UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PÓS GRADUAÇÃO EM NEUROCIÊNCIAS E BIOLOGIA CELULAR

ANÁLISE DE ANEUPLOIDIAS DOS CROMOSSOMOS 17 E 22 E DE DELEÇÕES DO GENE TP53 EM METÁSTASES CEREBRAIS DE MAMA

DOUGLAS SERRA VASCONCELOS

BELÉM 2009

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

ii

DOUGLAS SERRA VASCONCELOS

ANÁLISE DE ANEUPLOIDIAS DOS CROMOSSOMOS 17 E 22 E DE DELEÇÕES DO GENE TP53 EM METÁSTASES CEREBRAIS DE MAMA

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Neurociências e Biologia Celular, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Pará, como requisito para a obtenção do título de Mestre. Área de Concentração: Biologia Celular Orientador: Prof. Dr. Edivaldo H. C. de Oliveira

BELÉM 2009

iii

DOUGLAS SERRA VASCONCELOS

ANÁLISE DE ANEUPLOIDIAS DOS CROMOSSOMOS 17 E 22 E DE DELEÇÕES DO GENE TP53 EM METÁSTASES CEREBRAIS DE MAMA

Dissertação apresentada como requisito para a obtenção do grau de Mestre em

Neurociências e Biologia celular da Universidade Federal do Pará. Área de Concentração: Biologia celular.

Data de aprovação:___/___/___

Banca Examinadora:

_____________________________ - Orientador Prof. Dr. Edivaldo H. C. de Oliveira - UFPA _____________________________ Profa. Dra. Cleusa Y. Nagamachi - UFPA _____________________________ Profa. Dra. Margarida M. C. de Lima - UFPA

_____________________________ Prof. Dr. Nilson Praia Anselmo - UFPA

iv

À Equipe “de Câncer” do Laboratório de Citogenética, pelo apoio e confiança.

v

AGRADECIMENTOS

Agradeço sinceramente ao grupo do laboratório de Citogenética da UFPA,

principalmente ao Prof. Dr. Edivaldo de Oliveira, que teve uma paciência imensa em

orientar esta dissertação e de modo especial ao Fábio da Silva e a Luciana Quintana por

terem dado uma enorme contribuição na elaboração e análise dos resultados. Agradeço

ainda aos Professores Doutores Júlio e Cleusa por terem apoiado a execução deste projeto,

com orientações e comentários importantes. Ao grupo de Neurocirurgia do Hospital Ofir

Loyola, onde este trabalho foi concebido e onde as amostras foram colhidas. Aos pacientes

que aceitaram participar da pesquisa espontaneamente. De modo especial, agradeço ao Dr.

Reginaldo Brito e ao Prof. Dr. Nilson Praia Anselmo,que iniciaram e incentivaram este

importante projeto. Agradeço a minha família, Andréa, Matheus, Caio, Rodrigo, Yan e a

pequena Beatriz, que suportaram as horas que tive que ficar ausente. Descupem! Ciência às

vezes exige isso de nós. Finalmente, agradeço a Deus por ter me dado esta oportunidade.

vi

RESUMO

As metástases de mama representam 10% dos tumores metastáticos para o cérebro. A via de disseminação metastática para o cérebro em geral é hematogênica. Poucos são os trabalhos publicados até o momento que enfatizam o perfil citogenético de metástases de mama. Nesses, os principais rearranjos cromossômicos recorrentes envolvem os cromossomos 17 e 22, sugerindo que essas aneuploidias possam estar relacionadas com um maior poder de metastatização dos tumores primários. Dessa forma, com o objetivo de verificar o comportamento desses dois cromossomos em metástases cerebrais de mama, foram analisadas cinco amostras desse tipo tumoral através da aplicação de FISH interfásico em dois experimentos distintos, com sondas dos cromossomos 17 (centrômero e TP53) e com sondas do 22 (BCR, com a sonda de 9q11 como controle). Os experimentos com o cromossomo 17 demonstraram um número significativo de núcleos com a deleção do gene TP53, além da polissomia do cromossomo 17 como segundo evento mais freqüente. Em relação ao cromossomo 22, o evento mais observado foi a perda de uma de suas cópias. Deleções do TP53 estão relacionadas com um aumento da malignidade tumoral, visto que esse gene está envolvido em várias vias do controle do ciclo celular. Da mesma forma, a polissomia do cromossomo 17 também seria indicativa de um mau prognóstico, já que esse rearranjo apresenta-se relacionado com aumento de expressão da proteína HER-2, fato também associado a um mau prognóstico. Vários estudos relacionam aneuploidias do cromossomo 22, principalmente a monossomia, como um passo importante na gênese de neoplasias, provavelmente devido à inativação de genes supressores de tumor situados nesse cromossomo, como o NF2. Esses indicativos de mau prognóstico concordam com os dados de anamnese das pacientes, que tiveram metástases cerebrais após a ressecção dos tumores primários de mama, e posteriormente apresentaram uma média de aproximadamente 17 meses de sobrevida após a ressecção das metástases cerebrais, com reincidência de metástases múltiplas. Assim, concluímos que a análise do comportamento desses dois cromossomos em tumores de mama poderia ser um dado importante na definição de seu poder de metastatização e malignidade.

vii

ABSTRACT

Breast cancer metastases represent 10% of metastatic tumors in brain. The metastatic dissemination to the brain is in general hematogenic. Few reports concerning the cytogenetic profile of breast metastases have been published so far. In these, the main recurrent chromosomal rearrangements involve pairs 17 and 22, suggesting that primary tumors with these aneuploidies could present a higher metastatic risk. Hence, the aim of this report was the verification of the behavior of chromosomes 17 and 22 in five samples of breast metastases in brain, applying interphasic FISH in two distinct experiments, using probes of chromosome 17 (centromere and TP53) in one of them, and a probe of chromosome 22 (BCR, and 9q11 as a control) in the other experiment. Chromosome 17 probes showed a highly significative proportion of nuclei with deletion of one or both copies of gene TP53, and the polysomy of 17 as the second event more frequently observed. In relation to chromosome 22, the most observed event was the loss of one of the copies. TP53 deletion is related to an increase of the malignancy of tumors, because this gene is involved in several paths of control of cell cycle. In the same way, polysomy of chromosome 17 is also an indicative of a poor prognosis, because it causes a super-expression of protein HER-2, which is also related to poor prognosis. Several reports related aneuploidy of chromosome 22, especially monossomy, as an important step in the genesis of neoplasies, probably caused by the inactivation of tumor suppressor genes situated in this chromosome, such as NF2. These indicators of poor prognosis agreed with the anamnesis of the patients, with brain metastases after resection of breast primary tumor, and a survival-rate of approximately 17 months after resection of brain metastases, with recurrent multiple metastases afterwards. Hence, we conclude that the analysis of the behavior of these two chromosomes in breast primary tumors could be used as an important indicator of their metastatic power and malignancy.

viii

LISTA DE ABREVIATURAS

APC gene Adenomatosis Polyposis Coli BRCA1 gene Breast Cancer 1, early onset C-erbB2 gene Erythroblastic Leukemia Viral Oncogene Homolog 2 CT Tomografia Computadorizada DNA Ácido Desoxirribonucleico (Desoxiribonucleic Acid) DPC4 Membro 4 da família de genes SMAD FISH Hibridização in situ fluorescente (Fluorescence in situ Hybridization) GST Gene Supressor de Tumor HER2/NEU gene Receptor de Fator de Crescimento Epidermal Humano 2 L-myc gene v-Myc Myelocytomatosis Viral Oncogene Homolog 1 NF2 gene neurofibromina 2 (merlin) P16 gene inibidor da cinase ciclina-dependente 2A RB gene Retinoblastoma RNA Ácido Ribonucleico (Ribonucleic Acid) RM Ressonância Magnética SNC Sistema Nervoso Central TP53 gene da protein tumoral p53 WT1 gene tumor de Wilms 1

ix

SUMÁRIO

I INTRODUÇÃO 1

1 ASPECTOS GERAIS: CÂNCER E CÂNCER DE MAMA 1

2 METÁSTASES CEREBRAIS 2

3 METÁSTASES DE MAMA NO CÉREBRO 6

4 TRATAMENTO DAS METASTASES CEREBRAIS 7

5 ASPECTOS GENÉTICOS DO CÂNCER 8

5.1 Instabilidade Genômica 8

5.2 Oncogenes e Genes Supressores Tumorais 10

6 CITOGENÉTICA E CÂNCER 12

6.1 Considerações Gerais 12

6.2 Relação entre Rearranjos Cromossômicos e Genes Supressores Tumorais e

Proto-oncogenes

15

6.3 Dados Citogenéticos de Tumores de Mama 16

6.4 Aneuploidias em Metástases de Mama 17

7 OBJETIVOS 20

7.1 Objetivo Geral 20

7.2 Objetivos Específicos 20

II MATERIAL E MÉTODOS 21

1 AMOSTRAS 21

2 COLETA DAS AMOSTRAS 22

3 OBTENÇÃO DE NÚCLEOS INTERFÁSICOS 22

4 PREPARAÇÃO DAS LÂMINAS 23

5 PRÉ-HIBRIDIZAÇÃO 23

6 HIBRIDIZAÇÃO IN SITU 23

6.1 Sondas 23

6.2 Hibridização 24

6.3 Lavagem de Estringência

25

7 ANÁLISE E CAPTURA DAS IMAGENS 25

8 ANAMNESE 25

III RESULTADOS 26

1 EXPERIMENTOS DE HIBRIDIZAÇÃO IN SITU 27

IV DISCUSSÃO 31

1 SOBRE A IMPORTÂNCIA DOS RESULTADOS OBTIDOS A PARTIR

DA APLICAÇÃO DA TÉCNICA DE I-FISH: UMA VISÃO GLOBAL

31

2 OCORRÊNCIA DE ANEUPLOIDIAS DO CROMOSSOMO 17 33

3 DELEÇÕES DO GENE TP53 35

4. ANEUPLOIDIAS DO CROMOSSOMO 22 37

x

5 VALOR PROGNÓSTICO DOS RESULTADOS OBTIDOS 38

V CONCLUSÕES 41

VI REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 42

ANEXO I 51

ANEXO II 52

ANEXO III 54

ANEXO IV 55

1

I. INTRODUÇÃO

1. ASPECTOS GERAIS: CÂNCER E CÂNCER DE MAMA.

O termo câncer refere-se a uma variedade de patologias nas quais

crescimento e proliferação celular estão desregulados, levando à formação de uma

massa tumoral capaz de invadir, destruir tecidos vizinhos e disseminar-se para outros

órgãos do corpo por metástases. Embora fatores ambientais e dietéticos contribuam

para sua gênese, o câncer resulta de mudanças genéticas múltiplas em uma população

de células, as quais o tornam a doença genética mais freqüente (BORGES-OSÓRIO &

ROBSON, 2001; SNUSTAD & SIMMONS, 2001; NUSSBAUM et al., 2002).

Segundo a Organização Mundial de Saúde (WHO) ( KLEIHUES et al., 2002), mais de

11 milhões de pessoas são diagnosticadas com câncer todos os anos, sendo esta doença

responsável por 12,5% das mortes anuais no mundo. Estima-se que no Brasil mais de

120.000 pessoas morreram desta doença em 2002 (INCA, 2002). Considerando que o

total de tumores passíveis de prevenção pode alcançar mais de 50% de todos os casos

em países desenvolvidos e reconhecendo a importância da citogenética e da biologia

molecular no diagnóstico e prognóstico de pacientes com câncer, vários estudos dessa

natureza têm sido realizados visando a prevenção, detecção precoce e tratamento

dessas doenças malignas (CAI et al., 2001, DIAZ jr, 2005).

No caso das mulheres, o câncer de mama é a doença maligna mais comum e

a segunda causa de morte, atrás apenas do câncer de pulmão em mortes femininas nos

Estados Unidos (QIN, 2002). Estimou-se que aproximadamente 178.480 mulheres

foram diagnosticadas com câncer invasivo de mama em 2007, representando 12,67% da

população feminina americana e 26% de todos os casos de câncer nos Estados Unidos

(CHENG & HUNG, 2007).

2

Hitologicamente os carcinomas de mama podem ser divididos em ductal

(89%), lobular (5%), e forma combinada (6%), dependendo de seu sítio no tecido

mamário. Tanto o ductal como o lobular podem ser total ou parcialmente contidos na

membrana basal, nestes casos são denominados “in situ” e suas chances de cura

chegam a 100% somente com terapia local. (MARTINS, 2007).

Como em outras formas de carcinomas, o câncer de mama é caracterizado

pela instabilidade genômica, frequentemente envolvendo casos de aneuploidia dos

cromossomos 8, 17, 19, 20 e 22. Foram observadas também perdas gênicas, como a do

TP53 no braço curto do cromossomo 17, entre as alterações mais comumente vistas

(PROSSER et al., 1991; HEIM & MITELMAN, 1995; PANDIS et al., 1998;

LARRAMENDY et al., 2000; WATTERS et al., 2003). Além disso, PANDIS et al.

(1998) sugeriram que perdas dos cromossomos 17 e 22 em casos de câncer de mama

estão associados a uma maior predisposição a metástase.

2. METÁSTASES CEREBRAIS.

Conceitualmente, metástase representa um implante neoplásico sem

continuidade com o tumor primitivo. Todo o processo metastático, desde o

desprendimento do estroma celular do órgão primariamente afetado, passagem pela

membrana basal do endotélio, transporte na corrente sanguínea, passagem pela

membrana endotelial do órgão alvo e colonização da nova área é complexo (REY,

1999). Devido à progressiva incapacidade neurológica causada pelas metástases

cerebrais e a falta de tratamento efetivo como nas metástases viscerais e ósseas, esta

doença ainda representa um grande desafio a ser vencido (CHENG & HUNG, 2007).

A incidência crescente de metástases para o cérebro se deve a vários fatores.

Um deles é o aumento da sobrevida de pacientes com câncer sistêmico, em

3

conseqüência da melhora das estratégias de seu tratamento clínico e ou cirúrgicos.

Outro fator importante é a maior capacidade de diagnóstico de tumores do SNC, devido

à disponibilidade de tomografia computadorizada (CT) e ressonância magnética (RM)

(QUEIROZ & TÉDDE, 2007). Além disso, muitos agentes quimioterápicos não

atravessam a barreira hemoencefálica, oferecendo um verdadeiro “santuário” para o

desenvolvimento de metástases, ainda porque alguns destes agentes quimioterápicos

podem “enfraquecer” esta barreira e facilitar a disseminação de metástases para o SNC

(BREM & PANATTIL, 2005).

As metástases cerebrais são de um modo geral os tumores mais comumente

vistos clinicamente, compreendendo um pouco mais de 50% de todos os tumores

cerebrais (GRENBERG, 2005). As metástases intracranianas podem envolver o

parênquima cerebral, os nervos cranianos, vasos sanguíneos cerebrais, seios durais, a

duramater, as leptomeninges e a tábua craniana (ADAM, 2005). Nos Estados Unidos a

incidência anual de novos casos de metástases cerebrais é maior que 100.000,

comparando com apenas 17.000 tumores primários do cérebro (MAMELACK et al.

2005). Entre 15%-30% dos pacientes com câncer desenvolvem metástases cerebrais

(INCA, 2005). Em 15% dos pacientes sem histórias de câncer, uma metástase cerebral é

a primeira manifestação clínica (MAMELACK et al., 2005). Em 9% dos casos, uma

metástase é o único local detectável de disseminação. As metástases ocorrem em apenas

6% dos casos pediátricos (YUMANS, 2004), sendo o tumor de Wilms e os

osteosarcomas os mais freqüentes nesta faixa etária (GRENBERG, 2005).

Em tese, todos os tipos de tumores malignos podem originar metástases,

entretanto apenas alguns tipos o fazem mais freqüentemente, a saber: câncer de pulmão

44%, mama 10%, rim 7%, tubo gastrointestinal 6%, melanoma 3% e fonte incerta 10%.

4

Os tumores de pulmão e mama juntos somam mais de 50% das metástases

(YUOMANS, 2003; SILLS, 2005)

Quanto à localização das metástases cerebrais elas podem ser

parenquimatosas em 75% dos casos e meníngea no restante (25%) determinando uma

meningite carcinomatosa. A localização de 80% das metástases solitárias está nos

hemisférios cerebrais. (YOUNG, 2005). A maior incidência de metástases cerebrais é

posterior à fissura silviana, próximo à junção dos lobos temporal, parietal e occipital

(presumivelmente devido à disseminação embólica pelos ramos terminais da artéria

cerebral média, onde o fluxo sanguíneo é maior). Muitas tendem a se localizar entre as

substâncias brancas e cinzentas (MAMELACK et al. 2005). O cerebelo é o local mais

comum de metástases intracranianas e é a localização em 16% dos casos de metástases

solitária (YOUNG, 2005).

Assim como na maioria dos tumores cerebrais, os sinais e sintomas das

metástases tendem a ter um curso de instalação lenta quando comparado com sintomas

típicos de doenças cérebro-vasculares que tendem a ter início súbito e se resolver

lentamente. Ainda podem manifestar fenômenos elétricos como as crises convulsivas de

inicio súbito e resolução rápida. Não há achado clínico que permita a diferenciação de

um tumor metastático de uma neoplasia primária do SNC (BREM & PANATTIL,

2005).

Segundo BRAGA (2002), os sinais e sintomas incluem:

1. Aqueles devido à pressão intracraniana elevada por efeito de massa ou

bloqueio de liquor (hidrocefalia), cefaléia (50%) dos casos, náusea e

vômitos e depressão do nível de consciência;

2. Déficit focal, por compressão do parênquima cerebral e ou a formação de

edema perilesional, ou compressão de nervos cranianos;

5

3. Convulsões que ocorrem em 15% dos casos;

4. Alteração do estado mental - depressão, letargia, apatia e coma;

5. Sintomas sugestivos de fenômenos vasculares AIT (ataque isquêmicos

transitórios, chamados AITs de tumores) ou acidentes vasculares

estabelecidos por oclusões vasculares tumorais, ou hemorragias

intratumorais, como nos melanomas e tumores de células renais;

A avaliação clínica radiológica de tumores metastáticos para o SNC se faz

por estudos envolvendo tomografia computadorizada (CT) e ressonância magnética

(RM) do encéfalo (MAMELACK et al., 2005, McCCHEON, 2005).

As metástases aparecem como massa não complicada à tomografia

(redondas, bem circunscritas), se originando nos limites entre substância branca e

cinzenta, em áreas ditas watershed, fronteiras de territórios vasculares de lobos

diferentes. Caracteristicamente, um edema profundo da substância branca penetra no

cérebro a partir do tumor de forma mais pronunciada que aqueles vistos em tumores

primários (chamados “dedos de edema”). Quando lesões múltiplas estão presentes (na

CT e ou RM) a regra de Chambers se aplica: “quem contar a maior quantidade de

metástase está correto”. As metástases se impregnam por meio de contraste radiológico

e devem ser consideradas sempre no diagnóstico diferencial de uma lesão em anel

(McCCHEON, 2005).

A RM de encéfalo é mais sensível que a CT, especialmente na fossa

posterior, incluindo o tronco cerebral, detectando metástases múltiplas em

aproximadamente 20% das metástases diagnosticadas como únicas na CT. As múltiplas

projeções na RM de encéfalo para metástases são úteis no planejamento cirúrgico

(McCUTHEON 2005, YOUNG ,2005).

6

3. METÁSTASES DE MAMA NO CÉREBRO

A incidência total de metástase cerebral de tumores de mama é cerca de

30% (SWENSEN, 2007). A sobrevida média em cinco anos é de 98.1% em tumores

com invasão local e caem para 26% nos pacientes com metástases para sítios distantes,

sendo pulmão, fígado, ossos e cérebro os órgãos mais freqüentemente afetados.

(EWEND et al. 2005). As metástases de mama representam 10% dos tumores

metastáticos para o cérebro. A via de disseminação metastática para o cérebro em geral

é hematogênica. O processo pelo quais as metástases ocorrem é chamado cascata

metastática e é na verdade o grande processo biológico responsável pelo seu

desenvolvimento (YUOMANS, 2003).

O prognóstico dos pacientes com metástases cerebrais de câncer de mama

no geral é pobre, uma vez que na maioria dos casos o envolvimento pulmonar, hepático

e ósseo já ocorreu no momento de seu diagnóstico. A sobrevida média após o

diagnóstico de metástase cerebral varia de 2 a 16 meses, sendo de 1 ano em apenas 20%

dos casos ( CHENG & HUNG, 2007). Um índice prognóstico para metástases cerebrais,

incluindo a de mama, foi formulado pelo Radiation Terapy Oncology Group (RTOG),

baseados na análise de 1200 casos com uma variedade de tumores sólidos. Pacientes

com idade menor que 65 anos, os quais têm seus tumores primários controlados, sem

outros focos de metástase conhecidos e um índice de Karnofsk maior que 75,

usualmente têm melhores resultados, com média de sobrevida de 7.1 meses. Entretanto

pacientes acima de 65 e com índice de Karnofsk abaixo de 70, têm pior prognóstico

com média de sobrevida de 2.3 meses, em ambos os casos considerando nenhuma forma

de tratamento aplicada. Um fator favorável de sobrevida inclui metástase cerebral única

e longo período de tempo livre da doença primária. Com o controle da doença sistêmica,

a incidência de envolvimento do sistema nervoso central tem aumentado, e a maioria

7

destes pacientes com metástases de mama está morrendo devido à progressão da doença

no cérebro (McDERMOTT, 2005).

4. TRATAMENTO DAS METASTASES CEREBRAIS

Mesmo com tratamento ideal a sobrevida dos pacientes com metástases

cerebrais ainda é de 26 a 32 semanas, portanto, o seu manejo é paliativo (McCCHEON,

2005). Deve-se ter cuidado com a confirmação diagnóstica de tumores cerebrais

metastático, pois em 11% dos pacientes com alterações na CT e ou RM de crânio e com

história de câncer nos últimos cinco anos, podem não ser metástases, sendo fundamental

o diagnóstico diferencial com glioblastoma multiforme, astrocitomas, abscessos e

reações inflamatórias inespecíficas, pois quando se contempla o tratamento não

cirúrgico (radio ou quimioterapia) é fundamental a confirmação por biopsia (EWEND,

2005)

O tratamento das metástases cerebrais de mama inclui: corticosteróide,

radioterapia de cérebro total, ressecção cirúrgica, radiocirurgia e quimioterapia.

(YOUNG & PATCHELL, 2004). Os corticosteróides são usados para aliviar os

sintomas por diminuição do edema em torno da lesão cerebral (SWENSEN & KIRSCH,

2002). A radioterapia de cérebro total é considerada a forma de tratamento de escolha

para metástases cerebrais múltiplas, assim como pacientes com metástases solitárias que

não são qualificados para cirurgia ou radiocirurgia estereotáxica (CHENG & HUNG,

2007). Esta forma de tratamento é capaz de controlar os sintomas neurológicos e

melhorar a qualidade de vida em aproximadamente 75% a 85% dos pacientes, sendo

ainda capaz de prolongar o tempo de sobrevida quando comparada com corticosteróide

somente (YOUNG & PATCHELL, 2004).

8

A ressecção cirúrgica das metástases cerebrais de mama permite o

diagnóstico da doença intracraniana, além disso, pode melhorar os sintomas

neurológicos e melhorar a qualidade de vida por imediata descompressão cerebral por

remoção do efeito de massa do tumor (MAMELACK, 2005). A ressecção cirúrgica

também melhora o período de sobrevida quando comparada com outros modos de

tratamento isolados (SWENSEN & KIRSCH, 2002) Em pacientes com uma única

metástase acessível, bom desempenho de Karnofsk e doença extra-craniana estável, há

uma boa vantagem para o tratamento cirúrgico, principalmente quando combinado com

radioterapia de cérebro total somente. Entretanto a ressecção cirúrgica é considerada

limitada em pacientes com metástases múltiplas, a menos que haja entre elas uma lesão

muito sintomática, causando intenso déficit motor ou redução do nível de consciência

por efeito de massa do tumor (CHENG & HUNG,2007).

Geralmente a quimioterapia não tem sido considerada uma boa estratégia

para o tratamento das metástases do sistema nervoso central, devido à constituição da

barreira hematoencefálica, principalmente pelas Tight-Junction nas células endoteliais e

as junções tipo Gap dos pericitos dos astrócitos: estas estruturas celulares dificultam ou

não permitem a passagem de moléculas com alto peso molecular, típicas dos

quimioterápicos (PEEREBOOM, 2005).

5. ASPECTOS GENÉTICOS DO CÂNCER

5.1 Instabilidade Genômica

No curso da carcinogênese, as células experimentam várias alterações

genéticas (incluindo ganhos e deleções de genes e cromossomos) que estão associadas

com a transição de uma lesão pré-neoplásica a um tumor invasivo e daí sua metástase.

Uma alta freqüência de deleções cromossômicas, relacionadas com perda de

9

heterozigose, é considerada um marco em instabilidade genômica em câncer, hoje alvo

de estudos através de várias ferramentas de citogenética molecular (QIN, 2002).

Instabilidade do genoma tem sido considerada como importante fator na

formação e progressão da neoplasia. A célula deve sofrer uma, ou mais de uma,

alteração no seu genoma, usualmente na forma de mutações nos genes envolvidos no

ciclo celular, o que leva a um relaxamento dos mecanismos de controle do crescimento

e divisão (WARD, 2002). Células nas quais os mecanismos de controle foram alterados

têm maior chance de desenvolver novas anormalidades genéticas, isto é, se tornam

instáveis (BREIVIK, 2005). Quando a célula sofre grandes danos, que sobrepujam a sua

capacidade de reparação, se torna sujeita a sofrer alterações cromossômicas, como

translocações, deleções, amplificações, duplicações ou inversões de genes. Inserções,

deleções, duplicações e inversões geralmente resultam na produção de produtos gênicos

truncados, ou encurtados, enquanto que as trocas de bases alteram a seqüência de

aminoácidos do produto gênico ou também resultam em produto truncado. Mutações

externas à região codificadora podem afetar a transcrição, a tradução e o splicing do

RNA mensageiro e seu processamento. Assim, existe uma relação entre o agente

causador deste dano e o grau de heterogeneidade do clone celular que se desenvolverá,

o que, por sua vez, guarda estreita relação com a capacidade de algumas destas células

adquirirem resistência terapêutica e, portanto, definirem pior prognóstico ao tumor.

Muitos genes supressores tumorais foram identificados a partir da análise de mutações,

como o TP53, APC, DPC4 e o P16, envolvidos no processo carcinogênico em diversos

tecidos (FAGIN, 2002).

10

5.2 Oncogenes e Genes Supressores Tumorais

O tumor progride através do acúmulo de mutações genéticas e epigenéticas

que possibilitam sua liberação dos processos de controle celular e ambiental. Essas

mutações podem envolver genes que agem no ciclo celular, apoptose, angiogênese,

adesão celular, e reparo do DNA. Um grande número de tais genes, como oncogenes e

genes supressores tumorais (GST), já foi identificado (GRAY & COLLINS, 2000).

Durante a década de 90, uma terceira categoria de genes envolvida com o

câncer foi definida: aqueles que controlam o reparo do DNA (FISHEL et al., 1993). A

princípio, há dois tipos de genes que previnem o câncer quando em funcionamento

normal: os genes caretakers, que mantêm a integridade do genoma, tanto ao nível dos

nucleotídeos como dos cromossomos, e os genes gatekeepers, que mantêm um

crescimento celular funcional, incluindo os proto-oncogenes e genes supressores de

tumor (KINZLER et al., 1997; BREIVIK, 2005). Conjuntamente, alterações nesses

genes conduzem à instabilidade genômica, criando um ambiente em que o acúmulo de

mutações podem levar ao fenótipo câncer (GRETARSDOTTIR, 1998).

Os oncogenes, alelos mutantes ativados de uma classe de genes celulares

normais conhecidos como proto-oncogenes, facilitam a transformação maligna por

mecanismos tais como o estimulo à proliferação do clone mutado, o aumento do

suprimento sanguíneo ao tumor, e a inibição da apoptose (CONCIN et al., 2003). Os

oncogenes têm efeito dominante, uma vez que um único alelo mutado é suficiente para

alterar o fenótipo celular de normal para neoplásico. Essas mutações podem ser nos

próprios oncogenes, em seus elementos reguladores ou no número de cópias no

genoma, levando à desregularão ou hiperexpressão de seu produto oncogênico

(BREIVIK, 2005).

11

Genes protetores ou caretakers são verdadeiros supressores tumorais,

estando envolvidos no reparo de danos ao DNA e na manutenção da integridade do

genoma. Já os genes de manutenção, ou gatekeepers,estão envolvidos na regulação ou

inibição da proliferação celular. Para essas duas classes de genes, a perda ou inativação

de ambos os alelos pode levar ao câncer agora pelo acúmulo de mutações secundárias

em proto-oncogenes ou em genes supressores de tumor (GOODISON et al., 2005).

Um exemplo de gene supressor de tumor é o TP53, que está localizado no

braço curto do cromossomo 17, e desempenha importante papel no controle do ciclo

celular, reparo do DNA, e ativação da apoptose (WATTERS et al, 2003). O TP53

codifica uma fosfoproteina nuclear que funciona como um regulador transcricional, se

ligando em seqüencias específicas na fita de DNA (CONCIN et al., 2003). A evidência

inicial de que este gene estaria inativado em cânceres humanos foi dada por estudos

demonstrando que a perda de heterozigosidade para alelos situados no cromossomo 17

(17p13.1) era comum em muitos tipos tumorais (FEARON et al., 1987; VOLGESTEIN

et al., 1988; BAKER et al., 1990). Além disso, o gene TP53 está mutado em grande

parte dos indivíduos com síndrome de Li-Fraumeni, uma desordem hereditária

caracterizada por uma ampla variedade de sarcomas (MALKIN et al., 1992).

Em respostas ao dano na molécula de DNA, células com tipos selvagens de

TP53 exibem uma rápida resposta no aumento do nível celular da proteína p53, o que se

correlaciona muito bem com a parada do ciclo celular em G1. Esta parada em G1 é o

tempo necessário para que o processo de reparo ocorra antes que haja duplicação na fase

S do DNA danificado. Em caso de não ser possível o reparo do DNA, a p53 ativa a via

de capazes que levam a célula a apoptose (CONCIN et al., 2003).

Mutações no TP53 estão entre as anormalidades genéticas mais comuns

entre os cânceres humanos em geral e no câncer de mama em particular. Sua

12

participação na carcinogênese deriva do fato que alteram o ciclo celular, resultando em

um aumento da instabilidade genética. Adicionalmente, uma perda de ação da via

apoptótica dependente da p53 conduz ao aumento de resistência aos agentes

danificadores de DNA usados clinicamente como a rádio e a quimioterapia

(GERSTNER & FINE, 2007).

Mutações em proto-oncogenes e genes supressores tumorais podem ocorrer

em diferentes momentos e seqüencias particulares na via de progressão dos diferentes

tumores, e podem contribuir parcialmente para a aquisição de uma única alteração ou

totalmente para a aquisição simultânea de várias alterações distintas. Como

conseqüência dessa manifestação variável, os diferentes tipos tumorais podem

apresentar fenótipos diversos; entretanto, independente do caminho genético percorrido,

alterações nesses genes são comuns a todos os tipos de tumores, e o reconhecimento de

suas relações com a progressão da malignidade tem importante valor prognóstico e pode

facilitar o desenvolvimento de novas terapias (HANAHN & WEIBERG, 2000).

6. CITOGENÉTICA E CÂNCER.

6.1 Considerações Gerais

A instabilidade cromossômica é uma característica comum das células

cancerígenas. Muitos mecanismos celulares levam à instabilidade cromossômica,

envolvendo rearranjos numéricos e estruturais nessas células, incluindo problemas de

segregação, de pontos de checagem do ciclo, de estabilidade telomérica e de reparo de

DNA. O número de diferentes mecanismos relacionados à instabilidade cromossômica

vem aumentando rapidamente com novas descobertas. Considerando-se que a

instabilidade cromossômica é uma das maiores causas de resistência de tumores a certos

tratamentos, o entendimento dos mecanismos que levam a essa instabilidade tem uma

13

grande importância prática (GOLLIN, 2005). Estima-se que desequilíbrios no número

de cromossomos seja a modificação genética mais comumente encontrada nos tumores

sólidos analisados até o momento (HEIM & MITELMAN, 1995).

As aberrações cromossômicas numéricas são comumente observadas em câncer

humano. Três linhas de evidência nos levam a crer que essas aneuplodias são eventos

discretos de mutações cromossômicas que contribuem para o processo de transformação

maligna: primeiro, a análise de aneuplodias por técnicas de citogenética molecular

revelaram que aneuploidias cromossômicas específicas são relacionadas com tipos

tumorais distintos; segundo, linhagens de células tumorais aneuplóides apresentaram

uma elevada taxa de instabilidade cromossômica; e terceiro e mais importante, vários

genes que controlam a segregação cromossômica foram encontrados mutados em

células tumorais humanas, associando essas mutações à indução de aneuplodiais em

tumores (SAN, 2000; GOODISON et al. 2005).

Há um aumento crescente de estudos de anormalidades cromossômicas em

humanos, principalmente por estarem relacionadas etiologicamente a neoplasias,

envolvendo oncogenes e genes supressores de tumor, como produtos da instabilidade

genética (GISSELSSON, 2005). De acordo com SORENSEN e TRICHE (2000), esses

rearranjos podem levar a conseqüências como:

- Ativação de genes chaves no controle da proliferação e diferenciação celular que

codificam fatores de transcrição que se ligam ao DNA em seqüências definidas,

influenciando decisões celulares para entrar e sair do ciclo celular ou para expressar

genes associados à diferenciação.

- Quebras em um cromossomo ou em cromossomos diferentes, com fusões diversas,

inversões, translocações, em recombinações mitóticas de genes homólogos ou não

homólogos, levando a formação de gene quimérico.

14

Entretanto, informações acerca de aberrações recorrentes em tumores

sólidos e alguns hematopoiéticos são limitados devido à dificuldade de se obter material

de cultura primária destas células e por terem baixo índice mitótico (HEIM &

MITELMAN, 1995). Além disso, tumores sólidos têm freqüentemente cariótipos com

rearranjos complexos, tornando difícil a identificação de alteração genética envolvida na

patogênese do câncer (PATEL et al., 2000).

Uma divisão desigual dos cromossomos origina as aneuploidias. As

aneuploidias (perdas ou ganho de um ou mais cromossomos) vêm sendo observadas em

vários tipos diferentes de neoplasias, e apesar disso, não se sabe exatamente seu papel

na carcinogênese (DEY, 2004). Como esses rearranjos numéricos são consistentemente

observados em todos os cânceres, muitos trabalhos apóiam a hipótese de que as

aneuploidias são freqüentemente causadas por um tipo particular de instabilidade

genética, chamada instabilidade cromossômica, a qual pode refletir defeitos na

segregação mitótica (RAJAGOPALAN & LENGAUER, 2004)

Um princípio fundamental na compreensão de tumorigenese é que o câncer

surge a partir das aquisições seqüenciais de alterações cromossômicas em genes

específicos (GISSELSON, 2008). Estas mudanças (mutações e amplificações) ocorrem

em células individuais, e cada mudança atinge uma onda de expansão clonal, sendo

necessárias de 6 a 10 eventos clonais para se atingir maturação neoplásica. Ao contrário

das células normais, que contém um número regular de 46 cromossomos, as células

neoplásicas freqüentemente apresentam um número maior de cromossomos, cerca de 60

a 90, e podem diferir em número e estruturas em células de um mesmo tumor (HARITI,

2005)

As bases genéticas de todo processo de aneuploidias precisam de mais

investigações. Entretanto, tetraploidizações vistas em lesões pré-neoplásicas como o

15

esôfago de Barret, e colite ulcerativa, translocações balanceadas e telômeros curtos

vistos em células telomerase-negativas imortalizadas, e anormalidades em números

(dobrados) de centrômeros e mutações em genes responsáveis por pontos de checagem

de fusos mitóticos podem ser as bases genéticas para as aneuploidias ou instabilidade

cromossômicas (DEY, 2004; HARITI, 2005).

6.2 Relação entre Rearranjos Cromossômicos e Genes Supressores Tumorais e

Proto-oncogenes

As modificações cromossômicas que atuam na tumorigênese são

diretamente relacionadas com muitos proto-oncogenes, genes supressores tumorais e

outros genes de controle de ciclo celular (GUNTER, 2001, PEÑA & CASTRO, 2002).

No caso de deleções, o funcionamento normal desses genes e dos

mecanismos que eles controlam sofre modificações devido a uma haplo-insuficiência

ou desequilíbrio da expressão gênica; por essa via pode-se ativar os mecanismos

iniciais da gênese tumoral. Os exemplos incluem a deleção intersticial de 11p13, que

contém o gene supressor de tumor WT1 no tumor de Wilms; a deleção da banda

13q14, na qual se localiza o gene RB, responsável pelo retinoblastoma em crianças; e a

deleção do 17p13, no qual encontramos o gene TP53, relacionado com os carcinomas

gástrico, de mama, melanoma, de pulmão, de ovário e de cólon (HEIM &

MITELMAN, 1995; BERTRAM, 2000; GUNTER, 2001; PEÑA & CASTRO, 2002).

O gene TP53 está bem reconhecido como guardião do genoma humano: é importante

notar que as deleções que comprometem os locos dos genes TP53 e do RB

desencadeiam o surgimento de diferentes tipos de tumores em mais de 50% dos casos

(SANDBERG, 1994; HOLLSTEIN et al., 1991; LOPES et al., 2002).

16

Por outro lado, as translocações podem conduzir à trasativação gênica

anormal desses genes, como ocorre com o L-myc (1p32) em carcinoma de pulmão, o

N-ras (1p11) em neuroblastomas, APC (5q21) em polipose de cólon, BRCA1 (1p36 e

17q21) em câncer de mama e de ovário, e a super-expressão do oncogene HER2/NEU

em carcinoma de mama (MITELMAN, 2000; RABBITS, 1994; SCWAB, 1999;

OBARA et al., 2001). As translocações também afetam a estrutura e função de outros

genes, como aqueles que codificam fatores de crescimento (SHAEKNEV &

SHAEKNEV, 1997). Da mesma forma, esse tipo de rearranjo pode originar genes

híbridos (genes fusionados) cujos produtos, proteínas quiméricas, aumentam

notoriamente a proliferação celular e ativam mecanismos de gênese tumoral e

posterior metástase (AMAN, 1999; MITELMAN, 2000).

Conclui-se, dessa forma, que quaisquer modificações no número ou

estrutura dos cromossomos humanos que comprometam os locos de proto-oncogenes e

genes supressores tumorais ativam os mecanismos de surgimento de neoplasisas em

humanos.

6.3 Dados Citogenéticos de Tumores de Mama

As análises citogenéticas em câncer de mama já revelaram que esse tipo de

tumor apresenta-se bastante heterogêneo nesse aspecto (HEIM & MITELMAN, 1995;

MITELMAN, 1994; SLOVAK, 1996). A interpretação e identificação das aberrações

clonais tornam-se difíceis pela sua complexidade. O exato número e distribuição de

genes envolvidos na maioria desses rearranjos ainda são desconhecidos

(LARRAMENDY et al., 2002). Os primeiros estudos em tumores de mama revelaram

ganhos de 1q, 8q, 11q13, 17q22-24 e 20q13, e perdas de 17p e do cromossomo 22 como

17

as aberrações mais freqüentes (COURJAL & THEILLET, 1997; KNUUTILA et al.,

1998; KUUKASJAVIN et al., 1998).

Outra aneuplodia recorrente em tumores de mama envolve o

cromossomo 8: o ganho desse cromossomo foi observado em 100% dos casos de

tumores primários analisados por ROKA et al. (1998). Esse cromossomo pode ter

grande importância no carcinoma de mama, visto que vários genes que estão envolvidos

em sua gênese estão situados nesse cromossomo. Além disso, a aneuploidia do

cromossomo 8 parece ocorrer no início do processo neoplásico (DEVILEE &

CORNELISSE, 1994).

6.4 Aneuploidias em Metástases de Mama

O acúmulo de anormalidades cromossômicas, tais como rearranjos,

amplificações e deleções afetando diretamente genes envolvidos no controle da

proliferação, diferenciação e sobrevivência celular podem levar a um processo de passos

múltiplos para o desenvolvimento e progressão do câncer. A identificação de tipos

comuns de rearranjos genômicos é um dos grandes objetivos na pesquisa de câncer,

porque pode trazer informações sobre os mecanismos moleculares que levam à

transformação celular (GOODISON et al., 2005).

Segundo PANDIS et al.(1998), ao se analisar citogeneticamente células

obtidas a partir de metástases, as principais perguntas referem-se à sua estrutura

cromossômica: o cariótipo de células de metástases mantém o mesmo perfil

cromossômico dos tumores primários? Os rearranjos encontrados são semelhantes

àqueles dos tumores primários? Os rearranjos observados nos tumores primários podem

estar relacionados com o seu poder de se metastatizar? Os resultados ainda são

18

controversos, principalmente devidos às dificuldades técnicas em se obter boas

preparações para análises citogenética.

Poucos são os casos de estudos citogenéticos envolvendo tanto o tumor

primário como as suas eventuais metástases. Em estudos de metástases de mama em

linfonodos vários rearranjos também característicos do tumor primário foram

encontrados nas metástases, além de novos. Assim as metástases apresentam um maior

número de rearranjos por clone, mas um menor número de populações clonais,

selecionadas da massa tumoral após adquirirem capacidade para metastatizar (PANDIS,

1998, TEIXEIRA et al. 1996).

De todos os casos de metástases analisados por PANDIS et al. (1998), a

aneuploidia mais observada foi a monossomia do cromossomo 17 (70%) e perda no

cromossomo 22 (70%). Essas duas aberrações cromossômicas também são comuns em

tumores primários, indicando que eles podem ter um papel importante no

estabelecimento de metástases. Genes supressores de tumor como TP53, BRCA1 e

oncogenes como HER2/neu situados no cromossomo 17 podem ter suas dosagens

alteradas quando este demonstra anormalidade estrutural e numérica, o que tem sido

relacionado a pobre prognóstico (WATTERS et al., 2003). TSUDA et al. (1998)

também obervaram concordância entre perda de heterozigosidade tanto de 17p como

17q e graus de malignidade em um estudo envolvendo 150 tumores primários de mama

com metástases nos linfonodos axilares, e a combinação entre mutações do TP53 e

amplificações do c-erbB2 foi significante como prognóstico de recorrência e morte.

Já aneuploidias envolvendo o cromossomo 22 foram observadas

principalmente em tumores primários de SNC, como meningiomas, ependimomas e

schwanomas ( EVANS et al., 2000; WEINBERG, 2008). Entretanto, outros tumores

também foram caracterizados pela monossomia desse cromossomo como alguns

19

tumores intestinais (MARCI et al., 1998) e do ovário (CAUGHRON et al., 2005). O

gene NF2, situado no cromossomo 22, parece ser uma das possíveis causas da

associação de aneuploidias do par 22 e alguns tipos de neoplasias. De fato, dados da

literatura indicam que modificações do gene NF2 estão associados a 30% dos casos de

tumores cerebrais. Esse gene promove a produção de uma proteína denominada merlin,

que possui importante papel em muitas vias de sinalização relacionadas ao crescimento,

divisão e comunicação celular (BEGNAMI et al., 2007).

20

7. OBJETIVOS

7.1 Objetivo Geral

- Analisar a ocorrência de aneuploidias dos cromossomos 17 e 22 e deleções do gene

TP53 em metástases cerebrais de mama, através da aplicação de sondas centroméricas e

gene-específicas, comparando os resultados obtidos com os dados previamente

publicados.

7.2 Objetivos Específicos

- Analisar a ploidia de células obtidas de metástases cerebrais de mama.

- Observar a ocorrência de aneuplodiais envolvendo os cromossomos 17 e 22 em

metástases cerebrais de mama.

- Analisar a ocorrência de deleções do gene TP53 em metástases cerebrais de mama.

- Comparar os resultados com dados previamente publicados

- Comparar os dados com o histórico dos pacientes, procurando traçar relações entre as

mutações encontradas e o quadro clínico dos pacientes.

21

II. MATERIAL E MÉTODOS

1. AMOSTRAS

O presente trabalho faz parte de um projeto maior intitulado “Estudos

Citogenéticos e Moleculares em Tumores do Sistema Nervoso Humano na População

Paraense”, aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Centro de Saúde da

Universidade Federal do Pará (025/06 CEP-CCS/UFPA) (Anexo I). Os pacientes ou

seus parentes próximos foram informados sobre o estudo a ser realizado e, em caso de

concordância em participar do mesmo, solicitou-se a assinatura de um termo de livre

consentimento (Anexo II). As análises foram realizadas em cinco amostras de

metástases cerebrais de mama. A caracterização das amostras e dos pacientes encontra-

se na tabela I. Para controle da técnica de FISH, foi analisada uma amostra de

preparação obtida a partir de cultura de linfócitos de um indivíduo hígido que não foi

exposto a radiações ou medicamentos que pudessem interferir no resultado do estudo,

em período próximo à coleta.

Tabela I: Caracterização das Amostras Utilizadas nas Análises Protocolo Data de Coleta Sexo Idade Exame Histopatológico CONT01 05/05/2008 F 22 ---------- CSN037 28/07/2005 F 23 Adenocarcinoma metastático CSN099 06/06/2006 F 54 Adenocarcinoma metastático CSN133 30/03/2007 F 45 Adenocarcinoma metastático CSN134 10/04/2007 F 46 Adenocarcinoma metastático CSN155 18/01/2008 F 50 Adenocarcinoma metastático

22

2. COLETA DAS AMOSTRAS

Amostras de tecido tumoral foram coletadas durante o procedimento cirúrgico

pela equipe de Neurocirurgia do Hospital Ophir Loyola. O material foi colocado em

meio de cultura RPMI, contendo antibióticos, para prevenção de possível contaminação.

Imediatamente após sua coleta, o material foi encaminhado ao Laboratório de

Citogenética da Universidade Federal do Pará, para processamento.

3. OBTENÇÃO DE NÚCLEOS INTERFÁSICOS

Para obtenção de suspensão de núcleos interfásicos e eventuais metáfases,

seguiu-se a técnica de FORD e HAMERTON (1956) com modificações. O material

tumoral foi desagregado com o uso de bisturi, tesoura e colagenase em uma placa de

Petri. Depois da dissociação completa do tecido, acrescentaram-se cerca de 0,2 mL de

colchicina e 5 mL de meio RPMI enriquecido com 10% de soro bovino fetal, e o

material foi macerado. Posteriormente, centrifugou-se por 10 minutos a 1000 rpm. O

sobrenadante foi desprezado, e adicionaram-se 5 mL de solução hipotônica (KCl 0,075

M). O material foi então ressuspendido e incubado por 15 minutos a 37°C. Depois de

transcorrido esse tempo, acrescentou-se fixador Carnoy (3 metanol : 1 ácido acético) e

ressuspendeu-se. Após centrifugar-se o material por 10 minutos a aproximadamente

1000 rpm, descartou-se o sobrenadante com o uso de uma pipeta Pasteur,

acrescentando-se novo fixador (5 mL). Após ressuspensão, o material foi novamente

centrifugado. Esse procedimento foi repetido por três vezes. Após a última etapa,

acrescentaram-se apenas 2mL de fixador. O material foi então mantido em freezer.

23

4. PREPARAÇÃO DAS LÂMINAS

As lâminas para uso foram primeiramente lavadas, deixando-as por alguns

minutos em solução de álcool / éter (50%). Após esse procedimento:

1. Enxugou-se a lâmina com ajuda de um papel absorvente ou tecido.

2. Após a última centrifugação, retirou-se o sobrenadante e adicionou-se cerca de 1 ml

de fixador novo ao material. Ressuspendeu-se com ajuda de uma pipeta Pasteur.

3. Com a ajuda de uma micropipeta, 10 µl da suspensão foram adicionados à lâmina.

4. A lâmina seguiu para o processo de pepsinização e desidratação.

5. PRÉ-HIBRIDIZAÇÃO

Após a evaporação do fixador, as lâminas foram pepsinizadas para a retirada de

excessos de material citoplasmático ou qualquer outro material que pudesse

comprometer os resultados da hibridização in situ. Para isso, as lâminas foram

mergulhadas em solução de pepsina (500 µl de pepsina a 1% em 50 ml de HCl) por 3

minutos. Após a incubação, as lâminas foram incubadas três vezes em 2xSSC, por 3

minutos cada vez.

Depois do processo de pepsinização, as lâminas foram desidratadas em bateria

de alcoóis (etanol 70%, 70%, 90%, 90%, dois minutos em cada, e 100%, quatro

minutos. Em seguida, após a evaporação total do álcool, as lâminas foram envelhecidas

em estufa a 37oC, por 12-24 horas.

6. HIBRIDIZAÇÃO IN SITU

6.1 Sondas

Foram utilizadas sondas comerciais da marca Abbott Molecular (Illinois, EUA).

As sondas foram utilizadas em experimentos dual-colors, utilizando-se dois fluoróforos

24

distintos: SpectroRed e SpectroGreen. No experimento para detecção de aneuploidias

envolvendo o cromossomo 22, a sonda específica para o locus 22q11.2 (Vysis LSI BCR)

foi utilizada juntamente com o controle 9q34 (Vysis LSI ASS-ABL), visto que ambas as

sondas estavam disponíveis em um coquetel de duas cores. Já para a análise de

aneuplodias do cromossomo 17 e rearranjos envolvendo o gene tp53, utilizamos as

sondas específicas para o centrômero do 17 (Vysis CEP 17 17p11.1-q11.1 Alpha

Satellite) e para 17p13.1 (Vysis LSI TP53), respectivamente.

6.2 Hibridização

Foram seguidas as instruções do fabricante (Abbott Molecular):

1. Em um eppendorf, as sondas foram misturadas ao tampão de hibridização: 7

µl de tampão, 1 µl de sonda e 2 µl de água deionizada.

2. O material foi misturado no vortex por 5 segundos e centrifugado.

3. As sondas foram desnaturadas em banho-maria a 73oC por 10 minutos.

4. Após sua desnaturação (5 minutos em formamida a 70% a 73oC), as lâminas

foram desidratadas em bateria de alcoóis (etanol 70% gelado, 4 minutos,

70%, 90% e 90%, temperatura ambiente, 2 minutos cada, e 100%

temperatura ambiente, 4 minutos).

5. Depois da evaporação total do álcool, as lâminas foram colocadas em placa

quente a 50oC, e despejou-se 10 µl de solução de hibridização (tampão e

sondas).

6. Após dois minutos, as lâminas foram retiradas da placa quente. Uma

lamínula foi colocada sobre o material e as lâminas foram incubadas em

recipiente fechado a 42oC por 45 minutos.

25

6.3 Lavagem de Estringência

Após a incubação e retirada das lamínulas, as lâminas foram incubadas em

0.4xSSC/0.3% Tween a 73oC por dois minutos. Em seguida, as lâminas permaneceram

por ums minuto em 2xSSC/0,1% Tween. As lâminas foram então coradas em DAPI e

cerca de 10 µl de antifade foram aplicados em cada lâmina. Uma lamínula de

24mmx24mm foi colocada sobre o material. As lâminas foram mantidas em geladeira

até a análise ao microscópio.

7. ANÁLISE E CAPTURA DAS IMAGENS

A análise dos experimentos de FISH foi feita com objetiva de imersão em

microscópio de fluorescência AXIOPHOT acoplado a uma câmera digital. A captura de

imagens foi feita com o auxílio do programa AXIOVISION instalado em um

computador Pentiun IV. Usando os critérios de HOPMAN et al. (1994) apud

CARLSON et al. (2000), foram analisados 40 núcleos intactos de 3 a 5 áreas separadas

(120 a 200 núcleos no total). Regiões com background ou que não exibiam pelo menos

um sinal de hibridização não foram consideradas.

As diferentes combinações de números de sinais em cada núcleo e experimento

foram agrupadas em nove classes diferentes, sendo considerados normais os núcleos

que apresentaram dois sinais de cada uma das sondas utilizadas. A ausência de um sinal

foi considerada como deleção do segmento ou cromossomo em questão. A presença de

mais de dois sinais foi considerada como trissomia ou amplificação do segmento em

questão. Para se avaliar a ploidia média dos núcleos analisados, foi feita a comparação

da freqüência de marcações extras do centrômero do cromossomo 17 e do segmento do

cromossomo 22 com aquelas do cromossomo 9, normalmente não envolvido

diretamente com a tumorigênese em câncer de mama ou matástases. Dessa forma, a

26

freqüência de três sinais do cromossomo 9 em cada amostra foi considerada a

freqüência média de núcleos triplóides nessa determinada amostra, e sua comparação

com a freqüência de três sinais do centrômero do cromossomo 17 foi indicativo do

número de vezes que esses sinais representavam trissomia, e o número de vezes que

surgiam devido a triploidização do núcleo. O mesmo procedimento foi aplicado para a

interpretação dos dados do cromossomo 22. O número de núcleos analisados por caso

variou de 110 a 200, de acordo com o estado de cada uma das lâminas empregadas nos

experimentos de hibridização in situ.

8. ANAMNESE

Os dados clínicos dos pacientes que cederam as amostras para análise estão

contidos no Anexo III.

27

III. RESULTADOS

1. EXPERIMENTOS DE HIBRIDIZAÇÃO IN SITU

As sondas utilizadas produziram sinais claramente detectáveis e de fácil

interpretação. Todas as sondas foram aplicadas nas seis amostras, somando dois

experimentos de duas cores para cada uma delas. A utilização de experimentos

empregando-se duas sondas simultaneamente permitiu um melhor controle acerca do

comportamento de cada um dos cromossomos ou segmentos marcados. Além disso, a

análise em conjunto dos resultados permitiu uma interpretação mais segura em relação à

ploidia de cada um dos núcleos visualizados. No anexo IV apresentamos imagens

representativas das diferentes combinações entre os sinais nos dois experimentos

distintos.

As sondas gênicas nos cromossomos 9, 17 e 22 foram analisadas isoladamente e

em conjunto. A presença de um número de sinais diferente de dois simultaneamente nas

sondas do 9 e do 22 foi interpretado como indício de euploidias, enquanto as alterações

no número de sinais em apenas uma das sondas foram interpretadas como aneuploidias.

Foi utilizado um controle com núcleos obtidos a partir de cultura de linfócitos

para determinar a sensibilidade e a especificidade da técnica de FISH, através do qual

foi verificada uma baixa incidência de núcleos alterados (0-2,5%) para os genes e

cromossomos estudados na cultura de linfócitos.

Os resultados referentes ao gene TP53 e à sonda do centrômero do cromossomo

17 indicaram uma pequena variação de marcações entre os casos analisados. Os núcleos

normais foram a marcação com maior porcentagem para ambas as sondas em três dos

cinco casos, variando de 26,3% a 50%. Como segundo evento, destaca-se a deleção do

TP53, variando de 18,9% a 34,6%. O CSN 99 manteve-se divergente tanto em relação a

normalidade de núcleos quanto a deleção de TP53, destoando do padrão de atuação

28

deste gene nos demais casos. Estatisticamente, o CSN 99 encontra-se significante em

relação a todos os outros casos. De qualquer forma, considerando as classes com

núcleos com menos que dois sinais do TP53 como deleções permite considerar esse

rearranjo como o mais observado em todas as amostras, seguido de ganho do

cromossomo 17 (presença de mais de dois sinais da sonda centromérica (Tabela 2).

A análise dos cromossomos 9 e 22 nos tecidos tumorais revelou um padrão de

perda do cromossomo 22 em todos os casos (13% a 51% dos núcleos), exceto o CSN

99, com apenas 8,5% dos casos com perda desse cromossomo. Em três (CSNs 155, 134

e 37) dos cinco casos analisados, a normalidade dos núcleos prevaleceu em mais de

50% de núcleos examinados, seguido em um caso (CSN 155) por um evento de ganho

do cromossomo 9 - interpretado aqui por hiperploidia - e em dois casos (CSNs 134 e

37) por perda do cromossomo 22. A análise do CSN 133 apresentou 51% de núcleos

com perda do cromossomo 22, seguido com 19% de núcleos normais. Já o CSN 99

divergiu do padrão dos demais casos, demonstrando o ganho do cromossomo 9 - e

possível hiperploidia - em 30, 5%. A soma das classes com menos de dois sinais do

cromossomo 22, que são indicativos de perda desse cromossomo, fazem deste rearranjo

o mais comumente observado depois dos núcelos normais (Tabela 3).

29

Tabela 2 – Análise estatística dos experimentos de i-FISH do gene TP53 e o centrômero

do cromossomo 17.

Número de Sinais Número de Núcleos

Conclusões Possíveis Cen 17

TP53 CL* CSN 155 CSN 134 CSN 133 CSN 99 CSN 37

2 2 196 98% 32 16,8% 50 26,3% 100 50% 68 34% 54 36% Núcleo Normal

>2 2 0 60 30,5% 30 6 4 0 Ganho do cromossomo 17,

com perda do TP53 nas cópias adicionais

2 >2 0 0 0 0 0 0 Amplificação do TP53

>2 >2 4 16 16 1 4 5 Hiperploidia

<2 2 0 3 3 0 2 0 Perda do cromossomo 17,

presença de cópia extra do TP53

2 <2 0 37 19,4% 36 18,9% 68 34% 98 49% 62 41,3% Deleção de TP53

<2 <2 0 12 13 19 20 25 Hipoploidia

<2 >2 0 0 0 0 0 6 Perda do cromossomo 17 e TP53 amplificado

>2 <2 0 30 16,8% 42 23,6% 6 4 14% 8 Ganho do cromossomo 17 e

TP53 deletado em mais de um deles

*CL – Controle de Linfócitos.

30

Tabela 3: Análise estatística dos resultados de i-FISH dos cromossomos 9 e 22.

Número de Sinais Número de Núcleos Conclusões

Possíveis CL* CSN 155 CSN 134 CSN 133 CSN 99 CSN 37

194 97% 96 51,6% 115 57,5% 38 19% 11 5,5% 55 50% Núcleo Normal

>2 2 0 40 21,5% 7 2 61 30, 5% 8 Ganho do cromossomo 9

2 >2 0 5 3 1 4 3 Ganho do cromossomo 22

>2 >2 2 11 6 2 22 14 Hiperploidia

<2 2 0 4 4 3 5 0 Perda do cromossomo 9

2 <2 0 26 13% 45 22,5% 102 51% 17 8,5% 25 22,7% Perda do cromossomo 22

<2 <2 4 1 18 34 12 2 Hipoploidia

<2 >2 0 0 0 0 2 0 Perda do 9, ganho do 22

>2 <2 0 5 2 18 28 14% 3 Ganho do 9, perda do 22

* CL – Controle de Linfócitos

31

IV. DISCUSSÃO

1. SOBRE A IMPORTÂNCIA DOS RESULTADOS OBTIDOS A PARTIR

DA APLICAÇÃO DA TÉCNICA DE I-FISH: UMA VISÃO GLOBAL

Técnicas de citogenética molecular vêm trazendo um grande progresso na

análise cariotípica de células tumorais, permitindo uma análise global das aberrações

cromossômicas, como no caso da CGH ou do M-FISH, ou do comportamento de

cromossomos ou segmentos cromossômicos individuais, como no caso do uso de

sondas gene-específicas derivadas de BACs e que podem ser utilizadas em núcleos

interfásicos. Os dados das diferentes técnicas se somam para que haja um melhor

entendimento do papel de certas modificações cromossômicas na tumorigênese ou na

análise prognóstica de diferentes casos de neoplasias. De fato, muitos estudos mostram

que há uma associação clara entre diferentes características cariotípicas de tumores e o

tipo de tratamento que melhores resultados trarão e mesmo a sobrevivência dos

pacientes (BARDI et al., 2004).

A citogenética interfásica é uma alternativa valiosa para casos nos quais não foi

possível a obtenção de um número de metáfases satisfatório para a caracterização

citogenética de um caso. Entretanto, limita-se a quantidade de informações que podem

ser obtidas de cada experimento, visto que, como não se pode fazer uma análise

cariotípica global dos núcleos, é necessária a escolha de um número pequeno de sondas,

já baseada em uma seleção de acordo com os objetivos do experimento, como por

exemplo, sondas centroméricas dos pares cromossômicos envolvidos nas principais

aneuplodiais de humanos no caso de exames pré-natais (STUMM et al., 2006).

Por outro lado, uma grande vantagem do i-FISH é a utilização de células que não

precisam ser colocadas em cultura, podendo ser obtidas diretamente do tecido, como no

32

presente trabalho, o que diminui o tempo necessário para a obtenção dos resultados, ou

mesmo de material parafinado de lâminas histológicas (COWELL et al., 2004).

Considera-se que a transição metastática na maioria dos tumores humanos é

acompanhada por uma série de anomalias cromossômicas complexas recorrentes e

estocásticas. Essas mudanças refletem a pressão evolutiva pela qual as células

cancerígenas precisam passar para continuarem seu crescimento em ambientes

histopatologicamente diversos daquele no qual o tumor se originou (GAGOS &

IRMINGER-FINGER, 2005). Para este trabalho, dados referentes aos tumores

primários não estavam disponíveis para uma comparação genômica completa.

Entretanto, resultados de trabalhos anteriores envolvendo o mesmo tipo de tumor

primário – de mama –, porém com metástases em um tecido diferente – linfonodos –,

mostraram que aneuploidias envolvendo os cromossomos 17 e 22 estariam entre os

rearranjos mais observados tanto nos tumores primários como metastáticos, sugerindo

que essas aneuploidias possam estar relacionadas com um maior poder de

metastatização dos tumores primários (PANDIS et al., 1998, TSUDA et al., 1998). Em

adição, monossomias envolvendo esses cromossomos só foram obervadas em 10% de

tumores primários que não metastatizaram (PANDIS et al., 1995).

As amostras que analisamos foram classificadas histologicamente como

metástases cerebrais de mama. Apesar da incidência total de metástase cerebral de

tumores de mama ser de cerca de 30% (SUENSEN, 2007), pouco se sabe sobre sua

constituição cariotípica ou comparações com tumores primários de mama. Assim,

baseados nos dados já expostos de comparações cariotípicas entre tumores primários de

mamas e suas metástases, decidimos analisar a ocorrência dos rearranjos mais

significativos encontrados em comum entre esses dois tipos distintos de neoplasias. A

utilização de sondas que indicassem a ocorrência de aneuploidias envolvendo os

33

cromossomos 17 e 22 foi a metodologia escolhida e trouxe dados interessantes que irão

se somar a outros previamente publicados e poderão num futuro próximo, com o

aumento do número de amostras analisadas, definir a importância desses rearranjos nos

riscos de metastatização de tumores primários de mama.

2. OCORRÊNCIA DE ANEUPLOIDIAS DO CROMOSSOMO 17

A perda do cromossomo 17 foi um dos resultados mais comuns encontrados por

PANDIS et al. (1998), e o resultado mais comum na análise de TSUDA et al. (1998),

ambos em metástases de mama em linfonodos. Entretanto, um resultado comum a todas

as nossas amostras foi um baixo número de núcleos com monossomia do cromossomo

17. Um número um pouco mais significativo estatisticamente de núcleos mostrou,

todavia, um ganho de cópias desse cromossomo. A maioria desses ganhos representou

trissomias e, em menor número, tetrassomias. A presença de mais de quatro cópias do

cromossomo 17 foi observado em um número muito pequeno de núcleos, no caso 134,

com núcleos com 5 ou 6 cópias.

É importante ressaltar que a presença de mais de dois sinais do centrômero do

cromossomo 17 pode indicar, também, células hiperplóides, já que não foi utilizada

nenhuma outra sonda como controle de ploidia nos experimentos do cromossomo 17.

Porém, se considerarmos os resultados obtidos com as sondas dos cromossomos 9 e 22

nas mesmas amostras como indicadores da ocorrência de hiperploidia (a presença de

três cromossomos 9 ou três cromossomos 9 e três cromossomos 22 indicariam o grau de

hiperploidização na amostra), ainda teremos um número significativamente maior de

núcleos com ganho do 17 do que a parcela que seria considerada poliplóide.

A polissomia do cromossomo 17 já havia sido descrita em tumores de mama.

HYUN et al. (2008) detectaram a presença de ganho desse cromossomo em 32% do

34

total de casos analisados, o que corresponde a um resultado similar a outros estudos

(TANNER et al., 2000, ZHAO et al., 2002, DOWNS-KELLY et al., 2005, MEROLA et

al., 2006). Alguns autores sugerem que há uma relação direta entre o aumento de cópias

do cromossomo 17 e os níveis de expressão do gene HER-2 (Receptor de Fator de

Crescimento Epidermal Humano 2, do inglês Human Epidermal Growth Factor

Receptor-2). Apesar dos efeitos da polissomia desse cromossomo na expressão da

proteína HER-2 ainda não estarem bem estabelecidos, foi observada uma super-

expressão dessa proteína em associação com a presença de cópias extras do

cromossomo 17 (BOSE et al., 2002, WANG et al., 2002, DOWNS-KELLY et al., 2005,

MEROLA et al., 2006). A super-expressão do HER-2 está associada a um diagnóstico

pobre, tanto em cânceres de mama nódulo-negativos como em nódulos positivos

(SLAMON et al., 1987, TANDON et al., 1989, PRESS et al., 1993). Desde a

introdução do tratamento com trastuzumab, um anticorpo monoclonal contra a porção

extracelular da HER-2, pesquisas voltadas ao status dessa proteína vem sendo realizadas

em mulheres com câncer de mama, com o intuito de se identificar pacientes que serão

mais provavelmente beneficiadas com o uso de trastuzumab (VOGEL et al., 2002,

ROMOND et al., 2005).

Ganhos do cromossomo 17 e envolvimento do gene HER-2 no processo

metastático foram observados em adenocarcinoma de Barrets primários metastásticos e

em suas metástases em linfonodos (WALCH et al.,2000).

Nos casos de metástases analisados, observamos a ocorrência de polissomias do

17 de aproximadamente 9% (CSN099) a 36,7% (CSN155). Talvez o prognóstico pobre

relacionado com a polissomia do cromossomo 17 em tumores primários de mama, com

a associação da super-expressão da HER-2, seja também o motivo da observação desse

35

rearranjo em metástases cerebrais de mama, e indicaria um rearranjo clonal

possivelmente herdado das células que iniciaram o processo de metastatização.

3. DELEÇÕES DO GENE TP53

A proteína p53 tem um papel central na modulação de respostas celulares a

estresses citotóxicos, contribuindo para a parada do ciclo celular para o reparo do DNA

ou para a apoptose. A perda de sua função durante a tumorigênese pode levar ao

crescimento celular impróprio, sobrevivência celular aumentada e instabilidade genética

(KIRSCH & KASTAN, 1998). Foi sugerido que a ausência da p53 funcional em

tumores tem influência sobre a eficácia da quimioterapia e radioterapia (CHEENE,

2001). Quando os tipos mais frequentes de tumores são considerados, o gene TP53 está

mutado numa frequência média de 40 a 45% de todos os pacientes, sendo que essas

mutações normalmente correspondem a mutações de ponto ou deleções no cromossomo

17 (17p13) (MOLL et al., 2001, VOGELSTEIN et al., 2001).

Em todos os casos analisados, a deleção do gene TP53 foi a modificação mais

observada, e em quatro deles sobrepujando inclusive o número de núcleos com dois

cromossomos 17 e duas cópias do TP53, considerados como normais. Assim, a maioria

dos núcleos analisados apresentou uma deleção parcial do cromossomo 17 – perda do

segmento 17p13, no qual o TP53 está localizado. Caso seja considerada a hipótese dessa

deleção ter sido herdada do tumor primário, poderíamos argumentar que a deleção do

TP53 estaria relacionada com o prognóstico pobre dos casos em questão, visto que

todos sofreram metastatização após a retirada do tumor primário. Assim, a análise do

cromossomo 17 em tumores primários seria imprescindível para a definição do possível

prognóstico, tanto se considerando o aumento de expressão da proteína HER-2 no caso

de polissomias, como perda de controle do ciclo celular pela deleção do TP53.

36

A relação entre mutações no TP53 e clínica adversa já está bem estabelecida, o

que reflete a importância de sua proteína na regulação e crescimento das células

tumorais. Por exemplo, em estudos citogenéticos moleculares de tumores de baixa

malignidade, como neurocitomas centrais, não foi verificada a ocorrência de deleções

do gene TP53, enquanto em astrocitomas malignos resistentes a diversas terapias são

caracterizados pela inativação da p53 em um estágio precoce de sua evolução (ZHU et

al., 2005; QUINTANA, 2008). Em LMC (leucemia mielóide crônica), embora o início

da doença dependa da junção BCR/ABL, a progressão envolve alterações no TP53

(MITANI, 2001). Em pacientes com LMC, alterações em TP53 são encontradas em

cerca de 30% dos casos, especialmente em crise blástica e os estudos moleculares têm

indicado que em cerca de 25% dos casos em progressão, há inativação do TP53

provocada por rearranjos ou mutações em ponto (GOLONI, 2000, apud FETT-CONTE

& SALLES, 2002). Inclusive, o gene p51/p63, um novo membro da família do TP53,

mapeado em 3q27-9, quando mutado, pode atuar similarmente ao TP53 e ser

potencialmente responsável pela progressão da LMC (YAMAGUCHI et al., 2001). De

acordo com FETT-CONTE & SALLES (2002), a importância médica deste gene é

inegável, primeiro porque a detecção de mutações pode ser indicadora do diagnóstico e

do prognóstico, segundo porque é um alvo perfeito para prevenção, o que estimula as

abordagens de terapia gênica.

Apesar das deleções do TP53 não serem exclusivas de cânceres de mama, e sim

de muitos tipos tumorais, sua detecção pode ser utilizada como indicativo de um

prognóstico pobre e alto risco de metastatização. De fato, o acompanhamento da

anamnese dos pacientes mostra que a sobrevida após a retirada do tumor metastático

variou de somente 12 a 30 meses (apenas uma paciente ainda sobrevive, somando 12

meses após a retirada do tumor metastático, caso CSN155).A presença dessa deleção

37

como a anomalia mais observada em todos os casos de metástase analisados reforça

essa afirmação. Uma importante metodologia que poderia ser utilizada para a

confirmação dessa colocação seria a análise da deleção do TP53 em pacientes com

tumores primários e acompanhamento após a retirada deste.

4. ANEUPLOIDIAS DO CROMOSSOMO 22

Vários estudos relacionam aneuploidias do cromossomo 22, principalmente a

monossomia, como um passo importante na gênese de neoplasias, provavelmente

devido à inativação de genes supressores de tumor situados nesse cromossomo. Pelo

menos utações em um desses genes, NF2, vem sendo citadas como importantes na

gênese da doença genética neurofibromatose tipo 2, além de diversas neoplasias quando

mutado, principalmente em tumores do sistema nervoso, como meningiomas e

schwannomas, mas também em tumores ovarianos, melanomas e tumores de mama

(TROFATTER et al., 1993, LEKANNE et al., 1994, RUTTLEDGE et al., 1994, PAPI

et al., 1995, LINDGREN et al., 1996) . Mutações no NF2 não parecem ter um papel

essencial no surgimento de tumores em mama, fígado ou colo-retais, que normalmente

mostram perda de heterozigosidade nos alelos do cromossomo 22, sugerindo a

existência de um segundo gene supressor de tumor importante nesse cromossomo

(BIANCHI et al., 1994, AKAGI et al., 1995, KANAI et al., 1995). De fato, em um

estudo de 140 tumores primários de mama foi demonstrada a perda de heterozigosidade

(LOH) em 16 locos polimórficos de 22q em 56 amostras (40%). Desses, 11 retiveram a

heterozigosidade para marcadores próximos do NF2, mas apresentaram LOH para

marcadores mais distantes desse gene, reforçando a possibilidade de um segundo gene

supressor de tumor, associado ao câncer de mama. Além disso, comparações desses

38

resultados com dados clínico-histológicos indicaram que a perda alélica de 22q tende a

ocorrer mais frequentemente em tumores de alta malignidade (IIDA et al. 1998).

A deleção do cromossomo 22 foi o rearranjo mais observado nos experimentos

envolvendo sondas dos cromossomos 9/22, em todas as amostras analisadas. Como a

sonda utilizada nas análises deste trabalho correspondia a um gene situado em 22q, as

deleções do cromossomo 22 observadas podem indicar, na verdade, perda de 22q. Além

disso, caso este rearranjo tenha sido herdado clonalmente dos respectivos tumores

primários, estaríamos confirmando os achados de IIDA et al. (1998), que sugerem uma

associação entre essa deleção e tumores de alta malignidade: a ocorrência de metástase

e sobrevida curta dos pacientes dos quais foram coletadas as amostras seriam evidências

dessa alta malignidade.

5. VALOR PROGNÓSTICO DOS RESULTADOS OBTIDOS

Poucos estudos envolvendo tanto tumores primários de mama como suas

metástases foram publicados até o momento. Mesmo assim, podemos concluir que a

LOH de alelos do cromossomo 17 parece ser um fato comum entre os estudos

realizados (PANDIS et al., 1998, TSUDA et al., 1998). Essa perda de heterozigosidade

estaria relacionada principalmente ao 17p, e mais precisamente com o TP53. Apesar de

ainda precisarmos analisar um número amostral maior para confirmarmos esse fato, a

deleção do TP53, presente em todas as amostras de tumores analisadas, é um forte

indício que esse rearranjo poderia estar associado a uma maior malignidade e

consequentemente maior poder de metastatização dos tumores primários que os

originaram, assim como indicador de um prognóstico pobre, visto que a sobrevida de

quatro das cinco pacientes ficou com uma média de 17,4 meses (excluindo-se o caso

39

CSN 155), com a recorrência de metástases cerebrais após a primeira cirurgia de

ressecção das metástases cerebrais.

Entretanto, considerar apenas o gene TP53 como indicador prognóstico do

cromossomo 17 corresponderia a um dado incompleto, já que a confirmação de

polissomias desse cromossomo poderia também influenciar o gene HER-2, que está

também relacionado com a gênese e malignidade de tumores de mama. Dessa forma, o

cromossomo 17 deve ser analisado não só em relação à perda do TP53, mas também em

relação ao ganho de cópias dele, para se ter uma idéia melhor do real prognóstico desse

tumor, e até mesmo de terapias alternativas, considerando-se que os tumores com o

envolvimento do gene HER-2 são sensíveis ao tratamento com trastuzumab (VOGEL et

al., 2002, ROMOND et al., 2005).

Monossomias do cromossomo 22 ainda não são uma constante em estudos de

tumores metastáticos de mama. Entretanto, os estudos vem demonstrando que esse

cromossomo pode ter um papel importante na gênese e evolução tumoral, e que pode

mesmo existir um segundo gene supressor de tumor além do NF2 nesse cromossomo

(IIDA et al. 1998). Talvez a seleção das sondas utilizadas em estudos anteriores tenha

obscurecido a presença de monossomias do cromossomo 22, já que há inúmeros estudos

com sondas loco-específicas e centroméricas do cromossomo 17, porém um número

muito menor de estudo envolvem sondas do cromossomo 22. Dessa forma, tendo em

vista a observação de uma possível relação entre perdas de 22q e aumento de

malignidade em tumores de mama, sugerimos que essa sonda também deva ser utilizada

em análises do grau de malignidade desse tipo de tumor, especialmente em combinação

com as sondas do cromossomo 17, como realizadas no presente trabalho.

Nossos dados enfatizam a importância de rearranjos envolvendo esses

cromossomos, e da análise citogenética de tumores primários como indicador de

40

malignidade e de risco de metastatização em pacientes submetidos a ressecção desses

tumores primários. Um maior número de amostras e a inclusão de dados de tumores

primários poderiam corroborar nossa posição, que, entretanto, já encontra uma grande

concordância e soma seus resultados a estudos anteriores.

41

V. CONCLUSÕES

1. Apesar da contradição com alguns resultados anteriores, que demonstram perdas

de cromossomos 17 como um evento comum em metástases de mama, nossos

resultados foram bastante homogêneos entre as amostras, revelando ganhos de

cromossomo 17. O ganho de cromossomos 17, também já observada em tumores

metastáticos de mama, é relacionada à super-expressão do gene HER-2, fato

envolvido com o aumento da malignidade dos tumores de mama. Sendo assim, a

análise da aneuploidia deste cromossomo pode ser um importante indicador de

malignidade.

2. A deleção do gene TP53 foi a alteração mais observadas nos casos analisados,

demonstrando sua já conhecida importância em processos neoplásicos em geral,

já que está envolvido em várias vias de controle do ciclo celular e da via

apoptótica. Nossos resultados indicam que sua deleção pode ser um indicativo

de diagnóstico pobre, com aumento da malignidade e do poder de

metastatização.

3. Nulissomias ou monossomias do cromossomo 22 representam importantes

alterações citogenéticas na formação de alguns tumores, e tudo indica que as

perdas deste cromossomo apresentam um papel crucial na progressão e

formação de metástases, provavelmente devido à inativação de genes

supressores tumorais nele localizados. Um maior número amostral poderia

confirmar sua participação direta nas vias de progressão metastática.

4. A ocorrência simultânea dos eventos acima citados podem ser os responsáveis

pela manifestação clínica agressiva destes tumores, visto que os pacientes

apresentaram uma baixa sobrevida e reincidência de metástases antes do óbito.

42

IV. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Akagi K, Kurahashi H, Arita N, Hayakawa T, Monden M, Mori T, Takai S-I, Nishisho I (1995): Deletion mapping of the long arm of chromosome 22 in human meningiomas. Int J Cancer 60:178-182. Aman, P (1999). Fusion genes in solid tumours. Sem Cancer Biol 9:303-318. Baker SJ, Preisinger AC, Jessup JM, Paraskeva C, Markowitz S, Wilsson JKV, Hamilton S, Vogelstein B (1990) p53 gene mutations occur in combination with 17p allelic deletions as late events in colorectal tumorigenesis. Cancer Res 50:7717-7722. Bardi G, FengerC, Johansson B,Mitelman F, and Heim S (2004). Tumor Karyotype Predicts Clinical Outcome in Colorectal Cancer Patients. J Clin Oncol 22:2623-2634. Begnami, MD, Palau, M, Rushing, EJ, Santi, M, Quezado, M (2007). Evaluation of NF2 gene deletion in sporadic schwannomas, meningiomas and ependymomas by chromogenic in situ hybridization. Human Pathology 38:1345-1350. Bertram JS (2000). The molecular biology of cancer. Molecular Aspects of Medicine 6: 167-223. Bianchi AB, Hara T, Ramesh V, Gao J, Klein-Szanto AJP, Morin F, Menon AG, Trofatter JA, Gusella JF, Seizinger BR, Kley N (1994): Mutations in transcript isoforms of the nanrofibromatosis 2 gene in multiple human tumour types. Nature Genet 6:185-192. Bose S, Mohammed M, Shintaku P, et al. Her-2/neu gene amplification in low to moderately expressing breast cancers: possible role of chromosome 17/Her-2/neu polysomy. Breast J 2001;7:337–44. Borges-Osório, MR, Robson, WM (2001) Genética Humana. 2ª edição Artmed, Porto Alegre, 299pp. Braga, FM (2005). Metastasis cerebrais. In: SCHOR, N. (Ed.). Guia de medicina ambulatorial e hospitalar da UNIFESP. São Paulo: Manole. p. 119-124. Breivik, J (2005). The evolutionary origin of genetic instability in cancer development. Sem Cancer Biol 15: 51-60. Brem, S, Panattil, JG (2005). An Era of Rapid Advancement: Diagnosis and Treatment of Metastatic Brain Cancer. Neurosurgery 57(5) Supplement:S4-5-S4-9. Cai DX, Banerjee R, scheithauer BW, Lohse CM, Kleinschidt-Demaster BK, Perry A (2000) Chromossome 1p and 14q FISH analysis in clinicopathologic subsets of meningioma: diagnostic and prognostic implications. Journal of neuropathology and experimental neurology. 60: 628-636.

43

Carlson, JA, Healy, K, Tran, TA, Malfetano, J, Wilson, VL, Rohwedder, A, Ross, JS (2000). Chromosome aneusomy detected by Fluorescence in Situ Hybridization in vulvar squamous cell carcinomas and synchronous vulvar skin. Am J Pathol 157: 3-9. Caughron, SK, Bridge, JA, Bewtra, CB, Hunter, WJ, Nelson, M, Soundararajan, S, Silva, E, Gatalica, Z (2005). Monosomy 22 as a diagnostic aid in a case of late recurrence of adult granulosa cell tumor of the ovary. Cancer Genet Cytogenet 156:83-85. Cheene P (2001). Targeting p53 in cancer. Curr Med Chem Anti-Canc Agents 1 (2): 151-161. Cheng, X, Hung, M (2007). Breast cancer brain metástases. Cancer Metastasis Rev, v. 26, p. 635–643. Concin N, Zeillinger C, Tong D, Stimpfl M, König M, Printz D, Stonek F, Schneeberger C, Hefler L, Kainz C, Leodolter S, Haas OA, Zeillinger R (2003). Compararison of p53 Mutational status with mRNA and protein expression in a panel of 24 human breast carcinoma cells lines. Breast Cancer Res Treatment 79: 37-46. Cowell JK, Matsui SI, Wang YD, LaDuca J, Conroy J, McQuaid D, Nowak NJ (2004). Application of bacterial artificial chromosome array-based comparative genomic hybridization and spectral karyotyping to the analysis of glioblastoma multiforme. Cancer Genet Cytogenet 151:36-51 Courjal F, Theillet C (1997): Comparative genomic hybridization analysis of breast tumors with predeterminated profiles of DNA amplification. Cancer Res 57:4368–4377. Deville P, Cornelisse CJ (1994). Somatic genetic changes in human breast cancer. Biochim Biophys Acta 30(2-3): 113-130. Dey, P(2004). Aneuploidy and malignancy: an unsolved equation. J Clin Pathol 57:1245–1249. Diaz jr LA (2005). The current clinical value of genomic instability. Sem Cancer Biol 15:67-71. Downs-Kelly E, Yoder BJ, Stoler M, et al.(2005). The influence of polysomy 17 on HER2 gene and protein expression in adenocarcinoma of the breast: a fluorescent in situ hybridization, immunohistochemical, and isotopic mRNA in situ hybridization study. Am J Surg Pathol 1221–7. Espinosa, AB, Tabernero, MD, Maillo, A, Sayagués, JM, Ciudad, J., Merino, M, Alguero, MC, Lubombo, AM, Sousa, P, Santos-Briz, A, Orfao, A (2006). The cytogenetic relationship between primary and recurrent meningiomas points to the need for new treatment strategies in cases at high risk of relapse. Clin Cancer Res 12 (3): 772-780

44

Evans, DGR, Sainio M, Baser ME (2000). Neurofibromatosis Type 2. J Med Genet 37:897-904

Ewend, MG (2005). Current treatment paradigms for the management of patients with brain metastases. Neurosurgery 57 (5):4466-4477.

Fagin JA (2002). Mechanismis of aneuploidy in thyroid cancercells and tissue: Evidence for mitotic checkpoint disfunction without mutations in BUB 1 and BUBR1, Clinical endocrinology, v. 56, p. 341-350. Fearon ER, Hamilton S, Vogelstein B (1987). Clonal analysis of human colorectal tumors. Science 238:193-197. Fett-Conte, A., Salles, ABCF. (2002). A importância do gene p53 na carcinogênese humana. Rev.bras.hematol.hemote ,24(2):85-89 Fishel R, Lescoe MK, Rao MR, Copeland NG, Jenkins NA, Garber J, et al.(1993). The human mutator gene homolog MSH2 and its association with hereditary nonpolyposis colon cancer. Cell 77:167. Ford, CE, Hamerton, JL (1956). A colchicine, hypotonic citrate, squash sequence for mammalian chromosomes. Stain Technol 31(6): 247-251 Gagos S, Irminger-Finger I (2005). Chromosome instability in neoplasia: chaotic roots to continuous growth. Int J Biochem Cell Biol 37:1014-1033. Gerstner ER, Fine, RL (2007). Increased permeability of the blood-brain barrier to chemotherapy in metastatic brain tumors: establishing a treatment paradigm. J Clin Oncol 25:2306-2312. Gisselsson D (2008). Classification of chromosome segregation errors in cancer. Chromosoma 117(6):511-9. Gollin, S (2005). Mechanisms leading to chromosomal instability. Sem Cancer Biol 15:33-42. Goodison S, Viars C, Urquidi, V (2005). Molecular cytogenetic analysis of a human breast metastasis model: identification of phenotype-specific chromosomal rearrangements. Cancer Genet Cytogenet 156:37-48. Gray, JW, Collins, C (2000). Genome Changes and Gene Expression in Human Solid Tumours. Carcinogenesis 21: 443-452. Gretarsdottir, S (1998). BRCA2 and p53 Mutations in Primary Breast Cancer in Relation to Genetic Instability. Cancer Res 58: 859-862. Gunter C (2001). The molecular genetics of cancer: Down the rabbit hole. Hum Mol Genet 10: 655-656.

45

Hanahn D, Weinberg, RA (2000). The hallmarks of cancer. Cell 100 (1):57-70 Heim S, Mitelman, F (1995). Cancer Cytogenetics. 2ª edition. Wiley-liss, New York, p.369-88. Hollstein, M, Sidransky, D., Vogelstein, B, Harris, CC (1991). P53 mutations in human cancer. Science, 253 (5015): 49-53. Hyun C L, Lee HE, Kim KS, Kim S-W, Kim JK, Choe G and Park SY (2008). The effect of chromosome 17 polysomy on HER-2/neu status in breast cancer. J Clin Pathol 2008;61:317–321. Iida A, Kurose K, Isobe R, Akiyama F, Sakamoto G, Yoshimoto M, Kasumi F, Nakamura I, Emi M (1998). Mapping of a new target region of allelic loss to a 2-cM interval at 22q13.1 in primary breast cancer. Genes Chromosomes Cancer 21:108-112 Kanai Y, Tsuda H, Oda T, Sakamoto M, Hirohashi S (1995): Analysis of the neurofibromatosis 2 gene in human breast and hepatocellular carcinomas. Jpn J Clin Oncol 25:1-4. Kinzler KW, Vogelstein B (1997). Cancer-susceptibility genes. Gatekeepers and caretakers. Nature 386:761–3. Kirsch DG, Kastan MB (1998). Tumor-supressor p53: implications for tumor development and prognosis. J Clin Oncol 16 (9): 3158-3168. Knuutila S, Björkqvist A-M, Autio K, Tarkkanen M, Wolf M, Monni O, Szymanska J, Larramendy ML, Tapper J, Pere H, El-Rifai M, Hemmer S, Wasenius V-M, Vidgren V, Zhu Y (1998). DNA copy number amplifications in human neoplasms. Review of comparative genomic hybridization studies. Am J Pathol 152:1107–1123. Kleihues P, Louis DN, Scheithauer BW, Rorke LB, Reifenberger G, Burger PC, Cavenee WK (2002) The WHO classification of Tumors of the Nervous System. J Neuropathol Exp Neurol 61: 215-225. Kuukasjärvi T, Tanner M, Pennanen S, Karhu R, Visakorpi T, Isola J (1998): Optimizing DOP-PCR for universal amplification of small DNA samples in comparative genomic hybridization. Genes Chromosom Cancer 18:94–101. Larramendy M, Lushnikova T, Björkqvist AM, Wistuba II, Virmani AK, Shivapurkar N, Gazdar AF, Knuutila S (2002). Comparative genomic hybridization reveals complex changes genetic in primary breast cancer tumors and theirs cells line. Cancer Genet Cytogenet 119:132-138. Lekanne Deprez RH, Bianchi AB, Groen NA, Seizinger BR, Hagemeijer A, van Drunen E, Bootsma D, Koper JW, Avezaat CJJ, Kley N, Zwarthoff EC (1994): Frequent NF2 gene transcript mutation in sporadic meningiomas and vestibular schwannomas. Am J Hum Genet 54:1022-1029.

46

Lopes A., Rossi, BM, Nakagawa, WT (1996). Oncologia cirúrgica. In: FUNDAÇÃO ANTÔNIO PRUDENTE. Hospital A. C. Camargo. Manual de condutas diagnósticas e terapêuticas em oncologia. São Paulo: Âmbito, p. 15-22. Malkin D, Jolly KW, Barbier N, Look AT, Friend SH, Gebhardt MC, Andersen TI, Borresen A, Li FP, Garber J, Strong LC (1992). Germline mutations of the p53 tumor suppressor gene in children and young adults with second malignant neoplasms. New Engl J Med 326:1309-1315.

Mamelack AN, Granis F, Morgan Junior R, Pezner RD (2005) Brain metastasis. In: BERGER, M. S.; PRADOS, M. D. (Ed.). Textbook of neuro-oncology. 2nd ed. Philadelphia: Elsevier: Saunders. p. 391, 399.

Marci V, Casorzo L, Sarotto I, Dogliani N, Milazzo MG, Risio M (1998). Gastrointestinal Stromal Tumor, Uncommitted Type, with Monosomies 14 and 22 as the Only Chromosomal Abnormalities. Cancer Genet Cytogenet 102:135–138

Martins JS (2007). Implicações clínicas e econômicas da quimioterapia adjuvante no câncer de mama HER2/neu positivo. Revista Brasileira de Mastologia, 17:97-101.

McCutcheon, IE (2005). Metastic brain tumors. In: Rengachary SS, Ellenbogen RG (Ed.). Principles of neurosurgery. 2nd ed. Philadelphia: Elsevier, Cap. 31.

McDermott, MW (2005). Radiosurgery in metastatic brain cancer. Neurosurgery 47 (5): 4445-4453.

Merola R, Mottolese M, Orlandi G, et al.(2006). Analysis of aneusomy level and HER-2 gene copy number and their effect on amplification rate in breast cancer specimens read as 2+ in immunohistochemical analysis. Eur J Cancer 42:1501–6. Ministério da Saúde, Secretaria Nacional de Assistência à Saúde. Instituto Nacionam de Câncer (INCA). Corrdenação de Prevenção e Vigilância (Conprev) (2002). Atlas de mortalidade por câncer no Brasil 1979-1999 – Rio de Janeiro, 412 p. Os dados desta publicação estão disponíveis no site do INCA: <http.inca.gov.br>. Acesso em 25/04/2007. Mitani K (2001). Disease-related gene and tumor progression. Nippon Rinsho 59:2316- 2321. Mitelman, F (1994). Catalog of Chromosome Aberrations in Cancer. Wiley-Liss, New York. Mitelman, F (2000). Recurrent chromosome aberrations in cancer. Mutation Res, 62:247-253.

47

Moll UM, Erster S, Zaika A (2001). P53, p63 and p-73 solos, alliances and feuds among family members (Biochem Biophys Acta 1552 (2): 47-59. Nussbaum RL, Mcinnes RR, Willard HF (2002). Thompson & Thompson Genética Médica. 6ª edição, Guanabara Koogan S.A., Rio de Janeiro, pp. 274-293. Obara K, Yokoyama M, Asano G, Tanaka S (2001). Evaluation of myc and chromosome 8 copy number in colorectal cancer using interphase cytogenetics. Int J Oncol 18: 233-239. Pandis N, Jin Y, Gorunova L, Petersson C, Bardi G, Idvall I, Johansson B, Ingvar C, Mandahl N, Mitelman F, Heim S (1995) Chromosome analysis of 97 primary breast carcinomas: Identification of eight karyotypic subgroups. Genes Chromosomes Cancer 12:173–185. Pandis N, Teixeira MR, Adeyinka A,Rizou H, Bardi G,Mertens F, Andersen JA, Bondeson L, Sfikas K, Qvist H, Apostolikas N, Mitelman F (1998). Cytogenetic comparison of primary tumors and limph node metastases in breast cancer patients. Genes Chrom Cancer 22 :122-129. Papi L, De Vitis LR, Vitelli F, Ammannati F, Mennonna P, Montali E, Bigozzi U (1995): Somatic mutation in the neurofibromatosis type 2 gene in sporadic maningiomas. Hum Genet 95:347-351. Patel AS, Hawkins AL, Griffin, CA (2000). Cytogenetic and Cancer. Cur Opinion in Oncology 2000, 12:62–67

Peereboom, DM (2005). Chemotherapy in brain metástases. Neurosurgery 57 (5):54-65.

Peña CMM, Castro JLR (2002). Citogenética de tumours sólidos. Iatreia 15 (2). Press MF, Pike MC, Chazin VR, et al. (1993). Her-2/neu expression in node-negative breast cancer: direct tissue quantitation by computerized image analysis and association of overexpression with increased risk of recurrent disease. Cancer Res 53:4960–70. Prosser J, Elder PA, Condie A, et al.(1991). Mutations in p53 do not account for heritable breast cancer: a study in five affected families. Brit J Cancer 1991; 63: 181-84. Qin, L (2002). Chromosomal aberrations related to metastasis of human solid tumors. World J Gastroenterol 8 ( 5):769-776.

Queiroz RY, TÉDDE G (2007). Biópsia do linfonodo sentinela em mulheres com câncer de mama e mamoplastia redutora prévia- Técnica Radioguiada. Rev Bras Mastol 17:61-64.

Quintana, LG (2008). Aplicação da Técnica de AgNOR e de Sondas Loco-Específicas em Tumores do Sistema Nervoso Central. Dissertação de Mestrado, Instituto de Ciências Biológicas, UFPA, Belém-PA.

48

Rabbitts T (1994).Chromosomal translocations in human cancer. Nature 372:143-49. Rajagopalan, H, Lengauer, C (2004). Aneuploidy and Cancer. Nature 432:338-341

Rey, L (1999). Dicionário de termos técnicos de medicina da saúde. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan. p. 502.

Roka S, Fiegl M, Zojer M, Filipits M, Schuster R, Steiner B, Jakesz R, Huber H, Drach J (1998). Aneuploidy of chromosome 8 as detected by interphase fluorescence in situ hybridization is a recurrent finding in primary and metastatic breast cancer. Breast Cancer Res Treat 48: 125-133.

Romond EH, Perez EA, Bryant J, Suman, VJ, Geyer, CE et al (2005). Trastuzumab plus adjuvant chemotherapy for operable HER2-positive breast cancer. N Engl J Med 353:1673–84. Ruttledge MH, Sarrazin J, Rangaratnam S, Phelan CM, Twist E, Merel P, Delattre O, Thomas G, Nordenskj61d M, Collins VP, Dumanski JP, Rouleau GA (1994): Evidence for the complete inactivation of the NF2 gene in the majority of sporadic meningiomas. Nature Genet 6:180-184. 18. Sandberg AA (1994). Cancer cytogenetics for clinicians. Cancer J Clin 1994; 44 :136-159. Scwab M (1999). Oncogene amplification in solid tumors. Semin Cancer Biol 9: 303-318. Shaeknev SE, Shaeknev IV (1997). Common patterns of genetic evolution in human solid tumors. Cytometry 29: 1-27. Sills AK (2005). Current treatment approaches to surgery for brain metástases. Neurosurgery 57: 4424-4432 Slamon DJ, Clark GM, Wong SG, et al (1987). Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene. Science 235:177–82. Slovak ML (1996): Breast tumor cytogenetic markers. In: Human Cytogenetic Markers. SR Wolman, S Sell, eds. Humana Press Inc., Totowa, NJ, pp. 111–149.

Snustad P, Simmons MJ (2001). Fudamentos de Genética: 2ª edição, Guanabara koogan S. A., Rio de Janeiro, PP. 655-673.

Sorensen, PHB, Triche, TJ (2000). Gene fusions encoding chimaeric transcription

factors in solid tumours. Sem Cancer Biol 7:3-14.

49

Stumm M, Wegner, RD, Bloechle, M, Eckel, H (2006). Interphase M-FISH applications using commercial probes in prenatal and PGD diagnostics. Cytogenet Genome Res 114:296–301. Swensen, R, Kirsch W (2002). Brain Neoplasms in Women:A Review. Clin Obst and Gynec 45: 904–927 Tandon AK, Clark GM, Chamness GC, et al. (1989). HER-2/neu oncogene protein and prognosis in breast cancer. J Clin Oncol 7:1120–8. Tanner M, Gancberg D, Di Leo A, et al. (2000) Chromogenic in situ hybridization: a practical alternative for fluorescence in situ hybridization to detect HER-2/neu oncogene amplification in archival breast cancer samples. Am J Pathol 157:1467–72. Teixeira MR, Pandis N, Bardi G, Andersen JA, Heim S (1996). Karyotypic comparisons of multiple tumorous and macroscopically normal surrounding tissue samples from patients with breast cancer. Cancer Res 56:855–859. Trofatter JA, MacCollin MM, Rutter JL, Murrel JR, Duyao MP, Parry DM, Eldridge R, Kley N, Menon AG, Pulaski K, Haase VH, Ambrose CM, Mnnroe D, Bove C, Haines JL, Martuza RL, MacDonald ME, Seizinger BR, Short MP, Buckler AJ, Gusella JF (1993): A novel moesin-, ezrin-, radixin-like gene is a candidate for the neurofibromatosis 2 tumor suppressor. Cell 72:791-800. Vogel CL, Cobleigh MA, Tripathy D, et al.(2002). Efficacy and safety of trastuzumab as a single agent in first-line treatment of HER2-overexpressing metastatic breast cancer. J Clin Oncol 20:719–26. Vogelstein B, Fearon ER, Hamilton SR, Kern SE, Preisinger AC, Leppert M, et al. (1988). Genetic alterations during colorectal-tumor development. N Engl J Med 319:525-532 Vogelstein B, Lane D, Levine AJ (2000). Surfing the p53 network. Nature 408 (6810): 307-310. Walch AK, Zitzelsberger HF, Karin Bink K, Hutzler P, Bruch J, Braselmann H, Aubele MM, Mueller J, Stein H, Siewert JR, Hoffler H, Werner M (2000). Molecular Genetic Changes in Metastatic Primary Barrett’s Adenocarcinoma and Related Lymph Node Metastases: Comparison with Nonmetastatic Barrett’s Adenocarcinoma. Mod Pathol 13(7):814–824 Ward, LS (2002). Entendendo o processo molecular da tumorigênese. Arq Bras Endocrinol Metab 46, 4. Weinberg RA (2008). Biologia do Cancer. Artmed, 864 p. Wang S, Hossein Saboorian M, Frenkel EP, et al. (2002). Aneusomy 17 in breast cancer: its role in HER-2/neu protein expression and implication for clinical assessment of HER-2/neu status. Mod Pathol 15:137–45.

50

Watters AD, Going JJ, Cooke TG, Bartlett JMS (2003). Chromosome 17 aneusomy is associated with poor prognostic factors in invasive breast carcinoma. Breast Cancer Research and Treatment 77: 109–114. Yamaguchi H, Inokuchi K, Sakuma Y (2001)Mutation of the p51/p63 gene is associated with blastic crisis in chronic myelogenous leukemia.Leukemia, 2001. 15: 1729-1734. Young, RJ (2005). Neuroimagin of metastatic brain tumors disease. Neurosurgery 57 (5): 5411-5423.

Young B, Patchell, RA (1996). Brain metastases. In: Youmans, JR (Ed.). Neurological surgery. 4th ed. Philadelphia: W. B. Sauders. Cap. 125.

Zhao J, Wu R, Au A, et al. Determination of HER2 gene amplification by chromogenic in situ hybridization (CISH) in archival breast carcinoma. Mod Pathol 2002;15:657–65. Zhu Y,Guignard F, Zhao D,Liu L, Burns DK, Mason RP, Messing A, Parada LF (2005). Early inactivation of p53 tumor suppressor gene cooperating with NF1 loss induces malignant astrocytoma. Cancer Cell 8:119-130.

51

ANEXO I: APROVAÇÃO PELO COMITÊ DE ÉTICA

52

ANEXO II: TERMO DE LIVRE CONSENTIMENTO

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

A Universidade Federal do Pará, em colaboração com o Hospital Universitário João de Barros Barreto - HUJBB, está desenvolvendo uma pesquisa que permitirá conhecer melhor os mecanismos que ocasionam o desenvolvimento de tumores do sistema nervoso, através da identificação das alterações genéticas associadas ao quadro clínico do paciente e exame histopatológico. Estes estudos são realizados em pequenos fragmentos de tecido estomacal removido por cirurgia ou por exame endoscópico e oferecem novas possibilidades de diagnóstico.

Você está sendo admitido (a) neste Hospital, para estabelecimento de diagnóstico e/ou tratamento de algum tumor de sistema nervoso e há a necessidade da remoção de material biológico relacionado à esta enfermidade. Parte do material retirado será encaminhado para exames laboratoriais, necessários para o diagnóstico definitivo. O restante do material não utilizado é armazenado para novos exames, se necessário.

A obtenção do fragmento de tecido tumoral para pesquisa não implicará em riscos adicionais no seu tratamento ou na sua cirurgia, nem em aumento no tempo do exame ou cirurgia. O fragmento de material biológico será identificado no laboratório por um código formado por números e letras, preservando sua privacidade e identidade. A eventual inclusão dos resultados em publicação científica será feita de modo a garantir o anonimato do paciente.

É necessário esclarecê-lo (a) que não existem benefícios ou direitos financeiros a receber sobre os eventuais resultados decorrentes da pesquisa. Se você não concordar em doar o material para pesquisa, sua decisão não influenciará, de nenhum modo, no seu atendimento ou tratamento.

Caso você tenha alguma dúvida sobre este documento ou em relação a pesquisa, por gentileza, entre em contato com o Prof. Dr. Edivaldo H.C. de Oliveira ou com o Prof. Dr. Nilson P. Anselmo, através dos telefones 3183-1568 ou 3183-1558.

Uma cópia deste documento será arquivada em seu prontuário e, se desejar, uma cópia lhe será fornecida.

Declaro estar ciente das informações prestadas, tendo lido atentamente e concordado com o teor, e autorizo a utilização de amostras de tecido retiradas de meu organismo.

Belém, ............ de .............................................. de ....................

---------------------------------------------------------------------------- Assinatura do Paciente ou Responsável

Nome: ........................................................................................................................ RG: ...........................................................

53

ANEXO III: DADOS CLÍNICOS – ANAMNESE

GOVERNO DO ESTADO DO PARÁ SECRETARIA DE ESTADO DE SAÚDE PÚBLICA

HOSPITAL OPHIR LOYOLA

CSN 037 (Iniciais: HSBD, 23 anos). Adenocarcinoma metastático (mama), cirurgia dia : 28/07/2005, Reg.59.339. Dr. Douglas Vasconcelos. Paciente foi submetida a ressecção de adenocarcinoma de mama esquerda há 5 meses, há 3 semanas, vem evoluindo com cefaléia persistente a direita e teve dois episódios de crises convulsivas. Realizou CT e RM de encéfalo que demonstrou processo expansivo temporal direito. Foi operada em 28 de julho 2005 através de craniotomia aos moldes clássicos e ressecado o tumor completamente. Foi encaminhada a radioterapia de cérebro total. Não houve recidiva até dezembro de 2007. Em fevereiro de 2008, reinternou com múltiplos focos de metástases cerebrais, indo a óbito 3 semanas após. CSN 099 (Iniciais: FCL, 54 anos). Adenocarcinoma metastático (mama), cirurgia dia : 06/06/2006, Reg.80.883. Dr. Douglas Vasconcelos. Paciente procurou o serviço ambulatorial de neurocirurgia, encaminhada do serviço de mastologia, com cefaléia de forte intensidade, e hemiparesia esquerda de moderada intensidade, realizou CT e RM de encefálo as quais demonstraram grande processo expansivo parietoocciptal direito único, subcortical, grande edema vasogênico e hipercaptante do meio de contraste. Foi submetida a craniotomia parietooccital direita, com remoção do tumor, sendo seu exame histológico revelando adenocacinoma ductal. Assim foi encaminhada à radioterapia de cérebro total. A paciente obteve total melhora, logo após a cirurgia e manteve-se também até o termino da radioterapia. Um ano e meio após, retornou com crises convulsivas. Durante a investigação com RM de encéfalo, foi diagnosticada a presença de metástases múltiplas. Um RX de tórax demonstrou focos pulmonares. A paciente recebeu corticóide e faleceu 3 semanas depois. CSN 133 (Iniciais: MAS, 45 anos). Metástase de Adenocarcinoma ductal, Cirurgia dia; 30/03/2007, Reg. 129.726, Dr. Douglas Vasconcelos. Paciente apresentando cefaléia holocraniana persistente de moderada intensidade, e hemeparesia esquerda grau IV. Foi investigada com CT e RM de Encéfalo, as quais demonstraram tumor intraaxial frontoparietal em hemisfério cerebral Direito. Foi operada com ressecção total havendo grande melhora clínica, a seguir encaminhada para a radioterapia de cérebro total. A paciente retornou à consulta, três meses após sem sinais de recidiva. Em 02/2008 retornou com um episódio de crise convulsiva e na RM constataram-se múltiplos focos de metástases. Sua família optou por levá-la ao interior. Até agora não temos notícia. CSN 134 (Iniciais: RSP, 46 anos). Metástase de Adenocarcinoma de mama, cirurgia dia: 10/04/2007, Reg. 79575, Dr. Douglas Vasconcelos. Paciente apresentando cefaléia de forte intensidade, há 3 meses, com piora rapidamente progressiva há 2 semanas. Evoluiu com rebaixamento do nível de consciência. CT e RM de encéfalo: tumor cerebral intraaxial temporoparietal direito, com edema perilesional e efeito de massa. Foi operada com boa evolução. Encaminhada à radioterapia, realizou

54

doze sessões de 45 CG, de cérebro total. Houve grande melhora clínica. Retornou 2 meses em consulta assintomática. Em agosto de 2008 retornou com hemeparesia esquerda, CT e RM de encéfalo grande tumor, com efeito de massa. Família optou por não reoperar. Foi a óbito 3 semanas depois. CSN 155 (Iniciais LSC, 50 anos). Metástases de adenocarcinoma de mama ductal invasivo. RG: 1180053, operada em 18/01/2008, Dr Douglas Vasconcelos. Cefaléia freqüente, de moderada intensidade há um mês, vem evoluindo com piora clínica, crises convulsivas e hemiparesia direita. Realizou CT e RM que demonstraram processo expansivo parietotempopral esquerdo com efeito de massa. Foi operada com boa evolução, com remissão dos sinais e sintomas. Foi encaminhada à radioterapia de cérebro total. Retornou 4 semanas, após a radioterapia, sem sintomas. Até o momento não retornou mais.

55

ANEXO IV: IMAGENS REPRESENTATIVOS DOS EXPERIMENTOS DE I-FISH E SUA INTERPRETAÇÃO.

Figura 1: Hibridização in situ fluorescente dual color em núcleos interfásicos (9q37-vermelho/22q11-verde). A) núcleo normal com duas marcações de cada sonda; B) duas marcações do 9 e uma do 22; C) cinco marcações do 9 e três do 22; D) duas marcações do 9 e nenhuma do 22.

Figura 2. Hibridização in situ fluorescente dual color em núcleos interfásicos (TP53 vermelho/ CEP17 verde.): A) núcleo normal com duas marcações de cada sonda; B) uma marcação do cen17 e uma do TP53; C) duas marcações do centrômero, nenhuma do TP53; D) duas marcações do cen17 e uma do TP53.

A

C

C

B

D

D

A B

Livros Grátis( http://www.livrosgratis.com.br )

Milhares de Livros para Download: Baixar livros de AdministraçãoBaixar livros de AgronomiaBaixar livros de ArquiteturaBaixar livros de ArtesBaixar livros de AstronomiaBaixar livros de Biologia GeralBaixar livros de Ciência da ComputaçãoBaixar livros de Ciência da InformaçãoBaixar livros de Ciência PolíticaBaixar livros de Ciências da SaúdeBaixar livros de ComunicaçãoBaixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNEBaixar livros de Defesa civilBaixar livros de DireitoBaixar livros de Direitos humanosBaixar livros de EconomiaBaixar livros de Economia DomésticaBaixar livros de EducaçãoBaixar livros de Educação - TrânsitoBaixar livros de Educação FísicaBaixar livros de Engenharia AeroespacialBaixar livros de FarmáciaBaixar livros de FilosofiaBaixar livros de FísicaBaixar livros de GeociênciasBaixar livros de GeografiaBaixar livros de HistóriaBaixar livros de Línguas

Baixar livros de LiteraturaBaixar livros de Literatura de CordelBaixar livros de Literatura InfantilBaixar livros de MatemáticaBaixar livros de MedicinaBaixar livros de Medicina VeterináriaBaixar livros de Meio AmbienteBaixar livros de MeteorologiaBaixar Monografias e TCCBaixar livros MultidisciplinarBaixar livros de MúsicaBaixar livros de PsicologiaBaixar livros de QuímicaBaixar livros de Saúde ColetivaBaixar livros de Serviço SocialBaixar livros de SociologiaBaixar livros de TeologiaBaixar livros de TrabalhoBaixar livros de Turismo