terapia génica: da produção de modelos animais de doença ao tratamento luís pereira de almeida...

Terapia Génica:da produção de modelos animais de doença

ao tratamento

Luís Pereira de Almeida

luispa@ci.uc.pt

lpereiradealmeida@gmail.com

Departamento de Vectores e Terapia Génica Head: Mª Conceição Pedroso de Lima

Encontro de Ciência em PortugalFundação Calouste GulbenkianLisboa, 12 e 13 de Abril de 2007

Vectores virais

Transplantação de células

Células encapsuladas

Bombas osmóticas

Aebischer and Ridet TINs; 2000

Sistemas poliméricos

Terapia génica ex vivo

Terapia génica in vivo

Estratégias de administração para o sistema nervoso central

LPAlmeida

Transferência de genes com vectores lentivirais

Célula alvo

LTR GAGPRO POL

VIFVPR VPU NEF

LTRENV

TATREV

HIV-1

PGKGAG RRE

SASD

LTR

SIN

Transgene WHV

Genoma do vector

• Terceira geração - Seguros

• Sem capacidade de replicação

• Transdução de células que não se dividem

• Neurotropismo

• Expressão prolongada

• Ausência de resposta imunitária

LPAlmeida

Medula espinal

estriado

SN

200 000 a 300 000 células com o gene de interesse

Transferência de genes para diferentes regiões do sistema nervoso central do rato

RNA genome

surface glycoprotein

transmembrane proteins

matrixcapsidnucleocapsid

integrasereverse transcriptase

RNA genome

surface glycoprotein

transmembrane proteins

matrixcapsidnucleocapsid

integrasereverse transcriptase

RNA genome

surface glycoprotein

transmembrane proteins

matrixcapsidnucleocapsid

integrasereverse transcriptase

RNA genome

surface glycoprotein

transmembrane proteins

matrixcapsidnucleocapsid

integrasereverse transcriptase

RNA genome

surface glycoprotein

transmembrane proteins

matrixcapsidnucleocapsid

integrasereverse transcriptase

RNA genome

surface glycoprotein

transmembrane proteins

matrixcapsidnucleocapsid

integrasereverse transcriptase

LPAlmeida

Doença de Huntington

transcrição Huntingtina- 350kDa

traduçãoNH2

>40 Doença de Huntington

(CAG)n

huntingtin gene

8-29 normal

- 67 exões- 200 kb- cromossoma 4

Gene da Huntingtina

• Movimentos involuntários descoordenados, demencia, depressão, psicose

• morte 15-20 anos após manifestação• Sem terapia• Modelos transgénicos com

neurodegeneração, quando existente, muito ligeira

Neurónios Gabaérgicos

striatum

LPAlmeida

Gene mutado

Promotor5’LTR 3’ LTRGene da doença

1vector lentiviral

4

Modelos animais

Injecção no cérebro3

2

Produção de vectores lentivirais

- Doença de Huntington - Doença de Machado-Joseph- Doença de Parkinson- Doença de Alzheimer

Vectores lentivirais para produzir modelos animais de doenças neurodegenerativas

LPAlmeida

Vectores

controlo

Produção de um modelo da doença de Huntington utilizando vectores lentivirais

0.5mm

Agregados de huntingtina

Lesão neuronal

Huntingtina mutante 82 Q

transgene

transgene

Vectores

Huntintina mutante

VectoresHuntingtina mutante

50 µm

100 µm

Huntingtinacontrolo 19 Q

Ausência de agregados de huntingtina

Ausência de lesão neuronal

Injecção estereotáxica no cérebro do rato

LPAlmeida

• Novos modelos genéticos

• Transponíveis para outras espécies

• Estudo dos mecanismos moleculares da doença in vivo

• Avaliação de terapias

Utilização de vectores lentivirais para produzir modelos animais de doenças neurodegenerativas

Ataxia espinocerebelosa do tipo 3 ou doença de Machado Joseph

• Doença neurodegenerativa

• Maior incidência em Portugal (Ilha das Flores)

• Principal sintoma: ataxia - descoordenação dos movimentos musculares voluntários

Taroni F & DiDonato Nat Rev Neurosci. 2004 Aug;5(8):641-55

gene SCA3/MJD1

(CAG)n

n= 13-36 normal

n= 61 a 84 doença

Ataxina 3transcrição

translação

-14q32.1

NH2

gene da ataxina-3

42 kDa

LPAlmeida

AGCAGCAGCGGGACCTATC shAtax mut

T T C AA

A G AGTCGTCGTCGCCCTGGATAG

AGCAGCAGGGGGACCTATC shAtax wt

T T C AA

A G AGTCGTCGTCCCCCTGGATAG

Nova estratégia para o tratamento da doença de Machado-Joseph

silenciamento da expressão da ataxina-3 mutante com vectores lentivirais

Ataxina mutante

+

sequencias controlo

Ataxina mutante

+

sequências para silenciamento

ataxina-3 mutante

1H9 DARPP-32 Dupla marcação

1H9 DARPP-32

3 semanas

Neuroprotecção mediada pelos lentivirus que silenciam a produção da ataxina mutante

Ausência de agregados e de perda de DARPP-32

Agregados de Ataxina-3 perda de IR-DARPP-32

Ataxina-3 mutante

+ sequencias

controlo

Ataxina-3 mutante

+ sequências

para silenciamento

ataxina-3 mutante

LPAlmeida

Vectores lentivirais: plataforma tecnológica de administração no Sistema Nervoso Central

Mutantgene

Therapeuticgene

Therapy / validation ofmolecular targets

Models ofdisease

Mutantgene

Mutantgene

Therapeuticgene

Therapeuticgene

Therapy / validation ofmolecular targets

Models ofdisease

• Gerar novos modelos animais de doenças do Sistema Nervoso Central

• Validar alvos terapêuticos

• Terapia génica para o Sistema Nervoso Central

Terapia/validação de alvos moleculares

Modelos de doença

LPAlmeida

Agradecimentos

MIRCen

Nicole Déglon

Philippe Hantraye

Emmanuel Brouillet

Raymonde Hassig

Nöelle Dufour

Patrick Aebischer

Ruth Luthi-Carter

Étienne Regulier

Philippe Colin

Valérie Perrin

Veronica ColomerJohns Hopkins School of

Medicine, USA

Sebastian KuglerGottingen University, DE

Sandro AlvesIsabel FerreiraAna Luísa Carvalho Conceição Pedroso LimaSérgio SimõesJoão Nuno Moreira

1H9 DARPP-32 Dupla marcação

1H9 DARPP-32

3 semanas

Neuroprotecção mediada pelos lentivirus que silenciam a produção da ataxina mutante

Ausência de agregados e de perda de DARPP-32

Agregados de Ataxina-3 perda de IR-DARPP-32

Ataxina-3 mutante

+ sequencias

controlo

Ataxina-3 mutante

+ sequências

para silenciamento

ataxina-3 mutante

LPAlmeida

• Vectores lentivirais que expressam RNAs curtos de cadeia dupla permitem silenciar a expressão da ataxina-3 mutante envolvida na doença de Machado-Joseph- potencial interesse terapêutico

Vectores

controlo

VectoresHuntingtina mutante

de Almeida et al. (2002) J. Neurosci. 22: 3473-3483

Lentiviral-based Model of Huntington’s disease in adult rats

0.5mm

50 µm 100 µm

Agregados de huntingtina Lesão neuronal

Hu

nti

ng

tin

a m

uta

nte

82

Q

transgene

Hu

nti

ng

tin

aco

ntr

olo

19

Q

transgene