natal (Merkle et al., 2005; Tramotin et al., 2004).

Inicialmente a célula de glia radial foi estudada somente como célula suporte para

a migração, onde os neurônios recém-gerados se atrelam as CGR e migram

radialmente para a placa cortical (Rakic, 1995), e um precursor de células astrocitárias.

Mas, evidências demonstram que as células de glia radial também geram neurônios

durante o desenvolvimento embrionário (Kriegstein e Gotz, 2003; Kriegstein e Noctor,

2004; Malatesta et al., 2000; Miyata et al., 2001). Hoje já se sabe que a célula de glia

radial (CGR), apesar de sua aparente natureza glial, é um progenitor multipotente e da

origem em sua maioria a neurônios (Anthony et al., 2004; Campbell e Gotz 2002;

Weissman et al., 2003).

15

Em estudo anterior mostramos que a CGR cortical tem um curso muito mais

protraído em sua transformação astrocitária do que se pensava, mantendo-se na SVZ

(Alves et al. 2002). Isso leva a possibilidade de que a CGR cortical pode gerar não

somente astrócitos para o córtex cerebral, mas pode ser também fonte de

astrócitos/progenitores que povoam a SVZ/RMS pós natal.

4. Neurogênese Pós-Natal .

Evidências de neurogênese pós-natal foram obtidas ainda nos anos 60 (Altman,

1969), e na década de 80 (Kaplan, 1980). Esses resultados provocaram uma reação

negativa no meio científico gerando outras publicações que não confirmaram o achado

(para revisão, Kaplan, 2001). Ironicamente no mesmo período, estudos seminais sobre

neurogênese em pássaros com canto sazonal foram publicados (Alvarez-Buylla e

Nottebohm, 1988), sem no entanto causar um impacto imediato no entendimento e

avaliação da relevância da neurogênese para o cérebro maduro em outros vertebrados

(Kaplan, 2001). Hoje sabe-se que a neurogênese persiste na fase adulta (Zhao et al.,

2008; Ihrie et al., 2008; Sutter et al., 2007; Emsley et al., 2005) e que a SVZ mantém-se

ativa gerando interneurônios para o bulbo olfatório, pela rota migratória rostral (Altman,

1969; Lois e Alvarez-Buylla, 1993). No hipocampo viu-se que a neurogênese persiste

na fase adulta na camada subgranular do giro denteado estando correlacionada com a

memória (Sahay e Hen, 2007; Shors et al., 2002; Magavi et al., 2005).

Apesar do grande interesse pelo assunto há ainda muito para entender nesse

fenômeno. A identificação de marcadores que diferenciam os diferentes tipos celulares

16

e progenitores ainda é um importante problema (Svendsen et al., 2001). Muitas das

sinalizações moleculares que permitem a neurogênese e a regulação da proliferação na

SVZ ainda permanecem desconhecidas (Zhao et al., 2008).

Vários estudos apontaram evidências de neurogênese também em outras

regiões como no neocortex (Gould et al, 2001), corpo estriado (Luzzati et al., 2006),

hipotálamo (Kokoeva et al., 2005) e substancia negra (Zhao et al., 2003), no entanto,

estes ainda são controversos (Gould, 2007, Emsley et al., 2005). Algumas evidências

indicam que células precursoras endógenas podem de fato dar origem a neurônios

maduros no córtex cerebral de camundongos adultos em resposta à morte celular

induzida de neurônios de projeção (Magavi et al., 2000). Outros estudos demonstraram

que apesar da maciça proliferação que pode ser observada no córtex adulto em

resposta a lesões isquêmicas esta não é capaz de gerar novos neurônios (para revisão

ver Wiltrout et al., 2007). Desta forma apesar da controvérsia que cerca o assunto, as

únicas regiões universalmente aceitas como receptoras de novos neurônios funcionais

na fase adulta são o bulbo olfatório e o hipocampo (Emsley et al., 2005).

Outra questão que permanece sem resposta é a real função exercida pela

neurogênese pós-natal (Zhao et al., 2008; Gould, 2007; Rakic, 2002). Muitos neurônios

jovens migram para o bulbo olfatório, mas somente uma parte sobrevive para completar

sua diferenciação (Petreanu e Alvarez-Buylla, 2002). Pouco se sabe sobre a função

dos novos neurônios no bulbo olfatório em animais pós- natais. Foi sugerido que a

incorporação desses neurônios ao bulbo olfatório pode permitir mudanças na circuitaria

(Alvarez-Buylla et al., 2002; Shors et al., 2002; Sahay e Hen, 2007) estimuladas por

novos odores no meio ambiente (Magavi et al., 2005).

17

5. Junções Comunicantes .

As junções comunicantes, também conhecidas como gap junctions são

classicamente descritas como reuniões de poros ou canais intercelulares em regiões

especializadas de estreita aproximação das membranas plasmáticas de duas células

adjacentes, formando as chamadas placas juncionais. Vistos à microscopia eletrônica

de criofratura, cada canal se apresenta como uma protuberância, em forma de botão, e

guarda um distanciamento uniforme com os demais, formando arranjos hexaméricos

semi-cristalinos. Cada canal intercelular completo, em verdade, resulta do alinhamento

e estabilização, através de interações homofílicas, de dois hemicanais, de estrutura

protéica (Fig. 3 e 4). Codificando estas proteínas encontramos duas famílias gênicas

em vertebrados, não homólogas em níveis moleculares, mas guardando ambas forte

homologia estrutural. Representam estas famílias as conexinas, e, mais recentemente

reconhecidas, as panexinas (Panchin, 2005). As conexinas (Cx) compõem uma família

multigênica que soma pelo menos 20 membros nos mamíferos e são nomeadas de

acordo com a massa molecular deduzida a partir de suas seqüências primárias pós-

clonagem (Willecke et al., 2002). Apresentam-se funcionais como canais intercelulares

completos, os canais juncionais propriamente ditos, e como canais transmembranares

simples, os hemicanais ou conexons (Stout et al., 2004). As panexinas, classificadas

bem mais recentemente, são representadas por 3 isoformas, duas delas abundantes no

sistema nervoso, as panexinas 1 e 2 (Px1, Px2; Bruzzone e Dermietzel, 2006), As

panexinas neurais têm sido relacionadas à formação de canais transmembranares

simples (hemicanais) e de forma polêmica, a Px1 tem sido sugerida como capaz de

18

estabelecer corredores intercelulares completos pela aposição de dois hemicanais, à

semelhança dos canais juncionais completos de conexinas (Dahl e Locovei, 2006;

Barbe et al., 2006; Huang et al., 2007).

Os canais juncionais completos de conexinas permitem a passagem, geralmente

de forma bidirecional (Lawrence et al., 1978, Wei et al., 2004), de pequenas moléculas

– de até 1,2 kDa (Evans e Martin, 2002) - como íons inorgânicos (K+ e Ca2+) água e

metabólitos (glicose), incluindo segundos mensageiros intercelulares (AMPc e GMPc) e

pequenas proteínas (como calmodulina; Curran et al., 2007) e possivelmente serotonina

(Esser et al., 2006). Estudos mostraram a transferência de pequenos RNA de

interferência (RNAsi e RNAsh; Valiunas et al., 2005). Células que estabelecem este

intercâmbio são ditas, portanto, acopladas elétrica- e/ou bioquimicamente.

Figura 4. Representação de arranjos estruturais das conexinas para a formação de canais intercelulares juncionais . A – proteína estrutural formadora de canais intercelulares (conexina); B - estruturas hexaméricas, chamadas de conexons ou hemicanais, formadas por 6 unidades de conexinas em torno de um poro hidrofílico; C -interação de 2 conexons formando um canal intercelular completo; D – ilustra uma região de placa juncional, ou junção comunicante (gap junction), que constitui-se numa coleção de canais intercelulares concentrados em uma região da membrana (retiorado de Goodenough e Paul, 2003).

Intercellular channel

C

B A

D

Canal Axial

Membrana 2

Membrana 1

Canal Intracelular

Canal Intercelular Junção Comunicante

Conexina

19

Figura 5. Ilustração da distribuição molecular de uma única conexina na membrana plasmática. Os cilindros representam os 4 domínios transmembranares (M1-M4). A porção extracelular é composta por 2 alças (E1 e E2) cada qual com 3 resíduos de cisteína. A porção citoplasmática é formada por uma cauda amino- terminal (N), uma alça central ou citoplasmática (I), e um segmento carboxiterminal (C). (retirado de Willecke e Söhl, 2004).

Entre as funções gerais atribuíveis às junções comunicantes destacam-se:

i) Crescimento e diferenciação celular. Durante a embriogênese, o acoplamento

juncional tem sido sugerido como um importante modulador do ciclo celular, porém

efeitos duais têm sido descritos em modelos diversos como a regiões proliferativas do

telencéfalo em desenvolvimento e tumores; nas primeiras, o acoplamento juncional

correlaciona-se de um modo geral, positivamente com a manutenção da atividade

proliferativa, diminuindo à medida que as células deixam a fase M e saem do ciclo

celular (Bittman et al., 1997); por outro lado, em tumores, as conexinas e seus arranjos

funcionais têm sido interpretados como fatores de supressão tumoral, enquanto pró-

metastásicos (Trosko, 2005; Mesnil et al., 2005);

ii) Cooperação metabólica. Os canais juncionais têm sido reconhecidos como vias

de fluxo intercitoplasmático de metabólitos e substâncias reguladoras da fisiologia

celular. Intercâmbio nestas bases tem sido sugerido como recurso de regulação dos

citoplasmático

extracelular

I

transmembranar

20

níveis de proliferação e de sobrevivência das células (De Mello, 1983; Lowenstein,

1985; Bennett et al., 1991; Budunova e Williams, 1994; Medina e Tabernero, 2006);

iii) Morfogênese. A comunicação juncional vem sendo classicamente atrelada ao

desenvolvimento de assimetrias, padrões e polaridades em embriões de vertebrados, e

acredita-se que substâncias reguladoras, na qualidade de morfógenos de distribuição

transjuncional, em redes de células acopladas, estejam nos bastidores da

organogênese embrionária (Guthrie e Gilula, 1989; Levin, 2007);

iv) Cascatas de sinalização. As conexinas têm sido descritas como alvos de

sinalizadores celulares, em sistemas de cascata de sinalização, envolvendo segundos

mensageiros como AMPc ou Ca2+ e proteínas quinases/fosforilases (Sáez et al., 1989;

Levin, 2007).

5.1 Junções Comunicantes no SNC

As junções comunicantes são observadas estrutural e/ou funcionalmente em todo

o encéfalo, e em todas as classes celulares (Spray e Dermietzel, 1996). Estabelecidas

entre neurônios, formam vias intercelulares de baixa resistência elétrica, denominadas

sinapses elétricas; entre representantes gliais, acoplam astrócitos fortemente, enquanto

fracamente os outros subtipos gliais entre si, e alguns destes com a astroglia (ex.

acoplamento astrócitos-oligodendrócitos); as junções comunicantes gliais, portanto, têm

sido propostas como mediadoras na formação de redes sinciciais, pangliais (Venance

et al., 1997; Fróes e Campos de Carvalho, 1998; Giaume e Venance, 1998).

Finalmente, entre estas e neurônios (Fróes et al., 1999; Nedergaard, 1994; Nadarajah

et al. 2002, Alvarez-Maubecin et al., 2000, Schipke et al., 2004; Thalakoti et al., 2007).

21

Ambos os tipos de junções parecem sofrer modulação durante o desenvolvimento, o

que pode ser demonstrado por ensaios in vitro e in situ (Venance et al., 1997; Fróes et

al., 1999; Fróes e Campos de Carvalho, 1998; Yuste et al., 1995; Kandler et al., 1995;

Peinado et al., 1993).

A presença, a atividade de canais intercelulares juncionais ou mesmo sua

associação como parceiros moleculares em outros sistemas da fisiologia celular, como

os complexos de adesão, têm sido correlacionadas à histogênese neural, regulando os

níveis de proliferação celular, a migração e a formação de domínios de co-ativação

previa- e durante o amadurecimento de circuitos de neurotransmissão (Bruzzone e

Dermietzel, 2006). Por outro lado, a expressão de conexinas no SNC parece

correlacionar-se com a expressão de genes associados ao desenvolvimento e

especificação regional, enquanto alvos de modulação por fatores de crescimento,

neuromoduladores e neurotransmissores. Sugere-se, portanto, que a funcionalidade

destas vias diretas de intercâmbio célula-célula e o crescimento/amadurecimento dos

circuitos neurais sejam eventos até certo ponto interdependentes, pois coordenados

entre si. A expressão/funcionalidade de proteínas juncionais tem sido também

associada a um grande número de patologias neurais, algumas destas relatáveis em

períodos precoces do desenvolvimento encefálico, a exemplo de processos isquêmicos

perinatais, sugerindo-se um papel como agentes de expansão dos danos neurais

(Nakase et al., 2003; Farahani et al., 2005; de Pina-Benabou et al., 2005; Bates et al.,

2007; Wiencken-Barger et al., 2007).

O envolvimento de proteínas juncionais, especialmente de conexinas, em

processos celulares e histogenéticos do desenvolvimento do SNC é atualmente

classificável em três níveis relativamente à formação dos poros: 1. como poros

22

transcelulares, 2. como poros transmembranares e 3. independentemente de poros

funcionais. Na forma de poros transcelulares, as proteínas juncionais são reconhecidas

no sistema nervoso em sua função clássica, promovendo o intercâmbio transcelular de

íons envolvidos na excitabilidade celular, metabólitos e mensageiros secundários.

Durante o desenvolvimento do sistema nervoso, a primeira forma, dependente de poros

intercelulares que instalam a condição conhecida por acoplamento juncional, tem sido

descrita no contexto de arranjos multicelulares de neuroblastos jovens, em atividade

proliferativa na zona ventricular (Lo Turco e Kriegstein 1991; Bittman et al. 1997), que

envolveriam também células de glia radial formando clusters de

progenitores/precursores neurais.

Pós-natalmente em roedor, temos evidências de formação de clusters de

neurônios jovens acoplados em período crítico da formação da circuitaria básica do

córtex telencefálico, apresentando números máximos de células recrutadas em torno de

P7 e diminuindo progressivamente para níveis baixos ao final da segunda semana pós-

natal (Peinado et al. 1993; Kandler e Katz 1995). Nestes clusters corticais, neurônios

piramidais são claramente reconhecíveis, no entanto, outras classes neuronais e

elementos astrogliais têm sido também sugeridos (Bitmann et al. 2002; Furtado 2008

manuscrito Projeto de tese de Mestrado). Na zona subventricular pós natal, o

acoplamento de neuroblastos entre si e da glia radial tem sido sugerido pela expressão

de conexinas (Miragall et al., 1997; Nadarajah et al. 1997; Cina et al., 2007) e por

ensaios funcionais de acoplamento por corante em populações celulares in situ

(Menezes et al. 2000), aguardando-se, no entanto, demonstrações mais diretas destes

possíveis pareamentos.

Poros transmembranares de conexinas têm sido descritos mais recentemente na

23

literatura, representando a atividade de conexons não alinhados. Sua atividade tem sido

relatada no sistema nervoso central em desenvolvimento, em regiões proliferativas,

como a zona ventricular (Weissman et al., 2004) e o epitélio pigmentado da retina

(Pearson et al. 2005). Os autores propõem que estes poros constituam vias

transmembranares de secreção de ATP que regulariam a propagação de ondas de

cálcio localmente e, através destas, os níveis de proliferação celular.

Por fim, um terceiro modo de atuação das proteínas de junções comunicantes

parece prescindir da formação de poros juncionais, transcelulares e transmembranares

(Stout et al., 2004; Wei et al., 2004; Xu et al., 2006; Elias et al., 2007) e têm sido

descrito na formação e estabilização de módulos de adesão celular. Evidências

recentes na literatura sugerem em comum a interação molecular das conexinas com

proteínas de citoesqueleto (filamento intermediário, microtúbulos) e de complexos

multiproteicos de adesão (como complexos de N-caderinas, por exemplo) promovendo

o contato célula-célula e consequentemente favorecendo a migração celular (Xu et al.,

2006, Elias et al., 2007).

Em conjunto, no contexto do telencéfalo, estes achados sugerem que as proteínas

juncionais carregam diferentes mensagens na coordenação, em níveis celulares e

multicelulares, da histogênese neural. Por um lado, sua atividade como hemicanais

implicaria na regulação da atividade coordenada de grupos de células jovens em, zonas

proliferativas, apresentando-se como fortes candidatos à modulação do ciclo celular

como intermediários na propagação de ondas e flutuações espontâneas de cálcio. Por

outro lado, na forma de canais intercelulares completos, comporiam domínios de co-

ativação por cálcio no córtex, envolvendo células mais maduras, já fora do ciclo

proliferativo, como os jovens neurônios piramidais, putativamente antecipando formas

24

de organização colunar propostas para o córtex. Finalmente, através de sua

participação em complexos de adesão/interação com proteínas do citoesqueleto

independentemente ou não da formação de poros transcelulares, as proteínas

juncionais atuariam na modulação da migração celular estabelecida entre estes dois

domínios neurais, as zonas proliferativas e as lâminas corticais.

6. Junções Comunicantes e Camadas Germinativas .

As junções comunicantes aparentemente exercem importante função na

proliferação celular, na migração e na diferenciação neuronal durante o

desenvolvimento cerebrocortical.

Diferentes conexinas e,mais recentemente, as panexinas, têm sido descritas no

contexto do desenvolvimento telencefálico (Bittman et al., 1997; Bittman et al.,2002;

Barbe et al., 2006; Vogt et al., 2005; Cina et al., 2007), no entanto, em sua maioria, os

estudos exploram superficialmente aspectos de regionalização e laminação da

expressão de proteínas juncionais (geralmente concentrados nas lâminas da formação

cortical) e falham numa identificação mais conspícua dos tipos celulares que

apresentariam estas moléculas. Portanto, deparamo-nos no momento, com dados

imprecisos 1. quanto ao repertório de conexinas funcionais, 2. quanto à definição dos

tipos celulares que expressam as isoformas protéicas através das camadas

telencefálicas, incluindo as regiões proliferativas, e 3. quanto ao perfil temporal de

expressão destas proteínas. Os estudos mais completos concentram-se no telencéfalo

de ratos embrionários, tendo-se descrito na zona ventricular inicialmente a expressão

25

das conexinas 26 e 43 (Nadarajah et al., 1997) e posteriormente Cx36, 37, e 45 (Cina

2007) na VZ cortical. Os perfis temporais gerados durante a exuberância da

neurogênese pré-natal no roedor apontam para o aumento dos níveis de expressão das

conexinas mais abundantes da VZ (Cx26, Cx43, Cx45) com o avanço do

desenvolvimento embrionário e o pico da neurogênese, sugerindo a participação de um

repertório específico destas conexinas. Com o aumento da espessura da parede

cortical, acompanhado de involução da VZ, a presença destas conexinas diminui nas

proximidades do ventrículo, mas aumenta nas camadas superiores (Nadarajah, 1997).

Em níveis celulares, na VZ, contamos hoje com as seguintes descrições: a glia

radial, definida dentro de critérios morfológicos gerais e/ou de imunorreatividade para

nestina e RC2: 1. apresenta-se imunorreativa para as conexinas 43 e 26 (Nadarajah et

al., 1997; Bittman et al., 1999; Elias et al., 2007); 2. apresenta à ME placas juncionais

homo- e heterocelulares (estas últimas possivelmente estabelecidas entre estas e

neuroblastos) (Nadarajah et al., 1997); 3. Mostra-se acoplada por critérios de

acoplamento por corante com possíveis coortes de neuroblastos pré-migratórios, ainda

em ciclo proliferativo (LoTurco e Kriegstein, 1991, Bittman et al., 1997, Bittman e

LoTurco, 1999), sugerindo-se os grupos glia radial/neuroblastos acoplados da VZ como

os primórdios das unidades funcionais radiais de colonização cortical (Rakic, 2007;

LoTurco e Kriegstein, 1991); 4. por fim, em estudos recentes, apresenta-se como

centros de coordenação da proliferação celular na VZ, mediante a deflagração de

ondas espontâneas de cálcio, através de ATP secretado por hemicanais de proteínas

juncionais, que passa a agir paracrinamente sobre células da VZ vizinhas, incluindo

células da glia radial (Weissman et al., 2004).

26

Os mecanismos de sinalização que determinam se as células progenitoras neurais

permanecem em estado proliferativo ou iniciam a diferenciação celular ainda não estão

completamente esclarecidos, no entanto algumas evidências sugerem um envolvimento

direto das conexinas com esta transição. A Cx43, por exemplo, descrita como o subtipo

majoritário em glia, mas também detectável em neurônios, é expressa em altos níveis

em células progenitoras neurais de rato em desenvolvimento (Bittman et al., 1999), a

exemplo da glia radial. Seus níveis decrescem com a diferenciação destas células em

neurônios in vivo (Leung et al., 2002); de forma semelhante, os níveis desta conexina

também decrescem gradualmente com a indução da diferenciação de células neuronais

imortalizadas em cultura (Rozental et al., 1998).

As unidades neuroblastos/glia radial acopladas na VZ parecem incluir os

precursores em todas as fases do ciclo celular, exceto a fase M, e não conteriam

neurônios pós-mitóticos. O acoplamento seguiria ainda um padrão dinâmico através do

ciclo celular, acentuando-se na direção de G2 e decrescendo em G1; ao longo da

neurogênese embrionária exibiria um padrão temporal quanto à exuberância de

comunicação na fase S do ciclo celular destes precursores neurais: alto no início da

neurogênese e baixo na neurogênese tardia, período em que aumenta o número de

células que saem do ciclo celular. Parece, então, que precursores desacoplados têm

menor probabilidade de entrar na fase S. Estas sugestões experimentais são

fortalecidas pela diminuição no quantitativo de células entrando na fase S conseqüente

ao uso de desacoplantes (Bittman et al., 1997). Coerentemente, guardadas as reservas

de que trata-se de estudo que defende o papel das conexinas como formadoras de

hemicanais na glia radial da VZ, o bloqueio farmacológico destes canais por agentes

desacoplantes típicos foi fortemente correlacionado à inibição do ciclo celular e das

27

ondas de cálcio associadas (Weissman et al., 2004). Estas resultados indicam que

estas proteínas e os poros por estas formados, sejam intercelulares ou transcelulares,

estão envolvidos na regulação de formas neurônio-gliais de excitabilidade celular, como

as ondas de cálcio e na regulação do ciclo proliferativo celular no telencéfalo em

desenvolvimento.

Conforme comentado acima, segundo a literatura, neuroblastos proliferativos da

VZ encontram-se acopladas à célula de glia radial, e deixariam de acoplar durante a

migração, enquanto acolados aos prolongamentos gliais (LoTurco e Kriegstein, 1991;

Bittman et al., 1997). Uma vez desligados da glia radial, re-estabeleceriam redes de

acoplamento juncional, em arranjos colunares na formação cortical, num processo de

construção e amadurecimento dos circuitos corticais (Nadarajah et al., 1997; Bittman e

Lo Turco, 1997; Bittman et al., 2002). Portanto, estas observações sugeririam um papel

dual da comunicação juncional sobre o ciclo proliferativo e sobre a diferenciação

neuronal e estabelecimentos de circuitos corticais, enquanto sem função durante a

migração radial.

Por outro lado, é possível que em algum momento durante o processo migratório

radial, ainda que intermitentemente, o acoplamento celular possa estabelecer-se entre

o par neuroblasto/glia. A presença de placas juncionais entre prolongamentos da glia

radial e neuroblastos em migração radial a partir da VZ parece sugerir esta

possibilidade (Nadarajah et al., 1997). Por outro lado, no entanto, estas placas

juncionais poderiam exercer papéis outros independentes da propriedade destas

junções quanto à formação de poros intercelulares completos ou de hemicanais. De

fato, estudos mais recentes sugerem as junções comunicantes como fortes parceiras

em complexos de adesão celular envolvidos na interação neuroblasto/prolongamento

28

glial, no caminho para as lâminas corticais durante a corticogênese pré-natal (Elias et

al., 2007). Independentemente dos mecanismos moleculares envolvidos, estudos com

transgênicos nulos para Cx43, revelam alterações de laminação cortical (Fushiki et al.

2003; pós-natos nocaute), hipocampal e cerebelar (Wiencken-Barger et al., 2007)

compatíveis com distúrbios da migração celular. De fato, camundongos embrionários

com baixa expressão fenotípica para Cx43 apresentam uma acumulação de BrDU

anormal na zona intermediária, quando o estabelecimento normal dessas células seria

na placa cortical (Fushiki et al., 2003).

Os estudos concernentes à expressão de proteínas juncionais na zona

subventricular são ainda mais escassos, e menos sistemáticos que estes realizados no

contexto da neurogênese pré-natal, dificultando conclusões acerca da significância

funcional da presença destas proteínas nesta camada proliferativa. Dentre os esparsos

relatos, temos os estudos de Miragall e colaboradores (1992, 1997), que descreveram a

presença da Cx43 por ensaios de imuno-histoquímica pós-natalmente na SVZ, em toda

a sua extensão até o bulbo olfatório e concluíram por sua expressão em células de

aspecto quiescentes da SVZ pós-natal enquanto pela ausência de Cx26 e Cx32

(Miragall et al., 1997).

Acredita-se na possibilidade de envolvimento das conexinas em processos

normais de neurogênese e plasticidade do adulto (Peretto et al., 2005; revisado em

Rouach et al., 2002; Weissman et al., 2004). A falha na regulação da neurogênese

pode estar associada a algumas doenças: na epilepsia e doença de Huntington a

neurogênese estaria aumentada e nas desordens afetivas a neurogênese estaria

diminuída (Abrous et al., 2005). Por outro lado, a neurogênese perinatal e a

neurogênese no adulto representam atualmente fortes focos investigativos, dada as

29

expectativas de recuperação de lesões do sistema nervoso central por reposição

celular. Acreditamos ao elucidar o papel do acoplamento celular na regulação e controle

da neurogênese durante o desenvolvimento normal possamos contribuir para a

definição de novas estratégias clínicas aplicadas ao tratamento de patologias

neurológicas.

Em estudos anteriores, revelamos a presença de extenso acoplamento juncional

por corante na SVZ e RMS pós-natal, em período de exuberância das atividades

proliferativa e migratória celular nesta região (Menezes et al., 2000). Posteriormente,

mostramos a transformação astrocitária sofrida pela glia radial da SVZ/RMS é um

fenômeno muito mais complexo do que se imaginava, envolvendo a permanência

destas células em nichos proliferativos desta camada e sugerindo-as na composição do

túnel astroglial que mais tarde perfaria as paredes da SVZ adulta (Alves et al. 2002). A

glia radial em transformação, portanto, foi postulada como forte candidata à reguladora

de aspectos da fisiologia da SVZ/RMS, como as atividades proliferativa e migratória dos

neuroblastos em trânsito pela SVZ/RMS. Quais fatores estariam regulando a

permanência da glia radial na SVZ? Estaria a comunicação juncional na SVZ,

envolvendo a glia radial entre si, os neuroblastos entre si, ou ambos em parcerias

heterocelulares, implicada na regulação da transformação da glia radial e na

concomitância fisiológica de processos proliferativos, migratórios e de diferenciação

celular vividos pelos neuroblastos da SVZ em seu percurso até o bulbo olfatório? Na

base destas questões de forte implicação fisiológica, no entanto, está a elucidação dos

possíveis sub-compartimentos de comunicação juncional e dos parceiros celulares

envolvidos na formação destas que poderiam ser vistas como potenciais redes

multicelulares coordenadas por comunicação juncional. Para tanto, buscamos a

30

definição destas redes em estudos in vivo/in situ, que elegem a glia radial da SVZ, de

ancoragem pial como ponto de partida para as possíveis parcerias juncionais.

Focalizamos, assim, a participação da célula de glia radial (CGR) nas redes de

acoplamento da SVZ pós-natal (Fig. 6).

Neste projeto testaremos a hipótese de que neurônios, neuroblastos, glia radial e

astrócitos possam construir circuitos de acoplamento que podem estar influindo na

atividade celular local. Para tanto utilizaremos uma adaptação da técnica de

“transection loading” (Menezes et al., 2000) “in situ”, para carregar especificamente as

CGR com corantes permeantes e não permeantes para “gap junctions” de forma a

evidenciar o acoplamento celular realizado por estas células. Em resumo, os

prolongamentos piais das CGRs neonatais residentes na SVZ serão seccionados para

permitir a entrada dos corantes diretamente para o citoplasma celular.

31

Figura 6. Possíveis parceiros da célula de glia radial na rede celular acoplada na SVZ. Células em vermelho indicam as células carregadas inicialmente pela mistura de corantes usada para revelar o acoplamento juncional. Células apenas verdes representam as células marcadas por acoplamento celular. Vide materiais e métodos. Pares deletraas maisculas indicam pares de células acopladas: RR, entre células e glia radial; RN, entre células de glia radial e neuroblastos; RA, células de glia radial e astrocitos. WM, substancia branca (white matter em inglês); SVZ, zona subventricular.

A utilização dos prolongamentos piais das CGR como forma de carregamento

específico destas células é uma forma de responder se as células da glia radial da SVZ

contribuem para o acoplamento celular observado nesta camada (Menezes et al.,

2000). Com esta técnica exclui-se a possibilidade de carregamento direto de outras

células que não a própria CGR, tornando-a a única doadora possível neste ambiente.

RN

RR

RR

RA

32

II. Objetivos .

Avaliar a contribuição específica da célula de glia radial (CGR) para o

acoplamento celular na zona subventricular pós-natal. Com o perspectiva de que isto

possa fornecer subsídios para entender o papel das junções comunicantes na

regulação, migração e diferenciação na zona subventricular pós-natal.

1. Objetivos Específicos

1. Avaliar a distribuição do acoplamento por corante observado na SVZ/RMS

a partir da CGR.

2. Identificar os tipos celulares envolvidos no acoplamento observado com a

CGR.

3. Determinar a natureza juncional deste acoplamento.

33

III. Metodologia .

1. Animais e anestesia:

Utilizamos filhotes de ratos (Wistar), do nascimento (dia pós-natal 0, P0) a P6

nascidos em nossa própria colônia.

Os filhotes foram anestesiados por hipotermia. Todos os procedimentos

respeitaram as normas do NIH (National Institute of Health).

2. Carregamento Pial

Os filhotes (aproximadamente 30 animais) foram decapitados, seguindo então a

dissecção do crânio e a exposição da superfície encefálica submersos em solução

salina de Gey (GSS; do inglês Gey’s salt solution - 1mM Ca+2, GIBCO) gelada

suplementada com glicose (6 mg/ml). Depois da dissecção, os cérebros foram imersos

em tampão fosfato salina (0,1M, pH7.4) (PBS) livre de cálcio (PBS

ØCa+2/EGTA/glicose) à temperatura ambiente e as meninges rebatidas. Realiza-se um

leve esfregaço com tira de papel, que além de retirar a pia mater, provoca uma leve

lesão na superfície (Fig 7), e goteja-se solução com o permeante Lucifer Yellow (LY;

443 Da - 0,25%, Molecular Probes) e o fluorocromo não-permeante dextran conjugado

à Rodamina (RD; 3000 Da - 0,5%, Molecular Probes). Após lavagem com solução GSS,

o material foi fixado em paraformaldeído 4% em PBS, durante 3h. Depois os cérebros

34

foram processados para criomicrotomia ou seccionados no vibratomo (Vibratome

V1000, Pelco). No primeiro caso, os cérebros foram crioprotegidos, cortados

parassagitalmente em criostato (12 m, Leitz), as fatias montadas em lâminas e

analisadas à microscopia de epifluorescência. No segundo caso os cérebros foram

cortados em vibratomo (50 m) e as fatias montadas em lâminas e analisadas à

microscopia de epifluorescência e confocal. Algumas das secções obtidas ao vibratomo

foram processadas para imuno-histoquímica.

Figura 7. Esquema sagital de marcação no carregamento pial mostrando os dois sítios de marcação desta técnica: o córtex cerebral e a SVZ. Pontos vermelhos representam RD e pontos amarelos representam LY.

Como controle para captação por hemicanais ou inespecífica de LY modificamos

o ensaio de carregamento pial para uma adaptacao baseada na técnica de transection

35

loading. Neste ensaio, 2 (dois) animais, após a decapitação, foram submetidos, em

substituição ao procedimento de carregamento pial, a um único corte coronal bilateral

no lobo occipital. Este corte, realizado com bisturi cirurgico, atingiu em todos os animais

o ventrículo lateral, expondo assim a luz ventricular aos corantes. Após quatro minutos,

os cérebros foram lavados com PBS (3x de cinco minutos) e fixados como descrito

anteriormente.

3. Injeção Intraventricular de Carbenoxolone

Seis animais (P4; em três experimentos separados) receberam uma única

injeção intraventricular de carbenoxolone (100mM; CBX; ácido 3β-hidroxi-11-oxooleano-

12-eno-30-óico-3-hemissuccinato), antes do procedimento de carregamento pial. Para

tanto, os animais foram anestesiados por hipotermia e uma pequena abertura foi feita

na parte posterior do crânio expondo a superfície cortical. Uma micropipeta de vidro foi

introduzida aproximadamente 1200 mm da superfície pial ao ventrículo injetando 1-2L

de CBX (5mM) para obter uma concentração de final de 100-200M no espaço

extracelular cerebral (supondo o volume de líquor 50-60L – calculado a partir do

volume conhecido no adulto de 250l – Burns et al., 1976). A incisão foi fechada por

cola de cianoacrilato e os animais tiveram uma sobrevida de 30 minutos, sendo

submetidos na seqüência ao mesmo procedimento de carregamento pial com a

presença de 100mM de CBX na mistura de corantes. Como controle, foi injetado

somente veículo (seis animais). Muitos dos animais que receberam CBX apresentaram

convulsões após recuperarem-se da anestesia.

36

4. Excesso de cálcio Extracelular

Neste caso, os cérebros de oito (em quatro experimentos separados) animais

(P4) foram expostos durante todo o procedimento de carregamento pial a

concentrações elevadas de cálcio. Para tanto, cálcio foi adicionado em todas as

soluções em uma concentração final de 5mM. Todo o procedimento seguiu sem outras

alterações de protocolo.

5. Marcação com carbocianina

Para identificar as células de glia radial a partir da superfície pial, imediatamente

após o procedimento de carregamento pial, os cérebros foram imersos em uma solução

aquosa de Dil (1,1'-dioctadecil-3,3,3',3'- tetrametilindocarbocianina perclorato; DiIC18(3);

5% de sucrose e 0.5% de etanol) por 30 minutos, lavados em GSS por 5 minutos e

imediatamente fixados com PFA. Após esse procedimento, pequenos cristais de Dil

foram depositados, sob inspeção visual na superfície cortical exposta.

6. Imuno-histoquímica e análise

Após curto período de fixação, algumas lâminas foram lavadas em PBS e depois

incubadas (pernoite) com o anticorpo monoclonal anti-β- tubulina de classe III (1:1000;

Covance) numa solução contendo 0,05% de Triton-X e 10% de soro normal de cabra

em PBS. Após 3 lavagens com PBS, as lâminas foram incubadas por duas horas em

anticorpo secundário anti-camundongo feito na cabra conjugado ao fluoróforo Alexa

37

Fluor 546 (1:400; Molecular Probes) diluídos em solução a 10% de soro de cabra em

PBS. Após 3 lavagens com PBS, lâminas foram cobertas com lamínula de vidro

utilizando meio de montagem N-propilgalato e seladas com esmalte.

As lâminas foram analisadas ao microscópio óptico invertido (TE200, Nikon),

fotogrados com camara digital CoolSnap-Procf monocromática (Media Cybernetics).

Para aquisição de imagens também foi utilizado microscopia confocal (LSM 510, Zeiss).

38

IV. Resultados .

A técnica de carregamento pial revelou, em todas as idades analisadas, células

com dupla marcação pelos corantes utilizados (LY+RD+ - células carregadas

diretamente pelo esfregaço pial) em duas regiões: nas camadas celulares do córtex

cerebral e na zona subventricular (SVZ; Fig. 8). Em todos os casos estas células foram

encontradas restritas as regiões subjacentes às superfícies do esfregaço. Células

marcadas apenas com Lucifer Yellow (LY+RD-), i.e., acopladas, foram encontradas

principalmente nas camadas celulares do córtex cerebral e na SVZ. Muitas vezes o

acoplamento juncional (LY+RD-) estendeu-se para além da superfície de carregamento

direto, em especial para as regiões rostrais da SVZ, ou seja, para dentro da RMS (Fig.

9).

41

4. 1. Células carregadas pelos corantes na SVZ apresentam uma distribuição bi-

modal

As células marcadas (LY+RD- e LY+RD+) na SVZ apresentam-se distribuídas em

um padrão bi-modal característico em todas as idades analisadas (Fig. 10). Nota-se

então dois grupos de células distintos: um próximo à borda externa da SVZ (Fig. 10

setas), e outro próximo à luz ventricular (Fig. 10 asteriscos). Além de apresentar uma

morfologia não-radial, o grupo próximo à borda externa da SVZ sobrepõe-se à região

onde mostramos anteriormente estarem estacionadas as células de glia radial em

transformação (Alves et al., 2002). Isto sugere que estas células são CGR em

transformação e estão acopladas. O grupo adjacente à luz ventricular apresenta

morfologia bipolar e se assemelha a CGRs bipolares e/ou células ependimárias.

Novamente, observamos células duplo-marcadas (LY-RD+) e mono-marcadas

(LY+RD-) confirmando a presença de células de ancoragem pial e sugerindo

acoplamento juncional também neste extrato. Esse padrão de distribuição manteve-se

durante todas as idades analisadas (Fig. 11; entre P0 a P6).

44

4.2. Células carregadas pelos corantes na SVZ são glia radial

Devido à morfologia específica das células de glia radial, corpos celulares no

interior da SVZ e longos prolongamentos atingindo a superfície pial, possivelmente toda

a célula diretamente carregada na SVZ é uma célula de glia radial. Isto porque, com a

técnica de carregamento pial, somente a célula de glia radial seria capaz de captar os

corantes e levá-los a SVZ. Mesmo frente a esta argumentação consistente decidimos

confirmar esta hipótese fazendo um ensaio de dupla marcação usando o transporte

post-mortem da carbocianina Dil nos cérebros previamente submetidos ao

carregamento pial.

Para tanto, mergulhamos os cérebros carregados em uma solução aquosa de Dil

(1,1'-dioctadecil-3,3,3',3'- tetrametilindocarbocianina perclorato; DiIC18(3); 5% de

sucrose e 0.5% de etanol) por 30 minutos, lavados em GBSS por 5 minutos e

imediatamente fixados com PFA. Durante esse procedimento, pequenos cristais de Dil

são depositados na superfície cortical exposta. Após um período de 7 dias observamos

CGR marcadas com o Dil com diversas morfologias na SVZ: células com morfologia

mais complexa geralmente situadas na borda externa da SVZ e células bipolares,

próximas à luz ventricular (Fig. 12 seta e cabeça de seta). A maioria das CGR

marcadas com DiI abaixo da área de carregamento pial também se apresentou positiva

para LY (Fig 12) tanto na borda externa dorsal da SVZ (Fig. 12 C,D e E) quanto na

superfície ventricular (Fig. 12 F,G e H).

46

4.3. Células carregadas pelos corantes não são marcadas por captação

inespecífica

Para excluir a possibilidade de captação inespecífica de corantes pelas células da

SVZ, realizamos controles de captação de corantes onde os cérebros eram submetidos

a um corte profundo na região occipital, em substituição ao esfregaço pial, e, em

seguida, expostos aos corantes. Nestes experimentos, apesar dos corantes invadirem a

luz ventricular, não houve captação na SVZ para além da região imediatamente

adjacente ao corte (Fig. 13). Estes resultados confirmam que a técnica do carregamento

pial revela especificamente as CGR diretamente atingidas pelo esfregaço e que todo o

transporte transcelular do corante LY advém única e exclusivamente das CGRs

diretamente marcadas pelo carregamento.

48

4. 4. Células LY-positivas são Beta III tubulina negativas

Para inferir sobre os parceiros acoplados com as células de glia radial nos

conjuntos de células monomarcadas realizamos ensaio de imuno-histoquímica para a

isoforma classe III da beta tubulina, específica de neurônios e neuroblastos (Lee et al.,

1990; Menezes e Luskin, 1994), empregando o anticorpo TuJ1, nos cérebros

submetidos ao carregamento pial (Fig. 14). Nestes ensaios, realizamos o carregamento

pial somente com LY, de forma que o vermelho da RD não prejudicasse a análise do

TuJ1 revelado com secundário conjugado a fluorocromo RITC. Observamos que as

células LY-positivas são sempre TuJ1 negativas (Fig. 14). Note que nestes ensaios não

discriminamos entre células carregadas diretamente ou por acoplamento. No entanto, a

ausência de células TuJ1+/LY+ indica que tanto as células carregadas diretamente

quanto as marcadas por acoplamento não são neuroblastos.

50

4.5. Agentes desacoplantes diminuem a incidência de perfis celulares

monomarcados na SVZ/RMS

Para avaliar de forma preliminar se o acoplamento celular observado seria

mediado por junções comunicantes usamos um agente farmacológico bem estabelecido

como inibidor da comunicação juncional, o carbenoxolone (CBX - Davidson e

Baumgarten, 1988), e manobras de alto cálcio (Spray, 1996; Menezes et al., 2000).

O CBX empregado para a inibição da comunicação juncional oferece as

vantagens de ser hidrofílico e pouco tóxico (Marins, 2006; Tese de Doutorado). Até o

momento, tem se provado um bloqueador que age indistintamente para os isotipos de

conexinas (Spray et al., 2002; Salameh e Dhein, 2005). À semelhança da quase

totalidade dos agentes farmacológicos descritos como inibidores da comunicação

juncional, a presença de CBX não abole completamente o acoplamento celular

detectável por espalhamento de corantes in situ, porém o reduz significativamente, algo

entre 70 e 90% (Davidson e Baumgarten, 1988; Van Haarst et al., 1996; Menezes et al.,

2000; Pais et al., 2003).

Injetamos CBX (1-2l; 1mM) unilateralmente no ventrículo lateral esquerdo, 20-40

minutos antes do procedimento de carregamento pial. Nos animais tratados com CBX

observamos uma diminuição do acoplamento juncional, ou seja, diminuição da

proporção de células LY+RD- (Fig. 15 B). Como pode ser observado qualitativamente

na figura 8, a proporção de células LY+/RD- (acopladas) sobre LY+/RD+ (carregadas

diretamente) são consistentemente maiores no controle. A análise estatística ainda não

foi possível, dada a grande variabilidade dos níveis de carregamento entre os animais,

51

exigindo-nos experimentos adicionais que atendam à diminuição dos desvios-padrão na

coleção de ensaios.

Outra estratégia para o bloqueio do acoplamento foi efetuar o procedimento de

carregamento pial na presença de altas concentrações de cálcio extracelular (5mM).

Nestes experimentos encontramos também uma diminuição acentuada do acoplamento

celular (Fig. 15C). Não efetuamos razões para estes ensaios, mas qualitativamente

observamos uma redução acentuada, próxima a zero, dos perfis monomarcados

relativamente aos duplo-marcados, consistente com a descrição anterior, de que o

bloqueio com calcio provoca uma redução do acoplamento mais acentuada em

comparação com os ensaios com CBX (Menezes et al., 2000).

53

V. Discussão .

Neste trabalho investigamos a contribuição das células de glia radial (CGR) para a

rede de acoplamento presente na zona subventricular (SVZ). Para tanto,

desenvolvemos uma técnica capaz de carregar exclusivamente a CGR de forma direta

na SVZ. Demonstramos aqui que as CGRs participam de uma extensa rede acoplada,

apresentando uma distribuição espacial bimodal, e que persiste durante os seis

primeiros dias pós-natais. Nossos resultados sugerem que, a princípio, esse

acoplamento parece ser homocelular, envolvendo apenas células de origem glial. A

distribuição restrita e o caráter aparentemente homogêneo das células envolvidas

sugere a formação de compartimentos sinciciais que podem corresponder a

microdomínios funcionais da SVZ/RMS, reforçando a idéia de uma heterogenidade

espacial dentro desta camada germinativa.

5.1. Considerações técnicas

A técnica de carregamento pial de corantes empregada neste trabalho é uma

variante in vivo, da metodologia desenvolvida anteriormente em nosso laboratório,

denominada de carregamento por transecção (transection loading) (Menezes et al.,

2000) para mapeamento in situ do acoplamento juncional. Ambas derivam da técnica

de carregamento por corte (scrape loading) desenvolvida para culturas de células

dissociadas (El Fouly, 1991). Diferente do método de carregamento por transecção, a

metodologia empregada foi capaz de marcar isoladamente as CGR e permitir a análise

54

do seu acoplamento no interior da SVZ/RMS, mantendo a histoarquitetura intacta. Esta

variante técnica aproveita o fato de ser a célula de glia radial a única da SVZ que possui

prolongamentos que se estendem até a superfície pial. Desta forma, ao expor apenas

esta superfície à mistura de corantes garantimos que qualquer carregamento direto

detectado na SVZ seja atribuível, exclusivamente, aos prolongamentos gliais expostos

ao esfregaço pial.

A hipótese de que na SVZ apenas as CGR apareceriam carregadas diretamente

pelo esfregaço foi confirmada de três maneiras: 1. com a utilização do rastreador

fluorescente post-mortem, a carbocianina DiI; 2. com a imuno-histoquímica para o

marcador fenotípico de neurônios e neuroblastos, o anticorpo TuJ1; 3. indiretamente,

com a disponibilização dos fluorocromos à luz ventricular, sem esfregaço, através de

uma incisão profunda na região occipital. O primeiro método permitiu analisar a

morfologia das células carregadas com LY, confirmando sua fenotipia CGR; por ser

empregado post-mortem descarta-se a possibilidade deste corante (DiI) ser captado

inespecificamente, garantido assim a especificidade da marcação das CGR. O

segundo, por exclusão às imunorreatividades, mostrou-nos a ausência de

neuroblastos/neurônios entre as células carregadas pelo método. Isto sugere

fortemente, que as células marcadas apenas com LY seriam de linhagem glial, ou,

precursores, ainda não diferenciados. Juntos estes dois resultados corroboram a

hipótese de marcação exclusiva de CGR pelo método de carregamento pial. O terceiro

método permite excluir a hipótese de captação inespecífica (e.g., endocitose,

fragmentação de membrana durante morte celular, ou mesmo abertura de poros na

membrana plasmática), que poderia justificar perfis monomarcados (LY+RD-): mesmo

atingidas profundamente pelo corte e banhadas diretamente com a dupla

55

permeante/não-permeante, não encontramos células marcadas com distribuição na

SVZ compatível com as reveladas pelo carregamento pial, exceto pelas células

carregadas diretamente (LY+RD+) nas imediações da incisão. Em conjunto,

confirmamos o perfil fenotípico das células diretamente carregadas como CGR e

excluímos a presença detectável de neuroblastos acoplados e a possibilidade de

transporte por difusão extracelular seguido de captação inespecífica dos corantes por

células da SVZ. Em manobras como esta, através da qual tem-se, com exclusividade, a

possibilidade de avaliação do acoplamento em grandes populações celulares in situ,

tornou-se possível selecionar uma única população celular de interesse e estudar o

acoplamento desta com as demais em seus sítios histoarquitetônicos de distribuição.

Apesar de inúmeros ensaios bem sucedidos (aproximadamente 7% dos

ensaios), a técnica é de difícil reprodução. Acreditamos que parte destes insucessos

podem ser explicados pela necessidade de que o procedimento seja realizado com

rapidez. Por exemplo, em alguns experimentos a mistura de corantes não atingiu a

SVZ, talvez pela retração antecipada das membranas dos podócitos das CGR, ou, mais

remotamente, pelo fechamento dos canais juncionais por cálcio ionizado extravasado

durante o esfregaço antes da exposição aos corantes. Outro fator a ser considerado é a

grande distância que os corantes necessitam percorrer até chegar a SVZ, isto poderia

aumentar as possibilidades de insucesso no carregamento em profundidade. Uma vez

que os corantes possam não atingir concentrações significativas pelas CGR na SVZ

antes do término do procedimento (fixação com PFA). Apesar destas dificuldades nos

ensaios bem sucedidos esta técnica revela uma distribuição espacial difícil de obter

através de outras metodologias.

56

5.2. O acoplamento celular é aparentemente homocelular

Na ocasião de nossos ensaios de carregamento pial combinados à marcação

com DiI, ou processados posteriormente para imuno-histoquimica ficamos impedidos de

empregar o não-permeante, RD, dada a emissão de fluorescência em comprimento de

onda similar ao DiI e aos anticorpos secundários disponíveis para imunoquímica no

laboratório munidos de fluorocromos na mesma faixa. Esta restrição técnica, à época,

além de interferir na determinação de subtipos celulares dentro da população marcada,

impediu-nos de diferenciar as células acopladas daquelas carregadas diretamente. No

entanto, devido à sobreposição quase absoluta das células DiI+ e LY+, por um lado, e à

exclusão completa de imunorreatividade das células carregadas com LY a TuJ1,

concluímos, dentro das condições experimentais utilizadas, sobre a natureza não

neuronal das células acopladas com aquelas carregadas diretamente. Para suplantar

esta limitação, pretendemos utilizar nos experimentos futuros a capacidade de

separação espectral proporcionada pelos equipamentos de microscopia confocal

(Conchello e Lichtman, 2007) e/ou a disponibilidade de novos conjugados de alto peso

e permeantes juncionais que permitam combinações complementares diversas, em

ensaios de imuno-histoquímica.

A não participação de neuroblastos nas redes de acoplamento reveladas para a

CGR pode sugerir a restrição a arranjos de acoplamento homocelular envolvendo as

CGR da SVZ (Fig. 16). No entanto, ensaios adicionais serão necessários para excluir os

outros pareamentos possíveis, como aqueles que pudessem envolver astrócitos já

diferenciados, por exemplo, em parcerias heterólogas (Fig. 16).

57

Figura 16. Parceiros da célula de glia radial na rede de acoplamento da SVZ elucidados neste trabalho. Vide figura 7 da introdução para legenda explicativa.

5.3. O acoplamento celular evidenciado por corantes possivelmente é mediado por

junções comunicantes

A técnica de transection loading – carregamento por transecção – foi

desenvolvida no laboratório como uma forma de detecção rápida e pouco dispendiosa

de junções comunicantes funcionais in vivo. Este método foi inicialmente empregado no

cérebro pós-natal para demonstrar pela primeira vez a existência de acoplamento

celular na zona subventricular telencefálica (Menezes et al., 2000).

RN

RR

RR

RA ?

58

A natureza juncional da difusão transcelular do permeante LY é, em geral,

confirmada por manobras conhecidas de desacoplamento total ou, mais comumente,

parcial. Nesta tese, empregamos dois agentes desacoplantes, o fármaco

carbenoxolone e a aplicação de alto cálcio em soluções de banho extracelular. Ambos

os tratamentos diminuíram drasticamente os perfis de células monomarcadas (LY+RD-)

em condições de carregamento pial, tanto na SVZ quanto no córtex, reforçando a

hipótese de carregamento transcelular por comunicação juncional. Em consonância

com nossos resultados anteriores (Menezes et al., 2000) o carbenoxolone promoveu

uma inibição parcial do acoplamento na SVZ, enquanto altas concentrações de cálcio,

resultaram em um bloqueio quase total. Esse resultado aponta positivamente para a

participação das junções comunicantes na formação de redes celulares acopladas da

SVZ. Além disso, a ausência de captação dos corantes por células fora de regiões de

esfregaço (Fig. 13) reforça a dependência com vias intercelulares de comunicação

juncional, tendo afastado a possibilidade de intermediação por hemicanais de

conexinas (Weissman et al., 2004).

A presença de conexinas na SVZ apontada em escassos estudos anteriores

(Miragall, et al.,1997) apóia a tese de intermediação por canais juncionais ativos no

espalhamento de permeantes observado na SVZ, apesar de não confirmada

posteriormente (Peretto et al., 2005). No entanto, reserva-se ao nosso grupo, até o

momento, as evidências mais conspícuas de que não só conexinas estariam presentes

na SVZ pós-natal, como também estariam implicadas na fisiologia desta camada.

Assim, detectamos a presença de conexinas 43 e 45 in situ na SVZ (dados não

mostrados) (Anna Lenice Xavier, 2008, Projeto de tese de Mestrado), presente de

maneira uniforme sugerindo sua expressão em variados tipos celulares. Demonstramos

59

ainda que o acoplamento juncional observado em culturas de explantes de SVZ

interfere amplamente na migração neuronal, e que tanto células gliais como

neuroblastos expressam a Cx 43 nestes explantes (Marins, 2006; tese de doutorado). É

possível que esta discrepância se deva a dificuldade da detecção de conexinas com os

anticorpos disponíveis atualmente, sendo a detecção por imuno-histoquímica ainda

gera controversias na literatura (ver discussão em Fillipov et al., 2003).

É possível, embora pouco provável, que parte das células que apresentaram

acoplamento revelado por corantes tenha sido marcada através da captação de LY por

poros formados por receptores purinérgicos P2X7 (Surprenant et al., 1996; Illes e

Ribeiro, 2004). Apesar de não podermos excluir a participação destes receptores na

incorporação e difusão de LY em nossos ensaios, por não termos realizados ensaios

farmacológicos específicos, algumas características de nosso modelo reduzem esta

possibilidade: 1. as altas concentrações do ligante (ATP) necessárias para abertura

destes poros (faixa mMolar) (Virginio et al., 1999a; 1999b) são pouco prováveis de

serem alcançadas na nossa preparação já que o local a nossa região de análise é

distante da região de captação do corante ou seja, de lesão; 2. apesar de alguns

autores defenderem tempos mais curtos para a abertura destes poros na presença de

elevadas concentrações de ATP (Virginio et al., 1999a; 1999b), tempos prolongados, da

ordem de 10 ou mais minutos têm sido relatados para o registro de níveis detectáveis

de captação direta de permeantes, portanto, freqüentemente maiores que o breve

tempo de exposição aos corantes (1-3 minutos) utilizado em nosso método; 3. se

houvesse a participação destes poros, esperaríamos a formação de grumos de células

LY+/RD-, uniformemente distribuídos pelo tecido; não guardaria, portanto, qualquer

60

caráter de correspondência, na profundidade da parede cortical, à área de esfregaço da

superfície pial.

Por fim, apesar de ainda não confirmadas em sistemas endógenos quanto à sua

capacidade de formação de canais intercelulares completos e funcionais, não

descartamos a possibilidade de que parte do acoplamento celular observado em

nossas preparações deva-se a uma classe recém descrita de proteínas juncionais, as

panexinas. Descritas na qualidade de homólogas funcionais das conexinas, porém, não

homólogas no seqüenciamento gênico (Bruzzone et al., 2003), estão presentes no

cérebro em desenvolvimento e adulto (Vogt et al., 2005), mas são ainda pouco

estudadas em relação ao seu papel nas camadas germinativas.

5.4. A célula de glia radial na dinâmica da SVZ

A investigação sobre o comportamento da célula de glia radial tem ganhado

grande importância nos últimos anos. Além da já conhecida função de arcabouço para

a migração neuronal, esta demonstrou ser a célula precursora multipotente. De fato, a

CGR parece ser a responsável pela produção de grande parte dos neurônios

excitatórios do cortex cerebral durante o desenvolvimento (Noctor et al., 2002,

Malatesta et al., 2003, Anthony et al., 2004) e também está presente em regiões de

adultos não mamíferos que são conhecidas por serem neurogênicas durante toda a

vida (Alvarez-Buylla et al., 2004, Zupanc and Clint, 2003, Garcia-Verdugo et al., 2002,

Weissman et al., 2003).

A centralização das funções neurogênicas e migratórias na CGR alerta para a

possibilidade de um eficiente controle regulatório, com a atividade de uma única célula

61

poder potencialmente influenciar tanto a produção neuronal como a arquitetura cortical.

Tendo em vista que algumas desordens neurológicas do desenvolvimento humano

associadas com malformações corticais envolvem defeitos na migração neuronal bem

como na produção desses neurônios (Sheen e Walsh et al., 2005; Mochida e Walsh,

2004), a modulação das funções da CGR pode ter importantes implicações clínicas.

Além disso, a morfologia única desta célula com o corpo celular na zona proliferativa e

uma fibra radial em contato com neurônios distantes do córtex em desenvolvimento

pode também permitir uma interação direta entre esta, que vem sendo interpretada

como um progenitor neural, e sua progênie, durante o desenvolvimento.

Apesar da expansão recente do conhecimento acerca das CGR, pouco ainda se

sabe sobre o repertório de agentes moleculares e os possíveis mecanismos de controle

de sua capacidade proliferativa e progenitora. Um mecanismo em potencial pode

envolver ondas de cálcio (Owens e Kriegstein, 1998) que são conhecidas por regular a

proliferação em vários tipos celulares (Berridge, 1995), também têm sido implicadas na

regulação da divisão celular na VZ (Owens e Kriegstein, 1998).

Como mostramos em trabalho anterior, na borda externa da SVZ concentram-se

os corpos celulares de glias radiais transformantes (Alves et al., 2002), sendo estes os

subtipos que julgamos reconhecer como células diretamente carregadas na SVZ neste

estudo. Também por nosso grupo, a cadeia de CGR foi demonstrada coincidindo

espacialmente com nichos de alta atividade proliferativa na borda externa da SVZ/RMS

(Menezes et al., 1998). Em adição, também demonstramos que os perfis de

acoplamento juncional, revelados pela técnica de carregamento por corte, na SVZ

ocupam estes mesmos nichos na borda externa (Menezes et al. 2000). Em conjunto,

estes achados apontam fortemente para um possível papel da comunicação juncional

62

apresentada pelas CGR na modulação da fisiologia da SVZ. Este papel via proteínas de

junções comunicantes poderia residir em: 1. compartimentalizar da SVZ – o

acoplamento entre as CGR observado nesta tese não parece envolver elementos

celulares da substancia branca ou mesmo os neuroblastos da SVZ; desta forma é

possível que o “túnel” formado por esta rede sincicial acoplada contribua na

coordenação de atividades de adesão celular, contribuindo para a estabilidade do

corredor glial (Peretto et al., 1997; Peretto et al., 2005; Xu et al., 2006; Elias et al.,

2007); 2. regular a secreção de fatores neurotróficos e substâncias neuromoduladoras

que sugere-se atuariam autocrina- e paracrinamente sobre a trama de neuroblastos em

atividades proliferativa e migratória (Mason et al., 2001; Stipursky e Gomes, 2007); 3.

controlar a transformação astrocitária da glia radial - A rede sincicial glial, ao garantir o

estabelecimento de um compartimento transcelular de CGR, poderia prover condições

à transformação do conjunto destas células em astroglia (Alves et al., 2002). Nem

mesmo sabemos ainda se esta influência é negativa, impedindo o curso desta

transformação, ou positiva, permitindo estas células a entrar no processo de

transformação em coortes. Resultados do nosso laboratório sugerem a primeira

hipótese, já que estas células parecem permanecer na borda externa da SVZ um longo

período (Alves et al., 2002). Além disto, pelo menos uma parte destas células

permanece nesta borda até a idade adulta (Menezes et al., 2008; manuscrito em

preparação). O acoplamento celular poderia por exemplo, atuar no sentido de manter

as CGR em um estado quiescente, conforme sua participação na maior parte das

linhagens tumorais estudadas (Trosko, 2007). Células totipotentes ou óvulos fertilizados

aparentemente não expressão genes de conexina ou tem a habilidade de formar

comunicação intercelular tipo gap, sendo assim acredita-se que toda célula tronco

63

mantêm-se na forma primitiva ou indiferenciada sendo seqüestrada de suas filhas

diferenciadas, sendo incapazes de acoplar com as células filhas (Trosko, 2000). Este

mesmo raciocínio poderia ser aplicado ao grupo de células acopladas próximo à luz

ventricular, aqui descrito, possuindo morfologia bipolar reminiscente as células

ependimárias. A rede de acoplamento que possivelmente envolve essas células

ependimárias poderia sustentar um sistema de sinalização para manutenção do estado

quiescente destas células (Spassky et al., 2005; Doetsch et al. 1999), embora alguns

estudos sejam contraditórios a esta suposta quiescência absoluta das células

ependimárias (Coskun et al., 2008; Johanson et al., 1999); 4. exercer uma função

tipicamente astrocitária como a manutenção da homeostase tecidual. O arranjo sincicial

das CGR poderia atuar no buffering de GABA e outras susbtâncias

neurotransmissoras/neuromoduladoras como fruto da sua atividade glial (Bolteus e

Bordey, 2004; Liu et al., 2006). Poder-se-ia imaginar que a comunicação juncional

envolvendo as CGR em redes sinciciais poderia contribuir com a formação de um

gradiente de moléculas na direção centro/periferia do corredor migratório representado

pela SVZ/RMS, determinando, junto a outros possíveis fatores, a existência e a

manutenção de domínios de fatores humorais que sustentassem os sub-

compartimentos já descritos na SVZ/RMS; exemplos seriam a acúmulo de células em

fase S na borda externa da SVZ, e os neuroblastos migratórios presentes no centro

desta camada (Menezes et al., 1998; Peretto et al., 2005).

Devido a sua posição e origem ontogenética, podemos considerar a CGR

presente na SVZ pós-natal como uma célula-tronco potencial, pelo menos uma

subpopulação destas (Merkle et al., 2007). A determinação de seu potencial progenitor

é objeto de estudo atualmente no nosso laboratório. Acreditamos que devido a sua

64

origem ontogenética cortical, as CGR estudadas nesta tese possam ter o potencial de

gerar neurônios piramidais, recapitulando seu potencial embrionário (Molyneaux et al.,

2005). Ou seja, estas CGRs, podem representar um manancial de células progenitoras

endógenas com o potencial de serem manipuladas com fins terapêuticos.

Lesões neurológicas são reconhecidamente incapacitantes e de difícil

tratamento, especialmente as que envolvem perda neuronal. A reposição neuronal

ainda é um objetivo desejável. Uma das estratégias em estudo atualmente é o

transplante de células ou precursores neuronais (Imitola, 2007; Gaillard et al., 2007;

Pfeifer et al., 2007). Deve-se levar em consideração que as atuais técnicas de

transplantes celulares têm as mesmas limitações de técnicas de transplante de órgãos

ou tecidos, como sofisticadas técnicas de cultivo/manutenção do material a ser

transplantado (Redmond et al., 2008), riscos de rejeição e mesmo a não incorporação

do transplante (Sinden et al. 1992) e outros como a produção de tumores e doenças

parasitárias dormentes (Steindler 2007; Siegel et al. 2007). Além disso, para

transplantes alogênicos, pode haver a necessidade de imunossupressão, amplamente

conhecida por diminuir o tempo de sobrevida do paciente por seus efeitos colaterais

(Sinden et al. 1992). Todos estes problemas seriam potencialmente evitados pela

ativação ou manipulação dos progenitores endógenos (Sohur et al., 2007). Sendo

assim, a manipulação das células tronco endógenas abre a possibilidade de uma

terapia mais barata, com maiores índices de sucesso e menores riscos para o paciente.

65

VI. Conclusões .

o A metodologia empregada foi capaz de marcar isoladamente as CGR e revelar uma

rede de células a estas acopladas por corante na SVZ/RMS.

o A distribuição das células acopladas mostrou-se concentrada em duas camadas: na

borda externa dorsal da SVZ e próxima à luz ventricular.

o Na SVZ, perfis de células acopladas são observados estendendo-se à região

posterior, enquanto anteriormente atingem a RMS.

o O acoplamento por corante é de natureza aparentemente homocelular.

o A comunicação juncional clássica, intermediada por conexinas, é sugerida como a

provável via de acoplamento por corante mediado pelas CGR neste modelo.

o Devido à exuberância e distribuição espacial, acreditamos que a comunicação

juncional estabelecida entre elementos gliais possa ser relevante para regulação da

neurogênese da SVZ pós natal.

66

VII.Referências bibliográficas .

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