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Rafael Ciro Marques Cavalcante
Desenvolvimento de estratégias vacinais contra tumores induzidos pelo
Vírus do Papiloma Humano tipo 16 (HPV-16) baseadas em linhagens
geneticamente modificadas de Bacillus subtilis
SÃO PAULO 2008
Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação do Departamento de Microbiologia do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para obtenção do Título de Mestre em Ciências Biológicas.
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Rafael Ciro Marques Cavalcante
Desenvolvimento de estratégias vacinais contra tumores induzidos pelo
Vírus do Papiloma Humano tipo 16 (HPV-16) baseadas em linhagens
geneticamente modificadas de Bacillus subtilis
SÃO PAULO
2008
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação do Departamento de Microbiologia do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para obtenção do Título de Mestre em Ciências Biológicas. Área de concentração: Microbiologia Orientador: Prof. Dr. Luís Carlos de Souza Ferreira
3
Este trabalho foi realizado sob a orientação da Prof. Dr. Luís Carlos de Souza
Ferreira, no Centro de Vacinas e Terapia Gênica (CEVAT-GENE 3), no
Departamento de Microbiologia do Instituto de Ciências Biomédicas da
Universidade de São Paulo, com o apoio financeiro da CAPES.
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Dedico aos meus Pais, por todo
apoio e pela incessante torcida.
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AGRADECIMENTOS
Quero, nesse espaço que me é reservado, demonstrar minha
gratidão a todos que de maneira solíscita ajudaram-me na execução e
confecção do presente trabalho. Tenho a alegria de ter contado com a
colaboração e com o entusiasmo de muitas pessoas, sem as quais a
conclusão do presente trabalho não seria possível.
Inicialmente, quero agradecer ao meu orientador Prof. Luís Carlos
de Souza Ferreira. Professor, melhor seria definí-lo como educador, que
com maestria e notável dedicação, propocionou-me dois anos de
aprendizado científico, bem como, de marcante amadurecimento pessoal.
Agradeço pela oportunidade inicial concedida, pela paciência com os erros,
pela confiança depositada e pelas, não raras, oportunidades de
aprendizado. Espero que o professor Luís continue trabalhando dessa
forma, no intuito de termos um país produtor de tecnologia e conhecimento,
menos dependente e, sobretudo, sem desigualdades sociais tão
expressivas.
Agradeço à Profa. Rita de Cássia Café Ferreira, pela oportunidade
de estágio em seu laborátório, pelos conhecimentos científicos
compartilhados, pelo apoio nos momentos difíceis e pela preocupação
constante com o bem-estar de todos no laboratório. Agradeço-a ainda,
pelas várias oportunidades de aprendizado e enriquecimeto profissional e
pessoal.
Agradeço à Dra Maria Elizabete Sbrogio de Almeida pela ajuda nos
experimentos envolvendo animais e, sobretudo, pela sua paciência de
transmitir parte de seus conhecimentos com tanta calma e compreensão.
Agradecimento especial à minha mãe, Maria Amélia Marques
Cavalcante, um exemplo de ser humano puro, sensível e amável.
Agradeço-a por apoiar-me, incondicionalmente, nessa empreitada com
alegria e fortaleza, mesmo nos momentos em que esteve triste ou
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desmotivada. Sou-lhe grato também por dividir comigo esse sonho
conquistado hoje.
Agradeço ao meu pai, Francisco de Assis Barroso Cavalcante, que
transmitiu-me segurança e fortaleza para olhar sempre em frente e encarar
dificuldades como etapas necessárias ao triunfo final. Agradeço-o também
pelos ensinamentos e experiências de vida transmitidos, sem os quais
seria, pelo menos, árduo viver.
Agradeço aos meus írmãos Diego e Raissa pelas palalavras de
apoio e afeto, principalmente, nos momentos mais difíceis.
Agradeço aos meu tios João Marques Pereira e José Marques
Pereira, pelo entusiasmo e pela dedicação com a qual encaram o trabalho,
fatos que me fizeram optar pela carreira acadêmica.
Agradeço à minha avó materna, Maria do Socorro Pereira, por todo
seu apoio e por ser um verdadeiro exemplo de vida.
Agradeço aos meus Amigos de infância Lairton Pereira Marinho e
Alexandra Marinho por todo seu entusiasmo e apoio.
Agradeço à minha namorada Martha Priscilla pela paciência e
comprrensão durante a execução desse trabalho, bem como, pelo
incessante apoio e carinho.
Agradeço aos meus amigos da época do colegial: Rodrigo Moreira,
Raimundo Paulino, Kildery Maciel, Carliandro Cavalcante, Rafaela Araújo e
Aretah Araújo pelo estímulo inicial e por torcer por mim.
Agradeço aos amigos da faculdade: Bruno Cavalcante, Gisele
Bastos, Gleylton Weyne, James Almada e Igor Simões que tanto me
encentivaram e torceram.
Agradeço ao Roberto Nepomuceno, por inicialmente, de bom
grado, oferecer-me sua casa, sem ao menos, conhecer-me e por ajudar-me
a dar os primeiros passos no laboratório com paciência e dedicação.
Agradeço a todo pessoal do grupo Bacillus Milene Batista, Priscila
Gomes, Renata Damásio, Juliano Paccez e Wilson Luiz pelas interessntes
discussões de artigos e aprendizado em conjunto. Agradecimento especial
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ao Juliano e Wilson por fornecerem apoio incondicional profissional e
pessoal nos momentos mais difíceis.
Agradeço aos amigos Otto, Marcelo, Aline, Cristiane, Sabrina,
Natália, Alexandre, Mariana, Catarina, Camila Calderon, Loren, Juliana,
Liliana, Camila Santos pelas conversas científicas, pela ajuda esclarecendo
muitas dúvidas, pelas interessantes sugestões e também pelas
descontraídas conversas.
Agradeço ao meu companheiro de república Robert pela amizade,
ajuda, pelos momentos de descontração e também pelo apoio e incentivo
nos momentos desanimadores.
E Agadeço, sobretudo, a Deus, por estar sempre me protegendo e
guiando.
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RESUMO
CAVALCANTE, R. C. M. Desenvolvimento de estratégias vacinais contra tumores induzidos pelo Vírus do Papiloma Humano tipo 16 (HPV-16) baseadas em linhagens geneticamente modificadas de Bacillus subtilis. 2008. 86 f. Dissertação (Mestrado em Microbiologia) - Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2008.
Bacillus subtilis é uma bactéria gram-positiva, não patogênica, formadora
de esporos e com um grande conhecimento disponível a cerca de sua genética e
fisiologia, comparável apenas à Escherichia coli K12. Recentemente, linhagens
geneticamente modificadas de B.subtilis foram utilizadas como veículos vacinais
mas, até o momento, não se havia avaliado a indução de respostas
imunológicas citotóxicas (linfócitos T CD8+) específicas em camundongos
imunizados com esporos ou células vegetativas. No presente trabalho, avaliou-
se a indução de linfócitos T CD8+ em animais imunizados com linhagens
vacinais de B. subtilis. Inicialmente empregou-se como alvo a proteína E7 de
vírus papiloma humano tipo 16 (HPV-16) fusionada ou não à proteína gD do
vírus herpes simples tipo 1 (HSV-1). Em uma segunda estratégia, empregou-se
como alvo a subunidade B da toxina termolábil (LTB) de E. coli
enterotoxicogênica (ETEC) co-expressa ou fusionada à proteína GroEL2 de
Mycobacterium bovis. As quantidades de E7 e gDE7 expressas pelas linhagens
recombinantes de B.subtilis ficaram abaixo do limite de detecção e não foram
suficientes para ativação de células T CD8+ específicas. Por outro lado,
linhagens de B. subtilis capazes de expressar LTB e GroEL2 promoveram a
ativação de linfócitos T CD8+ específicos. De um modo geral, o presente
trabalho representa uma contribuição inédita sobre a ativação de respostas
imunológicas de base celular em camundongos imunizados com linhagens
recombinantes de B.subtilis e os resultados obtidos certamente contribuirão para
a geração de veículos vacinais mais efetivos na profilaxia e tratamento de
diferentes doenças infecciosas, como infecções virais, ou degenerativas, como o
câncer.
Palavras-chave: Bacillus subtilis; Vacinas; HPV; ETEC; Mycobacterium b
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ABSTRACT
CAVALCANTE, R. C. M. Development of vaccine stratagies against tumors induced by human papilloma virus type 16 (HPV-16) based on genetically modified Bacillus subtilis strains. 86 p. 2008. Master thesis (Microbiology) - Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2008.
Bacillus subtilis is a sporulated, non pathogenic, gram-positive bacterial
species with a large amount of information concering its genetics and physiology,
comparable only to Escherichia coli K12. Recently, genetically modified B.subtilis
strains were successfully employed as vaccine vehicles but there is no
information concerning the activation of antigen specific cytotoxic immune
responses (T CD8+ lymphocytes) in mice vaccinated with either vegetative cells
or spores. In the present report, we evaluated the activation of CD8+ T cell
responses in mice immunized with B. subtilis vaccine strains genetically modified
in order to express the human papillomavirus type 16 (HPV-16) E7 protein as a
target antigen, isolated or genetically fused to the type I herpes simplex virus
(HSV-1) gD protein. In a second approach, we have also tested the B subunit
heat labile toxin, produced by enterotoxigenic E. coli (ETEC) strains, co-
expressed or genetically fused to the Mycobacterium bovis GroEL2 protein. E7
and gDE7 expression by B.subtilis vaccine strains were bellow the detection
limits and did not allow the activation of antigen-specific CD8+ T cell responses in
vaccinated mice. On the other hand, LTB-specific CD8+ T cell responses were
detected in mice immunized with B. subtilis expressing both LTB and GroEL2.
Collectively, the present study respresents an important contribution on the
activation of cellular immune responses in mice immunized with genetically
modified B.subtilis and should direct further analyses aiming the development of
more effective vaccine vehicles employed both for preventive and therapeutic
treatment of infectious and degenerative diseases, such as virus infections and
cancer.
Key words: Bacillus subtilis; Vaccines, HPV, ETEC, Mycobacterium bovis.
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS °C – graus Celsius µg – microgramas µL - microlitros AMPc – adenosina monofosfato cíclico APC – células apresentadoras de antígenos profissionais B. subtilis – Bacillus subtilis BSA – soroalbumina bovina C – base nitrogenada citosina CD – Cluster Differentiation CFA/I – fator de colonização I de ETEC CR-2 – domínio conservado II da proteína E7 CR-I – domínio conservado I da proteína E7 CT – toxina colérica C-terminal – carboxi terminal DC – célula dendrítica DNAc – fita de DNA complementar DO – densidade óptica DSM – difco sporulation media E. coli – Escherichia coli EDTA – ácido etilenodiamino tetracético EGTA – ácido etilenoglicol tetracético ELISA – enzime-linked immunosorbent assay ETEC - Escherichia coli enterotoxigênica G – base nitrogenada guanina g – gramas gA – glicoproteína A do HSV gB – glicoproteína B do HSV gC – glicoproteína C do HSV gD – glicoproteína D do HSV GM1– monossialogangliosídeo GRAS – generally recognized as safe h – horas H2SO4 – ácido sulfúrico HCl – ácido clorídrico HEPES – (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid ) HPV – vírus do papiloma humano HSP – proteína de choque térmico HSP60 – HSP de 60 kDa HSP65 – HSP de 65 kDa HSP70 – HSP de 70 kDa HSV – vírus do herpes simples
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HSV1 – HSV tipo 1 HSV2 – HSV tipo 2 IgG – imunoglobulina de classe G IL-12 – interleucina 12 INF-γ – interferom gama IPTG – isopropil-tio-b-galactosídeo KCl – cloreto de potássio kDa - kilodáltons KH2PO4 – fosfato de potássio KOAc – acetato de potássio L – litro L.casei – Lactobacillus casei L.lactis – Lactococcus lactis L.monocytogenes – Listeria monocytogenes LB – Luria Bertani LLO – listeriolisina O LPS – lipopolissacarídeo LT – toxina termolábil de ETEC LTB – subunidade B da LT LT-I – LT tipo I LT-II – LT tipo II M – molar M.bovis – Mycobacterium bovis m/v – relação massa por volume MgCl2 – cloreto de magnésio MHC – complexo de histocompatibilidade principal MHC-I – MHC classe I MHC-II – MHC classe II min – minutos mL – mililitros (10-3L) mM – milimolar (10-3M) Na2HPO4 – fosfato ácido de sódio NaCl – cloreto de sódio NaOH – hidróxido de sódio ng - nanograma nM – nanomolar (10-9M) N-terminal – amino terminal OPD – ortho-phenylenediamine pb – pares de bases PBS – tampão salina e fosfato PBST - tampão salina fosfato acrescido de 0,5 % de tween 20 PCR – reação em cadeia da polimerase PE7 – peptideo correspondente ao epítopo CD8 da proteína E7 de HPV-16 PgsiB – promotor do gene gsiB pH – potencial hidrogeniônico PlepA – promotor do gene lepA
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PspaC – promotor do gene spaC RBS – região de ligação ao ribossomo RNA – ácido ribonucléico RNAm – RNA mensageiro RNAt – RNA transportador rpm – rotações por minuto RT-PCR – transcriptase inversa PCR SDS – dodecil sulfato de sódio SFB – soro fetal bovino ST– toxina termoestável TC-1 – linhagem de células transformadas com E6 e E7 de HPV-16 Th1 – T helper 1 Th2 – T helper 2 TLR – tool like receptors TNF-α – fator de necrose tumoral alfa TRIS.HCl – tris(hydroxymethyl)aminomethane.HCl TTFC – fragmento C da toxina tetânica U – base nitrogenada uracila UFC – unidades formadoras de colônia V – volume V. cholerae – Vibrio cholerae VLP – virus like particles σB – fator sigma B
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Modelos de expressão heteróloga em linhagens recombinantes de B.subtilis.............................................................................................................23 Figura 2. Amplificação dos genes E7 e gDE7 a partir do vetor pGDE7........... 45 Figura 3. Clonagens dos genes E7 e gDE7 no vetor pHCMC03 e análise de restrição.............................................................................................................45 Figura 4. Representação esquemática dos vetores construídos para expressão dos genes E7 ou gDE7 em B.subtilis.................................................................46 Figura 5. Detecção in vitro da expressão das proteínas E7 e gDE7 produzidas pelas cepas de B.subtilis construídas................................................................ 47 Figura 6. Detecção de RNAm correspondentes às seqüências clonadas E7 e gDE7 por RT-PCR.............................................................................................48 Figura 7. Detecção de anticorpos IgG específicos anti-gD em camundongos C57BL/6, após três ou quatro doses da linhagem vacinal de B.subtilis LDVR2...............................................................................................................49 Figura 8. Análise de linfócitos T CD8+ específicos para o peptídeo PE7, em camundongos C57BL/6 imunizados por via subcutânea com as linhagens vacinais de B.subtilis LDV1, LDVR1 ou LDVR2................................................50 Figura 9. Análise de linfócitos T CD8+ / INF-γ+ específicos para o peptídeo PE7, em camundongos C57BL/6 após três doses de células ou esporos das linhagens LDV1, LDVR1 e LDVR2 pelas vias nasal (IN) ou subcutânea (SC)....................................................................................................................52 Figura 10. Representação esquemática dos vetores construídos para expressão de GroEL2 e / ou LTB em B.subtilis.................................................55 Figura 11. Detecção da expressão in vitro das proteínas GroEL2 e LTB pelas cepas de B.subtilis recombinantes construídas.................................................56
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Figura 12. Avaliação dos títulos de anticorpos anti-LTB séricos obtidos após o protocolo de imunização envolvendo células vegetativas e esporos das linhagens LDV72, LDV73, LDV74 e LDV2 administrados pela via subcutânea.57 Figura 13. Avaliação dos títulos de anticorpos anti-LTB séricos obtidos após o protocolo de imunização envolvendo células vegetativas e esporos das linhagens LDV72, LDV73, LDV74 e LDV2 administrados pela via intra-nasal..................................................................................................................58 Figura 14. Análise de linfócitos T CD8+ / INF-γ+ específicos para a proteína LTB, realizada a partir baços de grupos com cinco animais imunizados com células e esporos das linhagens LDV73, LDV74 e LDV2 pela via subcutânea.60 Figura 15. Análise de linfócitos T CD8+ / INF-γ+ específicos para a proteína LTB, realizada a partir baços de grupos com cinco animais imunizados com células e esporos das linhagens LDV73, LDV74 e LDV2 pela via intra-nasal..................................................................................................................61
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Lista dos iniciadores utilizados com suas sequências alvo...............36 Tabela 2. Vetores de expressão e linhagens de B. subtilis utilizados durante o estudo................................................................................................................36 Tabela 3. Análise de proteção contra modelo desafio com células tumorais (TC-1)................................................................................................................53
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SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................... 19
2 OBJETIVOS ................................................................................................... 33
3 MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................. 34
3.1 Construção de vetores ............................................................................. 34
3.1.1 Construção de vetores epissomais capazes de expressar as proteínas
E7, gDE7 ou GroEL2 ....................................................................................... 34
3.1.2 Construção de vetores epissomais capazes de expressar
simultaneamente GroEL2 e LTB .................................................................... 35
3.2 Preparação e transformação de bactérias competentes ....................... 37
3.3 Análise da expressão in vitro ................................................................... 38
3.4 Detecção de RNAm .................................................................................. 39
3.5 Preparação e purificação de esporos de linhagens recombinantes de
B.subtilis ........................................................................................................... 39
3.6 Protocolos de imunização ........................................................................ 40
3.7 Detecção de respostas de anticorpos séricos específicos .................. 40
3.8 Ensaio de marcação intracelular de IFN-g expresso por células CD8+ . 41
3.9 Cultivo de células TC-1, desafio e acompanhamento da evolução
tumoral ............................................................................................................. 42
3.10 Análises estatísticas................................................................................43
4 RESULTADOS................................................................................................44
4.1 Respostas imunológicas geradas após a administração de cepas de
B.subtilis recombinantes capazes de expressar as proteínas E7 e gDE7.44
4.2 Análise de respostas imunológicas induzidas após a administração de
linhagens de B.subtilis recombinantes capazes de expressar GroEL2 e/ou
LTB............................................................................................................... ..... 54
5 DISCUSSÃO................................................................................................... 62
6 CONCLUSÕES .............................................................................................. 75
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................. 76
ANEXO I............................................................................................................84
17
ANEXO II...........................................................................................................85
ANEXO III..........................................................................................................86
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1 INTRODUÇÃO
B.subtilis é uma bactéria gram-positiva, ubiquitária, não patogênica,
freqüentemente encontrada em solos. Possui a capacidade de formar
endosporos, estrutura de resistência capaz de permanecer viável por
milhares de anos, além de resistir a condições adversas como escassez de
nutrientes, extremos de pH, temperatura e salinidade e à exposição a
alguns agentes químicos e físicos utilizados no controle microbiano
(NICHOLSON et al., 2000). Apresenta baixo tempo de geração, multiplica-
se em meios simples e relativamente baratos e atinge altas densidades
celulares in vitro. B.subtilis é a bactéria gram-positiva mais estudada com
genética, bioquímica e fisiologia bem conhecidas, legado somente
comparado à Escherichia coli (HARWOOD, 1992; FERREIRA e
SCHUMANN, 2005).
Todo esse conhecimento acumulado, bem como, algumas
características intrínsecas à B.subtilis contribuíram para o largo uso desse
microrganismo no setor industrial. A capacidade de produzir e secretar
grandes quantidades de enzimas, notadamente proteases e alfa-amilases,
fez com que esse microorganismo fosse bastante empregado na indústria
de detergentes (HARWOOD, 1992). Além disso, B.subtilis possui marcante
atividade probiótica quando administrado por via oral (GÜNTHER e
JIMÉNEZ-MONTEALEGRE et al., 2005; BALCÁZAR e ROJAS-LUNA,
2007; HONG et al., 2005). Característica que explica seu uso em
alimentos, como o Natto da culinária oriental e a sua utilização em
formulações probióticas, principalmente para peixes crustáceos, aves e
humanos (HONG et al., 2005)
B. subtilis é um modelo interessante do ponto de vista de produção
de proteínas heterólogas. Como já mencionado, há grande conhecimento a
cerca das características genéticas, fisiológicas, bioquímicas e de cultivo.
Além disso, B.subtilis não possui membrana externa (LPS) e detém alta
capacidade intrínseca de secreção protéica, características que dispensam
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etapas adicionais de lise celular e de remoção de LPS (LI et al., 2004;
TERPE, 2006; YIN et al., 2007). Outro fator relevante é a disponibilidade de
vetores epissomais capazes de promover a produção de proteínas
heterólogas sob controle de diversos promotores gênicos fortes. De fato,
algumas proteínas heterólogas como a insulina, o fator de crescimento
epidermal humano e a interleucina 3 humana foram expressas e
purificadas com sucesso a partir de cepas geneticamente modificadas de
B.subtilis (WESTERS et al., 2004).
Recentemente, linhagens geneticamente modificadas de B.subtilis
capazes de expressar antígenos heterólogos foram empregadas como
veículos vacinais vivos (FERREIRA e SCHUMANN, 2005). De fato, o uso
de veículos vacinais vivos apresenta algumas vantagens em detrimento a
outras estratégias vacinais, dentre elas: a) mimetizam patógenos e
estimulam respostas imunológicas de mucosa; b) podem ser administradas
por via nasal ou oral, evitando riscos inerentes à via parenteral e reduzem a
necessidade de pessoal e infra-estrutura especializados para a
administração; e c) possuem baixo custo relativo de produção (DETMER e
GLENTING, 2006).
Os veículos vacinais vivos podem ser reunidos em dois grandes
grupos: os patogênicos atenuados e os não patogênicos. Veículos vacinais
não patogênicos são mais seguros que os atenuados, uma vez que, esses
últimos apresentam risco de reversão de patogenicidade, podem
desencadear doenças em hospedeiros imunologicamente comprometidos e
potencialmente produzem maiores reações adversas (MERCENIER et al.,
2000). Além das vantagens apresentadas por veículos vacinais vivos não
patogênicos, B.subtilis possui outras características particulares que
permitem alocá-lo como um dos veículos vacinais mais promissores no
desenvolvimento de estratégias vacinais baseadas em veículos vivos.
Detém o status GRAS (generally recognized as safe), propriedade que
confere segurança em seu uso inclusive em crianças, idosos e
imunocomprometidos. Muitas vantagens são conferidas pela formação de
20
esporos, entre elas, (i) estrutura termo-resistente que dispensa gastos com
manutenção da cadeia de frio durante transporte e estocagem, (ii) possuem
marcante atividade probiótica quando administrados por via oral,
propriedade que auxilia na prevenção e no combate a doenças entéricas e
(iii) são capazes de desencadear uma resposta imunológica balanceada
entre Th1 e Th2 ativando dessa forma tanto respostas celulares quanto
humorais (BARNES et al., 2007).
Encontram-se descritos na literatura dois modelos de utilização de
B.subtilis como veículo vacinal, são eles o modelo “out” e o modelo “in”
(ISTICATO et al., 2001; PACCEZ et al., 2006). O modelo “out” foi
inicialmente descrito por Isticato e colaboradores (2001) e está baseado na
expressão do antígeno alvo ancorado à superfície do esporo (Figura 1A). O
direcionamento para superfície do esporo é mediado pela fusão do gene
alvo a seqüências adicionais que codificam para proteínas da capa do
esporo denominadas de Cot. A expressão desse gene híbrido é codificada
por cópia única inserida no cromossomo bacteriano por recombinação
homóloga em sítio de gene não essencial para B.subtilis (DUC et al., 2003;
MAURIELLO et al., 2004). Nas formulações vacinais envolvendo esse
modelo, toda a carga antigênica apresentada ao sistema imune é oriunda
da administração de esporos das linhagens recombinantes com o antígeno
pré-formado ancorado em sua superfície. De fato, trabalhos empregando
esse modelo demonstraram que camundongos imunizados com esporos de
linhagens recombinantes de B.subtilis expressando o fragmento C da
toxina tetânica (TTFC), administrados tanto por via oral como parenteral,
desencadearam respostas humorais específicas e, sobretudo, foram
protegidos contra desafios com a toxina tetânica nativa (DUC et al., 2003;
MAURIELLO et al., 2004).
Em nosso laboratório foi desenvolvido um modelo alternativo,
denominado modelo “in”. Nesse modelo, o antígeno é acumulado no
interior da célula bacteriana e não há antígeno pré-formado em esporos de
linhagens recombinantes de B.subtilis (Figura 1B). Nesse caso, o sistema
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de expressão está baseado em uma série de vetores epissomais derivados
do plasmídeo pMTLBS72 que, em oposição a maioria dos vetores
epissomais de bactérias gram-positivas (BRON et al., 1991; JANNIÈRE et
al., 1990), é capaz de replicação bidirecional (tipo teta), demonstrando,
dessa forma, alta estabilidade estrutural e segregacional (TITOK et al.,
2003). Além disso, essa série de vetores apresenta número intermediário
de cópias por célula (6 a 10), o que permite mais cópias do gene de
interesse. A partir desses plasmídeos, nosso grupo desenvolveu vetores
epissomais capazes de produzir proteínas heterólogas sob o controle de
diferentes promotores, dentre eles PspaC, ativado por IPTG, PlepA, promotor
constitutivo e o promotor PgsiB, ativado em condições de estresse ambiental
(NGUYEN et al., 2005).
O promotor derivado do gene gsiB (glucose starvation inducible) é
reconhecido pelo fator sigma alternativo B (σB), expresso em baixos níveis
em condições fisiológicas e transcrito em situações de estresse ambiental
como, escassez de glicose, altas temperaturas, pHs baixos, além de adição
de sais e etanol (MAUL et al., 1995). Além disso, trabalhos anteriores do
nosso grupo demonstraram que esse promotor é também induzido in vivo,
uma vez que, animais imunizados com esporos de linhagens
recombinantes de B.subtilis, onde não há expressão do antígeno
heterólogo, desencadearam respostas imunológicas específicas contra o
antígeno alvo (PACCEZ et al., 2006, 2007; LUIZ et al., 2008).
Utilizando esse sistema, nosso grupo construiu linhagens de
B.subtilis capazes de expressar proteínas como a subunidade B da toxina
termolábil (LTB) e a subunidade estrutural (CfaB) do fator de colonização
CFA/I, ambas oriundas de linhagens de E.coli enterotoxigênica (ETEC).
Essas linhagens foram administradas na forma de células vegetativas ou
esporos a camundongos pelas vias oral e parenteral. Camundongos
imunizados apresentaram respostas humorais secretadas e sistêmicas
especificas para os antígenos expressos (PACCEZ et al., 2006, 2007; LUIZ
et al., 2008). Dessa forma, observa-se que ambos os modelos de
expressão heteróloga em
desencadear respostas humorais locais e sistêmicas especificas, após
administração a camundongos por vias de mucosa ou parenteral.
Figura 1 - Modelos de expressão heteróloga em linhagens recombinantes de B.subtilis. (A) representação esquemática do modelo “representação esquemática do modelo “estudo.
Vacinas tradicionalmente foram desenvolvidas com o objetivo de
induzir respostas séricas de anticorpos específicos capazes de reconhecer
antígenos expressos por diferentes patógenos. No entanto, com o aumento
do conhecimento da relação patógeno
ativação do braço celular da resposta imunológica é crucial para uma maior
eficácia de vacinas contra patógenos de ciclos complexos e para
potencializar a resposta humoral desencadeadas por muitas vacinas
convencionais (MOORE e HUTCHIN
imuno-terapêuticas contra o câncer, assim como contra muitas doenças
infecciosas crônicas, a ativação de linfócitos citotóxicos (T
específicos é a principal resposta imunológica capaz de levar à proteção
e/ou cura da doença. Uma vez que, quando ativadas adequadamente, tais
linfócitos destroem células transformadas e/ou infectadas a partir do
reconhecimento de antígenos alvos expressos.
O câncer cervical é o segundo mais comum entre as mulheres,
acometendo cerca de 493.000 mulheres/ano e ocasionando 274.000
mortes anuais (FERLAY et al., 2004). O vírus do Papiloma humano (HPV)
expressão heteróloga em B.subtilis (modelos “in” e “out”) são capazes de
desencadear respostas humorais locais e sistêmicas especificas, após
administração a camundongos por vias de mucosa ou parenteral.
Modelos de expressão heteróloga em linhagens recombinantes de (A) representação esquemática do modelo “
representação esquemática do modelo “in”, utilizado no presente
Vacinas tradicionalmente foram desenvolvidas com o objetivo de
induzir respostas séricas de anticorpos específicos capazes de reconhecer
antígenos expressos por diferentes patógenos. No entanto, com o aumento
do conhecimento da relação patógeno-hospedeiro ficou evidente que a
ativação do braço celular da resposta imunológica é crucial para uma maior
eficácia de vacinas contra patógenos de ciclos complexos e para
potencializar a resposta humoral desencadeadas por muitas vacinas
convencionais (MOORE e HUTCHINGS, 2007). Além disso, em estratégias
terapêuticas contra o câncer, assim como contra muitas doenças
infecciosas crônicas, a ativação de linfócitos citotóxicos (T
específicos é a principal resposta imunológica capaz de levar à proteção
a da doença. Uma vez que, quando ativadas adequadamente, tais
linfócitos destroem células transformadas e/ou infectadas a partir do
reconhecimento de antígenos alvos expressos.
O câncer cervical é o segundo mais comum entre as mulheres,
de 493.000 mulheres/ano e ocasionando 274.000
mortes anuais (FERLAY et al., 2004). O vírus do Papiloma humano (HPV)
A
22
”) são capazes de
desencadear respostas humorais locais e sistêmicas especificas, após
Modelos de expressão heteróloga em linhagens recombinantes de
(A) representação esquemática do modelo “out” e (B) , utilizado no presente
Vacinas tradicionalmente foram desenvolvidas com o objetivo de
induzir respostas séricas de anticorpos específicos capazes de reconhecer
antígenos expressos por diferentes patógenos. No entanto, com o aumento
ficou evidente que a
ativação do braço celular da resposta imunológica é crucial para uma maior
eficácia de vacinas contra patógenos de ciclos complexos e para
potencializar a resposta humoral desencadeadas por muitas vacinas
GS, 2007). Além disso, em estratégias
terapêuticas contra o câncer, assim como contra muitas doenças
infecciosas crônicas, a ativação de linfócitos citotóxicos (T CD8+)
específicos é a principal resposta imunológica capaz de levar à proteção
a da doença. Uma vez que, quando ativadas adequadamente, tais
linfócitos destroem células transformadas e/ou infectadas a partir do
O câncer cervical é o segundo mais comum entre as mulheres,
de 493.000 mulheres/ano e ocasionando 274.000
mortes anuais (FERLAY et al., 2004). O vírus do Papiloma humano (HPV)
B
23
é o principal agente etiológico do câncer de colo de útero, respondendo por
mais de 99% dos casos de câncer cervical diagnosticados (BOSCH et al.,
1995; WALBOOMERS et al., 1999). Mais de 120 tipos de HPV capazes de
infectar humanos já foram descritos e mais 40 tipos são capazes de
infectar células epiteliais do trato anogenital e de outras áreas de mucosa
do corpo. (VILLIERS et al., 2004). Além do tropismo tecidual, os HPVs
podem ser divididos em HPVs de baixo e alto risco, no tocante a
capacidade de desencadear câncer. Classificam-se como HPVs de baixo
risco, principalmente, os tipos 6 e 11 os quais estão comumente
associados a lesões anogenitais benignas denominadas verrugas genitais
(condylomata acuminata); (KOUTSKY et al., 1988; JABLONSKA e
MAJEWSKI, 1997). Os HPVs 16,18,31,33,35,45 e 51 são os principais
tipos considerados de alto risco, entre eles, destacam-se os HPVs 16 e 18
que respondem juntos por cerca de 70% dos casos de câncer cervicais
diagnosticados (WALBOOMERS et al., 1999; SMITH et al., 2007). O vírus
HPV também está envolvido, com menor prevalência, em outros tipos de
câncer, tais como, o de ânus, o de vulva o de pênis e o de boca (PARKIN e
BRAY, 2006).
O vírus do papiloma humano (HPV) é um vírus não envelopado
com DNA dupla fita circular, formato icosaédrico e capacidade de infectar o
epitélio estratificado (MC MURRAY et al., 2001; MCCANCE et al., 1998). O
vírus HPV possui dois genes de expressão tardia que codificam para as
proteínas do capsídeo L1 e L2 (L, do inglês late) e seis de expressão
precoce (E, do inglês early) que codificam para seis proteínas com variadas
funções regulatórias: E1, E2, E4-E7. Em particular, as proteínas E6 e E7
atuam na malignização celular, principalmente, por ligação ou inativação
dos produtos de genes supressores de tumor p53 e pRb, respectivamente
(WERNESS et al., 1990).
A E7 é uma fosfoproteína de 98 aminoácidos que apresenta dois
domínios Cys-X-X-Cys responsáveis pela formação de dedos de zinco (zur
HAUSEN, 1996). Na extremidade N-terminal existem dois domínios, um
24
parcialmente conservado denominado de CR-1 e outro completamente
conservado denominado de CR-2 (PHELPS et al., 1988). A proteína E7
juntamente com a proteína E6 são proteínas virais necessárias para a
manutenção das células no estado transformado (RODEN et al., 2004). A
E7 é a mais expressa em tumores induzidos por HPV, além de ser a
melhor caracterizada imunologicamente (RODEN et al., 2004). Assim,
grande parte das estratégias vacinais testadas contra tumores induzidos
por esse vírus é baseada nesse antígeno.
Vale destacar que há duas vertentes no desenvolvimento de
vacinas contra o câncer causado pelo HPV, as vacinas profiláticas e as
vacinas terapêuticas. As vacinas profiláticas almejam montar uma resposta
imune prioritariamente humoral contra as proteínas do capsídeo viral e,
dessa forma, impedir a entrada do vírus nas células. Em 2007, foi lançada
uma vacina profilática contra o HPV denomida de Gardasil (Merck). Sua
formulação inclui VLPs (virus like particles) de quatro tipos de HPV, sendo
dois de alto risco (16 e 18) e dois de baixo risco (6 e 11) e mais sulfato de
hidroxifosfato de alumínio como adjuvante. Dessa forma, essa vacina é
capaz de evitar a infecção pelos vírus HPV tipos 16, 18, 6 e 11. No entanto,
ela não é capaz de proteger pacientes que já estejam infectados pelo vírus
contra o câncer cervical, uma vez que, essa formulação não desencadeia
respostas celulares contra proteínas virais normalmente expressas na
superfície das células infectadas pelo HPV, como por exemplo, as
proteínas E6 e E7. De fato, as vacinas terapêuticas procuram preencher
essa lacuna, pois empregam estratégias que promovem a apresentação
dessas oncoproteínas ao sistema imunológico, de modo que respostas
citotóxicas antígeno específicas sejam geradas. Além disso, é fundamental
que células apresentadoras de antígeno profissionais (APCs),
particularmente as células dendríticas, sejam estimuladas, pois tais células
são capazes de ativar células T antígeno-específicas, possuindo dessa
forma importante papel na geração de resposta imune contra o câncer.
25
Uma formulação vacinal inclui além do antígeno alvo, substâncias
capazes de potencializar o efeito da vacina, tais compostos são
genericamente denominados de adjuvantes (do latim adjuvare, ajudar).
Eles foram originalmente descritos como: “substâncias usadas em conjunto
com um antígeno específico com o intuito de produzir maior imunidade que
o antígeno sozinho” (RAMON et al., 1952). Os mecanismos de ação dos
adjuvantes ainda não são totalmente conhecidos, mas, em geral, eles
melhoram a resposta imune a antígenos vacinais de muitas maneiras: eles
podem potencializar a imunogenicidade de “antígenos fracos”; aumentar a
velocidade/duração da resposta imune; modular a avidez, especificidade,
isotipo ou distribuição de anticorpos, estimular linfócitos T; promover a
indução de imunidade de mucosas; amplificar a resposta em indivíduos
imunonologicamente imaturos ou senescentes e também podem diminuir a
dose de antígeno necessária, reduzindo o preço das vacinas (LIMA et al.,
2004).
Entretanto, os adjuvantes tradicionais (sais de cálcio, compostos de
alumínio e emulsões oleosas) direcionam a resposta imune para Th2,
caracterizada pela produção de anticorpos específicos para determinadas
composições antigênicas, como por exemplo, o sulfato de hidroxifosfato de
alumínio usado na vacina Gardasil (Merck). A nova geração de adjuvantes,
que incluem motivos ricos em CpG, mofosforil lipídeo A e saponina (QS21),
promovem a polarização Th1. Esses efeitos são obtidos por meio da
ativação de células apresentadoras de antígenos (APCs), em particular
células dendriticas. Recentemente chaperonas moleculares, as proteínas
de choque térmico (HSPs), tem demonstrado interagir com APCs, com
considerável capacidade de ativar linfócitos T citotóxicos específicos.
Dessa forma, essa nova geração de adjuvantes possui importante papel no
desenvolvimento de vacinas contra patógenos de ciclos complexos, bem
como, na imunoterapia contra o câncer.
Como já foi citado, veículos vacinais baseados em linhagens
geneticamente modificadas de B.subtilis apresentam marcante atividade
26
adjuvante, no entanto tal potencial fora explorado somente na indução de
respostas humorais, por meio da utilização dos modelos “in” e “out”. Já foi
mencionado também que esporos de linhagens geneticamente modificadas
de B.subtilis são capazes de desencadear padrão de resposta mista, isto é,
um balanço entre resposta Th2 (prioritariamente humoral), bem explorada
nos trabalhos utilizando os modelos “in” e “out”, e Th1 (predominantemente
celular). Além disso, é sabido que veículos vacinais vivos geneticamente
modificados baseados em outras bactérias gram-positivas não patogênicas
como Lactococcus lactis, Lactobacillus casei e Streptococcus gordonii são
capazes de desencadear marcante resposta citotóxica específica contra
antígenos heterólogos expressos quando administrados em animais por
diferentes vias de inoculação (BERMÚDEZ-HUMARÁN et al., 2003;
CORTES-PEREZ et al., 2003; POOL et al., 2006; DI FABIO et al., 1997).
O presente trabalho explorou de forma pioneira, emprego de
veículos vacinais baseados em linhagens geneticamente modificadas de
B.subtilis com o objetivo de ativar respostas de células T CD8+ por meio da
utilização do modelo “in”. Para tal feito, construímos linhagens
recombinantes de B.subtilis capazes de expressar a proteína E7. Como já
foi visto, essa proteína é a mais estudada e a mais empregada no
desenvolvimento de estratégias vacinais terapêuticas contra o HPV. Além
disso, a proteína E7 apresenta epítopo único para células T CD8+,
compreendendo os aminoácidos xxRAHYNIVTFxx (49-57), doravante
denominado de PE7, (FELTKAMP, 1993) que permite a avaliação da
resposta celular T CD8+ específica. Há ainda um modelo desafio em
camundongos C57BL/6 que permite a avaliação da funcionalidade da
resposta imunológica montada após o protocolo vacinal. O modelo desafio
baseia-se na inoculação, por via subcutânea, de células de epitélio
pulmonar murino transformadas com os genes E6 e E7 de HPV-16 e v-
Has-ras, denominadas de TC-1 (LIN et al., 1996). Essas células proliferam-
se no local de inoculação e dão origem a tumores locais que expressam os
27
antígenos E6 e E7 de HPV-16, mimetizando, dessa forma, tumores
gerados pelo vírus HPV-16 no câncer cervical.
Estudos indicam que a proteína E7 é dotada de baixa estabilidade
em células eucarióticas e que fusões em sua porção N-terminal são
capazes aumentar sua meia vida (REINSTEIN et al., 2000). Bermúdez-
Humaran e colaboradores (2001) demonstraram também que a expressão
da proteína E7 na forma de proteína de fusão em L.lactis possuía maior
estabilidade quando comparada a proteína expressa em sua forma nativa.
Em trabalhos anteriores do grupo, a utilização da glicoproteína D
(gD) do Vírus do Herpes Simples Humano tipo 1 (HSV-1) como parceira de
fusão para antígenos alvo demonstrou marcante potencial adjuvante
quando administrada camundongos em estratégia vacinal baseada em
vacina de DNA. Alves e colaboradores (1998) empregaram uma vacina de
DNA capaz de expressar a proteína gD de HSV-1 fusionada ao fator de
colonização I de ETEC CFA/I. Nesse último trabalho constatou-se que a
fusão do antígeno à proteína gD foi capaz de potencializar a resposta
humoral anti-CFA/I em modelo murino. Em trabalho recente do grupo,
demonstrou-se que camundongos imunizados com vacinas de DNA
capazes de expressar a proteína E7 de HPV-16 geneticamente fusionada à
porção C-terminal da gD foram capazes de desencadear respostas
citotóxicas específicas para proteína E7 e, sobretudo, permaneceram
livres de tumor após desafio com células TC-1 (LÁSARO et al., 2005). Além
disso, Lásaro e colaboradores (2008), utilizado vacinas de DNA e
adenovírus recombinantes, demonstraram que a fusão de antígenos virais
à proteína gD demonstram maior imunogenicidade no tocante à resposta
celular, quando comparado à imunização com vacinas de DNA capazes de
expressar apenas os antígenos virais.
As glicoproteínas gA, gB, gC, gD e gE são as principais
constituintes do envelope viras dos HSVs (NORRILD, 1980). Há dois tipos
de vírus do herpes simples, o tipo 1 (HSV-1) e o tipo 2 (HSV-2). Em geral, o
HSV-1 está relacionado a lesões orolabiais, enquanto que o HSV-2 está
28
implicado em lesões genitais (NAHMIAS et al., 1990). Estima-se que de 40-
50% dos adolescentes e de 60 a 90% dos adultos estejam infectados com
o HSV-1 (RODU et al., 1992; SIEGEL et al., 1992), no entanto, apenas de
20-30% dos infectados apresentam lesões recorrentes (SPRUANCE et al.,
1988). A prevalência do HSV-2 é bastante variável nos Estados Unidos, por
exemplo, detecta-se a presença do vírus em aproximadamente 21% da
população enquanto que na África Sub-Saariana a prevalência pode ser tão
alta quanto 80% (PAZ-BAILEI et al., 2006).
As glicoproteínas do HSV são expressas na membrana plasmática
de células infectadas, agindo, dessa forma, como principal estímulo
antigênico para a resposta imune celular e humoral (NORRILD, 1980;
AURELIAN, 2004). A gD é o principal alvo de ativação de linfócitos T CD4+
em estratégias vacinais contra o HSV-1. Além disso, as gD do HSV-1 e
HSV-2 têm alto nível de similaridade e podem gerar proteção contra ambos
tipos virais (MIKLOSKA e CUNNINGHAM, 1998). Dessa forma, estratégias
vacinais que empregam a proteína gD como parceira de fusão têm caráter
bifuncional, uma vez que, desencadeiam respostas imunológicas tanto
contra o antígeno alvo à ela fusionado como podem também conferir
proteção contra os HSVs (1 e 2).
Diante dos motivos acima expostos, construiu-se uma linhagem
recombinante adicional de B.subtilis capaz de expressar uma proteína
híbrida constituída pela fusão da proteína E7, próxima à extremidade C-
terminal da proteína gD de HSV-1. Teoricamente, essa linhagem possui
maior potencial imunogênico no que concerne à geração de respostas
imunológicas específicas contra a proteína E7, pois a fusão com a proteína
gD promoveria maior estabilidade à proteína, o que aumentaria o tempo de
exposição ao sistema imune do hospedeiro. Além disso, como foi visto, a
proteína gD possui adjuvanticidade intrínseca, apresentando a propriedade
de potencializar respostas humorais e celulares contra antígenos-alvo.
Como foi citado no início do texto, trabalhos anteriores do grupo
demonstraram que linhagens geneticamente modificadas de B.subitilis
29
capazes de expressar a proteína LTB eram capazes de desencadear
respostas humorais locais e sistêmicas, quando administradas a
camundongos por diferentes vias (PACCEZ et al., 2006, 2007). No intuito
de fornecer mais uma evidência da funcionalidade do modelo “in” de
expressão heteróloga em B.subtilis na ativação de linfócitos citotócicos (T
CD8+) específicos, decidiu-se avaliar a ativação de linfócitos T CD8+
específicos para a proteína LTB após a administração de linhagens
vacinais em camundongos. No presente trabalho, utilizou-se a linhagem
denominada LDV2, a qual é capaz de acumular a subunidade B da toxina
termolábil (LTB) de E.coli enterotoxigênica (ETEC) no citoplasma sob o
controle do promotor PgsiB.
No entanto, a principal resposta imunológica desencadeada pelo
antígeno LTB em animais imunizados com linhagens vacinais de B. subtilis
é humoral (PACCEZ et al., 2006, 2007). Dessa forma, a ativação de
respostas imunológicas de caráter celular requer a utilização de adjuvantes
específicos. Com isso em mente, o presente trabalho também empregou
linhagens geneticamente modificadas de B.subtilis capazes de expressar
além da proteína LTB, a proteína GroEL2 de Mycobacterium bovis.
As proteínas GroEL são proteínas pertencentes ao grupo das
proteínas de choque térmico que possuem atividade de chaperonina. As
HSPs estão entre as moléculas mais conservadas da biosfera e são
vastamente distribuídas em todos os reinos (ZUGEL e KAUFMANN, 1999;
SILVA, 1999). As chaperoninas são proteínas capazes de exercer diversas
funções celulares dependendo do organismo em questão. Em resumo, tais
proteínas possuem papel fundamental no metabolismo das proteínas
celulares, exercendo atividades como síntese, dobramento e montagem de
complexos protéicos, transporte e degradação de proteínas, tráfego de
peptídeos, processamento antigênico e ação tampão contra mutações
(MANJILI et al., 2002; KIANG e TSOKOS 1998; NETZER e HARTL, 1998).
Além disso, elas mantêm as funções cruciais das vias celulares durante o
estresse, atenuando o dano causado nessas condições. Durante períodos
30
de estresse, as chaperoninas realizam suas funções ligando-se a sítios
hidrofóbicos nos polipeptídios e, dessa forma, impedem mudanças
conformacionais não viáveis. Elas previnem ainda a formação de
agregados protéicos, a montagem errônea de proteínas e facilitam o
transporte através das membranas celulares.
As micobactérias produzem duas GroEL distintas, denominadas
GroEL1 e GroEL2 (KONG et al., 1993). Ambas apresentam 60 kDa e
demonstram mais de 60% de homologia entre si (YOUNG et al., 1988).
GroEL1 é uma proteína não essencial para M.bovis que está envolvida
principalmente na formação de ácido micólico e na produção de biofilmes
bacterianos. A GroEL2 é uma proteína essencial que possui funções gerais
na manutenção da homeostase celular (housekeeping protein); (OJHA et
al., 2005). As GroEL de M.bovis são freqüentemente referidas como HSP-
60, uma vez que as mesmas são proteínas de choque térmico e possuem
60 kDa.
Acumulam-se as evidências que as HSPs são os principais
antígenos de muitos patógenos (KAUFMANN, 1990). A infecção é um
processo multifatorial onde estão envolvidos os fatores de virulência dos
patógenos e a resposta imune do hospedeiro. Durante a infecção, tanto o
patógeno como o hospedeiro aumentam a produção de HSPs. Devido a sua
abundancia, as HSPs tornaram-se antígenos proeminentes que disparam a
principal porção do sistema imune. Membros da família da HSP60 e HSP70
representam o principal alvo para anticorpos em muitas infecções com
helmintos nematóides protozoários e bactérias (YOUNG et al., 1989).
Atualmente, as HSPs são consideradas potentes indutoras do sistema
imune inato e especifico. Seu papel é atuar como “sinal de perigo” para
primar múltiplas vias de defesa do hospeiro. De fato, essas proteínas estão
sendo utilizadas no desenvolvimento vacinas contra infecções crônicas e
contra o câncer (TODRYK et al., 2000). Desse modo, essas proteínas, além
de funcionar como chaperonas em suas células de origem, possuem
marcante atividade imunoadjuvante.
31
O mecanismo de adjuvanticidade das HSPs não é bem conhecido.
Acredita-se que moléculas de HSPs se complexem com antígenos alvo e
potencializem a indução de respostas adaptativas. De fato, peptídios
complexados às HSPs entram em células apresentadoras de antígenos
profissionais através de receptores específicos como TLRs, LOX-1 e CD91
e primam células T por meio do aumento da apresentação via MHC classes
I e II (CALDERWOOD et al., 2007). Além disso, algumas HSPs são capazes
de induzir a secreção de citocinas pró-inflamatórias como TNF-α e IL-12 e a
maturação de células dendriticas (DC); (MANJILI et al., 2004; GALLUCCI e
MATZINGER, 2001). Diante do exposto, observa-se que o mecanismo de
adjuvanticidade das HSPs permeia todos os ramos da resposta imunológica,
características que fazem dessas moléculas importantes ferramentas para o
desenvolvimento de vacinas eficazes.
Em resumo, o presente trabalho avaliou a imunogenicidade de
linhagens geneticamente modificadas de B.subtilis no tocante a ativação de
linfócitos citotóxicos (T CD8+) em modelo murino. Para tal feito, foram
utilizados dois antígenos modelo, a proteína E7 de HPV-16 e a subunidade
B da toxina LT-I. Empregamos também duas proteínas adjuvantes, a
proteína gD de HSV em conjunto com a proteína E7 e a proteína GroEL2
de M.bovis com a proteína LTB. Ao todo, foram utilizadas cinco linhagens
vacinais de B.subtilis recombinantes, duas expressando o antígeno E7 e
três linhagens expressando LTB. Para o antígeno E7, foram empregadas
linhagens capazes de expressar o antígeno isolado e a proteína de fusão
gDE7. Para o antígeno LTB, foram aplicadas linhagens capazes de
expressar a proteína LTB isolada, de co-expressar a proteína LTB e a
proteína GroEL2 e de expressar uma proteína de fusão composta pelas
proteínas GroEL2 e LTB.
32
2 OBJETIVOS
O objetivo geral do presente trabalho foi avaliar as respostas
imunológicas celulares T CD8+ induzidas em camundongos após a
administração de veículos vacinais baseados em linhagens geneticamente
modificadas de B.subtilis. Em uma primeira estratégia, foram estudadas
linhagens de B. subtilis capazes de expressar o antígeno alvo E7 de HPV-
16 em sua forma nativa ou geneticamente fusionado à proteína gD do HSV-
1. Em uma segunda abordagem experimental, estudamos linhagens de B.
subtilis que expressam o antígeno LTB de ETEC, que co-expressam LTB e
GroEL2 de M.bovis ou que expressam a proteína híbrida GroEL2-LTB.
33
3 MATERIAIS E MÉTODOS
O trabalho envolveu etapas de clonagem, análise de transcritos,
avaliação da expressão de proteínas in vitro, imunização de animais,
análise da resposta imunológica e ensaios de desafio e testes estatísticos.
Inicialmente serão descritas as etapas de construção dos diferentes
vetores. Os iniciadores utilizados durante as amplificações e os vetores
construídos serão descritos no decorrer do texto e maiores detalhes
encontram-se apresentados, respectivamente, nas Tabelas 1 e 2. Em
seguida, serão descritas as demais metodologias empregadas com os
respectivos materiais utilizados em cada etapa.
3.1 Construção de vetores
3.1.1 Construção de vetores epissomais capazes de expressar as
proteínas E7, gDE7 ou GroEL2
Os fragmentos gênicos correspondentes aos genes E7 e gDE7
foram amplificados pela técnica da PCR, utilizando o vetor pGDE7
(LÁSARO et al., 2005) e os pares de iniciadores específicos Fw3E7BglII,
Rv3E7XbaI e F1gDE7BglII, R2gDE7XbaI, respectivamente. Os fragmentos
gerados de aproximadamente 300 pb e 1.500 pb, respectivamente, foram
clivados com as enzimas de restrição BglII e XbaI e inseridos no vetor
pHCMC03, previamente digerido com as enzimas BamHI e XbaI (NGUYEN
et al., 2005). Dessa forma, foram gerados dois novos vetores pLDVR1 e
pLDVR2, respectivamente.
O fragmento gênico correspondente ao gene groEL2 foi amplificado
pela técnica da PCR, a partir de DNA genômico de M.bovis cepa
AF2122/97 (GARNIER et al., 2003) e dos iniciadores específicos
GroEL2FBglII e GroEL2RBglII. O fragmento gerado, de aproximadamente
34
1.600 pb, foi clivado com a enzima de restrição BglII e inserido no vetor
pHCMC03 (NGUYEN et al., 2005), previamente digerido com a enzima
BamHI, gerando um novo vetor, denominado pLDV72.
3.1.2 Construção de vetores epissomais capazes de expressar
simultaneamente GroEL2 e LTB
Para verificar a influência da expressão de GroEL2 de M.bovis na
imunogenicidade de linhagens de B. subtilis capazes de expressar LTB,
foram construídas duas linhagens, uma capaz de expressar uma proteína
híbrida composta pela fusão das proteínas GroEL2 e LTB e outra capaz
expressar as duas proteínas na forma não fusionada sob o controle do
mesmo promotor. Para primeira construção, amplificou-se pela reação da
PCR o gene eltB, a partir de DNA cromossômico de ETEC H10407 e dos
iniciadores específicos LTBF3BcuI e LTBR3BcuI. O fragmento gênico
obtido de aproximadamente 300 pb foi tratado com a enzima BcuI e
inserido no vetor pLDV72, gerando um novo vetor, denominado pLDV73.
Para segunda construção, amplificou-se o gene eltB acrescido de uma
região gênica responsável pela ligação ao ribossomo (RBS) derivada do
gene gsiB de B.subtilis (TAAAAGGAGGAAG), a partir do plasmídeo
pLDV73 e dos iniciadores específicos LTBRBSF6AatII e LTBR6. O
fragmento gerado, de aproximadamente 300pb, foi clivado com a
endonuclease AatII e inserido no vetor pLDV72, previamente preparado
com a enzima EcoRV, gerando um novo vetor denominado, pLDV74.
35
Tabela 1 - Lista dos iniciadores utilizados com suas seqüências e gene alvo
Tabela 2 - Vetores de expressão e linhagens de B. subtilis utilizados Vetores Epissomais
Linhagem de B. subtilis
Proteína (s) Expressa(s)
Referência
pLDV1 LDV1 ----- PACCEZ et al., 2006
pLDVR1 LDVR1 E7 Presente estudo pLDVR2 LDVR2 gDE7 Presente estudo pLDV2 LDV2 LTB PACCEZ et al.,
2006 pLDV72 LDV72 GroEL2 Presente estudo pLDV73 LDV73 GroEL2-LTB (fusão) Presente estudo pLDV74 LDV74 GroEL2 e LTB Presente estudo
Iniciadores Sequência 5´- 3´ Gene alvo Fw3E7BglII GGGTGGCACAGATCTATGCATGGAG Gene E7 Rv3E7XbaI GGCGCCTTTCTAGATTATGGTTTCTG Gene E7 F1gDE7BglII CGTTATAGATCTATGGGGGGGGCGC Gene gDE7
R2gDE7XbaI ATTAAGGGGGGGTCTAGAGTAAAACAAGGGC
Gene gDE7
GroEL2FBglII
GGCCATAGATCTATGGCCAAGACAATTGCGTACGA
Gene groEL2
GroEL2RBglII
GGCCATAGATCTGATATCGAAATCCATGCCACCCATGTCG Gene groEL2
LTBF3BcuI GGCCACTAGTGCTCCTCAGTCTATTACAGAACTATG
Gene eltB
LTBR3BcuI
GGCCTCTAGACTAGTTTTCCATACTGATTGCCG
Gene eltB
LTBRBSF6AatII GGCCATGACGTCTAAAAGGAGGAAGAATTCATGGCTCCTCAGTCTATTACAGAACTATG
Gene eltB
LTBR6AatII
GGCCATGACGTCATGGCTCCTCAGTCTATTACAGAACTATG Gene eltB
36
3.2 Preparação e transformação de bactérias competentes
Os plasmídeos construídos foram inicialmente propagados E. coli
DH5-α. A indução da competência foi realizada segundo protocolo
estabelecido por Sambrook e colaboradores (2001). Bactérias crescidas
até a metade da fase exponencial (D.O.600nm 0,6) foram incubadas em
solução de 0,1 M de CaCl2 por 1h a 0º C. Em seguida, a solução foi
centrifugada (10 min 5000 g) e as bactérias ressuspendidas em uma
solução 0,1 M de CaCl2 acrescida de 10% de glicerol (m/v). Alíquotas de
200 µL foram congeladas a - 80 ºC até a utilização. A transformação foi
realizada ao se adicionar a mistura de ligação ou o plasmídeo purificado
(20 - 100 ng) às alíquotas de células, incubando em gelo por 30 min,
seguindo-se de um choque térmico (42 ºC) por 2 min, nova incubação em
gelo por 2 min e adição de 900 µL de LB e incubação a 37 ºC por 1h,
seguida por plaqueamento em meio seletivo.
Os plasmídeos recombinantes foram isolados através de extração
por lise alcalina e transformados na linhagem de B. subtilis WW02 (WEHRL
et al., 2000) ou na linhagem WB800 (MURASHIMA et al., 2002) segundo
protocolo descrito anteriormente por Anagnostopoulos e Spizizen (1961),
no qual a linhagem de B.subtilis torna-se naturalmente competente em
meio HS (20% de glicose, 0,1% de L-triptofano, 2% de casaminoácidos,
10% de extrato de levedura, 8% de arginina e 0,4% de histidina), passando
a uma etapa seguinte de transformação com os plasmídeos em meio LS
(20% de glicose, 0,1% de L-triptofano, 2% de casaminoácidos, 2% extrato
de levedura, 1 M de MgCl2 e 1 M de CaCl2) após adição de 0,1 M de
EGTA.
37
3.3 Análise da expressão in vitro
As linhagens pLDV1, pLDV2, pLDVR1, pLDVR2, pLDV72, pLDV73
e pLDV74 foram crescidas por uma noite em meio LB. Inóculos com
diluição inicial de 1 : 100, feitos em meio LB, foram mantidos a 37 ºC sob
agitação (200 rpm) até início do crescimento exponencial (DO600nm 0,6). As
culturas foram submetidas, em seguida, a um choque térmico a 45 ºC por
2h. As linhagens pLDVR1 e pLDVR2 foram expostas a outros estímulos
capazes de ativar o promotor derivado do gene gsiB (PgsiB). Após atingir o
inicio da fase exponencial, essas últimas foram submetidas a
concentrações crescentes de etanol, que variaram de 1 a 8%, a
concentrações de NaCl, que variaram de 2 a 10%, a pHs ácidos, variando
de 6 até 4 e ao crescimento por 48h, simulando a exaustão de nutrientes.
Em todos os casos, foram retiradas amostras antes da indução e
após a indução de 2h. Extratos totais de células foram obtidos por
tratamento em tampão específico (sacarose 15%, Tris-HCl 250 mM,
lisozima 800 µg/mL), incubados a 37 ºC por 15 minutos, posteriormente
foram acrescidos 10 µL de SDS a 10% e feita uma nova incubação a 37 ºC
por 15 minutos. Todo material utilizado para análise foi dissolvido em
tampão de amostra para eletroforese em gel de poliacrilamida e
quantidades equivalentes a aproximadamente 108 UFC células vegetativas
foram submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida 15%. Em
seguida, transferidas para filtro de nitrocelulose e posteriormente reveladas
com anticorpos policlonais e/ou monoclonais específicos para cada
antígeno utilizado.
38
3.4 Detecção de RNAm
Ensaios de RT-PCR foram realizados a partir de RNA total extraído
das linhagens LDVR1 e LDVR2 após protocolos de indução (descritos no
item anterior). O RNA total foi extraído utilizando o tampão de lise
(sacarose 15%, Tris-HCl 250 mM, lisozima 800 µg/mL), incubados a 37 ºC
por 15 min, posteriormente foram acrescidos 10 µL de SDS a 10% e feita
uma nova incubação a 37 ºC por 15 minutos. O produto da lise foi
centrifugado e o sobrenadante utilizado para purificação de RNA total. Para
purificação de RNA total utilizou-se o SV Total RNA Isolation System
(Promega) de acordo com as especificações estabelecidas pelo fabricante.
As reações de transcriptase reversa foram realizadas com OneStep RT-
PCR Kit (QIAGEN) com os iniciadores reversos específicos utilizados nas
amplificações dos genes E7 e gDE7, Rv3E7XbaI e R2gDE7XbaI,
respectivamente. À exceção dessa alteração, todas as recomendações
fornecidas pelo fabricante foram seguidas. Em seqüência, foram realizadas
amplificações, a partir dos pares de iniciadores específicos para E7 e gDE7
e das fitas de DNA complementar geradas.
3.5 Preparação e purificação de esporos de linhagens recombinantes
de B. subtilis
A esporulação das linhagens recombinantes de B. subtilis foi
induzida em DSM (difco-sporulation media) usando o método de exaustão
descrito por Nicholson e Setlow (1990). Resumidamente, a linhagem a ser
esporulada é crescida por uma noite em meio LB, a cultura é inoculada em
meio DSM e o crescimento é feito por 48 horas (37 ºC, 200 rpm). A cultura
crescida é centrifugada para remoção do meio (10000 g, 10 min a 4 ºC) e
com ¼ de uma solução 1 M KCl e 0,5 M NaCl, após nova etapa de
centrifugação, o preciptado foi ressuspendido em ¼ do volume inicial de
um tampão de Tris.HCl (50 mM, pH 7,2) contendo lisozima a 50 µg/mL e
39
incubado por 1h a 37 ºC. Os esporos foram limpos por lavagens
consecutivas em soluções de NaCl 1 M, água deionizada, SDS a 0,05%,
tampão TEP (50 mM de Tris.HCl, pH 7,2; 10 mM de EDTA) e finalizadas
com três lavagens consecutivas com água deionizada. Depois de limpos os
esporos foram estocados a - 20 ºC.
3.6 Protocolos de imunização
Os protocolos de imunização empregados foram baseados em
trabalhos previamente publicados que descrevem a utilização de esporos
de B. subtilis geneticamente modificados para expressar antígenos
heterólogos (LTB e fragmento C da toxina tetânica, TTFC) ancorados à
parede externa (DUC et al., 2003) e em trabalhos que empregaram
linhagens geneticamente modificadas L.lactis como vetor vacinal
expressando a proteína E7 de HPV-16 (BERMÚDEZ-HUMARÁN et al.,
2003). Camundongos C57BL/6 foram imunizados pelas vias nasal ou
subcutânea com uma dose de 5 x 1010 UFC de células vegetativas vivas
induzidas, como descrito no item anterior, ou esporos (1010 UFC) nos dias
0, 14 e 28. As amostras de soro foram colhidas um dia antes de cada dose
e sete dias após a última dose.
3.7 Detecção de respostas de anticorpos específicos séricos
Análises das respostas de anticorpos anti-LTB específicos foram
realizadas em placas de ELISA de 96 poços sensibilizadas com
gangliosídeo GM1 na concentração de 2 mg/mL em PBS, deixadas a 37 ºC
por 4 horas. Foi realizada uma etapa de bloqueio incubando as placas a
37ºC por 30 minutos com uma solução 1% de BSA dissolvida em tampão
PBS. Posteriormente a toxina LT purificada foi adicionada (0,5 µg por poço)
e incubada por 2h a 25 ºC. Foram realizadas diluições seriadas com soros
40
diluídos em tampão PBS contendo 0,1% de BSA e 0,05% de Tween-20.
Após uma etapa de lavagem com tampão PBS contendo 0,05% de Tween-
20, as placas foram incubadas com anticorpos anti-IgG de camundongo
conjugados à peroxidase por 1,5h à temperatura ambiente. As placas
foram reveladas com solução reveladora (tampão citrato-fosfato 0,2 M pH 5
acrescido de OPD (0,4 mg/mL) e H2O2 0,04% v/v) e as reações foram
interrompidas com 50 µL de solução de H2SO4 a 1 M. A absorbância foi
medida no comprimento de onda de 492 nm. Os resultados apresentados
são baseados em analise individual a partir de experimentos de imunização
realizados em duplicata com cinco animais por grupo. Os valores obtidos
com animais imunizados com a linhagem LDV72 (não expressa LTB) e não
imunizados foram subtraídos dos valores encontrados com as demais
linhagens capazes de expressar LTB. Os gráficos representam os títulos de
anticorpos atingidos representados pelas médias + desvio padrão.
A análise de anticorpos séricos específicos para proteína gD foram
realizados seguindo o mesmo protocolo descrito a cima, diferindo apenas
na etapa de sensibilização das placas de ELISA. Essas últimas, nesse
caso, foram sensibilizadas por uma noite com a proteína gD purificada (200
ng/poço) a 4 °C. Os ensaios foram realizados em triplicata e os valores
obtidos com camundongos não imunizados foram subtraídos dos valores
obtidos com a linhagem LDVR2 e LDV1. Os gráficos representam os títulos
de anticorpos atingidos representados pelas médias + desvio padrão.
3.8 Ensaio de marcação intracelular de IFN-g expresso por células T
CD8+
A marcação de IFN-g foi realizada com células mononucleares do
sangue periférico (PBMC) ou a partir de esplenócitos obtidos de baços
após sete dias do fim do protocolo vacinal. As células foram tratadas por 5
minutos no gelo com Ack Lising Buffer (BioSource International) até ruptura
das hemácias e então centrifugadas a 1500 rpm por 5 min. As células
foram incubadas a uma concentração de 106 células por 5 horas a 37 °C /
41
5% CO2 na presença de Brefeldin A (GolgiPlug; BD PharMingen) e
peptídeo específico E7 (aminoácidos 49-57) xxRAHYNIVTFxx (CHEN,
2003; PENG, 2004; FELTKAMP, 1993) para os grupos de animais
imunizados com as linhagens LDV1, LDVR1 ou LDVR2 ou proteína LTB
purificada para grupos de animais imunizados com as linhagens LDV72,
LDV73 LDV74 e LDV2. Após este período, as células foram incubadas por
30 min a 4 ºC com o anticorpo anti-CD8 conjugado com fluoresceína FITC
(BD PharMingen). Após a permeabilização com Cytofix/Cytoperm (BD
PharMingen) por 20 minutos a 4 ºC, as células foram tratadas com
anticorpo anti-IFN-g conjugado a ficoeritrina PE (BD PharMingen) por 30
min a 4 ºC. As células foram ressuspendidas em PBS e examinadas por
citometria de fluxo de duas cores utilizando o aparelho EPICS Elite XL
(Beckman Coulter). Os dados foram analisados pelo programa WinMDi
para a determinação das porcentagens de células INF-g+ / CD8+ sobre o
total de células T CD8+. Os experimentos envolvendo as linhagens LDV1,
LDVR1 e LDVR2 foram realizados em triplicata com análise individual de
camundongos de ativação de linfócitos T CD8+. Os resultados expressos
nos gráficos representam a média dos valores obtidos ± o desvio padrão.
Enquanto que nos ensaios envolvendo as linhagens LDV2, LDV72, LDV73
e LDV74, os soros dos animais imunizados foram submetidos à análise
individual. Os dados apresentados nos gráficos representam as médias dos
valores obtidos ± desvio padrão, já subtraídos dos valores encontrados em
animais imunizados com a linhagem LDV72 (não expressa LTB).
3.9 Cultivo de células TC-1, desafio e acompanhamento da evolução
tumoral
A linhagem celular tumoral TC-1 (LIN et al., 1996) é derivada de
células primárias do epitélio pulmonar de C57BL/6 transformadas com v-
Has-ras e os genes de E6 e E7 do HPV-16 (gentilmente cedida pelo
Dr.T.C. Wu, Universidade Johns Hopkins, EUA). As células TC-1 foram
cultivadas em meio DMEM suplementado com 2 mM L-glutamina, 1 mM
42
piruvato de sódio, 2 mM aminoácidos não essenciais, 10 mM tampão
HEPES, 50 U/mL penicilina/streptomicina, 10% de soro fetal bovino (SFB)
e mantidas a 37 °C e 5% de CO2. No dia do desafio tumoral, as células
foram tratadas com tripsina, lavadas duas vezes, e ressuspendidas em
meio sem soro em concentrações apropriadas para inoculação. Os animais
foram desafiados sete dias após a última imunização com número de
células que variou entre 104 e 5 x 105 células por animal por via
subcutânea. Os tumores foram acompanhados e medidos diariamente
durante 30 dias e animais que apresentassem tumores maiores que 1,5 cm
de diâmetro eram sacrificados antes do final do período de observação.
3.10 Análises estatísticas
Os resultados obtidos nos ensaios de ELISA e de marcação
intracelular foram analizados no programa Microcal Origin Professional
versão 8.0. Para a análise de siguinificância dos dados obtidos entre os
grupos experimentais, utilizou-se o teste T de Student após a verificação da
variância entre os grupos. O intervalo de confiança utilizado foi de 95%, de
forma que, diferenças entre os grupos com valores de “p” menores ou
iguais a 0,05 foram consideradas siguinificativas.
43
4 RESULTADOS
4.1 Respostas imunológicas geradas após a administração de cepas
de B.subtilis recombinantes capazes de expressar as proteínas E7 e
gDE7
Os genes correspondentes às proteínas E7 e gDE7 foram
amplificados e bandas únicas, correspondentes a 300 pb e 1.500 pb,
respectivamente, tamanhos esperados para os dois genes em estudo,
foram isoladas (Figura 2). Os fragmentos gênicos obtidos foram tratados
com enzimas de restrição apropriadas e inseridos no vetor de expressão
pHCMC03 (descritos em materiais e métodos). A clonagem do gene E7 no
vetor pHCMC03 foi confirmada por análise de restrição, utilizando a enzima
AvaIII. Como esperado, obteve-se uma banda única de 6.955 pb
(linearização do vetor) após a digestão do pHCMC03 (vetor vazio) e duas
bandas, uma de 5.571 pb e outra de 1.671 pb, após a digestão do vetor
construído (Figura 3A), denominado de pLDVR1 (Figura 4). A clonagem do
gene gDE7 também foi confirmada por análise de restrição com a mesma
enzima. Após as digestões, obteve-se novamente uma banda de 6.955 pb
correspondente ao vetor vazio, enquanto que, como esperado, uma banda
de 6.388 pb e outra de 1.671 pb foram observadas com vetor construído
(Figura 3B), denominado pLDVR2 (Figura 4). Ambas as construções foram
confirmadas também por análise de seqüenciamento (dados não
mostrados). Os vetores construídos, pLDVR1 e pLDVR2, foram inseridos
na cepa de B.subtilis WW02 gerando, respectivamente, as linhagens
recombinantes LDVR1 e LDVR2, enquanto que linhagens de B.subtilis
transformadas com o vetor vazio (pHCMC03) já haviam sido denominadas
de LDV1 (PACCEZ et al., 2006).
44
Figura 2 - Amplificação dos genes E7 e gDE7, a partir do vetor pGDE7. (A)
Amplificação do gene E7. Amostras: 1- Marcador de massa molecular GeneRuler™ 1 kb (Fermentas) e 2- PCR E7 e 3- Marcador de massa molecular (O’GeneRuler ™) 100 pb (Fermentas). (B) Amplificação do gene gDE7. Amostras: 1- GeneRuler™ 1kb (Fermentas) e 2- PCR gDE7.
Figura 3 - Clonagens dos genes E7 e gDE7 no vetor pHCMC03 e análise de restricão. (A) Análise de restrição após clonagem do gene E7 no vetor pHCMC03. Amostras: 1- Marcador de massa molecular (GeneRuler™) 1 kb (Fermentas), 2- vetor pHCMC03 (vetor vazio) após a digestão com a enzima AvaIII, 3- poço sem DNA e 4- vetor pLDVR1 construído, após a digestão com AvaIII. (B) Análise de restrição da clonagem do gene gDE7 no vetor pHCMC03. Amostras: 1- Marcador de massa molecular (GeneRuler™) 1 kb (fermentas), 2- vetor pHCMC03 (controle negativo), após a digestão com a enzima AvaIII e 3- vetor pLDVR2 construído, após a digestão com AvaIII.
6.000 pb
2 1 3
1.500 pb 1.671 pb
10.000 pb
A1 2 3 4
1.671 pb
8.000 pb
1.500 pb
2 1
1.500 pb 500 pb
250 pb
1 2 3
300 pb
A
5.581 pb
gDE7
6.388 pb
B
B
45
Figura 4 - Representação esquemática dos vetores construídos para expressão
dos genes E7 ou gDE7 em B.subtilis. (A) representação do vetor pLDVR1, construído a partir da clonagem do gene E7 no cerne do vetor pHCMC03. (B) representação esquemática do vetor pLDVR2, construído a partir da clonagem do gene gDE7 no cerne do vetor pHCMC03. Destaques para: o promotor PgsiB, em verde, os sítios da enzima Ava III, em vermelho e para os genes clonados E7 e gDE7, realçados com uma elipse.
As linhagens LDV1, LDVR1 e LDVR2 após indução in vitro
(descrito no item material e métodos) foram submetidas a ensaios de
western-blot. Ensaios utilizando o anticorpo monoclonal anti-E7 não foram
capazes de detectar a proteína E7, nem a quimera gDE7 produzidas pelas
cepas LDVR1 e LDVR2, respectivamente, reconhecendo apenas a proteína
E7 purificada (Figura 5A). Ensaios realizados com anticorpo monoclonal
anti-gD, que deveriam reconhecer a proteína gDE7 produzida pela cepa
LDVR2, reconheceram apenas a proteína gDE7 purificada (Figura 5B).
A fim de esclarecer a deficiência na detecção das proteínas
heterólogas produzidas pelas cepas de B.subtilis recombinantes
construídas, realizou-se ensaios de western-blot com anticorpos policlonais
anti-E7 e anti-gDE7 os quais eram capazes de detectar quantidades
mínimas de 50 ng e 100 ng de proteína purificada, respectivamente.
Ensaios de western-blot com esses anticorpos também não foram capazes
de detectar as proteínas recombinantes E7 e gDE7, respectivamente,
produzidas em amostras correspondentes a 108 unidades formadoras de
colônia (UFC) das linhagens LDVR1 e LDVR2.
A B
pLDVR1 pLDVR2
46
As linhagens recombinantes foram submetidas a incubações a
45°C durante 2h como forma de ativar o promotor derivado do gene gsiB,
condição que poderia acelerar a degradação de proteínas. No intuito de
reduzir esse risco, realizou-se também induções em outras situações de
estresse capazes de induzir o promotor PgsiB, tais como adição de NaCl e
etanol e exposição a extremos de pH e à escassez de nutrientes. Realizou-
se também a inserção dos plasmídeos construídos em cepas de B.subtilis
WB800 (MURASHIMA et al., 2002), linhagem deficiente nas oito principais
proteases naturalmente produzidas pelas cepas selvagens utilizadas no
estudo. Em nenhuma das condições citadas a cima, conseguiu-se detectar,
por ensaios de western-blot, a expressão das proteínas E7 e gDE7,
respectivamente pelas linhagens LDVR1 e LDVR2 (dados não mostrados).
Figura 5 - Detecção in vitro da expressão das proteínas E7 e gDE7 produzidas
pelas cepas de B.subtilis construídas. (A) Detecção utilizando anticorpo monoclonal anti-E7. Amostras: 1- LDV1, 2- LDVR1, 3- LDVR2 e 4- Proteína E7 purificada (18 kDa). (B) Detecção utilizando anticorpo monoclonal anti-gD. Amostras: 1- LDV1, 2- LDVR1, 3- LDVR2 e 4- Proteína gDE7 purificada (55 kDa).
Como os ensaios de western-blot realizados não foram capazes de
detectar a expressão das proteínas heterólogas produzidas, realizou-se
ensaios de RT-PCR a fim de inferir indiretamente a cerca da expressão das
proteínas heterológas pelas linhagens de B.subtilis LDVR1 e LDVR2.
Esses ensaios apesar de não detectarem a proteína, detectam o RNAm
correspondente e por estarem baseados em reações de PCR possuem
sensibilidade superior aos ensaios de western-blot. Após as amplificações,
B
A
E7
1 2 3 4
gDE7
1 2 3 4
47
obteve-se uma banda correspondente a 300 pb a partir do RNA extraído da
cepa LDVR1 mas não foi possível amplificar o gene gDE7 a partir do RNA
extraído da cepa LDVR2 (Figura 6). Não se detectou também amplificação
quando se utilizou iniciadores para amplificação do gene E7 (contido no
gene híbrido gDE7), a partir RNA extraído da cepa LDVR2 (dado não
mostrado). Ensaios de RT-PCR também foram realizados com RNAs
extraídos das cepas recombinantes submetidas aos diferentes estímulos
capazes de induzir o promotor PgsiB (citados anteriormente), novamente,
observou-se a presença do transcrito correspondente à proteína E7 a partir
da cepa LDVR1 e não se detectou RNAm correspondente ao gene gDE7 a
partir da cepa LDVR2 (dados não mostrados).
Figura 6 - Detecção de RNAm correspondentes às seqüências clonadas E7 e
gDE7 por RT-PCR. Amostras: 1- GeneRuler™ 1 kb (fermentas), 2- RT-PCR de LDV1, 3- RT-PCR de LDVR1 e 4- RT-PCR de LDVR2.
Os ensaios de imunização foram iniciados mesmo sem a detecção
da expressão in vitro, uma vez que, como já visto, todas as construções
foram confirmadas por análises de restrição e seqüenciamento e o
transcrito correspondente à proteína E7 foi detectado na cepa LDVR1 por
RT-PCR. Inicialmente, realizou-se um ensaio piloto utilizando apenas
células vegetativas das linhagens construídas, administradas por via
subcutânea a camundongos C57BL/6. Foram pesquisados anticorpos IgG
séricos específicos contra gD em soros de camundongos imunizados com
três ou quatro doses da linhagem LDVR2, com o intuito de avaliar a
expressão in vivo da proteína gDE7 por essa cepa vacinal. Anticorpos
321 41 2 3 4
300 pb 500 pb 250 pb
48
específicos contra gD foram detectados por ensaios de ELISA, a partir de
soros de animais imunizados com a linhagem vacinal LDVR2.
Camundongos que receberam três doses da linhagem LDVR2 (expressa a
proteína gDE7), apresentaram um título médio de 277,24, camundongos
imunizados com quatro doses apresentaram um título médio de 319,40 e o
grupo controle, que recebeu a linhagem vazia (LDV1), apresentou um título
médio inespecífico de 91,7 (Figura 7).
0
50
100
150
200
250
300
350
400
0 1 2 3
Figura 7 - Detecção de anticorpos IgG específicos anti-gD em camundongos C57BL/6 após três ou quatro doses da linhagem vacinal de B.subtilis LDVR2. No eixo das ordenadas estão expressos os títulos de IgG sérico anti-gD e no eixo das abscissas, os grupos de imunização correspondentes aos títulos obtidos: 1- grupo que recebeu três doses da linhagem controle LDV1, 2- grupo que recebeu três doses da linhagem LDVR2 e 3- grupo que recebeu quatro doses da linhagem LDVR2. As barras horizontais representam os títulos médios encontrados em cada grupo.
No mesmo ensaio piloto descrito acima, avaliou-se a presença de
linfócitos TCD8+/INF-γ+ específicos para o PE7 por citometria de fluxo, a
partir de sangue periférico colhido de camundongos imunizados com as
linhagens de B.subtilis LDVR1, LDVR2 e LDV1. Os camundongos
imunizados com a linhagem vazia (LDV1) apresentaram 0,11% de ativação
Grupos de imunização
Tít
ulo
s d
e Ig
G a
nti
-gD
49
de linfócitos TCD8+ / INF-γ+ sem o estímulo e 0,20% com o estímulo do PE7.
Os animais receberam a linhagem LDVR1 apresentaram valores de 0,09%
sem estímulo e 0,21% com estímulo, enquanto que o grupo que recebeu a
linhagem LDVR2 foi capaz de ativar a maior resposta obtida, 0,12% sem
estímulo e 0,65% com estímulo. Nesse primeiro ensaio não foi possível
fazer análise estatística dos dados obtidos, uma vez que, o ensaio fora
realizado uma só vez a partir de pools de linfócitos extraídos de sangue
periférico. Nesse experimento, demonstrou-se que a administração da
cepa vacinal LDVR2 foi capaz de induzir a produção de linfócitos T CD8+
específicos para o PE7, embora os valores encontrados sejam baixos
quando comparados àqueles encontrados em animais imunizados com
vacina de DNA (LÁSARO et al., 2005).
Figura 8 - Análise de linfócitos T CD8+ específicos para o peptídeo PE7, em
camundongos C57BL/6 imunizados por via subcutânea com as linhagens vacinais de B.subtilis LDV1, LDVR1 ou LDVR2. A população de linfócitos positiva para CD8 e INF-γ encontra-se destacada em um círculo, com a respectiva percentagem em relação ao numero de linfócitos T CD8+ totais, enquanto que as populações positivas apenas para CD8 apresentam-se realçadas por um retângulo. Linha superior ensaio sem estímulo e linha inferior estímulo com o PE7. As colunas representam a análise de linfócitos TCD8+ específicos para as diferentes construções testadas.
LDV1 LDVR1 LDVR2
Sem estímulo
Peptídeo E7
50
A fim de confirmar dados acima descritos e de testar a
imunogenicidade de esporos das linhagens recombinantes construídas,
além de explorar uma via de mucosa, repetiu-se o experimento descrito
acima incluindo, imunizações com esporos das linhagens recombinantes e
a utilização da via nasal tanto com células vegetativas como esporos das
linhagens vacinais de B.subtilis construídas. Após a detecção individual de
ativação de linfócitos TCD8+ específicos, em grupos com cinco animais
imunizados com células ou esporos das linhagens construídas, não se
conseguiu confirmar os dados obtidos para camundongos imunizados com
a linhagem LDVR2 (Figura 9). Em camundongos imunizados com esporos
da linhagem LDVR1 por via subcutânea, detectou-se um valor médio de
0,38% de ativação de linfócitos T CD8+ específicos. No entanto, observa-se
que nem todos os camundongos desse grupo responderam da mesma
forma. Esses dados não suportaram os resultados obtidos no primeiro
experimento e demonstram que as linhagens vacinal LDVR1 e LDVR2 não
foram capazes de ativar de modo significato a produção de linfócitos
TCD8+ específicos para o PE7 (Figura 9).Tal fato, pode ser atribuído à baixa
expressão dos antígenos alvo pelas linhagens vacinais de B. subtilis
desenvolvidas.
Figura 9 - Análise de linfócitos T CD8
camundongos C57BL/6 após três doses de células ou esporos das linhagens LDV1, LDVR1 e LDVR2 pelas vias nasal (IN) ou subcutânea (SC). No eixo das ordenadas, têmCD8+/INF-γ+ ativados valores obtidos do ensaio sem o peptídio E7. No eixo das abscissas, encontram-se representados os grupos de imunização: 1LDVR1, 3- LDVR2, 4imunizados com esporos assinalados com um asterisco (*).
Uma confirmação dos resultados obtidos após a medição de
linfócitos T CD8+ E7-específicos foi feita por meio da inoculação de animais
imunizados com células tumorais TC
vacinais. Inicialmente, desafiou
105 células TC-1. Observou
imunizados com as duas formulações vacinais (LDVR1 e LDVR2), bem
como no grupo controle (
das células tumorais (
significativas na velocidade do desenvolvimento de tumores entre os
grupos que receberam as diferentes formulações vacinais (
Devido a variações encontradas na literatura nos protocolos
vacinais e número de células TC
foram realizados, a fim de se averiguar a influência dessas variáveis na
Lin
fóci
tos
TC
D8
esp
ecíf
ico
s (%
)
Análise de linfócitos T CD8+/INF-γ+ específicos para o peptídeo Pcamundongos C57BL/6 após três doses de células ou esporos das linhagens LDV1, LDVR1 e LDVR2 pelas vias nasal (IN) ou subcutânea (SC). No eixo das ordenadas, têm-se os valores médios de linfócitos T
ativados expressos em percentagem, já subtraídos dos valores obtidos do ensaio sem o peptídio E7. No eixo das abscissas,
se representados os grupos de imunização: 1-LDVR2, 4- LDV1*, 5- LDVR1* e LDVR2*. Os grupos
imunizados com esporos das linhagens recombinantes encontramassinalados com um asterisco (*).
Uma confirmação dos resultados obtidos após a medição de
específicos foi feita por meio da inoculação de animais
imunizados com células tumorais TC-1 sete dias após a fim dos protocolos
vacinais. Inicialmente, desafiou-se os camundongos imunizados com 5 x
1. Observou-se o aparecimento de tumores nos animais
imunizados com as duas formulações vacinais (LDVR1 e LDVR2), bem
como no grupo controle (LDV1), dentro de uma semana após a inoculação
das células tumorais (Tabela 3). Não houve também diferenças
significativas na velocidade do desenvolvimento de tumores entre os
grupos que receberam as diferentes formulações vacinais (Tabela
Devido a variações encontradas na literatura nos protocolos
vacinais e número de células TC-1 inoculadas, experimentos adicionais
foram realizados, a fim de se averiguar a influência dessas variáveis na
Grupos de imunização
51
específicos para o peptídeo PE7, em camundongos C57BL/6 após três doses de células ou esporos das linhagens LDV1, LDVR1 e LDVR2 pelas vias nasal (IN) ou subcutânea
se os valores médios de linfócitos T expressos em percentagem, já subtraídos dos
valores obtidos do ensaio sem o peptídio E7. No eixo das abscissas, - LDV1, 2-
. Os grupos das linhagens recombinantes encontram-se
Uma confirmação dos resultados obtidos após a medição de
específicos foi feita por meio da inoculação de animais
as após a fim dos protocolos
se os camundongos imunizados com 5 x
se o aparecimento de tumores nos animais
imunizados com as duas formulações vacinais (LDVR1 e LDVR2), bem
LDV1), dentro de uma semana após a inoculação
3). Não houve também diferenças
significativas na velocidade do desenvolvimento de tumores entre os
Tabela 3).
Devido a variações encontradas na literatura nos protocolos
1 inoculadas, experimentos adicionais
foram realizados, a fim de se averiguar a influência dessas variáveis na
52
proteção induzida pelas cepas de B.subtilis recombinantes construídas.
Foram realizados desafios com número intermediário de células tumorais
variando de 5 x 104 à 5 x 105 e empregou-se um regime vacinal com
quatro doses com intervalos de 14 dias no intuito de melhorar a resposta
celular específica induzida. De forma, semelhante ao ensaio anterior, não
observamos proteção significativa conferida pelas vacinas aos animais
imunizados (dados não mostrados).
Tabela 3 - Análise de proteção contra modelo desafio com células tumorais (TC-1).
Grupos de imunizaçãoa Animais com tumor /Animais inoculadosb
Tempo médio (dias)c
Via subcutânead
LDV1 5/5 5,8 ± 1,14
LDVR1 5/5 5,8 ± 0,83
LDVR2 5/5 6,6 ± 1,14
LDV1* 5/5 6,4 ± 0,89
LDVR1* 5/5 5,6 ± 1,10
LDVR2* 5/5 6,6 ± 0,55
Via nasale
LDV1 5/5 5,8 ± 1,10 LDVR1 5/5 6,4 ± 0,55
LDVR2 5/5 6,2 ± 0,84
LDV1* 5/5 6,0 ± 0,71
LDVR1* 5/5 5,8 ± 0,84
LDVR2* 5/5 5,4 ± 0,89
a Grupos de 5 camundongos C57BL/6 foram imunizados com células ou esporos das linhagens vacinais LDV1, LDVR1 e LDVR2 pelas vias nasal e subcutânea em um regime vacinal constituído por três doses com intervalos de 14 dias. Sete dias após a última dose, os camundongos foram desafiados com 5 x 105 células da linhagem TC-1. b Relação entre o número de camundongos desafiados e os que desenvolveram tumores após um período de observação de 20 dias. c Tempo médio de desenvolvimento de tumores palpáveis nos grupos de imunização. d Camundongos imunizados por via subcutânea. e Camundongos imunizados por via nasal.
53
4.2 Análise de respostas imunológicas induzidas após a
administração de linhagens de B.subtilis recombinantes capazes de
expressar GroEL2 e/ou LTB
Ao todo, foram construídos três vetores capazes de expressar
GroEL2 e/ou LTB. O vetor denominado pLDV72 possui a seqüência gênica
da proteína GroEL2 de M.bovis sob o controle do promotor PgsiB (Figura
10A). Os vetores pLDV73 e pLDV74 possuem os genes GroEL2 e eltB, de
modo que o vetor pLDV73 detém um gene híbrido constituído pela fusão do
gene eltB à jusante do gene GroEL2 (Figura 10B), enquanto que, o vetor
pLDV74 possui as duas seqüências separadas por uma região gênica
correspondente a um sítio de ligação ao ribossomo (RBS) de B.subtilis
(Figura 10C). Em ambos os vetores, os genes clonados encontram-se sob
o controle do mesmo promotor (PgsiB). As construções foram confirmadas
por análises de restrição e de seqüenciamento (dados não mostrados). Os
vetores construídos: pLDV72, pLDV73 e pLDV74 foram inseridos em
B.subtilis WW02 gerando, respectivamente, as linhagens recombinantes
LDV72, LDV73 e LDV74. Utilizou-se, como controle positivo, a linhagem de
B.subtilis LDV2 que alberga o plasmídeo pLDV2 capaz de expressar
somente a LTB sob o controle do mesmo promotor utilizado nas
construções a cima descritas (PACCEZ et al., 2006).
Figura 10 - Representação esquemática dos vetores construídos para expressão
de GroEL2 e/ou LTB em expressar a proteína GroEL2. (B) pLDV73 vetor capaz de expressar a proteína GroEL2 fusionada à LTB. (C) pLDV74 vetor capaz de coexpressar GroEL2 e LTB. Em azul, o promotor Pum círculo os genes clonados.
As linhagens LDV72, LDV73, LD
expressão das proteínas heterólogas
de western blot utilizando anticorpos policlonais anti
Ensaios utilizando o anticorpo policlonal anti
detectar proteínas com massas correspondentes a 60 kDa nas linhagens
LDV72, LDV74 e LDV2. Fato que era esperado, uma vez que, as linhagens
LDV72 e LDV74 expressam GroEL2 e cepas de
expressam uma HSP de 60 kDa com mais de 60% de homologia com a
GroEL2 de M. bovis. A cepa LDV73 apresentou um sinal mais forte no
ensaio e um pouco acima dos 60 kDa, resultado que era esperado, uma
vez que, essa cepa produz tanto a HSP60 de
pLDV72
epresentação esquemática dos vetores construídos para expressão de GroEL2 e/ou LTB em B.subtilis. (A) pLDV72 vetor capaz de expressar a proteína GroEL2. (B) pLDV73 vetor capaz de expressar a proteína GroEL2 fusionada à LTB. (C) pLDV74 vetor capaz de coexpressar GroEL2 e LTB. Em azul, o promotor PgsiB e destacados em um círculo os genes clonados.
As linhagens LDV72, LDV73, LDV74 e LDV2, após indução da
expressão das proteínas heterólogas in vitro, foram submetidas a ensaios
utilizando anticorpos policlonais anti-GroEL2 e anti
Ensaios utilizando o anticorpo policlonal anti-GroEL2 foram capazes de
roteínas com massas correspondentes a 60 kDa nas linhagens
LDV72, LDV74 e LDV2. Fato que era esperado, uma vez que, as linhagens
LDV72 e LDV74 expressam GroEL2 e cepas de B.subtilis
expressam uma HSP de 60 kDa com mais de 60% de homologia com a
. A cepa LDV73 apresentou um sinal mais forte no
ensaio e um pouco acima dos 60 kDa, resultado que era esperado, uma
vez que, essa cepa produz tanto a HSP60 de B.subtilis (60 kDa) como a
A
B
pLDV73
pLDV74
54
epresentação esquemática dos vetores construídos para expressão (A) pLDV72 vetor capaz de
expressar a proteína GroEL2. (B) pLDV73 vetor capaz de expressar a proteína GroEL2 fusionada à LTB. (C) pLDV74 vetor capaz de co-
e destacados em
V74 e LDV2, após indução da
, foram submetidas a ensaios
GroEL2 e anti-LTB.
GroEL2 foram capazes de
roteínas com massas correspondentes a 60 kDa nas linhagens
LDV72, LDV74 e LDV2. Fato que era esperado, uma vez que, as linhagens
selvagens
expressam uma HSP de 60 kDa com mais de 60% de homologia com a
. A cepa LDV73 apresentou um sinal mais forte no
ensaio e um pouco acima dos 60 kDa, resultado que era esperado, uma
(60 kDa) como a
C
55
proteína de fusão GroEL2-LTB (Figura 11A). Ensaios utilizando o anticorpo
anti-LTB, como esperado, revelaram a expressão da proteína LTB (11,5
kDa) pelas linhagens LDV2 e LDV74, enquanto que uma banda de
aproximadamente 71 kDa foi detectada na linhagem LDV73, massa
correspondente a proteína de fusão gerada (GroEL2-LTB); (Figura 11B).
Assim, demonstra-se que as cepas LDV72, LDV73 e LDV74 são capazes
de expressar, respectivamente, as proteínas heterólogas GroEL2,
GroeEL2-LTB e GroeEL2 e LTB.
Figura 11 - Detecção da expressão in vitro das proteínas GroEL2 e/ou LTB pelas cepas
de B.subtilis recombinantes construídas. (A) Detecção utilizando anticorpos anti-GroEL2. Amostras: 1- LDV2, 2- LDV72, 3- LDV73, 4- LDV74 e 5- GroEL2 purificada. (B) Detecção utilizando anticorpo anti-LTB. Amostras: 1- LDV2, 2- LDV72, 3- LDV74, 4- LDV73 e 5- LTB purificada.
A análise de resposta humoral anti-LTB foi feita a partir dos títulos
IgG séricos obtidos em animais imunizados com células vegetativas ou
esporos das linhagens LDV72, LDV73, LDV74 e LDV2 pelas vias nasal ou
subcutânea. Os valores obtidos com a linhagem LDV72, cepa que não
expressa LTB, foram subtraídos dos resultados aqui expressos. Em
animais imunizados pela via subcutânea, observou-se que, à exceção de
grupos imunizados com a linhagem LDV73, a administração das cepas
vacinais na forma de células vegetativas desencadeou maiores títulos de
anticorpos anti-LTB séricos, quando comparados a títulos obtidos em
animais que receberam esporos das linhagens recombinantes
correspondentes (Figura 12). Comparando os títulos obtidos a partir da
administração de células vegetativas pela mesma via, constatou-se que
camundongos que receberam a linhagem LDV74 e LDV2 apresentaram
1 3 4 1 2 3 4 5
LTB
GroEL2
5 2
A B
56
títulos mais elevados, respectivamente, 120,4 e 74,3 do que camundongos
imunizados com a linhagem LDV73, 17,2 (Figura12). Não se observou
diferenças significativas nos títulos obtidos entre os grupos que receberam
esporos das linhagens LDV73, LDV74 e LDV2. Diante do exposto a cima,
pode-se propor que a fusão da proteína LTB à GroEL2, expressa pela
linhagem de B.subtilis LDV73, é capaz de inibir a produção de anticorpos
anti-LTB quando essa cepa é administrada a camundongos por via
subcutânea na forma de células vegetativas.
Figura 12 - Avaliação dos títulos de anticorpos anti-LTB séricos obtidos após o
protocolo de imunização envolvendo células vegetativas e esporos das linhagens LDV72, LDV73, LDV74 e LDV2 administrados pela via subcutânea. No eixo das ordenadas encontram-se representados os títulos de anticorpos anti-LTB obtidos e no eixo das abscissas os grupos de imunização correspondentes. Os valores obtidos com a linhagem LDV72 foram subtraídos dos demais grupos e grupos imunizados com esporos das linhagens recombinantes encontram-se indicados por um asterisco (*).
Em camundongos imunizados pela via nasal, também se observou
que a administração de células vegetativas das linhagens recombinantes
de B.subtilis LDV73, LDV74 e LDV2 desencadearam maiores títulos
quando comparados aos obtidos com camundongos imunizados pela
mesma via com esporos das linhagens correspondentes (Figura 13). Além
0
20
40
60
80
100
120
140
160
LDV73 LDV74 LDV5 LDV73* LDV74* LDV5*Grupos de Imunização
Tít
ulo
s d
e Ig
G a
nti
-LT
B
LDV 73 LDV74 LDV2 LDV73* LDV74* LDV2*
57
disso, por essa mesma via de imunização, foi possível observar que os
títulos atingidos em camundongos que receberam a linhagem LDV73 foram
inferiores aos obtidos com as linhagens LDV74 e LDV2, fato semelhante ao
que ocorreu nas imunizações por via subcutânea.
Ao se comparar as duas vias, pôde-se perceber que, de modo
geral, as imunizações por via nasal resultaram em menores títulos de
anticorpos quando comparados aos grupos que receberam as linhagens
recombinantes por via subcutânea (Figuras 12 e 13). Assim, constata-se
que há a inibição da resposta humoral sérica anti-LTB em camundongos
que receberam a linhagem LDV73, tanto pela via parenteral utilizada como,
pela via de mucosa e as respostas de anticorpos anti-LTB geradas pela
administração das cepas vacinais pela via subcutânea são superiores às
geradas em camundongos imunizados pela via nasal.
Figura 13 - Avaliação dos títulos de anticorpos anti-LTB séricos obtidos após o protocolo de imunização envolvendo células vegetativas e esporos das linhagens LDV72, LDV73, LDV74 e LDV2 administrados pela via intra-nasal. No eixo das ordenadas, encontram-se representados os títulos de anticorpos anti-LTB obtidos e no das abscissas, os grupos de imunização correspondentes. Os valores obtidos com a linhagem LDV72 foram subtraídos dos demais grupos e grupos imunizados com esporos das linhagens recombinantes encontram-se indicados por um asterisco (*).
0
5
10
15
20
25
30
35
40
LDV73 LDV74 LDV5 LDV73* LDV74* LDV5*
Tít
ulo
s d
e Ig
G a
nti
-LT
B
Grupos de imunização LDV 73 LDV74 LDV2 LDV73* LDV74* LDV2*
58
A fim de se avaliar a ativação de resposta celular tipo T CD8+
específica para proteína LTB em animais que receberam células ou
esporos das linhagens LDV72, LDV73, LDV74 e LDV2 pelas vias nasal e
subcutânea, realizou-se ensaios de citometria de fluxo em triplicata a partir
de pools de baços de cinco animais por grupo. Os valores obtidos nos
ensaios sem estímulo com a proteína LTB, bem como, os obtidos com a
linhagem LDV72 (expressa somente GroEL2) foram subtraídos dos valores
aqui representados. Em camundongos imunizados pela via subcutânea,
observou-se que aqueles que receberam as linhagens LDV2 e LDV73,
administradas na forma de células vegetativas, apresentaram maior
número de linfócitos T CD8+ específicos ativados, quando comparados a
animais que receberam esporos das linhagens correspondentes (Figura
14). Em contra partida, animais imunizados com esporos da linhagem
LDV74 pela mesma via, alcançaram valores superiores de linfócitos T CD8+
específicos ativados quando comparados aos valores obtidos em animais
que receberam células vegetativas da mesma linhagem (Figura 14). Em
animais imunizados com células vegetativas das linhagens LDV73 e LDV2,
por via subcutânea, observou-se a ativação 2,99% ±0,8 e 4,37% ±0,7,
respectivamente, de linfócitos T CD8+ específicos para LTB, valores
superiores aos obtidos com a linhagem LDV74, que ativou apenas 1,89% ±
0,1 (Figura 14). Constatou-se, com esses experimentos, que veículos
vacinais baseados em B.subtilis são capazes de desencadear respostas T
CD8+ específicas contra o antígeno modelo LTB expresso pelas cepas
vacinais. Além disso, as linhagens vacinais LDV73 e LDV2 administradas
na forma de células vegetativas e a linhagem LDV74 administrada na forma
de esporos pela via subcutânea revelaram-se mais promissoras na
ativação de respostas T CD8+ específicas contra o antígeno modelo LTB.
Figura 14 - Análise de linfócitos T CD8
realizada a partir baços de grupos com cinco animais imunizados com células e esporos das linhagens LDV73, LDV74 e LDV2 pela via subcutânea. No eixo das ordenadas, temT CD8+/INF-γsem a proteína LTB e no eixo das abscissasimunização correspondentes. Os grupos imunizados com esporos das linhagens recombinantes encontram(*). Os valores obtidos com a linhagem LDV72 foram subtraídos dos demais valores apresentados.
Em camundongos imunizados pela via nasal, observou
novamente que, à exceção de animais imunizados com linhagem LDV74, a
administração de células vegetativas
desencadeou maior número de linfócitos T CD8
LTB quando comparada à administração de esporos das linhagens
correspondentes. Nos camundongos imunizados com células vegetativas
pela mesma via, observou
cepa LDV73 alcançou
experimento, alcançando
já em camundongos imunizados com células vegetativas das linhagens
LDV74 e LDV5 desencadearam valores médios respectivamente de 1,5%
±0,1 e 1,5 ±0,4 de ativação (
Lin
fóci
tos
TC
D8+
esp
ecíf
ico
s
LDV73 LDV74 LDV2 LDV73* LDV74* LDV2*
linfócitos T CD8+/INF-γ+ específicos para a proteína LTB, realizada a partir baços de grupos com cinco animais imunizados com células e esporos das linhagens LDV73, LDV74 e LDV2 pela via subcutânea. No eixo das ordenadas, tem-se porcentagem de linfócitos
γ+ ativados, já subtraídos dos valores obtidos do ensaio sem a proteína LTB e no eixo das abscissas, os grupos de imunização correspondentes. Os grupos imunizados com esporos das linhagens recombinantes encontram-se assinalados com um asterisco (*). Os valores obtidos com a linhagem LDV72 foram subtraídos dos demais valores apresentados.
Em camundongos imunizados pela via nasal, observou
novamente que, à exceção de animais imunizados com linhagem LDV74, a
administração de células vegetativas das linhagens recombinantes
desencadeou maior número de linfócitos T CD8+ ativados específicos para
LTB quando comparada à administração de esporos das linhagens
correspondentes. Nos camundongos imunizados com células vegetativas
pela mesma via, observou-se que, em camundongos vacinados com a
cepa LDV73 alcançou-se a maior ativação de linfócitos T CD8
alcançando um valor médio 5,5% ±0,9 de ativação específica,
já em camundongos imunizados com células vegetativas das linhagens
desencadearam valores médios respectivamente de 1,5%
±0,1 e 1,5 ±0,4 de ativação (Figura 15). Entre os camundongos imunizados
Grupos de imunização
LDV73 LDV74 LDV2 LDV73* LDV74* LDV2*
59
específicos para a proteína LTB, realizada a partir baços de grupos com cinco animais imunizados com células e esporos das linhagens LDV73, LDV74 e LDV2 pela via
se porcentagem de linfócitos ativados, já subtraídos dos valores obtidos do ensaio
os grupos de imunização correspondentes. Os grupos imunizados com esporos das
se assinalados com um asterisco (*). Os valores obtidos com a linhagem LDV72 foram subtraídos dos
Em camundongos imunizados pela via nasal, observou-se
novamente que, à exceção de animais imunizados com linhagem LDV74, a
das linhagens recombinantes
ativados específicos para
LTB quando comparada à administração de esporos das linhagens
correspondentes. Nos camundongos imunizados com células vegetativas,
em camundongos vacinados com a
se a maior ativação de linfócitos T CD8+ do
um valor médio 5,5% ±0,9 de ativação específica,
já em camundongos imunizados com células vegetativas das linhagens
desencadearam valores médios respectivamente de 1,5%
15). Entre os camundongos imunizados
com esporos das linhagens recombinantes, ainda pela via nasal, detectou
se que os animais que receberam a linhagem LDV74 (3,0
desencadearam maior ativação de linfócitos T CD8
comparados a animais que receberam esporos das linhagens LDV73 (1,1%
±0,9) e LDV2 (1,1% ±0,8); (
Figura 15 - Análise de linfócitos T CD8
a partir baços de grupos com cinco animais imunizados com células e esporos das linhagens LDV73, LDV74 e LDV2 pela via nasal. No eixo das ordenadas, tem-se porcentagem de linfócitos T CD8valores obtidos do ensaio sem a proteína LTB e no eixo das abscissasgrupos de imunização correspondentes. Os grupos imunizados com esporos das linhagens recombinantes encontramOs valores obtidos com a valores apresentados.
Lin
fóci
tos
TC
D8s
pec
ífic
os
(%)
LDV73 LDV74 LDV2 LDV73* LDV74* LDV2*
com esporos das linhagens recombinantes, ainda pela via nasal, detectou
se que os animais que receberam a linhagem LDV74 (3,0
desencadearam maior ativação de linfócitos T CD8+ específicos quando
comparados a animais que receberam esporos das linhagens LDV73 (1,1%
±0,9) e LDV2 (1,1% ±0,8); (Figura 15).
de linfócitos T CD8+/INF-γ+ específicos para a proteína LTB, realizada a partir baços de grupos com cinco animais imunizados com células e esporos das linhagens LDV73, LDV74 e LDV2 pela via nasal. No eixo das ordenadas,
se porcentagem de linfócitos T CD8+/INF-γ+ ativados, já subvalores obtidos do ensaio sem a proteína LTB e no eixo das abscissasgrupos de imunização correspondentes. Os grupos imunizados com esporos das linhagens recombinantes encontram-se assinalados com um asterisco (*). Os valores obtidos com a linhagem LDV72 foram subtraídos dos demais valores apresentados.
Grupos de imunização
LDV73 LDV74 LDV2 LDV73* LDV74* LDV2*
60
com esporos das linhagens recombinantes, ainda pela via nasal, detectou-
se que os animais que receberam a linhagem LDV74 (3,0% ±0,7)
específicos quando
comparados a animais que receberam esporos das linhagens LDV73 (1,1%
específicos para a proteína LTB, realizada a partir baços de grupos com cinco animais imunizados com células e esporos das linhagens LDV73, LDV74 e LDV2 pela via nasal. No eixo das ordenadas,
ativados, já subtraídos dos valores obtidos do ensaio sem a proteína LTB e no eixo das abscissas, os grupos de imunização correspondentes. Os grupos imunizados com esporos
se assinalados com um asterisco (*). linhagem LDV72 foram subtraídos dos demais
61
5 DISCUSSÃO
No presente trabalho, mostrou-se, pela primeira vez, a expressão
das proteínas E7 de HPV-16 e GroEL2 de M.bovis em cepas
geneticamente modificadas de B.subtilis. Além disso, realizou-se também a
construção inédita de linhagens B.subtilis capazes de expressar as
proteínas híbridas gDE7 (proteína E7 fusionada à região próxima à
extremidade C-terminal da gD de HSV-1) e GroEL-LTB (sub-unidade B da
toxina LT de EHEC fusionada à extremidade C-terminal da proteína
GroEL2). Destaca-se ainda o pioneirismo na avaliação de respostas
celulares induzidas contra antígenos expressos por cepas geneticamente
modificadas de B.subtilis após administração por via parenteral e de
mucosa. Tais resultados representam uma importante contribuição aos
estudos voltados para utilização de linhagens geneticamente modificadas
de B.subtilis como veículo vacinal.
No presente trabalho, empregou-se o modelo de expressão em que
o antígeno alvo acumula-se no interior de células vegetativas de B.subtilis
(modelo “in”, ver introdução) utilizadas como veículo vacinal para a
expressão das proteínas E7 e gDE7. Como já exposto, esse modelo
permite um maior número de cópias do gene alvo o que,
conseqüentemente, leva à maior produção do produto gênico gerado,
quando comparado ao sistema que integra o gene alvo em cópia única ao
cromossomo da bactéria (“modelo out”). Apesar disto, não foi possível
detectar a expressão in vitro das proteínas E7 e gDE7 pelas cepas
recombinantes de B.subtilis LDVR1 e LDVR2, respectivamente, por
ensaios de western blot. Constatou-se que a falha na detecção das
proteínas recombinantes expressas pode ser atribuída a vários fatores,
entre eles, (i) a sensibilidade do ensaio de detecção das proteínas
expressas por western blot, (ii) a degradação das proteínas
recombinantes por proteases produzidas pela linhagem de B. subtilis
62
empregada e (iii) a baixa expressão das proteínas recombinantes pelas
cepas de B.subtilis construídas.
A proteína E7 foi expressa em diferentes hospedeiros procarióticos,
dentre eles: E.coli (KASHER et al., 1993; MIRECKA et al., 2006),
Salmonella Typhymurium (LONDOÑO et al., 1996), Listeria monocytogenes
(GUNN et al., 2000; LIN et al., 2002), Streptococcus gordonii (DI FABIO et
al., 1997) Lactobacillus casei (POOL et al., 2006). Lactococcus lactis
(BERMÚDEZ-HUMARÁN et al., 2003; CORTES-PEREZ et al., 2003). Vale
destacar que, à exceção dos trabalhos envolvendo E.coli, a expressão da
proteína E7 foi avaliada apenas por ensaios qualitativos como imuno blots.
Na expressão dessa proteína por linhagens recombinantes de B.subtilis,
observou-se que a quantidade de proteína E7 produzida por 108 unidades
formadoras de colônia (UFC) da linhagem LDVR1 foi inferior a 50 ng, uma
vez que esse último valor corresponde ao limiar de detecção dos
anticorpos anti-E7 utilizados. Dessa forma, a baixa sensibilidade dos
anticorpos empregados poderia ser uma possível explicação para a não
detecção da proteína E7 nos ensaios de western blot realizados. A
obtenção de anticorpos específicos com maiores títulos e afinidade à
proteína seria uma alternativa para demonstrar-se a expressão nas
linhagens de B. subtilis construídas.
A proteína gD foi expressa em E.coli (MOSKO et al., 2004) em
Pichia pastoris (van KOOIJ et al., 2002) e em sistema Baculovírus – células
de inseto (SISK et al., 1994). No caso de B.subtilis, expressou-se a
proteína gD na forma de proteína de fusão com a proteína E7 (linhagem
LDVR2). É válido ressaltar que essa fusão gênica havia sido relatada
somente em trabalho anterior do grupo cuja expressão foi observada em
células eucarióticas (LÁSARO et al., 2005). No entanto, semelhante ao
que ocorreu com a expressão da proteína E7, ensaios de western blot
demonstraram que a quantidade da proteína gDE7 produzida por 108 UFC
da linhagem LDVR2 foi inferior a 100 ng de proteína purificada (limite de
detecção dos anticorpos anti-gD utilizados). Como já explicitado, no
63
parágrafo anterior, acredita-se que a utilização de anticorpos com títulos
mais elevados e mais específicos detectariam a produção das proteínas
heterólogas em B.subtilis.
A linhagem de B.subtilis utilizada no trabalho (B.subtilis WW02)
possui grande capacidade intrínseca de secretar proteínas, sobretudo,
proteases as quais, potencialmente, podem degradar o produto de genes
heterólogos quando se utiliza essa bactéria como modelo de expressão
heteróloga (BOLHUIS et al., 1999; LI et al., 2004; WESTERS et al., 2004;
FERREIRA e SCHUMAN, 2005). De fato, alguns trabalhos demonstram
que cepas de B.subtilis deficientes em proteases são capazes de produzir
grandes quantidades de proteínas heterólogas. (FAHNESTOCK e FISHER,
1987; MURASHIMA, 2002; WESTERS et al., 2005). Dessa forma, a fim de
reduzir a interferência de proteases na detecção dos produtos gênicos
expressos, inseriu-se também os vetores gerados durante o trabalho
(pLDVR1 e pLDVR2) na linhagem B.subtilis WB800, linhagem deficiente
em oito proteases, possuindo uma atividade residual inferior a 0,20%
quanto comparada à cepa de B.subtilis selvagem (MURASHIMA et al.,
2002). Novamente, não foi possível detectar a expressão dos genes E7 e
gDE7 nas cepas de B.subtilis construídas. Na realidade, não se esperava
que as proteínas heterólogas E7 e gDE7 expressas pelas cepas de
B.subtilis construídas fossem degradadas pelas proteases produzidas, uma
vez que, os antígenos em questão foram acumulados intracelularmente,
enquanto que as principais proteases de B.subtilis são secretadas para o
meio externo ou ficam ancoradas à parede celular.
O sistema de expressão de proteínas heterólogas utilizadas no
presente estudo envolveu o promotor induzido por estresse, derivado do
gene gsiB, presente em vetor epissomal derivado do plasmídeo pMTLB72
(TITOK et al., 2003). Em trabalho anterior foi possível demonstrar que
linhagens de B. subtilis transformadas com tais vetores expressando a sub-
unidade B da toxina termolábil de E.coli podem acumular proteínas
heterólogas em concentrações 50 ng/108 UFC (PACCEZ et al., 2006). Uma
64
possibilidade para explicar variações na expressão de diferentes proteínas
heterólogos em sistemas de expressão procarióticos passa pela
adequação dos códons encontrados no gene que se deseja expressar. A
proteína gDE7 possui 25 resíduos de prolina codificados pelo códon CCC o
que corresponde a cerca de cinco por cento (5%) da proteína total,
enquanto que, B.subtilis utiliza preferencialmente os códons CCG e CCU
para codificar o aminoácido prolina. Quando se analisou apenas a proteína
E7, observou-se que tal códon raro para B.subtilis aparece apenas uma
vez, representando apenas cerca de um por cento da proteína total.
A utilização de códons varia entre as espécies de seres vivos e, até
mesmo, entre genes de um mesmo organismo (SHARP et al., 1995). Os
códons de um gene são fatores limitantes para expressão, sobretudo, se o
produto a ser expresso for oriundo de um gene heterólogo que apresente
códons incompatíveis com o hospedeiro utilizado para expressão
(FUGLSANG, 2003 e CHECHETKIN, 2006). Dessa forma, observa-se que
códons raros para B.subtilis são utilizados em grande parte da proteína
gDE7, fato esse que pode ter contribuído para baixa expressão e,
conseqüentemente, para falha da detecção in vitro por ensaios de western
blot da referida proteína. Já a proteína E7 apresenta apenas uma prolina
codificada por CCC, sendo, do ponto de vista de utilização de códom, mais
promissora para expressão heteróloga em B.subtilis. A substituição dos
códons CCC por CCG ou CCU pode aumentar a expressão da proteína
gDE7 em B.subtilis, uma vez que, como já fora mencionado, a referida
bactéria utiliza preferencialmente esses códons para codificar o aminoácido
prolina. Outra forma da aumentar expressão desse gene seria a introdução
da seqüência gênica responsável pela síntese do RNAt em questão no
genoma ou em vetor epissomal de B.subtilis, permitindo, dessa forma, a
complementação do códon raro.
Os experimentos de imunização foram realizados, mesmo sem a
detecção das proteínas recombinantes in vitro, uma vez que, todas as
construções realizadas foram confirmadas por análise de restrição e
65
seqüenciamento e observou-se a presença do transcrito na linhagem
LDVR1. As vias de imunização escolhidas foram baseadas em estudos
anteriores do grupo e em estudos empregando L.lactis, outra bactéria
gram-positiva não patogênica (CORTES-PEREZ et al., 2003). A via
parenteral já havia sido empregada com sucesso em trabalho anterior do
grupo que observou a geração de respostas imunológicas a partir da
administração de linhagens recombinantes de B.subtilis capazes de
expressar a proteína LTB em diferentes compartimentos celulares
(PACCEZ, 2006, 2007). Por outro lado, a via nasal foi empregada com
base em estudos que administraram linhagens geneticamente modificadas
de L.lactis capazes de expressar a proteína E7 a camundongos e
observaram respostas citotóxicas específicas contra o PE7 (CORTES-
PEREZ et al., 2003).
Ensaios de ELISA confirmaram a expressão da proteína gDE7 in
vivo pela cepa LDVR1. O título médio atingido (300), embora significativo, é
baixo quando comparado a títulos atingidos após a imunização com quatro
doses da vacina de DNA pGDE7 descrita por Lásaro e colaboradores
(2005). Durmanová e colaboradores em 2006, utilizando vacinas de DNA,
também encontram títulos elevados contra a proteína gD com valores de
títulos de aproximadamente 8.000. No entanto, vale destacar, que veículos
procarióticos podem não realizar modificações pós-traducionais presentes
em proteínas expressas por eucariotos, o que compromete a apresentação
de epítopos conformacionais e, conseqüentemente, diminui a
imunogenicidade da proteína heteróloga produzida. Entretanto, nossos
resultados demonstram que veículos vacinais baseados em linhagens
geneticamente modificadas de B.subtilis capazes de expressar a proteína
gDE7 são capazes de desencadear respostas de anticorpos séricos contra
a proteína gD quando administrados por via parenteral a camundongos
C57BL/6.
Na detecção de linfócitos TCD8+ específicos para o PE7 em animais
imunizados com as cepas recombinantes de B.subtilis LDV1 (controle
66
negativo), LDVR1 (expressa somente a proteína E7) e LDVR2 (expressa a
proteína gDE7), observou-se que no primeiro experimento realizado houve
a ativação significativa de linfócitos T CD8+ (0,65%) em camundongos que
receberam a linhagem LDVR2 por via subcutânea. No entanto, tal ativação
não foi confirmada após dois ensaios de imunização subseqüentes. De
fato, esperava-se que camundongos imunizados com a linhagem LDVR2
fossem capazes de apresentar maior ativação de linfócitos T específicos
para o PE7 quando comparados a animais que receberam a linhagem
LDVR1 que expressa apenas a proteína E7. Uma vez que, a linhagem
LDVR2 expressa a proteína E7 na forma de proteína de fusão, construção
que permite maior estabilidade a proteína E7 quando expressa em
hospedeiros bacterianos (CORTES-PEREZ et al., 2003; BERMÚDEZ-
HUMARÁN et al., 2003). Além disso, em trabalhos anteriores observou-se
que a fusão de antígenos à proteína gD na forma de vacinas de DNA foi
capaz de potencializar as resposta imunológicas contra os antígenos
modelo utilizados (ALVES et al., 1998; LÁSARO et al., 2005, 2008). Dessa
forma, no caso específico de B.subtilis, acredita-se que a baixa expressão
da proteína gDE7 tenha sido responsável pela não ativação de resposta
celular detectável. Acredita-se que uma melhor expressão do antígeno alvo
pelas linhagens recombinantes de B. subtilis, seja pela adequação de
códon ou pela utilização de outros promotores, possam gerar veículos
promissores para geração de respostas imunes celulares.
Outros pesquisadores já haviam observado respostas celulares
especificas para proteína E7 a partir da administração de veículos vacinais
capazes de expressar esse antígeno. Poo e colaboradores (2006),
utilizando L.casei expressando a proteína E7 fusionada geneticamente à
primeira porção da poli-γ-glutamato sintetase de B.subtilis, demonstraram
a ativação de 12% de linfócitos T totais ( T CD4+ e T CD8+) específicos
para a proteína E7 após um protocolo de imunização envolvendo três
séries de cinco doses por via oral. Vale ressaltar, que o veículo utilizado é
capaz de colonizar e se propagar por várias gerações após cada dose e
67
que o número de doses utilizado é bem superior ao utilizado no presente
estudo (ver materiais e métodos), fatores esses que implicam maiores
quantidades de antígenos apresentados ao sistema imune e a conseqüente
geração de uma maior ativação da resposta imune. No entanto, veículos
capazes de colonizar o hospedeiro apresentam risco potencial no que
concerne ao desenvolvimento de tolerância imunológica ao antígeno e / ou
ao veículo utilizado (DI FABIO et al., 1997).
Lin e colaboradores (2002) utilizaram linhagens geneticamente
modificadas de L.monocytogenes capazes de expressar a proteína E7
fusionada à listeriolisina O (LLO), produzida pela mesma bactéria. Nesse
último trabalho, detectou-se a presença de 6,5% de linfócitos T específicos
para o epítopo T CD8+ da proteína E7 em animais imunizados com duas
doses da formulação por via oral. Sewell e colaboradores (2004), utilizando
sistema semelhante, observaram a presença de 2,8% de linfócitos T CD8+
específicos para o pE7 após duas doses de L.monocytogens recombinante
por via intraperitoneal. É fundamental destacar que os modelos utilizados
nos dois últimos estudos empregam bactérias patogênicas atenuadas,
estratégia que, apesar de bastante promissora, possui risco potencial de
reversão de patogenicidade. As linhagens de B.subtilis utilizadas durante o
presente estudo são derivadas da cepa WW02 que é reconhecida como
segura para o uso em humanos e animais e ainda apresenta atividade
probiótica quando administrada por via oral.
Os ensaios de dupla marcação em citometria de fluxo detectam
apenas células T CD8+ ativadas pelo peptídeo apresentado, mas não
demonstram a atividade citotóxica propriamente dita. Trata-se de um
correlato importante para possíveis respostas citotóxicas. Alguns trabalhos
avaliaram a atividade citotóxica específica para E7 em ensaios de
citotoxidade in vitro. Lin e colaboradores (2002), utilizando abordagem
vacinal descrita a cima, detectaram e média 30 e 40% de lise específica
mediada por linfócitos extraídos de baços de camundongos imunizados,
respectivamente, pelas vias oral e subcutânea com as cepas
68
geneticamente modificadas de L.monocytogens. Bermúdez-Humarán e
colaboradores (2005) a partir da co-administração de duas cepas de
L.lactis, uma capaz de expressar a proteína E7 fusionada à LLO e outra
expressando interleucina -12 (IL-12) observaram 16% de lise específica
desencadeada por linfócitos extraídos de baços de camundongos
imunizados pela via nasal. No presente trabalho, não se avaliou a
citotoxicidade in vitro, após as imunizações com as linhagens
recombinantes de B.subtilis. No entanto, tão logo se construa cepas de
B.subtilis capazes de expressar maiores quantidades de E7 ou gDE7,
pretende-se realizar tais ensaios.
O desafio com células tumorais TC-1 é o melhor parâmetro para se
avaliar a funcionalidade das respostas imunológicas geradas por
formulações vacinais, uma vez que, verifica a atividade não só dos
linfócitos T CD8+ específicos, mas sim, de toda a resposta imune montada
in vivo em decorrência da administração de formulações vacinais. Em
desafio profilático com células TC-1, não se observou proteção contra o
aparecimento de tumores em animais imunizados pelas vias nasal ou
subcutânea com células vegetativas ou esporos das linhagens de B.subtilis
LDVR1 e LDVR2. Nos ensaios de desafio, foram utilizadas inicialmente 5 x
105 células TC-1, de acordo com trabalho anterior realizado no laboratório
(LÁSARO et al., 2005). Esses dados indicam que a baixa expressão dos
antígenos alvo não permitiu que as linhagens vacinais de B. subtilis
desencadeassem respostas imunológicas com atividade citotóxica
específica nos animais imunizados.
Pesquisadores que avaliaram a capacidade terapêutica de modelos
vacinais baseadas em vetores bacterianos em modelo desafio utilizaram
um número de células TC-1 variando entre 5 x 104 e 2 x 105 (BERMÚDEZ-
HUMARÁN et al., 2005; SEWELL et al., 2004; POO et al., 2006). A fim de
testar a influência do número de células tumorais na proteção
desencadeada pelas cepas de B.subtilis vacinais, ensaios de desafio foram
realizados com um número intermediário de células (105 células), no
69
entanto, nenhuma proteção foi observada após a administração das cepas
LDVR1 e LDVR2 de B.subtilis. Bermúdez-Humarán e colaboradores (2003,
2005) conseguiram 35% de proteção para o desenvolvimento de tumores
em camundongos imunizados por via intranasal com L.lactis capazes de
expressar a proteína E7 e secretar IL-12. Poo e colaboradores (2006)
conseguiram atingir 40% de proteção para o desenvolvimento de tumores
em camundongos imunizados com L. casei por via oral. A ausência de
efeito antitumoral em animais imunizados com as linhagens vacinas de B.
subtilis reflete, provavelmente, a baixa ativação de respostas celulares (T
CD8+) específicas para o peptídeo E7. Esse fato pode estar relacionado à
baixa produção dessas proteínas e a baixa estabilidade da proteína E7
gerada pela cepa LDVR1. Como dito antes, a adequação de códons
presentes na proteína gDE7, bem como a utilização de sistemas de
expressão mais eficientes para B.subtilis poderão permitir o aumento da
expressão da proteína em B.subtilis e, conseqüentemente, estimular o
sistema imune, de forma que o mesmo seja capaz de prevenir e erradicar
tumores induzidos pelo vírus HPV-16.
Recentemente, nosso grupo empregou um sistema vacinal de
sensibilização e reforço (Prime-Boost) baseado na administração de vacina
de DNA como sensibilização e B.subtilis recombinante como reforço
administrado por via oral (Anexo I). Nesse trabalho, foram utilizados células
e esporos de linhagens geneticamente de modificadas de B.subtilis
capazes de expressar a porção estrutural da fímbria CFA/I (CfaB) de ETEC
e a vacina de DNA pRECFA que codifica para o mesmo antígeno alvo
fusionado à gD do HSV-1 (LUIZ et al., 2008). Os resultados mostraram que
animais que receberam o regime vacinal de sensibilização-reforço
apresentaram respostas sinérgicas para os níveis séricos de anticorpos
anti-CfaB quando comparados a animais que receberam apenas uma das
formulações. Além disso, fêmeas de animais imunizados com as duas
formulações foram capazes de fornecer maiores níveis de proteção passiva
a neonatos após uma dose letal de ETEC, quando comparadas a fêmeas
70
que receberam apenas uma das formulações (LUIZ et al., 2008). Como
continuação dos estudos voltados para a avaliação do potencial vacinal das
linhagens recombinantes de B. subtilis, esperamos realizar imunizações do
tipo prime-boost que empregue uma vacina de DNA que expresse o
mesmo antígeno alvo (LÁSARO et al., 2005), em animais que
posteriormente imunizados com a linhagem de B.subtilis LDVR2 (capaz de
expressar gDE7) como reforço. Espera-se, dessa forma, amplificar os
efeitos imuno estimuladores frente a linfócitos T CD8+ específicos para PE7
ativados por linhagens vacinais de B. subtilis.
Como já fora mencionado, em trabalho anterior do grupo, mostrou-
se que cepas geneticamente modificadas de B.subtilis expressando a
proteína LTB são capazes de desencadear a produção de anticorpos
séricos e secretados, quando administradas a camundongos pela vias oral
ou parenteral (PACCEZ et al., 2006, 2007). No presente trabalho, a partir
do mesmo sistema de expressão, construiu-se cepas de B.subtilis capazes
expressar GroEL2 e/ou LTB, com o objetivo de avaliar o potencial desse
veículo vacinal em ativar respostas celulares (linfócitos T CD8+) contra o
antígeno modelo apresentado. Além disso, avaliou-se a influência da
expressão de GroEL2, tanto na forma fusionada como co-expressa com a
proteína LTB, na indução de respostas imunológicas celulares contra LTB.
Observou-se que, em geral, animais que receberam esporos, tanto
por via nasal como por subcutânea, apresentam menores títulos quando
comparados a grupos de camundongos que receberam células vegetativas
das linhagens correspondentes. Esse resultado era esperado, uma vez
que, quando esporos das linhagens recombinantes são administrados, o
antígeno alvo é formado apenas in vivo, enquanto que células vegetativas
são administradas com os antígenos pré-formados em seu interior. Tal
resultado já havia sido observado em trabalhos anteriores do grupo
envolvendo B.subtilis (PACCEZ et al., 2006, 2007; LUIZ et al., 2008).
Notou-se também que a administração das cepas recombinantes por via
nasal desencadeou menores títulos quando comparada à administração
71
por via subcutânea. Fato que pode ser atribuído a fatores intrínsecos a vias
de mucosa, tais como, produção de muco e enzimas hidrolíticas, presença
de microbiota residente e descamação celular, fatores que, sabidamente,
podem afetar a apresentação do antígeno ao sistema imune, sobretudo,
quando o antígeno alvo é expresso por um veículo vacinal vivo
(MERCENIER et al., 2000).
Entre os grupos de imunização, observou-se que a cepa LDV73
desencadeou títulos de anticorpos bem inferiores aos títulos obtidos com
as linhagens LDV74 e LDV2 tanto por via subcutanea como por via nasal.
Assim, observa-se que a fusão da LTB com a GroEL2 foi capaz de inibir a
resposta de anticorpos séricos contra LTB. De fato, as proteínas de choque
térmico possuem ligantes para receptores presentes em células
apresentadoras de antígenos (CD40 e CD91) os quais medeiam a
internalização e o direcionamento para a apresentação via MHC-I
(OSTERLOH e BRELOER, 2008). Desse modo, acredita-se que grande
parte da proteína híbrida (GroEL2-LTB) gerada esteja sendo apresentada
por via de MHC-I, gerando desse modo uma resposta prioritariamente
celular (Th1) em detrimento à resposta humoral.
No que concerne à resposta de células T CD8+ específicas para
LTB, observou-se que a cepa LDV73 foi capaz de desencadear respostas
celulares elevadas, sobretudo quando administrada por via nasal na forma
de células vegetativas. Observação que corrobora a hipótese descrita no
parágrafo anterior, uma vez que epítopos apresentados por via de MHC-I
geram respostas prioritariamente celulares. De fato, alguns pesquisadores
fusionaram proteínas de choque térmico a antígenos modelo e observaram
potente ativação de respostas celulares específicas. Liu e colaboradores
(2007) utilizando HSP65 de M.bovis fusionada à proteína E7 de HPV-16,
na forma de vacina de sub-unidade, observaram ativação específica, tanto
de linfócitos T CD4+ como de linfócitos T CD8+ específicos para PE7. e
proteção frente ao desafio com células TC-1. Huang e colaboradores
(2007) também observaram ativação de linfócitos T CD8+ específicos, bem
72
como, proteção a células TC-1 em camundongos que receberam HSP60
humana fusionada às proteínas E6 e E7 de HPV-16 na forma de vacina de
DNA. Outros trabalhos também enfocam a utilização de antígenos
complexados às HSPs em imunoterapias contra o câncer, uma vez que a
resposta celular é a principal envolvida na erradicação de tumores
(revisado por WANG et al., 2006). Assim, constata-se que os dados obtidos
com a administração de cepas de B.subtilis capazes de expressar a fusão
GroEL2-LTB (LDV73) estão em consonância com a literatura
especializada.
Em nossos ensaios, a maior ativação de respostas T CD8+
específica foi observada em camundongos imunizados com a a cepa
LDV73 por via nasal. De fato, outros pesquisadores já observaram a
ativação de respostas citotóxicas específicas, a partir da administração de
veículos vacinais vivos pela via nasal. Bermúdez-Humarán e colaboradores
(2005) desencadearam respostas citotóxicas específicas ao administrarem
L.lactis expressando a proteína E7 de HPV-16 por via nasal. Publicouver e
colaboradores (2004) utilizaram vírus recombinantes não patogênicos da
estomatitite vesicular capazes de expressar as proteínas do envelope do
vírus HIV, administrados pela via nasal a camundongos e observaram
ativação de respostas celulares específicas potentes contra esses
antígenos. De forma semelhantes, He e colaboradores (2007) registraram
respostas celulares específicasa partir da administração por via nasal de
vírus da influenza (H1N1) recombinantes atenuados capazes de expressar
os principais epítopos da maior proteína da membrana externa do
patógeno intracelular Chlamydia trachomatis. Nossos dados revelam,
portanto, que cepas geneticamente modificadas de B.subtilis representam
veículos vacinais alternativos para ativação de respostas imunológicas
celulares após administração por via de mucosal em modelo murino.
No presente trabalho, mostrou-se que cepas de B.subtilis, quando
utilizadas como veículos vacinais, são capazes de desencadear respostas
celulares específicas a antígenos heterólogos expressos. Além disso,
73
observou-se que a proteína GroEL2 de M. bovis quando expressa na forma
de proteína de fusão com o antígeno LTB por cepas recombinantes de
B.subtilis levam a uma modulação da resposta imune contra LTB no
sentido do aumento da ativação de linfócitos T CD8+ específicos. Desse
modo, acredita-se que a geração de cepas vacinais de B.subtilis capazes
de expressar a proteína GroEL2 fusionada à proteína E7 represente uma
estratégia promissora para a geração de vacinas terapêuticas para tumores
induzidos pelo HPV.
74
6 CONCLUSÕES
Constatou-se que é possível expressar as proteína GroEL2 de M.bovis,
LTB de ETEC, e as fusões quiméricas gDE7 e GroEL2-LTB em cepas
geneticamente modificadas de B.subtilis. Concluiu-se também que as linhagens
de B.subtilis que expressam as proteínas GroEL2 e LTB e gDE7 são capazes de
induzir respostas humorais específicas para os antígenos alvo quando
administradas a camundongos.
No que concerne à ativação de linfócitos T CD8+ , observou-se que entre
as linhagens que expressam GroEL2 e LTB, a linhagem LDV73 (expressa
GroEl2 fusionada à LTB) foi capaz de ativar a maior percentagem de linfócitos T
CD8+ específicos. Dessa forma, pode-se concluir que a proteína GroEL2 quando
fusionada ao antígeno alvo representa uma estratégia promissora para
potencializar a ativação de linfócitos T CD8+ .
A conclusão geral do trabalho foi que o modelo “in” de expressão de
antígenos heterólogos em B.subtilis, seja na forma de esporos, mas, sobretudo,
como células vegetativas, desenvolvido em nosso laboratório, pode ser adaptado
de forma a aumentar a ativação de linfócitos T citotóxicos para antígenos
específicos quando administrados em camundongos tanto pelas vias de mucosa
ou parenteral. Estudos posteriores deverão detalhar os resultados encontrados e
lançar as bases para o uso desse novo sistema vacinal voltado para a ativação
específica de células T.
75
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ANEXO I
Artigo publicado em periódico
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ANEXO II
Resumos envidos a congressos
85
ANEXO III
Premiação
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