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Universidade Federal Fluminense
ANA ALVES MACEDO
AÇÃO DA VITAMINA C NO PROCESSO FIBRINOLÍTICO IN VITRO
Niterói / Rio de Janeiro2009
ANA ALVES MACEDO
AÇÃO DA VITAMINA C NO PROCESSO FIBRINOLÍTICO IN VITRO
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Patologia da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre.Área de Concentração - Patologia Investigativa.
Orientadora (s): Profª Dra Hye Chung Kang Profª Drª Beatriz Guitton Renaud Baptista de Oliveira
Niterói / Rio de Janeiro2009
Ana Alves Macedo
AÇÃO DA VITAMINA C NO PROCESSO FIBRINOLÍTICO IN VITRO
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação em patologia da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre.Área de Concentração - Patologia Investigativa.
Aprovada em fevereiro de 2009
BANCA EXAMINADORA
Profª. Dr ª Helena Carla Castro Cardoso de AlmeidaUniversidade Federal Fluminense
( Examinador prévio)
Prof. Dr. Robson de Queiroz MonteiroUniversidade Federal do Rio de Janeiro
Dr ª Débora Galvão MoreiraInstituto de Traumato-ortopedia
Dr ª Georgina Severo RibeiroUniversidade Federal Fluminense
(Suplente)
Dr ª Maria de Fátima Batalha de MenezesInstituto Nacional do Câncer
(Suplente)
Às crianças do INCA e a todas as crianças que sofrem e lutam dia a dia contra o Câncer. Que este trabalho possa trazer contribuições para diminuir seus sofrimentos e ajudá-las a
atravessar esta difícil e longa estrada com mais serenidade.
À minha filha Júlia, pelos momentos que deixamos de estar juntas, por todas as brincadeiras que não brincamos e por todos os passeios que não fizemos.
Querida, este trabalho é para ajudar crianças como você continuarem brincando e juntas de suas mães.
Ao meu esposo Marcio Bomboni pela paciência, por tantos momentos roubados e por ter me ensinado que a vitória tem de ser conquistada.
Aos meus pais, alicerce de minha trajetória.
Ao meu irmão Cefas, que nos últimos anos, foi um dos meus grandes motivadores, me fazendo reafirmar o meu propósito de sempre fazer o meu melhor como enfermeira.
À minha grande família, pelo incentivo que me deram ao longo de minha vida e trajetória profissional;
Agradecimentos
A DEUS, por todas as coisas que me tem dado, que me permitiu existir e trilhar este caminho. Obrigado Senhor pelos encontros e desencontros nesta jornada, que me ensinaram
como ser e como não ser como mestre e como ser humano.
A Hye Chung Cang, minha querida orientadora que acreditou neste trabalho e com sua sabedoria oriental, sempre me acalmou e motivou quando o experimento não dava certo;
À Beatriz Guitton, minha orientadora que me deu oportunidade de realizar esta pesquisa;
À minha chefe Ailse Bittencoutt, que me liberou possibilitando a realização desta tese;
À Dra Eliane Pedra Dias pela oportunidade de inserção de enfermeiras neste maravilhoso mundo da PATOLOGIA;
À Ana Paula Kelly, minha amiga e substituta;
À Rosangela Brandão, minha querida secretária pelo apoio e carinho em todas as horas;
À querida Tereza, secretária sempre eficiente e solidária. Pronta para nos ouvir mesmo que os problemas fossem pessoais. Obrigado pelo carinho;
Aos funcionários da pediatria, que entenderam minha ausência durante estes dois anos;
À Dra Hilda, que gentilmente autorizou a realização de exames no laboratório do INCA e à querida Mercedes, pelo carinho e colaboração na realização dos exames;
À querida Simone Almeida, que com sua competência, possibilitou minha ausência na UTI Pediátrica;
Ao Prof. Porfírio, pelas valiosas contribuições que demonstraram o grande mestre que é;
Ao Professor Pedro Barbosa e Luciene Barbosa, pela ajuda nas análises estatísticas;
Aos Colegas da turma de mestrado 2007, que sempre me motivaram a prosseguir. Foi maravilhoso conhecer vocês. Em especial; Ana Denise, Ana Carolina, Terezinha, Tatiana,
Andréa, Samira, Fernanda, Midore. Com eles celebro este momento;
À Mariana Ferreira (UFF) que sempre se mostrou solícita;
Aos alunos Ana, Tiago, Mariane e Tainá, pela ajuda no laboratório, e em especial a companheira Magali Rezende; e a todos os Voluntários que concordaram gentilmente em
participar deste trabalho.
RESUMO
O cateter venoso central de longa permanência é um dispositivo indicado, em
algumas situações, para pacientes em uso de quimioterapia, a qual pode, por sua
vez, exigir freqüentes hemotransfusões. Entretanto, este dispositivo pode apresentar
oclusões por trombos. O trombolítico de escolha para recuperação da funcionalidade
do cateter é a Estreptoquinase, que apresenta risco e custo elevados. Há mais de 10
anos, enfermeiras utilizam a Vitamina C empiricamente na desobstrução destes
cateteres, com resultados positivos. O objetivo desta pesquisa foi analisar a ação da
vitamina C sobre os trombos sanguíneos, estabelecendo um modelo in vitro de
coagulação e fibrinólise. A metodologia utilizada foi um estudo experimental in vitro
(aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Medicina e do
Hospital Universitário Antônio Pedro/HUAP, sob número 153/07), que utilizou
sangue total de 10 voluntários sadios e 13 pools de plasmas citratados. Os
resultados revelaram redução nos valores de Dímeros D com significância estatística
quando tratado com vitamina C antes da formação do coágulo, e também, na
primeira e na segunda hora, após ocorrer o processo de coagulação. Nos estudos
utilizando pool de plasmas, diferença significativa foi observada somente na primeira
hora. O peso do coágulo do sangue total apresentou redução significativa somente
quando tratado com vitamina C antes do processo de coagulação, enquanto com o
pool não houve diferença significativa. A morfologia do coágulo tratado com vitamina
C mostrou intensa autólise na região periférica formando uma espécie de cápsula ao
redor da estrutura e pequena quantidade de fibrina na região central, enquanto o
coágulo tratado com solução salina apresentou moderada quantidade de fibrina em
toda área observada. Concluiu-se que a vitamina C atua com maior intensidade na
etapa pré-formação do coágulo, alterando a sua estrutura. No coágulo já formado, a
redução na geração do Dímero D até a segunda hora sugere uma inibição do
processo fibrinolítico porém, à medida que o ácido ascórbico vai perdendo sua
atividade estes valores se igualaram ao controle. Mesmo havendo necessidade de
maiores estudos sobre seu mecanismo de ação, estes resultados demonstraram que
a vitamina C interfere no processo de coagulação, o que explicaria sua atividade na
desobstrução de cateteres venosos.
Palavras-chaves: Ácido ascórbico, Coagulação sanguínea; Cateter; Fibrinólise; Enfermagem
ABSTRACT
The long-term central venous catheter is a device indicated, in some circumstances,
for patients under chemotherapy use, which can, by its turn, require frequent
hemotransfusions. However, this device can present occlusions due to thrombi. The
thrombolitical agent of choice for recuperation of the catheter functioning is the
Streptokinasis, that presents risks and elevated costs. For more than 10 years,
nurses utilize the Vitamin C empirically in these catheters disoclusion, with positive
results. The objective of this research was to analyze the vitamin C action on the
blood thrombi, establishing a model in vitro of coagulation and fibrinolysis. The
methodology used an experimental study in vitro (approved by the Ethical Committee
on Research of the Faculdade de Medicina e do Hospital Universitário Antônio
Pedro/HUAP, under number 153/07), that utilized total blood of 10 healthy volunteers
and 13 pools of citrated plasmas. The results revealed reduction in the D-Dimer
values with statistical significance when treated with vitamin C before the clot
formation, and also, in the first and second hours, after occurring the clot formation
process. In the studies using pool of plasmas, significant difference was only
observed when treated with vitamin C before the clot formation process, while with
the pool there was not significant difference. The clot morphology treated with vitamin
C showed intense autolysis in the peripheral region forming a species similar to a
capsule surrounding of the structure and small amount of fibrina in the central region,
while the clot treated with saline solution presented moderate amount of fibrina in the
whole observed area. It concludes that the vitamin C actuates with more intensity in
the clot pre-formation, altering its structure. In the clot just formed, the reduction in
the Dimer-D generation until the second hour suggests a fibrinolytic process
inhibition but, while the ascorbic acid loose its activity, these values equalize to the
control. Even having need of more studies about its action mechanism, these results
showed that the vitamin C interfere in the clot process, that explain its activity in the
venous catheters disobstruction.
Keywords: Ascorbic acid, blooding coagulation; Catheter; Fibrinolysis; Nursing .
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
A.D.P. Adenosina Difosfato
C.V.C. Cateter Venoso Central
C.V.C.L.P. Cateter Venoso Central de Longa Permanência
C.V.C.L.P.T.I. Cateter Venoso Central de Longa Permanência Totalmente Implantado
F.T. Fator Tecidual
M.E.C. Matriz Extracelular
PAIs Inibidores do Ativador de Plasminogênio
C.C.I.P. Cateter Central de Inserção Periférica
T.V.P. Trombose venosa profunda
f.VW Fator de Von Wilebrand
A.A. Ácido Ascórbico
tPA Ativador do Plasminogênio Tecidual
Fig. Figura
NaCl Cloreto de Sódio
UFF Universidade Federal Fluminense
LISTA DE ILUSTAÇÕES
GráficosGráfico 1 Atuação da Vitamina C no fVW, na atividade plaquetária, no t-PA, e
PAI-I....................................................................................................
49
Gráfico 2 Evolução dos valores de Dímero D dos coágulos com sangue
total......................................................................................................
68
Gráfico 3 Evolução dos valores de peso dos coágulos com sangue total.......... 71
LâminasLâmina 1 Imprint de coágulo tratado com vitamina C após a coagulação
corado com May-Grunwald Giemsa...................................................
74
Lâmina 2 Região periférica do coágulo tratado com vitamina C corada com
H.E......................................................................................................
75
Lâmina 3 Região periférica do coágulo tratado com solução salina corada
com H.E..............................................................................................
75
Lâmina 4 Região central do coágulo tratado com vitamina C corada com
H.E......................................................................................................
76
Lâmina 5 Região central do coágulo tratado com solução salina corada com
H.E......................................................................................................
76
Lâmina 6 Região periférica do coágulo tratado com vitamina C corada com
PAS.....................................................................................................
77
Lâmina 7 Região periférica do coágulo tratado com solução salina corada
com PAS.............................................................................................
77
Lâmina 8 Região central do coágulo tratado com vitamina C corada com
PAS.....................................................................................................
78
Lâmina 9 Região central do coágulo tratado com solução salina corada com
PAS.....................................................................................................
78
Lâmina 10 Região periférica do coágulo tratado com vitamina C corada com 79
Tricrômio de Masson...........................................................................Lâmina 11 Região periférica do coágulo tratado com solução salina corada
com Tricrômio de Masson...................................................................
79
Lâmina 12 Região central do coágulo tratado com vitamina C corada com
Tricrômio de Masson...........................................................................
80
Lâmina 13 Região central do coágulo tratado com solução salina corada com
Tricrômio de Masson...........................................................................
80
FigurasFigura 1 Criança com Cateter Venoso Central de Longa Permanência semi-
implantado..........................................................................................
20
Figura 2
(A,B e C)
Cateteres de longa permanência. Totalmente implantado, Semi-
implantado e de Inserção Periférica....................................................
22
Figura 3 Adesão e agregação plaquetárias....................................................... 29Figura 4 Atividades Pró e anticoagulantes das células endoteliais................... 31Figura 5 Cascata de coagulação mostrando vias intrínseca e
extrínseca............................................................................................
33
Figura 6 Sistema fibrinolítico mostrando ação sobre o trombo......................... 34Figura 7 Degradação do fibrinogênio e da fibrina............................................. 36Figura 8 Estrutura química da Vitamina C......................................................... 44Figura 9 Tubos de teste com sangue total. Adição de vitamina C e solução
salina antes da coagulação.................................................................
70
Figura 10 Tubos de teste com pool de plasma tratados com vitamina C e
solução salina antes da coagulação...................................................
73
Figura 11 Fibrina retirada dos tubos com pool de plasma tratados antes da
coagulação..........................................................................................
74
TabelasTabela 1 Exames laboratoriais dos voluntários (n=10)...................................... 66Tabela 2 Valores de Dímero D das amostras tratadas com sangue total.......... 67Tabela 3 Valores de Dímero D das amostras tratadas com pool de
plasmas...............................................................................................
69
Tabela 4 Peso do coágulo obtido das amostras de sangue total nos testes
realizados com vitamina C e solução salina.......................................
70
Tabela 5 Peso do coágulo obtido das amostras de pool de plasma nos testes
realizados com vitamina C e solução salina.......................................
72
SUMÁRIO
1-INTRODUÇÃO................................................................................................. 13 JUSTIFICATIVA................................................................................................ 18
2- REFERENCIAL CIENTÍFICO......................................................................... 19 2.1- CATETER VENOSO CENTRAL ............................................................ 20 2.2- HEMOSTASIA NORMAL........................................................................ 26 2.3- FIBRINÓLISE......................................................................................... 34 2.4- ASPECTOS MORFOLÓGICOS DO TROMBO...................................... 38 2.5- DROGAS USADAS NA PERMEABILIDADE DOS C.VC.L.P................. 38 2.6-VITAMINA C............................................................................................ 43
3-HIPÓTESE....................................................................................................... 50
4-OBJETIVOS..................................................................................................... 52 4.1- GERAL...................................................................................................... 53 4.2-ESPECÍFICOS........................................................................................... 54
5- MATERIAL E MÉTODOS............................................................................... 55
6- RESULTADOS............................................................................................... 64 6.1- RESULTADOS LABORATORIAIS DO DIMERO D................................. 66 6.2- RESULTADOS DOS PESOS DOS COÁGULOS.................................... 69 6.3 -MORFOLOGIA DOS COÁGULOS FORMADOS APÓS ADIÇÃO DE
VITAMINA C E SOLUÇÃO SALINA....................................................................74
7- DISCUSSÃO................................................................................................... 81
8- CONCLUSÃO................................................................................................. 90
9- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................... 93
10- ANEXOS....................................................................................................... 102
11- APÊNDICE................................................................................................ 109
INTRODUÇÃO
1- INTRODUÇÃO
O câncer infantil tem alcançado grande aumento nos índices de cura nos
últimos anos, principalmente quando tratado em centros especializados que dispõem
de suporte necessário para a abordagem terapêutica que esta patologia exige. O
tratamento, porém é complexo e envolve a utilização de três modalidades básicas,
sendo elas: cirurgia, quimioterapia e radioterapia (DE CAMARGO e LOPES, 2000).
Os protocolos quimioterápicos utilizam muitas vezes drogas lesivas à parede do
endotélio vascular (BARUZZI, 1997), e podem durar muitos meses ou ultrapassar
mais de um ano, o que acarreta grande prejuízo à rede venosa da criança. Por este
motivo, para evitar esta complicação, é necessário utilizar um dispositivo chamado
de cateter venoso central de longa permanência (CVCLP) (MASCI, 2006), que serve
para infusão de drogas, administração de hemocomponentes e coleta de sangue
para repetidos exames laboratoriais.
Além dessas indicações que possibilitam e facilitam a realização do
tratamento, os cateteres de longa permanência têm outra função, não menos
importante, não só para crianças, mas também para adultos que é a de contribuir
para a diminuição do estresse diário (MARTINS e CARVALHO, 2008). Esta
vantagem ameniza significativamente os efeitos do 1hospitalismo. Segundo
Gonçalves et al. (2005), pacientes pediátricos que fazem uso desse cateter
apresentam melhor qualidade de vida e adesão ao tratamento, porém Baruzzi et al.
(1997) afirmam que apesar da utilização de cateteres venosos centrais reduzirem o
risco de tromboflebite, a cateterização venosa apresenta complicações,
necessitando de cuidados especializados.
Wiernikowski e Athale (2005) referem que os cateteres venosos centrais
de longa permanência têm sido utilizados há mais de 20 anos, sendo importantes
para a qualidade de vida de crianças com câncer. Este dispositivo possui, todavia,
um tempo de permanência bastante diversificado, podendo durar semanas, meses
ou anos, conforme mostram as estatísticas de vários serviços. Sua durabilidade,
segundo Marcondes et. al. (2000), está relacionada com a ocorrência ou não de
complicações decorrentes de seu uso.
Estas complicações podem ser precoces, ocorridas durante o
procedimento de inserção como: posicionamento inadequado e quebra,
pneumotórax ou hemotórax, embolia aérea e agressão às estruturas adjacentes ou
tardias, ocorridas durante a permanência do cateter, destacando-se principalmente a
oclusão, a trombose venosa profunda e a infecção sistêmica (VERSO e AGNELLI,
2003). A oclusão pode ocorrer por depósito residual de medicamentos, por trombos
formados pelo refluxo de sangue da própria criança para dentro do cateter, ou por
acúmulo de plaquetas e sangue residual dentro do lúmen do cateter após a
hemotransfusão. Esta complicação em muitos casos pode acarretar a necessidade
1 Hospitalismo- atraso do desenvolvimento físico e mental da criança pequena, consecutivo a internamento prolongado num hospital ou instituição onde não encontra os contatos afetivos que lhe são necessários;
de retirada do cateter, levando prejuízo tanto para a criança, que terá o seu
tratamento prejudicado pela perda de acesso venoso e em muitos casos não poderá
mais utilizar aquela veia para colocação de outro cateter, quanto para a Instituição,
pois estes dispositivos apresentam custo elevado (entre R$750,00 e R$2.250,00),
segundo dados da Secretaria Especial de Assuntos Estratégicos do Paraná (2008) o
que já havia sido relatado por Pinto e Altoé (2003).
Durante muitos anos, na tentativa de manter a funcionalidade destes
cateteres, as enfermeiras do Instituto Nacional do Câncer (INCA) utilizaram
exclusivamente a Estreptoquinase e a Heparina para sua desobstrução e
manutenção, porém o uso de anticoagulantes e trombolíticos oferece riscos de
ocorrência de sangramentos (GOODMAN & GILMAN, 2006; BARUZZI,1997). A
Estreptoquinase é um trombolítico que apresenta graves riscos com a sua utilização.
Espinosa e Mariz (1997) ressaltam que a anafilaxia é um dos principais efeitos
indesejáveis deste fármaco, devido a sua origem bacteriana, pois é originário do
Estreptococo β- hemolítico.
A vitamina C endovenosa já era utilizada empiricamente pelos técnicos do
Instituto de Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira na década de 80 para
desobstrução de cateteres de inserção periférica de curta permanência.
No ano 1995, começou a ser utilizada empiricamente nos casos de
oclusão de cateteres no INCA. Em 2007, esta droga começou a ser citada como
opção para desobstrução no Manual de Rotinas Internas do INCA (BRASIL, 2007).
Em todos estes anos de uso empírico, foi observado um resultado bastante
satisfatório na desobstrução dos cateteres, sendo atualmente esta droga utilizada
como primeira escolha nesta Instituição em casos de oclusão e semi-oclusão de
cateteres.
Em um levantamento feito em cinco anos no ambulatório de cateter
infantil do INCA, em 60 cateteres com obstrução total, 57 foram desobstruídos com
vitamina C e somente três necessitaram usar o trombolítico estreptoquinase
(SANTANA, 2003).
Até a presente data não foi comprovado o efeito trombolítico da vitamina
C. A literatura existente ainda é bastante incipiente e os estudos realizados
demonstram um desencontro nos resultados no que diz respeito à aplicação do
ácido ascórbico no processo hemostático. Grande parte dos estudos já realizados foi
sobre a ação antioxidante da vitamina C, muitas vezes associada à vitamina E ou
outras substâncias, impossibilitando por enquanto uma hipótese da ação da vitamina
C isoladamente no processo de coagulação (KAEHLER et al., 2008; SAVINI et al.,
2007; PELLEGRINI et al., 2004; TOUSOULIS et al., 2003; ANTONIADES et al.,
2003; LABINJOH et al., 2001; CHESNEY et al., 2000; TOFLER et al, 2000; RIFICI et
al. ,1997; MHETA, 2006).
Entretanto, observamos na prática clínica nestes 13 anos de uso
empírico, que os resultados obtidos são muito satisfatórios, pois desde a sua
introdução no Serviço, a utilização da Estreptoquinase tornou-se bastante reduzida,
já que a vitamina C conseguiu desobstruir os cateteres em 96,6% dos casos de
cateteres com obstrução total (SANTANA, 2003).
Justificativa
A perda de cateteres por obstrução ocasionada por coágulos pode trazer
conseqüências desastrosas para a vida da criança, acarretando atraso no
tratamento anti-neoplásico, piora no prognóstico e maior risco de morte. A
necessidade de retirada de um cateter também apresenta uma relevância
econômica para a Instituição, pois estes cateteres possuem um custo de colocação
elevado. Em contra-partida, a vitamina C custa aproximadamente 0,23% do valor da
estreptoquinase que oferece graves riscos e restrições relacionadas ao seu uso
sendo necessário que se busque novas alternativas para solução desta
complicação.
Após anos de uso empírico da vitamina C na desobstrução de CVCLP
tanto em pacientes pediátricos quanto em adultos no Instituto Nacional do Câncer
(INCA), o entendimento do mecanismo de ação da vitamina C e a sua comprovação
científica neste processo, se tornam necessárias. Até o momento poucos efeitos
colaterais do Ácido Ascórbico foram relatados em estudos, quando utilizado para
outros fins, estando na maioria deles relacionados à administração de doses
elevadas e hipersensibilidade (Micromedex-2006).
REFERENCIAL CIENTÍFICO
2- REFERENCIAL CIENTÍFICO
2.1- CATETER VENOSO CENTRAL
Devido ao fato do tratamento quimioterápico necessitar de uma via de
acesso venoso segura para suportar os longos meses de tratamento e a toxicidade
que as drogas podem causar nos tecidos, é necessário à utilização com freqüência
de cateteres que possam permanecer por um longo período possibilitando a
realização deste tratamento (LABOUREY et al, 2004; YARBRO, 2000). Figura 1
Fig. 1 – Criança com Cateter Venoso Central de Longa Permanência semi implantado
Arquivo pessoal.
Os cateteres venosos centrais de longa permanência (CVCLP) são
dispositivos terapêuticos amplamente utilizados em todo o mundo nos últimos anos,
sendo considerados fundamentais para os pacientes que necessitem de tratamento
infusional prolongado. É uma tecnologia importante responsável por proporcionar
melhor qualidade de vida, diminuir o sofrimento e até mesmo salvar a vida de muitos
pacientes. Tem sido observado que crianças e adultos usuários destes cateteres se
tornam mais aderentes ao tratamento e tem um menor nível de estresse por não
estarem expostos a repetidas punções (GONÇALVES et. al, 2005).
Santos e Pitta (2003) relatam que este tipo de cateter foi criado em 1973
por Broviac e colaboradores, “[...] introduziram o uso de cateter de silicone com um
segmento extravascular. Esse cateter foi utilizado inicialmente para nutrição
parenteral prolongada” porém, desde 1952 Albaniac já se referia a um dispositivo
para cateterização venosa central para terapia infusional em pacientes graves ou
cronicamente enfermos (GONÇALVES et al , 2005).
No ano de 1979, Hickman observou a necessidade de utilizar estes
dispositivos também em pacientes submetidos ao transplante de medula óssea, mas
para isto era necessária uma adaptação ao cateter de Broviac para que permitisse
infusão ao mesmo tempo de drogas e de hemocomponentes (SANTOS e PITTA,
2003).
Somente após a década de 80 que Neiderhuber e colaboradores
projetaram os cateteres de longa permanência com reservatórios (Figura 2A),
chamados de Cateteres Venosos Centrais de Longa Permanência Totalmente
Implantados (CVCTI). Suas grandes vantagens em relação aos cateteres semi-
implantados (Figura 2B) são as baixas taxas de infecção e a maior liberdade para
realização das atividades pelos pacientes (KOCK et al, 1998). Mais recentemente
foram também criados os cateteres venosos centrais de inserção periférica (CVCIP)
(VERSO e AGNELLI, 2003), que podem ser implantados por enfermeiras habilitadas
e possuem menor custo, porém com menor durabilidade (Figura 2C).
A B C
Fig. 2- Cateteres de longa permanência. Totalmente implantado (A), semi-implantado (B) e cateter de
Inserção Periférica (C)
Atualmente existem basicamente dois tipos de CVCLP: os semi-
implantados criados por Hickman e Broviac (Figura 1) e os totalmente implantados
criados por Neiderhuber. Podem ser encontrados em vários diâmetros e com uma
ou duas vias, o que permite a infusão de grande quantidade de líquidos, nutrição
parenteral total, antibióticos, drogas vesicantes, coleta e transfusão de sangue e
hemoderivados. São feitos em poliuretano ou silicone radiopaco e o reservatório dos
cateteres totalmente implantados está disponível em polissulfona ou titânio. Verso e
Agnelli (2003) descrevem que o cateter ideal deve ser de fácil inserção e retirada,
baixo risco de infecção, baixo risco de sangramento e baixa trombogenicidade.
Apesar de ser um dispositivo de amplo uso e grande utilidade na prática
clínica, não está livre de causar complicações. Sua durabilidade está associada a
complicações que podem ocorrer precocemente durante o procedimento da
inserção, ou tardiamente durante sua permanência. As complicações precoces
incluem: posicionamento inadequado e quebra, pneumotórax ou hemotórax, embolia
aérea e agressão às estruturas adjacentes. As tardias: oclusão do cateter, trombose
venosa profunda e infecção sistêmica. As taxas totais estimadas para estas
complicações estão entre 0,3% e 12% (VERSO e AGNELLI, 2003).
A simples inserção do cateter lesionando a parede do vaso, por si só, já
acarreta a formação de trombos. A perda física do endotélio levará à exposição da
MEC, adesão plaquetária com liberação do fator tecidual e depleção dos PGI1 e Pas
(ROBBINS e COTRAN, 2005). Desta forma, o endotélio gera maiores quantidades
de fatores pró-coagulantes ou sintetiza quantidades menores de fatores
anticoagulantes. As plaquetas fluem centralmente no lúmen do vaso (fluxo laminar),
separado do endotélio por uma zona clara do plasma de movimento mais lento
(ROBBINS e COTRAN, 2005). Sendo assim, a alteração do fluxo sangüíneo causa
rompimento do fluxo laminar e promove maior interação das plaquetas com a parede
endotelial. Esses eventos resultam na redução da diluição dos fatores coagulantes,
retardando o fluxo interno dos inibidores dos fatores de coagulação e contribuindo
para a ativação celular endotelial, facilitando a formação do trombo.
As tromboses associadas ao CVC são tradicionalmente divididas em dois
tipos diferentes: a capa de fibrina, que recobre a superfície do cateter, e a trombose
mural que é referente à parede da veia. Após a inserção do cateter, a primeira etapa
induzida pelo contato de um biomaterial com o sangue é a absorção de proteínas
plasmáticas na superfície desse material (essencialmente a albumina). Este
processo conduz, em menos de 24 horas, a uma rede constituída de agregados de
fibrina e de plaquetas envolvendo o cateter. Depois de alguns dias, essa cobertura
fibrinosa de transforma em um material de células e colágeno (MERRER, 1994).
Em alguns pacientes, a persistência de CVC estimula a formação de
colágeno que induz a estabilização do trombo. Verso e Agnelli (2003) referem que,
este revestimento é uma complicação benigna, mas que interfere com a função do
cateter facilitando o desenvolvimento de infecção e sepse podendo preceder a
trombose mural.
Motivos diversos podem levar a perda do cateter, sendo necessária a
colocação de um novo CVCLP para a continuidade do tratamento, o que pode levar
ao aumento do risco de desenvolvimento de trombos. “Os fatores que fazem com
que os cateteres causem tromboses são as canulações repetidas, o uso prolongado,
infecções recorrentes e o traumatismo durante a inserção do cateter” (VIANNA et al.,
2005). No caso de pacientes com câncer, segundo Fimognari et.al. (2005), as
células tumorais produzem substâncias com atividade pró-coagulantes, o que
aumenta a predisposição ao aparecimento de trombos.
Embora o paciente com doença neoplásica possa apresentar tendência a um estado de hipercoagulabilidade (liberação de mediadores das células neoplásicas que ativam a cascata de coagulação) e maior risco de infecções (por ser imunodeficiente) estes cateteres tem sido largamente utilizados, dado o conforto de se evitar nova punção venosa a cada ciclo quimioterápico e de suportarem drogas de elevada ação vesicante”(BARUZZI et al., 1997).
Em análise retrospectiva entre 1985 e 1994 no Department of General
Surgery of Essen University Hospital, com uma população de 1500 pacientes com
cateteres totalmente Implantados, Kock et. al. (1998) relatam que as complicações
mais comuns são: infecção (4,8%), trombose (3,2%) e oclusão do reservatório (1%).
Em 249 cateteres monitorados por Labourey et al. (2004), no período de um ano,
constataram oclusão em 5,2% dos casos.
Em levantamento de dados realizado entre 1995 e 1999 no Serviço de
Oncologia Pediátrica do Instituto Nacional do Câncer - Rio de Janeiro, noutro estudo,
realizado por Gonçalves et al. (2005), foram analisados resultados alcançados nos
586 cateteres implantados em crianças com câncer (438 cateteres semi-implantados
e 148 cateteres totalmente implantados). Nestes, observou-se que 0,7% dos
cateteres semi-implantados e 7,41% dos totalmente implantados, apresentaram
alguma complicação mecânica, sendo a obstrução uma das mais freqüentes.
O tempo de permanência dos CVCLP é bastante variado, sendo diferente
de serviço para serviço. Segundo Kock et al. (1998), o tempo médio de permanência
dos cateteres em seu estudo foi de 382 dias, com um máximo de 1400 dias. Para
Marcondes et al. (2000), o tempo de permanência está relacionado a complicações
imediatas, tardias, grau de orientação dos cuidadores, treinamento da equipe e
idade da criança, que pode tracionar acidentalmente o cateter.
Apesar do seu largo uso e muitos riscos, o número de inserções de
CVCLP tem aumentado a cada dia. “Anualmente cerca de 500 mil cateteres venosos
centrais de longa permanência são implantados nos Estados Unidos para
quimioterapia e nutrição parenteral [...]” (UNAMUNO et al, 2005).
2.2- HEMOSTASIA NORMAL
O sistema hemostático é complexo, com várias vias relacionadas entre si,
as quais se ativam e/ou se inibem mutuamente. Entretanto, apesar dos mecanismos
e de certos fatores de coagulação que possibilitam essa interação ainda não serem
completamente conhecidos, grande parte das proteínas que constituem o sistema de
coagulação já está definida no que diz respeito a sua estrutura primária.
Segundo Bogliolo (2006), a hemostasia é um processo fisiológico
envolvido com a fluidez do sangue e com o controle de sangramento quando ocorre
lesão vascular. Laszlo et al. (2006) também ressaltam que o sistema hemostático
fluidifica o sangue com o propósito de manter a circulação, porém reage
imediatamente à lesão prevenindo a perda de sangue, com o retorno a seguir de sua
fluidez. “O sistema complexo compreende uma rede de enzimas ativadoras e
inativadoras e co-fatores derivados de células e tecidos, alguns circulantes e alguns
produzidos localmente” (RUBIN e GONSTEIN, 2006).
Assim, hemostasia normal é o resultado de um complexo equilíbrio entre
dois sistemas que atuam na coagulação do sangue, o pró-coagulante e o
anticoagulante. Enquanto o primeiro induz a formação do trombo, o segundo a inibe.
O sistema anticoagulante é constituído por proteínas inibidoras da coagulação
(antitrombina III, proteínas C e S) e pelo sistema fibrinolítico que destrói a fibrina
formada antes que seja produzido o coágulo (GREENBERG et al apud DE MEIS,
2006).
Muitos fatores, adquiridos ou genéticos, podem ter participação na quebra
desse equilíbrio levando a estados de hipo ou hipercoagulabilidade. Como definem
Robbins e Cotran (2005), o oposto patológico a hemostasia é a trombose, que pode
ser uma ativação inapropriada dos processos hemostáticos normais, tal como a
formação de um coágulo sanguíneo (trombo) na vasculatura não lesionada ou
oclusão trombótica de um vaso após uma lesão relativamente pequena.
É importante ressaltar que tanto a hemostasia quanto a trombose são
reguladas por três fatores predisponentes identificados em 1856 por Rudolph
Virchow, que ficaram conhecidas como tríade de Virchow, composta pela parede
vascular, as plaquetas e a cascata de coagulação (DE MEIS, 2006).
Hemostasia primária
Para que ocorra a hemostasia, é necessário que uma série de processos
aconteça. No momento em que ocorre a lesão vascular, tem início à primeira etapa
da coagulação com a vasoconstricção arteriolar (para reduzir o fluxo sanguíneo)
causado principalmente pela secreção local de fatores, como a endotelina. Fatores
hemodinâmicos, agentes infecciosos, mediadores plasmáticos e as citocinas podem
ser responsáveis pela ativação do endotélio. Nesse sentido, a formação, propagação
ou dissolução do trombo é determinada pelo equilíbrio entre as atividades anti-
trombóticas e pró-trombóticas (ROBBINS e COTRAN, 2005).
Segundo BOGLIOLO (2006), o endotélio íntegro impede a interação das
plaquetas com o fator de Von Wilebrand (fVW), que é responsável por provocar a
agregação e desgranulação plaquetária, o contato do plasma com o colágeno (o
qual aciona a cascata de coagulação) e a produção de ativadores de plasminogênio
cuja função resulta na formação de plasmina. Quando essa integridade é rompida,
ocorre então a adesão das plaquetas à matriz extracelular exposta (MEC) altamente
trombogênica, através de receptores como os de von Willebrand sendo então
ativadas, ou seja, são submetidas a uma alteração da forma e liberação de grânulos
secretórios. Rapidamente ocorre a agregação (os produtos secretados selecionam
plaquetas adicionais) formando um tampão hemostático primário. A agregação
plaquetária parece ser determinada fundamentalmente pela liberação local da
adenosina difosfato (ADP) entretanto, a trombina e até complexos antígeno-
anticorpos também podem levar a essa agregação (ROBBINS e COTRAN, 2005).
Rubin e Gonstein (2006) descrevem as plaquetas como pequenas células
discóides com 2 a 3 μm de diâmetro que circulam livremente por cerca de 10 dias,
com uma concentração de 150.000 a 400.000/ μl. Possuem mitocôndrias, partículas
de glicogênio, grânulos alfa (os quais mostram a molécula de adesão P-selectina
nas suas membranas além de conter fibrinogênio, fibronectina, fatores V e VIII, fator
plaquetário 4, fator de crescimento originado das plaquetas e fator-β de
transformação de crescimento) e os grânulos γ (que contêm adenina nucleotídeos,
cálcio ionizado, histamina, serotonina e epinefrina).
Robbins e Cotran (2005) referem que após o dano vascular, as plaquetas
encontram os constituintes da matriz extracelular (colágeno, proteoglicanos,
fibronectina e outras glicoproteínas adesivas) que são seqüestrados, normalmente,
abaixo do endotélio intacto. Assim, para desempenhar seu papel na hemostasia, as
plaquetas passam por uma série de etapas seqüenciais: adesão às proteínas da
matriz sub-endotelial (principalmente colágeno e fVW); mudança de formato (de
discóide para esférico); secreção de conteúdos de grânulos plaquetários (ADP,
adrenalina, cálcio, fVW; geração de tromboxano A2 por cicloxinase 1); alteração da
membrana que expõe a P-selectina e os fosfolipídeos aniônicos pró-coagulantes;
agregação iniciada pela liberação de ADP, onde as plaquetas aderem umas as
outras, como apresentado na figura 3 (RUBIN e GONSTEIN 2006; BOGLIOLO,
2006).
Fig. 3- Adesão e agregação plaquetárias
Fig. 3 - Adesão e agregação plaquetárias
Fonte: Robbins & Cotran, 2005 (modificado).
Hemostasia secundária
Após esses processos, a cascata de coagulação é ativada via fator
tecidual (FT), um fator pró-cogulante aderido à membrana sintetizado pelo endotélio,
em conjunto com os fatores plaquetários secretados. Há a conversão do fibrinogênio
solúvel circulante em fibrina insolúvel pela trombina, formando um coágulo de fibrina,
que força o agregado plaquetário. A trombina é responsável pela indução do
recrutamento plaquetário e pela liberação dos grânulos. Esta seqüência de
fenômenos, a hemostasia secundária, desprende mais tempo que o tampão
plaquetário inicial (ROBBINS e COTRAN, 2005).
Segundo Robbins e Cotran (2005), no intuito de prevenir uma hemorragia
adicional, os agregados plaquetários e a fibrina polimerizada se unem para formar
um tampão sólido e permanente. Nesta etapa, os mecanismos contra-regulatórios,
como o ativador do plasminogênio do tipo tecidual (t-PA), limitam o processo
hemostático ao local lesionado. Vários aspectos da hemostasia normal são
modulados pelas células endoteliais, em contrapartida, o fluxo normal de sangue é
mantido pelas propriedades antiplaquetárias, anticoagulantes e fibrinolíticas
endoteliais. Depois que ocorre o dano ou ativação, o endotélio apresenta diversas
atividades pró-coagulantes que podem ser vistas na figura 4.
Fig. 4: Atividades Pró e anticoagulantes das células endoteliais
Fonte: Robbins & Cotran, 2005 (modificado).
Na formação do coágulo, ocorrem interações entre proteases plasmáticas
e seus co-fatores (aceleradores de reação), tendo seu clímax na gênese da enzima
trombina, a qual por proteólise, transforma o fibrinogênio solúvel em filamentos
insolúveis de ativados (RANG et al., 2001).
A hipótese da cascata de coagulação foi levantada em 1964 por
Macfarlane e Davie & Ratnoff, como um meio de explicar a fisiologia da coagulação
sangüínea. Desta forma, fibrina, resultando na última etapa de uma complexa
cascata de enzimas (fatores de coagulação a cascata tem início quando os
precursores inativos são ativados em série, e cada um deles origina uma quantidade
maior do seguinte). A última enzima, a trombina, que deriva da protrombina (II),
realiza a conversão do fibrinogênio solúvel (I) numa rede insolúvel de fibrina, na qual
são retidos os eritrócitos, formando assim o coágulo.
Tradicionalmente são reconhecidas duas vias de coagulação como
referem Goodman e Gilman (2006): a via extrínseca (que envolve componentes do
sangue além de elementos que normalmente não estão presentes no espaço intra-
vascular), a qual opera in vivo e a via intrínseca ou de contato (iniciadas por
elementos presentes no intra-vascular), que alguns autores consideram não ter um
verdadeiro papel na hemostasia normal (VINE, 2009). É importante citar que existe
interconexões entre essas duas vias.
A via de contato intrínseca pode ser iniciada in vitro e começa quando o
fator XII (“fator Hageman”) adere a uma superfície de carga negativa, convergindo
para a via extrínseca no estágio de ativação do fator X. A via extrínseca é ativada
pelo fator tecidual, uma lipoproteína celular exposta em local onde há uma lesão
tecidual, entretanto, o complexo do fator VIIa- fator tecidual também ativa o fator IX
na via intrínseca. Nessa perspectiva ambas as vias resultam na ativação do fator X
que, em seguida, converte a protrombina em trombina. O cálcio e um fosfolipídeo
(PL) de carga negativa são essenciais para as ações do fator IXa sobre o fator X,
fator VIIa sobre o fator X e fator Xa sobre o fator II, como pode ser visto na figura 5.
O PL é fornecido pelas plaquetas ativadas, as quais aderem ao vaso lesado. Alguns
fatores promovem a coagulação através de sua ligação ao PL e a um fator de serina
protease, como por exemplo, o fator Va na ativação do fator II pelo fator Xa (RANG
et al, 2001).
Fig. 5 – Cascata de coagulação mostrando vias intrínseca e extrínseca
Fonte: Robbins & Cotran, 2005 (modificado).
Para Rang et al. (2001), a cascata enzimática de aceleração deve ser
controlada por inibidores, pois caso contrário, o sangue do organismo se coagularia
em poucos minutos. O inibidor mais importante é a antitrombina (ex. antitrombina
III), que inibe a atividade da trombina e neutraliza todas as serinas proteases na
cascata (fatores IXa, Xa, XIa e XIIa). As proteínas C e S, que são dependentes da
vitamina K, caracterizam-se por inativar os fatores Va e VIIIa. E por último, o inibidor
da via do fator tecidual (TFPI), uma proteína secretada pelo endotélio que associado
ao fator Xa e ao fator tecidual VIIa, inativa-os com o objetivo de restringir a
coagulação.
2.3- FIBRINÓLISE
A coagulação sangüínea também é controlada pela fibrinólise. O sistema
fibrinolítico remove o coágulo de fibrina uma vez que alcançou a sua função
hemostática em decorrência da ação da plasmina (figura 6). O plasminogênio, um
precursor inativo, é convertido em plasmina, uma enzima que degrada a fibrina. O t-
PA se liga à fibrina e converte o plasminogênio, que também se liga a fibrina, em
plasmina. "Os inibidores do ativador do plasminogênio 1 e 2 (PAI-1 e PAI-2) inativam
o t-PA; a α2 anti-plasmina (α2-AP) inativa a plasmina” (GOODMAN e GILMAN,
2006).
Fig. 6: Sistema fibrinolítico mostrando ação sobre o trombo.
Fonte: Robbins & Cotran, 2005, (modificado)
O plasma normalmente não possui capacidade de causar lise a fibrina,
exceto se lhe for fornecido um ativador do sistema fibrinolítico. Isto pode ser
observado tanto in vivo quanto in vitro (MAXWELL e WINTROBE, 1999).
Degradação do fibrinogênio e da fibrina.
A estrutura terciária da molécula do fibrinogênio determina a degradação
proteolítica seletiva e é importante para o entendimento de como o fibrinogênio e a
fibrina são degradados. A plasmina remove a porção terminal C da cadeia Aα, e os
primeiros 42 aminoácidos da cadeia Bβ, causando quebra do coágulo formado do
fibrinogênio chamado fragmento X. Este fragmento então é clivado em duas regiões
produzindo os fragmentos D e Y. O fragmento Y pode ser degradado produzindo o
fragmento E e um segundo fragmento D sendo imunologicamente distintos um do
outro. Quando o coágulo de fibrina é degradado, a plasmina ativa é segmentada
entre os domínios D e E, isto resulta em fragmentos de diferentes tamanhos e na
perda da estrutura e integridade do polímero de fibrina, conforme apresentado na
figura 7 (MAXWELL e WINTROBE, 1999).
Fig. 7: Degradação do fibrinogênio e da fibrina
Fonte: MAXWELL.1999 (modificado)
A degradação completa do coágulo rende uma forma dimérica do
fragmento D, conhecido como Dímero D, o menor produto da degradação da fibrina.
Complexos maiores compostos da combinação de polímeros de fibrina no protofibril
também são encontrados. "Estes fragmentos maiores podem ser futuramente
degradados pela plasmina dentro de complexos menores" (MAXWELL e
WINTROBE, 1999).
O teste do Dímero D é específico para indicação de que apenas a fibrina
foi lisada. Nesse teste é empregado um anticorpo anti-domínio D do monômero de
fibrina, e é nesse domínio que se dá a união entre dois monômeros de fibrina, o que
o torna específico para acusar a presença de trombina.
O Dímero D é reconhecido atualmente como o mais específico marcador
para trombose e fibrinólise fisiológica e, embora baixos níveis deste produto possam
ser detectados na circulação de indivíduos saudáveis, ocorre um significativo
aumento em seus níveis em pacientes com trombose venosa profunda, embolia
pulmonar, coagulação intra-vascular disseminada, infarto do miocárdio, câncer,
complicações da gravidez, sepse, entre outros. Sua principal aplicação clínica está
relacionada com a possibilidade de exclusão diagnóstica de eventos trombóticos
quando seus resultados são inferiores a 500 ng/ml (normais), contudo, sua dosagem
apresenta pouca ou nenhuma utilidade na distinção entre os pacientes com
trombose e aqueles sem trombose, se eles apresentarem idade superior a 60 anos
ou hospitalização por um período superior a três dias, elevados níveis de proteína-C
reativa; devido a sua baixa especificidade (MORESCO & SILLA, 2005).
Existem dois importantes ativadores do plasminogênio: o ativador do
plasminogênio tecidual (t-PA) e o ativador do plasminogênio tipo uroquinase (u-PA).
(RUBIN e GONSTEIN, 2006; ROBBINS e COTRAN, 2005; FRANCO, 2001). Os dois
ativadores têm alta especificidade de ligação com seu substrato (plasminogênio) e
promovem hidrólise de uma única fonte peptídica resultante na plasmina. “Além
disso, existem vários ativadores exógenos da fibrinólise, incluindo a estreptoquinase”
(RANG et al, 2001). O t-PA é fisiologicamente mais importante, liberado pelas
células endoteliais em resposta a diversos sinais (liberação esta que não ocorre
dentro do cateter pois é um processo que não envolve células do endotélio)no
cateter pois ), sendo mais ativo quando ligado a fibrina. “A afinidade pela fibrina
torna o t-PA um reagente terapêutico muito mais útil, pois ele enfoca a atividade
enzimática fibrinolítica a locais de coagulação recentes” (ROBBINS e COTRAN,
2005).
Para Robbins e Cotran (2005), o u-PA encontra-se presente no plasma e
em vários tecidos e é capaz de ativar o plasminogênio na fase líquida, enquanto a
plasmina converte o precursor da pró-uroquinase inativa em molécula u-PA ativa,
fazendo uma alça de amplificação.
2.4- ASPECTOS MORFOLÓGICOS DO TROMBO
Rubin e Gonstein (2006) referem que, “O trombo é um agregador
de sangue coagulado que contém plaquetas, fibrina, leucócitos e eritrócitos. A
formação de um trombo envolve um cabo de guerra entre fatores que promovem
trombose e os que a inibem”. Robbins e Cotran (2005) ressaltam que dependendo
do local onde são formados e do seu desenvolvimento, os trombos podem ter
tamanhos e formas diversas. Enquanto os trombos venosos se desenvolvem no
mesmo sentido do fluxo do sangue, os arteriais crescem na direção contrária do
ponto de ligação. Se a cauda difusora não estiver bem unida, principalmente nas
veias, há a probabilidade de ocorrer uma fragmentação, gerando um êmbolo.
Montenegro e Franco (1999) classificam os trombos de acordo com sua
aparência macroscópica e com sua cor em: vermelhos, brancos e mistos. Os
vermelhos são úmidos, têm aparência gelatinosa muito semelhante ao coágulo
sangüíneo. São formados prioritariamente por hemácias e se localizam nas veias.
Os brancos ou fibrinosos são constituídos por uma camada clara formada pela
mistura de plaquetas e fibrina dispostas em camadas alternadas, intercaladas por
uma camada escura de hemácias, conferindo um aspecto lamelar característico,
sendo conhecidas como estrias de Zahn. “Os trombos são típicos e firmemente
aderentes à parede arterial lesionada e são branco-acinzentados e friáveis,
compostos de uma mistura de plaquetas, fibrina, eritrócitos e leucócitos
degenerativos“ (ROBBINS e COTRAN, 2005).
Os mistos são formados pela junção de camadas fibrinosas (trombos
brancos) e por camadas de coagulação (trombos vermelhos), e são mais freqüentes.
Segundo Montenegro e Franco (1999) ainda são classificados em murais e arteriais
(ou oclusivos) conforme ocluam a luz dos vasos e as cavidades cardíacas.
Após a obstrução vascular trombótica, os trombos podem ter quatro
destinos: propagação (o trombo acumula a mistura de mais plaqueta e fibrina,
podendo levar a obstrução do vaso); dissolução (os trombos são removidos pela
fibrinólise); organização e recanalização (há o restabelecimento do fluxo vascular ou
a incorporação na parede vascular espessada) e a embolização (os trombos se
deslocam e viajam para outros locais da vasculatura). O trombo que se forma in
vivo, deve ser distinguido do coágulo sangüíneo que se forma no sangue estático in
vitro. Os coágulos são amorfos e consistem de uma difusa rede de fibrina na qual
todas as células sanguíneas são seqüestradas, enquanto trombos venosos e
arteriais possuem, cada um, uma estrutura distinta (RANG et al, 2001).
2.5- DROGAS USADAS NA PERMEABILIDADE DOS CATETERES
VENOSOS CENTRAIS DE LONGA PERMANÊNCIA
HEPARINA
Devido ao fato de que nem sempre existe a necessidade do uso contínuo
do cateter, pois muitas vezes o paciente não necessita de reposição de fluidos, mas
somente de receber medicações parenterais (GIL et al, 2008), é necessário a
manutenção da sua permeabilidade utilizando-se um agente anticoagulante. A
heparina tem sido utilizada como droga de escolha para prevenir a formação de
trombos dentro do lúmem dos cateteres em muitas unidades hospitalares. Segundo
Goodman & Gilman (2006), a heparina é encontrada nos grânulos secretores dos
mastócitos.
Seu efeito anticoagulante desaparece em poucas horas após a sua
suspensão, e a sua meia vida depende da dose administrada (Goodman & Gilman,
2006). O sangramento é o principal efeito adverso desta droga, e sua utilização está
contra-indicada em casos de hipersensibilidade à droga e em patologias ligadas a
coagulação com risco de hemorragias. Para Bowman apud GIL (2008), “o uso de
solução de heparina na permeabilidade do cateter é considerada perigosa e com
risco de sangramento”.
O mecanismo de ação está na formação de complexo com a anti-
trombina III (ATIII), com a qual tem elevada atividade devido à seqüência
pentassacarídica, que induz mudança conformacional e inativação do fator Xa e da
trombina. A heparina também se liga a trombina, fator IXa e fator Xa. (VACCARI,
2003).
Na rotina do Ambulatório de Cateter do INCA, a permeabilidade do cateter
quando não está sendo utilizado para infusão endovenosa é obtida através da
lavagem do lúmen com solução salina a 0,9% e 500U de Heparina /ml. Administra-
se de 1,0 a 1,5 ml dependendo do tamanho do 2primer do cateter (BRASIL, 2007).
Apesar do pequeno volume infundido, sempre existe a possibilidade da entrada da
solução na corrente sanguínea do paciente, aumentando o risco de sangramento.
ESTREPTOQUINASE
A Estreptoquinase é uma enzima utilizada em cateteres venosos na
tentativa da desobstrução por trombos (WOLOSKER et al, 2004). É um potente
agente trombolítico usado endovenosamente em infarto agudo do miocárdio, porém,
por ser originária de um estreptococo, pode apresentar reações antigênicas e até
mesmo reações anafiláticas (ESPINOSA, 1997). Por este motivo, a sua introdução
na desobstrução de cateter só pode ser realizada mediante prescrição medica e na
presença deste profissional, e uma vez tendo sido utilizada, não é recomendável sua
reutilização.
2 Primer- Valor de enchimento
A estreptoquinase foi o primeiro agente trombolítico utilizado clinicamente, sendo um polipeptídeo de cadeia única, com um peso molecular em torno de 50.000 daltons, que é produzido pelo estreptococo β–hemolítico do grupo C de Lancefild [...]. O mecanismo de ação da Estreptoquinase induz a ativação direta do plasminogênio, formando um complexo ativador, estreptoquinase-plasminogênio, que transforma o plasminogênio circulante em plasmina e, conseqüentemente, levando a desintegração da fibrina ligada ao coágulo, bem como um consumo de fibrinogênio circulante (ESPINOSA, 1997).
Sua principal toxicidade é a ocorrência de hemorragia resultante da lise
da fibrina e a formação sistêmica de plasmina, produzindo fibrogenólise e destruição
de fatores de coagulação (BARUZZI,1997; GOODMAN & GILMAN, 2006). Uma das
contra-indicações para a terapia com trombolíticos é o distúrbio hemorrágico,
complicação freqüente em algumas doenças neoplásicas e no tratamento
oncológico, devido à possibilidade de algumas drogas anti-neoplásicas causarem
diminuição dos níveis plaquetários.
Segundo a rotina interna do Ambulatório de Cateter do INCA/HCI, deve
ser administrado de 1,0 a 1,5 mL de Estreptoquinase diluída em NaCl 0,9%,
dependendo do primer do cateter (o que equivale a 7.500 ou 10.000 U/mL). Esta
solução é mantida por 1 hora dentro do primer do cateter, quando então é aspirada.
No Hospital do Câncer A.C. Camargo, é utilizado 12.500 U/mL de Estreptoquinase
em casos de obstrução (WOLOSKER et al, 2004).
Apesar de ser um potente agente trombolítico, nem sempre a
permeabilidade do cateter é restaurada após o seu uso. Labourey et al (2004)
relatam que após a infusão de Urokinase (5.000 a 10.000U) intralúmen em 3
cateteres obstruídos, obtiveram sucesso na desobstrução em somente um caso.
Assim como a Heparina, apesar do pequeno volume infundido dentro do
prime do cateter, existe também possibilidade de entrada da solução na corrente
sanguínea, acarretando grande risco de efeitos indesejáveis.
2.6 - VITAMINA C
No século XVIII, James Lind, médico Escocês, foi o primeiro a
correlacionar o aumento significativo de mortalidade entre os marinheiros com a
deficiência de Vitamina C (escorbuto). Os resultados de sua experiência foram
publicados em 1753. Em 1919, Drummond propôs chamar o fator de antiescorbútico
“C”. Somente em 1928, Albert von Szent Gyorgyi conseguiu isolar o fator
antiescorbuto em alimentos e o chamou de vitamina C. Em 1933, Hirst e Haworth
demonstraram a estrutura da Vitamina C, e pela sua relação com o escorbuto
sugeriram em conjunto com Szent-Gyorgyi a mudança do nome para ácido
áscórbico. Em 1937, Haworth e Szent Gyorgyi pelos seus estudos com a vitamina C,
receberam o Prêmio Nobel de Medicina, assim como Linus Pauling que também foi
agraciado com o Prêmio Nobel de Medicina por estudos com a Vitamina C (AZULAY
et al., 2003).
A vitamina C é uma vitamina hidrosolúvel que pode ser administrada por
via oral, intramuscular, subcutânea e endovenosa. O pH da solução de vitamina C
pode variar entre 5,6 e 7,0; mantendo estabilidade quando diluída em H2O, NaCl
0,9% e Glicose 5%. Deve ser protegida da luz, pois perde parte de sua atividade e
deve ser mantida em temperatura aproximada de 23ºC não ultrapassando 25ºC.
(HAND BOOK, 1998). A meia vida é de 16 a 20 dias e a não ingestão desta vitamina
pode apresentar manifestações clínicas em 1 a 3 semanas. ( BLEE et al., 2002)
Vitamina C é o termo freqüentemente utilizado para referir-se ao L-
ascórbico e ao seu produto de oxidação inicial, o ácido L-deidroascórbico, sendo que
ambos apresentam atividade como vitaminas. É uma cetocolona de seis carbonos,
com sua estrutura relacionada à glicose e outras hexoses (Figura 8). Após oxidação,
o ácido deidroascórbico permanece com a atividade integral do ácido ascórbico
(LAFEPE, 2008). A vitamina C é sintetizada por muitas plantas e por alguns animais.
Os seres humanos porém, não possuem capacidade para sintetizá-las, necessitando
ingerir quantidades suficientes de vitamina C para evitar o aparecimento do
escorbuto. Alguns cientistas, incluindo Linus Pauling, afirmam que a ingestão diária
de altas doses de vitamina C pode estar associada ao tratamento e profilaxia de
outras doenças além do escorbuto, como gripe e câncer (AZULAY et al., 2003).
Figura 8- Estrutura da Vitamina C (C6 H8 O6)Fonte: Wikipedia
Na natureza a vitamina C é encontrada sob duas formas: reduzida ou
oxidada (ácido deidroascósbico), ambas ativas, sendo a segunda menos difundida
nas substâncias naturais. A transformação de ácido ascórbico em ácido
deidroascósbico, geralmente ocorre no interior do organismo e é um processo
reversível. Essa transformação age como um sistema oxirredutor, o qual tem a
capacidade de transportar hidrogênio nos processos de respiração no nível celular.
Recomenda-se uma dose diária de 100 mg para a manutenção de nível de
saturação da vitamina C no organismo. Segundo Azulay et al. (2003), em situações
adversas como nas infecções, é necessário utilização de doses mais altas.
É também considerada um potente antioxidante que tem a capacidade de
agir in vivo e in vitro (PELLEGRINI et al., 2007; AZULAY et al., 2003).
Segundo Azulay et al. (2003), uma função do ácido ascórbico em nível
tecidual é a síntese de colágenos e outros constituintes orgânicos de matriz
intercelular em diversos tecidos, como dentes, osso e endotélio capilar. Este ácido é
rapidamente absorvido pelo intestino por um processo que depende do consumo de
energia. A absorção do ascorbato na dieta é quase completa. Encontra-se presente
no plasma e é distribuído de modo igual em todo organismo (LAFEPE, 2008).
Em muitos estudos, a vitamina C tem sido apontada como a chave
moduladora do estado oxidativo das plaquetas. Savini et al. (2007) referem que tanto
plaquetas quanto eritrócitos contém Ácido Ascórbico. O processo trombótico envolve
também leucócitos e estes tem capacidade de estocar altas concentrações de ácido
ascórbico. Raghavan et all (2003) realizou um estudo onde foi investigado o
significado fisiológico do ácido ascórbico na circulação usando plaquetas e
leucócitos de ratos, humanos e macacos. Os resultados indicaram que a adição de
ácido ascórbico potencializa a inibição da agregação plaquetária por
polimorfonucleares, mantendo as plaquetas em estado inativo e prevenindo os
eventos trombóticos.
Até o momento são relatadas poucas contra-indicações para o seu uso
porém, deve-se evitar administrá-la em pacientes com hipersensibilidade a
componentes da droga. Alguns efeitos observados são: precipitação de oxalato de
cálcio urinário, diarréia, náusea, vômito, cefaléia e desconforto no estômago
(MICROMEDEX, 2006).
Em busca sobre evidências da ação da vitamina C no processo de
coagulação nas bases de dados Lilacs, SciELO, Medline e PubMed no período de
1997 à 2008 usando como descritores: fibrinólise, coagulação sanguínea e ácido
ascórbico, foram encontrados 22 artigos no Medline, 60 no Pubmed, e nenhum no
ScieLo e Lilacs. Destes, somente nove artigos se referiam a estudos que avaliaram
a ação do Ácido ascórbico a um ou mais fatores envolvidos no processo de
coagulação em humanos. Quatro indicaram ação no fator de von Willebrand; três no
fator de ativação do plasminogênio; dois no inibidor do ativador do plasminogênio;
um na agregação plaquetária, e quatro referiram não ocorrer nenhuma ação da
vitamina C no processo de coagulação (gráfico 1).
Alguns dos artigos estudados tratavam da atuação da vitamina C em
fumantes, visto que estes apresentam níveis séricos de t-PA e PAI-1 reduzidos, o
que os colocam com um fator de risco a mais para doenças cardiovasculares.
Estudos semelhantes foram realizados, porém com resultados opostos.
Um estudo com uma amostra de 31 fumantes e 14 não fumantes obtiveram um
aumento dos níveis de t-PA nos adeptos ao fumo após infusão de substância P e
nitroprussiato de sódio concomitantemente com a vitamina C (KAEHLER et al.,
2008). Entretanto, Pellegrini et al, (2004) realizaram um estudo com 8 fumantes
onde foram administradas as mesmas substâncias, não obtendo nenhuma diferença
em tais valores antes e depois do estudo.
Uma publicação grega relata um estudo com 41 jovens fumantes que
foram divididos em 4 grupos: A, B, C e D, recebendo, respectivamente, 2g de
vitamina C; 2g de vitamina C + 400UI de vitamina E; 2g de vitamina C + 800UI de
vitamina E e placebo. Os resultados mostraram que a vitamina C associada à
diferentes doses de vitamina E tem efeito sobre o PAI-1, t-PA e fVW, sendo que
quanto maior a dose de vitamina E maior a redução desses fatores (ANTONIADES
et al., 2003).
Muitas hipóteses são levantadas, porém, apesar de conhecidos os danos
encontrados no tônus vascular em fumantes, os efeitos da atividade fibrinolítica
endotelial são complexos e ainda pouco compreendidos (KAEHLER et al., 2008).
Contudo, não foram somente em fumantes que foram observados efeitos da
vitamina C sob os fatores derivados do endotélio. Uma pesquisa realizada em 39
indivíduos portadores de Diabetes tipo II também tiveram os índices de fVW e t-PA
reduzidos após ingestão diária de 2g de ácido ascórbico (TOUSOULIS et al., 2003).
Entretanto, Chesney et al. (2000) em seu estudo, demonstraram um
aumento inesperado dos níveis do fVW após ingestão de vitamina C; este estudo
abordou 468 indivíduos que possuíam alguma doença arterial periférica. Foram
divididos em quatro grupos, sendo que um deles recebeu vitamina C e E, quando
comparado ao grupo que recebeu somente placebo demonstrou um aumento
significativo na concentração sérica de fVW, contradizendo o resultado de outras
pesquisas e também do que esperavam os próprios pesquisadores.
Desencontros foram observados em outras três pesquisas. A primeira
aborda um quantitativo de oito homens saudáveis e não fumantes que foram
divididos em quatro grupos que receberam placebo; metionina associada à vitamina
C; metionina e vitamina C, respectivamente. Foi demonstrado que não houve
nenhuma alteração nas concentrações de t-PA ou de PAI-1 em nenhum dos grupos
observados (LABINJOH et al., 2001). O mesmo ocorreu em outra pesquisa que
avaliou a ação do ácido ascórbico em indivíduos com obesidade central, não
havendo nenhuma alteração nos níveis de t-PA, fVW ou PAI-1 (RIFICI et al., 1997).
Em contra-partida, uma terceira pesquisa com um total de 18 participantes homens,
saudáveis e não fumantes que também avaliou a ação do ácido ascórbico, obteve
um resultado diferente da primeira pesquisa, sendo observado significativo aumento
de fVW; aumento da efetividade da fibrinólise; leve redução do t-PA, porém sem
significância estatística e não houve efeito sob o PAI-1 (TOFLER et al., 2000).
Outra publicação propõe que a vitamina C pode ser moduladora da
oxidação plaquetária. As plaquetas possuem fisiologicamente ácido ascórbico em
seu interior e essa concentração é que define a estabilidade ou lise plaquetária; o
efluxo e influxo de vitamina C dependem do carreador SVCT2 que se utiliza dos
canais de sódio dependentes. Aparentemente, a vitamina C tem a capacidade de
inibir a proteína trans-membrana CD40L, que tem propriedades pró-inflamatórias e
pró-trombóticas. A administração oral de vitamina C foi apontada como redutor da
agregação plaquetária (SAVINI et al., 2007).
A maioria desses estudos foram realizados com grupos pequenos de até
50 pessoas com exceção do estudo de Chesney et al. (2000) que utilizou 468
indivíduos. Muitos dos artigos estudados tratavam da atuação na vitamina C em
fumantes, nos quais os níveis séricos de t-PA e PAI-1 estão reduzidos ou envolviam
indivíduos com fatores de risco como doença arterial periférica, diabetes e
obesidade central. Apenas três trabalhos foram realizados com voluntários
saudáveis, porém com número pequeno de indivíduos estudados (TOFLER et al.,
2000; LABINJOH et al., 2001; SAVINI et al., 2007).
Gráfico 1– Atuação da Vitamina C no fVW, na atividade plaquetária, no t-PA, e PAI-I
ARTIGO 1 2 3 4 5 6 7 8 9fVW * _ * * *Plaquetas _ _ _ _ _ _ _ _t-PA * _ * * * *PAI-1 * _ * * * * * * não interferiu aumentou diminuiu _ não refere
Estes estudos anteriores foram realizados em humanos porém, o estudo
de Mehta (1998) sobre o efeito da suplementação alimentar de Vitamina C, vitamina
E e Vitamina C e E sobre o trombo aórtico induzido em 35 ratos, mostrou que estes
antioxidantes não afetaram o peso do trombo formado, porém, retardaram a sua
formação, reduziram a agregação plaquetária e reduziram a formação de superóxido
arterial quando comparados com o grupo controle.
Todavia, todos esses estudos ainda mostram a falta de concordância
entre os resultados de pesquisas sobre a ação que a vitamina C exerce na
hemostasia.
HIPÓTESE
3- HIPÓTESE
A vitamina C possui capacidade de induzir a dissolução de trombos.
OBJETIVOS
4- OBJETIVOS
4.1- Objetivo geral
Analisar a ação da vitamina C sobre os trombos sanguíneos,
estabelecendo um modelo in vitro de coagulação e fibrinólise.
4.2- Objetivos Específicos
Estabelecer um modelo in vitro de coagulação e fibrinólise para os testes com
vitamina C;
Analisar o efeito da vitamina C sobre o coágulo in vitro;
Avaliar o Dímero D como produto de degradação da fibrina após coagulação in
vitro tratada e não tratada com vitamina C;
Mensurar o peso do coágulo e o peso do coágulo seco tratado e não tratado
com vitamina C;
Comparar, no modelo estabelecido, a morfologia do coágulo sob a ação da
vitamina C e da solução salina.
MATERIAL E MÉTODOS
5 -MATERIAL E MÉTODOS
Tipo de estudo
Trata-se de um estudo exploratório descritivo, com realizaçao de
experimento in vitro.
Local da Pesquisa
A coleta de sangue, os exames laboratoriais de inclusão e o ensaio foram
realizados no Laboratório de Hematologia e de Patologia do Hospital Universitário
Antônio Pedro e o teste do Dímero D foi realizado no Laboratório de Hematologia do
Instituto Nacional de Câncer (HC-1).
Preceitos éticos
O estudo foi submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de
Medicina e do Hospital Universitário Antônio Pedro/HUAP da Universidade Federal
Fluminense (CEP/HUAP), de acordo com a Resolução 196/96 do Ministério da
Saúde. Aprovado em dezembro de 2007 sob número 153/07. Em 04/07/2008, foi
aprovado adendo para utilização de pool de plasma de descarte do Laboratório de
hematologia do HUAP, sob o mesmo número. (Anexo 1)
Todos os voluntários que concordaram em participar da pesquisa doando
as amostras de sangue assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido,
após lerem e serem esclarecidos, pessoalmente, sobre os objetivos e quaisquer
outras dúvidas que tivessem quanto ao destino das amostras. (Anexo 2)
Amostra do Estudo
Nos dois testes realizados foram utilizadas 27 amostras de sangue total
de voluntários sadios (1º teste), e 17 amostras de pools de plasmas citratado de
pacientes do Hospital Universitário Antonio Pedro (2º teste).
Teste 1 – Critérios de inclusão (teste sangue total)
Idade superior a 18 e inferior a 60 anos;
Não possuir um ou mais dos fatores de risco para tromboembolismo: obesidade
(IMC ≤ 30), varizes em membros inferiores, neoplasias, pneumopatia ou
cardiopatia crônica, puerpério, infecções sistêmicas e cirurgias ortopédicas de
grande porte em membros inferiores;
Não ser portador de doença que possa causar alterações hematológicas,
como: hemofilia, púrpura, câncer, doença de von Willebrand, entre outras.
Não estar em uso de medicamentos que possam alterar a coagulação (tais
como: AAS, estrogênio, Heparina, Abciximab, Clopidrogel, Dipiridamol,
Ticlopidina, Tirofiban, Trapidil e Triflusal).
Critérios de exclusão
Mulheres grávidas.
Não apresentar Eritrograma com hemoglobina <12,0 g/dl para mulheres e
<13,0 g/dl para homens e >15,5 g/dl para ambos os sexos, contagem de
plaquetas <150.000/mm3 e >400.000/mm3, TAP e PTT com relação de tempos
paciente/testemunho >1,3 (hemograma realizado no aparelho ABX Pentra® DX
120 e o coagulograma no AMAX 190®.
Teste 2 - Critérios de inclusão (teste pool de plasmas)
Plasma citratado de descarte do Laboratório de Hematologia;
Relação dos tempos ≤ 1,3.
Critérios de exclusão
Paciente em uso de anticoagulante;
Relação dos tempos ≥1,3.
Coleta dos dados
• Teste 1- Sangue total
Pré-teste 1 – no início foram coletados sangue total de 15 voluntários que
foram tratados com solução salina, Vitamina C, vitamina C mais solução salina,
Citrato de Sódio 3,2% e Estreptoquinase após 1 hora de formação do coágulo (vol.
de 1 a 5) e 3 horas depois da formação do coágulo (vol. de 6 à 15). Cinco
voluntários foram descartados por apresentarem resultados do hemograma ou
coagulograma dentro dos critérios para exclusão (n=10). A análise dos resultados
deste pré-teste apresentou interferência devido ao grande número de variáveis,
desde valores de hematócrito a diferentes tratamentos da amostra. Por isso foi
necessário um novo ensaio, mais simplificado, comparando a ação da solução salina
(controle da diluição dos fatores) com a vitamina C. Mesmo assim, alguns resultados
do pré-teste sugeriram redução no Dímero D, o que fez incluir a avaliação da ação
da vitamina C no início do processo de coagulação determinando como seria
realizado o teste.
Teste 1 – Para o teste definitivo com sangue total foram coletados sangue
de 12 voluntários sadios sendo adicionada solução salina e Vitamina C antes da
formação do coágulo; e solução salina e Vitamina C após 1 hora, 2 horas e 3 horas
da formação do coágulo. Dois voluntários foram excluídos por apresentarem
hemograma ou coagulograma fora dos critérios para inclusão (n=10).
Descrição do Teste 1
Para realização do teste foi coletado sangue da fossa antecubital após
antissepsia, sendo abortadas as coletas que sofreram alguma intercorrência, como:
garroteamento prolongado ou dificuldade de encontrar acesso venoso. A coleta foi
realizada com duas seringas. Com a primeira seringa foi coletado sangue para os
exames de hemograma e coagulograma (para os testes de inclusão) e com a
segunda seringa foram coletados sangue com o qual foram realizados os testes.
Antes da incubação, os tubos foram identificados de 1 a 9, sendo
distribuídos 1 ml de sangue total em todos eles. No tubo 1 foi adicionado 1 ml de
NaCl 0,9%, no tubo 2 foi colocado 1ml de Vitamina C e nada foi adicionado nos
tubos 3 a 9. Depois as amostras foram colocadas em banho-maria a 37°C por 1
hora, os tubos 4, 6 e 8 receberam 1ml de NaCl 0,9% e os tubos 5, 7 e 9 receberam 1
ml de Vitamina C. Após 1 hora de incubação (2 horas totais), os frascos 1, 2, 3, 4 e 5
foram retirados do banho-maria. Após a 3ª hora, os tubos 6 e 7 foram retirados e
após a 4ª hora os tubos 8 e 9.
Após este procedimento os coágulos foram retirados, pesados e
colocados em Formol tamponado. O sobrenadante foi centrifugado à 3.000 r.p.m.
por 10 minutos e adicionado 50 microlitros de Aprotinina, sendo armazenado à –
80ºC e transportado em gelo seco para realização do teste de Dímero D. Foram
preparados blocos de parafina dos coágulos remanescentes de dois voluntários. Os
outros coágulos foram reservados para posteriores estudos.
Para pesagem do coágulo de sangue total foi utilizada a balança
Sartorius® portable PT 120.
• Teste 2- Pool de plasmas citratados (mistura de 1 ml de plasma
de 10 pacientes)
Pré-teste 2 - Foram utilizados 4 pools de plasmas citratados para
realização de pré-teste com tromboplastina cálcica. Foram realizados testes com
solução salina e com Vitamina C antes da formação do coágulo e testes com
solução salina e com Vitamina C após a formação do coágulo. Todos apresentaram
redução do Dímero D, a partir de entao foram realizados os testes.
Teste 2 - Foram utilizados 13 pools de plasmas citratados para testes
com trombina. Foram realizados testes com solução salina e com Vitamina C antes
da formação do coágulo e testes com solução salina e com Vitamina C após a
formação do coágulo.
Descrição do Teste 2 - Peso do coágulo seco – Dosagem do fibrinogênio
-Adaptado (LEWIS, 2006). Este teste consiste em separar, desidratar e pesar a
fibrina do plasma citratado.
Para cada pool foram preparados quatro tubos contendo 1ml de plasma.
Em cada tubo foi colocada uma haste de madeira para facilitar a remoção da fibrina.
Foram adicionados 0,1 ml de CaCl2 e 0,9 ml de Trombina bovina 50 U NIH/ml. Nos
tubos um e dois foram pipetados 1ml de NaCl 0,9% e 1,0 ml de Vitamina C antes da
formação do coágulo de fibrina. Os tubos um, dois, três e quatro permaneceram em
banho-maria por 60 minutos à 37º C. Foi então adicionado 1,0 ml de NaCl 0,9% e
1,0 ml de Vitamina C nos frascos três e quatro, após a formação do coágulo de
fibrina. Os quatro tubos permaneceram por mais 60 minutos em banho-maria à
37ºC. A fibrina retirada de cada frasco foi lavada com solução salina e centrifugada à
3.000 r.p.m. por 10 minutos, lavada com água destilada e centrifugada à 3.000 r.p.m.
por 10 minutos. Posteriormente, após ser desidratada com acetona por 10 minutos,
foi seca na estufa e pesada. Foram acrescentados 50 microlitros de Aprotinina no
sobrenadante que permaneceu armazenado à – 80ºC e transportado em gelo seco
para realização do teste de Dímero D.
A balança utilizada para pesagem do coágulo seco (plasma) foi a balança
analítica digital Mettler Toledo® AB 240 (0,1g).
Dímero D - Nos dois testes o Dímero D foi escolhido para o tratamento
laboratorial das amostras. Segundo definição apresentada no manual do D-Dimer
Plus (2005), este é um teste imuno-turbidimético reforçado com látex para
determinação quantitativa de produtos de desintegração de fibrina reticulados
transversalmente no plasma humano, micro-partículas de látex revestidas com
anticorpos anti-Dímeros D (realizado no aparelho Sysmex- CA-1500®)
Preparo das lâminas.
Foram preparados blocos de parafina com os coágulos que foram
tratados com NaCl 0,9% e com Vitamina C depois da coagulação de dois
voluntários. De cada bloco foram feitos quatro cortes histológicos de quatro
micrômetros de espessura no aparelho Leica marca Jung® rm 2023, corados com
Hematoxilina Eosina, PAS, Hematoxilina Fosfotúngstica e Tricrômio de Masson. As
lâminas foram numeradas da seguinte ordem:
Lâminas 1 - com adição de NaCl 0,9% pré-formação do coágulo;
Lâminas 2 - com adição de NaCl 0,9% pós-formação do coágulo;
Lâminas 3 - com adição de Vitamina C pós-formação do coágulo;
Lâminas 4 - com adição de NaCl 0,9% pré-formação do coágulo;
Lâminas 5 - com adição de NaCl 0,9% pós-formação do coágulo;
Lâminas 6 - com adição de Vitamina C pós-formação do coágulo.
Não foi possível preparo de bloco de parafina dos coágulos quando
adicionado Vitamina C antes da coagulação, pois não houve formação do coágulo.
Portanto foram analisadas somente as lâminas dos blocos 2, 3, 5 e 6, por não ter
sido possível compará-las com as lâminas 1 e 4 tratadas com NaCl 0,9%.
Sistema óptico e de captura de imagem
As imagens foram capturadas utilizando-se um microscópio Nikon®
Eclipse E400, acoplado a uma câmera da Media Cybernetics 5 megapixels,
conectada a um computador contendo o programa Image-Pro Plus 4.5 (Media
Cybernetics, Silver Spring, EUA) . As imagens foram obtidas em formato tiff.
Análise Estatística
Para análise estatística dos resultados, foi utilizado o teste não-
paramétrico de Wilcoxon e Kruskal-Wallis utilizando o programa SPSS Versão 12.0.
Foi considerada significância estatística quando p≤0,05. Foram utilizadas médias e
desvio padrão para análise e confecção de tabelas.
RESULTADOS
6-RESULTADOS
Entre os 27 voluntários que aceitaram participar da pesquisa, sete foram
excluídos por não atenderem aos critérios pré-estabelecidos, sendo que dos 20
restantes, dez foram incluídos nos pré-testes e dez nos testes finais. A causa
principal de exclusão foi relação de tempos de PTT ou INR prolongados, seguidos
de anemia, de hematócrito elevado e de plaquetopenia.
A idade de todos os voluntários variou entre 19 e 47 anos, apresentando
média de 27 anos. Ao considerar apenas os incluídos nos testes, a média foi de 28
anos.
Em relação ao resultado do hemograma dos voluntários do grupo teste,
foi observado média de hemoglobina de 13,2 g/dl, hematócrito de 40,1%, plaquetas
287.300/mm3, relações de tempo de PTT 1,06 e INR 1.0 (Tabela 1).
Tabela 1 - Exames laboratoriais dos voluntários incluídos no estudo (n=10)
EXAMES MÉDIA VARIAÇÃO REFERÊNCIA
HEMATÓCRITO 40,1Mín.- 30,6Máx.- 50,2Média- 40,1
H- 42% à 54%M- 36% à 46%
HEMOGLOBINA 13,2Mín.-11,5Máx.-16,6Média- 13,2
H- 14,0 à 18,0 g/dlM- 12,0 à 16,0 g/dl
PLAQUETAS 287.300Mín.- 93.000Máx.- 375.000Média- 287.300
150.000 à 400.000/mm3
TAP (INR) 1,0Mín.-0,963Máx- 1,408Média- 1,0
≤1,3
PTT 1,06Mín- 0,88Máx- 1,49Média- 1,06
≤ 1,3
6.1. RESULTADOS LABORATORIAIS DO DÍMERO D
Observou-se que o Dímero D do sangue total ao ser tratado com vitamina
C previamente à formação do coágulo apresenta marcada redução, sendo 71,6 mic/l
enquanto o controle, tratado com solução salina, apresentou 190,0 mic/l, sendo esta
diferença significativa (p≤0,01). Ao tratarmos o coágulo com vitamina C após uma
hora de sua formação, obtivemos um resultado estatisticamente significativo tanto
após à primeira hora, quanto após à segunda hora de atuação da vitamina C sobre o
coágulo, com valores de 89,4 mic/l para o teste e 195,3 mic/l para o controle na
primeira hora e 102,1 mic/l para o teste e 234,7mic/l para o controle na segunda
hora. Apenas nos testes onde a vitamina C e a solução salina atuaram sobre o
coágulo formado durante três horas, não houve diferença estatisticamente
significativa apresentando 126,6 mic/l para a amostra tratada com vitamina C e
108,6 mic/l para o controle (Tabela 2).
Tabela 2. Resultado da quantificação do Dímero D dos testes com Vitamina C e
solução salina em sangue total, antes da coagulação e após uma, duas e três horas
de ação sobre o coágulo. Expressos em média, desvio padrão e número de
amostras testadas.
DÍMERO D (mic/l) Solução
TempoNaCl 0,9%
(média)Vitamina C
(média)
Pré-coágulo 190,0 ± 225,6 (8) 71,6 ± 34,8 (8)*
1ª hora pós-coagulação 195,3 ± 259,0 (10) 89,4 ± 48,5 (10)*
2ª hora pós-coagulação 234,7 ± 317,0 (10) 102,1 ± 111,1 (10)*
3ª hora pós-coagulação 108,6 ± 57,7 (8) 126,6 ±123,3 (10)
*Aplicado teste estatístico de Wilcoxon apresentando diferença significativa com
possibilidade de erro de 1%.
Embora não tenha ocorrido resultado com diferença estatística dos
Dímeros D entre a primeira, segunda e terceira horas de atuação da vitamina C após
a formação do coágulo, observamos um comportamento diferente na sua dinâmica,
onde o controle (solução salina) mantém seus valores médios após uma e duas
horas decaindo na 3ª hora, enquanto a vitamina C mantém os valores baixos na
primeira e segunda horas, aumentando na terceira hora (Gráfico 2).
Dímero-D Sangue Total
15,2
15,5
12,4
15,5
14,5
16,5
1011,5
1314,5
1617,5
19
1ª hora 2ª hora 3ª hora
Salina Vit C
Gráfico 2- Evolução dos valores de Dímero D expressos em mic/l, em ensaios
utilizando sangue total (n=10), tratado com vitamina C comparado ao tratamento
com solução salina em uma, duas e três horas. Utilizado teste de Kruskal Wallis.
Ao avaliar o efeito da vitamina C sobre o pool de plasmas, observou-se que
tanto ao ser tratada previamente com vitamina C quanto após uma hora da formação
do coágulo, ocorre marcada redução do Dímero D com relevância estatística.
Sendo, respectivamente, de 129,7 mic/l para 82,3 mic/l antes da formação e de
107,8 mic/l para 81,3 mic/l no tratamento pós-formação do coágulo (Tabela 3).
Tabela 3- Resultados da quantificação do Dímero D dos testes com vitamina C e
solução salina em pool de plasmas citratados, antes da coagulação e após uma,
duas e três horas de ação sobre o coágulo. Expressos em média, desvio padrão e
número de amostras testadas.
DÍMERO D (mic/l) Solução
TempoNaCl 0,9%
(média)Vitamina C
(média)
Pré-coagulação 129,7 ± 47,0 (13) 82,3 ±33,1 (12)*
Pós-coagulação 107,8 ± 37,2 (12) 81,3 ± 38,2 (12)*
*Aplicado teste estatístico de Wilcoxon apresentando diferença significativa com
possibilidade de erro de 1%.
6.2. RESULTADOS DO PESO DOS COÁGULOS
Observou-se que nas amostras com sangue total tratadas previamente
com vitamina C, não ocorreu a formação de um coágulo bem estruturado,
dificultando a comparação dos pesos como pôde ser observado na figura 9, sendo
que a maioria, 80%, apresentou peso zero pois não foi possível isolar o coágulo
formado e definido quando tratado com vitamina C. Houveram duas exceções,
sendo que numa das amostras se formou um coágulo mínimo e na outra um coágulo
similar ao controle. Mesmo assim apresentou diferença estatística com nível de
significância de 1% (p<0.01). Os valores encontrados neste grupo apresentaram
peso médio de 82,0 mg no coágulo formado ao ser pré-tratado com vitamina C e 594
mg no coágulo pré-tratado com solução salina.(Tabela 4).
Tabela 4 - Resultado dos pesos dos testes com Vitamina C e solução salina em
sangue total, antes da coagulação e após uma, duas e três horas de ação sobre o
coágulo. Expressos em média, desvio padrão e número de amostras testadas.
PESO DO COÁGULO COM SANGUE TOTAL (mg)
SoluçãoTempo
NaCl 0,9% (média)
Vitamina C(média)
Pré-coágulo
594,0 ± 216,91 (10) 82,0 ± 235,74 (10)*
1ª hora pós-coagulação 455,0 ± 95,83 (10) 368,0 ± 167,25 (10)
2ª hora pós-coagulação 440,0 ± 106,56 (10) 411,0 ± 137,55 (10)
3ª hora pós-coagulação 444,4 ± 83,53 (10) 453,0 ± 144,99 (10)
*Aplicado teste estatístico de Wilcoxon apresentando diferença significativa com
possibilidade de erro de 1%.
Figura 9 - Tubos de teste com sangue total. Adição de vitamina C e NaCl 0,9% antes da coagulação.
NaCl Vit C
NaCl Vit C
Na figura 9, observa-se que no sangue tratado com vitamina C antes da
coagulação, não houve formação de coágulo após duas horas de ação, enquanto o
tubo do sangue tratado com solução salina apresentou coágulo moldado ao formato
do tubo.
O peso dos coágulos tratados com vitamina C por uma, duas e três horas
após a sua formação, não apresentaram diferenças estatisticamente significantes
(tabela 4) porém, observamos uma tendência ao progressivo aumento no peso até
que, na terceira hora, o valor se iguala à amostra tratada com solução salina na
primeira hora, e cujo peso manteve-se estabilizado desde esta primeira hora (gráfico
3).
Peso Sangue Total
17,6
14,112,8
18,3
14,9
15,5
1011,5
1314,5
1617,5
19
1ª hora 2ª hora 3ª hora
Salina Vit C
Gráfico 3- Evolução dos pesos dos coágulos com sangue total expresso em
miligramas (mg) em ensaios utilizando sangue total (n=10) que foram tratados após
a coagulação com vitamina C, comparados ao tratamento com solução salina após a
coagulação em uma, duas e três horas de ação. Utilizado teste de Kruskal Wallis.
Tabela 5- Resultado dos pesos dos coágulos tratados com Vitamina C comparado
aos pesos dos testes com solução salina em pool de plasmas citratados, antes e
após a coagulação. Expressos em média, desvio padrão e número de amostras
testadas.
PESO DO COÁGULO COM POOL DE PLASMA(mg) Solução
TempoNaCl 0,9%
(média)Vitamina C
(média)
Pré-coágulo 16,5 ± 27,6 (13) 7,6 ± 3,7 (13)
Pós-coágulo 7,3 ± 2,7 (13) 7,4 ± 3,5 (12)
*Aplicado teste estatístico de Wilcoxon apresentando diferença significativa com
possibilidade de erro de 1%.
O peso dos coágulos do pool de plasmas não apresentou diferença
significativa quando tratados com vitamina C previamente ou uma hora após a
formação do coágulo (Tabela 5). No entanto, devemos salientar que o coágulo
previamente tratado com vitamina C não consegue formar uma estrutura organizada
com retração de coágulo perceptível (Figura 10) e que pudesse ser retirado
integralmente do tubo como ocorria no tubo controle como observado na figura 11-
A. Isso resultou na dificuldade de isolar o coágulo para permitir uma pesagem
confiável, pois em todas os testes tivemos de isolar um conjunto de fragmentos do
material geleificado formado (Figura 11-B).
Observou-se que conforme esperado, o controle tratado com solução
salina apresenta redução significativa no peso do coágulo, o que corresponderia a
um processo fibrinolítico normal. Ao ser tratado com vitamina C não há diferença
relevante, mantendo-se constante.
Figura 10- Tubos com com pool de plasmas tratados com vitamina C e solução salina antes da coagulação. O plasma tratado com vitamina C não consegue formar uma estrutura organizada perceptível, enquanto o coágulo tratado com NaCl 0,9% apresenta rede de fibrina visível.
NaCl Vit. CNaCl Vit C
6.3. MORFOLOGIA DOS COÁGULOS FORMADOS APÓS ADIÇÃO DA
VITAMINA C E SOLUÇÃO SALINA.
A técnica de imprint não permitiu a leitura das lâminas coradas com o
corante hematológico May-Grunwald Giemsa, deixando as células com a coloração
extremamente azulada e não evidenciando a rede de fibrina (Lâmina 1).
Lâmina 1- Imprint de coágulo de sangue total corado com corante May-Grunwald Giemsa – Objetiva de 100x.
Figura 11- Fibrina retirada dos tubos nos testes com pool de plasmas tratados com solução salina e Vitamina C antes da formação do coágulo. Observa-se rede de fibrina aderida de forma homogênea em torno da haste do teste realizado com solução salina (A), enquanto nos testes com vitamina C o mesmo não acontece, tendo sido extraída fragmentada do tubo (B).
NaCl Vit C
Na amostra tratada com solução salina após a coagulação, corada com
Hematoxilina Eosina (Lâmina 3), observa-se material representado por hemácias
com moderada autólise associada a raras células leucocitárias e moderada
quantidade de fibrina que se distribui dispersamente por todo o coágulo. a Lâmina 2,
de coágulo tratado com vitamina C, apresenta material representado por hemácias
com acentuada autólise associada a raras células leucocitárias, em meio a pequena
quantidade de fibrina predominantemente na periferia e material hialino na periferia
do coágulo, com aspecto de "cápsula" compacta.
Bordo do coágulo tratado com vitamina C
Borda do coágulo tratado com solução salina
Hematoxilina Eosina Hematoxilina Eosina
Objetiva de 10x Objetiva de 10x
Leucócitos Leucócitos
Material hialinizado
Lâminas 2 e 3- Lâminas de sangue total tratado com vitamina C (2) e com solução salina (3) após a coagulação, coradas com HE. Observa-se material hialinizado na periferia do coágulo, com aspecto de "cápsula" compacta. Material representado por hemácias e polimorfonucleares com acentuada autólise(2). Material representado por hemácias e polimorfonucleares com moderada autólise (3).
2 3
Na região central dos coágulos corados com HE tratados com vitamina C
(lâmina 4) pode ser observado material com raros polimorfonucleres, moderada
autólise e discreta rede de fibrina. A lâmina controle tratada com H.E (lâmina 5),
exibe moderada autólise, mas apresenta rede de fibrina mais evidente que a rede
observada na do grupo teste.
Região central do coágulo tratado com vitamina C
Região central do coágulo tratado com solução salina
Hematoxilina Eosina Hematoxilina Eosina
Objetiva de 10x Objetiva de 10x
FibrinaFibrina
Lâminas 4 e 5 - lâminas da região central do coágulo de sangue tratado com vitamina C (4) e com solução salina (5) após a coagulação, coradas com H. E. Apresentando pequena quantidade de fibrina e moderada autólise (4) e grande quantidade de fibrina com moderada autólise (5).
4 5
A borda do coágulo do grupo controle corado com PAS evidenciou
discreta autólise e material fibrinóide em grande quantidade na periferia (Lâmina 7).
A lâmina de coágulo de sangue total tratada com vitamina C e corada com PAS
(lâmina 6), exibiu pequenas redes de fibrina e intensa autólise, revelando também
material hialino na borda do coágulo com aspecto de cápsula compacta.
Bordo do coágulo tratado com vitamina C
Borda do coágulo tratado com solução salina
PAS PAS
Objetiva de 100x Objetiva de 100x
Fibrina
Fibrina
Fibrina
Lâminas 6 e 7- Lâminas de sangue total tratado com vitamina C (6) e com solução salina (7) após a coagulação, coradas com PAS. Observa-se material hialinizado na periferia (6). Observa-se grande quantidade de fibrina na periferia (7).
Materialhialino
6 7
Apesar das lâminas da região central dos coágulos coradas com PAS,
não terem contribuído muito com o estudo, consegue-se perceber que a rede de
fibrina parece mais evidente na lâmina tratada com solução salina em comparação a
tratada com vitamina C, e a autólise também parece estar mais acentuada.
Região central do coágulo tratado com vitamina C
Região central do coágulo tratado com solução salina
PAS PAS
Objetiva de 40x Objetiva de 40x
8 9Fibrina Fibrina
Lâminas 8 e 9- Lâminas de sangue total tratado com vitamina C (8) e com solução salina (9) após a coagulação, coradas com PAS. Observa-se pequenas redes de fibrina no material tratado com vitamina C (8) e grandes redes de fibrina no material controle.
A coloração com Tricrômio de Masson (Lâminas 10 e 11) não contribuiu
para a avaliação, porém pode-se perceber a diferença de estrutura nas bordas,
evidenciando a capsula que envolve o coágulo tratado com com vitamina C.
Coágulo tratado com vitamina C Coágulo tratado com solução salina
Tricrômio de Masson Tricrômio de Masson
Objetiva de 10x Objetiva de 10x
10 11
Lâminas 10 e 11- Lâminas de sangue total tratado com vitamina C (10) e com solução salina (11) após a coagulação, coradas com Tricrômio de Masson. Observa-se material hialinizado na periferia do coágulo tratado com vitamina C com aspecto de "cápsula"(10).
As lâminas da região central dos coágulos (Lâminas 12 e 13) coradas
com Tricrômio de Masson, não contribuíram com o estudo, não sendo possível
visualização da rede de fibrina.
Região central do coágulo tratado com vitamina C
Região central do coágulo tratado com solução salina
Tricrômio de Masson Tricrômio de Masson
Objetiva de 10x Objetivo de 10x
12 13
Apesar de ter sido repetida por três vezes a técnica de coloração com
Hematoxilina Fosfotúngstica, não ocorreu coloração das estruturas celulares, ficando
extremamente clara e impossibilitando a visualização de qualquer estrutura no
coágulo.
Lâminas 12 e 13 - Lâminas de sangue total tratado com vitamina C (12) e com solução salina (13) após a coagulação, coradas com Tricrômio de Masson. Região central do coágulo
DISCUSSÃO
7- DISCUSSÃO
As vitaminas são substâncias que participam em variadas reações
metabólicas controladas por enzimas e coenzimas no organismo, sendo essenciais
ao funcionamento do organismo na forma de co-fatores, os que as torna essenciais
para o metabolismo celular. A ação das vitaminas no processo de coagulação já é
conhecida de longa data. Em 1929, Henrik Dam , descobriu a vitamina K, cujo nome
vem da palavra Dinamarquesa "Koagulation" (KLACK, 2006), pois a sua deficiência
gera a não produção dos chamados fatores vitamina K dependentes sendo o fígado
o local onde são sintetizadas as proteínas da coagulação dependentes de vitamina
K (DÔRES et al., 2001). Outra vitamina que tem sido estudada em relação a
atividade na coagulação é a vitamina E (MEHTA, 1999), esta vitamina possui
importante atividade anti-oxidante e poderia estar intervindo na coagulação.
A necessidade da vitamina C é conhecida desde o século XVIII, quando o
aumento significativo de mortalidade entre marinheiros que passavam longos
períodos embarcados foi associada à deficiência de alimentos cítricos (AZULAY et
al.,2003).
No entanto, os estudos realizados até a presente data e os dados
encontrados na literatura sobre a ação da vitamina C no processo hemostático
apresentam resultados muito variados, não permitindo uma conclusão definitiva
sobre o efeito desta molécula (KAEHLER et al., 2008; SAVINI et al., 2007;
PELLEGRINI et al., 2004; TOUSOULIS et al., 2003; ANTONIADES et al., 2003;
LABINJOH et al., 2001; CHESNEY et al., 2000; TOFLER et al.,2000; RIFICI et
al.,1997; MHETA, 2006).
Este estudo tem em foco a ação da vitamina C sobre os trombos
sanguíneos (in loco), e para estabelecer o modelo de estudo, foi realizado um
projeto piloto que demonstrou a necessidade de avaliar além do processo
fibrinolítico, o próprio processo de coagulação que parecia estar sofrendo a ação do
mesmo. Desta forma, foi estabelecido o modelo utilizando como controle o
tratamento da amostra com Cloreto de Sódio 0,9% (solução salina), devido à
diluição que a vitamina C promoveria nos fatores de coagulação sendo avaliado
antes e depois da formação do coágulo.
Para os testes iniciais foi utilizado um pool de plasma citratado para
estabelecer um modelo que não sofresse interferência dos valores de hematócritos
que, devido a valores variados de plasma, geram diferentes diluições dos mesmos.
Essas diferentes diluições poderiam alterar de forma variável os fatores de
coagulação, levando à geração de coágulos menores e menor quantidade de
produtos de degradação. Neste modelo foi utilizada a trombina para promover a
geração da rede de fibrina. Os testes foram realizados tratando-se com vitamina C
antes e depois da formação do coágulo.
Posteriormente o experimento realizado com o pool de plasmas foi
replicado com o sangue total e, neste momento, decidiu-se adicionar os tempos de 2
e 3 horas após tratamento com vitamina C com objetivo de avaliar a evolução do
coágulo e como se comportava ao longo do tempo.
Ao executarmos os experimentos, algumas observações foram realizadas
em relação a algumas características físico-químicas do coágulo formado. No
sangue total, previamente tratado com vitamina C, foi observado que 80% das
amostras não apresentaram coágulo estável que permitisse pesagem após duas
horas sob incubação em banho-maria a 37 °C. No teste utilizando o pool de plasmas
observou-se a solidificação do plasma, porém a estrutura formada era muito instável,
fragmentando-se no procedimento de retirada do tubo para fins de pesagem. Neste
caso, o controle apresentou estrutura moldada, com retração perceptível e de fácil
retirada do tubo para o processamento e pesagem. Os plasmas utilizados foram de
amostras citratadas e centrifugadas a 500g, resultando em plasma pobre em
plaquetas. No entanto, como nas amostras controle ocorreu retração do coágulo de
fibrina (Figura 11 A), podemos considerar que haviam plaquetas suficientes na
amostra para que esta retração ocorresse. Ono et al. (2008), relatam que o tamanho
do trombo está diretamente relacionado a agregação plaquetária, o que pode ser
confirmado ao comparar-se o tamanho dos coágulos com sangue total com aqueles
formados a partir de plasma pobre em plaquetas.
A ausência de retração do coágulo observada ao se tratar o sangue total
com vitamina C antes da coagulação, pode ser conseqüência da ação da vitamina C
sobre a atividade plaquetária, uma vez que as plaquetas exercem esta função,
sendo essenciais no estágio inicial da formação do trombo pois secretam
mediadores que promovem o recrutamento e ativação de outras plaquetas e de
leucócitos (WOHNER, 2008). Estes por sua vez, têm capacidade de estocagem de
grande quantidade de acido ascórbico e podem prevenir o início da coagulação ao
liberar Óxido Nítrico que atua como inibidor da agregação plaquetária (RAGHVAN,
2003).
Os valores de Dímero D do sangue tratado com vitamina C, antes da
coagulação, apresentam significativa redução, possivelmente como resultado da
alteração na velocidade da formação do coágulo e, conseqüentemente, diminuição
do substrato para a ação da plasmina que gera menor quantidade de produtos de
degradação. Estes achados vão de encontro aos estudos de Mehta (1998) que
observou o retardo na formação do trombo após suplementação alimentar com
antioxidantes (vitamina C, vitamina E).
Quando o coágulo formado durante uma hora de incubação em banho-
maria é tratado com vitamina C, percebem-se valores no Dímero D marcadamente
reduzido, porém com valores discretamente maiores que o Dímero D da amostra
tratada antes do processo de coagulação, possivelmente pela fibrinólise basal nos
momentos iniciais da formação do coágulo. Nesta primeira hora, observa-se valores
significativamente reduzidos, possivelmente em decorrência da ação sobre os
ativadores da plasmina (TOFFLER et al, 2003; TOUSOULIS et al, 2003;
ANTONIADES et al, 2003), ou potencialização dos inibidores dos ativadores da
plasminogênio (ANTONIADES et al., 2003; TOUSOULIS et al, 2000).
Até a segunda hora esta redução é mantida, e na terceira hora não foram
observadas diferenças ao comparar com a solução salina, no entanto, este aumento
não atinge os valores da primeira e segunda hora encontrados na amostra controle
(NaCl 0,9%).
O Dímero D dos testes com pool de plasmas citratados, tratadas com
vitamina C antes e após uma hora da coagulação, apresentam comportamento
similar ao ser observado nas amostras testadas com vitamina C sobre o sangue
total, ocorrendo redução significativa nos dois momentos.
Ao comparar os valores de Dímero D dos plasmas citratados antes da
formação do coágulo com os valores de Dímero D do teste com sangue total,
tratados com solução salina, observamos valores menores na amostra de pool de
plasmas, possivelmente devido a geração de ativadores de plasminogênio (PAIs),
pelos leucócitos que também induzem a inibição da agregação plaquetária na
presença de ácido ascórbico (Raghvan, 2003).
Ao analisarmos o peso das amostras de sangue total tratada com
vitamina C antes da coagulação, observamos redução com significância estatística.
Embora não haja diferenças com significância estatística, em uma hora, duas e três
horas de tratamento com vitamina C após a coagulação, os valores atingidos na
primeira hora após o tratamento com solução salina, valor médio semelhante só é
atingido após a terceira hora do tratamento com vitamina C, indo de forma análoga
aos estudos de Metha (1980), que observou redução na velocidade de formação do
coágulo ao usar suplementação alimentar com antioxidantes em modelo murino.
Não foram observados valores significativamente diferentes nos ensaios
utilizando pool de plasmas, no caso das amostras tratadas com vitamina C
previamente à formação do coágulo, devido à dificuldade no seu isolamento e
secagem, uma vez que se apresentava fragmentado e úmido por mais tempo em
comparação ao grupo controle.
Os corantes utilizados foram o PAS, Tricrômio de Masson, H. E e
Hematoxilina Fosfotúngstica, escolhidos após discussão com o Patologista Porfírio
José Soares - Professor do Departamento de Patologia da UFF, pela possibilidade
de que estes corantes tem em evidenciar a rede de fibrina. O corante Hematoxilina
Fosfotúngstica, não contribuiu para o estudo, pois apesar de haver sido preparada
três vezes, não possibilitou a leitura das lâminas, deixando-as extremamente
descoradas.
As três colorações, PAS, H.E e Tricrômio de Masson evidenciaram
presença de material hialinizado na periferia do coágulo, com aspecto de "cápsula"
compacta que se distingue nitidamente do resto do material (Lâminas 2, 6 e 10), o
que não foi observado em nenhuma lâmina do controle. A região central dos
coágulos tratados com vitamina C corada com H.E. apresenta moderada autólise, e
rede de fibrina mais evidente que a observada no grupo teste (Lâmina 4 e 5). As
lâminas da região central dos coágulos tratados com vitamina C coradas com
Tricrômio de Masson e PAS não contribuíram para a avaliação (Lâminas 8 e 12).
As estruturas do coágulo visualizadas sugerem a atividade da vitamina C
da periferia para o centro, pois intensa autólise é observada, principalmente na sua
região mais externa. A rede de fibrina encontra-se mais evidente no grupo controle,
podendo ser muito bem definida com o PAS (Lâmina 7), o que não foi observado no
material tratado com vitamina C (Lâmina 6). Os controles apresentam integridade
estrutural na periferia (Lâminas 3, 7 e 11), muitas vezes permitindo a observação de
filamentos de fibrina na superfície do coágulo (Lâmina 7).
Os dados obtidos sugerem que a vitamina C atua nas diferentes etapas
do processo de coagulação e pode contribuir na desobstrução dos cateteres
intravenosos. No ensaio pré-coagulação foi observado inibição da formação do
coágulo. Ao atuar sobre o coágulo já formado, induz a uma autólise intensa na
região periférica, formando uma espécie de capa protetora, permitindo que a
dinâmica normal do coágulo possa ocorrer no seu interior com retração e fibrinólise.
O Dímero D estaria reduzido no sangue total nos momentos iniciais sob ação da
vitamina C no coágulo já formado, devido a inibição promovida pela vitamina C
sobre o processo de coagulação.
Sua ação sobre a estrutura do coágulo ocorre da periferia para a região
central promovendo intensa lise perceptível à microscopia, assim, favorecendo a
redução e inibindo o aumento do tamanho do coágulo pré-formado e a geração de
novos coágulos, facilitando o restabelecimento do fluxo local.
CONCLUSÃO
8- CONCLUSÃO
Ao pesquisar a ação da Vitamina C num modelo in vitro sobre os trombos
sanguíneos, observou-se que a vitamina C atua com maior intensidade na etapa
pré-formação do coágulo alterando a sua estrutura, dessa forma conclui-se que:
✔ A hipótese levantada foi rejeitada.
✔ Foi criado um modelo in vitro de coagulação e fibrinólise.
✔ Os resultados indicaram que a vitamina C inibe a formação de novos trombos
e impede a progressão de trombos já formados.
✔ Quando é utilizada sobre o coágulo formado, reduz a geração do Dímero D até
a segunda hora de tratamento e à medida que o ácido ascórbico vai perdendo a
sua atividade, os valores do Dímero D gerados igualam-se ao grupo controle. No
entanto, estes valores se mantêm inferiores aos valores obtidos na primeira e
segunda hora nas amostras controle, sugerindo uma inibição, também do
processo fibrinolítico.
✔ O peso do coágulo de sangue total apresentou redução significativa somente
quando tratado com vitamina C antes do processo de coagulação, enquanto com
o pool de plasmas citratados, não houve diferença significativa.
✔ A morfologia do coágulo tratado com vitamina C mostra intensa autólise na
região periférica formando uma espécie de cápsula ao redor da estrutura e
pequena quantidade de fibrina na região central, enquanto o coágulo tratado com
solução salina apresenta moderada quantidade de fibrina em toda área
observada.
Os resultados desta pesquisa confirmam os resultados da prática clínica
com o uso da vitamina C na desobstrução de cateteres venosos centrais, e
fornecem respaldo sobre a afirmação de que a vitamina C tem ação sobre o
processo de coagulação. Porém são necessários mais estudos para definir sobre
quais elementos do processo de coagulação e fibrinólise esta Vitamina atua, e qual
o seu mecanismo de ação.
Acreditamos que este estudo possa contribuir para a assistência ao
cliente portador de cateter e, em especial, às crianças com câncer.
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ao implante de cateter para hemodiálise: avaliação pela ultra-sonografia com
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60. VINE, A. K. Recent advances in Haemostasis and Thrombosis. Retina, the Journal of Retinal and Vitrious Diseases. 29 (1), 2009.
ANEXOS
ANEXO 1 FOLHA DE APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA
ANEXO 2FOLHA DE APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA- ADENDO
ANEXO 3TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Universidade Federal FluminensePrograma de Pós graduação em Patologia Curso de mestrado Projeto: “AÇÃO DA VITAMINA C NO PROCESSO FIBRINOLÍTICO IN VITRO”Pesquisador Responsável: Ana Alves Macedo Orientadoras: Dra. Beatriz Guitton Renaud Baptista de Oliveira Dra. Hye Chung Kang
Telefones para contato: (021) 2575-59-29 - (031) 92088250
Nome do voluntário: ______________________________________________________Idade: _______ anos R.G: ________________________Telefone: ___________________________ Celular: ___________________________
O(A) Sr. (a) está sendo convidado(a) a participar do projeto de pesquisa intitulado “AÇÃO DA VITAMINA C NO PROCESSO FIBRINOLÍTICO IN VITRO”' que está sendo desenvolvida como dissertação de mestrado na Universidade Federal Fluminense – de responsabilidade da pesquisadora Ana Alves Macedo.
Muitos pacientes, inclusive crianças com câncer, utilizam um cateter na veia durante meses ou até mais de um ano. Para que toda vez que for fazer quimioterapia não seja necessário a punção de uma veia. No entanto, este cateter muitas vezes obstrui (entope) por acúmulo de sangue no seu interior acarretando em alguns casos, necessidade de ser retirado, o que causa prejuízo para o tratamento além de desconforto e dor para o paciente.
Alguns medicamentos são utilizados para a desobstrução do cateter, mas possuem efeitos colaterais. O objetivo desta pesquisa é analisar a ação da Vitamina C na desobstrução de cateteres.
Aos voluntários é solicitado autorização para coleta de sangue, lembrando que os materiais utilizados (seringa e agulha) são estéreis e descartáveis e que será realizada por pessoa treinada e habilitada.
Você não será identificado pelo seu nome nesta pesquisa, o que manterá seu anonimato e confidencialidade.
Serão coletados 15 ml de sangue para uso na pesquisa e para exames laboratoriais. Com uma parte da amostra (8ml) serão realizados exames para avaliar se o seu sangue poderá ser utilizado na pesquisa onde serão avaliados Eritrograma, contagem de plaquetas, TAP, PTT e tempo trombina. A outra parte (7 ml) será utilizada na formação do coágulo.
Caso você seja portador de algum fator de risco para tromboembolismo: varizes em membros inferiores, hemofilia, púrpura, neoplasias, pneumopatia ou cardiopatia crônica, doença de von Willebrand, esteja em puerpério, tenha sido submetido a cirurgia recente ou esteja em uso de medicamentos que possam alterar a coagulação, tais como, AAS, estrogênio, Heparina, Abciximab, Clopidrogel, Dipiridamol, Ticlopidina, Tirofiban, Trapidil e Triflusal, etc., deverá informar ao pesquisador pois não poderá participar do estudo.
Seu sangue que será utilizado apenas na pesquisa em questão e os dados serão divulgados em eventos e publicações científicas.
Na posição de participante voluntário desta pesquisa, você pode recuar-se ou desistir de participar e retirar o seu consentimento a qualquer momento que você julgar necessário sem que isso implique em qualquer tipo de prejuízo.
Atenção: Se a qualquer momento você necessitar fazer uso de medicamentos que alterem sua capacidade de coagulação, você deverá, informar caso seja solicitado novamente sua participação.
Eu,____________________________________________________________ , li e entendi todas as informações sobre este estudo e todas as minhas perguntas e/ou dúvidas foram respondidas a contento. Portanto consinto voluntariamente participar desta pesquisa.
Niterói, _____ de _____________________ de _______
______________________________________________________________Nome e assinatura do voluntário
______________________________________________________________Nome e assinatura do responsável por obter o consentimento
______________________________________________________________Testemunha 1
______________________________________________________________Testemunha 2
ANEXO 4COMPROMISSO DE DIVULGAÇÃO DE RESULTADOS
ENCAMINHADO AO COMITÊ DE ÉTICA
Eu, ANA ALVES MACEDO, declaro que os resultados da pesquisa intitulada
“AÇÃO DA VITAMINA C NO PROCESSO FIBRINOLÍTICO IN VITRO” serão tornados
públicos, sejam eles favoráveis ou não a confirmação das hipóteses formuladas.
Niterói, agosto de 2007.
____________________________________________________
Pesquisador responsável
ANEXO 5
COMPROMISSO DE UTILIZAÇÃO DO MATERIAL E RESULTADOS DA PESQUISA ENCAMINHADO AO COMITÊ DE ÉTICA
Eu, ANA ALVES MACEDO, declaro o uso e destinação do material e/ou
dados coletados na pesquisa intitulada “AÇÃO DA VITAMINA C NO PROCESSO FIBRINOLÍTICO IN VITRO” serão usados somente para fins de divulgação científica na
área da saúde.
Niterói, agosto de 2007.
____________________________________________________
Pesquisador responsável
APÊNDICE 1
SOLUÇÕES USADAS NA PESQUISA:
APROTININA – Trasylol ®Fabricante: BAYERLote: BXBSDT1Data da fabricação: 07/2005Validade: 06/2008Concentração:500.000 UIC
ACETONA® – (CH3)2COFabricante: VetecLote 0605929Validade: 09/2011
ESTREPTOQUINASE - Streptase®Fabricante: ZLB BehringLote:58525711UData da fabricação:11/05Validade;10/08Concentração: 250.000 UI
VITAMINA C - Cevita®Fabricante: TeutoLote:0217211/ 0217213 /0217210Data da fabricação:12/2006Validade: 12/2008Composição:Ácido ascórbicoConcentração:100mg/ml
TROMBOPLASTINA CÁLCICA Fabricante: PT LabtestLote: 7003Ref. 501-5/2
FIBRINOGEN HEMOSTASISFabricante: LabtestLote: 8003Validade: 31/05/09Ref. 503- 5/2 Composição: Trombina BovinaConcentração: 100 u NHI/mL
SORO FISIOLÓGICO 0,9%Lote: 80141Validade: 02/2010
APÊNDICE 2
Quadro dos valores dos pesos e Dímeros D das amostras de pool de plasmas
PRÉ FORMAÇÃO DO COÁGULO
Peso D-dímero
Pool Vit C NaCl 0,9% Vit C NaCl 0,9%1 0,0040 0,0047 86,0 141,02 0,0066 0,0075 95,0 238,03 0,0050 0,0090 70,0 103,04 0,0010 0,0177 < 50 95,01 0,0129 0,0088 134,0 185,02 0,0140 0,0060 121,0 132,03 0,0110 0,0084 111,0 141,04 0,0095 0,0082 121,0 147,01 0,0069 0,0098 50,0 106,02 0,0045 0,0072 50,0 63,03 0,0068 0,0096 50,0 67,04 0,0080 0,1080 50,0 122,05 0,0085 0,0102 50,0 146,0
POS FORMAÇÃO DO COÁGULO
Peso D-dímero
Pool Vit C NaCl 0,9% Vit C NaCl 0,9%1 0,0053 0,0013 59 982 0,0071 0,0077 114 1693 0,0138 0,0047 62 1244 0,0070 0,0087 < 50 961 0,0136 0,0095 164,0 156,02 gelatinosa 0,0119 102,0 131,03 0,0108 0,0074 116,0
4 0,0075 0,0057 108,0 118,01 0,0038 0,0084 50,0 101,02 0,0053 0,0062 50,0 50,03 0,0060 0,0052 50,0 50,04 0,0055 0,0094 50,0 124,05 0,0033 0,0082 50,0 76,0
Amostra insuficiente
APÊNDICE 3
Quadro dos valores dos pesos e Dímeros D das amostras de sangue total
Pré formação do coágulo Pós formação do coágulo
Nº Teste 1 hora 1ª hora 2ª hora 3ª hora
Na Cl 0,9%
Vit C Sem soluto Na Cl 0,9%
Vit C Na Cl 0,9%
Vit C Na Cl 0,9%
Vit C
1
Peso 0,84 0 0,58 0,54 0,55 0,54 0,42 0,42 0,64
D dímero
210,0 145,0 611,0 187,0 147,0 248,0 116,0 217,0 98,0
2Peso 0,76 0,07 0,39 0,40 0,23 0,34 0,13 0,52 0,15
D-dímero
736,0 98,0 1692,0 922,0 184,0 1101,0 411,0 Amostrainsuficiente
445,0
3Peso 0,48 0 0,65 0,44 0,42 0,47 0,38 0,33 0,37
D-dímero
80,0 50,0 Plasmahemoliz.
116,0 51,0 125,0 63,0 Plasmahemolizado
59,0
4Peso 0,83 0 0,90 0,44 0,42 0,45 0,48 0,60 0,62
D-dímero
50,0 50,0 115,0 60,0 50,0 50,0 50,0 67,00 50,0
5Peso 0,38 0 0,24 0,24 0,34 0,34 0,40 0,35 0,43
D-dímero
112,0 50,0 S/ leit 105,0 50,0 93,0 50,0 102,0 50,0
6Peso 0,70 0 0,008
destruído0,53 0,44 0,49 0,39 0,47 0,45
D-dímero
135,0 80,0 S/ leit 101,0 88,0 140,0 103,0 96,0 50,0
7Peso 0,20 0,75 0,32 0,39 0 0,33 0,27 0.26 0,60
D-dímero
111,0 50,0 1425,0 162,0 121,0 316,0 72,0 50,0 205,0
8Peso 0,46 0 0,74 0,49 0,31 0,35 0,54 0,40 0,44
D-dímero
86,0 50,0 124,0 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 143,0
9Peso 0,77 0 0,25 0,55 0,59 0,66 0,62 0,44 0,45
D-dímero
209,0 127,0 353,0 157,0 103,0 174,0 56,0 156,0 116,0
10Peso 0,52 0 0,44 0,53 0,38 0,43 0,48 0,47 0,38
D-dímero
70,0 50,0 250,0 93,0 50,0 50,0 50,0 131,0 50,0
