proteômica cromatografia prof. dr. luciano pinto

Proteômica

Cromatografia

Prof. Dr. Luciano Pinto

Cromatografia

• Chroma + graphein = cor + escrita

-1903: Mikhail Sémionovitch Tswett (1872-1919)

Definição

• Método fisico-químico de separação de substâncias

• Presença de duas fases: Estacionária e móvel

• Separação ocorre devido a diferença de interação entre as substâncias e as fases

• Podendo ser uma analise qualitativa e/ou quantitativa

Cromatografia em papel

Tipos de cromatografia

Cromatografia por exclusão moleculargel filtração

• A fase estacionária (matriz) consiste num gel com poros de diferentes tamanhos

• Proteínas de menor massa percorreram o ‘caminho’ dos poros

• Separa moléculas de diferentes tamanhos

• Resina usada – SEPHADEX, SUPERDEX

• – polímero de glicose- gel formado por esferas com poros

• Proteínas maiores são “excluídas” saindo primeiro na coluna

Gel Filtração

Característica da MatrizSuperdex

Típica cromatografia de gel filtração

Cromatografia de afinidade

• Resina usada AGAROSE- polímero de açucares de algas ao qual se liga um composto pelo qual a proteína tenha afinidade

– enzima - o ligante é o seu substrato;– anticorpo - o ligante é o antígeno;– receptor de hormônio - ligante é o hormônio;

• É a mais específica de todas.

Tipo de cromatografia de afinidade

• Pode ter o antígeno ligado

• Pode ter o anticorpo ligado

Cromatografia de troca iônica

• Resina usada - CELULOSE ligada covalentemente a grupos com carga positiva ou negativa

– carboximetilcelulose (- negativa)– dietilaminoetilcelulose (+ positiva)

• Proteínas com a mesma carga da resina saem primeiro da coluna

• Moléculas carregadas ligam-se a grupos de carga oposta que se situam na matriz

• Remoção das proteínas que se ligaram à matriz é feita alterando as características do meio

Troca iônica: adsorção das moléculas

Troca iônica : eluição das moléculas

Troca iônica: eluição das moléculas e equilíbrio da coluna

Cromatógrafos

Análise em escala laboratorial- pequenas purificações

Cromatógrafos

Cromatógrafos

Colunas de cromatografia

Purificação seqüencial: Típica Aplicação

• Captura e purificação de:

• Proteínas, ex.: – Anticorpos

monoclonais – Sangue/ fatores do

plasma – Proteínas

recombinantes • Peptídeos • Polissacarídeos • Oligonucleotídeos • Vírus

Diferentes tipos de colunas em linha