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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
ANÁLISE FITOQUÍMICA E ATIVIDADE LEISHMANICIDA DE
FRAÇÕES DE SEMENTES DE ANNONA MURICATA L.
(ANNONACEAE) DE UM CULTIVO EM TOMÉ-AÇU, PARÁ
THIAGO FREITAS SILVA
BELÉM – PA
2017
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
ANÁLISE FITOQUÍMICA E ATIVIDADE LEISHMANICIDA DE
FRAÇÕES DE SEMENTES DE ANNONA MURICATA L.
(ANNONACEAE) DE UM CULTIVO EM TOMÉ-AÇU, PARÁ
Autor: Thiago Freitas Silva
Orientadora: Prof.ª Dra. Alaíde Braga de Oliveira
Co-orientadora: Prof.ª Dra. Maria Fâni Dolabela
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, área de concentração: Fármacos e Medicamentos, do Instituto de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Pará, em cumprimento às exigências para obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
BELÉM – PA
2017
ANÁLISE FITOQUÍMICA E ATIVIDADE LEISHMANICIDA DE
FRAÇÕES DE SEMENTES DE ANNONA MURICATA L.
(ANNONACEAE) DE UM CULTIVO EM TOMÉ-AÇU, PARÁ
FOLHA DE APROVAÇÃO
Thiago Freitas Silva
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, área de concentração: Fármacos e Medicamentos, do Instituto de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Pará, em cumprimento às exigências para obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Aprovado em:
Banca Examinadora
Prof.ª Dra. Alaíde Braga de Oliveira (Orientadora) Instituição: PPGCF UFPA
Ass:_______________________________________
Prof. Dr. Wagner Luiz Ramos Barbosa
Instituição: PPGCF UFPA
Ass:_______________________________________
Prof.ª Dra. Edilene Oliveira da Silva Instituição: ICBIO UFPA
Ass:_______________________________________
BELÉM – PA
2017
AGRADECIMENTOS
A Deus, como criador e sustentador de todas as coisas, única base
epistemológica suficiente para o conhecimento, e doador de boas dádivas aos
homens, dentre as quais a ciência e a racionalidade.
À minha família, na pessoa dos meus pais, como primeiros educadores e tão
dedicados mantenedores, sem os quais eu não teria alcançado quase nada do que
tive a alegria de alcançar, e na pessoa dos meus irmãos, companheiros de alegrias
e tristezas, que me motivam a ser um bom exemplo como irmão mais velho.
À minha noiva e companheira de laboratório, Anna Carolina Pontes, pelo
apoio, ânimo, discussão, crítica, compreensão e exemplo, todos prestados com
amor e atenção.
À minha orientadora, Profª Drª Alaíde Braga de Oliveira, pela amizade
construída, bem como sua inspiradora dedicação à pesquisa, e admirável paciência
para ensinar e orientar alguém comparativamente tão inexperiente.
À minha co-orientadora, Profª Drª Maria Fâni Dolabela, por todo apoio,
instrução, aconselhamento e amizade.
À doutoranda no PPGCF da UFMG, Tatiane Freitas Borgati, pelo
companheirismo e realização das análises por ressonância magnética nuclear, bem
como pelo auxílio na interpretação dos resultados.
Aos colegas mestrandos, Mirian Bastos, João Silva, Valdicley Vale e Heliton
Brigido, por toda ajuda na realização do trabalho, risadas compartilhadas, e
refeições divididas com alegria, regadas a conversas que podem mudar o mundo.
Ao Prof Dr Geraldo Célio Brandão, pela realização das análises por massas e
auxílio na interpretação dos resultados.
Ao ICBIM, da UFU, nas pessoas da Profª Drª Renata C. de Paula, Iasmin
Araújo e Juliana Miranda, pela realização dos testes de citotoxicidade e atividade
anti-amastigota.
À UFPA, em especial à secretaria e coordenação do PPGCF, representadas
pelas sras. Cliciane Melo e Maria Brasília, e pelo Prof Dr José Luiz Vieira.
Aos amigos do Laboratório de Farmacologia e Doenças Negligenciadas da
UFPA, e Laboratório de Fitoquímica da UFMG, pela prontidão em ajudar,
compartilhando conhecimento ou emprestando uma mão amiga, e por me
receberem tão bem, ainda que sendo um aluno de outra instituição.
Agradeço a cada pessoa que me auxiliou, torceu ou orou pelo meu sucesso.
EPÍGRAFE
“Quem tem conhecimento é comedido no falar, e quem tem entendimento é de espírito sereno”
-Bíblia Sagrada (NVI), Pv 17.27
“Pois o Senhor é quem dá sabedoria; de sua boca procedem o conhecimento e o
discernimento”
-Bíblia Sagrada (NVI), Pv 2.6
“O saber ensoberbece, mas o amor edifica”
-Bíblia Sagrada (ARA), 1 Co 8.1
“O primeiro passo em direção ao conhecimento
é saber que somos ignorantes”
-Richard Cecil
RESUMO
SILVA, T. F. Análise fitoquímica e atividade leishmanicida de frações de sementes de Annona muricata L. (Annonaceae) de um cultivo em Tomé-Açu, Pará. Dissertação, Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal do Pará, Belém, 2017. A leishmaniose é uma doença parasitária que representa um problema de saúde mundial. Poucos fármacos estão disponíveis para seu tratamento e estes apresentam graves efeitos colaterais, toxicidade, além de resistência do parasito e o inconveniente da administração parenteral. Annona muricata L., conhecida no Brasil como graviola, constitui rica fonte de acetogeninas, uma classe de produtos naturais com comprovada atividade leishmanicida. Este trabalho teve como objetivo identificar, quantificar e avaliar a atividade leishmanicida de frações ricas em acetogeninas de A. muricata contra formas promastigotas e amastigotas de Leishmania amazonensis. A partir de sementes coletadas de três exemplares em Tomé-Açu, Pará, foi preparado um extrato etanólico (EE) por percolação. O EE foi submetido a três diferentes processos de partição líquido-líquido envolvendo solventes de diferentes polaridades, gerando 9 frações: FH1, FCL1, FMH1, FDM2, FAE2, FMH2, FCL3, FAE3 e FMH3. As frações FAE2 e FCL3 foram submetidas a fracionamento por coluna cromatográfica (CC). Análises espectométricas revelaram as frações FAE2 e FCL3 e suas subfrações como as mais ricas em acetogeninas, contento 10 diferentes grupos de acetogeninas. Observou-se ainda uma concentração das acetogeninas em solventes de polaridade média, como acetato de etila e clorofórmio. As frações e subfrações avaliadas foram ativas contra formas promastigotas de L. amazonensis (6,48 ≤ CI50 ≤ 24,36 µg/mL), porém foram citotóxicas contra macrófagos murinos, apresentando, portanto, baixo índice de seletividade (0,98 ≤ IS ≤ 2,68). Esta citotoxicidade, no entanto, aponta para uma atividade antitumoral. Quanto a atividade anti-amastigota, as amostras foram pouco ativas (9 ≤ % de infecção ≤ 48). Palavras-chave: acetogeninas; atividade leishmanicida; Annona muricata; RMN
quantitativo.
ABSTRACT
SILVA, T. F. Phytochemical analysis and leishmanicidal activity of fractions from seeds of Annona muricata L. (Annonaceae) from a cultivation in Tomé-Açu, Pará. Master’s degree, Pharmaceutical Sciences Postgraduation Program, Universidade Federal do Pará, Belém, 2017. Leishmaniasis is a parasitic disease that represents a health problem around the world. Few drugs are available for its treatment, and these present serious collateral effects, toxicity, parasite resistance and the inconvenience of parenteral administration. Annona muricata L., known in Brazil as graviola, is a rich source of acetogenins, a class of natural products with proven leishmanicidal activity. This work aimed to identify, quantify and evaluate the leishmanicidal activity of acetogenin rich fractions of A. muricata against promastigote and amastigote forms of Leishmania amazonensis. An ethanol extract (EE) was prepared by percolation from seeds collected from three specimens in Tomé-Açu, Pará. EE was submitted to liquid-liquid partition by 3 different processes with solvents of varying polarity, giving 9 fractions: FH1, FCL1, FMH1, FDM2, FAE2, FMH2, FCL3, FAE3 and FMH3. Separations by column chromatography (CC) of fractions FAE2 and FCL3 were also performed. Spectrometric analyses revealed fractions FAE2 and FCL3 and its subfractions as acetogenin rich, containing 10 different groups of acetogenins. It was also observed a concentration of the acetogenins in medium polarity solvents as ethyl acetate and chloroform. The fractions and subfractions evaluated were active against promastigote forms of L. amazonensis promastigotes (6,48 ≤ CI50 ≤ 24,36 µg/mL), but cytotoxic against murine macrophages, thus presenting low selectivity index (0,98 ≤ SI ≤ 2,68).This cytotoxicity, though, points to a antitumoral effect. Regarding the anti-amastigote activity, the samples had low activity (9 ≤ % of infection ≤ 48). Palavras-chave: acetogenins; leishmanicidal activity; Annona muricata; qRNM.
LISTA DE ABREVIATURAS
AcOEt Acetato de Etila
CCS Cromatografia em Coluna de Sílica
CCD Cromatografia em Camada Delgada
CI50 Concentração Inibitória de 50%
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
DAD Detector de Arranjos de Diôdo
DMSO Dimetilsulfóxido
DMSO-d6 Dimetilsulfóxido deuterado
EE Extrato Etanólico
ESI Eletrospray Ionization
EtOH Etanol
FAE2 Fração Acetato de Etila Partição 2
FCL3 Fração Clorofórmio Partição 3
HEX n-Hexano
MeOH Metanol
RPMI Roswell Park Memorial Institute
TMS Tetrametilsilano
UV Ultravioleta
Vis Visível
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Ciclo biológico de Leishmania spp. ........................................................... 24
Figura 2- Estruturas químicas de fármacos leishmanicidas: (A) Anfotericina (B)
Miltefosina (C) Estibogluconato de sódio (Pentostam®) (D) Paromomicina (E)
Antimoniato de meglumina (Glucantime®) (F) Pentamidina ...................................... 26
Figura 3 - (A) Arbusto; (B) flor; (C) botão de flor e (D) fruto de Annona muricata ..... 28
Figura 4 – Diferentes tipos de unidades γ- lactona que ocorrem em acetogeninas .. 30
Figura 5 – Estruturas químicas de acetogeninas com unidade γ-lactona do tipo A .. 31
Figura 6 - Exemplo de fragmentações características de acetogeninas em
espectometria de massas com ionização por impacto eletrônico (Coibina A) ........... 37
Figura 7 - Estruturas químicas de anonacina (A) e uvaricina (B) .............................. 38
Figura 8 - Fluxograma da partição líquido-líquido do Extrato Etanólico pelo Método 1.
MeOH/H2O: solução metanol/água 1:1 ..................................................................... 46
Figura 9 - Fluxograma da partição líquido-líquido do Extrato Etanólico pelo Método 2.
MeOH/H2O: solução metanol/água 1:1 ..................................................................... 47
Figura 10 - Fluxograma da separação dos cristais formados no Extrato Etanólico da
porção solúvel em n-hexano. .................................................................................... 47
Figura 11 - Fluxograma da partição líquido-líquido do Extrato Etanólico pelo Método
3. MeOH/H2O: solução metanol/água 1:1 ................................................................. 48
Figura 12 - Disposição das amostras nas placas de 96 poços.................................. 55
Figura 13 - Fórmula para cálculo de células viáveis .................................................. 55
Figura 14 – Cromatograma por CCD do extrato etanólico e porção solúvel em n-
hexano ...................................................................................................................... 63
Figura 15 – Cromatograma por CCD das frações provenientes das partições ......... 63
Figura 16 - Cromatograma por CLAE-DAD do extrato etanólico e suas frações com
tempo de retenção (TR) de picos de interesse.......................................................... 65
Figura 17 - Espectros de absorção no UV de picos do Extrato Etanólico registrados
por CLAE-DAD .......................................................................................................... 66
Figura 18 - Cromatogramas por CLAE-DAD das frações da primeira partição ......... 67
Figura 19 - Espectros de absorção no UV online de picos dos cromatogramas por
CLAE-DAD referentes às frações da primeira partição ............................................. 68
Figura 20 - Estruturas químicas de duas acetogeninas ............................................ 68
Figura 21 - Espectros de absorção no UV online dos picos majoritários nos
cromatogramas por CLAE-DAD das frações da segunda partição ........................... 70
Figura 22 - Cromatogramas por CLAE-DAD das frações da segunda partição ........ 70
Figura 23 - Espectros de absorção no UV online de picos do cromatograma por
CLAE-DAD referentes à fração acetato de etila 2 (FAE2). ........................................ 71
Figura 24 – Cromatogramas em CLAE-DAD das frações da terceira partição ......... 72
Figura 25 - Espectros de absorção no UV online de picos dos cromatogramas em
CLAE-DAD referentes às frações da terceira partição .............................................. 72
Figura 26 - Espectros de absorção no UV online de picos do cromatograma em
CLAE-DAD referentes à fração clorofórmica 3 (FCL3). ............................................. 73
Figura 27- Perfis cromatográficos por CLAE-DAD da subfração nº 5 (FAE2(5)) obtida
a partir da fração acetato de etila 2 por cromatografia de coluna em duas diferentes
programações. .......................................................................................................... 75
Figura 28 - Espectros de absorção no UV online de picos no cromatograma por
CLAE-DAD da subfração nº 5 (FAE2(5)) obtida a partir da fração acetato de etila por
cromatografia de coluna ............................................................................................ 76
Figura 29- Perfis cromatográficos por CLAE-DAD da subfração FAE2(5.5) e
espectros no UV online dos picos majoritários. ......................................................... 78
Figura 30- Perfis cromatográficos por CLAE-DAD da subfração FAE2(5.6) e
espectros no UV online dos picos majoritários. ......................................................... 78
Figura 31 - Espectros de absorção no UV online de picos dos cromatogramas por
CLAE-DAD referentes à subfração FAE2(5.5). ......................................................... 79
Figura 32 - - Espectros de absorção no UV online de picos nos cromatogramas por
CLAE-DAD referentes à subfração FAE2(5.6). ......................................................... 79
Figura 33 – Cromatograma de Íons Totais (CIT) do extrato etanólico no modo
positivo. ..................................................................................................................... 83
Figura 34 – Espectro de massas do Extrato Etanólico registrado na faixa de 450 a
700 m/z. .................................................................................................................... 83
Figura 35 - Espectro de massas da FAE2 registrado no intervalo de 450 a 700 m/z.
.................................................................................................................................. 86
Figura 36- Espectro de massas da FAE 2(5.6) compreendido entre os TR 7 e 12
minutos registrados entre 450 e 700 m/z. ................................................................. 87
Figura 37 - Espectro de massas da FAE 2(5.5) compreendido entre os TR 7 e 12
minutos registrados entre 450 e 700 m/z. ................................................................. 87
Figura 38 - Espectro de massas da FCL3 compreendido entre os TR 7 e 12 minutos
registrados entre 450 e 700 m/z.. .............................................................................. 88
Figura 39 - Espectro de massas da FCL 3.7 compreendido entre os TR 7 e 12
minutos registrados entre 450 e 700 m/z. ................................................................. 89
Figura 40 - Espectro de massas da FCL 3.9 compreendido entre os TR 7 e 12
minutos registrados entre 450 e 700 m/z. ................................................................. 90
Figura 41 - Espectro de RMN de 1H de EE, com destaques para os deslocamentos
característicos de acetogeninas ................................................................................ 92
Figura 42 - Espectro de RMN de 1H de FAE2 seccionado, com destaques para os
deslocamentos característicos de acetogeninas ....................................................... 93
Figura 43 - Espectro de RMN de 1H de FCL3 seccionado, com destaques para os
deslocamentos característicos de acetogeninas ....................................................... 94
Figura 44 - Espectro de RMN de 1H de EE com adição de antraceno e amplianção
da região com sinais utilizados para quantificação ................................................... 96
Figura 45 - Espectros de RMN 1H de FAE2, FCL3, FCL3.7 e FCL3.12, com adição
de antraceno e amplianção da região com sinais utilizados para quantificação ....... 97
Figura 46 - Estruturas químicas das acetogeninas anonacina e solamina ................ 98
Figura 47 - Estruturas químicas das acetogeninas corossolona e coibina C ............ 99
Figura 48 – Imagens de macrófagos obtidas no ensaio de atividade anti-amastigota
de FCL 3.12 ............................................................................................................. 102
Figura 49 - Imagens de macrófagos obtidas no ensaio de atividade anti-amastigota
de FCL 3.12 ............................................................................................................. 102
Figura 50 - Estrutura química da acetogenina bulatacina ....................................... 103
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Valores de deslocamentos químicos (δ) característicos de diferentes tipos
de lactonas terminais de acetogeninas em espectros de RMN de 1H ....................... 33
Tabela 2 - Valores de deslocamentos químicos (δ) característicos de diferentes tipos
de lactonas terminais de acetogeninas em espectros de RMN de 13C ...................... 33
Tabela 3 - Valores de deslocamentos químicos (δ) característicos de diferentes
acetogeninas em espectros de RMN de 1H ............................................................... 34
Tabela 4 - Valores de deslocamentos químicos (δ) característicos de diferentes
acetogeninas em espectros de RMN de 13C ............................................................. 35
Tabela 5 - Programação A: Condições utilizadas nas análises por CLAE-DAD........ 50
Tabela 6 - Programaçao B: Condições utilizadas nas análises por CLAE-DAD........ 50
Tabela 7 - Condições utilizadas nas análises por CLUE-DAD-IES-MS ..................... 51
Tabela 8 - Critérios para classificação da atividade leishmanicida de acordo com
valores CI50 ............................................................................................................... 56
Tabela 9 - Rendimentos do processo extrativo das sementes de Annona muricata e
partições do extrato etanólico.................................................................................... 60
Tabela 10- Resultados da detecção de acetogeninas por cromatografia em camada
delgada ..................................................................................................................... 62
Tabela 11 – Número de subfrações coletadas, com suas massas, de acordo com o
eluente utilizado, na coluna cromatográfica da fração acetato de etila 2 (FAE2) ...... 74
Tabela 12 - Número de subfrações coletadas, com suas massas, de acordo com o
eluente utilizado, na coluna cromatográfica da subfração nº 5 (FAE2(5)) obtida a
partir da fração acetato de etila 2 .............................................................................. 77
Tabela 13 - Número de subfrações coletadas, com suas massas, de acordo com o
eluente utilizado, na coluna cromatográfica da fração clorofórmica da terceira
partição (FCL3) ......................................................................................................... 80
Tabela 14 - Massa dos fragmentos esperados de acetogeninas de acordo com sua
massa molar. ............................................................................................................. 82
Tabela 15 - Acetogeninas já isoladas de sementes de Annona muricata com massas
moleculares 578 e 596. ............................................................................................. 84
Tabela 16 - Acetogeninas já isoladas de sementes de Annona muricata com massas
576, 580 e 624. ......................................................................................................... 85
Tabela 17 - Concentrações de acetogeninas obtida por qRMN de 1H no extrato
etanólico e frações analisadas .................................................................................. 95
Tabela 18 - CI50 das subfrações analisadas para atividade antipromastigota em
Leishmania amazonensis ........................................................................................ 100
Tabela 19 - Atividade anti-amastigota em Leishmania amazonensis das subfrações
analisadas (percentual de infecção). ....................................................................... 101
Tabela 20 - Valores da concentração citotóxica (CC50) das frações analisadas em
linhagem de macrófago murino (RAW 264.7). ........................................................ 103
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 18
2 REVISÃO DA LITERATURA .................................................................................. 21
2.1 Leishmaniose ................................................................................................... 21
2.2 Annona muricata L. .......................................................................................... 26
3 OBJETIVOS ........................................................................................................... 40
3.1 Objetivo geral ................................................................................................... 40
3.2 Objetivos específicos ....................................................................................... 40
4 MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................................... 41
4.1 Material ............................................................................................................ 41
4.1.1 EQUIPAMENTOS ...................................................................................... 41
4.1.2 SOLVENTES ............................................................................................. 41
4.1.3 FASES ESTACIONÁRIAS ......................................................................... 41
4.1.4 MEIO DE CULTURA E OUTROS .............................................................. 42
4.1.5 REVELADORES PARA CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA
(CCD) .................................................................................................................. 42
4.1.5.1 Anisaldeído - Ácido Sulfúrico (AS) .......................................................... 42
4.1.5.2 Reagente Kedde ..................................................................................... 42
4.1.6 PREPARO DOS MEIOS DE CULTIVO ...................................................... 42
4.1.7 MATERIAL BIOLÓGICO ............................................................................ 43
4.1.7.1 Parasito Leishmania ............................................................................... 43
4.1.8 MATERIAL VEGETAL ............................................................................... 43
4.2 Métodos ........................................................................................................... 44
4.2.1 ANÁLISES FARMACOGNÓSTICAS ......................................................... 44
4.2.1.1 pH ........................................................................................................... 44
4.2.1.2 Perda por dessecação ............................................................................ 44
4.2.1.3 Teor de cinzas totais ............................................................................... 44
4.2.1.4 Densidade aparente ................................................................................ 44
4.2.1.5 Granulometria ......................................................................................... 45
4.2.2 PREPARAÇÃO DO EXTRATO ETANÓLICO DE SEMENTES (EE) ......... 45
4.2.3 PARTIÇÕES LÍQUIDO-LÍQUIDO DO EXTRATO ETANÓLICO DE
SEMENTES (EE) ................................................................................................ 45
4.2.3.1. Método 1 - Primeira partição líquido-líquido .......................................... 45
4.2.3.2. Método 2 - Segunda partição líquido-líquido ......................................... 46
4.2.3.3. Método 3 - Terceira partição líquido-líquido ........................................... 47
4.2.4 FRACIONAMENTO DE FAE2 POR CROMATOGRAFIA EM COLUNA DE
SÍLICA GEL (CCS) ............................................................................................. 48
4.2.5 - FRACIONAMENTO DE FCL3 POR CROMATOGRAFIA EM COLUNA DE
SÍLICA GEL (CCS) ............................................................................................. 49
4.2.6 DETECÇÃO DE ACETOGENINAS POR CROMATOGRAFIA EM CAMADA
DELGAGA (CCD) ............................................................................................... 49
4.2.7 ANÁLISES POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA
ACOPLADA A DETECTOR DE ARRANJOS DE DIÔDOS (CLAE-DAD). .......... 50
4.2.8 ANÁLISES POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ULTRA EFICIÊNCIA
ACOPLADA A DETECTOR DE ARRANJO DE DIÔDOS (CLUE-DAD) E
ESPECTÔMETRO DE MASSAS COM IONIZAÇÃO POR ELECTROSPRAY
(IES-MS) ............................................................................................................. 51
4.2.8.1 Identificação de acetogeninas no extrato e frações a partir das análises
por CLUE-EM-IES .............................................................................................. 51
4.2.9 ANÁLISES POR RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR DE
HIDROGÊNIO E CARBONO-13 (RMN de 1H e de 13C)...................................... 52
4.2.9.1 Identificação de acetogeninas no extrato etanólico e frações a partir das
análises de RMN de 1H e de 13C ........................................................................ 53
4.2.9.2 Quantificação de acetogeninas no extrato etanólico e frações por RMN 53
4.2.10 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE LEISHMANICIDA ...................................... 54
4.2.10.1 Atividade anti-promastigota .................................................................. 54
4.2.10.2 Atividade antiamastigota ....................................................................... 56
4.2.10.3 Atividade citotóxica ............................................................................... 56
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO .............................................................................. 58
5.1 Características farmacognósticas do pó das sementes de Annona muricata .. 58
5.2 Investigação de acetogeninas por CCD e CLAE-DAD ..................................... 59
5.2.1 EXTRATO ETANÓLICO E FRAÇÕES DAS PARTIÇÕES ......................... 59
5.2.2 FRACIONAMENTO CROMATOGRÁFICO DE FAE2 E FCL3 ................... 73
5.4 Análises por CLUE-EM-IES de frações contendo acetogeninas ...................... 81
5.5 Identificação e quantificação de acetogeninas por qRMN de 1H ...................... 91
5.6 Atividade antileishmania .................................................................................. 98
6 CONCLUSÃO ....................................................................................................... 104
7 REFERÊNCIAS .................................................................................................... 105
18
1 INTRODUÇÃO
As leishmanioses são um grupo de doenças negligenciadas, comumente
associadas à pobreza, e que tem maior ocorrência em países do norte e leste
africano, do sudeste asiático e América Latina. Estima-se que 1,5 milhões de novos
casos ocorram por ano no mundo, provocando entre 20 e 30 mil óbitos. São duas as
principais manifestações clínicas desta patologia, a leishmaniose visceral (LV) e
leishmaniose tegumentar (LT). O Brasil é um dos seis países responsáveis por 90%
dos casos de LV no mundo. Esta forma da doença atinge 23 das 27 Unidades
Federativas, ocasionando de 200 a 300 óbitos/ano. A LT pode ser encontrada em
todas as Unidades Federativas, com registro de 233.638 casos entre os anos de
1990 e 2013, os quais se concentram principalmente na região Norte. O Brasil se
encontra no grupo de países nos quais ocorre um terço dos casos de LT no mundo
(BRASIL, 2014; WHO, 2015).
As leishmanioses são causadas por parasitos de mais de 20 espécies do
gênero Leishmania, os quais geram diferentes manifestações da doença, ou casos
assintomáticos (BATES, 2008; WHO, 2015). A LV é a forma mais grave, letal se não
tratada, e caracteriza-se por febre, perda de peso, hepato-esplenomegalia e anemia.
A LT subdivide-se em três: a leishmaniose cutânea localizada (LCL), forma mais
comum da doença, manifesta-se através de lesões no local da infecção, as quais
são indolores, com bordas bem definidas, fundo avermelhado e base eritematosa. A
leishmaniose muco-cutânea (LMC), que causa lesões destrutivas localizadas na
mucosa, em geral nas vias aéreas superiores. E a leishmaniose cutânea difusa
(LCD), uma forma rara de leishmaniose, relacionada a uma reação imune
inadequada. Nesta, uma disseminação do parasito leva ao surgimento de várias
lesões não ulcerosas espalhadas pelo corpo (BRASIL, 2014).
O tratamento das leishmanioses, no Brasil, é realizado principalmente por
quimioterapia com antimoniais pentavalentes (Sb5+) como Glucantime® ou,
alternativamente, Anfotericina B e Pentamidina. Em geral, os fármacos utilizados
contra a leishmaniose requerem tempo prolongado de uso, administração via
parenteral e provocam vários efeitos adversos. Estes fatores levam a uma baixa
adesão à terapia, o que tem contribuído para o surgimento de parasitos resistentes.
19
Este quadro aponta a necessidade de desenvolvimento de novos fármacos
leishmanicidas. Na área de pesquisa, desenvolvimento e inovação de fármacos
várias estratégias podem ser adotadas, dentre as quais a validação do uso popular
de plantas com fins medicinais, e a obtenção de moléculas promissoras a partir de
plantas (BRASIL, 2014; WHO, 2010).
Annona muricata, árvore arbustiva comum na região Norte, é conhecida no
Brasil como graviola, e possui importância econômica principalmente devido a seus
frutos, que são comercializados na forma de polpa, sucos, doces e sorvetes. Além
disso, a graviola também é utilizada para fins medicinais. A decocção das suas
folhas, por exemplo, é utilizada por comunidades tradicionais brasileiras como
analgésico, para emagrecimento e contra o diabetes, e o suco da fruta contra
parasitos intestinais (BENEVAL et al. 2016; CAETANO, SOUZA e FEITOZA, 2014).
Em outras partes do mundo, no entanto, diferentes usos são atribuídos a várias
partes da planta. De especial interesse é a utilização de suas folhas por nativos da
Malásia para tratar úlceras decorrentes da leishmaniose tegumentar (BADRIA e
SCHAUSS, 2009). Estudos científicos têm servido de fundamentação para este uso
ao identificar extratos metanólicos e etanólicos de diferentes partes de A. muricata
com atividade promissora contra promastigotas de diferentes espécies de
Leishmania, relacionando esta atividade à presença de acetogeninas nestes extratos
(OSORIO et al. 2007; VILA-NOVA et al. 2013). As acetogeninas são uma classe de
metabólitos secundários presentes em todas partes de A. muricata, mas
encontrados em maior abundância nas sementes (MOGHADAMTOUSI et al. 2015).
Portanto, ainda que o uso tradicional da graviola contra leishmaniose esteja mais
relacionado às suas folhas, uma vez que sua atividade leishmanicida está associada
a presença de acetogeninas, e as mesmas encontram-se principalmente nas
sementes, levando-se em consideração ainda que as sementes são uma parte da
planta normalmente descartada no processo produtivo de polpas, estas despontam
como de interesse para estudos que investiguem sua atividade leishmanicida,
visando seu aproveitamento (LIAW et al. 2010).
Este trabalho buscou avaliar a atividade leishmanicida de sementes de
graviola cultivadas na região amazônica (Tomé-Açu, Pará), a qual, sendo
comprovada, poderia incentivar o aproveitamento das sementes e, portanto,
20
agregaria valor ao que normalmente é tratado como resíduo no processo de
beneficiamento da graviola para produção de polpas, doces, etc., uma atividade
bastante explorada no estado do Pará. Além disso, uma maior valorização das
sementes de A. muricata contribuiria para o crescimento da agricultura familiar,
principal responsável pelo seu cultivo hoje (LEMOS, 2014; SOUZA, PEREIRA e
FONSECA, 2012).
21
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Leishmaniose
As leishmanioses, um grupo de doenças causadas por parasitos do gênero
Leishmania, estão entre as doenças classificadas como doenças tropicais
negligenciadas. Possuem uma prevalência global de 14 milhões de casos e uma
incidência anual de 1,5 a 2 milhões de novos casos. São também responsáveis por
20 a 30 mil mortes por ano, estimando-se que 350 a 400 milhões de pessoas
estejam em risco de infecção. Este grupo de doenças ocorre em 98 países, sendo
que 79 destes são países em desenvolvimento (ALVAR et al. 2006; WHO, 2010).
As leishmanioses podem ser classificadas em dois tipos, de acordo com suas
manifestações clínicas, que são: Leishmaniose Visceral (LV), e Leishmaniose
Tegumentar (LT). Esta última se subdivide em: cutânea localizada (LCL);
mucocutânea (LMC); e cutânea difusa (LCD). A forma da doença que irá se
manifestar depende da espécie do parasito infectante; da espécie do vetor
transmissor; e de características do hospedeiro (genéticas e de resposta imune).
Esta multiplicidade de fatores torna a leishmaniose uma das doenças de mais
complexa epidemiopatogênese (SHARMA e SINGH, 2008; WHO, 2015).
No mundo todo são registrados de 200 a 400 mil novos casos de LV por ano.
Destes, 90% ocorrem em apenas cinco países, entre os quais está o Brasil, onde o
agente causador desta doença é Leishmania (Leishmania) chagasi. O Brasil é o
responsável pela quase totalidade de casos de LV nas Américas. Casos autóctones
são relatados em 22 dos Estados brasileiros, estando a maioria deles concentrados
na região Nordeste (BRASIL, 2014; WHO, 2015). A LV é a forma mais perigosa de
leishmaniose e leva a óbito em 90% dos casos se não tratada (BRASIL, 2010).
A LT possui ampla distribuição mundial, com mais de 1 milhão de casos
registrados por ano. Nas Américas pode ser encontrada desde o sul dos Estados
Unidos até o norte da Argentina, com exceção de Chile e Uruguai. O Brasil encontra-
se entre os sete países do mundo com maiores taxas de leishmaniose cutânea, e é
o país da América do Sul com maior número de casos (ALVAR et al. 2012). No
Brasil, desde 2003, são notificados casos autóctones de LT em todos os Estados da
22
Federação, e a região Norte é a que possui o maior número de casos confirmados,
tendo sido registrados 233.638 casos entre os anos de 1990 e 2013 (BRASIL, 2014).
A LT é uma doença dermatológica infecciosa, não contagiosa que, ainda que muitas
vezes não seja fatal, exige atenção por causar deformidades que afetam tanto o
âmbito psicossocial como podem incapacitar o indivíduo infectado para exercer suas
funções (REITHINGER, 2005).
A LCL, forma mais comum da LT, é uma forma de leishmaniose em que os
parasitos se restringem ao local da infecção, causando lesões limitadas que podem
ser múltiplas. Esta forma de leishmaniose em muitos casos segue com cura
espontânea ou gera um caso assintomático, o que pode ser um problema, pois o
infectado passa a agir como reservatório. A LCL pode ser causada por: Leishmania
(Viannia) guyanensis, Leishmania (Leishmania) amazonensis e Leishmania (Viannia)
braziliensis (BRASIL, 2014).
A LMC é um tipo de leishmaniose que gera mutilações mucocutâneas. Ela
inicia-se com uma infecção local, através da qual os parasitos chegam até as
mucosas por via linfática ou hematogênica, e ali, devido a uma resposta imune
exagerada, ocorrem as lesões. Estas lesões comumente sofrem infecção bacteriana
secundária e, diferentemente da LCL, não cicatrizam por si só, o que pode agravar o
quadro geral do paciente e eventualmente levar a óbito. O principal agente causador
da LMC no Brasil é a L. (V.) braziliensis (LOPES et al. 2010).
A LCD é a forma mais rara de LT e se origina por uma complicação
imunológica do hospedeiro. Caracteriza-se por uma intensa proliferação do parasito,
gerando várias lesões crônicas não ulcerosas com formação de pápulas, nódulos ou
infiltrações difusas. Muitas vezes mesmo com o tratamento a doença não involui, ou
então após curto período de tempo há recidiva. No Brasil, a espécie causadora de
LCD é L. (L.) amazonensis (BARRAL et al. 1995).
Leishmania é um protozoário intracelular pertencente à ordem Kinetoplastida,
família Trypanosomatidae e gênero Leishmania. Este gênero se subdivide em
complexos agrupados em dois subgêneros: Leishmania e Viannia. O subgênero
Leishmania reúne espécies causadoras de LT e LV, e são algumas delas: L. (L.)
major e L. (L.) tropica, responsáveis pela leishmaniose tegumentar no Velho Mundo;
23
L. (L.) mexicana, L. (L.) amazonensis, L. (L.) pifanoi e L. (L.) venezuelensis,
causadoras de leishmaniose tegumentar nas Américas; e L. (L.) donovani, L. (L.)
infantum e L. (L.) chagasi, causadoras de leishmaniose visceral. Já o subgênero
Viannia agrupa espécies causadoras de LT apenas, como: L. (V.) braziliensis, L. (V).
guyanensis, L. (V.) panamensis, e L. (V.) peruviana (LAINSON e SHAW, 1987). No
total, são cerca de vinte espécies patogênicas ao homem (CDC, 2014).
O ciclo biológico dos parasitos causadores da leishmaniose (Figura 1) ocorre
quando a fêmea infectada do inseto flebotomíneo do gênero Phlebotomus (vetores
nos países do Velho Mundo) ou Lutzomyia (vetores nos países do Novo Mundo),
introduz na pele de um mamífero suscetível formas promastigotas metacíclicas do
parasito Leishmania (COLLIN et al. 2009; NEVES et al. 2016). No hospedeiro
vertebrado, os promastigotas são fagocitados por células mononucleares,
principalmente macrófagos, nos quais ficarão restritos ao fagolisossomo (junção do
fagossomo com lisossomos). Ali, por influência do ambiente ácido, os promastigotas
transformam-se em amastigotas, os quais diminuem a atividade microbicida do
macrófago. Após a transformação, eles se multiplicam por divisão binária até que o
macrófago se rompa, liberando novos amastigotas que poderão infectar células
dendríticas, fibroblastos ou outros macrófagos. O ciclo tem continuidade quando o
flebotomíneo se infecta com o parasito ao ingerir células dendríticas ou macrófagos
infectados por amastigotas, os quais se transformarão em promastigotas em seu
trato gastrointestinal e se multiplicarão por divisão binária até atingirem o estágio de
promastigotas metacíclicas, quando o inseto poderá inoculá-las em um novo
hospedeiro mamífero, reiniciando-se o ciclo (SHARMA e SINGH, 2008). Apesar
desta ser a forma clássica de transmissão da leishmaniose, a infecção também pode
ocorrer por transfusão sanguínea, transplante de órgãos ou congenitamente (PAVLI
e MALTEZOU, 2010). Além do homem, existem outros hospedeiros vertebrados
para a Leishmania, como: roedores, marsupiais e canídeos, inclusive o cão
doméstico (Canis familiaris) (GRAMICCIA e GRADONI, 2005).
24
Figura 1 - Ciclo biológico de Leishmania spp.
Fonte: SILVA, 2012.
Os fármacos de primeira escolha na terapia leishmanicida são os antimoniais
pentavalentes (Sb5+), os quais foram desenvolvidos há mais de 70 anos. Existem
dois principais fármacos deste tipo utilizados, o estibogluconato de sódio
(Pentostan®) e o antimoniato de meglumina (Glucantime®). O primeiro é produzido
no Reino Unido e geralmente utilizado nos países que o compõe, nos EUA e na
maioria dos países da África e Oriente Médio, enquanto o segundo, produzido na
França e no Brasil, é mais comumente utilizado em países de língua francesa e na
América Latina. Ambos apresentam eficácia limitada, efeitos tóxicos e colaterais
frequentes, administração parenteral, e restrição de uso no caso de grávidas e
pacientes infectados com HIV (AMATO et al. 2000). Associado a esses fatores, o
tratamento prolongado (no mínimo 20 dias, podendo chegar até 40 dias) com altas
doses faz com que muitos pacientes abandonem o tratamento antes do seu término,
favorecendo o surgimento de resistência do parasito em larga escala. Na Índia por
exemplo, o tratamento com antimoniais foi banido, uma vez que em algumas
localidades as cepas que infectavam a população possuíam 100% de resistência a
esse fármaco (MOHAPATRA, 2014).
Uma opção ao tratamento com antimoniais é a Anfotericina B, um antibiótico
que age ligando-se ao ergosterol da membrana plasmática do parasito, aumentando
Transmitidos durante repasto
Transmitidos durante repasto
25
sua permeabilidade e afetando seu equilíbrio osmótico, causando sua morte. Este
fármaco também é de administração parenteral e possui uma série de efeitos tóxicos
graves e tratamento igualmente longo, o que restringe seu uso (MOLINA et al.
2007). No entanto, há uma versão deste medicamento conhecida como Anfotericina
B Lipossomal que utiliza nanotecnologia para restringir a ação da molécula às
células do sistema fagocitário mononuclear, reduzindo assim grandemente seus
efeitos adversos. Esta seria a melhor escolha medicamentosa para o tratamento da
leishmaniose, mas seu alto custo restringe seu uso em larga escala (BRASIL, 2007;
RATH et al. 2003).
Existem ainda outros fármacos leishmanicidas considerados de segunda linha
como a Paromomicina, Pentamidina (Lomidina®) e Miltefosina. Apesar da
Pentamidina ser a mais utilizada como fármaco de segunda escolha, é importante
chamar a atenção para a Miltefosina, que é o único medicamento utilizado no
tratamento das leishmanioses que possui administração por via oral, além de
apresentar menos efeitos adversos que os demais. Seu uso se dá principalmente na
Índia, mas possui limitações pelo seu efeito teratogênico e pequena janela
terapêutica (SINGH, KUMAR e SINGH, 2012).
Em síntese, os fármacos disponíveis para o tratamento da leishmaniose
possuem efeitos tóxicos e graves reações adversas (MOLINA et al. 2007), o tempo
de tratamento é prolongado e na maioria dos casos por via parenteral, sendo ainda o
custo do tratamento elevado (BRASIL, 2014), e a resistência do parasito crescente
(MOHAPATRA, 2014).
Mediante o exposto, a busca de novos fármacos assume um caráter de
urgência e as plantas despontam como fontes de novas moléculas ativas (CRAGG e
NEWMAN, 2013; WHO, 2010).
26
2.2 Annona muricata L.
A família Annonaceae, à qual pertence a espécie Annona muricata L., é a
maior das 6 famílias pertencentes à ordem Magnoliales, e junto da família
Magnoliaceae está entre as mais estudadas da ordem citada (APG, 2003). Também
conhecida como custard apple family, ou família da ata, esta possui cerca de 135
gêneros e 2500 espécies, as quais podem ser encontradas principalmente em zonas
tropicais, sendo algumas poucas espécies encontradas em regiões temperadas
(RICHARDSON et al. 2004). Constituída por árvores, arbustos e mais raramente
trepadeiras, usualmente perenifólias, esta família recebe seu nome da palavra latina
(B) (A)
(C) (D)
(F) (E)
Figura 2- Estruturas químicas de fármacos leishmanicidas: (A) Anfotericina (B) Miltefosina (C)
Estibogluconato de sódio (Pentostam®) (D) Paromomicina (E) Antimoniato de
meglumina (Glucantime®) (F) Pentamidina
27
anon, que significa algo como produção precoce, referindo-se à grande produção de
frutos característica nas Annonaceae (NRCS, 2008).
Muitas das espécies de Annonaceae possuem grande importância econômica
como fonte de frutos e óleos comestíveis, como por exemplo Annona squamosa,
Annona muricata e Annona senegalensis; outras como fonte de fragrâncias para a
perfumaria, como Cananga odorata; e de maneira geral, muitas são usadas
medicinalmente em vários países para o tratamento de diversas enfermidades,
inclusive no tratamento de males associados ao câncer, e tumores (BINDU, 1998;
MOGHADAMTOUSI et al. 2015).
Apesar de, relativamente ao seu tamanho, a família Annonaceae ser
considerada umas das famílias menos estudadas fitoquimicamente (BINDU, 1988),
já foram identificados como componentes de interesse nesta família alcaloides,
principalmente isoquinolínicos, e as acetogeninas, as quais são promissoras como
agentes antitumorais e antiparasitários. Até o presente momento, cerca de 400
acetogeninas já foram isoladas de Annonaceae (AMINIMOGHADAMFAROUJ,
2011).
O gênero Annona possui mais de 120 espécies catalogadas. No Brasil já
foram identificadas 30 dessas espécies na região amazônica, área de maior
concentração de espécies desse gênero no continente americano. O gênero Annona
tem sido estudado por possuir espécies com grande interesse econômico e
alimentício, como Annona muricata L., Annona squamosa L. e Annona reticulata L.,
além de ser fonte de acetogeninas e alcaloides isoquinolínicos (MOSCA,
CAVALCANTES e DANTAS, 2006).
28
Figura 3 - (A) Arbusto; (B) flor; (C) botão de flor e (D) fruto de Annona muricata
Annona muricata L., conhecida como soursop (inglês), guanabana (espanhol)
e, no Brasil, como gravioleira, é uma árvore terrestre, perenifólia, de caráter ereto,
medindo de 5 a 8 metros de altura quando adulta, com uma copa aberta e
arredondada. Possui folhas grandes, de um verde escuro brilhante. Sua fruta,
graviola, é comestível e de grande tamanho, com formato de coração, chegando a
ter entre 15 e 20 cm de diâmetro (Figura 3) (SOUZA et al. 2009).
Além do uso da polpa do seu fruto para a preparação de sucos, sorvetes,
doces e cremes, todas as demais partes da planta, como folhas, sementes, cascas,
raízes e flores de A. muricata têm sido amplamente utilizados para fins medicinais
por comunidades nas Américas, África e Índia. É utilizada para o tratamento de
artrite, neuralgia, reumatismo, diarreia, disenteria, febre, malária, escoriações,
vermes, cistite, diabetes, dores de cabeça, insônia, abscessos, úlceras provocadas
AA BB
DD CC
29
por leishmaniose, afecções associadas ao câncer e, ainda, como inseticida, larvicida
e piscicida (ADEWOLE e CAXTON-MARTINS, 2006; ADEWOLE e OJEWOLE, 2009;
BENEVAL et al. 2016; CAETANO, SOUZA e FEITOZA, 2014; MISHRA, AHMAD e
SHARMA, 2013).
Os efeitos de A. muricata foram avaliados em diferentes ensaios
biológicos/farmacológicos, tendo sido observadas importantes atividades
relacionadas aos seus principais constituintes bioativos (alcaloides, acetogeninas,
megastigmanas, flavonoides, fenóis e ciclopeptídeos), como: antidepressiva,
citotóxica para diversas linhagens de câncer, neurotóxica, moluscicida,
antileishmania, inseticida, antimalárica, anti-inflamatória, hipoglicemiante,
anticonvulsionante, entre outras (MOGHADAMTOUSI et al. 2015).
2.3 Acetogeninas
Dentre os constituintes bioativos encontrados em A. muricata, as
acetogeninas, em especial, têm chamado atenção, e até o momento mais de 100
diferentes representantes desta classe já foram isolados desta espécie, a maioria
possuindo atividade anticâncer e antiparasitária (MOGHADAMTOUSI et al. 2015). As
acetogeninas são uma classe distinta de metabólitos secundários, com 35 ou 37
carbonos, caracterizados por possuírem uma longa cadeia alifática de 32 ou 34
carbonos, não ramificada, apresentando em uma das extremidades um anel de γ-
lactona, além de diferentes funções oxigenadas, que podem ser hidroxilas,
carbonilas cetônicas, anéis oxirânicos (epóxidos), anéis tetraidrofurânicos (THF) ou
tetraidropirânicos (THP) e, mais raramente, ligações duplas ou tríplices. (ALALI, LIU
e MCLAUGHLIN, 1999). A rota biosintética responsável pela formação destes
compostos ainda não está totalmente elucidada, mas é provável que eles sejam
originados pela condensação de acetilCoA pela rota do acilpolimalonato (SIMÕES et
al. 2010; ZAFRA-POLO et al. 1998).
As acetogeninas apresentam uma grande diversidade estrutural e são
classificadas de acordo com a presença de grupos funcionais, como epóxidos;
número e posição de anéis THF ou THP, e tipo de subunidade de anel de γ-lactona;
30
a qual pode ser uma γ-lactona-α-β-insaturada (mais comum), cetolactona, γ-
hidroxilactona insaturada ou uma β-hidroxilactona. A Figura 4 mostra os principais
tipos de anéis γ-lactona em acetogeninas. Quanto aos grupos funcionais, estes
podem ser do tipo epóxi, e nesse caso, sem anéis THF, uma vez que os anéis epóxi
são considerados precursores dos anéis THF; lineares (sem anel THF); mono-THF,
bis-THF adjacentes e não adjacentes, tri-THF e não clássicas com anel THP. Na
Figura 5 estão representadas as estruturas de algumas acetogeninas com anel γ-
lactona do tipo A, e diferentes grupos funcionais ao longo da cadeia, algumas das
quais isoladas de A. muricata, uma das principais fontes de acetogeninas na família
Annonaceae. As acetogeninas mais comuns, representando 206 das aproxidamente
417 acetogeninas isoladas até o momento, são as mono-THF com unidade γ-
lactona-α-β-insaturada (BERMEJO et al. 2005).
Tipo A: γ-lactona-α-β-
insaturada
Tipo B: cetolactona
Tipo C: γ-hidroxilactona
insaturada Tipo D: β-hidroxilactona
R = H ou OH
1
2 3
4 35(33)
36(34)
37(35)
1
2 3
4 35(33)
36(34) 37(35) 1
2 3
4 35(33)
36(34)
37(35)
1 2
3 4
35(33)
36(34)
37(35)
Figura 4 – Diferentes tipos de unidades γ- lactona que ocorrem em acetogeninas
31
Tipo 1: Linear Ex: Coibina A*
Tipo 2: Epóxi Ex: Coronina*
Tipo 3: mono-THF
Ex: cis-Solamina*
Tipo 4: bis-THF adjacente
Ex: Robustocina*
Tipo 5: bis-THF não adjacente
Ex: Gigantecina
Figura 5 – Estruturas químicas de acetogeninas com unidade γ-lactona do tipo A * Acetogeninas já isoladas de A. muricata
32
Quanto à identificação de acetogeninas em plantas da família Annonaceae,
diferentes técnicas, em especial espectrométricas, devem ser empregadas em
conjunto. Costuma-se inicialmente confirmar a presença de acetogeninas através da
detecção da subunidade γ-lactona por análises de cromatografia de camada delgada
(CCD), ultravioleta (UV) e infravermelho (IV). Para se definir então o tipo de
acetogenina encontrado, são necessários estudos de espectrometria de massas
(EM) e ressonância magnética nuclear (RMN), através dos quais deve-se buscar
identificar o tipo de subunidade γ-lactona presente na acetogenina investigada, bem
como as funções oxigenadas presentes, posicionando-as ao longo da cadeia.
No que diz respeito à utilização de técnicas de RMN, dados já definidos pela
literatura para os deslocamentos químicos esperados para cada tipo específico de
subunidade γ-lactona e para a detecção da presença de grupos funcionais são
necessários na identificação das acetogeninas, inclusive quando em misturas
(ALLEGRAND et al. 2010). Como exemplo, as Tabelas 1 e 2 apresentam
deslocamentos químicos registrados em RMN de 1H e 13C para os diferentes tipos
de subunidades γ-lactona apresentados na Figura 4. A diferença entre os valores de
deslocamento químico para cada tipo de unidade γ-lactona é suficiente para que se
possa distinguir entre uma e outra. O tipo D por exemplo não possui H-3 e H-4,
contrastando facilmente com os outros; os tipos B e C não possuem H-36(34),
Tipo 6: tri-THF
Ex: Goniocina**
Tipo 7: THP
Ex: Mucocina
Figura 5 (cont.) – Estruturas químicas de acetogeninas com unidade γ-lactona do tipo A ** Único exemplo da classe até o momento
33
contrastando com A e D, e a diferença do deslocamento químico de H-35(33) entre
os tipos B e C permite distingui-los.
Tabela 1 - Valores de deslocamentos químicos (δ) característicos de diferentes tipos de lactonas terminais de acetogeninas em espectros de RMN de 1H
Tipos de γ-lactona
H-2 H-3 H-4 H-35(33) H-36(34) H-37(35)
Tipo A¹ - 2,26 1,52 6,95 4,99 1,42
Tipo B¹ 3,02 1,99 e 2,23 4,54 3,01 e 2,66 - 2,20
Tipo C¹ - 2,40 3,82 6,75 - 1,70
Tipo D¹ 2,55 - - 4,15 4,50 1,38
Tabela 2 - Valores de deslocamentos químicos (δ) característicos de diferentes tipos de lactonas terminais de acetogeninas em espectros de RMN de 13C
Tipos de γ-lactona
C-1 C-2 C-3
C-4 C-35(33) C-36(34) C-37(35)
Tipo A¹ 173,8 134,2 25,6 27,3 148,9 77,4 19,2
Tipo B¹ 178,8 33,4 35 78,9 43,8 205,5 29,9
Tipo C¹ 172,9 133,9 33,3 69,5 150,5 104,1 24,2
Tipo D¹ 177,4 43,78 25,6 27,3 73,7 82,5 18,1
As Tabelas 3 e 4 apresentam valores de deslocamentos químicos das
acetogeninas cujas estruturas constam na Figura 5 e representam os diferentes
tipos que possuem unidade γ-lactona do tipo A. Em cada exemplo os valores de
deslocamento químico (δ) dos hidrogênios de CH2 são muito próximos, e facilmente
identificáveis, em torno de 1,20-1,60. Os δ’s em torno de 3,0 são associados a
hidrogênios de anéis oxirânicos, em torno de 3,4 identificam hidrogênios de
carbonos ligados a hidroxilas, e os em torno de 3,8 identificam os hidrogênios de
anéis THF adjacentes ao oxigênio. Deslocamentos em campo mais alto, em torno de
5,0, estão associados a hidrogênios ligados a carbonos olefínicos. Essa diferença
nos valores de deslocamento, associada a dados de massa, permite identificar os
grupos funcionais presentes na molécula e determinar sua posição ao longo da
cadeia.
Legenda: ¹ BERMEJO, et al. 2005
Legenda: ¹ BERMEJO, et al. 2005
34
Tabela 3 - Valores de deslocamentos químicos (δ) característicos de diferentes acetogeninas em espectros de RMN de 1H
Hidrogênios Coibina
A Tipo 1a
Coronina Tipo 2b
cis-Solamina
Tipo 3c
Robustocina Tipo 4d
Gigantecina Tipo 5e
Goniocina Tipo 6f
Mucocina Tipo 7g
H-3 2,26 m 2,26 t 2,25 t 2,26 t a 2,38 m
b 2,51 m
a 2,40 m
b 2,53 m
a 2,40 m
b 2,53 m H-4 1,55 m 1,52 m 1,55 m 1,55 m 3,87 m 3,85 m 3,84 m
H-5 1,26 m 1,23-1,39 1,24-1,40 1,24-1,28 1,42 m 1,47 m 1,47 m
H-6 1,20-1,40 1,23-1,39 1,24-1,40 1,24-1,28 1,24-1,28 1,20-1,60 1,10-1,35
H-7 1,20-1,40 1,23-1,39 1,24-1,40 1,24-1,28 1,24-1,28 1,20-1,60 1,10-1,35
H-8 1,20-1,40 1,23-1,39 1,24-1,40 1,30 m 1,31 m 1,20-1,60 1,10-1,35
H-9 1,20-1,40 1,23-1,39 1,24-1,40 1,49 m 1,45 m 1,44 m 1,10-1,35
H-10 1,20-1,40 1,23-1,39 1,24-1,40 3,95 m 3,87 m 3,93 m 1,10-1,35
H-11 1,20-1,40 1,23-1,39 1,24-1,40 a 1,57 m b 2,03 m
a 1,55 m b 2,07 m
a 1,62 m b 2,02 m
1,46 m
H-12 1,20-1,40 1,52 m 1,24-1,40 a 1,60 m b 1,97 m
a 1,63 m b 1,92 m
a 1,64 m b 1,70 m
3,88 m
H-13 1,20-1,40 2,95 m 1,24-1,40 3,99 m 3,87 m 3,83-3,92 a 1,49 m b 2,02 m
H-14 1,41 m 2,99 m 1,46 m 3,89 m 3,40 m 3,83-3,92 a 1,62 m b 1,92 m
H-15 3,42 m 1,71 m 3,41 m a 1,76-1,84 b 1,94-1,96
1,56 m a 1,64 m b 1,96 m
3,8 m
H-16 3,42 m 1,71 m 3,81 m a 1,76-1,84 b 1,94-1,96
1,56 m a 1,64 m b 1,90 m
3,43 m
H-17 1,55 m 2,99 m 1,74 m 3,89 m 3,40 m 3,83-3,92 1,52 m
H-18 2,20 m 2,95 m 1,92 m 3,35 m 3,87 m 3,83-3,92 1,62 m
H-19 5,40 m 1,60 m 3,81 m 1,44 m a 1,65 m b 2,07 m
a 1,64 m b 1,96 m
3,48 m
H-20 5,38 m 2,22 m 3,41 m 1,24-1,28 a 1,73 m b 1,92 m
a 1,60 m b 1,90 m
3,15 m
H-21 2,05 m 5,39-5,41 1,46 m 1,24-1,28 3,87 m 3,80 m a 1,45 m b 1,70 m
H-22 1,20-1,40 5,39-5,41 1,24-1,40 1,24-1,28 3,40 m 3,37 m a 1,43 m b 2,10 m
H-23 1,20-1,40 2,05 m 1,24-1,40 1,24-1,28 1,50 m 1,38 m 3,28 m
H-24 1,20-1,40 1,31 m 1,24-1,40 1,24-1,28 1,24-1,28 1,20-1,60 3,05 m
H-25 1,20-1,40 1,23-1,39 1,24-1,40 1,24-1,28 1,24-1,28 1,20-1,60 1,41 m
H-26 1,20-1,40 1,23-1,39 1,24-1,40 1,24-1,28 1,24-1,28 1,20-1,60 1,10-1,35
H-27 1,20-1,40 1,23-1,39 1,24-1,40 1,24-1,28 1,24-1,28 1,20-1,60 1,10-1,35
H-28 1,20-1,40 1,23-1,39 1,24-1,40 1,24-1,28 1,24-1,28 1,20-1,60 1,10-1,35
H-29 1,20-1,40 1,23-1,39 1,24-1,40 1,24-1,28 1,24-1,28 1,20-1,60 1,10-1,35
H-30 1,20-1,40 1,23-1,39 1,26 m 1,26 m 1,24-1,28 1,20-1,60 1,10-1,35
H-31 1,30 m 1,23-1,39 1,26 m 1,26 m 1,24-1,28 1,20-1,60 1,10-1,35
H-32 0,87 t 1,26 m 0,88 t 0,86 t 1,26 m 1,20-1,60 1,10-1,35
H-33 6,99 d 1,26 m 6,98 t 6,97 d 1,26 m 1,28 m 1,10-1,35
35
H-34 5,00 dq 0,88 t 4,99 dq 4,98 dq 0,82 t 0,87 t 0,88 t
H-35 1,42 t 6,98 d 1,41 d 1,41 d 7,17 d 7,20 q 7,19 d
H-36 - 4,99 dq - - 5,06 dq 5,06 dq 5,06 dq
H-37 - 1,41 d - - 1,41 d 1,35 d 1,43 d
Tabela 4 - Valores de deslocamentos químicos (δ) característicos de diferentes acetogeninas em espectros de RMN de 13C
Carbonos Coibina
A Tipo 1a
Coronina Tipo 2b
cis-Solamina
Tipo 3c
Robustocina Tipo 4d
Gigantecina Tipo 5e
Goniocina Tipo 6f
Mucocina Tipo 7g
C-1 173,9 173,8 173,8 173,9 174,6 174,3 174,6
C-2 134,3 134,2 134,3 134,2 131,1 131,1 131,2
C-3 25,3 25,2 25,1 25,1 33,3 33,2 33,3
C-4 27,3 27,4 27,4 27,3 69,9 69,8 69,9
C-5 29,6 24,3-29,7 25,7-29,7 25,8-29,6 37,0 37,2 37,3
C-6 25,4-29,5 24,3-29,7 25,7-29,7 25,8-29,6 25,8-29,6 25,4-29,7 26-33
C-7 25,4-29,5 24,3-29,7 25,7-29,7 25,8-29,6 25,8-29,6 25,4-29,7 26-33
C-8 25,4-29,5 24,3-29,7 25,7-29,7 26,1 25,8-29,6 25,4-29,7 26-33
C-9 25,4-29,5 24,3-29,7 25,7-29,7 35,8 35,8 35,6 26-33
C-10 25,4-29,5 24,3-29,7 25,7-29,7 80,1 79,3 79,6 26-33
C-11 25,4-29,5 24,3-29,7 25,7-29,7 a 28,4 b 32,2
a 28,2 b 32,3
32,1 35,6
C-12 25,4-29,5 27,8 25,7-29,7 a 28,4 b 28,4
a 28,2 b 28,2
28,3-28,5 79,3
C-13 25,4-29,5 56,4 25,7-29,7 80,7 82,0 81,1-82,3 32,4
C-14 33,5 56,5 34,0 81,5 74,1 81,1-82,3 28,3
C-15 74,6 25,0 74,3 28,4 37,0 28,3-28,5 81,9
C-16 74,3 25,0 82,8 28,4 37,0 28,3-28,5 73,8
C-17 33,5 56,9 28,1 82,5 74,3 81,1-82,3 28,7
C-18 23,4 57,3 28,1 74,7 82,7 81,1-82,3 28,8
C-19 129,0 27,8 82,8 34,5 a 28,2 b 32,3
28,5 73,5
C-20 131,1 25,2 74,3 25,8-29,6 a 28,2 b 28,2
28,8 80,1
C-21 27,2 128,1 34,0 25,8-29,6 82,7 83,0 26,9
C-22 25,4-29,5 131,1 25,7-29,7 25,8-29,6 74,4 74,2 31,9
C-23 25,4-29,5 27,2 25,7-29,7 25,8-29,6 37,0 33,3 70,5
C-24 25,4-29,5 29,6 25,7-29,7 25,8-29,6 25,7-29,7 25,6 82,0
C-25 25,4-29,5 24,3-29,7 25,7-29,7 25,8-29,6 25,7-29,7 29,3-29,7 25,5
Legenda: a GLEYE, C. et al. 1997; b GLEYE, C. et al, 2001; c GLEYE, C. et al. 1998; d
GLEYE, C. et al. 2000; e ALKOFAHI, A. et al. 1990; f GU, Z. et al. 1994; g SHI, G. et al.
1995.
36
C-26 25,4-29,5 24,3-29,7 25,7-29,7 25,8-29,6 25,7-29,7 29,3-29,7 26-33
C-27 25,4-29,5 24,3-29,7 25,7-29,7 25,8-29,6 25,7-29,7 29,3-29,7 26-33
C-28 25,4-29,5 24,3-29,7 25,7-29,7 25,8-29,6 25,7-29,7 29,3-29,7 26-33
C-29 25,4-29,5 24,3-29,7 25,7-29,7 25,8-29,6 25,7-29,7 29,3-29,7 26-33
C-30 25,4-29,5 24,3-29,7 31,9 31,9 25,7-29,7 29,3-29,7 26-33
C-31 22,6 24,3-29,7 22,7 22,6 25,7-29,7 29,3-29,7 26-33
C-32 14,1 31,9 14,1 14,1 31,7 31,9 26-33
C-33 149,0 22,7 148,8 148,9 22,3 22,7 26-33
C-34 77,5 14,2 77,5 77,4 14,4 14,1 14,1
C-35 19,0 148,7 19,2 19,2 151,2 151,9 151,8
C-36 - 77,4 - - 77,9 78,0 78,0
C-37 - 19,2 - - 19,1 19,1 19,1
Quantos às análises de EM, algumas das técnicas utilizadas são a
espectrometria de massas com bombardeamento por átomos rápidos (EMBAR),
espectrometria de massas com ionização por “eletronspray” (EM-IES), e
espectrometria de massas com ionização por impacto eletrônico (EM-IE)
(MCLAUGHLIN, 2008; YANG et al. 2009). É possível encontrar na literatura estudos
do padrão de fragmentação das acetogeninas em EM que facilitam a sua
identificação. A maioria dos dados se refere a fragmentações por EM-IE, uma vez
que a maior parte das pesquisas envolvendo acetogeninas foram realizadas na
década de 90, e essa era a técnica mais acessível à época (LAPREVOTE e DAS,
1994; SMITH, LIU e WOOD, 1991). Análises por EM-IQ (espectrometria de massas
com ionização química) e EMBAR também eram empregadas, geralmente para a
definição da fórmula molecular. A Figura 6 apresenta um esquema de fragmentação
típico de coibina quando analisada por EM-IE.
Legenda: a GLEYE, C. et al. 1997; b GLEYE, C. et al, 2001; c GLEYE, C. et al. 1998; d
GLEYE, C. et al. 2000; e ALKOFAHI, A. et al. 1990; f GU, Z. et al. 1994; g SHI, G. et al.
1995.
37
.
.
Atualmente, no entanto, a fonte de ionização mais comum nos
espectrômetros de massas é “eletronspray”, tendo os aparelhos com ionização por
impacto eletrônico quase desaparecido (SAWAYA et al. 2004; WU, RODGERS e
MARSHALL, 2005). No estudo das acetogeninas e outros lipídios complexos, o
método de ionização por eletronspray (IES), por ser mais brando que o método por
IE, pode levar à formação de íons primários [M + H]+ com sinais fracos, além da
formação de adutos como [M + Na]+, que podem dificultar a definição da estrutura
(ALLEGRAND et al. 2010). Por isso, é comum adicionar-se iodeto de lítio às
amostras estudadas, que leva à formação proeminente de íons [M + Li]+ e seus
fragmentos, possibilitando assim a obtenção de mais informações precisas e
relevantes (BENNION et al. 2007). Apesar disso, Gu e colaboradores (1997)
desenvolveram um método para identificação de acetogeninas por EM-IES, inclusive
em matrizes complexas, que dispensa a utilização de iodeto de lítio, tendo como
base a formação de adutos de sódio para auxiliar a identificação. A partir do estudo
de acetogeninas isoladas, este grupo de pesquisadores definiu quais seriam as
fragmentações características esperadas de uma determinada acetogenina de
acordo com sua massa e número de hidroxilas. Este método possibilitou a
identificação de sete acetogeninas de massas diferentes em um extrato metanólico
de Rollinia mucosa.
Figura 6 - Exemplo de fragmentações características de acetogeninas em espectometria de massas com ionização por impacto eletrônico (Coibina A) Fonte: GLEYE et al., 1997
38
Figura 7 - Estruturas químicas de anonacina (A) e uvaricina (B)
Desde a descoberta da uvaricina (Figura 7B) em 1982, como a primeira das
acetogeninas, esta classe de metabólitos tem sido amplamente investigada pelo seu
elevado potencial de atividade biológica. De fato, a uvaricina, quando descoberta, foi
anunciada como novo agente anti-câncer (TEMPESTA, KRIEK e BATES, 1982), e
as acetogeninas de maneira geral foram reconhecidas como os mais potentes
inibidores do complexo I (NADH: ubiquinona oxidorredutase) da cadeia respiratória
mitocondrial (BERMEJO et al. 2005; ESPOSTI et al. 1994). Hoje são conhecidas,
além da atividade antitumoral das acetogeninas, outras atividades importantes como
antimalárica, antiparasitária e pesticida (MCLAUGHLIN, 2008).
As acetogeninas, apesar de serem potentes agentes citotóxicos contra células
cancerígenas, após serem estudadas por mais de trinta anos ainda não geraram
nenhum fármaco anti-câncer. Seu mecanismo de ação ainda não foi completamente
elucidado. Restam dúvidas quanto ao sítio de ligação exato e relações estrutura-
atividade. Sabe-se que a natureza lipofílica das acetogeninas é fator importante na
ligação ao sítio na mitocôndria (TORMO et al. 1999), mas estudos realizados
utilizando diferentes acetogeninas, que se distinguiam apenas pelas posições de
hidroxilas, ou pela presença de anéis THF, revelaram pouca ou nenhuma variação
na atividade apresentada entre elas. Foi demonstrado, no entanto, que as
acetogeninas mais ativas são aquelas do tipo bis-THF adjacentes com γ-lactona-α-β-
insaturada, além de que um maior número de hidroxilas parece aumentar a atividade
(TAKADA et al. 2000).
(A)
(B)
39
Em resumo, as acetogeninas, ainda que descobertas há mais de trinta anos,
e pesquisadas desde então, continuam sendo importantes alvos de estudos como
classe de metabólitos secundários promissora para o tratamento de câncer e outras
doenças como malária e leishmaniose.
40
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
Realizar análise fitoquímica e avaliar a atividade leishmanicida de sementes
de Annona muricata L.
3.2 Objetivos específicos
Caracterizar, em termos farmacognósticos, o pó das sementes de Annona
muricata L.;
Obter e caracterizar extrato etanólico e frações;
Quantificar as acetogeninas no extrato e frações por RMNq.
Avaliar atividade in vitro do extrato etanólico e frações obtidos:
o Antipromastigota frente a cepa de Leishmania amazonensis;
o Anti-amastigota frente a cepa de Leishmania amazonensis;
o Citotóxica em macrófagos murinos imortalizados.
41
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Materiais
4.1.1 EQUIPAMENTOS
Balança analítica - Bioprecisa, modelo FA2104 N Eletronic Balance;
Cabine de fluxo laminar vertical – Pachane, modelo PA 310;
Coluna de fase reversa LiChrospher® RP 18 (5 µM) 12,5 cm LiChrocart 125-4
(Merck Millipore®);
Cromatógrafo líquido de alta eficiência (CLAE-DAD), modalidade analítica,
Waters®, equipado com injetor automático, mod. 2695; detector de arranjos
de diodos (DAD), mod. 2996; bomba mod. L-6200A; integrador, mod. C-R4A;
Cromatógrafo líquido de ultra eficiência acoplado a espectrômetro de massas
(CLUE-PDA-MS/ESI) marca WATERS ACQUITY® H-Class Core System.
Espectômetro de RMN Bruker Advance DPX 200;
Incubadora de CO2- Ultrasafe, modelo HF212 UV;
Leitora de Microplacas - Biotek, modelo ELX 808;
Medidor de pH, Marconi, modelo PA200;
4.1.2 SOLVENTES
Acetato de etila, ácido fórmico, ácido fosfórico, clorofórmio, diclorometano, n-
hexano, hidróxido de amônio, metanol (Isofar®);
Acetonitrila grau CLAE, metanol grau CLAE (Tedia Company®);
Água deionizada (sistema Milli-Qplus);
Clorofórmio deuterado (Merck®);
DMSO-D6 (Sigma Aldrich®);
Etanol (Souza Cruz®).
4.1.3 FASES ESTACIONÁRIAS
Sílica gel 60 (0,063 – 0,200 mm) para coluna cromatográfica (Merck®).
42
Sílica gel 60 G (90% < 55 µm) para cromatoplacas (Merck®)
4.1.4 MEIO DE CULTURA E OUTROS
Fosfato de sódio dibásico anidro P.A- Labsynth produtos para laboratório;
Gentamicin (Sulfato de gentamicina) 80 mg/2mL solução injetável - Nova
Farma Indústria Farmacêutica LTDA;
Meio RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute) com glutamina e 25 MM;
Bicarbonato de sódio- Sigma Aldrich;
MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolium 500 mg,
Sigma-Aldrich;
Penicilina G - Sigma Aldrich;
Soro bovino Fetal – Gibco®.
4.1.5 REVELADORES PARA CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD)
4.1.5.1 Anisaldeído - Ácido Sulfúrico (AS)
Misturou-se anisaldeído (0,5 mL) com ácido acético glacial (10 mL), em
seguida adicionou-se metanol (85 mL) e ácido sulfúrico concentrado (5 mL). A
seguir, o reagente foi armazenado em frasco âmbar sob refrigeração (2-8°C;
WAGNER; BLADT; ZGAINSKI, 1984).
4.1.5.2 Reagente Kedde
Solução A: Ácido 3,5-dinitrobenzóico a 3% em metanol. Solução B: KOH a
5,7% em água. As soluções foram combinadas no momento da pulverização nas
placas (MULIA et al. 2015).
4.1.6 PREPARO DOS MEIOS DE CULTIVO
O meio RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 (com L-Glutamina e sem
bicarbonato de sódio) incompleto foi preparado utilizando-se cerca de 800 mL de
água ultrapura (Milli-Q®) em béquer, à qual foram adicionados sob agitação
constante: bicarbonato de sódio (2 g), D-glicose (2 g; dextrose), tampão HEPES
43
(5,98 g), RPMI 1640 em pó (10,4 g). O conteúdo foi então transferido para balão
volumétrico de 1L e o volume completado com água ultrapura. Logo após, ajustou-
se o pH do meio para 7,2. O meio foi esterilizado em membrana de 0,22 μm e
acondicionado em frascos estéreis mantidos a 4 ºC.
Para o preparo de 40 mL do meio RPMI completo, foram adicionados ao meio
RPMI incompleto, preparado de acordo com o descrito acima, 4 mL de soro fetal
bovino desnaturado (a 56 °C) e 0,4 mL de uma solução de antibiótico (10.000 U/mL
de penicilina + 10.000 µg/mL de estreptomicina, Gibco®), previamente preparada. O
preparo deste meio segue o Protocolo Experimental do Instituto Evandro Chagas.
4.1.7 MATERIAL BIOLÓGICO
4.1.7.1 Parasito Leishmania
A espécie de parasito utilizada foi L. (L.) amazonensis. Para o ensaio
antipromastigota utilizou-se cepa isolada de caso humano procedente de
Ulianópolis, Estado do Pará, gentilmente cedido pelo Instituo Evandro Chagas, cujo
código é MHOM/BR/2009/M26361. Para o ensaio anti-amastigota utilizou-se a cepa
199 cedida pelo ICBIM/UFU. Cepas diferentes foram utilizadas em cada teste por
questões de disponibilidade.
4.1.8 MATERIAL VEGETAL
As sementes foram obtidas em três diferentes remessas, entre abril-maio de
2015, todas advindas de frutos produzidos em cultivo particular, no município de
Tomé-Açu, Estado do Pará, sob as coordenadas 2°25'S 48°07'W. Uma exsicata foi
produzida, mas ainda aguarda identificação.
As sementes de A. muricata foram lavadas em água corrente e imersas
brevemente por 3 vezes em etanol a 70%, seguindo-se a isso a secagem a 40 °C
em estufa com ventilação de ar forçado por sete dias. Após a secagem das
sementes, estas foram reduzidas a pó em moinho de facas.
44
4.2 Métodos
4.2.1 ANÁLISES FARMACOGNÓSTICAS
4.2.1.1 pH
A determinação do pH foi efetuada de acordo com a Farmacopeia Brasileira V
ed. (BRASIL, 2010). Uma amostra de 3g do pó foi adicionada à água destilada para
o preparo de uma solução a 1%, que foi então aquecida em chapa elétrica por 5
minutos. O extrato em seguida foi filtrado por algodão e levado ao potenciômetro. O
procedimento foi efetuado em triplicata e o resultado definido pela média aritmética.
4.2.1.2 Perda por dessecação
A perda por dessecação consiste em um método gravimétrico para
determinação de água e substâncias voláteis em drogas vegetais. Conforme descrito
na Farmacopéia brasileira, uma amostra de 2g do material vegetal em pó foi
transferida para pesa-filtro, em seguida levada à estufa a 110 ºC por 5 horas. Após
esse período a amostra arrefeceu em dessecador e foi pesada novamente para
calcular a diferença na massa (BRASIL, 2010). O procedimento foi efetuado em
triplicata e o resultado definido pela média aritmética.
4.2.1.3 Teor de cinzas totais
A determinação de cinzas totais abrange tanto as cinzas de origem fisiológica
quanto não fisiológicas. Uma amostra de 3g do material vegetal em pó foi pesada e
transferida para um cadinho previamente tarado, e então incinerada em mufla
(Quimis®), obedecendo-se um gradiente de temperatura a fim de se evitar projeções
do material: 30 minutos a 200ºC, 60 minutos a 400ºC e 90 minutos a 600ºC
(BRASIL, 2010). O procedimento foi realizado em triplicata e o resultado definido
pela média aritmética.
4.2.1.4 Densidade aparente
A densidade aparente considera o volume total da amostra incluindo o espaço
vazio entre os grãos. Neste procedimento o material vegetal foi colocado em uma
proveta até preencher o volume de 15 mL. A proveta então foi pesada em balança
45
analítica e os valores de densidade foram obtidos através do quociente entre o valor
da massa e volume (SAMPAIO e SILVA, 2007). O procedimento foi realizado em
triplicata e o resultado definido pela média aritmética.
4.2.1.5 Granulometria
A granulometria foi determinada de acordo com a Farmacopeia Brasileira,
com adaptações. Uma amostra de 10g do pó foi adicionada à sequência de peneiras
1,70 mm; 710 µm; 355 µm; 180 µm e 125 µm, as quais foram levadas ao agitador
mecânico por 15 minutos. Ao final deste tempo a quantidade retida em cada peneira
foi pesada e definido o tipo do pó (BRASIL, 2010). O procedimento foi realizado em
triplicata e o resultado definido pela média aritmética.
4.2.2 PREPARAÇÃO DO EXTRATO ETANÓLICO DE SEMENTES (EE)
O extrato etanólico foi preparado por maceração exaustiva, utilizando-se 400g
do pó das sementes e etanol 96 °GL como solvente extrator. O extrato resultante foi
recolhido e concentrado em evaporador rotativo até resíduo, obtendo-se assim o
extrato etanólico (EE) das sementes, de caráter pastoso, que foi conservado (no
congelador de uma geladeira) a -2 °C.
4.2.3 PARTIÇÕES LÍQUIDO-LÍQUIDO DO EXTRATO ETANÓLICO DE SEMENTES
(EE)
O EE obtido foi dividido em três porções de aproximadamente 20g cada. Para
cada uma delas seguiu-se um processo diferente de partição líquido-líquido a fim de
que se pudesse avaliar qual seria o método mais apropriado para a obtenção de
uma fração rica em acetogeninas.
4.2.3.1. Método 1 - Primeira partição líquido-líquido
46
Uma alíquota do EE (20 g) foi dissolvida em 300 mL de uma solução de
MeOH/H2O 1:1 que foi submetida a extrações sucessivas com n-hexano e
clorofórmio, de acordo com o fluxograma a seguir:
Figura 8 - Fluxograma da partição líquido-líquido do Extrato Etanólico pelo Método 1.
MeOH/H2O: solução metanol/água 1:1
Da partição, portanto, foram obtidas três frações: Fração Hexânica (FH1);
Fração Clorofórmica (FCL1) e Fração Metanol-Água (FMH1).
4.2.3.2. Método 2 - Segunda partição líquido-líquido
Uma alíquota de EE (20 g) foi dissolvida em 300 mL de uma solução de
MeOH/H2O 1:1 e em seguida foi submetida a extrações sucessivas com
diclorometano e acetato de etila, de acordo com o fluxograma a seguir:
47
Figura 9 - Fluxograma da partição líquido-líquido do Extrato Etanólico pelo Método 2. MeOH/H2O: solução metanol/água 1:1
Da partição foram obtidas, portanto, três frações: Fração Diclorometano
(FDM2); Fração Acetato de Etila (FAE2) e Fração Metanol-Água (FMH2).
4.2.3.3. Método 3 - Terceira partição líquido-líquido
O EE tendo sido mantido em geladeira, veio a formar grandes e numerosos
cristais. Quando da divisão do EE total em 3 porções de aproximadamente 20g,
estes cristais foram reunidos em uma das porções. Adicionou-se então a essa
porção do extrato 50 mL de n-hexano, a qual foi em seguida filtrada, obtendo-se
assim uma fração solúvel em n-hexano, e os cristais, separadamente.
Figura 10 - Fluxograma da separação dos cristais formados no Extrato Etanólico da porção solúvel em n-hexano.
Resíduo
EE +
48
Após essa etapa, ao resíduo da fração solúvel em n-hexano (EEH), foram
adicionados 100 mL de uma solução de MeOH/H2O 1:1, e a solução obtida foi
submetida a partições sucessivas, com clorofórmio e acetato de etila, de acordo com
o fluxograma a seguir:
Figura 11 - Fluxograma da partição líquido-líquido do Extrato Etanólico pelo Método 3. MeOH/H2O: solução metanol/água 1:1
Da partição, portanto, foram obtidas três frações: Fração Clorofórmica (FCL3);
Fração Acetato de Etila (FAE3) e Fração Metanol-Água (FMH3).
4.2.4 FRACIONAMENTO DE FAE2 POR CROMATOGRAFIA EM COLUNA DE
SÍLICA GEL (CCS)
FAE2 foi submetida a cromatografia em coluna aberta de sílica gel 60 (0,2-0,5
mm 107734 Merck®), com as seguintes características: 1,5g de amostra; altura da
coluna - 75 cm; altura da porção com sílica e amostra - 30 cm; diâmetro da coluna -
5,5 cm, visando a obtenção de uma fração rica em acetogeninas. A partir de FAE2
obtiveram-se 27 subfrações, que foram avaliadas em CCD e CLAE-DAD, sendo
selecionada a subfração FAE2(5), com massa > 100 mg e perfil sugestivo de
acetogeninas para refracionamento.
O refracionamento de FAE2(5) ocorreu novamente por CCS com as seguintes
características: 117 mg de amostra; altura da coluna - 100 cm; altura da porção com
sílica e amostra - 35 cm; diâmetro interno da coluna - 1,5 cm. Obtiveram-se 15
49
subfrações que foram submetidas à análise por CCD. As subfrações número 5 e 6
foram reunidas por apresentarem perfil semelhante, e sugestivo de acetogeninas, e
nomeadas FAE2(5.5).
4.2.5 - FRACIONAMENTO DE FCL3 POR CROMATOGRAFIA EM COLUNA DE
SÍLICA GEL (CCS)
FCL3 foi submetida a CCS utilizando-se sílica gel 60 (0,2-0,5 mm 107734
Merck®), com as seguintes características: 13g de amostra; altura da coluna - 75
cm; altura da porção com sílica e amostra - 45 cm; diâmetro da coluna - 5,5 cm, com
o intuito de se obter uma fração enriquecida em acetogeninas. A partir de FCL3
obtiveram-se 22 subfrações, que foram avaliadas por CCD, e as frações de número
7 a 12 apresentaram perfil sugestivo de acetogeninas.
4.2.6 DETECÇÃO DE ACETOGENINAS POR CROMATOGRAFIA EM CAMADA
DELGAGA (CCD)
O extrato etanólico das sementes, as frações resultantes das partições
líquido-líquido e as frações e subfrações de colunas cromatográficas foram
analisadas por CCD. Foram preparadas cromatoplacas com sílica gel 60 G para
CCD (107731 Merck®), nas quais foram aplicadas as amostras a serem analisadas.
Diferentes solventes ou misturas de solventes foram utilizados como fases móveis,
levando-se em conta a polaridade dos constituintes esperados. Como reveladores
para as acetogeninas foram utilizados os reagentes de Kedde (VILA-NOVA et al.
2011) e anisaldeído sulfúrico (RAGASA et al. 2014). Sob a ação do reagente de
Kedde as acetogeninas geram uma cor entre róseo e lilás, geralmente fraca, que
esvanece em pouco tempo, bastando-se, no entanto, reaplicar o reagente para
realçar a coloração novamente. É importante ressaltar que o reagente de Kedde
colore apenas as acetogeninas que possuam anel γ-lactônico α-β-insaturado,
excluindo os outros tipos (VILA-NOVA et al. 2011). No entanto, as acetogeninas
desse tipo são as mais comuns (BERMEJO et al. 2005). Para os casos de
acetogeninas que não possuem o anel γ-lactônico α-β-insaturado, o anisaldeído
sulfúrico age como um revelador geral, produzindo uma cor rósea ou esverdeada na
presença de acetogeninas (RAGASA et al. 2014).
50
4.2.7 ANÁLISES POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA
ACOPLADA A DETECTOR DE ARRANJOS DE DIÔDOS (CLAE-DAD).
As amostras analisadas foram preparadas em tubo cônico do tipo eppendorf
de 2 mL, adicionando-se 3 mg de cada amostra dissolvida em 1 mL de metanol grau
CLAE. Em seguida fez-se sonicação em aparelho de ultrassom por 10 minutos e
então centrifugação por 10 minutos a 10.000 rpm, para se obter sobrenadante mais
límpido. As amostras foram então filtradas e transferidas para tubos identificados. O
volume de amostra injetado foi de 10 µL.
Os espectros no UV foram registrados no comprimento de onda de 210 nm.
Foram empregadas duas programações de eluição, uma delas, que será aqui
referida como Programação A, é usualmente empregada no Laboratório de
Fitoquímica da Faculdade de Farmácia/UFMG na análise preliminar de extratos
vegetais, e a segunda, aqui referida como Programação B, foi descrita para a
análise de amostras contendo acetogeninas (YANG et al. 2010). Os dados
referentes a estas condições de análise constam das tabelas 5 e 6.
Tabela 5 - Programação A: Condições utilizadas nas análises por CLAE-DAD
Tempo (min)
Fluxo (mL/min)
Eluente A* (%)
Eluente B** (%)
Temperatura (°C)
Coluna Detecção UV
0
1
95,0 5,0
40
LiChrospher 100, C-18,
125 x 4 mm, 5 µm
210 nm 60 5,0 95,0
65 5,0 95,0
70 95,0 5,0
* H2O + 0,1% ác. Fosfórico ** Acetonitrila
Tabela 6 - Programaçao B: Condições utilizadas nas análises por CLAE-DAD
Tempo (min)
Fluxo (mL/min)
Eluente A* (%)
Eluente B** (%)
Temperatura (°C)
Coluna Detecção
UV
0
1
15,0 85,0
40
LiChrospher 100, C-18,
250 x 4 mm, 5 µm
210 nm 40 15,0 85,0
60 5,0 95,0
* H2O + 0,1% ác. Fosfórico ** Metanol
51
4.2.8 ANÁLISES POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ULTRA EFICIÊNCIA
ACOPLADA A DETECTOR DE ARRANJO DE DIÔDOS (CLUE-DAD) E
ESPECTÔMETRO DE MASSAS COM IONIZAÇÃO POR ELECTROSPRAY (IES-
MS)
As análises foram realizadas em espectrômetro de massas com detector TQ
Acquity Waters com ionização por electrospray (+) acoplado a cromatógrafo Acquity
UPLC Waters e detector PDA Acquity Waters.
As amostras foram preparadas em tubo cônico do tipo eppendorf de 2 mL,
adicionando-se 2mg de cada amostra dissolvida em 1 mL de metanol grau CLAE.
Em seguida foi realizada sonicação em aparelho de ultrassom por 10 minutos e
então centrifugação por 10 minutos a 10.000 rpm. As amostras foram então filtradas
e transferidas para tubos identificados. O volume de injeção utilizado foi de 0,3 µL.
As condições de análise constam da Tabela 7.
Tabela 7 - Condições utilizadas nas análises por CLUE-DAD-IES-MS
Tempo (min)
Fluxo (mL/min)
Eluente A* (%)
Eluente B** (%)
Temperatura (°C)
Coluna Detecção
UV
0
0,3
95,0 5,0
40 °C
Acquity UPLC
HSS, C-18 SB, 50 x 2,1 mm, 1,8 µm
210 nm 10 5,0 95,0
11 95,0 5,0
13 95,0 5,0
* H2O + 0,1% ác. Fórmico ** Acetonitrila
4.2.8.1 Identificação de acetogeninas no extrato e frações a partir das análises por
CLUE-EM-IES
Para a identificação de acetogeninas em misturas através dos dados obtidos
na análise por CLUE-EM-IES foi utilizada a metodologia descrita por Gu e
colaboradores (1997), com modificações. A identificação é possível a partir dos íons
característico obtidos pela fragmentação de acetogeninas em modo positivo, que
são aqueles de massas [M + Na]+, [M + H]+ e íons fragmentários resultantes de
perdas de água, de acordo com o número de hidroxilas na molécula, representados
pelos íons [M + H - H2O]+, [M + H - 2H2O]+, etc. Além disso, acetogeninas com uma
52
hidroxila na posição C-4 apresentam perda da unidade γ-lactona + 1CH3 da cadeia
alifática representada por íons de massa [M + Na - 112]+, esta perda, porém,
aparece mais claramente quando analisada por estudos de massas-massas. Como
exemplo, uma acetogenina de massa 596 que possui quatro hidroxilas ao longo da
cadeia alifática deve gerar os fragmentos com as seguintes massas: 619 [M + Na]+,
597 [M + H]+, 579 [M + H - H2O]+, 561 [M + H - 2H2O]+, 543 [M + H - 3H2O]+, 525 [M
+ H - 4H2O]+ e, possivelmente, 507 [M + Na - 112]+. Vale ressaltar, no entanto, que
esta metodologia não possibilita diferenciar acetogeninas isoméricas que estejam
em mistura, mas apenas confirmar a presença de uma ou mais acetogeninas de
uma determinada massa. Para a identificação de acetogeninas específicas
seguindo-se este método seria necessária a utilização de padrões, com a
comparação dos TRs dos fragmentos característicos no padrão e na mistura.
O EE e as frações FAE2, FAE2(5.5), FAE2(5.6), FCL3, FCL3.7 e FCL3.12
foram, portanto, investigados quanto a presença de acetogeninas por CLUE-EM-IES
de acordo com esta metodologia. Inicialmente foram obtidos o Cromatograma de
Íons Totais (CIT) de EE e os espectros de massas dos constituintes referentes aos
picos com tempos de retenção entre 7 e 12 minutos, faixa na qual se encontra a
maioria dos picos com absorção de radiação UV de λ 210 nm. Os sinais nos
espectros foram então analisados com o intuito de se encontrar um padrão de
fragmentação que correspondesse a algum grupo de acetogeninas já identificadas
em A. muricata, e de massa conhecida. Ainda, a intensidade relativa no espectro de
massas dos picos de íons comprovadamente relacionados a acetogeninas foi
considerada como indicativa da abundância daquela(s) acetogenina(s) de massa
correspondente. O mesmo procedimento foi utilizado para análise das frações.
4.2.9 ANÁLISES POR RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR DE HIDROGÊNIO
E CARBONO-13 (RMN de 1H e de 13C)
Os espectros de RMN de 1H e de 13C foram obtidos em espectrômetros
BRUKER AVANCE DPX200 e DRX400 no Laboratório de Ressonância Magnética
Nuclear de Alta Resolução – LAREMAR, Departamento de Química, ICEx, UFMG.
Os solventes utilizados na solubilização das amostras foram o clorofórmio deuterado
(CDCl3) e o dimetilsulfoxido deuterado (DMSO-d6). Os deslocamentos químicos (δ)
foram medidos em ppm e as constantes de acoplamento (J) em Hertz (Hz). Como
53
referência interna foi utilizado o tetrametilsilano (TMS). Para processar os espectros
utilizou-se o programa TOPSPIN 3.0 - Bruker.
4.2.9.1 Identificação de acetogeninas no extrato etanólico e frações a partir das
análises de RMN de 1H e de 13C
O EE e algumas frações foram avaliados quanto a presença de acetogeninas
a partir da análise de RMN de 1H e de 13C. Buscou-se por sinais referentes a γ-
lactona conforme descrito nas Tabelas 1 e 2, e os sinais referentes ao restante da
molécula de acordo com as Tabelas 3 e 4. Aquelas amostras que apresentaram
estes sinais foram tidas como positivas para a presença de acetogeninas. Em
conjunto com dados obtidos pela análise por CLUE-EM-IES, procurou-se confirmar a
presença de alguns tipos específicos de acetogeninas já descritas em A. muricata.
4.2.9.2 Quantificação de acetogeninas no extrato etanólico e frações por RMN
Para a quantificação de acetogeninas por RMN utilizou-se a metodologia
descrita por Machado e colaboradores (2014). As amostras analisadas foram
inicialmente dissolvidas em CDCl3, e a elas foi adicionado 1,0 mg de antraceno
como padrão interno. Em seguida, na análise por RMN de 1H, compara-se a área de
sinais referente ao antraceno e às acetogeninas. Estes devem estar em regiões do
espectro com pouca ou nenhuma sobreposição de sinais. No caso do antraceno
foram escolhidos os sinais referentes aos quatro α-hidrogênios da molécula, que
ocorrem como multipleto em torno de δ 8. Para acetogeninas foram escolhidos sinais
de hidrogênios presentes na unidade γ-lactona. No caso de anonacina, o sinal
referente ao H-35 que ocorre em torno de δ 7,18, e no caso de solamina, o sinal
referente ao H-33, que ocorre em torno de δ 6,97. A partir da relação entre os sinais
escolhidos do padrão e da acetogenina analisada é possível obter a concentração
através da fórmula a seguir:
Equação 1 - Fórmula para cálculo da concentração de acetogeninas
Em que IT e IIS são os valores das integrações referentes aos sinais de
54
acetogenina selecionadas para este experimento e aos sinais do padrão interno,
respectivamente. MT é a razão entre a massa molar da acetogenina (anonacina ou
solamina) e o número de prótons referentes ao sinal em 7,18 (H-33/35 em
acetogeninas com OH em C-4) ou 6,98 (H-33/35 em acetogeninas sem OH em C-4)
ppm, e MIS a razão entre a massa molar do antraceno e o número de prótons na
região de δ 8. WIS é a massa do padrão interno (antraceno) em mg, e WL é a massa
da amostra em g.
4.2.10 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE LEISHMANICIDA
4.2.10.1 Atividade anti-promastigota
A atividade anti-promastigota foi avaliada através de uma adaptação do
método descrito por Okpekon et al. (2004). Formas promastigotas de L. (L.)
amazonensis, durante a fase logarítmica de crescimento, foram centrifugadas a
3500 rpm por 10 minutos. Em seguida, o sobrenadante foi desprezado e o
sedimento ressuspenso em meio RPMI completo. Os promastigotas do meio foram
quantificados em câmara de Neubauer e ajustados para uma concentração
correspondente a 5 x 106 parasitos/100 μL. Esta suspensão foi distribuída em placas
de cultura de células com fundo chato que já possuíam as amostras a serem
testadas (100 μL/poço). Na figura 12, encontra-se detalhada a disposição das
amostras na placa. As concentrações utilizadas para as amotras, e controle de
solvente foram 200; 100; 50; 25; 12,5; 6,25 e 3,125 μg/mL. O controle positivo foi
realizado pela adição de Anfotericina B nas seguintes concentrações: 25; 12,5; 6,25;
3,125, 1,5625 e 0,7812 μg/mL. As placas foram incubadas a 26 °C por 72h. Após o
período de incubação das promastigotas com as amostras e fármacos, foram
adicionados 10 μL de uma solução brometo 3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-
difeniltetrazólio (MTT) a 5 mg/mL em cada poço. A placa foi coberta com papel
alumínio, sucedendo-se nova incubação por 4 h em estufa a 26 °C para que o MTT
seja metabolizado e consequentemente fossem formados os cristais de formazam.
Após 4 h, foi adicionado 10 μL de dimetilsulfóxido (DMSO), para solubilizar os
cristais de formazam gerados na metabolização do MTT. Para facilitar esse processo
foi empregada agitação manual por 5 min.
55
Em seguida, realizou-se a leitura da densidade óptica das amostras em leitor
de placas de ELISA, no comprimento de onda de 490 nm. A viabilidade da forma
promastigota foi avaliada com base na absorbância dos poços, que é proporcional
ao MTT metabolizado. A porcentagem de células viáveis (promastigotas) foi
calculada pela seguinte fórmula, adaptada de Ngure et al. (2009):
Figura 13 - Fórmula para cálculo de células viáveis Fonte: NGURE e colaboradores (2009)
A concentração inibitória 50% (CI50) é a concentração que causa a redução de
50% das células em crescimento (viáveis) e foi determinada pelo programa
GraphPad Prism versão 6.0. Foram adotados os seguintes critérios para
determinação de atividade, adaptados de Mota et al. (2015):
Figura 12 - Disposição das amostras nas placas de 96 poços Legenda:
Fonte: SILVA, 2016
56
Tabela 8 - Critérios para classificação da atividade leishmanicida de acordo com valores CI50
CI50 µg/mL Resultados
100 Ativo
Entre 101-200 Moderadamente ativo
Acima de 200 Inativo
4.2.10.2 Atividade antiamastigota
O extrato etanólico de sementes de A. muricata e as frações derivadas deste
foram avaliados quanto a sua atividade antiamastigota contra macrófagos infectados
por L. amazonensis (cepa 199) adaptando-se método de Neal e Croft (1984).
Macrófagos imortalizados (linhagem RAW 264.7) foram distribuídos em placas de 24
poços (1x105 macrófagos/poço) contendo lamínulas circulares. Em seguida, após a
adesão dos macrófagos às lamínulas, parasitos da espécie L. amazonensis (cepa
199) foram adicionados aos poços (1x106 parasitos por poço). Para que ocorresse a
infecção dos macrófagos pelos parasitos, as placas foram mantidas em níveis de
oxigênio de demanda biológica por 24h. Após a infecção, os macrófagos foram
adicionados aos poços as amostras teste em cinco concentrações (3,12µg/mL a
50µg/ml – fator de diluição 2), em duplicata. As placas contendo os macrófagos
infectados e as amostras foram incubadas por um período de 72h. Após este
período, as lamínulas foram retiradas dos poços, coradas por Panótico Rápido® e
analisadas em microscópio ótico. A taxa de infecção dos macrófagos (número de
macrófagos infectados / número de não infectados, após contagem de 300
macrófagos por lamínula, em triplicata) foi determinada para as amostras testes por
comparação com a taxa de infecção do controle sem tratamento (100% de infecção).
4.2.10.3 Atividade citotóxica
O extrato etanólico de sementes de A. muricata e as frações derivadas deste
foram submetidos à avaliação da citotoxicidade in vitro contra macrófagos murinos
RAW 264.7 segundo adaptação de método de Denizot e Lang (1986).
Resumidamente, as células foram distribuídas em microplacas de 96 poços (4x105
células/100μL por poço) e incubadas em estufa de CO2 à 37°C por 24h para a
adesão das células à placa. Em seguida, foram adicionados 100μL de meio RPMI
57
completo contendo diferentes concentrações amostras testadas em triplicata. As
placas foram incubadas por mais 24h. Ao final deste período, foram adicionados
28μl/poço de uma solução de MTT a 2mg/mL. Após 1h30m de incubação com o
MTT foram adicionados 100μl/poço de DMSO. A leitura foi realizada em
espectrofotômetro a 570nm. A dose letal mínima que inibe em 50% o crescimento
das células na presença amostras testes e controle (Anfotericina B) foi determinada
em comparação com células cultivadas apenas em meio de cultura, consideradas
100% de crescimento. Os resultados foram avaliados no programa Origin 8.5 com
determinação das curvas dose-resposta traçadas com ajuste sigmoidal. Foram
determinadas as concentrações citotóxicas que inibem em 50% o crescimento das
células (CC50) em relação aos controles negativos (meio de cultivo com macrófagos,
sem amostras-teste ou Anfotericina B).
4.2.10.4 Índice de Seletividade
Para que se pudesse determinar o grau de segurança na utilização das
amostras testadas contra as células alvo, no caso, os macrófagos, foi calculado o
Índice de Seletividade (IS) de acordo com a seguinte fórmula (PAGÉ et al. 1993):
Foram consideradas seguras amostras com IS ≥ 10 (WENIGER et al. 2006).
58
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Características farmacognósticas do pó das sementes de Annona muricata
Os estudos farmacognósticos são importantes por permitirem avaliar a
qualidade do material vegetal utilizado e auxiliarem na sua identificação quando
comparados a monografias das plantas investigadas (CHANDA, 2014). A análise de
umidade residual do pó por gravimetria gerou um valor médio de 11,4%, que se
encontra dentro do limite (8-14%) estabelecido pela Farmacopeia Brasileira V ed.
(BRASIL, 2010). O valor encontra-se um pouco acima do encontrado por outros
autores, como 8,5%, encontrado por Onimawo (2002) e 7,7% encontrado por
Kimboguila e colaboradores (2010), o que pode estar relacionado a uma maior perda
de constituintes voláteis junto da umidade (FITTKAU e KLINGE, 1973). Quanto ao
teor de cinzas totais, o valor encontrado de 1,44% encontra-se bem abaixo do
encontrado pelos mesmos autores citados acima, sendo de 13,6% para Onimawo
(2002) e 9,7% para Kimboguila e colaboradores (2010). Esse resultado indica uma
menor contaminação do pó obtido, já que o teor de cinzas está principalmente
relacionado à presença de matéria estranha. O valor de pH determinado para o pó
das sementes no presente estudo foi de 8,63. Este valor é semelhante ao
encontrado por outros autores que analisaram sementes de A. muricata (ONIMAWO,
2002; KIMBOGUILA et al. 2010), bem como sementes de outros integrantes da
família Annonaceae (FORMAGIO et al. 2010), e provavelmente está relacionado a
presença de alcaloides no gênero, que possuem caráter básico (HARBORNE,
1984). Nos estudos de granulometria, o pó obtido foi caracterizado como pó grosso,
de acordo com a Farmacopéia Brasileira V ed. (2010), com retenção de 82% do pó
no segundo tamis, de 355 µm. O pó grosso é adequado para a realização de
estudos fitoquímicos por reduzir a amostra a partes suficientemente pequenas para
aumentar a área de superfície, sem gerar compactação excessiva do pó, o que
poderia atrapalhar o processo de extração por solventes (ZHANG et al. 2007).
59
5.2 Investigação de acetogeninas por CCD e CLAE-DAD
5.2.1 EXTRATO ETANÓLICO E FRAÇÕES DAS PARTIÇÕES
Para se chegar ao extrato etanólico e frações ricas em acetogeninas, foi
realizada a percolação do pó das sementes com etanol 96 °GL, seguida de
diferentes partições líquido-líquido. Os rendimentos dos processos extrativo e de
separação utilizados neste trabalho foram calculados e se encontram na Tabela 9.
Para a obtenção de um bom rendimento em processos extrativos é importante a
utilização de solventes e métodos adequados ao material vegetal utilizado
(BIMAKRA et al. 2011). Diferentes partes das plantas armazenam espécies e
concentrações diferentes de constituintes químicos que podem ainda variar de
acordo com fatores ambientais (solo, suprimento de água, temperatura, pragas,
espécies concorrentes, etc) e de maneira sazonal, variando com as estações do ano
ou até mesmo horas do dia (BLANK et al. 2007; STEFANELLO et al. 2010). No caso
de Annonas, as acetogeninas costumam ser encontradas em maior concentração
nas sementes e, no caso de Annona muricata, essa parte da planta oferece um
maior rendimento em extrações com etanol quando comparada a outras partes
como folha, casca, fruto, galhos e raiz (ANSANTE, 2014; BRITO, 2014;
RANISAHARIVONY et al. 2015). Assim, utilizou-se o etanol, um ótimo solvente
extrator, uma vez que é capaz de extrair constituintes em um amplo espectro de
polaridade (ANASTAS e WARNER, 2000; FALKENBERG et al. 2010), e o material
vegetal seco e em pó grosso (70% > 355 µm), o que melhora a extração por evitar a
compactação excessiva do pó e aumentar a superfície de contato (LAROZE et al.
2010). O método extrator foi a maceração, devido ao seu baixo custo, praticidade e
capacidade de extrair constituintes minoritários (RANISAHARIVONY et al. 2015).
O processo extrativo realizado a partir das sementes por percolação gerou um
extrato etanólico (EE) com rendimento de 15%. Este rendimento foi semelhante ao
encontrado por Brito (2014), que usou metodologia similar, portanto, sugere-se que
o método aqui utilizado foi eficiente na extração dos constituintes solúveis em etanol
presentes nas sementes de A. muricata. O EE foi submetido a partições por 3
métodos diferentes (págs. 40-43), e os rendimentos obtidos das frações que
constam na Tabela 9 foram semelhantes aos relatados por outros autores como
Brito (2014) e Ranisaharivony e colaboradores (2015). Os maiores rendimentos
60
obtidos foram aqueles das frações hexânica (FH1, 75%), clorofórmica (FCL3, 72%) e
diclorometânica (FDM2, 62%), solventes de baixa e média polaridade. Isso se deve
provavelmente ao fato de sementes apresentarem usualmente um teor elevado de
óleos fixos (triacilgliceróis), que tendem a se concentrar nos solventes de caráter
menos polar em uma partição líquido-líquido com solventes de diferentes
polaridades (BRANCO et al. 2010). As frações de polaridade média, FCL1, FAE2
apresentaram um rendimento de 9 e 10%, respectivamente, semelhante ao das
frações mais polares FMH1 e FMH2, indicando que os constituintes mais polares
estão em teor mais baixo no extrato etanólico das sementes. No entanto, as frações
FAE3 e FMH3 da terceira partição, tiveram um rendimento de apenas 2,9 e 3%,
respectivamente. Isso ocorreu provavelmente por essas frações serem provenientes
de EEH, que presumivelmente extraiu principalmente compostos de baixa e média
polaridade do EE.
Tabela 9 - Rendimentos do processo extrativo das sementes de Annona muricata e partições
do extrato etanólico
Extrato/frações Método extrativo Quantidade inicial
(g) Rendimento g (%)
EE Maceração a partir do pó das sementes com etanol 96 °GL
(pág. 40) 400 60 g (15%)
FH1
Partições do Extrato Etanólico (págs. 40-43)
20
15 g (75%)
FCL1 1,8g (9%)
FMH1 1,56g (7,8%)
FDM2
20
12,4g (62%)
FAE2 2g (10%)
FMH2 1,6g (8%)
FCL3
20
14,4g (72%)
FAE3 0,58g (2,9%)
FMH3 0,6g (3%)
Legenda: EE – extrato etanólico; FH1 – fração hexânica 1; FMH1 – fração metanol/água 1; FCL1 – fração clorofórmica 1; FDM2 – fração diclorometano 2; FMH2 – fração metanol/água 2; FAE2 – fração acetato de etila 2; FCL3 – fração clorofórmica 3; FMH3 – fração metanol/água 3; FAE3 – fração acetato de etila 3.
A detecção de acetogeninas por CCD no extrato e frações revelou a presença
destes metabólitos em quase todas elas (Tabela 10, Figuras 14 e 15). EE e EEH
61
apresentaram perfis em CCD semelhantes quando as placas foram reveladas pelo
reagente de Kedde, sugerindo que boa parte das acetogeninas presente no EE são
solúveis em hexano, o que levanta a hipótese de um extrato hexânico ser a melhor
opção para extração de acetogeninas das sementes de A. muricata, diminuindo uma
etapa do processo aqui utilizado. A diferença dos perfis quando revelados por
anisaldeído sulfúrico pode estar relacionada a outros constituintes que não
acetogeninas, já que o AS é um revelador inespecífico.
Quanto às análises por CCD das frações das partições líquido-líquido, entre
aquelas da primeira partição, todas apresentaram resultado positivo para Kedde, o
que aponta para o fato de existirem acetogeninas de diferentes polaridades no EE.
No entanto, FCL1 apresentou uma mancha mais intensa que as demais frações, o
que pode sugerir uma maior concentração de acetogeninas nesta fração, de
polaridade média. Nas análises com revelação por AS, os perfis de FCL1 e FMH1
foram semelhantes, com manchas de mesma intensidade, o que sugere que um
mesmo grupo de constituintes está presente em ambas frações. Isto pode estar
associado, como discutido anteriormente, a utilização de um tempo inadequado no
processo de partição para a devida separação dos constituintes. FH1 teve resultado
negativo na revelação por AS, possivelmente por uma pequena concentração de
acetogeninas nesta fração.
Nas frações da segunda partição líquido-líquido, semelhantemente ao que
aconteceu naquelas da primeira partição, FAE2, fração obtida com solvente de
polaridade média, foi a que apresentou mancha mais intensa na análise com o
revelador de Kedde, sugerindo uma maior concentração de acetogeninas na
mesma. FDM2 e FMH2 também apresentaram resultado positivo para acetogeninas,
e as manchas revelam tipos de polaridades diferentes em cada uma delas. Na
análise por AS, todas frações foram positivas, apresentando mais uma vez tipos
diferentes de acetogeninas, pelas suas manchas, o que aponta para uma melhor
separação, se comparado a frações da primeira partição.
Nas frações da terceira partição líquido-líquido, mais uma vez todas foram
positivas na análise com revelador de Kedde. FCL3, neste caso a fração de menor
polaridade, foi a que apresentou mancha mais intensa. No entanto, como já
discutido, FCL3 e FAE3 foram obtidas com solventes de polaridade muito
62
semelhante, por isso pode-se afirmar que mais uma vez as acetogeninas parecem
ter se concentrado no solvente de polaridade média. FAE3 apresentou resultado
negativo na análise por AS, possivelmente por uma baixa concentração de
acetogeninas nesta fração.
Tabela 10- Resultados da detecção de acetogeninas por cromatografia em camada delgada
Amostra Revelador Resultado
EE Kedde +
Anisaldeído sulfúrico (AS) +
FH1 Kedde +
Anisaldeído sulfúrico (AS) -
FMH1 Kedde +
Anisaldeído sulfúrico (AS) +
FCL1 Kedde +
Anisaldeído sulfúrico (AS) +
FDM2 Kedde +
Anisaldeído sulfúrico (AS) +
FMH2 Kedde +
Anisaldeído sulfúrico (AS) +
FAE2 Kedde +
Anisaldeído sulfúrico (AS) +
FCL3 Kedde +
Anisaldeído sulfúrico (AS) +
FMH3 Kedde +
Anisaldeído sulfúrico (AS) -
FAE3 Kedde +
Anisaldeído sulfúrico (AS) -
Legenda: EE: Extrato Etanólico; FH1: Fração Hexânica 1; FMH1: Fração metanol/água 1; FCL1: fração clorofórmio 1; FDM2: fração diclorometano 2; FAE2: fração acetato de etila 2; FMH2: fração metanol/água 2; FCL3: fração clorofórmio 3; FAE3: fração acetato de etila 3; FMH3: fração metanol/água 3
63
Figura 14 – Cromatograma por CCD do extrato etanólico e porção solúvel em n-hexano
Legenda - EEH: porção do extrato etanólico solúvel em n-hexano; EE: extrato etanólico de sementes
Fase móvel - Acetato de etila:Metanol 9:1 Reveladores - A: Kedde; B: Anisaldeído Sulfúrico
Figura 15 – Cromatograma por CCD das frações provenientes das partições Legenda - FH1: Fração Hexânica 1; FMH1: Fração metanol/água 1; FCL1: fração clorofórmio 1;
FDM2: fração diclorometano 2; FAE2: fração acetato de etila 2; FMH2: fração metanol/água 2; FCL3: fração clorofórmio 3; FAE3: fração acetato de etila 3; FMH3: fração metanol/água 3
Fase móvel - Acetato de Etila/Metanol 9:1 Reveladores - (A) Kedde (B) Anisaldeído Sulfúrico
EE EEH EE EEH
A B
FDM2 FMH2 FAE2 FDM2 FAE2 FMH2
AA AA BB BB
FH1 FMH1 FCL1 FH1 FMH1 FCL1
AA BB
FCL3 FAE3 FMH3 FCL3 FAE3 FMH3
64
A reunião dos dados de cada partição líquido-líquido parece mostrar que as
acetogeninas, apesar de sua longa cadeia lipofílica, estavam presentes em maior
teor nas frações de polaridade intermediária, como acetato de etila (FAE2) e
clorofórmio (FCL1 e FCL3), com exceção de FAE3. Isso se deve, provavelmente, ao
grande número de funções oxigenadas (hidroxilas, anéis THF e anel lactônico)
presentes nas acetogeninas, que contribuem para aumentar sua polaridade, fazendo
com que tenham maior afinidade por solventes de polaridade média (FONTANA et
al. 1998; TAKADA et al. 2000). A análise por CLAE-DAD, discutida adiante, fortalece
esta hipótese, uma vez que se observou nas frações FAE2 e FCL3 uma maior
abundância de picos indicativos de acetogeninas, comparativamente às demais
frações.
Após a detecção de acetogeninas por CCD, análises por CLAE-DAD também
foram realizadas com o objetivo de conhecer o perfil cromatográfico do extrato e
frações, bem como detectar acetogeninas pelos seus espectros no UV registrados
online. Na Figura 16, que mostra os cromatogramas do extrato etanólico e frações
obtidos pela Programação A, se observa que, de maneira geral, parece haver alguns
picos comuns aos vários cromatogramas, na faixa de 46 a 54 min. Os espectros no
UV referentes aos constituintes destes picos, obtidos online, mostram que todos
podem ser atribuídos a acetogeninas, apresentando absorção no UV em torno de
210 nm. Este resultado é promissor, mostrando que as acetogeninas foram
extraídas eficientemente pelo etanol.
Na Figura 16A, que corresponde ao cromatograma por CLAE-DAD do EE, é
possível verificar vários picos com diferentes tempos de retenção, sugerindo uma
composição variada, com substâncias de diferentes polaridades. Tal resultado era
esperado, uma vez que os extratos brutos costumam ser matrizes muito complexas,
com diferentes constituintes (RAVAOMANARIVO et al. 2014; GOMATHI et al. 2015).
Deve-se ressaltar que os picos de maior intensidade aparecem a partir de 46 min, o
que, devido às características utilizadas na análise segundo as quais constituintes
de baixa polaridade possuem TRs maiores, indica que a maior parte dos
constituintes do EE com absorção em torno de 210 nm seja de
65
TR 21,6 min
TR 53,1 min
TR 16,2 min
TR 3,2 min TR 52,9 min
TR 2,4 min TR 14,6 min
TR 53 min TR 43,3 min
TR 53 min
TR 54,1 min
TR 52,9 min TR 16,2 min
TR 46,8 min
TR 47,7 min
TR 47,8 min
TR 49 min
TR 12,7 min
TR 14,7 min
TR 12,7 min
TR 11,3 min
B
C
G
I
J
H
F
D
E
A
Figura 16 - Cromatograma por CLAE-DAD do extrato etanólico e suas frações com tempo de retenção (TR) de picos de interesse
Condição: Programa A - Coluna LiChrospher 100, C-18, 125 x 4 mm, 5 µm; fluxo = 1 mL/min, temperatura 40 °C
Fase móvel: t = 0 min: 95% água e 5% acetonitrila; t = 60 min: 5% água e 95% acetonitrila; t = 65 min: 5% água e 95% acetonitrila; t = 70 min: 95% água e 5% acetonitrila
Legenda: A - extrato etanólico; B - fração hexânica 1 (FH1); C - fração clorofórmica 1 (FCL1); D - fração metanol/água 1 (FMH1); E - fração diclorometano 2 (FDM2); F - fração acetato de etila 2 (FAE2); G - fração metanol/água 2 (FMH2); H - fração clorofórmica 3 (FCL3); I - fração acetato de etila 3 (FAE3); J - fração metanol/água 3 (FMH3).
66
média a baixa polaridade. O espectro de absorção no UV referente ao constituinte
responsável pelo pico de maior intensidade com TR 46,81 min (Figura 17) possui
uma absorção máxima próxima a 210 nm (~208 nm), característica de acetogeninas
com anel γ-lactônico α-β-insaturado (MELOT et al. 2009; YANG et al. 2010). Além
disso, o tempo de retenção é semelhante ao encontrado por outros autores que
utilizaram perfis de análise por CLAE semelhantes ao utilizado no presente trabalho
(GROMEK et al. 1994; GU et al. 1995). O pico vizinho ao mais intenso, com TR 47,7
min, apresenta máximo de absorção no UV online em 214 nm, podendo também ser
atribuído a uma acetogenina. As absorções no UV de outros picos sugerem tratar-se
também de acetogeninas com diferentes TRs.
Nos cromatogramas referentes às frações da primeira partição, FH1, FCL1 e
FMH1 (Figura 18), observa-se que na fração FH1 predominam substâncias de baixa
polaridade, como era de se esperar, mas também estão presentes substâncias de
média polaridade. O pico 1 desta fração (TR 21,6 min), pico de maior área (12,56%),
bem como o pico 22 (TR 53,1 min), ambos com max em torno de 210 nm, sugerem a
presença de acetogeninas. Em FCL1 estão presentes substâncias de alta, média e
Figura 17 - Espectros de absorção no UV de picos do Extrato Etanólico registrados por CLAE-DAD
Legenda: TR - tempo de retenção; AU - absorbância
TR 53 min
TR 63,8 min TR 55,3 min
TR 49,2 min TR 48,7 min
TR 53,5 min
TR 46,8 min TR 47,7 min
67
baixa polaridade, e o pico majoritário (TR 52,9 min) provavelmente é devido a uma
acetogenina, considerando sua absorção no UV (Figura 19). A fração FMH1 contém,
principalmente, compostos polares, como se deduz pela predominância dos picos
com TR de até 20 minutos. Seus picos majoritários, 1 (TR 2,4 min, 17,4% área) e 9
(TR 14,6 min, 21,3% área), provavelmente não correspondem a acetogeninas, como
se deduz a partir de seus espectros no UV, mas os picos com TR 22,1 min e 25,6
min apresentam, ambos, absorção no UV com max de 209,6 nm, sugerindo a
presença de acetogeninas mais polares.
FH1
FCL1
FMH1
21,6 min 53,1 min
52,9 min
2,4 min
14,6 min
22,1 min 25,6 min
Figura 18 - Cromatogramas por CLAE-DAD das frações da primeira partição Legenda: FH1 – fração hexânica 1; FCL1 – fração clorofórmica 1;
FMH1 – fração metanol/água 1
68
É importante observar que as acetogeninas estão presentes em todos as
frações desta partição, com tempos de retenção diversos, apontando para
acetogeninas com diferentes polaridades, resultado este consonante com aqueles
encontrados na análise por CCD. A justificativa para esta constatação é o fato de as
acetogeninas apresentarem variada polaridade em função do variado número de
funções oxigenadas presentes nessas moléculas. De fato, já foram isoladas
acetogeninas com apenas dois grupos hidroxila, como montecristina, portanto de
menor polaridade, assim como acetogeninas com três anéis THF e duas hidroxilas,
como a goniocina, portanto mais polares (ALALI et al. 1999; BERMEJO et al. 2005).
Figura 19 - Espectros de absorção no UV online de picos dos cromatogramas por CLAE-DAD referentes às frações da primeira partição
Legenda: TR - tempo de retenção; AU - absorbância; A - fração hexânica 1 (FH1); B - fração clorofórmica 1 (FCL1); C - fração metanol/água 1 (FMH1).
A
B
Figura 20 - Estruturas químicas de duas acetogeninas Legenda: A - Montecristina; B - Goniocina
TR 53,1 min
TR 16,2 min
TR 3,2 min
TR 52,9 min
TR 25,6 min TR 22,1 min
TR 2,4 min
TR 14,6 min
A A B
B B C
C C C
TR 21,6 min
69
Nos cromatogramas referentes às frações da segunda partição (Figura 22),
nota-se que na fração FDM2 predominam picos com TR > 20 min, como era de se
esperar por se tratar de constituintes de baixa polaridade, solúveis em diclorometano
(RAO e NAGARAJU, 2003). Os picos mais intensos são aqueles de números 8 (TR
43,3 min, 13,5% área) e 12 (TR 53 min, 28,6% área), sendo que este último
apresenta espectro no UV característico de acetogeninas (Figura 21). Na fração
FAE2 predominam substâncias de média e baixa polaridade, com dois picos
intensos com TR 53,0 (36,0% área) e 54,1 (15,7% área) minutos, ambos com
absorção no UV com λmax 209,6 nm, sugestiva de acetogeninas. Os demais picos
registrados na faixa de 50 a 55 minutos possuem, todos, absorções em torno de λmax
210 nm (Figura 23), o que sugere uma fração rica em acetogeninas, motivo pelo
qual esta foi escolhida para subsequente fracionamento. A fração FMH2 apresenta
um perfil semelhante ao de FAE2, com a diferença de um maior número de picos
foram detectados nos primeiros 5 minutos, sendo, portanto, substâncias de caráter
mais polar, como esperado, uma vez que a fração metanol/água deveria acumular
as substâncias de caráter polar. É interessante observar, no entanto, que o pico
majoritário na fração FMH2 (TR 52,9 min, 26,4% área) parece corresponder ao pico
majoritário encontrado em FAE2 (TR 53,0 min), que foi relacionado à presença de
acetogeninas, e o mesmo ocorre com os demais picos próximos ao majoritário. Este
fato sugere que a separação na segunda partição não foi eficiente, sendo talvez
necessário um maior número de extrações da camada hidrometanólica com acetato
de etila para se ter uma melhor extração da provável acetogenina com TR 53,0 min.
(ACREE e ABRAHAM, 2006; MELWANKI e FUH, 2008). Mais uma vez, assim como
nas frações da primeira partição, todas as frações desta segunda partição
apresentaram picos que, pelos seus espectros no UV, devem corresponder a
acetogeninas.
70
A A B
B C C
TR 53 min
TR 54,1 min
TR 53 min
TR 16,2 min TR 52,9 min
TR 43,3 min
Figura 21 - Espectros de absorção no UV online dos picos majoritários nos cromatogramas por CLAE-DAD das frações da segunda partição
Legenda: TR - tempo de retenção; AU - absorbância; A - fração diclorometano 2 (FDM2); B - fração acetato de etila 2 (FAE2); C - fração metanol/água 2 (FMH2).
53,0 min FDM2
FAE2
FMH2
43,3 min
53,0 min 54,1 min
52,9 min 54,1 min
Figura 22 - Cromatogramas por CLAE-DAD das frações da segunda partição Legenda: FDM2 – fração diclorometano 2; FAE2 – fração
acetato de etila 2; FMH2 – fração metanol/água 2
71
Figura 23 - Espectros de absorção no UV online de picos do cromatograma por CLAE-DAD referentes à fração acetato de etila 2 (FAE2).
Legenda: TR - tempo de retenção; AU - absorbância
Nos cromatogramas referentes às frações da terceira partição (Figura 24),
claramente se nota que a maioria das substâncias menos polares se concentrou na
fração FCL3, enquanto que as mais polares se concentraram nas frações FAE3 e
FMH3. Isso ocorre porque o clorofórmio, primeiro solvente utilizado nesta partição,
possui caráter menos polar que o acetato de etila (4,1 e 4,4 P’ respectivamente), o
que levou a uma maior concentração dos constituintes mais polares na fração
acetato de etila, que apresentou perfil semelhante à fração FMH3. Os espectros no
UV relacionados aos constituintes responsáveis pelos picos mais intensos na fração
FCL3 (TR 47,8, 39,9% área e 49 min, 12,31% área) apresentam λmax em torno de
210 nm (Figura 25), sugerindo a presença de acetogeninas. Vários outros picos
registrados para esta fração também apresentam espectros no UV característicos de
acetogeninas (Figura 26), revelando que FCL3 é uma fração rica em acetogeninas.
No cromatograma de FAE3, os picos majoritários, com TR de 12,7 (20,9% área) e
14,7 min (16,0% área), apresentam espectros no UV (Figura 25) característicos de
alcalóides aporfínicos que são frequentes em Annonaceae e descritos para A.
muricata (LEBOEUF et al. 1981), sendo que na fração na fração FMH3 está
presente um mesmo alcaloide com TR 12,7 min (TSIMOGIANNIS et al. 2007). Mais
uma vez aqui, as frações FAE3 e FMH3 apresentaram perfis muito semelhantes,
levantando a questão da ineficiência da partição com esses dois solventes, já
discutida anteriormente, sugerindo que a partição final com metanol/água seria
dispensável. Mesmo assim, esta terceira partição foi a mais eficiente para a
separação e concentração de acetogeninas dentre aquelas testadas.
TR 55,3 min
TR 58,4 min TR 59,8 min TR 61,3 min
TR 56,1 min TR 57,3 min
72
Figura 25 - Espectros de absorção no UV online de picos dos cromatogramas em CLAE-DAD referentes às frações da terceira partição
Legenda: TR - tempo de retenção; AU - absorbância; A - fração clorofórmica 3 (FCL3); B - fração acetato de etila 3 (FAE3); C - fração metanol/água 3 (FMH3).
Figura 24 – Cromatogramas em CLAE-DAD das frações da terceira partição Legenda: FCL3 – fração clorofórmica 3; FAE3 – fração acetato de
etila 3; FMH3 – fração metanol/água 3
TR 49 min
TR 14,7 min
TR 12,7 min
TR 11,3 min
TR 12,7 min
TR 47,8 min A A B
B C C
FCL3
FAE3
FMH3
49,0 min 47,8 min
12,7 min
14,7 min
12,7 min
14,7 min
73
Figura 26 - Espectros de absorção no UV online de picos do cromatograma em CLAE-DAD referentes à fração clorofórmica 3 (FCL3).
Legenda: TR - tempo de retenção; AU - absorbância
Em resumo, a análise fitoquímica até este ponto revelou que, como esperado,
acetogeninas estão presentes no EE, e que dentre as frações obtidas por partição
líquido-líquido, as mais promissoras foram FAE2 e FCL3, por apresentarem maior
número de picos sugestivos de acetogeninas nas análises por CLAE-DAD, e
principalmente na região de substâncias de média polaridade (TR 45-60 min.), onde
é mais provável que as acetogeninas destas frações se encontrem. Por esse motivo
as mesmas foram submetidas a fracionamento por cromatografia de coluna de sílica
gel (CCS).
5.2.2 FRACIONAMENTO CROMATOGRÁFICO DE FAE2 E FCL3
O fracionamento de FAE2 por CCS gerou 27 subfrações, das quais a
subfração número 5 (FAE2(5)) foi a que apresentou maior massa (211,5 mg), além
de resultado positivo para Kedde, o que é um indicativo da presença de
acetogeninas. Não se fez reunião de subfrações porque foram observados perfis
muito diferentes nas análises por CCD, o que sugeriu a necessidade da realização
de uma nova separação. Assim como ocorreu nas partições líquido-líquido, aqui
também as acetogeninas parecem ter se concentrado nas subfrações de polaridade
média (4 a 13), eluídas com AcOEt ou AcOEt/Metanol, uma vez que estas foram as
subfrações de maior massa (Tabela 11). Este resultado é condizente com o
TR 52,3 min
TR 56,3 min TR 55,5 min
TR 51,3 min TR 50,3 min
TR 54,3 min
74
encontrado por outros autores que usaram técnicas de extração e separação
semelhantes (ELISYA et al. 2014; MULIA et al. 2013; YAMTHE et al. 2015), e
confirma a afinidade das acetogeninas por solventes de polaridade média. Na
Tabela 11 pode-se ver também que as maiores massas se concentram nas
subfrações obtidas com solventes de baixa polaridade (1 a 3), do que de alta
polaridade (21-27), mostrando que as substâncias polares presentes no EE foram
extraídas na sua maioria por FMH1, quando da partição, deixando em FAE2
principalmente constituintes de polaridade média e baixa.
Tabela 11 – Número de subfrações coletadas, com suas massas, de acordo com o eluente utilizado, na coluna cromatográfica da fração acetato de etila 2 (FAE2)
Fase móvel Subfrações coletadas Massa (mg)
CH2Cl2 1 136,1
CH2Cl2:AcOEt 1:1 (v/v) 2
3
64,0
24,5
AcOEt 4 79,4
AcOEt:MeOH 9:1 (v/v)
5
6
7
8
9
10
211,5
73,6
11,1
12,5
2,5
1,0
AcOEt:MeOH 7:3 (v/v)
11
12
13
20,2
38,3
7,5
AcOEt:MeOH 1:1 (v/v) 14
15
16,1
0
AcOEt:MeOH 3:7 (v/v)
16
17
18
19
20
8,0
4,8
9,7
10,4
24,1
MeOH
21
22
23
24
25
7,9
5,0
2,0
7,6
3,3
MeOH:H2O 9:1 (v/v) 26
27
27,2
20,9
75
Figura 27- Perfis cromatográficos por CLAE-DAD da subfração nº 5 (FAE2(5)) obtida a partir da fração acetato de etila 2 por cromatografia de coluna em duas diferentes programações.
Condição: Programação A e B - Coluna LiChrospher 100, C-18, 125 x 4 mm, 5 µm; fluxo = 1 mL/min, temperatura 40 °C
Fase móvel: Programação A: t = 0 min: 95% água e 5% acetonitrila; t = 60 min: 5% água e 95% acetonitrila; t = 65 min: 5% água e 95% acetonitrila; t = 70 min: 95% água e 5% acetonitrila. Programação B: t = 0 min: 15% água e 85% metanol; t = 40 min: 15% água e 85% metanol; t = 60 min: 5% água e 95% metanol
Legenda: (A) Programação A; (B) Programação B; TR: Tempo de retenção; AU: Absorbância
A análise por CLAE-DAD da subfração FAE2(5) foi realizada tanto pela
Programação A quanto pelo Programação B. Os cromatogramas correspondentes
são mostrados na Figura 27. É possível observar nestes cromatogramas que esta
fração contém principalmente dois constituintes representados pelos picos 6 (47,4
min, 56% área) e 7 (48,3 min, 23% área), na porção A da Figura 27, ambos com max
próximo de 210 nm no UV, o que aponta para a presença de acetogeninas. Na
porção B da Figura 27 é possível ver alguns picos, sendo o pico majoritário o de
número 3 (14,6 min, 71% área), com max 209,6 nm no UV online. Os outros picos
com TR acima de 48,3 devem todos corresponder a acetogeninas, de acordo com
os espectros no UV correspondentes (Figura 28). Esta análise mostrou que o
fracionamento realizado por CCS foi eficiente em separar este grupo de
acetogeninas dos demais constituintes encontrados na fração FAE2, além de revelar
essa fração como rica em acetogeninas.
TR 47,4 min
TR 48,3 min
TR 14,6 min
76
FAE2(5) foi submetida a novo fracionamento por CCS, e foram obtidas 15
subfrações, das quais as de número 5 e 6, ambas eluídas com AcOEt, foram as que
apresentaram características sugestivas de acetogeninas na análise por CCD, além
de estarem entre as de maior massa (84 e 20 mg respectivamente) (Tabela 12).
Pode-se ver pela tabela que o padrão de eluição das amostras para a CCS de
FAE2(5) foi semelhante àquele de FAE2, onde a maior parte da massa concentrou-
se nas amostras eluídas com solventes de polaridade média (4-11) e, em segundo
lugar, naquelas amostras eluídas com solventes de baixa polaridade (1-3), enquanto
que as amostras eluídas com solventes polares (12-15) possuíram pouca massa.
Esse fato reitera a hipótese de que as acetogeninas, que aparentam ser o principal
constituinte da fração FAE2 e subfração FAE2(5), como mostrado pelas análises de
CLAE-DAD, são extraídas principalmente por solventes de polaridade média.
Figura 28 - Espectros de absorção no UV online de picos no cromatograma por CLAE-DAD da subfração nº 5 (FAE2(5)) obtida a partir da fração acetato de etila por cromatografia de coluna
Legenda: A - Programação A; B - Programação B; TR - tempo de retenção; AU - absorbância
TR 49,3 min
TR 50,1 min
TR 49,9 min
TR 50,8 min TR 52,5 min
TR 49 min
TR 17,4 min TR 18,3 min TR 21,7 min
A A A
A A A
B B B
77
Tabela 12 - Número de subfrações coletadas, com suas massas, de acordo com o eluente utilizado, na coluna cromatográfica da subfração nº 5 (FAE2(5)) obtida a partir da fração acetato de etila 2
Fase móvel Subfrações coletadas Massa (mg)
CH2Cl2 1 0
CH2Cl2:AcOEt 1:1 (v/v) 2
3
9
14
CH2Cl2:AcOEt 3:7 (v/v) 4 29
AcOEt 5
6
84
20
AcOEt:MeOH(1%) (v/v) 7 3
AcOEt:MeOH(2%) (v/v) 8 0
AcOEt:MeOH(5%) (v/v) 9
10
0
4
AcOEt:MeOH 9:1 (v/v) 11 2
AcOEt:MeOH 7:3 (v/v) 12
13 6
MeOH 14
15
4
0
Pode-se notar no cromatograma de ambas subfrações (Figuras 29 e 30) um
pico majoritário com TR 47,7 min e absorção máxima no UV em 209,6 nm, que deve
corresponder a uma ou mais acetogeninas, uma vez que é possível notar um
pequeno pico sobreposto ao principal, o que pode indicar uma segunda substância,
eluindo em tempo muito semelhante à substância principal e que, portanto, pode se
tratar de um isômero (GROMEK et al. 1994; YANG et al. 2010). Há um outro pico
nas subfrações nos TR 49,6 min (Programação A) e 15,5 min (Programação B) para
FAE 2(5.5), e 50,3 (Programação A) e 18,7 (Programação B para FAE 2(5.6). Estes
picos também possuem máximo de absorção no UV em torno de 210 nm (Figuras 31
e 32), e por isso devem corresponder a diferentes acetogeninas. Apesar disso,
decidiu-se reunir estas subfrações, diante da sua semelhança, sob o nome de FAE
2(5.5). As Figuras 31 e 32 mostram que praticamente todos os picos presentes
neste cromatograma correspondem a acetogeninas, dada a sua absorção máximo
no UV, sugerindo esta subfração corresponde provavelmente a uma mistura de
acetogeninas isoladas.
78
TR 47,7 min
TR 12,4 min
TR 15,5 min
TR 49,6 min
TR 14,7 min
TR 47,8 min
TR 12,6 min
TR 18,7 min
TR 50,3 min
Figura 29- Perfis cromatográficos por CLAE-DAD da subfração FAE2(5.5) e espectros no UV online dos picos majoritários.
Condição: Programação A e B - Coluna LiChrospher 100, C-18, 125 x 4 mm, 5 µm; fluxo = 1 mL/min, temperatura 40 °C
Fase móvel: Programação A: t = 0 min: 95% água e 5% acetonitrila; t = 60 min: 5% água e 95% acetonitrila; t = 65 min: 5% água e 95% acetonitrila; t = 70 min: 95% água e 5% acetonitrila. Programação B: t = 0 min: 15% água e 85% metanol; t = 40 min: 15% água e 85% metanol; t = 60 min: 5% água e 95% metanol
Legenda: (A) Programação A; (B) Programação B; TR: Tempo de retenção; AU: Absorbância.
Figura 30- Perfis cromatográficos por CLAE-DAD da subfração FAE2(5.6) e espectros no UV online dos picos majoritários.
Condição: Programação A e B - Coluna LiChrospher 100, C-18, 125 x 4 mm, 5 µm; fluxo = 1 mL/min, temperatura 40 °C
Fase móvel: Programação A: t = 0 min: 95% água e 5% acetonitrila; t = 60 min: 5% água e 95% acetonitrila; t = 65 min: 5% água e 95% acetonitrila; t = 70 min: 95% água e 5% acetonitrila. Programação B: t = 0 min: 15% água e 85% metanol; t = 40 min: 15% água e 85% metanol; t = 60 min: 5% água e 95% metanol
Legenda: (A) Programação A; (B) Programação B; TR: Tempo de retenção; AU: Absorbância.
79
Figura 32 - - Espectros de absorção no UV online de picos nos cromatogramas por CLAE-DAD referentes à subfração FAE2(5.6).
Legenda: A - Programação A; B - Programação B; TR - tempo de retenção; AU - absorbância
Notou-se pouca diferença entre os perfis cromatográficos das subfrações
FAE2(5) e FAE2(5.5), mostrando que este segundo fracionamento não foi eficiente,
gerando subfrações com perfis cromatográficos muito semelhantes. No entanto, o
Figura 31 - Espectros de absorção no UV online de picos dos cromatogramas por CLAE-DAD referentes à subfração FAE2(5.5).
Legenda: A - Programação A; B - Programação B; TR - tempo de retenção; AU - absorbância
A A A
B B B
A A A
A A A
B B B
TR 49,5 min
TR 50,3 min
TR 49,8 min
TR 51,2 min TR 52,9 min
TR 49 min
TR 14,7 min TR 15,5 min TR 18, min
80
fracionamento por CCS da fração FAE2 foi eficiente em separar a provável
acetogenina que corresponde ao pico majoritário presente em seu cromatograma
(Figura 22), uma vez que este pico se reproduz nos cromatogramas de FAE2(5) e
FAE2(5.5). Além disso, constituintes minoritários nestas duas subfrações parecem
corresponder, em sua maioria, a acetogeninas. Portanto, sugere-se que uma única
CCS de FAE2 realizada cuidadosamente seja suficiente para se obter uma
subfração rica em acetogeninas.
Foi realizada ainda uma CCS a partir da fração FCL3, da qual foram obtidas
22 subfrações (Tabela 13). As subfrações de maior massa (1-4) foram eluídas com
solventes de baixa polaridade e apresentaram resultado negativo para acetogeninas
na análise por CCD com o reagente de Kedde. Portanto, sugere-se que seu principal
conteúdo seja de óleos fixos (principalmente triacilgliceróis), abundantes nas
sementes de A. muricata (BRANCO et al. 2010). Este resultado contrasta com
aquele da CCS de FAE2, no qual o maior acúmulo de massa se deu nas subfrações
eluídas com solventes de polaridade média. Isso se deve provavelmente ao fato de
que em FAE2, os óleos fixos devem ter se acumulado na fração FDM2, que é a de
menor polaridade da segunda partição, enquanto que FCL3 é a fração de menor
polaridade da terceira partição, mas que também concentrou a maior parte da
acetogeninas. Apesar das subfrações 1 a 4 serem as de maior massas, em segundo
lugar estão as subfrações 12 e 13, que apresentaram resultado positivo para
acetogeninas na análise por CCD com revelador de Kedde, e foram eluídas com
misturas de solventes de polaridade média, principalmente AcOEt, reproduzindo
assim o resultado encontrado no fracionamento por CCS da fração FAE2, reiterando
a hipótese de que a maioria das acetogeninas das sementes de A. muricata tem
afinidade por solventes de polaridade média.
Tabela 13 - Número de subfrações coletadas, com suas massas, de acordo com o eluente utilizado, na coluna cromatográfica da fração clorofórmica da terceira partição (FCL3)
Fase móvel Subfrações coletadas Massa (mg)
Hex - -
Hex:CH2Cl2 1:1 (v/v) 1
2
542
6081
CH2Cl2 3
4
470
3030
81
CH2Cl2:AcOEt 1:1 (v/v) 5 318
CH2Cl2:AcOEt 3:7 (v/v) 6 94
CH2Cl2:AcOEt 1:9 (v/v) 7 157
AcOEt
8
9
10
11
36
58
57
89
AcOEt:MeOH 9:1 (v/v) 12
13
709
421
AcOEt:MeOH 7:3 (v/v)
14
15
16
17
18
106
90
50
40
17
AcOEt:MeOH 1:1 (v/v) 19
20
37
81
AcOEt:MeOH 2:8 (v/v) 21
22
0
0
5.4 Análises por CLUE-EM-IES de frações contendo acetogeninas
EE e as frações FAE2, FAE2(5.5), FAE2(5.6), FCL3, FCL3.7 e FCL3.9 foram
investigadas quanto a presença de acetogeninas por CLUE-EM-IES de acordo com
a metodologia descrita por GU, e colaboradores (1997), com modificações.
Inicialmente foi obtido um cromatograma de íons totais (CIT) de EE (Figura
33), para que se pudesse saber em que tempo haveria uma maior abundância de
íons. A figura mostra que a maioria dos íons se encontra entre os TR de 7 e 12
minutos, faixa em que se espera a eluição de substâncias de média e baixa
polaridade, inclusive acetogeninas. Por isso, selecionou-se esse intervalo do CIT
para que a partir dele fosse extraído o espectro de massas, que se encontra na
Figura 34. No espectro é possível identificar pelo menos seis picos que poderiam
corresponder a acetogeninas através das suas massas moleculares + 1H ([M + H]+),
e são eles os picos de massa 613, 597, 595, 579, 563 e 531, os quais
corresponderiam a acetogeninas de massa 612, 596, 594, 578, 562 e 530. De
acordo com a metodologia utilizada, para que esses picos se confirmassem como de
acetogeninas, seria necessário identificar no espectro picos que indicassem uma
82
subsequente perda de hidroxilas na forma de água (-18 amu) a partir de [M + H]+,
além do aduto com sódio [M + Na]+. Cada massa destas citadas está associada a
um grupo de isômeros de acetogeninas, que possuem um número determinado de
hidroxilas e, portanto, devem apresentar um número determinado de perdas
subsequentes de água de acordo com a Tabela 14. Por exemplo, para que se
confirmasse que o pico de massa 597, pico de maior intensidade no espectro
analisado, está de fato associado ao grupo de acetogeninas de massa 596, seria
necessário identificar no espectro um pico de massa 619, correspondendo ao aduto
com sódio, e picos de massa 579, 561, 543 e 525, que correspondem à perda de
quatro hidroxilas na forma de água. Esses picos podem de fato ser identificados no
espectro de EE, assim como aqueles esperados para o grupo de acetogeninas de
massa 612, 594, 578, 562 e 530, descritos na Tabela 14.
Tabela 14 - Massa dos fragmentos esperados de acetogeninas de acordo com sua massa molar.
M [M + Na]+ [M + H]+ [M + H - H2O]+
[M + H - 2H2O]+
[M + H - 3H2O]+
[M + H - 4H2O]+
[M + H - 5H2O]+
[M + H - 6H2O]+
530 553 531 513 495 - - - -
562 585 563 545 - - - - -
576 599 577 559 541 - - - -
578 601 579 561 543 - - - -
580 603 581 563 545 527 - - -
594 617 595 577 559 541 - - -
596 619 597 579 561 543 525 - -
612 635 613 595 577 559 541 523 -
614 637 615 597 579 561 543 525 507
624 647 625 607 589 571 553 - -
Legenda: M – Massa molar
83
Figura 33 – Cromatograma de Íons Totais (CIT) do extrato etanólico no modo positivo.
Figura 34 – Espectro de massas do Extrato Etanólico registrado na faixa de 450 a 700 m/z.
84
Foram consideradas como mais abundantes no EE, diante da intensidade
relativa dos picos dos seus fragmentos, aquelas acetogeninas de massas
moleculares 596 e 578. Apesar de alguns dos fragmentos esperados para as
acetogeninas com essas massas se sobreporem (Tabela 14), o pico de massa 601,
que corresponde ao fragmento [M + Na]+ das acetogeninas de massa 578,
claramente se distingue, apontando para a existência de acetogeninas de massa
596 e 578 no EE. É importante ressaltar que estas massas não estão associadas a
uma acetogeninas apenas, mas a um grupo de isômeros de acetogeninas e é,
portanto, impossível determinar, através dessa metodologia, se está presente no EE,
por exemplo, apenas a acetogenina corossolona, de massa 578, ou anocatacina A,
também de massa 578, ou ambas. Seria necessário isolar uma substância de massa
578, e em conjunto com a análise de RMN então determinar de qual isômero se
trata. A Tabela 15 mostra acetogeninas já isoladas de sementes de A. muricata que
correspondem às massas 596 e 578, e pode-se observar que há várias. A
anonacina, uma das possíveis acetogeninas encontradas de massa molecular 596, é
descrita como majoritária nas diferentes partes de A. muricata, podendo chegar a
até 70% do seu conteúdo de acetogeninas (CHAMPY et al. 2005). De fato, no
presente estudo os picos relativos à massa molecular 596 foram aqueles com maior
intensidade em todas frações e subfrações analisadas, com exceção de FCL 3.7 e
FCL3.9, e supõe-se, portanto, que os mesmos estejam associados a anonacina ou
cis-anonacina. Quanto ao grupo de acetogeninas de massa 578, a corossolona é
descrita como acetogenina mais comum e, portanto, provavelmente presente em
maior quantidade nas amostras estudadas.
Tabela 15 - Acetogeninas já isoladas de sementes de Annona muricata com massas moleculares 578 e 596.
M Nome Posição das hidroxilas
Configuração relativa de anéis
THF
Fórmula molecular
578
Corossolona (CO, 10)
15, 20
tr / t / tr
C35H62O6
Anocatacina A 4, 23 t / tr / t / tr C35H62O6
Anocatacina B 4, 23 c / tr / c / tr C35H62O6
596
cis-Anonacina
4, 10, 15, 20
tr, c, tr
C35H64O7
cis-Goniotalamicina 4, 10, 13, 18 tr, c, tr C35H64O7
85
Arianacina + Javoricina 4, 12, 15, 20 tr, t, tr C35H64O7
Gigantetrocina B 4, 14, 17, 18 t / tr-tr C35H64O7
Muricatetrocina A+B 4, 16, 19, 20 t /er ou tr-tr C35H64O7
Muricina A 4, 19, 26, 27 t / tr-tr C35H64O7
Muricina Ba 4, 19, 26, 27 t / tr-tr C35H64O7
Muricina C
4, 21, 24, 25
t / tr-tr
C35H64O7
a Possui carbono com configuração S na posição 4, diferentemente de muricina A. De fato é a única acetogenina conhecida com essa configuração; Legenda: M – massas molar; c - cis; t - trans; er - eritro; tr - treo. Fonte: BERMEJO, e colaboradores (2005).
O espectro de massas de FAE2 (Figura 35) revelou a presença da maioria
dos fragmentos também encontrados em EE, com exceção dos fragmentos
provenientes de acetogeninas de massa 530 que, ainda que presentes,
apresentaram intensidade muito baixa. Estes resultados reiteram os resultados de
CLAE-DAD, mostrando que o método de partição líquido-líquido foi eficiente em
separar as acetogeninas em uma fração de polaridade média. Em adição aos
fragmentos já encontrados em EE, foi possível identificar fragmentos relativos a
acetogeninas de massa molecular 580 (Tabela 14), que provavelmente estavam em
menor concentração em EE, e por isso ocultos pela presença de outros
constituintes. Em FAE2 os grupos de acetogeninas majoritários foram aqueles de
massa 578, 580 e 596. A Tabela 16 mostra acetogeninas já isoladas de sementes
de A. muricata de massa molar 580 e que podem, portanto, estar presentes em
FAE2.
Tabela 16 - Acetogeninas já isoladas de sementes de Annona muricata com massas 576, 580 e 624.
M Nome Posição das hidroxilas
Configuração relativa de anéis
THF
Fórmula molecular
576 Coibina C+D (Dupla em C21/19)
17/15, 18/16 tr-c C37H68O4
580
Murisolina
4, 15, 20
tr / t / tr
C35H64O6
Corosolina 10, 15, 20 tr / t / tr C35H64O6
Muricina H 19, 24, 25 t / tr-tr C35H64O6
624
cis-Annomontacina
4, 10, 17, 22
tr / c / tr
C37H68O7
Legenda: M – massa molar; c - cis; t - trans; er - eritro; tr - treo. Fonte: BERMEJO et al. 2005.
86
FAE 2(5.5) e FAE 2(5.6), originadas do fracionamento de FAE2 por CCS,
foram analisadas em seguida. FAE 2(5.5) apresentou quase que exclusivamente
fragmentos correspondentes a acetogeninas de massa molecular 596 (Figura 36)
que, como discutido anteriormente, provavelmente correspondem à anonacina ou
cis-anonacina. FAE 2(5.6), semelhantemente, apresentou principalmente fragmentos
relativos a acetogeninas de massa molecualr 596 (Figura 37), mas também foi
possível identificar fragmentos associados a acetogeninas de massa molar 624. O
padrão de fragmentação para acetogeninas com essa massa encontra-se na Tabela
14 e, como mostra a Tabela 16, uma única acetogenina com essa massa, cis-
anomontacina, foi até o momento isolada de sementes de A. muricata, podendo-se
deduzir então, que a mesma está presente em FAE 2(5.6).
Figura 35 - Espectro de massas da FAE2 registrado no intervalo de 450 a 700 m/z.
87
Figura 37 - Espectro de massas da FAE 2(5.5) compreendido entre os TR 7 e 12 minutos registrados entre 450 e 700 m/z.
Figura 36- Espectro de massas da FAE 2(5.6) compreendido entre os TR 7 e 12 minutos registrados entre 450 e 700 m/z.
88
FCL3, apesar de ter sido obtida por partição do EE por um método diferente
do utilizado para obtenção de FAE2 (Itens 4.2.3.2 e 4.2.3.3, págs. 42-44),
apresentou perfil muito semelhante ao desta (Figura 38), com predominância de
grupos de acetogeninas de massa molar 578, 580 e 596, aqui representadas pelos
seus íons moleculares [M+1], que podem corresponder às acetogeninas descritas
nas Tabelas 15 e 16. A partir disso e dos dados já discutidos de CLAE-DAD, pode-
se inferir que ambas as metodologias utilizadas para particionar EE foram eficientes
em separar acetogeninas. Levando-se em consideração, no entanto, que FCL3 foi
obtida a partir de uma única etapa de partição, enquanto que FAE2, a partir de duas,
a primeira seria mais adequadamente utilizada para a separação de acetogeninas, já
que uma única etapa de partição reduziria a perda de material.
O espectro de massas de FCL 3.7, diferentemente das outras frações,
apresentou predominantemente fragmentos associados a acetogeninas de massa
Figura 38 - Espectro de massas da FCL3 compreendido entre os TR 7 e 12 minutos registrados entre 450 e 700 m/z..
89
molar 578 e 576, ainda que também estejam presentes fragmentos relativos às
acetogeninas de massa molar 596 (Figura 39). A Tabela 14 mostra os fragmentos
esperados de acetogeninas com massa molar 576, e a Tabela 16 mostra que
apenas duas acetogeninas com essa massa, Coibinas C e D, isoladas em mistura,
foram até agora encontradas em sementes de A. muricata. Logo, pode-se inferir que
as mesmas se encontram nesta subfração.
Semelhantemente, FCL 3.9 apresentou principalmente fragmentos referentes
a acetogeninas de massa molar 578 e 580 e, em menor intensidade, 576. Pela
primeira vez, fragmentos associados a acetogeninas de massa molar 596
praticamente não foram detectados (Figura 40).
Em resumo, o grupo de isômeros de acetogeninas de massa molar 596 foi
aquele de maior intensidade em EE, FAE2, FAE 2(5.5), FAE 2(5.6) e FCL3.
Provavelmente a acetogenina mais abundante com esta massa nestas frações e
subfrações seja a anonacina, já descrita como acetogenina majoritária em A.
Figura 39 - Espectro de massas da FCL 3.7 compreendido entre os TR 7 e 12 minutos registrados entre 450 e 700 m/z.
90
muricata. As frações FCL 3.7 e FCL 3.9, no entanto, apresentaram principalmente
acetogeninas de massa molar 578 e 580, mostrando que as metodologias de
separação por CCS, ainda que menos eficientes que metodologias mais sofisticadas
como CLAE preparativo, são uma opção válida para separação de acetogeninas. No
total, foi possível identificar pelo menos dez grupos de acetogeninas, de acordo com
suas massas moleculares (530, 562, 576, 578, 580, 594, 596, 612, 614 e 624), que
podem corresponder a mais de vinte diferentes acetogeninas, dado a existência de
vários isômeros. O número possível de isômeros de acetogeninas para,
praticamente, cada uma das massas molares consideradas faz com que seja
virtualmente impossível a diferenciação entre os mesmos em matrizes complexas
como são estas frações e subfrações. Para tanto seria necessário o isolamento ou
obtenção de misturas com reduzido número de acetogeninas. Os dados disponíveis
permitem sugerir a presença das acetogeninas cis-annomontacina e coibinas C e D,
uma vez que são as únicas acetogeninas de massas molares 624 e 576,
respectivamente, já isoladas de sementes de A. muricata.
Figura 40 - Espectro de massas da FCL 3.9 compreendido entre os TR 7 e 12 minutos registrados entre 450 e 700 m/z.
91
5.5 Identificação e quantificação de acetogeninas por qRMN de 1H
Análises de RMN de 1H foram realizadas para identificar a presença de
acetogeninas no EE, FAE2 e FCL3. Todos os espectros obtidos (Figuras 41-43)
apresentaram sinais característicos de acetogeninas referentes à unidade γ-lactona-
α,β-insaturada com deslocamentos em torno de δ 1,4 (H-35/37); 5,0 (H-34/36) e 7,0
(H-33/35) ou 7,2 (H-33/35 para acetogeninas com OH em C-4). Sinais referentes aos
hidrogênios de carbonos ligados a hidroxilas também foram observados, com
deslocamentos em torno de δ 3,4, assim como sinais referentes a anéis THF, com
deslocamentos em torno δ 3,8 (hidrogênios-α em relação ao oxigênio do anel). O
espectro de FCL3, especificamente (Figura 43), apresentou sinais em δ 5,38 que
podem ser referentes a hidrogênios olefínicos, o que condiz com os dados de EM
que revelaram a presença de coibinas C e D na fração FCL3.12, acetogeninas que
possuem ligações duplas carbono-carbono.
Estes dados de RMN, associados aos dados anteriormente discutidos de EM,
CLAE-DAD e CCD permitem confirmar a presença de acetogeninas no extrato e
frações estudados. A utilização destas diferentes técnicas adiciona robustez ao
resultado, mas é importante reconhecer as limitações de cada uma. As técnicas
mais simples e de baixo custo, como CCD e CLAE-DAD, são principalmente
presuntivas, quando não se dispõe de um padrão para ser avaliado
concomitantemente aos extratos ou frações em estudo. Por esse motivo, estas
metodologias costumam ser utilizadas em estágios iniciais de análises fitoquímicas.
Já as técnicas de EM e RMN, mais caras e sofisticadas, quando utilizadas de acordo
com a metodologia aqui descrita, prescindem das técnicas de CCD e CLAE-DAD
para a identificação de acetogeninas e, portanto, diminuem potencialmente o tempo
das análises (KRISHNAN, KRUGER, RATCLIFFE, 2004; MOCO et al. 2007).
A quantificação de acetogeninas por de RMN de 1H foi realizada em triplicata
para as amostras EE, FAE2, FCL3 e FCL3.7 e FCL3.12, e o valores de
concentração foram obtidos a partir da média de cada análise (Tabela 17).
Espectros representativos das amostras de cada fração encontram-se nas Figuras
44 e 45.
92
Figura 41 - Espectro de RMN de 1H de EE, com destaques para os deslocamentos característicos de acetogeninas
93
Figura 42 - Espectro de RMN de 1H de FAE2 seccionado, com destaques para os deslocamentos característicos de
acetogeninas
94
Figura 43 - Espectro de RMN de 1H de FCL3 seccionado, com destaques para os deslocamentos característicos de acetogeninas
95
Nestes experimentos, as acetogeninas representaram apenas 0,76% do peso
total do pó de sementes (calculado a partir do EE), o que é comum, uma vez que
esta classe de metabólitos secundários costuma estar em baixa concentração nas
plantas (SHITAN, 2016). No entanto, os métodos de extração e os de fracionamento
utilizados foram eficientes em concentrar acetogeninas, já que seu teor aumentou a
cada etapa. Em especial, o aumento da concentração em FAE2 sugere a partição
líquido-líquido como um método simples para obtenção de frações ricas em
acetogeninas, que podem vir a ser utilizadas em formulações farmacêuticas. As
concentrações de acetogeninas expressas em anonacina foram mais altas em EE,
FAE2, FCL3 e FCL3.12, corroborando dados que relatam esta acetogenina como
majoritária (BONNEAU et al. 2017). Em FCL3.7, no entanto, as concentrações foram
mais altas quando expressas em solamina que como anonacina. Isto condiz com os
dados obtidos por EM, onde FCL3.7 foi a única fração em que o pico de massa
molar 597, provavelmente associado a anonacina, não foi predominante. Ainda,
FCL3.7 foi obtida por CCS, eluída em solução de CH2Cl2:AcOEt 1:9, enquanto que
FCL3.12, foi eluída em AcOEt:MeOH 9:1. Assim, a diferença de polaridade entre
solamina e anonacina (Figura 46), que possuem duas e quatro hidroxilas,
respectivamente, pode justificar o fato de FCL3.7 ter maior concentração de
acetogeninas expressas como solamina.
Tabela 17 - Concentrações de acetogeninas obtida por qRMN de 1H no extrato etanólico e frações analisadas
Amostra Concentração de acetogeninas na amostra (mg/g) ± desvio padrão
Calculada como anonacina Calculada como solamina
EE 85,12 ± 3,81 76,10 ± 5,10
FAE2 786,18 ± 27,87 202,72 ± 36,31
FCL3 105,54 ± 8,71 60,23 ± 14,93
FCL3.7 134,93 ± 22,76 616,16 ± 35,48
FCL3.12 942,64 ± 38,26 99,67 ± 2,61
Legenda: EE – extrato etanólico; FAE2 – fração acetato de etila 2; FCL3 – fração clorofórmica 3; FCL3.7 – subfração de coluna 7, da fração clorofórmica 3; FCL3.12 – subfração de coluna 12, da fração clorofórmica 3.
96
Os valores inicialmente obtidos para concentração de acetogeninas quando
expressas como anonacina para FCL3.12 foram dados impossíveis, pois sugeriam
que haveria 1,556g de acetogeninas em 1g de amostra. Isto ocorreu porque nesta
amostra o valor da integração dos sinais escolhidos para análise referentes a
acetogeninas calculadas como anonacina foi maior que aqueles do antraceno,
padrão interno utilizado. Uma maior concentração de antraceno (1,5 mg/mL) foi
então utilizado para que se pudesse obter dados coerentes, o que se provou
possível. Não obstante, a construção de uma curva de calibração para se
estabelecer com precisão limites de detecção e quantificação, seria o ideal, o que
não foi realizado pelos autores responsáveis pela técnica aqui reproduzida. Bonneau
e colaboradores (2017), em experimento semelhante, utilizaram com sucesso como
padrão interno o fumarato de dimetila, tendo também estabelecido os limites de
detecção e quantificação para sua técnica, a qual pode ser, portanto, uma alternativa
àquela utilizada nesta análise.
Figura 44 - Espectro de RMN de 1H de EE com adição de antraceno e amplianção da região com sinais utilizados para quantificação
4 α-H Antraceno H-35 Anonacina
H-33 Solamina
97
FCL3 FAE2
4 α-H Antraceno H-35 Anonacina
H-33 Solamina
4 α-H Antraceno H-35 Anonacina
H-33 Solamina
4 α-H Antraceno H-35 Anonacina
H-33 Solamina
4 α-H Antraceno
H-35 Anonacina
H-33 Solamina
FCL3.7 FCL3.12
Figura 45 - Espectros de RMN 1H de FAE2, FCL3, FCL3.7 e FCL3.12, com adição de antraceno e amplianção da região com sinais utilizados para quantificação
98
5.6 Atividade antileishmania
As subfrações FCL 3.7, FCL 3.9, FCL 3.12, FAE 2(5.4), FAE 2(5.5) e FAE
2(5.6) foram avaliadas quanto à sua atividade antipromastigota pelo método do MTT.
Os valores de CI50 determinados para cada subfração encontram-se na Tabela 18.
Todas as subfrações apresentaram CI50 < 100 µg/mL e, portanto, foram
consideradas ativas de acordo com parâmetros estabelecidos na metodologia.
Atribui-se a atividade antipromastigota dessas subfrações à presença de
acetogeninas, confirmada pelas análises espectométricas. Estes resultados são
coerentes com dados da literatura, uma vez que acetogeninas isoladas e extratos de
A. muricata têm sido identificados como ativos contra formas promastigotas de
diferentes espécies de Leishmania. Osorio e colaboradores (2007) obtiveram um
extrato de acetato de etila das folhas de A. muricata que apresentou CI50 de 25
µg/mL contra formas promastigotas de L. amazonensis e L. braziliensis. Vila-Nova e
colaboradores (2013) isolou duas acetogeninas, anonacinona e corosolona, as quais
apresentaram CI50 entre 6,72-8,00 e 16,14-18,73 µg/mL, respectivamente, contra L.
major, L. donovani e L. mexicana. O mesmo grupo, em outro momento, determinou
as CI50 de anonacinona e corosolona contra formas promastigotas de L. chagasi,
obtendo valores que variaram de 13,5 a 28,7 µg/mL e 43,5 a 79,9 µg/mL,
respectivamente (VILA-NOVA et al. 2011). Ainda, Le Grandic, e colaboradores
Anonacina
Solamina
Figura 46 - Estruturas químicas das acetogeninas anonacina e solamina
99
Figura 47 - Estruturas químicas das acetogeninas corossolona e coibina C
(2004) avaliaram a atividade antipromastigota de doze acetogeninas contra L.
donovani, e encontraram valores de CI50 variando de 4,7 a 47,3 µM. Os valores de
CI50 encontrados para as frações avaliadas no presente estudo, portanto,
assemelham-se àqueles encontrados pelos autores citados para acetogeninas
isoladas. Este resultado é promissor, uma vez que as frações são de mais fácil
obtenção do que as acetogeninas isoladas, o que reduziria o custo de um possível
produto com atividade antileishmania obtido a partir de A. muricata.
Dentre as amostras estudadas, FCL 3.7 e FCL 3.9 foram as que
apresentaram menor atividade. De acordo com os dados da análise por IES-MS e
RMN, estas foram as únicas amostras nas quais a anonacina (Figura 46) não foi
predominante, mas sim as acetogeninas corossolona e/ou coibina C/D (Figura 47).
Esta diferença na constituição das amostras é provavelmente o motivo da diferença
na atividade, uma vez que estudos de estrutura-atividade revelam que uma maior
quantidade de hidroxilas e anéis THF, assim como uma hidroxila no carbono C-4,
estão associados com maior atividade anticancerígena (OBERLIES et al. 1997;
YANG et al. 2009) e, portanto, podem também estar associados com a atividade
antipromastigota. A anonacina possui uma maior quantidade de hidroxilas que
corossolona e coibina C/D, além de uma hidroxila em C-4, o que a tornaria mais
ativa que as demais acetogeninas citadas.
Corossolona
Coibina C
100
No entanto, os ensaios de atividade antipromastigota são apenas presuntivos
quanto a possível atividade antileishmania de uma amostra, já que a forma
responsável pelo desenvolvimento das leishmanioses no homem é a amastigota.
Além disso, outro parâmetro importante a ser avaliado é a citotoxicidade de uma
amostra, para que se possa ser calculado o índice de seletividade (IS) da mesma,
que expressa mais adequadamente sua atividade.
Tabela 18 - CI50 das subfrações analisadas para atividade antipromastigota em Leishmania amazonensis
Amostra CI50 + DP (µg/mL) Classificação
FCL3(7) 24,63 ± 0,07 Ativo
FCL3(9) 15,46 ± 0,52 Ativo
FCL3(12) 10,87 ± 0,20 Ativo
FAE2(5.4) 12,68 ± 0,75 Ativo
FAE2(5.5) 6,48 ± 0,60 Ativo
FAE2(5.6) 9,99 ± 0,77 Ativo
Anfotericina B 4,9 ± 0,67 Ativo
Legenda: CI50 < 100µg/mL- ativo; 100 < CI50 < 200µg/mL- moderadamente ativo; CI50 >
200µg/mL- inativo (MOTA, 2010); DP: desvio padrão.
Nos ensaios de atividade anti-amastigota avaliou-se o efeito das subfrações
FCL 3.11, FCL 3.12, FAE 2(5.4) e FAE 2(5.6) em macrófagos murinos (RAW 264.7)
infectados com L. amazonensis (cepa 199). Os resultados foram expressos em
porcentagem de infecção de macrófagos nas diferentes concentrações avaliadas
(Tabela 19).
Dentre as frações avaliadas, FCL 3.12 apresentou resultados promissores, e
seus dados de RMNq de 1H revelaram uma alta concentração de acetogeninas
calculadas como anonacina (Tabela 17). Um dado importante, no entanto, é a
morfologia alterada dos macrófagos observada em alguns dos experimentos
(comparar Figuras 48 e 49), e especialmente em FCL 3.12. Goon-Tae, e
colaboradores (2016) ao avaliar o efeito imunomodulatório de um extrato etanólico
de A. muricata em macrófagos RAW 264.7, identificou alterações na membrana dos
mesmos, associando-as a estimulação da diferenciação celular e da resposta imune
101
*Só foi possível determinar o percentual de infecção em um dos experimentos pois no outro haviam muitos macrófagos com morfologia alterada, portanto não há média ou desvio padrão. **Testada apenas na concentração de 50 µg/mL.
provocadas pelo extrato. Esta regulação da resposta imune poderia ser a
responsável por inibir a infecção dos macrófagos. Uma outra hipótese levantada é
que, devido a sua natureza físico-química, as acetogeninas poderiam atuar como
tensoativos, consequentemente desestabilizando a membrana lipídica dos
macrófagos. Essa desestabilização impediria a interação de proteínas de membrana
do parasito com as da célula, inviabilizando assim sua incorporação pelo macrófago
e contribuindo para a redução do percentual de infecção (MORRÉ et al. 1994;
OBERLIES et al. 1997; SHIMADA et al. 1998). A possibilidade mais plausível para o
que provocou a alteração de membrana dos macrófagos, no entanto, é a
citotoxicidade de FCL 3.12, pois foram utilizados para o teste anti-amastigota
macrófagos de linhagem cancerígena, e atividade antineoplásica contra diferentes
linhagens tem sido associada a acetogeninas (CORIA-TÉLLEZ et al. 2016;
GEORGE et al. 2012; MOGHADAMTOUSI et al. 2015).
Tabela 19 - Atividade anti-amastigota em Leishmania amazonensis das subfrações analisadas
(percentual de infecção).
Amostras Concentração (µg/mL) ± Desvio padrão
50 25 12,5 6,25 3,12
FCL 3.11 24,5 ± 3,5 25 ± 8,3 28 ± 9,1 39 ± 1,4 37,5 ± 2,1
Perc
en
tuais
de in
fecção
FCL 3.12 11* 9* 30* 44* 47*
FAE2 (5.4) 33* 25* 30* 41,5 ± 4,4 38,5 ± 3,2
FAE2 (5.6) 30 ± 2,8 36* 26 ± 2,8 38 ± 4,1 28*
Anfotericina B 0**
102
Figura 48 – Imagens de macrófagos obtidas no ensaio de atividade anti-amastigota de FCL 3.12. A: macrófagos não infectados, não tratados; B: macrófagos infectados não tratados. Cabeças de seta: amastigotas de Leishmania amazonensis
A B
10 μm 10 μm
A
10 μm
10 μm 10 μm
B
C
Figura 49 - Imagens de macrófagos obtidas no ensaio de atividade anti-amastigota de FCL 3.12. A: macrófagos infectados, tratados com FCL 3.12; B: macrófagos não infectados tratados com FCL 3.12; C: macrófagos infectados tratados com anfotericina B. Cabeças de seta: amastigotas de L. amazonensis; setas: vacúolos.
103
O ensaio de citotoxicidade foi realizado com macrófagos murinos da linhagem
RAW 264.7, avaliando-se as mesmas amostras testadas no ensaio anti-amastigota.
Os resultados obtidos (Tabela 20) mostram que todas as amostras foram citotóxicas,
com índices de seletividade (IS) inferiores a 10. Como dito anteriormente, esta
citotoxicidade provavelmente é devida ao fato de as células utilizadas no ensaio anti-
amastigota serem de linhagem cancerígena. A inibição do sistema oxidativo NADH é
um efeito característico de acetogeninas e que é especialmente observado em
células neoplásicas por possuírem atividade metabólica exacerbada (GRANDIC et
al. 2004). Essa tese é reforçada pela pesquisa realizada por Morré e colaboradores
(1994), que ao comparar a citotoxicidade de uma acetogenina, bulatacina (Figura
49), contra células cancerígenas HELA e HL-60 com a citotoxicidade contra células
normais do fígado de ratos, constatou que a inibição do sistema NADH e, portanto, a
citotoxicidade, foi seletiva para células cancerígenas. Assim, é necessário realizar
testes de citotoxicidade com células normais para que se possa melhor avaliar a
atividade citotóxica das amostras estudadas. Além disso, estes resultados apontam
as acetogeninas como potentes inibidores de células cancerígenas, corroborando
dados da literatura (KOJIMA et al. 2013; SUN et al. 2016).
Tabela 20 - Valores da concentração citotóxica (CC50) das frações analisadas em linhagem de macrófago murino (RAW 264.7).
Fração CC50 (µg/mL) CI50 (µg/mL) IS (CC50/CI50)
FAE2 (5.4) 12,50 12,68 0,98
FAE2 (5.6) 26,74 9,99 2,68
FCL 3.11 17,95 16,80 1,06
FCL 3.12 12,37 10,87 1,13
Anfotericina B 264,10 4,90 53,90
Bulatacina
Figura 50 - Estrutura química da acetogenina bulatacina
104
6 CONCLUSÃO
Os métodos de partição mais eficientes para a obtenção de frações ricas em
acetogeninas foram o segundo, realizado com diclorometano, acetato de etila e
metanol/água, e o terceiro, realizado com clorofórmio, acetato de etila e
metanol/água, os quais geraram as frações FAE2 e FCL3. A separação por CCS
revelou-se eficiente em separar acetogeninas, as quais concentraram-se
principalmente em solventes de média polaridade. As análises por espectrometria
permitiram identificar como principais constituintes dessas frações, e das subfrações
de FAE2 analisadas, acetogeninas de massa molar 596, dentre as quais a principal
e provavelmente mais abundante é anonacina. Nas subfrações de FCL3, no entanto,
as acetogeninas mais abundantes são as de massa 578, sendo a principal a
corosolona. Estes dois metabólitos são possivelmente os responsáveis pela
atividade antipromastigota encontrada, os quais também apresentaram potencial
atividade antitumoral, uma vez que foram citotóxicos contra células RAW 264.7 e
consequentemente apresentaram baixa seletividade. Esta citotoxicidade também
pode estar associada à ausência de atividade anti-amastigota relevante, pois a lesão
dos macrófagos utilizados no teste anti-amastigota pode ter impedido a interação
efetiva dos constituintes das frações com as células amastigotas. Faz-se necessário,
portanto, a realização de estudos de citotoxicidade utilizando-se células normais
para que se possa definir a real citotoxicidade das amostras estudas contra
macrófagos e, não havendo citotoxicidade relevante, novos estudos de atividade
anti-amastigota. Assim será possível determinar o valor das amostras estudadas na
busca de constituintes leishmanicidas.
105
7 REFERÊNCIAS
ACREE JUNIOR, W.; ABRAHAM, M. H. The analysis of solvation in ionic liquids and organic solvents using the Abraham linear free energy relationship. Journal of Chemistry Technology and Biotechnology, v. 81, p. 1441–1446, 2006.
ADEWOLE, S. O.; CAXTON-MARTINS, E. A. Morphological changes and hypoglycemic effects of Annona muricata Linn. (Annonaceae) leaf aqueous extract on pancreatic B-cells of streptozotocin-treated diabetic rats. African Journal of Biomedical Research, v. 9, p. 173–187, 2006.
ADEWOLE, S.; OJEWOLE, J. Protective effects of Annona muricata L. (Annonaceae) leaf aqueous extract on serum lipid profiles and oxidative stress in hepatocytes of streptozotocin-treated diabetic rats. African Journal of Traditional Complementary and Alternative Medicine, v. 6, p. 30–41, 2009.
ALALI, F. Q.; LIU, X.-X.; MCLAUGHLIN, J. L. Annonaceous Acetogenins: Recent Progress. Journal of Natural Products, v. 62, p. 504-540, 1999.
ALKOFAHI, A.; RUPPRECHT, J. K.; LIU, Y.-M.; CHANG, C.-J.; SMITH, D. L. e MCLAUGHLIN, J. L. Gigantecin: A novel antimitotic and cytotoxic acetogenin, with nonadjacent tetrahydrofuran rings, from Goniothalamus giganteus (Annonaceae). Experimentia, v. 46, p. 539-541, 1990.
ALLEGRAND, J.; TOUBOUL, D.; SCHMITZ-AFONSO, I.; GUÉRINEAU, V.; GIULIANI, A.; LE VEN, J.; CHAMPY, P. e LAPRÉVOTE, O. Structural study of acetogenins by tandem mass spectrometry under high and low collision energy. Rapid Communications Mass Spectrometry, v. 24, n. 24, p. 3602, 2010.
ALVAR, J. et al. Leishmaniasis worldwide and global estimates of its incidence. PLoS One, v. 7, n. 5, p. 1-12, 2012.
ALVAR, J.; YACTAYO, S., BERN, C. Leishmaniasis and poverty. Trends in Parasitology, v. 22, p. 552-557, 2006.
AMATO, V. S. et al. Use of itraconazole in the treatment of mucocutaneous leishmaniasis: a pilot study. International Journal of Infectious Diseases, v. 4, n. 3, p. 153-157, 2000.
AMINIMOGHADAMFAROUJ, N.; NEMATOLLAHI, A.; WIART, C. Annonaceae: bio-resource for tomorrow’s drug discovery. Journal of Asian Natural Products Research, v. 13, n. 5, p. 465-476, 2011.
ANASTAS, P. T.; WARNER, J.C. Green chemistry: theory and practice. Oxford University Press, 2000.
ANSANTE, T. F. Metabólitos secundários de Annonaceae: triagem, fracionamento biomonitorado e bioatividade frente a Spodoptera frugiperda (J. E. Smith, 1797) (Lepidoptera: Noctuidae). 2014. 103 f. Dissertação (Mestrado) - Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Piracicaba - SP, 2014.
106
ANTONELLI, L. R. V. et al. Antigen specific correlations of cellular immune responses in human leishmaniasis suggests mechanisms for immunoregulation. Clinical and Experimental Immunology, v. 136, n. 2, p. 341-348, 2004.
APG. Angiosperm Phylogeny Group, Botanical Journal of the Linnean Society v. 141, p. 399, 2003.
BADRIE, N.; SCHAUSS, A. G. Soursop (Annona muricata L.): composition, nutritional value, medicinal uses, and toxicology. In: Ronald Ross Watson and Victor R. Preedy, editors, Bioactive Foods in Promoting Health. Oxford: Academic Press, p. 621-643, 2009.
BARBOSA, M. G. V. et al. Fauna de flebotomíneos (Diptera: Psychodidae) em um foco de leishmaniose tegumentar americana na área periurbana de Manaus, Estado do Amazonas. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v. 41, n. 5, p. 485-491, 2008.
BARRAL, A.; COSTA; J. M. L.; BITTENCOURT, A. L.; BARRAL-NETO, M.; CARVALHO, E. M. Polar and subpolar diffuse cutaneous leishmaniasis in Brazil: clinical and immunopathologic aspects. International Journal of Dermatology, v. 34, n. 7, p. 474-479, 1995.
BEAUV, P.; LEBOEUF, M.; CAVÉ, A. Alcaloídes des Annonacées XXVIII: Alcaloídes de l'Uvaria chamae. Medical Phytotherapy, v. 14, p. 143, 1980.
BENNION, B.; DASGUPTA, S.; L. HOGAN, E. e B. LEVERY, S. Characterization of novel myelin components 3-O-acetyl-sphingosine galactosylceramides by electrospray ionization Q-TOF MS and MS/CID-MS of Li+ adducts. Journal of Mass Spectrometry, v. 42, p. 598, 2007.
BENEVAL, E. B. et al. Estudo etnofarmacológico comparativo na região do Araripe da Annona muricata L. (Graviola). Revista Cubana de Plantas Medicinales, v. 21, n. 1, p. 9-19, 2016.
BERMEJO, A. et al. Acetogenins from Annonaceae: recent progress in isolation, synthesis and mechanisms of action. Natural Product Reports, v. 22, p. 269-303, 2005.
BIMAKRA, M. et al. Comparison of different extraction methods for the extraction of major bioactive flavonoid compounds from spearmint (Mentha spicata L.) leaves. Food and Bioproducts Processing, v. 89, p. 67-72, 2011.
BINDU, T. K. Phytochemical investigation of a few plants. Thesis. Department of Chemistry, University of Calicut, 1998.
BLANCHE, G. R. et al. Separation and potential valorization of chemical constituents of soursop seeds. Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, v. 4, n. 2, p. 161-171, 2015.
107
BLANK, A. F. et al. Influence of season, harvest time and drying on Java citronella (Cymbopogon winterianus Jowitt) volatile oil. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 17, p. 557-564, 2007.
BONNEAU, N.; CYNOBER, T.; JULLIAN, J.-C.; CHAMPY, P. 1H qNMR Quantification of annonaceous acetogenins in crude extracts of Annona muricata L. fruit pulp. Phytochemical Analysis, 2017, DOI 10.1002/pca.2668.
BRANCO, P. C. et al. Characterization of Annona cherimola Mill. seed oil from Madeira island: a possible biodiesel feedstock. Journal of the American Oil Chemist Society, v. 87, n. 4, p. 429-436, 2010.
BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Farmacopeia Brasileira. 4. ed. São Paulo: Atheneu, 1998.
_____. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Manual de Vigilância da Leishmaniose Tegumentar Americana. 2.ed. Brasília: Ministério da Saúde, 2007.
_____. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento de Vigilância Epidemiológica. Guia de vigilância epidemiológica. 7. ed. Brasília: Ministério da Saúde, 2009.
_____. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Farmacopeia Brasileira. 5. Ed. Brasília: Anvisa, 2010. 546p.
_____. Ministério da Saúde. Guia de Vigilância em saúde. Departamento de Vigilância em Saúde. Departamento de Vigilância Epidemiológica. Ministério da Saúde. 812p. Brasília, 2014.
BRITO, E. F. Bioatividade de extratos de anonáceas e piperáceas sobre Tuta absoluta (Meyrick) (Lepdoptera: Gelechiidae) em tomateiro. 2014. 92 f. Tese (Doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agronômicas, Botucatu - SP, 2014.
BURDICK & JACKSON. Solvent Guide, 3rd ed. Burdick & Jackson Laboratories, Muske-gon, MI, 1990. CAETANO, R. S.; SOUZA, A. C. R.; FEITOZA, L. F. O uso de plantas medicinais utilizadas por frequentadores dos ambulatórios Santa Marcelina, Porto Velho – RO. Revista Saúde e Pesquisa, v. 7, n. 1, p. 55-63, 2014.
CDC. Centers for Disease Control and Prevention. Leishmaniasis. Disponível em: <http://www.cdc.gov/ncidod/dpd/parasites/leishmania/>. Acesso em 03 mar. 2016.
CHAMPY, P.; HÖGLINGER, G.U.; FEGER, J.; GLEYE, C.; HOCQUEMILLER, R.; LAURENS, A.; GUERINEAU, V.; LAPREVOTE, O.; MEDJA, F.; LOMBES, A.; MICHEL, P. P.; LANNUZEL, A.; HIRSCH, E. C.; RUBERG, M. Annonacin, a lipophilic inhibitor of mitochondrial complex I, induces nigral and striatal neurodegeneration in
108
rats: possible relevance for atypical parkinsonism in Guadeloupe. Journal of Neurochemistry, v. 88, p. 63, 2004.
CHENG, K. F.; LEUNG, K. S.; LEUNG, P. C. Interactions between modern and Chinese medicinal drugs: a general review. The American Journal of Chinese Medicine, v. 2, n. 31, p. 163-169, 2003.
COLLIN, N. et al. Sand fly salivary proteins induce strong cellular immunity in a natural reservoir of visceral leishmaniasis with adverse consequences for Leishmania. PLoS Pathogens, v. 5, n. 5, p. 1-11, 2009.
CONSOLACION Y. R.; RICHARD F. G.; CHIEN-CHANG S. Chemical constituents of Annona muricata. Der Pharma Chemica, v. 6, n. 6, p. 382-387, 2014.
CORIA-TÉLLEZ, A. V.; MONTALVO-GONZÁLEZ, E.; YAHIA, E. M.; OBLEDO-VÁZQUEZ, E. N. Annona muricata: a comprehensive review on its traditional medicinal uses, phytochemicals, pharmacological activities, mechanisms of action and toxicity. Arabian Journal of Chemistry, 2016.
CRAGG, G. M.; NEWMAN, D. J. Natural products: a continuing source of novel lead drugs. Biochimica et Biophysica Acta – General Subjects, v. 1830, n. 6, p. 3670-3695, 2013.
DAIGNEAULT, M. et al. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and Monocyte-Derived Macrophages. PLoS ONE, v. 5, n. 1, p. 1-10, 2010.
DANUTA, G.; REYNALD, H.; ANDRE, C. Qualitative and quantitative evaluation of annonaceous acetogenins by high performance liquid chromatography. Phytochemical Analysis, v. 5, p. 133-140, 1994.
DAVID, J. N.; GORDON, M. C. Natural Products as Sources of New Drugs from 1981 to 2014. Journal of Natural Products, v. 79, p. 629-661, 2016.
DE SOUZA, R. et al. Enhanced extraction yields and mobile phase separations by solvent mixtures for the analysis of metabolites in Annona muricata L. Leaves. Journal of Separation Science, v. 32, p. 4176–4185, 2009.
DENIZOT, F.; LANG, R. Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability. Journal of Immunology Methods, v. 89, n. 2, p. 271-277, 1986.
ESPOSTI, M. D. et al. Natural substances (acetogenins) from the family Annonaceae are powerful inhibitors of mitochondrial NADH dehydrogenase (Complex I). Biochemistry Journal, v. 301, p. 161–167, 1994.
FALKENBERG, M. B.; SANTOS, R. I.; SIMÕES, C. M. O. Introdução à análise fitoquímica. In: Simões, C. M. O.; Schenkel, E. P.; Gosmann, G.; Mello, J. C. P.; Mentz, L. A.; Petrovick, P. R. (Org.). Farmacognosia: da planta ao medicamento. Floriánopolis: UFRGS/UFSC, 2010. Cap. 7, p. 165-182.
109
FERAS, Q. A.; XIAO-XI, L. e JERRY L. M. Annonaceous Acetogenins: Recent Progress. Journal of Natural Products, v. 62, p. 504-540, 1999.
FITTKAU, E. J. e KLINGE, H. On Biomass and Trophic Structure of the Central Amazonian Rain Forest Ecosystem. Biotropica, vol. 5, n. 1, p. 2-14, 1973.
FONTANA, J. D. et al. Selective polarity and adsorption guided extraction/purification of Annona sp. polar acetogenins and biological assay against agricultural pests. Applied Biochemistry and Biotechnology, vol. 70, n. 1, p. 67-76, 1998.
FORMAGIO, A. S. N; MASETTO, T. E.; BALDIVIA, D. S.; VIEIRA, M. C.; ZÁRATE, N. A. H.; PEREIRA, Z. V. Potencial alelopático de cinco espécies da família Annonaceae. Brazilian Journal of Biosciences, v. 8, n. 4, p. 349-54, 2010.
FRANÇA-COSTA, J.; WANDERLEY, J. L. M.; DEOLINDO, P.; ZARATTINI, J. B.; COSTA, J.; et al. Exposure of phosphatidylserine on Leishmania amazonensis isolates is associated with diffuse cutaneous leishmaniasis and parasite infectivity. PLoS ONE, v. 7, n. 5, p. 1-10, 2012.
GEORGE, V. C.; KUMAR, D. R. N.; RAJKUMAR, V.; SURESH, P. K.; KUMAR, R. A. Quantitative assessment of the relative antineoplastic potential of the n-butanolic leaf extract of Annona muricata Linn. in normal and immortalized human cell lines. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention, v. 13, n. 2, p. 699-704, 2012.
GLEYE, C.; LAURENS, A.; HOCQUEMILLER, R.; LAPRÉVOTE, O.; SERANI, L. e CAVÉ, A. Cohibins A and B, acetogenins from roots of Annona muricata. Phytochemistry, v. 44, n. 8, p. 1541-1545, 1997.
GLEYE, C.; DURET, P.; LAURENS, A.; HOCQUEMILLER, R. e CAVÉ, A. cis-Monotetrahydrofuran acetogenins from the roots of Annona muricata. Journal of Natural Products, v. 61, p. 576-579, 1998.
GLEYE, C.; RAFIDIARISON, N.; DURET, P.; LAURENS, A. e HOCQUEMILLER, R. Robustocin, a new acetogenin from the seeds of Annona muricata. Natural Products Letters, v. 14, n. 4, p. 239-245, 2000.
GLEYE, C.; AKENDENGUE, B.; LAURENS, A. e HOCQUEMILLER, R. Coronin from roots of Annona muricata, a putative intermediate in acetogenin biosynthesis (1). Planta Medica, v. 67, p. 570-572, 2001.
GOMATHI, D. et al. GC-MS analysis of bioactive compounds from the whole plant ethanolic extract of Evolvulus alsinoides (L.) L. Journal of Food Science Technology, v. 52, n. 2, p. 1212-7, 2015.
GOSSAGE, S. M.; ROGERS, M. E.; BATES, P. A. Two separate growth phases during the development of Leishmania in sand flies: implications for understanding the life cycle. International Journal for Parasitology, New York, v. 33, n. 10, p.1027-1034, Sept. 2003.
110
GRAMICCIA, M.; GRADONI, L. The current status of zoonotic leishmaniases and approaches to disease control. International Journal for Parasitology, v. 35, n. 11-12, p. 1169-1180, 2005.
GROMEK, D.; HOCQUEMILLER, R.; CAVÉ, A. Qualitative and quantitative evaluation of annonaceous acetogenins by high performance liquid chromatography. Phytochemical Analysis, v. 5, p. 133-140, 1994.
GU, Z.-M.; FANG, X.-P.; ZEOG, L. E MCLAUGHLIN, J. L. Goniocin from Goniothalamus giganteus: the first tri-THF Annonaceous acetogenin. Tetrahedron Letters, v. 35, n. 30, p. 5367-5368, 1994.
GU, Z-M. et al. Annonaceous acetogenins - potent mitocrondrial inhibitors with diverse applications. Phytochemistry of Medicinal Plants, v. 29, p. 249-310, 1995.
GU, Z-M.; ZHOU, D.; WU, J.; SHI, G.; ZENG, L. e MCLAUGHLIN, J. L. Screening for annonaceous acetogenins in bioactive plant extracts by liquid chromatography/mass spectrometry. Journal of Natural Products, v. 60, p. 242-248, 1997.
HAIJUN, Y. et al. HPLC Method for the Simultaneous Determination of Ten Annonaceous Acetogenins after Supercritical Fluid CO2 Extraction. International Journal of Biomedical Science, vol. 6, n. 3, p. 202-207, 2010.
HARBORNE, J. B. Plant Chemosystematics. London: Academic Press, 1984.
HUSSAIN, H. et al. Fruitful decade for antileishmanial compounds from 2002 to late 2011. Chemical Reviews, v. 114, p. 10369-10428, 2014.
KIM, G.-T.; TRAN, N. K. S.; CHOI, E.-H.; SONG, Y.-J.; SONG, J.-H.; SHIM, S.-M.; PARK, T.-S. Immunomodulatory efficacy of standardized Annona muricata (graviola) leaf extract via activation of mitogen-activated protein kinase pathways in RAW 264.7 macrophages. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, v. 2016, p. 1-10, 2016.
KIMBONGUILA, A.; NZIKOU, J. M.; MATOS, L.; LOUMOUAMOU, B.; NDANGUI, C. B.; PAMBOU-TOBI, N.P.G.; ABENA, A. A.; SILOU, TH.; SCHER, J. E DESOBRY, S. Proximate composition and physicochemical properties on the seeds and oil of Annona muricata grown in congo-brazzaville. Research Journal of Environmental and Earth Sciences, v. 2, n. 1, p. 13-18, 2010.
KOJIMA, N.; FUSHIMI, T.; TATSUKAWA, T.; YOSHIMITSU, T.; TANAKA, T.; YAMORI, T.; DAN, S.; IWASAKI, H.; YAMASHITA, M. Structure–activity relationships of hybrid annonaceous acetogenins: powerful growth inhibitory effects of their connecting groups between heterocycle and hydrophobic carbon chain bearing THF ring on human cancer cell lines. European Journal of Medicinal Chemistry, v. 63, p. 833-839, 2013. KRISHNAN, P.; KRUGER, N. J.; RATCLIFFE, R. G. Metabolite fingerprinting and profiling in plants using NMR. Journal of Experimental Botany, v. 56, p. 255-265, 2005.
111
LAINSON, R.; SHAW, J. J. Evolution, classification and geographical distribution. In: PETERS, W.; KILLICK-KENDRICK, R. (Eds.). The leishmaniasis in biology and medicine, v.1. London: Academic Press, 1987, p. 1-120.
LALA, H. R. R. et al. Efficacy of seed extracts of Annona squamosa and Annona muricata (Annonaceae) for the control of Aedes albopictus and Culex quinquefasciatus (Culicidae). Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, v. 4, n. 10, p. 798-806, 2014.
LAPREVOTE, O.; DAS, B. C. Structural elucidation of acetogenins from Annonaceae by fast atom bombardment mass spectrometry. Tetrahedron, v. 50, p. 8479-8490, 1994.
LAROZE, L. E. et al. Extraction of antioxidants from several berries pressing wastes using conventional and supercritical solvents. European Food Research and Technology, v. 231, p. 669-677, 2010.
LAUVE, R. T. Y. et al. Extracts from Annona Muricata L. and Annona Reticulata L. (Annonaceae) Potently and Selectively Inhibit Plasmodium Falciparum. Medicines, v. 2, p. 55-66, 2015.
LEBOEUF, M.; LEGUEUT, C.; CAVÉ, A.; DESCONCLOIS, J. F.; FORGACS, P.; JACQUEMIN, H. Alcaloïdes des Annonacées XXIX: Alcaloïdes de l'Annona muricata L. Planta Medica, v. 42, n. 5, p. 37-44, 1981.
LE GRANDIC, S. R.; FOURNEAU, C.; LAURENS, A.; BORIES, C.; HOCQUEMILLER, R.; LOISEAU, P.M. In vitro antileishmanial activity of acetogenins from Annonaceae. Biomedicine & Pharmacotherapy, v. 58, n. 6–7, p. 388-392, 2004.
LIAW, C-C. et al. Historic perspectives on annonaceous acetogenins from the chemical bench to preclinical trials. Planta Medica, v. 76, p. 1390-1404, 2010.
LOPES, A. H. et al. Trypanosomatids: odd organisms, devastating diseases. The Open Parasitology Journal, v. 4, n. 1, p. 30-59, 2010.
MACHADO, A. R. T.; LAGE, G. A.; MEDEIROS, F. S.; SOUZA-FILHO, J. S.; PIMENTA, L. P. S. Total α-β-unsaturated-γ-lactone acetogenins in Annona muricata by proton NMR spectroscopy. Applied Magnetic Resonance, v. 46, n. 2, p. 153-160, 2015.
MAHAVEER, B.; MELWANKI, F. Partitioned dispersive liquid–liquid microextraction: An approach for polar organic compounds extraction from aqueous samples. Journal of Chromatography A, v. 1207, n 1–2, p. 24-28, 2008.
MCCALL, L. I.; ZHANG, W. W.; MATLASHEWSKI. Determinants for the development of visceral leishmaniasis disease. PLoS Pathogens, v. 9, n. 1, p. 1-7, 2013.
MCLAUGHLIN, J. L. Paw paw and cancer: Annonaceous acetogenins from discovery to commercial products. Journal of Natural Products, v. 71, p. 1311-1321, 2008.
112
MICHELETTI, A. C.; BEATRIZ, A. Progressos recentes na pesquisa de compostos orgânicos com potencial atividade leishmanicida. Revista Virtual de Química, v. 4, p. 268-286, 2012.
MISHRA, S. et al. Annona muricata (the cancer killer): a review. Global Journal of Pharmacology Research, v. 2, p. 1613–1618, 2013.
MOCO, S.; VERVOORT, J.; BINO, R. J.; DE VOS, R. C. H. Metabolomics technologies and metabolite identification. Trends in Analytical Chemistry, v. 26, n. 9, p. 855-866, 2007.
MOGHADAMTOUSI, S. Z. et al. Annona muricata (Annonaceae): a review of its traditional uses, isolated acetogenins and biological activities. International Journal of Molecular Science, v. 16, p. 15625-15658, 2015.
MOHAPATRA, S. Drug resistance in leishmaniasis: Newer developments. Tropical Parasitology, v. 4, n. 1, p. 1-9, 2014.
MOLINA, I. et al. Efficacy of liposomal amphotericin B for secondary prophylaxis of visceral leishmaniasis in HIV-infected patients. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, v. 60, n. 4, p. 837-842, 2007.
MORRÉ, D. J.; CABO, R.; FARLEY, C.; OBERLIES, N. H.; MCLAUGHLIN, J. L. Mode of action of bullatacin, a potent antitumor acetogenin: inhibition of NADH oxidase activity of HELA and HL-60, but not liver, plasma membranes. Life Sciences, v. 56, n. 5, p. 343-348, 1994.
MOSCA, J. L.; CAVALCANTE, C. E. B.; DANTAS, T. M. Características Botânicas das Principais Anonáceas e Aspectos Fisiológicos de Maturação. Fortaleza: Embrapa Agroindústria Tropical, 2006. (EMBRAPA -Documentos, n. 106).
MOTA, E. F.; ROSARIO, D. M.; VEIGA, A. S. S.; BRASIL, D. S. B.; SILVEIRA, F. T.; DOLABELA, M. F. Biological activities of Croton palanostigma Klotzsch. Pharmacognosy, v. 11, n. 43, p. 601-606, 2015.
MUKHERJEE, D. et al. Induction of apoptosis by zerumbone isolated from Zingiber zerumbet (L.) Smith in protozoan parasite Leishmania donovani due to oxidative stress. Brazilian Journal of Infectious Diseases, v. 20, n. 1, p. 48-55, 2016.
MULIA, K. et al. Practical isolation of bullatacin from Annona muricata leaves extract using an open column chromatography technique. Advanced Materials Research, v. 789, p. 545-550, 2013.
MULIA, K. et al. Selective polarity-guided extraction and purification of acetogenins in Annona muricata L. leaves. International Journal of Technology, v. 6, n. 7, p. 1221-1227, 2015.
NAGESWARA, R. R.; NAGARAJU, V. An overview of the recent trends in development of HPLC methods for determination of impurities in drugs. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, v. 33, n. 3, p. 335-377, 2003.
113
NATURAL RESOURCES CONSERVATION SERVICE (NRCS). Plants profile: Annona squamosa L. United States Department of Agriculture. 2008: 4-17.
NEAL, R. A.; CROFT, S. L. An in-vitro system for determining the activity of compounds against the intracellular amastigote form of Leishmania donovani. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, v. 14, n. 1, p. 463-475, 1984.
NEVES, D. P.; MELO, A. L.; LINARDI, P. M.; VITOR, R. W. A. (Ed.) Parasitologia humana. 13. ed. São Paulo: Atheneu, 2016. 264p.
NEWMAN, D. J.; CRAGG, G. M. Natural products as sources of new drugs over the 30 years from 1981 to 2010. Journal of Natural Products, v. 75, p. 311–338, 2012.
NEWMAN, D. J.; CRAGG, G. Natural products as sources of new drugs from 1981 to 2014. Journal of Natural Products, v. 79, n. 3, p. 629–661, 2016.
NGURE, P. K. et al. In vitro antileishmanial activity of extracts of Warburgia ugandensis (Canellaceae), a Kenyan medicinal plant. Journal of Medicinal Plants Research, v. 3, n. 2, p. 61-66, 2009.
NIANGUANG, L. et al. Recent progress on the total synthesis of acetogenins from Annonaceae. Journal of Organic Chemistry, v. 48, n. 4, 2008.
OBERLIES, N. H.; CHANG, C.-J.; MCLAUGHLIN, J. L. Structure−activity relationships of diverse annonaceous acetogenins against multidrug resistant human mammary adenocarcinoma (MCF-7/Adr) cells. Journal of Medicinal Chemistry, , v. 40, n. 13, p. 2102–2106, 1997. OKPEKON, T.; YOLOU, S.; GLEYE, C.; ROBLOT, F.; LOISEAU, P.; BORIES, C.; GRELLIER, P.; FRAPPIER, F.; LAURENS, A.; HOCQUEMILLER, R. Antiparasitic activities of medicinal plants used in Ivory Coast. Journal of Ethnopharmacology, v. 90, p. 91-97, 2004.
OLIVEIRA, A. B.; et al. Plant derived antimalarial agents: new leads and efficient phythomedicines. Part I: Alkaloids. Anais da Academia Brasileira de Ciencias, v. 81, n. 4, p. 715-740, 2009.
ONIMAWO, I.A. Proximate composition and selected physicochemical properties of the seed, pulp and oil of soursop (Annona muricata). Plant Foods for Human Nutrition, v. 57, n. 2, p 165–171, 2002.
OSORIO, E. et al. Antiprotozoal and cytotoxic activities in vitro of Colombian Annonaceae. Journal of Ethnopharmacology, v. 111, p. 630-635, 2007.
PAGÉ, C.; PAGÉ, M.; NOEL, C. A new fluorimetric assay for cytotoxicity measurements in vitro. International Journal of Oncology, v. 3, p. 473-476, 1993.
PAVLI, A.; MALTEZOU, H.C. Leishmaniasis, an emerging infection in travelers. International Journal of Infectious Diseases, v. 14, n. 12, p. 1032-1039, 2010.
114
QIN, L.; CHRISTINE, L. C.; GREG, E. C. Ultraviolet absorbance detection of colchicine and related alkaloids on a capillary electrophoresis microchip. Analytica Chimica Acta, v. 572, n. 2, p. 205-211, 2006.
RANISAHARIVONY, B. G. et al. Separation and potential valorization of chemical constituents of soursop seeds. Journal of Pharmacology and Phytochemistry, v. 4, n. 2, p. 161-171, 2015.
RATH, S. et al. Antimoniais empregados no tratamento da leishmaniose: estado da arte. Química Nova, v. 26, n. 4, p. 550-555, 2003.
REITHINGER, R.; AADIL, K.; KOLACZINSKI, J.; MOHSEN, M.; HAMI, S. Social impact of leishmaniasis, Afghanistan. Emerging Infectious Diseases, v. 11, n. 4, p. 634–636, 2005.
RICHARDSON, J. E. et al: in Flowering Plants of the Neotropics, edited by N. Smith, S.A. Mori, A. Henderson, D.W. Stevenson, and S.V. Healdet (Princeton University Press, Princeton, NJ, 2004).
ROCHA, L. G. et al. A review of natural products with antileishmanial activity. Phytomedicine, v. 12, n. 6-7, p. 514-535, 2005.
SAWAYA, A. C. H. F.; TOMAZELA, D. M.; CUNHA, I. B. S.; BANKOVA, V. S.; MARCUCCI, M. C.; CUSTODIO, A. R.; et al. Electrospray ionization mass spectrometry fingerprinting of propolis. Analyst, v. 129, n. 8, p. 739–744, 2004
SHARMA, U.; SINGH, S. Insect vectors of Leishmania: distribution, physiology and their control. Journal of Vector Borne Diseases, v. 45, n. 4, p. 255-272, 2008.
SHI, G.; ALFONSO, D.; FATOPE, M. O.; ZENG, L; GU, Z.-M.; ZHAO, G.-X.; HE, K.; MACDOUGAL, J. M. e MCLAUGHLIN, J. L. Mucocin: a new annonaceous acetogenin bearing a tetrahydropyran ring. Journal of American Chemical Society, v. 117, p. 10409-10410, 1995.
SHIMADA, H.; GRUTZNER, J. B.; KOZLOWSKI, J. F.; MCLAUGHLIN, J. L. Membrane conformations and their relation to cytotoxicity of asimicin and its analogues. Biochemistry, v. 37, p. 854-866, 1998.
SHIMADA, H.; KOZLOWSKI, J. F.; MCLAUGHLIN, J. L. The localisations in liposomal membranes of the tetrahydrofuran ring moieties of the annonaceous acetogenins, annonacin and sylvaticin, as determined by 1H NMR spectroscopy. Pharmacological Research, v. 37, n. 5, p. 357-364, 1998.
SHITAN, N. Secondary metabolites in plants: transport and self-tolerance
mechanisms. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, v. 80, n. 7, p. 1283-
1293, 2016.
SILVA, J. V. S. Estudo farmacognóstico, fitoquímico e atividade leishmanicida de duas espécies de Geisoospermum (Apocynaceae). 2016. 114 f. Dissertação
115
(Mestrado em Ciências Farmacêuticas) - Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal do Pará, Belém, 2016.
SILVA, M. A. L. Desenvolvimento de sistemas baseados em Nested-PCR convencional e em único tubo para o diagnóstico de leishmaniose visceral. 2012. 99 f. Tese (Doutorado em Saúde Pública) - Centro de Pesquisas Ageu Magalhães, Fundação Oswaldo Cruz, Recife, 2012.
SILVEIRA, F. T.; LAINSON, R.; CORBETT, C. E. P. Clinical and immunopathological spectrum of American cutaneous leishmaniasis with special reference to the disease in Amazonian Brazil: a review. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 99, n. 3, p. 239-251, 2004.
SIMÕES, C. M. O. et al. Farmacognosia da Planta ao Medicamento. 6. ed. Porto Alegre: Ed - UFSC, 2010.
SINGH, N.; KUMAR, M.; SINGH, R. Leishmaniasis: current status of available drugs and new potential drug targets. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine, v. 5, n. 6, p. 485-497, 2012.
SMITH, D. L.; LIU, Y. M.; WOOD, K. V. 1991. Structure elucidation of natural products by mass spectrometry. Recent advances in phytochemistry. (N. H. Fischer; M. B. Isman; T. H. A. Hafford, eds.). Plenum press, New York, volt. 25, p. 251-269.
SOHEIL, Z. M. et al. Annona muricata (Annonaceae): A Review of Its Traditional Uses, Isolated Acetogenins and Biological Activities. International Journal of Molecular Science, v. 16, p. 15625-15658, 2015.
SONIA, C. N. Q.; CAROL, H. C. e ISABEL C. S. F. J. Métodos de extração e/ou concentração de compostos encontrados em fluidos biológicos para posterior determinação cromatográfica. Química Nova, vol. 24, n. 1, p. 68-76, 2001.
SOUZA, E. B. R.; SILVA, R. R.; AFONSO, S.; SCARMINIO, I. S. Enhanced extraction yields and mobile phase separations by solvent mixtures for the analysis of metabolites in Annona muricata L. leaves. Journal of Separation Science, v. 32, n. 23-24, p. 4176-4185, 2009.
STEFANELLO, M. E. A. et al. Composição e variação sazonal do óleo essencial de Myrcia obtecta (O. Berg) Kiaersk. Var. obtecta, Myrtaceae. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 20, n. 1, p. 82-86, 2010.
SUMITRA CHANDA. Importance of pharmacognostic study of medicinal plants: An overview. Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, v. 2, n. 5, p. 69-73, 2014.
SUN, S.; LIU, J.; ZHOU, N.; ZHU, W.; DOU, Q. P.; ZHOU, K. Isolation of three new annonaceous acetogenins from Graviola fruit (Annona muricata) and their anti-proliferation on human prostate cancer cell PC-3. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, v. 26, n. 17, p. 4382-4385, 2016.
116
TAKADA, M. et al. Definition of crucial structural factors of acetogenins, potent inhibitors of mitochondrial complex I. Biochimica et Biophysica Acta, v. 1460, p. 302–310, 2000.
TEMPESTA, M. S.; KRIEK, G. R.; BATES, R. B. Uvaricin, a new antitumor agent from Uvaria accuminata (annonaceae). Journal of Organic Chemistry, v. 47, p. 3151–3153, 1982.
TEMPONE, A. G. et al. Targeting Leishmania (L.) chagasi amastigotes through macrophage scavenger receptors: the use of drugs entrapped in liposomes containing phosphatidylserine. Journal Antimicrobial Chemotherapy, v. 54, n. 1, p. 60-68, 2004.
TORMO, J. R. et al. Specific interactions of monotetrahydrofuranic Annonaceous acetogenins as inhibitors of mitochondrial complex I. Chemico-Biological Interactions, v. 122, p. 171–183, 1999.
TSIMOGIANNIS, D. et al. Characterization of flavonoid subgroups and hydroxy substitution by HPLC-MS/MS. Molecules, v. 12, p. 593–606, 2007.
VILA-NOVA, N. S. et al. Leishmanicidal activity and cytotoxicity of compounds from two Annonacea species cultivated in Northeastern Brazil. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, vol. 44, n. 5, p. 567-571, 2011.
VILA-NOVA, N. S. et al. Different susceptibilities of Leishmania spp. promastigotes to the Annona muricata acetogenins annonacinone and corossolone, and the Platymiscium floribundum coumarin scoparone. Experimental Parasitology, vol. 133, p. 334-338, 2013.
_____. et al. Different susceptibilities of Leishmania spp. promastigotes to the Annona muricata acetogenins annonacinone and corossolone, and the Platymiscium floribundum coumarin scoparone. Experimental Parasitology, vol. 133, p. 334-338, 2013.
WENIGER, B.; VONTHRON-SÉNÉCHEAU, C.; KAISER, M.; BRUN, R.; ANTON, R. Comparative antiplasmodial, leishmanicidal and antitrypanosomal activities of several biflavonoids. Phytomedicine, v. 13, p. 176-180, 2006.
WORLD HEALTH ORGANIZATION (WHO). Control of the leishmaniasis: report of a meeting of the WHO Expert Committee on the Control of Leishmaniasis. In: WHO Technical Report Series, Organization, W.H., p. 201. Editora World Health Organization, 2010.
_____. Leishmaniasis - Situation and trends. Disponível em: <http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs375/en/>. Acesso em: 29 abr. 2016.
WU, Z. G.; RODGERS, R. P.; & MARSHALL, A. G. Characterization of vegetable oils: detailed compositional fingerprints derived from electrospray ionization Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 52, n. 17, p. 5322–5328, 2004.
117
YANG, H. J.; LI, X.; TANG, Y.; ZHANG, N.; CHEN, J. W. e CAI, B. C. Supercritical fluid CO2 extraction and simultaneous determination of eight annonaceous acetogenins in Annona genus plant seeds by HPLC-DAD method. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analyses, v. 49, p. 140, 2009.
YANG, H.; ZHANG, N.; LI, X.; CHEN, J.; CAI, B. Structure–activity relationships of diverse annonaceous acetogenins against human tumor cells. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, v. 19, n. 8, p. 2199-2202, 2009.
YANG, H.; ZHANG, N.; ZENG, Q.; YU, Q.; KE, S.; LI, X. HPLC method for the simultaneous determination of ten annonaceous acetogenins after supercritical fluid CO2 extraction. International Journal of Biomedical Science, v. 6, n. 3, p. 202-207, 2010.
YETRI, E. et al. Tablet formulation of the ethyl acetate soluble extract of soursop (Annona Muricata L.) leaves. Asian Journal of Applied Sciences, v. 2, In. 3, 2014.
ZAFRA-POLO, M. C. et al. Natural Acetogenins from Annonaceae, synthesis and mechanisms of action, Phytochemistry, v. 48, p. 1087–1117, 1998.
ZHANG, Z.-S.; LI, D.; WANG, L.-J.; OZKAN, N.; CHEN, X. D.; MAO, Z.-H.; YANG, H.-Z. Optimization of ethanol-water extraction of lignans from flaxseed. Separation and Purification Technology, v. 57, n. 1, p. 17-24, 2007.