Análise da superexpressão de chaperonas moleculares de cana-de-açúcar em Arabidopsis thaliana como

modelo para o estudo da influência destas proteínas na produção de biomassa

Aluna: Danieli Cristina GonçalvesOrientador: Carlos Ramos – Instituto de Química (IQ)Co-orientador: Gonçalo Pereira – Instituto de Biologia (IB)

MARÇO/2010

Tópicos AbordadosTópicos Abordados

• Introdução– Chaperonas– Chaperonas e Plantas– Produção de Biomassa

• Resultados anteriores• Objetivos• Metodologia• Resultados• Próximos passos

AsAs ChaperonasChaperonas

• Proteína – estrutura tridimensional!!• Ambiente celular não favorece o

enovelamento e estabilidade…• Chaperonas:

– Ligação e estabilização– Translocação– Desagregação– Renovelamento– Entrega para proteólise

CONTROLE DE

QUALIDADE

AsAs ChaperonasChaperonas

• Regulação de vias!!– Função protéica (correto enovelamento)– Disponibilidade (estabilidade e degradação)

• Expressão: estresse e constitutiva!• Classificadas em famílias, de acordo a massa

molecular– Muito conservada entre eucariotos

AsAs ChaperonasChaperonas

Adaptado de Borges & Ramos, 2005

ChaperonasChaperonas ee PlantasPlantas

• Organismos sésseis– Estresses ambientais: temperatura, salinidade,

metais pesados, deficiência hídrica.– Sobrevivência e produtividade!!

FormaçãoFormação dada MadeiraMadeira

• Xilogênese– Divisão, expansão, deposição de parede

lignificada e morte celular.– Expressão diferencial espacial e temporal

• Qualidade da madeira:– Dimensão dos elementos anatômicos, balanço

dos constituintes (celulose, hemicelulose, lignina)

FormaçãoFormação dada MadeiraMadeira

Adaptado de Hertzberg et al, 2001

FormaçãoFormação dada MadeiraMadeira

• Qual o papel das chaperonas neste processo??

– Chaperonas são mais expressas na diferenciação do xilema do que em outros tecidos;

– Expressão de smHsp diminuída em resposta a compressão mecânica (+ lignina);

– Chaperonas Hsp70, Hsp60, Hsp90 e smHsps com maior nível de expressão no xilema de Eucalyptus;

EucalyptusEucalyptus

• Espécies do gênero Eucalyptus - plantações industriais– E. grandis e E. urophyla – rápido

crescimento e adaptabilidade– E. globulus – alto teor de celulose e

menor conteúdo de ligninas– E. pellita - menor valor comercial; alto

conteúdo de ligninas

ResultadosResultados AnterioresAnteriores

• Genolyptus:– Maior expressão de Hsp70 e smHsp no xilema de E.

globulus• Microarranjos:

– Hsp100 e Hsp90 com maior expressão no xilema de E. globulus

• cDNAs chaperonas:– Proteínas já expressas em E. coli;– Caracterização biofísica realizada;

ResultadosResultados AnterioresAnteriores

• Identidade entre as proteínas:– smHsp - 70%– Hsp70 - 94%– Hsp100 - 85%– Hsp90 - 92%

ObjetivosObjetivos

• Análise do banco Genolyptus:– Perfil da expressão de chaperonas e co-chaperonas nas

diferentes espécies e tecidos

• Superexpressão as chaperonas Hsp100, Hsp82, Hsp70 e smHsp (de cana de açúcar) em planta-modelo (Arabidopsis thaliana)

MetodologiaMetodologia

• Como controle negativo, utilizaremos o vetor ‘vazio’

Subclonagem dos cDNAs em vetor binário

Transformação de A. thaliana

Cultivo de A. thaliana

Avaliação dos efeitos da

superexpressão

Fenótipo

Anatomia

Composição

Metodologia:Metodologia: SubclonagemSubclonagempET28a-HSP PCR HSP pGEM-HSP

Metodologia:Metodologia: TransformaçãoTransformação

• Via A. tumefaciens.• Transformação in planta:

solução contendo A. tumefaciens borrifada sobre plantas no estágio inicial de florescimento

MetodologiaMetodologia: AvaliaçãoAvaliação dosdos transgênicostransgênicos

• Fenotípica

• Anatomia do caule– Coloração com Safranina-O e Azul de Astra: conteúdos de

celulose e lignina e distribuição no tecido

• Composição– Ligninas e carboidratos – dosagem e HPLC

Fonte: Srebotnik & Messner, 1994

ResultadosResultados

• Construção do ‘vetor vazio’

35S Poli A

pCAMBIA

1539 / 7914 1370 / 8083

1000

2000

5000

ResultadosResultados

• Subclonagem da Hsp82– PCR OK!– Ligação no pGEM OK!

• pGEM – 3000 pb• Hsp82 – 2100 pb

– Sequenciamento OK!– Ligação no pRT100

pGEM-Hsp821 2 3 4 M

1000

2000

3000

5000

Legenda:

1) Não digerido

2) XhoI e BamHI

3) BamHI

4) XhoI

ResultadosResultados

• Cultivo de A. thaliana– Problemas com o subtrato;

PróximosPróximos PassosPassos

• Finalizar a subclonagem da Hsp82• Iniciar a subclonagem das outras Hsps• Transformar A. thaliana• Análises:

– Fenotípicas– Anatômicas– Químicas

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Obrigada!!