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CINÉTICA ENZIMÁTICA

Dra. Leticia Bucio Ortiz. Depto. Ciencias de la Salud. DCBS. UAM-Izt. México.

E + S SE E + P

Dra. Leticia Bucio Ortiz. Depto. Ciencias de la Salud. DCBS. UAM-Izt. México.

• Proteínas con actividad catalítica de los seres vivos.

• Unidades del Metabolismo

• Regulan la vel. de las reac. quím. espontáneas (DG-).

• No promueven reacciones no-espontáneas (DG +).

• Incrementan la Vel. De reacción 103 a 1012 veces sin

afectar el sentido de la reacción.

• No forman parte del producto de la reacción.

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PROPIEDADES GENERALES• AUMENTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN

– De 106 to 1012 veces vs sin enzima.

– Aún más rápido que los catalizadores químicos.

• CONDICIONES DE REACCIÓN– Temperatura 25-40 oC (algunas hasta 75 oC)

– pH neutro (5-9), la mayoría 6.5 – 7.5

– Presión atmosférica normal

• CAPACIDAD DE REGULACIÓN– Por concentración de sustrato

– Por concentración de enzima

– Por inhibidores competitivos (semejantes al sustrato)

– Por inhibidores no competitivos (modificación covalente de la enzima)

– Por regulación alostérica

• ALTA ESPECIFICIDAD DE REACCIÓN– Interacción estereoespecífica con el sustrato

– No hay productos colaterales

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ALTA

ESPECIFICIDAD

DE REACCIÓN

INTERACCIÓNESTEREO

ESPECÍFICA CON SU

SUSTRATO

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Los Substratosse acercan a la Enzima

(sitio Activo)

Enzima

Substratos

HO-

H-

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Los reactivos

interaccionan

con la enzima

(sitio activo)

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Cambia la

configuración de la

enzima

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La unión del sustrato produce un cambio conformacional

de la enzima hexoquinasa (cinasa), la cual es monomérica.

Substrato

de glucosa

Sitio de enlace

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Se realiza la

reacción

catalítica

Dra. Leticia Bucio Ortiz. Depto. Ciencias de la Salud. DCBS. UAM-Izt. México.

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Dra. Leticia Bucio Ortiz. Depto. Ciencias de la Salud. DCBS. UAM-Izt. México.

Actividad enzimática finales del siglo XIX.

En 1882: complejo enzima-sustrato como intermediario del proceso de catálisis enzimática.

En 1913: Leonor Michaelis y Maud Menten desarrollaron esta teoría y propusieron una

ecuación de velocidad que explica el comportamiento cinético de los enzimas.

http://www.ehu.eus/biomoleculas/enzimas/enz3.htm#mm

[ET] = [E] + [ES]

Como [E] = [ET] - [ES], resulta que: v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]

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Leonor Michelis y Maud Menten (1913)

Tiempo

Co

nc

en

t.

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E + S ESK1

K-1

ES E + PK2

K-2

[Et ] = Concentración de E total libre y combinada

[ES]

[Et ] – [ES] = Concentración de E libre

[S] normalmente > a [Et ] de tal forma [ES] es despreciable Vs [S]

1.- Vel. de formación ES = K1 ( [Et ] – [ES] ) [S]

La deducción comienza por considerar

las Velocidades de Formación y de Descomposición de ES

La velocidad de formación de ES a partir de E + P es muy pequeña y puede despreciarse

[ES]

[E] + [S]K1 =

K1 ( [E] + [S] ) = [ES]

2.- Vel. de descomposición de ES = K-1 [ES] + K2 [ES]

3.- Estado estacionario.

Vel. de formación de ES = vel. de descomposición. La [ES] se mantiene constánte

4.- Separación de las constantes de velocidad

K1 ( [Et ] – [ES] ) [S] = K-1 [ES] + K2 [ES]

K1 [Et ] [S] – K1 [ES] [S] = (K-1 + K2) [ES]

K1 [Et ] [S] = K1 [ES] [S] + (K-1 + K2) [ES] Dra. Leticia Bucio Ortiz. Depto. Ciencias de la Salud. DCBS. UAM-Izt. México.

K1 [Et ] [S] = K1 [ES] [S] + (K-1 + K2) [ES]

K1 [Et ] [S] = ( K1 [S] + (K-1 + K2) ) [ES] simplificando

K1 [Et ] [S]

K1 [S] + (K-1 + K2) [ES] =

5.- Definición de la velocidad inicial (Vo) en función de [ES]

La Vel. Inicial de acuerdo con la Teo. de M-M, está determinada por la

vel. de descomposición del [ES], K2 ,

ES E + PK2

K-2

Vo

K2

[ES] =

[Et ] [S]

[S] + (K-1 + K2)

K1

[ES] =

Vo = K2 [ES]

[ES]

[ES]

K2 [Et ] [S]

[S] + (K-1 + K2)

K1

Se puede simplicar:

Vo = Definiendo KM

Cte. De Michaelis-Menten como(K-1 + K2)

K1

Vmax como K2 [Et] que es la Vel. Cuando todo el

enzima disponible E, se halla presente en forma de ES.Vmax [S]

[S] + KM

Vo =Ecuación de Michaelis-Menten o Ecuación de Velocidad

para una reacción de un solo S catalizada por un E.

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ECUACIÓN DE MICHAELIS-MENTEN Vo = V max [S]

Km + [S]

1

2 Vo = Vmax

De la ecuación de M-M se deduce una rel. numérica importante

Cuando la Vo es la mitad de la Vmax

Vmax Vmax [S]

2 KM + [S] =

1 [S]

2 KM + [S] =

KM = 2 [S] – [S]

KM = [S]Dra. Leticia Bucio Ortiz. Depto. Ciencias de la Salud. DCBS. UAM-Izt. México.

E E-S E

S P

Velocidad: cantidad de producto formado en una unidad de tiempo

S E P

100 1000 100

1000

1000

1000

1000

1000

1000

250 250

500 500

750 750

1000 1000

2000 1000

3000 1000

Vmax

(mM) mU (mM/ min)

Dra. Leticia Bucio Ortiz. Depto. Ciencias de la Salud. DCBS. UAM-Izt. México.

Cinética enzimática en función de la concentración

de sustrato

KM

1

2 Vo = Vmax

KM = [S]

Vmax

Dra. Leticia Bucio Ortiz. Depto. Ciencias de la Salud. DCBS. UAM-Izt. México.

Catalasa H2O2 25.0

Hexoquinasa ATP 0.4

D-Glucosa 0.05

D-Fructosa 1.5

Anhidrasa carbónica HCO3- 9.0

Quimotripsina Gliciltirosinilglicina 108.0

N-Benzoiltirosinamida 2.5

-Galactosidasa D-Lactosa 4.0

Treonina deshidrogenasa L-Treonina 5.0

ENZIMA SUSTRATO Km (mM)

Dra. Leticia Bucio Ortiz. Depto. Ciencias de la Salud. DCBS. UAM-Izt. México.

• La KM es inversamente proporcional con la

actividad de la enzima.

• Valor de KM grande, baja actividad

• Valor de KM pequeño, alta actividad

La KM

es un parámetro de

Actividad Enzimática

Dra. Leticia Bucio Ortiz. Depto. Ciencias de la Salud. DCBS. UAM-Izt. México.

Catalasa H2O2 25.0

Hexoquinasa ATP 0.4

D-Glucosa 0.05

D-Fructosa 1.5

Anhidrasa carbónica HCO3- 9.0

Quimotripsina Gliciltirosinilglicina 108.0

N-Benzoiltirosinamida 2.5

-Galactosidasa D-Lactosa 4.0

Treonina deshidrogenasa L-Treonina 5.0

ENZIMA SUSTRATO Km (mM)

En ayunas 95 mg/dl. 950 mg/L = 5.27 mM

Después de comer …. Dra. Leticia Bucio Ortiz. Depto. Ciencias de la Salud. DCBS. UAM-Izt. México.

H2O

Quimotripsina Ac-Phe-Ala Ac.Phe + Ala 150

H2O

Pepsina Phe-Gly Ac-Phe + Ala 0.3

H2O

Ribonucleasa Citidina 2’,3’ Citidina 3’ 7.9

fosfato cíclico fosfato

Anhidrasa Carbónica

Km de algunas enzimas

ENZIMA SUSTRATO Km (mM)

Mathews C.K. y Van Holde K.E 1998. .Bioquímica 2ª. Ed. McGraw-Hill Interamericana. España. Pag 418

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Hexosa Cerebral

Azúcar Km

(mol/ L)

Cinasas

D-Glucosa 8 X 10 -6 Glucocinasa

Hexocinasa IV

D-Fructosa 2 X 10 -3 Fructocinasa

D-Manosa 5 X 10 -6 Manocinasa

D-Galactosamina 8 X 10 -5 Galactocinasa

Km

(mmol/ L)

8

2000

5

80

Km

(mmol/ L)

0.008

2.0

0.005

0.08

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ATP + Glucosa ADP + 6-fosfato de glucosa

2 Rutas

Enzimas: pueden catalizar reacciones donde hay 2 S =

Hexocinasa

•Desplazamiento Simple, los 2 S se unen a la E

A + B + E EAB C + D

•Doble desplazamiento o ping-pong

A + B + E AE BE + C

D

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Determinación Cuantitativa de la Cinética Enzimática

1. La reacción global

2. Procedimiento analítico para determinar el S que

desaparece o el P que aparece

3. Sí el E requiere Cofactores (iónes o coenzimas)

4. La dependencia de la actividad enzimática con la

[S] o sea la KM de la Enzima.

5. El pH óptimo

6. Un intervalo de temperatura en la que la E es

estable y muestra actividad elevada.

Dra. Leticia Bucio Ortiz. Depto. Ciencias de la Salud. DCBS. UAM-Izt. México.

Catalasa H2O2 25.0

Hexoquinasa ATP 0.4

D-Glucosa 0.05

D-Fructosa 1.5

Anhidrasa carbónica HCO3- 9.0

Quimotripsina Gliciltirosinilglicina 108.0

N-Benzoiltirosinamida 2.5

-Galactosidasa D-Lactosa 4.0

Treonina deshidrogenasa L-Treonina 5.0

ENZIMA SUSTRATO Km (mM)

En ayunas 95 mg/dl. 950 mg/L = 5.27 mM

Después de comer …. Dra. Leticia Bucio Ortiz. Depto. Ciencias de la Salud. DCBS. UAM-Izt. México.

Pepsina 1.5

Tripsina 7.7

Catalasa 7.6

Arginasa 9.7

Fumarasa 7.8

Ribonucleasa 7.8

Enzima pH óptimo

Vo

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4 37 85

Temperatura oC)

Vo

10 50 100

Coenzima

Vo

10 30 50 70 100

Tiempo (min)

Vo

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1.0 Unidad de Actividad Enzimática (U):

La cantidad que transforma 1.0 mmol (10-6 M) de S /min,

a 25 0C, en las condiciones de medida óptima.

Actividad específica:

Es el no. de U de una E / mg de proteína.

Es decir: una medida de la pureza de la E.

Al purificarla, el valor llega a un máximo y es estable.

Número de recambio

No. de moléculas de S transformadas /unidad de tiempo,

por una molécula de E ( o por un solo sitio catalítico)

Enzima No. de Recambio

Anhidrasa carbónica 36 000 000

B-Amilasa 1 000 000

B-Galactosidasa 12 000

Fosfoglucomutasa 1 240

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[S] (mM) Vo (mM/ min)

1.25 0.86

1.67 1.02

2.5 1.32

5 1.67

10 2.09

¿Vmax?

¿KM?

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y = m x + b

Transformación de la M-M. Representación Doble Recíproco

Vmax [S]

[S] + KM

Vo =

Vmax [S]

KM + [S]Vo =

1 KM + [S]

Vo Vmax [S] =

Sí se toman los recíprocos de ambos

1 KM 1 [S]

Vo Vmax [S] Vmax [S] =

Separando los componentes de numerador

+

1 KM 1 1

Vo Vmax [S] Vmax

=

Simplificando

+Ecuación de

Lineweaver-Burk

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0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40

1.60

1.80

2.00

0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60

Vo

(mm

ol/L

min

)

[S] mM

Michaelis Menten

S (mM) Vo (mmol/L min)

0.05 0.71

0.10 1.07

0.20 1.50

0.35 1.80

0.50 1.88

1/S 1/Vo

20.0 1.4

10.0 0.9

5.0 0.7

2.9 0.6

2.0 0.5y = 0.0494x + 0.4257

R² = 0.9991

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

-10.0 -5.0 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0

Linewever-Burk

1/[S]

1/ V

o

1 KM 1 1

Vo Vmax [S] Vmax

= +

y = m x + b

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Gráfica de Eadie-Hofstee

Vmax [S]

KM + [S]Vo =

(KM + [S]) Vo = Vmax [S]

KM Vo [S] Vo Vmax [S]

[S] [S] [S]=

+

Vo = - KM Vo Vmax

[S]

+

y = m x + b

Vo

[S]

V max

KM

Vo

Vmax

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S (mM) Vo (mmol/L min)

0.05 0.71

0.10 1.07

0.20 1.50

0.35 1.80

0.50 1.88

1/S 1/Vo

20.0 1.4

10.0 0.9

5.0 0.7

2.9 0.6

2.0 0.5

Vo/S Vo

14.200.71

10.701.07

7.501.5

5.141.8

3.761.88

y = -0.1168x + 2.3571R² = 0.9947

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

Vo

Vo/S

E-H

7

Dra. Leticia Bucio Ortiz. Depto. Ciencias de la Salud. DCBS. UAM-Izt. México.

Cuando:

Vo= Vmax Todos los sitios activos están

ocupados y no hay moléculas de E libre.

KM= [S] Sí... ½ Vmax

KM representa la cantidad de sustrato

necesaria para fijarse a la mitad de la E

disponible y producir la mitad de la Vmax

KM representa la concentración del sustrato en

una célula

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Gracias

Dra. Leticia Bucio Ortiz. Depto. Ciencias de la Salud. DCBS. UAM-Izt. México.